SE467987B - Saett att bestaemma maengden av ett tumoerantigen-immunokomplex - Google Patents

Description

467 987 10 15 20 25 30 35 och också i överensstämmelse med mätbe- tingelserna. Vidare finns för närvarande ingen metod tillgänglig för skiljande av koagulerad IgG från IC.

Det har rapporterats att mängden av ett IC Vid cancer är höggradigt proportionell mot det framskridna stadiet, dvs metastas, av cancern (Theofilopoulos, A.N. et al, J. Immunol., 119, 657 (1977)). Emellertid är det ej alls klarlagt huruvida det IC som bestämmes med den konventionella metoden är ett komplex av cancerspeci- fikt antigen och antikropp. Speciellt vid cancer upp- träder ofta åtföljande bildning av en antikropp som är reaktiv i förhållande till beståndsdelar i normala cel- ler eller vävnader, dvs autoantikropp som undergår en icke-specifik reaktion. Vid bestämningen av IC vid en sådan malign sjukdom måste därför antigenet som utgör IC identifieras; i annat fall är det omöjligt att rik- tigt bestämma sjukdomen, dess specificitet, etc.

Med hänsyn därtill har nu intensiv forskning genom- förts för upprättande av en metod för bestämning av antigen-specifika IC som kan specifikt bestämma ett IC som är specifikt mot eflztumör-associerat antigen som ingår i patientens kroppsvätska. Följaktligen har det enligt uppfinningen visat sig att kroppsvätskor från patienter innehåller komplementbindande IC vari de in- gående antigenen (tumör- markörer), såsom BFP Utasyflßfetoprotein), AFP (A3feto- protein), TAG (tumörassocierad glykobindning, se de publicerade,icke granskade japanska patentansökningarna (Kokai) nr 29949/1982, 29950/1982 och 29951/1982), CEA (karcinoembryon-antigen), etc. Det har vidare visat sig att ett sådant IC kan,när det är bundet till ett insolubiliserat antikomplement,bindas specifikt till en märkt substans eller enbart ett sådant IC kan insolubi- líseras specifikt och märkas och att ovan angivna syfte är tumörassocierade antigen kan uppnås genom bestämning av den specifika aktiviteten av erhållen insolubiliserad märkt reaktionsprodukt 'Å (fn- 10 15 20 25 30 35 467 987 eller den icke reagerade märkta substansen. Föreliggande uppfinning är baserad på dessa nya upptäckter.

Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser ett sätt att bestämma ett immunkomplex i vilket ett tumörassocierat antigen ingår som utgöres av "basic"-fetoprotein (BFP), a-feto- protein (AFP) eller tumörassocierad glykobindning (TAG), kännetecknat därav, att det innefattar stegen: (1) reaktion av ett komplementbindande, tumörasso- cierat antigen-antikroppkomplex, ingående i en kropps- vätska med antingen ett insolubiliserat anti-komplement eller med en insolubiliserad substans, som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet, eller antikroppen däremot, som ingår i komplexet, under bild- ning av en immunkomplex-insolubiliserad-anti-komple- mentbindningsprodukt eller en immunkomplex-insolubili- serad-substansbindningsprodukt, (2) reaktion av immunkomplex-insolubiliserad-anti- komplementbindningsprodukten med en i förväg bestämd mängd av märkt substans, som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet, som ugöres av BFP, AFP eller TAG, eller antikroppen däremot, som ingår i bind- ningsprodukten, eller reaktion av immunkomplex-insolu- biliserad-substans-bindningsprodukten med en i förväg bestämd mänd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, (3) separation av erhållen reaktionsprodukt från den icke reagerade märkta substansen eller från icke reagerat märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, och (4) bestämning av den specifika aktiviteten av reaktionsprodukten eller den separerade icke reagerade reaktanten. ' Sättet enligt uppfinningen har ej varit känt tidigare och tillhandahåller en teknik för bestämning av IC som är specifik för tumörassocierade antigen 10 15 20 25 30 467 987 och vilkas bestämning har ansetts vara svår. Enligt föreliggande uppfinning kan sådana IC bestämmas speci- fikt med en relativt enkel metod. Sättet enligt uppfin- ° ningen är följaktligen mycket användbart patologiskt IF' och kliniskt för undersökningen, diagnosen och progno- sen av tumörer.

Föreliggande uppfinning beskrives närmare nedan.

En utföringsform av föreliggande uppfinning kan tillämpas genom att ett tumör-associerat-antigen-anti- kroppskomplex uppvisande komplementbindningsegenskaper och ingående i en kroppsvätska såsom ett IC reageras med ett insolubiliserat antikomplement under bildning av en IC-insolubiliserad-antikomplement-bindningsprodukt, att bindningsprodukten reageras med en i förväg bestämd mängd av en märkt substans som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet eller antikroppen mot det tumörassocierade antigenet som utgör IC i bind- ningsprodukten, att reaktionsprodukten separeras från den icke reagerade märkta substansen och att den speci- fika aktiviteten av reaktionsprodukten eller den icke reagerade märkta substansen bestämmes. Mer specifikt angivet reageras ett komplement-bíndækæ -tumörassocie- rat-antigen-antikroppkomplex ingående i en kroppsvätska såsom ett IC först med insolubiliserat antikomplement under bildning av en IC-insolubiliserad anti-komplement- bindningsprodukt. IC ingäende i kroppsvätskan och som skall användas enligt uppfinningen för bestämning är ett sådant vari antigenet ärett tumörassocierat anti- gen utvald i gruppen bestående av BFP, AFP odwTAG.

