DE3202894A1

DE3202894A1 - Verfahren zur bestimmung von tumor-assoziierten glykoprotein enthaltenden verbindungen, anwendung des verfahrens zur krebsdiagnose und kit fuer die anwendung des verfahrens

Info

Publication number: DE3202894A1
Application number: DE19823202894
Authority: DE
Inventors: Mazakazu Takasaki Gunma Adachi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-01-29
Filing date: 1982-01-29
Publication date: 1983-08-11
Also published as: SE8200517L; GB2114287A; CH653442A5; NL8200334A; GB2114287B; US4455380A; SE462186B

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE

DR. ING..E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-I NG. W.EITIE · D R. RER. NAT. K. HOFFMAN N · Dl PL.-I N G. W. LEH N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE * DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MD N CH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29019 (PATH E)

36 256 o/wa

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten Glykoprotein enthaltenden Verbindungen, Anwendung des Verfahrens zur Krebsdiagnose und Kit für die Anwendung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten Glykoproteine enthaltenden Substanzen (nachfolgend mit TAGS = tumor associated glycolinkage abgekürzt) in Körperflüssigkeiten von Säugern, d.h. TAGS einschliesslich Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide und/oder Zucker, die bestimmte spezifische Endgruppen aufweisen und die bei der Wucherung von nicht-differenzierten Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Krebszellen, ansteigen,
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Als Verfahren zur Diagnose von Krebs hat man bereits

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spezifische Glykoproteine bestimmt, die bei Krebspatienten gebildet werden. Die meisten dieser Verfahren machen von der Antigenität des Proteinteils von Glykoproteinen Gebrauch; z.B. gibt es Diagnosen für primären Leberkrebs, indem man ck-i-Fötoprotein bestimmt und eine Diagnose für Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere Rektumkrebs, indem man CEA bestimmt (Igaku no Ayumi; Progress in Medicine, 106, 5, Fifth Saturday Special Issue, Seiten 235-250 (1978)). Diese Diagnosemethoden sind aber in ihrer Anwendbarkeit verhältnismässig beschränkt.

Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Körperflüssigkeit von Krebspatienten TAGS enthält, das aus nicht-differenzierten Zellen (hauptsächlich Krebszellen) stammt und in die Flüssigkeit abgegeben wird und dass TAGS sich hauptsächlich in der Zuckerkettenstruktur, Zuckerkettenlänge und Art der Zusammensetzung der Zuckerreste unterscheidet. Man hat auch schon festgestellt, dass man das Niveau von TAGS in einer Körperflüssigkeitsprobe bestimmen kann, indem man TAGS in einer Körperflüssigkeit mit einem Lectin umsetzt, das sich spezifisch mit Galaktose-(ß1 -» 3 oder ß1 ·» 4)-N-acetylglukosamin-Endgruppen und/oder Galaktose-(ß1 ■» 3 oder ß1 ■* 4)-N-acetylgalaktosamin-Endgruppen bindet (GB-2 043 890A, US-Patentanmeldung Serial Nr. 187 890 vom 1. September 1980).

Aufgrund des zunehmenden Bedürfnisses nach Methoden, das Niveau von TAGS zu bestimmen und nach Diagnoseverfahren, die in ihrer Anwendbarkeit weniger beschränkt sind und die eine erhöhte Empfindlichkeit aufweisen, wurden

gründliche Untersuchungen angestellt. Dabei wurde gefunden, dass TAGS Glykoproteine, Glycopeptide, Glykolipide und/oder Zucker mit N-Acetyl-D-galaktosamin-(nachfolgend als AG abgekürzt) oder L-Fukose-Endgruppen enthält, die sich spezifisch mit bestimmten Arten von Lectinen binden (nachfolgend wird ein Lectin, das sich spezifisch mit AG-Endgruppen bindet als AG-bindendes Lectin bezeichnet und ein solches, das sich spezifisch mit L-Fukose-Endgruppen verbindet wird als L-Fukose-bindendes Lectin bezeichnet) und dass man daher durch Umsetzen von TAGS in einer Körperflüssigkeit mit einem AG-bindenden Lectin oder L-Fukosebindenden Lectin (nachfolgend werden diese Lectine manchmal auch als spezifisches Lectin bezeichnet) Krebszellen nachweisen kann, dass man den Grad ihres Wachstums überwachen kann und dass man deren Wachstumsprofil für die Krebsdiagnose erkennen kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen neuen Erkenntnissen.

Es ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Bestimmung des TAGS-Niveaus in einer Körperflüssigkeit zu zeigen. Deshalb wird in der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Niveaus von TAGS in einer Körperflüssigkeit offenbart, bei dem man TAGS in einer Probe einer Körperflüssigkeit mit einem AG-bindenden Lectin oder L-Fukose-bindenden Lectin unter Bildung eines TAGS-Lectinkomplexes umsetzt und die Menge an TAGS-Leetinkomplex oder an nicht-umgesetztem Lectin misst.

Fig. 1 und 2 · sind grafische Darstellungen einer

Standardkurve, die man gemäss einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Anwendung eines kompetitiven Reaktionsverfahrens (Beispiel 1 Viii und IX) erhält.
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Fig. 3 und 3" sind grafische Darstellungen einer

Kalibrierungskurve gemäss einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Anwendung des kompeti-

0 tiven Reaktionsverfahrens von Beispiel

2(11) .

Fig. 4 ist eine grafische Darstellung des TAGS-

Niveaus bei gesunden Personen und bei verschiedenen Krebspatienten, bestimmt

unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens mittels eines kompetitiven Reaktionsverfahrens gemäss Beispiel

Fig. 5 ist eine grafische Darstellung, die das

TAGS-Niveau von gesunden Personen und Patienten mit verschiedenen Krebsarten gemäss Beispiel 3 (II). zeigt.

Fig. 6 ist eine grafische Darstellung einer

Kalibrierungskurve gemäss einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Anwendung eines . Sandwich-Verfahrens gemäss Beispiel

3(111).

Fig. 7 ist eine grafische Darstellung einer

Kalibrierungskurve, erhalten nach dem Verfahren gemäss Beispiel 3(IV) unter Verwendung von PGM als Standardsubstanz. 5

Fig. 8a_r b + c sind grafische Darstellungen, die das

TAGS-Niveau in Proben, bestimmt mittels der Kalibrierungskurve von Fig. 7, zeigen.

Fig. 9 und 9" sind grafische Darstellungen einer Kalibrierungskurve gemäss einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung des kompetitiven Reaktionsverfahrens von Beispiel 4(1).

Fig. 10 ist eine grafische Darstellung einer

Kalibrierungskurve gemäss einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Anwendung des Sandwich-

Verfahrens gemäss Beispiel 4(11).

Fig. 11 ist eine grafische Darstellung des

TAGS-Niveaus von gesunden Personen und Patienten mit verschiedenen Krebser

krankungen, bestimmt unter Anwendung des kompetitiven Verfahrens von Beispiel . 4(111).

Fig. 12 ist eine grafische Darstellung, die

das TAGS-Niveau von gesunden Personen

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und von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen, bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 4(IV) zeigt.
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Fig. 13 ist eine grafische Darstellung einer

Kalibrierungskurve, wie sie nach dem Verfahren gemäss Beispiel 4(V) erhalten wurde.
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Fig. 14 ist eine grafische Darstellung des TAGS-

Niveaus in Proben, bestimmt unter Anwendung der Kalibrierungskurve von Fig. 13.

Als Körperflüssigkeiten, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kommen beispielsweise Blut, Zellgewebeflüssigkeiten, Lymphflüssigkeit, Thoraxflüssigkeit, Eingeweideflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, cerebrospinale Flüssigkeit und Speichel in Frage. Von diesen Flüssigkeiten wird Blut in Form von Serum oder Blutplasma besonders bevorzugt. Die Menge der für die Bestimmung benötigten Körperflüssigkeit liegt im Bereich von etwa 0,01 bis 10 ml und vorzugsweise 0,1 bis 0,2 ml.

Erfindungsgemäss wird TAGS von einer Körperflüssigkeit isoliert und mit einem spezifischen Lectin gemäss der Erfindung umgesetzt und die Menge des TAGS-gebundenen spezifischen Lectins oder die restliche Menge des spezifischen Lectins wird gemessen oder alternativ wird ein spezifisches Lectin markiert und direkt der Körperflüssigkeit zugegeben und das TAGS-gebundene markierte spezifische

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Lectin oder nicht-umgesetztes, markiertes, spezifisches ■•Lectin werden isoliert und die Menge an TAGS-gebundenem markierten, spezifischen Lectin oder nicht-umgesetztem markierten, spezifischen Lectin wird gemessen. Nach beiden Methoden kann man das TAGS-Niveau in einer Körperflüssigkeit bestimmen.

TAGS kann aus Körperflüssigkeiten nach üblichen Extraktions- oder Abtrennungsverfahren, wie man sie für Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide und/oder Zucker mit AG- oder L-Fukose-Endgruppen anwendet, isoliert werden. Zu diesen Methoden gehört das Aussalzen, das Ausfällen, das Extrahieren, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebe und Inaktivierung von Enzymen. Diese Verfahren können auch in Kombination angewendet werden. Insbesondere kann man eine solche Fraktion gewinnen, indem man Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure oder Zinksulfat zu Serum oder Plasma gibt oder Serum oder Plasma erwärmt, den dabei gebildeten Niederschlag zur Entfernung von Albumin, Immunoglobulin und dergleichen filtriert und dann eine Dialyse durchführt.

Bei Verwendung eines markierten Lectins können gesammelte Proben oder Körperflüssigkeit, ausgenommen Blut, als Testprobe (nachfolgend als Probe bezeichnet) verwendet werden.

