DE69835424T2

DE69835424T2 - Boviner atmungs- und darmcoronavirus als impfstoff

Info

Publication number: DE69835424T2
Application number: DE1998635424
Authority: DE
Inventors: C. Lisa Olathe STINE; J. Michael Des Moines McGINLEY; A. Gary Bucyrus ANDERSON; L. Douglas Olathe STINE; K. Karen Parkville BROWN; D. Andre Gladstone DORY; Adrian Lenexa LIEM
Original assignee: IMMTECH BIOLOG LLC; Immtech Biologics Bucyrus LLC; Bayer Corp
Current assignee: IMMTECH BIOLOG LLC; Immtech Biologics Bucyrus LLC; Bayer Corp
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2018-03-05
Also published as: CA2231591A1; JP2001519781A; EP0975360A2; EP0975360B1; ATE334697T1; KR20000075775A; DK0975360T3; AU6346598A; KR100531491B1; WO1998040097A2; AU725439B2; DE69835424D1; BR9808226A; CN1283315C; CN1250380A; ES2270508T3; WO1998040097A3; NZ337702A

Description

Gebiet der Erfindung: Die vorliegende Erfindung betrifft ein bovines respiratorisches Coronavirus, das in einer modifizierten Lebendform, einer deaktivierten Form oder einer Untereinheitsform verwendet werden kann, um eine Vakzine herzustellen, die vor Erkrankungen schützt, die durch bovines respiratorisches Coronavirus (BRCV) und bovines enterales Coronavirus (BECV) verursacht werden. Die Erfindung betrifft auch ein bovines enterales Coronavirus, das in einer modifizierten Lebendform, einer deaktivierten Form oder einer Untereinheitsform verwendet werden kann, um eine Vakzine herzustellen, die vor Erkrankungen schützt, die entweder durch bovines respiratorisches Coronavirus oder bovines enterales Coronavirus verursacht werden, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Vakzinen.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik: Das Ausbrechen von Atemwegserkrankungen in geimpften Tierherden wart die Frage auf, ob es noch andere Viren oder Bakterien gibt, die an der Auslösung von bovinem respiratorischem Krankheitskomplex (Läusefleckfieber) beteiligt sind. Die primären Ursachen für diesen Krankheitskomplex wurden in Form von vier Viren identifiziert: infektiöses bovines Rhinotracheitisvirus (IBRV), Parainfluenzavirus Typ 3 (Pl₃), Virus der bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) und bovines respiratorisches Synzytialvirus (BRSV). Um gegen den Krankheitskomplex zu schützen, wurden auf dem Gebiet der Erfindung Impfprogramme eingesetzt, die die Verwendung von Vakzinen für alle diese Viren entweder in einzelner Form (einwertig) oder in kombinierter Form (zweiwertig, wenn zwei beliebige dieser Viren in einer Vakzine enthalten sind, oder mehrwertig, wenn mehr als zwei Viren in einer Vakzine enthalten sind) umfassen. In der Vergangenheit schienen diese Vakzinen wirksam zu sein. Die Kontrolle über bovinen respiratorischen Krankheitskomplex mit diesen Vakzinen wurde jedoch erst jüngst aufgrund von ausbrechenden Atemwegserkrankungen unter geimpften Tierherden, die die Möglichkeit von anderen beteiligten Viren oder Bakterien aufzeigen, in Frage gestellt.
Ein bovines Coronavirus wurde bereits im Jahr 1984 von McNulty et al. (Vet. Micro. 9, 425-434 (1984)) aus dem Atemtrakt von Kälbern mit Atemwegssymptomen isoliert. Seit damals gibt es eine heftige Kontroverse darum, ob aus dem Atemtrakt von Rin dern (BRCV) isolierte Coronaviren die Verursacher des Krankheitsausbruchs in Viehherden, die mit gängigen bovinen Atemwegsvakzinen geimpft wurden, sind. Ist dies der Fall, so gibt es ebenfalls eine Kontroverse darum, ob BRCV dasselbe ist wie Coronaviren, die aus dem Darmtrakt von Rindern isoliert werden (BECV).
BECV, welches das erste Mal in den 1970ern von Mebus et al. (Am. J. Vet. Res. 34, 145-150 (1973)) isoliert wurde, ist heute durchwegs als wichtige Ursache für Diarrhöe bei neugeborenen Kälbern anerkannt. Es wurde auch als mit Winterdiarrhöe beim erwachsenen Vieh in Zusammenhang stehend erkannt. Zur Vermehrung von BECV wurden auf dem Gebiet der Erfindung zahlreiche Zelltypen, einschließlich primärer Zellen (Trachealorgan- und Darmkultur), und mehrere Zelllinien verwendet. Beispiele für die Zelllinien umfassen: menschliche Rektaltumorzellen (ATCC-Bezeichnung HRT-18), Vero-Zellen, Madin Darby Bovine Kidney-(MDBK-) Zellen und Madin Darby Canine Kidney-1-(MDCK1-) Zellen. Der Zusatz von exogenem Trypsin verstärkt oder fördert das Wachstum von BECV in diesen und in zahlreichen anderen Zelllinien. BECV-Vermehrung in frühen Passagen dieser Zellkulturen erfolgt typischerweise ohne das Auftreten eines erkennbaren zytopathischen Effekts (CPE). Spätere Passagen führen zu einem ausgeprägten CPE, der durch Synzytienbildung und Zellablösung gekennzeichnet ist.
Eine Vakzine, die den Anspruch erhebt, Kälber gegen Darmerkrankungen, die durch BECV verursacht werden, zu schützen, wurde bereits hergestellt und ist erhältlich. Sie wird dem Muttertier vor dem Kalben verabreicht. Das Schutzvermögen der Vakzine wurde in Frage gestellt, da sie auf passiver Immunisierung beruht (Myers & Snodgrass, J. Am. Vet. Med. Assoc. 181, 486-488 (1982), und Mostl & Burki, J. Vet. Med. 35, 186-196 (1988)). Die Immunisierung von Kälbern durch Verabreichung modifizierter Lebend-BECV auf oralem Weg schützte in Laborversuchen Kälber, die kein Kolostrum erhielten, erwies sich jedoch in Feldversuchen nicht als wirksam (Thurber et al., Can. J. Comp. Med. 41, 131-136 (1977)).
Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, dass das zunehmende Auftreten von Atemwegserkrankungen in Viehkoppeln, von Winterdysenterie bei erwachsenen Milchkühen und Schlachtvieh sowie von Diarrhöe bei neugeborenen Kälbern, wahrscheinlich durch BRCV und BECV verursacht, darauf hinweist, dass ein Bedarf an einer Lösung für dieses Krankheitsproblem besteht. Innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft gibt es eine Diskussion darüber, ob BRCV und BECV Varianten ein und desselben Virus sind. Dr. Johannes Storz, der anerkannte führende Forscher auf diesem Gebiet, veröffentlichte vor kurzem, dass es in vitro und in vivo signifikante Unterschiede zwischen BRCV und BECV gibt, dass sie aufgrund dieser Unterschiede eindeutig unterschiedliche Viren sind und dass daher nicht erwartet werden kann, dass sie gegenseitig Schutz bieten (Storz, JAVMA 208(9), 1452-1455 (1996)). Diese signifikanten Unterschiede zwischen BRCV und BECV sind: 1) BRCV kann leicht aus Feldproben bei einer ersten Passage ohne die Hilfe von Trypsin unter Verwendung einer klonierten menschlichen Rektaltumor- (cHRT-) Zelllinie isoliert werden, und BRCV-Isolate, die auf diese Weise vermehrt wurden, zeigen eine deutliche und verstärkte Zellfusionszytopathologie; im Gegensatz dazu können Isolierungen von Wildtyp-BECV typischerweise nicht ohne mehrere Passagen oder Trypsinunterstützung oder beides vorgenommen werden und zeigen keine Zellfusionszytopathologie; 2) BRCV- und BECV-Isolate weisen unterschiedliche In-vitro-Hämagglutinierungsmuster auf, wobei BECV Nagetier- und Hühner-Erythrozyten (RBCs) hämagglutiniert, während BRCV nur hämagglutinierte Nagetier-Erythrozyten isoliert; 3) BECV ist eine Hauptursache für virale Diarrhöe bei jungen Kälbern, während BRCV aus einem hohen Prozentsatz von Rindern, die Atemwegssymptome wie Husten, Dyspnoe, Nasenausfluss und erhöhte Körpertemperatur aufwiesen, isoliert wurde. Aufgrund solcher Unterschiede führt Storz' Lehre von der Verwendung einer BRCV-Vakzine zum Schutz vor Erkrankungen, die sowohl durch BRCV als auch durch BECV verursacht werden, oder von der Verwendung einer BECV-Vakzine zum Schutz vor Erkrankungen, die entweder durch BECV oder BRCV verursacht werden, offenbar weg.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte cHRT-Zelllinie und Verfahren zur Verwendung derselben zur Vermehrung von BRCV oder BECV auf höhere Titer, um eine stark antigene Masse zu erzeugen, die bei der Produktion einer kommerziell nutzbaren Vakzine nützlich ist. Unter der Bezeichnung "stark antigene Masse" wird eine immunogen wirksame Menge eines Virus oder eines Antigens, das aus dem Virus stammt, verstanden, die zur Immunisierung von Rindern nützlich ist, um Schutz vor Erkrankungen zu bieten, die durch BRCV oder BECV ausgelöst werden. Unter der Bezeichnung "kommerziell nutzbar" wird verstanden, dass die Vakzine kosteneffizient produziert werden kann. Eine kommerziell nutzbare Vakzine sollte beispielsweise keine mit untragbaren Kosten verbundenen Konzentrationen der antigenen Masse erfordern, um eine wirksame antigene Masse für Vakzinen zu erhalten. Eine solche cHRT-Zelllinie, nämlich HRT-18G, wurde von Dr. Storz bei der American Type Culture Collection hinterlegt und bekam die Zugriffsnummer CRL 11663 zugeteilt. Eine zweite, wirksamere cHRT-Zelllinie wurde von den Erfindern entwickelt und als HRT-E6 bezeichnet. Diese Zelllinie wurde am 6. April 1998 unter der Zugriffsnummer CRL 12478 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Isolieren der verbesserten (klonierten), als HRT-E6 bezeichneten cHRT-Zelllinie. Das Klonierungsverfahren lieferte in selektiver Weise eine cHRT-Zelle, die BRCV auf höhere Titer vermehrt, als sie mit der Ausgangszelle mit der ATCC-Bezeichnung CCL 244 oder mit den HRT-18G-Zellen nach dem Stand der Technik erzielt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Vermehrung der BRCV- oder BECV-Viren auf einen hohen Titer, was eine stark antigene Masse erzeugt, in einer cHRT-Zelllinie wie z.B. der HRT-E6, sodass eine kommerziell nutzbare Vakzine hergestellt werden kann.
Es wurde erkannt, dass sowohl eine deaktivierte, mit Adjuvans versehene Vakzine als auch eine modifizierte Lebend-BRCV-Vakzine eine neutralisierende Antikörperantwort in davor seronegativen Kälbern in signifikantem Ausmaß stimulierten, um eine geeignete immunologische Aktivität bereitzustellen, die Schutz und eine immunogen wirksame Menge anzeigt. Auch wird in Betracht gezogen, dass Immunisierung von Kälbern mit Coronavirus respiratorische und enterale Coronaviruserkrankungen nach intranasalem Challenge mit einem virulenten BRCV reduzieren würde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben erläutert betrifft die vorliegende Erfindung eine modifizierte Lebend-, eine deaktivierte oder eine Untereinheitsform einer Vakzine oder einer Kombination davon zum Schutz von Rindern gegen Erkrankungen, die durch BRCV oder BECV ausgelöst werden, umfassend eine immunogen wirksame Menge eines oder mehrerer BRCV- oder BECV-Isolate oder Antigene davon. Das/Die BRCV- oder BECV-Isolat(e) kann/können durch Beimpfen anfälliger Zellkulturen mit Proben aus einem erkrankten Tier, wie z.B. einem Kalb, erhalten werden. Eine Untereinheit kann durch Extraktion aus dem Virus oder mittels Expression in Form einer Rekombinante von einem Nicht-BRCV- oder Nicht-BECV-Organismus erhalten werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Immunisierung von Rindern, um sie gegen durch BRCV oder BECV ausgelöste Erkrankungen zu schützen, umfassend eine immunogen wirksame Menge von BECV oder BRCV-Isolat(en) oder Antigenen davon. Das/Die BECV- oder BRCV-Isolat(e) oder seine Antigene können in Form eines modifizierten Lebendvirus, eines deaktivierten Virus oder einer Untereinheit vorliegen, worin die Untereinheit durch Extraktion aus dem Virus oder mittels Expression in Form einer Rekombinante von einem Nicht-BECV- oder Nicht-BRCV-Organismus erhalten werden. Kombinationen beliebiger der obigen Merkmale sowie Zusätze eines Adjuvans und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Das Virus wird in einer hochempfindlichen Zelllinie, wie z.B. einer cHRT-Zelllinie, vermehrt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine verbesserte, klonierte menschliche Rektaltumorzelle, HRT-E6, die als ATCC CRL 12478 bezeichnet wurde. Die Verbesserung umfasst eine wesentlich wirksamere Vermehrung von BRCV- und BECV-Viren auf diesen Zelllinien als entweder ihre Ausgangszelle CCL 244 oder eine andere cHRT-Zelle, HRT-18G. Diese verbesserte cHRT-Zelle, die hierin als HRT-E6 bezeichnet wird, kann unter Anwendung von fachbekannten Grenzwert-Verdünnungsverfahren in 96-Well-Gewebekulturplatten gebildet werden. Diese Verfahren umfassen das Züchten von CCL-244-Zellen in einem Gefäß, wie z.B. einer Rollflasche, das Entfernen der Zellen mittels fachbekannter Trypsinbehandlung (unter Verwendung einer Trypsin-EDTA-Lösung, die 0,05 % bis 0,25 % Trypsin in Kombination mit 0,04 % EDTA enthält), das Zählen der lebensfähigen Zellen, die aus dem Gefäß entfernt wurden, und das Herstellen von 10fach- oder anderen, gleichermaßen brauchbaren Verdünnungen der Zellen in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) oder Minimal Essential Medium (MEM) plus Serum, vorzugsweise fötales bovines Serum oder Pferdeserum, sodass ein großer Anteil der Wells in der 96-Well-Platte theoretisch nur eine Zelle enthalten. Die Zellen werden mittels Mikroskop betrachtet, um zu bestimmen, welche Wells tatsächlich eine einzige Zelle enthalten. Sobald die Wells, die anfänglich nur eine einzelne Zelle enthielten, konfluent werden, werden die Zellen in jedem Well mittels fachbekannter Trypsinierungsverfahren entfernt und Passagen unterzogen, bis ein großes Volumen an Zellen erhalten wird. Jedes große Volumen an Zellen, die von einer einzigen Zelle abstammen, wird als Klon definiert und bekommt eine eigene Nummer zugeteilt. Jeder Klon wird mittels Beimpfung mit BRCV- oder BECV-Isolaten und Selektieren jener mit hohen Titern auf hohe Empfindlichkeit gegenüber BRCV und BECV getestet. Beispielsweise vermehrt eine empfindliche Zelle BRCV oder BECV in Mengen, die ausreichen, um einen zytopathischen Effekt (CPE) hervorzurufen. Die empfindlicheren Klone vermehren BRCV oder BECV auf Titer von 10^3,0 Gewebekultur-infektiösen Dosiseinheiten (TCID₅₀/ml). Die empfindlichsten Klone, die hierin als hochempfindliche Zellen kategorisiert werden, vermehren BRCV und BECV in Mengen von 10^5,0 TCID₅₀/ml. Als solche werden die empfindlichsten Klone nacheinander Passagen unterzogen, um letztendlich eine hochempfindliche Zelllinie zu bilden, die leicht zur Vermehrung von BRCV und BECV verwendet werden kann, um eine kommerziell nutzbare Vakzine bereitzustellen, während die empfindlicheren Klone leicht zur Vermehrung und Isolierung von BRCV oder BECV zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden können.