DE2728802C2 - Verfahren zum Herstellen eines antischistosomen immunologischen Mittels - Google Patents

Verfahren zum Herstellen eines antischistosomen immunologischen Mittels

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DE2728802C2
DE2728802C2 DE2728802A DE2728802A DE2728802C2 DE 2728802 C2 DE2728802 C2 DE 2728802C2 DE 2728802 A DE2728802 A DE 2728802A DE 2728802 A DE2728802 A DE 2728802A DE 2728802 C2 DE2728802 C2 DE 2728802C2
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schistosomes
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    • A61P33/10—Anthelmintics
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines antischistomonen immunologischen Mittels aus einem Gesamtextrakt von Antigenen aus tierischen oder menschlichen Schistosomen sowie das nach dem Verfahren hergestellte Immunologische Mittel.
Die Bilharziose (Schistosomiase) wird nach dem tatsächlichen Stand des Wissens nur mittels Chemotherapie, insbesondere mit Niridazol, bekämpft. Dieses Produkt heilt die Krankheit, jedoch schützt es nicht gegen eine spätere Infektion. Der Befall erfolgt transkutan; die eindringenden Larven (Cerkarien), durchdringen die Haut, wandeln sich um und gelangen, wobei sie immer wachsen, in die Leber, wo sie einige Wochen nach dem Befall geschlechtsreif werden. Die Männchen befruchten die Weibchen und anschließend legen die Weibchen ihre Eier in den periintestinalen Gefäßen (intestinale Bilharziose) oder den perivesikalen Gefäßen (Urinärbilharziose) ab. Diese Eier durchdringen die intestinalen oder vesikalen Wände, werden nach außen abgegeben und wandeln sich in eine Larve um. die eine Wassermolluske befällt. In der Molluske vermehrt sich die Larve und wandelt sich in Cerkarien um, die wieder den Menschen befallen.
Die Chemotherapie bewirkt also keine lmmunisie rung.
Eine Vaccinotherapie. bei der im allgemeinen eine Immunisierung gegen die Antigene von infizierenden Organismen (Bakterien oder Viren) durchgeführt wird, hat jedoch bei Bilharziose bisher noch nicht zum Erfolg geführt, so daß man auf die Chemotherapie angewiesen war, die nach der Heilung keine erneute Infektion verhindern kann.
In der DEOS 24 20 706 sind Antigene aus Schistosomen beschrieben! die Verwendung dieser Antigene betrifft jedoch kein immunologisches Mittel, sondern ein diagnostisches Mittel. Es ist auch nichts darüber ausgesagt, daß durch die dort beschriebene Verfahrensweise, d.h. durch Inkubation in einer wäßrigen Salzlösung, eine Veränderung der Wirkungsrichtung der Gesamtantigene eintreten würde. Es ist lediglich angegeben, daß ein Reinigungseffekt bei der Herstellung der somatischen Antigene erzielt wird, so daß bei ihrer Verwendung zu diagnostischen Zwecken eine
ίο sicherere Testreaktion erzielt werden kann
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines anüschistosomen immunologischen Mittels.
Es ist bekannt, daß gegen Schistosomen wirkende Medikamente über Zielplätze des Parasiten wirken, die durch Antigene (Zielantigene) gebildet werden, weiche für die Unversehrtheit und das Oberleben des Parasiten wesentliche Molekülstrukturen darstellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren der eingangs definierten Gattung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Gesamtextrakt mit gegen Schistose—icn wirkenden Medikamenten wie Niridazol, Thiosinamin, Natrium-Stibocaptat, Emetinhydrochlorid, Amphotalid oder Kalium- Antimontartrat, die als immobilisierte oder nicht-immobilisierte Liganden dienen.
über Affinitätschromatographie reagieren läßt und die dabei gebildeten Zielantigene von dem Extrakt abtrennt.
Das so erhaltene antischistosome Mittel kann insbesondere für die Präventivbehandlung von Bilharziose verwendet werden. Die in den Organismus injizierten Zielantigene bewirken die Bildung von Antikörpern gegen diese Zielantigene, und damit von Schutzstoffen gegen die Bilharziose. Bislang war es nicht möglich, als Schutzstoffe gegen den Parasiten
ji wirkende Antikörper aus einem Gesamtextrakt der Antigene der Parasiten zu erhalten, welcher beispielsweise durch die überstehende Flüssigkeit eines Homo· genisats der Parasiten in einer NaCl-Lösung gebildet wird.
