DE3129923A1

DE3129923A1 - Verfahren zur bestimmung von tumor-assoziierten, glykoprotein enthaltenden verbindungen und verfahren zur diagnose von krebs

Info

Publication number: DE3129923A1
Application number: DE19813129923
Authority: DE
Inventors: Masakazu Takasaki Gunma Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-29
Publication date: 1982-04-08
Also published as: US4571382A; FR2487984A1; SE453947B; SE8104597L; DK157346C; JPS6116945B2; GB2083623A; ES504989A0; DK157346B; ES8302315A1; DK339381A; CH658132A5; FR2487984B1; IT8149004A0; JPS5729949A; NL8103606A; GB2083623B; DE3129923C2; IT1143216B

Description

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OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN

Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoprotein enthaltenden Verbindungen und Verfahren zur Diagnose von Krebs

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten Glycoproteine enthaltenden Substanzen (nachfolgend mit TAGS = tumor associated glycolinkage abgekürzt) in Körperflüssigkeiten von Säugern, d.h. TAGS einschliesslich Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide und/oder Zucker, enthaltend Galaktose- (ß1-> 3 oder ß1-> 4)-N-acetylglukosamin oder Galaktose- (ß1-»· 3 oder ß1-> 4)- . N-acetylgalaktosamin-Endgruppen, die bei der Wucherung von nichtdifferenzierten Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Krebszellen, ansteigen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnose von Krebs durch Bestimmung der vorerwähnten TAGS.

Als Verfahren zur Diagnose von Krebs hat man bereits

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spezifische Glykoproteine bestimmt, die bei Krebspatienten, gebildet werden. Bei diesem Verfahren macht man von der Antigenität hauptsächlich des Proteinteils von Glykoproteinen Gebrauch; z.B. gibt es bekannte Diagnosen für primären Leberkrebs, indem man cb ..-Fötoprotein bestimmt und eine Diagnose für Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere Rektumkrebs, indem man CEA bestimmt (Igaku No Ayumi, Bd. 106, Nr. 5, Fifth Saturday Special Issue, S. 235-250 (1978) in "Progress in Medicine"). Diese Diagnosemethoden sind aber in ihrer Anwendbarkeit relativ beschränkt und es besteht ein Bedürfnis nach einer Diagnosemethode für die Bestimmung von einer Vielzahl von Krebsarten.

Bisher ist keine Diagnosemethode bekannt, bei welcher man die Bindungsspezifität von Zuckerresten an TAGS anwendet.

Es wurde gefunden, dass die Körperflüssigkeit von an Krebs erkrankten Patienten TAGS enthält, das aus nichtdifferenzierbaren Zellen (hauptsächlich Krebszellen) stammt und in die Flüssigkeit abgegeben wird, und dass TAGS sich erheblich in der Zuckerkettenstruktur, Zuckerkettenlänge und Art der Zusammensetzung der Zuckerreste unterscheidet. Aufgrund intensiver Untersuchungen wurde gefunden, dass dieses TAGS Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide und/oder Zucker mit Galaktose-(ß1-*· 3 oder ßi-» 4)-N-acetylglukosamin-Endgruppen oder Galaktose-(61-*-3 oder ß1-> 4)-N-acetylgalaktosamin-Endgruppen enthält und dass dieses TAGS sich speziell mit Lectin kombiniert, und dass die Gegenwart oder Abwesenheit von Krebszellen, der Grad der Wucherung und.der Anstieg oder der Zerfall dieser Zellen bestimmt werden kann, indem man

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die Körperflüssigkeits-TAGS mit Lectin umsetzt und man so den Krebs diagnostiziert. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entwicklung.

•Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Messung von Körperflüssigkeits-TAGS-Niveaus nach einem kompetitiven Verfahren oder einem Sandwich-Verfahren aufzuzeigen, sowie ein Verfahren zur Diagnose von Krebs durch Messung von TAGS-Niveaus.

Fig. 1 zeigt eine Standardkurve, die man erhält

mittels des kompetitiven erfindungsgemässen Verfahrens,

Fig. 2 zeigt eine Kalibrierungskurve für das kompetitive Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 3 zeigt TAGS-Niveaus von gesunden Personen,

gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 4 zeigt TAGS-Niveaus von an Krebs erkrankten Patienten, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren der Erfindung,

Fig. 5 zeigt eine Kalibrierungskurve für das Sandwich-Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 6 zeigt eine Kalibrierungskurve für das koiripetitive Verfahren gemäss der Erfindung,

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Fig. 7a zeigt die TAGS-Niveaus von gesunden Personen, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 7b+c zeigen die TAGS-Niveaus von an Krebs erkrankten Personen, gemessen nach dem kompetitiven Verfahren gemäss der Erfindung,

Fig. 7d+e zeigt die TAGS-Niveaus von Patienten, die an verschiedenen anderen Erkrankungen als Krebs leiden oder von schwangeren Frauen.

Die vorerwähnte Aufgabe der Erfindung kann gelöst werden durch das folgende Verfahren, indem man:

(1) kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS (nachfolgend als zu bestimmendes Material bezeichnet) und eine bestimmte Menge an unlöslich gemachtem TAGS oder TAGS-ähnlicheiti Material (nachfolgend als insolubilisiertes TAGS oder insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material bezeichnet) mit einer definierten Menge Lectin, das mit einem Markierungsmittel markiert ist (nachfolgend als markiertes Lectin bezeichnet) umsetzt, das insolubilisierte TAGS oder das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material, das an das markierte Lectin gebunden ist, und ungebundenes markiertes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt;

(2) dass man kompetitiv das zu messende Material und eine definierte Menge TAGS oder TAGS-ähnliches Material, das mit dem Markierungsmittel markiert ist

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(nachfolgend als markiertes TAGS oder markiertes TAGS-ähnliches Material bezeichnet) mit einer definierten Menge von Lectin oder unlöslich gemachtem Leetin (nachfolgend als insolubilisiertes Lectin bezeichnet) umsetzt, das markierte TAGS oder markierte TAGS-ähnliche Material gebunden an das Lectin oder insolubilisierte Lectin und ungebundenes markiertes TAGS oder TAGS-ähnliches Material voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt; und

(3) indem man das zu messende Material mit insolubilisiertem Lectin unter Bildung eines TAGS-insolubilisiertes Lectin-Komplex umsetzt, diesen Komplex mit einer definierten Menge an markiertem Lectin umsetzt, den an das markierte Lectin gebundenen Komplex und ungebundenes markiertes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten bestimmt.

Als Körperflüssigkeit, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, können verschiedene Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, z.B. Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Cerebrospinalflüssigkeit und Speichel. Von diesen Flüssigkeiten wird Blut in Form von Serum oder Blutplasma besonders bevorzugt. Die Menge der für die Bestimmung benötigten Körperflüssigkeit liegt im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 ml, vorzugsweise von 2 bis 5 ml. Diese Körperflüssigkeit kann noch weiter gereinigt sein, um die Glykoproteine enthaltenden Materialien, wie Glykoproteine,

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Glycopeptide/ Glykolipide und/oder Saccharide, zu isolieren.

