DE2126957A1

DE2126957A1 - Impfstoff gegen Gänsehepatitis

Info

Publication number: DE2126957A1
Application number: DE19712126957
Authority: DE
Inventors: auf Nichtnennung. P Antrag
Original assignee: Schettler, Hermann, Dr., East Lansing, Mich. (V.St.A.):
Priority date: 1971-05-29
Filing date: 1971-05-29
Publication date: 1972-12-07
Also published as: DE2126957B2; FR2143588A1; NL7109033A

Description

Impfstoff gegen Gänsehepatitis

Die Erfindung betrifft Impfstoffe gegen Gänsehepatitis, die eine Immunisierung von Wassergeflügel, insbesondere Gänsen, herbeiführen.

Die Gänsehepatitis ist eine Viruskrankheit, welche in Wassergeflügelzuchten großen wirtschaftlichen Schaden verursachen kann. Bisherige Untersuchungen befaßten sich vorwiegend mit einer klinischen Beschreibung von verschiedenen Virusstammen. Das Resultat der Untersuchungen war, daß keines der isolierten Viren in der Lage war, das im Felde beobachtete Krankheitsbild zu reproduzieren, so daß die isolierten Erreger nicht als die die Krankheit verursachenden Viren angesprochen werden konnten. Es wurde nicht erkannt, daß sich die Krankheit vorwiegend in einer Entzündung der Leber der erkrankten Tiere manifestiert. Genaue Untersuchungen haben aber nun ergeben, daß sich die Krankheit vorwiegend in einer Leberentzündung (Hepatitis) und in einer Bauchspeicheldrüsenentzündung (Pankreatitis) äußert. Da das Krankheitsbild je nach Empfänglichkeit der Gänse-

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küken, die wiederum von deren mütterlichen Antikörpergehalt im Blut sowie von deren Alter zum Zeitpunkt der Infektion abhängt, in verschiedenen Erscheinungsformen auftritt, muß angenommen werden, daß die Krankheit in variierenden klinischen Bildern auftritt.

Nach experimenteller Infektion mit dem isolierten Virus wurden vier verschiedene Krankheitsformen beobachtet:

1. Werden Gänseküken in einem Alter von 1 bis 8 Tagen infiziert, so kommt es zu einer sehr plötzlich auftretenden schweren Krankheit, der alle Gössel zum Opfer fallen, falls sie keinen mütterlichen Antikörperschutz besitzen. Die ersten Krankheitszeichen sind gewöhnlich am J.Tage nach der Infektion zu beobachten. Am 3· Tage also, manchmal aber auch erst am 4. oder 6. Tage, verweigern die infizierten Tiere das Futter, schlagen häufig mit dem Kopf, bekommen etwas Lidbindehautentzündung und sitzen die meiste Zeit dicht gedrängt zusammen. Sie sind vermehrt wärmebedürftig. Zu dieser Zeit sind die Gänschen noch ziemlich kräftig, da sie bis zur Verweigerung des Futters gleichgut wachsen wie nichtinfizierte Tiere. Ί bis 2 Tage später verweigern sie dann auch das Trinkwasser, bekommen, ein eingefallenes Gesicht und verklebte Augen. In der Zwischenzeit sind sie so schwach geworden, daß sie sich nur mit großer Mühe erheben können und dann auch nur wenige Schritte laufen. Den Kopf stützen sie dabei auf den Boden und verenden in diesem Stadium meist innerhalb von wenigen Stunden.

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Das Sektionsbild zeigt deutlich geschwollene Leber, dick gefüllte Gallenblase, vermehrte Flüssigkeit in der Bauchhöhle und graugrünlichen schleimigen Mageninhalt, der häufig nach dem Eintritt des Todes aus dem Schnabel läuft.

bis 14 Tage alte infizierte Tiere zeigen zwei verschiedene Krankheitsbilder:

a) 5 bis 6 Tage nach der Ansteckung erkranken alle infizierten Gänschen augenscheinlich. Ein Teil verweigert das Futter, andere zeigen mehr einen reduzierten Flitterverbrauch. Der Kot wird dünnflüssig—weißlich, später schleimig-weiß. Ein Teil dieser Tiere wird auffällig müde und schwach und verendet ungefähr 4 bis 1o Tage nach Auftreten der ersten Krankheitssymptome. Die meisten dieser Gänse haben verklebte Nasenöffnungen und Augen sowie membranartige fibrinöse Auflagerungen auf der Zunge und am Gaumen.

b) Die überlebenden Tiere bleiben deutlich im Wachstum zurück, bekommen einen deutlich eingezogenen Brustkorb und manchmal einen vergrößerten Leib, verlieren die Federn, besonders auf Rücken, Flügeln und Hals. Einige Tiere erscheinen generell nackt mit stark geröteter Haut und deutlich geschwollener Bürzeldrüse. Herden mit derartigem Erscheinungsbild sind also schon von weitem als infiziert zu erkennen. Der größte Teil dieser Gänse ist schwach, sondert sich von der übrigen Herde ab und verendet noch bis zur

8. oder 1o. Woche.

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3· Drei Wochen alte Gänse erkranken klinisch nur zu · einem Teil. Das dann auftretende Krankheitsbild ist' zwar etwa verzögert, ähnelt aber im wesentlichen dem unter 2b) beschriebenen Krankheitsbild. In dieser Gruppe wurden jedoch vermehrte Lahmheiten beobachtet. Die Gänse hinkten meist auf einem Bein, manchmal aber auch auf beiden, und konnten sich nur schwer vom Boden erheben. Ein Teil dieser Tiere starb, andere überlebten unter deutlich zurückgebliebenem Wachstum. Ungefähr 3o% * aller überlebenden Tiere zeigten in der 1o. bis

12. Woche eine hochgradige Lidbindehautentzündung. Infolge einer darauffolgenden Infektion mit Bakterien aus der Pasteurellagruppe erblindeten sehr viele dieser Tiere. . -

4. Vier Wochen alte Junggänse durchseuchen ohne sichtbare Krankheitserscheinungen. Sie sind jedoch nicht 100% resistent, da sie intravenös infiziert dasselbe Krankheitsbild entwickeln, wie es unter 2. beschrieben wurde.

