DE2806146A1

DE2806146A1 - Tumor-spezifische gylkoproteine und methode zum nachweis von tumorigenen krebsarten

Info

Publication number: DE2806146A1
Application number: DE19782806146
Authority: DE
Inventors: Sally Delong Bolmer; Eugene A Davidson
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1977-02-18
Filing date: 1978-02-14
Publication date: 1978-08-24
Also published as: CH648330A5; FR2381058A1; JPS6218869B2; DE2806146C2; JPS60155975A; JPS6129464B2; CA1087979A; IT1102384B; US4146603A; GB1591561A; CH658317A5; IT7848072A0; FR2381058B1; JPS53127822A

Description

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Research Corporation New York, N.Y. / USA

Tumor-spezifische Glykoproteine und Methode zum Nachweis von tumorigenen Krebsarten

Die vorliegende Erfindung betrifft Tumor-spezifische Glykoproteine, die aus den Blutseren von menschlichen Patienten isoliert werden können,und eine Methode zum Nachweis von tumorigenen Krebsarten.

Untersuchungen in einer Reihe von Laboratorien, einschließlich denen der Anmelderin, haben gezeigt, daß Tierzellen in Gewebekulturen unter Bedingungen gezüchtet werden können, die es ihnen ermöglichen, charakteristische Eigenschaften, die

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typisch für das Gewebe sind, aus dem sie stammen, beizubehalten. In anderen Worten bedeutet dies, daß z.B. Knorpelzellen in Gewebekulturen gezüchtet werden können und dabei typische Produkte der Knorpelmatrix produzieren, Hypophysenzellen würden Hypophysenhormone erzeugen etc. Zu den Produkten, denen im Labor der Anmelderin besonderes Interesse gewidmet wurde, zählen eine Gruppe von komplexen Sacchariden, die normalerweise als Sekretionsprodukte der Zellen angesehen werden, indem sie in der extra-zellulären Matrix, in der sich faserartige und zelluläre Elemente befinden, aufgefunden werden. Diese Verbindungsklasse hat etwa 6 Vertreter mit gewissen gemeinsamen Merkmalen, insbesondere hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und einer hohen negativen Ladung. Die zuletzt genannte Eigenschaft dient häufig dazu, diese spezielle Gruppe zu isolieren und zu identifizieren.

Es wurde dann eine Untersuchung durchgeführt, wobei ein direkter Vergleich zwischen einer normalen Zeil-Linie und der gleichen Zeil-Linie nach Infektion mit einem viralen Agens, das die Zelle tumor igen machte ,gezogen *gerden konnte. über diese Arbeit wurde in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Band 70, No.1, Seiten 53-56, Januar 1973, berichtet.

Es wurde festgestellt, daß kein qualitativer Unterschied zwischen den Saccharidprodukten bestand, wohl aber ein quantitativer Unterschied durch die Virustransformation einsetzte, und zwar insbesondere was die Synthese eines der charakteristischen Saccharide betraf. Diese quantitative Veränderung ist bei Untersuchungen in Zellkultursystemen nützlich, könnte jedoch niemals bei Tierversuchen angewandt werden, da das spezielle Produkt normalerweise in den meisten Geweben des Körpers gefunden wird, nicht-antigen ist und unter keinen Umständen als charakteristisch für eine Tumorzelle angesehen werden kann. Nichtsdestoweniger waren qualitative Unterschiede von Interesse, die jedoch ganz allgemeiner Art waren.

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Es konnte die Folgerung gezogen werden, daß die Umwandlung einer Zeil-Linie durch Virustransformation zumindest eine Veränderung bei der Synthese der komplexen Saccharide mit sich brachte.

Wie in Biochemistry (1974) Band 13, S. 1233, berichtet, wurde im Labor der Anmelderin eine ähnliche Versuchsserie mit B16 Melanoma-Zellen von Mäusen und einer Kontroll-Population von normalen Melanocyten, die aus der Iris von Mäusen erhalten wurden, durchgeführt. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Melanom-Zellen und der Kontrollzüchtung waren etwas stärker ausgeprägt, als bei den Versuchen mit den oben beschriebenen normalen und Virus- transformierten Paaren. Diese Unterschied können kurz wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Beim Vergleich der Tumorζeilen mit den normalen Zellen lag sowohl ein qualitativer als auch ein quantitativer Unterschied in der Produktion von komplexen Sacchariden vor.

2. Insbesondere wurde ein wesentliches Produkt der normalen Zeilen, Hyaluronsäure, von der tumorigenen Linie überhaupt nicht erzeugt.

3. Von der Tumorlinie wurde ein sulfatiertes Polysaccharid mit ungewöhnlich hohem Molekulargewicht produziert, welches bei den normalen Zellen nicht auftrat.

Bezüglich des sulfatierten Polysaccharides ist es wesentlich darauf hinzuweisen, daß sich diese Verbindung von den normalen Komponenten des Gewebes einzig in ihrer Molekulargröße und nicht in ihrer molekularen Architektur unterscheidet. Das heißt.

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die Struktur des Saccharides war mit den Strukturen identisch, die normalerweise in Geweben gefunden werden, lediglich ihr Molekulargewicht war etwas höher. Es wird nochmals daraufhin gewiesen, daß diese Versuche geeignet sind für Studien bei Zellkulturbedingungen; als eine diagnostische Methode sind sie jedoch weitgehend unbrauchbar, da die in Frage kommende Verbindung durch eine Vielzahl von Zellen in den Wirtstieren schnell metabolisiert wird.. , Sobald eine solche Verbindung im Kreislauf aufträte, würde sie schnell wieder herausgefiltert und von Leberzellen, Zellen der Niere, Fibroblasten etc. abgebaut. Aus diesem Grunde bietet die Anwesenheit oder die Produktion dieses Saccharides durch die Tumorzellen keine Anwendungsmöglichkeit, und zwar sowohl aus den obengenannten Gründen als auch aufgrund der Tatsache, daß die Verbindung selbst nicht-antigen ist.

In einer Veröffentlichung in Cancer Research, 36, 424 - 431, Februar 1976, (E.A. Davidson) wurde über die Ergebnisse einer Untersuchung des komplexen Saccharides menschlicher Zellen berichtet, die in vieler Hinsicht ähnlich den bei Mäusen erhaltenen Ergebnissen sind. Die menschlichen Melanomzellen produzieren weniger Hyaluronsäure als die Kontrollmelanocyten und ein hochmolekulares sulfatiertes Polysaccharid, ähnlich dem wie es in den Mauszellen produziert wird.

Weitere Untersuchungen mit Mäusen brachten die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins zutage. Aus diesem Grunde war man bemüht, die Art des Glykoproteins in Mäusen näher kennenzulernen und zwar insoweit als dessen Eigenschaften, strukturelle Chemie und biologische Funktion bestimmt werden konnten. Viele der chemischen Eigenschaften des Moleküls werden in der Veröffentlichung von E.A. Davidson in "Biochemical and Biophysical Research Communications", Bd. 70, No. 1, Mai 1976 beschrieben. Die Anwesenheit eines ungewöhnlichen Glykoproteins .in menschlichen Melanomzellen oder dessen Produktion durch dieselben wird in dieser Veröffentlichung nicht angesprochen.

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Die vorliegende Erfindung betrifft das Auffinden, die Isolierung und Identifizierung eines Glycoproteins oder einer Klasse von Glykoproteinen, die von menschlichen Krebszellen produziert werden, und die Erkenntnis, daß diese Art eines Glykoproteins von Normalzellen nicht produziert wird. Außerdem wurde gefunden, daß dieser einzigartige Typ eines Glykoproteins in den Seren von Krebspatienten vorliegt und daß aufgrund dessen dieses Phänomen in der Diagnose und der Behandlung von Krebs nützlich sein würde.

Es wurde eine neue Art bzw. Klasse von Glykoproteinen gefunden, die von bösartigen Tumorzellen produziert wird, während sie von gesunden oder normalen Zellen nicht produziert wird. Diese einmalige Art oder Klasse eines Tumor-spezifischen Glykoproteins (im folgenden manchmal als "TSGP" bezeichnet) ist im Tumor anwesend, wird von den Tumorzellen produziert, abgesondert und erscheint im Kreislauf des Wirts, bei Tieren sowie bei Menschen, und zwar etwa zu der Zeit, als eine fühlbare Tumormasse nachgewiesen werden kann. Das TSGP kann auch in einem beliebigen früheren Stadium auftreten.

