SE451508B - Bestemning av substanser med tumorassocierade glykobindningar medelst lektiner som specifikt binder till terminala galaktos (beta 1 - 3 eller beta 1 - 4)-n-acetylglukosamin- eller -n-acetylgalaktosamingrupper samt cance - Google Patents

Description

451 509 tativ metod för bestämning av TAG-halter i kroppsvätskor, som har bred tillämpning.

Med beaktande av det förhållandet att i kroppsvätskorna hos individer eller patienter med cancer förefinnes TAG bildad av icke differentierade celler (för det mesta cancerceller) och dessa frigöras inli kroppsvätskan och att TAG drastiskt skil- jcr sig från substanser innehållande glykobindningar, vilka bildas av differentierade celler (för det mesta normala cel- ler) och frigöras in i kroppsvätskorna, med avseende på den kemiska strukturen i sockerkedjan, dess längd och sammansätt- ningen av sockerdelarna, har omfattande forskning utförts, vilken lett till upptäckten att TAG har en galaktos-(Bl-93 eller Bl-04)-N-acetylglukosamin-avslutande grupp och bindes specifikt till lektiner och att TAG-halten i ett prov av kroppsvätska kan bestämmas genom reaktion av TAG med en lek- tin. TAG-halten indikerar närvaro eller frånvaro av cancer- celler, deras livskraft och ökning och minskning därav samt medger framgångsrik diagnos av olikartade cancertyper eller tumörer. Föreliggande uppfinning är baserad på den ovannämnda upptäckten.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahållas sålunda ett ,sätt för bestämning av TAG-halten i ett prov av kroppsvätska, vilket innefattar att man bringar TAG i ett prov av kropps- vätskan att reagera med jordnötslektin (PNA) eller ricinbön- lektin (RCA) till bildning av ett TAG/lektin-komplex samt mäter mängden TAG/lektin-komplex eller icke-reagerat lektin medelst agglutinering eller en märkt substans för lektin, varvid TAG utgöres av sockerrester med en bindningsspeci- ficitet för PNA eller RCA eller med socker besläktade sub- stanser som innehåller nämnda sockerrester såsom en ändgrupp.

Figur l i de bifogade ritningarna utgör en kurva som repre- senterar de mängder TAG som bestämts enligt exempel l nedan och figur 2 utgör en grafisk representation av de mängder TAG som bestämmes enligt exempel 2 nedan. 451 508 Olikartade kroppsvätskor kan användas enligt uppfinningen.

Exempel på lämpliga kroppsvätskor innefattar blod, Vävnads- vätskor, lymfa, hydrothorax, ascites, amniotisk vätska, mag- saft, urin, pankreas-vätska, cerebrospinal-vätska, saliv etc.

Av dessa vätskor föredrages blod, särskilt i form av serum eller plasma.

Den mängd kroppsvätska som användes för prov är vanligen ungefär l till ungefär 10 ml, företrädesvis 2 - 5 ml.

Enligt uppfinningen kan bestämning av TAG-halten i ett prov av kroppsvätska utföras antingen genom isolering eller sepa- ration av TAG från kroppsvätskan genom reaktion därav med en lektin till bildning av ett TAG-lektin-komplex och bestämning av mängden TAG-lektin-komplex eller icke reagerad lektin efter separation därav, eller genom tillsats av märkt lektin till provet av kroppsvätska direkt till bildning ev ett' TAG- märkt lektin-komplex, separation av det erhållna TAG~märkt lektin-komplexet eller icke reagerat märkt lektin och be- stämning av mängden därav.

För att separera TAG-fraktionen från ett prov av kroppsvätska kan man använda konventionella metoder för extraktion eller separation av glykobindningshaltiga substanser såsom utsalt- ning, fällning, extraktion med lösningsmedel, centrifugering, dialys, molekylsiktning, enzyminaktivering etc. eller en kom- bination av två eller flera därav. Exempelvis kan en TAG- fraktion erhållas genom tillsats av en för fällning eller denaturering effektiv mängd sulfosalicylsyra, trikloro- ättiksyra eller zinksulfat till blodserum eller blodplasma eller upphettning av blodserum eller blodplasma för fällning av albumin, immunoglobulin och liknande, avlägsnande av de fällda proteinerna genom filtrering och dialys av filtratet.

