DE69730152T2

DE69730152T2 - Verfahren zur erzeugung aktiver immunität durch vakzinkonjugate

Info

Publication number: DE69730152T2
Application number: DE69730152T
Authority: DE
Inventors: A. John THOMA; E. Eid HADDAD; E. Craig WHITFILL; P. Alan AVAKIAN
Original assignee: University of Arkansas
Current assignee: University of Arkansas
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2017-09-27
Also published as: CA2264810C; PL332540A1; ES2224273T3; BR9713312B1; CN100389827C; US20030044414A1; EA199900342A1; IL128014A0; US6890527B2; US6440408B2; JP4113588B2; EP0951299A1; AU715555B2; IL128014A; WO1998014212A1; ID21338A; US20020015706A1; CA2264810A1; JP2000507608A; CN1231614A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle Erkrankung oder eine Protozoen-Erkrankung durch Verabreichung eines Impfstoffkonjugats an Versuchsobjekte, wobei das Konjugat aus einem lebenden Bakterium oder Protozoen und einem neutralisierenden Antikörper oder Fragment davon besteht.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine Viruserkrankung durch Verabreichung eines Impfstoffkonjugats, wobei das Impfstoffkonjugat aus einem Lebendvirus und einem viralen neutralisierenden Antikörper besteht, werden in US-PS 5,397,568 und 5,397,569 von Whitfill et al. beschrieben. Diese Referenzen beschäftigen sich nur mit Viruserkrankungen.
Verfahren zur Behandlung von Kokzidiose, einer Protozoen-Erkrankung sowohl bei Vögeln als auch bei Säugern, die durch verschiedene Eimeria Spezies ausgelöst wird, werden in US-PS 4,935,007 von Baffundo et al. und US-PS 5,055,292 von McDonald et al. beschrieben. Die in ovo Inokulation gegen Kokzidiose wird in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 96/40233 und 96/40234 beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle oder eine Protozoen-Erkrankung in einem Vogel, umfassend das Verabreichen eines Impfstoffkonjugats an ein Ei, wobei das Impfstoffkonjugat ein lebendes Bakterium oder einen lebenden Protozoen umfasst und einen neutralisierenden Faktor, der an das lebende Bakterium oder den lebenden Protozoen gebunden ist. Der neutralisierende Faktor ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antikörperfragmenten. Der Antikörper oder das Antikörperfragment ist dazu in der Lage, lebende Bakterien oder Protozoen zu neutralisieren. Das Impfstoffkonjugat wird in einer Menge verabreicht, die ausreicht, in einem Vogel eine Immunantwort gegen die lebenden Bakterien oder Protozoen zu erzeugen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einer Impfstoffzubereitung, die zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle oder Protozoen-Erkrankung in einem Versuchsobjekt nützlich ist. Die Impfstoffzubereitung ist eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung, die ein Impfstoffkonjugat umfasst. Das Impfstoffkonjugat umfasst ein lebendes Bakterium oder einen Protozoen und einen neutralisierenden Faktor, der an das lebende Bakterium/den Protozoen gebunden ist. Der neutralisierende Faktor ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antikörperfragmenten. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann die lebenden Bakterien oder Protozoen neutralisieren. Das Impfstoffkonjugat ist in der pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung in einer Menge enthalten, die wirksam ist, im Versuchsobjekt eine Immunantwort gegen das lebende Bakterium oder den lebenden Protozoen zu erzeugen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ausscheidung von Oocysten in Vögeln, die mit einem Impfstoffkonjugat geimpft wurden, das 500 E. acervulina Oocysten enthält, komplexiert entweder mit 2,5, 25 oder 150 μl polyklonalem Antikörper, verglichen mit nicht-geimpften Kontrollen (cntrl) und einer Kontrolle, die mit Oocysten aber ohne Antikörper geimpft wurde. Ausscheidung von Oocysten wird als Maß für Infektiosität verwendet.
2 zeigt die Ausscheidung von Oocysten in Vögeln, die mit einem Impfstoffkonjugat geimpft wurden, das 500 E. acervulina Oocysten enthält, komplexiert entweder mit 25 oder 150 μl polyklonalem Antikörper, verglichen mit nicht-geimpften Kontrollen (cntrl) und einer Kontrolle, die mit Oocysten aber ohne Antikörper geimpft wurde. Ausscheidung von Oocysten wird als Maß für Infektiosität verwendet.
3 zeigt die Ausscheidung von Oocysten nach Impfung und niedrig dosierter E. acervulina Challenge. Bei der Impfung wurde ein Impfstoffkonjugat verwendet, das 500 E. acervulina Oocysten umfasste, komplexiert entweder mit 2.5, 25 oder 150 μl polyklonalem Antikörper; Kontrollen waren eine nicht-geimpfte Kontrolle (cntrl) und eine Kontrolle, die mit Oocysten, aber ohne Antikörper geimpft wurde (0).
4 zeigt die Gewichtszunahme (in Gramm) in Vögeln nach der Impfung und nach einer hoch dosierten E. acervulina Challenge. Bei der Impfung wurde ein Impfstoffkonjugat verwendet, das 500 E. acervulina Oocysten umfasste, komplexiert entweder mit 2.5, 25 oder 150 μl polyklonalem Antikörper; Kontrollen waren eine nicht-geimpfte Kontrolle (cntrl) und eine Kontrolle, die mit Oocysten, aber ohne Antikörper geimpft wurde (0).
5 zeigt Läsionswerte in Vögeln nach der Impfung und nach einer hoch dosierten E. acervulina Challenge. Bei der Impfung wurde ein Impfstoffkonjugat verwendet, das 500 E. acervulina Oocysten umfasste, komplexiert entweder mit 25 oder 150 μl polyklonalem Antikörper; Kontrollen waren eine nicht-geimpfte Kontrolle (cntrl) und eine Kontrolle, die mit Oocysten, aber ohne Antikörper geimpft wurde (0).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Impfstoffzubereitung bereit, umfassend einen lebenden Organismus (Bakterien oder Protozoen), komplexiert mit neutralisierenden Antikörpern, die für diesen Organismus spezifisch sind. Die Menge an neutralisierenden Antikörperkomplexen ist derart, dass der Organismus noch in der Lage ist, eine aktive Immunantwort zu erzeugen, während zum gleichen Zeitpunkt ein gewisses Ausmaß an Schutz gegen die schädigenden Effekte des Pathogens bereitgestellt wird. Während die Anmelder nicht auf eine einzelne Theorie beschränkt werden wollen, wird derzeit angenommen, dass der gegenwärtige Impfstoffkomplex in einer Art von verzögerter Freisetzung des pathogenen Organismus resultiert.
Man nimmt an, dass der gegenwärtige Impfstoffkomplex die pathogenen Effekte des Impfstofforganismus in dem geimpften Versuchsobjekt verzögert oder anfänglich davor schützt. Diese Verzögerung oder dieser anfängliche Schutz ist jedoch nur temporär (im Gegensatz zu den Effekten, die man bei Verwendung eines toten oder inaktivierten Impforganismus erwarten würde). Der Impfstofforganismus im Komplex infiziert das Versuchsobjekt schließlich und induziert somit aktive Immunität. Das Ausmaß der Verzögerung hängt von der Menge des verwendeten Antikörpers, dem bestimmten Impfstofforganismus und des zu impfenden Versuchsobjekts ab. Solch eine Verzögerung der Infektion ist bei der Impfung junger Versuchsobjekte wichtig, insbesondere, wenn viele Versuchsobjekte geimpft werden. Es ist zum Beispiel einfacher und kosteneffektiver, Hühner in ovo zu impfen verglichen mit frisch geschlüpften Küken.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der neutralisierende Faktor in einer Menge bereitgestellt, die das Auftreten pathologischer Veränderungen verzögert, die mit der Infektion des Versuchsobjekts durch den lebenden Impfstofforganismus assoziiert sind. Die „Verzögerung" ist vergleichbar; die pathologischen Veränderungen werden im Vergleich mit jenen Veränderungen verzögert, die auftreten würden, wenn man den lebenden Impfstofforganismus ohne komplexierenden neutralisierenden Faktor verabreichen würde.
Die Verwendung der vorliegenden Impfstoffkonjugate ist sicherer als die Verwendung des unkonjugierten Organismus, kann jedoch trotzdem eine schützende aktive Immunantwort induzieren. Der Ausdruck „sicher" wird hier verwendet, um zu zeigen, dass der Nutzen der Impfung in der Mehrzahl der geimpften Individuen irgendeine Schädigung überwiegt.
Antikörper, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Bakterien- oder Protozoen-neutralisierende Antikörper. Bakterien- oder Protozoen-neutralisierende Antikörper sind jene, die in vivo die Infektiösität eines Bakteriums oder Protozoen bekämpfen, wenn die Bakterien oder Protozoen und die Antikörper für eine ausreichende Zeit miteinander reagieren können. Die Quelle der Bakterien- oder Protozoen-neutralisierenden Antikörper ist unkritisch. Sie können von jedem Tier, einschließlich Vögeln (z. B. Hühner, Truthahn) oder von Säugern (z. B. Ratte, Kaninchen, Ziege, Pferd) abstammen. Die Bakterien- oder Protozoen-neutralisierenden Antikörper können monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Vgl. z. B. D. Yelton und M. Scharff, 68, American Scientist 510 (1980). Die Antikörper können Chimären sein. Vgl. z. B. M. Walker et al., 26, Molecular Immunology 403 (1989).
Bakterien- oder Protozoen-neutralisierende Antikörper, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Immunglobuline jedes Isotyps sein, einschließlich IgM, IgG, IgA, IgD und IgE Immunglobulinen. Am meisten bevorzugt werden IgG und IgM und IgG Immunglobuline (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).