Um ein Material, das Glykoproteine in hohen Anteilen enthält, aus der Körperflüssigkeit zu gewinnen, kann man die üblichen Methoden, wie eine Extraktion oder Abtrennung von Glykoproteinen, wie das Aussalzen, Ausfällen, Extraktion, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebmethode, Inaktivieren des Enzyms oder eine Kombination davon anwenden. Insbesondere kann man eine solche Fraktion gewinnen, indem man Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure oder Zinksulfat zu Serum oder Plasma zugibt oder Serum oder Plasma erwärmt, den dabei gebildeten Niederschlag zur Entfernung von Albumin, Immunoglobulin und dergleichen filtriert und dann eine Dialyse durchführt.

Bei dem erfindungsgemässen Bestimmungsverfahren kann man gesammelte Körperflüssigkeitsproben, ausgenommen Blut, so wie sie sind als Versuchsproben (nachfolgend als "Proben" bezeichnet) verwenden. Um aber zu vermeiden, dass sich die Proben denaturieren und um die Umsetzung mit Lectin zu beschleunigen, können niedrigzuckerhaltige Proteine, wie Rinderserumalbumin (BSA) und dergleichen zu den Proben als Schutzproteine zugegeben werden. Weiterhin erhält man gute Ergebnisse in einigen Fällen durch die Zugabe einer geeigneten Menge eines Schutzproteins zu einer Probe, aus welchem Albumin, Immunoglobulin und dergleichen entfernt wurden. Bei Blutproben kann man Serum, das nach einem bekannten Serumsammeiverfahren erhalten wurde, oder Plasma, das unter Verwendung von Antikoagulantien, wie Häparin, EDTA, Zitronensäure und dergleichen, gesammelt wurde, als Probe verwenden,

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wobei man besonders eine Seruinprobe bevorzugt, die gesammelt und zubereitet wurde unter Verwendung von Häparin als Antikoagulationsmittel. Wenn die TAGS-Niveaus verhältnismässig hoch sind, wie bei Ascites, kann man gewünschtenfalls die Prpben mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnen.

Als gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendendes Lectin werden solche angeführt, die sich spezifisch mit Galaktose- (ß1-ü> 3 oder ß1-» 4)-N-acetylglukosamin oder Galaktose- (BI-* 3 oder ß1-> 4) -N-acetylgalaktosamin kombinieren (J. B. C. 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 6^2, 144 (1975); Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 .(1969); Br. J. Exp. Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 75_' Nr. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, V3_, 196-204 (1974); Carbohydrate Research, 5J_, 107-118 (1976)), wie Erdnuss lectin, Kastorbohnenlectin (Ricinus communis) und dergleichen.

Als Markierungsmittel zum Markieren von Lecitinund TAGS oder TAGS-ähnliches Material, können verschiedene Enzyme, verschiedene fluoreszierende Materialien und verschiedene · radioaktive Materialien, etc., verwendet werden- Solche Enzyme schliessen ein Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, ß-Galaktosidase und aktive Fragmente von Hämoctapeptiden, etc., und fluoreszierende Materialien schliessen beispielsweise ein Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanatrhodarain, Dansylchlorid (d.h. 5-Dimethylamino-i-naphthalinsu-lfonylchlorid), etc.. Geeignete radioaktive Materialien sind bei-

125 131 spielsweise radioaktives Jod (z.B. J, J, etc.)_r radioaktives Tritium, etc

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In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "TAGS--ähnliches Material" Galaktose-(ß1-3> 3 oder ß1-» 4)-N-acetylglukosamin, Galaktose- (ß1-> 3 oder ß1-> 4)-N-acetylgalaktosamin und Zuckerderivate, die solche Glykoproteine an den Endgruppen enthalten. Solche Zuckerderivate sind beispielsweise Glykoprotein von humaner Magenschleimhaut, Glykoprotein, das man erhält, indem man endständige Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhautmembran entfernt, humanes IgG-Glykoprotein oder deren Asialoderivate, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivate von Glykoprotein von Schweine-Thyroglobulin-Glykoprotein B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-1 von Human-IgE oder dessen Asialoderivat, Asialoderivat von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivat von Glykoprotein H-C von Human-IgA.., Asialoderivat von Glykoprotein H-B oder H-A von Human-IgA.., Asialoderivat von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivat von Rinderfötos-Glykoprotein, Deasialoderivat von Glykoprotein, das an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Kaninchenleberzellen-protoplasmischen Membranen teilnimmt, sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivate von Human-06.-Säureglykoprotein, Asialoderivate von Glykofolin, Glykoprotein oder Glykopeptid von T-Antigen oder dergleichen, wie sie in "Biochemical Data Book I" beschrieben werden (verteilt von der Japanese Chemical Society und veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 26. November 1979, Seiten 503-510) und Asialo-GM₁=AM. und Glykolipide von Rinder-Erythrocyten, wie sie in der gleichen Literaturstelle auf Seiten 840-841 beschrieben werden. Von diesen werden besonders bevorzugt Asialoderivate von Rinderfötus-Glykoprotein, sulfatiertes

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Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, sulfatiertes Glykoprotein von Human-Magenschleimhaut und Asialoderivate von Human-cO -Säureglykoprotein.

Insolubilisiertes TAGS, insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material und insolubilisiertes Lectin stellt man her durch chemische oder physikalische umsetzung von TAGS, TAGS-ähnlichem Material oder Lectin mit einem unlöslichen Träger. Geeignete unlösliche Träger sind beispielsweise Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharze, Dextran, Plastikfilm, Plastikrohr, Nylon, Glasperlen, Seide, Polyamxnmethylvinylether-Maleinsäure-Copolymere, Aminosäure-Copolymere, Ethylen-Maleinsäure-Copolymere, etc.. Die Insolubilisierung kann man bewirken durch ein •Verfahren, bei dem kovalente Bindungen gebildet werden (z.B. durch ein Diazoverfahren, ein Peptidverfahren beispielsweise einem Säureamidderivat-Verfahren, einem Carboxychloridharz-Verfahren, einem Carbodiimidharz-Verfahren, einem Maleinsäureanhydridderivat-Verfahren, einem Isocyanatderivat-Verfahren, einem Cyanogenbromidaktivertes Polysaccharid-Verfahren, einem Zellulosekarbonatderivat-Verfahren, einem Verfahren, bei dem man ein Kondensierungsmittel verwendet, etc. - einem Alkylierungsverfahren, einem Träger-Bindungsverfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, Hexamethylenisocyanat, etc., einem Träger-Bindungsverfahren nach der Ugi-Reaktion und dergleichen; einem Ionen-Bindungsverfahren unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes als Träger; und einem physikalischen Absorptions-verfahren unter Verwendung von porösem Glas, wie Glasperlen, als Träger. Von diesen werden das Cyanogenbromid-

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aktiviertes Polysaccharid-Verfahren für das kovalente Bindungen bildende Verfahren und das Träger-Bindungsverfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels bevorzugt. Bei dem Cyanogenbromid-aktiviertes Polysaccharid-Verfahren kann man insolubilisiertes TAGS, insoiubilisiertes TAGS-ähnliches Material oder insolubilisiertes Lectin erhalten, indem man TAGS, etc., mit der 10- bis 1000-fachen Menge eines cyanogenbromidaktivierten Trägers in einem geeigneten Lösungsmittel bei 0 bis 40⁰C, vorzugsweise bei 20 bis 30⁰C während 2 bis 4 Stunden umsetzt.

