JP2818760B2 - ロータウィルス組換体ワクチン及びその製造方法 - Google Patents

ロータウィルス組換体ワクチン及びその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なロータウィルス組換体、この新規な
組換体を使用するワクチン、これらの製造及び投与の方
法に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも、WC
3株のウシロータウィルスのv.p.4中和抗原をエンコード
した遺伝子と、選択されたヒトロータウィルスのv.p.7
中和抗原をエンコードした遺伝子を含んだ組換体に関す
る。
従来技術 ロータウィルスは、感染性胃腸炎（下痢）の一つの最
も重要な病因学的物質である。感染性胃腸炎は、世界的
な幼児死亡の最たる原因である。急性の感染性胃腸炎
［Wslsh et al,New Eng.J.Med.,301:967（1979）］によ
り年間500万から1000万人の幼児死亡があり、ロータウ
ィルスによるものは、その内毎年合計の10から40％を占
めている［deZoysa and Feachem,Bull WHO,63:569（198
5）］。感染性胃腸炎による発展途上国の幼児死亡率は
極めて高いが、ロータウィルスは、米国のような先進国
においても入院を伴う多くのこのような症状を発生させ
る。このように、ロータウィルスが誘発する感染性胃腸
炎は、先進国においても幼児死亡率の10大原因の１つで
ある［Ho et al,27th Interscience Conf.Antimicrobio
l Agents Chemtherapy,p2（1987）］。
血清学の研究は、事実上、世界中のすべての幼児が、
生後２年から３年の間にロータウィルスに感染すること
を示している。ロータウィルスが誘発する病気は生後６
〜24カ月の間に最も多く発生するのであるが、発展途上
国における病気の発生は、生後６カ月以内であることが
一般的である。ロータウィルスの感染は、人から人へ、
糞便−経口経路によって起こり、典型的には、潜伏期間
が１〜３日である。ロータウィルスの感染は幼児では多
くの死亡者を出すが、大部分の成人の感染は、軽く無症
状である。さらに、ロータウィルスは事実上すべての家
庭用動物から新生児の下痢を発生させる原因であること
が確認されている。霊長類動物及びウシを起源とするロ
ータウィルスは直径が約70nmの球形のビールスであり、
二重キャプシッド構造という特徴を具えている。ロータ
ウィルスのゲノムは、二重RNAの11の分節（segments）
とRNAポリメラーゼからなる。RNAの各々の分節は、１つ
の蛋白質遺伝子物質をコード（code）する遺伝子であ
る。現在明らかにされている動物及びヒトロータウィル
スの大部分は、グループＡロータウィルスと名付けら
れ、共通の交差反応（corss−reactive）抗原を分類し
ている［Estes et al,Immunochemistry of Viruses,Els
evier,Amsterdam:389（1984）］。しかしながら、ロー
タウィルスの異なる種（species）は、独特な特異性血
清型ビールス表面抗原によって区別することができる。
これらの表面抗原は、従来の血清中和（SN）試験によっ
て、きわめて容易に検出される。血清中和試験におい
て、特異性血清型の精製ビールスから製造された抗血清
は、異種（heterologous）血清型のビールスより同種
（homologous）血清型のビールスの方が高いSNタイター
（titer:力量）を示す。人のロータウィルスでは、現
在、少なくとも６つの血清型−−血清型1,2,3,4,M69及
び新しい血清型WI61が確認されている。［Wyatt et al,
infect and Immun，37:110（1983）;Matsuno et al,J.V
irol.,54:623（1985）Clark et al,J.Clin Microbiol.,
25:1757（1987）］。
動物又はヒトにおける種々の血清型の交差免疫（cros
s−immunity）の現在入手可能な報告は、ロータウィル
スの感染に対して免疫の防御をするには、特異性血清型
の抗遺伝子励起のための必要性に関して矛盾する結果を
示した。例えば、動物のワクチン研究に関する種々の報
告を参照されたい［Wyatt et al,Science,203:548（197
9）;Zissis et al,J.Inf.Dis., 148:1061（1983）;Sheri
dan et al,J.Inf.Dis., 149:434（1984）］。また、動物
又ヒトについて評価されたロータウィルスワクチンの種
々の報告を参照されたい［Mebus et al,J.A.V.M.A.,16
3:880（1973）;Thurber et al,Canad,Vet.J.,17:197（1
976）;Vesikari et al,Lancet,2:807（1983）;De Mol e
t al,Lancet,2:108（1986）;Clark et al,Amer.J.Dis.C
hildren, 140:350（1986）;Kapikian et al,Vaccines,Ne
w York,Cold Spring Harbor Lab.,357（1985）;Losonsk
y et al,Ped Inf.Dis., ５:25（1986）;Santosham et a
l,27th Int.Conf.Antimicrobiol.Agents and Chemother
apy,p.99（1987）］。これらの研究は、一部の権威者を
して理想のロータウィルスワクチンは、すべてに効果の
ある人のロータウィルス血清型に代表される特異性血清
型抗原を含まねばならないということを、推測させるに
いたった。
ヒトロータウィルスは、細胞培養に適応できるヒトロ
ータウィルスが特にヒトワクチン基質として受け入れら
れると考えられる細胞として、効率よく複製されないと
いう理由で、ワクチン使用のためには特に力をいれて研
究されなかった。さらに、ヒトロータウィルス分離体の
病原的可能性はあまり知られていない。これらの欠点を
解決するために、ヒトロータウィルスと動物のロータウ
ィルスの遺伝子組換が提唱されてきた。ロータウィルス
の「組換」（reassortment）と呼ばれるこのような組換
は、ロータウィルスのRNAのゲノムの分節された性質、
及び共同感染中の遺伝子組換のその高い頻度ゆえ可能で
ある。例えば、培養中の細胞が２つの異なるロータウィ
