DE3854575T2

DE3854575T2 - Reassortantes Rotavirusvakzin.

Info

Publication number: DE3854575T2
Application number: DE3854575T
Authority: DE
Inventors: H Fred Clark; Paul Offit; Stanley A Plotkin
Original assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1987-11-30
Filing date: 1988-11-30
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2008-12-01
Also published as: EP0323708B1; EP0323708A1; DE3854575D1; LU91297I2; ATE128873T1; NL300252I2; AU2630688A; AU618973B2; NL300252I1; JPH02138970A; GR3018262T3; IL88534A0; CA1303525C; ZA888931B; DE122006000071I1; IL88534A; JP2818760B2; ES2079358T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen neuartige Rotavirus-Reassortanten, Vakzinen unter Verwendung der neuartigen Reassortanten und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verabreichung. Insbesondere stellt die Erfindung eine Reassortante bereit, in der entweder das für das ursprünglich unter der Bezeichnung v.p.3, jedoch später unter der Bezeichnung v.p.4 bekannte Neutralisierungsantigen kodierende Gen oder das für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierende Gen vom Rinder-Rotavirus des Stamms WC3 stammt, das andere dieser beiden Gene aus einem ausgewählten Human-Rotavirus stammt und weitere Gene vom Rinderstamm und/oder vom menschlichen Rotavirus stammen.

Stand der Technik

Rotaviren stellen das wichtigste ätiologische Agenz der infektiösen Gastroenteritis (Diarrhöe) dar, die weltweit der Hauptgrund für Kindersterblichkeit ist. Von den jährlich ungefähr 5 bis 10 Millionen Fällen von Kindertod, die durch akute infektiöse Gastroenteritis verursacht werden [Walsh et al, New Eng. J. Med. 301:967 (1979)], verursachen Rotaviren zwischen 10 bis 40% aller Fälle pro Jahr [deZoysa und Feachem, Bull WHO, 63:569 (1958)]. Obwohl die durch infektiöse Gastroenteritis verursachten Fälle von Kindersterblichkeit in Entwicklungsländern erstaunlich sind, so führen Rotaviren auch dazu, daß ein Großteil solcher Fälle in entwickelten Ländern, wie z. B. den Vereinigten Staaten, zu einem Krankenhausaufenthalt führt. So ist rotavirusbedingte infektiöse Gastroenteritis sogar in entwickelten Ländern einer der zehn Hauptgründe für Kindersterblichkeit [Ho et al, 27th Interscience Conf. Antimicrobiol Agents Chemotherapy, Seite 2 (1987)].
Serologische Untersuchungen deuten daraufhin, daß weltweit praktisch alle Kinder während ihrer ersten zwei oder drei Lebensjahre mit Rotavirus infiziert werden. Während rotavirusbedingte Krankheiten hauptsächlich zwischen 6 und 24 Monaten auftreten, so tritt die Krankheit in unterentwickelten Ländern häufig im Alter von unter 6 Monaten auf. Rotavireninfektion wird fäkal/oral von Mensch zu Mensch übertragen und hat typischerweise eine Inkubationszeit von ein bis drei Tagen. Bei Kindern ist die Anzahl von Opfern bei Rotavireninfektion hoch, während die meisten Infektionen bei Erwachsenen mild oder symptomfrei sind. Rotaviren wurden außerdem als Erreger von Diarrhöe bei Neugeborenen bei praktisch allen Haustierarten identifiziert. Rotaviren, die von Primaten oder Rindern stammen, sind kugelförmige Viren mit einem Durchmesser von ungefähr 70 nm und durch eine doppelte Hüllstruktur gekennzeichnet. Das Rotavirengenom verfügt über elf Abschnitte doppelsträngiger RNA und über eine RNA- Polymerase. Jeder RNA-Abschnitt stellt ein Gen dar, das für ein einziges aus einem Protein bestehendes Genprodukt kodiert. Die meisten der bis jetzt identifizierten tierischen und menschlichen Rotaviren werden den Rotaviren der Gruppe A zugeordnet und verfügen über ein gemeinsames kreuzreaktives Antigen [Estes et al, Immunochemistry of Viruses, Elsevier, Amsterdam: 389 (1984)]. Verschiedene Rotavirusarten lassen sich jedoch durch unterschiedliche serotypspezifische Virus-Oberflächenantigene unterscheiden. Diese Oberflächenantigene lassen sich am einfachsten in herkömmlichen Serum- Neutralisations(SN)-Tests nachweisen. Bei einem Serum- Neutralisationstest produziert ein Antiserum gegen ein gereinigtes Virus eines bestimmten Serotyps einen höheren SN-Titer mit einem Virus eines homologen Serotyps als mit einem Virus eines heterologen Serotyps. Bei den Human- Rotaviren unterscheidet man heutzutage zwischen mindestens sechs Serotypen, nämlich den Serotypen 1, 2, 3, 4, M69 und einem neuen Serotypen WI61. [Wyatt et al, Infect and Immun, 37:110 (1983); Matsuno et al, J. Virol., 54:623 (1985) Clark et al, J. Clin. Microbiol., 25: 1757 (1987)].
Bezüglich der Frage, ob serotypspezifische Antigenstimulierung zur Bildung eines Immunschutzes gegen Rotavireninfektion erforderlich ist, ist man mit dem derzeit verfügbaren Wissen über die Kreuzimmunität verschiedener Serotypen bei Tieren und bei Menschen zu widersprüchlichen Ergebnissen gelangt. Siehe z.B. eine Reihe von Berichten über Untersuchungen mit Vakzineprovokation bei Tieren [Wyatt et al, Science, 203:548 (1979); Zissis et al, J. Inf. Dis. 148:1061 (1983); Sheridan et al, J. Inf. Dis. 149:434 (1984)]. Siehe auch eine Reihe von Berichten über Rotavirus-Vakzinen, die an Tieren und am Menschen ausgewertet wurden [Mebus et al, J.A.V.M.A., 163:880 (1973); Thurber et al, Canad, Vet. J., 17:197 (1976); Vesikari et al, Lancet, 2:807 (1983); De Mol et al, Lancet 2:108 (1986); Clark et al, Amer. J. Dis. Children, 140:350 (1986); Kapikian et al, Vakzines, New York, Cold Spring Harbor Lab., 357 (1985); Losonsky et al, Ped Inf. Dis., 5:25 (1986); Santosham et al, 27th Int. Conf. Antimicrobiol. Agents and Chemotherapy, Seite 99 (1987)]. Diese Untersuchungen haben bei einigen Fachleuten zu der Vermutung geführt, daß eine ideale Rotavirus-Vakzine möglicherweise serotypspezifische Antigene enthalten muß, die für alle weitverbreiteten Humanrotavirus-Serotypen typisch sind.
Der Grund dafür, daß Human-Rotaviren nicht zum Zweck einer Vakzine eifrig verfolgt wurden, liegt darin, daß zellkulturadaptierte Human-Rotaviren schlecht replizieren, insbesondere in den Zellen, die man als Substrate für humane Vakzinen als annehmbar erachtet. Außerdem ist die mögliche Pathogenität von Human-Rotavirusisolaten weitgehend unbekannt. Um diese Nachteile zu überwinden, wurde die genetische Rekombination von Human- Rotaviren mit tierischen Rotaviren vorgeschlagen. Solch eine Rekombination, die bei Rotaviren als "Reassortierung" bezeichnet wird, ist deshalb möglich, da das RNA-Genom von Rotaviren abschnittartig aufgebaut ist und Genreassortierung während Koinfektion mit großer Häufigkeit auftritt. Werden zum Beispiel kultivierte Zellen einer Mischinfektion mit zwei verschiedenen Rotavirus-Stämmen unterzogen, so tritt häufig ein spontanes Vermischen, d.h. eine genetische Reassortierung, von den Abschnitten der beiden Rotaviren auf. Einzelne Virusnachkommen aus solchen Mischinfektionen werden dadurch selektiert, daß man Einzel-Plaques aus einem Plaque-Test isoliert. Durch die charakteristische Wandlungsgeschwindigkeit in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) jedes Genabschnitts läßt sich nachweisen, von welchen Eltern jeder Genabschnitt des Virusnachkommen stammt.
Reassortante Rotaviren, die als mögliche Humanvakzine hergestellt und vorgeschlagen wurden, umfaßten hauptsächlich Rotaviren tierischer Herkunft, bei denen ein einzelnes Genprodukt, nämlich das 38 000 Dalton schwere v.p.7-Antigen von Gen 9 oder 8, durch das für das v.p.7 kodierende Gen eines Rotavirus des Human-Serotyps ersetzt wurde. Das v.p.7-Protein agiert als wichtiges serotypspezifisches Antigen und ist in Serum-Neutralisationstests wirksam. Es vermag serotypspezifische neutralisierende Antikörper und im Maussystem serotypspezifischen Immunschutz gegen durch Rotavirus verursachte Krankheit zu induzieren. Siehe z.B. Offit et al, J. Virol., 60:491 (1986)]. Zu diesen Reassortanten, die das für v.p.7 kodierende Gen enthalten, gehören Reassortanten, denen ein U.K.-Stamm des Rinder-Rotavirus mit einem v.p.7 des Serotyps 1, 2, 3 oder 4 oder ein Rhesus- Rotavirus (RRV) mit einem v.p.7 des Serotyps 1, 2 oder 4 zugrundeliegt [Midthun et al, J. Virol., 53:949 (1985); Midthun et al J. Clin. Microbiol., 24:822 (1986) und US- A-4 571 385].

