DE2644766A1

DE2644766A1 - Arzneimittel

Info

Publication number: DE2644766A1
Application number: DE19762644766
Authority: DE
Inventors: Roland Willard Ament; Daniel C Fender
Original assignee: Wildlife Vaccines Inc
Current assignee: Wildlife Vaccines Inc
Priority date: 1975-10-03
Filing date: 1976-10-04
Publication date: 1977-04-14
Also published as: GB1521596A; JPS5243696A; DK441976A; IT1068240B; FR2338050A1; US4009259A

Description

PATENTANWÄLTE

KLAUS D. KIRSCHNER DR. WOLFGANG DOST

DIPL.-PHYSIKER Dl PL-CHEMIKER

D-8OOO MÜNCHEN 2

BAVARIARINQ 38 Uneer Zeichen:

Our reference: β 823 D/TW

31377/3330

Datum: 4 . Oktober 1976

WILDLIFE VACCINES, INC.
Wheat, Ridge,
Colorado, V.St.A.

Arzneimittel

Die Fischindustrie muß jedes Jahr erhebliche Verluste durch Fischkrankheiten hinnehmen. Mit dem Anwachsen großer Fischzuchtanlagen haben die durch Krankheiten erlittenen wirtschaftlichen Verluste die Bekämpfung dieser Krankheiten zu einer zwingenden Notwendigkeit gemacht.

Die Weltfischiridustrie liefert für die menschliche Ernährung reichhaltige, essentielle, eiweißreiche tierische Nahrungsmittel. Diese Ernte, die von fast allen Nationen der Welt eingebracht wird, stellt einen grundsätzlichen Nahrungsrohstoff für die menschliche Ernährung dar. Die Handelsfischerei repräsentiert mehrere Milliarden DM, verteilt auf Ernte, Verarbeitung, Verteilung und Verbrauch der Produkte. Weltweit gesehen, hat auch die Sportfischerei erhebliche Bedeutung.

Aus verschiedenen Gründen stellt sich in der Handels- und Sportfischerei zunehmend die Forderung nach einer Krankheitsbekämpfung, um den Fischbestand zu erhalten. Bisher steh^rö"ijedoch noch

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keine brauchbaren Maßnahmen oder Geräte zur Krankheitsbekämpfung zur Verfügung. Ganze Schwärme, besonders zur Laichzeit flußaufwärts ziehender Fische, sind in den letzten Jahren erheblich dezimiert worden, während andere nun ernsthaft bedroht sind. Sowohl durch Bebrüten gezogene als auch natürlich aufgewachsene Fische haben hohe Verluste, einschließlich Brutverluste, hinnehmen müssen.

Ähnlich wie andere Vertebraten, sind die jungen Fische gegenüber zahlreichen hochinfektiösen Krankheiten besonders empfindlich. Es liegt auf der Hand, daß man winzige Fische nicht in größerem Maßstab Nadelinjektionen unterziehen kann. Ein neues Verabreichungssystem ist deshalb eine Grundvoraussetzung für praktikable Arzneimittel- und Vaccineverabreichungen.

Das Problem erlangt besondere Bedeutung, wenn man bedenkt, daß ernsthafte Lachskrankheiten die Existenz der Lachsfischerei, wie sie bisher existiert hat, bedrohen können. In ähnlicher Weise gilt dies auch für andere Salmoniden, zum Beispiel Forellen. Weltweit gesehen, ist die Zukunft des Lachses von besonderem Interesse. So hat man zum Beispiel beobachtet, daß die teueren Rotlachse (Oncorhy^chus nerka) in Kalifornien, Oregon und Washington erhebliche Schädigungen haben hinnehmen müssen oder überhaupt ausgerottet sind. Bis vor kurzem wurden noch große Schwärme beobachtet. Der Rotlachs stellt den dominierenden Marktfisch in Alaska dar. Die jährlich in Alaska produzierten Lachskonserven, in erster Linie Rotlachs, stellten in der Vergangenheit einen geschätzten Gesamtwert von nahezu 500 Millionen DM dar. In den letzten Jahren wurde jedoch ein starker Abfall beobachtet, und die Rotlachsfischerei wurde 197^ starken Beschränkungen unterworfen. Obwohl die Gründe für diesen Abfall unterschiedlich und komplex sind, muß man Fischkrankheiten in diese Betrachtung mit einbeziehen. Dies gilt nicht nur für die Länder, in denen der Rotlachs und andere Fischarten ursprünglich zuhause sind, sondern infolge der zunehmenden Bedeutung der Fischzucht, auch für andere Länder.

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Die Rotlachszucht, aufgrund der Kostbarkeit des Fisches wirtschaftlich besonders interessant, unterliegt einer ernsthaften Beeinträchtigung durch eine Viruskrankheit, die erst kürzlich identifiziert und benannt worden ist. Es handelt sich hierbei um Infektiöse Hematopoietische Nekrose, abgekürzt IHN. Man betrachtet diese Krankheit als einen der Hauptgründe für die Schädigung der Rotlachsschwärme im Columbiafluß-Entwässerungssystem. Im Jahre 1974 vom US Fisch and Wildlife Service durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß IHN in ganz Alaska in natürlich laichenden Rotlachsen verbreitet ist.

Es besteht somit ein großes Bedürfnis nach einer immunisierenden Vaccine gegen die IHN-Krankheit. Der IHN-Virus stellt keinen selektiven pathogenen Erreger für den Rotlachs dar. Vielmehr hat sich gezeigt, daß er auch eine ernsthafte Bedrohung für andere, zur Laichzeit flußaufwärts wandernde Salmoniden, zum Beispiel für Süßwasserforellen, darstellt. Im Sacramentofluß-Entwässerungssystem lag die Mortalität bei künstlich gebrüteten Lachsen im Jahre 197^ bei über 90 Prozent; als Grund hierfür wird IHN vermutet. Bei der betreffenden Lachsart handelte es sich um den Chinooklachs (Oncorhynchus tschawytscha). Weiterhin ist die Tatsache von Bedeutung, daß über 40 Prozent der Stahlkopfforellen (Salmo gairdneri) in diesem Flußsystem eine IHN-Infektion hatten.

Kürzlich wurde diese Krankheit bei Chinooklachsen beobachtet, die zu Brutstätten im Columbiafluß-System zurückkehrten. Dies ist nicht besonders überraschend, weil der IHN-Virus in den großen Rot lachsschwärmen des Columbiaflusses vorhanden war, bevor diese Schwärme im wesentlichen verschwanden. Es ist zu vermuten, daß ähnliche Probleme auch bei anderen Fischen in anderen Ländern auftreten.

Bezüglich der Fischerkrankungen sieht es so aus, als ob nur immunologische Verfahren den erforderlichen Langzeitschutz, vom gerade geschlüpften bis zum erwachsenen Fisch, gegen Virus- und Bakterienkrankheiten ermöglichen würden.

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Verschiedene Forellenarten haben eine große Bedeutung, sowohl kommerziell als auch für die Sportfischerei. Diese Kaltwasserfische sind sehr begehrt. Die Infektiöse Pankreas-Nekrose (IPN) stellt eine ernsthafte Porellenkrankheit dar, die eine erhebliche DSzimierung bewirkt. So ging zum Beispiel in den Vereinigten Staaten in Oregon, sowohl 1973 als auch 197^, ein großer Teil der durch Bebrütung gezogenen Forellenbestände durch diese eine Krankheit verloren.

Eine weitere bedeutende Viruskrankheit stellt die hochinfektiöse und kontagiöse Channel Catfish-Viruskrankheit (CCVD), von der der amerikanische Wels (Gattung Ictalurus) befallen wird, dar. Man schätzt, daß allein in den Vereinigten Staaten eine Impfung von jährlich 500 Millionen Fingerlingen gegen CCVD erforderlich wäre.

Selbstverständlich sind auch andere Fischarten durch Krankheiten bedroht, wobei zwar das Auftreten der einzelnen Krankheiten regional unterschiedlich sein kann, das Problem der Fischkrankheiten als solches jedoch weltweite Bedeutung hat.

Aufgrund der zahlreichen ernsthaften Bakterien- und Pilzerkrankungen, die ein Gesundheitsrisiko für die Handels- und Sportfischerei darstellen, besteht ein starkes Bedürfnis zur Bekämpfung dieser Krankheiten, wofür weitere Beispiele die durch Aeromonas ^almonicida verursachte Furunkulose, die durch Vibrio anguillarum verursachte Vibriose und die durch ein Enterobakterium verursachte Darm-Rotmaulkrankheit (Enteric Redmouth Disease) sind. Jede dieser Krankheiten ist für die Vernichtung großer Fischbestände in der gesamten Welt verantwortlich und von einer Immunisierung gegenüber diesen Bakterienkrankheiten würden sämtliche Salmoniden profitieren.