Das TSGP wird von den Tumorzellen gebildet, ohne Rücksicht um welchen Tumor es sich dabei handelt, und erscheint im Kreislaufsystem von Menschen, die an Lungen-, Brust-, Dickdarm-,Uterus- und Magenkarzinomen, Melanomen und ähnlichen leiden. Leukämien und andere Blutkrankheiten stellen einen Defekt in der Reifekontrolle dar, wodurch eine abnorme Zahl von Zellen auftritt, wie man sie normalerweise in den metabolen Bildungsschritten findet. Aus diesem Grunde wird bei vielen oder den meisten dieser Blutkrankheiten kein TSGP produziert, da die Zellen selbst nicht tumorigen sind. Außerdem ist es gut möglich, Leukämien durch iuiskroskopische Untersuchung einer Blutprobe nachzuweisen, so daß Leukämien vom diagnostischen Standpunkt kein Problem darstellen.

Das spezifische Glykoprotein, das von einem Wirtstier mit einer bösartigen Tumorerkrankung produziert wird, kann sich je nach

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Charakter und Art des Tumors sowie auch hinsichtlich des betroffenen Wirts unterscheiden, jedoch ungeachtet, um welchen Tumortyp es sich handelt, wird ein Produkt der Art und Klasse von Tumor-Glykoproteinen (TSGP), die gemäß der Erfindung aufgefunden, isoliert und charakterisiert wurden, angehören.

Es wird daraufhin gewiesen, daß die Wachstumscharakteristiken und andere Eigenschaften von Tumoren mit unterschiedlichem zellulären Ursprung (und von verschiedenen Personen } nicht gleich sein werden. Jedoch scheint es, daß der hier beschriebene Glykoprotein-Typ charakteristischerweise von einer großen Anzahl von Tumoren produziert wird. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von TSGP eines beliebigen Tumortyps sind einander genügend ähnlich, um durchwegs die Anwendung von Standard-Isolationsmethoden zu erlauben.

Die im nachfolgenden beschriebenen Merkmale hinsichtlich der Eigenschaften, chemischen Struktur und biologischen Funktion sind für TSGP charakteristisch und dienen dazu, es von den normalerweise im Serum gefundenen Gljkoproteinen zu unterscheiden:

Ca) Löslichkeit in Perchlorsäure (0,6M) bei O⁰C oder in Trichloressigsäure (5%) bei O⁰C.

(b) Sialinsäure- oder N-Acetylneuraminsäure- (im folgenden manchmal als "NANA" bezeichnet) Gehalt mit 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Glucosamin, Galactosamin und Sialsäure(bzw. Sialinsäure genannt).

(c) Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) und Eluierung mit Pyridinacetatpuffer, pH 5,2, bei einer Konzentration von ungefähr 0,4M.

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(d) Einschluß an Sephadex G-I50 (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) in O,1M Pyridinacetat, pH 5,2. Eluierung bei 1,5 χ .dem Ausschlußvolumen, kalibriert mit Dextranblau.

(e) Affinität für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert an einen Sepharoseträger, wie z.B. eine Weizenkeim-Sepharose-Säule in 0,05 M Natrium- oder Kaliumchlorid. Es können andere künstliche Träger für das Weizenkeim-Lektin verwendet werden. Eluierung von der Säule erfolgt spezifisch mit N-Acetylglucosamin (0,1 M in Wasser ist optimal). Andere Lektine, die für TSGP eine Affinität besitzen, jedoch nicht derart spezifisch sind, umfassen limulus-polyphemus-(Krebs) Lektin und nach Entfernung von Sialsäureresten Ricinus-Communis-II-Lektin.

(f)" Diese Affinität für das Weizenkeim-Agglutinin wird bei Behandlung mit Sialidase (gereinigt durch Affinitätschromatographie, um es von Protease freizumachen) von einer der verschiedenen Quellen verloren. Ein wesentliches Kriterium bei dieser Analyse ist es, daß es nicht notwendig ist, die Sialsäure vom TSGP vollständig zu entfernen, um die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin zu zerstören.

(g) Die Sialsäure in TSGP ist an Galactose gebunden und kann auch an N-Acetylgalactosamin gebunden sein.

(h) Elektrophorese von TSGP in 6 % Polyacrylamid-GeI in Gegenwart von Natriumdodeclysulfat (0,1 %) und Anfärben des Gels auf Protein und Kohlen-

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hydrat zeigt, daß TSGP ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000 , wahrscheinlich etwa 60 000 besitzt. Diese Zahl ist nicht genau anzugeben, da Glykoproteine in allgemeinen nach dieser Methode anomale Molekulargewichtswerte ergeben. Das Glykoprotein tritt jedoch in ein 6 %-iges vernetztes Gel ein und wandert in demselben. Nach Einwirkung von Pronase (pronase digestion) redu-" ziert sich das Molekulargewicht auf etwa 10 000 bis 15 000. Dies stellt einen Protease-resistenten Kern dar und läßt die Annahme zu, daß die Sialsäure-.reste und die Saccharidsubstituenten auf dem PoIypeptidkern (backbone) angeordnet sind, bzw. sich um diesen herum zusammenballen.

"(i) Durch isoelektrische Fokussierung in Gelen oder in Lösung wird TSGP deutlich von irgendwelchen kontaminierenden Serumkomponenten (wiecC-1-saures Glykoprotein) abgetrennt. TSGP hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und kann aufgrund gering-'fügiger Unterschiede im Sialsäuregehalt mehrere eng beisammenliegende Bande aufzeigen.

(j) TSGP enthält ebenfalls eine neutrale Hexose, hauptsächlich Galactose; es ist keine Glucose anwesend. Nachweis ist möglich durch Analyse auf neutrale Zucker (z.B. mittels der Methode von Dubois et al, Anal. Chem., 2!i8, 350 (1966) )

(k) TSGP kann als ein Produkt menschlicher Tumorzellen in vitro in monoschichtiger Kultur nachgewiesen werden.

(1) Der Hauptanteil an Kohlenhydrat von TSGP, der die Hauptmenge an Sialsäure enthält, ist mit der PoIypeptitkomponente über eine O-glykosidische Bindung verknüpft und zwar von einem einzelnen N-Acetylgalactosaminyl-Rest zur Hydroxylgruppe von Serin oder

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Threonin (als Partialsequenz kann angesehen werden: Galactosyl-N-Acetylgalactosamin, jeweils in den 3- und 6-Stellungen mit Sialsäur.eresten substituiert) .

(m) Die gesamte Saccharid-Kette kann von dem Polypeptid durch Behandeln mit 0,01 N Natriumhydroxid, 16 Stunden bei 2O°C, abgespalten werden. Die sich ergebende Saccharid-Kette kann auf einer G25-Sephadex-Säule (1,2 χ 60 cm) abgetrennt werden und wird bei 1,15 χ dem Ausschlußvolumen (kalibriert mit Dextranblau) eluiert.

(n) Die Aminosäurezusammensetzung der TSGP-Fraktion nach Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-25 ergibt Glutaminsäure, Prolin, Asparaginsäure, Threonin und Leucin als hauptsächliche Aminosäuren. · ■

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die charakteristischen Unterscheidungsmerkmale Tumor-spezifischer Glykoproteine, die aus den Blutseren von Krebs-infizierten Menschen isoliert werden können, folgende sind: Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure, hoher Sialsäure-Gehalt der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, d.h. über etwa 0,065 mg Sialsäure pro ml Ausgangsserumprobe und vorzugsweise über etwa 0,80 mg/ml, ein Pronase-resistenter Kern, der die Hauptmasse an Kohlenhydrat enthält, Affinität, für Weizenkeim-Agglutinin, in Abhängigkeit von der Sialsäure, besondere elektrophoretische und chromatographische Mobilität, ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 50 000 bis 70 000 und ein isoelektrischer Punkt von etwa 4,2 bis 4,6. Besonders charakteristische Eigenschaften des Tumor-spezifsehen Glykoproteins, die sich für diagnostische Zwecke eignen, um letzteres von anderen Glykoproteinen in den Seren normaler

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Patienten zu unterscheiden, bestehen darin, daß TSGP einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und die Perchlorsäure-lösliche Fraktion einen Sialsäuregehalt von über etwa 0,065 mg/ml der ursprünglichen Serumprobe hat.

Eine Anzahl der verwendeten Produkte ist im Handel erhältlich. ¹¹ Sephadex "-Produkte werden von Pharmacia Fine Chemicals A.B., Uppsala, Schweden hergestellt und vertrieben. Es handelt sich um vernetzte Dextrane mit unterschiedlicher Porosität oder Subsfcituenten."Sepharose" ist ein in kugelförmigen Partikeln geformtes Agarose-Gel. "DEAE-Sephadex A25 oder A50" wird aus Sephadex G25 oder G50 durch chemische Substituierung von Diäthylaminoäthyl-Gruppen hergestellt. Letztere sind schwach basische Anionenaustauscher. Sie haben einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron und quellen zu einem Säulenvolumen von 89 (15-35) ml pro Gramm Trockengel. Sephadex G150 hat einen Kugeldurchmesser von 40 bis 120 Mikron, einen Fraktionierungsbereich von 5 bis 150 000 Molekulargewicht und ein Säulenvolumen (bed volume) von 20 bis 30 ml pro Gramm Trockengel. Sepharose 4B weist eine Agarose-Konzentration von 4 % und einen Naßkugeldurchmesser von 40 bis 190 Mikron auf.

