CH662427A5

CH662427A5 - Verfahren zur bestimmung von tumorantigen spezifischen immunkomplexen.

Info

Publication number: CH662427A5
Application number: CH138184A
Authority: CH
Inventors: Masaru Ishii; Shugo Akazawa
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1982-07-16
Filing date: 1983-07-14
Publication date: 1987-09-30
Also published as: GB8403775D0; GB2133146B; DE3367281D1; SE467987B; EP0100914A1; WO1984000421A1; SE8401424D0; EP0100914B1; JPS5915858A; SE8401424L; GB2133146A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung von Tumorantigen spezifischen Immunkomplexen.

Wenn im lebenden Körper ein Antikörper gegen ein Antigen erzeugt wird, so verbindet sich der Antikörper bekanntlich mit dem Antigen, um einen Immunkomplex (im folgenden auch als «IC» bezeichnet) zu bilden. Derartige Immunkomplexe werden bei Autoimmunerkrankungen, infektiösen Erkrankungen, bösartigen Tumoren und ähnlichen Krankheiten gefunden. Die Anwesenheit von Immunkomplexen verursacht sogenannte Immunkomplexkrankheiten. Die Entdeckung oder Bestimmung von Immunkomplexen, insbesondere löslichen Immunkomplexen, welche im Blut von Patienten mit verschiedenen Krankheiten gelöst sind, erlaubt eine Erforschung und Diagnose von Krankheiten, eine Analyse von Krankheitsursachen und eine weitere Prognose, so dass verschiedene Methoden zur Entdek-kung und Bestimmung von Immunkomplexen vorgeschlagen worden sind. Derartige bereits bekannte Verfahren sind physicochemische Methoden, wie Ultrazentrifugation, und immunbiologische Verfahren, wie die Anti-Immunglo-bulinmethode und Verfahren, bei denen Komplemente oder Zellen verwendet werden. Die herkömmlichen Verfahren t

zum Nachweis von löslichen Immunkomplexen im Blut sind jedoch lediglich Antigen unspezifische Methoden, ausgenommen in den Fällen, in denen das pathogene Antigen spezifisch bekannt ist. Es ist bekannt, dass die Immunkomplexe bildenden Antigene verschiedenartig sind und im allgemeinen mit Antikörpern bedeckt sind, so dass ihr spezifischer Nachweis schwierig ist. Dementsprechend wird bei den herkömmlichen Methoden anstelle des Nachweises des Antigens die Menge eines an das Antigen gebundenen Antikörpers bestimmt, so wird beispielsweise die Menge an Immunglobulin gemessen und die gemessene Menge des Antikör5

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pers als Menge an Immunkomplex in der Probe behandelt. Folglich ist die so bestimmte Immunkomplexmenge für das Antigen, welches eine der Komponenten des Immunkomplexes bildet, unspezifisch. Darüber hinaus koaguliert das inhärent in der Probe vorhandene Immunglobulin und spezifisch innerhalb des Messsystems, mit dem Ergebnis, dass das koagulierende Immunglobulin zu der Menge des zu messenden Immunkomplexes addiert wird. Der Anteil einer derartigen Immunglobulinkoagulation variiert stark von Probe zu Probe und ausserdem in Abhängigkeit von den Messbedingungen. Darüber hinaus ist zurzeit keine Methode zur Unterscheidung der Koagulation vom Immunkomplex verfügbar.

Es ist berichtet worden, dass die Menge eines Immunkomplexes bei Krebs hoch im Verhältnis zu dessen Fortschreiten, d.h. der Metastasenbildung, ist (A.N. Theofilopoulos et al., J. Immunol., 119 (1977), 657). Es ist jedoch vollkommen unklar, ob der mit Hilfe der konventionellen Methode bestimmte Immunkomplex ein Komplex aus krebsspezifischem Antigen und Antikörper ist. Insbesondere tritt im Fall von Krebs häufig als Begleitreaktion eine Bildung eines Antikörpers auf, der mit den Bestandteilen normaler Zellen oder Gewebe reagiert, d.h. ein Autoantikörper, welcher eine unspezifische Reaktion eingeht. Dementsprechend muss bei der Immunkomplexbestimmung bei einer derartigen bösartigen Erkrankung das den Immunkomplex bildende Antigen identifiziert werden. Andernfalls ist es unmöglich, die Krankheit, deren Spezifizität und dergleichen genau zu bestimmen.

Im Hinblick auf die im vorhergehenden beschriebene Situation wurden intensive Forschungen durchgeführt, um eine Technik zur Bestimmung Antigen spezifische Immunkomplexe zu schaffen, welche geeignet ist, einen für ein Tumorantigen spezifischen Immunkomplex, welche in der Körperflüssigkeit des Patienten vorhanden ist, in spezifischer Weise zu bestimmen. In der Folge wurde gefunden,

dass Körperflüssigkeiten von Patienten komplementbindende Immunkomplexe enthalten, worin die als Bestandteile vorhandenen Antigene Tumorantigene sind (Tumor-Marker), wie beispielsweise BFP basisches Fetoprotein), AFP (a-Fetoprotein), TAG (vgl. JP-OS EN (ICokai), No. 29949/ 1982, No. 29950/1982 und No. 29951/1982), CEA (carzino-embryonales Antigen), usw. Es wurde weiterhin gefunden, dass es möglich ist, einen derartigen Immunkomplex, wenn an ein immobilisiertes Antikomplement gebunden, in spezifischer Weise an eine markierte Substanz zu binden, oder einen Immunkomplex allein in spezifischer Weise zu immobilisieren und markieren und dass die gestellte Aufgabe erfüllt werden kann, indem die spezifische Aktivität des resultierenden immobilisierten markierten Reaktionsproduktes oder der nicht umgesetzten markierten Substanz bestimmt wird.

In Rinsho Kensa (Tokyo) von Februar 1977, Seiten 136 bis 142, sind herkömmliche, nicht-spezifische Verfahren zur Bestimmung aller Arten von Immunkomplexen, unabhängig von den Anteilen der Antigenen, offenbart. Somit bezieht sich diese Literatur nicht auf tumorspezifische Antigene TAG.