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von BRCV oder BECV zu einer stark antigenen Masse, die eine immunologisch wirksame Menge an BRCV, BECV oder Antigenen davon ergibt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (1) Vermehren einer hochempfindlichen Zelle an einer Gefäßoberfläche oder in Suspension in Gegenwart eines Gewebekulturmediums, um die Zellen in einer annehmbaren Lebendzellzahl, die zumindest 1 × 10⁵/ml beträgt, wirksam zu produzieren; (2) Beimpfen der hochempfindlichen Zelle mit BRCV oder BECV, um eine infizierte Zellkultur zu erzeugen; (3) Inkubieren der infizierten Zellkultur bei 30 bis 38 °C, bis ein annehmbarer CPE hervorgerufen wird, vorzugsweise bei zwischen 35 und 37 °C; (4) Ernten der resultierenden infizierten Zellkultur mittels Transfer in einen Sammelbehälter; (5) gegebenenfalls Zerstören der übrigen ganzen Zellen in der geernteten infizierten Zellkultur durch Verfahren, die Mikrofluidisieren, Gefrieren-Auftauen und Beschallung umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind; und (6) gegebenenfalls Konzentrieren der infizierten Zellkultur zu einer hochantigenen Masse. Der Konzentrationsschritt kann auf fachbekannte weise durchgeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Ultrafiltration, Zentrifugation, Ausfällung oder Chromatographie. Auch wenn jegliche hochempfindliche Zelle verwendet werden kann, um das BRCV und BECV zu vermehren, erfolgt vorzugsweise eine Verwendung von cHRT-Zellen, noch bevorzugter von HRT-E6, bezeichnet als ATCC CRL 12478. Es folgt eine spezifischere, jedoch nicht einschränkende Beschreibung eines Vermehrungsverfahrens. Die cHRT-Zellen, wie z.B. HRT-E6, werden in einem Gefäß, wie z.B. einer Rollflasche, oder auf Mikroträgern in einem Bioreaktor in einem Gewebekulturmedium, wie z.B. Dulbecco's Minimal Essential Medium, ergänzt mit einem Serum, wie z.B. 1- bis 10%igem bovinem Serum oder Donor-Pferdeserum, und einem geeigneten Puffersystem, wie z.B. 1,3 g/l Natriumbicarbonat, gezüchtet. Zellpassagen erfolgen mit Zellzahlen, die ausreichen, um die erwünschte Konfluenz oder Zelldichte der Zellen an der Oberfläche des Gefäßes oder der Mikroträger oder in Suspension innerhalb von 24-48 Stunden zu erzielen. Von konfluenten Monolayers, suspendierten Zellen oder Mikroträgern wird das Wachstumsmedium entfernt, und sie werden anschließend mit BRCV oder BECV beimpft, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von zwischen 0,001 und 0,1, vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,1, zu erzeugen. Die resultierenden Viren können zuerst auf die Monolayers adsorbiert oder mit Zellen in Suspension kombiniert werden, und anschließend kann das Erhaltungsmedium zugesetzt werden. Das Erhaltungsmedium ist im Wesentlichen dasselbe wie das oben beschriebene Zellwachstumsmedium, außer dass eine verringerte Menge an Serum zugesetzt wird. Die resultierenden virusinfizierten Gewebekulturen werden bei zwischen 30 und 38 °C, vorzugsweise zwischen etwa 35 und 37 °C, inkubiert, bis vollständiger CPE beobachtet wird. Typischerweise wird vollständiger CPE zwischen 1 und 7 Tagen nach der Infektion, vorzugsweise zwischen 2 und 4 Tagen nach der Infektion, beobachtet. Die virusinfizierten Gewebekulturen, die einen annehmbaren CPE aufweisen, werden in einem einzigen Behälter gesammelt (geerntet), wodurch Erntelösungen erzeugt werden. Ein annehmbarer CPE für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist bei zumindest 50 % Zerstörung der Zellschicht gegeben.
Die Erntelösungen können mit einem beliebigen mehrerer Deaktivierungsmittel deaktiviert werden, um die deaktivierte Form der Vakzine herzustellen. Veranschaulichende, nicht jedoch einschränkende Beispiele zur Attenuierung können mehrfache Passagen in Gewebekultur und Behandlung mit mutagenen Mitteln umfassen, um eine Mutante zu selektieren, die nicht in der Lage ist, Krankheit auszulösen, wenn sie jungen Kälbern intranasal injiziert wird. Darüber hinaus kann Lebendernte ohne Erzeugung von Mutationen durch Verabreichung der daraus hergestellten Vakzine auf atypischem Weg, einschließlich intramuskulärer, subkutaner oder intradermaler Verabreichung, verwendet werden.
Bei der Herstellung einer Untereinheitsvakzine wird BRCV oder BECV wie zuvor beschrieben gezüchtet, und die Virusernte wird mittels eines beliebigen von mehreren Mitteln, einschließlich, wenn auch nicht ausschließlich, Detergenzien und organischer Lösungsmittel, extrahiert. Extrakte können in extrahierter Form verwendet werden oder können durch Ultrafiltration und/oder Säulenchromatographie weiter gereinigt und anschließend zur Formulierung zu einer Vakzine mit einem Adjuvans kombiniert werden. Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren umfasst das Infizieren von cHRT-Zellen mit BRCV gemäß dem bereits vorher beschriebenen Verfahren. Die infizierten Zellen werden dann geerntet, sobald der CPE >80 % erreicht hat. Geerntete infizierte Zellen werden mittels Zentrifugation bei niedriger Drehzahl von der Flüssigkeit getrennt, und die gewonnenen Pellets werden durch Zusatz eines Detergens in einem Puffersystem extrahiert. Das Puffer-Detergens-System besteht aus phos phatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder einem beliebigen anderen Puffer, der für Gewebekulturzellen nicht toxisch ist, plus 1,0 bis 10,0 % Detergens wie z.B. IGEPAL CA-360, das von der Sigma Chemical Company erhältlich ist. Vorzugsweise werden 1,0 bis 2,0 % Detergenzien, ausgewählt aus der aus IGEPAL CA-360, Triton-X-100 (erhältlich von der Sigma Chemical Company) und Natriumdodecylsulfat (ebenfalls von der Sigma Chemical Company erhältlich) bestehenden Gruppe, eingesetzt. Organische Lösungsmittel werden in denselben Konzentrationen eingesetzt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Alkohole, Ester oder Ether. Jegliches Puffersystem kann verwendet werden, solange es für Gewebekulturzellen nicht toxisch ist. Andere geeignete Puffer umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf andere Salze, wie z.B. Sulfate und Carbonate, und organische Puffer wie Tris[hydroxymethyl]-aminomethan (TRIS), N,N'-Bis[2-ethansulfonsäure], 1,4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), die alle von der Sigma Chemical Company erhältlich sind. Dieses Puffer-Detergens-System wird verwendet, um das Zellpellet zu resuspendieren, und die Extraktion erfolgt durch Vermischen des suspendierten infizierten Zellpellets bei einer kontrollierten Temperatur zwischen 4 °C und 37 °C, vorzugsweise zwischen 4 °C und 10 °C, bis das Zellpellet einheitlich solubilisiert ist (im Allgemeinen zwischen 30 und 120 min lang). Nach dieser Extraktion wird jegliches lösliches Material durch Zentrifugation bei niedriger Drehzahl (im Chargen- oder kontinuierlichen Betrieb) entfernt und kann wie zuvor beschrieben neuerlich extrahiert werden. Solubilisierte Extrakte werden dann vereinigt und mittels Säulenchromatographie (Größenausschluss, Lectin- oder andere Affinität, Anionen/Kationen-Austausch und/oder Umkehrphase) gereinigt, bevor Adjuvanzien zugesetzt werden, oder die Extrakte werden direkt mit Adjuvanzien versetzt. Die antigene Masse wird durch fachbekannter Verfahren, wie z.B. enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), HPLC, FPLC oder Elektrophorese, vor Zusatz der Adjuvanzien gemessen. Ist die antigene Masse ausreichend stark, so kann der Extrakt oder gereinigte Extrakt in PBS verdünnt werden. Ist die antigene Masse zu schwach, um immunogen wirksam zu sein, so kann der Extrakt oder gereinigte Extrakt unter Verwendung von Ultrafiltration, Zentrifugation oder anderen derartigen Konzentrationsverfahren aufkonzentriert werden. Der Zusatz von Adjuvanzien kann unter Verwendung eines beliebigen der nachstehend beschriebenen Adjuvanzien durchgeführt werden.