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt reassortante Rotaviren zur Verfügung, die zur Verwendung als Vakzinen gegen Infektion mit Human-Rotaviren geeignet sind. Eine Art von erfindungsgemäßen Reassortanten enthält zumindest das Gen (den Genabschnitt 4) des Rinder-Rotavirusstamms WC3 (oder eines seiner Isolate), das für das ursprünglich unter der Bezeichnung v.p.3, jedoch später unter der Bezeichnung v.p.4 bekannte Neutralisierungsantigen kodiert, und das für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierende Gen aus einem ausgewählten Human-Rotavirus. Reassortanten, die gemäß diesem Gegenstand der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, enthalten zwnindest einen weiteren Genabschnitt eines Human-Rotavirus sowie den für v.p.7 kodierenden Genabschnitt, mit der Voraussetzung, daß der für das ursprünglich unter der Bezeichnung v.p.3, jedoch später unter der Bezeichnung v.p.4 bekannte Antigen kodierende Abschnitt vom Rinderstamm WC3 stammt. Ein oder mehrere weitere Genabschnitte vom Rinderstamm WC3 können ebenfalls vorliegen.
In den Reassortanten dieser Klasse gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Genabschnitt 4 des Rinder- Rotavirusstamms WC3 oder dessen Nachkommenschaft, wie in US-A-4,636,385 beschrieben, verwendet. Weitere spezifische Rinder-Rotaviren des WC-Stamms, die das ursprünglich unter der Bezeichnung v.p.3, jedoch später unter der Bezeichnung v.p.4 bekannte Antigen der neuen Reassortante zur Verfügung stellen können sind WC2, WC4, WC5, WC6, WC7, WC8, WC9 und WC10.
Das Neutralisierungsantigen aus Genabschnitt 4 war ursprünglich in der Literatur unter der Bezeichnung v.p.3 bekannt. Die Untersuchung von Liu, Offit und Estes, über die in der Publikation "Identification of the simian rotavirus SA 11 genome segment 3 product" [Identifikation des Produkts von Abschnitt 3 des Affen-Rotavirus SA 11- Genoms] in Virology, 136, 26-32 (1988) berichtet wurde, zeigte, daß ein Neutralisierungsantigen auch aus dem Genabschnitt 3 von Rotaviren erhalten werden konnte. In dieser Publikation wurde daher von diesen Wissenschaftlern vorgeschlagen, daß das Neutralisierungsantigen aus Genabschnitt 3 die Bezeichnung v.p.3 tragen und die Bezeichnung des Neutralisierungsantigens aus Genabschnitt 4 von v.p.3 zu v.p.4 geändert werden sollte. Dieser Änderung bezüglich der Nomenklatur wurde in der vorliegenden Anmeldung Rechnung getragen, und das betreffende Neutralisierungsantigen, das sich, wie an anderer Stelle im Text vermerkt, von Genabschnitt 4 ableitet, wird im folgenden als Neutralisierungsantigen v.p.4 bezeichnet (obwohl hiermit kein Identitätsunterschied zu dem unter der Bezeichnung v.p.3 in der US-Patentanmeldung, deren Priorität im Rahmen des internationalen Abkommens in Anspruch genommen wird, bestimmten Antigen beabsichtigt ist).
Das für das Neutralisierungsantigen v.p.7 in dieser Klasse von neuen Reassortanten kodierende Human-Rotavirusgen kann aus jedem beliebigen Human-Rotavirus- Serotyp, gegen den immunisiert werden soll, ausgewählt werden. Eine Aufzählung solcher Serotypen, die jedoch nicht begrenzend ist, beinhaltet die Serotypen 1, 2, 3, 4, M69 und WI61, sowie neue, bis jetzt noch nicht bestimmte Virusserotypen.
Ein bestimmtes Beispiel von Reassortanten gemäß dieser erfindungsgemäßen Klasse ist WC3:2-5 (auch bekannt als WI78-1,6-II), die unten genauer beschrieben wird. Diese Reassortante wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, am 25. November 1987 unter der Hinterlegungsnummer ATCC VR2193 und VR2195 hinterlegt. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Hinterlegungen bei der ATCC, auf die im folgenden Text Bezug genommen wird, der Öffentlichkeit entsprechend den Erfordernissen der Bestimmungen 28(3) und (4) EPÜ verfügbar, wobei die Verfügbarkeit bis zur Veröffentlichung des Hinweises auf die Erteilung des Europäischen Patents oder bis zu dem Tag, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen wird, bzw. als zurückgezogen gilt, lediglich bei Bereitstellung einer Probe an einen vom Anmelder genannten Fachmann gilt. Andere von der Erfindung zur Verfügung gestellte Reassortanten sind WC3:2-6 (auch bekannt unter der Bezeichnung WI78-1,7-II), WI61:7,9; WI79-4, WI78-4 und WI61-4. Diese sowie andere von der Erfindung umfaßte Reassortanten können vom Fachmann durch Durchführung der im vorliegenden Text offenbarten Verfahren erhalten werden. Eine weitere Klasse von neuen Reassortanten gemäß der vorliegenden Erfindung enthält zumindest das für das Neutralisierungsantigen v.p.4 kodierende Gen eines Human- Rotavirus und das für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierende Gen eines Rinder-Rotavirusstamms WC3, wobei die restlichen Gene vom Human-Rotavirus und/oder vom Rinder-Rotavirusstamm stammen. Die gleichen Rinderstämme WC, die, wie oben beschrieben, zur Bereitstellung des v.p.4-Antigens in der anderen Klasse verwendet wurden, können auch in der vorliegenden Klasse verwendet werden. Gleichermaßen sind die für diese Klasse von Reassortanten nützlichen Human-Rotaviren wie oben für die andere Klasse beschrieben.
Als weiterer Gegenstand der Erfindung wird eine Vakzine für den Immunschutz gegen durch Human-Rotavirus verursachte akute Diarrhöe zur Verfügung gestellt, die mindestens einen der neuen reassortanten Rotaviren der vorliegenden Erfindung enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen erfindungsgemäßen reassortanten Virus. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
a) Infektion eines geeigneten Zellsubstrats mit einer Mischinfektion, bestehend aus einem Rinder-Rotavirusstamm WC3 und einem Human-Rotavirus unter Bedingungen, die eine Genreassortierung in dieser infizierten Kultur gestatten; und
b) PAGE-Untersuchung von Nachkommenschaftsklonen aus in der infizierten Kultur entstandenen Plaques auf das Verhandensein entweder einer Reassortante mit zumindest dem für das v.p.4-Antigen kodierenden Gen des Rinder- Rotavirus WC3 und zwei Genen des Human-Rotavirus, wobei es sich bei einem um das für das v.p.7-Antigen kodierende Gen handelt, oder einer Reassortante mit zumindest dem für das v.p.7-Antigen kodierenden Gen des Rinder-Rotavirus WC3 und dem für das v.p.4-Antigen kodierenden Gen des Human-Rotavirus. Für dieses Verfahren geeignete Zellsubstrate sind zum Beispiel CV-1, Vero, BSC-1, MA104 und primäre Primaten-Nierenzellkulturen.