ルス株に混合して感染する場合、２つのロータウィルス
の自然混合或いは遺伝子組換が頻繁に生じる。このよう
に混合感染から誘導される独立した子孫ビールスは、プ
ラーク検定により生じた分離された個々のプラークによ
って選択される。子孫ビールスの各々の遺伝子分節の親
細胞の起源は、各々の遺伝子分節のポリアクリルアミド
・ゲルの電気泳動中における泳動の特性速度によって決
定することができる。
ヒトワクチンの候補として用意された組換体ロータウ
ィルスは、遺伝子９又は８の38,000ダルトンのv.p.7抗
原である１つの遺伝子物質が、ヒトの血清型ロータウィ
ルスのv.p.7エンコード遺伝子によって置換された主と
して動物起源のロータウィルスを含んでいた。v.p.7蛋
白質は、血清中和試験で機能する、主要な特異性血清型
抗原として作用する。それは、ロータウィルスの病気に
抗するマウス系では、特異性血清型中和抗体の誘発と特
異性血清型免疫防御の誘発が可能である。例えば、［Of
fit et al,J.Virol.,60:491（1986）］を参照された
い。v.p.7エンコード遺伝子を含むこのような組換体
は、血清型1,2,3或いは４のv.p.7を有するU.K.株ウシロ
ータウィルスを起源に持つ組換体、或いは血清型1,2或
いは４のv.p.7を有するRRVロータウィルスを基本にする
組換体を含んでいる［Midthun et al,J.Virol.,53:949
（1985）;Midthun et al J.Clin.Microbiol.,24:822（1
986）and米国特許第4,571,385号］。
発明の概要 本発明は、ヒトロータウィルス感染に抗するワクチン
として有用な組換体ロータウィルスを提供する。本発明
による１つの組換体は、少なくとも、v.p.4中和抗原を
エンコード（encode）したウシロータウィルス株WC3か
らの遺伝子と、v.p.7中和抗原をエンコードし選択され
たヒトロータウィルスからの遺伝子を含んでいる。本発
明によって製造される組換体は、v.p.7エンコード遺伝
子分節（segments）と同様、v.p.3エンコード分節がWC3
牛株から得られる場合には、他のヒトロータウィルス遺
伝子分節を含むことができる。
本発明の組換体は、米国特許第4,636,385号に開示さ
れているように、ウシ株WC3ロータウィルス或いはその
子孫からの遺伝子４を具えている。新規な組換体にv.p.
4抗原を付与するであろう他の特定のWC株ウシロータウ
ィルスは、WC2,WC4,WC5,WC6,WC7,WC8,WC9及びWC10であ
る。
新規な組換体において中和抗原v.p.7をエンコードす
るヒトロータウィルス遺伝子は、免疫付与が望まれる如
何なるヒトロータウィルス血清型（serotype）から選択
してもよい。このような血清型のリストには、いまだ同
定されていない新しいウィルス性の血清型のほか、血清
型1,血清型2,血清型3,血清型4,血清型M69及び血清型WI6
1を含んでいる。
本発明による組換体の特定の例は、後に詳述する、WI
79−3,9又はWC3:2−５である。これらの例示的な組換体
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）,12301 Parklaw
n Drive,Rockville,Marylandに寄託されている。WI79−
3,9は、受託番号ATCC VR2194及びVR2196として1987年1
1月25日に寄託され、WC3:2−５は、受託番号ATCC VR21
93及びVR2195として1987年11月25日に寄託された。反対
の記述がない限り、ここで引用されるATCCのすべての保
管物は、出願人に特許が付与されれば入手することがで
きる。本発明によって製造される他のロータウィルス
は、WC3:2−6;WI78−8;WI61:7,9;WI79−4,WI78−４及び
WI61−４である。本発明に含まれる他の組換体と同様、
これらの組換体は、ここに記載される以下の手続に従え
ば当業者に入手可能である。本発明による他の１つの組
換体は、少なくとも、v.p.4中和抗原をエンコードした
ヒトロータウィルスからの遺伝子と、v.p.7中和抗原を
エンコードしたウシWC3株ロータウィルスからの遺伝子
を含んでいる。同じウシWC株は、上述したように、v.p.
4抗原を用いて得られるであろう。同様にこの組換体に
有用なヒトロータウィルスも上述したとおりである。
本発明の他の観点では、本発明の新規な組換体のロー
タウィルスを少なくとも１つ含む、ヒトロータウィルス
によって生ずる急性の下痢に抗する免疫学的防御をもた
らすためのワクチンが提供される。
本発明の他の観点では、本発明の新規な組換体のビー
ルスを製造するための方法が提供される。この方法は、 （ａ）感染培養（infected culture）中で遺伝子組換を
可能にする状態下において、ウシロータウィルス株WC3
及びヒトロータウィルスの混合させた感染物（mixed in
fection）で適当な細胞基質を感染させるステップと、 （ｂ）少なくともv.p.4抗原をエンコードしたウシWC3ロ
ータウィルス遺伝子とv.p.7抗原をエンコードしたヒト
ロータウィルス遺伝子を含んだ組換体、或いは、少なく
ともv.p.7抗原をエンコードしたウシWC3ロータウィルス
遺伝子とv.p.4抗原をエンコードしたヒトロータウィル
ス遺伝子を含んだ組換体の存在の有無のためPAGEによ
り、感染した培養中で形成されるプラークから子孫クロ
ーンを検査するステップからなる。この方法を使用する
ための適当な細胞基質は、CV−1,Vero,BSC−1,MA104及
び第１の（primary）霊長類腎臓細胞培養を含む。
本発明の他の１つの観点では、本発明の組換体ワクチ
ンを使用してヒトロータウィルス感染に抗するように、
ヒトにワクチン接種する方法が提供される。この方法
は、ヒトに、約106.0から109.0pfuのワクチンを少なく
とも１回の投与で経口或いは鼻の経路により、或いは注
射により投与する。また、この方法は、最初の投与後、
約３乃至４週間のワクチンのさらなる服用にも適用でき
る。ワクチンは、幼児或いは妊婦に直接、又は幼児に免
疫を与える目的で乳母に投与することもできる。
本発明の他の観点及び効果は、実施例を含む以下の発
明の詳細な説明の記述によって明らかになるであろう。
発明の詳細な記述 本発明は、ヒトロータウィルス感染に抗する免疫的防
御を付与するようなワクチンとしての使用に好適なロー
タウィルス組換体に関する。組換体は、少なくともv.p.
