DE69030383T2

DE69030383T2 - Impfstoff-Konjugate zur Behandlung von Vogelkrankheiten

Info

Publication number: DE69030383T2
Application number: DE69030383T
Authority: DE
Inventors: Tommy Fredericksen; James Thaxton; John Thoma; Julius Tyczkowski; Craig Whitfill
Original assignee: University of Arkansas
Current assignee: University of Arkansas
Priority date: 1989-10-02
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 1997-10-23
Anticipated expiration: 2010-10-02
Also published as: AU6755990A; CA2066661C; ATE150976T1; DK0495008T3; IL95867A; ES2158200T3; DK0755684T3; CA2066661A1; AU641958B2; IL95867A0; EP0495008A1; US5871748A; EP0495008A4; EP0755684A1; US5397569A; US6136319A; US6299874B1; DE69033728T2; DE69030383D1; WO1991004749A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Impfstoff-Konjugat, das einen lebenden Virus und einen neutralisierenden Antikörper oder ein Fragment davon umfaßt, sowie dessen Verwendung zum Hervorrufen einer aktiven Immunität bei Vögeln.
Gyles et al., 47 Poultry Sci. 430 (1968), und Gyles und Brown, 50 Poultry Sci. 901 (1971), stellten fest, daß die Rückbildung von durch den Rous Sarcoma-Virus (RSV) hervorgerufenen Tumoren bei Küken der Arkansas-Progressorlinie und der Arkansas Regressorlinie unter genetischer Kontrolle steht. Whitfill et al., 61 Poultry Sci. 1573 (1982), berichtete von einer Fraktion mit geringem Molekulargewicht, die durch Gelpermeationschromatographie von Arkansas-Regressorkükensera isoliert wurde. Die aktive Fraktion mit geringem Molekulargewicht wurde als Virusneutralisierungsfaktor (VNF) mit geringem Molekulargewicht bezeichnet. Siehe Whitfill et al., 17 Immunogenetics 387 (1983).
Gyles und Whitfill, Annual Report of Project Contributions to NE-60 (Okt. 1986), berichteten danach, daß der VNF den Rous Sarcoma-Virus und den die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus neutralisiert, wenn er in Kombination damit an neun Tage alte SPAFAS-Ei-Embryos verabreicht wird, wie durch Chorionallantoismembranpustelbildung gemessen wurde. Später berichteten Gyles und Whitfill, Annual Report of Project Contributions to NE-60 (Okt. 1987), daß der VNF den die infektiöse Schleimbeutelerkrankung auslösenden Virus (IBDV) und den infektiösen Bronchitis-Virus (IBV) neutralisiert, wenn er in Kombination damit an neun Tage alte SPAFAS-Ei-Embryos verabreicht wird, und antimikrobielle Aktivität aufweist. Bisher wurde nicht darauf hingewiesen, daß VNF ein virusneutralisierender Antikörper ist.
Virusneutralisierende Antikörper sind Antikörper, welche die Infektivität eines Virus neutralisieren können, wenn der Virus und die Antikörper über einen ausreichend langen Zeitraum miteinander reagieren können. Ein solches Verfahren wird im Verlauf der Durchführung eines Neutralisierungstests ausgeführt. Der Neutralisierungstest, der die erste Technik war, die für den Nachweis von Antikörpern gegen ein Virus in Serum verwendet wurde, kann im Prinzip mit jedem Virus durchgeführt werden. Siehe allgemein: Handbook of Experimental Immunology, 37.9 (D.M. Weir Hrsg., 2. Auflage, 1973) (Blackwell Scientific Publications).
N. Phillips, 33 Vira. Agr. (Lima E. sum.) 111 (1956) (Zusammengefaßt in J. Vasington et al., 39 Poultry Sci. 1418, 1419 (1960)) untersuchte in dem Bemühen, eine spontane und anhaltende Immunität gegen den die Newcastle- Erkrankung auslösenden Virus bei Vögeln hervorzurufen, die Wirkung von Plasma und Dotter in Kombination mit einem lebenden Virus. Das Plasma wurde von Vögeln erhalten, die einen natürlichen Ausbruch der Erkrankung überlebt hatten, und der Dotter wurde von Eiern erhalten, die von denselben Vögeln gelegt worden waren. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, daß alle Küken, die eine gleichzeitige Impfung der Plasma-Dotter-Mischung und des Virus erhielten, und jene, die den Virus zwei Tage später erhielten, die Belastung mit der künstlichen Beimpfung überlebten.
J. Vasington et al., 39 Poultry Sci. 1418 (1960), untersuchten die Schutzwirkung des Immunserums von die Newcastle-Erkrankung auslösendem Virus und Gammaglobulin gegen eine Belastung mit dem die Newcastle-Erkrankung auslösendem Virus an 4 bis 5 Wochen alten Küken. Die Belastung wurde gleichzeitig mit oder anschließend an die Verabreichung des Immunserums oder Gammaglobulins durchgeführt. Es zeigte sich, daß die gleichzeitige Verabreichung von NDV und Gammaglobulin an einen Vogel den Vogel vor dem Tod schützte, aber zu keiner aktiven Immunität führte. Siehe Id., 1424 Tabelle 4 und begleitenden Text. Es wird nicht vorgeschlagen, den Virus und den Antikörper als Komplex zu verabreichen.
H. Stone und W. Boney, 128 P.S.E.B. Med. 525 (1968), berichten von der Impfung von 1-2 Tage alten Küken gegen den die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus mit einem Impfstoff, der chemisch inaktiviertes Virus-Antigen in Form eines Antigen-Antikörper-Komplexes, freien homologen Antikörper und ein Aluminium-Hydroxid-Adjuvans enthält. Die Komplexbildung des Antigens mit dem inaktivierten Virus führte zu keinem verstärkten Schutz gegen die Belastung, siehe Id. 528, und die Daten zeigten, daß die Verwendung eines Adjuvans für die Ergebnisse kritisch war.
D. Higgins, 14 Avian Diseases 579, 585 (1970), stellt fest, daß die Gegenwart mütterlicher neutralisierender Antikörper im Dotter von Eiern von Hennen, die gegen den die Newcast le-Erkrankung auslösenden Virus (NDV) immun sind, allgemein bekannt ist. Higgins behauptet, daß, wenn der Antikörper- Antigen-Komplex, der nach der Dottersackbeimpfung mit NDV gebildet wird, durch die embryonische Gewebe vor dem Schlüpfen diffundiert, wie dies bei nicht kombinierten Dottersackantikörpern der Fall ist, und in dem neonatalen Küken fortbesteht, er später die aktive Anti-NDV-Immunität stimulieren kann. Higgins legt nicht nahe, daß neutralisierende Antikörper mit einem lebenden Virus zu einem Komplex gebildet werden, um diesen Virus abzuschwächen, und der Komplex dann als Impfstoff verabreicht wird.
Platt et al., US-A-4.493.825 offenbaren einen Impfstoffkomplex, der ein Immunisierungsmittel mit einem daran gebundenen Antikörper umfaßt, wobei an den Antikörper wiederum ein Mikropartikel gebunden ist. Pathogene Mikroorganismen, ein vollständiger Virus und antigene Proteine werden als Immunisierungsmittel vorgeschlagen. Die Autoren behaupten, daß die Möglichkeit, solche Komplexe als Impfstoffe zu verwenden, überraschend ist, da davon ausgegangen wurde, daß die Immunisierungsaktivität des antigenen Proteins durch die Antikörperbindung gestört wird. Siehe Col. 2, Zeile 14-17. Die Autoren legen nicht nahe, daß ihr Impfstoff ohne den Einschluß des Mikropartikels funktionsfähig ist, schlagen nicht vor, daß neutralisierende Antikörper verwendet werden, schlagen nicht vor, daß ein lebender Virus, der eine Erkrankung auslösen kann (d.h. ein pathogener) verwendet werden kann, behaupten nicht, daß die Konjugation eines Antikörpers mit einem lebenden Virus ein Individuum vor einer Infektion durch diesen lebenden Virus schützt, und schlagen nicht vor, daß ein neutralisierender Antikörper verwendet werden sollte, um einen Schutz vor einer Infektion durch einen pathogenen lebenden Virus zu erreichen, wenn ein pathogener lebender Virus als Immunisierungsmittel verwendet wird.
K. Fahey et al., 70 J. Gen. Virol. (1989) offenbaren einen virusneutralisierenden Antikörper gegen IBDV. Der Antikörper, der ursprünglich monoklonal war, wurde zur Trennung eines Strukturproteins von löslich gemachten Viruspartikeln zur Entwicklung eines Spaltimpfstoffes für IBDV verwendet. Es wird nicht vorgeschlagen, daß der virusneutralisierende Antikörper ein Individuum vor IBDV schützt, so daß der IBDV mit dem daran gebundenen neutralisierenden Antikörper als lebender Impfstoff verabreicht werden kann.
DE-B-1041214 offenbart die Zubereitung von Haptophoren oder prosthetischen Gruppen (Antikörperfragmenten) durch hydrolytische Behandlung von Antiserum. Diese Antikörperfragmente werden mit einem Virus zur Bildung eines inaktiven oder deaktivierten Antikörperkomplexes vermischt. Die Pathogenität muß von dem Komplex vor dessen Verwendung entfernt werden und er muß nach der Injektion in das Tier vollständig neutralisiert bleiben.
Die vorliegende Erfindung besteht in der Verwendung eines konjugierten Impfstoffes zur Herstellung eines Medikamentes, mit dem eine aktive Immunität gegen eine Viruserkrankung eines Vogels hervorgerufen wird, wobei der konjugierte Impfstoff umfaßt:
einen Impfvirus, bestehend aus einem lebenden Vogelvirus, der diese Erkrankung in dem Vogel bewirken und der eine aktive Immunreaktion daraufin dem Vogel hervorrufen kann; und
einen an diesen Impfvirus gebundenen neutralisierenden Faktor in Form eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments, der den Virus neutralisieren kann, wobei der konjugierte Impfstoff zunächst den Vogel gegen eine Infektion durch den Impfvirus schützt;
der konjugierte Impfstoff anschließend dem Impfvirus ermöglicht, eine aktive Immunität gegen einen weiteren Angriff durch den Virus zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung beruht auf unseren anhaltenden Bemühungen, den virusneutralisierenden Faktor (VNF) zu charakterisieren. Während dieser Forschungsarbeit erwies sich die aktive Komponente früherer Zubereitungen von VNF überraschenderweise als eine Kontamination mit höherem Molekulargewicht in diesen Zubereitungen mit im allgemeinen geringerem Molekulargewicht. Insbesondere erwies sich der VNF als ein virusneutralisierender Antikörper. Diese Erkenntnis ermöglicht neue Verwendungen von virusneutralisierenden Antikörpern und Fragmenten davon in der Herstellung von lebenden abgeschwächten Virusimpfstoffen. Angesichts der Tendenz mütterlicher Antikörper in Küken, die Entwicklung einer aktiven Immunität gegenüber einer Belastung mit einem lebenden Virus störend zu beeinflussen, siehe P. Abdu et al., Worlds Poultry Science V, 42, 219, (1968); P. Sharma et al., Zootecnica International, 51 (Juni 1989), sind diese Ergebnisse besonders unerwartet.
