NL8000536A

NL8000536A - Bepaling van met tumor gepaard gaande glycobrug en kankerdiagnose.

Info

Publication number: NL8000536A
Application number: NL8000536A
Authority: NL
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-01-30
Filing date: 1980-01-29
Publication date: 1980-08-01
Also published as: CH645728A5; DE3003301A1; ES8102679A1; DK36980A; ES488747A0; DE3003301C2; FR2461256A1; SE8000705L; IT1165552B; SE451508B; IT8047743A0; GB2043890A; IT8047743A1; GB2043890B; FR2461256B1; US4389392A

Description

• ,/

Bepaling van met tumor gepaard gaande glycobrug en kankerdiagnose.

De uitvinding heeft betrekking op bepaling van de spiegel van met tumor gepaard gaande glycobrug bevattende stoffen, te weten aan suiker verwante stoffen, waaronder glycoprotelnen, glycopeptiden, glycolipiden en suikers (in het vervolg afgekort als 5 TAG) in een lichaamsvloeistofmonster van een zoogdier, in het bijzonder die TAG, die toenemen als ongedifferentieerde celleh, in het bijzonder tumor- of kankercelgroei en kankerdiagnose op grond van dergelijke bepaling.

Er is een werkwijze bekend voor het bepalen van de 10 spiegel van specifieke glycoproteinen in een lichaamsvloeistofmonster van kankerpatiënten. Hierbij maakt men gebruik van de antigeniteit van hoofdzakelijk de proteinerest van de glycoprotelnen. Zo bepaalt men bijvoorbeeld de -foetoprotefnespiegel en carcinoembryonisch antigeen (in het vervolg afgekort als CEA) spiegel voor de diagnose 15 van primair hepatoom en kanker van de spijsverteringsorganen, in het bijzonder rectal kanker, enz. (zie Igaku no Ayumi, vol. 106, No. 5, Fifth Saturday Special Issue, blz. 235-250 (1978)). Deze methoden voldoen echter niet, aangezien men ze slechts op bepaalde typen kanker en tumoren kan toepassen.

20 Anderzijds is er nog geen diagnostische methode bekend waarbij men gebruik maakt van de specifieke schakeling van de suikerrest van TAG,

Er bestaat reeds lang behoefte aan een eenvoudige, goedkope, kwantitatieve werkwijze voor het bepalen van de TAG spie-25 gels in lichaamsvloeistoffen, die over een breed gebied kan worden toegepast.

Gelet op het feit, dat er in de lichaamsvloeistoffen van kankerpatiënten TAG aanwezig is, dat geproduceerd wordt door ongedifferentieerde cellen (meestal kankercellen) en aan de 8000536 * 2 lichaamsvloeistoffen wordt afgegeven en TAG drastisch verschilt van glycobrug bevattende stoffen, die door gedifferentieerde cellen (meestal normale cellen) geproduceerd en aan de lichaamsvloeistoffen afgegeven zijn, voor wat betreft de chemische structuur van de 5 suikerketen, zijn lengte en de samenstelling van de suikerresten, heeft men uitgebreid onderzoek verricht, hetgeen geleid heeft tot de ontdekking, dat TAG een eindstandige galactose-(01-+3 of (?l->-4) -N-acetylglucosaminebrug bevat en specifiek bindt met lectinen en men de TAG spiegel in een lichaamsvloeistof monster kan bepalen door reac-10 tie van de TAG met een lectine. De tag spiegel wijst op aan- of afwezigheid van kankercellen, hun groeisnelheid en de stijging en daling daarvan en maakt een succesvolle diagnose van verschillende kankersoorten of tumoren mogelijk. De uitvinding is op bovengenoemde ontdekking gebaseerd.

15 Aldus geeft de uitvinding een werkwijze voor het bepalen van de TAG spiegel in een lichaamsvloeistofmonster, waarbij men de TAG in een lichaamsvloeistofmonster met een lectine laat reageren onder vorming van een TAG-lectine complex en de hoeveelheid TAG-lectine complex of niet gereageerd hebbend lectine meet en een 20 pakket voor gebruik bij een dergelijke werkwijze.

Bijgaande fig. 1 is een grafiek, die de hoeveelheden TAG voorstelt, die volgens voorbeeld I van de uitvinding zijn bepaald en fig. 2 is een grafiek, die die hoeveelheden TAG 25 voorstelt, die zijn bepaald volgens voorbeeld II van de uitvinding.

Men kan bij de uitvinding verschillende lichaamsvloeistoffen gebruiken. Voorbeelden van geschikte lichaamsvloeistoffen zijn bloed, weefselvloeistoffen, lympfen,hydrotorax, ascites, amniotische vloeistof, maagsap, urine, pancreassap, cerebrospinaal 30 vloeistof, speeksel, enz. Hiervan verdient bloed, met name in de vorm van serum of plasma, de voorkeur.

De als monster gebruikte hoeveelheid vloeistof bedraagt gewoonlijk 1-10 ml, bij voorkeur 2-5 ml.