Antikörperfragmente zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Fragmente von Bakterien- oder Protozoen-neutralisierenden Antikörper, in denen die variable Bindungsstellenregion erhalten ist. Beispielhaft sind F(ab')₂ Fragmente, F(ab') Fragment und Fab Fragmente. Vgl. im allgemeinen Immunology: Basic Processes, 95–97 (J. Bellanti Hrsg. 2. Ausgabe 1985).
Antikörper oder Antikörperfragmente zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können noch an weitere Elemente gekoppelt sein. So kann z. B. eine Mikrosphäre oder ein Mikropartikel an den Antikörper oder an das Antikörperfragment gekoppelt sein, wie beschrieben in US-PS 4,493,825 von Platt, dessen Offenbarung durch Bezugnahme Teil der Beschreibung ist.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bakterien oder Protozoen verwendet, die pathogen wären (d. h. in der Lage, eine Krankheit auszulösen), wenn sie nicht an einen neutralisierenden Faktor gekoppelt wären. Die Pathogenität der Bakterien oder Protozoen kann den Bakterien oder Protozoen inhärent sein oder in der Empfänglichkeit des zu behandelnden Versuchsobjekts (z. B. Vögel in ovo) begründet sein. Im allgemeinen haben viele pathogene Bakterien oder Protozoen den positiven Effekt, aktive Immunität in Versuchsobjekten auszulösen, die damit infiziert werden, und viele attenuierte Impfstoffstämme von Bakterien oder Protozoen haben die Fähigkeit, zumindest ein wenig Krankheit in einem Versuchsobjekt auszulösen. Somit bedeutet der hier verwendete Begriff „pathogen", der dazu verwendet wird, die Bakterien oder Protozoen zu beschreiben, dass der Schaden, der durch Verabreichung der Bakterien oder Protozoen ausgelöst wird, jeden Nutzen übertrifft, der daraus resultieren würde. Ein „aktiver" oder „lebender" Organismus bezieht sich auf einen Organismus, der nicht abgetötet ist. Ein „Impfstofforganismus" bezieht sich auf einen Organismus, der zur Induktion einer schützenden Immunantwort verwendet wird, obwohl negative Nebeneffekte auftreten können (in solchen Fällen übertrifft der Nutzen der aktiven Immunität jegliche negativen Nebenwirkungen). Es wird bevorzugt, dass die Bakterien oder Protozoen lebende Organismen sind, die in dem zu behandelnden Versuchsobjekt eine aktive Immunantwort auslösen.
Das Impfstoffkonjugat wird in die Impfstoffzusammensetzungen in einer Menge aufgenommen, die ausreicht, um in dem zu behandelnden Versuchsobjekt eine aktive Immunantwort gegen das Bakterium oder den Protozoen auszulösen. Der hier verwendete Begriff „Immunantwort" bezeichnet jedes Ausmaß an Schutz aus nachfolgender Behandlung mit dem Bakterium öder dem Protozoen, der in einer Population von Versuchsobjekten einen gewissen Nutzen hat, entweder in Form von verringerter Mortalität, verringerten Läsionswerten, verbesserten Futterumsatzraten, oder der Verringerung von irgendwelchen anderen schädigenden Effekten der Krankheit, ungeachtet dessen, ob der Schutz teilweise oder vollständig ist.
Im Hinblick auf das Ausmaß an Schutz, das durch den neutralisierenden Faktor bereitgestellt wird, muss die Menge an neutralisierendem Faktor, der in Kombination mit dem Bakterium oder dem Protozoen im Impfstoff verabreicht wird, nicht ausreichen, um einen vollständigen Schutz vor dem Bakterium oder Protozoen zu gewährleisten, solange die durch das Bakterium oder den Protozoen erzeugte schädigende Antwort auf ein Maß reduziert wird, an dem der Nutzen der erzeugten Immunantwort jeglichen Schaden, der aus der Infektion resultiert, übertrifft.
Der hier verwendete Begriff „Versuchsobjekte" soll unter anderem sowohl Säuger als auch Vögel umfassen. Beispielhafte Säuger umfassen Mäuse, Ratten, Schweine, Kaninchen, Schafe, Frettchen, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde und Primaten, einschließlich Menschen. Der Begriff „Vögel" umfasst Männchen und Weibchen jeder Vogelspezies, ist jedoch in erster Linie auf Geflügel gerichtet, die für Fleisch oder Eier kommerziell gezüchtet werden. Daher umfasst der Begriff „Vogel" insbesondere Hühner, Gockel und Enteriche von Hühnern, Truthähne, Enten, Gänse, Wachteln und Fasan.
Bakterien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen in nicht beschränkender Weise Actinobacillosis lignieresi, Actinomyces bovis, Aerobacter aerogenes, Anaplasma marginale, Bacillus anthracis, Borrelia anserina, Brucella canis, Clostridium chauvoei, C. hemolyticium C. novyi, C, perfringens, C. septicum. C. tetani, Corynebacterium equi, C. pyogenes, C. renale, Cowdria ruminantium, Dermatophilus congolensis, Erysipelothrix insidiosa, Escherichia coli, Fusiformis necrophorus, Haemobartonella canis, Hemophilus spp. H. suis, Leptospira spp., Moraxella bovis, Mycoplasma spp. M. hyopneumoniae, Nanophyetus salmincola, Pasteurella anatipestifer, P. hemolytica, P. multocida, Salmonella abortus-ovis, Shigella equirulis, Staphylococcus aureus, S. hyicus., S. hyos, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. equi, S. uberis, und Vibrio fetus (für die entsprechenden Krankheiten siehe Veterinary Pharmacology and Therapeutics 5. Ausgabe, Seite 746 Tabelle 50.2 (N. Booth und L. McDonald Hrsg., 1982) (Iowa State University Press); und Corynebacterium diptheriae, Mycobacterium bovis, M. leprae, M. tuberculosis, Nocardia asteroides, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Brucella spp., Francisella tularenssis, Legionella pneumophila, Chlamydia psittaci., C. trachomatis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, S. typhimurium, Yersinia enterocolitica, Y. pestis, Vibriocholera, Haemophilus influenza, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, N. meninigitidis, Coxiella burneti, Rickettsia mooseria, R. prowazekii, R. rickettsii, R. tsutsugamushi, Borrelia spp., Leptospira interrogans, Treponema pallidum, und Listeria monocytogenes (für die entsprechenden Krankheiten siehe R. Stanier et al., The Microbial World, Seiten 637–38 Tabelle 32.3 (5. Ausgabe 1986).
Protozoen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen in nich-beschränkender Weise die Kokzidiose-auslösende Spezies Eimeria (E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. acervulina, E. mivati, und E. maxima), Anaplasma marginale, Giardia Spezies z. B., Giardia lamblia), Babesia Spezies (z. B., B. canis, B. gibsoni, B. equi, B. caballi, B. bigemina, B. argentina, B. divergens, und B. bovis), Trichomonas foetus, Entamoeba histolytica, und Balantidium coli; Plasmodium Spezies (z. B., P. falciparum, P. malariae, P. vivax, und P. ovale), Leishmania Spezies (z. B., L. donovani, L. braziliensis, L. tropica, und L. mexicana), Trvpanosoma Spezies z. B., T. brucei und T. cruzi), Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis, Toxoplasmosa gondii, und Pneumocystis carinii. Der hier verwendete Begriff „Vogel-Protozoe" ist ein Protozoe, von dem man weiß, dass er Vögel infizieren kann.
Die Organismen können in jeder geeigneten Form verabreicht werden, einschließlich Sporen oder Cysten davon. So können z. B. infektiöse kokzidiale Organismen in Form von sporulierten Oocysten, Sporozoiten und Sporocysten verabreicht werden.
Die genaue Anzahl der in Form eines Konjugats verabreichten Organismen ist nicht kritisch, ausgenommen dass die Anzahl wirksam sein muss, um eine immunologische Reaktion durch das Tier auszulösen. Im allgemeinen beträgt die Anzahl der verabreichten Organismen, in Abhängigkeit vom Organismus, dem Ort und der Weise der Verabreichung, dem Alter und dem Zustand des Versuchsobjekts, etc. von 1, 10 oder 100 Organismen bis zu 1000, 10000, 100000 oder 1 Million Organismen. Wenn die Organismen an Vögel in ovo (in Eier) als Konjugat verabreicht werden, dann kann die Dosierung von 50, 100, oder 500 bis zu 2000, 10000, 20000, 30000, 50000 oder 100000 oder mehr Organismen betragen.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können an Versuchsobjekte auf jede beliebige Weise verabreicht werden. Beispielhaft sind die orale Verabreichung, durch intramuskuläre Injektion, durch subkutane Injektion, durch intravenöse Injektion, durch intraperitoneale Injektion, durch Augentropfen oder durch Nasenspray. Wenn das zu behandelnde Versuchsobjekt ein Vogel ist, dann kann der Vogel ein geschlüpfter Vogel sein, einschließlich einem frisch geschlüpften Vogel (d. h., etwa die ersten drei Tage nach dem Schlüpfen), ein jugendlicher und ein erwachsener Vogel. Das Impfstoff kann an Vögel in ovo verabreicht werden, wie beschrieben in US-PS 4,458,630 von Sharma (die Offenbarung dieser und aller anderer hier zitierten Patentreferenzen ist durch Bezugnahme Teil der Beschreibung).
Die in ovo Verabreichung des Impfstoffs erfordert die Verabreichung des Impfstoffs an Eier. Eier, an die der erfindungsgemäße Impfstoff verabreicht wird, sind fertile Eier, die sich vorzugsweise im vierten Viertel der Inkubation befinden. Hühnereier werden am 15. bis zum 19. Tag der Inkubation behandelt, und werden bevorzugt etwa am 18. Tag der Inkubation (der 18. Tag der Embryonalentwicklung) behandelt. Truthahneier werden bevorzugt am 21–25. Tag der Inkubation behandelt, bevorzugt am 25. Tag der Inkubation.
