DE3486292T2 - Tierärztliche Impfstoffe. - Google Patents

Tierärztliche Impfstoffe.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Veterinärvakzinen, insbesondere Adjuvanzien enthaltende Veterinärvakzinen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Veterinärvakzinezusammensetzung vorgesehen, umfassend ein Virusantigen, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Adjuvans, u.zw mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus Ethylenmaleinsäureanhydrid und Styrol-Copolymer mit einer Mischung aus Acrylsäure und Methacrylsäure.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzinezusammensetzung, welches die Vereinigung eines Virusantigens, eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers und eines Adjuvans, u.zw. mindestens eines Mitglieds, ausgewählt aus Ethylenmaleinsäureanhydrid und Styrol-Copolymer mit einer Mischung aus Acrylsäure und Methacrylsäure, umfaßt.
  • Vorzugsweise ist die Veterinärvakzine eine Hundecoronavirusvakzine. Unsere gleichzeitig schwebende Europäische Patentanmeldung 84902632.3 (Veröffentlichungsnummer 0145783), aus der die vorliegende Anmeldung ausgeschieden ist, offenbart eine Hundecoronavirusvakzine und ein Verfahren zur Herstellung derselben. Die obengenannte Europäische Patentanmeldung ist hierin als "Stammanmeldung" bezeichnet.
  • Die Stammanmeldung sieht insbesondere eine Vakzinezusammensetzung vor, die das avirulente antigene Produkt, gebildet entweder durch
  • a) Abschwächen von Lebendhundecoronavirus durch Durchgang durch Zellen von Katzenursprung, derart, daß bei Verabreichung an einen Hund durch Injektion das abgeschwächte Lebendvirus selektiv das Darmepithel infiziert, oder
  • b) Inaktivieren von in Katzen- oder Hundezellen vermehrtem Hundecoronavirus,
  • wobei das avirulente antigene Produkt in einer Menge vorhanden ist, die zum Schützen eines Hundes vor Infektion durch virulentes Hundecoronavirus wirksam ist, und einen nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
  • Die ursprüngliche Isolierung des virulenten CCV erfolgte aus einem Hund, der an Gastroenteritis starb. Dem Isolat wurde die Bezeichnung TN-449 gegeben. Virusnachweismethoden einschließlich Elektronenmikroskopie zeigten, daß CCV als das einzige Virus in den vom Hund genommenen Proben vorhanden war. Dann wurde das Virusisolat für Vermehrungs- und Abschwächungszwecke in CRFK- Zellkulturen gegeben. Ein niedriges Virusinokulum wurde in CRFK- Zellkulturen gegeben, die in 24 Stunden oder weniger konfluent wurden. Ein Verhältnis Virus zu Zellen von etwa 1 zu 3000 wurde verwendet. Die niedrige Viruszufuhr erfordert eine erhöhte Zahl von Virusvermehrungen, was den Abschwächungsprozeß unterstützt. Das Durchleiten des Virus dauerte etwa zwei Monate. Zwölf aufeinanderfolgende Zelldurchgänge wurden in einer heterologen Zellkultur, wie CRFK, durchgeführt, um Abschwächung zu erzielen. Hunde wurden mit verschiedenen Dosishöhen des Materials von Durchgang 12 geimpft. Dosishöhen von 7,5 log&sub1;&sub0;, 5,5 log&sub1;&sub0;, 3,5 log&sub1;&sub0; und 1,5 log&sub1;&sub0; wurden parenteral in Hunden verwendet. Ein nichtgeimpfter Hund wurde als Kontaktkontrollhund gehalten. Diese Tiere wurden nach Vakzination beobachtet. Die Hunde blieben gesund, ohne daß Symptome von Gastroenteritis festgestellt wurden. Postinokulationsserologie verifiziert, daß das Virusinokulum in den Hunden repliziert hatte. Dies demonstrierte die Abschwächung des TN-499- Virus. Es wurde ein weiterer Virusdurchgang von TN-449 gemacht, um das Grundkeimvirus festzulegen. Die TN-449-Kultur wurde bei American Type Cultur Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die Bezeichnung ATCC Hinterlegungs-Nr. VR-2068.
  • Das neue abgeschwächte (d. h. modifizierte) Lebendhundecoronavirus weist drei charakteristische Merkmale auf, die es als Vakzinevirus verwendbar machen: (1) das abgeschwächte CCV ist zum Wachstum und für Reproduktion in Zellkultur, insbesondere Zellen von Katzen- oder Hundeursprung, völlig geeignet, (2) das abgeschwächte CCV bewirkt keine Krankheit, wenn es einem Hund verabreicht wird, und (3) bei Verabreichung durch Injektion, z. B. subkutan, parenteral und dgl., infiziert das Virus selektiv Darmepithel. Wegen dieser einmaligen Merkmale des abgeschwächten CCV wird in den Gedärmen lokalisierte Immunität hervorgerufen, wenn das Virus Hunden verabreicht wird.
  • Diese einmaligen Merkmale scheinen der zum Abschwächen des Virus angewandten Methode zuschreibbar zu sein. Abgeschwächtes Lebend-CCV, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird hergestellt durch mindestens achtmaliges Leiten eines virulenten CCV-Stammes durch Zellen von Katzenursprung bei einem niedrigen Verhältnis Virus zu Zellen von 1 : 1000 bis 10 000, vorzugsweise 1 : 1500 bis 7500, wobei die Virusteilchen durch die TCID&sub5;&sub0;-Methode (infektiöse Dosis für Gewebekultur) gemessen werden.
  • Das Durchführen des Virus bei einem niedrigen Verhältnis Virus zu Zellen beschleunigt die Abschwächung und ermöglicht, daß die Zellen mit einer minimalen Zahl von Durchgängen abgeschwächt werden. Das niedrige Verhältnis Virus zu Zellen dient auch zum genetischen Selektieren nur jener Zellen, die für Zellkultur völlig geeignet sind, wodurch ein abgeschwächter Virusstamm gebildet wird, der in einer Vakzine verwendbar ist. Für Abschwächungszwecke sollten Katzenzellen verwendet und Hundezellen vermieden werden. Das CCV scheint in Katzenzellen leicht abgeschwächt zu werden, wenn jedoch Hundezellen verwendet werden, besteht die Möglichkeit, daß das Virus in den virulenten Zustand zurückkehrt. So sollten, wenn das abgeschwächte CCV für Produktionszwecke gezüchtet wird, mehr als ein oder zwei Durchgänge durch Hundezellen vermieden werden. Die Zellen sollen mindestens achtmal durch die Katzenzellen geleitet werden, gewöhnlich 8 bis 60 Durchgänge, vorzugsweise 8 bis 25 Durchgänge.
  • Die CCV-Vakzinezusammensetzung gemäß der Stammanmeldung umfaßt ein abgeschwächtes Lebendvirus mit einem Titer von höher als 2,5 log&sub1;&sub0; Virusteilchen/ml (oder Dosis), vorzugsweise mindestens 3,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis), insbesondere mehr als 3,3 log Virusteilchen/ml (oder Dosis), gemessen nach der FAID&sup5;&sup0; (Fluorescent Antibody Infectious Dose)-Methode (King et al., Can. Journal of Comparative Medicine & Vet. Science, 29, S. 85-89 (1965)). So hohe Titer wie 5 bis 7 log FAID&sub5;&sub0; wurden erhalten. Die CCV-Vakzinezusammensetzung umfaßt ein abgeschwächtes Lebend-CCV und kann auch ein abgeschwächtes Lebend- oder abgetötetes CPV-Virus enthalten. Außerdem kann die Vakzine zusätzliches abgeschwächtes Lebendvirus oder abgetötete Viren, wie Hundestaupevirus, Hundeparainfluenzavirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II und Hunderotavirus enthalten. Das abgeschwächte Lebend-CCV-Virus ergibt eine vollständige immunologische Reaktion auf die Virusinfektion. Jedoch erzeugt die Infektion ein Fieber, das etwa 0,5 bis 1,0ºF (etwa 0,28 bis 0,55ºC) niedriger ist als der virulente Stamm von CCV. Die Vakzinezusammensetzung enthält eine ausreichende Menge des abgeschwächten Lebendvirus, um in einem Hund eine immunologische Reaktion hervorzurufen, und ein nicht-toxisches pharmazeutisch annehmbares steriles Träger- oder Verdünnungsmittel, wie sterile Kochsalzlösung. Vorzugsweise ist der Träger oder das Verdünnungsmittel für parenterale Injektion geeignet, jedoch kann der Träger oder das Verdünnungsmittel auch von einer Art sein, die zur Verwendung als Nasensprühmittel geeignet ist.
  • Das Verfahren zum Vermehren des CCV in Säugerzellen gemäß der Stammanmeldung umfaßt die folgenden Schritte: Inokulieren von Säugergewebekulturzellen mit CCV, Kultivieren der Zellen in einer einhundertprozentigen (100%) konfluenten dichten Monoschicht vor diesem Inokulationsschritt oder innerhalb von 24 Stunden ab diesem Inokulationsschritt, Ernten der Zellen 24 bis 96 Stunden nach der Inokulation und Sammeln des vermehrten Virus aus den geernteten Zellen.
  • Die Säugergewebekulturzellen werden mit CCV bei einem Verhältnis von CCV-Virus (gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;-Methode) zu Zellen von 1 : 500 bis 1 : 1, vorzugsweise 1 : 100 bis 1 : 5, insbesondere 1 : 75 bis 1 : 10, angeimpft. Die Säugergewebekulturzellen sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Crandall-Katzennierenzellen (CRFK), Wood's-Katzenzellinie (FC), eine Hundenierenzellinie (DK), Madin Darby-Hundnieren-(MDCK) und die Hunde A72-Zellinie. Das CCV wird einer Suspension der Zellen zugesetzt oder auf eine Monoschicht der Zellen aufgebracht. Die Menge an Zellen und Virus soll derart sein, daß sich eine konfluente dichte Monoschicht der Zellen innerhalb von 12 bis 48, vorzugsweise 24 bis 36 Stunden nach Animpfung bildet. Optimal sollten zum Zeitpunkt der Animpfung die Zellen im Wachstumsbehälter in einer Menge vorhanden sein, die ausreichend ist, eine Zellenmonoschicht von mindestens 100 000 bis 1 000 000 Zellen pro cm² innerhalb von etwa 12 bis 48 Stunden nach Animpfung, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach Animpfung, zu bilden. Jedoch kann eine geringere Zahl von Zellen verwendet werden. Vorzugsweise sind die Zellen in einer Menge anwesend, die ausreichend ist, zwischen 150 000 und 500 000 Zellen/cm² innerhalb von 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden, zu bilden. Das Virus wird an den Zellen während mindestens 60 Minuten, aber gewöhnlich weniger als 300 Minuten, vorzugsweise zwischen 90 und 240 Minuten, bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, adsorbiert.