Adjuvanzien können mit den deaktivierten oder modifizierten Lebend-Erntelösungen oder mit Untereinheits- oder rekombinanten Antigenen, die von BRCV oder BECV abgeleitet wurden, zur Herstellung einer Vakzine verwendet werden. Wird zur Herstellung einer Vakzine ein Adjuvans verwendet, so versteht es sich, dass jegliches Adjuvans zugesetzt werden kann, um die Wirksamkeit der Vakzine zu erhöhen. Solche Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Polymere oder Block-Copolymere einschließlich Carbopol^®, DEAE-Dextran, Dextransulfat, Methacrylate und POLYGEN^TM; IMMUGEN^TM; Aluminiumsalze, wie z.B. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat; Avridine; Lipid A; Dimethyldodecylammoniumbromid; Pockenvirusproteine, wie z.B. Baypamune; Öle, wie z.B. SUPRIMM^TM, EMULSIGEN^TM, EMULSIGEN PLUS^TM; Tieröle, wie z.B. Squalen; Mineralöle, wie z.B. Drakeol und Montanides; Pflanzenöle, wie z.B. Erdnussöl; Triterpenoidglykoside, wie z.B. Saponin, QuilA und QS21; Detergenzien, wie z.B. Tween-80 und Pluronics; Bakterienkomponenten-Adjuvanzien, wie z.B. aus Corynebacterium, Propionibacterium und Mycobacterium; Interleukine, Monokine und Interferone; Liposome, ISCOMs; synthetische Glykopeptide, wie z.B. Muramyldipeptide und Derivate davon; Choleratoxin; oder Kombinationen davon.
Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Vermehrung eines BRCV durch Züchten des Virus in einer Gewebekultur bis zu einer Menge, die ausreicht, um Rinder gegen durch BRCV oder BECV ausgelöste Erkrankungen zu schützen oder um die Molekülstruktur von BRCV oder BECV zur Herstellung von Untereinheits- oder Rekombinationsprodukten zu identifizieren, wobei die Herstellung das Inokulieren von BRCV auf eine Gewebekultur, die eine klonierte menschliche Rektalzelle (cHRT), vorzugsweise HRT-E6, bezeichnet als ATCC CRL 12478, ist, sowie das Ernten des gezüchteten Virus umfasst.
Diese Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Vermehrung eines BECV durch Züchten des Virus in einer Gewebekultur bis zu einer Menge, die ausreicht, um Rin der gegen durch BECV oder BRCV ausgelöste Erkrankungen zu schützen oder um die Molekülstruktur von BECV oder BRCV zur Herstellung von Untereinheits- oder Rekombinationsprodukten zu identifizieren, wobei die Herstellung das Inokulieren von BECV auf eine Gewebekultur, die eine klonierte menschliche Rektalzelle (cHRT), vorzugsweise HRT-E6, bezeichnet als ATCC CRL 12478, ist, und das Ernten des gezüchteten Virus umfasst.
Gemäß der Erfindung kann ein weitgehend kreuzreaktives BRCV- oder BECV-Isolat für hierin beschriebene Vakzinenpräparate verwendet werden. Derartige Kreuzreaktivität kann durch In-vitro-Studien zu Kreuzneutralisation (siehe beispielsweise Beispiel 5) demonstriert werden. Nähere und spezifischere Details der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele dargestellt, ohne dieselbe dadurch einzuschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Klonieren von HRT-Zellen zur Produktion von cHRT-Zellen
Menschliche Adenokarzinomzellen, die von der ATCC erhalten wurden (bezeichnet als CCL 244), wurden zur Produktion von cHRT-Zellen wie folgt verwendet. Die erhaltenen Zellen wurden anfänglich in RMPI 1640 mit zugesetzten 10 % Pferdeserum oder in DME oder MEM mit 5-10 % fötalem bovinem Serum (FBS) ausgepflanzt und darin aufrechterhalten. Alle Studien wurden unter Verwendung von DME oder MEM mit FBS durchgeführt.
Die Klone von CCL 244 wurden unter Verwendung von standardmäßigen Grenzwert-Verdünnungsverfahren in 96-Well-Gewebekulturplatten erhalten. Dieses Verfahren umfasste das Entfernen der HRT-18-Zellen aus einem Gefäß, in dem sich die Zellen durch den Zusatz von Trypsin/EDTA-Lösung, die 0,1 % Trypsin und 0,04 % EDTA enthielt, vermehrten, das Zählen der lebensfähigen Zellen und Herstellen von Zehnfach-Verdünnungen der Zellen in DME oder MEM plus 10 % FBS, sodass theoretisch ein großer Anteil der Wells der 96-Well-Platte nur eine Zelle aufwies. Die Wells wur den mikroskopisch untersucht, um zu bestimmen, welche Wells tatsächlich nur einen einzigen Zellursprung aufwiesen. Zahlreiche Wells zeigten einen kleinen Zellcluster, doch fünf Wells wurden ausgewählt, da sie anscheinend einer einzigen Zelle entsprungen waren. Nach 10 Tagen Wachstum/Aufrechterhaltung wurde ein Well (Klon) für weiteres Klonieren in einer 96-Well-Platte trypsiniert. Dasselbe Klonierverfahren wurde wiederholt. Beim zweiten Klonierdurchgang schienen sich drei Klone jeweils aus einer einzigen Zelle zu entwickeln, und der Klon in Well E6 wurde als derjenige ausgewählt, der in darauf folgenden Versuchen expandiert und verwendet werden sollte. Dieser Klon wurde als HRT-E6 bezeichnet. Die vier verbleibenden Klone wurden aufrechterhalten, bis eine gewisse Sicherheit darüber herrschte, dass E6 für zumindest manche zusätzliche Studien und die Entwicklung zu einer stabilen Zelllinie mittels fachbekannter Verfahren annehmbar war.
