DE69333588T2

DE69333588T2 - Verfahren zur verstärkung zellularer immunantworten

Info

Publication number: DE69333588T2
Application number: DE69333588T
Authority: DE
Inventors: S. Balbir BHOGAL; I. Krishnaswamy DAYALU; D. Jay GERBER
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1993-09-21
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2013-09-22
Also published as: DE69333588D1; MX9306016A; ATE273022T1; AU4931293A; DK0839050T3; AU687750B2; CA2145760A1; PT839050E; WO1994007531A1; EP0839050A1; ES2225825T3; EP0839050B1; JPH08502253A; EP0839050A4

Description

Dies ist eine Teilfortführungsanmeldung der US-Patentanmeldung SN07/634,237, eingereicht am 26. Dezember 1990, die eine Teilfortführungsanmeldung der US-Patentanmeldung SN07/575,921, eingereicht am 31. August 1990 ist, die eine Teilfortführungsanmeldung der US-Patentanmeldung SN07/530,669, eingereicht am 29. Mai 1990, ist.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Impfstoffe, und genauer Verfahren zur Verstärkung Zell-vermittelter Immunantworten auf Antigene von Mycoplasma hyopneumoniae bei neugeborenen Ferkeln.
Hintergrund der Erfindung
Es ist von Fällen im Fachgebiet der passiven Immunisierung von Neugeborenen gegen Infektion mit einem ausgewählten, eine Krankheit hervorrufenden Mittel durch Verabreichung eines Impfstoffes an ein trächtiges Tier oder ein säugendes Muttertier berichtet worden. Es wird angenommen, dass diese passiven Immunantworten auf die Übertragung von mütterlichen IgA-Antikörpern durch die Plazenta auf das Junge und/oder durch die intestinale Absorption der mütterlichen Immunglobuline, die in Kolostrum oder Milch vorhanden sind, durch das Neugeborene zurückzuführen sind.
Kolostrum und Milch, die dem Neugeborenen schützende Immunfaktoren liefern, weisen auch eine außergewöhnliche und einzigartige Zusammensetzung von Kohlenhydraten, Fetten Aminosäuren, Mineralien, Vitaminen, Wachstum fördernden Faktoren wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin und Somatomedine wie auch Lactoferrin, Interleukin-1 (IL-1) und vasoaktiven Peptiden des Verdauungstraktes und einigen Neuropeptide auf.
Nach der Aufnahme von Kolostrum besiedelt der mütterliche Immunfaktor, besonders Antikörper, Antikörper produzierende Zellen und T-Zellen, über das intestinale Schleimhautgewebe verschiedene Lymphgewebe des Neugeborenen verteilt und bleibt während der frühen nachgeburtlichen Phase der Reifung seines Immunsystems dort bestehen, bis das eigene Lymphsystem des Neugeborenen zur Antikörperproduktion und Induktion oder Sensibilisierung von T-Zellen in der Lage ist. Kolostrum und Milch des Menschen enthalten aktivierte und Gedächtnis-T-Lymphocyten von bis zu 73 % der gesamten Lymphocytenpopulation. Gedächtnis-T-Lymphocyten machen bis zu 92 % der gesamten Lymphocytenpopulation aus. Darüber hinaus legen experimentelle Daten aus Kolostrum und Milch des Menschen nahe, dass nahezu alle (99,8 %) T-Zellen des Helfer-Phänotypps (CD4⁺) und die meisten (92%) T-Zellen des cytotoxischen/Suppressor-Phänotyps (CD8⁺) Gedächtnis-T-Zellen sind. Diese T-Lymphocyten spielen im Zusammenwirken mit anderen Immunfaktoren eine wichtige Rolle bei der immunologischen Entwicklung des Neugeborenen in Bezug auf seine Fähigkeit, auf zukünftige Zusammentreffen mit Antigenen aus der Umgebung oder beabsichtigte Exposition durch Impfungen zu reagieren.
Auf dem Fachgebiet der Immunologie ist gut belegt, dass die Exposition von neugeborenen Tieren gegen eine Mehrheit von Antigenen aus der Umgebung oder Impfung gewöhnlich zur Toleranzinduktion führt, die von verschiedenen Faktoren wie etwa dem Antigentyp, der Dosis und der Art der Verabreichung und dem genetischen Hintergrund abhängt. Im Gegensatz dazu würde eine ähnliche Exposition der ausgewachsenen Tiere unweigerlich zu einer Immunantwort führen.