Es wird daraufhin gewiesen, daß TSGP von carcino-embryonischem Antigen, wie in US-PS 3 663 684 beschrieben, u.a. unterschieden werden kann durch Einschluß von TSGP auf Sephadex G150 (wie oben unter (d) beschrieben), die Affinität von TSGP für ein konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin, immobilisiert auf einem Sepharose-Träger (wie oben unter (e) beschrieben), sowie durch das Molekulargewicht (wie oben unter (h) beschrieben). Carcinoembryonisches Antigen weist keine dieser Eigenschaften auf.

Die Feststellung, daß diese einzigartige Art bzw. Klasse von Glykoproteinen in Tumoren anwesend ist, von Tumorzellen produziert und abgesondert wird, und im Kreislauf des Wirts, einschließlich eines menschlichen Wirts erscheint, sowie die

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Identifizierung und Charakterisierung von TSGP erlaubt folgende Anwendungsmöglichkeiten:

I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Tumorerkrankung.

II. Nachweis oder Analyse des in seiner Art einzigartigen TSGP in einer menschlichen Blutprobe mittels radioimmunologischer oder anderer Nachv;eismethoden als ein Mittel für die Diagnose und Behandlung von Krebs.

III. Individualisierte Therapie durch Isolierung von TSGP von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs in größeren Mengen durch Plasmapherese oder eine andere Methode, Verwendung dieses Materials zur direkten Antikörperherstellung in einem Wirtstier oder dem Patienten und Verwendung dieses Antikörpers zur direkten Immunotherapie. Eine Kopplung dieses Antikörpers mit Agenzien, die auf die Krebszellen toxisch wirken, würde eine gezielte Einführung von lethalen Agenzien in Krebszellen ermöglichen .

IV. Verwendung des von einem Krebspatienten isolierten TSGP zur Herstellung von Antikörper die die Oberfläche der Tumorzelle angreifen können, wodurch eine von Antikörper vermittelte Lyse durch das normale Immunsystem des Wirts möglich ist, bzw. Änderungen auf der Oberfläche der Tumorzellen hervorgerufen werden, wodurch übliche therapeutische Agenzien wirksamer angreifen könnten.

V. Bestimmung des Glykoproteinspiegels im Serum eines Patienten und Auswertung dieser Information als direkter Index für eine therapeutische Behandlung.

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I. Frühdiagnose von Personen mit irgendeiner Art von bösartiger Erkrankung:

Es wurde ^festgestellt, daß die Anwesenheit von TSGP in menschlichen Seren eine direkte Indikation für das Vorliegen eines bösartigen Tumors (nicht eingeschlossen sind Bluterkrankungen) des untersuchten Patienten sein kann. Es wurde eine einfache, jedoch genaue Methode zum Nachweis der An- oder Abwesenheit von TSGP in menschlichen Seren entwickelt. Auf diese Weise entstand eine allgemein anwendbare diagnostische Nachweismethode, die weder angreifend noch zerstörend wirkt, und die als Teil einer routinemäßig durchgeführten ärztlichen Untersuchung von Patienten in der risikoreichen Altersgruppe, d.h. Frauen über 40, Männer in bestimmten Berufen etc., angewandt werden kann. Ausgehend von einer einzigen Blutprobe kann die Methode als Teil einer Routineuntersuchung für Personen aller Altersgruppen angewandt werden.

Der ursprüngliche analytische- Nachweis für TSGP basiert auf den folgenden Eigenschaften desselben:

1. Das Glykoprotein hat eine sehr hohe negative Ladung.

2. Die negative Ladung ist in der Hauptsache, wenn nicht ausschließlich, auf die Anwesenheit von N-Acetylneuraminsäure zurückzuführen.

3. Die N-Acetylneuraminsäure war auf den Saccharid-Ketten angeordnet, die die Tendenz zeigen, sich zusammenzuballen und eine Kernstruktur auszubilden, die gegenüber Proteolyse resistent ist.

4. Das stark saure Gebilde war in einer geeigneten Konzentration von Perchlorsäure oder Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel löslich.

5. Das Glykoprotein weist eine Affinität für Weizenkeim-Agglutinin, welches an Sepharose immobilisiert ist, auf.

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6. Das Glykoprotein kann aufgrund seiner hohen negativen Ladung an einer Vielzahl von anionischen Austauschern fraktioniert werden, einschließlich Diäthylaminoäthyl-Cellulose, Diäthylaminoäthyl-Sephadex, Ecteola-Cellulose, und starken und schwachen Anionenaustauschharzen, wie Dowex 1 oder Dowex 2.

7. Der hohe Kohlenhydratgehalt des Glykoproteins und seine Ladung erlauben eine Identifizierung durch Polyacrylamid- oder andere Gel-Elektrophorese-Methoden, sowie Anfärben entweder durch übliche Proteinfarbstoffe oder durch Farbstoffe für die Kohlenhydratkomponente unter Verwendung von Perjodsäure-Schiff-Reagens oder andere Reagenzien.

Kurz zusammengefaßt basiert die diagnostische Nachweismethode auf den generalisierten und allgemeinen Strukturmerkmalen des Glykoproteins, d.h. den hohen Sialsäuregehalt, den Pronasebeständigen Kern, die Affinität für Weizen-Agglutinin und die charakteristische elektrophoretische und chromatographische Mobilität.

Die -allgemein anwendbare Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von TSGP im menschlichen Blutserum umfaßt die Beschaffung einer Serumprobe von einem menschlichen Patienten, Behandeln der Serumprobe mit einem TSGP-Lösungsmittel, wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, Entfernung des gebildeten Niederschlages durch eine geeignete Methode zur Fest-Flüssig-Trennung, wie Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation; Neutralisierung der löslichen Fraktion mit einem alkalischen Material, wie Kaliumhydroxid, Analysieren des löslichen Anteiles auf den Gehalt an N-Acetylneuraminsäure und Protein, und Vergleich der gefundenen Werte für N-Acetylneuraminsäure und Protein mit Grundlinien-Parametern, aufgestellt für Normal- und Krebsseren.

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Die Analyse auf NANA kann durch eine der üblichen bekannten Methoden erfolgen, einschließlich der Perjodat-Resorcinol-, Thiobarbitursäure oder der direkten Ehrlich Methode.(G.W. Jourdian et al, J.Biol.Chem.,246,431 (1971); L. Warren, J^ Biol.Chem., 234, 1971 (1959); und I. Werner et al, Acta Med.Soc. Uppsala, 57, 230 (1952).

Die Protexnbestiinmungen können z.B. durch ein modifiziertes Coomasie-Blau-G-Verfahren oder durch die Methode nach Lowry oder durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm erfolgen (O.H. Lowry et al, J.Biol. Chem.., 193 , 265 (1951) und M.M.Bradford, Anal.Biochem., 72, 248 (1976) ).

Auf der Grundlage der zusammengestellten Daten von 370 menschlichen Serumproben wurden die folgenden Parameter zur Feststellung des Vorliegens von bösartigen Tumoren bei Menschen festgelegt (basierend auf der Analyse der Perchlorsäure-löslichen Fraktion, bezogen auf das Volumen der ursprünglichen Serumprobe):

(1) Ein Sialsäuregehalt (NANA) von über etwa 0,065 mg/ml weist auf die Möglichkeit eines Tumors hin; ein Sialsäuregehalt von über etwa 0,080 mg/ml indiziert einen wahrscheinlichen Tumor.

(2) Ein Proteingehalt von über etwa 0,35 mg/ml weist auf einen möglichen Tumor, ein Proteingehalt von über etwa 0,4 mg/ ml auf das wahrscheinliche Vorliegen eines Tumors hin.