Es wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, ob die CCL-244-Ausgangszellen und HRT-E6-Zellen gegenüber ausgewählten bovinen Viren empfindlich waren. Die Viren umfassten bovines respiratorisches Synzytialvirus (BRSV-Stamm 375), Virus der bovinen Virusdiarrhöe (BVDV-NADL-Stamm), bovines Herpesvirus Typ I (BHV-1-Cooper-Stamm), bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (Pl₃-Stamm SF-4) und BRCV (Stamm RA2R7). Frische Monolayers von CCL-244- und HRT-E6-Zellen wurden mit den Viren beimpft, und Adsorption erfolgt 30-60 Minuten lang in serumfreiem Medium. Dieses Medium wurde entfernt und verworfen, und Erhaltungsmedium, das 2 % FBS enthielt, wurde zugesetzt. Die Kulturen wurden 5-7 Tage lang täglich beobachtet, und sofern kein CPE ersichtlich war, wurden Kulturlösungen entweder direkt auf frische Zellen (CCL 244 und HRT-E6) übergeführt oder bei –70 °C tiefgefroren und dann auf die Zellmonolayers übertragen. Drei solcher Blindpassagen wurden für jedes Virus, das keinen CPE zeigte, durchgeführt. Die Resultate für das Wachstum der verschiedenen Viren auf HRT-18G-Zellen wurden der Veröffentlichung von Storz (JAVMA 208(9), 1452-1455 (1996)) entnommen. Die Resultate sind nachstehend in Tabelle 1 angeführt. CCL-244-, HRT-E6- und HRT-18G-Zellen waren bei der ersten Passage gegenüber BRCV empfindlich. Storz berichtet, dass seine HRT-18G-Zellen gegenüber BHV-1 empfindlich waren. BHV-1 zeigte bis zu einem späten Zeitpunkt in der Inkubationsphase der zweiten Passage auf die HRT-E6-Zellen dieser Erfindung keinen CPE. Dieser Versuch zeigt, dass sich die HRT-E6-Zellen phänotypisch von HRT-18G-Zellen und den CCL-244-Ausgangszellen unterscheiden.
Tabelle 1 Virusempfindlichkeit von CCL-244- und HRT-E6-Zellen im Vergleich mit dem von Dr. Storz berichteten Wachstum an HRT-18G
Beispiel 2
Einzigartigkeit von cHRT-Zellen im Vergleich mit der CCL-244-Ausgangszelle
Um die Einzigartigkeit der Klone der CCL-244-Zellen (cHRT), die HRT-E6 umfassen, zu charakterisieren, wurde ein Versuch durchgeführt, um die BRCV-Wachstumseigenschaften der Zellen im Vergleich mit jenen mehrerer anderer Zellen, die in der Lage sind, bovine Viren zu vermehren, zu bewerten. BRCV-Isolat RA2R7, das von einem Kalb aus South Dakota, das eine Atemwegserkrankung aufwies, erhalten wurde, wurde auf Zelllinien, einschließlich Madin Darby Bovine Kidney-Zellen (MDBK), Schweinehodenzellen (ST), feliner Lungenzellen (FL), Bayer-9009-Zellen und HRT-E6-Zellen inokuliert. Das BRCV-Isolat und/oder seine Subkulturlösungen wurden 60 min lang in serumfreiem Medium adsorbiert. War kein CPE eindeutig feststellbar, so wurden die Kulturen entweder direkt auf frische Zellen übertragen oder eingefroren und anschließend auf die verschiedenen Zellmonolayers übertragen. Fünf Passagen wurden mit jeder Zelllinie durchgeführt. Außer HRT-E6 zeigten keine der Zellen zu irgendeinem Zeitpunkt während des Versuchs CPE. Daher sind cHRT-Zellen einzigartig.
Beispiel 3
Einzigartigkeit von cHRT-Zellen im Vergleich mit der CCL-244-Ausgangszelle
Um die Einzigartigkeit der cHRT-Zellen einschließlich HRT-E6 und HRT-18G gegenüber den CCL-244-Ausgangszellen näher darzustellen, wurde der folgende Versuch durchgeführt. Zwei BRCV-Isolate, RA2R7 und AZ26649, isoliert aus einem Kalb aus Arizona, das eine Atemwegserkrankung aufwies, und ein BECV-Isolat, bezeichnet als 50-3 (erhalten von Dr. Johannes Storz), wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet. Jedes wurde dann entweder auf CCL-244-Zellen, HRT-E6-Zellen oder HRT-18G-Zellen titriert. Titrationen wurden in 96-Well-Platten unter Verwendung von frischen Monolayers von jeder der Zellen gemäß fachbekannten Verfahren durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 2 als Titer, angegeben als log₁₀ TCID₅₀/ml, aufgelistet.
Tabelle 2 Titer von BRCV und BECV auf cHRT-Zellen im Vergleich mit ihren Titern an den CCL-244-Ausgangszellen
Es ist eindeutig, dass die cHRT-Zellen BRCV-Isolate auf signifikant höhere Titer vermehren als die CCL-244-Ausgangszellen. Es ist bemerkenswert, dass alle drei Zellen das BECV-Isolat 50-3 auf etwa dieselben Titerniveaus vermehrten. Bei der Vermehrung von BRCV für kommerzielle Vakzinen ist es wichtig, die höchstmöglichen Titer zu erzielen. Daher sind die cHRT-Zellen für die Vermehrung von BRCV kommerziell nutzbar, während die CCL-244-Zellen dies nicht sind.
Beispiel 4
Bestätigung des Unterschiedes zwischen BRCV- und BECV-Isolaten
Ein Vergleich wurde zwischen den verschiedenen in Beispiel 3 erwähnten Isolaten und anderen Isolaten, die in diesem Zusammenhang beschrieben wurden, angestellt, um zu überprüfen, ob sie tatsächlich BRCV-Isolate waren. Gemäß Storz (JAVMA 208(9), 1452-1455 (1996)) hämagglutiniert BRCV Maus-RBCs und hämagglutiniert Hühner-RBCs nicht. In diesem Versuch wurden die Isolate RA2R7, AZ26649, LSU-051 (BRCV-Isolat, erhalten von Dr. Storz), 6J305 (BRCV-Isolat, erhalten von Imm-Tech) und 50-3 bezüglich Hämagglutinierungsaktivität (HA) gegen sowohl Maus- als auch Hühner-RBCs bewertet. Virus-Pools von jedem dieser Isolate wurden gemäß Standard-Hämagglutinierungsverfahren unter Verwendung von 0,5 % Maus- oder Hühner-RBCs getestet. Die Resultate sind als Kehrwert der stärksten Verdünnung angegeben, die zu Hämagglutinierung führt, (HA-Titer) und sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Aus den Resultaten ging eindeutig hervor, dass die BRCV-Isolate RA2R7, AZ26649, LSU051 und 6J305 Maus-RBCs hämagglutinieren und Hühner-RBCs nicht und sich daher vom bekannten BECV-Isolat 50-3 unterscheiden, das Maus-RBCs auf viel höhere Titer hämagglutiniert und auch eine gewisse Hämagglutinierung der Hühner-RBCs zeigt.
Tabelle 3 Hämagglutinierungstiter von BRCV- und BECV-Isolaten
Beispiel 5
Kreuzneutralisation von BRCV- und BECV-Isolaten
Auch wenn Beispiel 4 zeigte, dass sich BRCV- und BECV-Isolate darin unterscheiden, dass sie verschiedene HA-Muster zeigen, ist es wichtig, den antigene Verwandtschaft für die Zwecke der Vakzinenentwicklung aufzuzeigen. Daher wurde ein Kreuzneutralisationsversuch durchgeführt. Drei BRCV-Feldisolate wurden auf Kreuzneutralisation bewertet. BRCV-CA wurde aus einem Kalb von einer kalifornischen Viehkoppel isoliert. BRCV-TX wurde aus einem Schlachtkalb von einer texanischen Viehkoppel isoliert, und BRCV-OK wurde aus einem Schlachtkalb aus Oklahoma isoliert. BECV 50-3 wurde wiederum als das bekannte BECV-Isolat eingesetzt. Zwei Kaninchen wurden wiederholt gereinigte Viruspräparate (Untereinheiten) in Adjuvans, hergestellt aus jedem der Isolate, injiziert. Nach der letzten Injektion wurde den Kaninchen Blut abgenommen, und die Seren wurden gesammelt. Die gesammelten Seren wurden auf ihre Fähigkeit bewertet, BRCV- und BECV-Isolate in einem In-vitro-Zellkulturtest zu neutralisieren.
Alle Virusisolate wurden mittels Ultrazentrifugation in einem 20-60%igen linearen Saccharosegradienten gereinigt. Gereinigtes Virus wurde in einer Konzentration von 20-50 μg pro Dosis Gesamtprotein mit Freundschem komplettem Adjuvans (FCA) für die primären Kanincheninjektionen und mit Freundschem inkomplettem Adjuvans (FIA) für die darauf folgenden Boosterinjektionen kombiniert. Die Injektionen wurden intramuskulär in 21-Tagesintervallen verabreicht. Eine abschließende Blutabnahme zur Gewinnung von Serum erfolgte sieben Tage nach der letzten Injektion.