Bei der Affinitätschromatographie wird der Ligand durch ein gegen Schistosomen wirkendes Medikament gebildet, das als Mittel zur Fixierung der Zielantigene wirkt. Vorzugsweise immobilisiert man den Liganden an einem unlöslichen Träger auf der Basis von Agarose über eine Kupplungsreaktion, und trennt die an den Liganden gebundenen Zielantigene durch übliche Elutionsmittel vom Träger ab. Die Zielantigene weiden anschließend Tieren injiziert, in deren Organismus sie die Bildung von schützenden, sjegen Bilharziose wirksamen Antikörpern auslösen.
Man kann auch eine Affinitätschromatographie anwenden. be' welcher der Ligand ein nicht fixiertes und nicht immobilisiertes, gegen Schistosomen wirkendes Medikament ist. Hierbei set/· man den Liganden als
r. übersättigte Lösung ein, wobei die Zielantigene auf dem unlöslich zurückgebliebenen l.iganden fixiert werden, worauf man den die Zieiantigene tragenden Liganden abtrennt und gegebenenfalls in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Bespiele ff/läutert:
1. Gewinnung der Zielantigene
Die Zieiantigene wurden aus einem Gesamtantigen* extrakt von Schistosomen (Schistosoma mansoni)
isoliert, der aus beim Hamster gesammelten, erwachse* rieh Würmern hefgestellt wurde, falls nichts anderes angegeben ist. 3500 frisch gesammelte Würmer
(Arbeitsweise von Radke et al) wurden in 2 ml 0,5 M NaCI-Lösung homogenisiert, in einer Potter-Apparatur eingefroren und wieder aufgetaut und anschließend in einer Zentrifuge bei 40 000 g 30 Minuten zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde als Gesamtantigen verwendet
Die als Liganden verwendeten, gegen Schistosomen wirkenden Medikamente waren das Niridazol, Thiosinamin, Natrium-Stibocaptat, Emetinhydrochlorid, Amphotalid und Kalium-Antimontartrat
Affinitätschromatographie
Herstellung der immobilisierten Liganden
Zwei bekannte, handelsübliche Träger auf Basis von Agarose (Sepharose AH und CH der Fa. Pharmacia-Schweden) wurden zur Synthese von spezifischen Absorptionsmitteln verwendet, in denen der Ligand von dem Träger durch eine Kette mit sechs Kohlenstoffatomen getrennt ist Der Ligand wird durch eine Kupplungsreaktion mit Carbodiirnid auf dem Träger fixiert Der eine Träger (Sepharose CH) besitzt freie Carboxylgruppen, die zum Kuppeln von Liganden mit freien, primären Aminogruppen verwendet werden können. Der zweite Träger {Sepharose AH) besitzt freie, primäre Amingruppen, die zum Kuppeln von Carboxylgruppen verwendet werden können. Für die Kupplung mit Carbodiimid wurde die vom Hersteller vorgeschlagene Reaktionsweise angewandt. Niridazol (30 mg/10 ml Wasser), Thiosinamin (30 mg/10 ml Was- i<> ser), Amphotalic' (30 mg/10 ml Dioxan) wurden an 2 g Sepharose CH gekuppelt. Natrium-Stibocaptat (30 mg· 15 ml Wasser)und Kalium-Antimontartrat(30 mg'lO ml Wasser) wurden an 2 g Sepha'ose ΛΗ gekuppelt. Die angewandte Arbeitsweise war für jeues Arzneimittel die π Gleiche. Das lyophilisierte Pulver des jeweiligen Agarosegels wurde ausgewogen, dann in einem Überschuß einer 0,5 M NaCI-Lösung zum Quellen gebracht. Zur Entfernung von Lactose und Dextran wurde das Gel mit der 0.5 M NaCI-Lösung und anschließend zur Entfernung von NaCl mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Lösung des Liganden wurd^ dem Gel zugesetzt. Der pH-Wert der Suspension wurde zwischen 4.5 und 6 eingestellt. Ein Endverhältnis von Flüssigkeit : Gel von 2:1 ist für ein leichtes Rühren günstig; dies erfolgt bei Laboratoriumstemperatur. Das Carbodiitnidpulver wird in einer Endkonzentration von 0.1 M hinzugegeben. Der pH-Wert wird 1 Stunde zwischen 4,5 und 6 gehalten. Die Reaktion läuft innerhalb von 24 Stunden bei Laboratoriumstemperatur >o ab. Das Gel wird nacheinander mit alkalischen und sauren Pufferlösungen, welche 1 M NaCI enthalten, gewaschen. Falls Dioxan zur Auflösung des Liganden verwendet wurde, ist es erforderlich, das Gel mit diesem Lösungsmittel zu waschen. Das Gel wird zuletzt mit destilliertem Wasser gewaschen.