Insolubilisiertes TAGS, etc., kann man auch durch ein Bestrahlung-induziertes Polymerisations-Verfahren herstellen. Dabei wird eine wässrige Dispersion eines polymerisierbaren Monomers, enthaltend TAGS oder TAGS-ähnliches Material, hergestellt und mit Licht oder Ionenstrahlung zum Polymerisieren des Monomers bestrahlt. Als Mittel zur Herstellung der wässrigen Dispersion wird ein hydrophobes polymerisierbares Monomer (A) in einer 0,1 bis 5 Gew.%-igen wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Polymer (B) dispergiert. Alternativ kann man ein hydrophiles polymerisierbares Monomer (C) oder ein Gemisch aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C) in einer 3 bis 20. Gew.%-igen wässrigen Salzlösung dispergieren oder ein hydrophobes polymerisierbares Monomer (A) wird in einer wässrigen Lösung, die 0,01 bis 5 Gew.% eines oberflächenaktiven Mittels (D) enthält, dispergiert. Wenn eine so erhaltene Dispersion dann mit Licht oder einer Ionenstrahlung bestrahlt wird, dann wird das dort in der dispersen Phase vorliegende polymerisierbare

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Monomer polymerisiert unter Bildung einer Polymerisationsmatrix für TAGS und dergleichen. Gewünschtenfalls kann man diese dann zu einem Blatt oder zu Teilchen ausbilden.

Spezielle Beispiele für hydrophobe polymerisierbar Monomere (A) sind Glycidylmethacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat/ Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Polyethylenglykol-2 O O-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, 1,4-Butylenglykoldimethacrylat, 1,6- Hexanglykoldimethacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat und die entsprechenden Acrylate hiervon. Im allgemeinen kann man jedes wasserunlösliche Monomer, das durch Bestrahlung mit Licht oder mit Aktivstrahlen polymerisiert werden kann, unabhängig von der jeweiligen Art, verwenden.

Als typische Beispiele für hydrophile polymerisierbare Monomere (C) können angeführt werden 2-Hydroxyethylmethacry lat , Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Methoxypolyethylenglykol-1OOO-methacrylat, Polyethylenglykol-400-dimethacrylat, Polyethylenglykol-6OO-dimethacrylat und die entsprechenden Acrylate davon, sowie Methacrylsäure, Acrylamid, N-Vinyl-2-pyrrolidon, etc.. Im allgemeinen kann jedes wasserlsöliche Monomer, das durch Bestrahlung mit Licht oder mit Aktivstrahlen polymerisiert werden kann, unabhängig von seiner Art, verwendet werden.

Als typische Beispiele für wasserlösliche Polymere (B)

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können Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum erwähnt werden.

Als typische Beispiele für das oberflächenaktive Mittel (D) können Natriumlaurylsulfat, Kaliumoleat, Natriumoleat, Sorbititiönolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmonooleat, Propylenglykolmonolaurat, ölsäure, Natriumdodecylbenzolsulfonat, etc., genannt werden. Jedes oberflächenaktive Mittel, das das polymerisierbar Monomer oder das TAGS oder TAGS-ähnliche Material in dem polymerisierbaren Monomer mit dessen Mycelen löst, kann unabhängig von seiner Art verwendet werden.

Mit radioaktivem Material markiertes TAGS, mit radioaktivem Material markiertes TAGS-ähnliches Material und mit radioaktivem Material markiertes Lectin erhält man, indem man in TAGS, TAGS-ähnliches Material oder Lectin ein radioaktives Jodatom, wie J oder J einführt. Die Einführung von radioaktivem Jod wird durch ein übliches Jodierungsverfahren bewirkt, z.B. durch ein oxidatives Jodierungsverfahren unter Verwendung von Chloramin T (Nature V5±, S. 495 (1962); Biochem. J., 89, S. 114 (1963)). Dabei wird die Jodierung in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einer Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8, vorzugsweise einer 0,2M Phosphatpufferlösung - pH 7), bei etwa Raumtemperatur während 5 bis 60 Sekunden in Gegenwart von Chloramin T durchgeführt. Radioaktives Jod und Chloramin T werden vorzugsweise in Mengen von 1 bis 5 mCi bzw. 10 bis 100 Nanomol pro Nanomol Thyrosin, enthalten in TAGS oder dergleichen, angewendet. Das so markierte TAGS oder dergleichen wird dann isoliert

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und abgetrennt und kann in üblicher Weise aufbewahrt werden, erforderlichenfalls in lyophilisierter Form.

Enzymmarkiertes TAGS, enzymmarkiertes TAGS-ähnliches Material und enzymmarkiertes Lectin kann man durch ein bekanntes Kupplungsverfahren herstellen (z.B. B. F. Erlanger et al; Acta. Endocrinol. Suppl·., 168, 206 (1972) und M. H. Karol et al; Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 57, 713 (1967)). Dabei wird TAGS oder dergleichen mit Enzym in einer Pufferlösung von pH 4 bis 6 (z.B. einer 1mM Acetatpufferlösung, pH 4,4) bei Raumtemperatur während

2 bis 5 Stunden in Gegenwart eines Oxidationsmittels, wie NaJO./ umgesetzt und anschließend wird mit NaBH₄ oder dergleichen reduziert. Enzym wird in einer Menge von 1 bis

3 Molen pro Mol TAGS oder dergleichen verwendet. Das Oxidationsmittel wird in einer Menge von 100 bis 300 Molen pro Mol TAGS und dergleichen verwendet und das Reduktionsmittel in einer Menge von 1 bis 2 Molen.

Mit fluoreszierendem Material markiertes TAGS, mit fluoreszierendem Material markiertes TAGS-ähnliches Material und mit fluoreszierendem Material markiertes Lectin wird hergestellt, indem man TAGS oder dergleichen mit einem bekannten fluoreszierenden Mittel, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodaminisothiocyanat (RITC) in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH von 6 bis 8 bei 0⁰C bis Raumtemperatur und vorzugsweise bei Raumtemperatur während 0,5 bis 3 Stunden umsetzt (fluoresziierende Antikörper-Verfahren; "Ikagaku Jikkenho Koza, Nr. 4, S. 263-270). Das fluoreszierende Material wird vorzugsweise in einer Menge von 1/5= von TAGS oder dergleichen verwendet.

