JPS62192325A - ワクチン、その製造法及びヒトのロ−タウイルス感染症に対するワクチン接種における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトのロータウィルス感染症に対するワクチン
接種に用いるためのワクチン及びそのようなワクチンの
製造及び使用法に関するものである。

発明の背景 急性の感染性下痢は世界の多くの地域における病気及び
死の主要原因である。発展途上国では下痢症の影響は大
きい。１年間に（１９７７−１９７８）、アジア、アフ
リカ及びラテンアメリカでは、下痢の３０〜５０億症例
が５００万〜１０００万人の死につながったと推定され
た（Ｗａｌｓｈ、Ｊ、＾、ｅｔ　ａＬ　Ｎ。

Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　１９７９；　３０１　；
　９６７−９７４）。

初めに確認されて以来、ロータウィルスは乳幼児の入院
を必要とする急性胃腸炎の最も重要な原因物質であるこ
とが証明された。合衆国、英国、オーストラリヤ及び日
本における研究は、急性下痢症で入院した子供の３４％
〜６３％がロータウィルス感染症であることを示してい
る。

発展途上国における胃腸炎の包括的研究は最近になって
ようやく行われたとはいえ、ロータウィルスは非常に重
要な病原体であるように思われる（Ｏｆｆｉｔ、Ｐ、＾
、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏｌｌ１ｐ、　Ｔｈｅｒ、　１
９８２８（８１：２ｌ−２６）。

ロータウィルスに起因する胃腸炎は主に幼児期の病気で
あり、最も一般的には６〜２４ケ月の子供がかかる。こ
の病気の流行のピークは温暖気候の地域では寒い季節に
あり、熱帯地方では一年中あられれる。ロータウィルス
は人から人へ、糞便−経口経路によって感染し、潜伏期
間は１〜３日間である。生後６ケ月〜２４ケ月の群にお
こる感染症には似つかわしくなく、大部分の被験乳児は
無症候であるかほんの軽い症状をあられす。また、小さ
い子供におこるひどい症状とは対照的に、大部分の成人
の感染症は軽く、または無症候である、というのは、そ
のようなエピソードはロータウィルスを排泄しているこ
とが判っている子供との接触の結果としての再感染を示
すのが一般的だからである＜０ｆｆｉｔ、Ｐ、Ａ、ｅｔ
　ａｌ＋等）。

ロータウィルスは子牛、豚、子羊及びマウスを含むいく
つかの動物の種類における新生児下痢症の原因としても
証明された。

ロータウィルスは、その起原が牛であろうと霊長類動物
であろうと、直径約７０ｍ−の球形で、この名称はその
明らかな二重キャブジッド構造に由来する。これらのゲ
ノムは、二重鎖ＲＮＡの１１の分節とＲＮＡのポリメラ
ーゼとから成る（Ｒｏｄｇｅｒ＋　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｊ、　Ｃ１１ｍ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ。

１９８１、上３　：　２７２−２７８　；Ｖｅｒｌｙ、
　Ｌ、ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　
１９７７　；　３５　：　５８３−５８６　ｉ　５ａｂ
ａｒａ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉ
ｒｏｌ。

Ｄｅｃ、　　１９８２＋　　ｐ８１３−８２２　：　Ｃ
１ａｒｋ＋　　ｆａｎ　Ｎ−ｎｅｔ　ａｌ＋“感染及び
免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　　Ｉｎ５ａｎｉｔ
ｙ）　”Ｍａｙ　　１９８２　、ｐ４９２　　４９７　
；　Ｒｏｄｇｅｒ、　　Ｓ、、　　ｅｔ　ａｌ＋Ｊ、　
　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、、　　Ｊｕｎｅｌ　９７９　、　
　ｐ　８３９−８４６）　　。

興なる種属のロータウィルスは血清学的交差反応を示す
一般抗原を与える。しかしながら、ロータウィルスには
、血清中和（ＳＮ）試験で最も速く検出される特異的表
面抗原によって特徴づけられる異なる血清型が存在する
という証拠がある０例えば精製ウィルスに対して作られ
た抗血清は、異種血清型のウィルスとよりも、同種ウィ
ルスとの方が、ずっと高いＳＮ値を与える。