In den letzten Jahren haben zahlreiche Versuche zur Impfung von Fischen zu unterschiedlichem Erfolg geführt. Hierbei wurden Bakterienimpfstoffe und Vaccinen während längerer Zeiträume

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mit der Nahrung einverleibt, wobei ein gewisser Erfolg erzielt werden konnte. Man hat auch schon versucht, Bakterienimpfstoffe direkt dem Wasser im Fischbehälter zuzusetzen, wobei jedoch enttäuschende Ergebnisse erhalten wurden. Zwar konnten abgeschwächte oder modifizierte Organismen dem Fischwasser mit Erfolg zugesetzt werden; mit der Möglichkeit, daß die Organismen ihre Virulenz zurückerlangen und Flüsse, Seen, Brutstätten usw., befallen, scheidet diese Lösung jedoch für die Praxis aus. Man hat einen Schutz von Fischen auch schon durch parenterale Injektionen von Antigenen herbeigeführt. Aus ökonomischen Gründen scheiden jedoch Nadelinjektionen im allgemeinen aus. Dessen ungeachtet sind zahlreiche Fischzuchtbetriebe gezwungen, ihre Fische einzeln zu injizieren, um zumindest eine Verringerung der Krankheitsverluste zu erreichen. Es liegt auf der Hand, daß diese manuelle Methode nicht befriedigen kann.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein ökonomisches Verfahren zur Verabreichung von bestimmten Stoffen, z.B. von Arzneistoffen oder das Wohlbefinden fördernden Stoffen, an Wassertiere, vorzugsweise Fische, zur Verfügung zu stellen, das mit geringstmöglichem Aufwand in der Praxis durchgeführt werden kann.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Behandlungsmittel bzw. Impfstoffe für die Behandlung bzw. Impfung von Wassertieren, vorzugsweise Fischen, zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Behandlung von Wassertieren, vorzugsweise von Fischen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Wassertiere in eine hyperosmotische Lösung , die mindestens einen die Gesundheit oder das Wohlbefinden fördernden Stoff enthält, eintaucht.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren so durchgeführt, daß man die Wassertiere zunächst mit einer hyperosmotischen Lösung und anschließend mit einem die Gesundheit oder das Wohlbefinden fördernden Stoff in Berührung bringt.

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Vorzugsweise liegt der Wirkstoff als wäßrige Lösung vor. Das Inberührungbringen erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen der Tiere, wobei man im Fall von Fischen diese einfach in der Behandlungslösung schwimmen läßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zweistufige Verfahren so durchgeführt, daß man die Tiere für eine Dauer von 0,5 bis 3 Minuten mit der hyperosmotischen Lösung in Berührung bringt, nach dem Herausnehmen aus der hyperosmotischen Lösung für eine Dauer von 2 bis 5 Minuten mit dem Wirkstoff, vorzugsweise einem Antigen oder Chemotherapeutikum, vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung, in Berührung bringt, und schließlich aus dem Wirkstoffmedium herausnimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung zur Behandlung von Fischen bzw. zur Verabreichung von Wirkstoffen, vorzugsweise von Antigenen oder Chemotherapeutika, an Fische so durchgeführt, daß man die hyperosmotische Lösung in einer Menge von 1 Liter pro 4,5 kg Fisch anwendet, die Fische für eine· Dauer von 0,5 bis 3 Minuten in der hyperosmotischen Lösung hält, dann die Fische herausnimmt, für eine Dauer von 2 bis 5 Minuten in dem Wirkstoffmedium, vorzugsweise der Wirkstofflösung, in einer Menge von 1 Liter Wirkstoffmedium pro 4,5 kg Fisch, schwimmen läßt, und schließlich die Fische aus dem Wirkstoffmedium herausnimmt .

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um eine Vaccine gegen infektiöse hematopoietische Nekrose.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um einen Vibrio anguillarum -Bakterienimpfstoff.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um einen Aeromonas salmonicida - Bakterienimpfstoff.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um eine Rinderserumalbumin-Vaccine.

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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um einen Enteric Redmouth - Bakterienimpfstoff.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei · dem Antigen um eine Channel Catfish Virus - Vaccine.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um einen Impfstoff gegen infektiöse Pankreasnekrose.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die hyperosmotische Lösung mindestens 1200 milliosmolar.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Osmolarität durch Natriumchlorid oder Harnstoff bedingt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Behandlungsmittel aus einer hyperosmotischen Lösung, die mindestens einen die Gesundheit und/oder das Wohlbefinden fördernden Wirkstoff enthält.

Die bevorzugten Wirkstoffe sind vorstehend beschrieben.

Neben den zuvorgenannten Bestandteilen können in dem Behandlungsmittel auch andere, übliche Zusatzstoffe, z.B. Konservierungsmittel, wie Oxytetracyclinhydrochlorid, enthalten sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Behandlungsmittel ein Zweikomponentenbehandlungsmittel dar, wobei die erste Komponente eine hyperosmotische Lösung, vorzugsweise ein Konzentrat und insbesondere ein wasserfreies Konzentrat hiervon, und die zweite Komponente eine Wirkstofflösung, z.B. eines Antigens oder Chemotherapeutikums, oder ein Konzentrat hiervon, enthält.

Zwei Beispiele für bevorzugte Konzentrate der* ersten Komponente sind nachfolgend angegeben; vorzugsweise kommen p.a.-Reagenzien zur Anwendung.

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Konzentrat 1

Bestandteil

NaCl 80

KCl 0,2

Na₂HPO₄ 1,15

KH ΡΩ Ω

CaCl₂ 0,1

MgCl₂-6 H₂O 0,1

Konzentrat 2 Bestandteil

NaCl 68

KCl 4

CaCl₂- 2 H₂O 2,65

MgSO₁₁- 7 H₂O 2

NaHPO₁₄- 1 H₂O 1,4

Dextrose 10

NaHCO, 22

Die vorgenannten Konzentrate werden bei Gebrauch in so viel Wasser, vorzugsweise entionisiertem V/asser, gelöst, daß die Gesamt-

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menge 1000 ml beträgt. Selbstverständlich kann die erste Komponente auch von vornherein in verdünnter Form vorliegen, jedoch ist dies aus wirtschaftlichen Gründen weniger bevorzugt.

In der Praxis werden hyperosmotische Lösungen auch als hypertonische Lösungen bezeichnet.

Die Wirkstoffkonzentration in der zweiten Komponente unterliegt an sich keinen besonderen Beschränkungen. Vor Gebrauch erfolgt Verdünnung mit Wasser, vorzugsweise entionisiertem Wasser, auf die gewünschte Konzentration, die sich in der Praxis nach Maßgabe der gewünschten Wirkung durch wenige Versuche ermitteln läßt. Im Fall einer Rinderserumalbuminvaccine ist z.B. eine Konzentration von 2 Prozent geeignet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Anwendung der vorgenannten Behandlungsmittel in einem der vorgenannten Verfahren zur Behandlung von Wassertieren.

Für die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen zur Bewertung der verschiedenen Verabreichungssysteme wurde Rinderserumalbumin (BSA) als Antigen ausgewählt, da es ausreichend antigen wirkt und ein Molekulargewicht von 60 000 besitzt.

Das allgemeine Verfahren besteht darin, daß man die Fische in eine hyperosmotische Lösung und danach in die Vaccine oder ein anderes, die Gesundheit oder das Wohlbefinden förderndes Medium eintaucht. Es können auch Chemotherapeutika angewendet werden.

Rinderserumalbumin wurde in diesen Untersuchungen zunächst dazu verwendet, um die grundlegenden Zusammenhänge der Antigen-"Aufnähme" durch die Fische mittels verschiedener Methoden zu klären. Die Wirksamkeit der Antigen-Verabreichungssyst'eme wurde nach Maßgabe des aus dem Fischserum isolierten Rinderserumalbumins bestimmt. Hierbei wurde zur quantitativen Bestimmung der BSA Serumkonzentrationen die Rocket-Elektrophoresemethode angewendet. Bei dieser Methode verwendet man eine Agarplatte, die BSA-Antiserum im Agar enthält. Nachdem man sowohl unbekannte Serumproben als

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auch einen Standard (BSA in Fischserum) in Vertiefungen gebracht hat, erzeugt man eine elektrophoretische Wanderung durch den BSA-Antiserum enthaltenden Agar. Die Mengenbestimmung in der unbekannten Probe erfolgt durch Bezug auf die Wanderung des bekannten BSA-Fischserum-Standards.

Es wurde gefunden, daß die hyperosmotische Lösung die Aufnahme der die Gesundheit und/oder das Wohlbefinden fördernden Stoffe in das Fischserum erheblich erleichtert. Es wurden zahlreiche Chemikalien auf ihre Eigenschaft als hyperosmotische Adjuvantien für den Einstrom der die Gesundheit und/oder das Wohlbefinden fördernden Stoffe in die Versuchsfische untersucht. Diese Chemikalien sind in Tabelle I zusammengestellt. Alle Chemikalien wurden in gleicher Weise untersucht, wobei fünf Forellen für eine Dauer von 3 Minuten in eine die Versuchschemikalie enthaltende 2-prozentige BSA-Lösung eingetaucht wurden. 45 Minuten danach läßt man die Fische vom Schwanz her ausbluten.