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Nachfolgend wird die Bestimmungsmethode gemäss der vorliegenden Erfindung durch das !competitive Verfahren oder das Sandwich-Verfahren beschrieben.

Bei diesen beiden Verfahren wird die Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel bei 45⁰C oder weniger, vorzugsweise bei 4 bis 40⁰C₇ und insbesondere bei 20 bis 40⁰C vorgenommen. Als Lösungsmittel, die nicht nachteilig auf die Reaktion,von TAGS oder TAGS-ähnliches Material mit Lectin einwirken, werden Wasser und Pufferlösungen vonpH 6 bis 7,8 (z.B. 0,1 bis 0,3M tris-Hydrochlorwasserstoffsäure-Pufferlösung - pH etwa 7,5, 0,1M Phosphatpufferlösung - pH etwa 7,4, etc.) bevorzugt. Die Reaktion wird während 5 bis 40 Stunden, vorzugsweise 15 bis 25 Stunden durchgeführt.

Die Abtrennung von TAGS (oder TAGS-ähnlichem Material) das an Lectin gebunden ist, von ungebundenem Lectin oder TAGS (oder TAGS-ähnlichem Material) voneinander kann in üblicher Weise vorgenommen werden. Das heisst, dass, wenn insolubilisiertes TAGS (oder TAGS-ähnliches Material) oder insolubilisiertes Lectin verwendet wird, eine einfache Abtrennung der festen Phase von der flüssigen Phase (durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren) ausreicht und dass in anderen Fällen Chromatografie, Elektrophorese, Aussalzen, Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration, Absoprtion oder eine Kombination davon verwendet werden kann oder ein Trennverfahren unter Verwendung von Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel (japanische veröffentlichte Patentanmeldung 151 263/80).

Die Aktivität des Markierungsmittels in dem so abgetrennten

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Produkt wird unter Auswahl einer geeigneten Methode, in Abhängigkeit von der Art des Markierungsmittels, durchgeführt. Beispielsweise wird bei einem Enzym ein geeignetes Enzymsubstrat für eine colorimetrische Analyse, Emissionsanalyse oder Fluoreszenzanalyse ausgewählt und gewünschtenfalls verwendet man einen. Farbstoff, einen Aufheller oder ein Färbungsmittel·, um die Enzymaktivität zu messen oder, wenn ein Fluoreszierungsmittei oder ein radioaktives Material als Markierungsmittel verwendet wird, wird die Fluoreszenzintensität oder die Radioaktivität gemessen. Auf diese Weise kann man reagiertes und nichtreagiertes TAGS, TAGS-ähnliches Material oder Lectin be.stimmen und daraus kann die Menge des in Frage stehenden Materials erkannt werden.

Wie bereits vorher dargelegt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die vorteilhafte Bestimmung von TAGS in einer Körperflüssigkeit. Aus der so bestimmten TÄGS-Menge kann man Krebs in jedem Stadium von einem Anfangsstadium bis zum letzten Stadium bestimmen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für die Aufdeckung von Krebs im Frühstadium. Da Glykoproteine bei der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, kann man diese Methode für eine grössere Anzahl von Krebsarten, als mit den üblichen Antikörper verwendenden Verfahren (^-Fötoprotein, CEA, etc.), bei denen hauptsächlich die Proteingruppe bestimmt wird, anwenden, z.B. bei Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs, Eierstockkrebs, Mundkrebs, Zungenkrebs, Kehlkopfkrebs, Prostatakrebs, Liposarcom, bösartiges Melanom, Uteruskrebs, primäres Magensarcom, etc.

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I ir Ct · · β··

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Weiterhin ist das erfindungsgemässe Verfahren dadurch charakterisiert, dass es hochspezifisch für Krebs ist unddass es nicht mit Determinanten ähnlicher-Substanzen in der Körperflüssigkeit von schwangeren Frauen und von Patienten, die an anderen Krankheiten als Krebs leiden, wie Gastritis, Magengeschwür, Zwölffingerdarmgeschwür, Colitis, Pankreatitis, Diabetes mellitus, Nephritis, GYstitis, Blasensteine, Cholecystitis, Gallensteine, Hirnerweichung, Apoplexy, Anginapektoris, Herzversagen, Myocardinfarkt, Hochdruck, Artritis, Depression, allergischer Coryza, Purpura, Pneumonie, Pulmonarpneumatose, Bronchitis, Asthma, akute Häpatits, chronische Häpatitis, etc., leiden, kreuzreagiert.

Weiterhin ermöglicht es die Erfindung,Galaktose-(ß1 ■* 3 oder ßH 4)-N-acetylglukosamin oder Galaktose-(ß1-> 3 oder B1-» 4)-N-acetylgalaktosamin oder Zucker oder Zuckerderivate (z.B. Glycoproteine, Glykopeptide, Glykolipide, Glykoterpen, Glykosteroide, etc.) die endständiges GIykoprotein enthalten, zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachfolgend ausführlicher in den nicht beschränkend auszulegenden Beispielen anhand von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

5 mg Peroxidase (aus Meerrettich) wurden in 1 ml einer

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0,3Μ wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung gelöst. 0,1 ml einer 0,1M Fluordinitrobenzol enthaltenden Ethanollösung wurden zu dieser Lösung gegeben und anschliessend wurde leicht während einer Stunde bei Raumtemperatur gerührt und ann wurden 0,1 ml einer 0,06M NaJO.-Lösung zugegeben und weitere 30 Minuten schwach gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 1 ml einer 0,16M Ethylenglykollösung gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur schwach gerührt. Anschliessend wurde die Lösung gegen 0,01M Kohlensäure-Natriumhydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) bei 4°C während eines Tages und einer Nacht dialysiert.

(II) Y§£ §ί}£§!^_5Ηί5_5ί§£3$ΐ§£§ίϊ_Υ2ίϊ oxidase^Lectin-Peroxidase^

5 mg Erdnusslectin wurden in 3 ml der gemäss (I) zubereiteten aktivierten Peroxidase gelöst und bei Raumtemperatur" während 2 bis 3 Stunden unter Umsetzen schwach gerührt. 5 mg NaBH, wurden zugegeben und bei 4⁰C während 3 Stunden umgesetzt. Anschliessend wurde diese Lösung gegen eine O,1M tris-Chlorwasserstoffsäure-.Pufferlösung (pH 7,4) während eines Tages und einer Nacht dialysiert und dann einer Sephadex G 150 Gel-Säulenchromatografie (Eluierungsmittel 0,1M tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung; pH 7,4) unter Ausführung einer Gelfiltration unterworfen. Die optischen Dichten (OE>₂80 ^{und OD}403^ J^eder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen, bei denen sich die Peaks von OD₂₈₀ und OD₄₀₃ überlappten, wurden gesammelt.

