DE2817299A1 - Verfahren zur herstellung eines attenuierten infektioese-gastroenteritis (tge)-virusstammes zur anwendung in lebendvakzinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines attenuierten infektioese-gastroenteritis (tge)-virusstammes zur anwendung in lebendvakzinen

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DE2817299A1 DE19782817299 DE2817299A DE2817299A1 DE 2817299 A1 DE2817299 A1 DE 2817299A1 DE 19782817299 DE19782817299 DE 19782817299 DE 2817299 A DE2817299 A DE 2817299A DE 2817299 A1 DE2817299 A1 DE 2817299A1
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Description

PHN.8781 Va/AvdV
"Verfahren zur Herstellung eines attenuierten Infektiöse-Gastroenteritis(TGE)-Virusstammes zur Anwendung in Lebendvakzinen".
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines attenuierten lebenden Virusstainmes, der dazu benutzt werden kann, Schweine, insbesondere Ferkel, vor infektiöser Gastroenteritis (TGE) zu s chü t ζ en.
TGE ist eine sehr ansteckende Schweinekrankheit, die nahezu überall in der Welt vorkommt und grosse Verluste bei der Schweineaufzucht herbeiführt.
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PIIN. S781
10 Jt-. 78
Bei Ferkeln, die in den ersten Wochen nach der Gelmrt infiziert verden, verläuft die Krankheit praktisch immer tödlich. Da zu diesem Zeitpunkt eine aktive Immunisierung noch nicht möglich ist, wird schon geraume Zeit versucht, ein Verfahren zu entwickeln, durch das die Ferkel über das Mutterschwein passiv
immunisiert werden können.
Obgleich einige Vorschläge bekannt sind,
Ferkel über das Kolostrum des Mutterschweins passiv zu immunisieren (belgische Patentschrift 669 881
und niederländische Patentanmeldung 6ß 09 013)> ist aus kürzlich erschienener Literatur bekannt, dass eine passive Immunität bei Ferkeln zwar durch orale Infektion des Mutterschweins mit Feldstämmen des TGE-Virus (d.h.
mit virulentem Virus) erzeugt werden kann, aber Versuche, dies mit Virusstammen zu bewirken, die durch Zellkulturpassagen attenuiex-t sind, sind ohne Erfolg
• geblieben oder gewährten nur einen beschränkten Schutz " ("Infection and Immunity" I976, S. 1642 - 1646).
Dies ist darauf zurückzuführen, dass bei derartigen Serienpassagen nicht nur die Virulenz, sondern auch die Immunogenität erheblich abnimmt.
Da es grosse Risiken mit sich bringt, Mutterschweinen virulentes Virus zu verabreichen, ist dieses Verfahren zum Schützen von Ferkeln vor TGE ungeeignet und unakzeptabel.
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-v>- PIIN. 8781
IO.4.78
Nach der Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, dass es möglich ist, ein attcnuiertes nicht virulentes immunogen wirksames TGE-Virus dadurch zu erhalten, dass virulentes TGE-Virus einer Vielzahl aufeinanderfolgender Serienpassagen über Schildrüsenzellkulturen unterworfen wird.
Insbesondere wurde gefunden, dass ein attenuierter nichtpathogener immunogen wirksamer TGE-Virusstamm dadurch erhalten wird, dass virulentes Virus 25O bis 350t vorzugsweise etwa 300, Serienpassagen über Zellkulturen von Schweineschilddrüsengewebe unterworfen wird.
Es ist bekannt, dass die Immunität von Ferkeln gegen TGE, die über das Kolostrum eines mit virulentem Virus infizierten Mutterschweins erzielt wird, von der Immvinoglobulin-A(lgA)-Antikörperbildung in den Milchdrüsen abhängig ist (inier. J. Vet. Res. ^L· Ü975)»
s. 267-271).