När man använder ett märkt lektin kan andra kroppsvätskor än blod användas såsom testprov (nedan betecknat "prov“).

Det föredrages emellertid att tillsätta ett protein med låg 451 508 sockerhalt, såsom bovin-serumalbumin (BSA), etc. såsom ett skyddsprotein för att förhindra denaturering av provet och samtidigt befrämja reaktionen med lektin. Företrädesvis 1.41 sättes en lämplig mängd av skyddsproteinet till proven efter avlägsnande av albuminer, immunoglobuliner, etc. från proven, eftersom detta medger bestämning under mer reglerade beting- ” elser.

Vid användning av blodprov kan man såsom prov använda blod- serum erhållet enligt den konventionella metoden för ut- vinning av blodserum eller blodplasma som erhållits enligt den konventionella metoden för utvinning av blodplasma med användning av ett antikoaguleringsmedel såsom heparin, EDTA, citronsyra, etc., varvid blodplasma som erhållits med använd- ning av heparin såsom ett antikoaguleringsmedel föredrages.

Proven kan utspädas med vatten eller med lämpliga vattenhal- tiga buffertlösningar om så är nödvändigt eller önskvärt, t.ex. när TAG-halten är relativt hög såsom vid ascites, etc.

Enligt uppfinningen kan man använda de lektiner, som speci- fikt kan kombineras med galaktos-(Bl-i3 eller Bl-?4)-N- acetylglukosamin såsom beskrives i J.B.C., 250, 8518 - 8523 (l975); Biochem. Biophys. Res. Com., 62, 144 (l975); Z.

Immunitätsforsch. 138, 423 - 433 (l969); Br. J. Exp. Pathol, 27, 228 - 236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, nr 5, 2215 - 2219 (l978); Biochemistry 13, 196 - 204 (1974), etc. exempelvis jordnötslektin, ricinbönlektin (Ricinus comunis) etc. substanser som kan användas för att märka lektiner och där- igenom göra dem påvisbara radiometriskt, fluorimetriskt, kolorimetriskt och liknande är enzymer, fluoriserande sub- stanser och radioaktiva substanser. Exempel på lämpliga enzy- mer innefattar glukoamylas, glukosoxidas, peroxidas, alka- å; liskt fosfatas, ß-galaktosidas, hemoktapeptid, etc. och akti- va delar därav. Exempel på lämpliga fluoriserande substanser innefattar fluorescein, fluoresceinisotiocyanat, rodamin, dansylklorid (dvs. 5-dimetylamino-l-naftalensulfonylklorid), 451 508 etc. Exempel på lämpliga radioaktiva substanser innefattar radioaktivt jod, tritium, etc. För att märka lektiner med de ovan beskrivna märkande substanserna kan varje konventionell metod för märkning av kända proteiner användas, såsom anti- gener och antikroppar med enzymer, fluoriserande substanser och radioaktiva substanser. Exempelvis kan lektiner märkas med radioaktiva isotoper enligt den metod som beskrives i Kazuo Shizunome och Yuichi Kumahara: "Radioimmunoassay", sid 45 - 56 (1978), publicerad av Asakura Publishing Co., Tokyo.

Vid sättet enligt uppfinningen användes märkta eller icke märkta lektiner företrädesvis i blandning med lämpliga lös- ningsmedel. Varje lösningsmedel som inte denaturerar märkta eller icke märkta lektiner kan användas, exempelvis fysiolo- gisk saltlösning, vatten, 0,1 M Tris-HCl-buffrad lösning (pH ungefär 7,5), 0,1 M fosfatbuffert-lösning (pH ungefär 7,4) etc. Mängden lektin i lösningsmedlet eller utspädnings- medlet kan väljas beroende på agglutinationsvärdet (som de- finieras med avseende pâ en slutlig eller maximal utspäd- ning av i serie 2-faldigt utspädda prov). typen av märkning eller de substanser som skall bestämmas etc. och är vanligen ungefär 0,01 till ungefär 100 ug/ml, företrädesvis 0,03 - 40 ug/ml. De ovan angivna märkta eller icke märkta lektin- lösningarna kan ytterligare utspädas.