4蛋白質をエンコード（encode:すなわち暗号化するこ
と）した遺伝子分節を与える弱毒化されたウシロータウ
ィルスWC−３と、少なくともv.p.7蛋白質をエンコード
した遺伝子分節を組換体に与える疫学的に重要な人の血
清型を代表するロータウィルスとの間における遺伝子組
換によって製造される。
蛋白質v.p.4は、ロータウィルスの遺伝子４の88,000
ダルトン主（major）表面構造蛋白質である。これは、
v.p.7のように、SN試験の操作において、特異性血清型
（serotype−specific）中和抗体を減じることができる
ような、また、ロータウィルスの病気に抗する特異性血
清型免疫防御をマウス系に誘導することができるような
主特異性血清型抗原として作用する。［Offit et el,
（1986）supraを参照されたい］。実験的研究では、v.
p.4は、また、細胞培養中においてロータウィルス宿主
領域のコントロールと［Kalica et al,Virol.，125:194
（1983）;Greenberg et al,Infec.Immunol.,37:104（19
82）］、生体内における（in vivo）ロータウィルス毒
性の仲介［Offit et al,J.Virol.,57：（1986）］の役
割をしていることが報告されている。
最も望ましくは、本発明による組換体は、米国特許第
4,636,385号に詳細に開示されるように、弱毒化された
ウシロータウィルス株WC3或いはその子孫からv.p.4をエ
ンコードした遺伝子４を含んでいる。このロータウィル
ス株についてのさらなる技術情報は前記特許に開示され
ている。WC3の代替物となるこの株菌型の代表的分離型
は、WC2,WC4,WC5,WC6,WC7,WC8,WC9及びWC10である。こ
れらウシロータウィルスは、これらの独特なRNA電気泳
動型、霊長類動物の赤血球細胞を凝集させないこと、こ
れらのプラーク形態学及びSN試験の反応によってウシロ
ータウィルスの他の株と直ちに区別することができる。
本発明の組換体に使用される現在最も好ましい株はWC3
である。WC3は、CV−１細胞（ATCC CCL70）中で高いタ
イターで複製でき、人の幼児では弱毒化され免疫遺伝子
になることが知られている［Clark et al,Amer.J.Dis.C
hildren,140:350（1986）］。
v.p.7蛋白質をエンコードする遺伝子分節を与えるロ
ータウィルスは、周知の血清型1,2,3,4及びM69と、新規
な血清型WI61の双方を含む選択された如何なる血清型の
ヒトビールスであってもよい。［Clark et al,1987 sup
raを参照されたい。］また、選択されたヒトロータウィ
ルスは、組換体に使用するために、所望ならば弱毒化す
ることができる。v.p.7蛋白質は、特別なヒトロータウ
ィルスの遺伝子分節８或いは遺伝子分節９のいずれかに
コード化（code）される。v.p.7をエンコードする遺伝
子の位置は、従来の実験的方法により各特異性ロータウ
ィルスについて決定付される。本発明に有用なヒトロー
タウィルス株は、血清型１の株WC179,WICC1及びWI/U;血
清型２の株WI−SC2及びWI/Q;血清型３の株WI77,WI78,WI
/P及びWIC−17;血清型４の株WI−CC4;血清型の株WI61で
ある。ヒト血清型ロータウィルスのこのリストはこれ以
外にもあり、新しく同定されたヒトを起源にするロータ
ウィルスもここに開示される方法及び複合物質に有効で
あることが考えられる。ヒトロータウィルスは、v.p.7
をエンコードする遺伝子より組換体に望ましく寄与する
ことができる。しかしながら、v.p.4をエンコードする
遺伝子は、本発明の組換体を得るにあたって、ウシ株か
ら得なければならない。
従って、本発明の他の観点では、本発明の組換体は特
定の例として説明される。このような１つの例は、ウシ
ロータウィルスWC3からの２乃至５の４つの遺伝子とヒ
トの血清型３のロータウィルス株WI78の１及び６乃至11
の７つの遺伝子を含んでいるWC3:2−５で表される新規
な組換体である。同様に、ウシロータウィルスWC3から
の２乃至６の５つの遺伝子と、ヒトの血清型３のロータ
ウィルス株WI78の１及び７乃至11の６つの遺伝子を含ん
でいるWC3:2−６で表される新規な組換体である。
さらに、例示的な新規な組換体は、v.p.7蛋白質をエ
ンコードする遺伝子の供給側としてヒトの血清型WI61が
利用できる。例えば、WI61:7,9は、新規なヒトの血清型
WI61からの遺伝子７と９と、WC3からの遺伝子１乃至６
と８と10と11とを含んでいる。
本発明によって得られるさらなる組換体は、弱毒化さ
れたヒトロータウィスルにより与えられるv.p.4蛋白質
をエンコードする遺伝子と、弱毒化されたウシロータウ
ィルスWC3によって得られるv.p.7蛋白質をエンコードす
る遺伝子を含んでいる。本発明のこの観点による新規な
組換体の例は、ヒトの血清型１の株WI79からのv.p.3蛋
白質をエンコードした遺伝子４と、ウシ株WC3からの遺
伝子１乃至３と５乃至11の遺伝子を含む79−４である。
このような他の新規な組換体は、ヒトの血清型３の株WI
78の遺伝子４と、WC3から残り10の遺伝子を含む78−４
である。新規な組換体WI61−４は、同様に、新規なヒト
の血清型ロータウィルスから遺伝子４と、WC3から残り
の遺伝子を含んでいる。
本発明の新規な組換体の２つは、以下、詳細に説明さ
れる。しかしながら、上述した組換体のすべてが、以下
に明示されてはいない組換体と同様に、実施例の説明に
従い、本発明の方法をもってすれば、当業者には容易に
製造することができるであろう。
本発明は、新規な組換体の製造方法も含むものであ
る。この方法は適切な細胞培養で培養することによりヒ
トと他種のロータウィルスを分離する工程を有してな
る。分離技術は周知であり、以下の実施例１に詳しく説
明されている。
このような分離と感染に適した細胞は、アフリカミド
リザルの腎臓細胞CV−１（ATCC CCL−70）;BSC−１（A
TCC CCL−26）、胎児のミドリザル腎臓細胞MA−104及
びVERO（ATCC CCL−81）、及び第１次霊長類腎臓細胞