Auf Seite 15, Zeilen 10 bis 18 der englischen Übersetzung ist erwähnt, dass fallsein Immunkomplex festgestellt wird, die Frage offen bleibt, was das Antigen bewirken kann, und zwar wegen der Vielzahl der Antigene. Ferner wird darauf hingewiesen, dass kein schnell durchführbares Verfahren zur Verfügung steht und somit in den Laboratorien auf grosses Interesse stösst.

Daraus geht hervor, dass diese Literatur kein Verfahren beschreibt oder andeutet, das spezifisch zur Bestimmung von Immunkomplexen verwendet werden kann.

Ferner wird das Vorhandensein von Immunkomplexen, die Bestandteile der Antigene BFP, AFP, TAG oder CEA aufweisen, nicht einmal erwähnt.

In Rensho Kensa (Tokyo) vom Januar 1979 wird zudem ein herkömmliches, nicht-spezifisches Verfahren zur Bestimmung von Immunkomplexen beschrieben.

Diese Publikation enthält aber keine Hinweise auf einen Immunkomplex, indem der Antigen-Bestandteil aus BFP, AFP, TAG oder CEA besteht.

Schliesslich ist in der Publikation Koso Meneki Sokuteiho oder Enzyme Immunoassay ein sogenanntes Sandwich-Verfahren beschrieben, das aber keine Hinweise auf eine Verwendung für Immunkomplexe und auch nicht deren Existenz erwähnt, dessen Bestandteile BFP, AFP, TAG oder CEA einschliessen.

Dieses Verfahren war bisher nicht bekannt und schafft eine Technik zur Bestimmung von Immunkomplexen, welche für Tumorantigene spezifisch sind, und ermöglicht die Überwindung der bisher bei der Bestimmung auftretenden Schwierigkeiten. Es können derartige Immunkomplexe mit Hilfe eines verhältnismässig einfachen Verfahrens spezifisch bestimmt werden. Folglich ist das Verfahren pathologisch und klinisch für die Untersuchung, Diagnose und Prognose von Tumoren ausserordentlich nützlich.

Die Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens werden im folgenden detailliert beschrieben.

Eine Variante des Verfahrens kann ausgeführt werden, indem man einen Tumorantigen-Antikörperkomplex, welcher Komplementbindungseigenschaften besitzt und als Immunkomplex in einer Körperflüssigkeit vorhanden ist, mit einem immobilisierten Antikomplement zur Bildung eines Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierten Antikomplement umsetzt. Der in der Körperflüssigkeit anwesende und erfindungsgemäss für die Bestimmung verwendete Immunkomplex ist ein Komplex, in dem das Antigen ein Tumorantigen aus der aus BFP, AFP, CEA und TAG bestehenden Gruppe ist. Der Immunkomplex, bei dem das Antigen BFP oder TAG ist, wird bevorzugt. Der Immunkomplex, worin das Antigen BFP oder AFP ist, wurde zuerst mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens nachgewiesen. Bis dahin war nicht bekannt, dass in Körperflüssigkeiten derartige Immunkomplexe vorhanden sind. Die die oben erwähnten Antigene enthaltenden Immunkomplexe können an Komplemente gebunden werden, d.h., sie besitzen die Fähigkeit, das Komplementsystem zu aktivieren, und sind an das Komplement gebunden vorhanden, d.h. in Form eines Antigen-Antikörper-Komplement-Komplexes. Dementsprechend ist erfindungsgemäss der Immunkomplex an ein immobilisiertes Antikomplement gebunden, unter Ausnützung der Komplementbindungseigenschaften des Immunkomplexes. Geeignete Proben für die Durchführung der Bestimmung sind verschiedene Körperflüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Ascites, Pleuraexsudat, Spinalflüssigkeit und dergleichen. Wird beispielsweise Blut als Probeflüssigkeit verwendet, so ist die Verwendung von Serum oder Plasma zu bevorzugen, welche vor der Verwendung in üblicher Weise behandelt werden. Die Menge der zu verwendenden Probe beträgt im allgemeinen etwa 0,01 bis etwa 1,0 ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,3 ml.

Das immobilisierte Antikomplement ist im Handel erhältlich oder kann durch chemische oder physikalische Reaktion eines Antikomplements mit einem unlöslichen Träger in üblicherweise hergestellt werden. Die Wahl des Antikomplements ist nicht besonders beschränkt sofern dieses ein Antikörper gegen eine Humankomplementkomponente Clq oder C3 oder dergleichen ist. Derartige Antikom-plemente sind im Handel erhältlich oder können nach üblichen Methoden hergestellt werden.

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Beispiele für geeignete unlösliche Träger sind Cellulose-pulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carbo-xymethylcellulose, lonenaustauscherharz, Dextran, Kunststoffolie, Kunststoffrohre, Nylon, Glasperlen, Seide, Poly-aminmethylvinyläthermaleinsäurecopolymer, Aminosäure-copolymer, Äthylenmaleinsäurecopolymer und dergleichen. Die Immobilisierung des Antikomplements kann nach einem der folgenden Verfahren vorgenommen werden: die Art zu verfahren als kovalentes Bindungsverfahren, Peptid-verfahren (Verfahren unter Verwendung von Säureamidderi-vaten, Carboxychloridharzen, Carbodiimidharzen, Maleinsäureanhydridderivaten, Isocyanatderivaten, Bromcyan aktivierten Polysacchariden, Cellulosecarbonatderivaten oder Verfahren unter Verwendung eines Kondensationsmittels), Alkylierungsverfahren, Trägerbindungs verfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, Hexamethylenisocyanat oder dergleichen, Trägerbindungsverfahren unter Verwendung der Ugi-Reaktion oder ähnlicher chemischer Verfahren ; Ionenbindungsverfahren, bei denen ein Ionenaustauscherharz oder ein ähnlicher Träger verwendet wird ; oder Verfahren unter Ausnützung einer physikalischen Adsorption, wobei Glasperlen oder ähnliches poröses Glas als Träger verwendet wird.