För att tillämpa sättet enligt uppfinningen blandas en förut bestämd mängd TAG-fraktion eller kroppsvätska per se med en given mängd lektin resp. märkt lektin och den erhållna bland ningen får stå för reaktion vid ungefär 45°C eller därunder, företrädesvis vid ungefär 4 - 40°C, mest föredraget ungefär 20 - 4000. Det märkta eller icke märkta TAG-komplexet eller det icke reagerade märkta eller icke märkta lektinet kan se- pareras från reaktionsblandningen på varje konventionellt separationssätt, exempelvis genom kromatografering, elektro- fores, utsaltning, fraktionering, dialys, gelfiltrering, adsorption eller en kombination därav eller genom en separa- 451 508 tionsmetod med användning av agargel, agarosgel eller poly- ukrylamidgel.

För separation av icke reagerat märkt eller omärkt lektin från reaktionsblandningen kan närmare bestämt en lämplig mängd av ett fällningsmedel för TAG-lektin-komplexet sättas till den ovan angivna reaktionsblandningen och det erhållna komplexet avlägsnas, exempelvis genom centrifugering varvid man erhåller den icke reagerade märkta eller icke märkta lektin-fraktionen såsom en överflytande vätska. Representa- tiva fällningsmedel är polyetylenglykol, ammoniumsulfat (till mättnad), "Rivanol“ (akrinol), etc. Betingelserna för centrifugeringen kan väljas lämpligt beroende på de använda fällningsmedlen. När exempelvis polyetylenglykol användes såsom fällningsmedel föredrages det att utföra centrifuge- ringen vid ungefär l.0OO G i ungefär 30 - 60 minuter.

När TAG-märkt eller icke märkt lektin-komplex isoleras från icke reagerat lektin kan komplexet separeras med lätthet från icke reagerat lektin med användning av skillnaden med avseende på diffusionshastighet mellan komplexet och icke reagerat lektin på agargel, agarosgel eller polyakrylamid- gel. När reaktionsblandningen skiktas på gelen i ett kärl diffunderar närmare bestämt icke reagerat lektin in i gelen under det att TAG-lektin-komplexet förblir på gelen, d.v.s. utanför gelen och utan att diffundera. De kan sålunda sepa- reras från varandra med lätthet på konventionellt sätt. Det förefinnes ingen begränsning med avseende på framställning av gelerna och konventionellt använda metoder kan användas för detta ändamål. Exempelvis sättes en viss mängd agar, agaros eller polyakrylamid till ett utspädningsmedel, som inte förorsakar denaturering av proteinerna, t.ex. destillerat vat- ten, citrat- eller Tris-HCl-buffert-lösning (pH ungefär 7,5) etc., åtföljt av upphettning vid 60 - 80°C under försiktig om- rörning för upplösning och lösningen uthälles i ett lämpligt kärl såsom ett provrör och får svalna till stelning i form av en gel. Gelens koncentration väljes i beroende av dimensionen 451 sus (t.ex. molekylvikten, stereostrukturen etc;) för den märkande substansen och det TAG-märkta lektin-komplexet. Enligt upp- finningen användes vanligen geler med ungefär 0,4 - 2,0 vikt- procent, företrädesvis 0,7 - 1,0 viktprocent..Den erhållna gelen kan innehålla ett konserveringsmedel om så är önskvärt eller nödvändigt. Den så framställda gelens yta kan vara platt eller konkav, varvid den senare formen föredrages emedan de komplex som bildas inte häftar till kärlets vägg.

Mängden TAG-märkt eller icke märkt lektin-komplex eller icke reagerat märkt eller icke märkt lektin bestämes på konven- tionellt sätt och TAG-halten i kroppsvätskan kan beräknas från det erhållna värdet.

För mätning av mängden kvarvarande icke märkt lektin kan olika metoder användas. Det föredrages emellertid att till proven sätta en substans som kan reagera specifikt med lek- tinet för agglutinering eller fällning av detsamma, varvid man iakttar förändringen visuellt eller mäter med användning av optisk analys, t.ex. den optiska densiteten. Exempel på lämpliga lektin-agglutinerande substanser innefattar gluko- proteiner med en galaktos-(Bl-93 eller ßl-+4)-N-acetyl- glukosamin-ändgrupp, exempelvis kaninerytnxyt, neuraminidas- behandlad fårerytrocyt etc., samt "Sephade ", glaspärlor etc. belagda med de ovan beskrivna glykoproteinerna.