Isolierung von Zielantigenen mit Hilfe
der immobilisierten Liganden
Der rohe Antigenextrakt von Schistosomen (3500 Würmer = 20 mg Trockengewicht) wird über die Säule mit 2 ml Gel geschickt. Die Säule wird mit einer 0,5 M NaCI-Lösung gewaschen, bis die optische Dichte (Extinktion) bei 280nrt1 bei Null ist. Die fixierten Antigenanteile werden mit 0,2 M Glykokoll-HCl, 0,5 M NaCl pH = 2,8 elujert Das Eluat wird sofort in 1 M Phösphätpuffef (pH*Wert «· 8) neutralisiert, dann gegen Wasser diatysiert Die Menge des erhaltenen Produktes wird über die optische Dichte bei 280 nm abgeschätzt
Affinitätschromatographie über nicht
immobilisierte Liganden
1,5 mg Medikament liegen unter den Bedingungen des Versuches während des Kontaktes mit dem Antigenexirakt der Würmer bzw. während der mit gesättigten Lösungen des Medikaments durchgeführten Waschvorgänge in unlöslicher Form vor. Der Antigenextrakt (0,1 ml = 1 mg Trockengewicht) der Schistosomen, welche bei der Maus (zur Immunisierung von Mäusen) oder beim Hamster gesammelt wurden (zur Immunisierung von Kaninchen) wurde mit 2 mg Miridazole, 5 mg Thiosinamin, 10 mg Kaliurn-Antimontartrat, 40 mg Natrium-Stibocaptat 15 mg Emetinhydrochlorid bzw. 3 mg Amphotalid in Kontakt gebracht Nach einstündigem Kontakt bei 37° C und Kontakt über 30 Minuten bei Laboratoriumstemperatur wurde das unlösliche Medikament dreimal mit 10 ml der mit dem jeweiligen Medikament gesättigten Lösung gewaschen. Der Zielantigenligand dient zur Immunisierung von Mäusen oder Kaninchen. .
2. Immunochemische Charakterisierung und
parasitäre Lokalisierung von Zielantigenen
Diese Untersuchung wurde unter Verwendung der Immunseren (I.S.) von Kaninchen, die mit den verschiedenen Zieiantigenen injiziert waren, durchgeführt.
Immunisierung von Kaninchen
Eine Menge an unlöslichem Medikament, inkubiert mit dem Antigenextrakt der Schistosomen (die Gesamtmenge an unter den beschriebenen Bedingungen erhaltenem Unlöslichen) wurde bei Kaninchen (Vaitukailis et al.) injhiert.
Das Blut wurde am 35. Tag (S1), am 50. Tag (S2) und am 80. Tag (Si) abgenommen.
Für die mit Immunoelektrophorese und Immunfluoreszenz durchgeführten Untersuchungen wurden die I.S. zuvor durch die Gastantigene absorbiert. Die Absorption wurde durch Zugabe von 10 mg lyophilisiertem Hamsterserum und 10 mg lyophilisierter Hamsterleber zu 1 m! I.S. durchgeführt. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C wurde das Gemisch eine Nacht bei 4" C aufbewahrt und anschließend zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit stellt das absorbierte I.S. dar.
Untersuchung der Zielantigene bei der
Immunoausfällung
Die klassische Immunoelektrophorese wird entsprechend der von Capron et al beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung des Antigenextraktes von Schistosomen und der unterschiedlichen I.S.-Anti /ielantigene durchgeführt.