Weiter wurde nachgewiesen, dass nur dann eine genügende Menge von IgA-Antikörpern beim Mutterschwein gebildet wird, wenn sich das Virus über die ganze oder nahezu die ganze Länge des Dünndarmes vervielfacht hat (E.H. Bohl und Mitarbeiter, Infec. Immun. JJ_ (1975), 23-31 und E.H. Bohl und Mitarbeiter, Infect. Immun. Jj (1972),
s. 289-301).
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PHN. 8781 10.4.78
Da die Menge an IgA-Antikörpern nur langsam
abnimmt (F.J. Bourne und Mitarbeiter, Immunol. 2k_ (197j)> S. 157-162), kann an Hand der Menge an IgA-Antikörpern, die über Kolostrum und Milch ausgeschieden wird, festgelegt werden, ob in einem bestimmten Falle eine gute passive Immunisierung möglich ist.
Wenn das durch das Verfahren nach der Erfindung attenuierte Virus Mutterschweinen oral verabreicht wird, vervielfacht es sich noch im gesamten Darmkanal dieses Tieres, so dass die Ferkel dieser Mutterschwelrie über die IgA-Antikörper des Kolostrums völlig vor den Folgen einer Infektion mit virulentem TGE-Virus geschützt werden. Es ist besonders überraschend, dass ein Virusstamm nach einer derart grossen Anzahl von Passagen noch immunogen wirksam ist.
In der nachstehenden Tabelle A sind die durch den Serumneutralisationstest bestimmten IgA-Antikörpertite: • von Proben des Kolostrums aufgeführt. Diese Proben wurden zentrifugiert, mit einer physiologischen NaCl-Lösung (1 : 10) verdünnt und 30 Minuten lang bei ^O C erhitzt.
Dann wurde der pH-Wert mit Hilfe eines Gemisches gleicher Volumina von 1N HCl und 2M Essigsäure auf k,6 bis k,65 gebracht, wobei 20 Minuten lang gerührt wurde. Nach Zentrifugieren (12000 g und k C) wurde während
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■■&■-- PIlN. 8781
10.^.7S.
einer Nacht gegen 0,1 M Tris--(hydrox3Tnethyl)~amino-imetliän-0j2 M NaCl dialysiert, das mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht worden war. Die Proben wurden dann in 5 Ί0 Carbowax (Molgewicht 20000) auf
> die Hälfte konzentriert und auf eine Säule (2,5 χ 100 cm) mit Sephadex-G—200 gebracht. Die Eluierung wurde mit Tris-NaCl-Puffer, pH 8,0, durchgeführt.
TABELLE A IgA-Antikörpertiter
ο Anzahl Passagen Kolostrumtiter
2 1 : 50
120 ' 1 : 30
300 . 1 : 25
350 ■ 1 : 2,5
' Es hat sich daher herausgestellt, dass,
nachdem Mutterschweinen die 3OO. Passage des nach * der Erfindung attenuierten TGE-Virus verabreicht worden war, ein verhältnismässig hoher Gehalt an IgA-Antikörpern im Kolostrum gefunden wird.
Die Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
Das virulente Virus, von dem ausgegangen WUI'de, wurde aus einem infizierten Schwein im "Institut fill? Mikrobiologie und Infektionskrankheiten der Tiere" in München isoliert. Dieser sehr'virulente
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Virusstamm, der nachstellend als B1-Stamm bezeichnet wird, wurde direkt auf Scliilddrüsengewebe von Schweinen isoliert.