Die Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann daher zur Erzeugung einer aktiven Immunität gegen eine Viruserkrankung bei Vögeln verwendet werden. Das Impfstoff-Konjugat wird in einer wirksamen Menge zur Erzeugung einer Immunreaktion gegen den lebenden Virus in Vögeln verabreicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein befruchtetes Vogelei bereitgestellt, in dem eine pharmazeutisch geeignete Substanz deponiert ist, die einen konjugierten Impfstoff, mit dem eine aktive Immunität gegen ein Viruserkrankung des Vogels hervorgerufen wird, umfaßt, wobei der konjugierte Impfstoff umfaßt:
einen Impfvirus, bestehend aus einem lebenden Vogelvirus, der diese Erkrankung in dem Vogel bewirken und der eine aktive Immunreaktion daraufin dem Vogel hervorrufen kann; und
einen an diesen Impfvirus gebundenen neutralisierenden Faktor in Form eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments, der den Virus neutralisieren kann, wobei der konjugierte Impfstoff zunächst den Vogel gegen eine Infektion durch den Impfvirus schützt;
wobei der konjugierte Impfstoff in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um es dem Impfvirus zu ermöglichen, eine aktive Immunität gegen einen weiteren Angriff durch den Virus zu stimulieren.
Es werden nun bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
Figur 1, 2 und 3 schematisch die verschiedenen Zubereitungen von Kükensera der Arkansas-Regressorlinie zeigen, die für die Reinigung des VNF und die Bestimmung der relativen VNF-Aktivitäten verwendet wurden.
Figur 4 das Elutionsprofil der ≥ 50k Serumkomponente von Kükensera der Arkansas-Regressorlinie durch TSK-Chromatographie zeigt.
Figur 5 das Elutionsprofil der Peak I-Komponente von der TSK-Chromatographiezeigt, die in Figur 4 dargestellt ist.
Figur 6 das Elutionsprofil der Peak II-Komponente von der TSK-chromatographie zeigt, die in Figur 4 dargestellt ist.
Figur 7 das Elutionsprofil der Peak III-Komponente von der TSK-Chromatographie zeigt, die in Figur 4 dargestellt ist.
Figur 8 das Elutionsprofil der ≥ 100k Serumkomponente von Kükensera der Arkansas-Regressorlinie durch TSK-Chromatographie zeigt.
Figur 9 bis 11 die zunehmende Reinigung von VNF zeigen, die durch die erste, zweite und dritte Kreislaufführung der Peak II-Komponente, die in Figur 8 dargestellt ist, durch eine TSK-Chromatographiesäule erreicht wurde.
Figur 12 durch TSK-Chromatographie die Reinheit von VNF zeigt, der durch frühere Techniken hergestellt wurde.
Antikörper, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind virusneutralisierende Antikörper. Virusneutralisierende Antikörper sind jene, welche die Infektivität eines Virus in vitro bekämpfen, wenn der Virus und die Antikörper über eine ausreichend lange Zeit miteinander reagieren können. Die Quelle des virusneutralisierenden Antikörpers ist nicht kritisch. Sie können von jedem Vogel stammen, z.B. vom Huhn und Truthahn. Die virusneutralisierenden Antikörper können polyklonalen oder monoklonalen Ursprungs sein. Siehe, z.B., D. Yelton und M. Scharff, 68 American Scientist 510 (1980). Die Antikörper können chimär sein. Siehe, z.B., M. Walker et al., 26 Molekular Immunology 403 (1989). Die Antikörper können von jener Art sein, die bisher als virusneutralisierender Faktor (VNF) bekannt war. Siehe, z.B., Gyles und Whitfill, supra. VNF, der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann vom Wildhuhn (Gallus gallus) und von Vogelstämmen erhalten werden, die von Gallus gallus abstammen, die imstande sind, VNF zu produzieren. Beispielhaft für solche abgeleiteten Stämme ist die Arkansas-Regressorhühnerlinie. Unter anderem können Vögel durch das International Registry of Poultry Genetics Stocks, Bulletin Nr. 476, Agriculture Publication Nr. U-351376 (erhältlich von der University of Connecticut, Storrs, Connecticut) ausfindig gemacht werden.
Virusneutralisierende Antikörper, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Immunglobuline von jedem Isotyp sein, einschließlich IgM-, IgG-, IgA-, IgD- und IgE-Immunglobuline. IgG und IgM sind stärker bevorzugt und IgG-Immunglobuline (z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) sind besonders bevorzugt.
Antikörperfragmente, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Fragmente von virusneutralisierenden Antikörpern, welche deren Bindungsstelle der variablen Region beibehalten. Beispielhaft sind F(ab')&sub2;-Fragmente, F(ab')-Fragmente und Fab-Fragmente. Siehe allgemein: Immunology: Basic Processes, 95-97 (J. Bellanti Hrsg., 2. Aufl., 1985).
Antikörper oder Antikörperfragmente, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können mit zusätzlichen Elementen verbunden sein. Zum Beispiel kann eine Mikrokugel oder ein Mikropartikel mit dem Antikörper oder Antikörperfragment verbunden sein, wie in US-A- 4.493.825 beschrieben ist.
Die vorliegenden Erfindung verwendet Viren, die in dem behandelten Individuum pathogen wären (d.h., imstande, eine Erkrankung hervorzurufen), wenn sie nicht an den neutralisierenden Faktor gebunden wären. Die Pathogenität des Virus kann in dem Virus selbst inhärent sein (z.B. ein Virus wie der infektiöse Virus der Schleimbeutelerkrankung, der schwierig abzuschwächen ist) oder auf die Anfälligkeit des zu behandelnden Individuums zurückzuführen sein (z.B. Vögel in ovo). Im allgemeinen haben viele pathogene Viren die positive Wirkung, eine aktive Immunität bei infizierten Individuen hervorzurufen, und viele abgeschwächte Impfvirusstämme haben die Fähigkeit, zumindest eine gewisse Erkrankung bei Individuen auszulösen. Somit bedeutet der Begriff "pathogen", wie hierin zur Beschreibung von Viren verwendet, daß der Schaden, der Individuen durch die Verabreichung des Virus zugefügt wird, jeden Nutzen überwiegt, der sich daraus ergäbe. Es wird bevorzugt, daß der Virus einer ist, der zur Auslösung einer aktiven Immunreaktion in dem behandelten Individuum imstande ist.
Das Impfstoff-Konjugat ist in den Impfstofformulierungen in einer Menge pro Einheitsdosis vorhanden, die zur Auslösung einer aktiven Immunreaktion gegen den Virus in dem zu behandelnden Individuum ausreicht. Der Begriff "Immunreaktion", wie hierin verwendet, bezeichnet jedes Maß an Schutz vor einer anschließenden Virus-Exposition, das von einem gewissen Nutzen in einer Population von Individuen ist, sei es in der Form einer verringerten Mortalität, von verringerten Läsionsraten, verbesserten Futterverwertungsverhältnissen oder in Form der Verringerung von anderen schädlichen Auswirkungen der Erkrankung, unabhängig davon, ob der Schutz teilweise oder vollständig ist.
In bezug auf das Ausmaß des Schutzes, das durch den Neutralisierungsfaktor geboten wird, muß die Menge des in Kombination mit dem Virus verabreichten Neutralisierungsfaktors in dem Impfstoff nicht ausreichend sein, um einen vollständig Schutz gegen den Virus zu bieten, solange die schädliche Reaktion, die durch den Virus hervorgerufen wird, auf ein Maß verringert wird, bei dem die Nutzen der erzeugten Immunreaktion jeden Schaden überwiegen, der durch die Infektion entsteht. Vorzugsweise werden in bezug auf den an Vögel verabreichten VNF den Vögeln zwischen 10 und 1000 Aktivitätseinheiten pro Dosis Impfstoff-Konjugat verabreicht. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden so gemischt, daß sie diese Mengen an VNF pro Einheitsdosis enthalten.
Viren, die mit dem neutralisierenden Faktor zur Bildung eines Impfstoffes vermischt werden können, umfassen den Rous Sarcoma Virus, den die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus, den die infektiöse Schleimbeutelerkrankung auslösenden Virus und den die infektiöse Bronchitis auslösenden Virus.
Der Begriff "infektiöser Virus der Schleimbeutelerkrankung" (IBDV), wie hierin verwendet, umfaßt alle Stämme von IBDV. Beispielhaft sind der lebende Lukert-Stamm-Impfvirus der Schleimbeutelerkrankung, der entweder von Vineland Laboratones in Vineland, New Jersey oder Salsbury Laboratories in Charles City, Iowa erhältlich ist, der virulente Belastungsvirus der Schleimbeutelerkrankung, der von U.S.D.A. in Ames, Iowa (Originalisolat von S.A. Edgar) erhältlich ist, und der infektiöse Virusstamm VR2161 der Schleimbeutelerkrankung, der in U.S. Patent Nr. 4.824.668 an Melchior und Melson offenbart ist.
Der Begriff "Rous Sarcoma-Virus" (RSV), wie hierin verwendet, umfaßt alle RSV-Stämme. RSV wurde seit seiner Entdekkung zu Beginn dieses Jahrhunderts eingehend untersucht. Siehe allgemein: 1 RNA Tumor Viruses: Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. Auflage, 59-61 (R. Weiss, N. Teich, H. Varmus und J. Coffin, Hrsg., 1984). Eine Testtechnik für den Rous Sarcoma-Virus wird in Brit. J. Exptl. Med., 99:183 berichtet. Moloney, J. Nat. Cancer Inst., 16:877, berichtet von der Entwicklung von Standardchargen des Virus zur Verwendung in quantitativen Untersuchungen. Siehe auch: U.S. Patent Nr. 3.326.767 an Holper und Kiggins. Zahlreiche Rous Sarcoma-Stämme sind in dem ATCC Catalogue of Animal and Plant Viruses, Chlamydiae, Rickettsiae and Virus Antisera (5. Auflage, 1986) auf Seite 110-112 angeführt.
Der Begriff "infektiöser Bronchitis-Virus" (IBV), wie hierin verwendet, umfaßt alle IBV-Stämme. Beispielhaft sind der Mass. 41 Stamm, Arkansas 99 Stamm, Connecticut A5968 und Michigan State University Repository Code 42 Stamm, die alle von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich sind. Der Begriff "die Newcastle- Erkrankung auslösender Virus" umfaßt alle Stämme des die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus.
Der Begriff "Vogel" wie hierin verwendet, soll alle Männchen oder Weibchen jeder Vogelart umfassen, soll aber in erster Linie Geflügel umfassen, das kommerziell für Eier oder Fleisch gezüchtet wird. Daher soll der Begriff "Vogel" insbesondere Hennen, Hähne und männliche Küken, Truthähne, Enten, Gänse, Wachteln und Fasane umfassen.
Den Vögeln können Impfstoffe der vorliegenden Erfindung durch jedes geeignete Mittel verabreicht werden. Zum Beispiel durch orale Verabreichung, durch intramuskuläre Injektion, durch subkutane Injektion, durch intravenöse Injektion, durch intraperitoneale Injektion, durch Augentropfen oder durch Nasenspray.
Der Vogel kann ein geschlüpfter Vogel, einschließlich eines frisch geschlüpften Vogels, sein (d.h. etwa die ersten drei Tage nach dem Schlüpfen), ein Jungtier und ein erwachsener Vogel sein. Den Vögeln kann der Impfstoff in ovo verabreicht werden, wie in U.S. Patent Nr. 4.458.630 an Sharma beschrieben ist.