  • Erntbare Virustiter von mindestens etwa 1000 und gewöhnlich mindestens etwa 2000, gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;-Methode, können innerhalb von 18 Stunden nach Animpfung erhalten werden, jedoch kann es in manchen Fällen bis zu 120 Stunden oder länger dauern, um maximale Virustiter zu erhalten. Maximale Virustiter werden gewöhnlich etwa 24 bis 96 Stunden nach Animpfung erhalten. Die Zellmonoschicht wird entweder durch Gefrieren-Auftauen oder durch enzymatische Einwirkung zum Erhöhen des Virusgehaltes der geernteten Flüssigkeiten entfernt. Die geernteten Flüssigkeiten werden dann mit einem Virusstabilisator, wie Saccharosephosphatglutamat (SPG), Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA) oder NZ-Amin- Gelatine zum Abfüllen des Endproduktes vereinigt oder in größerer Menge zum späteren Auftauen und Auffüllen mit Virusstabilisator gefroren. Alternativ können die geernteten Flüssigkeiten inaktiviert werden.
  • Isolate von Hundecoronavirus, wie der I-171 Stamm (ATCC VR 809), das TN-499 (ATCC VR-2068) oder eines der drei von der Cornell Universität erhältlichen Hundecoronaviren (K378-8-, S378-6- und A76-Stämme), können zur Herstellung einer inaktivierten CCV-Vakzine verwendet werden. Die inaktivierte CCV-Vakzinezusammensetzung umfaßt ein oder mehrere Isolate eines inaktivierten Hundecoronavirus mit Präinaktivierungsvirustitern von höher als 4,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis) und vorzugsweise höher als 5,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis), gemessen durch die FAID&sup5;&sup0; (fluoreszierender Antikörper-infektiöse Dosis)-Methode (King et al., Can.Journal of Comparative Medicine and Vet Science 29, S. 85-89, 1965). Die typische Dosis ist 1 ml.
  • Inaktivierte CCV-Flüssigkeiten können auch durch eine beliebige Zahl von verfügbaren Techniken, wie eine Amicon-Konzentriereinrichtung, Pellicon (Millipore)-Konzentriereinrichtung, Fälltechniken, wie mit Ammoniumchlorid, Konzentrieren mit Carbowax-Flüssigkeit oder -Wachs in Verbindung mit einem Dialyserohr, oder Adjuvans-Konzentriertechniken, wie mit Aluminiumphosphat, konzentriert werden.
  • So hohe Titer wie 5 bis 7 log FAID&sub5;&sub0; wurden erhalten. Die inaktivierte CCV-Vakzinezusammensetzung umfaßt ein oder mehrere inaktivierte Hundecoronaviren und kann auch ein abgeschwächtes modifiziertes Lebend- oder abgetötetes Hundeparvovirus (CPV) enthalten. Außerdem kann die Vakzine in jeder Kombination oder einzeln zusätzliche abgeschwächte modifizierte Lebendviren oder abgetötete Viren, wie Hundestaupevirus, Hundeparainfluenzavirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II, Hunderotavirus, Masernvirus, Hundecalicivirus und Hundeherpesvirus enthalten. Die inaktivierte CCV-Vakzine ruft eine vollständige immunologische Reaktion auf die Virusinfektion hervor.
  • Die Vakzinezusammensetzung gemäß der Stammanmeldung umfaßt eine ausreichende Menge des Hundecoronavirus-Antigens zum Bewirken einer immunologischen Reaktion in einem Hund und ein nicht-toxisches pharmazeutisch akzeptables Adjuvans oder eine Adjuvanskombination.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung der Stammanmeldung betrifft den Verabreichungsweg. Die Induktion von humoral-systemischen Schutz, genießen durch serumneutralisierende Antikörperspiegel, sowie die Induktion von lokaler Immunität im Darmtrakt sind ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung. Die oral-intranasalen Verabreichungswege sollen beide Arten von Schutz bewirken. Jedoch ist die allgemeine Annahme dieses Verabreichungsweges nicht gut und daher würde die Verwendung und der anschließende Schutz, der durch eine CCV-Vakzine geliefert wird, nicht realisiert werden. Eine abgeschwächte Lebendvirusvakzine, die parenteral verabreicht wird, sieht humorale und lokalisierte Immunität vor. Die parenterale Vakzination mit einer inaktivierten CCV-Vakzine induziert sowohl humorale Immunität als auch lokalisierte Immunität. Der Ausdruck "parenterale Vakzination" soll subkutane und intramuskuläre Impfwege einschließen.
  • Die abgeschwächte Vakzine wird gewöhnlich in einer Dosis von mindestens 2,5 log Virusteilchen pro Dosis, vorzugsweise mindestens 1000 Virusteilchen (3 log Virusteilchen) pro Dosis, insbesondere mindestens 3,3 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht.
  • Die inaktivierte Vakzine wird vorzugsweise in einer Dosis von mindestens 10 000 inaktivierten Virusteilchen (4 log Virusteilchen) pro Dosis, vorzugsweise mindestens 5,0 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht. Die Vakzine kann in einem Ein- oder Zweidosissystem verabreicht werden. Die zweite Dosis sollte nicht mehr als 6 Wochen nach der ersten liegen. Vorzugsweise wird die zweite Dosis 2 bis 3 Wochen nach der ersten Dosis verabreicht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung der Stammanmeldung ist die Inaktivierung des Hundecoronavirus. CCV-Fluide können mit einer Reihe von Inaktivierungsmitteln inaktiviert werden, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, binäres Äthylenimin, Acetyläthylenimin, β- Propiolacton, Formalin, Phenol, UV-Strahlung oder γ-Strahlung.
  • Vorzugsweise wird β-Propiolacton in Konzentrationen von 0,01 bis 0,5% verwendet. Konzentrationen von β-Propiolacton von 0,05 bis 0,2% werden am häufigsten verwendet. Das Inaktivierungsmittel wird den in den Vermehrungsbehältern enthaltenen Virusflüssigkeiten, Flüssigkeiten, die aus dem Vermehrungsbehälter geerntet und kombiniert wurden, oder Virusflüssigkeiten, die aus den Vermehrungsbehältern geerntet, kombiniert, gelagert, gefroren und dann aufgetaut wurden, zugesetzt.
  • β-Propiolacton wird den Virusflüssigkeiten zugesetzt, wobei die nachteilige Verschiebung des pH zu Azidität mit Natriumhydroxid- oder Natriumbicarbonatlösung reguliert wird. Die Kombination inaktivierungsmittel-Virusflüssigkeiten wird bei Temperaturen von 4 bis 37ºC inkubiert. Inkubationszeiten von 24 bis 72 Stunden werden verwendet.
  • Ein anderes verwendete Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin. Gleiche Volumina einer 0,2 molaren Bromäthylaminhydrobromidlösung und einer 0,4 molaren Natriumhydroxidlösung werden gemischt und 60 min bei etwa 37ºC inkubiert. Das resultierende cyclisierte Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin, das den Virusflüssigkeiten mit 0,5 bis 4% V/V zugesetzt wird. Die Inaktivierungsvirusflüssigkeiten werden 24 bis 72 Stunden unter periodischem Rühren bei etwa 4 bis 37ºC gehalten.
  • Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist das Adjuvanssystem. Einzelne oder eine Kombination von Adjuvanzien können zur Erhöhung der Immunreaktion verwendet werden. Beispiele für erfindungsgemäße Adjuvanzien sind Ethylenmaleinsäureanhydrid und Neocryl A640. Andere Adjuvanzien, wie Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxid, können in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans verwendet werden. Neocryl ist ein Markenname für eine Latexemulsion eines Copolymers von Styrol und einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure. Neocryl A640 ist ein nicht-koalisiertes wässeriges Acrylcopolymer mit Styrol mit einem pH von 7,5, einer Viskosität von 100 cps (Brookfield 25ºC), das Gewicht pro Gallone beträgt 8,6 Pfund, wie geliefert, mit einem Gehalt von 40 Gew.% Feststoffen und 38 Vol.% Feststoffen. Die Bezeichnung A640 bezeichnet eine Qualität hievon. Andere verwendbare Neocryl- Qualitäten sind 520, 625 und 966. Die Bezeichnung "CSMA" wird im nachstehenden für ein copolymer von Styrol mit einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure verwendet.
  • Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA), hergestellt mit einer 5% G/V Konzentration in Wasser wird den inaktivierten Virusflüssigkeiten bei 0,01 bis 6% V/V Konzentration zugesetzt. Der pH der resultierenden Flüssigkeiten wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7,7 eingestellt.
  • CSMA, hergestellt in einer 50% V/V Suspension in Wasser wird den inaktivierten CCV-Flüssigkeiten in einer Menge von 0,1 bis 10 Vol.% zugesetzt. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH einzustellen, da CSMA neutralen pH hat.
  • Das Kombinieren von zwei oder mehreren Adjuvantien kann wie folgt durchgeführt werden, ist aber nicht auf diese Kombination beschränkt. Äthylenmaleinsäureanhydrid, wie beschrieben, wird bei 0,01 bis 6% V/V den inaktivierten Virusflüssigkeiten zugesetzt. Die Mischung wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7,1 bis 7,7 eingestellt. Der Zusatz von 0,01 bis 10% CSMA, wie beschrieben, wird durchgeführt, ohne daß weitere pH-Einstellungen erforderlich sind.
  • Um das Wesen der vorliegenden Erfindung deutlicher zu offenbaren, sind nachstehend spezifische Beispiels angeführt. Einige der Beispiele veranschaulichen die in der Stammanmeldung offenbarte Erfindung. In den Beispielen sind alle Temperaturen in ºC angegeben, log bedeutet log zur Basis 10, und es werden die folgenden Abkürzungen verwendet: g für Gramm, mcg für Mikrogramm, ml für Milliliter, min für Minuten und h für Stunden.
    • Beispiel 1:
  • Dieses Beispiel illustriert die Vakzineherstellung.
  • Der Produktionsstamm wurde ursprünglich von einem Hund isoliert, der an CCV-Enteritis gestorben war. Das Virus wurde in Crandall-Katzennierengewebe (CRFK)-Kultur serienmäßig vermehrt. Bei Erhalt wurde das Virus CCV-MSV bezeichnet und einmal zum Grundkeim CCV-MSV(X) durchgeleitet. Die CCV-MSV (Hundecoronavirus Grundkeimvirus)-Kultur wurde bei American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer VR 2068. Bei der Vakzineherstellung wurden die Zellkulturen in dynamischen Kulturen gezüchtet. In einigen vorhergehenden Versuchen wurden statische Kulturen verwendet. Zellkulturen wurden in Minimal Essential-Medium (MEM), ergänzt mit Vitaminen, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Natriumbicarbonat und L-Glutamin, gezüchtet. Eine Menge von 30 mcg/ml Gentamicin wurde als Konservierungsmittel zugesetzt. Eine 5 bis 10 Gew.% Konzentration von Rinderserum wurde für Zellwachstum zugesetzt. Die Serumkonzentration wurde auf nicht mehr als 1% für ein Aufrechterhaltungsmedium vermindert. Trypsin wurde bei einer Konzentration von 0,5 ml/l Medium zugesetzt, um Virusinfektiosität zu fördern.