Volgens de uitvinding kan men de TAG spiegel in 35 een lichaamsvloeistofmonster bepalen door TAG uit de lichaamsvloei- 8000536 * t ί 3 stof af te scheiden en met een lectine te laten reageren onder vorming van een TAG-lectine complex en de hoeveelheid TAG-lectine complex of niet gereageerd hebbend lectine te meten na afscheiding daarvan of door een gemerkt lectine aan het lichaamsvloeistofmonster 5 toe te voegen» waardoor rechtstreeks TAG-gemerkt Jectine complex wordt gevormd» het verkregen TAG-gemerkt lectine complex of niet gereageerd hébbend lectine af te scheiden en de hoeveelheid daarvan te meten.

Ter afscheiding van de TAG fractie uit een lichaams-10 vloeistofmonster kan men gebruik maken van conventionele methoden ter extractie of afscheiding van glycobrug bevattende stoffen als uitzouten, precipitatie, extractie met oplosmiddelen, centrifugering, dialyse, een moleculaire zeef, enzyme-inactivering, enz., of een of andere combinatie daarvan. Zo kan men bijvoorbeeld TAG fractie ver-15 krijgen door toevoeging van een voor precipitatie of denaturering doeltreffende hoeveelheid sulfosalicylzuur, trichloorazijnzuur of zinksulfaat aan bloedserum of plasma, of door verhitting van bloed-serum of plasma ter precipitatie van albumine, immunoglobuline, enz., verwijdering van de geprecipiteerde proteinen door filtratie en 20 dialyse van het filtraat.

In geval men een gemerkt lectine gebruikt, kan men andere lichaamsvloeistoffen dan bloed als zodanig als monster gebruiken. Het verdient echter de voorkeur een proteïne met laag suikergehalte, bijvoorbeeld runderserum albumine (BSA), enz. als 25 beschermend proteïne toe te voegen teneinde denaturering van het monster te voorkomen en tegelijkertijd de reactie met lectine te bevorderen. Bij voorkeur voegt men een geëigende hoeveelheid beschermend proteïne aan de monsters toe nadat men albuminen, immunoglobuline, enz. uit de monsters heeft verwijderd, aangezien met de bepa-30 ling dan onder beter beheerste omstandigheden kan uitvoeren. Als men bloedmonsters gebruikt, kan men bloedserum, dat op de gebruikelijke wijze is verkregen, of bloedplasma, dat op de gebruikelijke wijze is verkregen onder gebruikmaking van een anti-coaguleermiddel, als heparine, EDTA, citroenzuur, enz., als monster gebruiken, waar-35 bij bloedplasma, dat onder gebruikmaking als heparine als anti- 8000535 4 coaguleermiddel is verkregen, de voorkeur verdient. Men kan de monsters verdunnen met water of met geschikte bufferoplossing in water, indien dit nodig is of men het gewenst acht, bijvoorbeeld in gevallen, waarin de tag spiegel tamelijk hoog, als in ascites, 5 enz. Men kan bij de uitvinding die lectinen gebruiken, die specifiek kunnen combineren met galactose-(β1^3 of β1-*4)-N-acetylglucosamine als beschreven in 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys.

Res, Comm. 62, 144 (1975); Z, Immunitaetsforch, 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp. Pathol. 27, 228-236 (1946); Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 10 75, No. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry 13, 196-204 (1974), enz.

bijvoorbeeld pinda lectine, lectine uit de Ricinus communis, enz.

Stoffen, die men kan gebruiken voor het merken van lectinen, waardoor men ze radiometrisch, fluorimetrisch, colo-rimetrisch, enz. waarneembaar kan maken zijn enzymen, fluorescerende 15 stoffen en radio-actieve stoffen. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn glucoamylase, glucose-oxydase, peroxydase, alkalische fosfatase, β-galactosidase, hemeoctapeptide, enz, en actieve fragmenten daarvan. Voorbeelden van geschikte fluorescerende stoffen zijn fluoresceine, fluorescelne isothiocyanaat, rhodamine, dansylchloride (te weten 20 5-dimethylamino-1-naftaleensulf onylchloride), enz. Voorbeelden van geschikte radio-actieve stoffen zijn radio-actief jodium, tritium, enz. Ter merking van lectinen met boven beschreven merkstoffen kan men allerlei bekende werkwijzen gebruiken voor het merken van bekende proteïnen als antigenen en antilichamen met enzymen, fluorescerende 25 stoffen en radio-actieve stoffen. Zo kan men bijvoorbeeld lectinen met radio-actieve isotopen merken volgens de werkwijze, beschreven in Kazuo Shizunome en Yuichi Kumahara; "Radioimmunoassay" blz. 45-56 (1978) Asakura Publishing co., Tokyo.