Zellkulturcn von SchweincschiJ.ddrüseiigevebe wurden durch Anwendung von vom Schlachthof in München stammenden Schilddrüsen hergestellt. Die Schilddrüsen wurden nach Entfernung der Kapsel und Sterilisation der Oberfläche (2 χ mit 95 c/° Alkohol) in Stücke von 1 bis 2 mm geschnitten und dx^eimal in PBS (Phosphate Buffered Saline) gewaschen. Den so erhaltenen Gewebestückchen wurde eine 0,37 /° Trypsin-PBS-Lösung (ohne Ca und Mg ) zugesetzt und anschliessend wurde bei 37 C eine fraktionierteTrypsinbehandlung durchgeführt. Die ersten zwei Trypsinfraktionen wurden verworfen ,(nach einer Behandlungsdauer von einer Stunde) und
die Fraktionen 3 und k (Behandlungsdauer 1,5 Stunden) wurden filtiex-t und bei 4 C stehengelassen. Die Trypsin-• Wirksamkeit wurde durch Zusatz von Serum gehemmt. Nach Beendigung dieser Behandlung wurde die ZeIltrypsinsuspension 10 Minuten lang zentrifugiert (5OO g). Die obenstehende Flüssigkeit wurde verworfen und das Sediment wurde in PBS suspendiert und aufs neue zentrifiigiert. Dann.wurde das Zellsediment in 10 ml Kulturmedium aufgenommen. Als Kulturmedium wurde Earle's Salzlösung verwendet. Es können aber auch andere
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geeignete Kulturmedien Anwendung- finden. Das Züchtungsmedxum enthielt 10 °/o Kälberserum und das Aufrechterlialtungsmedium enthielt 5 c!° dieses Serums. Weiter enthielt das Medium 50 ml Lactalbumlnhydrolysat pro Liter Medium und gegebenenfalls ein oder mehrere Antibiotika. Das Auswachsen der Zellen erfolgt in normalen Züchtungsgefässen, z.B. flachen Gläsern oder Kunststoffflaschen. Das Kulturmedium wurde nach 2 bis 3 Tagen ersetzt. Nach 4- bis 6-tägiger Züchtung bei 37 C waren die primären Zellkulturen gewöhnlich mit einer Zellschicht zugewachsen.
Für die Passagen des B1-Stammes des TGE-Vix-us in den obengenannten Zellen und die Bestimmung des infektiösen Vermögens des Virus in den unterschiedlichen . Teilen des Dünndarmes wurden sekundäre Zellkulturen von Schweineschilddrüsen verwendet. Diese sekundären Zellkulturen wurden dadurch erhalten, dass die primären Zellkulturen aufs, neue im Verhältnis 1 : 2 ausgesät wurden.
Die Attenuierung des Vix-us wurde durch 25O bis 35O Serienpassagen über sekundäre Schweineschilddrüsengewebezellen bei einer Temperatur von 37 C durchgeführt. Diese Serienpassagen wurden auf übliche Weise durchgeführt. Auf Grund des zytopathogenen Effekts und mit Hilfe von Virustitrationen wurde festgestellt, dass der Virustiter
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gewöhnlich, nach 24- bis 'l8-stiuidig-er Inkubation maximal war.
Die Erfindung wird nunmehr an Hand der folgenden Versuche näher erlerntert. VERSUCH A;
Um den Einfluss einer Serienpassage über Schweineschilddrüsengewebe auf die Virulenz des Virus zu bestimmen, wurde jeweils 2 ml der 2. (2 χ 10 PFU/ml), der 120. (2 χ 10 PFU/ml), der 25Ο. (8 x 10 PFU/ml), der 3OO. (4 χ 10 PFU/ml) und der 350. (4 χ 10 PFU/ml) Passage zwei gesonderten Ferkeln aus einem Ivurf neugeborener Ferkel verabreicht. Die Titer der verschiedenen Passagezahlen sind in "plaque"-bildenden Einheiten pro ml (PFU/ml) ausgedrückt. Die verwendeten Versuchstiere
wurden in einem Alter von 1 bis 2 Tagen .von Mutterschweinen, die keine neutralisierenden Antikörper . gegen TGE-Virus besassen, weggenommen und mit der « Flasche - genährt. Am zweiten Lebenstag wurden die Ferkel durch Verabreichung von 2 ml eines der obengenannten Serienpassagenpegel des Virus oral infiziert. Zehn Kcntrollferkeln wurde 2 ml Kulturmedium verabreicht.
Der Verlauf des klinischen Krankheitsprozesses wurde jeden Tag zweimal kontrolliert. Wenn die Ferkel am zehnten Lebenstag noch am Leben waren, wurde für die Antilcörpei'bestimmuiig eine Blutprobe entnommen.