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20 ml der geraäss (II) erhaltenen Lectin-Peroxidase wurden zu Galaktose-agarose (AGALACTOPYRANOSYL AGAROSE ®, hergestellt von P.L.Lab. USA) gegeben und mit 200 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Die Säule wurde mit 0,2M NaCl-Lösung, enthaltend 0, 5M Lactose, eluiert, und die ersten 10 ml-Fraktionen mit Peaks für "0D_o--₀ und OD.»- wurden gesammelt und gegen eine physiologische Salzlösung während eines Tages und einer Nacht unter Gewinnung von gereinigter Lectin-Peroxidase dialysiert. Der Proteingehalt des Produktes wurde nach der Lowry-Methode bestimmt (Lowry O.H. et al, J. Biol. ehem., 193, S. 265 (1951) und betrug etwa 1 g.

15 gCNBr-akt!vierte Agarose wurden in 3 1 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehenlassen mit 1 1 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) auf einem Glasfilter gewaschen. Man erhielt insgesamt etwa 50 ml aktivierte Agarose. Diese wurde in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert und 5 ml einer 0,01M Phosphatpufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg Erdnusslectin (nachfolgend als PNA bezeichnet) wurden dazugegeben und während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung

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Ψ Β «·

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der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf ein Glasfilter gegeben und das Reaktionsprodukt wurde darauf gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer 1M Monoethanolaminlosung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschliessend wurde das Reaktionsprodukt auf einem Glasfilter mit 1 1 einer 0,1M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 1 1 einer 0,1M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

(IV) Y§£ äii£§
Material

1 g sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut (anschliessend als PGM abgekürzt) wurde in 100 ml einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und dazu wurde unter Eiskühlung des pH's auf 1T eine 1N wässrige NaOH-Lösung tropfenweise zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 7,0 mit 1N HCl eingestellt und anschliessend wurde nochmals 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 10 1 einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) über Nacht dialysiert, wobei man gereinigtes TAGS-ähnliches Material (reines PGM) erhielt.

(IV) YgEf§hren_zur_Herstellung_von_TAGS-ähnlichem Material

Alternativ wurde rohes PGM (100g ) zu 1 1 destilliertem

- 33 -

■ο*· t» ·

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- 33 -

Wasser gegeben. Dann wurde die Mischung über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und zentrifugiert
(100 000 g x 1 Stunde).Die überstehende Flüssigkeit würde gesammelt und lyophilisiert, wobei man etwa 5 g gereinigtes PGM erhielt.

(a) Markierung mit einem Enzym (PGM-Peroxidase:

4 mg Peroxidase aus Meerrettich (HRPO) (Ο,ΐμπιοί) wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Dazu wurden 0,2 ml von 0>1M NaJO₄ gegeben und nach 20-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung gegen 1 inM Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,4) während eines Tages und einer
Nacht zur Entfernung von nichtumgesetztem NaJO₄ dialysiert. Zu dieser dialysierten Reaktionslösung wurden
etwa 60 μΐ einer 0,2M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) gegeben und der pH der Lösung auf 9,0 eingestellt. Dann wurden zu dieser Lösung direkt 0,6 ml PGM (10 mg/ml), gelöst in einer 0,01M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung
(pH 9,5) gegeben, und 2 Stunden bei Raumtemperatur vermischt und dazu wurden dann 0,1 ml einer 4 mg/ml NaBH₄-Lösung in destilliertem Wasser gegeben, worauf man 2
Stunden bei 4⁰C stehen Hess. Diese Lösung wurde dann gegen eine 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5) während
eines Tages und einer Nacht dialysiert und unter Verwendung von Sephadex G 200 (1,5 χ 150 cm) unter Erhalt von reiner PGM-Peroxidase (PGM-POX) gereinigt. Das Geleluiermittel wurde in 5 ml-Anteilen gesammelt und die Absorption wurde bei OD₂₃₀ und OD₄₀₃ gemessen.

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125

(b) Markierung von Isotop ( J-PGM):

125

PGM wurde mit J nach dem oxidativen Jodierungsverfahren unter Verwendung von Chloramin T markiert.

10 μg PGM wurden in 50 μΐ einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und dazu wurden 10 μΐ von 1 mCi Na¹²⁵J (trägerfrei, N.E.N.) und 50 ^g/100 μΐ Chloramin T-Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung gegeben und nach Vermischen bei Raumtemperatur während 30 Sekunden wurden 1000 μg/100 μΐ Na-S^Og-Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung zugegeben. Anschliessend wurde

125

1 mg von Na J zugegeben und untergemischt. Das so er-

125
haltene J-PGM wurde über Sephadex G-50 (1 χ 30 cm)

1 25

gereinigt. Das so erhaltene J-PGM hatte eine Radioaktivität von etwa 1 bis 2 μCi/μg.

1 25

0,1 ml von J-PGM (100 ng 0,17 iiCx entsprechend etwa

2.4 χ 10 cpm) , erhalten in (V), 0,1 ml von reinem Standard-PGM (0,1 μg/ml, 0,2 \iq/ml, 0,5 μg/ml, 1 ug/ml-,

2.5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml), erhalten in (IV), 0,1 ml von PNA (10 ug/ml) und 0,2 ml einer 0,05MPhosphorsäure-Pufferlösung (0,15M NaCl; 0,1 % BSA: 0,02 %NaNO^)wurden in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas vermischt und während 1 Stunde bei 25°C inkubiert. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 0,1 ml Anti-PNA-Kaninchenserum (hergestellt von

125 E. Y. Laboratory: 10-fache verdünnte Lösung) zu der J-

125
PGM, gebunden an PNA und J-PGM, nichtgebunden an PNA, gegeben und nach 1-stündigem'Inkubieren bei 25⁰C wurde

- 35 -

- 35 -

die Reaktionslösung bei 4°C während 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die Radioaktivität eines Niederschlags

( J-PGM gebunden an PNA) wurdä gemessen und eine Standardkurve aufgestellt (Fig. 1). Aus den dabei gefundenen Ergebnissen geht hervor, dass der Prozentsatz an Gebundenem (B/T) 20 bis 25 % betrug und dass eine 50 %-ige Inhibierung bei einer Konzentration von 0,6 pg/ml erzielt ■wurde.

Eine überschüssige Menge von PGM wurde zu 100 ml einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gegeben und darin suspendiert. Eine 0V0.1 N NaOH-Lösung wurde dazugegeben und der pH der Suspension auf etwa 11 eingestellt und dann wurde 20 Minuten bei 3000 Upm zentrifigiert und die überstehende Lösung gewonnen. Zu dieser überstehenden Lösung wurden tropfenweise 0,03N HCl unter Einstellung des pH-Wertes auf 7,0', zugegeben und dann wurde nochmals mit 3Q00 Upm während 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde gegen eine 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) unter Erhalt einer PGM-Lösung dialysiert. Der Zuckergehalt und der Proteingehalt dieser Lösung wurden bestimmt und der Hexosegehalt wurde mit 5 bis 7 mg/ml festgestellt mittels der Phenol-Schwefelsäure-Methode, unter Verwendung von Glukose als Standard,und der Proteingehalt wurde mit 1 bis 2 mg/ml unter Verwendung von BSA als Standard gemessen. Die PGM-Lösung wurde

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der nachfolgenden strahlungsinduzierten Polymerisation unterworfen.