Um zu vermeiden, dass sich die Proben denaturieren und um die Umsetzung mit dem spezifischen Lectin zu beschleu- ■ nigen, können niedrig-zuckerhaltige Proteine, wie Rinderserumalbumin (BSA) vorzugsweise zu den Proben als Schutzproteine zugegeben werden. Bessere Ergebnisse erhält

man, indem man eine geeignete Menge des Schutzproteins der Probe nach der Entfernung von Albumin, Immunoglobulin und dergleichen zugibt. Bei Blutproben kann man Serum, das man nach einem bekannten Serumsammelverfahren erhalten hat, oder Plasma, das unter Verwendung von Antikoagulantien, wie Häparin, EDTA, Zitronensäure und dergleichen, gesammelt wurde, verwenden. Eine besonders bevorzugte Probe ist ein Plasma, das unter Verwendung von Häparin als Antikoagulanz gesammelt und zubereitet wurde. Ist das TAGS-Niveau verhältnismässig hoch, wie bei Patienten, die unter Ascites leiden, so kann man gewünschtenfalls die Proben mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnen.

Jedes AG-bindende Lectin oder L-Fukose-bindende Lectin kann erfindungsgemäss verwendet werden, sofern es in der Lage ist, sich spezifisch mit Glykoproteinen, Glykopeptiden, Glykolipiden und/oder Zuckern mit AG- oder L-Fukose-Endgruppen zu verbinden. Geeignete Beispiele für AG-bindende Lectine schliessen Dolichos-Bohnen (Dolichos biflorus), Maclura-tomifera-lectin, Helixpomatia-lectin, Lima-Bohnen (Phaseolus limensis)-lectin, Sojabohnen (Glycine max)-lectin und Bauhinia-Bohnen (Bauhinia purpurea)-lectin ein. Geeignete Beispiele von L-Fukose-bindenden Lectinen schliessen Lotus-tetragonolobuslectin (Brt. J. Enp. Pathi., 3_4, 94 (1953)) und Ulexeuropeus-lectin (Boyd., W.C. und Sharpleigh E., Blood, % 1195 (1954)} ein.

Als Markierungsmittel zum Markieren des Lectins können verschiedene Enzyme, fluoreszierende Materialien und radioaktive Materialien verwendet werden. Beispiele für

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Enzyme sind Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, ß-Galaktosidase und aktive Fragmente von Hämoctapeptiden, etc.; und fluoreszierende Materialien schliessen beispielsweise ein Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Dansylchlorid (d.h. S-Dimethylamino-i-naphthalin-sulfonylchlorid), etc.; und radioaktive Materialien sind beispielsweise radioaktives

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Jod (z.B. J, J, etc.), radioaktives Tritium, etc..

Wie noch beschrieben wird, kann man das bei der vorliegenden Erfindung verwendete spezifische Lectin mit diesen Markierungsmaterialien markieren, wobei man Verfahren anwendet, wie sie üblicherweise zum Markieren bekannter Proteine, wie Antigene, oder Antikörper, mit Enzymen, fluoreszierenden Materialien oder radioaktiven Materialien angewendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird in folgender Weise durchgeführt: Zuerst wird eine vorbestimmte Menge einer Körperflüssigkeit oder einer TAGS-Fraktion mit einem markierten oder unmarkierten spezifischen Lectin vermischt und die Mischung wird auf eine Temperatur unterhalb 45°C, vorzugsweise zwischen 4 und 40⁰C, und besonders bevorzugt zwischen 20 und 40⁰C, erwärmt. Das gebildete TAGS-gebundene markierte oder unmarkierte spezifische Lectin oder das nicht-umgesetzte markierte oder unmarkierte spezifische Lectin wird dann durch eine übliche Trenntechnik isoliert, z.B. durch Chromatografie, Elektrophorese, Aussalzen, Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration, Adsorption oder Kombinationen davon. Alternativ kann man als Abtrennungsmittel Agargel,

Agarosegel oder Polyacrylamidgel verwenden (siehe JA-OS 151 263/80) .

So kann man das nicht-umgesetzte markierte oder unmarkierte spezifische Lectin isolieren, indem man zu der Reaktionsflüssigkeit eine geeignete Menge eines Niederschlagsmittels für ein Glykoprotein-gebundenes spezifisches Lectin, wie Polyethylenglykol, gesättigtes Ammoniumsulfat oder Rivanol (Acrinol) gibt; dann folgt die Zentrifugierung oder eine andere Methode, um das TAGS-gebundene markierte oder unmarkierte spezifische Lectin abzutrennen. Geeignete Bedingungen für die Zentrifugierung hängen von dem verwendeten Niederschlagsmittel ab; wird Polyethylenglykol als Niederschlagsmittel verwendet, so wird die Zentrifugierung vorzugsweise bei etwa 1000 G während 30 bis 60 Minuten durchgeführt.

Das TAGS-gebundene markierte oder unmarkierte spezifische Lectin kann einfach von dem nicht-umgesetzten markierten oder unmarkierten spezifischen Lectin abgetrennt werden, indem man die unterschiedlichen Diffusionsgrade auf Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel anwendet. Gibt man das Reaktionsgemisch auf ein Gel, dann diffundiert das TAGS-gebundene spezifische Lectin nicht und bleibt auf der Oberfläche des Gels, während das nicht-umgesetzte spezifische Lectin durch das Gel hindurchdiffundiert. Man kann somit das TAGS-gebundene spezifische Lectin einfach von dem nichtumgesetz ten spezifischen Lectin trennen.

Das vorerwähnte Gel kann in üblicher Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann man eine geeignete Menge

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Agar, Agarose oder Polyacrylamid zu einem Verdünnungsmittel, wie destilliertem Wasser, oder einer verdünnten Zitronensäure oder Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH = ca. 7,5) geben und die Mischung wird dann auf 60 bis 80⁰C unter schwachem Rühren erwärmt unter Ausbildung einer Lösung, die man in einen geeigneten Behälter, z.B: ein Reagenzglas,gibt und dann abkühlen lässt, bis die Lösung zu einem Gelee koaguliert. Die Konzentration des Gels wird je nach der Grosse (z.B. dem Molekulargewicht, stereospezifischer Struktur) des nicht-umgesetzten Lectins gemäss der Erfindung und des TAGS-gebundenen markierten spezifischen Lectins gewählt. Im allgemeinen hat das Gel eine Konzentration von 0,4 bis 2,0 Gew.% und vorzugsweise 0,7 bis 1,0 Gew.%. Erforderlichenfalls oder gewünschtenfalls kann das Gel ein Konservierungsmittel enthalten. Das so hergestellte Gel kann eine flache Oberfläche haben, jedoch wird eine konkave Oberfläche bevorzugt, weil der gebildete Komplex nicht an der Innenwand des Behälters anhaftet.

Das TAGS-Niveau der Körperflüssigkeit kann aus der Menge des isolierten TAGS-gebundenen markierten oder unmarkierten spezifischen Lectins oder des nicht-umgesetzten markierten oder unmarkierten spezifischen Lectins, bestimmt durch übliche Verfahren, berechnet werden.

Es gibt eine Reihe von Verfahren, die man anwenden kann, um die Menge an unmarkiertem, spezifischen Leetin, das bei der Reaktion nicht verbraucht wurde, zu messen. Vorzugsweise·gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit eine Substanz, die spezifisch mit dem spezifischen Lectin

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unter Agglutination oder Ausfällen reagiert und die dabei entstehende spezifische Änderung wird visuell beobachtet oder durch fotometrische Analyse gemessen. So kann man die Reaktionsflüssigkeit serienverdünnen nach der Zweifach-Verdünnungsmethode, mit einem Verdünnungsmittel, wie 0/15M Phosphatpuffer oder physiologischer Kochsalzlösung, und eine vorbestimmte Menge der Verdünnung wird auf eine V-förmige Platte, U-förmige Glasplatte oder ein kleines Reagenzglas und dergleichen gegeben, und eine Substanz, die eine spezifische Agglutinationsreaktion mit dem spezifischen Lectin ergibt, wird zugegeben und die Mischung wird dann gerührt und stehen gelassen bei einer Temperatur unterhalb 45°C und vorzugsweise zwischen 4 und 40⁰C während 30 Minuten oder länger und vorzugsweise 60 bis 90 Minuten, und der letzte oder maximale Grad der Verdünnung, bei welcher die Agglutination stattfindet, wird bestimmt. Der maximale Verdünnungsgrad wird als Agglutinationswert definiert. Alle spezifischen Lectine, die gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, haben im wesentlichen den gleichen Agglutinationswert.

Ein Beispiel für eine Substanz, die eine spezifische Agglutinationsreaktion mit einem spezifischen Lectin ergibt, ist ein Glykoprotein mit AG- oder L-Fukose-Endgruppe. Pur das AG-bindende Lectin kann man Sephadex, Latex, Glasperlen und dergleichen, die mit Glykoprotein mit AG-Endgruppen beschichtet sind, wie Cytolipine K und R von Humanerythrocytenmembran, sulfatiertes Glyko-0 peptid A von Schweinemagenschleimhautmembran und Asialoderivate von Human-blutaktiven Substanzen Typ A, Mucin

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Typ A von Schweinesubraandibularmembran, Asialo GM₁ und Follisman-Antigensubstanz verwenden. Für das L-Fukosebindende Lectin kann man Sephadex, Latex, Glasperlen und dergleichen, die mit Glykoproteinen mit L-Fukose-Endgruppen beschichtet sind, wie Human-blutaktive Substanzen Typ Le^a und Le , sulfatiertes Glykoprotein Typ A von Schweinemagenschleimhautmembran, sulfatierte glykoproteinaktive Substanz Typ H(O) von Schweinemagenschleimhautmembran und Humanerythrocyten H₁-Antigen verwenden.