Bij de werkwijze van de uitvinding gebruikt men 30 gemerkte of ongemerkte lectinen bij voorkeur in vermenging met geschikte oplosmiddelen. Men kan gebruik maken van allerlei oplosmiddelen, die gemerkte of ongemerkte lectinen niet denatureren, bijvoorbeeld fysiologische zoutoplossing, water, 0,1 M tris-HCl bufferoplossing (pH 7,5), 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,4) enz. Men kan 35 de hoeveelheid lectine in oplosmiddel of verdunningsmiddel kiezen 8000536 I < * 5 afhankelijk van de agglutineerwaarde (die wordt gedefinieerd als de uiteindelijke of maximum verdunning van een reeks tweevoudig verdunde monsters), het type merking, of de te bepalen stoffen, enz. en bedraagt gewoonlijk 0,01-100 f*gMlr bij voorkeur 0,03-40 ^g/ml. Men kan 5 bovengenoemde gemerkte of ongemerkte lectine-oplossingen verder verdunnen.

Bij het uitvoeren van de werkwijze van de uitvinding vermengt men een vooraf bepaalde hoeveelheid tag fractie of lichaamsvloeistof als zodanig net een gegeven hoeveelheid lectine of 10 gemerkte lectine en laat het verkregen mengsel ter reactie staan bij 45° C, bij voorkeur bij 4-40° C, liefst bij 20-40° C. Het TAG-onge-merkte of gemerkte-lectine complex of het niet gereageerd hebbende ongemerkte of gemerkte lectine kan op elke bekende wijze van het react!emengsel worden gescheiden, bijvoorbeeld door chromatografie, 15 elektroforese, uitzouting, fractionering, dialyse, gelfiltratie, adsorptie of een combinatie daarvan of volgens een scheidingsmethode onder gebruikmaking van agargel, agarosegel of polyacrylamidegel.

Nader gezegd kan men ter afscheiding van het niet gereageerd hebbende gemerkte of ongemerkte lectine van het reactie-20 mengsel een geschikte hoeveelheid precipiteermiddel voor het TAG-lectine complex aan bovengenoemd reactiemengsel toevoegen en het verkregen complex door bijvoorbeeld centrifugeren verwijderen, waardoor men de niet gereageerd hebbende gemerkte of ongemerkte lectine fractie als bovenstaande vloeistof verkrijgt. Goede voorbeelden van 25 preeipiteermiddelen zijn polvethyleenglycol,ammoniumsulfaat (tot verzadiging) , Rivanol (acrinol), enz. Men kan de omstandigheden bij het centrifugeren aanpassen aan de gebruikte preeipiteermiddelen. Als men bijvoorbeeld polyethyleenglycol als precipiteermiddel gebruikt, verdient het de voorkeur 30-60 min. te centrifugeren bij 1000 G.

30 In gevallen, waarin men TAG-gemerkt of ongemerkt lectine complex van niet gereageerd hebbend lectine scheidt, kan men het complex gemakkelijk van het niet gereageerd hebbende lectine scheiden door gebruik te maken van het verschil in diffusiesnelheid tussen complex en niet gereageerd hebbend lectine op agargel, agaro-35 segel of polyacrylamidegel. In het bijzonder als men het reactiemengsel 8000536 6 in een vat als laag op de gel aanbrengt, diffundeert niet gereageerd hebbend lectine in de gel, waarbij het TAG-lectine complex op de gel achterblijft, dat wil zeggen buiten de gel zonder te worden gediffundeerd. Aldus kan men de scheiding gemakkelijk op de bekende wijze 5 uitvoeren. Er is geen beperking aan de bereiding van de gelen en men kan voor dit doel de bekende methoden gebruiken. Zo kan men bijvoorbeeld een zekere hoeveelheid agar, agarose of polyacrylamide toevoegen aan een verdunningsmiddel, dat proteïne niet laat denatureren, bijvoorbeeld gedestilleerd water, citraat of Tris-HCl bufferoplos-10 sing (pH 7,5), enz. en vervolgens onder zachtjes roeren op 60-80° c verhitten teneinde een oplossing te verkrijgen en de oplossing in een geschikt vat uitgieten, bijvoorbeeld een proefbuis en haar laten afkoelen tot een gelei-achtig produkt. Men kiest de gelconcentratie afhankelijk van de dimensie (bijvoorbeeld molecuulgewicht, stereo-15 structuur, enz.) van de merkende stof, en het TAG-gemerkte lectine complex. Gewoonlijk gebruikt men bij de uitvinding gelen van 0,4-2,0 gew.%, bij voorkeur van 0,7-1,0 gew.%. De verkregen gel kan indien nodig of gewenst een conserveermiddel bevatten. Het oppervlak van de aldus bereide gel kan vlak of concaaf zijn, waarbij laatstgenoemde 20 vorm de voorkeur verdient aangezien te vormen complexen dan niet aan de rand van het vat gaan kleven.

Men meet de hoeveelheid TAG-gemerkt of ongemerkt lectine complex of niet gereageerd hebbend gemerkt of ongemerkt lectine op bekende wijze en men kan de TAG spiegel in de lichaamsvloei-25 stof uit de verkregen waarde berekenen.