興なるロータウィルス血清型の臨床的に重要な知識は現
在のところ不充分であるが、ヒトにおける血清型間の交
差免疫は限られていることを示す疫学的証拠はある。

ヒト・ロータウィルスは、ウィルスコアにある二、三の
抗原の差に基づいて二つのサブグループに分けられる＊
　　（Ｋａｐｉｋｉａｎ、＾、Ｚ、　ｅｔ　ａＬＩｎｆ
ｅｃｔ、　　ｌｍ５ｕｎ、　　３３　　：　　４１５　
−　４　２　５　　（１９８１）　　　；Ｇｒｅｅｎｂ
ｅｒｇ＋　　Ｈ，ａｔ　　ａｌ　　Ｉｎｆｅｃ＋　Ｉｍ
ａｕｎ＋　３９＝　　９１−９９　（１９８３））、ヒ
トの病気ではサブグループ２の方が優勢であることがよ
くわかってきた。しかしながら°、サブグリープ２は、
血清中和（ＳＮ）試験によって区別できる３種類の明瞭
な血清型、即ち１．３及び４型から成る。（１１ｙａｔ
ｔ、　Ｒ，Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　１８＝３１０−３１７　（１９８３
））、血清型！及び３はヒトにおける疾病の最も重要な
原因であるようにみえる。フィラデルフィア小児病院で
行われた研究は、血清型３が、１９８２−８３年におけ
るロータウィルス胃腸炎の最も一般的な原因であったこ
とを示している。血清型に関するその他の分離物は血清
型１である。上記研究期間中に血清型２０−タウイルス
は認められなかった：血清型４は世界的に知られている
が、非常に少ない。

続発感染を経験した患者を調べてみると、一つの血清型
によって生じた病気は別の血清型による病気を防御しな
いことがわかった（ＺｔｓｓｉｓＧ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｌａｎｃｅｔ＋　Ｊａｎ　？＋　１９７８＋　Ｐ、３
８　３９）　＊ベルギーの研究者も最近、成人志願者を
ウシＮＣＤＶ株ロータウィルスで免疫する試みに失敗し
たと報告した（Ｖｅｓｔｋａｒｉ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａ
ｌ、。

Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｔｄ、　５３　：　２２
９−２３６　（１９８３））。この研究では、生きてい
るＮＣＤＶロータウィルスを摂取した２０人の志願者中
、−人だけがロータウィルスに対するエライサ試験（Ｅ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ）で検出される抗体値の上昇を示した。そ
の後同じこれらの研究者はより高い量（１０８１ＴＣＩ
　Ｄ５０）の生きているＮＣＤＶロータウィルスをフィ
ンランドの乳児に与えた（νｅｓｔｋａｒｉ＋　Ｔ、＋
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｏｃｔ、８＋１９
８３　　ｐ、８０７−８１１）。ＳＮ試験により、前に
はｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅであった１９人の乳幼児中
１３人に、同種ＮＣＤＶロータウィルスに対するＳＮ抗
体上昇がおこった。しかしながら、ヒト・ロータウィル
ス（血清型１又は２）に対してＳＮＮ抗体上上昇示した
子供は、ヒトロータウィルスに対する先在性ＳＮ抗体タ
イターをもっていた子供達であった。

褒肌叫旌亀免既！ ウシ、ロータウィルスの成る株（ここでは“ＷＣ株”と
記されることもある）が、培養細胞の少ない継代接種後
、乳幼児において、病気を発生することなくウシ及びヒ
ト・ロータウィルスに対して効率的免疫反応を誘起する
ワクチンを与えることが発見された。本発明の新規のワ
クチンを作るのに有用な、ウシ・ロータウィルスの代表
的菌株である、ＷＣ３と呼ばれる生きたウィルスは、東
南ペンシルバニアにいる子ウシの糞便から何回も分離さ
れた。その種の菌株を代表するその他の分離物はＷＣ２
，３，４゜５．６．７，８，９．１０と命名され、それ
らの明白なＲＮＡ電気泳動型、即ちポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって検出されるヴイリオンニ重鎖ＲＮ
Ａ分節の移動パターンによって（Ｐ　Ａ　Ｇ　、　Ｒｏ
ｄｇｅｒ　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６　：　ｐ、　６１０６１７　（
１９７７）　）並びにそれらが霊長類動物の赤血球を凝
集できないことによって、ＮＣＤＶ株のようなその他の
ウシ・ロータウィルス菌株とは容易に区別される。ウシ
・ロータウィルスのこの菌株は、血清学的試験即ち血清
中和（ＳＮ）試験及びプラークの形によって、その他の
ウシ及び霊長類動物のロータウィルスとも区別される（
Ｍａｔｓｕｎｏ＋　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｃ１１
ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　５　；　ｐ、１−４　（
１９７７＞）　　。