Mit den erfindungsgemäßen reassortanten Vakzinen können Menschen gegen Infektion mit Human-Rotavirus geimpft werden. Das Impfverfahren besteht darin, daß man einem Menschen mindestens eine Dosis der ungefähr 106,0 bis 109,0 pfu enthaltenden Vakzine auf oralem oder nasalem Weg bzw. mittels Injektion verabreicht. Bei diesem Verfahren kann auch eine zusätzliche Dosis der Vakzine ungefähr 3 bis 4 Wochen nach der ersten Dosis verwendet werden. Die Vakzine kann direkt an Kleinkinder oder an Schwangere oder stillende Mütter zwecks Übertragung von Immunität auf ein Kleinkind verabreicht werden.
Weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach dem Studium der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung einschließlich der erläuternden Beispiele ihrer Durchführung ersichtlich.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Rotavirus-Reassortanten, die sich zur Verwendung als Vakzinen zur Verleihung eines Immunschutzes gegen Infektion mit Human- Rotaviren eignen. Die Reassortanten werden durch die genetische Reassortierung zwischen einem abgeschwächten Rinder-Rotavirus WC3, das in einer ersten Klasse von Reassortanten zumindest den das v.p.4-Protein kodierenden Genabschnitt und in einer zweiten Klasse von Reassortanten zumindest den für das v.p.7-Protein kodierenden Genabschnitt zur Verfügung stellt, und einem Rotavirus, der einen epidemiologisch wichtigen Human-Serotyp darstellt, der der ersten Klasse von Reassortanten zumindest den für das v.p.7-Protein kodierenden Genabschnitt und zumindest einen weiteren Genabschnitt sowie der zweiten Klasse von Reassortanten zumindest den für das v.p.4- Protein kodierenden Genabschnitt zur Verfügung stellt, hergestellt.
Bei dem Protein v.p.4 handelt es sich um ein wichtiges, 88 000 Dalton schweres Oberflächenstrukturproteinprodukt des Gen 4 eines Rotavirus. Wie v.p.7 fungiert es als wichtiges serotypspezifisches Antigen, das in SN- Tests wirksam ist und serotypspezifische neutralisierende Antikörper zu induzieren und im Maussystem serotypspezifischen Immunschutz gegen durch Rotavirus verursachte Krankheit zu induzieren vermag [Siehe Offit et al, (1986) oben]. In experimentellen Untersuchungen wurde gezeigt, daß v.p.4 auch bei der Kontrolle des Wirtskreises für Rotaviren in der Zellkultur [Kalica et al, Virol., 125:194 (1983); Greenberg et al, Infec. Immunol., 37:104 (1982)] und bei der Vermittlung von Rotavirenvirulenz in vivo [Offit et al, J. Virol., 57:46 (1986)] eine Rolle spielt.
Höchst wünschenswert ist es, daß eine Reassortante gemäß der vorliegenden Erfindung das für v.p.4 kodierende Gen 4 aus dem abgeschwächten Rinder-Rotavirusstamm WC3 oder dessen ausführlich in US-A- 4 636 385 beschriebener Nachkommenschaft enthält; auf die Offenbarungen dieses Patents wird hiermit ausdrücklich hingewiesen, um zusätzliche Information über diesen Rotavirusstamm zur Verfügung zu stellen. Representative Isolate dieses Stammtyps, mit denen WC3 ersetzt werden kann, sind WC2, WC4, WC5, WC6, WC7, WC8, WC9 und WC10. Diese Rinder-Rotaviren lassen sich leicht von anderen Stämmen von Rinder-Rotaviren aufgrund ihres RNA-Elektropherotyps, ihrer Unfähigkeit zur Hämagglutination roter Blutkörperchen von Primaten, ihrer Plaque-Morphology und der Antwort im SN- Test unterscheiden. Der gegenwärtig zur Verwendung in den Reassortanten der vorliegenden Erfindung bevorzugteste Stamm ist WC3. WC3 repliziert in CV-1-Zellen (ATCC CCL70) mit einem hohen Titer, und seine Attenuierung und Immugenität in Kleinkindern ist bekannt [Clark et al, Amer. J. Dis. Children, 140:350 (1986)].
Wird der für v.p.4 kodierende Abschnitt vom Rinder- Rotavirus WC3 oder einem seiner Isolate zur Verfügung gestellt, so kann es sich bei dem Rotavirus, das den für das v.p.7-Protein-kodierenden Genabschnitt zur Verfügung stellt, um einen beliebigen ausgewählten Human-Serotypvirus einschließlich der bekannten Serotypen 1, 2, 3, 4 und M69 und des neuen Serotyps WI61 handeln [siehe Clark et al, 1987 oben]. Das gewählte Human-Rotavirus kann gegebenenfalls auch für die Verwendung in der Reassortante abgeschwächt sein. Das v.p.7-Protein wird entweder von dem Genabschnitt 8 oder Genabschnitt 9 des jeweiligen Human-Rotavirus kodiert. Die Position des für v.p.7 kodierenden Gens kann für jedes einzelne Rotavirus durch übliche experimentelle Verfahren bestimmt werden. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Human-Rotavirusstämmen gehören die Stämme WI79, WICCI und WI/U von Serotyp 1; die Stämme WI-SC2 und WI/Q von Serotyp 2; die Stämme WI77, WI78, WI/P und WIC-17 von Serotyp 3; der Stamm WI-CC4 von Serotyp 4; und Serotyp/Stamm WI61. Diese Aufzählung von Rotaviren des Human-Serotyps ist nicht begrenzend; es wird erwartet, daß neubestimmte Rotaviren menschlichen Ursprungs ebenfalls für die im vorliegenden Text offenbarten Verfahren und Mittel verwendet werden können. Das Human-Rotavirus stellt zumindest ein weiteres Gen zur Verfügung und kann zusätzlich zu dem für v.p.7 kodierenden Gen noch mindestens ein weiteres Gen für die Reassortante zur Verfügung stellen. Wird jedoch das für v.p.7 kodierende Gen vom Human-Rotavirus zur Verfügung gestellt, so muß das für v.p.4 kodierende Gen vom Rinderstamm zur Verfügung gestellt werden, um erfindungsgemäße Reassortanten zu erhalten.
Spezielle Beispiele von Reassortanten gemäß der vorliegenden Erfindung sind eine neue Reassortante mit der Bezeichnung WC3:2-5 (auch bekannt unter der Bezeichnung WI78-1,6-11), die vier Gene, nämlich von 2 bis 5, vom Rinder-Rotavirus WC3 und sieben Gene, nämlich 1 und 6 bis 11, des Rotavirus vom Human-Serotyp 3, Stamm WI78, enthält. Ebenso enthält die neue Reassortante WC3:2-6 (auch bekannt unter der Bezeichnung WI78-1,7-11) 5 Gene, nämlich 2 bis 6, vom Rinder-Rotavirus WC3 und 6 Gene, nämlich 1 und 7 bis 11 vom Rotavirus des Human-Serotyps 3, Stamm WI78.
Bei weiteren beispielhaften neuen Reassortanten wird der Human-Serotyp WI61 als Spender des für das v.p.7- Protein kodierenden Gens verwendet. Zum Beispiel enthält WI61:7,9 die Gene 7 und 9 vom neuen Human-Serotypstamm WI61 und die Gene 1 bis 6 sowie 8, 10 und 11 von WC3.
Weitere von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte Reassortanten enthalten das für das v.p.4- Protein kodierende Gen, das von einem abgeschwächten Human-Rotavirus stammt, und das für das v.p.7-Protein kodierende Gen, das vom abgeschwächten Rinder-Rotavirus WC3 stammt. Beispiel neuer Reassortanten gemäß diesem Gegenstand der Erfindung ist WI79-4, die das für das v.p.4-Protein kodierende Gen 4 vom Human-Serotyp 1, Stamm WI79, und die Gene 1 bis 3 sowie 5 bis 11 vom Rinderstamm WC3 enthält. Eine weitere derartige neue Reassortante ist WI78-4, die Gen 4 vom Human-Serotyp 3, Stamm WI78, und die restlichen zehn Gene von WC3 enthält. Ebenso enthält die neue Reassortante WI61-4 Gen 4 vom neuen Human-Serotyp-Rotavirus und die restlichen Gene von WC3.