Ter meting van de hoeveelheid resterend, niet-gereageerd hebbend lectine kan men verschillende methoden gebruiken. Het verdient echter de voorkeur aan de monsters een stof toe te voegen, die specifiek met het lectine kan reageren onder agglutinering 30 of precipitatie en deze verandering visueel waar te nemen of door meting van bijvoorbeeld de optische dichtheid. Voorbeelden van geschikte agglutineermiddelen voor lectine zijn glycoprotelnen met een eindstandige galactose-(81+3 of β1+4)-N-acetylglucosamine groep, bijvoorbeeld konijnen erythrocyt, met neuramidase behandelde schapen 35 erythrocyt, enz, en Sephadex, glasparels, enz., bekleed met boven 8000536 * -» 7 beschreven glycoprotelnen.

In de praktijk kan men deze methode als volgt uitvoeren» Men verdunt boven beschreven reactiemengsel in een serie met tweevoudige verdunning met als verdunningsmiddel bijvoorbeeld 5 0,15 M fosfaatbufferoplossing, fysiologische zoutoplossing, enz. en brengt monsters van de verdunning op V- of U-vormige platen of in glazen gleuven of in kleine proefbuisjes, of iets dergelijks en vermengt ze elk onder roeren met een stof, die lectine specifiek kam agglutineren en laat de plaatjes, enz», die het mengsel dragen, 10 staan bij 45° C of minder, bij voorkeur bij 4-40° C gedurende 30 min. of meer, bij voorkeur 60-90 min, teneinde de definitieve of maximum verdunning vast te stellen, waarbij nog agglutinering optreedt. Deze maximum verdunning wordt gedefinieerd als het aggluti-neergetal. De lectinen, die men bij de uitvinding kan gebruiken, ver-15 tonen nagenoeg hetzelfde agglutineergetal.

In gevallen, waarin men gemerkte lectinen gebruikt, kan men de TAG spiegel bepalen volgens een methode, die geschikt is voor het meten van gemerkte stoffen, zo kan men bijvoorbeeld na scheiding van TAG-lectine complex en niet gereageerd hebbend gemerkt 20 lectine de hoeveelheid TAG-gemerkt lectine complex of niet gereageerd hebbend gemerkt lectine bepalen door een voor een enzyme geëigend substraat uit te kiezen, welk substraat door colorimetrische of fluorimetrische analyse kan worden geanalyseerd en de activiteit te bepalen van het enzyme als het lectine daarmee is gemerkt, door be-25 paling van de fluorescentie-intensiteit als het lectine met een fluorescerende stof is gemerkt, of door bepaling van de radio-activi-teit als het lectine met een radio-active stof is gemerkt. Als men voor het merken van lectine bijvoorbeeld een enzyme (als peroxydase) gebruikt, druppelt men een vooraf bepaalde hoeveelheid reactiemengsel 30 op het geloppervlak in een proefbuis en laat het geheel 1-48 uur bij kamertemperatuur, bij voorkeur bij 4-25° C staan. Daarna voegt men aan het aldus behandelde reactiemengsel een gegeven hoeveelheid geschikt substraat voor het enzyme (bijvoorbeeld waterstofperoxyde) toe teneinde de enzymatische reactie te doen optreden, waarna men deze 35 reactie binnen een geëigende tijd stopt en de optische dichtheid 8000536 8 van het verkregen mengsel meet, waarbij men indien nodig een kleurstof of kleurvormer (bijvoorbeeld o-fenyleendiamine) gebruikt* Eventueel voegt men, als men een fluorescerende stof voor het merken van lectine gebruikt, een vooraf bepaalde hoeveelheid verdunningsmiddel, 5 bijvoorbeeld een bufferoplossing, na incubatie aan het reactiemengsel op de gel toe en meet de fluorescentie-intensiteit van het verkregen mengsel.

Een bijzonder handzame wijze voor het uitvoeren van de hier beschreven werkwijze is het gebruik van een pakket voor 10 de bepaling van TAG in een lichaamsvloeistof, bijvoorbeeld plasma of serum. Een dergelijk pakket kan een reagens omvatten, dat een plantaardig lectine bevat als specifiek agglutineermiddel voor tag. Het lectine reagens kan ook een stabilisator en/of conserveermiddel voor lectine bevatten, bijvoorbeeld proteïnen met laag suikergehalte als 15 runderserum albumine. Bij een voorkeursuitvoeringsvorm kan dit plant aardige lectine reagens gelyofiliseerd zijn en kan er in het pakket ook een reconstitueermiddel aanwezig zijn, dat een op water gebaseerd of met water vermengbaar oplosmiddel (pH 6-7,8, bij voorkeur 7-7,2) bevat. De reagentia kunnen eventueel ook buffers voor het op een 20 bepaalde pH houden van het gereconstitueerde reagenssysteem en conserveermiddelen en/of stabilisatoren ter voorkoming van ontleding van het materiaal vóór gebruik bevatten. Hoewel buffers niet als kritisch bestanddeel van de pakket reagentia worden beschouwd, gebruik men bij het uitvoeren van de onderhavige werkwijze bij voorkeur een pH 25 van 6-7,8, liefst van 7-7,2, Het reconstitueer-middel bevat als oplosmiddel bij voorkeur water. Zo kam men bijvoorbeeld fysiologische zoutoplossing, fosfaatbufferoplossing, enz. als reconstitueermiddel gebruiken. Verder kam men een met water vermengbaar oplosmiddel toevoegen, dat de reactie niet nadelig beïnvloedt.