Diese Erkrankungsformen wurden auch in Peldbeobachtungen festgestellt. Die Inkubationszeit ist also mindestens 3 Tage, kann sich aber bis zu 18 Tagen nach ■ der Ansteckung erstrecken.

Die Prognose ist, wie den Beschreibungen unter 1 und zu entnehmen ist, schlecht. Die Gewebeveränderungen der erkrankten Tiere erscheinen besonders in der Leber, die meistens stark vergrößert und somit geschwollen erscheint. Weiterhin kommt es zu Gewebsveränderungen der Bauchspeicheldrüse, der serösen Häute des Bauchraumes, zu Veränderungen am Herzmuskel und gegebenenfalls noch bei anderen Organen. Spezielle

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Untersuchungen, die die "biologischen und physikochemikalisehen Eigenschaften des Gänsehepatitisvirus betreffen,haben ergeben, daß der Erreger Eigenschaften besitzt, die von allen bisher bekannten Geflügelviren differien. Diese seien als folgende aufgeführt:

1. Eine serologische Verwandtschaft mit folgenden Geflügelviren konnte ausgeschlossen werden:

Infektiöse Bronchitis der Hühner Atypische Geflügelpest (Newcastle disease) Geflügelpocken

Geflügelinfluenza A

Aviare Encephalomyelitis (AE) Aviares Adenovirus (CELO)

Aviare Eeovirus (Stamm 2313) Infektiöse Laryngotracheitis (ILT) Gänse Reovirus (Isolat Krauss) Gänse Reovirus (Isolat Csontos, Derzsy) Infektiöse Entenhepatitis (Klassische Stamm) Entenpest (Infektiöse Entenenteritis) Infektiöse Leber- und Milζentzündung der Eulen Infektiöse Bursaentzündung der Hühner (Gumboro Disease)

2. Gänsehepatitisvirus vermehrt sich in der Gewebekultur (Gänsefibroblasten) mit bisher für Geflügelviren nicht bekannten Veränderungen an den infizierten Zellen. Einschlußkörperchen wurden in Zellkernen und Zellplasma beobachtet.

Die physikalischen Eigenschaften werden im Folgenden zusammengefaßt:

Das Virus hat keine Hülle (Envelop). Es ist folglich resistent gegen Xther und Chloroform.

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2. Das Virus ist hochgradig resistent gegen folgende Inaktivierungsmittel: (Empfindlichkeit oder Resistenz sind Kriterien für die Klassifizierung von Viren).

a) thermische Inaktivierung

b) Fermenteinfluß Co-25% Trypsin)

c) 1 molare MgCl bei 56⁰C.

d) niedrigen pH (3.0)

e) niedrige Fluorkohlenwasserstoffe (Freon 113) f) Sodiumdodecylsulfate (0,1%) SDS '. .

g) Formalin 1 : 1000

h) Phenol 0.5%

i) Sodiumdesoxycholate (o.25%) DOC

k) Xther und Chloroformbehandlung

3. Filtrationsversuche haben ergeben, daß die durchschnittliche Partikelgröße des Erregers unter

5o nm liegt.

4. Der Zytopathische Effekt in Gänseembryö-fibroblasteü — kulturen konnte durch Zugabe von DNA-Inhibitoren (5-«j"od-2-desoxyuridine) komplett verhindert werden.

ψ Dies bedeutet, daß GHV als Nucleinsäure Desoxyribo-

nucleinsäure (DNA) enthält.

Die unterschiedlichen Eigenschaften gegenüber anderen Geflügelviren seien hier noch einmal kurz zusammengestellt»

1. Größe : kleiner als 5o nm. ) _(unbet_{annt für ωάβΓΘ}

2. DNA - Typ der Nucleinsäure ^J Geflügelviren)

' 3- Typische CPE in Gewebekultur ist verschieden von

allen bisher bekannten Geflügelviren. 4, Extreme resistenz gegenüber von Inaktivierungsmitteln.

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5« Keine serologische Verwandtschaft mit anderen bekannten Geflügel viren.

Alle diese Eigenschaften dienen als Charakteristica der als Parvovirusgruppe zusammengefaßten Viren, von denen einige Vertreter bisher nur vom Menschen und Säugetieren isoliert werden konnten.

Da GHV das erste Isolat dieser Gruppe ist, wurde eine Aufnahme in die American Type Culture Collection beantragt.

Folgende Isolate dieser Gruppe sind wissenschaftlich als Gänsehepatitisvirus zu. benennen, falls sie serologisch eine Verwandtschaft mit diesem Virus aufweisen sollten. Die nachstehende Erfindung soll für alle späteren Isolate, die Verwandtschaft zu diesem Erreger aufweisen, in gleichem Maße gültig sein.

Die wirtschaftlichen Verluste sind einmal durch die unmittelbaren Todesfälle und zum anderen durch die mangelnde Gewichtszunahme der erkrankt gewesenen, aber wieder genesenen Junggänse bedingt.

Eine genaue Beschreibung dieser Krankheit, die als "Gänsehepatitis" bezeichnet werden soll, entsprechend den vorstehenden Angaben, existiert bisher noch nicht. Einige Literatur, die sich auf Feldbeobachtungen stützt, ist aber über ähnliche Krankheitsbilder bei Gänsen bereits vorhanden. Als vorbeugende Maßnahme wurde die Verimpfung von Serumproben aus Herden mit Verlusten empfohlen, die aber keinen hundertprozentigen Erfolg zeigten, da bisher weder der Antikörpergehalt, noch die Spezifitat dieser SWen geprüft

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werden konnten. Außerdem haben Versuche ergeben, daß so immunisierte Gänseküken nach experimenteller Infektion mit Gänsehepatitisvirus an Hepatitis erkrankten.