Die Bindung des Immunkomplexes an das immobilisierte Antikomplement kann beispielsweise durch Umsetzen einer Probe, welche den Immunkomplex enthält, mit dem immobilisierten Antikomplement in etwa 0,2 bis etwa 0,5 ml einer Pufferlösung erfolgen. Die Reaktion kann bei etwa 4 bis etwas 37°C während etwa 0,5 bis etwa 48 Stunden durchgeführt werden. Die in Betracht kommenden Pufferlösungen sind nicht besonders begrenzt und schliessen schwach alkalische Pufferlösungen, welche üblicherweise einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 aufweisen, ein, wie beispielsweise 0,5 M Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer, Borsäurepuffer oder dergleichen. Die Pufferlösung kann ausserdem übliche Zusatzstoffe, wie Rinderserumalbumin (BSA), oder ein ähnliches Schutzprotein, Thimerosal oder ein ähnliches Antiseptikum, NaCl und dergleichen, enthalten.

Die Reaktion liefert ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement. Das Bindungsprodukt wird anschliessend gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen gewaschen und danach mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz umgesetzt, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für das Tumorantigen oder den Antikörper, welche den , Immunkomplex des Bindungsproduktes bilden, aufweist.

Die markierte Substanz, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für das Tumorantigen aufweist, wird hergestellt, indem man in üblicher Weise ein Markierungsmittel mit dem Antikörper gegen das den zu bestimmenden Immunkomplex bildenden Tumorantigen umsetzt, z.B. Anti-BFP für BFP, Anti-AFP für AFP, Anti-CEA für CEA oder Anti-TAG fürTAG. Im Falle von TAG ist es ausserdem möglich, als markierte Substanz Produkte zu verwenden, welche durch Reaktion eines Markierungsmittels mit verschiedenen Lecithinen erhalten werden.

Beispiele für derartige Lecithine sind solche, die ein spezifisches Bindungsvermögen mit endständiger Galactose aufweisen [J.B.C. 250, (1975), 8518-8523; Biochem. Biophys. Res. Comm., 62, (1975), 144;Z. Immunitätsforsch, 138, (1969), 423-433 ; Br. J. Exp. PathoL, 27, (1946), 228-236;

Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 75, Nr. 5, (1978), 2215-2219; Bio-chemistry 13, (1974), 196-204; Carbohydrate Research, 51, ( 1976) 107-118], wie Erdnusslecithin («PNA»), Rizinussa-menlecithin (Ricinus Commuris), und dergleichen; Lecithin mit einem spezifischen Bindungsvermögen an endständiges N-Acetylgalactosamin, wie Lecithin von Dolichosbohnen (Dolichos bifluorus), Lecorangen, Helixpomatia, Limabohnen (Phaseolus limensis), Sojabohnen (Glycine max) oder Bauhiniabohnen (Bauhinia purpurea); und solche mit einem spezifischen Bindungsvermögen an endständige L-Fucose wie Lecithin von Lotus tetragonolobus [Brt. J. Enp. Pathi, 34(1953), 94], von Ulex europeus [Boyd. W.C. und E. Sharpleigh, Blood, 9, (1954), 1195] und dergleichen.

Die markierte Substanz, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für den Antikörper gegen das Tumorantigen aufweist, wird hergestellt, indem man ein Markierungsmittel mit dem Tumorantigen selbst in üblicher Weise umsetzt, zum Beispiel BFP, AFP, TAG oder CEA. Als derartige Antikörper, Antigene und Lecithine sind solche brauchbar, die im Handel erhältlich sind oder nach üblichen Methoden hergestellt werden können [Masaru Ishii et al., Saishin Igaku, (Modern Medicine) Vol. 36, No. 5,(1981), Seiten 860-866],

Die Auswahl der Markierungsmittel zur Herstellung der markierten Substanzen, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für das Tumorantigen oder dessen Antikörper aufweisen, ist nicht besonders begrenzt. Beispiele für brauchbare Markierungsmittel sind übliche enzymatische Markierungsmittel, wie Glucoamylase, Glucoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galactosidase, aktive Fragmente von Enzymen, wie Hemoctapeptide und dergleichen ; ferner radioaktive Markierungsmittel wie 1251,131I und ähnliche radioaktive Iodisotope, radioaktives Lithium und dergleichen. Markierte Substanzen können wie im folgenden beschrieben hergestellt werden. So können beispielsweise Enzym markierte Substanzen unter Verwendung der genannten enzymatischen Markierungsmittel mit Hilfe eines Bindungsprozesses unter Verwendung von Glutaraldehyd, der als übliches Vernetzungsmittel für Proteine bekannt ist, hergestellt werden. Insbesondere wenn Glukoseoxidase oder Peroxidase verwendet wird, ist ein Verfahren brauchbar, bei dem Aldehyd mittels der Periodsäuremethode in die Glykol-bindung des Enzyms eingeführt wird und die Bindung danach mit der Aminogruppe der zu markierenden Substanz verbunden wird. [Method in Enzymology, Vol. 37, (1975) Seiten 133-136]. Ebenfalls brauchbar ist ein Verfahren, bei dem der Antikörper in F(ab' )-SH, dem Maleinimid einverleibt ist, eingebracht und das resultierende Produkt an das Markierungsmittel gebunden wird [Journal of Biochemistry, Vol. 79 ( 1976), Seiten 233-236 und I.e. Vol. 62 ( 1976) Seiten 285-292]. I25I, l3lI und dergleichen können für eine Markierung verwendet werden, zum Beispiel unter Anwendung des üblichen Chloramin-T-Verfahrens [Nature, 194, (1962), Seite 495; Biochem. J., 89, (1963), Seite 114].

Die oben erwähnten markierten Substanzen zur Verwendung für das erfindungsgemässe Verfahren sind im Handel erhältlich und sind für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendbar.