Es wurde eine Ausgangsuntersuchung mit 59 Proben durchgeführt, wobei die Perjodat-Resorcinol-Methode und die direkte Ehrlich-Methode für N-Acetylneuraminsäure-Spiegel und das Lowry-Verfahren für Protein-Spiegel angewandt wurden. Es wurde festgestellt, daß zwischen 30 Krebspatienten und 29 Normalkpntrollen eine vollständige Unterscheidung im Gehalt der Sialsäure bestand. Das heißt, der

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höchste Normalspiegel war immer noch niedriger als der niedrigste Spiegel, der bei einem Patienten mit diagnostizierter bösartiger Erkrankung festgestellt wurde. Diese Ausgangsuntersuchung schloß eine Anzahl von Erkrankungen verschiedener Art, Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Lymphom- und Melanom-Patienten ein, davon ausgehend, daß die Produktion eines Perchlorsäurelöslichen Glykoproteins eine allgemeine Eigenschaft einer Anzahl von Tumoren darstellt. Die statistische Analyse dieser Werte zeigte, daß die Zufallswahrscheinlichkeit dieser Ergebnisse geringer als 1 in 1000 ist.

unter Auswertung der in der vorangehend beschriebenen Untersuchung erhaltenen Spiegel als parametrische Kriterien, wurde eine viel größere Untersuchung mit etwa 311 Patienten durchgeführt, die sowohl an bösartigen Erkrankungen und einer Reihe von nicht-malignen Beschwerden litten sowie einer Anzahl von normalen Kontrollpersonen. Lediglich basierend auf die Gehalte an Protein und Sialsäure (N-Acetyl-neuraminsäure) wurde eine über 95 %-ige Unterscheidung zwischen Normalpersonen und nichtbösartig erkrankten Personen einerseits und Patienten mit Tumor andererseits erhalten. Außerdem bestand kein signifikanter Unterschied zwischen normal- und nicht-bösartig erkrankten Personen oder zwischen Männern und Frauen. Es wurde eine Reihe anderer statistischer Tests durchgeführt, wobei die Daten von dieser Gruppe stammen. Es sei hier nur angeführt, daß die Zufallswahrscheinlichkeit zur Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe und der anderen Gruppe geringer ist als 1 in 1000. Es besteht auch eine deutliche Korrelation mit dem Fortschritt der Erkrankung. So haben Personen mit ausgestreuter (disseminated), verbreiteter metastatischer Erkrankung höhere Spiegel an zirkulierendem TSGP als solche mit lokalisierter Erkrankung; Personen, die sich in Remission befinden, bzw. Personen nach einer chirurgischen und/oder chemotherapeutischen oder Strahlungsbehandlung tendieren dazu, niedrigere Spiegel an zirkulierendem Glykoprotein zu haben.

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Diese Ergebnisse führten zu einer Reihe von weiteren Untersuchungen. Zuerst wurde das Augenmerk auf die wenigen falschen positiven Bestimmungen, die sich in dieser Gruppe zeigten, gerichtet. Es zeigte sich,daß mehrere derselben von asthmatischen Patienten herrührten und können, in der Tat auf einen Faktor, der mit dieser Krankheit assoziiert ist, bezogen werden.

Dementsprechend wurde eine weitere Untersuchung mit .den falschen Positiven, mit Normalproben und verschiedenen Patienten mit diagnostiziertem Krebs durchgeführt, um festzustellen, ob die gefundenen qualitativen Unterschiede im Zellkultursystem auch in der Serumprobe wiederholt werden konnten. Statt nur einfach die Spiegel an N-Acetyl-neuraminsäure in der Perchlorsäurelöslichen Fraktion zu berücksichtigen, wurde das Perchlorsäurelösliche Material einer Gel-Elektrophorese unterzogen (wie insbes. im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben) zum Nachweis des charakteristischen Tumor-Glykoproteins (TSGP). Das Tumorspezifische Glykoprotein hat einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6 und ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 70 000, allgemein etwa 60 000.

Nach Durchführung dieser zweiten Untersuchung reduzierte sich die Anzahl an falschen Positiven auf Null; lediglich Patienten mit diagnostiziertem Tumor zeigten eine charakteristische Glykoprotein-Bande auf der Gel-Elektrophorese. Obwohl einige wenige der Personen mit Erkrankungen (insbes. Leukämien) N-Acetylneuraminsäure-Spiegel aufwiesen, die nicht in die anormalen Gruppe fielen, traten keine Normalen oder nicht-bösartig erkrankten Normalen in der positiven Gruppe nach der zweiten Untersuchung auf. Darüber hinaus konnte die Anwesenheit des charakteristischen Glykoproteins bei solchen Personen mit bösartiger Erkrankung gezeigt werden," die niedrigere Spiegel an N-Acetylneuraminsäure aufwiesen.

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Zusammengefaßt zeigt die entwickelte Nachweismethode folgendes :

1. Es besteht ein ungewöhnlich hoher wahrscheinlichkeitsgrad in der Voraussage des Vorliegens eines Tumors sowie des Erkrankungsstadiums, basierend lediglich auf der Messung der N-Acetyl-neuraminsäure-.und Protein-Spiegel in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion des Serums.

2. "Die sehr kleine Anzahl von falschen Positiven kann vollständig durch eine zweite Untersuchung, die eine Gel-Elektrophorese und Untersuchung der Gele auf das Vorliegen des charakteristischen Tumor-spezifischen Glykoproteins umfaßt, eliminiert werden.

3. Der Voraussagewert dieser Methode ist mindestens ebenso gut oder besser als irgendeine der gegenwärtigen oder früher beschriebenen Methoden, einschließlich dem carcinoembryonischen Antigen, wie es in der US-PS 3 683 684 beschrieben wird.

4. Obwohl TSGP nicht für sämtliche Tumore oder in der Tat sogar z.B. für sämtliche Lungencarcinome identisch sein mag, besitzt es doch eine ausreichende Identität aufgrund struktureller Charakteristiken, um eine verallgemeinerte diagnostische Nachweismethode zu erlauben .. Wichtig ist die Feststellung, daß zwei verschiedene Personen mit der gleichen anatomischen Diagnose dennoch Tumore mit unterschiedlichen Charakteristiken in Bezug auf : Metastasegeschwindigkeit, Wachstumsgeschwindigkeit sowie charakteristischer Produkte aufweisen können. Es besteht die Möglichkeit, daß jeder Tumor eine unterschiedliche biologische Einheit und eine unterschiedliche Krankheit

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darstellt, und daß keine zwei identisch sind, wenn man
charakteristische Zellprodukte in Betracht zieht.· Aus
diesem Grunde besteht eine dringende Notwendigkeit für
eine verallgemeinerte Identifikationsmethode und eine allgemein anwendbare therapeutische Strategie, bevor ein vernünftiger Fortschritt in Bezug auf Früherkennung oder therapeutische Behandlung mit weitem Anwendungsbereich erwartet werden kann.

Die Tatsache, daß ein Tumor-spezifisches Glykoprotein in
menschlichen Seren anwesend ist, welches ein Produkt des
Tumorwachstums darstellt- , stellt ein allgemeines diagnostisches Mittel dar.

Die folgenden Beispiele beschreiben praktische Ausführungsformen gemäß der Erfindung, wie sie auch im vorangehenden beschrieben sind. Diese Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, jedoch keine Einschränkung derselben darstellen.

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BEISPIEL 1

Reinigung und Isolierung des Tumor-spezifischen Glyokoproteins

Serumproben von Patienten mit diagnostizierten festen Tumoren (Lungen-, Magen- und Brustkarzinom und Melanom wurden verwendet, die jeweils eine ähnliche chromatographische und elektrophoretische Mobilität zeigten) wurden wie folgt behandelt:

70 Mikroliter einer 60-%igen Perchlorsäure wurden pro ml Serum zugegeben und die Lösung gemischt. Zu dieser Lösung werden 0,93 ml 0,6 M Perchlorsäure pro ml Serum zugegeben. Diese Lösung wird gut gemischt und eine Stunde (45 bis 90 Min. sind ausreichend) bei O⁰C stehengelassen. Das Gemisch wird dann bei 80OO g 1O Min. lang (6 bis 12 Min.) zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren vom Niederschlag getrennt.

Die erhaltene überstehende Lösung wird mit 1,2 M Kaliumhydroxid auf pH 6 bis 7 eingestellt und 10 Min. bei 0⁰C stehengelassen. Das Kaliumperchlorat wird wie oben durch Zentrifugation (Filtration ist ausreichend) abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang (16 bis 36 Stunden sind ausreichend) gegen 10~ M Pyridinacetat, pH 5,2 , dialysiert.

Eine DEAE-Sephadex-A-25-Säule (1,5 χ 40 cm) wird entsprechend den Anweisungen des· Herstellen bereitet und mit 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, äquilibriert.

Die Probe des dialysierten Perchlorsäure-Überstandes wird (vorzugsweise) durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf etwa das Zehnfache konzentriert. Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Sialsäure und bis· zu 30 mg Protein wird auf die Säule aufgebracht und diese daraufhin mit einem linearen Gradienten aus 0,01 M bis 1,OM Pyridinacetat, pH 5,2, (das gesamte Gradientenvolumen beträgt 600 ml) eluiert.

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Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde werden Fraktionen gesammelt (5 bis 6 ml Fraktionen). Diese Fraktionen werden dann auf ihren Protein- und Sialsäuregehalt nach Lowry et al und mittels der Perjodat-Resorzinol-Methode analysiert. Die Sialsäure-positiven Fraktionen, die den Hauptanteil dieser Säure enthalten, und bei einer Gradientkonzentration von etwa 0,4 M eluiert werden, werden vereinigt, bei O⁰C 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Diese Fraktion enthält das Tumor-spezifische Glykoprotein und kann etwas (Λ/-1 -saures Glykoprotein, eine normale Serumkomponente, enthalten.