ＷＣ株のロータウィルスは種々の細胞培養、特にサル腎
臓組織培養−アフリカミトリザル腎臓（Ｃｅｒｃｏｐｉ
ｔｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈｉｏｐｓ）樹立細胞系ＶＥＲＯ
（ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）　、ＭＡ−１０４、Ｂ５Ｃ−
１（ＡＴＣＣＣＣＬ　２６）及びＣＶ−１（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ　７０）並びに霊長類赤毛猿（Ｍａｃａｃｃａ　ｍ
ｕｌａｔｔａ　）腎細胞及び赤毛猿二倍体細胞株ＦＲｈ
Ｌ−２（ＡＴＣＣＣＣＬ１６０）を含む−において増殖
する。その上ＷＣ株は、霊長類の−例えばアフリカミド
リザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈｉｏｐ
ｓ）　、赤毛猿、カニクイザル−第一次、第二次又は第
三次腎細胞で増殖する。本明細書及び請求範囲に使用す
る“霊長類動物の腎組織培養”という用語は、第一次、
第二次及び第三次細胞培養及び樹立細胞系及び細胞株を
含むことを意図する。

生ワクチンは口又は鼻の径路により（前者が好ましい）
ロータウィルス感染の危険性が比較的高い乳幼児に大量
に投与することが意図される。危険性の最も高い年齢は
一般に６ケ月から３０ケ月であるから、生後約６ケ月に
なる子供に先ず最初にワクチンを投与するべきである。

定期的に、例えば３〜６週間間隔で経口投与量を倍増し
、免疫反応を高める。

１０５〜１０Ｂ１好ましくは１０７のプラーク形成単位
（ｐｆｕ）／ｍｌの量で投与するのに必要なワクチン濃
度は、サル腎臓組織培養で容易に得られ、従って生きた
ウィルス（これからワクチンが形成される）の濃度は必
要ない。しかしながら、ワクチンは、実施例に示すよう
に、それを処理して細胞性蛋白質及び核酸のような細胞
成分を除去することによって精製される。

ワクチンは、凍結乾燥するか、その液体形を一２０℃〜
−７０℃に冷凍することによって安定して貯蔵すること
ができる。

ＷＣ株のウィルス分離物は東南ペンシルバニアに住む子
ウシの糞便から回収される。そのような子ウシからは異
なる分離物ＷＣ２〜ＷＣＩＯが回収された。そしてそれ
ら全てを本発明のワクチン製造に用いることができる。

しかしながら、話を簡単にするために、発明の詳細な説
明は成る程度、分離物ＷＣ３と関連づけて述べる。

ロータウィルス菌株の選定 既述のように、ＷＣ株のロータウィルスは東南ペンシル
バニアに住む子ウシの糞便から回収される。しかしなが
ら、世界の別の地域に住む子ウシからのウシ・ロータウ
ィルス菌株が本発明によるワクチン製造に使用するため
のクリテリヤに合うことは考えられる。即ち、前述の明
瞭なＲＮＡ電気泳動型をもつこれら菌株は霊長類動物赤
血球を凝集せず、血清中和試験によってその他のウシ及
び霊長類動物−ロータウィルスと区別される。

本発明のワクチンの製造に用いるウィルス株をあらかじ
め特徴づけた２種類のウシ・ロータウィルス株と、いく
つかのパラメータによって比較した。そして互いに容易
に区別できることがわかった。比較したウィルスは、ネ
ブラスカでメブス（Ｍｅｂｕｓ）が分離しく　Ｍｅｂｕ
ｓ、　Ｃ，八、　ｅｔａｌ、、　Ｃａｎａｄ、　Ｖｅｔ
、　Ｊ、　１９７１　、１２　：　ｐ６９−７２）ウシ
・ワクチンとして用いた（Ｍｅｂｕｓ。

Ｃ，Ａ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、Ａ、Ｖ、Ｍ、八
、　　１９７３．　１６３　　：ｐ８８０　ｅｔ　５ｅ
ｑ）ネブスカ子ウシ下痢ウィルス（ＮＣＤＶ）、ＡＴＣ
ＣＶＲ−４５２，及びサスカチワンでパビュク（［１ａ
ｂｉｕｋ）が分離した（Ｂａｂｉｔ＋に、　　Ｌ、八、
、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ　　、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１９７７、　６　：　ｐ６１０−６１７）　、ここでは
ＣＢＶと記すカナダ・ウシ・ウィルス株Ｃ４８６、ＡＴ
ＣＣＶＲ−９１７である。