Eine der neuen Reassortanten der vorliegenden Erfindung wird weiter unten ausführlich beschrieben. Es können jedoch alle oben beschriebenen Reassoranten sowie weitere Reassortanten, die nicht einzeln bestimmt wurden, vom Fachmann unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen beschrieben, hergestellt werden.
Ein weiterer Teil der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der neuen Reassortanten. Dieses Verfahren umfaßt den Schritt der Isolierung des Human- Rotavirus bzw. weiterer Rotavirusarten durch Kultivierung in einer geeigneten Zellkultur. Beim Isolierungsverfahren handelt es sich um ein Standardverfahren, das ausführlicher in Beispiel 1 beschrieben wird.
Zellen, die sich für eine solche Isolierung und Infektion eignen, sind CV-1 Nierenzellen von der afrikanischen Meerkatze (ATCC CCL-70); und BSC-1 (ATCC CCL-26), MA-104- sowie VERO-Fötuszellen von der grünen Meerkatze (ATCC CCL-81) und primäre Primat-Nierenzellkulturen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind unter primären Primat-Nierenzellkulturen die erste, zweite und dritte Passage von Nierenzellen der angegebenen Primatenart zu verstehen. Jedes dieser Zellkultursubstrate kann in mit 10% fötalem Kälberserum angereicherten BHK-Medium [Macpherson, I und M. Stoker, Virology, 16:147 (1962)], Eagle's essentiellem Minimalmedium mit 10% fötalem Kälberserum oder Medium 199 mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert werden. Diese Medien können auch 25 Mikrogramm Gentamycin pro Milliliter enthalten. Diese Zellinien können allein oder in Kombination für die Reihenpassage der Viren verwendet werden. Werden sie in Kombination verwendet, so kann eine eigene, jedoch unterschiedliche Zellinie für jede einzelne Passage des Virus verwendet werden.
Zweitens wird eine geeignete Zellkultur sowohl mit dem abgeschwächten Rinder-Rotavirusstamm WC3 und dem gewünschten Human-Serotyp-Rotavirus infiziert. Mischinfektionen dienen dazu, das Potential für Reassortierungen dadurch zu maximieren, daß sie für die gleichzeitige Replikation hoher, gleicher Konzentrationen jedes Elternvirus sorgen. Nach der Infektion und nach einer für die Genreassortierung ausreichenden Zeitspanne sowie unter Bedingungen für die Genreassortierung werden reassortante Nachkommenschaftsklone durch die zufällige Auswahl von Plaques geprüft, d.h. mittels Durchführung eines Plaque- Tests der aus der Mischinfektion erhaltenen Viren. Das Virus wird in Einzelplaques, die durch Überimpfung der erhaltenen Mischinfektion auf eine weitere Einzelzellschichtkultur induziert wurden, vermehrt. Jede derartige Viruspopulation wird mittels Page-SS analysiert, um ihren Elektropherotyp mit dem jedes Eltern-Rotavirus zu vergleichen. Der Anteil isolierter reassortanter Rotaviren kann durch die Auswahl von Plaques gefördert werden, die sich morphologisch von der Morphologie eines Elternteils unterscheiden. Nachkommenschaftsklone können auch aus den nach der Mischinfektion erhaltenen Viren nach Behandlung mit Hyperimmunantiserum gegen den Serotyp des Rotavirus, welches das für das v.p.4 kodierende Gen zur Verfügung stellt [siehe z.B. das Verfahren in US-A-4,571,385], vor Durchführung der Plaque-Analyse der Population ausgewählt werden. Dieses Verfahren läßt sich auf jedes Humanvirus oder tierische Virus, für das eine serotypspezifische Vakzine benötigt wird, anwenden.
Nachkommenschaftsklone werden dadurch untersucht, daß man einzelne Plaques erntet, diese dann einzeln in Zellkultur kultiviert und ihre genetische Konstitution mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Silberfärbung (PAGE-SS) nach der Methode von Dolan et al, J. Clin. Microbiol. 21:753 (1985) untersucht. Reassortante Nachkommenschaftsklone werden dann als potentielle Vakzinen gewählt, wenn zumindest das Vorhandensein des für das v.p.4-Antigen kodierenden Gens 4 aus dem abgeschwächten Rinder-Rotavirusstamm WC3 und des für das Rotavirus- Hauptflächenantigen v.p.7, das mit der Neutralisierung von Viren verbunden ist, kodierenden Gens sowie mindestens eines weiteren Gens vom Rotavirus, gegen das Immunschutz erwünscht ist, durch PAGE-SS nachgewiesen wird. Für eine weitere Gruppe von erfindungsgemäßen Reassortanten werden die Klone auch dann als potentielle Vakzine gewählt, wenn das Vorhandensein des Gens 4 vom Humanserotyp-Rotavirus und des für v.p.7 kodierenden Gens von Rotaviren anderer Arten, z.B. WC3, durch PAGE-SS nachgewiesen wird.
Die Erfindung umfaßt weiterhin Vakzinen zur Erzeugung von Immunschutz gegen durch Infektion mit Human- Rotavirus hervorgerufene akute Diarrhöe. Diese Vakzinen enthalten eine oder mehrere der neuen Reassortanten gemäß der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls übliche Vakzinenhilfsstoffe und/oder Träger, z.B. wäßrige Aluminium- und Magnesiumhydroxysuspensionen. Beim Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vakzine inokuliert man ein geeignetes Zellsubstrat, z.B. CV-1- Zellen, und führt mit der sich darin befindenden Reassortante Passagen durch. Durch Kombination einer oder mehrerer verschiedener Human-Serotyp-Reassortanten kann die Vakzine mit einem polytypischen virusneutralisierenden Antikörper antworten.
Die erfindungsgemäßen Vakzinenpräparate können bei einem Verfahren zur Impfung von Menschen gegen Infektion mit Human- oder Rinder-Rotavirus verwendet werden. Die Vakzinenpräparate enthalten eine oder mehrere der im vorliegenden Text beschriebenen Reassortanten und werden vorzugsweise oral oder nasal in hoher Dosis verabreicht. Die Vakzine kann auch mittels Injektion verabreicht werden.
Es ist auch möglich, die Vakzine werdenden oder stillenden Müttern zwecks Übertragung von Immunität auf das Kind zu verabreichen. Die Dosierung für alle Verabreichungswege beträgt im allgemeinen über 10&sup6;, vorzugsweise zwischen 10&sup6; und 10&sup9;, plaquebildende Einheiten (pfu) der Reassortante. Es können auch zusätzliche Dosen der Vakzine verabreicht werden. Eine pharmazeutisch annehmbare Vakzine mit gebührender Berücksichtigung von pH, Isotonie, Stabilität usw. kann gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden. Das bei einem Impfverfahren verwendete Dosierungsschema läßt sich unter Berücksichtigung verschiedener Wirts- und Umweltfaktoren, z.B. Alter des Patienten, Verabreichungszeit und geographische Lage und Umwelt, festlegen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einschließlich zweier spezifischer beispielhafter reassortanter Viren.