Weiterhin gab es bisher noch kein Verfahren, das ein spezielles, gegen die Krankheit gerichtetes Hyperimmunserum herzustellen erlaubte. Außerdem gab es bisher kein Verfahren, um Zuchtgänse zu immunisieren, damit die Nachkommen mit Antikörperschutz geboren werden und somit in der empfänglichen Zeit, weitgehend den ersten drei Wochen, vollständig durch mütterliche Antikörper geschütz sind.

Weiterhin gab es noch kein Verfahren, um ein geeignetes, gegen die Krankheit gerichtetes Hyperimmunserum herzustellen, das Gänseküken oder bebrütete Gänseembryonen vom Zeitpunkt der Impfung an vor dem Ausbruch der Gänsehepatitis schützt.

Die Erfindung umfaßt folgende Gegenstände:

1. einen Impfstoff zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er virulente Gänsehepatitisviren enthält, die bei Junggänsen die unter 1-4 beschriebenen Krankheitssymptome hervorrufen.

Das virulente Virus dieses Impfstoffes liegt vorzugsweise in Form einer Zeilsuspension in Eiflüssigkeit und Embryozellgewebe (vorzugsweise zerkleinert und homogenisiert) oder in Form einer Zeilsuspension eines als Gewebekultur in einem Kahrmedium gezüchteten Virus vor. Die zu verwendenden Ei- oder Gewebekulturen entstammen vor-

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zügsweise von Wassergeflügel, insbesondere von Gänsen. ■

2. Ein Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes gemäß (1), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man virulente Gänsehepatitisviren über Eikulturen oder Gewebekulturen von Wassergeflügel vermehrt und vorzugsweise in eine für die parenterale Verabreichung geeignete Form bringt.

Die Vermehrung des Virus wird vorzugsweise in einem pharmakologisch zulässigen Kulturmedium durchgeführt.

3. Ein Verfahren zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man älteren Zuchttieren, insbesondere Gänsen, die älter als 4 Wochen sind, Impfstoff gemäß (1) bzw. nach (2) hergestellten Impfstoff verabreicht.Vorzugsweise wird der Impfstoff in Form einer flüssigen Suspension, zweckmäßig parenteral, verabreicht.

Vorzugsweise wird der Impfstoff mehrmals verabreicht, wobei die zweite Verabreichung zweckmäßig 3 bis 6 Wochen nach der ersten Verabreichung durchgeführt wird.

4« Einen Impfstoff zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, der dadurch gekennzeichnet ist^ daß er attenuierte Gänsehepatitisviren gemäß (1) bzw. hergestellt gemäß (2) enthält.

5. Ein Verfahren zur Herstellung des attenuierten Impf stoff es gemäß (4-) , das dadurch gekennzeichnet

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ist, daß man virulente Gänsehepatitisviren gemäß (1) durch Behandlung mit Chemikalien bis zur Beseitigung der Pathogenität unter Erhaltung der Antigenizität attenuiert.

Hierbei geht man zweckmäßig so vor, daß man das attenuierte Virus von begleitendem Zellmaterial abtrennt und auf chemischem oder physikalischem Wege konzentriert. Die Attenuierung des Virus wird vorzugsweise mit ß-Propiolacton durchgeführt«

6* Ein Verfahren zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Zuchttieren oder Küken den Impfstoff gemäß (4) oder hergestellt gemäß (5) verabreicht* Hierbei geht man zweckmäßig so vor, daß man den Impfstoff unter Zufügung eines Adjuvans parenteral verabreicht*

7. Ein Hyperimmunserum zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel oder deren Embryonen gegen Gänsehepatitis, das dadurch gekennzeichnet ist^ daß es durch Tierpassagen von virulentem Gänsehepatitisvirus erzeugte Antikörper enthält. Das Hyperimmunserum kann mit Seirum der zu immunisierenden Tierspezies supplementiert sein.

8« Ein Verfahren zur Herstellung eines Hyperimmunsefüms gemäß (7)* das dadurch gekennzeichnet ist, daß man virulentes Gansehepatitisvirus wiederholt Wirtstieren inokuliert. Das Virus kann Säugetieren oder Wassergeflügel, vorzugsweise Gänsen, inokuliert werden. Vorzugsweise wird das Virus

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parenteral inokuliert. Zur Inokulation in artfremde Wirtstiere verwendet man eine gereinigte Virussuspension, wobei die Reinigung zweckmäßig durch Behandlung mit einem niederen Fluorkohlenwasserstoff (z.B. Frigen 113) erfolgt. Zweckmäßig verwendet man Viren aus Zellkulturen von Wassergeflügel, insbesondere von Gänsen, und supplementiert das Kulturmedium mit Serum der zu immunisierenden iierspezies.

Das so hergestellte Hyperimmunserum enthält artverwandte oder artfremde fertige Antikörper gegen Gänsehepatitisviren und enthält kein lebendes Virus.

9. Die Verwendung des Hyperimmunserums gemäß (7) oder hergestellt gemäß (8) zur passiven Immunisierung von Wassergeflügel (insbesondere Gänsen) oder deren Embryonen. Im ersten Fall wird das Hyperimmunserum 1 bis 2 Tage alten Gänseküken parenteral inokuliert; im zwäten Fall wird das Serum befruchteten Gänseeiern inokuliert, vorzugsweise am 8. Bebrütungstage. Die Inokulation kann ohne Konservierungszusätze vorgenommen werden, vorzugsweise in den Dottersack. Hierdurch wird der sich entwickelnde Embryo bereits im Ei geschützt, da in den meisten Fällen bereits die Bruteier infiziert sind.

Die einzelnen Gegenstände der Erfindung sind nachstehend näher erläutert.