Wird das markierte spezifische Lectin verwendet, so kann man das TAGS-Niveau nach einer geeigneten Verfahrensweise bestimmen, die in Abhängigkeit von dem für das spezifisehe Lectin verwendeten Markierungsmittel ausgewählt wird. Ist das spezifische Lectin beispielsweise mit einem Enzym markiert, so kann man das TAGS-Niveau bestimmen, indem man die enzymatisch^ Aktivität misst unter Verwendung eines geeigneten Enzymsubstrats für ein colorimetrisches oder fluoreszenzanalytisches System. Ist das Markierungsmittel ein fluoresziierendes Material so kann man das TAGS-Niveau bestimmen, indem man die Fluoreszenzintensität misst und ist das Markierungsmittel ein radioaktives Material, so kann man das TAGS-Niveau durch Messung der Radioaktivität bestimmen. Auf diese Weise wird die Menge des TAGS-gebundenen markierten spezifischen Lectins oder von nicht-umgesetztem markierten spezifischen Lectin gemessen.

Eine besonders einfache Verfahrensweise zur Durchführung der vorerwähnten Bestimmung gemäss der vorliegenden

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Bestimmung besteht in der Verwendung eines Kits zur Bestimmung des TAGS-Niveaus von Körperflüssigkeiten, wie Blutplasma oder Serum. Für. die Zwecke der Erfindung kann man einen Kit, der ein spezifisches Lectin, das spezifisch mit TAGS gebunden wird, verwenden. Ein Stabilisator und/oder Konservierungsmittel, wie Glyzerin oder Rinderserumprotein, können zu dem spezifischen Lectinreagenz zugegeben werden. Das spezifische Lectinreagenz kann ein lyophilisiertes Produkt sein oder der Kit kann ein wasserlösliches oder wassermischbares Lösungsmittel enthalten. Weiterhin kann das spezifische Lectinreagenz eine Pufferlösung enthalten, um den pH nach dem Rekonstituieren zu halten und/oder ein Konservierungsmittel und/oder einen Stabilisator enthalten, um eine vorzeitige Zerstörung der Probe zu vermeiden. Die Pufferlösung ist für den Kit nicht wesentlich, aber wenn man sie verwendet, so soll deren pH vorzugsweise auf 6 bis 7,8 eingestellt sein. Das Rekonstituierungsmittel enthält vorzugsweise Wasser, aber ein Teil oder das gesamte Wasser können durch ein wassermischbares Lösungsmittel ersetzt werden. Wassermischbare Lösungsmittel sind dem Fachmann bekannt und Beispiele hierfür sind Glyzerin, Alkohole, Glykole und Glykolether, wobei diese Aufzählung nicht limitierend ist. D-ie Menge des in dem Lösungs- oder Verdünnungsmittel enthaltenen spezifischen Lectins wird entsprechend dem Agglutinationswert (der durch die letzte oder maximale Verdünnung bei Serien-Zweifach-Verdünnungs- ■ proben definiert wird), der Art des Markierungsmittels oder der zu bestimmenden Substanz, etc., gewählt. Im allgemeinen ist das spezifische Lectin in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise 0,03 bis

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40 μg/ml enthalten. Die obige Lösung des markierten oder unmarkierten spezifischen Lectins kann noch weiter verdünnt werden.

Die Ziele der vorliegenden Erfindung können mit Vorteil mittels eines kompetitiven Verfahrens oder eines Sanwich-Verfahrens, wie sie nachfolgend beschrieben werden, erzielt werden:

(1) Das in einer Körperflüssigkeit zu bestimmende TAGS (nachfolgend auch manchmal als zu bestimmendes Material bezeichnet) und eine gegebene Menge von insolubilisiertem TAGS oder insolubilisiertem TAGS-ähnlichem Material werden kompetitiv mit dem spezifischen Leetin, das mit einem Markierungsmittel markiert wurde (nachfolgend als markiertes, spezifisches Lectin bezeichnet) umgesetzt und das insolubilisierte TAGS oder insolubilisierte TAGS-ähnliche Material, das an das markierte spezifische Lectin gebunden ist, wird von dem ungebundenen markierten spezifischen Lectin abgetrennt und die Aktivität des Markierungsmittels bei beiden Materialien wird zur Bestimmung des TAGS-Niveaus gemessen.

(2) Das zu bestimmende Material und eine gegebene Menge TAGS oder TAGS-ähnliches Material, das mit einem Markierungsmittel markiert wurde (nachfolgend als markiertes TAGS und markiertes TAGS-ähnliches Material bezeichnet) werden kompetitiv mit einer gegebenen Menge des spezifischen Lectins oder insolubilisierten spezifischen Lectins umgesetzt und das markierte TAGS oder markierte TAGS-ähnliche Material, gebunden an das spezifische Lectin

oder an insolubilisiertes spezifisches Lectin wird von dem ungebundenen markierten TAGS oder ungebundenen markierten TAGS-ähnlichen Material abgetrennt und die Aktivität des Markierungsmittels bei beiden Materialien wird zur Bestimmung des TAGS-Niveaus gemessen.

(3) Das zu bestimmende Material wird mit dem insolubilisierten spezifischen Lectin unter Bildung eines Komplexes aus TAGS und dem insolubilisierten spezifisehen Lectin umgesetzt und der Komplex wird mit einer gegebenen Menge des markierten spezifischen Lectins umgesetzt und der an das markierte spezifische Lectin gebundene Komplex wird dann von dem ungebundenen markierten spezifischen Lectin abgetrennt und die Aktivität des Markierungsmittels bei beiden Materialien wird zur Bestimmung des TAGS-Niveaus gemessen.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird durch den Begriff "TAGS-ähnliches Material" ein Zuckerderivat mit AG- oder L-Fukose-Endgruppen gemeint. Beispiele hierfür sind Zucker mit AG-Endgruppen, wie sulfatiertes Glykopeptid Typ A von Schweinemagenschleimhautmembran, Cytolipine K und R von Humanerythrocytenmembran, Asialoderivate von Humanblutaktiven Substanzen Typ A_r Mucin Typ A von Schweine- submandibularmembran, Asialo GM₁ und Follisman-Antigen-

substanz und/oder Zuckerderivate mit L-Fukose-Endgruppen, wie Human-blutaktive Substanzen Typ Le und Le , sulfatiertes Glykoprotein Typ A von Schweinemagenschleimhautmembran, sulfatierte glykoproteinaktive Substanz Typ H(O) von Schweinemagenschleimhautmembran und Humanerythrocyt-H₁-Antigen.

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V -U

Das insolubilisierte TAGS, insolubilisierte TAGS-ähnliche Material und insolubilisierte spezifische Lectin kann man chemisch oder physikalisch herstellen, indem man TAGS, TAGS-ähnliches Material oder das spezifische Lectin mit einem unlöslichen Träger umsetzt. Geeignete unlösliche Träger sind beispielsweise Zellulosepulver, Sephadex, Sepharose, Polystyrol, Filterpapier, Carboxymethylzellulose, Ionenaustauschharze, Dextran, Plastikfolien, Plastikrohre, Nylon, Glasperlen, Seide, Polyamin-Methylvinylether-Maleinsäure-Copolymere,Aminosäure-Copolymere, Ethylen-Maleinsäure-Copolymere, etc.. Die Insolubilisierung kann man durch ein eine kovalente Bindung, bildendes Verfahren /z.B. ein Diazo-Verfahren, ein Peptidverfahren (z.B. ein Säureamidderivatverfahren, ein Carboxychloridharzverfahren, ein Carbodiimidharzverfahren, ein Maleinsäureanhydridderivatverfahren, ein Isocyanatderivatverfahren, ein Cyanogenbromid-aktiviertes Polysaccharidverfahren, ein Zellulosekarbonatderivatverfahren, ein Verfahren unter Verwendung eines Kondensierungsmittels, etc.), ein Alkylierungsverfahren, ein Träger-Bindungs-Verfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, Hexamethylenesoocyanat, etc., ein Träger-Bindungsverfahren nach der Ugi-Reaktion und dergleichen?, ein Ionenbindungsverfahren unter Verwendung eines Trägers, wie einem Ionenaustauschharz, und ein physikalisches Adsorptionsverfahren unter Verwendung von porösem Glas, wie Glasperlen, als Träger, bewirken. Von diesem wird das Cyanogenbromid-aktivierte Polysaccharidverfahren und das trägergebundene Verfahren unter Verwendung eines Vernetzungsmittels als kovalente Bindung bildendes Verfahren bevorzugt. Beim Cyanogenbromidaktivierten Polysaccharidverfahren kann man insolubilisiertes

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TAGS, insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material und insolubilisiertes spezifisches Lectin erhalten, indem man TAGS, etc., mit einer 10- bis 1000-fachen Menge Cyanogenbromid-aktiviertem Träger in einem geeigneten Lösungsmittel bei 0 bis 40⁰C und vorzugsweise 20 bis 30⁰C während 2 bis 4 Stunden umsetzt.