  • Konfluente Kulturen von CRFK-Zellen wurden trypsinisiert und in Rollkulturen gepflanzt, so daß nach 24 h eine Dichte von 150 000 Zellen pro cm² erhalten wurde. Die Kulturen wurden bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde entfernt.
  • Das Produktionskeimvirus wurde in kaltem fließenden Wasser aufgetaut. Ausreichend Virus wurde zugesetzt, um ein Mindestinfektionsmultiplizitäts(MOI)-Verhältnis von 1 : 100 zu erzielen. Eine 2000 cm³-Flasche enthielt 300 bis 500 Millionen Zellen. Bei 1 : 50 MOI 300 · 10&sup6; dividiert durch 50 wurde ein infektiöses Mindestvirusinokulum von 6 · 10&sup6; oder 106,8 FAID&sub5;&sub0; pro Rollkultur erhalten. Viruskeime und Produkternten ergaben 105,5 bis 107,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. So wurden gewöhnlich 20 ml unverdünnter Keim bis 1 ml unverdünnter Keim pro Flasche verwendet. Der Keim wurde pro Rollflasche mit Kulturmedium auf ein Volumen von 50 ml gebracht. Das Virus wurde auf Monoschichten oder in Suspension 2 h bei 35 bis 38ºC absorbieren gelassen.
  • In einem spezifischen Beispiel wurde ein Keim, titriert bei 105,7 FAID&sub5;&sub0; pro ml mit 15 ml pro verwendeter Rollflasche als Inokulum verwendet. 32 Rollflaschen wurden, wie beschrieben, angeimpft. Die Flaschen wurde mit 2 l MEM bei 1% FCS und 0,5 ml Trypsin aufgefüllt. Die Flüssigkeiten wurden zusammen mit dem Zellmaterial 48 h nach Infektion geerntet, verteilt und bei -40ºC oder niedriger gefroren.
  • Die Flaschen ergaben 66,5 l Virusflüssigkeiten. Der Titer der Flüssigkeiten betrug 105,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. Das Material wurde später aufgetaut und mit Medium und Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA)-Stabilisator gemischt und gefriergetrocknet.
    • Beispiel 2:
  • Dieses Beispiel illustriert Vermehrung im Darm durch parenterale Impfung.
  • Der Zweck der Untersuchung war, zu bestimmen, ob die CCV- Vakzine das Replikat im Darmtrakt finden würde, wenn sie intranasal oder intramuskulär gesunden empfindlichen Hunden verabreicht wird.
  • 4 Hunde wurden in zwei Gruppen geteilt und isoliert und vor der Vakzination wurde ihnen Blut entnommen. Die Hunde Nr. 63 und 64 wurden intramuskulär mit einer 10 ml Dosis (106,3 FAID&sub5;&sub0;/ Dosis) CCV (x + 1)-Keim (Keim hergestellt durch einen zusätzlichen Durchgang vom Grundkeim) vakziniert. Die beiden anderen Hunde Nr. 62 und 65 wurden intranasal mit einer 2 ml Dosis (105,6 FAID&sub5;&sub0;/Dosis) des gleichen CCV-Keims vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Hunden Blut entnommen, von den Fäkalien wurden Abstriche gemacht für Virusisolierung in CRFK- Zellkultur und die Tiere wurden eingeschläfert. Gewebegeschabsel von Trachea, Duodenum, Jejunum und Cöcum wurde auf Objektträger gegeben. Diese Ausstriche wurden dann durch die direkte Fluoreszenzantikörpertechnik auf Virusreplikation beobachtet.
    • Virusisolierung von Fäkalien
  • Aus den Fäkalien konnte kein Coronavirus isoliert werden.
    • Direkte FA-Anfärbung von Abstrichen
  • Die Ergebnisse von Fluoreszenzantikörperanfärbung von Gewebeabstrichen sind in Tabelle 2-1 gezeigt. Tabelle 2-1 CCV direkte FA von Abstrichen Hund Viruszufuhr Dosis Vakzinationsweg Abstriche/Zahl genommener Abstriche Abstriche/Gesamtabstriche positiv
  • IN = intranasal NA = nicht anwendbar
  • 100% der von den intranasal geimpften Hunden genommenen Darmabstriche waren auf Virusreplikation positiv, während 70% der Darmabstriche von den intramuskulär geimpften Hunden auf Virusreplikation positiv waren.
  • Virusreplikation erfolgte in allen drei Teilen des Darmtraktes. Virusreplikation wurde auch in der Trachea der intranasal vakzinierten Hunde festgestellt.
  • Der Grad von Virusentwicklung im Darm von intranasal geimpften Tieren und die Tatsache, daß die Trachea ebenfalls Virusreplikation zeigte, kann anzeigen, daß dieser Impfweg die natürliche Eintrittspforte für Infektion ist.
    • Schlußfolgerung
  • Virusreplikation im Darmtrakt kann 5 Tage nach intramuskulärer oder intranasaler Verabreichung hoher Dosisspiegel des Virus erzielt werden.
    • Beispiel 3:
  • Dieses Beispiel illustriert niedriges Virusinokulum, für Darmreplikation parenteral verabreicht.
  • Der Zweck dieser Untersuchung war, zu bestimmen, ob die CCV- Vakzine bei intramuskulärer Verabreichung in niedriger Dosishöhe lokalisieren und im Darmtrakt replizieren würde.
  • Zwei Hunde Nr. 60 und 68 wurden mit 1 ml CCV-MSV (x+3)-Keim verdünnt auf 103,0 FAID&sub5;&sub0;/ml intramuskulär vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Tieren Blut entnommen und die Tiere wurden eingeschläfert. Ausstriche von Villigeschabsel wurden vom Duodenum, Jejunum und Cöcum für direkte FA-Beobachtung zum Nachweis von Virusreplikation gemacht. Diese Abstriche wurden behandelt und mit CCV-spezifischem FITC (Fluorisothiocyanat)-gebundenem Konjugat angefärbt und durch FA untersucht.
    • Direkte CCV-FA von Villigeschabsel
  • Die Gewinnung von positivem CCV von den Villigeschabsel abstrichen ist in Tabelle 3-1 gezeigt. Tabelle 3-1 CCV direkte FA von Villi Hund Viruszufuhr Vakzinationsweg Abstriche/Zahl genommener Abstriche Abstriche/Gesamtabstriche positiv durchschnittl.
  • CCV-Replikation wurde in allen Bereichen des Darmtraktes beider Hunde 5 Tage nach der intramuskulären Verabreichung von 3 log Virus gefunden. Ein Durchschnitt von 79% der beobachteten Proben war auf Virusreplikation positiv. Dieser Perzentsatz läßt sich günstig mit den 70% positiven Proben vergleichen, die mit Hunden erhalten wurden, denen in einer anderen Untersuchung 5,6 log Virus verabreicht worden war.
  • CCV-Replikation kann im Darmtrakt von empfindlichen Hunden, die mit 103,0 FAID&sub5;&sub0;/Dosis CCV-Vakzine parenteral vakziniert wurden, 5 Tage nach Vakzination gezeigt werden.
    • Beispiel 4:
  • Vorläufige Vakzine- und Reizbestimmung
  • Der Zweck dieser Untersuchung war, ein Hundecoronareizvirus zu bestimmen und festzustellen, ob das Vakzinevirus irgendwelche durch das Reizvirus induzierte Symptome verhindert und Darminfektion durch das Reizvirus vermindert oder verhindert.
  • Zwei auf Hundecoronavirus empfindlichen Hunden, Nr. 61 und 66, wurde Blut entnommen und sie wurden mit 3 log CCV MSV (x+3)- Keim intramuskulär vakziniert. Diese Tiere wurden bis zum Zeitpunkt der Reizung isoliert gehalten.
  • 21 Tage nach Vakzination wurde den beiden mit CCV vakzinierten Hunden zusammen mit den vier auf CCV empfindlichen Hunden Nr. 75, 79, 74 und 76 Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und mit 5 ml/Hund CCV-Reizvirus gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml oral und 3 ml intranasal. Jeder Hund erhielt 105,7 FAID&sub5;&sub0; Reizvirus.
  • Die Hunde Nr. 74 und 76 wurden 7 Tage nach der Reizung auf Temperaturreaktion, WBC (weiße Blutkörperchen)-Zahl, Lymphozytenzahlreaktion und andere Symptome beobachtet. 5 Tage nach der Reizung wurden die beiden CCV-vakzinierten Hunde Nr. 61 und 66 zusammen mit den beiden Reizkontrollhunden Nr. 75 und 79 eingeschläfert. Darmgeschabselausstriche wurden vom Duodenum, Jejunum und Cöcum jedes Hundes gemacht. Fluoreszenzantikörperanfärbung wurde an diesen Ausstrichen durchgeführt, um das Ausmaß der Virusreplikation im Darmtrakt zu bestimmen. Tabelle 4-1 CCV SN-Untersuchung Serumneutralisierender Antikörper-Titer Hund Gruppe vor Vakzination vor Reizung
  • * vakzinierter Hund
  • ** Reizkontrolle
  • Beide vakzinierten Tiere waren vor der Vakzination seronegativ und 21 Tage nach der Vakzination auf einen Grad von 1 : 1122 serokonvertiert.
  • Durchschnittlich 95,6% aller in den Kontrollen beobachteten Darmproben zeigten eine 4(+) Virusreplikationshöhe. Keines der vakzinierten Tiere zeigte eine 4(+) Virusinfektionshöhe in den Darmproben. Daher wurde eine 100%ige Verminderung der 4(+) Infektionshöhe erzielt.
  • Insgesamt 17,4% der vakzinierten Proben waren positiv mit einer 1(+) Infektionshöhe, während insgesamt 100% der Reizkontrollproben positiv waren (95,6% bei 4+, 4,4% bei 1+). Eine perzentuelle Gesamtverminderung der Darminfektion von 82,6% wurde in den vakzinierten Tieren erzielt.