Die zelluläre Basis für dieses verschiedene Antwortverhalten von Neugeborenen und Erwachsenen ist nicht eindeutig definiert. Dieses Phänomen kann durch zwei kritische Faktoren, besonders den Status der mütterlichen Immunreaktivität und des mütterlichen Repertoirs an B- und T-Zellen und die postnatale Antigenexposition des Neugeborenen gegen Gram-negative Mikroben (LPS), hervorgerufen werden. Zum Beispiel erfolgt die Besiedlung des Darms unverzüglich nach der Geburt, z.B. bei Kälbern innerhalb von 4 Tagen und bei Schweinen innerhalb von etwa 1 Woche.
Stoyanov, Veterinarnomeditsinski Nauki, 13 (9), 1976, 24–27, legt die Impfung von Muttersauen und anschließend der Ferkel mit zwei unterschiedlichen Impfstoffen von M. hyorhimis offen.
Es besteht auf dem Gebiet der Impfmedizin ein Bedarf für ein Verfahren zur Verstärkung von Immunität, besonders der nicht-Antikörper vermittelten Immunität (oder Zell vermittelten Immunität) bei Neugeborenen, denen die vollständig entwickelten Immunsysteme fehlen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Verstärkung von Zell vermittelter Immunantworten von neugeborenen Tieren, besonders Schweinen, auf ein Antigen oder ein immunogenes Agens von M. hyopneumoniae. Dieses Verfahren beinhaltet Impfung von trächtigen Tieren mit einem Impfstoff, der das ausgewählte immunogene Agens enthält, und die anschließende Verabreichung eines Impfstoffes, der das gleiche Antigen enthält, an die entsprechenden Neugeborenen.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hiervon genauer beschrieben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Verstärkung von Zell vermittelten Immunantworten bei neugeborenen Tieren, besonders Schweinen, auf ein Immunogen oder Antigen von Mycoplasma hyopneumoniae. Dieses Verfahren beinhaltet die Verabreichung einer Impfstoffzusammenstellung, die ein ausgewähltes immunogenes Agens von Myoplasma enthält, an eine trächtige Sau und die nachfolgende Verabreichung einer geeigneten Dosis der Impfstoffzusammenstellung, die das gleiche Imunogen enthält, an das (die) neugeborene(n) Ferkel, um eine Zell vermittelte Immunantwort auf dieses Immunogen im Ferkel zu erhalten.
Dieses Verfahren ruft eine verstärkte Zell-vermittelte Immunantwort (CMI) in den gesäugten und geimpften Neugeborenen auf das spezifische Immunogen bei der zweiten Präsentierung des Immunogens durch mindestens eine direkte Impfung des Ferkels hervor. Zusätzlich erlaubt das Verfahren der Erfindung für den Fall, dass ein Neugeborenes einen Immundefekt aufweist, besonders durch mehr als eine Impfung der gesäugten Ferkel, die Rekonstitution des mütterlichen Immunrepertoires im Neugeborenen.
Die hierin verwendeten Ausdrücke Immunogen von Mycoplasma hyopneumoniae, immunogenes Agens oder Antigen können sich auf ein vollständiges, bevorzugt inaktiviertes Pathogen von Mycoplasma hyopneumoniae beziehen. Diese Ausdrücke umschließen auch ein pathogenes Protein, das in Rohform und/oder hiervon gereinigt isoliert wurde, oder ein synthetisches Protein, ebenso wie einige Teilstücke des synthetischen, gereinigten oder isolierten pathogenen Proteins, das antigene Eigenschaften aufweist. Es ist möglich, dass das Antigen auch ein biologisches Material des genannten Pathogens, das kein Protein ist, einschließt.