Die Umsetzung zwischen dem Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement und der markierten Substanz kann in dergleichen Weise durchgeführt werden wie die Umsetzung zwischen der Probe und dem immobilisierten Antikomplement.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das so mit der markierten Substanz markierte Reaktionsprodukt von der nicht umgesetzten markierten Substanz abgetrennt, worauf entweder das Reaktionsprodukt oder die nicht umgesetzte Substanz auf ihre spezifische Aktivität hin untersucht wird. Die Abtrennung kann leicht mit Hilfe üblicher Methoden bewirkt werden, zum Beispiel durch Entfernen der Flüssigkeit vom Reaktionsprodukt durch Absaugen und Waschen des zurückbleibenden Produktes, wenigstens dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung. Die spezifische Aktivität des Produktes oder der Substanz wird mit einer Methode gemessen, die für das verwendete Markierungsmittel geeignet ist. Wurde beispielsweise ein enzymati-

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sches Markierungsmittel verwendet, so bringt man dieses auf dem Substrat des Enzyms zur Entfaltung seiner Wirkung und bestimmt die Menge des zersetzten Produktes des Substrates mit Hilfe einer üblichen Methode, zum Beispiel mittels Extinktionsmessung. Wurde ein radioaktives Markierungsmittel verwendet, so erfolgt die Bestimmung mit einer üblichen Zählmethode für radioaktive Strahlung. Wird die spezifische Aktivität der nicht umgesetzten markierten Substanz gemessen, so kann die Aktivität des Reaktionsproduktes leicht rechnerisch als Differenz zwischen der spezifischen Aktivität der nicht umgesetzten Substanz und der anfänglichen spezifischen Aktivität der verwendeten markierten Substanz ermittelt werden.

Auf diese Weise kann ein spezifischer Immunkomplex in der Probe, d.h. nur der Immunkomplex, welcher BFP, AFP, CEA oder TAG als konstituierendes Antigen enthält, leicht in spezifischer Weise mit Hilfe einer der Varianten des erfindungsgemässen Verfahrens bestimmt werden.

Die zweite Variante des erfindungsgemässen Verfahrens wird wie im folgenden beschrieben durchgeführt und kann in gleicherweise wie die zuerst beschriebene Variante zur Lösung der Aufgabe der Erfindung herangezogen werden.

Bei der Durchführung der zweiten Verfahrensvariante wird eine Probe, welche den gleichen spezifischen Immunkomplex wie im Falle der erstgenannten Variante enthält, mit einer immobilisierten Substanz, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für das Tumorantigen oder dessen Antikörper, welche den Immunkomplex bilden, umgesetzt.

Die immobilisierte Substanz ist das oben erwähnte Anti-BFP, Anti-AEP, Anti-CEA, Anti-TAG, Lecithin, BFP, AFP oder CEA, an einen üblichen unlöslichen Träger fixiert, zum Beispiel einen der bereits erwähnten. Das oben erwähnte Anti-BFP, Anti-AFP, Anti-TAG, Anti-CEA, Lecithin, BFP, AFP, TAG oder CEA kann auf dem unlöslichen Träger mit Hilfe einer bekannten Methode fixiert werden, zum Beispiel mit Hilfe der gleichen Technik, wie sie zu der Herstellung des immobilisierten Antikomplements beschrieben ist.

Die Umsetzung zwischen der Probe und der immobilisierten Substanz wird in gleicherweise durchgeführt wie die Umsetzung zwischen der Probe und dem immobilisierten Antikomplement, wobei nur der in der Probe anwesende spezifische Immunkomplex selektiv als immobilisierter Feststoff erhalten werden kann.

Bei der zweiten Verfahrensvariante des erfindungsgemässen Verfahrens wird das so erhaltene Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz dann mit einem markierten Antikomplement Anti-Antikörper oder Protein A umgesetzt. Das zu verwendende markierte AntiKomplement bzw. der markierte Anti-Antikörper wird durch Markieren eines Antikomplements oder eines AntiAntikörpers, welcher mit dem Komplement oder dem Antikörper des immobilisierten Immunkomplexes eine Immunreaktion eingeht, mit einem üblichen Markierungsmittel hergestellt.

Das Antikomplement und das Markierungsmittel können die gleichen sein wie sie für die Durchführung der ersten Verfahrensvariante verwendet wurden. Der Anti-Antikörper unterliegt keiner besonderen Begrenzung, sofern er ein Antikörper gegen den Antikörper ist. Wird beispielsweise eine von einem menschlichen Körper entnommene Probe für die Bestimmung verwendet, so ist Anti-Humanimmunglobulin G oder dergleichen brauchbar. Die Markierungsmethode kann die gleiche sein, wie sie üblicherweise zur Anwendung kommt. Anstelle des markierten Antikomplements oder des markierten Anti-Antikörpers kann in ähnlicher Weise markiertes Protein A verwendet werden. Als solches kann beispielsweise handelsübliches Protein A verwendet werden, welches zum Beispiel vom E.Y. Laboratory hergestellt wird.

Die Reaktion zwischen dem Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz und dem markierten Antikomplement, markiertem Anti-Antikörper oder markiertem Protein A kann zum Beispiel unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden wie die im vorhergehenden beschriebene Reaktion zwischen der Probe und dem immobilisierten Antikomplement.

Das so erhaltene Reaktionsprodukt und die nicht umgesetzte markierte Substanz (markiertes Antikomplement, markierter Anti-Antikörper oder markiertes Protein A) werden voneinander getrennt und in der gleichen Weise wie bei der ersten Verfahrensvariante auf ihre spezifische Aktivität hin untersucht, wobei nur der spezifische Immunkomplex in der Probe in spezifischer Weise nachgewiesen und bestimmt werden kann. Auf diese Weise kann der in der Körperflüssigkeit enthaltene Immunkomplex, welcher das spezifische Tumorantigen enthält, mit Hilfe der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Dies stellt eine Krebsdiagnose vom Anfangs- bis zum Endstadium sicher und ermöglicht insbesondere eine Frühdiagnose von Krebs. Da mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens das spezifische Tumorantigen, welches in der Körperflüssigkeit in Form eines Immunkomplexes anwesend ist, spezifisch bestimmt werden kann, ist die Erfindung für die Diagnose, Analyse und Erforschung von Krebserkrankungen, Autoimmunerkrankungen und dergleichen nützlich, welche mit Hilfe der herkömm lichen Technik zur Bestimmung derartiger Antigene in freier Form nicht nachgewiesen werden können.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Referenzbeispiele und der Beispiele näher erläutert.