Das insolubilisierte TAGS, insolubilisierte TAGS-ähnliche Material und insolubilisierte spezifische Lectin kann man auch mittels eines strahlungsinduzierten Polymerisationsverfahrens herstellen. Man kann eine wässrige Dispersion eines polymerisierbaren Monomers, enthaltend TAGS, TAGS-ähnliches Material oder spezifisches Lectin, herstellen und mit Licht oder ionischer Bestrahlung bestrahlen und das Monomer polymerisieren unter Bildung einer Polymermatrix von TAGS, TAGS-ähnlichem Material oder spezifischem Lectin. Eine solche wässrige Dispersion wird hergestellt, indem man ein hydrophobes polymerisierbares Monomer (A) in einer 0,1 bis 5 Gew.%-igen wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Polymers (B), Dispergieren von hydrophilem, polymerisierbarem Monomer (C) in einer wässrigen Lösung, dispergiert oder indem man eine Mischung aus dem hydrophoben polymerisierbaren Monomer A mit einem hydrophilen polymerisierbaren Monomer (C) in einer 3 bis 20 Gew.%-igen wässrigen Kochsalzlösung dispergiert oder, indem man das hydrophobe polymerisierbar Monomer (A) in einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,01 bis 5 Gew.% eines oberflächenaktiven Mittels (D), dispergiert. Wenn eine so hergestellte Dispersion mit Licht oder ionischen Strahlen bestrahlt wird, wird das als disperse Phase vorliegende polymerisierbare Monomer unter Bildung einer Polymermatrix von

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TAGS, TAGS-ähnlichem Material oder spezifischem Lectin polymerisiert. Gewünschtenfalls kann man die Matrix zu einer Folie oder zu Teilchen einer geeigneten Grosse formen.
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Spezifische Beispiele für hydrophobe polymerisierbare Monomere (A) sind beispielsweise Glyzidylmethacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Diethylenglykoldimethacrylat, Triethylenglykoldimethacrylät, Trimethylolpropantrimethacrylat, Polyethylenglykol 200-dimethacrylat, Dipropylenglykoldimethacrylat, 1,4-Butylenglykoldimethacrylat, 1,6-Hexanglykoldimethacrylat, Methoxydiethylenglykoldimethacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat und die entsprechenden Acrylate. Im allgemeinen kann jedes wasserunlösliche Monomer, das durch Licht oder Strahlung polymerisiert werden kann, verwendet werden.

Typische Beispiele für hydrophile polymerisierbare Monomere (C) sind 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methoxytetraethylenglykolmethacrylat, Methoxypolyethylenglykol 4 00-methacrylat, Methoxypolyethylenglykol 1000-methacrylat, Polyethylenglykol 400-dimethacrylat, Polyethylenglykol 600-dimethacrylat, Methacrylsäure, Acrylamid, N-Vinyl-2-pyrrolidon, etc., und die entsprechenden Acrylate davon. Im allgemeinen kann jedes wasserlösliche Monomer, das durch Bestrahlung mit Licht oder Strahlen polymerisiert werden kann, verwendet werden.

Typische Beispiele für wasserlösliche Polyemere (B) sind Polyvinylpyrrolidon, Polymethacry!säure, Polyacrylsäure,

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Polyvinylalkohol, Hydroxypropylzellulose, Gummiarabikum, etc. .

Typische Beispiele für oberflächenaktive Mittel (D) sind Natriumlaurylsulfat, Kaliumoleat, Natriumoleat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonooleat, Propylenglykolmonolaurat, ölsäure und Natriumdodecylbenzolsulfonat. Jedoch ist jedes oberflächenaktive Mittel, das in seiner mizellaren Struktur das polymerisierbare Monomer oder TAGS, TAGS-ähnliche Material oder spezifische Lectin in dem polymerisierbaren Monomer zurückhalten kann, geeignet.

Mit radioaktivem Material markiertes TAGS, mit radioaktivem Material markiertes TAGS-ähnliches Material, mit radioaktivem Material markiertes spezifisches Lectin kann man herstellen, indem man in TAGS, TAGS-ähnliches Material oder spezifisches Lectin ein radioaktives Jodatom wie J oder J, einführt. Die Einführung von radioaktivem Jod wird durch übliche Jodierungsverfahren bewirkt, z.B. durch eine oxidative Jodierung unter Verwendung von Chloramin T (Natur, 194, Seite 495 (1962); Biochem. J., _89, Seite 114 (1963)). Dabei wird die Jodierung in einem geeigneten Lösungsmittel,(z.B. einer Pufferlösung von pH 6 bis 8, vorzugsweise 0,2M Phosphatpufferlösung mit pH 7,0) bei etwa Raumtemperatur während 5 bis 60 Sekunden in Gegenwart von Chloramin T durchgeführt. Radioaktives Jod und Chloramin T werden vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 5 mCi bzw. 10 bis 100 Nanomolenpro Nanomol Tyrosin, enthalten in TAGS, TAGS-ähnlichem Material oder spezifischem Lectin, angewendet.

Das so markierte TAGS, TAGS-ähnliche Material oder spezifische Lectin wird isoliert und in üblicher Weise abgetrennt und gelagert, erforderlichenfalls in lyophilisierter Form.
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Enzymmarkiertes TAGS, enzymmarkiertes TAGS-ähnliches Material und enzymmarkiertes spezifisches Lectin können nach bekannten Kupplungsverfahren (z.B. gemäss B.F. Erlanger et al, Acta. Endocrinol. Suppl., 168, 206 (1972) und M.H. Karol et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, ΕΓ7, 713 (1967)) hergestellt werden. Hierfür wird TAGS, TAGS-ähnliches Material oder spezifisches Lectin mit einem Enzym in einer Pufferlösung bei pH 4 bis 6 (z.B. 1 mmol Acetatpufferlösung, pH 4,4) bei Raumtemperatur während 2 bis 5 Stunden in Gegenwart eines Oxidationsmittels, wie NaJO₄, mit anschliessender Reduktion durch NaBH₄ oder dergleichen umgesetzt. Enzym wird in einer Menge von 1 bis 3 Molen pro Mol TAGS oder dergleichen verwendet. Das Oxidationsmittel iwrd in einer Menge von 100 bis 300 Molen pro Mol TAGS oder dergleichen und das Reduktionsmittel in einer Menge von 1 bis 2 Molen verwendet.

Fluoreszenzmaterial-markiertes TAGS, Fluoreszenzmaterialmarkiertes TAGS-ähnliches Material und Fluoreszenzmaterialmarkiertes spezifisches Lectin werden hergestellt, indem man TAGS, TAGS-ähnliches Material oder spezifisches Lectin mit einem bekannten Fluoreszenzmaterial, wie Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodaminisothiocyanat (RITC) in Wtiisür oder einer physiologischen Kochsalzlösung bei pH 6 bis 8 bei 0⁰C bis Raumtemperatur und vorzugsweise bei Raumtemperatur während 0,5 bis 3 Stunden umsetzt

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(Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren; Ikagaku Jikkenho Koza, Nr. 4, Seiten 263-270). Vorzugsweise wird das Fluoreszenzmaterial in einer Menge von 1/50 des TAGS oder dergleichen verwendet.
5

Das Bestimmungsverfahren gemäss der Erfindung durch das kompetitive Verfahren oder das Sandwich-Verfahren wird nachfolgend beschrieben.

Bei den beiden Verfahren werden die Umsetzungen in einem geeigneten Lösungsmittel bei 45°C oder weniger, vorzugsweise 4 bis 40⁰C und insbesondere 20 bis 40⁰C/ durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel sind solche, die die Umsetzung von TAGS oder TAGS-ähnlichem Material mit spezifischem Lectin nicht ungünstig beeinflussen, z.B. Wasser oder physiologische Kochsalzlösungen, wobei Pufferlösungen mit pH 6 bis 7,8 (z.B. 0,1 bis 0,3M Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, pH etwa 7,5; 0,1M Phosphatpufferlösung, pH etwa 7,4; etc.) bevorzugt werden. Die Umsetzungen werden während 5 bis 40 Stunden,vorzugsweise 15 bis 25 Stunden, durchgeführt.

Das gebildete TAGS (oder TAGS-ähnliche Material), gebunden an das spezifische Lectin, kann von dem ungebundenen spezifischen Lectin oder ungebundenen TAGS (oder TAGS-ähnlichem Material) in üblicher Weise abgetrennt werden. Verwendet man insolubilisiertes TAGS (oder TAGS-ähnliches Material) oder insolubilisiertes spezifisches Lectin, so wird die Festphase einfach von der Flüssigphase durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren abgetrennt.

In anderen Fällen kann man Chromatografie, Elektrophorese,

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Aussalzen, Fraktionieren, Dialyse, Gelfiltration, Adsorption oder Kombinationen davon anwenden oder Trennverfah-• ren unter Verwendung von Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel verwenden, wie in JA-OS 151 263/80 beschrieben wird.

Die Aktivität des Markierungsmittels für das so abgetrennte Produkt kann nach einer geeigneten Methode festgestellt werden, die man von den bereits beschriebenen Verfahren auswählen kann und hängt von der Art des Markierungsmittels ab. Die gemessene Aktivität kann man dann anwenden, um das TAGS-Niveau der Probe zu bestimmen.