Der Impfstoff kann auf jede Weise, die den Impfstoff durch die Hülle transportiert, an das Ei verabreicht werden. Die bevorzugte Verabreichungsart ist jedoch die Injektion. Die Injektionsstelle ist bevorzugt innerhalb der durch das Amnion definierten Stelle, einschließlich der Amnionflüssigkeit und dem Embryo selbst, im Dottersack, oder in der Luftzelle. Bevorzugt wird in die durch das Amnion definierte Stelle injiziert. Am Beginn des vierten Viertels der Inkubation ist das Amnion ausreichend vergrößert, so dass seine Penetration fast immer dann sichergestellt wird, wenn die Injektion von der Mitte des großen Ende des Eies entlang der longitudinalen Achse gesetzt wird.
Der Mechanismus der Injektion in das Ei ist nicht kritisch, aber es ist bevorzugt, dass das Verfahren die Gewebe und Organe des Embryos oder der extraembryonalen Membranen, die ihn umgeben, nicht beschädigen, so dass die Behandlung die Schlüpfrate nicht verringert. Eine hypodermische Spritze mit einer Nadel von etwa 18 bis 22 G ist für diesen Zweck geeignet. Zur Injektion in die Luftzelle muss die Nadel nur etwa 2 mm weit in das Ei eingesetzt werden. Eine Nadel von 1 inch Ausmaß durchdringt die Hülle, die äußere und innere Zellmembran, die die Luftzelle und das Amnion umschließen, wenn sie vom Zentrum des großen Ende des Eis vollständig eingesetzt wird. In Abhängigkeit von der genauen Entwicklungsstufe und der Position des Embryos, wird eine Nadel dieser Länge entweder in der Flüssigkeit oberhalb des Kükens oder im Küken selbst enden. Ein Vorloch kann vor dem Einsetzen der Nadel durch die Hülle gestochen oder gebohrt werden, um eine Beschädigung oder ein Abstumpfen der Nadel zu verhindern. Wenn erwünscht, dann kann das Ei mit einem in wesentlichem bakterien-undurchlässigen Versiegelungsmaterial wie Wachs oder Ähnlichem versiegelt werden, um das nachfolgende Eindringen von unerwünschten Bakterien zu vermeiden.
Es ist vorgesehen, dass ein Hochgeschwindigkeits-automatisiertes Ei-Injektionssystem für Vogelembryonen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung besonders geeignet ist. Solche Vorrichtungen sind in zahlreicher Weise erhältlich, beispielhaft sind jene aus US-PS 4,681,063 von Hebrank und US-PS 4,040,388 ; 4,469,047 und 4,593,646 von Miller zu nennen. All diese Vorrichtungen, zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angepasst, umfassen einen Injektor, der den hier beschriebenen Impfstoff enthält, wobei der Injektor so positioniert ist, dass ein Impfstoff in ein Ei injiziert werden kann, dass von der Vorrichtung gehalten wird. Andere Eigenschaften der Vorrichtung werden oben definiert. Zusätzlich kann, wenn gewünscht, eine Versiegelungsvorrichtung, die funktionell mit der Injektionsvorrichtung gekoppelt ist, bereitgestellt werden, um nach der Injektion das Loch im Ei zu versiegeln.
Bevorzugte Vorrichtungen zur Injektion ins Ei zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind in den US-PS 4,681,063 und 4,903,635 von Hebrank offenbart. Diese Vorrichtung umfasst einen Injektionsapparat zum Transport von flüssigen Substanzen in eine Vielzahl von Eiern und eine Saugvorrichtung, die gleichzeitig eine Vielzahl von einzelnen Eiern aus ihren aufwärts gerichteten Teilen erfasst und anhebt und mit der Injektionsvorrichtung zur Injektion in die Eier kooperiert, während die Eier von der Saugvorrichtung erfasst werden. Die Eigenschaften dieser Vorrichtung können mit den Eigenschaften der vorstehend beschriebenen Vorrichtung zur Durchführung der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Bevorzugte Testobjekte zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Vögel.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung verwendet bevorzugt Vögel in ovo.
Ein erfindungsgemäßes Impfstoffkonjugat wird hergestellt durch Vermischen des neutralisierenden Faktors mit einem lebenden Bakterium oder Protozoen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine ausreichende Zeit, um ein Konjugat aus neutralisierendem Faktor und lebendem Bakterium/Protozoen zu erzeugen (z. B. durch Kombinieren des neutralisierenden Faktor und des Bakteriums oder des Protozoen in einem herkömmlichen flüssigen Träger vor der Verabreichung an ein Versuchsobjekt, bis sich ein Konjugat gebildet hat. Dies kann vorteilhafterweise durchgeführt werden durch einfache Zugabe von Hyperimmunserum, das neutralisierende Antikörper enthält, zu einer wässrigen Lösung, die die lebenden Bakterien oder Protozoen enthält. Erfindungsgemäße Impfstoffformulierungen umfassen vorzugsweise das Impfstoffkonjugat in lyophilisierter Form oder das Impfstoffkonjugat in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind vorzugsweise flüssige, insbesondere wässrige Träger. Zum Zwecke der Herstellung solcher Impfstoffformulierungen können der neutralisierende Faktor und die Bakterien oder Protozoen in Natriumphosphat-gepufferter Saline (pH 7,4), herkömmlichen Medien wie MEM oder Bakterienwachstumsmedien vermischt werden. Die Impfstoffformulierung kann in einem sterilen Glasbehälter gelagert werden, der mit einem Gummistopfen verschlossen ist, durch den Flüssigkeiten injiziert werden können und durch den Formulierung durch eine Spritze entnommen werden kann.
Das erfindungsgemäße Impfstoffkonjugat oder der Komplex ist ein Komplex oder Konjugat aus Antikörpern und Lebendimpfstoff-Organismen; die Bindung zwischen Antikörper und Impfstofforganismus ist lösbar und keine kovalente Bindung. Die Menge an neutralisierenden Antikörpern, die zur Verwendung mit einem gegebenem Impfstofforganismus und in einem gegebenem Versuchsobjekt geeignet ist kann durch bekannte Verfahren leicht bestimmt werden. Die Verwendung von zu wenig Antikörper wird zu unerwünscht frühen oder ernsten pathogenen Effekten führen, die durch den Impfstofforganismus ausgelöst werden; die Verwendung von zuviel Antikörper kann den Impfstofforganismus vollständig inaktivieren oder unfähig machen, eine schützende Immunantwort zu erzielen.
Erfindungsgemäße Impfstoffformulierungen können optional ein oder mehrere Adjuvanzien enthalten. Jedes geeignete Adjuvans kann verwendet werden, einschließlich chemischer und Polypeptid-Immunstimulantien, die die Reaktion des Immunsystems auf das Antigen erhöhen. Vorzugsweise werden Adjuvanzien wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, pflanzliche und tierische Öle und Ähnliche mit dem Impfstoffkonjugat in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Immunantwort des Testobjektes auf das Impfstoffkonjugat zu erhöhen. Die Menge an Adjuvans, die zum Impfstoffkonjugat zugegeben wird, hängt von der Art des Adjuvans ab, und liegt im allgemeinen im Bereich vom etwa 0,1-fachen bis zum etwa 100-fachen des Gewichts der Bakterien oder Protozoen, vorzugsweise von etwa 1-fachen bis zum 10-fachen des Gewichts der Bakterien oder Protozoen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen können optional einen oder mehrere Stabilisatoren enthalten. Jeder geeignete Stabilisator kann verwendet werden, einschließlich Kohlehydrate wie Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sucrose, Dextrin oder Glukose; Proteine wie Albumin oder Casein, und Puffer wie Alkalimetallphosphate und Ähnliches. Die Verwendung eines Stabilisators ist besonders vorteilhaft, wenn die Impfstoffformulierung eine lyophilisierte Formulierung ist.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher in den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1
Bakterienspezies
Das Bakterium Pasteurella multocida verursacht in vielen Vogelspezies eine hochansteckende Krankheit. Die Krankheit, Fowl Cholera, tritt häufig als septikämische Krankheit auf und führt zu hoher Morbidität und Mortalität. Es gibt einige Lebendimpfstoffe gegen Fowl Cholera, die sowohl an Hühner als auch an Truthähne verabreicht werden können.
Ein Stamm von P. multocida wird in vitro mit Antikörpern komplexiert, die spezifisch für P. multocida sind, um Bakterium-Antikörper Komplexe zu erzeugen. Verschiedene Verhältnisse von Bakterium zu Antikörper werden getestet, um ein Verhältnis zu bestimmen, welches das Bakterium nicht vollständig inaktiviert, und immer noch eine aktive Immunantwort zulässt. Diese Komplexe werden entweder in Hühnern oder Truthähnen als Impfstoff verwendet. Die Reaktionen auf den Impfstoff werden überwacht und mit den Reaktionen von Vögeln verglichen, die mit der gleichen Dosis eines P. multocida Impfstoffs, der nicht mit Antikörpern komplexiert ist, geimpft wurden. Läsionen nach der Impfung, die Antikörperreaktion über den Verlauf der Zeit und die allgemeine Vogelgesundheit werden während der Studie überwacht.
Andere Bakterien werden ebenfalls auf die gleiche Weise getestet. Diese Bakterien beinhalten in nicht-beschränkender Weise Mycoplasma gallisepticum in Hühnern oder Truthähnen, Bordetella avium in Truthähnen, Salmonella Spezies in Hühnern oder Truthähnen, und Salmonella und Listeria Spezies in Nagern.