  • Eine weitere Analyse dieser Daten kann durchgeführt werden, die der 4+ Infektionshöhe im Vergleich mit einer 1+ Infektionshöhe Signifikanz gibt. Diese Analyse kann in Tabelle 4-2 gefunden werden. Tabelle 4-2 Hund Infektionsgrad Zahl von Darmproben pro Gruppe Zahl von Proben multipliziert durch den Infektionsgrad Gesamtzahl pro Gruppe oder infektiöser Index Kontrollen vakzinierte Tiere CCV-Reizbestimmungsergebnisse und Diskussion 1. Temperaturreaktion Temperaturreaktion (100ºF) nach CCV-Reizung Tag nach Reizung Hund Gruppe beobachtete Reizkontrolle Durchschnitt eingeschläferte Reizkontrolle nicht festgestellt, bis in hohe Temp. festgestellt eingeschläfert für Darm-FA Durchschnitt
  • * kritisch hohes Fieber
  • Die CCV-Reizung rief ein kritisch hohes Fieber (103,5ºF) in den CCV-empfindlichen Reizkontrollhunden am Tag 3, 4 bzw. 5 hervor. Alle vier Reizkontrollhunde zeigten während zwei aufeinanderfolgenden Tagen Temperaturen von 103,5ºF. Die mittlere Temperatur der Hunde 74 und 76 betrug 103,8 bzw. 104,3&sup0;F am Tag 3 nach der Reizung und 104ºF am Tag 4 nach der Reizung. Hund 75 hatte eine verzögerte Temperaturreaktion von 104 und 103,5ºF an den Tagen 4 und 5 nach Reizung.
  • Die CCV-vakzinierten Hunde zeigten während der 3 Tage, an denen sie beobachtet wurden, während der kritischen Fieberperiode keine Temperatur über 103ºF. Die CCV-Reizung bewirkte in CCV- empfindlichen Hunden eine signifikante fiebrige Reaktion und die CCV-Vakzine verhinderte diesen Temperaturanstieg. 2. WBC-Reaktion WBC-Zahl nach CCV-Reizung (x100) Tage nach Reizung Hund *kritische Tage WBC-Abfall nach CCV-Reizung
  • Der kritische Zeitraum für einen WBC-Abfall nach CCV-Reizung war an den Tagen 3, 4 und 5. Diese Daten zeigen, daß WBC- Beobachtung ein kritischer Parameter für das Hundecoronaviruskrankheitssyndrom sein kann. 3. Lymphozytenzahl Lymphozytenzahl nach CCV-Reizung (x100) Tage nach Reizung Hund
  • * kritische Tage
  • In den CCV-Reizkontrollhunden entwickelte sich eine Lymphopenie beginnend am Tag 1 mit Hund 76 und am Tag 3 mit Hund 74. Die Lymphopenie hielt bis zum Tag 5 nach Reizung an. Weitere Analyse des perzentuellen Lymphozytenabfalls ist im nachstehenden angegeben. % Lymphozyten-Abfall nach CCV-Reizung Tage nach Reizung Hund
  • * kritische Tage
  • Lymphopenie mit über 50%iger Verminderung der Lymphozyten trat in 6 von 12 Beobachtungen der Reizkontrollhunde auf mit den schwersten Vorkommnissen an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 74 hatte mehr als 50% Lymphopenie an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 76 zeigte eine Lymphopenie von über 50% an den Tagen 3, 4, 5 und 7 nach Reizung und hatte den stärksten Abfall von 78% an den Tagen 4 und 5 nach Reizung. 4. Symptome Hund keine keine Nasenausfluß Anorexie Entwässerung trockene Fäkalien leichter Nasenausfluß leichter Augenausfluß Anorexie Entwässerung Fäkalien naß weicher Stuhl leichter Nasenausfluß leichter Nasen- und Augenausfluß keine keine wie oben wie oben leichter Nasenausfluß Fäkalien weich wie oben
  • Symptome von CCV-Infektion begannen am Tag 3 nach Reizung und verliefen gleichzeitig mit der fiebrigen Reaktion und Lymphopenie. Symptome von Nasenausfluß, Anorexie, Entwässerung und Augenausfluß dauerten bis zum Tag 7 nach Reizung, dem letzten Tag der Beobachtung, an. Die CCV-Reizung rief signifikante CCV-Symptome in CCV- empfindlichen Hunden hervor.
    • Bestimmung von Virusreplikation im Darmtrakt von vakzinierten Tieren und Kontrollen 5 Tage nach Reizung
  • Insgesamt 8 Stellen in der Trachea für Abstrichpräparate und 23 Stellen längs des Darmtraktes wurden für die Bestimmung gewählt. Darmgeschabsel wurde auf Objektträger gegeben, mit Aceton fixiert und mit spezifischem Hundecoronavirus FA-Konjugat angefärbt. Der Replikationsgrad wurde mit 4+ Infektion, 1+ Infektion oder kein Virus vorhanden bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in den Tabellen 4-3 und 4-4 gezeigt. Tabelle 4-3 Probenbestimmung auf Hundecoronavirusreplikation Gruppe Hund Grad von Zahl von Abstrichen Reizkontrolle kein vakziniertes Tier
  • In keinem der Hunde wurde Tracheavirusreplikation festgestellt. Weitere Bestimmungen der % positiver Proben schließen die Tracheaproben aus. Tabelle 4-4 Hunde Proben pro Infektionsgrad im Darmtrakt mittlere Gesamt pro Testgruppe Kontrolle Durchschnitt vakzinierte Tiere Durchschnitt
  • Ein infektiöse Indexhöhe von 178 für die Kontrollen gegenüber 8 von den vakzinierten Tieren zeigt eine Verminderung der Infektion von 95,5% an.
  • Die Untersuchung beweist somit, daß die CCV-Reizung schwere meßbare klinische Symptome von CCV-Erkrankung hervorrief und die CCV-Reizung im Darm festgestellt werden kann. Die CCV-Vakzine senkt den Infektionsgrad im Darm des vakzinierten Hundes und eliminiert die klinischen Symptome und das Fieber nach CCV-Reizung im Vergleich mit CCV-empfindlichen Reizkontrollhunden.
    • Beispiel 5:
  • Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit der Vakzine.
  • Junge Hunde erwiesen sich durch einen Serumneutralisationstest durch FA als seronegativ auf CCV. 22 der Tiere wurden mit einer Mindestdosis der Vakzine vakziniert. Einer Hälfte der Gruppe wurde die Vakzine subkutan und der anderen Hälfte der Gruppe die Vakzine intramuskulär gegeben. Die vakzinierten Hunde wurden dann einzeln untergebracht, aber zusammen mit drei weiteren jungen Hunden, die als Umgebungskontrollen dienten, im gleichen Bereich gehalten. Die Tiere wurden 3 Wochen lang beobachtet. Es zeigten sich keine ungünstigen Wirkungen von der Vakzine und es gab keine Anzeichen von Umgebungsexposition an das Virus.
  • Jedes vakzinierte Tier wurde so gehalten, um einen direkten Kontakt Hund zu Hund zu verhindern. Dieser Vorgang wurde angewandt, um zu verhindern, daß ein vakzinierter Hund, der für Ausbreitung sorgen kann, unabsichtlich einen anderen vakzinierten Hund exponiert, der zum Zeitpunkt der Vakzination nicht immunisiert sein könnte. Die Umgebungskontrollen wurden im gleichen Bereich untergebracht, aber von den vakzinierten Tieren physisch getrennt gehalten. Diesen Tieren wurde während der Beobachtungszeit periodisch Blut entnommen und sie wurden am Tag 21 eingeschläfert. Darmgeschabselabstriche wurden gemacht und durch direkte Fluoreszenzantikörperanfärbung untersucht. Serologische Bestimmung der entnommenen Serumproben und Bestimmung der Darmgeschabselabstriche stellten fest, ob Umgebungsexposition an ein Hundecoronavirus erfolgt war.
  • 21 Tage nach Vakzination wurden die vakzinierten Tiere und die Kontrollen anästhesiert, Blut entnommen und die Tiere intranasal-oral mit virulentem Reizvirus gereizt. Das Reizvirus wurde titriert, um die Viruszufuhr zu bestimmen. Die vakzinierten Tiere, die Kontrollen und die Reizumgebungskontrollen wurden im gleichen Gebäude untergebracht. Die vakzinierten Tiere und die Kontrollen wurden täglich auf Temperaturerhöhung, Lymphopenie, Leukopenie und andere Symptome von Corona-induzierter Erkrankung beobachtet.
  • Eine regellose Wahl von vakzinierten Tieren und Kontrollen zum Einschläfern und Bestimmen des Grades von Reizvirusreplikation im Darmtrakt erfolgte an den Tagen 5, 6 und 7 nach Reizung. Die Reizumgebungskontrollen wurden eingeschläfert und Abstriche von Darmtraktgeschabsel an den Tagen 6 und 7 untersucht.
  • Alle Versuchstiere wurden in Räumen untergebracht, wo die Temperatur nach der Reizung 50 bis 70ºF betrug.
    • Ergebnisse: A. Viruszufuhr (siehe Tabelle 2-1)
  • 10 Replikattitrationen wurden an dem zum Vakzinieren der ersten Gruppe von vakzinierten Tieren verwendeten Virus durchgeführt. Ein mittlerer geometrischer Titer von 2,9 log Virus wurde verwendet.
    • B. Vergleich von Antikörperreaktion und gesamte geometrische Durchschnitte
  • Ein mittlerer geometrischer Titer von 1: 138 491 wurde durch den subkutanen Vakzinationsweg erhalten. Der intramuskuläre Impfweg bewirkte eine mittlere geometrische serologische Reaktion von 1 : 113 761. Zwischen den Verabreichungswegen und der erzielten serologischen Reaktion war kein signifikanter Unterschied zu sehen.
    • C. Vakzineumgebungskontrollen (siehe Tabelle 5-1 und 5-2)
  • Die drei als Umgebungskontrollen verwendeten Hunde erwiesen sich am Tag 0 und am Ende der Untersuchung als seronegativ.
  • Diese drei Hunde wurden eingeschläfert und ihre Darmtrakte durch Anfärben von Darmgeschabselabstrichen mit fluoreszierendem Antikörper auf Infektion untersucht. Die für jedes Tier untersuchten 18 Proben waren auf Hundecoronavirus negativ.
  • Es wurde gefolgert, daß kein Hundecoronavirus vom "Wildtyp" die Einrichtung kontaminierte und die Untersuchung ungültig machte.
    • D. Titration des Reizvirus
  • Ein Isolat von Hundecoronavirus wurde für intransal-orale Verabreichung an jeden vakzinierten und Reizkontrollhund erhalten. Ein geometrischer Durchschnitt von 5,47 log pro ml wurde aus 7 Titrationen erhalten. Jedes Tier erhielt 2 ml Virus intranasal und 3 ml oral. Daher wurde jedes Tier mit 6,2 log Virus gereizt.
    • E. Beobachtungen und Bestimmungen nach Reizung 1. Temperaturreaktion
  • Es erfolgten 131 Beobachtungen für die subkutan und intramuskulär vakzinierten Gruppen. Es wurde keine Temperaturreaktion von höher als 103ºF festgestellt.
  • An den Reizkontrollhunden erfolgten 57 Temperaturbeobachtungen. Insgesamt 6 Beobachtungen oder 9,5% der Beobachtungen waren über 103ºF. Diese Temperaturen waren 103,2, 103,2, 103,4, 103,6, 104,0 bzw. 105,0.