培養である。本発明を実施するために、第１次霊長類腎
臓細胞は、霊長類の与えられた種から誘導される腎臓細
胞の第１次、第２図（secondary）、第３次（tertiar
y）継代接種（passage）を含んでいる。これらの細胞培
養物質の各々は、10％胎児子ウシ血清を補ったBHK培地
［MacPherson,I and M.Storker,Virology,16:147（196
2）］、10％胎児子ウシ血清のイーグル最小必須培養、
或いは10％胎児子ウシ血清の培養199で増殖させられ
る。また、これらの培地は１ミリリットル中25マイクロ
グラムのジェンタマイシン（gentamicin）を含んでい
る。これらの細胞系は、単独で、或いはビールスの連続
継代接種において組合せで使用される。組合せで使用さ
れた場合、分離されしかし異なる細胞系はビールスの種
々の継代の各々に使用することができる。
第２に、適切な細胞培養は、弱毒化されたウシロータ
ウィルス株WC3と、所望のヒトの血清型ロータウィルス
とで感染される。混合感染は、各々親細胞ビールスの大
きく、かつ等しい濃度が同時に複製することを確実にす
ることにより、組換の可能性は最大限に示される。感染
させ、さらに遺伝子組換のための充分な時間と放置の
後、組換体の子孫クローン（progeny clones）は、プラ
ークのランダムな選択によって、例えば、混合感染から
のビールス収量のプラーク検定を行うことによって検査
される。ビールスは、他の細胞培養単層上で混合感染の
収量の接種により誘導される独立したプラーク中で繁殖
する。各々のこのようなビールス集団のPage−SS分析
は、その電気泳動型と各々の親細胞ロータウィルスの電
気泳動型を比較することによって行われる。分離された
組換体ロータウィルスの比率は、形態が両親細胞の形態
と異なるプラークを選択することによって増加させられ
る。或いは、子孫クローンは、集団のプラーク分析を行
う前において、v.p.3をエンコードする遺伝子を与える
ロータウィルスの血清型の超免疫抗血清（hyperimmune
antiserum）の処理［例えば米国特許第4,571,385号の方
法を参照されたい］後、混合感染のビールス収量から選
択されてもよい。この方法は特異性血清型ワクチンが要
求される種々のヒト或いは動物にも適用できる。
子孫クローンは、個々のプラークの採集することによ
って検査され、これらプラークはこのとき細胞培養中で
個々に培養され、かつDolan et al,J.Clin.Microbiol. 2
1:753（1985）の操作により銀株（silver strain）を伴
うポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（PAGE−SS）によ
ってこれら遺伝子の組織を検査される。PAGE−SSが少な
くとも弱毒化されたウシロータウィルス株WC3からのv.
p.4抗原をエンコードする遺伝子４と、免疫防御が求め
られているものに抗してロータウィルスからのビールス
中和と関連する主ロータウィルス表面抗原v.p.7をエン
コードするための遺伝子との存在を示すのであれば、組
換体子孫クローンは、ワクチンの候補者として選ばれ
る。或いは、本発明による組換体の他の群のために、PA
GE−SSがヒトの血清型ロータウィルスからの遺伝子４と
他の種のロータウィルス例えばWC3からの遺伝子をエン
コードするv.p.7の存在を示すのであればそのクローン
はワクチン候補者として選ばれる。
また、本発明は、ヒトロータウィルス感染による急性
の下痢に抗する免疫学的防御を生じるワクチンを提供す
る。これらワクチンは、本発明の新規な組換体の１以上
を含み、選択的に、従来のワクチン補助液、及び／又
は、例えば水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウム
の水溶液懸濁液のような担体を含んでいる。本発明によ
るワクチンを製造する方法は、例えばCV−１細胞のよう
な適切な細胞基質の接種と、その中に組換体を継代接種
することを含んでいる。１以上の異なるヒトの血清型組
換体の組合せによって、ワクチンはポリタイプ（polyty
pic）のウイルス性中和抗体反応を惹き出すことができ
る。
それ故、本発明は、ヒト或いはウシロータウィルス感
染に対して新規な組換体を人にワクチン接種を行う方法
も提供する。前述された１以上の組換体を含むワクチン
物質が、好ましくは経口或いは鼻の経路により高投与量
で投与される。また、ワクチンは注射による投与も可能
である。
さらに、ワクチンは、妊婦や幼児に免疫をあたえる手
段として乳母に投与することもできる。すべての投与経
路における投与量は、一般に組換体の106以上、好まし
くは、106乃至109プラーク形成単位（pfu）である。ワ
クチンの追加的投与も可能である。薬学的に受け入れら
れるワクチンの製造は、ph、等張性、安定性等につい
て、当業界で知られている。ワクチン接種法の投与管理
は、種々の受容体と環境要因、例えば、患者の年令、投
与時間及び地理的な場所や環境を考慮して投与される。
以下の実施例は、２つの特定の組換体ビールスをもっ
て、本発明の方法及び組成物を説明している。
実施例1:ロータウィルスの分離 本発明による組換体を製造するために使用されるウシ
ロータウィルス株WC3、及びヒトロータウィルス株は、
細胞系MA104中で分離され、ついで、細胞系CV−１中で
増殖させられる。
ヒト起源のロータウィルスは、Clark et al.（1987）
supraのヒトロータウィルス株WI61の分離として既に述
べたように標準法により分離された。下痢症状の幼児の
便は、２重鎖RNAのロータウィルスの特徴ある11の分節
の検出のための、PAGE−SSによる検査によって、ロータ
ウィルスを含むことが確認された。ロータウィルスを含
む便は、1ml中500単位のペニシリン、1ml中500マイクロ
グラムのストレプトマイシン、1ml中40マイクログラム
のジェンタマイシン、1ml中50単位のニスタチン（nysta
tin）、及び1ml中20マイクログラムのトリプシンを含む
血清を有しないイーグル最小必須培地の５％（w/v）懸
濁液中に乳化された。便懸濁液は30分間2000Xgで遠心分