Impfstoffkonjugate werden an Vögel entweder wie vorstehend beschrieben in ovo oder nach dem Schlüpfen verabreicht.
BEISPIEL 2
Protozoen-Spezies
Der Protozoe Eimeria acervulina (genauer, Sporocysten und/oder Oocysten davon) wird in vitro mit Antikörpern komplexiert, die für Eimeria acervulina spezifisch sind, um Protozoen-Antikörperkomplexe zu bilden. Diese Komplexe werden in Hühnern als Impfstoffe verwendet. Die Reaktionen auf den Protozoen-Antikörperkomplex werden beobachtet und mit Reaktionen von Vögeln verglichen, die mit der gleichen Dosis von E. acervulina geimpft wurden, ohne Komplexierung mit Antikörpern. Verschiedene Verhältnisse von Protozoe zu Antikörper werden getestet, um ein Verhältnis zu bestimmen, welches den Protozoen nicht vollständig inaktiviert, und immer noch das Auftreten einer aktiven Immunantwort ermöglicht. Die Ausscheidung von Oocysten in geimpften Fezes, die intestinale Absorptionsfähigkeit (bewertet durch Aufnahme von Cartenoid) und das Körpergewicht werden nach der Impfung bestimmt. 10–21 Tage nach der Impfung erhalten Vögel in jeder geimpften Gruppe eine virulente Challenge mit E. acervulina. Ausscheidung von Oocysten in geimpftem Fezes, Zunahme an Körpergewicht während des Behandlungszeitraums und intestinale Absorptionsfähigkeit (bewertet durch Aufnahme von Cartenoid) werden für geimpfte und ungeimpfte Kontrollen bestimmt.
Andere Eimeria Spezies werden ebenfalls in Hühnern, Truthähnen und Nagern getestet, als auch Cryptosporidium Spezies in Hühnern oder Truthähnen und Histomonas meleagridis in Hühnern oder Truthähnen.
Impfstoffkonjugate werden an Vögel entweder in ovo wie vorstehend beschrieben oder nach dem Schlüpfen verabreicht.
BEISPIEL 3
Ausscheidung von Eimeria Oocysten nach Impfung
Hühner wurden geimpft und untersucht, um die Effekte der Komplexierung eines E. acervulina Oocysten-Impfstoffs mit einem Antikörper zu untersuchen.
Vier Impfstrategien wurden untersucht. Behandlungsgruppen wurden (durch orale Magensonde) mit 500 E. acervulina sporulierten Oocysten geimpft, die mit entweder 0, 2.5, 25 oder 150 Einheiten polyklonalem Antikörper, der für E. acervulina spezifisch ist, komplexiert waren. Jede Behandlung wurde 3 Gruppen von je 5 Leghorn Hühnern zuteil (in jeder Gruppe insgesamt 15 Vögel; insgesamt 60 Behandlungsvögel). Eine Kontrollgruppe von 15 Vögeln (5 Vögel in 3 Wiederholungen) erhielten keine Oocysten und keinen Antikörper, wurden aber durch eine oral Magensonde mit 0,1 ml PBS behandelt, dass am Tage des Schlüpfens verabreicht wurde und wurden nachfolgend einer Challenge unterzogen.
Antikörpereinheiten werden auf einer volumetrischen Basis definiert, wobei 1 μl = 1 Einheit. Ein ELISA Assay wurde dazu verwendet, die „Titereinheiten" der im vorliegenden Beispiel verwendeten Antikörperzubereitung zu bestimmen; dieser Assay wurde jedoch nicht validiert. Nach dem ELISA Assay hatte die E. acervulina Antikörperzubereitung einen Titer von 90,782 Einheiten/ml. Die hier genannten Dosen stellen relative Vergleiche bereit; die geeignete Menge an zu komplexierendem Antikörper mit einem gegebenem Organismus hängt von dem Organismus ab, von der Antikörperzubereitung und dem beabsichtigten Testobjekt. Ein Fachmann kann unter Verwendung von bekannten Techniken geeignete Organismus : Antikörper-Verhältnisse für eine bestimmte Verwendung bestimmen.
Die Oocysten und Antikörper wurden in PBS für mindestens 1 Stunde vor der Impfung bei Raumtemperatur vermischt. Der Impfstoffkomplex wurde dann bis zur Verabreichung bei 4°C gelagert. Hühner wurden am Tage des Schlüpfens geimpft.
Ausscheidung von Oocysten nach der Impfung wurde durch Sammeln von Fezes an den Tagen 4–8 nach der Impfung und Zählen der Oocysten im Fezes bestimmt. Der Mittelwert der Oocysten-Ausscheidung und die Standardabweichung wurde für jede Gruppe bestimmt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, reduzierte die Verwendung von 150 μl Antikörper, komplexiert mit 500 Oocysten auf signifikante Weise die Ausscheidung von Oocysten.
Tabelle 1 Infektiösität – Ausscheidung von Oocysten pro Vogel
BEISPIEL 4
Ausscheidung von Eimeria Oocysten nach Challenge
Vögel in den in Beispiel 1 beschriebenen Behandlungsgruppen wurden dann am Tage 13 nach dem Schlüpfen einer Challenge mit 250 Oocysten von E. acervulina in PBS unterzogen, verabreicht durch orale Magensonde. 4–8 Tage nach der Challenge wurde Fezes gesammelt, und die durchschnittliche Ausscheidung von Oocysten wurde als Prozentsatz der Oocysten-Ausscheidung der Kontrollgruppe bestimmt (das statistische Modell beinhaltete die Kontrollgruppe). Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Eine stärkere Ausscheidung von Oocysten nach der Challenge zeigt einen schwächeren Schutz gegen die Challenge mit dem Pathogen.
Tabelle 2 – Schutz nach der Challenge
BEISPIEL 5
Schutz nach Challenge
Daten, die in Tabelle 2 bereitgestellt wurden, wurden ohne die Kontrollgruppendaten im statistischen Modell re-analysiert. Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Die in den Beispielen 1–3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von 150 μl Antikörper zusammen mit der Impfdosis von 500 E. acervulina Oocysten entweder zu einer Verringerung der pathogenen Effekte der Impfung führte (verglichen mit der Verwendung der gleichen Impfung mit geringeren Mengen an Antikörpern, oder keinem Antikörper; dies zeigte sich durch verringerte Ausscheidung von Oocysten nach der Impfung), oder möglicherweise eine Verzögerung der pathogenen Effekte der Impfdosis. Wie in Tabelle 1 gezeigt, führte die Verwendung von 150 μl Antikörper, komplexiert an die Impfstoff-Oocysten zu einem geringeren Infektiösitätslevel als die Impfung ohne Antikörper oder die Verwendung von geringeren Mengen Antikörpern (p ≤ 0,15).
Wie in Tabelle 2 gezeigt, hatten Vögel, die mit Antikörper-Oocysten-Impfstoff geimpft wurden, nach einen Challenge mit 250 E. acervulina Oocysten eine verminderte Ausscheidung von Oocysten, verglichen mit ungeimpften Vögeln. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Impfstoff-Zubereitung aus Antikörper und Oocysten wirksam eine schützende Immunantwort gegen das Challenge-Pathogen hervorrufen kann. Der Schutz war am besten in der Behandlungsgruppe, die mit Oocysten, aber ohne Antikörper geimpft wurde, mit einer Signifikanzschwelle von 0,05. Wie in Tabelle 3 gezeigt, sieht man auch bei Vögeln, die mit dem Antikörper-Oocysten-Impfstoff geimpft wurden, den besten Schutz in der Gruppe, die mit Oocysten, aber nicht mit Antikörper behandelt wurde.
Die vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung eines Impfstoffkomplexes aus Antikörper und Oocysten entweder zu einer Reduzierung der pathogenen Effekte der Impfstoff-Oocysten führte, oder zu einer Verzögerung der pathogenen Effekte der Impfstoff-Oocysten, während immer noch eine schützende Immunantwort entsteht. Man würde erwarten, dass jeder Effekt die Sicherheit des Impfstoffs erhöhen würde, entweder indem man zulässt, dass der Impfstoff an Versuchsobjekte verabreicht wird, die für die pathogenen Effekte des Impfstofforganismus empfänglicher sind, oder an jüngere Versuchsobjekte (wie z. B. Vögel in ovo).
Das Vorhergehende veranschaulicht die vorliegende Erfindung, und beschränkt diese nicht. Die Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.
BEISPIEL 6
Verwendung eines Antikörper-Oocysten (Eimeria acervulina) Impfstoffkonjugats in einem niedrig dosierten Challenge-Modell
In dieser Untersuchung wurde ein Impfstoff aus 500 Eimeria acervulina Oocysten getestet, die an variierende Mengen Antikörper komplexiert waren (2,5–150 μl). Behandlungen wurden mit einer ungeimpften Kontrolle und einer Kontrolle, die ohne Antikörper geimpft wurde, verglichen. Alle Behandlungen erfolgten einen Tag nach dem Schlüpfen. Die Ausscheidung von Oocysten wurde für alle Behandlungen 4–8 Tage nach der Impfung gemessen. Ausscheidung von Oocysten wurde auch nach einer Challenge in niedriger Dosierung am Tag 13 gemessen.
Material und Methoden: Hyvac SPF Leghorn Hühner wurden verwendet, um jeglichen Effekt maternaler Antikörper auszuschließen. Polyklonale Antikörper wurden aus Hühnern produziert, die mit E. acervulina Oocysten geimpft wurden. Zwei Antikörper-Präparationen wurden kombiniert, um einen E. acervulina Antikörper mit einem endgültigen Titer von 90,782 zu erzeugen. Die Behandlungsgruppen und der Versuchsaufbau sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Der Impfstoffkomplex wurde durch Vermischen von Oocysten (USDA # 12 Charge 28-131-36) mit Antikörper in einem geeigneten Volumen erzeugt. Der Komplex wurde eine Stunde vor der Verabreichung bei Raumtemperatur inkubiert. Vögel erhielten am Tag des Schlüpfens eine 200 μl Dosis der jeweiligen Behandlung über eine Magensonde. Fäkales Material wurde von Tag 4 bis zum Tag 8 gesammelt. Fäkale Proben wurden gesammelt und mit McMaster-Kammern gezählt, um die Ausscheidung von Oocysten pro Vogel zu bestimmen.