Aufgrund der unterschiedlichen Toxizität der verschiedenen Chemikalien sind die angewendeten Konzentrationen unterschiedlich. Bei den gesamten Untersuchungen wurde die höchste nicht-toxische Konzentration angewendet. Nur NaCl und eine 8 Prozent NaCl enthaltende, physiologisch ausgewogene gepufferte Salzlösung wurden bei Konzentrationen von über I65O mOsm (rrßamol/Liter) untersucht.

Die Ergebnisse bezüglich des Einflusses der Chemikalien auf den Einstrom einer 2-prozentigen BSA-Lösung sind in Tabelle I zusammengestellt .

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- 44- Tabelle I

Ergebnis der untersuchten Chemikalien 3-minütiges Bad in (2 Prozent BSA + Chemikalie)

Chemikalie	_PH^a)	%	mOsm	BSA/mg/ml	Standard fehler
Dextrose	7,1	30	I65O	14	1
	7,1	15	825	10	1
Saccharose	7,4	49	I65O	38	4,5
CaCl₂	7,4	8,25	1240	22	4
HCO,-	7,7	4,9	800	53	10
	7,7	2,45	400	29	4
KCl	7,2	2	500	30	5
	7,2	0,8	200	15	5
MgCl₂	7,5	2,8	400	44	8
	7,5	1,4	210	21	5
PBS^b)	7,2	1	275	20	3,4
NaCl	7,0	5,32	I65O	145	19
	7,0	2,66	800	30	5
Harnstoff	8,7	10	I65O	26	8
Methanol	7,0	5		11	3
PEG^C-6000	6,0	20		8	6
DMSO (Dimethyl- sulfoxid)	7,2	10	3000	124	15
I65O mOSM	7,2	5	23OO	107	9
NaCl	7,2	2,5	I9OO	I89	15

pH der Chemikalienlösung vor der Zugabe von BSA, phosphatgepufferte Salzlösung.

PEG = Polyäthylenglykol

Aus Tabelle I folgt, daß die in den hyperosmotischen Lösungen verwendeten Chemikalien die Zellmembranen der Wassertiere für den Durchgang von Stoffen, ohne biophysikalische Änderung in den Zellmembranen, präparieren.

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/η

Zum Beispiel handelt es sich bei den Makrophagen um Zellen in dem Immunitätssystem von lebenden Tieren, die fremde Stoffe, wie Antigene, fressen (phagocytieren). Die hyperosmotischen Lösungen erleichtern die Tätigkeit der Makrophagen bei der Verwertung antigener Stoffe.

Als Mindestschwellenwert ist eine Konzentration von etwa 1200
mOsmol wirksam, wobei auch größere Mengen angewendet werden können. Die oberste Grenze ist durch diejenige Konzentration gegeben, der die Wassertiere für eine Dauer von 0,5 bis 3 Minuten
ohne wesentliche Schädigungen zu widerstehen vermögen. Somit ist die Behandlungsdauer von der Konzentration der hyperosmotischen
Lösung abhängig; toxische Konzentrationen sollten auf jeden Fall vermieden werden.

Der hyperosmotische Effekt in Abhängigkeit der Zeit und der Konzentrationen wurde bestimmt.

Es wurden drei Untersuchungen durchgeführt, um den Einfluß der
Eintauchzeit, der Konzentration des hyperosmotischen Stoffes
(NaCl) und der Konzentration des Antigens (BSA) auf den Einstrom von BSA in das Pischserum zu bestimmen.

Zur Untersuchung dieser grundsätzlichen Zusammenhänge wurde ein
Standard-Testsystem verwendet, das 5₃32 Prozent NaCl in phosphatgepuffertem Wasser mit 2 Prozent BSA enthält. Nachdem man die
Fische 3 Minuten in diese Standardlösung eingetaucht hat, werden sie in Wasserbehälter überführt. 45 Minuten nach der Vaccination läßt man die Fische vom Schwanz her ausbluten.

In Fig.l ist die Abhängigkeit des BSA-Einstroms von der Eintauchzeit der Fische in die Standard-Antigenlösung dargestellt. Die
Begrenzung der Eintauchzeit wird durch die Mortalität bestimmt,
die vermutlich auf den toxischen Einfluß von NaCl in der Lösung
zurückgeht. Bei 4 Minuten Eintauchzeit wird zum ersten Mal Mortalität beobachtet, und nach 5 Minuten beträgt die Mortalität 100
Prozent. Hieraus ergibt sich, daß die hyperosmotische Behandlung bzw. Vorbehandlung optimal 0,5 bis 2 Minuten dauern sollte; eine

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Dauer von bis zu 3 Minuten kann jedoch toleriert werden.

Der Einfluß unterschiedlicher BSA*-Konzentrat ionen in dem Standard-Test syst em auf den Einstrom in das Fischserum ist in Fig. 2 dargestellt. Fig. 2 zeigt somit die Abhängigkeit des BSA-Einstroms von der BSA-Konzentration bei einer 5,3 Prozent NaCl enthaltenden Lösung und einer Eintauchzeit von 3 Minuten. Man sieht, daß die Antigenkonzentration in der hyperosmotischen Vaceinelösung einen großen Einfluß auf die erhaltene BSA-Serumkonzentration hat.

Die Ergebnisse unterschiedlicher NaCl-Konzentrationen im Standard-Test sy st em sind in Fig. 3 dargestellt. Fig. 3 zeigt somit die Abhängigkeit des BSA-Einstroms von der NaCl-Konzentration bei einer 2-prozentigen BSA-Lösung. Hierbei beobachtet man einen scharfen

Serum-Anstieg des iBSA-Spiegels zwischen 2,8 und 5,6 Prozent NaCl. Konzentrationen von 1,9 bis 8,5 Prozent NaCl in Wasser führen zu guten Ergebnissen.

Zusätzliche Versuche zeigen, daß ein sehr scharfer Anstieg der BSA-Serumkonzentration bei etwa l400 mOsmol NaCl stattfindet. Die 5,32-prozentige NaCl-Lösung (I650 mosmolar) liegt nahe der Mindestschwellenkonzentration. Andere Untersuchungen zeigen, daß eine 8-prozentige, gepufferte NaCl-Lösung zu hohen BSA-Gehalten im Fischserum führt.

etwa
Weiterhin wurde gefunden, daß eineV"3-minütige Eintauchzeit in das Antigen- oder Vaccinemedium das Optimum darstellt, wobei ein Bereich von etwa 2 bis etwa 5 Minuten geeignet ist.

Aufgrund der Möglichkeit der Veränderung der Antigenität und demgemäß der Immunogenität des Proteins in Anwesenheit relativ hochkonzentrierter Salzlösungen wurde ein Zweistufenverabreichungssystem'untersucht. In der ersten Stufe wurden die Fische der Behandlung mit dem Chemikalienbeschleuniger unterworfen und dann •in der zweiten Stufe in eine Antigenlösung eingetaucht. Fig. H zeigt die Ergebnisse dieser Zweistufenverabreichungsmethode. Hierbei werden die Fische zunächst für eine unterschiedliche Zeitdauer in die Salzlösung (5,3 Prozent NaCl) und dann 3 Minuten in

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eine 2-prozentige BSA-Lösung eingetaucht. Fig. 4 zeigt die Abhängigkeit der BSA-Aufnähme von der Eintauchzeit in die Salzlösung. Das Ergebnis zeigt die besondere Eignung dieser Verabreichungsmethode. Hierbei bringt jedoch das Weglassen des Proteins aus dem Salzbeschleuniger gewisse Schwierigkeiten mit sich; offensichtlich setzt das BSA die Toxizität des NaCl herab. Somit hat das Salz allein eine viel stärkere Wirkung als in Kombination mit BSA.

Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Toxizität in der ersten Stufe durch Verwendung einer phosphatgepufferten, 8-prozentigen NaCl-Lösung beseitigt werden kann, wobei große BSA-Mengen in das Serum der behandelten Fische einströmen.

Sämtliche Angaben beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben.

Die Ergebnisse beim Eintauchen in 5,3-prozentige NaCl-Lösungen und 10-prozentige Harnstofflösungen sind in Fig. 5 dargestellt, die

den Einfluß der ersten Behandlungsstufe (Vorbehandlung) zeigt. (In Fig.5 steht HST für Harnstoff und PBS für phosphatgepufferte Salzlösung.)

Unter Verwendung der Standard-Testlösung wird der angegebene pH der Lösung auf einen Wert von 5, 7 bzw. 9 eingestellt. Jede dieser Lösungen wird nach der Standardmethode angewendet. Fig. 6A zeigt die Ergebnisse, d.h. den Einfluß des pH-Wertes auf die BSA-Aufnahme. Da eine Erhöhung des pH-Wertes die Wanderung des BSA in den Fisch erleichtert, werden der Standard-Testlösung h,3 Prozent Hydrogencarbonat (HCO-, ) zugesetzt. Obwohl dies noch nicht quantitativ festgelegt ist, zeigen die Ergebnisse, daß die Verwendung von HCO," zur Erhöhung des pH-Wertes und der Ionenstärke die BSA-Serumkonzentration erhöht. Untersuchungen der ersten Stufe (hyperosmotische Vorbehandlung) mit dem pH-Wert als Variabler tragen zur Klärung der Rolle des pH-Wertes bei. Gegenwärtig wird angenommen, daß der pH beiträgt, entweder zur Wirkung von NaCl, der Dehydratisierung (Gewichtsverlust, entsprechend einem Wert von 2,87 Prozent oder darüber) oder möglicherweise zu einer elektrischen Ladungsanziehung. Da BSA mit steigendem pH eine negative Ladung annimmt, kann es verständlich erscheinen, daß die Fische infolge einer Diffusion von freiem Na insgesamt positiv sind und somit

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eine Anziehung entgegengesetzter Ladungen verursachen. Die besten Ergebnisse werden beim Arbeiten mit einer hypertonischen Lösung im pH-Bereich von etwa 7 bis etwa 9 erhalten.