Das Verfahren nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie folgt durchgeführt werden:

(1) Umsetzen des komplexbindenden, in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorliegenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes entweder mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für TAG oder den Antikörper gegen TAG, welche Bestandteil des Komplexes sind, aufweist, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden ;

(2) Umsetzen des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz, welche ein spezifisches Bindungsvermögen für TAG oder den Antikörper gegen TAG, welche das Bindungsprodukt bilden, aufweist, oder Umsetzen des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, Anti-Antikörpers oder Protein A ;

(3) Abtrennen des resultierenden Reaktionsproduktes vor der nicht umgesetzten, markierten Substanz oder dem markierten Antikomplement, Anti-Antikörper oder Protein A; und

(4) Bestimmen der spezifischen Aktivität des Reaktionsproduktes oder des abgetrennten, nicht umgesetzten Reaktionspartners.

Insbesondere kann die in Stufe 1 verwendete immobilisierte Substanz, die mit dem Immunkomplex umgesetzt wird ein immobilisiertes Lecithin mit einem spezifischen Bindungsvermögen für endständige Galactose sein. Danach wirc das resultierende Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Lecithin mit einem, mit einem Enzym markierten, Anti-Clq-Antikörper, Anti-C3-Antikörper oder Protein A umgesetzt.

Das Verfahren nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie folgt ausgeführt werden:

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{1) Umsetzen eines komplementbindenden, in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex anwesenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz mit einem spezifischen Bindungsvermögen für BFP oder den Antikörper gegen BFP, welche Bestandteile des Komplexes sind, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden;

(2) Umsetzen des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit einem spezifischen Bindungsvermögen für BFP oder den Antikörper gegen BFP, welche Bestandteile des Bindungsproduktes sind, oder Umsetzen des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, Anti-Antikörpers oder Protein A ;

(3) Abtrennen des resultierenden Reaktionsproduktes von der nicht umgesetzten markierten Substanz oder dem markierten Antikomplement oder Anti-Antikörper oder Protein A;und

Insbesondere kann das in Stufe 1) verwendete immobilisierte Anti-Komplement, welches mit dem Immunkomplex umgesetzt wird, ein immobilisierter Anti-C3-Antikörper oder Anti-Clq-Antikörper sein. Dann wird das resultierende Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einem, mit einem Enzym markierten, Anti-BFP-Antikörper umgesetzt.

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Referenzbeispiele und Beispiele näher erläutert werden.

Referenzbeispiel 1 Herstellung von C3-Sepharose 4B Zu 1,51 einer IO"3 n wässrigen Salzsäurelösung wird eine Menge von 15 g (Trockengewicht) Bromcyan (CNBr) aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) zugesetzt. Die Mischung wird während 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, worauf die salzsaure Lösung mittels eines Glasfilters entfernt wird. Der feste Anteil wird mit 3 1 0,1 molarem Bicarbonatpuffer (pH 8,0) gewaschen und dann zu 200 ml 0,1 molarem Bicarbonatpuffer (pH 8,0) hinzugefügt. Anschliessend wurden 100 mg Human C3 [Biochemical Journal (England), Band 193 (3), (1981), Seiten 963-970] zu dem Gemisch hinzugefügt und die entstandene Mischung bei Raumtemperatur während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mittels eines Glasfilters filtriert, der feste Anteil zu 200 ml 1 molarer wässriger Monoäthanolaminlösung (pH 8,0) hinzugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehengelassen. Die Mischung wurde durch ein Glasfilter geleitet, worauf der feste Anteil gründlich mit 210,1 molaren Essigsäurepuffers (pH 4,0), welcher 0,5 mol NaCl enthielt, und danach mit 21 Boratpuffer (pH 8,0), welcher 0,5 mol NaCl enthielt, gründlich gewaschen wurde. Der Waschvorgang wurde wiederholt, bis die optische Dichte bei 280 nm (OD280) der Waschflüssigkeiten auf einen Wert nicht höher als 0,002 abnahm, wobei Human C3-Sepharose 4B erhalten wurde. Das Produkt wurde in 0,05 molarem Phosphatpuffer, welcher 0,2% BSA und 0,2% NaN3 enthielt, bei 4°C zur Verwendung aufbewahrt.

Referenzbeispiel 2

(1) Herstellung von Anti-C3-Serum

Eine Menge von 10 mg Human C3 (das gleiche wie im Referenzbeispiel 1) wurde in 10 ml physiologischer Kochsalzlösunggelöst, dann wurde 1 ml der Lösung mit 1 ml vollständigem Freund'schem Adjuvans vermischt und die Mischung in einer Dosierung von 0,2 ml subkutan an ein Kaninchen verabreicht. Die Mischung wurde mit der gleichen Dosierung 2 Wochen später verabreicht und dann einen Monat nach der zweiten Immunisierung. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde das Blut aufgefangen, um Antihuman-C3-Serum zu erhalten.

(2) Herstellung von F(ab' )z von Anti-C3-Antikörper [F(ab')>Anti-C3]

Eine Menge von 10 ml Anti-C3-Serum, welches nach Verfahren (1) erhalten worden war, wurde mit 20 ml 0,9%iger NaCl-Lösung vermischt, worauf 10 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung tropfenweise zu der Mischung hinzugefügt wurden. Die entstandene Mischung wurde zentrifugiert (3000 Upm, 15 Minuten), um einen festen Anteil zu erhalten, welcher mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) dialy-siert wurde, um eine y-Globulinfraktion herzustellen. Die Fraktion wurde einer Affinitätschromatographie unterworfen, wobei eine Säule mit C3-Sepharose 4B, nach Referenzbeispiel 1 erhalten, geleitet wurde, worauf mit 0,05 molarem Phosphatpuffer (pH 7,4), welcher 0,14 mol NaCl enthielt, gewaschen und mit 0,1 molarer wässriger Essigsäurelösung, welche 0,5 mol NaCl enthielt, eluiert, um gereinigten Anti-C3-Antikörper zu erhalten. Der Antikörper wurde mit 4 mg Pepsin bei 24°C während 24 Stunden behandelt und dann einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-150 unterworfen, worauf mit 0,1 molarem Boratkupfer (pH 8,0), welcher 0,5 mol NaCl enthielt, eluiert wurde, um die F(ab' )2kl-Anti-C3-Fraktion zu erhalten.