  • Das geringe Ausmaß der in den Reizkontrollhunden festgestellten Temperaturreaktion war in den vakzinierten Tieren nicht vorhanden.
    • 2. Weiße Blutkörperchen (WBC)-Reaktion
  • Es wurde weder in den vakzinierten Hunden noch in den Reizkontrollhunden ein signifikanter Abfall der WBC festgestellt.
    • 3. Lymphozytenreaktion
  • Für die Reizkontrollhunde schien es einen signifikanten Abfall an Lymphozyten zu geben. 7 von 10 Reizkontrollhunden oder 70% hatten Lymphozytenabfälle von größer als oder gleich 60%. Nur 3 der gereizten vakzinierten Hunde (13%) hatten einen Lymphozytenabfall von über 60%, der in den vakzinierten Hunden 5,2-mal niedriger war; ein 2,7-mal niedrigerer Abfall an Lymphozyten in den vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 35% oder höher in Betracht gezogen wurde, und ein 2,16-fach geringerer Abfall der Lymphozyten in vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 25% oder höher in Betracht gezogen wurde.
  • Die Daten zeigten, daß das Reizvirus eine Wirkung auf die Reizkontrollhunde hatte und daß die Vakzination einen derartigen schweren Abfall an Lymphozyten in den immunisierten Tieren verhinderte.
    • 4. Symptome der Krankheit
  • Die in diesem Reizversuch festgestellten Krankheitssymptome waren nicht so häufig wie in vorhergehenden Versuchen. Jedoch zeigten die Reizkontrollhunde mehr Symptome als die vakzinierte Gruppe. Ein Symptom des Krankheitsindex wurde gefunden durch Dividieren der Zahl von pro Testgruppe beobachteten Symptomen durch die Gesamtzahl von erfolgten Beobachtungen. Beispielsweise wurden 3 Symptome in den intramuskulär vakzinierten Hunden festgestellt. Insgesamt erfolgten 61 Beobachtungen. Daher betrug der Symptomindex 3/61 oder 0,049. In Tabelle 5-1 ist der Symptomindex pro Gruppe zusammengefaßt. Tabelle 5-1 beobachtete Zahl von Testgruppe Symptome Beobachtungen Symptomindex kombinierte vakzinierte Tiere Kontrollen
  • Eine Verminderung des Symptomindex von 92,8% wurde beim Vergleich der kombinierten vakzinierten Gruppe mit den Reizkontrollhunden erhalten. Obwohl die Krankheitssymptome in den Kontrolltieren nicht reichlich waren, verhinderte die Vakzine viele Symptome in den immunisierten Tieren signifikant.
  • Jedes der 10 Reizkontrolltiere zeigte Symptome, so daß der Symptomindex ein schweres Krankheitssyndrom in nur wenigen Kontrollhunden nicht reflektiert. 7 der 23 vakzinierten Hunde zeigten jeweils ein Krankheitssymptom.
    • 5. Darminfektion - Bestimmung durch das FA-Ausstrichverfahren
  • Die Bestimmung des Infektionsgrades des Darmtraktes durch Reizvirus in den Kontrollhunden und den vakzinierten Hunden ist der kritischste Parameter zum Bestimmen der Wirksamkeit einer Hundecoronavirusvakzine. Die Gedärme wurden entfernt und in kaltem Leitungswasser leicht gewaschen. Die Teile wurden mit einem Skalpell geöffnet und Geschabsel entnommen. Das Geschabsel vom Darmepithel der Versuchstiere wurde direkt oder abgeschilfert auf Glasobjektträger gegeben. Die Probeentnahme erfolgte in jedem Tier an ungefähr derselben Stelle. Die Abstriche wurden 30 min bei 25ºC zweimal in 100% Aceton fixiert. Spezifisch markiertes Hundecoronaviruskonjugat wurde zum Anfärben jedes Abstriches während 1 h bei 37ºC verwendet. Die Abstriche wurden in Carbonatpufferwaschflüssigkeit gewaschen und mit einer 50 W Quecksilber (HOB)- Lichtquelle beobachtet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5-2 bis 5-6 angegeben. Jedes Feld wurde beobachtet und ein negativer bis 4+ Fluoreszenzwert angegeben. Tabelle 5-2 Beobachtungen von Darmgeschabselabstrichen von Reizkontrollhunden Tage nach Reizung Zahl der Proben Zahl von Proben pro Grad infektiöser Index insgesamt Durchschnitt Tabelle 5-3 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben infektiöser Index Tabelle 5-4 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben Zahl von Proben pro Grad infektiöser Index Umgebungskontrolle Tabelle 5-5 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben Zahl von Proben pro Grad infektiöser Index Umgebungskontrolle Tabelle 5-6 Vergleich des infektiösen Index, der die Verminderung der Darminfektion anzeigt Testgruppe infektiöser Index pro Einschläferungstag SC-vakzinierte Tiere IM-vakzinierte Tiere kombinierte Gruppen Reizkontrollen Verminderung kombinierte Gruppe gegenüber Kontrollen
  • Der infektiöse Index der Reizkontrollen betrug 1,47 bis 3,73 mit einem Durchschnitt von 2,345, während die kombinierte vakzinierte Gruppe von 22 Hunden einen infektiösen Index von 0,103 hatte. Diese Daten zeigen, daß in den vakzinierten Hunden eine Verminderung der Darminfektion von 95,6% erzielt wurde.
    • Beispiel 6:
  • Dieses Beispiel illustriert Hundecoronavirus als ein Kombinationsprodukt.
  • Eine Pilotvakzinereihe wurde mit Hundecoronavirus und Hundeparvovirus als Komponenten wie folgt chargiert:
  • CCV-Flüssigkeiten 4,5 l
  • CCV-Flüssigkeiten 2,0 l
  • Stabilisator 2,2 l
  • Kalbfötusserum 0,1 l
  • 1n NaOH 0,08 l.
  • Die Materialien wurden unter Kühlen gemischt und aseptisch in einer Dosis von 1 ml in Flaschen gefüllt. Die Vakzineflaschen wurden dann Desikkation unterworfen. Die Virusausbeuten waren wie folgt
  • CCV 105,4 FAID&sub5;&sub0;/Dosis
  • CPV 106,5 FAID&sub5;&sub0;/Dosis
  • Es ist durchaus möglich, CCV als Kombinationsprodukt routinemäßig herzustellen und zu chargieren.
  • Dieser Teil der Untersuchung diente dazu, zu bestimmen, ob Antigenbeeinträchtigung auftritt, wenn Hundecoronavirus und Hundeparovirus zur Verabreichung als Kombinationsvakzine kombiniert werden.
  • Der Versuchsplan kann in Tabelle 6-1 gefunden werden. Drei Gruppen von Hunden wurden verwendet. Gruppe I wurde mit einer vollen Dosis Hundecoronavakzine (1 ml) vakziniert. Gruppe II wurde mit einer vollen Dosis Hundecorona-Parvovirusvakzine (1 ml) vakziniert. Die dritte Gruppe wurde mit einer vollen Dosis Hundeparvovirus (1 ml) vakziniert. Portionen jeder Gruppe wurden intramuskulär (IM) vakziniert, während die übrigen Hunde subkutan (SC) vakziniert wurden. Den Hunden wurde am Tag 0 und auch 21 Tage nach Vakzination Blut entnommen. Umgebungskontrollen wurde am Tag 0 und am Tag 21 ebenfalls Blut entnommen. Tabelle 6-1 Antigenblockierungsuntersuchungs-Versuchsplan Behandlung Gruppe I Gruppe II Gruppe III Blutentnahme vor Vakzination und Vakzination (Tag 0) Blutentnahme nach Vakzination Tag (21) ja ja ja
  • Fünf Replikattitrationen wurden an jeder Virusfraktion durchgeführt. Die Daten zeigten eine Viruszufuhr von 4,5 log Coronavirus für Gruppe I, 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe III und 4,4 log Hundecoronavirus mit 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe II.
    • 1. Testgruppe I - mit Hundecoronavirus vakziniert
  • Die Daten zeigten, daß ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 6498 gegen Hundecoronavirus erhalten wird.
    • 2. Testgruppe II - mit Hundecorona-Parvovirus vakziniert
  • Die Hunde in Testgruppe II entsprachen einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 87 222 gegen Hundecoronavirus und einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 58 579 gegen Hundeparvovirus 21 Tage nach Erhalt 1 Dosis Vakzine.
    • 3. Testgruppe III - mit Hundeparvovirus vakziniert
  • Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 65 893 wurde in dieser Testgruppe gegen Hundeparvovirus erhalten.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6-2 zusammengefaßt. Tabelle 6-2 Postserologische Hundecorona- und Parvoreaktion Zusammenfassung arithmetischer und geometrischer Durchschnitte Antikörper nach Vakzination Gruppe Vakzine
  • * Arithmetischer Durchschnitt
  • ** geometrischer Durchschnitt
    • Analyse auf Antigenblockierung a. Hundecoronavirus (siehe Tabelle 6-2)
  • Für das Hundecoronavirus wurde keine Antigenblockierung festgestellt. Ein mittlerer geometrischer Antikörpertiter von 1 : 87 222 wurde mit dem Kombinationsprodukt erzielt im Vergleich mit einer mittleren geometrischen Antikörperhöhe von 1 : 6498 mit dem Einzelprodukt gegen Hundecoronavirus. Ein Verstärkungseffekt wird mit dem Hundecoronavirus in Kombination erzielt. Eine 13,4- fache Erhöhung des Hundecoronavirusantikörpertiters wird bei Vergleich des Kombinationsproduktes mit dem Einzelprodukt erhalten u
    • b. Hundeparovirus
  • Es gab keinen signifikanten Unterschied der Antikörpertiter gegen Hundeparvovirus, als das Kombinationsprodukt mit dem Einzelprodukt verglichen wurde. Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 58 579 mit dem Kombinationsprodukt läßt sich gut mit einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 65 893 mit dem Einzelprodukt vergleichen. Es wurde keine Antigenblockierung festgestellt.
    • Beispiel 7:
  • Dieses Beispiel illustriert ein Inaktivierungsverfahren. Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch binäre Äthylenimininaktivierung (BEI) inaktiviert. Eine Vorratslösung A von 0,2 molarem Bromäthylaminhydrobromid wurde durch Zusetzen von 40,98 g zu entionisiertem Wasser hergestellt und auf 1000 ml gebracht. Die Lösung B war Natriumhydroxid, 0,4 molar. Diese wurde durch Zusetzen von 16 g NaOH zu entionisiertem Wasser und Auffüllen auf 1000 ml hergestellt. Die Vorratslösungen wurden bei Raumtemperatur gelagert, bis sie zur Verwendung fertig waren. Vor der Verwendung wurden gleiche Volumina der Lösung A und B gemischt und zum Cyclisieren bei 37ºC inkubiert. Die cyclisierte Lösung wurde dann bei 2% V/V Konzentration den CCV-Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden gründlich gemischt und 72 h bei 37ºC inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden 20 ml sterile 1 molare Natriumthiosulfatlösung zugesetzt, um Neutralisation des BEI zu gewährleisten. Verdünnte und unverdünnte Proben der inaktivierten Flüssigkeiten wurden in empfindliche Gewebekultur gegeben, um nicht-inaktiviertes Virus nachzuweisen. Die Gewebekultur wurde dreimal durchgeleitet und durch fluoreszierenden Antikörper unter Verwendung von spezifischem CCV-Konjugat geprüft. Versuche zeigten vollständige Inaktivierung.