30 Als boven gezegd kam men de TAG spiegel in een lichaamsvloeistofmonster goed volgens de onderhavige uitvinding bepalen. voorts kan men de uitvinding, waatrmee men met tumor gepaaird gaemde glvcoburg kam herkennen over een breed gebied toepassen bij verschillende kankersoorten of tumoren, vergeleken bij de bekende methoden 35 of systemen, waarbij men gebruik maakt van amtigeniteit en hoofdzake- 8000536 9 lijk de proteïnerest herkent van glycoproteïnen als CEA, a^-foeto-proteïne, enz. en kan men de uitvinding toepassen bij de diagnose van allerlei kankersoorten en tumoren als maagkanker, borstkanker, dikke darm kanker, rectaal kanker, ovariumkanker, mondholtekanker, 5 tongkanker, larynx kanker, prostaatkanker, lyposarcoom, kwaadaardig melanoom, kwaadaardig lympfoom, primair maagsarcoom, hepatoom, enz., waarbij men de ziekte gemakkelijk in een vroeg of later stadium kan vaststellen en de uitvinding is dan ook zeer vaardevol voor de vaststelling van kanker in een beginstadium.

10 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe.

Tenzij anders is aangegeven zijn alle hier genoemde delen en percentages betrokken op het gewicht.

Voorbeeld I

15 Bepaling van bloedcellen agglutinering onder gebruikmaking van inhi-bitie-reactie.

I. Bereiding proefmonster.

Men verzamelde bloed met 7 patiënten met maagkanker, U patiënten met longkanker, 3 patiënten met borstkanker en van tel-20 kens 1 patiënt met dikke darm kanker, rectaal kanker, ovariumkanker, mondholtekanker, tongkanker, larynx kanker, uterus kanker, prostaatkanker, kwaadaardig melanoom, lyposarcoom, kwaadaardig lympfoom, en primair maagsarcoom en van 7 gezonde personen en bereidde op de bekende wijze plasmamonsters. Bij de plasmamonsters voegde men por-25 tiesgewijze onder roeren een 6 % sulfosalicylzuuroplossing in water totdat de volumeverhouding van toevoegsel tot plasma 1:1 werd. Na voldoende roeren centrifugeerde men het mengsel 10 min. bij 3000-3500 omv./min. en dialyseerde de bovenstaande vloeistof ter bereiding van proefmonster 2U uur met water en 0,15 M fosfaatbufferoplos-30 sing.

II. Bepaling.

Bij elk van de onder I. boven verkregen proefmonsters voegde men een gelijk volume 0,15 M fosfaatbuffer, waarin opgelost 0,8 yg/ml pinda lectine (een produkt van E.Y. LABORATORIES 35 INC.) en leit het mengsel 30 min. onder roeren bij 20-37° C reageren.

8000536 10

Men verdunde het reactiemengsel met 0,15 M fosfaatbufferoplossing ter verkrijging van een reeks tweevoudige verdunningen, die men elk bracht op een V-vormige plaat in een hoeveelheid van 50 uX en onder g ' g roeren vermengde met 50 j£L konijnen erythrocyt (1 x 10 tot 2 x 10 5 cellen/ml). Nadat men de verdunning 1 uur bij 37° C had laten staan nam men in elke verdunning optredende erythrocyt agglutinering waar. Het maximum verdunningsgetal, waarbij de agglutinering nog optrad werd gedefinieerd als agglutineergetal en men maakte zijn beoordeling op grond van dit getal. De verkregen resultaten worden weergegeven 10 in onderstaande tabel A.

8000535 11 !

δ ί + II

δ > II

I H Ol I β

> I O' S

Η I , £ B

* ! + E *

I 5 "H

h I ® S

H J 'o s

Η I w *H

! ! *

B [ ♦ + 6 B

Η I

x ! + X i + § ! s ! s Η I + 0 U 0 i g Ö u " ® i 3 λ: « c I o> <S ! ia ® § ^ .S 8 3 g g* > }

s ϊ H ! g g a 5 8 i I

I "f- S Η 3 D 0« h! ^ J ! Ü Η H > * g I ♦ S S * S S S £ I +

> ί M

> i is 1 a * H o A! M ® Ϊ in u „ E ^ i n n ® n E « e h S ® ® aj ® n a: δ η ί ^ , a. x c x $ £ H ί ++ + e S fl ί 1 g X 4J Ai Ö * η ί t ί η I + + + $£&&£$&

+ ! Η H

i_i + + + I HH>HH

+ + + , WHHH>>> 1 1’ M § O ® 0 O' (j h e •Η Λ Ή +1 +) ^«(OfflflNOCO^NH x

00 N rt ΙΛ M U ΙΊ ή W

H Cl O ID CM »1 ® O' ^ §

g S

8000536 12 III. Observatie.