Referenzbeispiel 3

Herstellung von enzymmarkiertem Antikörper [mit alkalischer Phosphatase markierter F(ab')2-Anti-BFP]

F(ab')2-Anti-BFP wurde in dergleichen Weise, wie in Referenzbeispiel 2 beschrieben, hergestellt. Ein Anteil von 10 mg des Produktes und 10 mg alkalische Phosphatase (Typ II, kristalline alkalische Rinderintestinalphosphatase [englisch: bovine intestinal alkaline phosphatase crystals], SIGMA Chemical Co.) wurden zu 10 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer (pH = 7,5), welcher 0,5 mol NaCl enthielt, zugegeben, worauf 0,5 ml 25%ige Glutaraldehydlösung langsam tropfenweise zu der Mischung hinzugefügt wurden. Die entstandene Mischung wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von 5 g Glycin wurde der Uberschuss an Glutaraladehyd blockiert, und die Mischung mit physiologischer Kochsalzlösung dialysiert. Die erhaltene Flüssigkeit wurde eingeengt und dann einer Gelfiltration an Sepharose 6B (Farmacia) unterworfen, um eine aktive Fraktion aufzufangen und durch alkalische Phosphatase markierten F(ab')>Anti-BFP zu erhalten.

Referenzbeispiel 4

Herstellung von immobilisiertem F(ab' )2-Anti-C3

Im Referenzbeispiel 2 erhaltenes F(ab')2-Anti-C3 wurde mit 0,1 molarem Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) auf 25 (ig/ml eingestellt. Die Lösung wurde in den Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte (aus Polyvinylchlorid hergestellt, U-Platte, Cooke-Engineering Co.) in einer Menge von 150 (il je Vertiefung untergebracht, während einer Stunde bei 37°C inkubiert und dann bei 4°C während 20 Stunden stehengelassen. Nach dem Entfernen der Lösung aus den Vertiefungen, wurden die Vertiefungen dreimal mit Kochsalzlösung gewa-

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sehen, um immobilisiertes F(ab')2-Anti-C3 zu erhalten. Die bei denen der Anteil an freier BFP hoch ist, wurde gefunden, Vertiefungen wurden mit einem Tris-HCl-Puffer zum dass die Werte für BFP enthaltenden Immunkomplex im

Abdichten gefüllt und bei 4°C aufbewahrt. Der Puffer wurde aggravierten Stadium der Hepatitis niedrig waren, wohin-unmittelbar vor der Verwendung entfernt. gegen hohe Werte an BFP enthaltenden Immunkomplex im

5 Stadium der Genesung erhalten wurden. Das Ergebnis Referenzbeispiel 5 scheint anzuzeigen, dass das von regenerierenden Leber-

Herstellung von immobilisiertem Lecithin (PNA-Perlen) zellen produzierte BFP demjenigen von Krebszellen abgelei-Polystyrol-Perlen (Précision Plastic Co., Ltd., USA, tetem äquivalent ist, und zeigt weiter, dass das vorliegende

6,4 mm Durchmesser) wurden mit 1 n wässriger NaOH- Verfahren zur klinischen Identifizierung von Hepatitis

Lösung und abwechselnd mit 1 n wässriger HCl-Lösung io nützlich ist.

gewaschen, und zwar mit jeder Lösung dreimal, und danach mit destilliertem Wasser so lange gewaschen, bis der pH-Wert der Waschflüssigkeit annähernd 7 betrug. Von diesen Perlen Beispiel 2

wurden 1000 in 120 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer, welcher Eine in Referenzbeispiel 5 erhaltene PNA-Perle und 0,5 ml 100 p.g/ml PNA (Erdnusslecithin, Produkt der E.Y. Labora- is 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH = 7,4), welcher 0,2%

tory) enthielt, eingebracht und dann während 24 Stunden bei Gelatine, 0,15 mol NaCl, 5 mmol MgCk, 5 mmol CaCk und 4°C stehengelassen. Danach wurde abfiltriert und mit 0,01% Thimerosal enthielt, wurden zu 0,1 ml des Serums oder

Wasser gewaschen. Anschliessend wurden die Perlen in Plasmas, welche in Referenzbeispiel 6 erhalten wurden, hin-

200 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer, welcher 0,2% Gelatine zugefügt, worauf die Mischung während 5 Stunden bei 25°C enthielt, untergebracht und dann während 24 Stunden bei 20 inkubiert wurde. Die Perle wurde dann dreimal mit physiolo-4°C stehengelassen. Danach wurde abfiltriert und mit gischer Kochsalzlösung gewaschen und danach zu einer

Wasser gewaschen, um immobilisiertes PNA zu erhalten. Die Mischung von 0,1 ml Peroxidase-markiertem Protein A PNA-Perlen wurden in 0,05 molarem Phosphatpuffer (0,14 (4000fache Verdünnung, E.Y. Laboratory) und 0,5 ml 0,05 mol NaCl, 0,2% Gelatine, 0,01% NaN3, pH = 7,4) aufbe- molaren Tris-HCl-Puffers (pH = 7,4), welcher 0,2% Gelatine,

wahrt. 25 0,15 mol NaCl und 0,01%Thimerosal enthielt, hinzugefügt,

worauf während 16 Stunden bei 25°C inkubiert wurde. Referenzbeispiel 6 Danach wurde die Perle dreimal mit physiologischer Koch-