Beispiel 1: Isolierung der Rotaviren

Der Rinder-Rotavirusstamm WC3 und die Human-Rotavirusstämme, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Reassortanten verwendet wurden, wurden in der Zellinie MA104 isoliert und anschließend auf Wachstum in der Zellinie CV-1 adaptiert.
Die von Menschen stammenden Rotaviren wurden mittels Standardmethoden wie zuvor für die Isolierung des Human- Rotavirusstamms WI61 in Clark et al. (1987) oben beschrieben isoliert. Der Rotavirusnachweis im Stuhl von an Gastroenteritis erkrankten Kleinkindern erfolgte durch Untersuchung mit der PAGE-SS-Methode, mit der die elf Abschnitte doppelsträngiger RNA, die für Rotavirus charakteristisch sind, nachgewiesen werden können. Rotavirushaltiger Stuhl wurde in serumfreiem essentiellen Minimalmedium nach Eagle, das 500 Einheiten Penicillin/ml, 500 Mikrogramm Streptomycin/ml, 40 Mikrogramm Gentamycin/ml, 50 Einheiten Nystatin/ml und 20 Mikrogramm Trypsin/ml enthielt, aufgeschwämmt, wodurch eine 5%ige (w/v) Suspension erhalten wurde. Die Stuhlsuspension wurde durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 2000 g geklärt. Geklärter Überstand wurde mit einem gleichen Volumen gereinigtem Trypsin (10 Mikrogramm/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 60 Minuten bei 37 Grad C inkubiert. 0,2 ml des trypsinisierten Stuhlüberstands wurde zur Beimpfung von MA104-Zellkulturen in Röhrchen verwendet, wobei die Zellkulturen vorher mit PBS gewaschen wurden. Nach 30minütiger Absorption dieser rotavirusenthaltenden Flüssigkeit bei 37 Grad wurden die Kulturen in den Röhrchen mit 1,5 ml Sato-Medium versetzt, das 1 Mikrogramm/ml gereinigtes Trypsin enthielt, und bei Grad in einem Rollapparat bebrütet.
Die beimpften Zellkulturen wurden nach siebentägiger Bebrütung dadurch geerntet, daß man Zellen und Zellkulturmedium gemeinsam tiefgefroren und aufgetaut wurden. Eine Reihenpassage wurde dadurch durchgeführt, daß man neue Röhrchen mit MA104-Zellkultur mit 0,2 ml unverdünnter Zellkultursuspension beimpfte, wobei die Zellkultur wie die mit Stuhlsuspensionsüberstand beimpfte Anfangspassage behandelt worden war. Zellkultursuspensionen jeder einzelnen Passage wurden mittels PAGE-SS- Methode auf das Vorhandensein von Rotavirus-RNA untersucht. Nachweisbare Konzentrationen an Rotavirus-RNA wurden üblicherweise auf der zweiten oder dritten Passagestufe erhalten. In der zweiten bis fünften Zellkulturpassage fand man üblicherweise eine sichtbare cytopathische Wirkung (CPE). Nachdem der Rotavirusstamm cytopathisch wurde, wurden Reihenpassagen jeweils dann durchgeführt, wenn sich die CPE auf über 75% der Einzelzellschicht erstreckte (2 bis 7 Tage). Wurde durch ein Rotavirusisolat ständig innerhalb von 48 Stunden (üblicherweise innerhalb 4 bis 8 Passagen) eine CPE in Rollröhrchenkulturen induziert, so wurde eine Reihenpassage in stationären MA104-Zellkulturen durchgeführt, die mit BHK-Medium ernährt wurden, dem 13 Mikrogramm/ml ungereinigtes Trypsin (Flow Laboratories) zugesetzt worden war. Die Reihensubkultur in stationären MA104- Zellkulturen wurde auf gleicher Weise wie bei den Rollröhrchen durchgeführt, und zwar so lange, bis man fand, daß das isolierte Rotavirus in einer mit Agarose überschichteten MA104-Zellkultur gut Plaques induzierte.
Wenn das Rotavirusisolat im Plaque-Induktionsversuch nach Offit et al., J. Virol. Methods, 7:29 (1983) gut Plaques induziert [im allgemeinen 10&sup5; bis 10&sup7; pfu pro ml], so hat es sich an das Wachstum in der MA104-Zellkultur adaptiert. Es wird dann mittels ähnlicher Reihenpassageverfahren an das Wachstum in stationären CV-1-Zellkulturen adaptiert, wobei es sich jedoch beim Medium um serumfreies MEM-Medium nach Eagle handelt, das 6,25 Mikrogramm/ml ungereinigtes Trypsin (Flow) enthält. Das isolierte Rotavirus kann auf unterschiedlichen Passagestufen durch Isolierung und Vermehrung eines in MA104- Zellkultur produzierten Einzel-Plaque genetisch gereinigt werden. An das mechanische Aufsaugen von Zellen innerhalb einer Einzel-Plaque, die deutlich von anderen umgebenden Plaques getrennt ist, schließt sich eine Reihenvermehrung des in dieser Zellsuspension enthaltenen Virus mittels Standardmethoden an.
Die Identität des zellkulturadaptierten Rotavirus im Vergleich mit dem Virus in der Ausgangs-Stuhlsuspension wird durch Vergleich der in Polyacrylamid-Gel induzierten RNA-Elektropherotypen bestätigt. Der Serotyp jedes zellkulturadaptierten Rotavirus läßt sich durch Reaktion mit serotypspezifischen Hyperimmunantiseren gegen in Kaninchen oder Meerschweinchen hergestellten Rotavirus- Prototypen bestimmen [Clark et al, (1987) oben].