Gewinnung des virulenten Gänsehepatitisvirus (GHV) Das Virus kann durch Sektion eines an Hepatitis erkrankten Gänschens durch Herausschneiden von"Organen,

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wie Leber und Pankreas, gewonnen werden. Die Diagnose kann auf der Basis der Geschichte der Herde, der pathologisch-anatomischen Erscheinungsform, der histolpgischen Veränderungen sowie dem VirusnaGhweis durch Immunofluoreszens erbracht werden. Außerdem gelingt eine Yirusisolierung zweckmäßigerweise über Eikulturen von Gänsen. Dazu werden Proben von Leber, Milz und Pankreas mit steriler Pufferlösung • zu einem Hpmogenisat verrührt und mit Antibiotika

versetzt (8omg Streptomycin, 1o. ooo IE Penicillin/ml). . Nach 3o minütigen Stehenlassen bei Zimmertemperatur " wird das Hpmogenisat bei 3000g abzentrifugiert und vor. der überstehenden Flüssigkeit 1 cur auf die Choripallantoismembran 15-tägig vorbebrüteter Gänseembryonen inoculiert. Eier, die nach 24 - 48 Stunden absterben, ■ werden verworfen, da sie meist bakteriell kontaminiert sind. Spezifischer Embryotod wird vom 5. - 15- Bebrütungstage nach der Inokulation zu erwarten sein. Als Virusträger werden die Amnipn-Allantpisflüssigkeit und die CAM und Embryo gesammelt. Bei Embryonen, die in einem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium absterben, wird eine neue Passage über Gänseembryonen empfohlen. Ein so isolierter Virusstamm ist unter y der Nr. ATTC .... bei der American Type Culture

Collection, Maryland, USA und bei der Staatlichen Bakteriologischen Untersuchungsanstalt München deponiert und kann dort angefordert werden.

Die Bestimmung von Feldisolaten kann durch serologische Reaktionen mittels Beferenzseren gesichert werden.

Herstellung des Impfstoffes mit virulentem GHV Der vorstehend definierte GHV-Stamm bezeichnet als

319 wird durch Inokulation von 0,2ml auf die

Chorioallantoismembran (CAM) 15tägig Gebrüteter Gänseeier vermehrt. Die so infizierten Eikulturen sterben innerhalb von 4-8 Tagen infolge Virusvermehrung ab. Von den abgestorbenen Embryonen werden die Eiflüssigkeiten (Amnion-Allantoisflüssigkeit) sowie die Eihäute (CAM) und Embryonen steril gesammelt, das Material mittels Homogenisator unter sterilen Bedingungen zerkleinert und bei -20⁰C eingefroren. Die Einfrierung hat den Zweck, die noch intakten Zellen zu sprengen, um somit eine maximale Virusausbeute zu sichern. Denselben Zweck erreicht man durch Behandlung mit Ultraschall oder Behandlung der Zellsuspension mit einer Natriumdesoxycholat-Lösung (0,25%ig, 4- Stunden bei 37⁰C). Nach dem Auftauen oder der oben angegebenen anderen Behandlung wird das grobe Zellmaterial durch Zentrifugieren (1000 ü/min) 2o Min. sedimentiert und die überstehende Flüssigkeit als Impfvirus verwendet. Vor dem Abfüllen in kleinere Anteile ist eine Sterilitätskontrolle zum Ausschluß von Begleitbakterien erforderlich. Kontaminierte Viruspräparate sind zu verwerfen. Der Virusgehalt dieser als bakterienfrei erkannten Lösung wird durch Titrierung in Gewebeoder Eikulturen bestimmt. Er beläuft sich gewöhnlich auf 1o- bis 1o embryoletale Dosen (ELD,-) pro ml. Dieses. Virus kann anschließend nach Zusatz von Antibiotika als Impfvirus verwendet werden.

Das Virus wird bis zur Verwendung im Zustand der Kältestarre deponiert (bei -20 bis -70⁰C eingefroren oder gefriergetrocknet) und 12 Stunden vor Gebrauch mit einem Depotzusatz (Aluminiumhydroxyd hergestellt nach arzneimittelrechtlichen Bestimmungen) in einem Verhältnis von 1 : 10, d.h. 1 Teil Virussuspension auf 9 Teile Aluminiumhydroxydlösung, innig vermischt

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und nach einer Adsorptionszeit von 12 Stunden bei 4⁰C verwendet.

Dieser Impfstoff ist sowohl für eine parenterale als auch orale 'Applikation geeignet, da es sich hierbei um ein lebendes Virus handelt, das in einem homologen Wirt verabreicht, diesen zur Eigenvermehrung des Virus anregen kann und der durch diesen Prozeß der Infektion zur Antikörperbildung veranlaßt wird.

Als weiteres Verfahren zur Herstellung von Impfvirus kann die Gewebekultur verwendet werden. Dazu werden Vaasergeflügel-Fibroblastenkulturen, gewachsen in technischen, käuflichen Nährmedien, wie z.B. Medium 199? E»it Proteinzusätzen (Tryptose-Phosphat-Brühe und Serum) mit an die Gewebekultur adaptierten GHV.infiziert und nach einer weiteren Bebrütung von 4 bis Tagen geerntet. Bas Virus verursacht infolge seiner Vermehrung eine Zerstörung des Zellrasens. Bei der Virusernte wird sowohl die überstehende, flüssigkeit als auch der Zellrasen von den Kulturträger entfernt, das flüssigkeit-Zellgemisch, wie oben beschrieben, auf physikalischem oder chemischem Wege aufgeschlos-

W sen, das Zellmaterial abzentrifugiert und wie das

Eikulturvirus weiterbehandelt.

Aktive Immunisierung mit virulentem GHY-Impfstoff Von dem beschriebenen Impfstoff werden 3 ecm subcutan zweimal im Abstand von 3 bis 6 Wochen (parenteral) verabreicht. Die letzte Impfung soll mindestens 6 Wochen vor Legebeginn abgeschlossen sein.

Da Untersuchungen ergeben haben, daß Gänse erst ab einem Alter von 4 Wochen eine genügend ausgeprägte Altersresistenz besitzen, sollten nur Gänse ab diesem

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Alter, vorzugsweise Gänse, die älter als 8 Wochen sind, immunisiert werden. Um Mißerfolgen vorzubeugen, wird zweckmäßig die ganze Herde, und zwar männliche und weibliche Tiere, an einem Tage immunisiert. Drei Wochen vor Legebeginn*sollte der Antikörperstatus der Herde durch Entnahme einiger Serumproben geprüft werden, um bei mangelnden Antikörpertiter die Herde noch einmal immunisieren zu können. Die Immunisierung kann auch mit Kulturvirus allein, d.h. ohne Zusatz eines Depotstoffes, durchgeführt werden.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die so immunisierten Zuchtgänse ihre Elternimmunität auf ihre Nachkommen übertragen, wodurch eine mütterliche Immunität der Gänseküken während der Zeit der höchsten Empfänglichkeit, nämlich in den ersten 3 Lebenswochen, gegeben ist.