    • Beispiel 8:
  • Dieses Beispiel erläutert ein anderes Inaktivierungsverfahren.
  • Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit β-Propiolacton (BPL) inaktiviert. Die Virusflüssigkeiten bei einem Volumen von 1 l wurden mit 5 ml 1 n Natriumhydroxid gepuffert, um die aus den von der β-Propiolactonhydrolysierung freigesetzten sauren Produkten resultierende pH-Änderung zu kompensieren. Eine Hälfte von 1 ml konzentriertem BPL wurde den Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden 24 h bei 4ºC ± 1ºC unter periodischem Rühren gehalten. Nach dieser Zeit wurden Proben der Flüssigkeiten entnommen, durch auf Gewebekultur geleitet und durch einen Fluoreszenzantikörpertest auf nicht-inaktivierten Virus getestet. Versuche zeigten vollständige Inaktivierung an.
    • Beispiel 9:
  • Dieses Beispiel illustriert die Zugabe von Adjuvans zum inaktivierten Virus.
  • Adjuvans 9A, Äthylenmaleinsäureanhydrid, wurde auf folgende Weise hergestellt. 150 g BMA 31 von Monsanto Artikel LC07 wurden in 3 l entionisiertem Wasser gelöst und auf 85ºC erhitzt. Die Mischung wurde gerührt, bis das EMA 31 sichtbar gelöst war. Phenolrot, Artikel 7715, ICN Pharmaceuticals, wurde in einer Menge von 0,03 g zugesetzt. Der pH der Zubereitung wurde mit 175 ml 10 n Natriumhydroxid, Eastman Kodak Co., auf 6,8 eingestellt. Das Adjuvans wurde in 6 Glasflaschen mit Schraubverschluß in einer Menge von jeweils 500 ml verteilt und bei 15 psi Druck und einer Temperatur von 121ºC 2 h lang dampfsterilisiert.
  • Adjuvans 9B, eine wässerige Suspension von CSMA, wurde auf folgende Weise hergestellt. 7,5 l Neocryl A-640, Artikel RL-414, wurden mit 7,5 l entionisiertem Wasser mit einem Gehalt von 70 g Natriumchlorid, Artikel KMPA, Mallinckrodt, gemischt. Die Zubereitung wurde gemischt und in 30 500 ml-Glasbehälter mit Schraubverschluß verteilt. Diese wurden 2 h bei einem Druck von 15 psi und einer Temperatur von 121ºC dampfsterilisiert.
  • 25 l abgetötetes Hundecoronavirusantigen wurden mit 271,7 ml Adjuvans 9A vereinigt. Es gab eine pH-Verschiebung zu sauer und es erfolgte eine Einstellung mit 21 ml 1 n Natriumhydroxid, was in einem pH von 7,5 resultierte. Der. Mischung wurden 1902,6 ml Adjuvans 4B zugesetzt. Die gesamte Vakzine wurde gemischt und zum Testen und Bestimmen in 18 850 13 mm-Miniampullenvakzinebehälter, Endtyp I, gefüllt.
    • Beispiel 10:
  • Dieses Beispiel illustriert einen anderen Adjuvanszusatz zum inaktivierten Virus.
  • 1 l Hundecoronavirusflüssigkeiten, die mit 2% BEI inaktiviert waren, wurden in diesem Verfahren verwendet. Die Adjuvantien wurden auf folgende Weise hergestellt:
  • Adjuvans 10A: Eine Äthylen-Maleinsäureanhydrid (EMA)-Lösung wurde auf folgende Weise hergestellt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde bei 0,01 M in entionisiertem Wasser hergestellt. 8 g Natriumchlorid (NaCl) pro l wurden mit 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 1,15 g dibasischem Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;) und 0,2 g monobasischem Kaliumphosphat (KH&sub2;PO) versetzt. 6300 ml PBS wurden beim Herstellen von EMA verwendet. PBS wurde auf 100ºC erhitzt. 315 g EMA 31 #LCO7329 (Monsanto Co., 800 N. Lindberg Blvd., St. Louis, Missouri 63166) wurden zugesetzt und in PBS gelöst. 0,05 g Phenolrot wurden zugesetzt, um Gesamt-pH- Einstellung gen zu erleichtern. Nach dem Lösen wurde der pH der Lösung mit 260 ml 10 n Natriumhydroxid (NaOH) auf 6,8 eingestellt. Die Lösung wurde in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß verteilt und durch Behandlung im Autoklaven während 2 h bei 121ºC und 15 psi sterilisiert.
  • Adjuvans 10B: Eine CSMA-Suspension, verdünnt in PBS, wurde auf folgende Weise hergestellt. 5 Gallonen der gleichen PBS, wie oben mit bezug auf Adjuvans 10A beschrieben, wurden mit 5 Gallonen Neocryl A640, Artikel RC-4570 (polyvinyl Chemical Industries, 730 Main Street, Wilmington, Mass. 01887) gemischt. Die Suspension wurde gründlich gemischt und in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß und 12 l-Krüge verteilt. Diese Behälter wurden zum Sterilisieren 3 h lang bei 121ºC und 15 psi im Autoklaven behandelt.
  • 1 l der inaktivierten CCV-Flüssigkeiten wurde mit einem Magnetmischer gründlich gemischt. 60 ml Adjuvans 10A wurden Zuge setzt. Unmittelbar danach wurden 10 ml 1 n NaOH zugesetzt, um den pH auf 7,34 einzustellen (bestimmt durch ein Orion pH-Meter). 100 ml Adjuvans 10B wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 10 min gemischt und dann für Tierversuche in aliquote Teile geteilt.
    • Beispiel 11:
  • Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien mit inaktivierten Hundecoronaviren (CCV) KV.
  • 52 Hunde, seronegativ und auf CCV empfindlich, wurden verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Adjuvanssysteme mit einer abgetöteten Hundecoronavirusvakzine zu demonstrieren. Alle Versuchshunde wurden mit einer Dosis Produkt parenteral geimpft. Es wurde ein 2 Dosis-Vakzinationsschema verwendet. Serumneutralisierende Antikörperspiegel wurden 3 Wochen nach einer Impfung und 2 Wochen nach einer zweiten Impfung bestimmt. Reziproke mittlere geometrische serumneutralisierende Antikörperspiegel Zahl v. Versuchshunden Antigenspiegel verwendete Adjuvansarten Vor Vakzination 3 Wochen nach 1. Vakzination 2 Wochen nach 2. Vakzination Minimum voll
  • Alhydrogel und Reheis sind Markennamen für Aluminiumhydroxid.
  • Die Daten zeigen, daß das kombinierte Adjuvanssystem aus EMA-31 und Neocryl-A640 überlegen ist.
    • Beispiel 12:
  • Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Vakzinebestimmung.
  • Diese Untersuchung war dazu bestimmt, die Eignung und den Grad der Wirksamkeit einer inaktivierten Coronavirusvakzine zu bestimmen. Das in Beispiel 10 beschriebene Produkt mit Adjuvanszusatz wurde für diese Untersuchungen verwendet. Die Untersuchung würde auch bestimmen, ob eine Dosis oder zwei erforderlich wären, um den Hund adäquat zu schützen. 10 Hunde, die durch Serumneutralisationsversuche als CCV-seronegativ getestet wurden, wurden in der zweiteiligen Untersuchung verwendet. 6 der Hunde, Nr. 214, 222, 219, 220, 212 und 213, wurde eine 1 ml-Dosis Vakzine intramuskulär verabreicht. Diesen Hunden wurde an den Tagen 4, 7, 11, 14 und 21 nach der ersten Vakzination Blut entnommen, um die Reaktion auf die Vakzine serologisch zu beobachten. Die Hunde 214 und 222 zusammen mit Reizkontrollen, 244 und 245, wurden intranasal-oral mit 1-171 Virus (ATCC VR-809) gereizt. 5 Tage nach der Reizung wurden die vier Tiere eingeschläfert und auf Beweis von Coronavirusinfektion untersucht. Gesamtpathologie zeigte eine auf fallende Entzündung des Dünndarmes in den Reizkontrollen (244 und 245). Die geimpften Tiere zeigten jedoch, wenn überhaupt, nur geringe Entzündungsanzeichen. Das gleiche traf bei Prüfung des Pankreas zu. Proben des Gehirns, der Hirnhäute, der Lunge, der Leber, der Milz, des Mesenteriums, der Mesenteriumlymphknoten, des Pankreas und 10 Proben von gleichem Abstand und Stellen in den Gedärmen wurden von jedem Hund für CCV-Nachweis durch Fluoreszenzantikörper-Exfoliation genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-1 angegeben. Tabelle 12-1 CCV-Hundeuntersuchung Eine Dosis abgetötete Hundecoronavirusvakzine- CCV-FA-Exfoliationsergebflisse 5 Tage nach Reizung Hund Nr. und Behandlungsgruppe Gewebe Durchschnitt Kontrollen Gehirn Hirnhäute Lunge Leber Milz Mesenterium Mesenteriumlymphknoten Pankreas Darm 1 Darm 2 Darm 3 Darm 4 Darm 5 Darm 6 Darm 7 Darm 8 Darm 9 Darm 10 Gesamtdarm Niere
  • Bei Vergleich des Infektionsgrades, wie durch Fluoreszenzantikörper-Exfoliation bewiesen, war ersichtlich, daß die Vakzine beim Vermindern von Virusinfektion der Gedärme wirksam war. Ein Gesamtfluoreszenzantikörper (FA)-Durchschnitt von 52 1/4+ wurde in den Reizkontrollen gezeigt. Es zeigte sich, daß die vakzinierten Tiere einen 1/4 + FA Durchschnitt hatten. Dies zeigte eine 99,5%ige Verminderung in den vakzinierten Tieren im Vergleich mit den Reizkontrollen an. Eine modifizierte Lebendvakzine ergab daher eine 95%ige Verminderung, was beweist, daß der durch die inaktivierte Vakzine gelieferte Schutz vergleichbar wäre.