IC vari antigenet är BFP eller TAG föredrages. IC vari ingående antigenâh'BFP, AFP eller TAG har detekterats med sättet enligt uppfinningen för första gången. Kon- ventionellt var det ej känt att sådana IC ingår i kroppsvätskor. IC innehållande ovanstående antigen 10 15 20 25 30 35 467 VD oo -a kan bindas till komplement, dvs uppvisar förmåga att aktivera komplementsystemet och ingår såsom bundna till komplementet, dvs i form av ett antigen-antikropp-komp- lementkomplex. Enligt föreliggande uppfinning är följ- aktligen IC bundet till ett insolubíliserat antikomp- lement med utnyttjande av komplementbindningsegenska- perna hos IC.

Prov som är användbara för bestämningen är olika kroppsvätskor, såsom blod, lymfa, ascites, pleural ut- söndring, spinal vätska, etc. En sådan kroppsvätska kan uppsamlas på konventionellt sätt från den önskvärda patienten som behöver sådan bestämning. När exempelvis blod användes såsom provet användes företrädesvis serum eller plasma, som kan behandlas på konventionellt sätt före användning. Mängden prov som skall användas är vanligen cirka 0,01 till cirka 1,0 ml, och företrädes- vis cirka 0,1 till cirka O,3 ml.

Det insolubiliserade antikomplementet kan vara kommersiellt tillgängligt eller framställas genom ke- misk eller fysikalisk reaktion av ett antikomplement med en olöslig bärare på konventionellt sätt. Anti- komplementet är ej speciellt begränsat så länge som det utgör en antikropp mot ett komplement, såsom en antikropp mot human komplementkomponent Clq eller C3 eller liknande. Följaktligen kan kommersiellt till- gängliga antikomplement eller sådana som framställts på konventionellt sätt användas.

Exempel på användbara olösliga bärare är cellu- losapulver, Sephadex, Sepharo§e,polystyren, filter- papper, karboximetylcellulosa, jonbytarharts, dextran, plastfilm, plaströr, nylon, glaspärlor, silke, poly- amín-metylvinyleter-maleinsyrasampolymer, aminosyra- sampolymer, eten-maleinsyrasampolymer, etc. Antikomp- lementet insolubiliseras genom diazoprocessen såsom kovalent bindningsprocess, peptidprocess (syraamid- derívatprocess, karboxikloridhartsprocessen, karbo- 467 937 10 15 20 25 30 35 diimidhartsprocessen, maleinsyraanhydridderivat- processen, isocyanatderivatprocessen, bromcyanid-akti- verad-polysackaridprocessen, cellulosakarbonatderivat- processen eller processen vari ett kondensationsmedel användes), alkyleringsprocessen, bärarbindningspro- cessen med användning av en bryggbildare (såsom glutaraldehyd, hexametylenisocyanat eller liknande), bärarbindningsprocessen baserad på Ugi-reaktionen eller liknande kemisk process; jonbindningsprocessen vari ett jonbytarharts eller liknande bärare användes; eller fysikalisk adsorptionsprocess, vari glaspärlor eller liknande poröst glas användes såsom bärare.

IC bindes till det insolubiliserade antikomple- mentet, exempelvis genom reaktion av ett prov innehål- lande IC med det insolubiliserade antikomplementet i cirka 0,2 till cirka 0,5 ml av en buffertlösning. Reak- tionen kan genomföras vid cirka 4 till cirka 37OC under cirka 0,5 till cirka 48 timmar. Buffertlösningen är ej speciellt begränsad och innefattar en svagt alkalisk buffertlösning som vanligen uppvisar ett pH av cirka 7,0 till cirka 8,0, såsom 0,5-M fosfatbuffert, tris-HCl- buffert, borsyrabuffert eller liknande. Buffertlösningen kan ha konventionella tillsatser inneslutna däri, såsom bovinserumalbumin (BSA) eller liknande skyddsprotein, timerosal eller liknande antiseptiskt medel, NaCl, etc.

Reaktionen ger en IC-insolubiliserad antikomple- mentbindningsprodukt. Enligt föreliggande uppfinning tvättas därefter bindningsprodukten noggrant med fysio- logisk saltlösning eller liknande och reageras därefter med en förbestämd mängd av märkt substans som kan bindas specifikt till tumörassocierat antigen eller antikroppen som ingår i IC i bíndningsprodukten. Den märkta sub- stansen som kan bindas specifikt till det tumörassocie- rade antigenet framställes genom att på konventionellt sätt reageras ett märkningsmedel med antikroppen mot de tumörassocierade antigenet som ingår i IC som skall 'I 10 15 20 25 30 35 467 987 bestämmas, exempelvis anti-BFP för BFP, anti-AFP för AFP eller anti-TAG För TAG. För fallet TAG är det också möjligt att använda produkterna som erhålles genom reaktion av ett märkningsmedel med olika lektiner såsom märkta substanser. Exempel på sådana lektiner är de som kan bindas specifikt till ändstående galaktos [U.B.c. zso, ss1s-8523 (197s); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975); Z. Immunitaetsforch. 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp.

Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 75, No. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974); Carbohydrate Research, S1, 107-118 (1976)] såsom jordnötslektin (betecknas hädanefter "PNA"), rícinoljelektín (Ricinus Commuris), etc; sådana som kan bindas specifikt till ändstående N-acetylgalaktosamin, såsom lektin från Dolíchos-böna (Dolichos biflorus), apelsinlektin, Helix pomatia-lek- tin, limabönelektin (Phaseolus limensis), sojabön- lektin (Glycine max), Bauhinía-bönlektin (Bauhinia purpurea); och sådana som bindes specifikt till änd- stående L-fukos, såsom Lotus tetragonolobus-lektin jhrt. J. Bnp. Pathi, 34, 94 (19ss)], Ulex europeus- lektin [Boyd. W.C. and Sharpleigh. E., Blood, 9, 1195 (1954)), etc. ' Den märkta substansen som kan bindas specifikt till antikroppen mot det_tumörassocierade antigenet framställes genom reaktion av ett märkningsmedel med den tumörassocierade antigenen i sig, dvs BFP, AFP eller TAG på konventionellt sätt. Användbara så- som sådana antikroppar, antigen och lektiner är sådana som är kommersiellt tillgängliga eller sådana som framställts med konventionella metoder ÄMasaru Ishii er al, saishin Igaku, voifi 36, NO. 5, sid 860- 866 (19s1)J.