離によって浄化された。浄化された上澄液は、等量の精
製トリプシン（10マイクログラム/ml）とともに燐酸緩
衝食塩水中で37℃において60分間インキュベイションさ
れた。トリプシン処理された便の上澄液は、すでにPBS
で３回洗浄されたMA104細胞の管培養へ0.2ml接種され
た。37℃において30分間ロータウィルスを含む溶液に吸
収された後、管培養は1ml中１マイクログラムの精製ト
リプシンを含む1.5mlのSato培地に入れられ、37℃にお
いてローラ装置でインキュベイションされた。
接種された細胞培養は、混合された細胞と細胞培養培
地を冷凍解凍により、７日間インキュベイションした後
に採集された。連続継代接種が、便の懸濁上澄み液を接
種された最初の継代接種と同様の方法で処理されたMA10
4の細胞培養の新しい管に0.2mlの非希釈細胞培養を接種
することによりおこなわれた。各々の継代接種の細胞培
養懸濁液は、PAGE−SS法によりロータウィルスRNAの存
在が分析された。ロータウィルスRNAの検出可能な濃度
は、通常、第２、第３継代接種レベルで得られる。可視
的な細胞変性効果は、通常では、第２乃至第５細胞培養
継代接種で現れた。ロータウィルスが細胞変性した後、
CPEが細胞単層の75％以上現れたときは常に（２乃至７
日間）、連続継代接種がおこなわれた。ロータウィルス
分離が、48時間中にローラ管培養のCPEを一貫して誘導
した場合（通常４乃至８の継代接種）、連続継代接種
が、1ml中13マイクログラムの未精製トリプシン（Flow
Labs）を補ったBHKが入れられたMA104の定常培養中でお
こなわれた。MA104細胞定常培養中の連続継代培養が、
ローラ管を使用した連続継代細胞と同様の方法でおこな
われ、分離されたロータウィルスがMA104細胞培養中に
横たえられたアガロース下でプラークを効率よく誘導す
るように確認できるまで続けられた。
ロータウィルス分離が、Offit et al,.J.Virol.Metho
ds，７:29（1983）によるプラーク誘導検定でプラーク
を効率よく誘導させた場合［通常105乃至107pfu/ml］、
それはMA104細胞培養中で増殖させられた。そして、そ
れは培地がイーグルMEM血清を持たず、1ml中6.25マイク
ログラムの未精製タイプシン（Flow）を含むものを除い
て、同様の連続継代接種法によりCV−１の定常培養中で
成長させられる。適当な、異なる継代接種レベルで、分
離されたロータウィルスは、MA104細胞培養中で製造さ
れた単プラークの分離および増殖によって遺伝学的に精
製することができる。周囲のプラークから充分に分離さ
れた、単一プラーク中の細胞の機械的な吸引の後、標準
法によってこの細胞懸濁液に含まれたビールスの連続的
増殖が続けられる。
最初の便の懸濁液中のビールスと比較される細胞が培
養されたロータウィルスが何であるか、ポリアクリルア
ミド・ゲル中で誘発されたRNA電気泳動型との比較によ
り確かめられる。細胞が培養された各々のロータウィル
スの血清型は、特異性血清型超免疫抗血清と、ウサギ或
いはモルモットで製造された原型ロータウィルスとの反
応により決定することができる［Clark et al,（1987）
supra］。
実施例2:ロータウィルスの製造 A.WC3:2−５ 24ウェル（well）プラスチック・プレート（おおよそ
ウェル当たり1cm2の細胞単層）中のMA104細胞培養は、P
BSで２度洗浄され、1.5×105pfuのヒトの血清型３ロー
タウィルス株WI78継代接種レベル17）と1,5×103pfuのW
C3ロータウィルス（継代接種レベル11）を含む混合物に
接種された。WC3が最も速いヒト起源のロータウィルス
分離より速く成長するため、過量のWI78が入れられた。
1ml中13マイクログラムのトリプシン1mlに対してウェル
当たり1.5mlのBHK培地が加えられ、37℃でインキュベイ
ションが行われた後、ビールスは、同温度で30分インキ
ュベイションにより細胞に吸収させられた。CPEが72時
間公表感染で完全な細胞集団となった後、培養は３回の
冷凍解凍により採集され、子孫ビールスはMA104中で標
準法によりプラークされた。親細胞ロータウィルスWC3
から誘導されたプラークより小さなプラークは、採集さ
れ、増殖され、PAGE−SSで分析された。
この混合感染の子孫プラークの中に、WI78:1,7,9で示
される組換体があった。この組換体は親細胞ロータウィ
ルスWI78の遺伝子分節1,7,9を含んでおり、残りすべて
はWC3からの遺伝子分節であった。このビールスは、３
回のプラーク精製を含め、MA104中で10回連続的に継代
接種された。WI78:1,7,9が標識超免疫抗血清により血清
型３のロータウィルスに中和されなかったため［例えば
Clark et al,AJDC，（1986）supra］、親細胞WI78の遺
伝子８は、遺伝子９はそうでないが、特異性血清型３の
v.p.7蛋白質をエンコードしていなければならないこと
が観察された。
第２混合感染は、WI78ロータウィルスが混合されたWI
78:1,7,9組換体を上記のようにしておこなわれた。この
混合感染から誘導された子孫プラークの中に、ウシロー
タウィルスWC3からの遺伝子２乃至５と残りのすべての
遺伝子はWI78ロータウィルスからの遺伝子を含む組換体
があった。WC3:2−５で示されるこの組換体は、３回の
プラーク精製を含み、MA104細胞培養中で６回継代接種
された。ビールス中和（VN）試験中で、超免疫標識血清
を双方のヒトの血清型３のロータウィルスとウシロータ
ウィルス血清型ビールスに反応させるWC3:2−５ビール
ス反応は、その表現型が血清型３とウシの双方を示し
た。
また、WC3:2−５は、CV−１中で少なくとも106.0pfu/
mlのタイターを複製する。この投与において、経口接種
された成人及び生後２カ月の幼児では完全に弱毒化され
た。WC3:2−５を経口接種されたほとんどの幼児は、略
々等しい頻度で、ヒトの血清型３のロータウィルス及び
／又はウシの血清型ロータウィルスにVN抗体として反応
する。
B.WI79−3,9 24ウェル中のMA104細胞培養はPBSで２回洗浄され、2.