Herstellung eines Impfstoffes mit attenuiertem GHV Untersuchungen haben ergeben, daß auch heterologe Wirtstiere, also Tiere, in denen das Virus natürlicherweise nicht vorkommt, zu einer Antikörperbil- · dung gegen daa Virus befähigt sind. Da Laboruntersuchungen ergeben haten, daß sich das Virus nicht in entsprechend isolierten und kultivierten Zellen dieser Wirte vermehrt, muß angenommen werden, daß hierbei das Virus als Protein den Körper zur Antikörperbildung veranlaßt. Es ist verständlich, daß zu diesem Prozeß eine entsprechend höhere Viruskonzentration verwendet werden muß.

Bei dieDem Verfahren wird GHV, wie oben beschrieben, gezüchtet. Dies kann sowohl in Eikulturen als auch

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in Gewebekulturen geschehen. Das Virus wird nach der Klarzentrifugation durch Ultrazentrifugation (100 000g, 6o Min.) oder durch Zusatz von

(50 mM Endkonzentration) und AlCl, (25 mM Endkonzentration) präzipitiert. Außerdem können andere physikalische und chemische Konzentrationsprozesse, die aus der Literatur bekannt sind, angewendet werden. Die hierbei erhaltene zehnfache Konzentration der Viruspartikel wird durch Zusatz von ß-Propiolacton (Betaprone, Fellow's Testagar Co.,Detroit, Michigan, oder Schuchard-Feinchemikalien, München) inaktiviert.

" Hierbei wird eine 5»0%ige Lösung von ß-Propiolacton

(BPL) in destilliertem Wasser unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt. Dann wird ein Teil des verdünnten BPL zu neun Teilen Viruskonzentrat gegeben. Die Verdünnungen von BPL werden bei 0-4°C hergestellt. Nach der Zugabe des BPL zu der konzentrierten Virussuspension wird das Gemisch in verschlossenen Gefäßen bei 4°C 10 Min. geschüttelt und anschließend 4 Stunden in einem Wasserbad bei 37°C unter Eühren mittels Magnetrührer belassen. Das Präparat wird dann über Nacht bei 4-⁰C aufbewahrt, wobei das BPL vollständig hydrolysiert. Die so be-

} handelte Virussuspension wird durch Aufbringen von

0,1 ml unverdünnter Suspension und 0,1 ml einer 1:100-Verdünnung auf die Chorioallantoismembran von 14 Tage embryonierten Gänseeiern auf Restinfektiosität getestet. Von dem so inaktivierten Virus werden 5 ecm mindestens dreimal im Abstand von drei Wochen subcutan oder intramuskulär verabreicht.

Antikörpertestungen müssen nach der 2. und jeder folgenden Immunisierung ekrehgeführt werden.

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Herstellung von Hyperimmunseriim

a) Homologe Wirte (Gänse)

Zu diesem Zwecke werden Gänse, die zum Zwecke der Immunserumherstellung eingestallt werden, dreimal im Abstand von drei Wochen intramuskulär mit 5 ml des wie vorstehend beschriebenen hergestellten attenuierten Lebendvirus immunisiert. Nach dem Antikörpertest durch serologische Reaktionen werden die Tiere entweder 2o Tage nach der letzten Impfung durch Schlachtung entblutet oder aber durch Venenpunktion (zweckmäßigerweise Flügelvene oder Fußvene) geblutet. Im letzteren Falle bleiben die Tiere am Leben und können nach der physiologischen Erneuerung des Blutverlustes wiederholt geblutet werden. Die maximal von einer ausgewachsenen Gans zu entnehmende, tolerierbare Blutmenge beträgt 100 bis 150 ml (je nach Körpergewicht). Nach jeder Blutentnahme soll eine erneute Infektion (i.m.) mit lebendem Virus durchgeführt werden« Von dem gewonnenen Blut kann das Blutplasma (wobei das Blut durch Zusatz von 3% Natriumzitrat (1 ml 3%iges Natriumzitrat pro 12 ml Blut) ungerinnbar gemacht wurde) durch Abzentrifugieren der Blutkörperchen gewonnen werden.

Ohne Koagulationshemmungsmittel kommt es zu einer Erstarrung des Blutes, wobei sich das Serum vom Blutkuchen trennt. Dieser physiologische Prozeß kann durch Zentrifugation von erstarrtem Blut (bei 3000 U/min, 4-5 Min.) beschleunigt werden. Das abzentrifugierte bernsteingelbe oder etwas rötlich gefärbte Serum wird gesammelt, mit Konservierungsstoffen versetzt und anschließend steril filtriert (Konservierungsstoff: o,5% Phenol oder Merthiolat 1:1o 000). Das fertige Serum wird bis zur Verwendung in gefrore-

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nem Zustand bei -20°C aufbewahrt. Serum ohne Konservierungsstoff kann mit Antibiotica (10 000 IE Penicillin und 4o mg Streptomycin pro ml) versetzt werden.

b) Heterolöge Wirte

1. Anderes Geflügel und Säugetiere

Die Reaktion heterologer Wirte nach einer Infektion mit GHV basiert nicht auf einer Antikörperbildung infolge Virusvermehrung in dem entsprechenden Wirt, sondern auf einer Abwehrreaktion des Wirtes gegen-

" über artfremden Eiweißkörpern. Hierbei reagieren also

die Viruspartikel für sich selbst als wirtsfremde Proteine, wogegen der zu immunisierende Wirt Antikörper bildet. Die so erzeugten Antikörper sind geeignet, das GHV-Virus in einem Restsystem zu neutralisieren und sind außerdem befähigt, parenteral in empfängliche Gänse verabreicht, diese vor dem Ausbruch der Krankheit zu schützen. Die Antikörper sind, ähnlich wie diese von homologen Wirten, direkt gegen das spezifische Virus gerichtet. Sie erzeugen keine Dauerimmunität, sondern werden durch den physiologischen Abbauprozeß innerhalb von 3 bis 4 Wochen

| aus dem Blutstrom eliminiert.