Eine weitere Reinigung des Tumor-spezifsehen Glykoproteins kann durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie über DEAE-Sephadex A-50 erreicht werden.

Die nach der oben beschriebenen Chromatographie erhaltene Fraktion, die die Sialsäure enthält, wird auf eine 1,2 χ 50 cm Säure aus DEAE-Sephadex A-50 aufgebracht und die Säule mit einem linearen Pyridin-Acetat-Gradienten (0,01 M bis 0,5 M, pH 5,2, 400 ml) eluiert. Es werden zwei Sialsäure-positive Fraktionen erhalten, die jeweils bei den Gradientenkonzentrationen 0,42 und 0,46 M eluiert werden. Die zweite Fraktion enthält das Tumor-Glykoprotein und ist im wesentlichen frei von anderen Verunreinigungen. Diese Fraktion wird durch 24 Stunden lange Dialyse gegen destilliertes Wasser bei O⁰C entsalzt und durch Lyophilisation konzentriert.

Alternativ wird die Fraktion mit dem Tumor-spezifsehen Glykoprotein, wie sie von der DEAE-Sephadex-A-25-Säule erhalten wird, einer Gel-isoelektrischen Fokussierung in einem pH 3,5 bis 7,0 Ampholin-Gradienten mit Hilfe eines LKB-Multiphorgerätes von LKB Instruments, Inc., unterworfen. Kontaminierende saure Glykoproteine weisen isoelektrische Punkte von 3,5 bis 3,8 auf und werden deutlich von dem Tumor-spezifischen Glykoprotein getrennt, das einen isoelektrischen Punkt bei 4,4 (4,2 bis 4,6) besitzt. Nach demselben Prinzip kann präparativ

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gearbeitet werden, indem eine 110 ml Ampholin-Säule (LKB) und der oben beschriebene pH -Gradient verwendet wird. Der Bereich zwischen pH 4,2 und 4,6 wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisation konzentriert. Das Produkt kann in 0,01 M Natrium- oder Kaliumchlorid, das O,OO5 M Phosphatpuffer, pH 6,5 enthält, gelöst werden.

Eine letzte Reinigung sowie eine Prüfung auf Verunreinigungen kann durch Affxnitätschromatographie des Glykoproteins auf einer Weizenkeim-Agglutinin-Sepharosesäule erreicht werden.

Die Glykoproteinlösung (in Natriumchlorid/Phbsphat O,01 M/ 0,005 M pH 6,5) wird auf eine 1 χ 10 cm Säule mit Sepharose 4 B, das mit Weizenkeim-Agglutinin konjugiert ist,und die mit der gleichen Lösung äquilibriert wurde ,gegeben. Die Säule wird mit 3 bis 5 Volumen des äquilibrierenden Puffers gewaschen (von dem Tumor-Glykoprotein sollte dabei nichts von der Säule eluiert werden). Das Tumor-Glykoprotein kann mit einem scharfen, symmetrischen Peak mit 0,01 M N-Acety!glucosamin eluiert werden. Der Zucker wird durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entfernt und das Glykoprotein durch Lyophilisation konzentriert.

BEISPIEL

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Lösung A wird durch Vermischen von 0,24 g Acrylamid (erhältlich von Eastman Organic DPI und zweimal in Aceton umkristallisiert) mit 0,73 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 100 ml Wasser hergestellt. Lösung B bereitet man durch Auflösen von 150 mg Kaliumoder Ammoniumpersulfat in 100 ml· Wasser. Lösung C enthält 7,7 g NaH₃PO₄-H₂O, 38,6 g Na₃HPO₄^H₂O, 4 g Natriumdodecylsulfat und 1,15 ml N,N,N¹,N¹-Tetramethyläthylendiamin (Eastman DPI) pro Liter. Das Gel wird hergestellt durch Mischen von

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einem Teil der Lösung A mit zwei Teilen der Lösung B und einem Teil der Lösung C. Das Gemisch wird sofort in ein 5 χ 75 mm Gel-Röhrchen mit einer Höhe von 55 mm gegeben. Das Gel wird 10 mm mit H₂O überschichtet und das auf diese Weise hergestellte Röhrchen eine Stunde lang bei 25°C stehengelassen. Das Röhrchen wird daraufhin in ein Reservoir eingegeben. Eine Probe, 10 bis 25 μΐ, die 5 bis 20 ug Glykoprotein enthält, wird auf das obere Ende der Geloberfläche überschichtet und ein Elektrophoreselauf bei 70 V zwei Stunden lang durchgeführt. Das Gel wird herausgenommen, und mit 10 %-iger Trichloressigsäure 3 Min. lang fixiert und dann mit 0,3 %-igem Coomassie Brilliantblau R in 10 % Essigsäure / 45 % . Methanol / 45 % H₂O zwei Stunden lang bei 40°C gefärbt. Das Material wird daraufhin mit 7 % Essigsäure / 30 % Methanol / 63 % Wasser fünfmal zwei Stunden lang bei 40°C (oder bei 25°C entsprechend länger) entfärbt. Die Färbemethode für Glykoprotein entspricht der von Zacharius et al , Anal. Biochem., 30 , 148 (1969), beschriebenen.

BEISPIEL

Bestimmung von Sialsäure- (NANA) und Protein-Spiegel in den Perchlorsäurelöslichen Glykoproteinfraktionen von Krebs- bzw. normalen Patienten

Es wurden Serumproben gesammelt von 30 Krebspatienten (einschließlich Brust-, Lungen-,Dickdarm-,Lymphom- und Melanomkrebs) sowie von 29 normalen,als Kontrolle dienenden Personen:. Die Serumprobe jedes Patienten sowie die Kontrollproben wurden mit Perchlorsäure gemischt, die lösliche Fraktion nach Entfernung des Niederschlages gewonnen, und diese lösliche Fraktion neutralisiert, wie es im vorangehenden Beispiel 1 beschrieben wird. Die neutralisierte Perchlorsäure-lösliche .Fraktion wird auf Protein nach der Methode von Lowry et al auf Sialsäure nach dem direkten Ehrlich-Verfahren analysiert

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■as·--

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 bis 4 aufgeführt.

Fig. 1 zeigt die in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion gefundene Proteinmenge (mg/ml) sowohl der normalen als auch der Krebsproben. Der durchschnittliche Proteingehalt für Normalpersonen beträgt 0,35 mg/ml und der durchschnittliche Proteingehalt für Krebspatienten 0,79 ml/ml. Der Unterschied ist signifikant mit einem Wert von weniger als 0,001 (weniger als 1 Chance in 1000, daß es sich dabei um einen Zufall handelt).

Fig. 2 zeigt die Menge (mg/ml) an gefundener Sials.äure (NANA) in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion der Proben von den Normalpersonen sowie den Krebspatienten. Der durchschnittliche Sialsäuregehalt für Normalpersonen betrug 0,034 gegenüber dem Durchschnittswert für Krebspatienten mit 0,162 (Λ«Ο,ΟΟ1).

Fig. 3 zeigt wiederum die Daten von Fig. 2, indem sie den Bereich des Sialsäuregehaltes sowohl bei Normalpersonen als auch bei Krebspatienten und einen Vergleich derselben wiedergibt.

Fig. 4 zeigt den Bereich des Sialsäuregehaltes von Normalpersonen und Personen mit Brustkrebs.

BEISPIEL

Bestimmung des Sialsäure- (NANA), und Proteinspiegels in Perchlorsäure-löslichen Glykoproteinfraktionen von Krebs- und Normalpatienten

Es wurde eine zweite Serie mit. 311 Individuen unter Anwendung eines unsichtbaren, kontrollierten Codesystems durchgeführt. Die Personengruppe schloß solche mit festen und Bluttumoren (Leukämie) ein. Die Gruppe der Krebspatienten umfaßte die folgenden Krebstypen: Lymphoro-, Brust-, Darm-, Melanom-, Sarkom-, Testikular-, Rhabdomyosarkom-, Lungen-, Nieren- und

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Cervikalkrebs. Eine Anzahl der untersuchten Personen litt an einen großen Bereich umfassenden, nicht-bösartigen Krankheiten oder Zuständen, einschließlich: Schwangerschaft, Geschwüre, Asthma, Infektionskrankheiten, Trauma, Kerzbeschwerden. Andere der Individuen stellten gesunde Normalpersonen dar. Die Serumproben von sämtlichen der 311 Personen wurden,wie im Bespiel 3 beschrieben, behandelt und analysiert.

Basierend auf den in Beispiel 3 erhaltenen Daten, wurden Bereiche für Normalspiegel an Sialsäure und Protein in der Perchlorsäure-löslichen Fraktion ermittelt. Es wurden Bereiche aufgestellt für "möglichen Tumor" (possible tumor): Sialsäure über 0,065 mg/ml und Protein über 0,35 mg/ml. Proben, die über diesem Bereich liegen, wurden als möglicher Tumor diagnostiziert. Proben mit einem Sialsäuregehalt von über 0,080 mg/ml und einem Proteinspiegel über 0,4 mg/ml wurden als sehr wahrscheinlicher Tumor diagnostiziert.