Die Vögel wurden in einen Brutraum umgesetzt und am Tage 13 nach dem Schlüpfen einer niedrig dosierten Challenge unterzogen (250 E. acervulina Oocysten). Fezes wurde an den Tagen 4–8 nach der Challenge gesammelt und wie vorstehend beschrieben gezählt.
Die geimpfte Kontrolle zeigte ≈ 12 × 10⁶ ausgeschiedene Oocysten pro Vogel. Die Behandlungen mit 2,5 μl und 25 μl Antikörper zeigten ähnliche Ergebnisse, die Behandlung mit 150 μl Antikörper kann jedoch einen hemmenden Effekt gehabt haben, da im Vergleich zur Kontrolle lediglich 46% ausgeschieden wurden. Siehe 1.
Nach einer niedrig dosierten Challenge zeigten sich in allen mit Antikörper geimpften Behandlungsgruppen ähnliche Ergebnisse. 3. Die drei Antikörper-Behandlungsgruppen hatten durchschnittlich 40% Ausscheidung der Kontrolle. Die geimpfte Kontrolle zeigte lediglich 23% Ausscheidung der Kontrolle.
BEISPIEL 7
Verwendung eines Antikörper-Oocysten (Eimeria acervulina) Impfstoffkonjugats in einem hoch dosierten Challenge-Modell
Zwei Antikörper-Oocysten Impfstoffkonjugat-Formulierungen wurden in einem hochdosierten Challenge-Modell getestet. Die Infektiösität wurde durch Ausscheidung von Oocysten und durch Reaktion auf Challenge gemessen, wie gemessen durch Gewichtszunahme und Läsionswerte. Die Impfstoffkonjugate bestanden aus 500 E. acervulina Oocysten, komplexiert entweder mit 25 oder 150 μl Antikörper (wie in Beispiel 6 beschrieben); siehe Tabelle 5. Es wurden der gleiche Vogelstamm, Antikörper und Oocysten Charge wie in Beispiel 6 beschrieben verwendet.
Tabelle 5
Impfstoffe wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und am Tage 0 nach dem Schlüpfen in einem Volumen von 200 μl verabreicht. Fäkales Material wurde am Tag 4–8 gesammelt und ausgezählt.
Die im gegenwärtigen Experiment gemessenen Post-Challenge Parameter unterschieden sich von Beispiel 6. Am Tage 13 wurden alle Behandlungsgruppen einer hochdosierten Challenge unterzogen und das Gewicht jedes einzelnen Vogels wurde aufgezeichnet. Nach 8 Tagen (Tag 21) wurden die Vögel gewogen und die Läsionen gezählt.
Die Ausscheidung von Oocysten war in diesem Experiment für die geimpfte Kontrolle niedriger, wie auch für die beiden Antikörperbehandlungen, verglichen mit Beispiel 6; die geimpfte Kontrolle (ohne Antikörper) zeigte eine 20-fache Abnahme in der Ausscheidung von Oocysten (siehe 2). Der Grund für diese Reduzierung ist unklar.
Alle Behandlungsgruppen wurden einer hochdosierten Challenge unterzogen (Challenge mit 500 Oocysten) und die Gewichtszunahme und die Läsionswerte wurde untersucht. Ergebnisse aus der Gewichtszunahme (4) zeigten keinen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen, einschließlich der geimpften und der ungeimpften Kontrollen. Die Ergebnisse der Läsionswerte (5) zeigten einen Schutz aller geimpften Gruppen gegenüber den ungeimpften Kontrollen.
BEISPIEL 8
Pasteurella multocida
Erzeugung von Antiserum gegen P. mu multocida: 10 SPF-Küken wurden vom Schlüpfen an in einem sterilen Raum untergebracht; im Alter von 4 Wochen erhielt jeder Vogel (subkutane Injektion in den Hals) 0,5 ml Solvay's „Pabac", einen käuflichen inaktivierten P. multocida Öl-Emulsions-Impfstoff, der die Serotypen 1, 3 und 4 enthält; im Alter von 8 Wochen wurden zusätzlich 0,5 ml subkutan in den Hals injiziert und weitere 0,5 ml wurden intramuskulär in die rechte Brust injiziert. Im Alter von 10 Wochen wurden jedem Vogel durch Herzpunktion etwa 20 ml Blut entnommen. Aus dem Blut wurde Antiserum gewonnen, gepoolt, und durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Nach zahlreichen Sterilitätstests, die alle negative Ergebnisse zeigten, wurden die Antiseren in Röhrchen unterschiedlicher Größe gegeben und bis zur Verwendung in einem Kühlschrank bei –20°C gelagert.
Isolierung und Titerbestimmung der Cu und M9-Stämme von P. multocida
Die Stämme Cu und M9 von P. multocida wurden aus Lebendimpfstoffen herangezogen, Choleramune Cu bzw. Multimune M, die beide von Biomune hergestellt werden. Es wurde bestimmt, dass sich diese Stämme von P. multocida am besten bei –70°C in einem Gemisch von 90% Kultur und 10% Glycerin einfrieren lassen.
BEISPIEL 9
Schlüpffähigkeit von Eiern, die am Tag 18 mit P. multocida inokuliert wurden
Dieses Experiment war dazu gedacht, zu bestimmen, ob verschiedene Anzahlen von koloniebildenden Einheiten (CFUs) von P. multocida Stämmen Cu und M9 die Schlüpffähigkeit von SPF Eiern nach in ovo Inokulation am Tage 18 der Inkubation beeinflussten. Jeder P. multocida Stamm wurde in phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnt, um drei Verdünnungen zu erzeugen: 1000 CFUs pro 0,1 ml; 100 CFUs pro 0,1 ml; und 10 CFUs pro 0,1 ml. Am Tage 18 der Inkubation wurden 0,1 ml jeder Verdünnung für jeden Stamm in vierzehn SPF-Eier inokuliert. 13 Eier wurden mit 0,1 ml eines Gemisches einer „Brain Heart Infusion Broth" (BHI), PBS und Glycerin (Vehikelkontrolle) inokuliert und 13 Eier erhielten keine Inokulation.
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, dass die Schlüpffähigkeit von SPF Eiern in den Gruppen 2 bis 7 stark behindert war.
Tabelle 6 Schlüpffähigkeit von SPF Eiern nach Inokulation von P. multocida am Tag 18
In jedes inokulierte Ei wurden 0,1 ml eines Gemisch aus Kultur/PBS inokulert, das die geeignete Anzahl von CFUs enthielt. Die Verdünnungen, die 1 × 10(2) CFUs/ml enthielten, wurden für jeden Stamm titriert und die Titer unterschieden sich ein wenig von den Zielzahlen. Gruppe 4 enthielt 10,5 CFUs/Ei, Gruppe 3 105 CFUs/Ei und Gruppe 2 enthielt 1050 CFUs/Ei. Gruppe 7 enthielt 12,5 CFUs/Ei, Gruppe 6 125 CFUs/Ei und Gruppe 5 1250 CFUs/Ei. Eier der Gruppe 1 wurden mit 0,1 ml eines Gemisches aus BHI/PBS/Glycerin inokuliert.
BEISPIEL 10
Koloniewachstum von P. multocida nach Komplexierung mit Hühner-Antiserum
1 ml des Hühner-P. multocida Antiserums (siehe Beispiel 8) wurde aus –20°C genommen und bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Serum wurde in Reihen verdünnt, 2-fach in PBS. 0,5 ml jeder Serumverdünnung wurden mit 0,5 ml einer P. multocida Cu-Stammkultur vermischt, der 100 CFUs/0,5 ml enthielt. Dieses Gemisch reagiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Ablauf einer Stunde wurden 0,5 ml jedes Serum-Verdünnungsgemisch auf TSA-Platten im Doppelansatz verdünnt und die Vorratslösung mit 200 CFUs/ml P. multocida Cu-Stamm wurde dreifach plattiert. Die Platten wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation gezählt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 und 8 dargestellt. Tabelle 7
Tabelle 8 Titer der 2 × 10(2) Vorratslösung des P. multocida Cu Stamm
Proben der Vorratslösung in Tabelle 8 wurden nach Zubereitung aller Gemische plattiert. Die Lösung wurde nicht für eine weitere Stunde stehen gelassen. Ein Gemisch von 0,5 ml dieser Vorratslösung und 0,5 ml Antiserum erzeugt erwartete 152 CFUs/ml Gemisch.
Die Ergebnisse zeigen einen Rückgang der Anzahl der bakteriellen CFUs vom am wenigsten verdünnten Antiserum zum am stärksten verdünnten Antiserum (Tabelle 7). Dies kann auf die Reaktionszeit zurückzuführen sein. Das am stärksten verdünnte Antiserum reagierte länger mit der Lebendkultur als das am wenigsten verdünnte Antiserum (20–30 Minuten länger). Die gesteigerte Zeit kann dazu geführt haben, das mehr Kolonien absterben. Wiederholtes Vortexen der Vorratslösung (3–4 CFUs/ml) kann auch zu dem beobachteten Rückgang der Koloniezahl geführt haben. Das nächste Beispiel untersucht diesen Trend weiter.