Zur Herstellung dieser Seren wird frisches Kulturvirus (Eikultur oder Gewebekultur), wie oben beschrieben, gez^üchtet und geerntet. Nach dem Einfrieren wird die klar zentrifugierte Flüsssigkeit mit ERIGEN 113 (Freon 113 = niederer Fluorkohlenwasserstoff) in einem Verhältnis von 1:1 mittels hochtouriger Homogenisator innig vermischt und nach einer Unterbrechung von 30 bis 40 Min. bei 3000 U/Min, in einer KühlZentrifuge bei 4⁰C zentrifugiert (Dauer der Zentrifugation 20 Min.). Bei diesem Prozeß geliert das

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Frigen-Proteingemißch und wird auf den Boden des Zentrifugenglases geschleudert, während die Viruspartikel in der überstehenden wässrigen Phase verbleiben. Aus dieser Flüssigkeit wird das Virus wiederum mittels 50 mM NapCO, und 25 mM AlCl₃. präzipitiert. Von diesem Viruskonzentrat werden dann die zu verwendenden Wirte mindestens dreimal in einem Abstand von drei Wochen immunisiert. Die Menge des verwendeten Viruskonzentrates richtet sich nach der Größe des verwendeten Wirtes (2 ml für Geflügel, 2o ml für ein erwachsenes Großtier). Vor jeder Wiederholungsimpfung wird der Antikörpertiter durch serologische Laboratoriumsmethoden bestimmt und die Tiere werden bei Erreichen von genügend hohen Titerwerten entblutet. Sollen die so immunisierten Tiere am Leben bleiben, richtet sich die zu entnehmende Blutmenge nach dem maximal zu tolerierenden Blutverlust. Nach jeder Blutentnahme wird eine Reimmunisierung empfohlen. Die Sammlung und Aufbereitung des Blutserums oder -plasmas richtet sich nach dem für homologe Wirte beschriebenen Methoden. Von jedem gesammelten Serumpool wird der antikörperwirksame Titer festgestellt und notiert. Außerdem wird jeder Serumpool durch Nummern gekennzeichnet und die Art und das Datum der Gewinnung genau festgehalten. Falls vom Gesetzgeber verlangt, können Stichproben im Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main, getestet werden.

Der umfängreiche Reinigungsprozeß kann sich erübrigen, falls Gewebekulturvirus zur Immunisierung verwendet wird, das in Serum der zu immunisierenden Tierspezies gewachsen ist. In diesem Falle kommt es bei einer parenteralen Applikation des Kulturvirus in den zu immunisierenden Wirt nicht zu ge-

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fährlichen Sehockreaktionen. Außerdem wird durch diese Methode ein Virusverlust, der bei Jedem Reinigung sprozeß entsteht, vermieden. Jedoch kann auch mit diesem Kulturvirus ein Konzentrierungsprozeß, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.

2. Pferde . -.:

8 bis 1o Zentner schwere Pferde werden, wie oben beschrieben, immunisiert. Nach Beendigung des Immunisierungsprozesses werden die Tiere geblutet. Das Blut wird mittels Antikoagulantien (2,8%iges Natriumzitrat) W ungerinnbar gemacht. Von einem 9 Zentner schweren Pferd werden 8 Liter Blut durch Punktion der Vena Jugular!s entnommen und bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Morgen wird das abgeschiedene Blutplasma von dem Bodensatz der roten und weißen Blutkörperchen getrennt und die Blutkörperchen nach Resuspension in 37°<3 warmer physiologischer Kochsalzlösung durch sterile Gazefilter in dem Spenderwirt reinfundiert. Auf„diese Weise„können jede Woche 8 Liter Blut entnommen werden, wobei die maximale Plasmamenge 4· Liter beträgt. Ähnliche Verfahren können mit Ziegen oder Schafen angewendet werden.

► ■ .■'■.■ '■ ^: · ■'■■ ' :'■ ■ ' In den meisten Fällen erübrigt sich eine spezielle Trennung der Immun-Gammaglobuline durch chemische fällung. Diese kann jedoch, falls gewünscht, in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. (Präzipi- ■ tatiofi mit Ammoniumsulfat - 4o-5o%ige Sättigung mit anschließender Dialyse gegen geeignete Pufferlösungen). Eine Supplementierung des Imunserums mit Vitaminen und speziellen Antibiotieaconzentrationen kann als therapeutische Dosis, berechnet auf ein Gänseküken pro ml durchgeführt werden.

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Anwendung des Immuneerums bei Gänseküken Homologes und heterologes Immunserum können in gleicher Weise angewendet werden· Im allgemeinen sollte 1 ml Hyperimmunserum pro Gänseküken verwendet werden. Es hat sich gezeigt, daß eine möglichst frühzeitige Immunisierung der Gänseküken angezeigt ist, da eine Infektion bereits in Ονο oder aber während des Schlupfvorganges stattfinden kann.

Die Gänseküken werden also zweckmäßierweise bei der Entnahme aus dem Schlupfbrüter mit 1 cm Serum subkutan auf der dorsalen Seite vom übergang des Halses zum Brustkorb geimpft» An dieser Stelle ist genügend lokeres Unterhautbindegewebe vorhanden, in das man gut 1 cnr Serum deponieren kann. Bei einer Impfung in die Schenkelmuskulatur kann es leicht zu Verletzungen von Sehnenscheiden und Gelenken kommen, wobei es zu nachfolgenden Lahmheiten kommen kann.