Die in ovo Verabreichung des Impfstoffes beinhaltet die Verabreichung des Impfstoffes an Eier. Eier, welchen der Impfstoff der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, sind fruchtbare Eier, die sich vorzugsweise im vierten Viertel der Inkubation befinden. Hühnereier werden an etwa dem fünfzehnten bis neunzehnten Tag der Inkubation behandelt und werden vorzugsweise an etwa dem achtzehnten Tag der Inkubation behandelt (dem achtzehnten Tag der embryonalen Entwicklung). Truthahneier werden vorzugsweise an etwa dem einundzwanzigsten bis sechsundzwanzigsten Tag der Inkubation behandelt und werden insbesondere an etwa dem fünfundzwanzigsten Tag der Inkubation behandelt.
Den Eiern kann der Impfstoff der Erfindung durch jedes Mittel verabreicht werden, das die Verbindung durch die Schale transportiert. Das bevorzugte Verfahren der Verabreichung ist jedoch durch Injektion. Die Injektionsstelle liegt vorzugsweise innerhalb des Bereichs, der durch das Amnion, einschließlich der Amnionflüssigkeit und dem Embryo selbst definiert wird, im Dottersack oder in der Luftkammer. Insbesondere wird die Injektion in den Bereich verabreicht, der durch das Amnion definiert wird. Mit dem Beginn des vierten Viertels der Inkubation ist das Amnion ausreichend vergrößert, so daß dessen Penetration nahezu jederzeit garantiert ist, wenn die Injektion von der Mitte des großen Endes des Eis entlang der Längsachse erfolgt.
Der Mechanismus der Eiinjektion ist nicht kritisch, aber es wird bevorzugt, daß das Verfahren die Gewebe und Organe des Embryos oder der umgebenden Fetalmembrane nicht ungebührlich beschädigt, so daß die Behandlung die Schlüpfrate nicht verringert. Eine Injektionsspritze, die mit einer Nadel der Stärke 18 bis 22 ausgestattet ist, ist für den Zweck geeignet. Zur Injektion in die Luftkammer muß die Nadel nur etwa zwei Millimeter in das Ei eingeführt werden. Eine 2,5 cm (ein Inch) Nadel durchdringt die Schale, die äußeren und inneren Schalenmembrane, welche die Luftkammer umgeben, und das Amnion, wenn sie von der Mitte des großen Endes des Eis vollständig eingeführt wird. Abhängig von der exakten Entwicklungsstufe und der Position des Embryos endet eine Nadel dieser Länge entweder in der Flüssigkeit über dem Küken oder in dem Küken selbst. Es kann ein Probeloch durch die Schale gestanzt oder gebohrt werden, bevor die Nadel eingesetzt wird, um eine Beschädigung oder Abstumpfung der Nadel zu verhindern. Falls erwünscht, kann das Ei mit einem im wesentlichen bakterienundurchlässigen Abdichtungsmaterial wie Wachs oder dergleichen abgedichtet werden, um ein anschließendes Eindringen von unerwünschten Bakterien zu verhindern.
Es angenommen, daß ein automatisiertes Hochgeschwindigkeits-Eiinjektionssystem für Vogelembryos besonders zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Es sind zahlreiche derartige Vorrichtungen verfügbar, wie zum Beispiel jene, die in U.S. Patent Nr. 4.681.063 an Hebrank und U.S. Patent Nr. 4.040.388, 4.469.047 und 4.593.646 an Miller offenbart sind. Alle derartigen Vorrichtungen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen einen Injektor, der den hierin beschriebenen Impfstoff enthält, wobei der Injektor zur Injektion eines Eis, das von der Vorrichtung getragen wird, mit dem Impfstoff angeordnet ist. Andere Merkmale der Vorrichtung wurden zuvor besprochen. Falls erwünscht, kann zusätzlich eine Abdichtungsvorrichtung, die funktionsfähig mit der Injektionsvorrichtung verbunden ist, zum Abdichten des Lochs in dem Ei nach der Injektion vorgesehen sein.
Eine bevorzugte Eiinjektionsvorrichtung zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist in U.S. Patent Nr. 4.681.063 und 4.903.635 an Hebrank offenbart. Diese Vorrichtung umfaßt eine Injektionsvorrichtung zur Abgabe flüssiger Substanzen in eine Mehrzahl von Eiern und eine Saugvorrichtung, die gleichzeitig eine Mehrzahl einzelner Eier an ihren nach oben weisenden Teilen erfaßt und anhebt und mit dem Injektionsmittel zur Injektion der Eier, während die Eier von der Saugvorrichtung erfaßt sind, zusammenarbeitet. Die Merkmale dieser Vorrichtung können mit den Merkmalen der zuvor beschriebenen Vorrichtung zur Durchführung der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.
Ein Verfahren zur Verwendung des Medikamentes der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise an Vögeln in ovo ausgeführt werden. Ein bevorzugter Virus zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist der infektiöse Virus der Schleimbeutelerkrankung.
Ein Impfstoff-Konjugat der vorliegenden Erfindung wird durch Vermischen des neutralisierenden Faktors mit einem lebenden Virus in einem pharmazeutisch geeigneten Träger über eine ausreichende Zeit zur Bildung eines Lebendvirus- Neutralisierungsfaktor-Konjugates hergestellt (zum Beispiel durch Kombinieren des neutralisierenden Faktors und des Virus in einem gemeinsamen flüssigen Träger über mindestens eine Stunde vor der Verabreichung an ein Individuum). Dies kann vorteilhaft durch einfaches Zusetzen hyperimmuner Sera, die VNF enthalten, zu einer wässerigen Lösung erfolgen, die den lebenden Virus erhält. Impfstofformuiierungen der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise das Impfstoff-Konjugat in lyophilisierter Form oder das Impfstoff- Konjugat in einem pharmazeutisch geeigneten Träger. Pharmazeutisch geeignete Träger sind vorzugsweise flüssige, insbesondere wässerige, Träger. Für den Zweck der Herstellung solcher Impfstofformulierungen können der neutralisierende Faktor und der Virus in natriumphosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder herkömmlichen Medien, wie MEM, vermischt werden. Die Impfstofformulierung kann in einem sterilen Glasbehälter gelagert werden, der mit einem Gummistopfen verschlossen ist, durch welchen Flüssigkeiten injiziert und die Formulierung mit einer Spritze herausgezogen werden kann.
Impfstofformulierungen der vorliegenden Erfindung können wahlweise ein oder mehr Adjuvantien enthalten. Jedes geeignet Adjuvans kann verwendet werden, einschließlich chemischer und Polypeptid-Immunstimulantien, welche die Reaktion des Immunsystems auf Antigene verstärken. Vorzugsweise werden Adjuvantien wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, pflanzliche und tierische Öle und dergleichen mit dem Impfstoff-Konjugat in einer ausreichenden Menge zur Verstärkung der Immunreaktion des Individuums auf das Impfstoff-Konjugat verabreicht. Die Menge des zugesetzten Adjuvans zu dem Impfstoff-Konjugat ist abhängig von der Art des Adjuvans unterschiedlich und liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 mal dem Gewicht des Virus, vorzugsweise von 1 bis 10 mal dem Gewicht des Virus.
Die Impfstofformulierungen der vorliegenden Erfindung können wahlweise einen oder mehr Stabilisatoren enthalten. Es kann jeder geeignete Stabilisator verwendet werden, einschließlich Kohlenhydrate wie Sorbitol, Manitol, Stärke, Sucrose, Dextrin oder Glucose; Proteine wie Albumin oder Casein; und Puffer wie Alkalimetallphosphat und dergleichen. Die Verwendung eines Stabilisators ist besonders vorteilhaft, wenn die Impfstofformulierung eine lyophilisierte Formulierung ist.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung kann in einem Verfahren zur Erzeugung einer aktiven Immunität gegen den die infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung in einem Vogel verwendet werden, durch Verabreichung eines Impfstoff-Konjugats, welches den lebenden, infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung und einen neutralisierenden Faktor, der an den lebenden Virus gebunden ist, enthält, an das Individuum in einem Zeitraum im Bereich von etwa dem letzten Viertel der in ovo Inkubation bis etwa zu den ersten drei Tagen nach dem Schlüpfen. Der neutralisierende Faktor ist vorzugsweise ein IgG-Immunglobulin oder ein IgG- Immunglobulinfragment und ist imstande, den lebenden Virus zu neutralisieren. Das Impfstoff-Konjugat wird in einer wirksamen Menge verabreicht, um eine aktive Immunität gegen den infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung in dem Individuum zu erzeugen. In einem besonderen Beispiel wird hyperimmunes Serum von Küken, das gegen den infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung zubereitet ist, in den in den folgenden Beispielen beschriebenen Anteilen gemischt, um ein Konjugat zu bilden (z.B. 22 EID&sub5;&sub0;s Virus mit 136 Einheiten pro 50 µl hyperimmunem Serum; 2,2 EID&sub5;&sub0;s Virus mit 338 Einheiten pro 50 µl hyperimmunem Serum). Der Virus ist IBD-BLEN infektiöser Schleimbeutelerkrankungs-Virus- Impfstoff, erhältlich von Sanofi Animal Health, Berlin, Maryland, USA, Tel. (301) 641-2060. Das Konjugat wird dann bis zur Trockenheit als Endimpfstoffprodukt in einer Ampulle lyophilisiert und gelagert. Zur Verwendung wird das Impfstoff-Konjugat in einem Verdünnungsmittel wieder aufgelöst und 100 Mikroliter pro Dosis werden subkutan in den Hals des kükens während der normalen Behandlung nach dem Schlüpfen injiziert (für gewöhnlich am Tag 1 oder 2 nach dem Schlüpfen).
Ein weiteres beispielhaftes Medikament der vorliegenden Erfindung kann in einem Verfahren zur Erzeugung einer aktiven Immunität gegen den die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus in einem Vogel verwendet werden, durch Verabreichung eines Impfstoff-Konjugats, welches den lebenden, die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus und einen neutralisierenden Faktor, der an den lebenden Virus gebunden ist, enthält, an das Individuum über einen Zeitraum im Bereich von etwa dem letzten Viertel der in ovo Inkubation bis etwa zu den ersten drei Tagen nach dem Schlüpfen. Der neutralisierende Faktor wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgG-Immunglobulinen und IgG-Immunglobulinfragmenten und ist imstande, den lebenden Virus zu neutralisieren. Das Impfstoff-Konjugat wird in einer wirksamen Menge verabreicht, um eine aktive Immunität gegen den die Newcastle-Erkrankung auslösenden Virus in dem Individuum zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben. Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung anzusehen.