Beispiel 2: Herstellung der Reassortante WC3:2-5

Eine MA104-Zellkultur in einer Plastikschale mit 24 Näpfchen (ungefähr 1 cm² Einzelzellschichten pro Näpfchen) wurde zweimal mit PBS gewaschen und mit einer Mischung aus 1,5 x 10&sup5; pfu des Rotavirusstamms WI78, Humanserotyp 3 (Passagestufe 17), und 1,5 x 10³ pfu des Rotavirus WC3 (Passagestufe 11) beimpft. Es wurde deshalb ein Überschuß an WI78 verwendet, da WC3 schneller als die meisten vom Menschen stammenden Rotavirusisolate wächst. Man ließ das Virus die Zellen durch 30-minütiges Bebrüten bei 37 Grad C absorbieren, wonach man pro Näpfchen 1,5 ml BHK-Medium mit 13 Mikrogramm/ml Trypsin/ml zugab und bei der gleichen Temperatur weiterbebrütete. Sobald CPE 72 Stunden nach der Infektion bei der gesamten Zellpopulation festgestellt wurde, wurde die Kultur durch drei Gefrier- bzw. Auftauzyklen geerntet, und mit dem Nachkommenschaftsvirus wurden nach Standardverfahren Plaques in MA104-Zellen hergestellt. Plaques, die kleiner als die durch Eltern-Rotavirus WC3 induzierten Plaques waren, wurden geerntet, vermehrt und mittels PAGE-SS analysiert.
Unter den Nachkommenschaftsplaques dieser Mischinfektion befand sich eine mit WI78:1,7,9 bezeichnete Reassortante. Diese Reassortante enthielt die Genabschnitte 1, 7 und 9 des Eltern-Rotavirus WI78 und alle weiteren Genabschnitte aus WC3. Mit diesem Virus wurde zehnmal in MA104-Zellen eine Reihenpassage durchgeführt, wobei auch drei Plaque-Reinigungen durchgeführt wurden. Da WI79:1,7,9 nicht von dem gegen Serotyp 3-Rotavirus gerichteten Vergleichs-Hyperimmunantiserum neutralisiert wurde [siehe z.B. Clark et al, AJDC, (1986) oben], wurde beobachtet, daß Gen 8 des Eltern-WI78 und nicht Gen 9 für das Serotyp-3-spezifische v.p.7-Protein kodieren muß.
Eine zweite Mischinfektion wurde wie oben mit der Reassortante WI78:1,7,9 zusammen mit WI78-Rotavirus durchgeführt. Unter den aus dieser Mischinfektion erhaltenen Nachkommenschafts-Plaques befand sich eine Reassortante, die die Gene 2 bis 5 aus dem Rinder-Rotavirus WC3 und alle restlichen Gene aus dem Rotavirus WI78 enthielt. Diese als WC3:2-5 bezeichnete Reassortante wurde sechsmal in einer MA104-Zellkultur passagiert, wobei auch 3 Plaque-Reinigungsschritte durchgeführt wurden. Die Reaktion des Virus WC3:2-5 in einem Virusneutralisations(VN)-Test mit Hyperimmun-Bezugssera sowohl gegen Human-Rotavirus Serotyp 3 als auch Virus vom Serotyp eines Rinder-Rotavirus zeigte, daß dieses Virus sowohl über einen Serotyp -3- als auch einen Rinder-Phänotyp verfügt.
Bei Replikation von WC3:2-5 wird ebenfalls in CV-1- Zellen ein Titer von mindestens 106,0 pfu/ml erzielt. Bei dieser Dosierung ist der Virus vollständig für durch Schluckimpfung geimpfte Erwachsene und für Kleinkinder schon ab dem zweiten Lebensmonat abgeschwächt. Von den Kindern, die durch Schluckimpfung mit WC3:2-5 geimpft wurden, reagiert ein hoher Prozentsatz mit ungefähr gleicher Häufigkeit durch Produktion von virusneutralisierendem (VN) Antikörper gegen Human-Rotavirus vom Serotyp 3 und/oder Rotavirus vom Rinder-Serotyp.

Beispiel 3: Verfahren zur Herstellung von beispielhaften neuartigen Vakzinen aus WC3:2-5

Die Reassortante WC3:2-5 wurde auf Wachstum in CV-1- Zellkultur durch vier zusätzliche Passagen in CV-1-Zellen adaptiert. Die vierte Passage in CV-1-Zellen besteht aus einer an freiwilligen erwachsenen Probanden und an Kindern ausgewerteten Textvakzine.
Die Vakzine wurde durch Beimpfung von 850 cm²- Plastikrollflaschen mit CV-1-Zellkultur hergestellt, wobei die Zellkultur in MEM-Medium nach Eagle mit 10% fötalem Kälberserum und 25 Mikrogramm/ml Gentamycin kultiviert wurde. Die Zellen wurden beimpft, als sechs Tage nach Beimpfung mit Zellen eine zusammenwachsende Einzelschicht erhalten wurde. Die Zellkulturen wurden zweimal mit PBS gewaschen, um restliches Serum zu entfernen, und mit 10 ml WC3:2-5-Rotavirusstammkultur mit insgesamt 6,0 x 106 pfu beimpft (die Multiplizität der Infektion MOI betrug ungefähr 0,10). Das Virus wurde durch 60-minütige Inkubation bei 37ºC an die Zellen absorbieren gelassen. Man entfernte das Inoculum und versah die Zellen mit 80 ml serumfreiem BHK-Medium, das 5,0 Mikrogramm/ml ungereinigtes Trypsin und 25 Mikrogramm/ml Gentamycin enthielt, pro Rollflasche. Die mit Rotavirus infizierten Zellkulturen wurden bei 37º bebrütet, bis die gesamte Einzelzellschicht CPE aufwies, d.h. ungefähr 72 Stunden. Anschließend erntete man das Virus durch Aufbrechen der Zellen mittels drei Gefrier- und Auftauzyklen. Zelltrümmer wurden durch 60-minütiges Zentrifugieren bei 2000 g bei 4ºC entfernt. Der erhaltene Überstand enthielt die Testvakzine. Diese wurde bei -70ºC bis zur Prüfung auf Sterilität und Freiheit von zusätzlichen Viren und Bestimmung der Konzentration an infektiösem reassortanten Rotavirus tiefgefroren.
Die Sterilitätsprüfungen bestanden darin, daß man mit der Vakzine Standard-Labormedien zur Kultur von aeroben und anaeroben Bakterien, Mycobakterien und Pilzen beimpfte.
Die Untersuchung der Vakzine auf Mycoplasmen bestand darin, daß man 3T3-Mäusezellen in Kultur beimpfte und anschließend mit Hoechst-Färbemittel für intracytoplasmatische DNA färbte. Eingeschlossen in der Untersuchung auf zusätzliche Viren war die Beimpfung von Human- und primaten Zellkulturen bei Vorhandensein von auf üblichem Weg erhaltenem serotypspezifischen Anti-Rotavirusserum, um die Replikation des Vakzinevirus zu unterdrücken, und diese Kulturen wurden auf das Auftreten von CPE und/oder Hämadsorption beobachtet. Ausgewachsene sowie neugeborene Mäuse wurden mit der Vakzine intracerebral und durch Schluckimpfung geimpft und anschließend 30 Tage lang beobachtet. Ausgewachsene Meerschweinchen wurden intraperitonial geimpft und 15 Tage lang nach der Impfung beobachtet.
Die infektiöse Konzentration von reassortantem Rotavirus WC3:2-5 wurde mittels Standard-Plaquetest bestimmt. Die Vakzine in diesem Beispiel hatte einen Titer von 106,3 pfu/ml. Die Stammvakzine wurde bei der American Type Culture Collection als ATCC-Nr. VR2195 hinterlegt.