Das mittlere Gewicht der Versuchsfische beträgt etwa 6 g (165 Fische/kg) . Die Einzelgewichte reichen von etwas weniger als 2 g bis 8 g. Deshalb wurde, aufgrund der großen Unterschiede der BSA-Konzentrationen bei den einzelnen Fischen, die Größe als möglicher Faktor in Betracht gezogen. Die Fische wurden in drei Gewichtsklassen von 2, 4 und 8 g eingeteilt. Die einzelnen Gruppen wurden jeweils dem Standardtest unterworfen. Fig. 6B zeigt, daß kein Zusammenhang zwischen dem Fischgewicht und der BSA-Aufnahme besteht.

Um zu bestimmen, wo sich das BSA in den Fischen nach der Aufnahme befindet, wird eine Gruppe von Fischen dem Standardtest unterworfen, und dann werden mit zunehmender Zeit, von der Vaccination ab gerechnet, Unterproben genommen. Überraschenderweise beobachtet man eine sehr schnelle anfängliche Aufnahme, die einen Wert von etwa 20 ug/ml zur Zeit 0 nach der Vaccination ergibt. Die Maximalkonzentrationen von BSA werden jedoch erst 45 bis 60 Minuten nach der Vaccination erreicht. Infolge der langsamen Abgabe von BSA an das Blut liegt es nahe anzunehmen, daß die geimpften Fische einen BSA-Vorrat anlegen, der entweder in einem bestimmten Gewebe (nicht im Blut) aufkonzentriert oder in irgendeiner Weise maskiert wird und sich in nicht-antigener Form befindet. Die hohen Serum-BSA-Konzentrationen werden beibehalten und erst über mehrere Tage langsam abgebaut.

Infolge des zeitlichen Anstiegs des Serum-BSA wird vermutet, daß an dem bzw. den Eintrittspunkten ein Reservoir besteht. Da bekannt ist, daß Fische als Reaktion auf eine Dehydratisierung Wasser trinken, wurde zunächst angenommen, daß der Nahrungsaufnahmetrakt den Eintrittspunkt darstelle. Es war jedoch nicht möglich, BSA im Nahrungsaufnahmetrakt unmittelbar nach der Vaccination mit dem Standardtest nachzuweisen. Proben aus dem Magen zeigen, daß etwas Vaccinematerial verschlungen werden kann; es ist jedoch offensichtlich denaturiert. Zwangsweise sowohl in den Magen als auch das

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Rektum mittels Intubation eingeführte Vaccineflüssigkeiten führen zu Serum-BSA-Konzentrationen vom Wert 0.

Die Kiemen wurden als mögliches Eintrittstor angesehen und analysiert, indem man das Gewebe einer Schallbehandlung in dem gleichen Gewicht Salzlösung unterwarf und das überstehende der Analyse unterzog. Man sollte anfänglich einen hohen Kiemen-BSA-Spiegel und einen niedrigen Serumspiegel erwarten, und diese Verhältnisse sollten sich mit der Zeit umkehren. Dies war jedoch nicht der Fall, und somit können die Kiemen auch nicht als Eintrittstor angesehen werden. Zu diesem Zeitpunkt wurde angenommen, daß das BSA alles auf einmal in den geimpften Fisch eintreten und dann in ein inneres Organ gelangen könnte. Deshalb wurden die vordere Niere, Milz und Leber sämtlich auf BSA untersucht; keines dieser Organe enthielt jedoch ausreichende Konzentrationen, um sie als Reservoir auszuweisen.

Kürzliche Untersuchungen haben gezeigt, daß das mögliche Eintrittstor in die Fische unter Anwendung der Zweistufen-hyperosmotischen Adjuvanslösung zwischen den Seitenlinien der Fische liegt. Die Seitenlinie besitzt schmale Öffnungen zu den Kiemen, entlang den beiden Längsseiten des Fisches, sowie mehrere Öffnungen im Kopf- und Kiemenbereich. Die Seitenlinien sind mit Zilien ausgekleidet und enthalten eine große Anzahl von Makrophagen, die möglicherweise im Seitenliniensystem anwesende Antigene fressen (phagocytieren). Die Seitenlinien liegen in Nachbarschaft zu dem Lymphsystem, das möglicherweise den Eintrittsweg gefressener Antigene in den Blutkreislauf darstellt.

Nach dem Standardsystem behandelte und unmittelbar danach getötete Fische zeigen kein BSA im Blut, jedoch außerordentlich hohe Konzentrationen (250 ug oder darüber) in den Seitenlinien. Hohe BSA-Gehalte werden in dem Serum etwa 45 Minuten nach der Antigen-Behandlung beobachtet, und zu diesem Zeitpunkt ist die BSA-Konzentration in den Seitenlinien nur geringfügig herabgesetzt.

Es wurde beobachtet, daß die Ansprechbarkeit der Versuchsfische auf die Standardtestbedingungen täglichen Schwankungen unterlag.

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Bei dem ersten Belastuhgsversuch wurden 40 Fische in einem Netz 2 Minuten außerhalb des Wassers gehalten. Nachdem man die Fische in einen Behälter mit fließendem Wasser zurückgegeben hatte, wurden sie dem Standardtest unterzogen, wobei in zeitlichem Abstand Unterproben genommen wurden.

Ein direkterer Belastungsversuch wurde so durchgeführt, daß man 10 ug Adrenalin, enthalten in 0,1 ml phosphatgepufferter Salzlösung, intraperitoneal injizierte. Einer Kontrollgruppe wurde 0,1 ml phosphatgepufferte Salzlösung allein intraperitoneal verabreicht. Diese Fische wurden dem Standardtest unmittelbar nach der Injektion, oder 10 Minuten später,unterworfen, um eine volle Stressoreaktion zu gewährleisten. Die Ergebnisse zeigen, daß Belastung einen Faktor darstellt, der die Tauchvaccineabgabe inhibiert, und deshalb muß dieser Einfluß so gering wie möglich gehalten werden. Die Versuche zeigen jedoch auch Unterschiede für diese zwei Experimente, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden. Der Grund für diese tägliche Veränderung in der Fischempfindlichkeit gegenüber der Vaccination ist nicht bekannt. Durch diese Versuche wurde nochmals bestätigt, daß die Kiemen, unter der Kontrolle der Stressreaktion, kein Eintrittstor für das Antigen darstellen. Da die Kiemen, ganz ähnlich wie die Lungen der Säuger, eine Vergrößerung der Austauschfläche, eine Zunahme des Blutstroms und eine Erhöhung der Vaskularität zeigen, spricht mehr für den BSA-Eintritt unter Stress als wenn sich die Fische nicht unter der Stressreaktion befinden.

Diese Versuche zeigen, daß der Eintritt des Antigens im Anschluß an die Vorbehandlung in der hyperosmotischen Lösung über das Seitenliniensystem der Fische erfolgt. Die in den Seitenlinien in großer Zahl enthaltenen Makrophagen fressen möglicherweise das Antigen, das infolge der Dehydratisierung in der hyperosmotischen Lösung·in das Seitenliniensystem hineingedrückt wird, worauf Absorption in das benachbarte Lymphsystem und dann in das Blut des Fisches erfolgt.

'Die Versuche zeigen ferner, daß ein Zweistufenverabreichungssystem unter Verwendung einer Vorbehandlung in einer hyperosmotischen

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- «Ο

Adjlrvanslösung (z.B. für etwa 2 Minuten), gefolgt von einem Eintauchen in die Antigenlösung (z.B. 3 Minuten), ein geeignetes System für die ökonomische Verabreichung von Wirkstoffen an Fische darstellt.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung ist nachfolgend die Herstellung eines für die Eintauchbehandlung geeigneten, repräsentativen Antigens beschrieben.

Die Herstellung des Materials erfolgt aus dem virulenten Virus der Infektiösen Hematopoietischen Nekrose (IHN). Der IHN-Virus wurde ursprünglich aus Regenbogenforellen in Tacoma, Washington, isoliert. Der IHN-Virus wurde in Pat Head Minnow (FHM)-Zellenlinienkulturen gezüchtet; verwendet wurde die dritte Passage. Der IHN-Virus ist für das Wirtstier virulent geblieben. Dieser Stamm des IHN-Virus wird als Regenbogenforellen-Stamm 127^ beze ichnet. Die komplette Vaccine enthält 100 Prozent des IHN-Virus-Regenbogenforellenstamms

Der IHN-Anzuchtvirus wird durch Serumneutralisation unter Verwendung eines speziellen, in Kaninchen hergestellten Antiserums identifiziert. Eine Identifizierung des Anzuchtvirus erfolgt ebenfalls durch seine typische cytopathogene Wirkung in FHM-Zellenlinienkulturen, die ein Rundwerden der Zellen und eine leichte Vergrösserung des Kerns mit einer Chromatinwanderung im Kern der Zelle zeigen.