Wie vorerwähnt, ermöglicht die vorliegende Erfindung die vorteilhafte Bestimmung von TAGS in einer Körperflüssigkeit. Aus der so bestimmten TAGS-Menge kann man Krebs in jedem Stadium bestimmen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für die Aufdeckung von Krebs im Frühstadium. Da Glykoproteine bei der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, kann man diese Methode für eine grössere Anzahl von Krebsarten, als mit den üblichen Antikörper verwendenden Verfahren {φ -Fötoprotein, CEA, etc.), bei denen hauptsächlich die Proteingruppe bestimmt wird, anwenden, z.B. bei maligner Lymphadenose, malignem Lymphom, Chorion-Epithelioma malignum, Leberkrebs, Gallenblasenkrebs, Pankreaskrebs, Lungenkrebs, Gallenkrebs, Thyroiddrüsenkrebs, multiplem Myelom, Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkarzinom, Rektalkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Kehlkopfkrebs, Prostatakrebs, Liposarkom, malignem Melanom, Uteruskrebs und primärem Magensarkom. Das Verfahren ist hinsichtlich des verwendeten

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spezifischen Lectins spezifisch; wird das AG-bindende Lectin verwendet, so ist die Erfindung besonders zur Diagnose von Krebsarten geeignet, die sich von undifferenzierten Zellen ableiten, wie maligner Lymphadenose, malignem Lymphoma und Chorion-epithelioma malignum. Weiterhin ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Krebsdiagnose unter Verwendung von AG-bindendem Lectin oder L-Fukosebindendem Lectin vorteilhaft, weil dieses Verfahren eine erheblich verminderte Kreuzreaktivität mit anderen Krankheiten als Krebs zeigt, z.B. häpatitischer Induration, Häpatitis, Magengeschwür, Diabetes mellitus, Colitis, etc., im Vergleich zu üblichen Krebsdiagnoseverfahren durch Bestimmung von d> .^-Föroprotein, CEA und dergleichen. Die üblichen Diagnoseverfahren ergeben häufig positive Resultäte bei Häpatitiserkrankungen, insbesondere bei Häpatitisinduration, akuter und chronischer Häpatitis und dergleichen, wodurch die Krebsdiagnose erheblich verunsichert wird. Andererseits zeigt die erfindungsgemässe Diagnosemethode eine niedrige Kreuzreaktivität mit häpatitischen Erkrankungen, wodurch eine genaue Krebsdiagnose ermöglicht wird.

Weiterhin ist die vorliegende Erfindung zur Bestimmung von Zuckern und Zuckerderivaten (z.B. Glykopeptiden, Glykoproteincn, Glykolipiden, Glykotherpenen und Glykosteroiden) mit AG- oder L-Fukose-Endgruppen geeignet.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nicht beschränkend auszulegen sind, beschrieben.

■ .

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Beispiel 1
(I)

5 mg Peroxidase (aus Meerrettich) wurden in 1 ml einer

0,3M wässrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung gelöst. 0,1 ml einer 0,1M Fluordinitrobenzol enthaltenden Ethanollösung wurden zu dieser Lösung gegeben und anschliessend wurde leicht während einer Stunde bei Raumtempera-

tür gerührt und ann wurden 0,1 ml einer 0,06M NaJO,-Lösung zugegeben und weitere 30 Minuten schwach gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 1 ml einer 0,16M Ethylenglykollösung gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur schwach gerührt. Anschliessend wurde die Lösung gegen 0,01M Kohlensäure-Natriumhydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) bei 4⁰C während eines Tages und einer Nacht dialysiert.

(II) Y^erf§hren_zum_Markieren_von_Lectin__mit_Per-

gxidase^^Dolichos-Bohnen-Lectin^Peroxidase^

5 mg Dolichos-Bohnen-Lectin wurden in 3 ml der gemäss (I) zubereiteten aktivierten Peroxidase gelöst und bei Raumtemperatur während 2 bis 3 Stunden unter Umsetzen schwach

gerührt. 5 mg NaBH₄ wurden zugegeben und bei 4⁰C während 3 Stunden umgesetzt. Anschliessend wurde diese Lösung gegen eine O,1M tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 7,4) während eines Tages und einer Nacht dialysiert und dann einer Sephadex G 150 Gel-Säulenchromatografie (Eluierungsmittel 0,1M tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung;

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pH 7,4) unter Ausführung einer Gelfiltration unterworfen. Die optischen Dichten (OD₃₈₀ und OD₄₀₃) jeder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen/ bei denen sich die Peaks von OD _g0 und OD ₃ überlappten, wurden gesammelt.

(III) Υ§Εί §i}ren_ zum_Markieren_vgn_Lec t in_mi t_Per-

oxidase iif2tHS-t®t£^a22D2i2^iJS_ii§2£ii}zPf£22il

dase

5 mg Lotus-tetragonolobus-lectin wurden in 3 ml aktivierter Peroxidase, erhalten gemäss (I) gelöst und die Lösung wurde schwach bei Raumtemperatur während 2 bis 3 Stunden gerührt. 5 mg NaBH₄ wurden zu der Lösung gegeben und 3 Stunden bei 4°C gehalten. Die Reaktionsflüssigkeit wurde gegen 0,1M Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (ρΉ 7,4) während eines Tages und einer Nacht dialysiert und anschliessend mittels Sephadex G 150 einer Gelsäulenchromatografie (Eluiermittel: 0,1M Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, pH 7,4) unterworfen. Jede Fraktion wurde bei OD₃₈₀ und OD₄₀₃ gemessen und die Fraktion, die Peaks für OD-_oA und OD ._Λ-, aufwiesen, wurden gesammelt.

(IV) Y§ii§hren_zur_Herstellun2_von_insolubilisiertem Lectin

15g CNBr-aktivierte Agarose wurden in 3 1 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehenlassen mit 1 1 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5 auf einem Glasfilter gewaschen. Man erhielt insge-

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samt etwa 50 ml aktivierte Agarose. Diese wurde in 200 ml 0,1 M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert und 5 ml einer 0,01M Phosphatpufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg Dolichos-Bohnen-Lectin, wurden dazugegeben und während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf ein Glasfilter gegeben und das Reaktionsprodukt wurde darauf gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer 1m Monoethanolaminlösung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschliessend wurde das Reaktionsprodukt auf einem Glasfilter mit 1 1 einer 0,1M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 1 1 einer 0₇1M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

(V) Yerfahren_zur_Herstellun2_von_insolubilisier₌ tem_Lect±ri

15 g CNBr-aktivierte Agarose wurden in 3 1 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehenlassen mit 1 1 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) auf einem Glasfilter gewaschen. Man erhielt insgesamt etwa 50 ml aktivierte Agarose. Diese wurde in 200 ml 0,1M Natriumhydrogenkarbonat (pH 8,5) suspendiert und 5 ml einer 0,01M Phosphatpufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg Doiichos-Bohnen-Lectin, wurden dazugegeben und während 2 Stunden unter gelegentlichem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung

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der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf ein Glasfilter gegeben und das Reaktionsprodukt wurde darauf gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer 1M Monoethanolaminlösung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschliessend wurde das

Reaktionsprodukt auf einem Glasfilter mit 1 1 einer 0,1M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend.0,5M NaCl) und 1 einer 0,1M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0/5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.
10

(VI) Y§£f§hren_zur_Herstellun2_von_TAGS-ähnlichem Material

1g sulfatiertes Glykoprotein von Schweinemagenschleimhaut (anschliessend als PGM abgekürzt) wurde in 100 ml einer 0,05M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) suspendiert und dazu wurde unter Einstellung des pH's auf 11 eine 1N wässrige NaOH-Lösung tropfenweise zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 7,0 mit 1N HCl eingestellt und anschliessend wurde nochmals 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 10 1 einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) über Nacht dialysiert, wobei man gereinigtes TAGS-ähnliches Material (reines PGM) erhielt.

L· U ί. Ο C/

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(VII) Verfahren_zur_Herstellun2_von_markiertem
TAGS-ähnlichen Material

(a) Markierung mit einem Enzym (PGM-Peroxidase:

4 mg Peroxidase aus Meerrettich (HRPO) (Ο,ΐμπιοί) wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Dazu wurden 0,2 ml von 0,1M NaJO. gegeben und nach 20-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung gegen 1 mM Essigsäure-Pufferlösung (pH 4,4) während eines Tages und einer
Nacht zur Entfernung von nichtumgesetztem NaJO. dialysiert. Zu dieser dialysierten Reaktionslösung wurden
etwa 60 μΐ einer 0,2M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung (pH 9,5) gegeben und der pH der Lösung auf 9,0 eingestellt.

Dann wurden zu dieser Lösung direkt 0,6 ml PGM (10 mg/ml), gelöst in einer 0,01M Hydrogenkarbonat-Pufferlösung
(pH 9,5) gegeben, und 2 Stunden bei Raumtemperatur vermischt und dazu wurden dann 0,1 ml einer 4 mg/ml NaBH.-Lösung in destilliertem Wasser gegeben, worauf man 2

Stunden bei 4⁰C stehen liess. Diese Lösung wurde dann gegen eine 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) während
eines Tages und einer Nacht dialysiert und unter Verwendung von Sephadex G 200 (1,5 χ 150 cm) unter Erhalt von reiner PGM-Peroxidase (PGM-POX) gereinigt. Das Geleluiermittel wurde in 5 ml-Anteilen gesammelt und die Absorption wurde bei ODJn_n und OD. __ gemessen.

1 25

(b) Markierung von Isotop ( J-PGM):

1 25

PGM wurde mit J nach dem oxidativen Jodierungsverfahren unter Verwendung von Chloramin T markiert.