BEISPIEL 1

Versuchstiere

Die für die Belastung mit Rous Sarcoma-Virus und die anschließende Serumsammlung verwendeten Vögel waren von der Arkansas-Regressorkükenlinie und der Arkansas-Progressorkükenlinie, die in Gyles et al., 46 Poultry Sci. 465 (1967), beschrieben sind, von welchen Bestände an der Agricultural Research Farm der University of Arkansas, Fayetteville, Arkansas, 72701, gehalten werden.

BEISPIEL 2

Standardimpfmaterial des Rous Sarcoma-Virus

Ein Standardimpfmaterial von RSV-RAV-1, das zur Stimulierung der Herstellung eines antiviralen Faktors in Regressorkükensera verwendet werden sollte, wurde mit einem RSV-RAV-1 Bryan High Titer Strain hergestellt, der als Charge #1 identifiziert wurde, hergestellt für die American Type Culture Collection in Rockviile, Maryland von Dr. John P. Bader, NCI, NIH. Der Titer betrug 2 x 10&sup6; PFU pro Mulliliter und wurde bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert. Die Beimpfung von Vögeln wurde durch Injizieren eines Standardimpfmaterials von 0,1 Milliliter verdünntem RSV-RAV-1 in das linke Flügelgewebe durchgeführt, wie in Whitfill et al., 61 Poultry Sci. 1573 (1981) beschrieben ist.

VERGLEICHSEEISPIEL A

Herstellung von Regressorküken-Hyperimmunsera

Die Aufgabe dieses Beispiels besteht darin, frühere Verfahren zur Herstellung eines Tumorhomogenats von empfänglichen Küken zu Vergleichszwecken darzustellen, die zum Boosten von Regressorküken verwendet wurden, um die Erzeugung eines virusneutralisierenden Faktors von Hyperimmunsera auszulösen. Regressorküken wurden mit einem Standard- RSV-Impfmaterial belastet und nach der vollständigen Tumorregression, die durch das sichtbare Verschwinden von Tumoren gemessen wurde, wurden ihnen mindestens drei Wochen lang einmal wöchentlich ein Standardimpfmaterial eines Rous Sarcoma-Tumorhomogenat-(RSTH)Boosters eingeimpft. Fünf Tage nach der letzten Booster-RSTH-Injektion wurden 20 Milliliter Blut von jedem Küken durch Herzpunktion entnommen und eine Stunde bei Raumtemperatur gerinnen gelassen. Geronnenes Blut wurde mit 3000 x g bei Raumtemperatur in einer Sorvall-Zentrifuge zehn Minuten sedimentiert und Hyperimmunsera wurden entfernt und bei 5ºC gelagert. Dieses Routineverfahren wurde mehrere Wochen bei einer bestimmten Gruppe von Spenderregressorküken fortgesetzt.

VERGLEICHSBEISPIEL B

Vorläufige Reinigung eines antiviralen Faktors mit geringem Molekulargewicht (LMF)

Die Aufgabe dieses Beispiels besteht darin, frühere Techniken zur teilweisen Reinigung des virusneutralisierenden Faktors von einem großen Volumen hyperimmuner Regressorkükensera zu Vergleichszwecken zu zeigen. Etwa 400 Milliliter von Regressorküken-Hyperimmunsera, die nach dem obengenannten Vergleichsbeispiel A hergestellt worden waren, wurden auf eine Sephadex G-25 Feinsäule (8 x 35 Zentimeter) aufgebracht und bei 250 Milliliter pro Stunde mit 0,005M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, eluiert. Von der Säule wurden vier Peaks eluiert und Peak IV, der letzte, der bei 2800 Milliliter eluierte, enthielt die VNF-Aktivität gegen RSV-RAV-1. Es zeigte sich, daß Peak IV RSV-RAV-1 durch Inkubation mit dem Virus mit anschließender Injektion in Flügelgewebe empfänglicher Küken neutralisierte, wie zuvor bei der Sephadex G-100 Fraktion II beschrieben wurde. Siehe Whitfill et al., 61 Poultry Sci. 1573 (1981). Peak IV eluierte für gewöhnlich in einem Gesamtvolumen von 1000 Milliliter Puffer mit 28 Millilitern pro Röhrchen und wurde gefriergetrocknet und bei einer Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter in sterilem destillierten Wasser wieder aufgelöst.

VERGLEICHSBEISPIEL C

Weitere Reinigung von Sephadex G-25 Peak IV unter Verwendung der Biogel P-2 Säulenchromatographie

Die Aufgabe dieses Beispiels besteht darin, frühere Techniken zur weiteren Reinigung und Entsalzung des virusneutralisierenden Faktors von früheren aktiven Vorläuferfraktionen unter Verwendung der Gelfiltrationssäulenchromatographie zu Vergleichszwecken zu zeigen.
Etwa 35 Milliliter von wieder aufgelöstem Sephadex G-25 Peak IV (3500 Milligramm), der laut Beschreibung von Vergleichsbeispiel B erhalten wurde, wurden auf eine Biogel P-2-Säule (5 Zentimeter x 40 Zentimeter) aufgebracht und in destilliertem Wasser bei einer Strömungsrate von 90 Millilitern pro Stunde eluiert. Die antivirale Aktivität gegen RSV-RAV-1 fand sich im ersten Peak (Peak 1), der bei dem Ruheinhalt nach 390 Milliliter mit 14 Millilitern pro Röhrchen eluierte. Dieser Peak 1, der in einem Gesamtvolumen von 100 Millilitern eluierte, wurde bis zur Trokkenheit gefriergetrocknet und die salzfreie Zubereitung wies die stärker gereinigte VNF-Zubereitung auf. Etwa 5-10 Milligramm des weiter gereinigten VNF stammten für gewöhnlich von Peak I der Biogel P-2 Säule. Eine Stammlösung des VNF in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser wurde zu einer Konzentration von 5 Milligramm pro Milliliter vor dem Testen der Aktivität frisch zubereitet.
Eine Aktivitätseinheit für diese Stammlösung wird als die Menge der Aktivität gegen den Rous Sarcoma-Virus in einem Milliliter dieser VNF-Lösung definiert. Ein Milliliter dieser Lösung neutralisiert vollständig 500 Standarddosen des Rous Sarcoma-Virus. Eine Standarddosis des Rous Sarcoma-Virus wird als die Verdünnung des Virus in 100 Mikrolitern definiert, die durchschnittlich 70 Pusteln auf neun Tage alten SPF Embryo-Chorionallantoismembranen am Tag 16 bildet. VNF ist für eine Zubereitung von 7 x 10&sup4; Kükenfibroblasten nicht toxisch, bis ein Dosispegel von 0,1 Aktivltätseinheiten erreicht ist.

BEISPIEL 3

Herstellung von delipidierten Hyperimmunsera der Regressorlinie

Dieses Beispiel zeigt die gegenwärtig bevorzugte Technik zur Herstellung von Regressorküken-Immunsera. Die Sera wurden wie zuvor in Vergleichsbeispiel A beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß geronnenes Blut bei 3000 rpm Minuten zur Entfernung von Teilchensubstanz zentrifugiert wurde und die erhaltenen Sera dann durch einen 5µm, 1,2 µm bzw; 0,45 µm Filter futriert wurden. Schließlich wurde das Serum zur Entfernung des in dem Serum enthaltenen Lipids durch C18-Patronen geleitet.

BEISPIEL 4

Konzentration und Hohl faserfiltration von delipidierten Hyperimmunsera

Eine schematische Übersicht des gegenwärtig bevorzugten Verfahrens zur Reinigung von VNF ist in Figur 1, 2 und 3 dargestellt. Dieses Beispiel liefert zusätzliche Information über die in diesen Figuren beschriebenen Verfahren.
Ein Serum, das nach der obengenannten Beschreibung von Beispiel 3 hergestellt worden war, wird durch einen Spectrum 50k oder 100k Hohlfaserzerteiler (erhältlich von Spectrum, Los Angeles, Kalifornien, USA) zirkuliert und mindestens vierfach für die Fraktion mit einem Molekulargewicht größer 50000 (≥50k Serumkomponente) oder die Fraktion mit einem Molekulargewicht größer 100000 (≥100k Serumkomponente) konzentriert. Entweder die ≥50k Serumkomponente oder die ≥100k Serumkomponente wird auf einer präparativen TSK -Säule nach den im folgenden Beispiel 5 beschriebenen Verfahren weiter fraktioniert, wobei der VNF in dem 150k bis 180k Teil jeder Serumkomponente enthalten ist.

BEISPIEL 5

Trennung von ≥50k oder ≥100k Serumkomponenten auf einer präparativen TSKOR-Säule

Eine präparative Spherogel TSK 2000 SW-Säule, die 21,5 mm mal 60 cm mißt, wird in 3x phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einer Strömungsrate von 8 ml pro Minute laufen gelassen, um die ≥50k Serumkomponente und ≥100k Serumkomponente in die in Figur 4 oder Figur 8 dargestellten Fraktionen zu trennen. Die Peakprozentsätze für Figur 4 und 8 sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 angegeben. Es ist zu beachten, daß der Zeitraum für die Elution der Peaks etwas unterschiedlich ist, abhängig von den Versuchsparametern wie der Verwendung von Vorsäulen und geringen Unterschieden in den Puffern. Durch die Kreislaufführung der ≥50k Fraktionen durch die Säule werden die Peaks I, II oder III teilweise voneinander getrennt. Diese sind in Figur 5 (Peak 1 von Fig. 4 bei 5,89 Minuten), Figur 6 (Peak II von Fig. 4 bei 6,71 Minuten) bzw. Figur 7 (Peak III von Fig. 4 bei 7,86 Minuten) dargestellt. Die virusneutralisierende Aktivität ist nur in Peak II vorhanden, der nachweislich die größte Menge spezifischer Aktivität enthielt. TABELLE 1 TABELLE 2
Figur 8, 9, 10 und 11 zeigen, wie Peak II von Fig. 8 weiter durch fortgesetzte Kreislaufführung durch die TSK -Säule gereinigt wird. Diese Mischung von ungereinigten ≥100k Serumkomponenten wurde anfangs als 5069a bezeichnet, dann nach weiterer Reinigung als 5070a, 5077a und schließlich als 5079a, welches die am stärksten gereinigte Form ist. Wie durch die Figuren dargestellt wird, wird jedesmal, wenn der Peak 11-Abschnitt, der von der TSK-Säule eluiert wird, fraktioniert und im Kreislauf geführt wird, dieser weiter gereinigt und die spezifische Aktivität erhöht. Die Peakprozentsätze für Figur 11 sind in der folgenden Tabelle 3 angeführt. Aktivitätseinheiten für die hochgereinigte IgG- Fraktion, die aktiven VNF enthält, werden wie folgt berechnet. Der ED&sub5;&sub0;-Titer gegen IBDV wird unter Verwendung von Virusneutralisierungstests, wie in der Folge beschrieben, bestimmt. Der ED&sub5;&sub0;-Titer ist die Verdünnung von VNF in 50 µl, die 50% der Zellen vor der Tötung durch den Virus schützt. Berechnungen beruhen auf der willkürlichen Bezeichnung eines ED&sub5;&sub0;-Verdünnungstiters von 1:25 als gleich 1 Aktivitätseinheit. Der tatsächliche ED&sub5;&sub0;-Titer für die besondere VNF-Zubereitung wird dann in Einheiten pro Milliliter und schließlich Einheiten pro Mikrogramm umgewandelt, die als die spezifische Aktivität definiert sind (siehe Beispiele für diese Berechnung in den Tabellen 5-7). TABELLE 3