Die FHM-Zellenlinie wird untersucht und muß den Anforderungen gemäß 9 CFR II3.52 genügen. Die Stammkultur (86. Passage) der FHM-Zelle und entweder jede Subkultur von Zellen, die zur Herstellung des biologischen Materials verwendet wird, oder die letztlich erhaltene Masse an geerntetem Material, werden auf Sterilität gemäß 9 CFR II3.26 und auf Mycoplasma gemäß 9 CFR 113.28 untersucht.

Die FHM-Zellenlinie wird in Eagle's MEM-Medium gezüchtet, das nicht-essentielle Aminosäuren und Natriumpyruvat, enthaltend 30 Einheiten Penicillin, 30 [ig Streptomycinsulfat und 2,5 Ug Amphotericin B pro ml, mit 10 Prozent sterilem Kalbsfötenserum

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enthält.

Von der FHM-Zellenlinie wird eine Subkultur durch Entfernen der Monoschichtkultur durch Zugabe von warmer (30 bis 37°O ATV-Lösung hergestellt. Nachdem man die erhaltene ATV-Zellensuspension mit 800 bis 1500 U/min zentrifugiert hat, werden die Zellen in sterile Behälter in einem Verhältnis von 3 : 1 in das vorgenannte Nährmedium eingebracht. Die Zellkulturen werden bei 28 ί 2°C für eine Dauer von etwa 2 bis 6 Tagen, oder solange bis Monoschichten entstanden sind, bebrütet.

Als Propagierungsmedium, sowohl für die Anzuchtviren als auch für die Produktionsviren, dient Eagle's Medium mit nicht-essentiellen Pyruvaten, enthaltend 30 Einheiten Penicillin,'30 μg Streptomycinsulfat und 2 ug Amphotericin B, pro ml.

Infizierte Gewebekulturflüssigkeiten werden für die Impfung von Keim- und Produktionsmonoschichtkulturen verwendet. Keimkulturflüssigkeiten für die Impfung werden durch rasches Auftauen in kaltem Fließwasser hergestellt. Vor ihrer Verwendung sind die Stoffe unverdünnt. Um zufriedenstellende Anzucht eigenschaften zu besitzen, muß der Virus einen Titer von mindestens 1000 TCID™ pro ml besitzen.

Das Nährmedium wird aseptisch von Monoschichtkulturen von zu impfenden FHM-Zellen entfernt. Sowohl Anzucht- als auch Produktionsviren werden auf die Zellkulturen überimpft; dann läßt man 30 bis 60 Minuten adsorbieren. Die folgenden Virusmengen werden auf jede Gewebekulturflaschen-Monoschicht überimpft: 0,5 ml bis 5 ml für 0,9 Liter—Flaschen, 10 ml bis 25 ml in die 5 Liter fassende Vitexflasche, und 20 bis 60 ml in die 9 Liter fassende Walzentrommelflasche. Nach der Adsorption werden etwa 100 ml, 500 ml und 1500 ml des in II, C beschriebenen Aufenthaltsmediums zu der 0,9 Liter fassenden Kulturflasche, der 5 Liter fassenden Vitex-Flasche bzw. der 9 Liter fassenden Walzentrommelflasche hinzugefügt.

Die geimpften Gewebekulturflaschen werden bei 18 t 2°C für eine Dauer von 4 bis 8 Tagen bebrütet, worauf Impfung mit dem üblichen

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Intervall von 5 bis 6 Tagen erfolgt.

Der aufgrund des Virus auftretende, typische cytopathogene Effekt wird im allgemeinen 5 bis 7 Tage nach dem Brüten bei 18 * 2°C beobachtet. Der cytopathogene Effekt macht sich durch ein Rundwerden der Zellen mit einer leichten Vergrößerung des Kerns bemerkbar. Die Kulturen werden sowohl mikroskopisch als auch- makroskopisch bezüglich abnormaler Zellerscheinungen und Verunreinigung kontrolliert .

Am Tag der Ernte werden die Flaschen mit den Virus-infizierten Gewebekulturen aus dem Brüter genommen und sorgfältig kontrolliert. Nur solche Flaschen, die frei von abnormalen Eigenschaften sind, die eine Verunreinigung anzeigen könnten, werden für die Produktion geerntet. Die infizierten Gewebekulturen werden 4 bis 8 Tage nach der Inkubation geerntet.

Die Virusflüssigkeiten werden von den Gewebekulturflaschen in einen sterilen Sammelbehälter aseptisch abgeerntet. Aus dem Virussammelbehälter werden Proben zur Untersuchung entnommen. Die geernteten Virusflüssigkeiten werden sofort mit Formaldehydlösung inaktiviert, bei einer Endkonzentration von 0,05 Prozent (1 Volumteil Formaldehydlösung, verdünnt 1 : 20 , wird zu 10 Volumteilen Reaktionsprodukt hinzugefügt). Die Inaktivierungsperiode dauert bei 28 t 2°C mit Rührintervallen mindestens 72 Stunden. Am Ende der

Inaktivierungsperiode werden die Kulturen in den Zwischenproduktkühler überführt.

Als Konservierungsmittel in der endgültigen Vaccine sind lediglich die in den Gewebekulturflüssigkeiten verwendeten Antibiotika

vorzugsweise vorhanden. Das Endprodukt enthältYnicrrt mehr als 30 Einheiten Penicillin, 30 ug Streptomycinsulfat und 2,5 Ug Amphotericin B pro ml.

Die produzierten inaktivierten Virusflüssigkeiten, die zufriedenstellende Eigenschaften besitzen, werden aseptisch in einem geeigneten sterilen Behälter gesammelt, der aus Glas oder nichtrostendem Stahl sein kann. Der geforderte Mindest-Virussammeltiter

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ζ? ■

vor der Inaktivierung beträgt 1O⁵'⁵ TCID₅₀ZO,2 ml, wobei Vermischen mit Virussammeichargen mit hohem Titer vor der Inaktivierung erfolgt, so daß die endgültige Charge mindestens einen Wert von 10 ' TCID(-₀/ml vor der Inaktivierung besitzt.

Beispiel für eine typische Serienproduktion

Titer (ml) vor der Inaktivierung

Inaktivierte Viruschargen	Volumen (ml)
A	25 OOO
B	25 000
C	50 000
Gesamt	100 000

10^5s5 TCID₅₀ 10^6j5 TCID

⁶⁵⁸

6 4 Mittelwert 10 ³ TCID_n

IO⁶⁵⁸ TCID

6 4 ³

Bestandteil	4
NaCl
KCl
Na₂HPO	6 HO
KH₂PO₄
CaCl₂
MgCl .

Die bevorzugte hyperosmotische Lösung besitzt folgende Zusammensetzung, wobei es sich bei den angegebenen Bestandteilen um p.a.-Reagenzien handelt:

g/Liter 80,0 0,2

1,15 0,2 0,1 0,1

entionisiertes Wasser, ergänzt zu 1000 ml

Herstellung:

1. Das NaCl, KCl, Na₃HPO₄ und KH₂PO₄ werden in etwa 750 ml entionisiertem Wasser gelöst.

2. Das CaCl₂ wird in etwa 75 ml entionisiertem Wasser gelöst.

3. Das MgCIp· 6 HpO wird in etwa 75 ml entionisiertem Wasser gelöst.

4. Die drei Lösungen werden miteinander in der Reihenfolge der Herstellung in einer ausreichenden Menge Wasser, zur Erzeugung

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von 1 Liter Lösung, gelöst.

5. Die Lösung wird in mittleren Mengen von 300 bis 500 Liter, bei einem Maximum von 65O Liter, hergestellt.

Die Lösung wird sterilisiert mittels Filtration durch ein Milliporenfilter (0,22 μ) in einen sterilen Sammelbehälter.

Oxytetracyclinhydrochlorid (als handelsübliche parenterale Lösung, die 10 000 ug/ml enthält) wird als Konservierungsmittel zu der Charge mit einer Endkonzentration von 30 ug/ml hinzugefügt, um eine zufällige bakterielle Verunreinigung der hyperosmotischen Lösung zu verhindern.

Behandlung der Fische

Zur Sicherheitsprüfung werden 30 empfindliche Regenbogenforellen, etwa 6,5 bis 9 cm lang, 2 Minuten in 1000 ml hyperosmotischem Adjuvans als Vorbereitung (1. Stufe) für die Vaccination gehalten. Nach dem Herausnehmen läßt man die Fische abtrocknen und hierauf 2 bis 3 Minuten in 500 bis 1000 ml Vaccine schwimmen. Nach der Vaccination hält man die Fische 14 Tage in einem Aquarium mit Wasser von 5 bis 15°C.