Als uit de resultaten van tabel A blijkt vertoonden alle gezonde personen een agglutineergetal van 128 of meer, terwijl kankerpatiënten veel lagere agglutineergetallen vertoonden dan 5 de gezonde. Zes van de zeven maagkankerpatiënten vertoonden een agglutineergetal van 8 of minder en de rest een van 32. Alle vier longkankerpatienten vertoonden een agglutineergetal van 1. Met betrekking tot andere kanker hadden bijna alle patiënten agglutineergetallen van 8 of minder met uitzonderingen met een agglutineergetal 10 van 32, waargenomen bij één patiënt met uteruskanker en een andere met primair maagsarcoom.

Als boven opgemerkt bedraagt het agglutineergetal, waargenomen bij patiënten met kwaadaardige tumor of kanker altijd 32 of minder, terwijl dat van gezonde personen 128 of meer bedraagt.

15 Deze methode geeft dan ook een doeltreffende werk

wijze voor het bepalen van de TAG spiegel in een lichaamsvloeistof-monster buiten het lichaam en kam dan ook goed worden gebruikt voor de diagnose van verschillende kwaadaardige tumoren of kankersoorten. Voorbeeld II

20 Bepaling onder gebruikmaking van met enzyme ge merkt lectine.

Referentietrap: I. Activering van peroxydase.

Bij 1 ml 0,3 M natriumwaterstofcarbonaatoplossing 25 in water, waarin 5 mg peroxydase was opgelost, voegde men 0,1 ml 0,1 M fluomitrobenzeenethanol-oplossing en roerde het mengsel zachtjes 1 uur bij kamertemperatuur. Daarna voegde men 1 ml 0,06 M natrium-perjodaatoplossing in water aan het mengsel toe en roerde 30 min. zachtjes bij kamertemperatuur. Het verkregen mengsel werd verder ver-30 mengd met 1 ml 0,1 M ethyleenglycoloplossing in water en 1 uur zachtjes bij kamertenroeratuur geroerd, waarna men het reactiemengsel 1 dag bij 4° dialyseerde met 0,01 M koolzuur-natriumwaterstocarbonaat-bufferoplossing (pH 9,5) teneinde een geactiveerd peroxydase preparaat te verkrijgen.

8000538 35 13 II. Meriting van lectine met per oxydase.

Men loste 5 mg pinda lectine op in 3 ml peroxydase preparaat, verkregen onder I. boven en roerde het mengsel 2-3 uur zachtjes bij kamertemperatuur ter reactie. Na toevoeging van 5 mg 5 NaBH. liet men het reactiemengsel 3 uur bij 4° C staan en dialyseerde 4 de verkregen oplossing gedurende een dag met 0,1 M Tris-HCl-buffer-oplossing (pH 7,4), waarna men het verkregen produkt onderwierp aan gelfiltratie onder gebruikmaking van Sephadex G 150 gel kolomchroma-tografie (elueermiddel: 0,1 M Tris-HCl bufferoplossing pH 7,4). De 10 optische dichtheden (οο280 β*1 °°493^ van elke verkregen fractie werden gemeten en de fracties waarvan de pieken van OD280 en OD403 e^aar overlapten, werden opgevangen.

III. Bereiding van agarosegel» 15 Men suspendeerde agarose (een produkt van Iwai

Kagaku Co., Ltd.) in een hoeveelheid van 1 gew*% in 0,01 M Tris-HCl bufferoplossing (pH 7,5) en verhitte de suspensie ter oplossing op 70-80° C. Bij deze oplossing voegde men 0,01 vol.% thimerosal en goot de verkregen oplossing uit in proefbuisjes in een hoeveelheid 20 van 1 ml/buis, waarna men het geheel bij kamertemperatuur liet staan ter bereiding van 1 gew.% agarosegel.

Voorbeeld II-1.

Polyethyleenglvcol methode.

25 I. Bereiding proefmonster.

Men nam 5 ml bloed van 25 kankerpatiënten, 2 patiënten met andere ziekten dan kanker en 23 gezonde personen onder (500 eenheden) gebruikmaking van een met heparinevbehandelde injectiespuit en centrifugeerde 10 min. bij 2000 omw./min. De verkregen bovenstaande 30 vloeistof (plasma) werd als proefmonster gebruikt.

II. Bepaling.

Het onder I. boven bereide proefmonster werd in twee proefbuizen gebeacht in een hoeveelheid van 200 ^1/buis, waarna 35 men telkens 50 jtl met peroxydase gemerkt lectine preparaat toevoegde, 8000536 14 dat 3,5 f*g/ml lectine in Tris-HCl bufferoplossing (pH 7,5) bevatte, bereid volgens de referentietrap van voorbeeld II, Na licht roeren liet men het mengsel 1 uur ter reactie bij 20-30° C staan. Daarna voegde men 250 μΐ toe van een oplossing van 8 % polyethyleenglycol 5 (molecuulgewicht 6000) in 0,1 M Tris-HCl bufferoplossing aan één van de proefbuizen en roerde het mengsel zachtjes onder vorming van monster A en voegde 250 μΐ 0,1 M Tris-HCl bufferoplossing toe aan een andere proefbuis en roerde het mengsel zachtjes ter vorming van monster B. Beide monsters A en B werden onder gebruikmaking van een 10 rotor van het zwaai-type 40-60 min, gecentrifugeerd bij 1000 g, waarna men de monsters ter reactie 30-60 min. bij 20-30° C liet staan.