Die zweidimensional Immunoelektrophorese wird entsprechend der von Laurell beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Es werden Glasplättchen von 5 χ 5 cm verwendet. Die Wanderung des Antigens Sn, (2 mg) in einem l°/oigen Agarosegel in Veronalpuffer von pH = 8,2 (Natriumveronal 16 g, N HCl 22 ml/Wassef auf 1000 rhi) erfolgt 2 Stunden unter einer Differentialgleichspannung von 12,5 V an den Rändern der Plättchen, Die zweite Wanderung erfolgt in einem LS. enthaltenden Agarosegel (Agarose 1,3%, 2,34 ml; I.S. 1,16 mi) im Laufe einer Nacht unter einer Differentialgleichspannung von 3 V an den Rändern der Plättchen.
Nachweis der enzymatischen Aktivitäten
der Zielantigene
Die enzymatischen Aktivitäten (LDH, Gb PDH, MDH, AlDH, ex.- und jU-Carboxylesterasen) wurden nach einer von Uriel entwickelten Technik an den mittels Doppeldiffusion in Gel zwischen dem Antigen S1n und den verschiedenen LS.-Zielantigenen erhaltenen Niederschlagen untersucht
Lokalisierung der Zielantigene an den
Schistosomen durch Immunofluoreszens
Schnitte von Schistosomen wurden in der folgenden Weise hergestellt und behandelt: Nach drei Waschvorgängen in phyiologisch gepuffertem Serum wurden die beim Hamster entnommenen Würmer in »Bouin-Hol-Iande-Sublime« fixiert, in Bädern mit steigenden Konzentrationen an Äthylenalkohol entwässert, mit Butylalkohol behandelt und in Paraffin eingeschlossen. Die Blöcke wurden in Schnitte mit einer Dicke von 5 bis 6 μπι geschnitten; diese wurden auf Objektträgern fixiert. Diese Schnitte der Würmer wurden vom Paraffin befreit, in physiologisch gepuffertem Serum gewaschen und 30 Minuten bei 37° C mit dem Immunserum-Anti-Zielantigen von Kaninchen, verdünnt auf V2O bis Vi60, inkubiert. Die Objektträger wurden anschließend in dem phyiologisch gepufferten Serum gewaschen und 30 Minuten bei 37° C mit fluoreszierenden Ziegenimmunoglobulinen und Kaninchen-Anti-Immunoglobulinen, verdünnt auf '/50, inkubiert. Die Objektträger wurden gewaschen und eihcr Gegenfärbung mit Evans-Blau unterworfen. Als Kontrolle für die Spezifität dieme die Inhibierung der Fluoreszenz, indem das Immunserum-Anti-Zielantigen verwendet wurde, das zuvor mit dem Gesamtantigenextrakt von Schistosomen absorbiert worden war.
~. Untersuchung der immunosierenden
Eigenschaften der Zielantigene
a) Immunisierung von Ratteii
Fischer-Ratten mit einem Alter von 3 Monaten und einem Gewicht von 180 g wurden nach folgendem Schema immunisiert:
55 Tage vor dem Befall wurde eine Injektion eier Zielantigene auf intradermalem Weg durchgeführt (Zielantigene 50 μg; Diphterieanatoxin 50 μΙ; vollständiges FreuriiTsches Adjuvans 40 μΙ).
38 Tage vor dem Befall wurde die gleiche Suspension subkutan injiziert.
24 Tage vor dem Befall erfolgte eine Injektion der gleichen Suspension in die Polkissen der Pfoten.
Am Tag 0 wurden 800 Cerkarien zugeführt.
Den Ratten wurden 45 Tage vor dem Befall (S\), 30 Tage vor dem Befall (S2). 17 Tage vor dem Befall (S3), 4 Tage vor dem Befall (SU) und 22 Tage nach dem Befall fSO Blut entnommen.
Ratten, welche die gleiche Suspension ohne Zielantigene erhalten hatten, dienten als Köntrölltief e.
Das Einsammeln der Würmer erfolgte 22 Tag; nach dem Befall durch Leberperfusion. Die' männlichen, weiblichen und nicht geschlechtsreifen Würmer wurden ausgezählt.