Mit „verstärkter CMI-Antwort" wird eine CMI-Antwort im Ferkel benannt, die die Produktion von T-Zellen umfasst, die gegen das infektiöse Agens, das das Antigen trägt, schützen, deren Antwort stärker ist als jene, die in trächtigen Sauen, induziert durch Verabreichung des Impfstoffes, beobachtet wird, oder die beobachtet wird, wenn der Impfstoff lediglich direkt dem Ferkel verabreicht wird, oder die bei nicht geimpften Ferkeln beobachtet wird, die von geimpften Sauen geboren werden. Der Ausdruck „Neugeborenes" bezieht sich auf ein kürzlich geborenes Tier mit einem Alter von weniger als etwa 10 Wochen. In dem Verfahren dieser Erfindung wurde das Neugeborene bevorzugt nach der Geburt mit mütterlichem Kolostrum gesäugt. Bevorzugt wurde das Neugeborene innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Geburt mit mütterlichem Kolostrum gesäugt. Die hierin verwendeten Ausdrücke „wirksame Menge" oder „wirksame immunogene Menge" bezeichnen die Menge an Antigen, die in der Lage ist, in dem geimpften Tier eine schützende Zell-vermittelte Immunantwort und gegebenenfalls eine schützende Antikörper-Antwort zu induzieren. Alternativ kann die wirksame Menge als jene definiert sein, die notwendig ist, um die Schwere jeder einzelnen der Krankheitserscheinungen, die mit Infektion mit M. hyopneumoniae einhergehen, für einen gewissen Zeitraum zu vermeiden oder zu mindern.
Auf diese Weise liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung von Zellvermittelten Immunantworten von Ferkeln auf ein ausgewähltes infektiöses Agens, M. hyopneumoniae. Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung eines Impfstoffes, der eine wirksame Menge eines Antigens oder Immunogens des infektiösen Agens enthält, an eine Sau vor der Geburt ihrer Ferkel. Nach dem Verfahren dieser Erfindung kann dieser Impfstoff der Sau vor der Zeugung ("breeding") verabreicht werden. Der Impfstoff wird jedoch bevorzugt einer trächtigen Sau zwischen etwa 6 Wochen und 2 Wochen vor dem Werfen, d.h. vor der Entbindung, verabreicht.
Nach der Geburt werden die Ferkel mit Milch und Kolostrum der geimpften Mutter gesäugt, bevorzugt innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Geburt. Bevorzugt werden die Ferkel über einen längern Zeitraum von der Mutter gesäugt. Das (die) Ferkel erhält (erhalten) dann eine erste Impfung, d.h. eine geeignete erste Dosis der selben Impfstoffzusammenstellung, die der Mutter verabreicht worden war. Diese erste Impfung wird den Ferkeln zwischen 3 Tagen und 3 Wochen nach der Geburt verabreicht. Bevorzugt wird den Ferkeln die erste Impfung eine Woche nach der Geburt verabreicht.
Wenn es erwünscht ist, kann der Impfstoff gegebenenfalls einem Ferkel ein zweites Mal, d.h. eine zweite Impfung, etwa zwei Wochen nach der ersten Impfung verabreicht werden. Die zweite Impfung kann erwünscht sein, wenn sich herausstellt, dass das Ferkel einen Immundefekt aufweist oder wenn es ungenügend mit mütterlichem Kolostrum gesäugt wurde.
Die immunregulatorische Wirkung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt wird, wird sogar erreicht, wenn die Ferkel nach 48 Stunden entwöhnt werden. In den nachstehend beschriebenen Untersuchungen waren die spezifischen proliferativen Antworten der T-Lymphocyten, das heißt, die Zell vermittelte Immunantwort, von Ferkeln, die von Sauen geboren und gesäugt wurden, die mit dem Impfstoff gegen Mycoplasma hyopneumoniae geimpft worden waren, nach der ersten Impfung der Ferkel zehn- bis zwanzigfach höher als die Antworten der T-Lymphocyten von Ferkeln nach der ersten Impfung dieser Ferkel, die von nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren.
Die Erfinder, die nicht wünschen, auf die Theorie des Mechanismus, auf dem dieses Verfahren beruht, festgelegt zu werden, gehen zur Zeit davon aus, dass das Kolostrum der zuvor geimpften Sauen spezifische B-Zellen und T-Zellen enthält, die Antikörper gegen das Antigen tragen, die interne Abbilder darstellen. Die Lymphorgane von Ferkeln, die mindestens innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Geburt mit diesem Kolostrum gesäugt wurden, werden mit diesen mütterlichen B- und T-Zellen besiedelt.