I praktiken kan denna metod utföras på följande sätt. Den ovan beskrivna reaktionsblandningen utspädes i serie med 2- faldig utspädning med ett utspädningsmedel, t.ex. 0,15 M fosfatbuffert-lösning, fysiologisk saltlösning etc., och an- delar av denna utspädning placeras på V- eller Ü-formiga. plattor eller objektglas eller i små provrör eller liknande och vart och ett blandas med en substans som kan agglutinera lektinet specifikt under omrörning och plattorna eller lik- nande uppvisande blandningen får därefter stå vid 45°C eller därunder, företrädesvis 4 - 40°C i 30 minuter eller mer, före- trädesvis 60 - 90 minuter, varvid man iakttar den slutliga 451 508 eller maximala utspädning vid vilken agglutinering fort- farande sker. Denna maximala utspädning definieras såsom agglutinationsvärdet. De lektiner som kan användas enligt uppfinningen uppvisar väsentligen samma agglutinationsvärde.

När märkta lektiner användas kan bestämningen av TAG-halten utföras enligt en metod som är lämplig för mätning av märkta substanser för lektiner. Efter separation av TAG-lektin- komplex och icke reagerat märkt lektin från varandra kan exem- pelvis mängden TAG-märkt lektin-komplex eller icke reagerat märkt lektin bestämmas genom utval av ett lämplig substrat för ett enzym, vilket substrat kan analyseras kolorimetriskt eller fluorimetriskt och bestämning av enzymets aktivitet när lektiner är märkt därmed; genom bestämning av intensiteten för fluoriscensen när lektinet är märkt med ett fluorise- rande medel; eller genom bestämning av radioaktiviteten när lektiner är märkt med en radioaktiv substans. När exempelvis ett enzym (t.ex. peroxidas) användes för märkning av lektin droppas en förutbestämd mängd av reaktionsblandningen på gelens yta i ett provrör och får stå vid ungefär rumstempera- tur, företrädesvis 4 - 25°C, i l - 48 timmar. Därefter sättes en given mängd av ett lämpligt substrat för enzymet (t.ex. väteperoxid) till den så behandlade reaktionsblandningen för att åstadkomma enzymatisk reaktion åtföljt av avbrytning av densamma efter en lämplig tidsperiod och den optiska densite- ten för den erhållna blandningen bestämmes om så erfordras med användning av ett färgämne eller en färgbildare (t.ex. o-fenylendiamin). När en fluoriserande substans användes för märkning av lektin sättes alternativt en förutbestämd mängd utspädningsmedel såsom en buffert-lösning till reaktions- blandningen på gelen efter inkubering och fluorescensintensi-_ teten för den erhållna blandningen mätes.

Ett särskilt lämpligt förfarande för att utföra den beskrivna metoden är med användning av ett testset för bestämning av TAG i en kroppsvätska, t.ex. plasma eller serum. Ett sådant testset kan innehålla ett reagens innehållande ett växt- 451 508 lektin såsom ett specifikt agglutinerande medel för TAG.

Lektinreagenset kan även innehålla en stabilisator och/eller ett konserveringsmedel för lektin, såsom proteiner med låg sockerhalt, t.ex. bovint serum-albumin. Vid en föredragen ut- föringsform kan detta växt-lektinreagens lyofiliseras och ett âterbildande medel innehållande en vattenbaserad eller ett med vatten blandbart lösningsmedel (pH ungefär 6 - 7,8, företrädesvis 7 - 7,2) kan även innefattas i testsetet. Rea- gensen kan eventuellt även innehålla buffertar för upprätt- hållning av det återbildade reagenssystemet vid ett reglerat pH och konserveringsmedel och/eller stabilisatorer avsedda att förhindra förstöring av materialet före användning. Även om buffert-medel inte anses vara en kritisk komponent i test- setreagenserna användes företrädesvis ett pH av ungefär 6 - 7,8, mer föredraget 7 - 7,2, vid utförande av sättet enligt uppfinningen. Det âterbildande reagenset kan före- trädesvis innehålla vatten såsom lösningsmedel. Exempelvis kan fysiologisk saltlösning, fosfatbuffert-lösning etc. an- vändas såsom âterbildande medel. Vidare kan man tillsätta ett med vatten blandbart lösningsmedel som inte ogynnsamt på- verkar reaktionen.