Die Untersuchung der Cytotoxizität der Seren wurde nach der von Caprorj et al. und von Clegg und Smithers beschriebenen Methode durchgeführt.
b) Immunisierung von Mäusen
Eine Menge an unlöslichem Medikament, die mit dem Antigenextrakt von Schistosoma mansoni inkubiert worden war (Vi0 der unlöslichen Menge, welche unter den angegebenen Bedingungen erhalten wurde, pro Maus) wurde in einer einzigen Injektion in die Polkissen der Pfoten von schwarzen C-57-Mäusen von 18 g Gewicht und einem Alter von 5 Wochen injiziert Diese
m Dose von Ligand-Antigen wird in 0,2 ml 8°/o>iger NaCI-Lösung, 0,1 g eines Emulgators und 25 μΐ vollständigem Freund'schem Adjuvans überführt. v
Vergleichsmäuse erhielten 0,1 g Emulgator und 25 μΙ vollständiges Freund'sches Adjuvans.
Ii Weitere Medikamentvergleichsmäuse erhielten die gleiche Menge an ursprünglichem Medikament ohne Antigen.
Die Mäuse wurden 15 Tage später einem Befall von 60 Cerkarien ausgesetzt und 70 Tage später einer Blutentnahme und Perfusion unf--worfen. Die männlichen und weiblichen, durch Lebcperfusion erhaltenen Würmer wurden ausgezählt
c) Passive Überführung von Antikörpem-
Ί. Anti-Zielantigenen bei der Maus
C-57-Mäuse erhielten 03 ml LS.-Anti-Zielantigen von Kaninchen auf intravenösem Weg in den Schwanz sowie 0,25 ml frisches Serum von gesunden Kanindien als Ergänzungsquelle auf intraperi'onealem Weg. Die Vergleichsmäuse erhielten 03 ml frisches Serum von gesunden Kaninchen auf intravenösem Weg und 0,25 ml auf intraperitonealem Weg. Der Befall mit 60 Cerkarien erfolgte 1 Stunde nach diesen Injektionen. 60 Tage nach dem Befall wurden die Mäuse nach der Blutentnahme
i"> getötet. Die Würmer wurden ausgezählt Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
1. Immunochemische Untersuchung von
Zielantigenen
a) Isolierung
2 ml Agarosegel-Ligand, die in Anwesenheit von 20 mg Antigenextrakt von Schistosorra mansoni gebracht wurden, ermöglichten die Gewinnung von folgenden Mengen an Zielantigei.en, bestimmt bei 280 nm:
Agarosegel 1
(Sepharose CH)-
Niridazol
'" Agarosegel 1
(Sepharose CH)-
Thiosinamin
Agarosegel 2
(Sepharose AH)-
^ Kalium-Artimontartrat
Agarosegel 2
(Sepharose AH)-
Natrium-stibocaptat
Agarosegw-11
bn (Sepharuse CH)-
Emetin
Agarosegel 1
(Sepharose CH)-. Arnphotalid
160 μg Zielantigen
290 μg Zielantigen
1,65 m^ Zielantigene
290 μg Zielantigene
260 μg Zielpntigene
80 μg Zielantigene
Agarosegel 1 und 2 (Sepharose AH und CH), die nicht an Liganden gekuppelt sind, fixieren das Antigen nicht spezifisch,
b) Immunoeleklroplioretisches Verhalten derZielaritigene
Die I.S.-Anti-Zielanligene, welche bei der klassischen oder zweidifriensionalett ImmiMoelekifophorese gegen einen Antigenextrakt von Schistosoma mansoni gebracht werden, ermöglichen jeweils die Gewinnung eines geeigneten, eine oder mehrere Ausfällungssysleme aufweisenden Profils. Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Amphotalid enthält keine entwickelbaren, ausfällenden Zielantigene.
Im Vergleich dazu ermöglicht das immunserum-Anti-Anligen S. mansoni bei der zweidimensionalen Immunelektrophorese die Aufdeckung von mehr als 40 ausfällenden Systemen.
c) enzyriiatische Aktivitäten der Zielantigene Diese sind in Tabelle ί zusammengestellt.
d) Lokalisierung der Zielantigene in den Parasiten
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Niridazol
Schistosomen, hauptsächlich bei Männchen, dessen Tuberkel ebenfalls fluoreszierend sind.
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Thiosinamin zeigt eine Fluoreszenz, die ausschließlich auf die Zellschicht des Verdauungscoekums beschränkt ist, ausgenommen die Zellkerne.