Solche Lymphocyten nisten sich im Lymphgewebe des Ferkels ein und vermehren sich und bestimmen nachfolgend die Immunreaktivität des Ferkels auf das Antigen des Impfstoffes. Bei der Exposition gegen den Impfstoff nach der Geburt, d.h. bei der ersten Impfung, erreicht das Immunsystem des Ferkels eine verstärkte Zell-vermittelte Immunantwort auf das Immunogen im Impfstoff.
Im Verlauf einer gegebenen Immunantwort bilden sich Idiotypen (Id oder Ab-1) genannte Antikörper auf ein gegebenes Antigen, die mehrere durch die Wechselwirkungen oder Faltung der hypervariablen Ketten von Ab-1 gebildete immunogene Determinanten aufweisen, in diesem Fall auf das Antigen von M. hyopneumoniae. Eine zweite Generation von Immunantworten, d.h. die Generation der Antikörper auf die immunogenen Determinanten von Ab-1, tritt ebenfalls als ein Teil des normalen immunregulatorischen Kreislaufs während der normalen Immunreaktion auf. Die Antikörper, die auf die Id-Determinanten von Ab-1 während des Verlaufs einer Immunreaktion auf ein gegebenes Antigen gebildet werden, werden anti-Idiotypen (anti-Id oder Ab-2) genannt. Mehrere Sätze der Ab-2-Antikörper wie etwa Ab-2β, Ab-2τ und Ab-2α können gegen unterschiedliche idiotypische Determinanten von Ab-1 gebildet werden. Einige der Ab-2, besonders Ab-2β, gebildet gegen Id, der innerhalb der Antigen-Bindungsstelle der Ab-1-Antikörper liegt, können eine strukturelle Konformität zu dem vom Ab-1 erkannten Antigen aufweisen. Diese Ab-2-Antikörper können durch ihre Konformation ein Spiegelbild oder Ersatz-Antigen für das Immunsystem des Wirts darstellen, selbst wenn sie chemisch gesehen Proteine und keine Lipopolysaccharide (LPS) oder LPS-ähnliche Antigene sind. Dies bildet die Basis der idiotypischen Mimikry oder internen Abbildung eines gegebenen Antigens und liefert eine logische Erweiterung der Immunnetzwerk-Theorie von Jerne, (Ann. Immunol., 125 (c): 373 (1974)).
Dieses System beinhaltet eine mögliche Anwendung zur Modulierung von Immunantworten und kann bei der Modulation der Immunreaktivität bei Neugeborenen nützlich sein. Die Immunisierung von trächtigen Tieren induziert eine B-Zell-Antwort, z.B. Immunglobulin Ab-1, und eine T-Zell-Antwort wie etwa T-Helfer Zellen, die durch Spezifität für ein gegebenes Antigen gekennzeichnet sind. Untersuchungen im murinen System legen nahe, dass Lyb5-B-Lymphocyten und Lyb5-ähnliche B-Lymphocyten, selbst wenn sie zu Toleranzinduktion durch LPS-ähnliche Antigene neigen, sehr wirksam für eine positive und produktive Immunantwort durch Spiegelbild-Ersatz-Antigene wie etwa jene, die durch anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper repräsentiert werden, stimuliert werden können. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass anti-Id die Entwicklung des Lyb5⁺ -B-Untersatzes von Lymphocyten verstärkt. Daher erfolgt das höchst praktische natürliche Verfahren, mit dem (1) Toleranz von Lyb5^– -B-Lymphoczyten und Lyb5^–-ähnlichen B-Lymphocyten verhindert werden kann und (2) die Entwicklung von Lyb5⁺ -B-Lymphocyten im Neugeborenen verstärkt werden kann, über den Weg der Impfung der Mutter und Sensibilisierung des Lyb5^–-Untersatzes der B-Zellen mit anti-Id. Auf diese Weise werden die Lymphorgane des Neugeborenen über die Aufnahme von Kolostrum mit diesen Zellen besiedelt, bevor das Neugeborene Antigenen aus der Umgebung ausgesetzt wird.