Såsom angetts ovan kan TAG-halten i ett prov av kroppsvätska med fördel bestämmas enligt uppfinningen. Uppfinningen, som medger identifikation av tumörassocierade glykobindningar kan vidare användas för olikartade cancer-typer eller tumörer i jämförelse med konventionella metoder eller system som an- vänder antigenisiteten och huvudsakligen utnyttjar glyko- proteinernas proteindel såsom CEA, al-foetoprotein etc. och metoden kan användas för diagnos av varje typ av cancer eller tumör såsom gastrisk cancer, bröstcancer, koloncancer, rektalfi cancer, äggstockscancer, cancer i munhålan, tungcancer, strup- cancer, prostatacancer, liposarkom, malign melanom, malign lymfom, gastrisk primär sarkom, hepatom etc. i deras tidiga till sena stadier, vilket sker med lätthet och sålunda är uppfinningen mycket användbar för att påvisa cancerarter i deras initiella stadier. 451 sas 10 Uppfinningen beskrives närmare i detalj under hänvisning till efterföljande exempel. Om inte annat anges hänför sig delar och procenttal till vikten.

Exempel l Bestämning med användning av inhiberingsreaktion för blodcellagglutinering (i) Framställning av ett testprov Blod tillvaratogs från var och en av sju patienter med gastrisk cancer, fyra patienter med lungcancer, tre patienter med bröstcancer och en patient vardera med koloncancer, rek- tal cancer, livmodercancer, munhålecancer, tungcancer, strup- cancer, äggstockscancer, prostatacancer, malign melanom, liposarkom, malign lymfm och gastrisk primär sarkom samt sju friska personer och plasmaprov framställdes på konven- tionellt sätt. Till plasmaproven sattes en 6%-ig vattenlös- ning av sulfosalicylsyra portionsvis under omrörning tills proportionen mellan tillsatsmedel och plasma blev l:l, beräk- nat på volymen. Efter omrörning i tillräcklig utsträckning centrifugerades blandningen vid 3.000 - 3.500 varv i l0 minu- ter och den överflytande vätskan dialyserades med vatten och 0,15 M fosfat-buffert-lösning i 24 timmar för framställning av testprover. (ii) Bestämning Till vart och ett av de enligt (i) ovan erhållna testproven sattes en lika volym 0,15 M fosfat-buffert-lösning, vari lösts 0,8 ug/ml jordnötslektin (en produkt från E.Y. Labora- tories, Inc.) och blandningen bringades att reagera under om- rörning vid 20 - 37°C i 30 minuter. Reaktionsblandningen ut- späddes med en 0,15 M fosfat-buffert-lösning för erhâllning av en serie av två-faldiga utspädningar av vilka var och en placerades på en V-formad platta i en mängd av 50 ul och blandades med 50 ul kaninerytrocyt (l x 108 till 2 x 108 celler/ml) under omrörning. Efter utspädning vid 37°C i l time iakttogs förekomst av agglutinering av erytrocyt i varje 451508 ll utspädning. Maximalt utspädningsvärde, varvid agglutinering fortfarande skedde, definierades såsom agglutineringsvärdet och bedömningen gjordes med användning av detta värde. Resul- taten anges i tabell 1 nedan. 12 Eomsæfl nmflamñ >N Hmoømomfiuvm N Hmufimonoflox > Eüflmawä Gwflfimä >HN uwuflmumfißu NH Hwunmumfidfl >H E0xHmm Eøxummomwa HHHM _äÄmähë~fl Hmunmu HHH> Hmuflmuvmwun HHH Mwäflnm nw0nmomum#mOHm HHN uwuflmomxooummmw HH> nwocæu Mmfluummm HH Mmfiuflmmm H>N um0cmuHw©0E>flH HM Hmocmu Hmuxwn H> Gowumm xmflnw H .#02 + + + + + -+ +++§ + +++ a N + 4 w + +. + + + +++ m ofi + + + Nm | . . - | . . | | . | . . | | | | | . . | | | | . | . | « | | . . | - | | « . | | . » | . . . | | . . 1 | . | » . | . | | . . | | | | | . « | « | » » . » | »| wo +++ wwfi omm ++ N~m ++ QNCH å lm wl; .å .ä J: ä; Ham, lå :ä 4,» ä. Ü |H| :H1 -mmfifimgflpwmwww 451 508 , umšoxwumh H Hfiwflmß 451 508 13 (iii) Iakttagelser Det framgår klart av resultaten ovan i tabell 1 att samtliga friska personer hade agglutineringsvärden av 128 eller där- över, under det att patienter med cancer uppvisade mycket lägre agglutineringsvärden än de friska: sex av sju patienter med gastrisk cancer visade ett agglutineringsvärde av 8 eller lägre och återstoden hade ett värde av 32. Samtliga fyra patienter med lungcancer hade ett agglutineringsvärde av l.