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-*r- PIIN. 8781
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Antikörper wurden mit Hilfe des Serunmeutralisa.tions-
tests unter Verwendung des Mikrotiterverfahrens
(Κ.H. ¥itte, Arch. ges. Virusforsch. _T3 (1971) S.I7I-I
bestimmt.
-TAEICLLE B
■klinische Symptome am Tag . .
Anzahl Passagen Ferkel Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 - X ·
14 - + + + X
15 --++++ +++ X
85 ___·++ ++ +++X
51 _____( + )___ 1j8
76 _______
ΎΎ — — _ _ _ _ _
+ bis +++ geringe bis starke Diarrhöe X tot
- keine Symptome
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-1&- PIIN. 878T
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Das erste Auftreten von Dictrrhöe "wurde als Ende der Inkubationszeit angenommen. Nur bei Ferkeln, denen die 2. Passage verabreicht vorden war, trat Erbrechen auf. Pur diese Passage betrug die Inkubationszeit 16 bis 18 Stunden. Bei den höheren Passagezahlen wurde eine Verlängerung der Inlcubationszext festgestellt, die bei der 300. Passage auf 80 Stunden anstieg.
Nach Infektion mit der 2. , 120. und 250. Passag trat bei den Tieren Diarrhöe auf, die einige Tage andauerte. Ferkel, denen die 3OO. Passage verabreicht worden war, erzeugten nur einige Tage Exkremente mit einer IcIeberigen Konsistenz, während Ferkel, denen die 35O. Passage verabreicht worden war, kein einziges Symptom der Krankheit aufwiesen.
Ferkel, die mit der 2. Passage des Virusstammes infiziert worden Viaren, starben 1 bis 2 Tage nach Verabreichung des Virus. Auch nach Verabreichung der 120 Passage überlebte keines der sechs Ferkel die Infektion. Von den vier mit der 25O. Passage infizierten Ferkeln blieb eines am Leben. Alle Tiere, denen die 3OO. Passage verabreicht worden war, überlebten die Infektion, ebenso Ferkel, denen die 350. Passage yerabreicht worden war.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Virulenz bis zur 250. Passage nur derart wenig
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attenuiert war, dass eine Infektion mit diesem Virus gewöhnlich ernste Krankheitserscheinungen und anschliessendes Sterben herbeiführte. VERSUCH Br
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu bestimmen, wo sich das Virus <ler verschiedenen Passagenpegel des nach der Erfindung attenuiertea Virus in Dünndarm vervielfacht. Dazu wurden dieselben Passagenpegel wie im Versuch A auf identische Weise neugeborenen Ferkeln verabreicht. Sofort nach dem Wahrnehmen der ersten Symptome einer typischen TGE-Virusinfektion wurden die isoliert gehaltenen gesondert infizierten Ferlcel getötet. Vom Duodenum an wurden in gleichmässigen Abständen von 25 bis 35 cm insgesamt dem Dünndarm zehn Proben entnommen. Diese Proben wurden zur Bestimmung des Virustiters, über die verschiedenen Teile des Dünndarmes verteilt, verwendet. Der Titer wurde nach Homogenisierung
* der Probe in einem Mörser und nach Zentrifugieren der 10 9&igen Suspension in PBS bestimmt. Dann wurden von
^O der obenstehenden Flüssigkeit zehnfache Verdünnungen hergestellt, wobei jeweils vier Züchtungsgefässe mit Schweineschilddrüsenzellen mit 0,2 ml der gesonderten Proben geimpft wurden. Nach J-t&glgev Bebrütung bei 37 C wurde der zytopathogene Effekt (CPE) abgelesen und wux^de der Titer nach dem Kärbischen Vorfahren
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(Naunyii-Schmicdebergs. Arch. Exp. Patliol. Phannakol. 162 (1931), S. 480-483) bestimmt.
TABELLE C
Anzahl Inkubations Virustiter Anzahl Inkubations-Passagen zeit in Darm- Passagen zeit
stück Nr. Viriistiter in Darm— stück Nr.