Wie hierin beispielhaft dargestellt, induziert Immunisierung von trächtigen Sauen (oder Sauen vor der Zeugung) mit einem gegebenen Antigen eines ausgewählten infektiösen Agens, z.B. M. hyopneumoniae, Ab-1-Antikörper, die spezifisch für die Epitope dieses Pathogens sind. Ab-2-Antikörper werden gleichfalls gegen Id von Ab-1 gebildet. Einige dieser Ab-2 oder anti-Id tragen strukturelle Konformität mit den Antigenen von Mycoplasma oder ein bestimmtes Epitop dieses Antigens. Sowohl die mütterlichen Antikörper Ab-1 als auch Ab-2 werden durch Antikörper produzierende Lymphocyten (B-Lymphocyten) während der Aufnahme von Kolostrum in den ersten wenigen Stunden nach der Geburt auf das Neugeborene übertragen. Kolostrum der Sau enthält 30% Lymphocyten Gew./Vol. in den ersten 16 Stunden nach der Abnabelung. B- und T-Lymphocyten, die durch die Schleimhaut des Verdauungstraktes in den ersten wenigen Stunden im Leben des Neugeborenen absorbiert werden, bestimmen den Grundstock des zukünftigen T- und B-Zellrepertoires in zahlreichen Lymphorganen.
Dieser Prozess wird durch mehrere Faktoren kontrolliert, einschließlich der Spezifität des Lymphocytenrepertoires des Kolostrums (das die Immunreaktivität und das Repertoire der Mutter widerspiegelt), Unreife des eigenen B-Zellrepertoires des Neugeborenen und Exposition des Neugeborenen gegen Antigene der Umgebung oder ausgewählter Impfstoffe.
Impfstoffzusammensetzungen, die für das Verfahren der Erfindung nützlich sind, können als Arzneimittel hergestellt werden, die eine wirksame immunogene Menge des ausgewählten Immunogens, z.B. das nachstehend beschriebene, inaktivierte M. hyopneumoniae-Virus, als einen aktiven Inhaltstoff in einem nicht toxischen und sterilen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthalten. Solch ein verträglicher Trägerstoff kann von Fachleuten auf dem Gebiet leicht ausgewählt werden und ist bevorzugt ein wässriger Trägerstoff. Eine Reihe von wässrigen Trägerstoffen können verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3% Glycerin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und allgemein frei von Partikeln. Diese Lösungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden.
Eine solche Impfstoffzusammensetzung, die für dieses Verfahren nützlich ist, kann den vorstehend beschriebenen inaktivierten Impfstoffbestandteil oder andere Mycoplasma-Immunogene der selben Mycoplasma-Arten enthalten. Noch andere, für die Verabreichung an Schweine geeignete Antigene, die nicht von Mycoplasma stammen, können in die Impfstoffzubereitung, die nach diesem Verfahren verabreicht wird, eingeschlossen sein.
Diese Antigene können bei Bedarf möglichen mit pharmazeutisch verträglichen, unterstützenden Substanzen wie etwa pH-Wert einstellenden und puffernden Agenzien, Konservierungsmitteln, Emulgatoren und dergleichen gemischt sein, um geeignete physiologische Bedingungen zu erreichen. Alternativ oder zusätzlich kann das inaktivierte M. hyopneumoniae mit einem herkömmlichen Adjuvans, z.B. Amphigen, Mineralöl und Lecithin, Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid und Saponinen wie etwa QuilA, gemischt oder an dieses adsorbiert sein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Impfstoffzusammensetzung, die nach dem Verfahren der Erfindung verabreicht werden kann, enthält eine wässrige Suspension oder Lösung, die den inaktivierten Stamm P-5722-3 von M. hyopneumoniae enthält. M. hyopneumoniae-Stamm P-5722-3 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, unter der Zugangs-Nr. 55052 hinterlegt.
Der Impfstoff, der diesen Stamm enthält, kann unter dem Handelsnamen RespiSure [SmithKline Beecham] käuflich erworben werden und ist Gegenstand der laufenden US-Patentanmeldung Ser.Nr. 07/634,237, hinterlegt am 26. Dez. 1990, und der entsprechenden veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung PCT/US91/03689, die hierin durch Referenz eingeschlossen sind. Der Impfstoffstamm liegt bevorzugt im physiologischen pH-Wertbereich gepuffert in einer zur Injektion bereiten Form vor.