Herstellung von Proben salzlösung gewaschen, worauf 0,5 ml 0,2 molaren Zitronen-

Blutmengen von 2 ml wurden von gesunden Personen, säure-Phosphatpuffers (pH = 5,0), welcher 0,03% H2O2 und

Patienten mit verschiedenen Krebsarten und anderen Krank- 30 1,0 ml physiologische Kochsalzlösung, welche 4 mg/ml heiten entnommen, danach koaguliert und zentrifugiert o-Phenylendiamin enthielt, zugegeben wurde. Danach wurde

(2000 Upm, 10 Minuten), um das zu untersuchende Serum zu die Mischung während 10 Minuten bei Raumtemperatur erhalten. Ähnliche Blutproben wurden mit einer Spritze, die inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,0 ml 1 n mit Heparin behandelt war (500 Einheiten), entnommen und wässriger Salzsäurelösung abgebrochen. Die Extinktion des zentrifugiert, um das zu untersuchende Plasma zu erhalten. 35 Reaktionsgemisches wurde bei einer Wellenlänge von

492 nm gemessen. Fig. 2 zeigt das Ergebnis.

Beispiel 1

Von dem in Referenzbeispiel 6 erhaltenen Serum wurden In Fig. 2 sind bei V die Ergebnisse einer Gruppe von 26 jeweils Mengen von 0, l ml in jede Vertiefung der Mikrotiter- gesunden Personen (Kontrollgruppe) und bei VI eine Gruppe platte, welche das immobilisierte F(ab')2-Anti-C3, hergestellt 40 von 32 Krebspatienten aufgeführt. Das Diagramm erlaubt in Referenzbeispiel 4, enthielt, eingebracht und während 2 die Diagnose von Krebs.

Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dem Entfernen des Reaktionsgemisches durch Absaugen wurde die Vertiefung dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Beispiel 3

Danach wurden 0,1 ml des markierten F(ab' )2-Anti-BFP, 45 Eine in Referenzbeispiel 5 erhaltene PNA-Perle und 0,5 ml hergestellt in Referenzbeispiel 3, in die Vertiefung einge- 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH = 7,4), welcher 0,2%

bracht und während 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Ent- Gelatine, 0,15 mol NaCl, 5 mmol MgCk, 5 mmol CaCk und fernen des Reaktionsgemisches durch Absaugen wurde die 0,01% Thimerosal enthielt, wurde zu 0,1 ml des nach Refe-Vertiefung dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung renzbeispiel 6 erhaltenen Serums oder Plasmas hinzugefügt,

gewaschen. Danach wurden in die Vertiefung 0,1 ml einer 50 Danach wurde die Mischung während 5 Stunden bei 25°C Substratlösung (0,1 molare wässrige Diäthanolaminlösung inkubiert. Dann wurde die Perle dreimal mit physiologischer [pH = 10], welche 50 mg/100 ml p-Nitrophenylphosphor- Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend zu einer säure enthielt) eingebracht, worauf 1 Stunde lang bei 37°C Mischung aus 0,1 ml Peroxidase markierten Ziegen-Anti-inkubiert wurde. Um die Reaktion abzubrechen, wurde eine Human-C3-Antikörper (Produkt der E.Y. Laboratory, X 10) Menge von 0,1 ml 1 n wässrige Natriumhydroxidlösung zuge- ss und 0,5 ml 0,05 molaren Tris-HCl-Puffers (pH = 7,4), welche geben. 0,2% Gelatine, 0,15 mol NaCl und 0,01% Thimerosal enthielt,

Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei einer hinzugefügt. Danach wurde die erhaltene Mischung wäh-Wellenlänge von 405 nm mittels eines Spektrometers unter rend 16 Stunden bei 25°C inkubiert. Anschliessend wurde die Verwendung einer Küvette mit einer Dicke von 1 mm Perle dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewa-

gemessen. Fig. 1 zeigt das Ergebnis. ßo sehen, wobei 0,5 ml 0,2 molaren Zitronensäure-Phosphatpuf-

InFig. 1 sind bei I die bei 19 gesunden Personen (Kontroll- fers (pH 5,0), welche 0,03% H2O2 enthielt und 1,0 ml physio-gruppe), bei II eine Gruppe von 16 Patienten mit primärem logische Kochsalzlösung, welche 4 mg/ml o-Phenylendiamin Leberkrebs, bei III eine Gruppe von 19 Patienten mit Magen- enthielt, zugesetzt wurden. Die Mischung wurde anschlies-krebs und bei IV eine Gruppe von 18 Patienten mit Hepatitis send während 30 Minuten bei Raumtemperatur inlcubiert. aufgeführt. Die Extinktionen oberhalb 0,250 sind in der 65 Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,0 ml 1 n wässriger Figur mit den Werten angegeben. Schwefelsäurelösung abgebrochen. Die Extinktion des Reak-

Das Diagramm erlaubt eine Krebsdiagnose. Bei der Durch- tionsgemisches wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm führung ähnlicher Messungen bei Patienten mit Hepatitis, gemessen. Figur 3 zeigt das Ergebnis.

9 662427

In Fig. 3 sind bei VII die Ergebnisse einer Gruppe von 19 Gruppe von 27 Krebspatienten angegeben. Das Diagramm gesunden Personen (Kontrollgruppe) und bei VIII einer erlaubt eine Krebsdiagnose.