Märkningsmedel för tillhandahållande av märkta substanser som kan bindas specifikt till tumör- 467 987' 10 15 20 25 30 35 associerat antigen eller antikropp mot det tumörasso- cierade antigenet är ej speciellt begränsade. Exempel på användbara märkningsmedel är konventionella enzy- matiska märkningsmedel, såsom glukoamylas, glukosoxi- das, peroxidas, alkalisk fosfatas, 5-galaktosidas, aktiva fragment av enzymer, såsom hemoktapeptid, etc; och radiaktiva märkningsmedel, såsom 1251, 1311 och liknande radioaktiva jodatomer, tritium, radioaktiv litium, etc. Märkta substanser framställes med använd- ning av dessa märkningsmedel på följande sätt. Exempel- vis kan enzymmärkta substanser framställas med använd- ning av sådana enzymatiska märkningsmedel, genom bind- ningsförloppet som utnyttjar glutaraldehyd, som är känd såsom en konventionell bryggbildare för proteiner.

Speciellt när glukosoxidas eller -peroxidas användes är ett förfarande användbart vari aldehyden införes genom perjodsyrametoden i glykobindningen i enzymet och bindningen därefter bindes till aminogruppen i sub- stansen för märkning [Method in Enzymology, vol. 37, sid 133-136 (1975)]. Också ett förfarande vari anti- kroppen överföres till F(ab')-SH, vari maleinimid inneslutes och erhållen produkt bindes till märknings- medlet är användbart [Journal of Biochemistry, vol. 79 sid 233-236 (1976) och samma publikation vol. 62, sid 285-292 (197631. 1251 1311 märkning, exempelvis medelst det konventionella kloramin-T-förfarandet [Nature, 194, sid 495 (1962), Biochem. J., 89, sid 114 (1963)].

Ovannämnda märkta substanser som kan användas enligt uppfinningen är kommersiellt tillgängliga och sådana kommersiella produkter är användbara enligt 3 , , etc kan användas för föreliggande uppfinning.

Reaktionen mellan IC-insolubiliserad-anti- komplementbindningsprodukten och den märkta substansen kan genomföras på samma sätt som reaktionen mellan provet och det insolubiliserade antikomplementet. 10 15 20 25 30 35 467 987 Enligt föreliggande uppfinning separeras erhållen reaktionsprodukt som märkts på detta sätt med den märkta substansen från icke reagerad märkt substans och en av dessa kontrolleras med avseende på specifik akti- vitet. Separationen kan åstadkommas enkelt på konven- tionellt sätt, exempelvis genom avlägsnande av vätskan från reaktionsblandningen genom avsugning och tvättning av den återstående produkten åtminstone tre gånger med fysiologisk saltlösning. Den specifika aktiviteten av produkten eller substansen mätes med ett förfarande som lämpar sig för det använda märkningsmedlet. När exempelvis ett enzymatiskt märkningsmedel användes bringas detta att verka på substratet för enzymet och mängden av nedbrytningsprodukten av substratet mätes på konventionellt sätt, exempelvis uttryckt såsom absorbans. När det radioaktiva märkningsmedlet använ- des räknas radioaktiviteten. När den specifika aktivi- teten av den icke reagerade märkta substansen mätes kan sådan aktivitet av reaktionsprodukten som skall mätas enkelt beräknas genom att den specifika aktivi- teten av den icke reagerade substansen dras av från den initiella specifika aktiviteten av den använda märkta substansen.

På detta sätt kan ett specifikt IC i provet, dvs endast det IC som innehåller BFP, AFP eller TAG såsom ingående antigen bestämmas specifikt och enkelt med ett av sätten enligt uppfinningen.

Det andra sättet enligt uppfinningen tillämpas genom att det komplementbindande tumörassocierade antigen-antikropp-komplexet som ingår i en kropps- insolubiliserad substans som kan bindas specifikt till det tumörasso- vätska såsom ett IC reageras med en cierade antigenet som utväljes ur gruppen bestående av BFP, AFP och TAG, eller antikroppen däremot som ingår i IC så att en IC-insolubiliserad-substans-bind- ningsprodukt bildas, att bindningsprodukten reageras 467 987 10 15 20 25 30 35 10 med en i förväg bestämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A som kan reagera med komplementet eller antikroppen i bindningsprodukten, att reaktionsprodukten separeras från icke reagerat märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A och att den specifika aktiviteten av reaktionsprodukten eller den icke reagerade reaktanten bestämmes, vari- genom det avsedda syftet med uppfinningen kan uppnås på likartat sätt som i det första sättet. Enligt det andra sättet reageras ett prov innehållande samma spe- cifika IC som för fallet enligt det första sättet med en insolubiliserad substans, som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet eller antikroppen mot det tumörassocierade antigenet som ingår i IC. Den insolubiliserade substansen som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet som ingår i IC är ovannämnda anti-BFP, anti-AFP, anti-TAG eller lektin, fixerad till en konventionell olöslíg bärare.

Den insolubiliserade substansen som kan bindas speci- fikt till antikroppen som ingår i IC är BFP, AFP_ eller TAG, fixerad till den olösliga bäraren på känt sätt, exempelvis med samma teknik som beskrivits för bildning av det insolubiliserade antikomplementet.