Die strahlungsinduzierte Polymerisation wurde wie folgt vorgenommen: Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (als Monomer es verwendet) wurde mit der vorerwähnten PGM-Lösung in einem Mischungsverhältnis von 33:67 abgemischt und die erhaltene Mischung wurde in ein 1 cm χ 15-20 cm Glasrohr gegeben und schnell auf -70⁰C oder weniger lyophilisiert. Anschliessend wurde das Gemisch mit 1x10 Rad Gammastrahlen zum Polymerisieren des Monomers bestrahlt. Jedes der so fixierten PGM-Materialien wurde hergestellt, indem man den polymeren Stab zu Scheiben einer .Dicke von 10 μΐη schnitt.

(VIII)

15 g (Trockengewicht) CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia AB) wurden in 3 1 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehen mit 1 1 einer 0,1M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) auf einem Glasfilter gewaschen, wobei man etwa 50 ml aktivierte Sepharose erhielt. Diese wurde in 200 ml einer 0,1M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) suspendiert und dazu wurden 5 ml einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7) , enthaltend 50 mg PGM, gegeben und dann liess man das Ganze 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen unter gelegentlichem Rühren.

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~ ι9 η ο ο ο J ι c. J J ζ. ο

Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf einem Glasfilter gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer 1M Monoethanolaminlösung . (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Dann wurde die Reaktionslösung auf einem Glasfilter jit 1 1 einer 0,1M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 1 1 einer 0,1M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

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(VIII') Y§£f §h£§S_2U£_Herstellung Yon_insolubilisieii- £§S_?^§§Zäiiiiii£il®S_iiäS§£iäi_lS§£§t§]:lHⁿ2 Y2ⁿ

PGM-Perlen). ■

10.000 Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 6,4 mm, hergestellt von der Precision Plastic Co., Ltd., USA, wurden mit einer verdünnten Lösung einer synthetischen Seife (Mamalemon ^ , hergestellt von Lion Co., Ltd.) in einer Konzentration von 1,5 ml/1 1 destilliertem Wasser gewaschen und anschliessend mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Anschliessend wurden sie in eine wässrige 0,5M NaOH-Lösung während 3 Tagen getaucht und gründlich gewaschen, bis der pH der Waschlösung etwa 6 betrug. Die so gewaschenen 10.000 Perlen wurden zu 2,5 1 einer 35 (W/V) %-igen PGM-Lösung in 50 mM Essigsäure-Puffer, eingestellt auf pH 4,5 mit 10N NaOH, gegeben und während 24 Stunden mit 10 Upm geschüttelt und dann filtriert und mit 8 1 destilliertem Wasser viermal gewaschen. Dann wurden die Perlen zu 2,5 1 einer Glutaraldehydlösung einer Endkonzentration von 1 V/V % in 50 mM Natriumphosphät-Puffer (pH 7) gegeben und mit 10 Upm während 2 Stunden rotiert und dann filtriert und dann mit destilliertem Wasser, wie vorher angegeben, gewaschen. Die so behandelten 10.000 Perlen wurden zu 2,5 1 einer 1M Glycinlösung in 50 nM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) 2 Stunden mit 10 Upm rotiert und dann filtriert und mit destilliertem Wasser in der vorher angegebenen Weise gewaschen und dann über Nacht bei 37°C getrocknet, wobei man PGM-Perlen erhielt. Die Oberfläche dieser Perlen wurde nach der Otcinol-H-SO.-Methode (M. Schönenberger et al: Z. Physiol. Chem. 309, 145 (1957)) bestimmt und ergab 2,7 + 0,2 ^g PGM/ Perle.

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(IX) Herstellun2_von_Testgroben

5 ml Blut wurden von krebskranken Patienten und von Patienten, die an anderen Krankheiten litten, sowie von schwangeren Frauen und gesunden Personen gesammelt, unter Verwendung von Häparin (500 Einheiten)-behandelten Spritzen und 10 Minuten mit 200 Upm zentrifugiert und die überstehende Lösung wurde zur Herstellung der Testproben verwendet.

Beispiel 2

Kompetitives Verfahren:

Ein Schnitt einer Scheibe (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt gemäss (VII) wurde in 50 μΐ PNA-gebundener Peroxidase (markiertes Lectin, hergestellt in (II)) und 200 μΐ der Probe (Testprobe, hergestellt gemäss (IX)) gegeben und 20 Stunden bei 25°C inkubiert. Dann wurde diese Scheibe mit PBS gewaschen und in 2,0 ml einer wässrigen Kochsalzlösung gegeben und dazu wurden 0,5 ml des Peroxidasematerials gegeben und das Ganze wurde T Stunde bei 25⁰C inkubiert. Anschliessend wurden 1,0 ml einer 3N Chlorwasserstoffsäure zugegeben und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. In gleicher Weise wurde die Absorption gemessen, wobei jedoch Proben mit verschiedenen Konzentrationen des Standardmaterials (PGM) verwendet wurden, um eine Kalibrierungskurve (Fig. 2)

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zu erhalten. Weiterhin wurde TAGS in der Testprobe erhalten gemäss (IX), unter Verwendung der Kalibrierungskurve bestimmt. Die Ergebnisse werden in den Fig. 3 und 4 gezeigt.

Aus den Fig. 3 und 4 geht hervor, dass ein ausgezeichneter Unterschied in den TAGS-Niveaus zwischen gesunden Personen und Personen, die an den verschiedenen Krebsarten erkrankt waren, besteht.

Beispiel 3

Sandwich-Verfahren:

200 μg PNA-Agarose, hrgesteilt in (III) wurden zu-100 μΐ einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), enthaltend in Lösung 1 bis 10 μg/ml PGM, gegeben und T Stunde bei 25⁰C unter Rühren inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Reaktionslösung mit einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) wurden 6 ug PNA, markiert mit Peroxidase, erhalten gemäss Beispiel 1 (II) , und 100 μ.1 einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) zugegeben und anschliessend wurde 1 Stunde unter Rühren bei 25⁰C inkubiert. Nach Zentrifugieren während 10 Minuten mit 3000 üpm wurde der Niederschlag gewonnen und dreimal mit einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Fig. gezeigt.