Die Ergebnisse der Diagnosen, die sich auf den Sialsäure- und Proteingehalt beziehen, sind folgende:

Prozent korrekt diagnostizierte maligne Krankheit: 83 %, mit einer 95 %-igen Genauigkeit, basierend auf den oben angegebenen sehr wahrscheinlichen Gehalten. Es wird daraufhin gewiesen, daß eine Reihe von Patienten mit Krebs eine Chemotheraphie oder Bestrahlungsbehandlung erhielten. Die Gesamtzahl in dieser Gruppe war zu niedrig, um sicherzustellen, daß eine der letztgenannten einen direkten Effekt auf die ΝΑΝΑ-Gehalte im Serum oder die Anwesenheit von TSGP hatten. Der Prozentsatz an "falschen" Positiven betrug 12 %.

Die falsche positive Gruppe wurde desweiteren untersucht, indem die Serumproben der Patienten einer Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 2 beschrieben _f unterworfen wurden.

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-vs- 2806H6

Das Tumor-spezifische Glykoprotein wurde in keinem dieser untersuchten Proben gefunden, einschließlich den asthmatisch nichtmalignen Kranken.

II. Radioimmuno-Bestimmung zum Nachweis des Tumorspezifischen Glykoproteins.

Unter Verwendung ausreichender Mengen an Material, das von menschlichen Patienten mit breitem Erkrankungä^ereich und hohen Glykoproteingehalten erhalten wurde, kann das Tumor-spezifische Glykoprotein durch Kombination einer Reihe von Methoden gereinigt werden, einschließlich AffinitätsChromatographie, Ionenaus tausch Chromatographie, isoelektrische Fokussierung und andere, und ein Antikörper zu diesem Glykoprotein entwickelt werden unter Anwendung einer Reihe von immunologischen Methoden. Anfangs werden Kaninchen, Meerschweinchen oder Hamster als Wirtstiere für die Entwicklung eines Antikörpers erster Stufe verwendet. Obwohl dies geeignet ist, mag es wünschenswert oder vorzuziehen sein, das Tumor-spezifische Glykoprotein durch Modifikation der Sialsäure, z.B. dux-ch Reaktion mit Aminen oder Hydraziden nach der Perjodatbehandlung oder durch partielle Entfernung oder Hydrolyse der Sialsäure (unter Verwendung von Sialidase aus einer Anzahl von Quellen- vibrio cholera , hemophilus influenzae, clostridium species, diploccocus pneumoniae u.a.) zu modifizieren, um darüber hinaus Kohlenhydrat-Gruppierungen freizulegen, die immunologisch reaktionsfähiger sein können.

Nachdem der Antikörper zu dem Tumor-spezifischen Glykoprotein in einem geeigneten Wirtstier erhalten worden ist, werden Antikörper zu diesem durch Injektion der Globulinfraktion des Wirts in eine Ziege hergestellt. Auf diese Weise wird z.B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper erhalten, der mit Radiojod oder durch andere geeignete Methoden radioaktiv markiert wird. Alternativ

125 3
kann TSGP radioaktiv mit I oder H nach R.O. Hynes, Proc.

Natl. Acad. Sei., USA, 70 , 3170 (1973) oder Liao et al,

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J. Biol. Chem. 248, 8247 (1973) markiert werden. Auf diese Weise erhält man einen radioimmunologischen Nachweis zur Bestimmung geringerer Mengen an Glykoprotein mit Hilfe von hochspezifischen immunologischen Methoden. Auf diese Weise erhält man einen Empfindlichskeitsspiegel, der 100 bis 10 000 -mal tiefer liegt als die Empfindlichkeit, die mit den rein-chemischen Verfahren, wie sie oben beschrieben werden, erreicht wird.

Da man davon ausgehen kann, daß das Tumor-Glykoprotein sogar von sehr wenig Tumorzellen, wenn diese in einer Kultur gezüchtet werden, produziert x-?ird ,ist die Annahme berechtigt, daß sehr kleine Tumorherde dieses Glykoprotein, das dann im Kreislauf der Individuen erscheint, produzieren und absondern. Eine hochempfindliche Nachweismethode, wie z.B. die Radioimmunobestimmung, macht es möglich, die Anwesenheit . dieser Komponente anzuzeigen, noch vor dem Auftreten irgendwelcher manifestierter Symptome, wie Schmerzen, Unbehagen, Gewebeknoten etc. Ein positiver Test mit Hilfe dieser Methode würde dem untersuchenden Arzt die Notwendigkeit für weitere und sorgfältigere diagnostische Untersuchungen des Patienten anzeigen, um die Art, den Typ und die Lage des Tumors sicherzustellen. Dies erlaubt eine frühe Behandlung, noch bevor das Tumorwachtum und Metastasen auftreten. Es besteht kein Zweifel, daß die frühzeitige Diagnose und Behandlung von Krebs noch immer das effektivste Mittel im Kampf gegen die hohe Sterblichkeitsrate, die mit dieser Krankheit assoziiert ist, darstellt.

BEISPIEL

Antikörperproduktion

Das gereinigte Tumor-spezifische Glykoprotein, z.B. gemäß Beispiel 1 (0,5 mg in 1 ml 0,15 M NaCl) wird mit einem geeigneten Agens (Freunds-Adjuvanz) vermischt und in ein geeignetes

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Tier injiziert. Die Injektion kann erfolgen: subkutan, intramuskulär (größere Volumen, 3 bis 4 X) in die Fußsohle (foot pad) oder durch entsprechende Kombination. Auf diese Weise können Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ziegen behandelt werden. Bei Kaninchen würde sich die Injektion in wöchentlichen Abständen über eine Periode von 6 Wochen wiederholen, worauf von dem Kaninchen Blut abgenommen und das Serum hergestellt wird. Dieses Serum ist ein nicht-absorbiertes TSGP- (Tumor-spezifisches Glykoprotein) Serum. Dies kann dann mit Hilfe eines normalen Serums absorbiert und ein sich bildender Niederschlag abgetrennt werden. Der überstand wird den Antikörper., spezifisch für TSGP, enthalten.

BEISPIEL 6

Modifikation von funktioneilen Gruppen am TSGP

Es wird eine selektive strukturelle Modifizierung des Tumorspezifischen Glykoproteins durchgeführt, um seine immunologischen Eigenschaften zu verstärken und um einer» Mechanismus zu schaffen für das Binden von spezifischen funktionellen Gruppen. Die TSGP-Probe wird in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0 (Natrium oder Kalium) hergestellt. Diese Lösung wird mit einem äquivalenten Volumen einer Lösung vermischt, die 2 bis 4 pHol Natriummetaperjodat im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch läßt man 30 Min. lang bei O⁰C stehen und zerstört das restliche Perjodat durch Zugabe von 5 uMol Natriumarsenit."Das modifizierte TSGP kann nun mit einem der verschiedenen Amine oder Hydrazide, wie von K. Itaya et al, Biochem. Biophys., Res. Comm. (>4_, 1028 (1975) beschrieben, umgesetzt werden. Dieses Verfahren ändert spezifisch die Sialsäuregruppierungen auf dem Molekül und erlaubt ihre Umwandlung zu einer immunologisch stärker responsiven Gruppierung.

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Das derivatisierte TSGP kann dann, wie oben beschrieben, für die Antikörper-Herstellung verwendet werden.

BEISPIEL

Hydrolyse von Sialsäuregruppierungen am. TSGP

Im Handel erhältliche Sialidase aus Vibrio cholerae oder Clostridium perfingens wird mittels Affinitätschromatographie (s. P. Cuatrecasas, Biochem. Biophys. Res. Comm., ^8, 947 (197O)) gereinigt. Das TSGP wird in einer Konzentration von 1 bis 2 mg/ ml in pH 5,0 Acetatpuffer (Kalium), der 2 mM Calciumacetat enthält, hergestellt. Diese Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die 50 Millieinheiten gereinigter Sialidase im gleichen Puffer enthält. Das Gemisch wird 18 Stunden (12 bis 24 Stunden) bei 37°C inkubiert. Das modifizierte TSGP wird, von· der frei gewordenen Sialsäure durch Chromatographie auf einer vernetzten Dextrangelsäule (1 χ 6O cm) in pH 5,0 Acetatpuffer (z.B. Sephadex G-50, das eine Ausschlußgrenze des Molekulargewichtes von etwa 50 000 und eine Teilchengröße von 30 bis 100 Mikron besitzt) abgetrennt. Das modifizierte TSGP erscheint im Ausschlußvolumen (erster Pröteinpeak). Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (24 Stunden) und Konzentrierung durch Lyophilisation kann das Material direkt für die Antikörper-Produktion, wie oben beschrieben, verwendet werden.