BEISPIEL 11
Dieses Experiment untersucht die Reaktion zwischen den Kolonien des P. multocida Cu-Stamm und den gleichen Verdünnungen des P. multocida Antiserums wie in Tabelle 6 gezeigt. Anstatt die „2 × 10(2)" Vorratslösung des P. multocida Stammes kontinuierlich zu vortexen wie im vorigen Experiment, wurde die Lösung durch Pipetieren sanft gemischt. Zur Bildung des jeweiligen Antikörper-Bakterium-Komplexes wurde jeweils 1 ml der Antikörperverdünnung mit 1 ml der verdünnten Kultur-Vorratslösung vermischt. Dieses Gemisch durfte für 1 Stunden reagieren. Die Vorratslösung wurde dreifach auf TSA-Platten plattiert und es wurde festgestellt, dass sie 186 CFUs/ml enthält (Tabelle 9). Der Rest dieser Lösung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden stehen gelassen.
Nach der Reaktionszeit von 4 Stunden, wurden 0,5 ml jedes Antikörper-Bakteriumsgemisch vermischt und doppelt auf TSA plattiert. Die Vorratslösung mit 186 CFU/ml wurde vermischt und dreifach auf TSA plattiert (0,5 ml Platte). Die Kolonien wurden 24 Stunden nach der Inkubation bei 37°C gezählt und nochmals nach 96 Stunden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9 und 10 dargestellt.
Tabelle 9 Titer der geplanten 2 × 10(2) CFUs/ml endgültigen Vorratslösung des P. multocida Stamm Cu
Tabelle 10
Die Ergebnisse in Tabelle 10 zeigen die gleiche abnehmende Koloniezahl mit zunehmender Antiserumverdünnung wie im vorigen Experiment, jedoch noch deutlicher. In den Verdünnungsgemischen 1 : 16 bis 1 : 4096 scheinen mehr CFUs/ml als erwartet vorhanden zu sein. Ähnliche Ergebnisse sind auch in Tabelle 7 dargestellt. Die Koloniezahlen in Tabelle 9 legen nahe, dass die CFUs über die Zeit in PBS in Abwesenheit von Serum absterben. Dies kann für die Koloniezahlen in den Verdünnungen 1 : 8192 bis 1 : 32768 in beiden Untersuchungen verantwortlich sein, die niedriger als erwartet sind. Das Antiserum kann einige wachstumshemmende Fähigkeiten in den höheren Verdünnungen zeigen, während es in den weniger verdünnten Gemischen wachstumsfördernde Wirkungen haben könnte.
Das nächste Experiment wurde durchgeführt, um mögliche Gründe für diese Beobachtungen zu untersuchen.
BEISPIEL 12
Die Auswirkungen des P. multocida Antiserums und des negativen Serums (Hühnerserum, das keine P. multocida Antikörper enthält) auf das Wachstum des P. multocida M9 Stamms wurde in vitro verglichen. Serumverdünnungen und Verdünnungen der P. multocida Kultur wurden wie in Beispiel 11 beschrieben erzeugt. 1 ml an Kultur, der 139 CFUs/ml (Tabelle 6) enthielt, wurde mit einem ml verdünntem Serum vermischt. Drei Verdünnungen (1 : 16, 1 : 512 und 1 : 32768) des negativen Serums wurden zubereitet und mit der geeigneten Menge an Bakterienkultur vermischt. Die Gemische aus Bakterienkultur/Serumverdünnung reagierten bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
Die Gemische aus Serumantikörper und Bakterium wurden doppelt auf TSA Platten (0,5 ml) plattiert und die Gemische aus negativen Serum und Bakterien wurden dreifach nach der einstündigen Reaktionszeit plattiert. Die Vorratslösung des P. multocida M9 Stamms wurde nach Zugabe von 0,1 ml zu allen Antiserum- und negativen Antiserum-Verdünnungen dreifach plattiert und nochmals, nachdem sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Kolonien wurden nach Inkubation bei 37°C für 24 Stunden gezählt und irgendwelche Veränderungen in den Zahlen wurden 48 Stunden nach der Inkubation notiert. Die Ergebnisse dieser Zählungen sind in den Tabellen 11 und 12 dargestellt.
Tabelle 11 Titer der geplanten 2 × 10(2) CFU/ml endgültigen Vorratslösung von P. multocida M9
Tabelle 12
Nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C wurden keine Veränderungen in den Koloniezahlen festgestellt.
Die Ergebnisse in den Beispielen 10–12 zeigen anfängliche Zunahmen, die zu schrittweisen Abnahmen in der Zahl von CFUs führen, mit zunehmender Verdünnung des Antiserums gegen P. multocida. Die kombinierten Ergebnisse legen nahe, dass anscheinend beide P. multocida Stämme das Serum als Wachstumsmedium verwenden können. Mit abnehmender Serumkonzentration nimmt auch das Wachstum von P. multocida ab. Einige der Ergebnisse legen nahe, dass P. multocida bei Verdünnung in PBS und Aufbewahrung bei Raumtemperatur zwischen 1 und 4 Stunden abstirbt. Dies könnte für die CFUs in den Verdünnungen 1 : 81992 bis 1 : 32768 verantwortlich sein, die niedriger als erwartet ausfallen. Mit abnehmender Konzentration des Serums steigt die Konzentration des PBS an. Es gab jedoch keinen großen Unterschied in den Koloniezahlen der Vorratslösung im vorliegenden Beispiel 1 Stunde vor und 1 Stunde nach dem Wartezeitraum, die niedrigen Zahlen in den höheren Verdünnungen existierten jedoch immer noch.
Die Koloniezahlen für die Serumgemische ohne Antikörper gegen P. multocida, im Vergleich mit ihren Gegenstücken, die P. multocida Antikörper enthalten und Zahlen in der Vorratslösung, können gewisse wachstumshemmende Eigenschaften auf das Antiserum mit P. multocida Antikörper zeigen. CFU Zahlen in den Proben ohne P. multocida Antiserum begannen hoch und sanken ab, aber nicht auf einen Wert, der niedriger als erwartet war, im Vergleich mit den CFU Zahlen in der Vorratslösung nach 1 Stunde. CFU Zahlen in zwei der drei Proben, die Antikörper gegen P. multocida enthielten, waren niedriger als in den Negativserum-Proben ohne P. multocida Antikörper. Eine wachstumshemmende Eigenschaft des P. multocida Antiserums kann durch andere anwesende Faktoren maskiert werden.
BEISPIEL 13
Schlüpffähigkeit von Eiern, in die am Tage 18 der Inkubation P. multocida Antiserum-P. multocida CFUs injiziert wurden
Diese Untersuchung wurde entwickelt, um den Effekt von Komplexen aus Serumantikörpern und Bakterien zu testen, die in ovo an SPF Eier verabreicht wurden. Die gleiche Zahl von CFUs (5 waren beabsichtigt) des P. multocida Stamm M9 wurde mit verschiedenen Mengen von P. multocida Antiserum vermischt und dann wurden 0,1 ml jedes Gemisches in fünfzehn SPF Eier in jeder der sieben Gruppen inokuliert. Eine Vorratslösung mit 100 CFUs/ml wurde mit einer Kultur des P. multocida Stamm M9 erzeugt. Um zu gewährleisten, dass jedes Ei die gleiche Anzahl an CFUs erhielt, wurde die geeignete Menge an Serum mit der geeigneten Menge an Vorratslösung für jede Gruppe in Intervallen von 5 Minuten vermischt. Diese Gemische verblieben für 30 Minuten bei Raumtemperatur, danach wurden 0,1 ml in fünfzehn Eier am Tage 18 der Inkubation inokuliert. Die Vorratslösung mit 100 CFUs/ml wurde nach der Zubereitung des Gemisches der letzten Gruppe dreifach plattiert und nochmals, nachdem das Gemisch der letzten Gruppe für 30 Minuten reagiert hatte (Tabelle 13). Die Platten wurden alle bei 37°C für 24 Stunden inkubiert und danach wurden die Kolonien gezählt. Tabelle 14 zeigt die Schlüpffähigkeitsdaten für jede Gruppe.
Tabelle 13
Tabelle 14 Auswirkungen der Inokulation von 1 ml von Gemischen, die Antiserum gegen P. multocida und CFUs des M9 Stamm von P. multocida enthalten, in SPF Eier am Tage 18 der Inkubation auf die Schlüpffähigkeit
Diese Untersuchung war ursprünglich dazu gedacht, in jedes Ei, das Bakterien erhalten sollte, 5,0 CFUs, vermischt mit dem geeigneten Volumen an P. multocida Antiserum, zu inokulieren. Die in Tabelle 13 gezeigte Titerinformation zeigt, dass die Eier eine Anzahl von CFUs erhielten, die näher an 3,2 als an 5 ist und dass aus der 30 Minuten Reaktionszeit nur ein geringer Kolonieverlust resultierte. Die Ergebnisse in Tabelle 14 zeigen, dass auch geringe Anzahlen von CFUs des Stamm P. multocida M9 für SPF Eier verheerend sind, wenn sie am Tage 18 der Inkubation verabreicht werden. Die Kontrollen in Gruppe 7 schlüpften zu 100%. In anderen Gruppen war das Schlüpfen stark beeinträchtigt. Von diesen Gruppen enthielten die Gruppen 5 und 6 die nächsthöchsten Prozentsätze an insgesamt geschlüpften Vögeln. Die Eier in Gruppe 6 bekamen das höchste Verhältnis von Antiserum gegen P. multocida (50 μl + 3,2 CFUs) inokuliert und zeigten insgesamt 60% Schlüpfen mit 27% normalem Schlüpfen. Dieser Trend legt nahe, dass das Antiserum gegen P. multocida, in Kombination mit den lebenden Bakterien, ein gewisses Ausmaß an Schutz für einen Hühnerembryo entweder durch Verringerung oder Verzögerung der pathogenen Effekte des Bakteriums bereitstellt.