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Kalium-Antimontartrat zeigt eine ähnliche Fluoreszenz.
Tabelle I
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Natrtum-Stibo-
Cän£äi ZC!nt Cine FlliOrflc"lr*'·' ^i** jaujcnhlif^rtliph auf rlif»
oberflächliche Zellschicht des Goekums unter Ausschluß der Kerne beschränkt und diskontinuierlich ist.
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Emetin zeigt eine vollständige Fluoreszenz der oberflächlichen Zellschicht des Coekums.
Das Immunserum-Anti-Zielantigen von Amphotalid zeigt nur eine diffuse Fluoreszenz des Parenchyms.
Anmerkungen zu Tabelle I:
+ Anzahl der bei der klassischen Immunoelektrophorese (IEP) erhaltenen Bögen und Anzahl der bei der zweidimensionalen IEP erhaltenen Spitzen zwischen einem Gesamtextrakt von Schistosoma mansoni und den Immunseren-Anti-Zielaniigen. *+ Menge der im Bereich der ausfällenden Systeme auftretenden enzymatischen Aktivität, erhalten zwischen dem Gesamtextrakt von Schistosomen und den Immunseren-Anti-Zielantigenen.
"+ Lokalisierung der Zielantigene. erreicht mit den unterschiedlichen Immunseren-Anti-Zielantigenen.
2. Immunobiologische Untersuchung
a) Untersuchung der immunologischen Erscheinungen bei immunisierten Ratten
In vitro-Untersuchungen der Cytotoxizität von Seren. Die Seren S\ bis 5s wurden getrennt und zum Nachweis ihres letalen Effekts auf die Schistosomen und die Schistosomulen gesammelt
Jeder Versuch wurde als Doppelversuch durchgeführt. Die unterschiedlichen Seren haben überhaupt keinen letalen Effekt auf erwachsene Schistosomen. Die Seren von mit Zielantigenen von Emetin oder Thiosinamin immunisierten Ratten (Ss) bewirkten eine ω Mortalität von 40% bzw. 27.5%. Die befallenen Vergleichstiere und die gesunden Vergleichstiere ergaben nur eine Mortalität von 20% bzw. 7%.
Auszählung der durch LeberpeFfusion erhaltenen Würmer.
Die Anzahl der männlichen, weiblichen und nicht geschlechtsreifen Würmer wurde festgestellt Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt
kaninchen-Immunserum- Immunoelektrophorese (IEP)+ zweidimensional enzymatische Aktivitäten++, Lokalisierung 1
Anti-Zielantigen von die im Bereich der aus der Zielantigene I
klassisch Anzahl fällenden Systeme auftreten bei der Immuno- i
der Spitzen fluoreszenz I
Anzahl 1 !
der Bögen 4
Niridazol 1 Parenchym i
Thiosinamin 3 6 G 6 PDH Coekum i
AlDH I
Kalium-Antimon-tartrat 4 MDH Coekum I
3 G 6 PDH 1
ff-Carboxylesterase I
Natrium-Stibocaptat 3 3 G 6 PDH Coekum S
0 AlDH I
Emetin 1 G 6 PDH Coekum ■>
Amphotalid 0 0 Parenchym
Tabelle II
ίο
Zahl der Würmer männlich weiblich
nicht insgesamt
geschlechtsreif
K(F.t?iroll-Ratten (4)
19,50 ±
16 ± 3,74
2,75 + 1,71 38,25 + 5,38
Ratten, immunisiert mit Zielantigenen von:
Kalium-Antimon-doppeltartrat (4) + 3,25 + 3,20 3 + 2,16 1,25 ± 0,96 7,5G + 5,07
Amphotalid (4) + 7,50 + 3,32 5,50 ± 5,07 1,75 ± 1,71 14,75 + 9,60
Anmerkungen zu Tabelle II:
Mittelwert (+ Abweichung) der männlichen, weiblichen, nicht geschlechtsreifen Würmer und der Gesamtzahl, gesammelt durch Leberperfusion von mit unterschiedlichen Zielantigenen immunisierten und 22 Tage zuvor befallenen Ratten.
+ Anzahl der Tiere.