VERGLEICHSBEISPIEL D

Reinheit des P-2 Peak I aus dem Vergleichs beispiel C durch TSK-Chromatographie

Dieses Beispiel zeigt den Mangel an Reinheit in früheren VNF-Zubereitungen. Eine VNF-Stammlösung, die, wie zuvor in Vergleichsbeispiel C beschrieben, hergestellt worden war, wurde auf eine TSK-Chromatographiesäule, wie zuvor in Beispiel 5 beschrieben, aufgebracht. Das Elutionsprofil ist in Figur 12 dargestellt, und der Prozentgehalt für jeden Peak ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Es ist zu beachten, daß die Fläche in Prozent für IgG nur 18,4% beträgt. Vergleiche diese Tabelle mit Tabelle 3. TABELLE 4

BEISPIEL 6

SDS-PAGE von gereinigten VNE-Fraktionen

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-(SDS-PAGE) Trennungen der am stärksten gereinigten VNF-Komponenten, die in den vorangehenden Beispielen erhalten worden waren, identifizierten VNF endgültig als IgG-Immunglobulin.
Es wurden 10 cm mal 10 cm Gele für SDS-PAGE mit einem Gradienten, der im 5000 bis 200000 MW-Bereich trennt, von ISS-Enprotech, Hyde Park, Massachusetts, USA, erhalten. Auf solchen Gelen verhält sich Peak II mit dem Küken-IgG identisch, indem er 65000 und 25000 MW Komponenten in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (2-ME) produziert. Auf solchen Gelen, aber ohne 2-ME, wandert der Peak II mit einer Hauptbande bei etwa 180000 MW, wie dies bei Küken-IgG der Fall ist.

BEISPIEL 7

Kükenfibroblastentest

Der Kükenfibroblastentest ist als eine in vitro Durchmusterung zur Identifizierung der VNF-Aktivität geeignet. Er ist zur Bestätigung der Reinigung von VNF von einer bekannten Quelle oder zur Bestätigung der Gegenwart von VNF in einer möglichen Quelle geeignet. Unser Test beruhte auf Standardverfahren, die von J. Skeeles et al., 23 Avian Dis. (1979) entwickelt wurden. Siehe auch Diseases of Poultry, 574 (M. Hofstad Hrsg., 8. Auflage, 1984). Kurz gesagt, Fibroblasten werden von 9-11 Tage alten spezifischen pathogenfreien Embryos geerntet, zu einer dünnen Schicht in Kulturschalen auf Complete Minimal Essential Media gezüchtet und in Mikrotiterplattenvertiefungen übertragen, die den die infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung (Lukert-Stamm) (IBDV) enthalten. Falls erwünscht, wird der IBDV in der Mikrotiterplatte vor dem Zusetzen der Fibroblastenzellen mit einer Zubereitung vermischt, die VNF enthält, oder von der angenommen wird, daß sie VNF enthält, um die Gegenwart oder das Fehlen oder das Ausmaß einer virusneutralisierenden Aktivität in der Zubereitung zu bestimmen. Die Inkubation von IBDV mit einer möglichen neutralisierenden Zubereitung wird etwa eine Stunde bei 37ºC durchgeführt. Der Endpunkt unseres Tests wurde mit einem MTT-Farbstoffverringerungstest bestimmt. Spezifische Aspekte unseres Verfahrens sind in der Folge angeführt.

A. Herstellung von Fibroblasten zur Verwendung in Mikrotiterplatten

1. Ernten und Züchten von Fibroblasten.
2. Sobald die Zellen konfluent sind, Entfernen der Medien aus den Gewebekulturschalten (Falcon 150x25 mm) und Trypsinieren mit 15-20 ml Trypsin. Das Einbringen der Platten in den Inkubator für 2-5 Minuten nach der Zugabe des Trypsins trägt dazu bei, die Zellen rascher von der Schale zu lösen als bei Raumtemperatur.
3. Nach dem Lösen der Zellen von den Schalen, Zusetzen von 5 ml Newborn Calf Serum zur Neutralisierung des Trypsins. Leichtes Schwenken der Schalen zur gründlichen Vermischung des Serums mit dem Trypsin.
4. Pipettieren des Trypsin/Serums und der Zellen aus den Schalen in gleiche Teilmengen in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Es ist hilfreich, die Platte an der Seite etwas zu neigen und die Platte mit dem Trypsin/Serumgemisch zu spülen, um etwaige anhaftende Zellen zu lösen. Auffüllen des Volumens der Röhrchen bis zur 40 ml Markierung mit MEM mit 5% FCS zur Neutralisierung von etwaigem zurückbleibenden Trypsin.
5. Schleudern der Mischung in den Röhrchen über 10 Minuten bei 1500 rpm bei 16ºC.
6. Nach dem Schleudern, Abgießen des Überstandes und Zugabe von 10 ml MEM mit 5% FCS zu jedem Röhrchen. Vermischen der Zellen mit einer Pipette zur Zerteilung etwaiger Klumpen. Vereinen aller Teilmengen in einem Behälter und gutes Vermischen.
7. Entfernen eines kleinen Teils aus den vereinten Teilmengen und Zubereiten einer 1:10 oder 1:20 Verdünnung in MEM mit 5% FCS (eine 1 ml + 9 ml Verdünnung ist für gewöhnlich ausreichend, um eine repräsentative Probe zu erhalten, aber eine 1 ml + 19 ml Verdünnung verringert die zu zählende Zellanzahl).
8. Zählen der verdünnten Zellen auf einem Hämozytometer und Verdünnen in MEM mit 5% FCS zur Herstellung einer 0,5 x 10&sup6; Zellen/ml Lösung.
9. Zusetzen von 200 µl der Zellösung zu den gewünschten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte unter Verwendung einer Mehrkanalpipettiervorrichtung. Die Zellösung muß in einem gut gemischten Zustand gehalten werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in allen Vertiefungen beizubehalten. Wenn 15-20 ml der Zellösung in eine sterile Petrischale eingebracht und mit frisch gemischten Zellen zwischen jedem Plattenpaar aufgefüllt werden, unterstützt dies eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in alle Vertiefungen.

B. Inkubation von Mikrotiterplatten

Inkubieren der Mikrotiterplatten über 2 Tage in einem 37ºC Inkubator mit 5,5% CO&sub2;. Die Platten können nach 1-2 Tagen unter einem Mikroskop betrachtet werden, um vorläufige Testergebnisse zu erhalten oder eine Prüfung auf sichtbare Kontamination durchzuführen. Die Kontamination kann als Trübung oder in Form von kleinen schwarzen Flecken in dem Medium erscheinen.

C. MTT-Tetrazolium-Farbstoffverringerungstest auf Proliferation oder Neutralisation

1. Vermischen einer 5 mg/ml Lösung eines MTT-Tetrazoliumfarbstoffs (erhalten von U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) in LXPBS. Nicht alle Kristalle lösen sich auf. Futersterilisation durch einen 0,45 µm Spritzenfilter unter einer sterilen Haube.
2. Entfernen von 100 µl Flüssigkeit aus jeder Vertiefung in jeder Platte unter einer sterilen Haube. "Pulsieren" der Platten durch Zugabe von 20 µl MTT zu jeder Vertiefung nach dem Entfernen der Flüssigkeit. Zurückstellen der Platten in den Inkubator für 3 Stunden.
3. Nach der Inkubation, Entfernen von 100 µl der Lösung aus jeder Vertiefung der Platte und Verwerfen (dieser Schritt muß nicht steril sein).
4. Zugabe von 100 µl saurem Isopropanol (40 ml lN HCl oder 3,3 ml 12N HCl in 1 Liter Isopropanol) in jede Vertiefung.
5. Mischen in einem Schüttler über 1 Minute bei mittelhoher Geschwindigkeit (Position 6 auf einem Dynatech Shaker).
6. Ablesen der OD innerhalb von 30 Minuten unter Verwendung einer Wellenlänge von 570 nm.
7. Kalibrieren auf 0 Extinktion mit Medium + MTT.
8. Ablesen mit einem geeigneten Softwareprogramm (d.h., Immunosofttm) und einer Matrize auf einem Mikroplattenlesegerät

BEISPIEL 8

Virusneutralisierende Aktivität verschiedener Serumfraktionen gegen den infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung im Kükenfibroblastentest

Die verschiedenen Serumfraktionen, die zuvor in Beispiel 3 bis 6 beschrieben wurden, wurden aufihre Aktivität gegen IBDV nach den zuvor in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren getestet. Diese Daten sind in den folgenden Tabellen 5 und 6 angeführt. Peak II war die einzige Fraktion, die den Großteil der virusneutralisierenden Aktivität enthielt. In allen Fällen war die spezifische Aktivität für Peak II am größten und für die am stärksten gereinigte Form von Peak II (5079b, Peak II - Tabelle 7 oder 5079a - Tabelle 8) am größten. Der relative Prozentgehalt von aktivem VNF, der in der Peak II IgG Fraktion enthalten ist, unterscheidet sich unter den Serumzubereitungen. Figur 3 und Figur 8-11 zeigen das Reinigungsschema und Reinigungsprofile der IgG- Fraktion, die den VNF enthält. Tabelle 5-7 zeigen die Aktivitäten der verschiedenen Fraktionen von der TSK 2000 Säule. Die Aktivität der Fraktion 5079a ist in Tabelle 8 dargestellt. Die 5079a Fraktion wurde in 5079b, Peak 1, fraktioniert, die sehr geringe Werte makroglobuliner Verunreinigungen enthielt, und in 5079b, Peak II, welche die IgG-Fraktion enthielt. Tabelle 7 zeigt, daß 5079b, Peak II, die VNF-Aktivität enthält. TABELLE 5
1 HyVAC Kükenfibroblasten bei 1 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung in 200 µl Volumen wurden in dem Test verwendet.
2 Verschiedene Fraktionen wurden in fünffachen Verdünnungen durch 1:15625 in 50 µl Voluminalvertiefung getestet.
3 Der verwendete Virus war IBDV vom Leukert-Stamm bei einer 1:100 Verdünnung in Vertiefungen mit 50 µl Volumen.
4 Berechnungen beruhen auf einer 1:25 Verdünnung = 1 Einheit Aktivitat in 50 µl Volumen.
5S = Spektralhohlfaser, Sar = Sartorius-Membransystem. TABELLE 6 TABELLE 7

BEISPIEL 9

Virusneutralisierender Faktor, der in Sera von anderen Küken-Regressorlinien mit dem Kükenfibroblastentest gefunden wurde