Kreuzneutralisationstests wurden durch Kombinieren von isolierten spezifischen Serumproben mit 100-300 TCID₅₀ jedes Virusisolats durchgeführt. Zweifach-Reihenverdünnungen von Serum wurden in 96-Well-Platten mit zwei Verdünnungsreihen pro Serumprobe hergestellt. 100 bis 300 TCID₅₀ Virus wurden zu allen Wells zugesetzt, und das Serum/Virus-Gemisch wurde eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden cHRT-Zellen zu allen Wells zugesetzt, und die Platten wurden bei 37 °C in einem feuchten Inkubator bei 5 % CO₂ 5-6 Tage lang inkubiert. Tabelle 4 ist eine Zusammenfassung der Resultate des In-vitro-Kreuzneutralisationstests. Die resultierende immunologische Aktivität ist durch Serumantikörpertiter, ausgedrückt als Kehrwert der stärksten Verdünnung von Serum, die das Virus vollständig neutralisierte, angegeben.
Die Resultate dieses Versuchs zeigten, dass in allen Fällen eine Antikörperantwort auf einzelne BRCV- oder BECV-Isolate alle der heterologen Isolate bis zu einem gewissen Grad neutralisieren konnte. Es gab eindeutige Unterschiede bezüglich der Kreuzneutralisation zwischen BRCV und BECV. In ähnlicher Weise scheint es Kreuzneutralisationsunterschiede auch unter den BRCV-Isolaten zu geben. Der gezeigte Unterschiedsgrad ist hier jedoch nicht groß genug, um BRCV und BECV als separate und unterschiedliche Serotypen zu klassifizieren.
Diese Daten zeigen eindeutig, dass eine Antikörperantwort auf ein BRCV- oder BECV-Isolat, das gemäß dieser Erfindung hergestellt wird, ausreichend kreuzneutralisierende Aktivität bereitstellt, um Challenges mit heterologen Isolaten zu neutralisieren. Insbesondere eine BRCV-basierte Vakzine ruft eine Antikörperantwort hervor, die einen Challenge mit BECV, einer ausgewählten Krankheitseinheit, wie oben gezeigt wurde, und anderen heterologen BRCV-Isolaten neutralisiert. Darüber hinaus wird erwartet, dass eine BECV-basierte Vakzine eine Antikörperantwort hervorrufen würde, die einen Challenge mit BRCV, einer ausgewählten Krankheitseinheit, wie ebenfalls oben gezeigt wurde, und anderen heterologen BECV-Isolaten neutralisieren würde. Tabelle 4 Kreuzneutralisations-Titer von BRCV- und BECV-Isolaten

a = Kehrwert der letzten Antikörperverdünnung, die das Virusisolat vollständig neutralisierte
b = Numerische Transformation des mittleren homologen Antikörper/Virus-Titers über dem jeweils mittleren heterologen Antikörper/Virus-Titer

Beispiel 6
Deaktivierte Vakzine von bovinem respiratorischem Coronavirus (BRCV)
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann eine antigene Masse von BRCV zu einer Vakzine formuliert werden, die eine immunogen wirksame Menge an Virus oder Antigenen davon enthält. Es folgt eine Beschreibung eines wirtschaftlich nutzbaren Verfahrens, durch das eine antigene Masse von BRCV hergestellt, deaktiviert und zu einer deaktivierten Vakzinenform formuliert wurde. Die Vakzine der Erfindung wurde intramuskulär verabreicht. Sie könnte jedoch auch subkutan oder, alter nativ dazu, intranasal, intradermal oder oral verabreicht werden. Zwischen einem und fünf Millilitern Vakzine können verabreicht werden.
BRCV-Isolat AZ26649 wurde in cHRT-Zellen wie oben beschrieben (HRT-18G) vermehrt. Diese Zellen wurden äußerst effizient kultiviert und in Wachstumsmedium, das aus DME, ergänzt mit 5 % fötalem bovinem oder Donor-Pferdeserum und einem geeigneten Puffersystem wie z.B. 1,3 g/l Natriumbicarbonat bestand, aufrechterhalten. Zellpassagen wurden mit ausreichenden Zellzahlen, um Konfluenz innerhalb von 24-48 Stunden zu erreichen, durchgeführt.
Konfluente Monolayers von cHRT-Zellen wurden mit BRCV in der folgenden Weise beimpft. Virusstammlösung wurde in serumfreiem DME verdünnt, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) eines infektiösen Viruspartikels pro 10 bis 100 (0,1 bis 0,01) cHRT-Zellen zu erreichen. Virusinfektion von cHRT-Zellen erfolgte durch Entfernen von verbrauchtem Wachstumsmedium, Ersetzen durch das verdünnte Virusinokulum in ausreichendem Volumen, um den Monolayer vollständig zu bedecken, und Adsorption bei 37 °C für 1 h. Nach der Adsorption wurde ein Erhaltungsmedium, das aus DME, ergänzt mit 2 % Fötalem Bovinem Serum (FBS) und einem geeigneten Puffersystem wie z.B. 1,3 g/l Natriumbicarbonat bestand, zugesetzt. Virusinfizierte Gewebekulturen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5,0 % CO₂ inkubiert, bis vollständiger CPE zu beobachten war. Der beobachtete CPE bestand aus rascher Zellaggregation und -fusion, gefolgt von Ablösung von Polykaryonen vom Substrat, was zu großen infizierten Zellaggregaten, suspendiert im Erhaltungsmedium führte. Typischerweise wurde vollständiger CPE beobachtet, und die Kulturen wurden 2-4 Tage nach der Infektion geerntet. Typischerweise lag der erhaltene TCID₅₀-Titer von BRCV im Bereich von 10^5,5 bis 10^8,0 TCID₅₀/ml Erntelösung.
Erntelösungen, die 10^6,67 TCID₅₀/ml BRCV enthielten, wurden mit 0,1 Vol.-% BPL unter Anwendung von Standardverfahren deaktiviert. Kurz zusammengefasst wurden Erntelösungen und BPL vereinigt und 24 h lang bei Umgebungstemperatur (etwa 25 °C) vermischt. Ein pH-Bereich von 6,8-7,2 wurde während der Deaktivierungsphase unter Verwendung von 3,0 N NaOH aufrechterhalten. Nicht einschränkende Beispie le für andere Deaktivierungsmittel oder -verfahren, die in Betracht gezogen werden, umfassen Formaldehyd, binäres Ethylenimin, Aussetzung gegenüber Hitze und UV-Licht.
Deaktiviertes BRCV wurde mit Carbopol^® (B.F. Goodrich Co.) als Adjuvans wie folgt versetzt. Ein Volumen an Stammlösungsadjuvans (1,5 % Carbopol^®) wurde mit einem Volumen an deaktiviertem Virus vereinigt, sodass eine endgültige Vakzinendosis 20 % Adjuvans (Vol./Vol.) enthielt. Mit Adjuvans versehene Lösungen wurden etwa 24 h lang bei Umgebungstemperatur (etwa 25 °C) vermischt. Nicht einschränkende Beispiele für andere geeignete Adjuvanzien, die in Betracht gezogen werden, umfassen: Aluminiumsalze, wie z.B. Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat; andere Polymere, wie z.B. POLYGEN^TM, DEAE-Dextran, Dextransulfat und Methacrylate; IMMUGEN^TM; Dimethyldodecylammoniumbromid; Pockenvirusproteine, wie z.B. Baypamune; Avridine, Lipid A; Öle, wie z.B. SUPRIMM^TM, EMULSIGEN^TM, EMULSIGEN PLUS^TM; Tieröle, wie z.B. Squalan oder Squalen; Mineralöle, wie z.B. Drakeol und Montanides; Pflanzenöle, wie z.B. Erdnussöl; Block-Copolymere; Triterpenoidglykoside, wie z.B. Saponin, QuilA und QS21; Detergenzien, wie z.B. Tween-80 und Pluronics; Bakterienkomponenten-Adjuvanzien, wie z.B. aus Corynebacterium, Propionibacterium und Mycobacterium; Interleukine, Monokine und Interferone; Liposomen, ISCOMs; synthetische Glykopeptide, wie z.B. Muramyldipeptide und Derivate davon; Choleratoxin; oder Kombinationen davon.