ヒト−ロータウィルスと同様に（Ｒｏｄｇｅｒ、　Ｓ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃ１ｔ＋Ｉ１．　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　１９８１　＋　　１３＋ｐ２７２−２
７８）　、ウシ・ロータウィルス株でも、ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動における１に重鎖ＲＮＡゲノム分
節の特徴的移動パターンは変動する。３種類のウシ・ロ
ータウィルス株ＷＣ３、ＣＢＶ及びＮＣＤＶ（７）ＲＮ
Ａ移動パターンの比較を第１図に示す。ＮＣＤＶ株とＣ
ＢＶ株のパターンは非常に似ていて多分区別がつかない
。ＷＣ３ウィルス株は、ＲＮＡ分節４と６との移動速度
の顕著な差、及び分節１の移動速度のより小さい差のた
め、並びに分節２と３との分離及び分節７，８．９の一
致によって、はっきり区別できる。

ＣＢＶもＮＣＤＶもどちらもサル赤血球を凝集すること
がわかっている（Ｓｐｅｎｃｅ、　Ｌ、、　ｅｔａｌ、
　　　Ｃａｎａｄ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７８
＋　　２４：　３５３；　　　Ｆａｉｒｖｅｌ、　　Ｍ
ル、　　ｅｔ　　ａｌ、＋Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ
　　１９７８＋９　：　ｐ　４５−１０５　；　Ｂ１５
ｈａｉ、　Ｆ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、置Ｃａｎａｄ、Ｊ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏ１．１９７８　、２４　ｐ１４２５−１
４３０）。

ＷＣ３との比較を１表に示す。

」 赤毛猿赤血球の凝集 ロータウィルス株　感染価（ｐｆｕ　／　ｍｌ）　　凝
集値ＷＣ３１０７７＜ｌ：２ ＮＣＤＶ　　　　１０７５　　　　　　１　：　２５６
ＣＢＶ　　　　　１０８５　　　　　　１　：　１０２
４ＷＣ３は霊長類動物の赤血球を凝集しないため明らか
に区別することができる。

ウシ・ロータウィルスは、培養細胞に生じたプラークの
形において異なる（Ｎａｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

ｇｅｎ、νｔｒｏ１．１９８２　、５９　：　１）　４
２７−４３０）。

ＮＣＤＶ及びＣＢＶ株と比較したＷＣ３株のプラーク形
を第２図に示す；ＷＣ３はこの試験により明らかに区別
できる。

殆ど全てのロータウィルスが群特異的抗原を与えるとは
いえ、ウシ・ロータウィルスＮＣＤＶ株は、血清中和試
験により、他の宿主（ｈｏｓｔ）種属のその他のロータ
ウィルスと区別された（Ｈｏｓｈｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、
、　　Ｊ、Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、１９８４　＋　１４９　
＋５　：　ｐ　６９４−７０２）ウシ・ロータウィルス
の抗原群は明らかには決定されていないが、ウシ・ロー
タウィルス間に抗原の変動があることは知られている（
Ｆａｔｒｖｅｌ＋　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、＋等；　Ｍ
ｕｒａｋａｍｉ、　Ｙ、　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９８１＋２５　：
　ｐ　１０９７−１１００；　Ｗｏｏｄｅ、　Ｇ、Ｎ、
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ　　、　Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、　　１９Ｂ３　
、　１８　：　ｐ３５８−３６４　；　Ｂｒｔｄｇｅｒ
、　Ｊ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ
ｏｌ。

１９Ｂ４．６５　：１）１１５１−１１５８　；　　Ｍ
ｕｒａｋａｍｉ。

Ｙ、＋　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎ
ｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ＋　１９８３＋１東、　　３　；
　ｐ　８５１−８５５）。プラーク減少血清中和試験に
より、ＷＣ３株をウシ・ロータウィルスのＮＣＤＶ株及
びＣＢＶ株、ヒト−ロータウィルスのＷａ株（ヒト血清
型１）、ヒトロータウィルスの８２株（血清型２）、ヒ
ト−ロータウィルスのＳＴ株（血清型４）及びサル・ロ
ータウィルスの５ＡＩＬ株（ヒト血清型３に等値）と比
較したものを２表に示す。抗血清を非経口的に過免疫し
たモルモット又は家兎で作った。

２表 抗原の関係（血清中和試験）＊ ロータウィルス株 ＊　指示ロータウィルスをＩ　Ｘ　１０１ｐｆｕ　／ｍ
ｌ含む懸濁液中のプラーク数を５０％減らすことができ
る最大血清希釈の逆数。