1 0 μg PGM wurden in 50 μΐ einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst und dazu wurden 10 μΐ von 1 mCi Na¹²⁵J (trägerfrei, N.E.N.) und 50 μg/100 μΐ Chloramin T-Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung gegeben und nach Vermischen bei Raumtemperatur während 30 Sekunden wurden 100 μg/100 μΐ Na₂S₂O_l--Lösung in einer 0,2M Phosphat-Pufferlösung zugegeben. Anschliessend wurde

1 27

1 mg von Na J zugegeben und untergemischt. Das so erhaltene ¹²⁵J-PGM wurde über Sephadex G-50 (1 χ 30 cm)

1 25

gereinigt. Das so erhaltene J-PGM hatte eine Radioaktivität von etwa 1 bis 2 μCi/μg„

(VIII) §§stimmungsverfahren

1 25

0,1 ml von J-PGM (100 ng 0,17 \iCL entsprechend etwa

2.4 χ 10 cpm), erhalten in (VII), 0,1 ml von reinem Standard-PGM (0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml,

2.5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml), erhalten in (VI), 0,1 ml von Dolichos-Bohnen-lectin (=DBA) (10 μg/ml) und 0,2 ml einer 0,05M Phosphorsäure-Pufferlösung (0,15M NaCl; 0,1 % BSA: 0,02 %NaNO₃)wurden in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas vermischt und während 1 Stunde bei 25⁰C inkubiert. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 0,1 ml Anti-DBA-Kaninchenserum (hergestellt von

E. Y. Laboratory: 10-fache verdünnte Lösung) zu der J-

1 25
PGM, gebunden an DBA und J-PGM, nichtgebunden an DBA, gegeben und nach 1-stündigem Inkubieren bei 25⁰C wurde

die Reaktionslösung bei 4⁰C während 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die Radioaktivität eines Niederschlags

125

( J-PGM gebunden an DBA) wurde gemessen und eine Standardkurve aufgestellt (Fig. 1). Aus den dabei gefundenen Ergebnissen geht hervor, dass der Prozentsatz an Gebundenem (B/T) 20 bis 25 % betrug und dass eine 50 %-ige Inhibierung bei einer Konzentration von 0,6 μg/ml erzielt wurde. (B/T = gebunden/total)

(IX)

1 25

0,1 ml von J-PGM (100 ng 0,17 μθΐ entsprechend

etwa 2,4 χ 10⁵ cpm), erhalten in (VII), 0,1 ml von reinem Standard-PGM (0,1 μg(ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml_/ 1,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml), erhalten in (VI), 0,1 ml von Lotus-tetragenolobus-lectin (=LTL) (10 μg/ml) und 0,2 ml einer 0,05M Phosphorsäure-Pufferlösung (0,15M NaCl; 0,1 % BSA: 0,02 ⁹ONaNO₃)wurden in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas vermischt und während 1 Stunde bei 25⁰C inkubiert. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 0,1 ml Anti-LTL-Kaninchenserum (hergestellt von

125 E. Y. Laboratory: 10-fache verdünnte Lösung) zu der J-

1 25
PGM, gebunden an LTL und J-PGM, nichtgebunden an LTL/ gegeben und nach 1-stündigem Inkubieren bei 25⁰C wurde die Reaktionslösung bei 4⁰C während 30 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die Radioaktivität eines Niederschlags

1 25

( J-PGM gebunden an LTL) wurde gemessen und eine Standardkurve aufgestellt (Fig. 2). Aus den dabei gefundenen Ergebnissen geht hervor, dass der Prozentsatz an Gebundenem (B/T) 20 bis 25 % betrug und dass eine 50 %-ige Inhibierung bei einer Konzentration von 0,6 μg/ml erzielt wurde.

(χ) Herstellung_von_insolubilisiertem_TAGS₌ähnli2 chert Material__(Herstellun2_von_PGM-insolubilisierten Blättern)£

Eine überschüssige Menge von PGM wurde zu 100 ml einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gegeben und darin suspendiert. Eine 0,01N NaOH-Lösung wurde dazugegeben und der pH der Suspension auf etwa 11 eingestellt und dann wurde 20 Minuten bei 3000 Upm zentrifigiert und die überstehende Lösung gewonnen. Zu dieser überstehenden Lösung wurden tropfenweise 0,03N HCl unter Einstellung des pH-Wertes auf 7,0, zugegeben und dann wurde nochmals mit 3000 Upm während 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde gegen eine 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) unter Erhalt einer PGM-Lösung dialysiert. Der Zuckergehalt und der Proteingehalt dieser Lösung wurden bestimmt und der Hexosegehalt wurde mit 5 bis 7 mg/ml festgestellt mittels der Phenol-Schwefelsäure-Methode, unter Verwendung von Glukose als Standard,und der Proteingehalt wurde mit 1 bis 2 mg/ml unter Verwendung von BSA als Standard gemessen. Die PGM-Lösung wurde der nachfolgenden strahlungsinduzierten Polymerisation unterworfen.

Die strahlungsinduzierte Polymerisation wurde wie folgt vorgenommen: Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (als Monomeres verwendet) wurde mit der vorerwähnten PGM-Lösung in einem Mischungsverhältnis von 33:67 abgemischt und die erhaltene Mischung wurde in ein 1 cm χ 15-20 cm Glasrohr gegeben und schnell auf -70⁰C oder weniger lyophilisiert. Anschliessend wurde das Gemisch mit 1x10 Rad Gammastrahlen zum Polymerisieren des Monomers be-

strahlt. Jedes der so fixierten PGM-Materialien wurde hergestellt, indem man den polymeren Stab zu Scheiben einer Dicke von 10 um schnitt.

(XI) Herstellung_von_insolubilisiertem_TAGS-ähnli-

15 g (Trockengewicht),CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia AB) wurden in 3 1 einer 0,001N Chlorwasserstoffsäure suspendiert und nach 30-minütigem Stehen mit 1 1 einer 0,1 M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) auf einem Glasfilter gewaschen, wobei man etwa 50 ml aktivierte Sepharose erhielt. Diese wurde in 200 ml einer 0,1M Natriumhydrogenkarbonatlösung (pH 8,5) suspendiert und dazu wurden 5 ml einer 0,01M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), enthaltend 50 mg PGM, gegeben und dann liess man das Ganze 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen unter gelegentlichem Rühren.

Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionslösung auf einem Glasfilter gewaschen und das Reaktionsprodukt wurde zu 200 ml einer 1M Monoethanolaminlösung (pH 8,5) gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Dann wurde die Reaktionsgemisch auf einem Glasfilter jit 1 1 einer 0,1M Essigsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) und 1 1 einer 0,1M Borsäure-Pufferlösung (enthaltend 0,5M NaCl) abwechselnd dreimal gewaschen.

(XII) Verfahren_zur_Herstellun2 von insolubilisier-

10.000 Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 6,4 mm, hergestellt von der Precision Plastic Co., Ltd., USA, wurden mit einer verdünnten Lösung einer synthetischen Seife (Mamalemon ^ , hergestellt von Lion Co., Ltd.) in einer Konzentration von 1,5 ml/1 1 destilliertem Wasser gewaschen und anschliessend mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Anschliessend wurden sie in eine wässrige 0,5M NaOH-Lösung während 3 Tagen getaucht und gründlich gewaschen, bis der pH der Waschlösung etwa 6 betrug. Die so gewaschenen 10.000 Perlen wurden zu 2,5 1 einer 35 (W/V) %-igen PGM-Lösung in 50 mM Essigsäure-Puffer, eingestellt auf pH 4,5 mit 10N NaOH, gegeben und während 24 Stunden mit 10 Upm geschüttelt und dann filtriert und mit 8 1 destilliertem Wasser viermal gewaschen. Dann wurden die Perlen zu 2,5 1 einer Glutaraldehydlösung einer Endkonzentration von 1 V/V % in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7) gegeben und mit 10 Upm während 2 Stunden rotiert und dann filtriert und dann mit destilliertem Wasser, wie vorher angegeben, gewaschen. Die so behandelten 10.000 Perlen wurden zu 2,5 1 einer 1M Glycinlösung in 50 nM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) 2 Stunden mit 10 Upm rotiert und dann filtriert und mit destilliertem Wasser in der vorher angegebenen Weise gewaschen und dann über Nacht bei 37⁰C getrocknet, wobei man PGM-Perlen erhielt. Die Oberfläche dieser Perlen wurde nach der Orcinol-

H₂SO.~Methode (M. Schönenberger et al: Z. Physiol. Chem. 309, 145 (1957)) bestimmt und ergab 2,7 + 0,2 μg PGM/ Perle.

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OZUZO34

Beispiel 2
(I)

5 ml Blut wurden von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen und von Patienten mit nichtmalignen Krankheiten und von gesunden Personen mittels mit Häparin (500 Einheiten) behandelten Spritzen gesammelt und die Proben wurden 10 Minuten mit 2000 Upm zentrifugiert und die überstehende Lösung wurde zur Herstellung der Testproben verwendet.

(II)
15

Zu 0,1 ml jeder dieser Testproben, hergestellt gemäss (I), wurde ein gleiches Volumen von 10 μg/ml Dolichos-Bohnen-Lectin-Peroxidase in 0,2 ml 0,15M Phosphatpufferlösung und ein PGM-insolubilisiertes Blatt gegeben und die Mischung wurde gut gerührt und 24 Stunden bei 20 bis 37°C stehen gelassen. Nach gründlichem Waschen des PGM-insolubilisierten Blattes in der Reaktionslösung wurde die Aktivität der an das Blatt gebundenen Dolichos-Bohnen-Lectin-Peroxidase von OD.<,« mittels des enzymatisehen Aktivitäts-Bestimmungsverfahrens unter Verwendung von H₃O₂ als Substrat und Orthophenylendiamin als Farbagens gemessen. Es wurde eine Kalibrierungskurve erhalten, in der man die Versuchsproben durch ein Standardmaterial (PGM) mit unterschiedlichen Konzentrationen ersetzte und wie dies in Fig. 3 und 3' gezeigt wird, wo die Werte von TAGS-D als Hexose-reduziertes Niveau von PGM bzw. N-Acetylgalactosamin-reduziertes Niveau gezeigt werden.

(III)

Die Ergebnisse wurden erhalten unter Verwendung einer Standardkurve gemäss Fig. 3 und 3'. Wie aus Fig. 4 hervorgeht, zeigten alle gesunden Personen einen TAGS-D-Wert von etwa 0,1 η mol/ml.