Die immunogene Wirksamkeit einer deaktivierten BRCV-Vakzine, die in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde, wurde mit Kälbern demonstriert. Vakzinen wurden so hergestellt, dass sie, basierend auf dem Prädeaktivierungs-TCID₅₀-Titer der viralen Erntelösungen, drei unterschiedliche antigene Massen enthielten. Vakzinen mit stark, mittel und schwach antigenen Massen wurden so formuliert, dass sie 10^5,5, 10^6,0 bzw. 10^6,5 TCID₅₀ pro 2,0-ml-Dosis BRCV enthielten. Jede Vakzine wurde vier Kälbern verabreicht, und weitere vier Kälber dienten als nicht geimpfte Kontrollgruppe. Die Kälber wurden in einem Zeitabstand von 19 Tagen zweimal intramuskulär geimpft. Den Kälbern wurde vor der primären Impfung, nach Verabreichung der zweiten Dosis und 7 und 14 Tage nach Verabreichung der zweiten Dosis zur Bewertung von Serumvirus-neutralisierender (SN-) Antikörperantwort auf BRCV Blut abgenommen. Während des Verlaufs des Versuchs wurden geimpfte und nicht geimpfte Tiere untereinander vermischt. Tabelle 5 fasst die SN-immunologische Aktivität, wie sie anhand dieses Beispiels demonstriert und als serumneutralisierende Antikörperantwort von Kälbern nach Impfung mit verschiedenen antigenen Massen der deaktivierten Vakzinen gemessen wird, zusammen.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, zeigten die Resultate dieser Studie, dass zwei Dosen an Vakzine mit schwach, mittel oder stark antigenen Massen eine 8,4-, 9,1- bzw. 16fache mittlere Zunahme der virusneutralisierenden Anti-BRCV-Antikörper hervorriefen. Im selben Zeitraum nahm der mittlere Antikörpertiter der untereinander vermischten, nicht geimpften Kontrollgruppe ab, was darauf hinweist, dass keine natürliche Aussetzung gegenüber BRCV während des Versuchs stattgefunden hatte. Da virusneutralisierender Antikörper gemessen wurde und im Allgemeinen anerkannt wird, dass eine vierfache Zunahme des Antikörpertiters ein Hinweis auf signifikante immunologische Aktivität ist, zeigen diese Daten, dass unter Verwendung einer deaktivierten BRCV-Vakzine eine immunogen wirksame Immunantwort hervorgerufen werden kann. Eine schwach antigene Masse von 10^5,5 TCID⁵⁰/ml erwies sich als für eine deaktivierte Vakzine als immunogen wirksam. Tabelle 5 Serumvirus-neutralisierende Antikörperantwort von Kälbern, die mit Vakzinen aus deaktiviertem bovinem respiratorischem Coronavirus geimpft wurden

AGM: = Antigene Masse

Beispiel 7
Modifizierte bovine respiratorische Coronavirus-Lebendvakzine
BRCV-Isolat AZ26649 wurde gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt, außer dass es in der als HRT-E6 identifizierten cHRT-Zelle vermehrt wurde. Das Virus wurde auf einen Titer von 10^6,7 TCID₅₀/ml gezüchtet und wurde durch Schütteln der Gefäße, die das Virus und die Zellen enthielten, und Transferieren des Virus und der Zellen in einen Sammelbehälter geerntet. Die geernteten Viruslösun gen wurden verwendet, um die Vakzine für diesen Versuch herzustellen. Auch wenn Klären, Aufkonzentrieren, Deaktivieren und Versehen mit Adjuvanzien nicht eingesetzt wurden, um diese Vakzine herzustellen, könnten all diese Verfahren oder ein Teil davon eingesetzt werden, um eine stärker antigene Masse zu erzeugen. Für diesen Versuch betrug die antigene Masse, die jedem Kalb verabreicht wurde, 5 × 10^6,7 TCID₅₀. Es liegt innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung, Adjuvans zu einer modifizierten Lebend-BRCV- oder -BECV-Vakzine zuzusetzen. Um eine erfolgreich mit Adjuvans versetzte, modifizierte Lebendvakzine herzustellen, kann das BRCV oder BECV eventuell weiter modifiziert (z.B. weniger virulent gemacht) werden müssen. Die Herstellung einer stärker modifizierten Version von BRCV oder BECV würde mittels Passage des AZ26649 oder jeglichen anderen BRCV oder BECV durch hochempfindliche Zellen, wie z.B. cHRT-Zellen, bis es keine Anzeichen von Erkrankung mehr hervorruft, wenn es seronegativen Kälbern intranasal verabreicht wird, erreicht werden. Ein anderes Verfahren wäre die Verabreichung der mit Adjuvans versetzten, modifizierten Lebendvakzine auf einem unnatürlichen Weg wie z.B. intramuskulär, intradermal, subkutan oder intraperitoneal und nicht intranasal. Alternativ dazu könnte das Virus mit mutagenisierenden Mitteln, wie z.B. Nitrosoguanidin, behandelt werden, und weniger virulente Mutanten könnten daraufhin selektiert werden. Mutanten würden aufgrund ihrer Unfähigkeit selektiert werden, Anzeichen von Erkrankungen hervorzurufen, wenn sie seronegativen Kälbern intranasal verabreicht werden, sowie aufgrund ihrer fortdauernden Fähigkeit, eine immunogen wirksame Vakzine zu bilden. Solche Verfahren zur weiteren Modifikation des Isolats verbessern die Sicherheit der Vakzine.
Drei Kälber (Nr. 61, Nr. 71 und Nr. 74) waren bei der primären Inokulation (ersten Impfung) etwa acht Monate alt. Die Kälber waren bezüglich BRCV seronegativ und erhielten 5,0 ml der zuvor beschriebenen Vakzine, die intranasal verabreicht wurde. Die geimpften Kälber wurden mit 1 × 10^5,8 TCID₅₀ von BRCV AZ 26649, das wie zuvor beschrieben gezüchtet und in ein Volumen von 10 ml inkorporiert wurde, 24 Tage nach ihrer einfachen primären Impfung provoziert. Drei nicht geimpfte, seronegative Kontrollkälber wurden zum selben Zeitpunkt mit derselben Menge an BRCV AZ 26649 provoziert. Alle Kälber wurden täglich zwölf Tage lang auf klinische Zeichen der BRCV-Erkrankung untersucht. Die klinischen Auswertungen umfassten eine Messung der Rektaltemperatur, eine Beobachtung von Atemwegssymptomen (Dyspnoe, Nasenausfluss und Husten) und eine Beobachtung von Symptomen im Gastrointestinaltrakt (Untersuchung der Exkremente, Appetit). Das Bewertungssystem ist nachstehend angeführt:
Die Spalte mit dem Titel "Klinische Resultate" in Tabelle 6 war eine Zusammenfassung aller Resultate der oben definierten Klassen Nasenausfluss und Dyspnoe, Husten, Appetit (Atemwegserkrankung), dividiert durch die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe (Mittelwert). Die "Enteralen Resultate" in Tabelle 6 stehen für den Mittelwert der Resultate der Klasse Konsistenz der Exkremente wie oben definiert. Tägliche Nasenabstriche wurden in MEM, das 5 % Gentamicin enthielt, erhalten und bei –70 °C gelagert, nachdem sie durch 0,45-μm-Spritzenfilter filtriert worden waren. Die Nasenabstriche wurden später mittels bekannter Inokulationsverfahren der cHRT-Zellen in einem Gewebekultursystem auf die Gegenwart von Virus getestet. Tabelle 6 unten zeigt die mittleren Rektaltemperaturen, die mittleren klinischen Gesamtresultate und Virusisolierungsresultate für die drei geimpften Kälber (geimpfte Tiere) im Vergleich zu den drei nicht geimpften Kälbern (Kontrollen) während der zwölf Tage nach dem Challenge.