２表に示す結果は、ロータウィルスのＷＣ３株が、ウシ
−ロータウィルスＮＣＤＶ及びＣＢＶ株と同様に、霊長
類のロータウィルス株Ｗａ及び５ＡＩＩと容易に区別さ
れることを示している。しかしながら、ウシ・ロータウ
ィルスの異なる菌株間の関係は複雑である。ＮＣＤＶに
対する抗血清は定量的に交差反応し、３ＭＷ４のウシ・
ロータウィルス株、ｗｃ３．ＮＣＤＶ及びＣＢＶを区別
しない。ＷＣ３株に対する抗血清は同種ＷＣ３ウィルス
を選択的に中和する。

ＣＢＶ株に対する抗血清は、ＮＣＤＶ及びＷＣ３ウィル
ス株とはあまり定量的には交差反応しない（２表参照）
。ＳＮ試験によって発見される同様な”　ｏｎｅ　ｗａ
ｙ　’″交差反応はウシ・ロータウィルス分離物で既に
報告された（Ｂｒｉｄｇｅｒｅｔ　ａｌ、＋　　ａｎｄ
　Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８３；　　
１ｂｉｄ　＞。

細胞培養 前述のように、ウシ・ロータウィルスのｗｃ株は霊長類
動物腎臓組織培養上で培養することができる。細胞系Ｃ
Ｖ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）　、ＢＳＣ−１　　（
ＡＴＣＣＣＣＬ−２６＞、ＭＡ−１０４及びＶＥＲＯ（
ＡＴＣＣＣＣＬ−８１＞を単独で用いるか、又は、ウィ
ルスの連続継代培養の場合は組合せて用いるのが好まし
い。組合せて用いる場合には、種々の継代培養の各々に
、単独の、しかも異なる細胞系を用いることができる。

霊長類足長喉属（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ　）腎細
胞は、ＢＨＫ細胞培地でも（Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ＋　
１．、　ｅｔ　ａｌ−＋ｆｂｉｄ）　、培地１９９でも
増殖する。どちらの場合にも１０％ウシ胎児血清及び２
５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充する。アフリカグリ
ーンマンキー腎細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）
は、１０％ウシ胎児血清及びゲンタマイシン２５μｇ／
ｍｌを補充したＢＨＫ細胞又は培地１９９で増殖させる
。赤毛猿胎児細胞ＭＡ−１０４は、１０％ウシ胎児血清
、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０
０μｇ／ｌ１１１を補充したＢＨＫ細胞培地で増殖させ
る。

ウィルスの分離、減毒及び増殖 ロータウィルスのＷＣ株は、糞便試料を選定された抗生
物質、例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタ
マイシン及びマイコスタチンを含むイーグル培地に懸濁
することにより分離される。その後試料を遠沈して細菌
及びその他の混入物を除去する。

遠沈して得た懸濁液を先ず、最初に１０％ウシ胎児血清
を補充し、糞便試料の際に培地に加えたものと同じ抗生
物質を含むイーグル培地で増殖した霊長類アフリカミド
リザル腎培養細胞で分離する。培養基は約７日間３７°
に保たれ、それから約−７０℃で冷凍して貯蔵し、その
後の使用にそなえる。

本発明のワクチンをつくるには、前記のようにして作っ
た、冷凍し解凍した全細胞培養物を、前記のように、霊
長類動物の腎組織培養から成る未感染培養細胞にサブ−
接種することにより連続感染を行う。各継代接種は３７
℃で行われ、明白な細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）があられ
れるまで−普通は接種後２〜４日でおこる一統けられる
。各継代接種で合計して１０５〜１０８プラーク形成単
位（ｐｆｕ　）　／　ｍｌが連続的に得られる。

継代接種の数は約５〜約２５の間に変動するが、１０〜
２０が好ましい。

初期継代接種では基質培養細胞は、１０％ウシ胎児血清
（Ｆｅ２）　、１００μｇ／＋ｎｌストレプトマイシン
及び１００Ｕペニシリンを補充したイーグル培地で増殖
する。その後の継代接種ではペニシリンを除いた同じ培
地が用いられる。