Vad beträffar de övriga cancertyperna hade nästan samtliga patienter agglutineringsvärden av 8 eller därunder med undan- tag för ett agglutineringsvärde av 32 som erhölls med en patient med livmodercancer och en annan med gastrisk primär sarkom.

Såsom angetts ovan var det iakttagna agglutineringsvärdet för patienter med maligna tumörer eller cancertyper alltid 32 eller därunder under det att de friska personerna hade ett värde av 128 eller däröver._ Av denna anledning utgör denna metod ett effektivt sätt att bestämma TAG-halten i ett prov av kroppsvätska utanför krop- pen och kan användas för diagnos av olika maligna tumörer eller cancertyper.

Exempel 2 Bestämning med användning av enzym-märkt lektin Referenssteg: (i) Aktivering med peroxidas Till l ml av en 0,3 M vattenlösning av natriumvätekarbonat, vari lösts 5 mg peroxidas härrörande från pepparrot sattes 0,1 ml 0,1 M fluorodinitrobensenetanol-lösning och bland- ningen omrördes försiktigt i 1 timma vid rumstemperatur. Där- efter försattes blandningen med 1 ml 0,06 M vattenlösning av NaJ04 varefter omrördes försiktigt vid rumstemperatur i 30 minuter. Den erhållna blandningen blandades ytterligare med l ml 0,1 M vattenlösning av etylenglykol och omrördes för- 451 508 14 siktigt vid rumstemperatur i 1 timma âtföljt av dialys av reaktionsblandningen med 0,01 M karbonsyra/natriumvätekarbo- nat-buffert-lösning (pH 9,5) vid 400 i en dag för erhållning av en aktiverad peroxidas-beredning. n! (ii) Märkning av lektin med peroxidas 5 mg lektin (jordnötslektin) löstes i 3 ml av den enligt (i) ovan erhållna peroxidas-beredningen och blandningen omrördes försiktigt vid rumstemperatur i 2 - 3 timmar för reaktion.