Anwendung des Immunserums bei Gänseembryonen Da eine in Ovo-Infektion des Embryos ziemlich sicher gelten kann, wurde eine Methode ausgearbeitet, die bereits den sich entwickelnden Embryo schützen kann. Zu diesem Zwecke werden die bebrüteten Gänseeier am 8. Tage nach der Einlage durchleuchtet und die nichtbefruchteten Eier, sowie die abgestorbenen Embryonen entfernt. Die Eier werden auf der Spitze stehend fixiert, und unter Lichtkontrolle wird ein kleines Loch kurz oberhalb der Eiflüssigkeit in die Luftkammer gebohrt. Die öffnung soll möglichst an der dem Embryo abgewandten Seite angebracht werden. Nach Desinfektion der so markierten Inokulationsstelle mittels Jodtinkturlösung wird mit einer möglichst dünnen Kanüle (Nr. 18 od. 14) 1 cm* Serum

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tief in das Eiinnere inokuliert. Bei den ersten Versuchen kann durch leichte Aspiration der Spritze der genaue Sitz im Sottersack geprüft werden. Sie öffnung in der Schale wird anschließend durch Kerzenwachs verschlossen und ,die Eier werden weiter bebrütet. ·-....

Sie so erzeugte Immunität der Gänseküken erwies sich als äußerst wirksam gegen den Ausbruch der Gänsehepatitis. Sas zu diesem Zweck verwendete Immunserum sollte außer Antibiotika keine Konservierungsstoffe enthaltene-Sie 'geschlüpften Gänseküken brauchen in diesem Falle nicht noch einmal immunisiert zu werden.

Sie nachstehend angegebenen Untersuchungen dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung:

1. 13o Gänseküken-eines gemeinsamen Schlupfes wurden in einem besonderen Isolierstall gehalten und Jeweils zu den in folgender Tabelle ersichtlichen Zeiten infiziert (GHV-Stamm SBM 319 5. Gänseeipassage, Titer 5,5* 10^»^ELS₅₀). 15 Gänse wurden mit 1 ml Virus intramuskulär infiziert, während 6 Gänse als Kontaktkontrollen dazugesetzt wurden. Sie nichtinfizierten Tiere blieben in strikter Isolierung.

Alter der Gänseküken zum Zeitpunkt der Infektion (Tage)	Zahl der klinisch sieht1. erkrankten Tiere Kontakt infiziert kontroll.	6	Zahl der fälle infiziert	Todes- Kont. kontr.
2	15	6	15	6
8	15	6	15	6
15	15	2	10	4
22	1o	0	5	1
■ . 29	3	0	2	0
35	0	0	0

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Anm.: Sie Todesfälle beziehen sich auf die gesamte

Versuchsdauer (3 Monate). Bei allen verendeten Tieren konnte die Diagnose Gänsehepatitis gesichert werden.

2± Λ$ sechs Wochen alte Gänse wurden mit 3 ecm desselben Virus direkt in die Blutbahn (intravenös) inokuliert. Alle Tiere entwickelten deutlich klinische Erscheinungen der Gänsehepatitis, wie sie in der Einleitung unter 2 und 3 beschrieben wurden. Drei dieser Tiere verendeten mit typischen Zeichen (Veränderungen) der Gänsehepatitis, während die anderen erkrankten Tiere unter Wachstumsdepression erkrankten und wieder genasen. Die Wachstumsdepression war signifikant hoch gegenüber von Kontrolltieren.

3. Immuhisierungsversuche:

5 Gänse, davon 2 legende Altgänse und 3 männliche Gänse (8 Wochen alt), wurden mit 4 ml Virus intramuskulär infiziert. Die Inokulation wurde am 12. und am 21. Tage wiederholt. Das Serum der Tiere wurde am 28. Tage nach der ersten Infektion gesammelt. Von 2 männlichen Tieren wurde das Serum mit Fluoreszin-Isothiozyanat konjugiert und im Immunofluor eszenstest verwend*. Das Serum zeigte spezifische Fluoreszenz in Gegenwart von Gänsehepatitisvirus.

Die Eier der weiblichen Tiere wurden weiterhin gesammelt und gebrütet. Die geschlüpften Gänseküken wurden am 2. Lebenstage mit GHV nasal infiziert. Bis zu einer Beobachtungszeit von 3 Wochen konnten keine Krankheitserscheinungen beobachtet werden. Da die ersten Eier dieser Gänse (vor der Immunisierung) für Viruskulturen verwendet wurden und 4 Gänseküken· die-

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ser Altgänse bei einer früheren Inokulation empfänglich waren, ist die Resistenz der späteren Gänseküken auf eine mütterliche Immunität, die auf das Ei übertragen wurde, zurückzuführen. Diese Untersuchung wurde auch durch Feldbeobachtungen bestätigt»

4-, Hyperimmunserum der oben beschriebenen männlichen Gänse wurde steril filtriert und für eine Inokulation in das embryonierte Gänseei mit 5000 IE Penicillin und 4o mg Streptomycin pro ecm versetzt. Von diesem Serum wurden 5aabryonierte bebrütete Gänseeier (8 Tage

™ nach Einlage in die Brutmaschine) mit 0,5 ml Serum und 5 mit 1 ml Serum in,den Dottersack des Embryos inokuliert. 5 Eier wurden nicht infiziert und blieben als Kontrolle. Die Gänseküken schlüpften in getrennten Kästen und wurden sofort markiert und bis zum Lebenstage in strikter Isolierung gehalten. Danach wurden alle Tiere am 18. Tage mit 4 ecm GHV in die Blutbahn infiziert (intravenös) (Virusdosis: 2.0 χ 10' *-* ELDc-q). Dabei handelt es sich um eine sehr hohe Dosis und damit um einen maximalen Belastungsversuch. 8 Tage nach der Infektion waren bereits 3 der nichtinokulierten Kontrolltiere (nicht inokulier-

fc te Eier) an typischen Zeichen der Gänsehepatitis gestorben. Die beiden anderen zeigten deutliche Krankheit serscheinungen. Die mit 0,5 ecm inokulierten Tiere zeigten zu.einem Teil klinische Erscheinungen, wie in der Einleitung unter 2 und 3 beschrieben. Nur ein Tier verendete aus dieser Gruppe, während sich die mit 1 ecm Hyperimmunserum im Ei inokulierten Junggänse ohne Krankheitserscheinungen in einem absolut normalen Wachstumsprozeß weiterentwickelten.