  • Serumneutralisations (SN)-Versuche am Tag 14 und 21 nach der Vakzination und Blutentnahmen am Tag 5 nach der Reizung wurden durchgeführt. "KV" bezeichnet "abgetötetes Virus". Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-2 angegeben. Tabelle 12-2 SN Ergebnisse nach einer Dosis KV CCV und Vergleich mit Reizkontrollen Tierbezeichnung Vakzine 14 Tage nach Vakzination 21 Tage nach Vakzination Tag der Reizung 5 Tage nach Reizung Dosis keine: Reizkontrolle nicht getestet
  • Aus Tabelle 12-2 ist ersichtlich, daß ein 1 : 59 SN- Antikörperspiegel zum Schutz ausreichend ist. Beide vakzinierten Tiere reagierten mit einer Dosis Vakzine so, daß sie einen ausreichenden Serumneutralisationsantikörpertiter zusammen mit lokaler Zielimmunität aufwiesen, um Schutz gegen Infektion vorzusehen. Die Reizkontrollen reagierten zur Zeit der Reizung serologisch, was weiter beweist, daß sie gereizt waren. Die vakzinierten Tiere reagierten 5 Tage nach der Reizung in den ersten Stadien einer amnestischen Reaktion.
  • Die zweite Dosisphase der Untersuchung begann 21 Tage nach der ersten Vakzination. Den vier übrigen Hunden wurde eine zweite 1 ml-Dosis der inaktivierten CCV-Vakzine, intramuskulär verabreicht, gegeben.
  • Zwei Wochen nach der zweiten Vakzination wurden die vier vakzinierten Hunde 212, 213, 219 und 220 zusammen mit zwei empfindlichen Coronakontrollhunden, 270 und 271, gereizt. Das 1-171 (ATCC VR-809) Coronavirus wurde als Reizvirus verwendet. 5 ml pro Hund wurden intranasal und oral verabreicht. 5 Tage nach der Reizung wurden alle sechs Hunde eingeschläfert und Proben des Darms, der Milz, des Gehirns und der Hirnhäute für Exfoliation Floureszenzantikörperuntersuchung zum Hundecoronavirusnachweis genommen. 10 Proben des Darms wurden genommen, aber nur einzelne Proben der anderen Organe. Die Exfoliationsergebnisse sind in Tabelle 12-3 zusammengefaßt. Tabelle 12-3 Exfoliation CCV FA-Ergebnisse nach Reizung Hund Vakzine PROBEN Darm Milz Hirn Hirnhäute Gesamtinfektiosität Dosen Reizkontrolle
  • Der Durchschnitt für die beiden Kontrollen auf CCV- Infektiosität betrug 24,3. Der Durchschnitt für die vier vakzinierten Hunde betrug 1,25. Die Gesamtverminderung der Infektiosität war 94,9% im Vergleich von vakzinierten Hunden mit Kontrollen. Es wurde festgestellt, daß CCV-Virusreplikation in den Hirnhäuten in den Kontrollen auftrat. Kein Anzeichen von Virus wurde in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere nach Reizung gefunden. Daher war den vakzinierten Tieren Schutz gegen Gehirnhautinfektion verliehen.
    • Beispiel 13:
  • Dieses Beispiel zeigt die Verträglichkeit von CCV KV mit anderen Virusfraktionen. Ziel dieser Untersuchung war es, zu zeigen, daß die abgetötete Hundecoronavirusvakzine in Kombination mit Hundestaupevirus-, Hundeadenovirus Typ 2-, Hundeparainfluenza und Hundeparvovirusvakzinen verwendet werden kann.
    • Versuchsplan 1. Vakzination
  • 21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml-Volumen der Immunisierungsfähigkeitsreihe vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert.
  • Den 21 vakzinierten Hunden und den sieben Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welcher Zeit die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, und 14 Tage nach der zweiten Vakzination Blut entnommen.
  • An allen vakzinierten Hunden erfolgten Antikörperspiegelbestimmungen für alle fünf Virusmittel, um die Höhe der Antikörperreaktion zu zeigen, die mit dem Kombinationsprodukt [DA&sub2;PC(KV)-CPV(MLV)] erwartet werden kann. Der Zweck dieser Daten war es, zu bestimmen, ob Antigenblockierung erfolgt.
    • Antigenverträglichkeit (siehe Tabelle 13-1)
  • Tabelle 13-1 ist eine zusammenfassende Tabelle, die die mittleren geometrischen Antikörpertiter für jede der im Kombinationsprodukt enthaltenen fünf Fraktionen angibt.
  • Die Daten beweisen die erwarteten Antikörpertiter, die mit einer Mindeststärke von KV Kombinationsreihe zu erwarten sind. Die Daten zeigen, daß alle vakzinierten Tiere auf Vakzination reagierten und daß keine Antigenblockierung auftrat. Die Reizdaten beweisen, daß die immunologischen Eigenschaften der KV CCV-Fraktion durch die vier anderen Virusfraktionen (CDV, CAV-2, CPI, CPV), die in der Vakzine vorhanden waren, nicht beeinträchtigt wurden. Tabelle 13-1 Mittlere geometrische Antikörpertiter 3 Wochen nach 1. Vakzination 2 Wochen nach 2. Vakzination Vakzinationsweg gesamt Hunde
    • Beispiel 14:
  • Dieses Beispiel illustriert Hundecoronavirusquerneutralisation zwischen fünf verschiedenen Isolaten
  • Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Querneutralisationsbeziehungen (Serumneutralisation des Virus) zwischen verschiedenen Isolaten von Hundecoronavirus zu bestimmen. Spezifisches Antiserum auf jedes einzelne Isolat wurde in empfindlichen Hunden hergestellt. Serumneutralisations (SN)-Tests mit den verschiedenen Isolaten bei konstanten Höhen oder Titern wurden gegen Zweifachverdünnungen der spezifischen Antisera gemacht. Mit anderen Worten, der Antikörper, der in den Hunden durch ein spezifisches Isolat induziert wurde, wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, verschiedene andere Virusisolate sowie das identische Virusisolat, das zum Induzieren des Antikörpers verwendet wurde, zu neutralisieren, bestimmt. Ein Virusisolat, das Antikörper induziert, welcher die meisten Virusisolate neutralisiert, ist der beste Vakzinevirusanwärter. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Die spezifischen Antisera sind vertikal gegen die verschiedenen horizontal angegebenen Isolate dargestellt. Die reziproke SN-Höhe ist ausgedrückt. Antisera gebildet durch CCV Antikörperhöhe gegen die virusindzierende Antikörperbildung Antikörperhöhen gegen andere Viren Nr.
  • Die Daten wurden vom Standpunkt des Antikörpers analysiert, der alle fünf Viren neutralisieren würde. Der durch das ATCC Nr. VR2068 Virusisolat induzierte Antikörper neutralisierte die anderen vier Viren in signifikantem Ausmaß.
  • Das A76-5 Antiserum und Virus erwiesen sich als am wenigsten querreaktiv mit den fünf getesteten Isolaten. Es erwies sich, daß das ATCC VR 2068 ein signifikantes Ausmaß an Querreaktivität mit diesem Virusisolat hatte.
  • Die Daten zeigen auch, daß es keine größeren serologischen Unterschiede zwischen diesen fünf Hundecoronaviren gibt. Die I-171- und ATCC VR 2068-Viren sind als die besten Auswahlen für Vakzinestämme angezeigt; jedoch könnte auf Grund der Querneutralisation zwischen allen Isolaten jedes der Hundecoronaviren als ein Antigen verwendet werden.
    • Beispiel 15:
  • Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit der Vakzine.
  • 28 auf CDV, CAV&sub2;, CPI, CCV und CPV seronegative Hunde wurden als vakzinierte Tiere und als Umgebungskontrollen verwendet. 21 Hunde wurden als geimpfte Tiere und 7 Hunde als Umgebungskontrollen verwendet. Die 7 Umgebungskontrollen zusammen mit 3 weiteren auf CCV seronegativen Hunden wurden als Reizkontrollhunde verwendet. 31 Hunde wurden für die gesamte Untersuchung verwendet.
  • 21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml Volumen der Immunisierungsfähigkeitsreihe vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert. Den 21 vakzinierten Hunde und den 7 Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welchem Zeitpunkt die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, 14 Tage nach der zweiten Vakzination und 28 Tage nach der zweiten Vakzination, was auch den Tag der Reizung darstellt, Blut entnommen.
  • An allen Umgebungskontrollen wurden für alle 5 viralen Mittel Antikörperhöhebestimmungen vorgenommen, um zu zeigen, daß während des Verlaufes der Untersuchung keine Exposition an Fremdvirus stattfand. Antikörperhöhebestimmungen vor der Reizung wurden vorgenommen, um die Empfindlichkeit der Reizkontrollhunde auf CCV zu zeigen.
  • Den 21 vakzinierten und den 10 Kontrollhunde wurde Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und mit der CCV I-171-Reizvirusidentität gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml pro Nasenloch und 3 ml oral oder 5 ml Reizung pro Hund. 2 Tage vor der Reizung und 6 bis 7 Tage nach der Reizung erfolgten Zählungen der weißen Blutzellenlymphozyten.
  • Fünf auf subkutanem Weg vakzinierte Hunde, fünf auf intramuskulärem Weg vakzinierte Hunde und fünf Reizkontrollhunde wurden 6 Tage nach der Reizung eingeschläfert. Am 7. Tag nach der Reizung wurden fünf auf subkutanem Weg, sechs auf intramuskulärem Weg und fünf Reizkontrollhunde eingeschläfert.
  • Der Dünndarm wurde entfernt und 10 bis 13 Zoll Teile von jedem Hund wurden zum Testen verwendet. Die zehn Teile wurden in jedem Hund von den gleichen Bereichen genommen. Der erste Teil (Probe 1) wurde unmittelbar unter dem Magen genommen und der letzte Teil (Probe 10) wurde unmittelbar oberhalb der Verbindung Dünndarm-Dickdarm erhalten. Jeder Teil wurde abgeschabt und die Darmproben wurden in PBS suspendiert. Die die Zellsuspension enthaltenden Rohre wurden insgesamt auf Aussehen beobachtet. Zellproben von jedem Rohr wurden auf Objektträger gegeben, luftgetrocknet, mit Aceton fixiert und mit Hundecoronavirusantikörperkonjugat angefärbt. Diese Objektträger wurden dann untersucht, um das Ausmaß der Virusinfektion zu bestimmen, das in den Zellen bestand.
    • Ergebnisse und Diskussion A. Zählungen von weißen Blutzellen nach Reizung
  • Eine Verminderung der Zahl der weißen Blutkörperchen von mehr als 45% von der Grundlinie wurde zum Zweck der Bewertung dieser Untersuchung verwendet.
    • Vakzinierte Tiere
  • Sechs Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den subkutan geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC-Zahlindexnummer (6 dividiert durch 65) betrug 0,092.
  • Drei Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 72 WBC-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC-Zahlindexnummer (3 dividiert durch 72) betrug 0,042.