Reaktionen mellan provet och den insolubiliserade substansen genomföres på samma sätt som reaktionen mel- lan provet och det insolubiliserade antikomplementet, varigenom endast det specifika_IC som ingår i provet kan erhållas selektivt såsom en insolubiliserad fast substans.

Den specifika IC-insolubiliserad-substansbind- ningsprodukten som erhålles sålunda reageras därefter med märkt antikomplement, antikropp eller protein A.

Det märkta antikomplementet eller den märkta anti- antikroppen som skall användas framställes genom märkning med ett konventionellt märkningsmedel av ett antikomplement eller en anti-antikropp som under- 10 15 20 25 30 35 467 987 11 går immunoreaktion med komplementet eller antikroppen i insolubiliserat IC. Antikomplementet och märknings- medlet kan vara samma som de som användes vid det första sättet.Anti-antikroppen är ej speciellt begränsad om den endast utgör en antikropp mot antikroppen. När exempel- vis ett prov härstammande från en människokropp använ- des för bestämning är anti-human immunoglobulin G eller liknande användbart. Märkningsmetoden kan vara densamma som den som vanligen användes. I stället för det märkta antikomplementet eller den märkta anti-antikroppen kan protein A som är märkt på likartat sätt också användas.

Kommersiellt protein A som exempelvis framställts av E.Y. Laboratory kan användas såsom sådant.

Reaktionen mellan IC-insolubi1iserad-substans- bindningsprodukten och det märkta antikomplementet, den märkta antikroppen eller märkt protein A kan genomföras exempelvis under samma betingelser som föregående reak- tion mellan provet och det insolubiliserade antikomple- mentet.

Den märkta reaktionsprodukten som erhålles sålunda och den oreagerade märkta substansen (märkt antikomple- ment, märkt anti-antikropp eller märkt protein A) sepa- reras från varandra och kontrolleras med avseende på 'specifik aktivitet på samma sätt som enligt det första sättet varigenom endast specifik IC i provet kan detek- teras och bestämmas specifikt.

På detta sätt kan specifik tumörassocierat-anti- gen-innehållande IC i kroppsvätskan bestämmas enligt föreliggande uppfinning. Detta garanterar diagnos av cancer från det initiella stadiet till slutstadiet, speciellt upptäckt av tidig cancer. Eftersom det spe- cifika tumörassocierade antigenet som ingår i form av ett IC i kroppsvätska bestämmes specifikt enligt före- liggande uppfinning är uppfinningen användbar för diagnos, analys och undersökning av tumörsjukdomar, autoimmunsjukdomar, etc, som ej kan detekteras med 467 987 10 15 20 25 30 35 12 konventionell teknik för bestämning av sådana antigen i fri form.

Förfarandet enligt en utföríngsform av föreliggan- de uppfinning kan tillämpas genom: (1) Reaktion av det komplementbindande tumör- associerat-antigen-antikroppkomplexet som ingår i en kroppsvätska såsom ett immunkomplex antingen med ett insolubiliserat antikomplement eller med en insolubili- serad substans som kan bindas specifikt till TAG eller antikroppen mot TAG som ingår i komplexet under bild- ning av ett immunkomplex-insolubiliserad-anti-komple- mentbindningsprodukt eller en immunkomplex-insolubili- serad-substansbindningsprodukt, A (Z) reaktion av immunkomplex-insolubiliserad- antikomplementbindningsprodukten med en i förväg be- stämd mängd av märkt substans som kan bindas specifikt till TAG eller antikroppen mot TAG som ingår i bindnings- produkten, eller reaktion av immunkomplex-insolubilise- rad-substansbindningsprodukten med en i förväg bestämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, (3) separation av erhållen reaktionsprodukt från icke reagerad märkt substans eller märkt antikomple- ment, anti-antikropp eller protein A, och (4) bestämning av den specifika aktiviteten av reaktionsprodukten eller den separerade icke reagerade reaktanten. Mer speciellt kan den insolubiliserade substansen som kan bindas specifikt till TAG som an- vändes i steget (1) utgöras av en insolubiliserad lektin som kan bindas specifikt till ändstående galaktos, som reageras med immunkomplexet. Därefter reageras erhållen immunkomplex-insolubiliserad-lektin- bindningsprodukt med en enzymmärkt anti-Cld-antikropp, anti-C3-antikropp eller protein A.

Sättet enligt en annan utföringsform av förelig- gande uppfinning kan genomföras genom att: nu 10 15 20 25 30 35 467 987 (1) Ett komplementbindande tumörassocierat-anti- gen-anti-kroppkomplex ingående i en kroppsvätska såsom ett ímmunkomplex reageras antingen med ett insolubili- serat antikomplement eller med en insolubiliserad sub- stans som kan bindas specifikt till BFP eller till antikroppen mot BFP som ingår i komplexet under bild- ning av en immunkomplex-insolubiliserad-antikomplement- bindningsprodukt eller ett immunkomplex-insolubiliserad substansbindningsprodukt, (2) att immunkomplex-insolubiliserad-antikomple- mentbindningsproduktaireagflgg med en i förväg bestämd mängd av märkt substans som kan bindas specifikt till BFP eller till antikroppen mot BFP som ingår i bind- ningsprodukten eller att immunkomplex-insolubiliserad- substansbindningsprodukten reageras med en i förväg bestämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, (3) att erhållen reaktionsprodukt separeras från icke reagerad märkt substans eller märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A,_och (4) att den specifika aktiviteten av reaktions- produkten eller den separerade icke reagerade reaktan- ten bestämmes. Speciellt kan det insolubiliserade anti- komplementet som användes i steget (1) utgöras av en insolubiliserad anti-C3-antikropp eller anti-C1q-anti- kropp som reageras med ímmunkomplex. Därefter reageras erhållen immunkomplex-insolubiliserad-antikomplement- bindningsprodukt med en enzymmärkt anti-BFP-anti- kropp. g Föreliggande uppfinning beskrives närmare med hän- visning till följande referensexempel och exempel.