それはワクチン中のペニシリンの存在が好ましくないか
らである。

最初の継代接種と後の継代接種との間に、好ましくは霊
長類動物腎細胞培養基上で、１回以上のプラーク精製−
継代接種を行うことが望ましい。そのようなプラーク精
製は、まずブラークアッセー法によって、実施例ではＭ
Ａ１０４細胞において、オフイツト（Ｏｆｆｉｔ　）等
が報告したように（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
７　：　２９　　（１９８３））アガロース・カッ＼−
を用いてウィルス滴定することにより実行される。プラ
ーク（１ケの感染単位によって誘起された死細胞部分）
が明らかに見える時には、他のプラークから充分よく分
離される。１ケのプラークからの細胞及びそれをおおう
アガロースをバストウールピペットで吸引し、ウィルス
増殖培地に懸濁する。

この“ブラークー精製”懸濁液中のウィルスはその後標
準法を用いて更に培養される。

最後の継代接種では霊長類腎細胞を、１０％新生子ウシ
血清及び２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＢ　
ＨＫ培地を入れたプラスチックローラー壜で融合するま
で増殖させる。感染前に増殖培地を除去し、細胞を燐酸
緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗う。それから細胞に、上記の
ように開裂した（最低４継代接種）ＭＣウィルスストッ
クを約０．１の感染の多重度で感染させる。

培養物を３７℃で約６０分間保ち、ウィルスを付着させ
る、それから接種物を除去する。その後培養物に血清補
充物は含まないが２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び３
μｇ／ｍｌ精製トリプシンを含むＢ　ＨＫ培地を与える
。

感染した培養細胞を３７℃でＣＰＥが認められるまで、
一般には４８〜９６時間以内、培養する。細胞を数回、
普通３回冷凍及び解凍サイクルを行うことによって細胞
を破壊することにより培養物を収穫する。その後細胞の
残骸を遠沈によって除去する。遠沈後の上澄液はワクチ
ンを含みそれを無菌性及び偶発性ウィルスの存在の試験
を行うまで一７０℃で貯蔵する。

こうして製造したワクチンを次の方法によって試験する
。（１）細菌、真菌及びマイコプラズマの増殖用標準培
地の接種；（２）霊長類動物、及びヒト細胞培養系の接
種〔抗−ＷＣａＣ矢高血清がＷＣ３ウィルスに感受性の
ある培養細胞に加えられる）；（３１成モルモット（Ｉ
Ｐ）、成マウス（経口、ＩＣ及びＩＶ）及び新生マウス
（経口及びＩＣ）の接種。

ワクチンは経口または鼻の径路で投与される。

用量は普通１０（ＥＩ　〜約１０’　ｐｆｕの桁で、１
０８ｐｆｕが好ましい。

ロータウィルスワクチンＲＩＴ４２３７の血清変換速度
は、ミルクを飲ませて胃液の酸性を中和してから経口投
与することによって増加することが示唆された（　　Ｖ
ｅｓｔｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｅしａｎｃｅｔ、
　５ｅｐｔ　２２．１９８４　ｐ７００）　、本発明の
ワクチンの血清変換速度を増加させるために、それを４
０　Ｌｌ１ｇ／　ｃｃ水酸化マグネシウム及び４５ＩＩ
１ｇ／　ｃｃ水酸化アルミニウム（Ｍａａｌｏｘ＠、　
Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈ。

ＲＯｒｅｒ＋　Ｉｎｃ、　）を含む懸濁液と組合わせる
。用いる懸濁液の量は１　ｃｃ／　ｋｇ体重の桁である
。

本発明のワクチンの安全性及び効果は次の実施例で報告
される一連の試験で証明された。

実施例１ ０−タウイルス・ワクチンの製造 分離物ＷＣ３はチェスター区、ペンシルバニアで生まれ
た子ウシから回収された。子ウシは飼育所には行かず（
飼育の失敗は新生児下痢にかかり易くする）、ペンシル
バニア獣医科大学に輸送された。その時生後約６〜１０
時間で、そこでは手で食餌を与えた。生後４日目に子ウ
シには下痢が起こった。そしてこの糞便の電子顕微鏡（
ＥＭ）検査はロータウィルスの存在を示した。

糞便試料を、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５
００Ｕペニシリン、４０μｇ／ｍＩゲンタマイシン及び
５０μｇ／ｎ＋１マイコスタチンを含むイーグル培地に
懸濁した。試料を２０００Ｘｇで３０分間遠沈し、細菌
及びその他の混入物金除去した。ウィルスのシードパッ
チを作るために、遠沈試料の上澄液を、１０％ウシ胎児
血清（Ｆｅ２）を補充し、糞便試料を接種した培地に含
まれたと同じ抗生物質を含むイーグル培地で増殖させた
霊長類（足長喉属）サル腎培養細胞に接種した。感染前
に培養細胞を燐酸緩衝溶液で２回洗って血清を除去しく
それはロータウィルスの増殖を阻害する）それから再び
、細胞増殖培地と同じだが血清を含まず、６．２５μｇ
／ｍｌ濃度のトリプシン（フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）を含む培地
で増殖させた。培養物は約７日間３７℃に保ち、それか
ら−７０℃に冷凍してその後の使用のために保存した。