Die Ergebnisse in den Tabellen 12 und 14, in denen Serum mit und ohne P. multocida Antikörper bzw. verschiedene Mengen an Serumantikörpern verglichen werden, zeigen einen möglichen hemmenden Effekt der Serumantikörper gegen P. multocida auf das Wachstum und vielleicht der pathogenen Effekte des Organismus. In Tabelle 14 wurde gezeigt, dass die beiden höchsten Mengen an Antikörper (Gruppen 5 und 6) zu besseren Schlüpfraten führten, verglichen mit dem Bakterium alleine (Gruppe 1).
BEISPIEL 14
Wachstum von M. gallisepticum; Erzeugung von Hyperimmunserum
Eine Kultur des Bakterium Mycoplasma gallisepticum Stamm F wurde von der North Carolina State University, Mycoplasma Labor, College of Veterinary Medicine, erhalten. Der F Stamm von M. gallisepticum wird in der kommerziellen Legehennen-Industrie als Lebendimpfstoff verwendet. 1,33 ml der Bakterienkultur wurden in 40 ml Frey's Medium, das mit 15% Schweineserum (FMS) ergänzt war, inokuliert. Dieses Gemisch wurde dann für etwa 18 Stunden bei 37°C inkubiert und die gewachsene Kultur wurde 80/20 mit sterilem Glycerin zum Einfrieren bei –70°C vermischt. Die Sterilität dieses Gemisches wurde auf Trypticase Soja Agar (TSA) getestet und es wuchsen keine fremden Organismen. Die Titerbestimmung für die M. gallisepticum Stamm F Vorratskultur nach 24 Stunden bei –70°C ergab 5,8 × 10(8) CFUs/ml.
Antiserum gegen den M. gallisepticum Stamm R wurde von dem NCSU Mycoplasma Labor erworben. Das Antiserum wurde durch Hyperimmunisierung von New Zealand weißen Kaninchen mit inaktiviertem M. gallisepticum Stamm R in Adjuvans erzeugt. Kaninchen wurden durch intramuskuläre und intradermale Injektion drei Mal vor der Blutentnahme immunisiert. Das Antiserum wird als MGA bezeichnet.
BEISPIEL 15
Wachstumshemmender Effekt von MGA auf den M. gallisepticum Stamm F
In diesem Experiment wurde das Wachstum einer gegebenen Menge des M. gallisepticum Stamm F über die Zeit untersucht, nachdem der Organismus mit verschiedenen Mengen von MGA vermischt wurde. Eine Probe von MGA wurde zuerst 1 : 10 in phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnt. Dann wurde das Antiserum weiter durch Aufstellen von 10 1 : 2 Reihenverdünnungen durch Zugabe von 0,5 ml der vorherigen Verdünnung zu 0,5 ml PBS (Verdünnungen 1 : 20 bis 1 : 10240) verdünnt. Ein Röhrchen der M. gallisepticum F Vorratskultur wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und 1 : 100 verdünnt. Diese 10(–2) Vorratslösung enthielt 5,8 × 10(6) CFUs/ml. Komplexe aus Bakterium und Antikörper wurden hergestellt durch Zugabe von 0,4 ml der 5,8 × 10(6) Vorratslösung zu 0,4 ml jeder der 11 MGA-Verdünnungen. Diese Komplexe reagierten bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Behandlung 12 bestand aus 0,4 ml PBS, zugegeben zu 0,4 ml der gleichen Bakterien-Vorratslösung.
Nach der 30 minütigen Reaktionszeit wurde jede der 12 Behandlungen in FMS von 10(–1) bis 10(–8) seriell verdünnt. Diese Röhrchen wurden 14 Tage inkubiert und das Wachstum wurde bei 41 Stunden, 47,5 Stunden und nach 14 Tagen bestimmt. (Das Wachstum von M. gallisepticum wird in FMS durch eine Farbveränderung nachgewiesen. Mit Zunahme des Bakterienwachstums sinkt der pH des Mediums, wodurch eine Farbveränderung im pH-Indikator Phenolrot ausgelöst wird. Während des Wachstum verändert sich die Farbe schrittweise von einem tiefen Rot zu Orange und schließlich zu Gelb. Das Ausmaß an Wachstum kann basierend auf der Farbe des Mediums ausgewertet werden). Ergebnisse werden in Tabelle 15 dargestellt. Tabelle 15 Wachstum von MGF, nachdem 0,4 ml von 12 Antiserum-Verdünnungen, die zwischen 0,039 μl und 40,0 μl Antiserum enthielten, mit 0,4 ml einer MgF Vorratslösung vermischt wurden

MgF*: MgF Antiserum in 0,4 ml
0,4 ml MgF**: 0,4 ml MgF 2,32 × 10(–6)
MgG Anwesenheit***: Anwesenheit von MgG durch das Verdünnungsröhrchen (nach 14 Tagen Inkubation)
–: (kein Wachstum; tiefrot)
+/–: (gerade beginnendes Wachstum; hellere rote Farbe als die Kontrollröhrchen)
+: (schwaches Wachstum; helles Rot)
++: (mittleres Wachstum; dunkles Orange)
+++: (mittleres bis starkes Wachstum; helles Orange)
++++: (starkes Wachstum; Gelb)

Am Tag 14 (Tabelle 1) wurde in allen 12 Behandlungen Wachstum nachgewiesen. In den Gruppen 1–4 war das Wachstum verzögert, wobei diese Gruppen die höchsten Konzentrationen an MGA enthielten. Das Wachstum in diesen Gruppen konnte nicht so früh wie in den Gruppen mit niedrigeren Konzentrationen an MGA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die höheren Konzentrationen von MGA einen wachstumshemmenden Effekt auf Bakterien hatten.
BEISPIEL 16
Wachstumshemmende Effekte von MGA auf M. gallisepticum
Ein Röhrchen des Vorrats an M. gallisepticum Stamm F wurde aufgetaut und 1 : 100 in FMS verdünnt. Diese 10(–2) Verdünnung enthielt etwa 5 × 10(6) CFUs/ml. Ein ml der 10(–2) Vorratsverdünnung wurde nach gründlichem Mischen in jedes der 8 Verdünnungsröhrchen gegeben. Zu jedem Röhrchen (siehe Tabelle 16) wurde eine gewisse Menge an MGA zugegeben und die Bakterien/Antiserum-Komplexe wurden vermischt. Sie wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und dann bei 37°C. Das Wachstum wurde über den Verlauf von 13 Tagen bestimmt, unter Verwendung von Farbveränderungen im FMS Wachstumsmedium als Indikator. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 dargestellt. Tabelle 16

+: (schwaches Wachstum; helles Rot)
++: (mittleres Wachstum; dunkles Orange)
+++: (mittleres bis starkes Wachstum; helles Orange)
++++: (starkes Wachstum; Gelb)

Mittleres Wachstum von M. gallisepticum trat innerhalb der ersten 27 Stunden der Inkubation in dem Röhrchen auf, das kein Antiserum enthielt und das Wachstum in diesem Röhrchen war stark bei 46 Stunden bei 37°C (Tabelle 16). In den Röhrchen, die mehr als 1,5 μl MGA oder 1,5 μl MGA enthielten, wurde in den ersten 27 Stunden der Inkubation kein Bakterienwachstum nachgewiesen. Nach 46 Stunden Inkubation wurde in den Röhrchen, die 12, 24 und 48 μl MGA enthielten, immer noch kein Wachstum nachgewiesen. Diese Röhrchen zeigten starkes Wachstum von M. gallisepticum nach 13 Tagen bei 37°C. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Bakterium in allen Röhrchen vorhanden war, aber das höhere Mengen an Antiserum das Wachstum für längere Zeit verzögerten als geringere Mengen. Die Zeit, die notwendig war, um das Wachstum nachzuweisen, scheint direkt proportional zur Menge an MGA im Bakterium-Antiserum Komplex zu sein.
BEISPIEL 17
Auswirkungen von Komplexen aus M. gallisepticum und MGA auf das Schlüpfen
Neun Gruppen von Eiern wurden am Tag 18 der Inkubation inokuliert. Sieben der Gruppen wurden mit einem von sieben unterschiedlichen M. gallisepticum Stamm F-MGA Komplexen inokuliert. Eine Gruppe wurde nur mit dem Bakterium inokuliert und eine andere Gruppe wurde mit einer 1 : 4 Verdünnung von FMS in PBS inokuliert.
Ein Röhrchen des M. gallisepticum Stamm F Vorrat wurde aufgetaut und 1 : 5 und 1 : 10 in 10% FMS und 90% PBS Verdünnungsmittel verdünnt. Geeignete Mengen dieser Verdünnungen wurden dazu verwendet, die Bakterium-MGA Komplexe zu erzeugen. Jedes Ei erhielt eine Injektion von 0,1 ml, die die gleiche Anzahl an M. gallisepticum CFUs enthielt, mit der geeigneten Menge an Antiserum für eine bestimmte Gruppe, mit der Ausnahme von Gruppe 1. Die Eier in Gruppe 1 erhielten 0,1 ml des FMS/PBS Verdünnungsmittel. Die Komplexe reagierten vor der Inokulierung 10 Minuten miteinander. Die Eier wurden dann bis zum Schlüpfen inkubiert.
Die 1 : 10 Verdünnung des Bakterienvorrats wurde titriert, indem 3 serielle Verdünnungen bis 10(–9) hergestellt wurden und durch Plattieren der 10(–6) Verdünnungsreihen auf TSA und Inkubation bei 37°C. Alle Röhrchen in allen drei Reihenverdünnungen zeigten Wachstum von M. gallisepticum. Der Titer betrug 8 × 10(8) CFUs/ml. Schlüpfergebnisse werden in Tabelle 17 gezeigt.