Diese Experimente wurden im wesentlichen auf dieselbe Weise wie die zuvor in Beispiel 8 beschriebenen Experimente ausgeführt, mit der Ausnahme, daß andere Quellen für den virusneutralisierenden Faktor getestet wurden. Die Daten für diese Experimente sind in der folgenden Tabelle 8 angeführt. Tabelle 8 vergleicht auch die Regressorsera mit HyLine-Sera. Diese Daten zeigen, daß Sera von den getesteten East Lansing-Regressorlinien von Küken keine signifikante VNF-Aktivität enthalten. Zusätzlich zeigte sich, daß Sera von nicht belasteten Arkansas Regressorvögeln VNF enthalten und daß Sera von belasteten Arkansas Progressorküken eine VNF-ähnliche Aktivität enthalten, die mit jener von belasteten Arkansas Regressorküken vergleichbar ist. TABELLE 8

BEISPIEL 10

Schutz von Küken beim Schlüpfen vor lebendem Virus, der in ovo mit VNE verabreicht wird

Dieses Experiment zeigtf daß VNF Küken beim Schlüpfen vor dem IBDV schützt, der als Impfstoff in ovo am Tag 18 der Inkubation verabreicht wird. Es ist zu beachten, daß bestehende IBDV-Impfstoffstämme so infektiös sind, daß sie ohne deutliche Verringerung der Schlüpffähigkeit schwierig in ovo zu verwenden sind.
Das hierin beschriebene Verfahren liefert auch einen Test für Konjugate, die als Impfstoff dienen können.
Die Studie umfaßte 9 Gruppen mit 10-15 HyVAC embryonierten Eiern in jeder Gruppe. Ein Standardimpfstoff gegen IBDV wurde von CEVA Laboratories, IBD-BLEN (1000 Dosen/Ampulle) zur Verfügung gestellt. Es wurden Dosen von 10x, 1X, 0,1X und 0,01X Impfstoff pro 50 µl Volumen zubereitet. VNF wurde mit einem 800 µg/50 µl Volumen als 1X Dosis verwendet und VNF-Dosen wurden in 1X (800 ug) und 0,1X Dosis (80 pg)/50 µl Mengen zubereitet. Zur in ovo Injektion wurden 50 µl IBD-BLEN und 50 µl VNF gemischt und mit CEVA-Verdünnungsmittel auf 200 µl Gesamtvolumen gebracht. Es wurden verschiedene Dosen von IBD-BLEN plus VNF als Impfstoffe verabreicht und verschiedene Dosen von nur IBD-BLEN Impfstoff wurden zur Beimpfung der 18 Tage alten Emryos verwendet. In Tabelle 9 sind die Impfstoffbehandlungen angeführt, welche die verschiedenen Gruppen erhielten. Die Vögel ließ man schlüpfen und in getrennten Gruppen bis Tag 5 nach dem Schlüpfen wachsen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Vögel gewogen und die Schleimbeutel gewogen und untersucht.
Neun Gruppen von Schleimbeuteln, drei pro Gruppe, wurden einer histologischen Bewertung unterzogen. Diese Gewebe wurden auffolgende Weise bewertet: 0 = normal; 1 = minimale Veränderung (die eine leichte Unregelmäßigkeit der Oberflächenschleimhaut, eine gewisse Lymphozytenverarmung in einigen Follikeln mit normaler Größe beinhaltet); 2 = leichte Veränderungen -- leichte Einstülpungen mit einer gewissen Lymphozytenverarmung und Atrophie der Follikel (dazu gehören auch gewisse entzündliche Veränderungen ohne Nekrose); 3 = mäßige Veränderungen -- stärkere Einstülpung der Schleimhaut mit verringerter Faltengröße (die meisten Follikel sind atrophiert und/oder an Lymphozyten verarmt, stärkere Entzündung oder Nekrose); 4 = ausgedehnte Veränderungen -- Falten offensichtlich atrophiert (interfollikulares Epithel ist in den Falten niedergedrückt, wodurch eine vakuolenartige Form verursacht wird. Dies umfaßt keine normalen Follikel mit einer stärkeren Entzündung oder Nekrose) ; 5 = starke Veränderungen -- normale Architektur ist schwer gestört, Faltengröße deutlich verringert. Auch dies kann eine ausgedehnte Entzündung oder Nekrose beinhalten.
Tabelle 9 und 10 zeigen die Körpergewichtszunahme, den Prozentgehalt des Schlüpfens, das Gewicht des Schleimbeuteis und die Schleimbeutelhistologie von verschiedenen Gruppen. Vögel, welche die 10X Dosis IBD-BLEN + 1X Dosis VNF erhielten, zeigten eine deutlich größere Schlüpffähigkeit (100%) als jene, welche nur die 10X Dosis IBD-BLEN erhielten (55%). Dasselbe trifft auf den 1X Impfstoff- Dosiswert zu. Die Körpergewichtszunahme war bei Vögeln, welche nur die 1X, 0,1X und 0,01X IBD-BLEN Impfstoffdosis erhielten, im Vergleich zu den nicht beimpften Kontrollen (14,8 Gramm) verringert (5 bis 9 Gramm) (Tabelle 11). Wenn jedoch diesen IBD-BLEN-Dosen VNF hinzugefügt wurde, war die Körpergewichtszunahme deutlich erhöht (17 bis 18 Gramm).
Im wesentlichen wurde derselbe Effekt wie bei der Körpergewichtszunahme auch bei dem Schleimbeutelgewicht beobachtet. Nur die IBD-BLEN-Dosen erzeugten eine Schleimbeutelatrophie und eine Schleimbeutelgewichtsabnahme (0,04 bis 0,06 Gramm) am Tag 5 im Vergleich zu Kontrollen (0,13 Gramm). Die Zugabe von VNF zu dem Impfstoff führte zu Schleimbeuteln mit normalem Gewicht (0,12 bis 0,15 Gramm) (Tabelle 10). Die Schleimbeutelhistologie zeigte jedoch, daß ein Verhältnis in dem Impfstoff von 1X Virus zu 10X VNF erforderlich ist, um die Schleimhaut vollständiger vor einer IBDV-Infektion zu schützen. Ein Impfstoff-Verhältnis von 1X Virus zu 1X VNF schützte die Schlüpffähigkeit, die Körpergewichtszunahme und das Schleimbeutelgewicht, verhinderte aber nicht, daß ein nicht neutralisierter Virus die Lymphozytenverarmung im Schleimbeutel verursachte (Tabelle 10). TABELLE 9 In ovo Impfung mit IBD-BLEN und VNF und Auswirkung auf die Schlüpffähigkeit und die Körpergewichtszunahme von Tag 0 bis Tag 5
Die Behandlung war bei dem 0,05 Wert für Gruppen mit unterschiedlichen Indizes signifikant.
1A 1X Dosis von IBD-BLEN stellt einen ED&sub5;&sub0; Titerwert von 1:500 dar.
2A 1X Dosis von VNF bedeutet 800 ug/Dosis. TABELLE 10 In ovo Impfung mit IBD-BLEN und VNF und Auswirkung auf das Schleimbeutelgewicht und die Histologie
Die Behandlung war bei dem 0,05 Wert für Gruppen mit unterschiedlichen Indizes signifikant.

BEISPIEL 11

Immunisierung von Küken durch Verabreichung von VNF und lebendem Virus in ovo

Dieses Beispiel ist eine Erweiterung des vorangehenden Beispiels 10, indem gezeigt wird, daß ein VNF-IBDV-Konjugat tatsächlich Küken gegen den infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung (IBDV) immunisiert. In diesem Experiment wurde VNF mit CEVA IBD-BLEN -Impfstoff vorinkubiert, wobei der Impfstoff bei empfohlenen und geringeren als optimalen konzentrationen bereitgestellt wurde, und die Mischung wurde in ovo an embryonisierte Eier vor der Lebendbelastung mit USDA-IBDV am Tag 39 nach der Impfung (oder Tag 35 nach dem Schlüpfen) verabreicht.
Die Studie bestand aus zehn Gruppen. HyVAC-Eier wurden in Gruppe 1-6 verwendet, und SPAFAS-Eier wurden in Gruppe 7-10 verwendet. Jede Gruppe wurde in einer eigenen Isoliereinheit untergebracht und alle Einheiten waren in demselben Raum angeordnet. Die Behandlungen unterschieden sich durch die verabreichten Materialien und die Verabreichungsmethoden. Die Behandlungsgruppen, Dosen und Probengrößen sind in der folgenden Tabelle 11 angeführt.
Basisdaten wurden von positiven Kontrollgruppen (Gruppe 1 und 7) und von negativen kontrollgruppen (2 und 8) erhalten. Fruchtbare, lebensfähige SPAFAS-SPF- und HyVAC-Eier wurden durch manuelle in ovo Injektion am Tag 18 der Inkubation geimpft. Die Injektion erfolgte durch die Oberseite des Eis in das Amnion. Das Injektionsvolumen betrug 200 µl. Die gemessenen Parameter waren die Schlüpffähigkeit, das Schlüpfgewicht, der IBD-Antikörpertiter, das Körpergewicht, das Schleimbeutelgewicht und die Schleimbeutelhistologie. TABELLE 11 Behandlungsgruppen, Dosen und Probengrößen
1A 1X Dosis (oder Standarddosis) von IBD-BLEN stellt einen ED&sub5;&sub0; Titerwert von 1:500 dar.
2VNF Dosis 1 = 1 Standard-VNF-Dosis (800u9/Dosis), VNF Dosis 2 = 0,1X Standard-VNF-Dosis, VNF Dosis 3 = 0,01X Standard-VNF-Dosis
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den folgenden Tabellen 12 bis 15 dargestellt. HyVAC-Vögel, die VNF vermischt mit IBD-BLEN erhielten, zeigten eine erhöhte Schlüpffähigkeit (82%) im Vergleich zu jenen, die nur Impfstoff erhielten (32%) und eine bessere Schlüpffähigkeit wurde bei den höheren VNF-Konzentrationen beobachtet (82- 47%) (Tabelle 12). Die SPAFAS-Schlüpffähigkeit kann aufgrund anderer Probleme, die während des Schlüpfens auftraten, nicht vergleichen werden (Tabelle 12). Jene, die für den Rest der Studie am Leben blieben, stellten jedoch verläßliche Vögel zur Untersuchung der Studienparameter dar. Die Sterblichkeit bis Tag 35 war in jenen Gruppen größer, die nur den Impfstoff oder eine Impfstoff-Kombination mit den geringeren VNF-Dosen erhielten (Tabelle 12). Höhere VNF-Dosen schützten vor einer hohen Sterblichkeit, wenn sie mit dem Impfstoff vermischt wurden (Daten waren ähnliöh wie bei den Kontrollen).
HyVAC-Vögel, die VNF mit IBD-BLEN vermischt erhielten, zeigten eine normale Gewichtszunahme (45-49 Gramm) nach der Belastung mit USDA-IBDV, aber die nicht geimpften Vögel zeigten eine geringe Gewichtszunahme (5,6 Gramm) (Tabelle 13). Die Impfung nur mit VNF bot keinen Schutz vor der USDA-Belastung. Ebenso war die Sterblichkeit bei diesen Gruppen im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollen verringert (Tabelle 12).
Im allgemeinen bot ein höheres Verhältnis von VNF zu dem Virus einen verbesserten Schutz für den Schleimbeutel nach der USDA-Belastung (Tabelle 14). Kontrollschleimbeutel, die keinen Impfstoff erhielten, waren nach der Belastung stark hämorrhagisch und ödemisch (Tabelle 14). Vögel, die nur den Impfstoff erhielten, hatten stark atrohpierte Schleimbeutel und Vögel, die den Impfstoff und VNF erhielten, hatten teilweise atrophierte Schleimbeutel nach der Belastung.
Vögel, die mit der Mischung von IBD-BLEN und VNF geimpft wurden, zeigten signifikant höhere Antikörpertiter bei der USDA-IBDV-Belastung als jene, die nur IBD-BLEN erhielten. (Tabelle 15). Dies zeigt, daß diese Vögel einen viel höheren Schutz nach der Impfung gegenüber jeder Sekundärinfektion während des Wachstums hatten als jene, die nur den Virusimpfstoff erhielten. Auch hier ist erkennbar, daß der Antikörpertiter bei der geringsten VNF-Dosis abzufallen beginnt, wenn er mit dem Virus vermischt wird. Dies zeigt, daß wenn an dem Schleimbeutel bei der Impfung ein zu großer Schaden verursacht wird, der Schutz im Sinne des Antikörpertiters während des restlichen Lebens des Vogels verloren geht. TABELLE 12 In ovo Impfung mit IBD-BLEN und VNF und Auswirkung auf die Schlüpffähigkeit und Sterblichkeitsrate
Verschiedene Indizes bezeichnen signifikante Unterschiede durch Chi-Quadrat-Analyse. TABELLE 13 In ovo Impfung mit IBD-BLEN und VNF und Auswirkung auf die Körpergewichtszunahme von SPF-Küken nach USDA-IBDV- Belastung am Tag 35 nach dem Schlüpfen
Mittel mit verschiedenen Indizes unterschieden sich signifikant bei dem 0,05 Wert. (Die SPAFAS 0,1X Behandlung war in den statistischen Analysen nicht enthalten.) TABELLE 14 Schleimbeutelgewicht von SPF-Kükengruppen nach der in ovo Impfung und einer USDA-IBDV-Belastung am Tag 35 nach dem Schlüpfen
Mittel mit verschiedenen Indizes unterschieden sich signifikant bei dem 0,05 Wert. (Die SPAFAS 0,1X Behandlung war in den statistischen Analysen nicht enthalten.) TABELLE 15 In ovo Impfung mit IBD-BLEN und VNF und Auswirkung auf den Antikörpertiter nach der ISDA-EBDV-Belastung TITER (LOG 10)
Mittel mit verschiedenen Indizes unterschieden sich signifikant bei dem 0,05 Wert.
1 In Gruppe 2 hatten 13% der Vögel Titer größer als 1000 und 87% hatten Titer kleiner 1000.
2 In Gruppe 3 hatten 82% der Vögel Titer größer als 1000 und nur 18% hatten Titer kleiner 1000.