この培養細胞の群特異的（一般）ロータウィルス抗原を
免疫螢光抗体染色法によって検査すると（ＭｃＮｕｌｔ
ｙ、　Ｍ、Ｓ−＋　ｅｔ　ａｌ、＋＾ｒｃｈ。

ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、　５４：　ｐｐ　２０１　２０９、
（１９７７）　）細胞がロータウィルスに感染している
ことが判明した。

連続感染は、上記のようにして作った冷凍及び解凍−全
細胞培養物を未感染培養細胞へサブ−接種することによ
り行われた。継代接種歴は次のようであった：細胞系Ｃ
ＶＩで３継代接種、細胞系ＭＡ−１０４で２回プラーク
精製、細胞系ＣＶＩで６回継代接種。

各継代接種は３７℃で行われ、ＣＰＥが明らかになるま
で、普通は接種後２〜４日、続けた。

１０７ｐｆｕ　／ｍｌから１０８ｐｆｕ　／ｍｌまでの
値が各継代接種で日常的に得られる。

最初の３継代接種では、細胞系ＣＶＩを、１０％ＦＣ３
及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ
ペニシリンを補充したイーグル培地に増殖させた。ＭＡ
−１０４細胞を用いる２回のプラーク精製継代接種及び
その後のＣＶｌ細胞における６回継代接種では、同じ培
養培地を用いた。但しペニシリンは除去した。何故なら
ば、ワクチン中にこれが存在するのは好ましくないから
である。ウィルス感染細胞は、血清のない６．２５μｇ
トリプシン／ｍｌを含む同じ培地に保持した。用いたプ
ラーク精製操作法は既述のようである。

１０％新生子ウシ血清及び２５μｇ／ｍｌゲンタマイシ
ンを補充したＢＨＫ培地を入れた８５０Ｍプラスチック
ローラー壜培地でＣＶ　１．ｉｌｌ胞を融合するまで増
殖させた。感染前に増殖培地を除去し、細胞単層をＰＢ
Ｓ熔液で３回洗った。

それから上記のように作ったＷＣ３ウィルスストック溶
液（ｐａｓｓａｇｅ　１０　１３）を感染の重複度約０
．１で、細胞に感染させた。ウィルスを３７℃で６０分
間付着させた。接種物を除去しローラー培養物に、血清
補充物は含まず、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び３
μｇ／ｍｌ精製トリプシン（シグマケミカルカンパニー
　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｆｃａｌＣｏｍｐａｎｙｈ　）
を含むＢＨＫ培地８０　ｍｌ／容器を供給する。

感染培養細胞を３７℃で融合−細胞変性効果が認められ
るまで（４８〜９６時間）培養する。

細胞を３サイクルの冷凍、解凍により破壊し、その後細
胞残骸を６０分間１８００ＸｇＯ遠沈により除去するこ
とにより培養細胞を収穫する。

遠沈後の上澄液を合一する。それはワクチンを含む。ワ
クチンはバルクのまま一７０℃で冷凍し、その後の無菌
性−及び偶発的ウィルスがないことを確かめる試験まで
保存する。

無菌試験は、ワクチンを好気性並びに嫌気性細菌、ミコ
バクテリヤ、真菌の培養のための標準実験室的培地に接
種することを含む。マイコプラズマの試験は、培養した
マウス（３Ｔ３）細胞の接種とそれに続くヘキスト染料
による細胞質内ＤＮＡ染色により行われた。ウィルス試
験はヒト及び霊長類動物の培養細胞（ＷＣ３ウィルスに
対する特異的抗血清を有する）の接種を含み、これの細
胞変性効果及び／又は赤血球吸着を観察した。成マウス
に、脳内に、経口及び静脈内に接種を行った。新生マウ
スに脳内及び経口的に接種し、モルモットには腹腔内に
接種した。マウスは接種後３０日間、モルモットは１５
日間観察した。

ワクチンの感染ウィルス含量をプラーク試験により測定
した。最終的ワクチンは、トリプシンのないウィルス増
殖培地又はＰＢＳでワクチンブールを１０’　ｐｆｕ　
／１Ｉｌｌまで希釈することにより調製した。