Der Versuch zeigte, daß bei dieser Art der Immuni-

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sierung des sich entwickelnden Embryos wahrscheinlich neben einer humoralen Immunität auch eine zellulare Immunität besteht, da normalerweise ein Großteil der mütterlichen Antikörper zu diesem Zeitpunkt aus dem Blute eliminiert sein müßte.

5. 3 vier Wochen alte Tauben (keine natürlichen Wirte des Virus) wurden mit Frigen 113 gereinigtem Eikulturvirus viermal im Abstand von 7 Tagen immunisiert. Das Serum wurde anschließend in der Komplementbindungsreaktion gegen Gänsehepatitisvirus getestet und erwies sich als positiv (Titer 1:64). Der Versuch zeigt, daß auch artfremde Tiere gegen das Virus Antikörper bilden können.

6u_ 1 ο Tauben wurden mit ß-Propiolakton inaktiviertem Virus (nach dem vorstehend angegebenen Verfahren) subcutan und intramuskulär infiziert. Die Inokulation wurde dreimal wiederholt. 5 Wochen nach der ersten Immunisierung wiesen die Seren durchschnittlich einen Titer von 1:40 auf (Komplementbindung). Dieser Versuch beweist, daß artfremde Wirte auch gegen inaktiviertes Virus Antikörper bilden können.

Fat ent ansprüche:

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Claims

— CD —

Patente ns ρ r ü c h e·

1« Impfstoff zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß er virulente Gänsehepatitisviren enthält, die bei Junggänsen die unter 1 - 4 beschriebenen Krankheitssymptome hervorrufen,

Alternative

1. Impfstoff zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß er virulente Gänsehepatitisviren des unter der Nr, ATTC .... bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA und bei der Staatliehen Bakteriologischen Untersuchungsanstalt München, deponierten Stammes enthält, die bei Junggänsen die unter 1-4 beschriebenen Krankzeitssymptome hervorrufen.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das... Virus in Form einer Zellsuspension in

ρ Eiflüssigkeit und Embryozellgewebe von infizier

ten Vogeleikuituren vorliegt.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus in Form einer Zellsuspen-sion eines als Gewebekultur in einem Nährmedium

Virus vorliegt.

Impfstoff nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein über Ei- oder Gewebe^ klilfcuren von Wassergeflügel yegm«hrtes Virus

stellt.

5. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes nach Anspruch 1 bis A, dadurch gekennzeichnet, daß man virulente Gänsehepatitisviren über Eikulturen oder Gewebekulturen von Vassergeflügel vermehrt und vorzugsweise in eine für die parenterale Verabreichung geeignete Form bringt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung in einem pharmakologisch zulässigen Kulturmedium vornimmt.

7- Verfahren zur aktiven Immunisierung von Vassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß man älteren Zuchttieren, insbesondere Gänsen, die älter als vier Vochen sind, den Impfstoff nach Anspruch 1 bis 4- verabreicht.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man den Impfstoff in form einer flüssigen Suspension, vorzugsweise parenteral, verabreicht.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verabreichung des Impfstoffes mehrmals vornimmt.

1O.Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite Verabreichung 3 bis 6 Vochen nach der ersten Verabreichung durchführt.

11.Impfstoff zur aktiven Immunisierung von Vassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß er attenuierte Gänsehepatitisviren gemäß Anspruch 1 bis 4 enthält.

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12. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Virulente Gänsehepatitisviren gemäß Anspruch 1 bis 4 durch Behandlung mit Chemiker lien bis zur Beseitigung der Pathogenität unter Erhaltung der Antigenizität attenuiert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das attenuierte Virus von begleitendem Zellmaterial abtrennt und auf chemischem oder physikalischem Wege konzentriert.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Attenuierung des Virus mit ß-Propiolacton durchführt.

15. Verfahren zur aktiven Immunisierung von Wassergeflügel gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß man Zuchttieren oder Küken den Impfstoff nach Anspruch 11 verabreicht.

16. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeich» net, daß man den Impfstoff unter Zufügung eines Adjuvans parenteral verabreicht.

17. Hyperimmunserum zur passiven Immunisierung von. Wassergeflügel oder deren Embryonen gegen Gänsehepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Tierpassagen von Gansehepatitisvirus gemäß Anspruch 1 bis 4 und 19 bis 23 erzeugte Antikörper enthält.

18. Hyperimmunserum nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß es mit Serum der zu immunisierenden Tierspezies supplementiert ist.

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19· Verfahren zur Herstellung eines Hyperimmunserums nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man virulentes Gänsehepatitisvirus gemäß Anspruch 1 bis 4 wiederholt Wirtstieren inokuliert.

20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man das Virus Säugetieren oder Vassergeflügel, vorzugsweise Gänsen, inokuliert.

21. Verfahren nach Anspruch 19 uder 2o, dadurch gekennzeichnet, daß man das Virus den Wirtstieren parenteral inokuliert.

22. Verfahren nach Anspruch 19 his 21, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Inokulation in artfremde Wirtstiere eine durch Behandlung mit einem niederen Fluorkohlenwasserstoff (Frigen 113) gereinigte Virussuspension verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man Virus aus Zellkulturen von Wassergeflügel, vorzugsweise von Gänsen, verwendet und das Kulturmedium mit Serum der zu immunisierenden Tierspezies supplementiert.

24. Verwendung des Hyperimmunserums nach Anspruch 17 oder 18 bzw. des nach Anspruch 19 bis 23 hergestellten Hyperimmunserums zur passiven Immunisierung von Vassergeflügel oder deren Embryonen.

25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 1 cnr des Hyperimmunserums bis 2 Tage alten Gänseküken-parenteral inokuliert.

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- 3ο - .

26. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hyperimnunserum befruchteten Gänseeiern inokuliert, vorzugsweise am

8. Bebrütungstage.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hyperimmunserum in den Dottersack inokuliert.

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