0×105pfuのヒトの血清型１株WI79ロータウィルスを含
む0.2mlの懸濁液に接種された（WI79は、２回のプラー
ク精製を含み、MA104細胞中で11回、そして、CV−１細
胞中で13回継代接種された）。ビールスが取り除かれ4.
0×101pfuのWC3ロータウィルス（継代接種レベル12）を
含むPBS0.2mlの懸濁液で洗浄された細胞が加えられた
後、ビールスは37.0℃で60分間細胞に吸収させられた。
細胞がPBSで３回洗浄され、1ml中13マイクログラムのト
リプシンを含むBHK培地1.5mlが加えられた後、WC3ロー
タウィルスは60分間吸収させられた。完成した細胞は、
CPEが完全な単層になるまで（おおよそ96時間公表感
染）、37.0℃でインキュベイションされた。そして、混
合感染は、３回の冷凍解凍により採集された。そして、
この採集された感染を有する細胞培養液体は、ウシ血清
型ロータウィルスに超免疫の兎の抗血清の等量の細胞培
養液体を加えてなる中和反応で反応させられ、従来の方
法によって得られ、１対50に希釈させられた。そして、
得られた中和混合物は、生存するビールスが標準法によ
ってMA104細胞培養中でプラークされた後、30分間37.0
℃でインキュベイションされた。MA104細胞培養中で誘
導されたプラークは、ランダムに採集され、MA104細胞
培養中に接種され、２重鎖RNA電気泳動をPAGE−SSによ
り親細胞ロータウィルスWC3とWI79と比較して分析され
た。これらプラーク分離物の中には、ヒト血清型からの
遺伝子９とウシロータウィルス株WC3から誘導された他
のすべての遺伝子１乃至８と11を含む、WI79−3,9で示
される組換体ロータウィルスがあった。
WI79−3,9は、超免疫抗血清のVN試験では、遺伝子学
的には２価の染色体である。それは、ウシ血清型とヒト
の血清型１ロータウィルスに抗血清として作用する。WI
79−3,9はCV−１細胞培養中で107.0pfu/mlのタイターに
複製する。この濃度では、経口接種された成人及び生後
２カ月の幼児において完全に弱毒化される。ほとんどの
幼児において、WI79−3,9ロータウィルスは、ロータウ
ィルス血清型及び／又はウシロータウィルス血清型に対
してVN抗体特異性を誘導する。
実施例3:例示的新規なワクチンを製造する方法 A.WC3:2−５ WC3:2−５組換体は、CV−１細胞中の４つの追加的継
代接種によりCV−１細胞培養中で成長させられた。４番
目のCV−１細胞継代接種はヒトの成人の志願者及び幼児
で評価を受けた試験ワクチンを有している。
ワクチンは、10％胎児子ウシ血清と25μg/mlのジェン
タマイシンを含むイーグルMEM培地で増殖されたCV−１
細胞培養の850cm2プラスチック・ローラボトルの接種に
より製造された。全面単層が細胞植え付け後に６日で得
られたときに、細胞が接種された。細胞培養は、残余血
清を除くためにPBSで２回洗浄され、全部で6.0×106pfu
（感染MOIの多重度は約0.1）を含む10mlのWC3:2−５ロ
ータウィルスストックに接種された。ビールスは37.0℃
で60分間のインキュベイションにより細胞に吸収させら
れた。接種物が除かれ、細胞は、血清を含まず5.0μg/m
lの未精製トリプシンと25μｇのジェンタマイシンを含
むBHK培地のローラフラスコとに80mlずつ入れられた。
ロータウィルスが感染した細胞培養は、無傷単層がCPE
を表すまで、約72時間37.0℃でインキュベイションされ
た。そして、ビールスは、３回の冷凍解凍で細胞を破壊
することにより採集された。細胞の破片は4.0℃で60分
間の2000Xgの遠心分離により除かれた。得られた上澄液
は試験ワクチンであった。それは、死滅試験、外部ビー
ルスからの隔離、感染組立体ロータウィルスの濃度検定
の待機のために−70℃で冷凍された。
死滅試験は、有機及び無機バクテリア、マイコバクテ
リア及び菌類の培養のための標準実験培地へのワクチン
の接種からなる。ワクチンは、内部細胞質DNAのためのH
oechst株を染み付けることによって、培養中に3T3マウ
スの接種によりマイコ・プラズマを試験された。外部ビ
ールスの試験は、ワクチン・ビールスの複製を抑圧する
ように、従来の方法により得られた特異的血清型抗ロー
タウィルス血清の存在下でヒト及び霊長類細胞培養の接
種を含んでおり、CPE及び／又は赤血球吸着の出現が観
察された。アダルト及び新生のマウスは、大脳及び口の
経路でワクチンが接種され、引き続き30日間観察され
た。アダルト・モルモットは腹膜に接種され、接種後15
日間観察された。
感染性組換体ロータウィルスWC3:2−５濃度は、標準
プラーク検定により決定された。本実施例のワクチン
は、106.3pfu/mlのタイターを有していた。ワクチンス
トックは、ATCC（American Type Culture Collection）
に、ATCC No.VR2195として寄託された。
B.WI79−3,9 組換体ロータウィルスWI79−3,9は、MA104細胞培養中
で３回の連続プラーク精製を含み計６回継代接種化さ
れ、CV−１細胞中で３回の継代接種によりCV−１培養で
成長させられた。第3CV−１細胞継代接種は、成人志願
者及び幼児で評価された試験ワクチンを与える。
試験ワクチンは、前述のＡ項のWC3:2−５で使用した
同様の方法により製造された。CV−１のローラーボトル
（850cm2）は、M.O.I.約0.30でWI79−3,9組換体ロータ
ウィルスに感染された。細胞培養が25μg/mlのジェンタ
マイシンと1.0μg/ml精製トリプシン（Sigma Chemical
Company）を含み無血清のBHK培地の100ml/ローラーボト
ルに入れられた後、ビールスは37.0℃で30分間吸収され
た。感染した細胞培養は37.0℃でインキュベイションさ
れ、CPEが感染72時間後に完全な単層となったときに採
集された。試験WI79−3,9ワクチンを製造するためにビ
ールスを採集し浄化する方法及び外部ビールスからの死
滅と隔離を確実にするようにする方法は、前述Ａ項に説
明したものと同一であった。WI79−3,9組換体ロータウ
ィルスは、107.5pfu/mlの感染性タイターを有してい
た。ワクチンストックは、ATCCにATCC No.VR2196とし
て寄託された。
実施例3:新規なワクチンの投与 A.WC3:2−５ 成人へのワクチンの投与:WC3:2−５の完全な１回の投
与（106.3pfu）が、31才から50才の６人の普通の成人志