BEISPIEL 12

Andere VWF-Quellen nach Bestimmung durch den Kükenfibroblastentest

Dieses Beispiel zeigt andere VNF-Quellen mit dem zuvor In Beispiel 7 beschriebenen Fibroblastentest.
Tabelle 16 zeigt die Virusneutralisierungstiter gegen IBDV von Serumproben verschiedener Vögel wie auch die entsprechenden ELISA-Titer. Aus diesen Daten geht hervor, daß einige Serumproben (HyLine-Küken) sehr hohe ELISA-Titer mit entsprechend geringem Virusneutralisierungstiter aufweisen. Daher ist es möglich, Antikörper zu haben, die sehr stark an IBDV binden, aber IBDV nicht neutralisieren. Die HyLine- Küken wurden mit RSV belastet, bildeten Tumore zurück und erzeugten bindende Antikörper gegen IBDV, erzeugten aber keine virusneutralisierenden Antikörper gegen IBDV. Die Serumprobe von Arkansas-Küken der Regressorlinie wies sowohl eine Bindungs- als auch Neutralisierungsaktivität gegen IBDV auf.
Eine interessante Beobachtung ist, daß nicht belastete Wildhuhn-Küken sowohl von der University of Arkansa als auch der Mississippi State University Serum mit neutralisierenden Antikörpern gegen IBDV produzieren. Es ist auch zu beachten, daß Tabelle 16 zeigt, daß eine VNF-artige Aktivität im Serum von SPAFAS-Küken gefunden wurde, die mit IBDV beimpft wurden. TABELLE 16 Virusneutralisierende Aktivität und ELISA-Titer von verschiedenen Serumproben, VVF (5077D) und SPAFAS-IBDV-Antisera gegen IBDV
1 Einheiten nach Verdünnung der ursprünglichen Probe bereinigt

BEISPIEL 13

In situ VNF-Impfpotential bei dem infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung

Die Aufgabe dieses Experiments war die Testung der Wirksamkeit der VNF-IBD-BLEN -Mischung bei Verabreichung durch IM-Injektion an Küken 1-2 Tage nach dem Schlüpfen zur Stimulierung der Immunität gegenüber einer sekundären Belastung mit USDA-IBDV Belastungsvirus.
Etwa 160 gesunde, 1 oder 2 Tage alte Hy-Vac-Küken, die sehr anfällig für den IBD-BLEN -Stamm sind und für gewöhnlich in normalen Studien für die Lizensierung von Impfstoffen eingesetzt werden, wurden verwendet. Die Belastung geimpfter Vögel wurde mit dem USDA Belastungsstamm des infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung (USDA-IBDV-CV) Charge #83-1, 103,8 EID&sub5;&sub0;/ml durchgeführt. Der Standardimpfstoff gegen IBDV wurde von SANOFI (IBD-BLEN ) mit 1000 Dosen/Ampulle, 102,7 EID&sub5;&sub0;/Dosis erhalten. VNF von Arkansas- Regressorlinienvögel, wie in der obengenannten Beschreibung hergestellt, 16000 µg/ml in 1,5X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4. Dessen Aktivität wird durch seine virusneutralisierende Aktivität gegen den Lukert-Stamm von IBDV unter Verwendung von Hy-Vac-Küken-Fibroblasten in Mikroneutralisierungstests bestimmt. Die Reinheit wurde durch HPLC geprüft.
Jedes Küken, das den IBD-BLEN -Impfstoff mit einer 1X oder 0,1X Dosis erhielt, empfing 100 µl der IBD-BLEN -Zubereitung durch IM-Injektion in den Oberschenkel des linken Beins. Das 100 µl Gesamtvolumen setzte sich aus 50 µl IBD- BLENM (1X oder 0,1X) + 50 µl CEVA-Verdünnungsmittel zusammen. (Gruppe 2 - 1X-Dosis, Gruppe 5 - 0,1X-Dosis)
Jedes Küken, das IBD-BLEN 1X + VNF (Dosis 1 oder Dosis 2) oder 0,1X + VNF (Dosis 1) empfing, erhielt 100 µl der Impfstoffmischung durch IM-Injektion. Das 100 µl Gesamtvolumen setzte sich aus 50 µl IBD-BLEN (1X oder 0,1X) + 50 µl VNF (Dosis 1 oder Dosis 2) zusammen. (Gruppe 3 - IBD-BLEN (1X) + VNF -Dosis 1, Gruppe 4 - IBD-BLEN (1X) + VNF - Dosis 2, Gruppe 6 - IBD-BLEN (0,1X) + VNF -Dosis 1).
Jedes Küken, das nur VNF empfing, erhielt 100 µl der VNF- Zubereitung durch IM-Injektion. Das 100 µl Gesamtvolumen setzte sich aus 50 µl VNF - Dosis 1 + 50 µl CEVA-Verdünnungsmittel zusammen (Gruppe 7).
Jedes Küken, das den USDA-IBDV-Belastungsvirus am Tag 21 nach der Impfung empfing, erhielt 30 pl der Zubereitung durch Augentropfen in jedes Auge. Das für beide Augen erforderliche Gesamtvolumen von 60 µl bestand aus einer Zubereitung einer 1:8 Verdünnung des Stamm-USDA-IBDV-Virus mit 6309 EID&sub5;&sub0;/30 µl (1,4 ml USDA-IBDV + 9,8 ml CEVA-Verdünnungsmittel - 23,5 EID&sub5;&sub0;/30 µl).
Daten aus diesem Experiment sind in der folgenden Tabelle 17 angeführt. Es ist zu beachten, daß die Vögel in Gruppe 6 einen Schutz am Tage 10 gegen den Impfvirus in dem Virus- VNF-Konjugat aufwiesen. Somit zeigen die Daten aus dieser Studie, daß es möglich ist, eine 0,1X Dosis von IBD-BLEN mit 136 Einheiten VNF zu neutralisieren oder zu hemmen, so daß der Schleimbeutel vor dem Virus in dem Vius-VNF-Konjugat bis Tag 10 geschützt ist. Wenn diese Vögel am Tag 29 mit dem USDA-Belastungsstamm belastet werden, zeigen sie ferner einen Schutz (keinen Körpergewichtsverlust, keine Sterblichkeit) vor dieser Belastung. TABELLE 17 Zusammenfassung von Körpergewichtszunahme, Schleimbeutelparameter und IBD-Antikörper-Titer für Beispiel 13
(%) = % der Vögel mit ≥ 1000 IBDV-Antikörpertiter.
ABCD Mittelwerte mit verschiedenen Indixes unterschieden sich signifikant beim 0,05 Wert

BEISPIEL 14

In situ Impfpotential von HyLINE-Sera mit SANOFI-IBD-BLEN -Impfstoff bei subkutanter Verabreichung an HyVAC-SPF-Küken

Die Aufgabe dieses Experiments war die Bewertung immunologischer und pathologischer Veränderungen im Sinne der Antikörpertiter und Schleimbeutelparameter bei 21 Tage alten Küken, die Impfungen von SANOFI IBD-BLEN erhielten, welche mit SC HyLINE-Sera inkubiert und als komplettes Impfstoff-Konjugat subkutan in den Hals des Vogels verabreicht worden waren.
Gesunde, einen (1) Tag als HyVAC-SPF-Küken (insgesamt etwa 90), die für eine IBD-BLEN -Impfung und eine USDA-IBDV-Belastung anfällig sind, wurden in diesen Studien verwendet.
SC-Sera ( 35000 ug/ml, #SC 2-22-90, ED&sub5;&sub0;/ml mit 1:3000000) ist ein Vollserum, das VNF enthält und durch Boosten von SC HyLINE-Küken mit SANOFI-IBD-BLEN nach bekannten Verfahren hergestellt wurde. Die VNF-Aktivität in diesem Serum wird durch Virusneutralisierungstests, wie zuvor beschrieben, bestimmt.
IBD-BLEN und SC-HyLINE-Sera wurden bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert. Nach der Herstellung wurden der IBD-BLEN - Impfstoff und die Serum-IBD-BLEN -Mischungen eine (1) Stunde vor der Impfung bei Raumtemperatur gehalten.
Daten für die verschiedenen Versuchs- und Kontrollgruppen in dieser Studie sind in Tabelle 18 angeführt. Diese Daten zeigen, daß bei VNF-Konzentrationen von gleich oder größer 316 Einheiten der Schleimbeutel nach dem Gewicht am Tag 22 vor dem Impfstoffvirus in dem Impfstoff-Serum-Konjugat, das am Tag 1 verabreicht wurde, geschützt werden kann. TABELLE 18 Dosistitrationsimpfung am Tag 1 nach dem Schlüpfen bei SPF-Küken unter Verwendung von SANOFI-IBD-BLEN plus Virusneutralisierungsfakto (VNF) und Bewertung der Schleimbeutelparameter am Tag 21 nach dem Schlüpfen (Beispiel 14)
A,B,C = Mittelwerte in einer Spaltenverarbeitung verschiedener Indizea unterschieden sich signifikant beim 0,05 Wert
1 A 0,01X Dosis von SANOFI-IBD-BLEN ist 2,24 EID50(Dosis (Charge #29967).
2 Virusneutralisierungsaktivität, ausgerückt als Einheiten/50 µl Dosis.