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Beispiel 4

Kompetitives Verfahren:

100 ja 1. einer Prohe (Testprobe, erhalten nach dem Verfahren (IX)) wurden in ein Reagenzglas gegeben, zu dem 500 μ! einer 0,3M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4), enthaltend- 0,22 W/V % Gelatine und 5 mM CaCl₂ gegeben und dazu wurden 5 mM MgCl,, gegeben. Eine PGM-Perle (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt nach dem Verfahren (VIII'))und 100 μΐ Lectin-Peroxidase (das lyophilisierte markierte Lectin, hergestellt gemäss Verfahren (II¹) in einer Konzentration von 1 mg/1 des vorher beschriebenen tris-HCl-Puffers) wurden zu der Probe gegeben und nach Rühren wurde das Gemisch 24 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Saugfilter abgesaugt und die Perle wurde mit 2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung auf einem Saugfilter gewaschen. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.

60 mg ortho-Phenylendiamin wurden in 200 ml eines 0,2M Mcllevin-Puffers (pH 5,8) gelöst und zu der Lösung wurde H₃D₂ bis zu einer Endkonzentration von 0,02 V/V % gegeben und das Gemisch wurde unter Bildung eines Färbungsmittels gerührt.

In einem Reagenzglas wurden 2 ml physiologische Kochsalzlösung und 500 μΐ des Pärbungsmittels sowie die gewaschene Perle vorgelegt und dann wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Enzymreaktion durch

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Zugabe von 1 ml 3N HCl abgestoppt. Die optische Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 492 nm bestimmt. In gleicher Weise wurde die Absorption gemessen, wobei aber Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen als Standardmaterial (PGM.) verwendet wurden, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten (Fig. 6). Dann wurde TAGS in den Testproben erhalten gemäss (IX) unter Verwendung de£ Kalibrierungskurve bestimmt. Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 7a, 7b, 7c, 7d und 7e gezeigt.

Claims

35 238 o/wa

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO / JAPAN

Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten,Glvkoprotein enthaltenden Verbindungen und Verfahren zur Diagnose von Krebs

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten,Glykqprotein enthaltenden Verbindungen (TAGS), dadurch gekennzeichnet , dass man kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS und eine definierte Menge an insolubilisiertem TAGS oder insolubilisiertem TAGS-ähnlichen Material mit einer definierten Menge markiertem Lectin reagiert, dass man das unlöslich gemachte TAGS oder unlöslich gemachte TAGS-ähnliche Material, welches an das markierte Lectin gebunden ist, und ungebundenes Lectin voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Substanzen bestimmt.

2. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das TAGS-ähnliche Material Galaktose-(ß1-i 3 oder ß1-»4)-N-acetylglukosamin, Galaktose- (ß1-> 3 oder ß1.-> 4)-N-acetyl-galaktosamin oder ein Zuckerderivat, enthaltend eine solche Zuckerkette als Endgruppe, ist.

3. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das markierte Lectin mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.

4. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Cerebrospinalflüssigkeit oder Speichel ist.

5. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das TAGS-ähnliehe Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von humanem Magenmuzin, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen von terminaler Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von der Magenschleimhautmembran von Schweinen, humanem IgG-Glykoprotein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweinethyroglobulin Glykolinkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein

3123323

B-1 von Human-IgE oder einem Asialoderivat davon, Asialoderivaten von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivaten von Glykoprotein H-C von Human-IgA.. , Asialoderivaten von Glykoprotein H-B oder H-A von Human-IgA.., Asialoderivaten von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivaten von Rinderfötus-Glykoprotein, Deasialoderivaten von Glykoproteinen, die an der Aufnahme von Asiäloglykoprotein von Kaninchenleberzellenprotoplasmischen Membranen teilnehmen/ sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human-Oü-Säureglykoprotein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen, Glykopeptid von T-Antigen, Asialo GM₁=AM. und Glykolipiden von Rindererythrocyten, wobei das Markierungsmaterial für das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktoxi-

125 dase, aktive Bruchstücke von Hämoctapeptid, . J,

J und radioaktivem Tritium; wobei das Lectin

ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin; und der unlösliche Träger für das insolubilisierte TAGS oder insolubilisierte. TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylcellulose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon, Glaskugeln, Seide, Polyarnin— Methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer.

Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / dass das TAGS-ähnliche Material für das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von humanem Magenmuzin, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen der terminalen Fucose aus sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhautmembran, Human-IgG-Glykoprotein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweine-Thyroglobulinglykolinkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-1 von Human-IgE oder dem Asialoderivat davon, Asialoderivat von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivate von Glykoprotein H-C von Human-IgA₁, Asialoderivat von Glykoprotein H-B oder H-A von Human-IgÄ.. , Asialoderivaten von humanem Transferringlykoprotein, Deasialoderivaten von Glykoprotein, die an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Kaninchenleberzellen-protoplasmischen Membranen teilnehmen, sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human- oC. Säureglykoprotein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen, Glykopeptid von T-Antigen, Asialo GM₁=AM₁ und Glykolipiden von Rindererythroeyten, wobei das Markierungsmaterial für das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken

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von Hämoctapeptid, J, J und radioaktivem Tritium; wobei das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Castorbohnenlectin, und das insolubilisierte TAGS oder

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44·· «e»

insolubilisierte TAGS-ähnliche Material eine PoIymermatrix ist/ die hergestellt wurde, indem man eine wässrige Dispersion eines polymerisierbaren Monomeren, enthaltend TAGS oder TAGS-ähnliches Material, mit Ionenstrahlen unter Polymerisation des Monomeren bestrahlt und wobei die wässrige Dispersion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem wasserlöslichen Polymer (B), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches .aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem oberflächenaktiven Mittel (D), und einer wässrigen Dispersion aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (C), bei welchem das hydrophobe polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycidylmethacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Polyethylenglykol-200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, 1,4-Butylenglykoldimethacrylat, 1,6-Hexanglykoldimethacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, MethyImethacrylat, EthyImethacrylat, ButyImethacrylat und die entsprechenden Acrylate davon; wobei das wasserlösliche Polymer (B) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum; wobei das

hydrophile polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Methoxypolyethylenglykol-1000-raethacrylat, Polyethylenglykol-400-dimethacrylat, Polyethylenglykol-600-dimethacrylat und den entsprechenden Acrylaten davon, und Methacrylsäure, Acrylamid und N-Vinyl-2-pyrrolidon; und das oberflächenaktive Mittel (D) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumlaury!sulfat, Kaliumoleat, Natriumoleat, Sorbitmonolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmonooleat, Propylenglykolmonolaurat, ölsäure und Natriumdodecylbenzolsulfonat.

7. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material eine Polymermatrix ist, die hergestellt wurde durch Bestrahlen einer wässrigen Dispersion eines Hydroxyethylmethacrylats, enthaltend sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut mit Röntgenstrahlen und wobei das markierte Lectin Peroxidase-markiertes Erdnusslectin ist.

8. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das insolubilisierte TAGS-ähnliche Material auf Polystyrolperlen insolubilisiertes sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut ist und dass das markierte Lectin ein Peroxidase-markiertes Erdnusslectin ist.