50 /tl van de verkregen bovenstaande vloeistof werd verzameld en toegevoegd aan twee ml vooraf bereide fysiologische zoutoplossing. Nadat men het voldoende had geroerd vermengde men het mengsel met 50 /tl 15 substraatoplossing, bestaande uit 0,1 M citraatbufferoplossing, orthofenyleendiamine (eindconcentratie 6 gew.%) en 0,1 gew.% waterstof peroxyde en liet het geheel 30 min. in het donker bij 20-30° C reageren. De substraatoplossing was vooraf bereid en bij 4° C bewaard, wat de voorkeur verdient. Daarna voegde men 1 ml 2 N zoutzuur aan 20 het reactiemengsel toe teneinde de reactie te stoppen en mat de kleur van het monster spectrofotometrisch als optische dichtheid bij 492 nm.

De hoeveelheid TAG-lectine complex, gedefinieerd als verschil (c) verkregen door optische dichtheid (a) van monster A af te trekken van optische dichtheid (b) van monster B werd grafisch 25 uitgezet in fig. 1, waarin het symbool 0 gezonde personen voorstelt en de nummers 1 t/m 27 de volgende patiënten betekenen: 1 en 18 maagkanker, 2, 6, 9, 16 en 17 longkanker, 3, 5, 7, 8 en 13 maagkanker (vroeg stadium), 4 en 14 voortschrijdende maagkanker, 10 hartgebre-ken, 11 lymphadenitis, 12 dikke darm kanker, uitgezaaid naar de lever, 30 15 uteruskanker uitgezaaid naar de long, 19 hydatideenmol, 20 dikke darm kanker, 21 uteruskanker, 22 en 26 ovariumkanker, 23 rectaal kanker, 24 prostaatkanker, 25 urethraal kanker en 27 hepatoom.

Uit de resultaten van fig. 1 blijkt, dat monsters met een hogere c-waarde dan waargenomen bij de monsters van gezonde 35 personen TAG in grotere hoeveelheden bevatten dan de monsters van 8000536 15 gezonde personen. Hiermee wordt sterk gesuggereerd, dat personen met hoge c-waarden tumor of kankercellen hebben.

Voorbeeld II-2

Gelfiltratie methode.

5 I. Men verzamelde bloed van 14 patiënten met kanker en 8 gezonde personen en bereicie daaruit proefmonsters op dezelfde wijze als in voorbeeld II.

II. Bepaling.

Men vermengde 5 1 verdunning van het proefmonster, 10 dat onder I. boven bereid was en 10.000 maal verdund was met H-oplos-sing, die bestond uit gedestilleerd water, waarin opgelost 8 % natriumchloride, 0,4 % kaliumchloride, 0,05 % natriumwaterstoffosfaat, 0,06 % kaliumdiwaterstoffosfaat, 0,05 % magnesiumsulfaat, 0,05 % magnesiumchloride, 0,1 % calciumchloride en 1 % glucose, met 50 jtl 15 met peroxydase gemerkt lectinepreparaat, dat bereid was volgens de referentietrap van voorbeeld II en 100 maal verdund was met 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,4) en 15 min. in een waterbad geincu-beerd was bij 23° C. Het verkregen mengsel werd 15 min. bij 23° C in een waterbad geincubeerd en daarna langzaam gebracht op het opper-20 vlak van agarosegel, bereid volgens de werkwijze van de referentietrap van voorbeeld II. Na de proefbuis, die de gel bevatte, 1 uur in een waterbad bij 23° C geincubeerd te hebben voegde men 2 ml 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,4) toe aan de agarosegel, die men daarna roerde. De bovenstaande vloeistof werd onmiddellijk overgebracht naar 25 een schone proefbuis, waaraan men vervolgens 400 y, 1 substraatoplos-sing voor peroxydase toevoegde, bereid volgens de referentietrap van voorbeeld II. Nadat men het voldoende had geroerd liet men het mengsel ter reactie 15 min. bij kamertemperatuur staan. De enzyme-reactie werd gestopt met 1 ml 1 N zoutzuur en het reactiemengsel 30 werd voldoende geroerd onder gebruikmaking van een thermomenger of iets dergelijks. Men mat de optische dichtheid van het aldus behandelde mengsel onder gebruikmaking van een spectrofotometer bij 492 nm. Als blanco gebruikte men een mengsel van 400 ml substraatoplossing en 1 ml 1 N zoutzuur. De verkregen optische dichtheidswaarden werden 35 op dezelfde wijze verwerkt als in voorbeeld II-1 en de berekende 8000536 16 hoeveelheid TAG-lectine werd grafisch uitgezet in fig. 2, waarin symbool 0 wijst op gezonde personen en nrs. 1-10 de volgende patiënten aangeven: 1. maagkanker, 2. hydatideenmol, 3. dikke darm kanker, 4. uterus-5 kanker, 5. ovariumkanker, 6. rectaal kanker, 7. prostaatkanker, 8. urethraalkanker, 9. hepatoom en 10. borstkanker.