BEISPIEL 15

Minimale schützende Dosis von HyLINE-Serum mit infektiösem Bursitis-Virus-Impfstoff bei subkutaner Verabreichung an

HyVAC-SPF-Küken

SANOFI-IBD-BLEN ist ein virulenter, lebender Virusimpfstoff, der akute und chronische Schleimbeutelläsionen 3-9 Tage nach der Impfung bei SPF-Küken hervorrufen kann. Frühere Experimente mit diesem Impfstoff an 1 bis 2 Tage alten HyVAC-SPF-Küken haben von Tag 10 bis Tag 14 eine Schleimbeutelatrophie durch intramuskuläre und subkutane Impfungen von 1X bis 0,0001X Dosen IBD-BLEN gezeigt.
In dieser Studie wurden bestimmte Gruppen von einen (1) Tag alten HyVAC-SPF-Küken subkutan mit verschiedenen Dosen von nur SANOFI-IBD-BLEN und in Kombination mit verschiedenen Dosen SC-HyLINE-Serum, das VNF enthielt, geimpft. Geimpfte und Kontrollküken wurden auf Schleimbeutelmorphologie wie auch starke Läsionen im Alter von 15 oder 22 Tagen untersucht und im Alter von 29 Tagen mit USDA-IBDV-Belastungsstamm belastet, um die Immunogenität zu bestätigen (14, 21 und 28 Tage nach der Impfung). Die Aufgabe dieses Experiments ist die Bewertung immunologischer und pathologischer Veränderungen im Sinne der Antikörpertiter und Schleimbeutelparameter bei 15 und 22 Tage alten Küken, die im Alter von einem (1) Tag (14, 21 und 28 Tage nach der Impfung) Impfungen mit verschiedenen Dosen von nur SANOFI-IBD-BLEN und inkubiert mit verschiedenen Dosen von SC-HyLINE-Serum, das als kompletter Impfstoff verabreicht wurde, erhalten hatten. Die USDA-IBDV-Belastung erfolgte im Alter von 29 Tagen.
Gesunde, einen (1) Tag alte HyVAC-SPF-Küken (630), die für eine IBD-BLEN -Impfung und eine USDA-IBDV-Belastung anfällig sind, wurden in dieser Studie verwendet. SC-Serum (40000 µg/ml, #5-18-90, ED&sub5;&sub0;/ml mit 1:511000) ist ein Vollserum, das VNF enthält und durch Boosten von SC HyLINE- Küken mit SANOFI-IBD-BLEN hergestellt wird. Die VNF- Aktivität in diesem Serum wird durch Virusneutralisierungstests wie zuvor beschrieben bestimmt. Im Handel erhältlicher Impfstoff gegen IBDV, IBD-BLEN , wurde von SANOFI- Laboratories mit 1000 Dosen/Ampulle, 102,3 EID&sub5;&sub0;-Titer bereitgestellt. Als Belastung wurde der USDA-Belastungsstamm des infektiösen Bursitis-Virus, Charge #83-3, 103,8 EID&sub5;&sub0;/ml, verwendet. Die Impfung erfolgte durch subkutane Injektion und die USDA-IBDV-Belastung erfolgte durch Augentropfen am Tag 29 nach dem Schlüpfen.
Daten aus diesem Experiment sind teilweise in Tabelle 19 angeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, daß bei einer Dosis von 338 Einheiten VNF und bei einer Impfstoffdosis von 0,01X (2,24 EID&sub5;&sub0;/Dosis) die Schleimbeutel vor dem Impfstoffvirus am Tag 15 und 22 geschützt waren und gegenüber einem USDA-Belastungsstamm am Tag 29 stark immun waren. Nach der USDA-Belastung am Tag 29 gab es eine normale Körpergewichtszunahme und keine Sterblichkeit in dieser Gruppe. TABELL 19 Dosistitrationsimpfung am Tag 1 nach dem Schlüpfen bei SPF-Küken unter Verwendung von SANOFI-IBD-BLEN plus Virusneutralisierungsfaktor (VNF) und Bewertung der Scheimbeutelparaeter und IBDV-Antikörpertiter am Tag 15, Tag 22 und 4 Tage nach der USDA-IBDV-Belastung¹ Verabreicht am 29² (Beispiel 15)
1 SUDA-IBDV-Belastungsstamm, verabreicht durch Ausgen tropfen am Tag 29 nach dem Schlüpfen mit 47 EID&sub5;&sub0;/Vogel an jede Gruppe mit Ausnahme der negativen Kontrolle.
2 Statistische Analyse nicht dargestellt.
* Gruppen, die mit IBDV kontaminiert waren.
3 Eine 0,01X Dosis von SANOFI IBD-BLEN enthielt 2,24 EID&sub5;&sub0;/Dosis (Charge # 29967).
4 Die Virusneutralisierungsaktivität wird ausgedrückt als Einheiten/50µl Dosis Vollserum, das VNF von SC- HyLine-Küken enthält.

Claims

1. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes zur Herstellung eines Medikamentes, mit dem eine aktive Immunität gegen eine Viruserkrankung eines Vogels hervorgerufen wird, wobei der konjugierte Impfstoff umfaßt:

einen Impfvirus, bestehend aus einem lebenden Vogelvirus, der diese Erkrankung in dem Vogel bewirken und der eine aktive Immunreaktion daraufin dem Vogel hervorrufen kann; und einen an diesen Impfvirus gebundenen neutralisierende Faktor in Form eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments, der den Virus neutralisieren kann, wobei der konjugierte Impfstoff zunächst den Vogel gegen eine Infektion durch den Impfvirus schützt;

der konjugierte Impfstoff anschließend dem Impfvirus ermöglicht, eine aktive Immunität gegen einen weiteren Angriff durch den Virus zu stimulieren.

2. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 1, bei der der lebende Virus der Rous Sarcoma-Virus ist.

3. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 1, bei der der lebende Virus der die infektiöse Schleimbeutelerkrankung auslösende Virus ist.

4. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 1, bei der der lebende Virus der infektiöse Bronchitis-Virus ist.

5. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 1, bei der der lebende Virus der die Newcastle-Erkrankung auslösende Virus ist.

6. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der neutralisierende Faktor ein IgG-Immunoglobulin oder ein IgG-Immunoglobulinfragment ist.

7. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der neutralisierende Faktor von polyklonalem Ursprung ist.

8. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der der neutralisierende Faktor von monoklonalem Ursprung ist.

9. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Medikament in einer Form für subkutanes Verabreichen hergestellt wird.

10. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Medikament in einer Form zur intraperitonealen Injektion hergestellt wird.

11. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Medikament in einer Form zur intramuskulären Injektion hergestellt wird.

12. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Medikament in einer Form zur Injektion in ovo hergestellt wird.

13. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Medikament eine lyophilisierte Substanz ist.

14. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Medikament einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.

15. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 14, bei der der pharmazeutisch geeignete Träger ein flüssiger Träger ist.

16. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach Anspruch 15, bei der der pharmazeutisch geeignete Träger ein wäßriger Träger ist.

17. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Medikament des weiteren ein Adjuvans umfaßt.

18. Verwendung eines konjugierten Impfstoffes nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Medikament des weiteren einen Stabilisator umfaßt.

19. Befruchtetes Vogelei, in dem eine pharmazeutisch geeignete Substanz deponiert ist, die einen konjugierten Impfstoff mit dem eine aktive Immunität gegen eine Viruserkrankung des Vogels hervorgerufen wird umfaßt, wobei der konjugierte Impfstoff umfaßt:

der konjugierte Impfstoff in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um es dem Impfvirus zu ermöglichen, eine aktive Immunität gegen einen weiteren Angriff durch den Virus zu stimulieren.

20. Befruchtetes Vogelei nach Anspruch 19, in dem der neutralisierende Faktor in einer Menge von 10 bis 1000 Aktivitätseinheiten vorhanden ist.

21. Befruchtetes Vogelei nach Anspruch 20, in dem der lebende Virus der Rous Sarcoma-Virus ist.

22. Befruchtetes Vogelei nach Anspruch 19, in dem der lebende Virus der die infektiöse Schleimbeutelerkrankung auslösende Virus ist.

23. Befruchtetes Vogelei nach Anspruch 19, in dem der lebende Virus der infektiöse Bronchitis-Virus ist.

24. Befruchtetes Vogelei nach Anspruch 19, in dem der lebende Virus der die Newcastle-Erkrankung auslösende Virus ist.

25. Befruchtetes Vogelei nach einem der Ansprüche 19 bis 25, in dem der neutralisierende Faktor ein IgG-Immunoglobulin oder ein IgG-Immunoglobulinfragment ist.

26. Befruchtetes Vogelei nach einem der Ansprüche 19 bis 25, in dem der neutralisierende Faktor von polyklonalem Ursprung ist.

27. Befruchtetes Vogelei nach einem der Ansprüche 19 bis 25, in dem der neutralisierende Faktor von monoklonalem Ursprung ist.

28. Impfpräparat, das zum Hervorrufen einer aktiven Immunität gegen den infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung bei einem Vogelsubjekt zweckdienlich ist, wobei das Impfpräparat folgendes umfaßt:

ein pharmazeutisch geeignetes Präparat mit einem konjugierten Impfstoff aus dem lebenden infektiösen Virus der Schleimbeutelerkrankung und einem an den lebenden Virus gebundenen neutralisierenden Faktor;

wobei der neutralisierende Faktor in IgG-Immunoglobulin umfaßt, das in der Lage ist, den lebenden Virus zu neutralisieren;

der konjugierte Impfstoff in einem Verfahren hergestellt wird, bei dem Blutserum, das den neutralisierenden Faktor enthält, mit dem lebenden Virus kombiniert wird;

der in dem pharmazeutisch geeigneten Präparat enthaltene konjugierte Impfstoff in einer Menge vorliegt, um eine Immunreaktion auf den lebenden Virus in dem Subjekt hervorzurufen, nachdem der Vogel zunächst gegen Infektion durch den Impfvirus geschützt wird.