Für die Zwecke dieser Erfindung beträgt eine wünschenswerte immunogene Menge des inaktivierten M. hyopneumoniae-Virus zur Impfung der Sau oder des Neugeborenen zwischen 5 × 10⁸ CCU und 5 × 10⁹ CCU, wenn es als der alleinige aktive Inhaltstoff in einer Impfstoffzusammensetzung verabreicht wird. In einer Impfstoffzusammensetzung, die zusätzliche antigene Bestandteile enthält, kann die gleiche immunogene Menge oder eine verminderte Menge von M. hyopneumoniae eingesetzt werden. Zur Verwendung in dem Verfahren dieser Erfindung ist es bevorzugt, dass die Impfstoffzusammensetzung in Form von bevorzugt etwa 2 ml enthaltenden Einheitsdosierungen vorliegt, wobei jede Dosis den gewünschten Titer enthält.
Andere geeignete, therapeutisch wirksame Dosen können, basierend auf den vorstehend genannten immunogenen Mengen, den behandelten Zuständen und den physiologischen Merkmalen des Tiers von Fachleuten auf diesem Gebiet leicht bestimmt werden. Bei Anwesenheit von zusätzlichen aktiven Agenzien können diese Einheitsdosierungen von Fachleuten leicht angepasst werden.
Nach dem Verfahren dieser Erfindung beinhaltet ein wünschenswertes Dosierungsschema die Verabreichung von einer oder zwei Dosen der gewünschten Impfstoffzusammensetzung an die Sau, entweder wenn sie trächtig ist oder vor der Zeugung, wobei es wünschenswert ist, dass der antigene Gehalt jeder einzelnen Fraktion wie vorstehend beschrieben ist, und die Verabreichung von mindestens einer Dosis an das Neugeborene, um die verstärkte CMI-Antwort dieses Verfahrens zu erhalten. Wenn zwei oder mehr Dosen an das trächtige Tier verabreicht werden, werden die Dosen bevorzugt mit einem Abstand von mindestens zwei Wochen verabreicht. Im Fall des M. hyopneumoniae-Impfstoffs dieser Erfindung werden zur ersten Immunisierung des trächtigen Schweins zwei Dosen in einem Abstand von etwa vier Wochen empfohlen, wobei die letzte Dosis zwei Wochen vor dem Werfen verabreicht wird. Eine Auffrischungsdosis vor jedem weiteren Werfen ist zu empfehlen, wenn das Intervall zwischen den Impfungen mehr als sechs Monate beträgt. Nach der Geburt der Neugeborenen sollte die erste Immunisierung mit einem Alter von zwischen etwa 3 Tagen und 3 Wochen begonnen werden, bevorzugt im Alter von einer Woche.
Die Art der Verabreichung der Impfstoffe der Erfindung kann über jeden geeigneten Weg erfolgen, der den Impfstoff in den Wirt überträgt. Der Impfstoff wird jedoch bevorzugt über intramuskuläre Injektion verabreicht. Falls erwünscht können andere Verabreichungsarten wie etwa subkutane, intradermale oder intravenöse Verabreichung ebenfalls angewendet werden.
Das nachstehende Beispiel dient lediglich der Veranschaulichung und soll nicht eingrenzend sein.
Beispiel 1: Impfstoffprüfung
Acht trächtige Sauen der weißen Landrasse wurden intramuskulär in einem Zeitraum, der auf zwischen etwa zwei bis 6 Wochen vor dem Werfen geschätzt wurde, mit der RespiSure-Impfstoffzusammensetzung [SmithKline Beecham] mit einer 2 ml-Dosis geimpft. Als Kontrollgruppe wurden acht Sauen verwendet, deren Tiere niemals gegen M. hyopneumoniae geimpft worden waren. Neugeborenen Ferkeln in einem Alter zwischen einer und drei Wochen, die gesäugt wurden oder von der Mutter über mindestens 48 Stunden nach der Geburt gesäugt worden waren, sowohl der geimpften als auch der Kontrollgruppe wurde dann eine erste Impfung intramuskulär in der selben Dosis mit der selben Impfstoffzusammensetzung verabreicht.
Durchflußcytometrie wurde nach den Anweisungen des Herstellers [FACSTAR^PLUS (Becton Dickinson, San Jose, CA)] durchgeführt. Das Durchflußcytometer, ausgestattet mit einem einzelnen Argonionen-Laser, wurde zur phänotypischen Analyse von Lymphocyten verwendet, die von den Ferkeln zu unterschiedlichen Zeitabschnitten nach der Impfung gewonnen wurden. Phänotypische Analysen von Lymphzellen mittels Durchflußcytometrie unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für Anhäufungen von Differenzierungs (CD)-Markern wie etwa CD4 und CD8 sind, wurden verwendet, um die Wirkungen der Impfungen auf die Ferkel im Alter von einer Woche zu untersuchen und um die Sensibilisierung von T-Zellen des CD4- und CD8-Phänotyps zu untersuchen. Murine monoclonale Antikörper, anti-CD4 und anti-CD8, die spezifisch für T-Zell-Marker des Schweins waren, wurden von der ATCC bezogen. Anti-CD2 wurde von Dr. Joan Lunney [USDA Beltsville] bezogen.