    • Kontrollen
  • 20 Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die WBC-Zahlindexnummer (20 dividiert durch 65) betrug 0,308 für die Reizkontrollen. Ein anderer Weg zum Ausdrücken dieser Daten ist, daß 30,8% der WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, 45% unterhalb der Grundlinienzahlen vor der Reizung lagen.
    • Diskussion
  • Die perzentuelle Verhinderung der WBC-Abfälle unter 45% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit Kontrollen beträgt 79,6%. Der Großteil der WBC-Abfälle erfolgte an den Tagen 2 und 3.
  • Tabelle 15-1 vergleicht die WBC-Abfälle von vakzinierten Tieren gegenüber Kontrollen auf täglicher Basis. Tabelle 15-1 Tage nach Reizung Hunde, die einen WBC-Abfall von oder höher unterhalb der Grundlinie zeigen Kontrollen vakzinierte Tiere
  • Daher verleiht die Vakzine den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz bei der Verhinderung von Abfällen der WBC- Zahlen.
    • B. Lymphozytenzellenzahlabfälle nach Reizung
  • Eine Lymphozytenzellenzahlverminderung von mehr als 50% von der Grundlinie wurde für die Zwecke der Auswertung dieser Untersuchung verwendet.
    • Vakzinierte Tiere
  • Sechs Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde.
  • Drei Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von den 72 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (3 dividiert durch 72) betrug 0,042 für diese Gruppe.
    • Kontrollen
  • 16 Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von den 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde Die Lymphozytenabfälle traten am häufigsten am Tag 4 nach der Reizung mit 7 von 10 Hunden (70%) auf, die einen Abfall der Lymphozyten zeigen. Zwei andere Tage, die eine hohe Frequenz von Lymphozytenabfällen nach Reizung zeigten, waren Tag 3 mit 5 von 10 Hunden (50%) und Tag 2 mit 3 von 10 (30%).
    • Diskussion
  • Die perzentuelle Verhinderung von Lymphozytenzahlabfällen unter 50% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit Kontrollen betrug 73,2%.
  • Der Großteil der Lymphozytenabfälle erfolgte an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung. Tabelle 15-2 vergleicht die Lymphozytenabfälle von vakzinierten Tieren gegenüber Kontrollen an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung. Tabelle 15-2 Tage nach Reizung Hunde, die Lymphozytenabfall von oder mehr unterhalb der Grundlinie zeigen Kontrollen vakzinierte Tiere
  • Die Daten zeigen, daß die abgetötete CCV-Vakzine den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz bei der Verhinderung von Abfällen der Lymphozyten nach Reizung verliehen hatte.
    • C. Darminfektion mit Hundecoronavirus nach Reizung Vakzinierte Tiere
  • Die 210 Darmproben wurden durch die Technik des Anfärbens mit fluoreszierendem Antikörper auf Anwesenheit von CCV-Virus untersucht.
  • In den Hirnhäuten keines der vakzinierten Tiere wurde eine Fluoreszenz, die typisch für das CCV-Virus ist, festgestellt.
  • Die Zahl von positiven Proben pro Infektionsgrad (4+ - 1/8+) wurde zusammengezählt und für jeden Hund die Gesamt-FA+ bestimmt. Der infektiöse Index für jeden Hund wurde nach folgender Methode berechnet.
  • Eine infektiöser Gruppenindex wurde durch zusammenzählen des infektiösen Index der einzelnen Hunde und Dividieren durch die Gesamtzahl von Hunden in jeder Gruppe erhalten.
  • Der infektiöse Index für die subkutan vakzinierten Hunde war 0,0025, während der infektiöse Index für die intramuskulär vakzinierten Hunde 0,0034 war.
  • Der infektiöse Index für die vakzinierten Tiere, untersucht am Tag 6, gegenüber den am Tag 7 untersuchten variierte nicht signifikant.
    • Kontrollen
  • Die 100 Darmproben wurden durch die Technik des Anfärbens mit fluoreszierendem Antikörper auf die Anwesenheit von CCV-Virus untersucht. 81 der 100 Proben (81%) waren viruspositiv. Der Infektionsgrad betrug von 4+ (hochinfizierte Proben) bis negativ. Alle 10 Reizkontrollhunde (100%) zeigten CCV-Infektion des Darmtraktes.
  • 3 der 10 Reizkontrollhunde (30%) zeigten in ihren Hirnhäuten für CCV typische Fluoreszenz.
  • Die Zahl von positiven Proben pro Infektionsgrad (4+ bis 1/8+) wurde verglichen. Die gleichen oben angewandten Berechnungsmethoden wurden für diese Daten verwendet.
  • Der infektiöse Index für die Reizkontrollhunde beträgt 1,594. Der infektiöse Index für die Reizkontrollhunde, untersucht am Tag 6, gegenüber den am Tag 7 untersuchten variierte in gewissem Ausmaß. 90% der Proben der am Tag 6 untersuchten Kontrollhunde waren positiv, während 72% der Proben der Kontrollhunde, die am Tag 7 untersucht wurden, positiv waren. Der Infektionsgrad war am Tag 7 gegenüber dem Tag 6 um 36,5% niedriger. Alle Kontrollhunde waren mit CCV infiziert.
    • Diskussion
  • Es wurde ein Vergleich der vakzinierten Tiere und der Kontrollen betreffend die Schwere und das Auftreten von Darminfektion gemacht. Die Daten wurden auch zwischen dem 6. und 7. Tag nach den Beobachtungsperioden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß der verliehene Schutzgrad nicht vom Vakzinationsweg abhängig ist.
  • Die Vakzine verminderte den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 99,7%. Die Daten basierend auf dem Auftreten von positiven Proben pro Testgruppe unabhängig vom Infektionsgrad zeigen, daß die Vakzine den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 96,5% verminderte. Die von den am Tag 6 und 7 nach der Reizung beobachteten Proben erhaltenen Daten zeigen, daß durch die Vakzine eine 98,1%ige Verminderung der Darminfektion, gemessen durch Schwere und Auftreten, vorgesehen wurde. Eine 97%ige Verminderung der Darminfektion, gemessen durch das Auftreten, wurde durch die Vakzine vorgesehen. Die Testparameter von Temperaturreaktion, Reaktion der weißen Blutkörperchen und Lymphozytenreaktion sowohl für vakzinierte Tiere als auch Kontrollen nach Reizung wurden zusammengefaßt. Es sei darauf verwiesen, daß CCV-Virus in den Hirnhäuten von 30% der Kontrollen festgestellt wurde, während kein CCV-Virus in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere festgestellt wurde.
    • D. Serologische Daten Umgebungskontrollen
  • Antikörperspiegelbestimmungen an den sieben Umgebungskontrollen zeigten, daß keine Exposition an fremdes CDV-, CAV-2-, CPI- oder CPV-Virus im Verlauf des Versuches erfolgte. Diese Antikörperspiegelversuche wurden an Blutproben durchgeführt, die 5 Wochen nach der ersten Vakzination entnommen worden waren, was auch der Zeitraum von 2 Wochen nach der zweiten Vakzination ist.
    • Antikörperspiegel auf Hundecoronavirus vor und nach Vakzination Vakzinierte Tiere
  • Die Antikörpertiter der vakzinierten Tiere zum Zeitpunkt der Vakzination, 3 Wochen nach der ersten Vakzination, 2 Wochen nach der zweiten Vakzination, 4 Wochen nach der zweiten Vakzination und 6 oder 7 Tage nach der Reizung zeigen, daß alle vakzinierten Tiere vor der Vakzination seronegativ waren. Die Daten zeigen, daß 20 von 21 vakzinierten Tieren (95,2%) auf die erste Vakzination serologisch reagierten. Der mittlere geometrische Titer betrug 1 : 7,9. Der mittlere geometrische Titer 2 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg um das 7,6-fache auf einen Titer von 1 : 59,7. Alle vakzinierten Tiere hatten SN-Titer von höher als oder gleich einem SN-Titer von 1 : 9. Der mittlere geometrische Titer 4 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg weiter um das 1,57-fache auf einen Titer von 1 : 93,9. Der niedrigste aufgezeichnete Antikörpertiter 4 Wochen nach der zweiten Vakzination betrug 1 : 34. Der subkutane Vakzinationsweg schien einen etwas höheren Antikörpertiter zu bewirken als der intramuskuläre Vakzinationsweg.
  • Die SN-Antikörperhöhen nach Reizung zeigen, daß in den vakzinierten Tieren nach Reizung ein niedrigerer Antikörperspiegel festgestellt wurde. Der Blutentnahmezeitpunkt 5 und 6 Tage nach Reizung ist wahrscheinlich zu früh, daß Amnesie erfolgt. Es kann sein, daß die Reizvirus-Antikörperwechselwirkung die beobachteten geringeren SN-Reaktionen erklären könnte.
    • Kontrollen
  • 7 der 10 Kontrollhunde dienten als Umgebungskontrollen sowie als Reizkontrollhunde. Die Hunde waren zum Zeitpunkt der Reizung seronegativ, was beweist, daß während der Untersuchung keine Umgebungsexposition an CCV-Lebendvirus erfolgte. Dies bewies auch ihre Empfindlichkeit auf das Reizvirus.
  • Die Antikörperspiegel 6 und 7 Tage nach Reizung blieben niedrig. Dies ist nicht unerwartet. Eine meßbare Antikörperreaktion auf parenterale CCV-Impfung ist 6 bis 9 Tage. Die FA-Beobachtungen der Darmtraktproben zeigen, daß das Virus in den Hunden vorhanden war, doch war keine Seroumwandlung in einem 7 Tage-Intervall zwischen Reizung und Blutentnahme vor dem Einschläfern der Hunde erfolgt.
  • Die obigen Ergebnisse demonstrieren die zufriedenstellende Immunisierungsfähigkeit einer abgetöteten Hundecoronavirus (CCV)- Vakzine.

Claims (5)

1. Veterinärvakzinezusammensetzung, umfassend ein Virusantigen, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Adjuvans, u.zw. mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus Ethylenmaleinsäureanhydrid und Styrol-Copolymer mit einer Mischung aus Acrylsäure und Methacrylsäure.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Virusantigen ein Hundecoronavirusantigen ist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Virusantigen ein avirulentes Antigenprodukt ist, welches hergestellt wird entweder
(a) durch Abschwächung des Hundecoronalebendvirus mittels Passage durch Zellen von Katzenursprung derart, daß das abgeschwächte Lebendvirus bei einer Verabreichung an einen Hund mittels Injektion das Darmepithel selektiv infiziert, oder
(b) durch Inaktivierung eines in Katzen- oder Hundezellen propagierten Hundecoronavirus.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das avirulente Produkt ein inaktiviertes Hundecoronavirusprodukt mit einem Präinaktivierungstiter von etwa 10.000 bis 10,000,000 Virusteilchen pro Dosis, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, ist.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Adjuvans Ethylenmaleinsäureanhydrid ist.
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