願者に投与された。志願者は、胃酸が一定に保たれるよ
うに、ワクチンの前にMaalox（Rorer）が与えられた。
全員が30日間医学的に安静にされた。全員に、接種後３
日の糞便中のワクチンロータウィルスの排泄が認められ
なかった。成人一名が、接種後30日で両方のWC3ロータ
ウィルスとヒトの血清型３ロータウィルスに対して、血
清抗体の増加を示した。他の志願者は、血清型１及び／
又は３及び／又はウシ血清型に対して全員が以前より血
清陽性であり、血清型３或いはウシの血清型ロータウィ
ルスに血清抗体の上昇を示さなかった。志願者の誰も血
清型１のロータウィルスに対して抗体の上昇を示さなか
った。
幼児へのワクチンの投与：まず、WC3ワクチンで事前
に免疫化された２名の幼児と、104.3pfuの事前投与とし
てWC3:2−５を与えられた２名の幼児と、105.3pfuの事
前投与を与えられた２名の幼児に、WC3:2−５が、105.3
pfuの少なめの投与量で投与された。最終的に、24名の
幼児が106.3pfuの完全な投与量が与えられた。すべての
幼児は、20％チェリーシロップを含む2.5mlの投与物を
経口により与えられた。約半数の幼児において、ワクチ
ン投与30分前に、幼児の体に従い少なくとも30mlの経口
投与することにより胃酸が中和された。
幼児全員において、接種後７日間においてワクチンに
関連する病気の発生が観察されたが、誰にもその徴候は
認められなかった。糞便試料が、標準プラーク検定によ
りワクチンロータウィルスの検出をするために、接種後
３日から７日の間で収集された。１名の幼児が、105.3p
fuのワクチン投与を受けた後に低いタイター（103.0pfu
/gの糞便以下）でワクチンロータウィルスが排泄され
た。30日の試験を満了した幼児29名中12名（41％）が、
ウシロータウィルス株WC3と原型ロータウィルス株SA11
（血清型３）とWa11（血清型１）に対して血清を試験し
た結果、感染後30日で血清抗体の増加を示した。観察さ
れた血清抗体反応は、２価の血清型３及びWC3:2−５組
換体ロータウィルスのウシの血清型複合物に向かい、ウ
シ血清型WC3ロータウィルス（幼児29名中８名、すなわ
ち28％）と血清型３ロータウィルス株SA11（幼児29名中
９名、すなわち31％）に対して最もよく表された。幼児
４名、すなわち14％だけが、Waに対するSN反応を示し
た。
WC3:2−５の組換体ビールスワクチン化集団の分析10
6.3pfuの完全投与量が与えられた幼児24名のみ）は、生
後２カ月乃至４カ月の幼児（3/13、すなわち23％）より
生後５乃至11カ月の幼児（6/11、すなわち55％）のほう
が効率良く反応したことを示した。ワクチン投与の前に
血清抗体の低いタイターを具えた幼児もワクチンの対す
る免疫反応を示すようである。例えば、ワクチン投与前
に血清型３ロータウィルスに対し1:250よりも低い血清
抗体タイターを持つ生後５カ月乃至11カ月の幼児では、
８名のうち６名、すなわち75％の幼児がワクチンに反応
する血清抗体の上昇を示した。
また、免疫反応を創り出した比率は、最初の投与後、
経口で30日与えられたWC3:2−５の２回目の投与量投与
により高めることができた。従って、完全な２回の投与
量が与えられた19名の幼児の７名、すなわち37％が第１
の投与に反応し;19名中10名、すなわち53％が第２の促
進剤投与量に反応し、19名中13名、すなわち68％が第
１、第２或いは双方の投与に反応した。
血清型３の中で分類される異なるロータウィルス株の
遺伝子的異変が、超免疫［Hoshino et al,1984］、或い
は単継代接種抗血清［Taniguchi et al,1985］を使用し
た交差中和試験で比較することにより観察された。従っ
て、WC3:2−５組換体ビールスの１回目投与後30日の18
名の幼児から収集された血清は、WC3:2−５組換体とSA1
1原型血清型３ロータウィルスに抗体を中和させるため
に試験された。多くの幼児が、SA11ビールスに対する検
出可能な血清抗体反応がないにもかかわらず、WC3:2−
５組換体に対して免疫反応を創り出した。WC3:2−５ワ
クチンの１回目投与後、２つの血清型３ビールスに対す
る血清抗体反応を具えた幼児の総発生率は、18名中13
名、すなわち72％であった。
B.WI79−3,9 成人へのワクチン投与:4名の成人志願者は、胃酸を一
定に保つために30mlのMaaloxを経口投与した後、完全投
与量（107.5pfu）のWI79−3,9ワクチンを経口により与
えられた。成人全員が医学的安静にされた。感染３日後
に収集された糞便試料中に誰にもワクチン組換体が排泄
されなかった。
幼児へのワクチン投与:WI79−3,9ワクチンは、2.0ml
のワクチンと0.5mlのチェリーシロップを含む2.5mlの経
口で幼児に投与された。幼児は、胃酸を一定に保つよう
に、ワクチン前30分以内に、幼児の体に従い30ml、或い
はワクチン前30分以内に体重1kg当たり1mlのMaaloxを時
折与えられた。つぎつぎに、２名の幼児は105.5pfuのWI
79−3,9投与量が与えられ;2名の幼児は106.5pfuの投与
量が与えられ;49名の幼児と３才の子供は107.5pfuの投
与量が与えられた。ワクチンに関連のある病的症状は観
察されなかった。完全投与量が与えられた50名の内４名
が、糞便中にワクチンビールスを検出できるレベルをも
って排泄した。ワクチンをいくらかの投与量で与えられ
た54名中31名の幼児、すなわち57％が、ロータウィルス
血清型1,3或いはウシの血清型の１以上に対するビール
ス中和血清抗体反応を見せた。WI79−3,9を主とする投
与量に対するこの免疫反応は、組換体ロータウィルスの
２価の抗遺伝子構成物を反映し、ウシのロータウィルス
血清型、WC3或いは血清型１、WI79に対して最もしばし
ば向けられたものであった。
幼児におけるWI79−3,9に対する免疫反応の誘導の効
率は、１回目の投与後から30日において、経口によりワ
クチンを第２の“促進的”（booster）投与を与えるこ
とによりさらに高められた。このような促進的投与量
は、最初の接種に使用されたWI79−3,9組換体ビール
ス、或いはWI79−3,9組換体の母細胞のビールスからな
るワクチンからなる。WI79−3,9ビールスワクチンとと
もに３回の促進的投与量のいくらかを含めた複合させた
結果では、生後２カ月乃至４カ月の幼児において血清抗
体反応は71％を与え、生後５カ月乃至11カ月の幼児にお
いて91％を与えた。また、促進的投与量を続けることに