II. Radioimmuno-Bestimmung ϊ

Verschiedene Arten von Radioimmuno-Bestimmungsmethoden können zum Nachweis von TSGP im Serum angewandt werden. Typische Beispiele stellen die Methoden der direkten Kompetition, der Vorbindung (prior binding) und der Doppel-Antikörper-Bindung dar und werden nachfolgend beschrieben.

Bei der Methode der direkten Kompetition verwendet man TSGP,

2S TSGP (³H oder

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radioaktiv markiertes TSGP (³H oder ¹²⁵I-Material) und TSGP-

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2806HS •31··

Antikörper,(z.B. von Kaninchen). Man stellt eine Standard-Titrat ions kurve auf, indem eine Reihe von bekannten TSGP-Konzentrationen in eine Anzahl von Reagenzgläser gegeben wird, die Aliquot des Perchlorsäure-Überstandes von normalem Serum enthalten, wobei dieses äquivalent dem zu analysierenden Serumvolumen ist (typischerweise 1 bis 5 ml). Dieses.Gemisch wird in 0,1 M Natriumkaliumphosphatpuffer, pH 7,2, hergestellt. Daraufhin wird ein Aliquot eines TSGP-Antiserums in jedes Reagenzglas gegeben, und zwar in ausreichender Menge, um mit dem gesamten vorliegenden TSGP im Reagenzglas mit der höchsten Konzentration zu reagieren. Dieses Gemisch wird 16 Stunden lang

bei 4°C stehengelassen, worauf eine bestimmte Menge (5 X

4
- 2 χ 10 Counts pro Minute) an radiomarkiertem TSGP zugegeben wird. Nach Inkubation für zwei Stunden bei 37°C werden der Antikörper und der Antigen-Antikörper-Komplex durch Zugabe eines geeigneten Agens, wie gesättigtes Ammoniumsulfat oder Ziegenanti-Kaninchenanti-Serum (s. unten) präzipitiert. Freies TSGP bleibt in Lösung und die Menge an radiomarkiertem TSGP in der löslichen Fraktion kann durch Bestimmung der radioaktiven Counts in einem Flüssig-Scintillationspektrometer ( H) oder einem

1 °5

gamma-'ScJntillationszähler ( I) bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Daten läßt sich eine. Standard-Titrationskurve aufstellen, aus der die TSGP-Konzentration einer unbekannten Serumprobe, die demselben Verfahren unterworfen wurde, abgeleitet werden kann.

Die radioimmunologische Methode der Vorbindung (prior binding) geht davon aus, daß der TSGP-Antikörper an einen unlöslichen Matrixträger, wie Sepharose 4B,gekoppelt wird, wodurch ein wiederverwendbarer gebundener, Partikel-Antikörper gebildet wird (AB-Sepharose). Diese Präparation wird dann mit bekannten Mengen an TSGP und radiomarkiertem TSGP wie oben beschrieben inkubiert und eine Standard-Titrationskurve aufgestellt. Der TSGP-Antikörper-Sepharose-Komplex kann durch Filtration und Waschen mit 0,15 M NaCl, um mechanisch eingeschlossenes Material

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zu entfernen, wiedergewonnen werden; Das Eluieren des gebundenen TSGP kann (mit 1O~ M KOH oder einem geeigneten Puffer) ohne Zerstörung der AB-Sepharose (wodurch sich diese wiederverwenden läßt) erreicht werden. Die Radioaktivität der eluierten TSGP-Fraktion wird bestimmt und aufgrund dieser Daten eine Standard-Titrationskurve wie oben aufgestellt. Zur Durchführung der radioimmunologischen Bestimmung wird die auf TSGP zu untersuchende Testprobe dann mit dem markierten Antigen und dem Antikörper inkubiert und die Radioaktivität der eluierten Fraktion, wie oben beschrieben, bestimmt.

Anstelle von Sepharose .als Träger, kann der Antikörper an Kunststoffoberflächen, wie Scheiben oder Reagensgläser in der von Catt, Science, _158, (1967) S. 1570 oder ÜS-PS 3 646 346 beschriebenen Weise gebunden werden, wobei die in den genannten Druckschriften beschriebenen Verfahren angewandt werden können.

Bei der Doppel-Antikörper-Methode ist es erforderlich, daß ein Antikörper zum TSGP-Antikörper (z.B. Ziegenanti-Kaninchen) hergestellt wird. Dies dient dazu, um den TSGP-TSGP-Antikörper-Komplex zu präzipitieren, wobei Spiegel von TSGP-Antikörper verwendet werden, die weit unter den oben beschriebenen liegen. Die Standardkurven werden auf ähnliche Weise (direkte Kompetition) hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein Zehntel bis ein Hundertstel der Mengen an TSGP-Antikörper eingesetzt werden. Die Fällung des TSGP-Antikörper-Komplexes wird durch Zugabe eines zweiten (Ziegen)Antikörpers und Inkubation für zwei Stunden bei 4°C durchgeführt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und dessen Radioaktivität bestimmt .

Anstelle der Radiomarkierung von TSGP kann der TSGP-Antikörper markiert werden und die in einer Versuchsprobe vorliegende

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Menge an TSGP durch Inkubation und Bestimmung der Radioaktivität der gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen bestimmt werden. Der markierte Antikörper kann auf eine feste Oberfläche oder auf geeignete Trägerteilchen aufgebracht (coated) werden, und dient als Reagenz, das mit TSGP-enthaltenden Testproben in Kontakt gebracht wird.

Die vorangehend beschriebenen Verfahren dienen dazu, um mittels radioimmunologischer Bestimmung sehr geringe Mengen von TSGP mit hoher Spezifität nachzuweisen. Dementsprechend kann eine frühzeitige Identifizierung der Anwesenheit von malignen Herden möglich gemacht werden, die auf routinemäßig durchgeführte radioimmunologische Bestimmungs-Analysen von Serumproben basiert. Das Auftreten von TSGP sollte als ein Signal für die Möglichkeit eines sich bildenden Tumors und der Notwendigkeit für weitere diagnostische Untersuchungen dienen.

III. Individual-Therapie durch Isolierung von TSGP und Antikörper-Herstellung:

Die Plasmapherese-Methode erlaubt es, bis zu 500 ml Serum von einem einzelnen Patienten zu erhalten. Auf diese Weise sollte es möglich sein, ausreichende Mengen an TSGP von dem einzelnen Patienten zu isolieren, die die Produktion von Antikörpern gestatten. Diese Antikörper richten sich gegen das TSGP und die Oberfläche der Tumorzellen. (Es konnte gezeigt werden, daß TSGP auf der Oberfläche von Tumoiizellen, die im Labor in Kulturen gezüchtet wurden, nachweisbar ist). Die Wechselwirkung dieses Antikörpers mit den Tumorzellen kann, durch das normale Immunsystem des Wirts, mittels . Sensibilisierung der Zellen zu deren Lyse führen. Die komplementäre oder durch die Zelle verursachte Lyse von Target-Zellen wird häufig in Gegenwärt von Agenzien, die mit der Zelloberfläche in Wechselwirkung, treten, verstärkt. Die ungezielte Ausfällung des Antikörpers mit zirkulierendem oder löslichem TSGP kann durch Verwendung von monovalenten Fab-Antikörper-Fragmenten verhindert werden.

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.37·

IV. Verwendung von TSGP zur Erleichterung der Chemotherapie:

Vorausgesetzt, daß Antikörper gegen TSGP, das von einer einzelnen Person isoliert wurde, produziert werden können, und daß diese Antikörper-Moleküle gegen die Oberfläche der Tumorzellen gerichtet werden, sollte es möglich sein, dieses Vehikel als spezifisches Trägeragens für funktioneile chemische Gruppen, die auf die Tumorzelle toxisch oder lethal wirken, zu verwenden. Das allgemeine Muster einer derartigen therapeutischen Anwendung hängt von der Modifikation des TSGP-Antikörpers und der Einführung eines geeigneten Derivates am neuen Zentrum (site) ab. Typischerweise werden Antikörper gegen TSGP aus dem Serum von Wirtstieren (z.B. Kaninchen) isoliert und gereinigt. Dies erfolgt durch eine Vielzahl von Standardverfahren, einschließlich Differentialpräzipitation der ß- und ^-Globulin-Fraktion, Gel-Ausschluß-Chromatographie auf Sephadex G-150, elektrophoretische Auflösung und schließlich durch Affinitätschromatographie auf einer TSGP - Sepharose -Säule. Der letzte Schritt verwendet den spezifischen Liganden (TSGP), immobilisiert durch Kopplung an einen inerten Träger (Cuatrecasas et al, wie oben zitiert) und sichert die Abtrennung aus der Hauptmasse der Globulinfraktion.