Zu dieser Zeit kann man die Fische einer zweiten Vaccination unterwerfen. Anschließend werden sie zusätzlich 14 Tage in dem Aquarium zur Beobachtung gehalten. Der Sicherheitstest gilt als bestanden, wenn mindestens 27 Fische überleben.

Zur Wertbestimmung werden 25 der geimpften Fische aus dem Versuch l4 Tage in einem Aquarium mit Wasser von 5 bis 15°C gehalten. 25 empfindliche, nicht-geimpfte Fische werden in einem separaten Aquarium als Kontrollgruppe gehalten. Am Ende der 14-Tage-Periode werden den geimpften Fischen und den Kontrollfischen intramuskulär 0,05 ml einer virulenten Erregerkultur des IHN-Virus, enthaltend etwa 4 LDp-Q, verabreicht. Der Schutzversuch gilt als bestanden, wenn mindestens 60 Prozent der geimpften Fische überleben und mindestens 70 Prozent der Kontrollfische innerhalb der 14-tägigen

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Beobachtungsperiode sterben.

Die, wie vorstehend beschrieben, hergestellte Vaccine wird zur Verhinderung von IHN-Infektionen bei gesunden Salmoniden vom "button-up"-Stadium und älter empfohlen.

Die Vaccine wird verabreicht, indem man die -Fische, die 24 Stunden nicht gefüttert worden sind, in einen Behälter, der die hyperosmotische Adj uvanslösung enthält, in einer Menge von etwa 0,5 kg Fisch/Liter einbringt. Nachdem man die Fische 0,5 bis 3 Minuten in der hyperosmotischen Lösung gehalten hat, nimmt man sie heraus und läßt abtropfen. Hierauf werden die Fische in einen die IHN-Vaccine enthaltenden Behälterj in einer Menge von etwa 0,5 kg Fisch/Liter Vaccine, eingebracht und 2 bis 3 Minuten schwimmen gelassen. Nachdem man die Fische aus der Vaccine herausgenommen hat, läßt man abtropfen und setzt die Fische wieder in ihren Aufbewahrungsbehälter ein. Eine zweite Vaccination wird 14 bis 21 Tage nach der ersten Vaccination empfohlen. Der Ausdruck "abtropfen" bedeutet, daß man überschüssige Flüssigkeit ablaufen läßt.

Die Temperatur der hyperosmotischen Adjuvanslösung und der IHN-Vaccine sollte weniger als t 5°C von der Temperatur des Wassers in den Aufbewahrungsbehältern abweichen. Das Material wird bei 2 bis 8°C gelagert.

Dieses Verfahren kann mit vergleichbarem Fischgewicht unter Verwendung des gleichen Behälters der hyperosmotischen Adjuvanslösung und des Behälters der IHN-Vaccine 10 mal wiederholt werden. Nach dem 10. Gebrauch wird das Material verworfen.

In einem anderen Beispiel können Enteric Redmouth -Bakterien zur Behandlung von Fischen verwendet werden. Bei den zur Herstellung dieses Material verwendeten Bakterien handelt es sich um den Hagerman-Stamm von Enteric Redmouth (ERM). Es handelt sich um ein nicht-klassifiziertes Enterobakterium, das ursprünglich aus sterbenden Regenbogenforellen im Hagermantalgebiet in Idaho im Jahre 1970 isoliert wurde. Es handelt sich um die 30. Passage (Tryptose-

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- tür -

Soja-Nährbrühe) und das Bakterium hat seine Virulenz für das Wirtstier behalten.

Jede Charge von Arbeits- und Produktionskeimen wird durch einen Agglutinationstest auf dem Objektträger unter Verwendung eines spezifischen, in Kaninchen hergestellten Antiserums identifiziert. Die Virulenz der Stammkultur gibt sich durch ihre Fähigkeit zu erkennen, die Krankheit in empfänglichen Fischen hervorzurufen. Die Virulenz des Organismus wird dadurch beibehalten, daß man alle 6 Monate eine neue Stammkultur durch Beimpfen von empfänglichem Fisch mit vorhandenen Stammkulturbakterien herstellt. Wenn die geimpften Fische die typischen Krankheitsanzeichen zeigen, werden die Bakterien aus dem Nierengewebe in sterile Nähragarplatten aseptisch reisoliert. Typische Kolonien werden ausgewählt und auf sterile Nährbrühe überimpft.

Die Produktionskulturen werden in einemkontinuierlichen Kultursystem erzeugt, wobei die Ernte der Kulturen unter Ersatz des Mediums, kontinuierlich oder in Intervallen erfolgt, wenn die photometrisch durchgeführte Turbiditätsbestimmung anzeigt, daß die

Kultur mindestens l'lCr Organismen/ml enthält. Die Bildungsdauer der ERM-Bakterien in der logarithmischen Phase des Wachstums beträgt 7 bis 11 Minuten. Die Mindestdauer der kontinuierlichen Kulturansätze beträgt 12 Stunden bei einer Maximaldauer von 120 Stunden.

Die geernteten Bakterienkulturen im Sammelbehälter werden durch 10 η NaOH bis auf einen End-pH von 8,7 bis 9*3 der Lysis unterworfen, bis mindestens 80 Prozent der intakten Bakterien, gemäß der Bestimmung mittels Zentrifugation in einem Hopkins-Rohr bei 1500 U/min, lysiert sind. Hierauf wird der pH der Kultur durch Zugabe von 10 η HCl auf einen Wert von 7 bis Y₃H eingestellt. Während dieser Einstellperiode unterliegen die meisten der verbliebenen intakten Bakterien der Lysis. Dann erfolgt die Zugabe von Formaldehydlösung, während dauernden Rührens, bis auf eine Endkonzentration von 0,1 Prozent. Die Kulturen werden mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und dann dem Zwischenproduktkühler zugeführt, wo das Material bis zur weiteren Verwen-

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dung verbleibt.

Am Ende des Lysevorgangs wird Bakterienimpfstoff-Formaldehyd-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,1 Prozent zugesetzt. Dann wird Oxytetracyclin-hydrochlorid (im Handel erhältliche parenterale Lösung, die 10 000 μg/ml enthält) zur Zeit der Abfüllung mit einer Endkonzentration von 30 μg/ml zugesetzt.

Die Durchführung der Schutzprüfung und die Wertbemessung erfolgen wie vorstehend beschrieben.

In einem weiteren Beispiel wird ein Vibrio anguillarum-Bakterienimpfstoff bzw. Bacterin, 78-skid-Stamm, hergestellt. Bei den zur Herstellung dieses Materials verwendeten Bakterien handelt es sich um Vibrio anguillarum. Die Bakterien wurden aus sterbenden Chinook-Lachsen in der Manchester Bay isoliert. Verwendet wird die 7* Passage (Tryptose-Soja-Agar), die ihre Virulenz für das Wirtstier behalten hat. Hiermit erfolgt die Impfung von empfindlichen Fischen; nach Reisolierung erfolgt 1 Passage auf Tryptose-Soja-Agar.

Der Vibrio anguillarum-Stamm, der mit 78-SKID bezeichnet wird, stammt vom National Marine Fishery Service.

Typisches Vibrio anguillarum-Koloniewachstum auf Tryptose-Soja-Agar-Platten mit normaler Koloniebegrenzung ist erhaben und begrenzt, besitzt eine weiße bis gelbe Farbe, ist nicht-fluoreszierend und besitzt kein diffusionsfähiges Pigment.

Die Züchtung der Produktionskulturen erfolgt in einem kontinuierlichen Kultursystem in pH-kontrollierten (durch Zugabe von steriler 1On NaOH), mechanisch und mittels steriler Luft bewegten, und mit Turbiditätsaufzeichnung ausgerüsteten Behältern, um die Geschwindigkeit der Ernte und die Zugabe von sterilem Medium .zum Behälter zu bestimmen. Nicht mehr als 600 1 Medium und geernteter Kultur werden aus kontinuierlichem Kulturansatz hergestellt, Die Bildungsdauer von Vibrio anRuillarum in der logarithmischen

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-♦*- 264Λ766

Wachstumsphase beträgt etwa 12 bis 20 Minuten.

Während der kontinuierlichen Ernte der Kultur wird die Turbidität beziehungsweise Trübung gemessen, um eine Ausbeute einer Kultur mit 8 Prozent Lichtdurchlässigkeit bei 625 mu zu gewährleisten. Proben werden am Anfang und Ende des kontinuierlichen Kulturansatzes genommen und auf Reinheit untersucht; mindestens

1 . 10 Organismen/ml durch Plattenzählung werden als zufriedenstellend angesehen.

Die Produktionskulturen werden aus der kontinuierlichen Kulturvorrichtung mittels eines sterilen geschlossenen Systems geerntet und in einen herkömmlichen sterilen Glas- oder nichtrostenden Stahl-Sammelbehälter überführt. Die Kulturen werden in diesem Sammelbehälter angereichert, bis der kontinuierliche Kulturansatz beendet i_st.