Die nachfolgende Tabelle I fasst die Wirkungen der ersten Impfung auf die T-Zell-Profile in peripheren Blutlymphocyten von Ferkeln zusammen.
Die in dieser Untersuchung verwendeten Mycoplasma-Antigene wurden aus dem Impfstoffstamm von Mycoplasma hergestellt, wie in PCT/US91/03689 beschrieben wurde, das durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
Die Lymphgewebe der Ferkel wurden aseptisch bei der Autopsie entfernt. Einzelzellpräparate wurden in Zellkulturmedien RPMI 1640 angefertigt, die 10% fötales Kälberserum und Penstrep [Gibco] enthielten. Die Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen aufgebracht und mit oder ohne Antigen und mit oder ohne Mitogene wie etwa Concavalin A (ConA) oder T-Zell-Mitogene und Lipopolysaccharide (LPS) oder B-Zell-Mitogene inkubiert. Nach 72 bis 96 Stunden wurden die Zellen mit ³H-Thymidin markiert und weiter für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden auf Filterpapier geerntet, und die Aufnahme von Thymidin wurde mit einem Beta-Zähler (Szintillationszähler; CpM) gemessen. Der Grad der Zellproliferation ist als Zählimpulse ("counts") pro Minute ausgedrückt.
Zwei Wochen nach einer einzelnen Impfung wiesen die T-Lymphocyten der Milz (mittlere CpM 31 × 10^–3), die peripheren und bronchialen Lymphknoten (mittlere CpM 8,6 × 10^–3) und das periphere Blut (mittlere CpM 21 × 10^–3) der Ferkel sehr hohe proliferative Reaktionen auf Mycoplasma-Antigene auf.
Die nachstehenden Abschnitte zeigen die beobachteten Reaktionen in bronchialen Lymphknoten, (BLN), peripheren Lymphknoten (PLN), Milz und peripheren Blut-Lymphocyten (PBLs) nach der ersten und zweiten Immunisierung und nachfolgender Challenge.
A. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 14 Tage nach der ersten oder primären Impfung mit Respisure im Alter von einer Woche.
B. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 7 Tage nach der zweiten oder sekundären Impfung mit Respisure im Alter von drei Wochen.
Der hohe Grad der Reaktivität der T-Lymphocyten auf die Antigene des Impfstoffes hängt mit der Anwesenheit von verschiedenen Mycoplasma-spezifischen immunkompetenten T-Zellen, besonders T-Helferzellen, in den Lymphorganen von Ferkeln zusammen, die von geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren. T-Zell-Reaktionen nach der ersten Impfung bei Ferkeln, die von geimpften Sauen geboren worden waren, waren mit den Reaktionen vergleichbar, die typischerweise von einer zweiten Impfung in einem Ferkel erwartet werden. Dieser Befund legt die Anwesenheit von T-Helferzellen mit der Vergangenheit einer früheren Exposition gegenüber Mycoplasma-Antigenen oder Antigen-ähnlichen Molekülen nahe.
C. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 10 Tage nach der zweiten oder sekundären Impfung mit Respisure im Alter von drei Wochen.
Die Reaktivität der Lymphzellen von geimpften Schweinen aus geimpften Sauen wurde 7 und 10 Tage nach der sekundären Impfung, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Nur marginale Erhöhungen wurden beobachtet, was nahe legt, dass eine sekundäre Impfung von besonderem Nutzen für Ferkel ist, die unter Feldbedingungen keine geeigneten Mengen an Immun-Kolostrum/Milch aufnehmen können. Während diese Kolostrum limitierten Schweine eine geringere Reaktion auf die erste Impfung zeigen können, würden sie in der Lage sein, eine schützende CMI-Antwort auf eine zweite Impfung aufzubauen.
D. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 4 Tage nach der Challengeinfektion mit 2 ml virulentem M. hyopneumoniae, 10 Tage nach der sekundären Impfung mit Respisure bei einem Alter von drei Wochen intranasal verabreicht.
E. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 7 Tage nach der Challenge-Infektion mit virulentem M. hyopneumoniae, 10 Tage nach der sekundären Impfung mit Respisure bei einem Alter von drei Wochen verabreicht.
F. Unterschiede bei proliferativen Reaktionen in vitro der Lymphzellen von Ferkeln, die von geimpften oder nicht geimpften Sauen geboren und gesäugt worden waren: 11 Tage nach der Challenge-Infektion mit virulentem M. hyopneumoniae, 10 Tage nach der sekundären Impfung mit Respisure bei einem Alter von drei Wochen verabreicht.
Während bemerkenswerte Erhöhungen der CMI-Antworten in den Lymphzellen der bronchialen Lymphknoten (BLN) 4 und 7 Tage nach der Challenge mit virulentem M. hyopneumoniae beobachtet wurde, wurden CMI-Antworten von Lymphocyten von Milz, PBLs und BLN so herabreguliert, dass sehr geringe Antworten an den Tagen 4 und 7 nach der Infektion beobachtet wurden. Eine Erhöhung der CMI-Antworten in diesen Bereichen wurde an Tag 11 nach der Challenge unter Verwendung herkömmlicher Techniken beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt wiesen jedoch auch BLN-Lymphocyten von Placebo-Tieren, die in einer ähnlichen Weise durch Challenge infiziert worden waren, hohe CMI-Antworten auf.
Obgleich das hierin angeführte Beispiel dieses Verfahren mit einem bestimmten, an Schweine verabreichten M. hyopneumoniae-Impfstoff zeigt, ist diese Erfindung nicht hierauf begrenzt. Die Impfstoffzusammensetzung kann andere Mycoplasma-Antigene enthalten und andere Arten von Mycoplasma-Antigenen. Zusätzlich kann die Impfstoffzusammensetzung Kombinationen von Mycoplasma-Antigenen enthalten, einschließlich von Antigenen der selben Art oder unterschiedlicher Arten von Mycoplasma.
Es wird erwartet, dass dieses Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, um die CMI-Antworten von Neugeborenen auf andere Impfproteine, die von pathogenen Mikroorganismen oder Viren stammen, zu erhöhen, wie etwa dem infektiösen Peritonitis-Virus der Katze, dem Immunschwäche-Virus der Katze, dem Rotavirus des Rindes, dem Parvovirus des Hundes, Borrelia und P. haemolytica des Rindes. Es wird erwartet, dass es von besonderem Nutzen für jede Tierart ist, besonders für Säuger, einschließlich für Menschen, Katzen, Hunde und Rinder und für Vogelarten, besonders Geflügel, einschließlich Hühner und Truthähne.

Claims

Verwendung eines Mycoplasma hyopneumoniae-Immunogens für die Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Verabreichung an ein weibliches Schwein vor der Geburt seines Neugeborenen und an sein Neugeborenes nach der Geburt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Impfstoffzusammensetzung für die Verabreichung an ein weibliches Schwein während seiner Trächtigkeit ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Impfstoffzusammensetzung für die Verabreichung an ein weibliches Schwein zwischen etwa 2 und 6 Wochen vor der Geburt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine Impfstoffzusammensetzung für die erste Verabreichung an das Neugeborene etwa 3 Tage bis 3 Wochen nach der Geburt ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei eine zweite Impfstoffzusammensetzung für die Verabreichung an das Neugeborene etwa 2 Wochen nach der ersten Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 wobei das Immunogen ein vollständiges, inaktives Mycoplasma hyopneumoniae-Pathogen, ein Mycoplasma hyopneumoniae-Protein, das in Rohform gewonnen und/oder daraus aufgereinigt wurde, oder ein synthetisches Mycoplasma hyopneumoniae-Protein oder ein Fragment des synthetischen, aufgereinigten oder gewonnenen pathogenen Proteins ist, welches die antigenen Eigenschaften des Pathogens besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Neugeborene vor der Impfung mit Kolostrum des weiblichen Schweins gesäugt wurde.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei, zusätzlich zu dem M. hyopneumoniae-Immunogen, ein Antigen einer anderen Mycoplasmaart verabreicht werden soll.