Alle Immunoglobuline sind selbst Glykoproteine; sie enthalten alle Galactose und die meisten haben mindestens einen Sialsäure-Substituenten. Diese Stellen sind geeignet für das Anbringen anderer funktioneller Gruppen. Typischerweise wird das isolierte Immunoglobulin entweder mit Natriummetaperjodat (wie vorangehend beschrieben) oder Galactoseoxidase (s. Gahmberg et al, J. Biol. Chem. 248, 4311 (1973) ) behandelt. Dabei ergibt sich, daß die Kohlenhydratkomponente des Immunoglobulins modifiziert wird und nun eine funktioneile Aldehyd-Gruppierung enthält, die mit einer Vielzahl von Agenzien umgesetzt werden kann.

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Zu den Chemikalien, die mit diesem Verfahren mit dem Antikörper gekoppelt werden können, gehören Hydrazide und Stickstoff-Senföle (nitrogen mustards). Die allgemeine Toxizität dieser Agenzien wird auffallenderweise reduziert, da das Zell-orientierte Trägermolekül (TSGP-Antikörper) deren Introduktion in den Herd bei einem geringen Anteil der Konzentration erlaubt die normalerweise angewendet wird.

V. Bestimmung des TSGP-Spiegels im Serum von Patienten und dessen Verwendung als Index für die therapeutische Behandlungsweise:

Da. das TSGP in direktem Zusammenhang mit dem Vorliegen von Krebs steht, kann der Fortschritt eines beliebigen Patienten, der eine Behandlung (z.B. Chemotherapie, Chirurgie) erfährt, zum Teil durch die Bestimmung der TSGP-Spiegel vor und nach der Therapie ermittelt werden. Typischerweise werden TSGP-Spiegel im Serum für eine beliebige Person aufgestellt und kontrolliert. Im allgemeinen werden Patienten, denen chirurgisch ein Tumor entfernt wurde, in drei- bis sechsmonatlichen Intervallen nachuntersucht. Die Diagnose zum Wiederaufteten der Krankheit oder der Wirksamkeit einer Drogenbehandlung erfolgt im allgemeinen durch das Nicht-Auftreten von Symptomen. Eine Routineuntersuchung der TSGP-Spiegel als Teil des allgemeinen üntersuchungsprotokolls würde erlauben, daß das Wiederauftreten eines Tumors wesentlich früher festgestellt werden kann, sowie die Bestimmung der Wirksamkeit einer spezifischen Behandlungsweise ermöglichen.

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Claims

30 246 m/fi Research Corporation New York, N.Y. / USA Tumor-spezifische Glycoproteine und Methode zum Nachweis von tumorigenen Krebsarten Patentansprüche

1. Tumor-spezifisches Glykoprotein, das aus dem Blutserum von Krebs-infizierten menschlichen Patienten isoliert werden kann, gekennzeichnet durch die Perchlorsäure-lösliche Fraktion des genannten Blutserums, die einen Sialinsäuregehalt von über etwa 0,065 mg pro ml Blutserum und einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 - 4,6 aufweist.

2. Tumor-spezifisches Glykoprotein, gekennzeich net durch die Perchlorsäure-lösliche Fraktion, die aus dem Blutserum von Krebs-infizierten menschlichen Patienten isoliert werden kann, und die einen Sialinsäuregehalt aufweist, der etwa 0,065 mg pro ml Blutserumprobe übersteigt.

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und einen Proteingehalt über etwa 0,35 mg pro ml Blutserumprobe besitzt.

3. Tumor-spezifisches Glykoprotein gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Sialinsäuregehalt etwa 0,080 rag pro ml und der Proteingehalt etwa 0,40 mg pro ml Blutserumprobe übersteigt.

4. Tumor-spezifisches Glykoprotein, das aus dem Blutserum von Krebs-infizierten Menschen isoliert werden kann, charakterisiert durch die Löslichkeit in 0,6 M Perchlorsäure, einen hohen Sialinsäuregehalt, einen Pronase-resistenten Kern, der die Hauptmasse der Kohlenhydrate enthält, die Affinität für Weizenkeim-Agglutinin in Abhängigkeit von der Sialinsäure, die Affinität für Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-25 und Eluierung mit Pyridinacetatpuffer pH 5,2 bei einer Konzentration von ungefähr 0,4 M, Einschluß auf Sephadex G-150 in 0,1 M Pyridinacetat, pH 5,2, ein Molekulargewicht im Bereich von 50 000 bis 70 000 und einen isoelektrischen Punkt von etwa 4,2 bis 4,6.

5. Verwendung des Glykoproteins gemäß Ansprüche 1 bis zur Feststellung und Diagnose von Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeic hnet, daß menschliche Seren einer chemischen oder Radioimmuno-Bestimmungsanalyse zum Nachweis des Tumor-spezifischen Glykoproteins unterworfen werden.

6. Verwendung des Glykoproteins gemäß Ansprüchen 1 bis zur Feststellung und Diagnose von Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet , daß menschliche Seren chemisch analysiert werden, um deren Gehalt an N-Acetylneuraminsäure zu bestimmen, und die erhaltenen Ergebnisse mit einem normalen Standard verglichen werden.

7. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Serumprobe mit Perchlor-

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säure vermischt wird, um die darin unlöslichen Komponenten auszufällen, worauf die Perchlorsäure-lösliche Fraktion chemisch auf ihren Gehalt an N-Acetylneuraminsäure analysiert wird..

8. Verwendung des Glykoproteins gemäß Ansprüchen 1 bis 4 zum Nachweis und zur Diagnose von Krebs-artigen Tumoren beim Menschen, dadurch gekennzeichnet , daß das Serum von einem Patienten, bei dem Krebs vermutet wird, mit Perchlorsäure vermischt wird, um die darin unlösliche Fraktion auszufällen, worauf die Perchlorsäure-lösliche Fraktion einer Gel-Elektrophorese oder einer isoelektrischen Fokussierung zum Nachweis der Anwesenheit eines Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4 unterworfen wird.

9. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß eine Serumprobe, die vermutlich von einem Krebskranken stammt, indem ihr N-Acetylneuraminsäuregehalt etwa 0,065 mg pro ml Blutserumprobe übersteigt, nochmals geprüft wird, um falsche Positive zu eliminieren, indem eine Perchlorsäure-lösliehe Fraktion einer Gel-Elektrophorese oder einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen wird, um im weiteren das Vorliegen eines Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4 nachzuweisen.

10. Tumor-spezifisches Glykoprotein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Radiomarkierung trägt.

11. Radiomarkierter Antikörper des Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4.

12. Radioimmunologische Bestimmungsmethode zum Nachweis von Produkten aus dem Zellmetabolismus eines krebsartigen Tumors, gekennzeichnet durch die Isolierung

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einer Perchlorsäure-löslichen Fraktion aus dem Serum des menschlichen Wirts, daraus Gewinnung eines Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4, Verwendung des genannten Glykoproteins als ein Antigen zur Bildung von Antikörpern dazu in einem Wirtstier, Radiomarkierung des genannten Antikörpers oder des Tumor-spezifischen Glykoproteins oder beider, und Umsetzung des markierten Produktes mit einer Perchlorsäurelöslichen Fraktion eines Serums von -einem Patienten, um den Glykoprotein-Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten, Abtrennen des genannten Komplexes und Bestimmung der Radioaktivität dieses Komplexes zum Nachweis sowie zur quantitativen Bestimmung des Tumor-spezifischen Glykoproteins im Serum des Patienten.

13. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Tumorspezifischen Glykoproteins, gekennzeichnet durch Mischen von Blutseren von einem Patienten mit einem Tumor mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure, Abtrennung der unlöslichen Fraktion, Neutralisieren der säurelöslichen Fraktion, Entfernen des bei der Neutralisation gebildeten Salzes, Dialysieren des löslichen Anteiles, Konzentrieren des dialysierten löslichen Anteiles und Gewinnung des Tumorspezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Gewinnung des Tumor-spezifischen Glykoproteins durch Chromatographie auf einer DEAE-Sephadex-A-25-Säule erfolgt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß das genannte Glykoprotein weiterhin durch isoelektrische Fokussierung oder Chromatographie auf DEAE-Sephadex A-50 gereinigt wird.

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16. Methode zum Nachweis der Existenz von Produkten des krebsartigen Zelliaetabolismus, dadurch gekennzeichnet, daß die Perchlorsäure-lösliche Fraktion des Blutserums eines Patienten zum Nachweis eines Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4 einer Radioimmunobestimmung unterworfen wird.

17. Derivat des Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet durch die Umsetzung des genannten Glykoproteins mit einem Perjodat.

18. Derivat des Tumor-spezifischen Glykoproteins gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es einen verminderten Sialinsäuregehalt aufweist, indem der Sialinsäureanteil des genannten Glykoproteins einer partiellen Entfernung oder Hydrolyse der Sialinsäure unterworfen wird.

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