Die geernteten Bakterienkulturen werden in dem Sammelbehälter · durch Zugabe von 1On NaOH bis auf einen pH von 8,7 bis 9_S3 lysiert, bis mindestens 80 Prozent der intakten Bakterien, gemäß der Zentrifugierung in einem Hopkinsrohr bei 1500 U/min,lysiert sind. Der pH der Kultur wird dann durch Zugabe von 1On HCl auf 7 bis 7,4 eingestellt. Während dieser Einstellperiode unterliegen die meisten restlichen intakten Bakterien der Lysis. Dann erfolgt, während konstanten Rührens, Zugabe von Formaldehydlösung bis auf eine Endkonzentration von 0,1 Prozent. Die Kulturen werden bei Raumtemperatur für eine Dauer von mindestens 48 Stunden gehalten und dann in den Zwischenproduktkühler bis zur Abfüllung überführt.

bzw. das Bacterj.n Der Bakterienimpfstoff in zufriedenstellender Weise geerntetes Material aus einem oder mehreren Ansätzen - wird unter aseptischen Bedingungen in einen sterilen Sammelbehälter aus nicht rostendem Stahl überführt. Durch Zugabe von steriler 1On NaOH-Lösung wird der pH auf einen Viert von 7_s0 bis 7_S4 eingestellt. Hierauf wird die Charge mit Oxytetracyclin-hydrochloridlösung (10 000 ng/ml) mit einer Endkonzentration von 30 ug/inl als Konservierungsmittel für die Lösung versetzt.

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Ja

Beispiel für eine typische Serienproduktion

Inaktivierte Vibrio anguillarura-Kulturflüssigkeiten 600 000 ml

Oxytetracyclin-hydrochlorid-Lösung 1 800 ml

Pormaldehydlösung 600 ml

insgesamt - 602 400 ml

Zur Zeit der Abfüllung werden zur Wertbestimmung und Sterilitätsprüfung des unabgefüllten Materials Proben entnommen. Der Ansatz wird auf 2 bis 8 ⁰C gekühlt, bis die Prüfungen abgeschlossen sind, und das Matsöal wird in die endgültigen Behälter abgefüllt.

Die Schutzprüfung wird folgendermaßen durchgeführt: 30 empfindliche Regenbogenforellen, etwa 6,5 bis 9 cm lang, werden 0,5 bis 3 Minuten in 500 bis 1000 ml hyperosmotischem Adjuvans zur Vorbereitung auf die Vaccination gehalten. Nachdem man die Fische aus der Vorbehandlungslösung herausgenommen hat, läßt man Abtropfen. Hierauf läßt man die Fische 2 bis 3 Minuten in 500 bis 1000 ml einer repräsentativen BakterienimpfStoffprobe, wie vorstehend beschrieben, schwimmen. Nach der Vaccination hält man die Fische 14 Tage in einem Warteaquarium mit V/asser von 5 bis 15 °C.

Während dieser Zeit erhalten die Fische eine zweite Vaccination, wie vorstehend beschrieben. Sie werden dann in das Warteaquarium zurückgegeben und dort zusätzlich 14 Tage zur Beobachtung ge^J halten. Die Schutzprüfung gilt als bestanden, wenn mindestens 27 Fische überleben.

Die Wertbestimmung geschieht wie folgt: 25 der geimpften Fische aus der Schutzprüfung werden 14 Tage in einem Aquarium mit Wasser von 5 bis 15 C gehalten. In einem separaten Aquarium werden als Kontrollgruppe 25 empfindliche, ungeimpfte Fische gehalten. Am Ende der l4tägigen Warteperiode werden den geimpften Fischen und den Kontrollfischen intramuskulär 0,05 ml einer virulenten Erregerkultur von Vibrio anguillarum-

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ao

Bakterien, enthaltend etwa H ^D₁-Q, verabreicht. Die Prüfung gilt als bestanden, wenn mindestens 60 Prozent der geimpften Fische überleben und mindestens 70 Prozent der Kontrollfische innerhalb der l4tägigen Beobachtungsperiode sterben.

Die Verabreichung des hergestellten Vibrio anguillarum-Bakterienimpfstoffes (78-skid-Stamm) erfolgt so, daß man die Fische, die 24 Stunden nicht gefüttert worden sind, in einem Behälter mit der hyperosmotischen Adjuvanslösung, in einer Menge von etwa 0,5 kg Fisch/Liter, hält. Nachdem man die Fische 0,5 bis 3 Minuten in der hyperosmotischen Adjuvanslösung gehalten hat, nimmt man sie heraus und läßt abtropfen. Hierauf läßt man die Fische 2 bis 3 Minuten, in einer Menge von etwa 0,5 kg Fisch/Liter Bakterienimpfstoff, in einem Behälter mit dem Vibrio anguillarum-Bakterienimpfstoff schwimmen. Nach dem Herausnehmen der Fische aus dem Bakterienimpfstoff läßt man abtropfen und gibt dann die Fische in ihren Wartebehälter zurück. Eine zweite Vaccination wird 14 bis 21 Tage nach der ersten Vaccination empfohlen.

Dieses Verfahren kann mit vergleichbarem Fischgewicht unter Verwendung des gleichen Behälters der hyperosmotischen Adjuvanslösung und des Behälters des Vibrio anguillarum-Impfstoffes 10 mal wiederholt werden. Nach zehnmaligem Gebrauch wird das Material verworfen.

Die Temperatur der hyperosmotischen Adjuvanslösung und des Vibrio anguillarum-Impfstoffes sollte weniger als +_ 5 ⁰C von der Temperatur des Wassers in den Wartebehältern abweichen. Das Material wird bei 2 bis 8 ⁰C gelagert.

Aeromonas salmonicida-Bakterienimpfstoff, C 74-11-Stamm, ist ein weiteres Beispiel für Bakterien, die erfindungsgemäß genutzt werden können.

Zur Herstellung dieses Impfstoffes werden Aeromonas salmonicida-Bakt erien verwendet, die aus sterbenden Lachsen (Onchorhynchus

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gorbuscha) im Pacific Environmental Institute, West Vancouver, British Columbia, isoliert wurden. Es wird die sechste Passage (Tryptose Soja-Nährbrühe) verwendet, die ihre Virulenz für das Wirtstier behalten hat.

Ein Aeromonas salmonicida-Stamm, C 74-11, wurde von der Pacific Biological Station in Nanimo, British Columbia, erhalten.

Typischerweise erfolgt das Aeromonas salmonicida-Kolonienwachstum auf Tryptose Soja-Agarplatten so, daß einige Kolonien cremig und gleißend, mit regulären Kolonierändern, aussehen. 72 Stunden nach Beginn der Züchtung bei 20 +_ 2 ⁰C erzeugen die Kolonien ein braunes, wasserlösliches Pigment, das in das Medium diffundiert.

Die Produktionskulturen werden in einem kontinuierlichen Kultursystem in pH-kontrollierten (durch Zugabe von steriler 1On NaOH), mechanisch und mittels steriler Luft gerührten Behältern gezüchtet, wobei eine Turbiditätsaufzeichnung erfolgt, um die Geschwindigkeit der Ernte und der Zuführung von sterilem Medium zum Behälter zu bestimmen. Nicht mehr als 6OO 1 Medium und geerntete Kultur werden mit einem kontinuierlichen Kulturansatz hergestellt.

Die Bildungsdauer von Aeromonas salmonicida in der logarithmischen Wachstumsphase beträgt etwa 12 bis 20 Minuten.

Während der kontinuierlichen Ernte der Kultur wird die Turbidität aufgezeichnet, um die Ausbeute einer Kultur mit einem 16-prozentigen Lichtdurchgang bei 625 mu zu gewährleisten. Am Anfang und Ende der kontinuierlichen Kulturansätze werden Proben' genommen und auf Reinheit und Gehalt geprüft, wobei mindestens 1 . 10° Organismen pro ml durch Plattenzählung für ein zufriedenstellendes Ergebnis vorhanden sein sollen.

Die Produktionskulturen werden in einem kontinuierlichen Kultursystem erzeugt, wobei die Ernte der Kulturen unter Ergänzung von

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Medium kontinuierlich oder in Intervallen erfolgt, wenn die photometrisch durchgeführte Turbiditätsbestimmung anzeigt, daß

die Kultur mindestens 1·10 Organismen/ml enthält. Die Mindestdauer der kontinuierlichen Kulturansätze beträgt 12 Stunden bei einer Maximaldauer von 120 Stunden. Die Ernte erfolgt gemäß Seite 26,

Abs. 3.

Die geernteten Bakterienkulturen im Sammelbehälter werden durch Zugabe von 10 η NaOH bis auf einen End-pH von 8,7 bis 9,3 der Lysis unterworfen, bis mindestens 80 Prozent der intakten Bakterien, gemäß der Bestimmung mittels Zentrifugation in einem Hopkins-Rohr bei 1500 U/min, lysiert sind. Hierauf wird der pH der Kultur durch Zugabe von 10 η HCl auf einen Wert von 7 bis 7,4 eingestellt. Während dieser Einstellperiode unterliegen die meisten der verbliebenen intakten Bakterien der Lysis. Dann erfolgt die Zugabe von Formaldehydlösung, während dauernden Rührens, bis auf eine Endkonzentration von 0,1 Prozent. Die Kulturen werden mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und dann den Zwischenproduktkühlern zugeführt, wo das Material bis zur weiteren Verwendung (Abfüllung)' verbleibt.