1 :neg 2:0,5 3:0,5 4:0,5
Stunden 5:1,0 (le Versach) g.^
Stunden
(2e Versach) ''"'-> 8:0,5
9:0,5 10:0,5 76 Stunden
(1e Versach)
Stunden
(2e Versaeh)
1:1,5 2:1,0 3:3,0 4:3,0 5:4,0 6:3,5 7:2,5 8:3,5 9:3,5 10:4,5
30 Stunden
(le Versach)
3*4 Stunden
(2e Versach)
1 :2,0 2:2,5 3:2,5 ^:3,5 5:3,0
6:4,5 7:3,0 8:2,5 9:3,0 10:2,5
keine
Symptome
1 :neg 2:neg 3: lieg 4:neg
5:2,5 6:3,0
7:0,5 8:neg 9:neg
25O 40 Stunden
(le Versach)
Stunden
(2e Vei-sach)
1 :neg 2:1,5 3:1,5 4:2,0 5:3,0 6:2,0 7:2,5 8:3,5 9:2,5 10:2,5 Kontrolle
ni cht
einfiziert
1-10 neg
keine
Symptome
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PHtI. 8781
Aus den in der obenstehenden Tabelle zusammengestellten Ergebnissen geht hervor, daß sich das virulente Virus der 2. Passage im ganzen Dünndarm, mit Ausnahme des Duodenums, vervielfachte. Ähnliches gilt für Virus der 120. und der 250. Passage.-Für die 2. Passage lagen die Virustiter zwischen o,5 und 1,0 log 10 TCIDcq/0,2 ml, während die Titer der 120. Passage zwischen 2,0 und 4,5 log 10 TCID 5Q/0,2 ml lagen. Ähnliche Titer wurden für die 250. und die
300. Passage gefunden. Dagegen konnte nach Verabreichung der 350. Passage nur im mittleren Teil des Jejunums eine Vervielfachung des Virus nachgewiesen werden. VERSUCH C:
Mit diesem Versuch wird nachgewiesen, daß Virus der nach der Erfindung erhaltenen 300. Passage, nachdem es einem trächtigen Mutterschwein verabreicht worden ist, die Ferkel wirksam gegen eine Infektion mit virulentem TGE-Virus vom Miller-Stamm schützt.
Der Versuch wurde mit 13 Mutterschweinen durchgeführt. Zu Beginn des Versuchs waren alle Mutterschweine frei von TGE-Virus-Antikörpern.
Die Gruppe I, bestehend aus 8 Mutterschweinen, wurde zweimal oral immunisiert, und zwar etwa 5 Wochen und 2 Wochen vor der voraussichtlichen Niederkunft. Die Immunisierung erfolgte oral, indem 4 ml des Virusmaterials in einer gegen Magensäure beständigen Kapsel verabreicht wurden.
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PHN 8781
Die Gruppe II (4 Mutterschweine) erhielt das Virus zur Hälfte oral (2 ml) in einer Kapsel und zur anderen Hälfte intranasal. Das Virusmaterial war für die Mutterschweine harmlos.
Ein Mutterschwein diente als Kontrolltier, es erhielt das Virus nicht.
Als virulentes Testvirus diente der Miller-Stamm des TGE-Virus. Nach 3 Passagen durch Ferkel wurde eine 1O$6ige Suspension aus feingeriebenem Dünndarm in PBS hergestellt. Nach Zentrifugieren, Aufteilen in Mengen von 2 ml und Einfrieren bei -700C wurde dieses Virusmaterial dazu benutzt, die Ferkel aller 13 Mutterschweine am dritten Lebenstag zu infizieren. Dazu wurde die Suspension derart verdünnt, daß 1 ml der Suspension 100 bis 1000 PID (Pig Infective Dose) enthielt, und jedem einzelnen Ferkel verabreicht.