Beispiel 3
(I)

Agarose (Produkt von Iwai Kagaku Co., Ltd.) wurde in 0,01M Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 7,5) in einer Konzentration von 1 w/w-% suspendiert. Die Suspension wurde auf 70 bis 80⁰C unter Ausbildung einer Lösung erwärmt und dazu wurden 0,01 v/v-% Thimerosal gegeben. Die Lösung wurde in 1 ml-Mengen auf Reagenzgläser verteilt und bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei man Agarosegel mit einer Konzentration von 1 w/w-% erhielt.

(II) Messung

Zwei Testproben (jeweils 200 Mikroliter) wurden in zwei Reagenzgläsern vorgelegt und dazu wurden 50 μΐ von Peroxidase-markiertem Dolichos-Bohnen-Lectin (3,5 ug/ml Lectin in 0,1M Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH von etwa 7,5) gegeben. Jede Mischung wurde schwach gerührt und dann 1 Stunde bei 20 bis 30⁰C stehen gelassen.

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Zu einer Probe (Probe A) wurden 250 μΐ einer 8 w/v-%-igen Lösung von Polyethylenglykol (Molekulargewicht 6000) in 0,1M Tris-HCl-Pufferlösung gegeben und zu der anderen Probe (Probe B) wurden 250 μΐ 0,1M Tris - HCl -Pufferlösung gegeben und beide Mischungen wurden schwach gerührt. Beide Proben wurden 30 bis 60 Minuten bei 20 bis 30⁰C stehen gelassen und auf einem Schwingrotor mit 1000 G 40 bis 60 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung (50 μΐ) wurde in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung abdekantiert und die Mischung wurde gründlich gerührt. Zu jedem Gemisch wurden 500 μΐ einer Lösung von Peroxidasesubstrat (nachfolgend als Substratflüssigkeit bezeichnet) gegeben und das Gemisch wurde in einer Dunkelkammer während 30 Minuten bei 20 bis 30°C stehen gelassen. Die Substratflüssigkeit wurde hergestellt, indem man Orthophenylendiamin und wässriges Wasserstoffperoxid zu einer 0,1M Zitratphosphat-Pufferlösung gab und auf eine Endkonzentration von 6 % bzw. 0,1 % einstellte. Die Substratflüssigkeit wird vorzugsweise bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2N Salzsäure abgebrochen. Die Farbänderung wurde durch Messung der Absorption bei 492 nm mit einem Spektrofotometer ausgewertet. Der Wert (c) den man durch Abziehen der Absorption (a) von Probe A aus der Absorption (b) von Probe B erhielt, wurde als Kurve der Menge des TAGS-gebundenen Lectins aufgetragen. Das Ergebnis wird in Fig. 5 gezeigt, in welcher die Kreise gesunde Personen bedeuten, die Zahlen (1) und (2) Patienten mit Leberkrebs und (3).Patienten mit maligner Lymphadenose bedeuten. Die Proben mit einem höheren Wert (c) als der von gesunden Personen bedeuten höhere TAGS-Niveaus im

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Plasma und legen die Vermutung nahe, dass Krebszellen in den Wirten produziert wurden.

(III)

200 μg DBA-Agarose wurden zu 100 μΐ einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend darin gelöst 1 bis 10 ug/ml PGM, gegeben und 1 Stunde unter Rühren bei 25⁰C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Reaktionslösung mit einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) wurden 6 μg DBA-markierte Peroxidase, erhalten gemäss Beispiel 1(11) und 100 μΐ einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben und dann wurde 1 Stunde unter Rühren bei 25°C inkubiert. Nach Zentrifugieren mit 300 Upm. während 10 Minuten wurde der Niederschlag gewonnen und dreimal mit 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen.

60 mg Orthophenylendiamin wurden in 20 ml 0,2M Mcllevein-Puffer (pH 5,8) gelöst und zu der gebildeten Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02 v/v-% H₀O₀ gegeben und das Gemisch wurde unter Ausbildung eines Färbungsmittels gerührt.

In einem Reagenzglas wurden 2 ml physiologische Kochsalzlösung und 500 μΐ des Färbungsmittles sowie die gewaschenen Perlen vorgelegt und anschliessend 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die enzymatische

Reaktion mit 1 ml 3N.HC1 abgestoppt. 30

- 43 -

L· U ί. O CJ

Die Absorption bei 492 nm wurde gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 6 gezeigt.

(IV)

100 μΐ einer Probe (Testprobe, erhalten gemäss Beispiel 2 (I)), wurden in einem Reagenzglas vorgelegt und dazu wurden 500 μΐ 0,3M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend darin eine Endkonzentration von 0,22 w/v-% Gelatine, 5 mmol CaCl₂ und 5 mmol MgCl₂, wurden zugegeben. Eine PGM-Perle (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt gemäss Beispiel 1(XII))und 100 μΐ Lectin-Peroxidase (das lyophilisierte markierte DBA, hergestellt gemäss Beispiel 1 (II), in einer Konzentration von 1 mg/1 des vorerwähnten Tris-HCl-Puffers) wurde zu der Probe gegeben und unter Rühren wurde die Mischung 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde abgesaugt und die Perlen wurden mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wobei das Waschwasser abgesaugt wurde. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.

In einem Reagenzglas wurden 2 ml physiologische Kochsalzlösung und 500 μΐ des Färbungsmittles sowie die gewaschenen Perlen vorgelegt und anschliessend 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die enzymatische Reaktion mit 1 ml 3N HCl abgestoppt.

- 44 -

Die optische Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 492 nra gemessen. Gleichzeitig wurde die Absorption in gleicher Weise gemessen, wobei man aber die Probe auf verschiedene Konzentrationen eines Standardmaterials (PGM) veränderte um eine Kalibrierungskurve (Fig. 7)

herzustellen. Anschliessend wurde TAGS in den Testproben, erhalten gemäss Beispiel 2(1) unter Anwendung der Kalibrierungskurve bestimmt. Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 8 gezeigt.
10

Beispiel 4
(I) Komgetitives_Verfahren

Ei-ne Scheibe (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt gemäss Beispiel 1(X)) wurde in 50 μΐ Lotustetragonolobus-lect'ingebundener Peroxidase (markiertes Lectin, hergestellt in Beispiel 1(HI)) und 200 μΐ der Probe (PGM unterschiedlicher Konzentrationen) gegeben und 20 Tage bei 25°C inkubiert. Dann wurde die Scheibe mit PBS gewaschen und in 2,0 ml einer wässrigen Kochsalzlösung getaucht und dazu wurden 0,5 ml eines Peroxidasematerials gegeben und dann wurde 1 Stunde bei 25°C inkubiert. Anschliessend wurden 1,0 ml 3N Salzsäure zugegeben und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. Gleichzeitig wurde die Absorption in gleicher Weise gemessen, wobei man aber die Probe auf unterschiedliche Konzentrationen eines Standardmaterials (PGM) veränderte, um eine Kalibrierungskurve (Fig. 9 und 9¹, worin die Werte von

TAGS als Hexose-reduziertes Niveau von PGM bzw.L-Fukosereduziertes Niveau von PGM angegeben sind) zu erhalten.

(II) §§SdwJ.ch^yer fahren

200 μg Lotus-tetragonolobus-Lectin-Agarose wurden zu 100 μΐ einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7/0), in welcher 1 bis 10 μg/ml PGM gelöst worden waren, gegeben und dann wurde 1 Stunde unter Rühren bei 25°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Reaktionslösung mit einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7/0) wurden 6 μg peroxidasemarkiertes Lotus tetragonolobus, erhalten gemäss Beispiel 1(111) und 100 μΐ einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) zugegeben und dann wurde 1 Stunde unter Rühren bei 25°C inkubiert. Nach 10-minütigem Zentrifugieren mit 3000 Upm wurde der Niederschlag gewonnen und dreimal mit einer 0_r05M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen.

60 mg Orthophenylendiamin wurden in 20 ml 0,2M Mcllevein-Puffer (pH 5,8) gelöst und zu der gebildeten Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02 v/v-% H₀O₀ gegeben und das Gemisch wurde unter Ausbildung eines Färbungsmittels gerührt.

Die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. Gleichzeitig wurde die Absorption in gleicher Weise gemessen, wobei jedoch die Probe auf verschiedene Konzentrationen eines Standardmaterials (PGM) verändert wurde, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten (Fig. 10).

(ill)

Zu 0,1 ml jeder der gemäss Beispiel 2(1) erhaötenen Testproben wurde ein gleiches Volumen von 10 μg/ml Lotustetragonolobus-Lectin-Peroxidase in 0,2 ml einer 0,15M Phosphatpufferlösung gegeben und ein PGM-insolubilisiertes Blatt wurde dazugegeben und das Gemisch wurde gerührt und 24 Stunden bei 20 bis 37°C stehen gelassen. Nach gründlichem Waschen des PGM-insolubilisierten Blattes in der Reaktionsflüssigkeit wurde die Aktivität der Lotustetragonolobus-Lectin-Peroxidase, gebunden an das Blatt, von OD₄₉₂ durch das enzymatische Aktivierungsbestimmungsverfahren unter Verwendung von H₂O₂ als Substrat und von Orthophenylendiamin als Färbemittel bestimmt. Man erhielt eine Kalibrierungskurve, indem man die Testprobene durch ein Standardmaterial (PGM) mit unterschiedlichen Konzentrationen ersetzte und die Kalibrierungskurve wird in Fig.

11 gezeigt, wo die Werte von TAGS-D als Hexose-reduzierendes PGM-Niveau angegeben werden.

Ergebnisse
■

Wie in Fig. 11 gezeigt wird, wiesen alle gesunden Personen

- 47 -

einen TAGS-D-Wert von weniger als 3 nM/ml auf.