Die Anzahl der Würmer bei Medikamenten-Vergleichsmäusen ist nicht signifikant verschieden von der Anzahl der Würmer bei Vergleichsmäusen. Der Test nach Student zeigt keine signifikant unterschiedlichen Werte zwischen der Anzahl der Würmer bei immunisierten Mäusen und der bei Vergleichsmäusen.
c) Untersuchung der biologischen Erscheinungen bei den einer passiven Übertragung von Antikörpern unterworfenen Mäusen
Der Test nach -S'.udenU der nash Kontrolle der Ausdehnung anwendbar ist, ermöglicht die Sammlung von hochsignifikanten Werten für die Verminderung der Anzahl der Würmer bei den Ratten, welche mit den Zielantigenen von KaÜum-Antimontartrat oder Amphotalid immunisiert wurden; t — 8,32; ddt — 6; ρ < 0,001 und t = 4,26; ddl = 6;p < 0,05.
25
b) Untersuchung von biologischen Erscheinungen bei immunisierten Mäusen
Die Anzahl der durch Leberperfusion gesammelten Die Anzahl der männlichen und weiblichen Würmer
männlichen und weiblichen Würmer wurde festgestellt. 30 ist in Tabelle III zusammengestellt.
Tabelle III
Anzahl der Würmer
männlich weiblich
insgesamt
Vergleichsmäuse, welche Serum von gesunden Kaninchen 10,60 + 7,80 11 + 10,77 21,60 + 17,81
erhielten (5) +
Mäuse, welche Immunserum von Anti-Zielantigen von Kaninchen erhielten
Thiosinamin (4) 5,75 ±4,27 7,75 ±9,54 13,50 ±13,72
Kalium-Antimon-tartrat (3) 3,67 ±4,04 3,61 ±5 8,67 ±7,51
Natrium-Stibocaptat (6) 4,50 ± 5,50 3,83 ± 3,71 8,33 ± 8,69
Emetin (7) 2 ±3,61 1,43+2,51 3,43+6,11
Anmerkungen zu Tabelle III:
Mittelwert (± Standardabweichung) der männlichen und weiblichen Würmer sowie der Gesamtwürmer bei Mäusen, welche
das Immunserum-Anti-Zielantigen der Medikamente erhalten hatten.
+ Anzahl der Tiere.
Der Test nach Student zeigt hoch signifikante Unterschiede zwischen der Anzahl der Würmer bei Vergleichsmäusen und der bei Mäusen, die das
Kaninchen-Immunserum-Anti-Zielantigen von Emetinerhalten hatten.
f = 2,59;ddl= 10;p < 0,001.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen eines antischistosomen immunologischen Mittels aus einem Gesamtextrakt von Antigenen aus tierischen oder menschlichen Schistosomen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gesamtextrakt mit gegen Schistosomen wirkenden Medikamenten wie Niridazol, Thiosinamin, Natrium-Stibocaptat, Emetinhydrochlorid, Amphotalid oder Katium-Antimontartrat, die als immobilisierte oder nicht-immobilisierte Liganden dienen, über Affinitätschromatographie reagieren läßt und die dabei gebildeten Zielantigene von dem Extrakt abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden an einem unlöslichen Träger auf der Basis von Agarose über eine Kupplungsreaktion immobilisiert und die an den Liganden gebundenen Zielantigene durch übliche Elutionsmiitei "vorn Träger trennt
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden als übersättigte Lösung einsetzt, wobei die Zielantigene auf dem unlöslich zurückgebliebenen Liganden fixier* werden, den die Zielantigene tragenden Liganden abtrennt und gegebenenfalls in einem geeigneten Lösungsmittel suspendier1..
4. Antischistosomes immunologiscljes Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nach Anspruch 1 bis 3 hergestellten Zielantigenen.
DE2728802A 1976-06-29 1977-06-27 Verfahren zum Herstellen eines antischistosomen immunologischen Mittels Expired DE2728802C2 (de)

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FR7620687A FR2356428A1 (fr) 1976-06-29 1976-06-29 Procede de preparation d'un agent immunologique antiparasitaire, produit obtenu et son application

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DE2728802A1 DE2728802A1 (de) 1978-01-05
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DE2728802A Expired DE2728802C2 (de) 1976-06-29 1977-06-27 Verfahren zum Herstellen eines antischistosomen immunologischen Mittels

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