B

3 Blatt Zeichnungen

Claims

662427 PATENTANSPRÜCHE

( 1 ) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen, komplementbindenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes entweder mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen aus basischem Fetoprotein, BFP, a-Fetoprotein, AFP, Tumor assoziierter Glykobindung, TAG oder dessen Antikörper, welche Bestandteile des Komplexes sind, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden; und

( 1 ) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen, komplementbindenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für BFP oder den Antikörper gegen BFP, welche Bestandteile des Komplexes sind zur Bildung eines Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder eines Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz; und

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für BFP oder den Antikörper gegen BFP, welche Bestandteile des Bindungsproduktes sind, oder Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge markierten Antikomplements, Anti-Antikörpers oder Protein A.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit einem immobilisierten Anti-C3-Antikörper umgesetzt und das resultierende Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Anti-C3-Antikörper mit, mit alkalischer Phosphatase markiertem, Anti-BFP-Antikörper zur Reaktion gebracht wird.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Verfahrensschritte aufweist:

(1) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenes komplementbindenden Tumoran-tigen-Antikörperkomplexes mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für TAG oder den Antikörper gegen TAG, welche Beständteile des Komplexes sind, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden;

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, Anti-Antikörpers oder Protein A.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit der immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für TAG umgesetzt wird, wobei die immobilisierte Substanz aus der aus immobilisiertem Anti-TAG, immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige Galactose, immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständiges N-Acetylgalactosamin und immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige L-Fucose bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit einem immobilisierten Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige Galactose umgesetzt und anschliessend das resultierende Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Lecithin mit einem enzymmarkierten Anti-Clq-Antikörper, Anti-C3-Antikörper oder Protein A zur Reaktion gebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit einem immobilisierten Erdnusslecithin umgesetzt und anschliessend das resultierende Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Erdnusslecithin mit, mit Peroxydase markiertem, Protein A zur Reaktion gebracht wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der resultierende Immunkomplex mit einem immobilisierten Erdnusslecithin umgesetzt und anschliessend das Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Erdnusslecithin mit, mit Peroxydase markiertem, Anti-C3-Antikörper zur Reaktion gebracht wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Verfahrensschritte aufweist:

(1) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen, komplementbindenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für TAG oder den Antikörper gegen TAG, welche den Komplex bilden, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden; und

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für TAG oder den Antikörper gegen TAG, welche das Bindungsprodukt bilden, oder Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, Anti-Antikörpers oder Protein A.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die markierte Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für TAG, welche Bestandteil des Komplexes ist, markiertes Anti-TAG, markiertes Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige Galactose, markiertes Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständiges N-Acetylgalactosamin oder markiertes Lecithin

2

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mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige L-Fucose ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die markierte Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für den Antikörper gegen TAG, welcher Bestandteil des Komplexes ist, markiertes TAG ist.

14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Verfahrensstufen aufweist:

(1) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen, komplementbindenden Tumoran-tigen-Antikörperkomplexes mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen BFP, AFP, TAG und CEA oder dessen Antikörper, welche Bestandteile des Komplexes bilden, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden; und

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, Antikörpers oder Protein A.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit der immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen umgesetzt wird, wobei die immobilisierte Substanz aus der aus immobilisiertem Anti-BFP, immobilisiertem Anti-AFP, immobilisiertem Anti-TAG, immobilisiertem Anti-CEA, immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige Galactose, immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständiges N-Acetylgalactosamin und immobilisiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige L-Fucose bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunkomplex mit der immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für den Antikörper, welcher Bestandteil des Komplexes ist, umgesetzt wird,

wobei die immobilisierte Substanz aus der aus immobilisiertem BFP, immobilisiertem AFP, immobilisierter TAG und immobilisiertem CEA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für den Antikörper, welcher einen Bestandteil des Komplexes bildet, immobilisierte TAG ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6,7,8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Anti-Komple-ment ein markierter Antikörper gegen eine Komplementkomponente Clq oder C3 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Verfahrensschritte aufweist:

( 1 ) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen komplementbindenden Tumorantigen-Antikörperkomplexes mit einem immobilisierten Antikomplement, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement zu bilden;

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen oder dessen Antikörper, welche Bestandteile des Bindungsproduktes sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsprodukt mit der markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen umgesetzt wird, wobei die markierte Substanz aus der aus markiertem Anti-BFP, markiertem Anti-AFP, markiertem Anti-TAG, markiertem Anti-CEA, markiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständige Galactose, markiertem Lecithin mit spezifischem Bindungsvermögen für endständiges N-Acetylgalactosamin und markiertem Lecithin mit spezifischem Bindungvermögen für endständige l^Fucose bestehenden Gruppe gewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsprodukt mit der markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für den Antikörper, der Bestandteil des Bindungsproduktes ist, umgesetzt wird,

wobei die markierte Substanz aus der aus markiertem BFP, markierter AFP, markiertem TAG und markiertem CEA bestehenden Gruppe gewählt ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2,3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das immobilisierte Antikomplement ein immobilisierter Antikörper gegen eine Komplementkomponente Clq oder C3 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Verfahrensschritte aufweist:

( 1 ) Reaktion eines in einer Körperflüssigkeit als Immunkomplex vorhandenen, komplementbindenden Tumoran-tigen-Antikörperkomplexes entweder mit einem immobilisierten Antikomplement oder mit einer immobilisierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen BFP, AFP, TAG oder CEA oder dessen Antikörper, welche den Immunkomplex bilden, um ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement oder ein Bindungsprodukt aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz zu bilden;

(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit einem spezifischen Bindungsvermögen für das Tumorantigen BFP, AFP, TAG und CEA oder dessen Antikörper, welche den Immunkomplex bilden oder Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, AntiAntikörpers oder Protein A;

(3) Abtrennung des gebildeten Reaktionsproduktes von der nicht umgesetzten markierten Substanz oder von dem nicht umgesetzten markierten Antikomplement, Anti-Antikörper oder Protein A; und

(4) Bestimmung der spezifischen Aktivität des Reaktionsproduktes oder des abgetrennten nichtumgesetzten Reaktionspartners.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen aufweist :

1. Verfahren zur Bestimmung eines Immunkomplexes, der spezifisch für ein Tumorantigen aus der Gruppe basisches Fetoprotein, BFP;a-Fetoprotein, AFP;Tumor assoziierte Glycobindung, TAG, und carzinoembryonales Antigen, CEA, ist, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
(2) Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisiertem Antikomplement mit einer vorgegebenen Menge einer markierten Substanz mit spezifischem Bindungsvermögen für das Tumorantigen BFP, AFP und TAG oder dessen Antikörper, welche den Immunkomplex bilden, oder Reaktion des Bindungsproduktes aus Immunkomplex und immobilisierter Substanz mit einer vorgegebenen Menge eines markierten Antikomplements, AntiAntikörpers oder Protein A.