Efter tillsats av 5 mg NaBH4 därtill fick reaktionsblandningen stå vid 400 i 3 timmar och den erhållna lösningen dialysera- des med O,l M tris-HCl-buffert-lösning (pH 7,4) under en dag varefter den underkastades gelfiltrering med användning av en "Sephade G 150"-gel-kolonnkromatografi (elueringsmedel: 0,1 M Tris-HCl-buffert~lösning pH 7,4). Optiska densiteter (0D28O och 0D4O3) för varje erhâllen fraktion bestämdes och de fraktioner vars toppar vid 0D28o och 0D4O3 överlappade varandra tillvaratogs. (iii) Framställning av agarosgel Agaros (en produkt från Iwai Kagaku Co., Ltd.) suspenderades i 0,0l M Tris-HCl-buffert-lösning (pH 7,5) i en mängd av 1% (beräknat på vikten) och suspensionen upphettades vid 70 - 80°C för upplösning. Till denna lösning sattes 0,01 volymprocent timerosal och den erhållna lösningen uthälldes i provrör i en mängd av l ml/rör varefter de fick stå vid rumstemperatur för framställning av 1% agarosgel (beräknat på vikten). 451 5-08 15 Exempel 2-l Polyetylenglykolmetoden (i) Framställning av testprovet S ml blod togs från var och en av de 25 patienterna med cancer, 2 patienter med andra sjukdomar än cancer och 23 friska perso- ner med användning av en spruta behandlad med heparin (500 enheter) och centrifugerades vid 2.000 varv per minut i 10 minuter. Den överflytande vätskan (plasman) användes såsom testprov. i (ii) Bestämning Testprovet enligt (i) ovan infördes i två provrör i en mängd av 200 ul/rör vartill sattes 50 ul vardera av den peroxidas- märkta lektin-beredningen innehållande 3,5 Vä/ml lektin i tris-HCl-buffert-lösning (pH ungefär 7,5) framställd enligt referenssteget i exempel 2. Efter försiktig omrörning fick blandningen stå vid 20 - 3000 i l timma för reaktion. Där- efter sattes 250 ul av en lösning av 8% (vikt/volym) poly- etylenglykol (molekylvikt 6.000) i 0,1 M Tris-HCl-buffert- lösning till ett av provrören och blandningen omrördes för- siktigt för erhâllning av ett prov A och 250 ul 0,1 M tris- HCl-buffert-lösning sattes till ett annat-provrör och bland- ningen omrördes försiktigt till bildning av prov B. Båda pro- ven A och B centrifugerades i 40 - 60 minuter med användning av en svängtypsrotor vid 1.000 G efter att proven fått stå vid 20 - 30°C i 30 - 60 minuter för reaktion. 50 ul av den erhållna överflytande vätskan tillvaratogs och sattes till 2 ml fysiologisk saltlösning som färdigställts i förväg. Efter tillräcklig omrörning blandades blandningen med 500 ul av en substratlösning bestående av 0,l M citratbuffert-lösning, ortofenylendiamin (slutlig koncentration 6 viktprocent) och 0,1 viktprocent väteperoxid och fick reagera vid 20 - 30°C i 30 minuter i mörker. Substratlösningen framställdes i förväg och lagrades vid 400, vilket föredrages. Därefter sattes l ml 2N klorvätesyra till reaktionsblandningen för att avbryta reaktionen och provets färg bestämdes spektrofotometriskt på 451 508 16 basis av optisk densitet vid 492 nm.

Mängden TAG-lektin-komplex definierades såsom den skillnad Q (c) som erhölls genom subtraktion av den optiska densiteten (a) för prov A från den optiska densiteten (b) för prov B och I: värdena infördes i ett diagram, figur 1, vari symbolen 0 betecknar friska personer och siffrorna (1) till (27) beteck- nar följande patienter: (l) och (18) gastrisk cancer; (2), (6), (9), (16) och (17) lungcancer; (3), (5), (7), (8) och (13) gastrisk cancer (tidigt stadium); (4) och (14) progressiv gastrisk cancer; (10) hjärtsvikt; (ll) lymfadenitis; (12) koloncancer som metastaterats i levern; (15) livmodercancer som metastaterats i lungan; (19) hydatidenmol; (20) kolon- cancer; (21) livmodercancer; (22) och (26) äggstockscancer; (23) rektal cancer; (24) prostatacancer; (25) uretral cancer; samt (27) hepatom.

Av de resultat som visas i figur 1 framgår att de prov som visar högre (c)-värde än som observerats i prov från friska personer innehölla TAG i större mängder än proven från friska personer. Detta synes klart visa att personer med ett högt '(c)-värde har tumör- eller cancer-celler.

Exempel 2-2 Gelfiltreringsmetod (i) Blod tillvaratogs från 14 patienter med cancer och 8 friska personer och testprov framställdes därav på samma sätt som i exempel 2. (ii) Bestämning Den femte ul av utspädning av testproven framställda enligt (i) ovan och utspädda 104 gånger med H-lösning bestående av destillerat vatten vari lösts 8% natriumklorid, O,4% kalium- klorid, 0,05% natriumvätefosfat, 0,06% kaliumdivätefosfat, 0,05% magnesiumsulfat, 0,05% magnesiumklorid, 0,1% kalcium- klorid och 1% glukos blandades med 50 ul av den peroxidas- ~ märkta lektin-beredningen som framställts enligt referens- 451 508 l7 steget i exempel 2, utspädd 100 gånger med 0,1 M fosfatbuffert- lösning (pH 7,4) och inkuberades l5 minuter i ett vattenbad vid 23oC. Den erhållna blandningen inkuberades i 15 minuter i ett vattenbad vid 23°C och påfördes därefter försiktigt på ytan av en agarosgel framställd enligt referenssteget i exem- pel 2. Efter inkubering av provröret innehållande gelen i ett vattenbad vid 23°C i l timma tillsattes 0,1 M fosfatbuffert- lösning (pH ungefär 7,4) till agarosgelen, vilken därefter omrördes. Den överflytande vätskan överfördes omedelbart till ett rent provrör, vartill sattes 400 ul av substratlösningen för peroxidas framställd enligt referenssteget i exempel 2.