Referensexempel 1 Framställning av C3-Sepharose 4 B En mängd av 15 g (torr vikt) bromcyanid-(CNBr)- aktiverad Sepharose 4 B (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) satšès :111 1,5 iiter av 10'3 N vaucenhainig iösning 467 987 10 15 20 25 30 14 av HCl. Blandningen fick stå vid rumstemperatur under 15 minuter och HCl-lösningen-avlägsnades genom ett glasfilter. Den fasta delen tvättades med 3 liter 0,1-M bikarbonatbuffert (pH 8,0) och sattes därefter till 200 ml av 0,1-M bikarbonatbuffert (pH 8,0). Där- efter sattes 100 mg human C3 [Biochemical Journal (England), vol. 193 (3), sid 963-970 (1981)] till blandningen och erhållen blandning utsattes för reak- tion vid rumstemperatur under 2 h under omröring då och då. Reaktionsblandningen filtrerades med ett glas- filter, den fasta delen sattes till 200 ml 1-M vatten- haltig monoetanolamínlösning (pH 8,0) och blandningen fick stå vid rumstemperatur under 2 timmar. Efter det att blandningen hade drivits genom ett glasfilter tvättades den fasta delen noggrant med 2 liter 0,1-M ättiksyrabuffert (pH 4,0) innehållande 0,5-M NaCl och därefter med 2 liter boratbuffert (pH 8,0) innehållande 0,5-M NaCl. Tvättförloppet upprepades tills den optiska densiteten vid 280 nm (OD280) för tvättlösningarna minskat så att den ej översteg 0,002 varigenom humant C3-Sepharose 4 B erhölls. Produkten konserverades i 0,05-M fosfatbuffert innehållande 0,2 % BSA och 0,2 % NaN3 vid 4°C före användning.

Referensexempel 2 (1) Framställning av anti-C3 serum En mängd av 10 mg humant G3 (samma som i referensexempel 1) löstes i 10 ml fysiologisk salt- lösning, 1 ml av lösningen blandades med 1 ml av komplett Freund's adjuvans och blandningen tillfördes en kanin subkutant i en dos av 0,2 ml. Blandningen administrerades dessutom i samma dos 2 veckor där- efter och 1 månad efter den andra ímmuniseringen.

En vecka efter den sista immuniseringen tillvaratogs blodet för erhållande av anti-human C3-serum. 10 15 20 25 30 35 .[> cm -a xo CO ~<| 15 (2) Framställníng av F(ab')2-fraktion av anti-C3-antikropp [F(ab')2-anti-C3] En mängd av 10 ml av anti-C3-serum erhållet genom förfarandet (1) blandades med 20 ml av O,9-pro- centig NaCl och 10 ml av mättat ammoniumsulfat sattes droppvis till blandningen. Erhållen blandning centri- fugerades (3000 rpm, 15 minuter) för erhållande av en fast andel som dialyserades med PBS (fosfatbuffrad saltlösning) för framställnüugav æ1y>globulin-fraktion.

Fraktionen drevs genom en kromatografisk affinitets- kolonn med C3-Sepharose 4B som erhållits i referens- exempel 1, följt av tvättning med 0,05-M fosfatbuffert (pH 7,4) innehållande 0,14-M NaCl och eluering med 0,1-M vattenhaltig ättiksyralösning innehållande 0,5-M NaCl för erhållande av renad anti-C3-antikropp. Anti- kroppen behandlades med 4 mg pepsin vid 37°C under 24 timmar och utsattes därefter för kolonnkromatografi på Sephadex G-150 (Farmacia) följt av eluering med 0,1-M boratbuffert (pH 8,0) innehållande 0,5-M NaCl för erhållande av F(ab')2-anti-C3-fraktion.

Referensexempel 3 Framställning av enzymmärkt antikropp [alkalisk fosfatas-märkt F(ab')2-anti-BFR] F(ab')2-anti-BFP framställdes på samma sätt som i referensexempel 2. En mängd av 10 mg av produkten och 10 mg av alkalisk fosfatas (typ II, bovin-tarm-alka- lisk-fosfataskristaller, SIGMA Chemical Co) sattes till 10 ml av 0,1-M fosfatbuffert (pH=7,5) innehållan- de 0,5-M NaCl och 0,5 ml av 25-procentig glutaralde- hydlösning sattes långsamt droppvis till blandningen och erhållen blandning omrördes vid rumstemperatur under 2 timmar. Med tillsats av S g glycin blockera- des överskottet av glutaraldehyd och blandningen dialyserades med fysiologisk saltlösning. Erhållen vätska koncentrerades och utsattes därefter för gel- filtrering på Sepharose 6B (Farmacia) för tillvara- 467 987 10 15 20 25 30 16 tagande av en aktiv fraktion och erhållande av alkalisk fosfatas-märkt F(ab')2-anti-BFP.

Referensexemgel 4 Framställning av ínsolubiliserad F(ab')2-anti-CS F(ab')2-anti-C3 som erhållits i referensexempel 2 reglerades till 25 pg/ml med 0,1-M tris-HC1-buffert (pH=8,0). Lösningen placerades i brunnar på en mikro- titerplatta (framställd av polyvinylkloríd, U-platta, Cooke Engineering Co.) i en mängd av 150 pl i varje brunn, inkuberades vid 37°C under 1 timme och fick därefter stå vid 4°C under 20 timmar. Efter avlägsnande av lösningen ur brunnen tvättades brunnarna med salt- lösning tre gånger för erhållande av ínsolubiliserad F(ab')2-anti-C3. Brunnarna fylldes med trís-HCl-buffert för tätning och konserverades vid 40C. Bufferten av- lägsnades omedelbart före användning.