(IV)

Zwei der Testproben (jeweils 200 Mikroliter), die gemäss Beispiel 2(I) hergestellt worden waren, wurden in zwei Reagenzgläser gegeben und dazu wurden 50 μΐ von Peroxidasemarkiertem Lotus tetragonolobus-Lectin (3,5 ug/ml Lectin in 0,1M Tris-HCl-Pufferlösung in einem pH von etwa 7,5), hergestellt gemäss Beispiel 1(111), gegeben. Diese Mischung wurde schwach gerührt und 1 Stunde bei 20 bis 30⁰C stehen gelassen. Zu einer Probe (Probe A) wurden 250 μΐ einer 8 w/v-%-igen Lösung von Polyethylenglykol (Molekulargewicht 6 000) in 0,1 M Tris- : ... HCl - Pufferlösung gegeben und zu der anderen Probe (Probe B) wurden 250 μΐ einer 0,1M Tris-HCl-Puff erlösung gegeben und dann wurde jede Mischung schwach gerührt. Beide Proben wurden 30 bis 60 Minuten bei 20 bis 30⁰C stehen gelassen und dann mit einem Schwingrotor mit 1000 G während 40 bis 60 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (50 μΐ) wurde zu 2 ml physiologischer Kochsalzlösung dekantiert und die Mischung wurde gründlich gerührt. Zu jeder Mischung wurden 500 μΐ einer Lösung von Peroxidasesubstrat (hierunter wird die Substratflüssigkeit verstanden) gegeben und das Gemisch wurde in einer Dunkelkammer 30 Minuten bei 20 bis 30⁰C stehen gelassen. Die Substratflüssigkeit wurde hergestellt durch Zugabe von Orthophenylendiamin und wässrigem Wasserstoffperoxid zu 0,1M Zitratpufferlösung bis zu einer jeweiligen Endkonzentration von 6 % bzw. 0,1 %.

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Die Substratflüssigkeit wird vorzugsweise bis zu ihrer Verwendung bei 4⁰C gelagert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2N Salzsäure abgestoppt. Die Farbänderung wurde durch Messung der Absorption bei 492 nra mit einem Spektrofotometer bewertet. Der Wert (c), den man erhält indem man die Absorption (a) der Probe A von der Absorption (b) der Probe B subtrahiert, wurde als Menge des TAGS-gebundenen Lectins aufgetragen. Die Ergebnisse werden in Fig. 12 gezeigt, in welcher die Kreise gesunde Personen, die Zahlen (1) und (2) Patienten mit Magenkrebs und (3) Patienten mit Brustkrebs bedeuten. Die Proben mit einem höheren Wert (c) als der bei gesunden Personen bedeuten höhere TAGS-Niveaus im Plasma und lassen befürchten dass sich Krebszellen im Wirt gebildet haben. ■

(V) Komge^itives_Verfahren

100 μΐ einer Probe (Testprobe, erhalten gemäss Beispiel 2(I)) wurden in ein Reagenzglas gegeben und dazu wurden 500 μΐ eines 0,3M Tris-HCl-Puffers (pH 7,4), enthaltend darin eine Endkonzentration von 0,22 w/v-% Gelatine, 5 mmol CaCl₂ und 5 mmol MgCl₂, gegeben. Eine PGM-Perle (insolubilisiertes TAGS-ähnliches Material, hergestellt gemäss Beispiel 1(XII)) und 100 μΐ Lectin-Peroxidase (lyophilisierte markierte DBA, hergestellt gemäss Beispiel 1(111), in einer Konzentration von 1 mg(l des vorerwähnten Tris-HCl-Puffers) wurden zu der Probe gegeben und nach dem Rühren der Mischung wurde diese 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde abgesaugt und die Perlen wurden mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend wurde das Waschwasser

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_ 49 -

abgesaugt. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.

60 mg Orthophenylendiamin wurden in 20 ml 0,2M Mcllevein-Puffer (pH 5,8) gelöst und zu der erhaltenen Lösung wurde ^o°2 bis zu einer Endkonzentration von 0,02 v/v-% gegeben und die Mischung wurde gerührt unter Ausbildung eines Färbemittels.

In einem Reagenzglas wurden 2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung und 500 μΐ des Färbungsmittels sowie die gewaschenen Perlen vorgelegt und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Dann wurde die enzymatische Reaktion mit 1 ml 3N HCl abgestoppt. Die optische Dichte des Reaktionsgemisches wurde bei 492 nm gemessen. Gleichzeitig wurde die Absorption in gleicher Weise gemessen, wobei jedoch die Probe auf verschiedene Konzentrationen eines Standardmaterials (PGM) eingestellt wurde, um ^ dadurch eine Kalibrierungskurve (Fig. 13) zu erhalten. Weiterhin wurde das TAGS in den Testproben, erhalten gemäss Beispiel 2(I) unter Verwendung der Kalibrierungskurve bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 14 gezeigt.

-so-

Leerseite

Claims

HOFFMANN · EITI^E & PARTNER

PATENTANWÄLTE

DR. ING.-E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPU-I NG. W. EITLE · D R. RER. NAT. K. HOFFMAN N . DIPL.-ING. W. LEH N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE - DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MON CH EN 81 . TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATH E)

36 256 o/wa

— 1 —

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

Verfahren zur Bestimmung von Tumor-assoziierten Glykoprotein enthaltenden Verbindungen_r Anwendung des Verfahrens zur Krebsdiagnose und Kit für die Anwendung des Verfahrens

PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur zur Bestimmung des Niveaus von Tumorassoziierten Glykoprotein enthaltenden Verbindungen (TAGS) in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , dass man TAGS in einer Körperflüssigkeitsprobe mit N-Acetyl-D-galactosamin (AG)-bindendem:Lectin oder L-Fukose-bindendem Lectin unter Ausbildung eines TAGS-Lectinkomplexes umsetzt und die Menge des gebildeten TAGS-Lectinkomplexes oder annicht-umgesetztem Lectin misst. ·
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung zwischen TAGS

und dem Lectin kompetitiv durchgeführt wird/ indem man das zu messende Körperflüssigkeits-TAGS und eine bestimmte Menge an insolubilisiertem TAGS oder insolubilisiertem TAGS-ähnlichen Material mit einer definierten Menge von markiertem Lectin umsetzt, das insolubilisierte TAGS oder insolubilisierte TAGS-ähnliche Material, das an das markierte Lectin gebunden ist, und ungebundenes Lectin voneinander trennt und in einem davon die Aktivität des Markierungsmittels misst.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung zwischen TAGS und dem Lectin durch kompetitive Reaktion zwischen dem zu bestimmenden Körperflüssigkeits-TAGS und einer bestimmten Menge von markiertem TAGS oder markiertem TAGS-ähnlichen Material mit einer definierten Menge Lectin oder insolubilisiertem Lectin durchgeführt wird, dass man das markierte TAGS oder markierte TAGS-ähnliche Material, gebunden an das Lectin oder das insolubilisierte Lectin, und ungebundenes markiertes TAGS oder markiertes TAGS-ähnliches Material voneinander trennt und die Aktivität des Markierungsmittels in einem davon misst.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Umsetzung zwischen TAGS und dem Lectin durchgeführt wird, indem man das zu messende Körperflüssigkeits-TAGS mit insolubilisiertem Lectin unter Bildung eines TAGS-insolubilisierten Lectinkomplexes umsetzt, dass man diesen Komplex mit einer bestimmten Menge eines markierten

Lectins umsetzt, dass man den an das markierte Lectin gebundenen Komplex und ungebundenes markiertes Lectin voneinander trennt und die·Aktivität des Markierungsmittels in einem davon misst. 5
5. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , dass man TAGS von der Körperflüssigkeitsprobe abtrennt und das abgetrennte TAGS mit dem Lectin umsetzt.
6. Verfahren gemäss Ansprüchen 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Lectin ein mit einem Enzym, einer fluoreszierenden Substanz oder einer radioaktiven Substanz markiertes Lectin ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zu der Körperflüssigkeit ein Schutzprotein zugibt.
8. Verfahren gemäss Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , dass die Körperflüssigkeit Blut, Gewebeflüssigkeit, Lymphe, Hydrothorax, Ascites, amniotische Flüssigkeit, Magensaft, Urin, Pankreassaft, cerebrospinale Flüssigkeit oder Speichel ist.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeit Blut- serum oder Blutplasma ist.

-A-
10. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym Glukoamylase, Glykoseoxidase, Peroxidase, Alkaliphosphatase oder Hämoctapeptid oder ein aktives Fragment davon ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Substanz Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat,'Rhodamin oder Dansylchlorid ist.
12. Verfahren gemäss Anspruch 6, .dadurch gekennzeichnet , dass die radioaktive Substanz radioaktives Jod oder Tritium ist.
13. Verfahren zur Krebsdiagnose, dadurch gekennzeichnet , dass man das Niveau von Tumorassoziierten Glykoprotein enthaltenden Verbindungen in einer Körperflüssigkeit eines Patienten nach einem der in den Ansprüchen 1, 2, 3 und 4 beschriebenen Verfahren bestimmt und den so gemessenen Wert mit dem einer gesunden Person vergleicht.
14. Kit zur Bestimmung des TAGS-Niveaus in einer Körperflüssigkeit, gekennzeichnet , durch ein AG-bindendes Lectin oder L-Fukose-bindendes Lectin als spezifisches Agglutinierungsmittel für TAGS..
15. Kit gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeich net, dass das Lectin lyophilisiert ist und der Kit zusätzlich ein Rekonstituierungsmittel, enthaltend ein wässriges oder ein wassermischbares Lösungsmittel, enthält.