Uit de resultaten van fig. 2 blijkt, dat er een opmerkelijk verschil bestaat in TAG spiegel in lichaamsvloeistof tussen gezonde personen en de verschillende kankerpatiënten.

10 De uitvinding kan in de praktijk worden toegepast in klinische laboratoria bij de bepaling van TAG-spiegels in lichaamsvloeistoffen als bloedserum of plasma.

15 3000536

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen van de spiegel van met tumor gepaard gaande glycobrug bevattende stof (TAG) in een lichaamsvloeistofmonster, met het kenmerk, dat men de TAG in een 5 lichaamsvloeistofmonster met een lectine laat reageren onder vorming van een TAG-lectine complex en de hoeveelheid TAG-lectine complex of niet gereageerd hebbend lectine meet.

2. Werkwijze volgens conclusie 1# met het kenmerk, dat men TAG van het lichaamsvloeistofmonster scheidt en het geschei- 10 den TAG met lectine laat reageren.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een gemerkt lectine gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het lectine gemerkt is met een enzyme, een fluorescerende stof 15 of„een radio-actieve stof.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men aan de lichaamsvloeistof een beschermend proteïne toevoegt.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de lichaamsvloeistof bloed, weefselvloeistof, lvmpfen, hydro- 20 thorax,ascites, amniotische vloeistof, maagsap, urine, pancreassap, cerebrospinaal vloeistof of speeksel is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk. dat de lichaamsvloeistof bloedserum of bloedplasma is.

8. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, 25 met het kenmerk, dat men de reactie gedurende tenminste 30 min. bij 45° c uitvoert.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat men de reactie bij 4-40° C uitvoert.

10 N-acetylglucosaminegroep of Sephadex of glasparels, die daarmee zijn bedekt.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, 30 dat men de reactie bij 20-40° C uitvoert.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk. dat men de reactie 60-90 min. uitvoert.

12. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men een lectine gebruikt, dat specifiek kan binden met 35 galactose- (β 1+3 of 81-*-4)-N-acetylglucosaminebrug. 8000536

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de lectine pinda lectine of lectine van Ricinus communis is.

14. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, 5 dat men de hoeveelheid niet gereageerd hebbend lectine bepaalt door agglutinering van het niet gereageerd hebbende lectine.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men het niet gereageerd hebbende lectine laat agglutineren met een glycoprotelne met een eindstandige galactose-(31+3 of 81+4)-

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat men als glycoprotelne konijnen erythrocyt of met neuraminidase behandeld schapen erythrocyt gebruikt.

17. Werkwijze volgens conclusie 4, met het ken merk, dat het enzymo glucoamylase, glucose-oxydase, peroxydase, alkalisch fosfatase of hemeoctapeptide of een actief fragment daarvan is.

18. Werkwijze volgens conclusie 4, met het ken-20 merk, dat men als fluorescerende stof fluoresceine, fluorescelne waterstofthiocyanaat of dansylchloride gebruikt.

19. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als radio-actieve stof radio-actief jodium of tritium gebruikt.

20. Werkwijze volgens conclusie 17. met het ken merk, dat het enzyme peroxydase is.

21. Werkwijze voor de diagnose van kanker met het kenmerk, dat men de TAG spiegel bepaalt in een lichaamsvloeistof-monster volgens de werkwijze van voorbeeld I en de verkregen TAG 30 spiegel vergelijkt met die van gezonde personen.

22. Pakket ter bepaling van de TAG spiegel in een lichaamsvloeistof met het kenmerk, dat het lectine bevat als specifiek agglutineermiddel voor TAG.

23. Pakket volgens conclusie 22, met het kenmerk, 35 dat de lectine gelyofiliseerd is en het pakket bovendien een 8000536 « e reconstitueermiddel bevat, dat een op water gebaseerd of met water vermengbaar oplosmiddel bevat.

24. Pakket volgens conclusie 22. met het kenmerk, dat de lectine pinda lectine is.

25. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk» dat men een TAG fractie uit de lichaamsvloeistof afscheidt, de vloeistof met gemerkt of ongemerkt lectine laat reageren, het niet gereageerd hebbende lectine van het reactjunengsel scheidt en de hoeveelheid niet gereageerd hebbend lectine of met TAG gereageerd 10 hebbend lectine meet.

26. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een lichaamsvloeistof met gemerkt of ongemerkt lectine laat reageren, het gereageerd hebbende lectine op een gel van het niet gereageerd hebbende lectine scheidt en de hoeveelheid gereageerd 15 hebbend of niet gereageerd hebbend lectine meet. 8000536