Referensexemgel S Framstållning av ínsolubiliserad lektin (PNA-pärlor) Polystyrenpärlor (Precision Plastic Co., Ltd., USA, 6,4-mm diameter) tvättades med 1-N vattenhaltíg NaOH-lösning och 1'N vattenhaltig HCl-lösning omväx- lande tre gånger med var och en och tvättades därefter med destillerat vatten tills pH-värdet i tvättvattnen blev cirka 7. En tusendel av pärlorna placerades i 120 ml av 0,1-M fosfatbuffert innehållande 100 pg/ml PNA (jordnötslektin, produkt från E.Y. Laboratory), fick därefter stå vid 4°C under 24 timmar och avfilt- rerades därefter och tvättades med vatten. Pärlorna placerades därefter i 200 ml 0,1-M fosfatbuffert innehållande 0,2 % gelatin, fick sedan stå vid 4°C under 24 timmar och avfiltrerades och tvättades där- efter med vatten för erhållande av insolubiliserat PNA. PNA-pärlorna konserverades i 0,05-M fosfatbuffert (0,14-M NaCl, 0,2 % gelatin, 0,01 % NaN pH=7,4). 3! 10 15 20 25 30 35 \:1 \o oo \.1 17 Referensexempel 6 Framställning av prover' En mängd av 2 ml blod tillvaratogs från var och en av friska personer och patienter med olika cancer- sjukdomar och andra sjukdomar, koagulerades och cent- rifugerades (2000 rpm, 10 minuter) därefter för erhål- lande av serum som skulle testas. På likartat sätt uttogs blod med en spruta behandlad med heparin (500 enheter) och centrifugerades för erhållande av plasma som skulle testas.

Exempel 1. referensexempel 6 placerades ivarje brunn i mikro- titerplattan som utgör insolubiliserat F(ab')2-anti-C3 En mängd av 0,1 ml av serum erhållet i framställt i referensexempel 4 och inkuberades vid 37°C under 2 timmar. Efter avlägsnande av reaktionsbland- ningen genom avsugning tvättades brunnen med fysiolo- gisk saltlösning tre gånger. Därefter placerades 0,1 mlt av märkt F(ab')2-anti-BFP framställt i referensexempel 3 i brunnen och inkuberades vid 37°C under 2 timmar.

Efter avlägsnande av reaktionsblandningen genom sug- ning tvättades brunnen med fysiologisk saltlösning tre gånger. I varje brunn infördes därefter 0,1 ml av en substratlösning (0,1-M vattenhaltig dietanolaminlös- ning (pH=10) innehållande 50 mg/100 ml p-nitrofenyl- fosforsyra), följt av inkuberíng vid 37°C under 1 timme.

En mängd av 0,1 ml av 1-N vattenhaltig NaOH-lösning tillsattes därefter för hejdande av reaktionen.

Absorbansen hos reaktionsblandningen mättes vid en våglängd av 405 nm med användning av en 1 mm bred cell i en spektrofotometer. Pig. 1 visar resultatet.

Med hänvisning till fig. 1 indikeras vid I en grupp om 19 friska personer (kontrollgruppL vid II en grupp om 16 patienter med primär levercancer, vid III en grupp av 19 patienter med magcancer och vid IV en grupp av 18 patienter med hepatit. Absorbansvärden överstigande 0,250 avsattes i ritningen tillsammans 467 987 10 15 20 25 30 35 18 med värdena.

Diagrammet tillhandahåller diagnos av cancer.

När likartade mätningar genomfördes på patienter med hos vilka halten fri BFP är hög visade det sig att halten BFP-innehållande IC var låg i det för- hepatit värrade stadiet av hepatit då däremot hög halt BFP- innehållande IC uppmättes i konvalescensstadiet.

Resultaten tycks antyda att BFP som bildas av regene- rerande levercell är ekvivalent med det som härstam- mar från cancerceller och visar vidare att föreliggande sätt är användbart för klinisk identifiering av hepatit.

Exempel 2. En PNA-pärla erhållen i referensexempel 5 och 0,5 ml 0,05 M tris-HCl-buffert (pH 7,4) innehållande 0,2 % gelatin, 0,15 M NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 0,01 % timerosal sattes till 0,1 ml av serum eller plas- ma erhållet i referensexempel 6 och blandningen inkube-. och rades vid ZSOC under 5 timmar. Pärlan tvättades därefter med fysiologisk saltlösning tre gånger och sattes där- efter till en blandning av 0,1 ml peroxidas-märkt protein A (4000-faldig spädning, E.Y. Laboratory) och 0,5 ml 0,05 M tris-HCl-buffert (pH 7,4) innehållande 0,2 % gelatin, 0,15 M NaCl och 0,01 % inkubering vid ZSOC under 16 timmar. Till pärlan som timerosal, följt av därefter tvättats med fysiologisk saltlösning tre gånger sattes 0,5 ml 0,2 M citronsyra-fosfatbuffert (pH=5,0) innehållande 0,03 % HZOZ lösning innehållande 4 mg/ml o-fenylendiamin och bland- -och 1,0 ml fysiologisk salt- ningen inkuberades vid rumstemperatur under 10 minuter.

Reaktíonen avstannades genom tillsats av 2,0 ml 1 N vattenhaltig klorvätesyralösning. Absorbansen hos reak- tionsblandníngen uppmättes vid en våglängd av 492 nm.

Pig. Z visar resultatet.