Die Resultate zeigen, dass die geimpften Kälber eine signifikante Verringerung von Atemwegserkrankungen (59 %) sowie eine signifikante Reduktion von Darmerkrankungen (59 %) aufwiesen. Ein geimpftes Kalb wies ein enterales Resultat von 1,0 an Tag 0 auf, das bis Tag 11 anhielt. Wird das Resultat für dieses Kalb aus der Studie genommen, so würde die BRCV-Vakzine eine 100%ige Reduktion bezüglich Darmerkrankungen zeigen. Eine 50%ige Reduktion wurde an den Tagen viraler Entlastung bei den geimpften Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Keine signifikanten Temperaturreaktionen wurden verzeichnet. Diese Daten zeigen, dass eine BRCV-Vakzine sowohl vor der respiratorischen als auch der enteralen Form der Coronaviruserkrankung schützen kann.
Tabelle 6 Resultate der Studie bezüglich BRCV-Impfung/Challenge
Um die immunologische Aktivität der BRCV-Vakzine dieses Beispiels noch näher zu demonstrieren, wurde Serum aus jedem geimpften Kalb an den Tagen 0 und 24 zur Bewertung von serumneutralisierenden Antikörpern gegen BRCV als ein Resultat der Impfung abgenommen, und Serum wurde auch an den Tagen 0 und 17 nach dem Challenge abgenommen, um zu demonstrieren, dass die Kälber tatsächlich dem Virus ausgesetzt waren. Tabelle 7 zeigt die Serum-Neutralisationstiter aller Kälber, angegeben als Kehrwert der letzten Verdünnung, die Neutralisation erzielte. Eine einzige Impfung mit der modifizierten Lebend-BRCV-Vakzine ergab bei allen geimpften Kälbern signifikante Titer. Kontrollkälber blieben seronegativ, was darauf hinwies, dass es keine Aussetzung gegenüber BRCV vor dem Challenge gab. Nach dem Challenge zeigten die geimpften Kälber eine Immunreaktion.
Tabelle 7 Serum-Neutralisationstiter von Kälbern nach Impfung, vor Challenge und nach Challenge
Beispiel 8
Herstellung einer Untereinheitsvakzine
Klonierte HRT-Zellen werden mit BRCV gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren infiziert. Die infizierten Zellen werden zwischen 12 und 72 Stunden nach der Infektion, wenn der CPE bei > 80 % liegt, geerntet. Infizierte Zellen werden auf die Extraktion durch Ernten der infizierten Gewebekulturflüssigkeiten vorbereitet, wobei dieses Ernten das Gießen der infizierten Gewebekultur in einen Sammelbehälter umfasst, der anschließend bei geringer Geschwindigkeit (etwa 1.000 x g) zentrifugiert werden kann. Die infizierte Gewebekultur kann in Chargen unter Verwendung einer normalen Zentrifuge oder in einer Durchlaufzentrifuge zentrifugiert werden. Nach dem Zentrifugieren wird das Zellpellet durch Zusatz eines Detergens in ein Puffersystem extrahiert. In diesem Beispiel ist das Puffer-Detergens phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) plus 1,0 % Nonidet P-40. Dieses Puffer-Detergens wird verwendet, um das Zellpellet zu resuspendieren, und Extraktion erfolgt durch Vermischen des suspendierten infizierten Zellpellets bei 4 °C, bis das Zellpellet gleichförmig solubilisiert ist, oder auch 30 bis 120 min lang. Nach dieser Extraktion wird jegliches unlösliches Material durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (Chargen- oder Durchlaufzentrifugation) entfernt und kann wie zuvor beschrieben neuerlich extrahiert werden. Solubilisierte Extrakte werden dann vereinigt und mittels Säulenchromatographie (Größenausschluss-, Lectin- oder andere Affinitäts-, Anionen/Kationenaustausch- und/oder Umkehrphasenchromatographie) vor dem Zusatz von Adjuvanzien gereinigt, oder die Extrakte können auch direkt mit Adjuvanzien versetzt werden. Die antigene Masse wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren, wie z.B. enzymgekoppelter Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), vor dem Zusatz der Adjuvanzien gemessen. Ist die antigene Masse stark genug, so kann der Extrakt oder gereinigte Extrakt in PBS verdünnt werden. Ist die antigene Masse zu schwach, als dass sie immunogen wirksam sein kann, so kann der Extrakt oder der gereinigte Extrakt unter Verwendung von Ultrafiltration oder eines anderen derartigen Konzentrationsverfahrens aufkonzentriert werden. Das Versetzen mit Adjuvanzien kann unter Verwendung jeglicher der oben beschriebenen Adjuvanzien durchgeführt werden.
Angesichts der obigen Offenbarungen wird angenommen, dass Fachleuten zahlreiche Varianten des BRC- und BECV-Vakzinenpräparats der Erfinder und dessen Verwendung sowie der Herstellung der cHRT-Zellen ersichtlich sein werden. In diesem Sinne sind die oben beschriebenen Beispiele ausschließlich als Veranschaulichung zu betrachten, und der Schutzumfang der hierin offenbarten Erfindung ist nur durch die beiliegenden Ansprüche eingeschränkt.

Claims

Verbesserte klonierte, menschliche Rektaltumorzelle, HRT-E6, bezeichnet als ATCC CRL 12478.
Verfahren zur Vermehrung von BRCV (bovinem respiratorischen Coronavirus) oder BECV (bovinem enteralem Coronavirus) zu einer hochantigenen Masse, folgende Schritte umfassend: a. Vermehren der Zelle nach Anspruch 1 an einer Gefäßoberfläche oder in Suspension in Gegenwart eines Gewebekulturmediums, um eine annehmbare Lebendzellzahl zu produzieren; b. Inokulieren der vermehrten Zelle nach Anspruch 1 mit BRCV oder BECV, um eine infizierte Zellkultur zu bilden; c. Inkubieren der infizierten Zellkultur bei 30 bis 38 °C, um einen annehmbaren CPE zu erzielen; d. Ernten der resultierenden infizierten Zellkultur mittels Transfer in einen Sammelbehälter; e. gegebenenfalls Aufbrechen der infizierten Zellkultur; und f. gegebenenfalls Einengen der infizierten Zellkultur zu einer hochantigenen Masse.
Verfahren zur Vermehrung eines bovinen respiratorischen Coronavirus (BRCV) durch Züchten des Virus in einer Gewebekultur bis zu einer Menge, die ausreicht, um Rinder gegen bovine Atemwegserkrankungen zu schützen oder um die Molekülstruktur von BRCV oder BECV zur Herstellung von Untereinheits- oder Rekombinationsprodukten zu identifizieren, umfassend die Schritte des Inokulierens von BRCV auf eine Gewebekultur, die eine Zelle nach Anspruch 1 ist, und des Erntens des gezüchteten Virus.
Verfahren zur Vermehrung eines bovinen enteralen Coronavirus durch Züchten des Virus in einer Gewebekultur bis zu einer Menge, die ausreicht, um Rinder gegen bovine respiratorische Coronaviruserkrankung und bovine enterale Coronaviruserkrankung zu schützen oder um die Molekülstruktur von BECV oder BRCV zur Herstellung von Untereinheits- oder Rekombinationsprodukten zu identifizieren, umfassend das Inokulieren von BECV auf eine Gewebekultur, die eine Zelle nach Anspruch 1 ist.