より、血清型３ロータウィルス（SA11）の異種菌型抗体
が、ウシ血清型に或いは血清型１のロータウィルスで得
られたものとしばしば同様の頻度で誘導された。このよ
うに、抗体が、米国における幼児のロータウィルス性病
気に最も関係がある２つの血清型1,3に誘導された。
ここに開示された思想に基づいて、本発明の方法及び
組成物は、当業者によって種々の改変が可能である。こ
のような改変は、特許請求の範囲に含まれるものと解さ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記１名の代理人 弁理士 木下 洋平 (72)発明者 スタンレイ・エイ・プロトキン アメリカ合衆国ペンシルバニア州19151 ペンウイン、ファーウッド・ロード 322 (72)発明者 エイチ・フレッド・クラーク アメリカ合衆国ペンシルバニア州19096 ウィンウッド、ウエスト・ウィンウッ ド・ロード1202 (72)発明者 ポール・オフィット アメリカ合衆国ペンシルバニア州19146 フィラデルフィア、エス・トゥエンティ フィフス・ストリート 410 審査官 斎藤 真由美 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．３, （1985），Ｐ．949−954 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．112, （1981），Ｐ．385−390 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．24，Ｎｏ．５，（1986），Ｐ．822 −826 Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．82，（1985）, Ｐ．8701−8704 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 68，（1987），Ｐ．115−122 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/15 C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 - 7/01 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ロータウィルスによって発病する胃腸炎の
    症状を緩和させるのに有用なワクチンであって、 （ａ）選択されたヒトロータウィルス株から得られたv.
    p.4をエンコードした１つの遺伝子分節と、ヒトロータ
    ウィルス株及びウシのWC3株又はその子孫株から得られ
    た10の遺伝子分節とからなる組換えられたロータウィル
    スであって、ここに、前記10の遺伝子分節の少なくとも
    １つがウシのWC3株又はその子孫株から得られたもので
    ある第１の組換えられたロータウィルスと、 （ｂ）選択されたヒトロータウィルス株から得られたv.
    p.7をエンコードした１つの遺伝子分節と、ヒトロータ
    ウィルス株及びウシのWC3株又はその子孫株から得られ
    た10の遺伝子分節とからなる第２の組換えられたロータ
    ウィルスであって、ここに、前記10の遺伝子分節の少な
    くとも１つがウシのWC3株又はその子孫株から得られた
    ものである第２の組換えられたロータウィルスとを有し
    てなり、 前記両組換えられたロータウィルスがヒト用ワクチンと
    して適当である、 ワクチン。
  2. 【請求項２】前記ヒトロータウィルスがビールス血清型
    １、血清型２、血清型３、血清型４、血清型M69、及び
    血清型WI61からなる群から選択される、請求項１のワク
    チン。
  3. 【請求項３】前記第１の組換えられたロータウィルス
    （ａ）がWI79−4,WI78−4,WI61−４からなる群から選択
    される、請求項１のワクチン。
  4. 【請求項４】前記第２の組換えられたロータウィルス
    （ｂ）がWI79−3,9とWI78−８からなる群から選択され
    る、請求項１のワクチン。
  5. 【請求項５】v.p.4をエンコードした選択されたヒトロ
    ータウィルス株から得られた１つの遺伝子分節と、ヒト
    ロータウィルス株及びウシのWC3株又はその子孫株から
    得られた10の遺伝子分節とからなる組換えられたロータ
    ウィルスであって、ここに、前記10の遺伝子分節の少な
    くとも１つがウシのWC3株又はその子孫株から得られた
    ものである、組換えられたロータウィルス。
  6. 【請求項６】前記ヒトロータウィルスがビールス血清型
    １、血清型２、血清型３、血清型４、血清型M69、及び
    血清型WI61からなる群から選択される、請求項５の組換
    えられたロータウィルス。
  7. 【請求項７】前記ロータウィルスが、WI79−4,WI78−4,
    WI61−４からなる群から選択される、請求項５の組換え
    られたロータウィルス。
  8. 【請求項８】v.p.4をエンコードした選択されたヒトロ
    ータウィルス株から得られた１つの遺伝子分節と、ヒト
    ロータウィルス株及びウシのWC3株又はその子孫株から
    得られた10の遺伝子分節とからなる組換えられたロータ
    ウィルスであって、ここに、前記10の遺伝子分節の少な
    くとも１つがウシのWC3株又はその子孫株から得られた
    ものである、組換えられたロータウィルスと、 薬品として受容できるキャリアとを有してなる、 ロータウィルスによって発病する胃腸炎の症状を緩和さ
    せるのに有用なワクチン。
  9. 【請求項９】前記組換えられたロータウィルスがWI79−
    4,WI78−４、及びWI61−４からなる群から選択される、
    請求項８のワクチン。
  10. 【請求項１０】遺伝子分節３と９がヒトロータウィルス
    株WI79から得られ、残りの遺伝子分節がウシのWC3株か
    ら得られる、組換えられたロータウィルスWI79−3,9。
  11. 【請求項１１】遺伝子分節８がヒトロータウィルス株WI
    78から得られ、残りの遺伝式分節がウシのWC3株から得
    られる、組換えられたロータウィルスWI78−８。
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