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t ο «

9, Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoproteine enthaltenden Verbindungen (TAGS), dadurch gekennzeichnet , dass man kompetitiv zu messendes Körperflüssigkeits-TAGS und eine definierte Menge von markiertem TAGS oder markiertem TAGS-ähnlichen Material mit einer definierten Menge an Lectin oder unlöslich gemachtem Lectin umsetzt, dass man das markierte TAGS oder das markierte TAGS-ähnliche Material, das mit dem Lectin verbunden ist oder insolubilisiertes Lectin und ungebundenes markiertes TAGS oder markiertes TAGS-ahnliehes Material voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einer der Substanzen bestimmt.

10. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material Galaktose-(ßi·^ 3 oder ß1* 4)-N-acetylglkosamin, Galaktose-(ß1-» 3 oder ßi·» 4)-N-acetylgalaktosamin oder ein Zuckerderivat, enthaltend Glykoprotein als Endgruppe, ist.

11. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekenn ζ e ichnet , dass das markierte TAGS oder das markierte TAGS-ähnliche Material mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.

12. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit,

· W 9

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amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Cerebrospinalflüssigkeit oder Speichel ist.

13. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das TAGS-ähnliche Material ausgewählt ist aus. der Gruppe bestehend aus Glykoprotein von Human-Magenschleimhaut, Glykoprotein, erhalten durch Entfernen der terminalen Fucose von sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhautmembran, Human-IgG-glykoprotein oder dem Asialoderivat davon, Rinder-IgG-Glykoprotein, Asialoderivaten von Glykoprotein von Schweine-Thyroglobulin-glykolinkage B, Glykoprotein von ovomukoider ß-Untereinheit, Glykoprotein B-1 von Human-IgE oder dem Asialoderivat davon, Asialoderivaten von Glykoprotein B-2 oder B-3 von Human-IgE und Asialoderivaten von Glykoprotein II-C von Human-IgA₁, Asialoderivaten von Glykoprotein ΊΙ-Β oder H-A von Human-IgA.., Asialoderivaten von Human-Transferringlykoprotein, Asialoderivaten von Rinderfötusglykoprotein, Deasialoderivaten von Glykoprotein, die an der Aufnahme von Asialoglykoprotein aus Kaninchenleberzellen-protoplasmischer Membran teilnehmen, sulfatiertem Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut, Asialoderivaten von Human-oü₁-Säureglykoprotein, Asialoderivaten von Glykofolin, Glykoprotein von T-Antigen_r Glykopeptid von T-Antigen, Asialo GM₁=AM.. und Glykolipiden von Rindererythrocyten; wobei das Markierungsmaterial· für TAGS oder TAGS-ähnliches Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, GIukooxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase,

ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämocta-

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peptid, J, J und radioaktivem Tritium; und wobei das Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und' Kastorbohnenlectin und der unlösliche Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus. der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, Nylon, Glasperlen, Seide, Polyaminomethylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer.

14. Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten, Glykoproteinen (TAGS), dadurch gekennzeichnet, dass man das zu bestimmende Körperflüssigkeits-TAGS mit einem insolubilisierten Lectin unter Bildung von TAGS-insolubilisiertem Lectinkomplex umsetzt, dass man diesen Komplex mit einer definierten Menge markierten Lectins umsetzt, dass man den an das markierte Lectin ge-

; bundenen Komplex und ungebundenes markiertes Lectin voneinander abtrennt und dann die Aktivität des Markierungsmittels in einer der beiden Komponenten misst.

15. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material oder einem radioaktiven Material markiert ist.

16. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 14, dadurch

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gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut, Zellgewebeflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Toraxflü.ssgikeit, Eingeweideflüssigkeit, ' amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, Cerebrospinalflüssigkeit oder Speichel ist.

17. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass das Lectin in dem insolubilisierten Lectin oder markierten Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin, dass das Markierungsmaterial für das markierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase, Glukooxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hämöcta-

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peptid, J, J und radioaktivem Tritium, und dass der unlösliche Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, • Nylon, Glaskugeln, Seide, Polyamin-Methylvinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer.

18. Bestimmungsverfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass das Lectin des insolubilisierten Lectins oder markierten Lectins ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erdnusslectin und Kastorbohnenlectin, dass, das Markierungsmaterial für das markierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glukoamylase,

Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase, ß-Galaktosidase, aktiven Bruchstücken von Hemocta-

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peptid, J/ J und radioaktivem Tritium; dass der insolubilisierte Träger für das insolubilisierte Lectin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellülose, Ionenaustauschharz, Dextran, Plastikfolie, Plastikrohr, "Nylon, Glasperlen, Seide, Polyamin-Methy1-vinylether-Maleinsäure-Copolymer, Aminosäure-Copolymer und Ethylen-Maleinsäure-Copolymer, und dass das insolubilisierte Lectin eine polymere Matrix ist, die hergestellt wurde durch Bestrahlen einer wässrigen Dispersion eines polymerisierbaren, Lectin enthaltenden Monomers mit Ionenstrahlen unter Polymerisation des Monomers, wobei die wässrige Dispersion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus hydrophobem polymerisierbaren Monomer (A) und einem wasserlöslichen Polymer (B), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus hydrophobem polymerisierbaren Monomer (A) und einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C), einer wässrigen Dispersion eines Gemisches aus einem hydrophoben polymerisierbaren Monomer (A) und einem oberflächenaktiven Mittel (D), und einer wässrigen Dispersion eines hydrophilen polymerisierbaren Monomers (C), wobei das hydrophobe polymerisierbare Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycidylmethacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat,

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Polyethylenglykoo-200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat und entsprechenden Acrylaten davon; und das wasserlösliche Polymer (B) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose und Gummiarabikum; wobei das hydrophile polymerisierbar Monomer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxypolyethylenglykol-400-methacrylat, Methoxypolyethylenglykol-100 0-meth- » acrylat,- Polyethylenglykol-400-dimethacrylat, PoIyethylenglykol-600-dimethacrylat und den entsprechenden Acrylaten davon, und Methacrylsäure, Acrylamid und N-Vinyl-2-pyrrolidon; und das oberflächenaktive Mittel (D) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumlaury!sulfat,. Kaliumoleat, Natriumoleat, Sorbitmonolaurat, Sorbitmonostearat, Sorbitmonooleat, Propylenglykolmonolaurat, Ölsäure und Natriumdodecylbenzolsulfonat.

19. Bestiitimungsverf ahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin Peroxidase-markiertes Erdnusslectin und das insolubilisierte Lectin Sepharose-insolubilisiertes Erdnusslectin ist.

20. Verfahren zur Diagnose von Krebs, dadurch: gekennzeichnet, dass man das Niveau

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an Tumor-assoziierten Glykoproteinen in einer Körperflüssigkeit eines Patienten, gemäss dem in den Ansprüchen 1,9 und 14 beschriebenen Verfahren, misst und das so gemessene Niveau mit dem einer Person normaler Gesundheit vergleicht.

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