Efter omrörning i tillräcklig utsträckning fick blandningen stå vid rumstemperatur i 15 minuter för reaktion. Den enzyma- tiska reaktionen avbröts med l ml lN klorvätesyra och reak- tionsblandningen omrördes tillräckligt med användning av en termomixer eller en liknande anordning. Den så behandlade blandningens optiska densitet bestämdes med användning av en spektrofotdmeter vid 492 nm. En blandning av 400 ml av substratlösningen och l ml l N klorvätesyra användes såsom blindprov. De erhållna värdena för den optiska densiteten behandlades på samma sätt som i exempel 2-1 och den beräknade mängden TAG-lektin infördes i ett diagram, figur 2, vari symbolen O betecknar friska personer och siffrorna (l) till (10) anger följande patienter: (1) gastrisk cancer; (2) hydatidenmol; (3) koloncancer; (4) livmodercancer; (5) äggstockscancer; (6) rektal cancer; (7) prostatacancer: (8) uretral cancer; (9) hepatom; och (10) bröstcancer.

Såsom framgår av de resultat som visas i figur 2 förefinnes en remarkabel skillnad med avseende på halten av TAG i kropps- vätska mellan friska personer och patienter med olika typer av cancer.

Uppfinningen kan tillämpas i kliniska laboratorier för be- stämning av TAG-halter i kroppsvätskor såsom blodserum eller plasma.

Claims (17)

451 508 l8 PATENTKRAV

1. Sätt att bestämma halten TAG (substanser med tumör- ms» associerade glykobindningar) i ett prov av kroppsvätska, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar TAG i ett prov av kroppsvätskan att reagera med jordnötslektin (PNA) eller ricinbönlektin (RCA) till bildning av ett TAG/lektin- komplex, och att man mäter mängden TAG/lektin-komplex eller icke-reagerat lektin medelst agglutinering eller en märkt substans för lektin, varvid nämnda TAG utgöres av socker- rester med en bindningsspecificitet för PNA eller RCA eller ' med socker besläktade substanser, som innehåller nämnda sockerrester såsom en ändgrupp.

2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda lektin är ett märkt lektin.

3. Sätt enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att det märkta lektinet är ett lektin märkt med ett enzym, en fluorescerande substans eller en radioaktiv sub- StaIlS .

4. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att kroppsvätskan är blod, vävnadsvätska, lymfa, hydrotorax, ascites, amnionvätska, magsaft, urin, pankreas- vätska, cerebrospinalvätska eller saliv.

5. Sätt enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att kroppsvätskan är blodserum eller blodplasma.

6. Sätt enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres vid 45°C eller därunder under minst 30 minuter. I IV!

7. Sätt enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres vid 4 - 40°C. *z 451 508 19

8. Sätt enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres vid 20 - 40°C.

9. Sätt enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att reaktionen utföres under 60 - 90 minuter.

10. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att lektinet utgöres av jordnötslektin.

11. ll. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att mängden icke-reagerat lektin bestämmes genom agglutinering av nämnda icke-reagerade lektin.

12. Sätt enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att det icke-reagerade lektinet agglutineras med kaninerytrocyt eller med fårerytrocyt, behandlad med neuraminidas.

13. Sätt enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet är glukoamylas, glukosoxidas, peroxidas, alkaliskt fosfatas eller hemoktapeptid eller ett aktivt fragment därav.

14. Sätt enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att den fluorescerande substansen är fluorescein, fluoresceinvätetiocyanat eller dansylklorid.

15. Sätt enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att den radioaktiva substansen är radioaktivt jod eller tritium.

16. Sätt enligt patentkravet 13, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet är peroxidas.

17. l7. Sätt för diagnos av cancer, k ä n nle t e c k n a t därav, att man bestämmer halten TAG i ett prov av kroppsvätska enligt metoden i patentkravet l och jämför den erhållna TAG- halten med den som iakttas hos friska personer.