Die Bakterienimpfstoffe - zufriedenstellend geerntetes Material aus einem oder mehreren Ansätzen - werden unter aseptischen Bedingungen in einen sterilen Sammelbehälter aus nichtrostendem Stahl überführt. Nachdem man den pH durch Zugabe von steriler 10 η NaOH auf einen Wert von 7,0 bis 7,4 eingestellt hat, wird die Charge mit Oxytetracyclin-hydrochlorid-Lösung (10 000 ug/ml) bis zu einer Endkonzentration von 30 ug/ml als Konservierungsmittel für die hyperosmotische Lösung versetzt.

Beispiel für eine typische Serienproduktion

inaktivierte Aeromonas salmonicida-

Kulturflüssigkeiten 600 000 ml

Oxytetracyclin-hydrochlorid-Lösung 1 800 ml

Formaldehydlösung 600 ml

insgesamt 602 400 ml

Zur Zeit der Abfüllung werden Proben zur Wertbestimmung und Sterilität sprüfung des unabgefüllten Materials genommen; die Charge

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wird auf 2 bis 8⁰C gekühlt, bis die Prüfungen abgeschlossen sind und das Produkt in die Endbehälter abgefüllt werden kann.

Das Endprodukt (abgefüllt in 56 g - Pläschchen) muß den Sterilität sanforderungen gemäß 9 CPR 113.26 genügen.

Die Schutzprüfung und die Wertbestimmung erfolgen wie bei anderen Bakterien.

Die Verabreichung des Materials erfolgt so, daß man Fische, die 24 Stunden nicht gefüttert worden sind, in der hyperosmotischen Adjuvanslösung, in einer Menge von etwa 0,5 kg Fisch/Liter, hält. Nachdem man die Fische 0,5 bis 3 Minuten in der hyperosmotischen Lösung belassen hat, nimmt man sie heraus und läßt abtropfen. Hierauf läßt man die Fische 2 bis 3 Minuten in einem den Aeromonas salmonicida-Bakterienimpfstoff enthaltenden Behälter, in einem Verhältnis von etwa 0,5 kg Fisch/Liter Bakterienimpfstoff, schwimmen. Nachdem man die Fische aus dem Bakterienimpfstoff herausgenommen hat, läßt man abtropfen und gibt sie in den Wartebehälter zurück. Eine zweite Vaccination wird 14 bis 21 Tage nach der ersten Vaccination empfohlen.

Dieses Verfahren kann mit vergleichbarem Fischewicht unter Anwendung des gleichen Behälters der hyperosmotischen Adjuvanslösung und des Behälters des Aeromonas salmonicida-Bakterienimpfstoffes 10 mal wiederholt werden. Nach 10-maligem Gebrauch wird das Material verworfen.

Die Temperatur der hyperosmotischen Adjuvanslösung und des Aeromonas salmonicida-Bakterienimpfstoffes soll weniger als ί 5°C von der Temperatur des Wassers des Wartebehälters variieren. Das Material wird bei 2 bis 8°C gelagert.

Der hier verwendete Ausdruck "die Gesundheit und/oder das Wohlbefinden fördernde Stoffe bzw. Medien" umfaßt Antigene, Vaccinen,. Seren, Bakterienimpfstoffe bzw. Bacterine, Chemotherapeutika usw., deren Wirkung letztlich darin besteht, eine Verbesserung des physiologischen Zustandes oder auch Gesundheitszustandes der

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Wassertiere herbeizuführen. Bei Antigenen handelt es sich um Stoffe, die im allgemeinen Eiweißnatur besitzen und im lebenden Organismus eine Immunreaktion (d.h die Bildung spezifischer Antikörper) bewirken. Weiterhin umfaßt dieser Ausdruck solche Stoffe, die das Auftreten bzw. die Stärke der Krankheiten herabsetzen oder die Tiere befähigen, die Krankheiten abzuwenden. Schließlich umfaßt dieser Ausdruck auch Stoffe, die es den Tieren ermöglichen können, Predatoren (Schädlinge) abzuwehren, oder die in irgendeiner Weise zur Verbesserung des Wohlbefindens der Wassertiere beitragen. Diese die Gesundheit und/oder das Wohlbefinden fördernden Medien oder Stoffe können auch als prophylaktische und/oder therapeutische Stoffe zur Bekämpfung von Krankheiten von Wassertieren, insbesondere Fischen und Krustentieren, angesehen werden. Antimikrobielle Stoffe sind im allgemeinen wirksam gegen verschiedene Bakterien, Pilze und Protozoen, die auf Fische, Krustentiere, usw. pathogen wirken. Zahlreiche durch Viren und Mikroben hervorgerufene Infektionen von Wassertieren können erfindungsgemäß überwunden werden, sofern man nicht-toxische Mengen anwendet. Weiterhin dürfen die Stoffe durch die hyperosmotischen Lösungen nicht nachteilig beeinflußt werden.

Nach der Behandlung mit den erfindungsgemäß beschriebenen Mitteln bzw. Medien können die Tiere in ihre natürliche Umgebung oder in irgendeine andere Umgebung, die ihrer natürlichen Umgebung nahekommt, z.B. Fischteiche oder Brutstätten, verbracht werden.

Der pH der hyperosmotischen Lösung liegt vorzugsweise nicht unter 5. Besonders bevorzugt wird ein pH-Bereich von 7 bis 9, wobei das Maximum etwa 9,5 beträgt.

Die Konzentrationen der hyperosmotischen Lösung, bezogen auf 0,85-prozentige Salzlösung (physiologische Kochsalzlösung), können in weitem Rahmen variieren. Vorzugsweise ist die Konzentration 1200 milliosmolar, wobei die Maximalkonzentration durch diejenige Konzentration gegeben ist, die die Tiere ohne größere Schädigung vertragen.

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5 10 Die Antigen-Konzentration beträgt vorzugsweise 10 bis 10 Antigenteilchen pro ml Vaccinelösung.

Es wurde gefunden, daß Chemotherapeutika unter Anwendung der gleichen, für Antigene beschriebenen Methode, ohne größere Veränderungen der Adjuvans- oder Vorbehandlungsmethode, verabreicht werden können. Die molekularen Konzentrationen der Chemotherapeutika können in weitem Rahmen variieren. Beispiele für geeignete Chemotherapeutika sind Antibiotika, Antivirusmittel, Antimykotika, Parasiticide und Anthelmentica.

Die Temperatur der hyperosmotischen Lösung und des Antigenmaterials kann variieren; im allgemeinen werden Raumtemperaturen bevorzugt. Es sind keine speziellen Erwärmungs- oder Kühlmaßnahmen erforderlich.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

■'1, Arzneimittel, bestehend aus einer hyperosmotischen Lösung, bezogen auf physiologische Kochsalzlösung, oder einem Konzentrat hiervon, die (das) mindestens einen die Gesundheit oder das Wohlbefinden fördernden Stoff als Wirkstoff, sowie gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe enthält.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 in Zweikomponentcnform, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Komponente die hyperosmotische Lösung oder das Konzentrat hiervon und die zweite Komponente den Wirkstoff, gegebenenfalls in gelöster Form, enthält.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hyperosmotische Lösung und/oder die Wirkstofflösung wässrige Lösungen darstellen.
H. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß die hyperosmotische Lösung mindestens 1200 milliosmolar ist.

5. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die hyperosmotische Lösung oder das Konzentrat hiervon folgende Zusammensetzung hat:

Bestandteil Gewichtsteile

NaCl 80

KCl 0,2

Na₂HPO₁₁ 1,15

KH₂PO₄ 0,2

CaCl₂ 0,1

MgCl₂.6 H₂O 0,1 Entionisiertes Wasser . 0 bis 1000

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68 ' 65 H 2, 2 10 1000 22 0 bis

6. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die hyperosmotische Lösung oder das Konzentrat hiervon folgende Zusammensetzung hat:

Bestandteil Gewichtsteile

NaCl

KCl

CaCl₂.2 H₂O MgSO₄.7 H₂O NaHPO₄.1 H₂O Dextrose

NaHCO₃

Destilliertes Wasser
7. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Antigen oder ein chemotherapeutisch aktiver Stoff ist.
8. Arzneimitel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Vibrio anguillarum-, Aeromonas salmonicida-, Rinderserumalbumin-, Enteric Redmouth- oder Channel Catfish Virus-Impfstoff, oder ein Impfstoff gegen Infektiöse Hematopoietische Nekrose oder gegen Infektiöse Pankreasnekrose ist.
9. Arzneimittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ΙΟ-⁵ bis 10 Antigenteilchen pro ml Impf stoff lösung anwesend sind,
10. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß der pH der hyperosmotischen Lösung mindestens 5, vorzugsweise 7 bis 9, beträgt.

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