Beispiel 4: Verabreichung der neuen WC3:2-5-haltigen Vakzine

Verabreichung der Vakzine an Erwachsene: Sieben freiwilligen normalen erwachsenen Probanden im Alter von 31 bis 50 Jahren wurde durch Schluckimpfung eine Volldosis (106,3 pfu) WC3:2-5 verabreicht. Vor der Vakzine wurden den freiwilligen Probanden 30 ml Maalox (Rorer) zur Pufferung der Magensäuren verabreicht. Alle Probanden blieben 30 Tage lang klinisch normal. Drei Tage nach der Impfung wurde bei keinem Probanden eine Ausscheidung von Impf-Rotavirus im Kot beobachtet. Ein erwachsener Proband wies 30 Tage nach der Impfung einen erhöhten Antikörperspiegel im Serum sowohl gegen WC3-Rotavirus als auch gegen Human-Rotavirus vom Serotyp 3 auf. Die anderen Probanden, die früher alle gegen Rotavirus vom Serotyp 1 und/oder 3 und/oder dem Rinder-Serotyp seropositiv waren, wiesen keinen erhöhten Antikörperspiegel im Serum gegen Rotavirus vom Serotyp 3 oder Rinder-Serotyp auf. Bei keinem Probanden fand man einen erhöhten Antikörperspiegel gegen Rotavirus vom Serotyp 1.
Verabreichung von Vakzine an Kleinkinder: In einer mit Vorsicht durchgeführten Reihe von Vakzineversuchen wurde WC3:2-3 erst in einer reduzierten Dosis von 105,3 pfu an zwei Kleinkinder verabreicht, die vorher mit WC3-Vakzine immunisiert worden waren, und anschließend an zwei Kleinkinder, denen WC3:2-5 in einer anfänglichen Dosis von 104,3 pfu verabreicht worden war, und dann an zwei Kleinkinder, denen eine anfängliche Dosis von 105,3 pfu verabreicht worden war. Schließlich wurde 24 Kleinkindern eine volle Dosis von 106,3 pfu verabreicht. Die Vakzine wurde allen Kindern in Form einer Schluckimpfung verabreicht, und zwar in einer Dosis von 2,5 ml, die 20% Kirschsyrup enthielt. Bei ungefähr der Hälfte der Kinder wurden die Magensäuren durch orale Verabreichung von mindestens 30 ml der Kinderrezeptur höchstens 30 Minuten vor Verabreichung der Vakzine neutralisiert.
Bei allen Kindern wurde während der ersten sieben Tage nach der Impfung auf Anzeichen von Krankheiten, die im Zusammenhang mit der Vakzine stehen, kontrolliert, es wurden jedoch keine Symptome beobachtet. Drei bis sieben Tage nach der Impfung wurde eine Kotprobe zum Nachweis von Vakzine-Rotavirus mittels Standard-Plaquetest genommen: ein einziges Kind schied nach Erhalt einer Vakzinedosis von 105,3 pfu einen niedrigen Titer (unter 103,0 pfu/Gramm Kot) an Vakzine-Rotavirus aus. Zwölf von 29 (41%) der Kinder, die den 30-Tage-Versuch beendeten, wiesen am 30. Tag nach der Infektion einen erhöhten Antikörperspiegel im Serum auf, als die Seren gegen den Rinder-Rotavirusstamm WC3 und die Protoyp-Rotavirusstämme SA11 (Serotyp 3) und Wa (Serotyp 1) getestet wurden. Die beobachteten Antikörperreaktionen im Serum waren meistens gegen das Rindervirus vom Serotyp WC3 (8 von 29 Kindern bzw. 28%) und gegen den Rotavirusstamm SA11 vom Serotyp 3 (9 von 29 Kindern bzw. 31%) gerichtet, was die bivalente Struktur des reassortanten Rotavirus WC3:2-5 aus Serotyp 3 und Rinder-Serotyp widerspiegelt. Nur bei 4 Kindern bzw. 14% wurde eine Seroneutralisierungsreaktion auf Wa nachgewiesen.
Eine Analyse der mit dem reassortanten Virus WC3:2-5 geimpften Population (nur die 24 Kinder, denen eine volle Dosis von 106,3 pfu verabreicht worden war) zeigte, daß Kleinkinder im Alter von 5 bis 11 Monaten wirksamer reagierten (6/11 bzw. 55%) als 2 bis 4 Monate alte Kleinkinder (3/13 bzw. 23%). Kinder mit niedrigen Antikörpertitern im Serum vor Verabreichung der Vakzine wiesen des weiteren mit höherer Wahrscheinlichkeit eine Immunreaktion auf die Vakzine auf. Zum Beispiel wiesen in der Population von 5 bis 11 Monate alten Kleinkindern mit Antikörpertitern im Serum gegen Rotavirus vom Serotyp 3 von unter 1:250 6 von 8, bzw. 75%, vor der Vakzine einen erhöhten Antikörperspiegel im Serum als Reaktion auf die Vakzine auf.
Der Prozentsatz der Kinder, die eine Immunreaktion entwickelten, ließ sich auch dadurch erhöhen, daß man eine zweite Dosis WC3:2-5-Vakzine 30 Tage nach der anfänglichen Dosis in Form einer Schluckimpfung verabreichte. Unter den 19 Kindern, denen 2 volle Dosen verabreicht worden waren, befanden sich 7 von 19, bzw. 37%, die auf die erste Dosis reagierten; 10 von 19, bzw. 53%, reagierten auf die zweite Auffrischungsdosis und 13 von 19, bzw. 68%, auf die erste, zweite oder beide Dosen.
Es wurde beobachtet, daß zwischen verschiedenen Rotavirusstämmen, die alle zum Serotyp 3 gezählt wurden, eine Antigen-Variation existiert, wenn man diese Stämme in Kreuzneutralisationstests unter Verwendung von Hyperimmun-Antisera [Hoshino et al, 1984] oder monoklonalen Antisera [Taniguchi et al, 1985] vergleicht. Die von 18 Kindern 30 Tage nach Erhalt ihrer ersten Dosis reassortantes Virus WC3:2-5 gesammelten Seren wurden daher auf Neutralisierungsantikörper gegen die Reassortante WC3:2-5 sowie den SA11-Prototyp Rotavirus vom Serotyp 3 untersucht. Trotz des Fehlens einer nachweisbaren Reaktion von Antikörper gegen SA11-Virus im Serum entwickelten viele Kinder eine Immunreaktion gegen das reassortante Virus WC3:2-5. Nach einer Einzeldosis WC3:2-5- Vakzine betrug die Anzahl von Kindern insgesamt mit einer Antikörperreaktion im Serum gegen jeden der Viren vom Serotyp 3 13 von 18 bzw. 72%.