Med hänvisning till fig. 2 indikeras vid V en grupp om 26 friska personer (kontrollgrupp) och vid IV en grupp om 32 cancerpatienter. Diagrammet tillhanda- håller cancerdiagnos. 10 15 20 25 19 Exempel 3. En PNA-pärla erhållen i referensexempel 5 och 0,5 ml 0,05 M tris-HCl-buffert (pH=7,4) innehållan- de 0,2 % gelatin, 0,15 H NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 och 0,01 % timerosal sattes till 0,1 ml av serum eller plasma erhållet i referensexempel 6 och blandningen in- kuberades vid ZSOC under S timmar. Pärlan tvättades därefter med fysiologisk saltlösning tre gånger och sattes därefter till en blandning av 0,1 ml peroxidas- -märkt get-anti-human-C3-antikropp (framställd av E.Y. Laboratory, X10) och 0,5 ml av 0,05 M tris-HCl- buffert (pH 7,4) innehållande 0,2 % gelatin, 0,15 M NaCl och 0,01 % timerosal följt av inkubering vid ZSOC i 16 timmar. Till pärlan som därefter tvättats med fysiologisk saltlösning tre gånger sattes 0,5 ml 0,2 M citronsyra-fosfatbuffert (pH 5,0) innehållande 0,03 % H O Z Z 4 mg/ml 0-fenylendiamin och blandningen inkuberades och 1,0 ml fysiologisk saltlösning innehållande vid rumstemperatur under 30 minuter. Reaktionen avstan- nades genom tillsats av 2,0 ml av 1 N vattenhaltig svavelsyralösning. Absorbansen hos reaktionsblandningen uppmättes vid en våglängd av 492 nm. Pig. 3 visar re- sultatet.

Med hänvisning till fig. 3 indikeras vid VII en grupp av 19 friska personer (kontrollgrupp) och vid VIII en grupp om 27 cancerpatienter. Díagrammet till- handahåller cancerdiagnosa

Claims (20)

10 15 20 25 30 467 987 20 Patentkrav

1. Sätt att bestämma ett immunkomplex i vilket ett tumörassocierat antigen ingår som utgöres av "basic"- fetoprotein (BFP), a-fetoprotein (AFP) eller tumörasso- cierad glykobindning (TAG), k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen: (1) reaktion av ett komplementbindande, tumörasso- cierat antigen-antikroppkomplex, ingående i en kropps- vätska med antingen ett insolubiliserat anti-komplement eller med en insolubiliserad substans, som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet, eller antikroppen däremot, som ingår i komplexet, under bild- ' ning av en immunkomplex-insolubiliserad-anti-komple- mentbindningsprodukt eller en immunkomplex-insolubili- serad-substansbindningsprodukt, (2) reaktion av immunkomplex-insolubiliserad-anti- komplementbindningsprodukten med en i förväg bestämd mängd av märkt substans, som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet, som ugöres av BFP, AFP eller TAG, eller antikroppen däremot, som ingår i bind- ningsprodukten, eller reaktion av immunkomplex-insolu- biliserad-substans-bindningsprodukten med en i förväg bestämd mänd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, (3) separation av erhållen reaktionsprodukt från den icke reagerade märkta substansen eller från icke reagerat märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A, och ' (4) bestämning av den specifika aktiviteten av reaktionsprodukten eller den separerade icke reagerade reaktanten.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen (1) reaktion av ett komplementbindande, tumörassocierat antigen-antikropp- 1") 467 987- 21 komplex som ingår i en kroppsvätska som ett immunkomp- lex med ett insolubiliserat antikomplement under bild- ning av en immunkomplex-insolubiliserad-antikomplement- bindningsprodukt, (2) reaktion av immunkomplex-insolu- biliserad-antikomplement-bindningsprodukten med en i förväg bestämd mängd av märkt substans som kan bíndas specifikt till det tumörassocierade antigenet eller antikroppen däremot som utgör bindníngsprodukten.

3. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att bindningsprodukten bringas att reagera med den märkta substansen som kan bíndas specifikt till det tumörassocierade antigenet, varvid den märkta sub stansen utgöres av märkt anti-BFP, märkt anti-AFP, märkt anti-TAG, märkt lektin som kan bíndas specifikt till ändstående galaktos, märkt lek- tin som kan bíndas specifikt till ändstående N-acetyl galaktosamin eller märkt lektin som kan bíndas speci- fikt till ändstående L-fukos.

4. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att bindningsprodukten bringas att reagera med den märkta substansen som kan bíndas specifikt till antíkroppen som ingår i bindningsprodukten, varvid den märkta substansen utgöres av märkt BFP, märkt AFP eller märkt TAG. _. "

5. Sätt enligt krav 2, 3 eller 4, k ä n n e- t e c k n a t därav, att det insolubiliserade anti- komplementet utgöres av en insolubiliserad antikropp mot en komplementkomponent Clq eller CS.

6. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen (1) att ett komple- mentbindande tumörassocierat*antigen-antikroppkomplex som ingår i en kroppsvätska bringas att reagera med en insolubiliserad substans som kan bíndas specifikt till det tumörassocierade antigenet som utgöres av BFP, AFP eller TAG eller antikroppen däremot som ingår i komp- lexet under bildning av en immunkomplex-insolubilise- 467 987 22 rad-substansbindningsprodukt och (2) att immunkomplex- insolubiliserad-substansbindningsprodukten bringas att reagera med en i förväg bestämd mängd av märkt anti- komplement, anti-antikropp eller protein A.

7. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att immunkomplexet bringas att reagera med den insolubiliserade substansen som kan bindas specifikt till det tumörassocierade antigenet, varvid den inso- lubiliserade substansen utgöres av insolubiliserad anti-BFP, insolubiliserad anti-AFP, insolubiliserad anti-TAG, insolubiliserat lektín som kan bindas. pecifikt till ändstående galaktos, insolubiliserat lektin som kan bindas specifikt till ändstående N-acetylgalaktosamin eller insolubiliserat lektín som kan bindas specifikt till ändstående L-fukos.

8. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att immunkomplexet bringas att reagera med den insolubiliserade substansen som kan bindas specifikt till antikroppen som ingår i komplexet, varvid den insolubiliserade substansen utgöres av insolubiliserad BFP, insolubiliserad AFP eller insolubiliserad TAG.

9. Sätt enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t därav, att den insolubiliserade substansen som kan bin- das specifikt till antikroppen som ingår i komplexet utgöres av insolubiliserad TAG.

10. sätt enligt krav 6; 7, s eller 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att det märkta anti- komplementet utgöres av en märkt antikropp mot en komp- lementkomponent Clq eller C3.

11. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen (1) att ett komple- mentbindande, tumörassocierat~antigen-antikroppkomplex ingående i en kroppsvätska såsom ett immunkomplex bringas att reagera med antingen ett insolubiliserat antikomplement eller med en insolubiliserad substans som kan bindas specifikt till TAG eller antikroppen

12. 'I x' 467 987 23 mot TAG som ingår i komplexet under bildning av en immunkomplex-insolubiliserad-antikomplementbindnings- produkt eller en immunkomplex-insolubiliserad-sub- stans-bindningsprodukt, och (2) att immunkomplex- insolubiliserad-antikomplement-bindningsprodukten bringas att reagera med en i förväg bestämd mängd av märkt substans som kan bindas specifikt till TAG eller antikroppen mot TAG som ingår i bindningsprodukten, eller att immunkomplex-ínsolubiliserad-substans-bind- ningsprodukten bringas att reagera med en i förväg bestämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A. fikt till TAG som ingår i komplexet utgöres av märkt anti-TAG, ett märkt lektin som kan bindas specifikt till ändstående galaktos, ett märkt lektin som kan eller ett märkt lektin som kan bindas specifikt till ändstående L-fukos.

13. Sätt enligt krav 11, k ä n n e t e c k n a t därav, att den märkta substansen som kan bindas speci- fikt till antíkroppen mot TAG som ingår i komplexet är märkt TAG.

14. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen (1) att ett komple- mentbindande, tumörassocierat-antigen-antikropp-komplex ingående i en kroppsvätska såsom ett immunkomplex bringas att reagera med en insolubiliserad substans som kan bindas specifikt till TAG eller till anti- kroppen mot TAG som ingår i komplexet under bildning av en immunkomplex-insolubiliserad-substans-bindnings- produkt, (2) att immunkomplex-insolubiliserad-substans- bindningsprodukten bringas att reagera med en i förväg bestämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A. 467 987 24

15. Sätt enligt krav 14, k ä n n e t e c k n a t därav, att immunkomplexet bríngas att reagera med den ínsolubilíserade substansen som kan bindas specifikt till TAG, varvid den insolubiliserade substansen ut- göres av insolubiliserad anti-TAG, ett insolubiliserat lektin som kan bindas specifikt till ändstående galak- tos, ett insolubiliserat lektin som kan bindas speci- fikt till ändstående N-acetylgalaktosamin eller ett insolubiliserat lektin som kan bindas specifikt till ändstående L-fukos.

16. Sätt enligt krav 15, k ä n n e t e c k n a t därav, att immunkomplexet bríngas att reagera med ett insolubiliserat lektin som kan bindas specifikt till ändstående galaktos och att erhållen immunkomplex-in- solubiliserad-lektin-bindíngsprodukt bríngas att rea- gera med en enzymmärkt anti-Clq-antikropp, anti-C3- antikropp eller protein A.

17. Sätt enligt krav 16, k ä n n e t e c k n a t därav, att ímmunkomplexet reageras med ett insolubi- liserat jordnötslektin och att erhållet immunkomplex -insolubiliserat-jordnötslektin-bindningsprodukt bríngas att reagera med peroxidas-märkt protein A.

18. Sätt enligt krav 16, k ä n n e t e c k n a t därav, att erhållet immunkomplex bríngas att reagera med ett insolubiliserat jordnötslektin och att immun- komplex-insolubiliserat-jordnötslektin-bindníngspro- dukten bríngas att reagera med peroxidasmärkt anti- C3-antikropp.

19. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar stegen (1) att ett komple- mentbindande, tumörassocierat-antigen-antikropp- komplex ingående i en kroppsvätska såsom ett immun- komplex bríngas att reagera med antingen ett insolu- 467 987 25 biliserat antikomplement eller med en insolubiliserad substans som kan bindas specifikt till BPP eller till antikroppen mot BFP som ingår i komplexet under bild- ning av en immunkomplex-insolubiliserad-antikomplement- bindningsprodukt eller en immunkomplex-ínsolubiliserad- substansbindningsprodukt, och (2) att immunkomplex-in- solubilíserad-antikomplement-bindningsprodukten bringas att reagera med en i förväg bestämd mängd av märkt substans som kan bindas specifikt till BFP eller till antikroppen mot BFP som ingår i bindningsprodukten eller att immunkomplex-insolubiliserad-substansbind- ningsprodukten bringas att reagera med en i förväg be- stämd mängd av märkt antikomplement, anti-antikropp eller protein A.

20. Sätt enligt krav 19, k ä n n e t e c k n a t därav, att immunkomplexet bringas att reagera med en insolubíliserad anti-C3' antikropp och att erhållen immunkomplex-ínsolubiliserad-anti-C3-antikropp-bind- ningsprodukt bríngas att reagera med anti-BFP-anti- kropp märkt med alkaliskt fosfatas.