TABELLE D
Neutralisationstiter des Serums der Mutterschweine und der Ferkel nach passiver Immunisierung mit der 300. Passage des TGE-B1-Stamms und Zahl der lebenden Ferkel am 15· Tag nach der Geburt
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A 8 - 45- - .ch d. -ZcI
14.		 PHN 8781
2.817299
B <\ Titer ' air.
3. 		..c Tag n:
η 		nrt Ferkel ge
boren/
Ferkel übor-
leber-4
A 16 64
/
1)
Jiiitter- Titer ' an
schveir. Tag der Geburt
!Tr.		 B <J 16 32 8-16
Gruppe I A 32 8-32 16-32 156 4/4
15 B < 1 16 8 2-16
A 32 2-8 2-16 128 11/7
22 B <1 32 64 16-64
A 4 16-128 8-128 64 10/10
23 B .<] 64 64 4-32
A 16 16-128 16-64 64 11/11
25 B <1 4 4 8-64
A 2 1-4 2-4 256 6/5
26 B <I 16 32 32-128
A 64 2-32 8-32 256 8/7
39 B 2 16 4-256
2 2-32 16 6/4
42 A 16 64 >256 8-16
B <1 16-256 128-256 7/7
44 A 32 32
B <1 16 64 4-32
Gruppe II A 128 16-32 4-32 256 5/5
17 B < 1 32 128 128-256
A 16 16-64 2-64 128 7/6
29 B ° 256 128 16-128
A
B 		-Cl 256-512 128-256 64 9/9
33 16 64 8-32
16-32 4-16 128 3/3
35 O 6/0
45
(Kontrolle)
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PHN 8781
Bemerkungen: 1) Ein Titer von 1 bedeutet vollständige Neutralisation durch unverdünntes Serum
A = Serum des Mutterschweines
B = Serum der Ferkel.
Nach Infizierung mit virulentem Virus des Miller-Stamms überlebten 55 von 63 Ferkeln (d.h. 87 %) in Gruppe I diese Infektion.
In Gruppe II überlebten 23 von 2h Ferkeln. Demgegenüber starben alle 6 Ferkel der Kontrollgruppe innerhalb von 7 Tagen nach
der Geburt.
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Claims (9)

PlIN. 8781 O.Philips' ::.;;.:-.;.■:.,-■...■:«::., cü^oven 1O·^·78 PATENTANSPRÜCHE:
1. . Verfahren zur Herstellungeines lebenden attenuierten TGE-Virusstammes, dadurch gekennzeichnet, dass ein nicht-virulenter immunogeii wirksamer Virusstamm dadurch hergestellt wird, dass ein virulenter TGE-S tamin einer Vielzahl von Gewebekulturpassagen unterworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der virulente Stamm direkt auf Schweineschilddrüsengewebe isoliert und auf diesem Gewebe auch weiteren Passagen unterworfen wird.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der virulente Stamm bis 350 Passagen bei 37 °C unterworfen wird.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, dass der virulente Stamm etwa 300 Passagen unterworfen wird.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis k}
■ dadurch gekennzeichnet, dass als virulenter TGE-Virusstamm der B1-Stamm verwendet wird.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5i dadurch gekennzeichnet, dass das Virus bei jeder Passage 1 bis "2 Tage bei 37 °C inkubiert und dann die das Virus enthaltende Flüssigkeit abgeschieden und der folgenden Passage über Zellen von Schweineschilddrüsengewobe unterworfen wird.
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PHN 8781
7. Lebendes attenuiertes nichtvirulentes iminunogen wirksames TGE-Virus, das durch das Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 erhalten ist.
8. Verfahren zur Herstellung einer TGE-Virus-Vakzine, dadurch gekennzeichnet, daß dem Material nach Anspruch 7 ein Stabilisator zugesetzt wird und daß das Gemisch gefriergetrocknet wird.
9. Vakzine, die nach dem Verfahren nach Anspruch 8 erhalten worden ist.
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DE19782817299 1977-04-21 1978-04-20 Verfahren zur herstellung eines attenuierten infektioese-gastroenteritis (tge)-virusstammes zur anwendung in lebendvakzinen Withdrawn DE2817299A1 (de)

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