Claims

1. Reassortantes Rotavirus zur Verwendung als Bestandteil einer Vakzine gegen Infektion mit Human- Rotavirus, umfassend:

(a) den von einem Rinder-Rotavirusstamm WC3 oder einem seiner Isolate stammenden, für das Neutralisierungsantigen v.p.4 kodierenden Genabschnitt 4, wobei dieses Isolat durch die WC3-Merkmale RNA-Elektropherotyp, Unfähigkeit zur Hämagglutination roter Blutkörperchen von Primaten, Plaque-Morphologie und Antwort im Serum- Neutralisationstest gekennzeichnet ist; sowie

(b) zumindest zwei Genabschnitte eines Human- Rotavirus, wobei es sich bei einem dieser mindestens zwei Genabschnitte um den für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierenden Genabschnitt handelt;

wobei diese Reassortante weiterhin durch ihre zurückbleibenden, ausschließlich von diesem Humanstamm, ausschließlich von diesem Rinderstamm oder von sowohl diesem Human- als auch diesem Rinderstamm stammenden Rotavirus- Genabschnitte gekennzeichnet ist und diese Reassortante weiterhin durch die Fähigkeit, gekennzeichnet ist im menschlichen Patienten im Erwachsenen- bzw. Kindesalter eine schützende Immunantwort auf Provokation mit nativem Rotavirus zu induzieren, ohne daß bei diesen Patienten schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten.

2. Reassortante nach Anspruch 1, wobei dieses Human- Rotavirus aus der Gruppe bestehend aus den Viren des Serotyps 1, Serotyps 2, Serotyps 3, Serotyps 4, Serotyps M69 und Serotyps WI61 ausgewählt ist.

3. Reassortante nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierenden Human-Genabschnitt um den Genabschnitt 9 handelt.

4. Reassortante nach Anspruch 3, wobei es sich bei dieser Reassortante um WI61-7,9 handelt und diese Reassortante durch die Genabschnitte 1-6, 8 und 10-11 des Rinder-Rotavirusstamms WC3 und die Genabschnitte 7 und 9 des Humanstamms WI61 gekennzeichnet ist.

5. Reassortante nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierenden Genabschnitt um den Genabschnitt 8 handelt.

6. Reassortante nach Anspruch 5, wobei es sich bei dieser Reassortante um WI78-1, 6-11 handelt und diese Reassortante aus den Genabschnitten 2-5 des Rinder- Rotavirusstamms WC3 und den Genabschnitten 1 und 6-11 des Human-Rotavirusstamms WI78 besteht.

7. Reassortante nach Anspruch 5, wobei es sich bei dieser Reassortante um WI78-1, 7-11 handelt und diese Reassortante durch die Genabschnitte 2-6 des Rinder- Rotavirusstamms WC3 und die Genabschnitte 1 und 7-11 des Human-Rotavirusstamms WI78 gekennzeichnet ist.

8. Reassortantes Rotavirus zur Verwendung als Bestandteil einer Vakzine gegen Infektion mit Human- Rotavirus, umfassend

(a) einen aus einem Rinder-Rotavirusstamm WC3 oder einem seiner Isolate stammenden Genabschnitt, wobei dieses Isolat durch die WC3-Merkmale RNA-Elektropherotyp, Unfähigkeit zur Hämagglutination roter Blutkörperchen von Primaten, Plaque-Morphologie und Antwort im Serum-Neutralisationstest gekennzeichnet ist und es sich bei diesem Genabschnitt um den für das Neutralisierungsantigen v.p.7 kodierenden Genabschnitt handelt; sowie

(b) zumindest den für das Neutralisierungsantigen v.p.4 kodierenden Genabschnitt aus dem Human-Rotavirus, wobei diese Reassortante weiterhin durch ihre zurückbleibenden, ausschließlich von diesem Humanstamm, ausschließlich von diesem Rinderstamm oder von sowohl diesem Human- als auch diesem Rinderstamm stammenden Rotavirus- Genabschnitte gekennzeichnet ist und diese Reassortante weiterhin durch die Fähigkeit gerennzeichnet ist, in menschlichen Patienten im Erwachsenen- bzw. Kindesalter eine schützende Immunantwort auf Provokation mit nativem Rotavirus zu induzieren, ohne daß bei diesen Patienten schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten.

9. Reassortantes Rotavirus zur Verwendung als Bestandteil einer Vakzine gegen Infektion mit Human- Rotavirus nach Anspruch 8, bestehend aus dem von einem Human-Rotavirus stammenden, für das Neutralisierungs antigen v.p.4 kodierenden Genabschnitt sowie zehn von einem Rinder-Rotavirusstamm WC3 oder einem seiner Isolate stammenden Genabschnitten, wobei dieses Isolat durch die WC3-Merkmale RNA-Elektropherotyp, Unfähigkeit zur Hämagglutination roter Blutkörperchen von Primaten, Plaque- Morphologie und Antwort im Serum-Neutralisationstest gekennzeichnet ist und diese Reassortante weiterhin durch die Fähigkeit gerennzeichnet ist, in menschlischen Patienten im Erwachsenen- bzw. Kindesalter eine schützende Immunantwort auf Provokation mit nativem Rotavirus zu induzieren, ohne daß bei diesen Patienten schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten.

10. Reassortante nach Anspruch 8, wobei das Human- Rotavirus aus der Gruppe bestehend aus den Viren des Serotyps 1, Serotyps 2, Serotyps 3, Serotyps 4, Serotyps M69 und Serotyps WI61 ausgewählt ist.

11. Reassortante nach Anspruch 8, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

WI79-4, wobei diese Reassortante durch die Genabschnitte 1-3 und 5-11 des Rinder-Rotavirusstamms WC3 und den Genabschnitt 4 des Human-Rotavirusstamms WI79 gekennzeichnet ist;

WI78-4, wobei diese Reassortante durch die Genabschnitte 1-3 und 5-11 des Rinder-Rotavirusstamms WC3 und den Genabschnitt 4 des Human-Rotavirusstamms WI78 gekennzeichnet ist; und

WI61-4, wobei diese Reassortante durch die Genabschnitte 1-3 und 5-11 des Rinder-Rotavirusstamms WC3 und den Genabschnitt 4 des Human-Rotavirusstamms WI61 gekennzeichnet ist.

12. Vakzine zur gefahrlosen Verwendung am Menschen zur Immunisierung gegen Infektion mit Human-Rotavirus, umfassend einen pharmazeutischen Träger, der zumindest ein reassortantes Rotavirus enthält, das aus der aus:

(a) einem reassortanten Rotavirus nach Anspruch 1; und

(b) einem reassortanten Rotavirus nach Anspruch 8 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

13. Vakzine nach Anspruch 12 zur Verabreichung an den Menschen auf oralem oder nasalem Weg bzw. mittels Injektion, wobei die Vakzine in einer ungefähr 106,0 bis ungefähr 109,0 pfu enthaltenden Einzeldosisform vorliegt.

14. Verfahren zur Herstellung eines reassortanten Virus nach Anspruch 1 oder 8, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Infektion eines geeigneten Zellsubstrats mit einer Mischinfektion bestehend aus einem Rinder-Rotavirusstamm WC3 und einem Human-Rotavirus unter Bedingungen, die eine Genreassortierung in dieser infizierten Kultur gestatten;

(b) PAGE-Untersuchung von Nachkommenschaftsklonen aus in dieser Kultur entstandenen Plaques auf das Vorhandensein entweder einer Reassortante mit zumindest dem für das v.p.4-Antigen kodierenden Genabschnitt des Rinder-Rotavirus WC3 und zwei Genen des Human-Rotavirus, wobei es sich bei einem dieser beiden Genabschnitte um den für das v.p.7-Antigen kodierenden Genabschnitt handelt, oder einer Reassortante mit zumindest dem für das v.p.4-Antigen kodierenden Genabschnitt des Human- Rotavirus und dem für das v.p.7-Antigen kodierenden Genabschnitt des Rinder-Rotavirus WC3.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Zellsubstrat ausgewählt ist aus der aus CV-1, Vero, BSC-1, MA104 und primären Primaten-Nierenzellkulturen bestehenden Gruppe.