Tabelle 17
Die Komplexe aus MGA und M. gallisepticum beeinflussten den Prozentsatz der Schlüpfrate und die Gesundheit der Küken. Gruppen mit bis zu 90% Schlüpfrate waren die Gruppen, die das größte Verhältnis von MGA zu CFUs aufwiesen (mit der Ausnahme von Gruppe 4). Der Prozentsatz an gesunden Küken war in den Gruppen 2 und 3 sehr viel höher als in anderen Gruppen, die Komplexe aus MGA und Bakterien mit weniger Antiserum in der Formulierung erhielten. Diese Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Verhältnisse von MGA zu Bakterium die Fähigkeit haben, einen sich entwickelnden Hühnerembryo zu schützen durch Verzögerung und/oder Verminderung der pathogenen Effekte des Bakteriums.
BEISPIEL 18
M. gallisepticum Stamm F/Antikörper-Kompleximpfstoff
Sechs Gruppen von 16 lebensfähigen Eiern wurden am Tage 18 der Inkubation inokuliert. Die 16 Eier in der Negativkontrollgruppe (Gruppe 6) wurden am Tag 18 mit 0,1 ml Verdünnungsmittel inokuliert (1 Teil FMS in 9 Teilen PBS), und schlüpften in einer größeren Schlüpfeinheit, die keine anderen Eier enthielt.
Ein Röhrchen des Vorrats an M. gallisepticum Stamm F wurde bei Raumtemperatur aufgetaut und 1 : 5 verdünnt (Vorrat 2). Die Titration von Vorrat 2 zeigte, dass sie 7 × 10(7) CFUs/ml enthielt. Vorrat 2 wurde dann in 0,9 ml Aliquots aufgeteilt und mit 0,5, 10, 20 oder 40 μl MGA kombiniert. Nach dem Vermischen wurden die Bakterium-MGA Formulierungen bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Diese Komplexe aus Bakterium und MGA wurden an die Eier in jeder Gruppe in 0,1 ml Dosen verabreicht. Eier der Gruppe 1 erhielten Inokulierungen, die nur Bakterien enthielten. Jede Gruppe von 16 Eiern wurde dann bis zum Tage des Schlüpfens in kleine abgetrennte Schlüpfeinheiten gesetzt. Die CFU-Werte für die MGA-M. gallisepticum Formulierungen sind in Tabelle 18 gezeigt.
Die verbleibende Verdünnung von Vorrat 2 wurde mit FMS in drei getrennten seriellen 10-fach Verdünnungen auf 10(–9) verdünnt. Die Verdünnungsröhrchen mit 10(–4), 10(–5) und 10(–6) Verdünnung wurden vierfach auf FMS Agar plattiert und bei 37°C für 9 Tage inkubiert.
Am Tag des Schlüpfens wurden die Gruppen 1–5 bearbeitet. Normale, gesund aussehende Küken wurden durch sterile Entnahme eines choanalen Abstrichs und Inokulation in Röhrchen, die 1,8 ml FMS enthielten, auf die Anwesenheit von M. gallisepticum untersucht. Nachdem die Küken bearbeitet wurden, wurden die untersuchten Küken aus jeder Gruppe in einem P2 Raum gebracht. Jede Gruppe wurde in einen separaten Brutraum gebracht und die Käfige hatten keinen Kontakt miteinander.
Die Küken in der Vehikel-Kontrollgruppe 6 schlüpften mit Verzögerung und wurden an dem Tag nach dem Schlüpfen der Gruppen 1–5 bearbeitet. 10 Kontrollvögel wurden durch Abstrich auf die Anwesenheit von M. gallisepticum untersucht und wurden in einen getrennten P2 Raum in einen Brutkasten gesetzt. Im Alter von 21 Tagen wurden aller überlebenden Küken entblutet und das Serum wurde zur Bestimmung von Antikörpern gegen M. gallisepticum durch Serumplatten-Agglutination (SPA) und ELISA entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 dargestellt.
Tabelle 18
Die Eier, die das Bakterium ohne Antiserum (Gruppe 1) und die zwei niedrigeren Konzentrationen von MGA+ M. gallisepticum (Gruppen 2 und 3) erhielten, hatten die niedrigste prozentuale Schlüpfrate und es schlüpften keine normalen Vögel. In der Vehikelkontrollgruppe (Gruppe 6) zeigte sich ein verzögertes Schlüpfen als auch ein geringeres Schlüpfen als erwartet. Dies wurde wahrscheinlich ausgelöst, da die Eier in einem größeren Schlüpfapparat inkubiert wurden, der für die Inkubation von 2000 Eiern gedacht war. Trotz dieses Schlüpfproblems, waren 10 Küken gesund und hatten negative Werte für M. gallisepticum-Isolierung und in zwei Serum-Antikörpertests. Die Gruppen 4 und 5 zeigten prozentuale Schlüpfungen und prozentuale normale Schlüpfungen, die eine große Verbesserung gegenüber den Gruppen 1, 2 und 3 darstellten. Die Eier in diesen Gruppen erhielten höhere Konzentrationen an MGA und Gruppe 5 (3,5 × 10(6) CFU+ 40 μl MGA) zeigte die beste Schlüpfung aller Gruppen. Alle Vögel, die zum Zeitpunkt der Serumentnahme noch lebten, waren gesund. Die Antikörperreaktion auf M. gallisepticum, die durch den SPA Test und ELISA gemessen wurde, zeigte, dass die M. gallisepticum Stamm F Komplex-Impfstoffe für die Vögel in den Gruppen 3, 4 und 5 wirksam waren.
Es ist interessant, dass ein Vogel in der Gruppe 5 für die M. gallisepticum Reisolierung bei Schlüpfen, im SPA Test und im ELISA negativ war. Alle anderen Vögel, die aus den Gruppen 3, 4 und 5 getestet wurden, waren positiv in diesem Fall. Es scheint, dass ein Vogel in Gruppe 5 nie infiziert wurde.
Die Beispiele 14–18 wurden durchgeführt, um die Nützlichkeit eines Bakterien : Antikörper Impfstoffkomplex zu testen. Diese Ergebnisse unterstützen das Konzept, dass die Zugabe eines spezifischen Antiserums (für das Impfstoffbakterium spezifisch) zu lebenden Bakterien in einem geeigneten Verhältnis Schutz an den Hühnerembryo bereitstellt durch Verringerung oder Verzögerung der pathogenen Effekte des Bakteriums, während sich gleichzeitig in den geschlüpften Küken eine wirksame Immunantwort entwickeln kann, wie sich durch die aktive humorale Immunantwort zeigt.

Claims

Impfstoff-Zubereitung, die zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle Erkrankung oder Protozoen-Erkrankung nützlich ist, umfassend ein Impfstoffkonjugat, umfassend (i) einen lebenden pathogenen Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pathogenen Bakterien und pathogenen Protozoen und (ii) einen neutralisierenden Faktor, der an den lebenden Organismus gebunden ist, wobei der neutralisierende Faktor den lebenden Organismus neutralisieren kann und aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antikörperfragmenten ausgewählt ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 1, wobei der neutralisierende Faktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IgG Immunglobulinen und IgG Immunglobulin-Fragmenten.
Zubereitung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der neutralisierende Faktor polyklonalen Ursprungs ist.
Zubereitung gemaß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der neutralisierende Faktor monoklonalen Ursprungs ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der lebende Organismus in Form von Sporen oder Zysten vorliegt und/oder wobei zusätzliche Elemente an die Antikörper oder Antikörper-Fragmente gekoppelt sind.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zubereitung lyophilisiert ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei diese für (i) subkutane Verabreichung; (ii) intraperitoneale Verabreichung; oder (iii) intramuskuläre Verabreichung formuliert ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der lebende Organismus ein Mycoplasma und optional Mycoplasma gallisepticum ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der lebende Organismus bei einem Säuger oder einem Vogel eine Krankheit auslösen kann, wobei der Vogel optional Geflügel ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 9, wobei der lebende Organismus eine Eimeria Spezies, und optional E. tenella oder E. acervulinia oder Mycoplasma gallisepticum ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 9, wobei der lebende Organismus ein Bakterium und optional Pasteurella multocida ist.
Verwendung der Zubereitung gemäß Anspruch 9 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung einer Krankheit bei einem Vogel oder bei einem befruchteten Ei, die von einem lebenden Organismus wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 definiert hervorgerufen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Zubereitung zur Verabreichung durch ein automatisiertes Hochgeschwindigkeits-Ei-Injektionssystem bestimmt ist.
Verwendung eines Produkts zur Herstellung eines Impfstoffes zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle Erkrankung oder eine Protozoen-Erkrankung umfassend (i) einen lebenden pathogenen Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pathogenen Bakterien und pathogenen Protozoen und (ii) einen neutralisierenden Faktor, der an den lebenden Organismus gebunden ist, wobei der neutralisierende Faktor den lebenden Organismus neutralisieren kann und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antikörperfragmenten.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Erzeugung aktiver Immunität gegen eine bakterielle Erkrankung oder eine Protozoen-Erkrankung, gekennzeichnet dadurch, dass ein Konjugat in eine Impfstoffzusammensetzung formuliert wird, umfassend (i) einen lebenden pathogenen Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pathogenen Bakterien und pathogenen Protozoen und (ii) einen neutralisierenden Faktor, der an den lebenden Organismus gebunden ist, wobei der neutralisierende Faktor den lebenden Organismus neutralisieren kann und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antikörperfragmenten.
Verwendung gemäß Anspruch 14 oder ein Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Impfstoffzubereitung eine oder mehrere der in den Ansprüchen 2 bis 10 genannten Eigenschaften umfasst.