シードバンチを細胞系ＣＶ−１−未感染細胞上に２回培
養した後のウィルスは、アメリカ培養コレクション（Ａ
ＴＣＣ）、ロックヴイル、マリ−ランド、Ｕ、Ｓ、Ａに
１９８５年２月４日に預託され、新規採用番号ＡＴＣＣ
ＶＲ−２１０１を与えられた。この実施例による第１０
回継代接種後の減毒ウィルスは、ＡＴＣＣに１９８５年
２月１４日に預託され、新規採用番号はＡＴＣＣＶＲ−
２１０２である。反対のことが唱えられない限り、本出
願で言及される全てのＡＴＣＣ保管物は出廓人、ザ・ウ
ィスター・インスティチュートに特許が与えられれば一
般に入手可能となり開示される。保管物は又、欧州特許
条約及びブタベスト条約を含む国際条約及び本出願が提
出された国々の外国特許法の要求するところにより手に
入る。

保管物の利用可能性は、本出願に関して又は本出願の分
割又は継続出願に関して発行されるあらゆる特許の価値
を減殺するような、本出願の発明を実施するライセンス
とはならない。

実施例２ 成人へのワクチン投与 実施例１のワクチンを、１０’ｐｆｕ／頚１を１回、５
人の正常成人志願者に経口投与して、安全性、免疫原性
及びウィルスが糞便中へ排出する可能性を試験した。

全志願者は臨床的疾患の徴候を示さなかった。

糞便に入るウィルスの試験結果及びロータウィルスに対
する抗体のＳＮ試験の結果を３表に示す。表かられかる
ように、接種後１〜２８日の間には糞便中にはウィルス
は発見されなかった（ウィルス分離法により）。５人の
志願者の中１人が、接種後７日及び１４日日目ＳＮ試験
で測定して血清中のＷＣ３に対する抗体の軽度の上昇を
示した。しかしＷａヒトロータウィルスに対する抗体の
上昇はなかった。その他の志願者はＳＮ抗体渕測定ＷＣ
３又はＷａロータウィルスどちらに対する抗体の上昇も
示さなかった。

１泉 血清中子り襲本 （，３９，′頁参照） 志願者の血清、唾液及び糞便でＥＬ−ＩＳＡ試験を行い
、得られた結果を４表に示した。そのＥＬ　Ｉ　ＳＡ試
験は普遍的な群特異的ロータウィルス抗原を検出した。

糞便と唾液を試験したのは、腸管腔内の抗体がロータウ
ィルス防御には２２９−２３０　　；　　　Ｓｎｏｄｇ
ｒａｓｓ、　　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、、　　八ｒｃｈ
。

Ｖｉｒｏｌ、　１９７６、　５２：　２０１　２０５）
　、唾液は主として分泌型抗体を含み、その合成は腸内
の分泌抗体産生に平行している。血清ＳＮ抗体試験から
れかるように、１人の志願者（ＭＫ−Ｍ）だけが血清抗
体値の顕著な上昇を示した。志願者ＭＤの血清及び糞便
中に、接種後１４日ロガけに見出された高いＥＬ　Ｉ　
ＳＡ抗体の意味は不明である。

」 （４０頁参照） 数値は○Ｄ４５０　　（＋Ｖ）　−０Ｄ４５０　　（−
Ｖ）、凹み中のＷＣ３ウィルス。下線を引いた数字は＞
ＯＤ　（−Ｖ）及び〉０日の数値 実施例３ 乳幼児におけるロータウィルスワクチンの経口接種 成人志願者における研究で臨床的安全生及び糞便への排
泄がないことがわかったので、実施例１のＷＣ３ワクチ
ンの経口投与を乳幼児にまでひろげた。これら（及び成
人試験）はウィスター研究所及びフィラデルフィア小児
病院両方の人間問題調査委員会（Ｈｕｍａｎ　５ｕｂｊ
ｅｃｔｓ　ＲｅｖｉｅｗＣｏｍｍｉ　ｔｔｅｅｓ）によ
って承認された。患者（成人）又は責任のある親（子供
の場合）から同意書を得た。

乳幼児の経口ワクチン接種の研究は二つの臨床群で同時
に行われた；（１）日本の小児科医の個人的患者が、日
本国石用県の金沢医科大学Ｄｒ。

トール・フルカワの指導の下でワクチン接種を受けた。

（２）フィラデルフィア小児病院の外来一般病院の患者
。使用ワクチンは実施例１のワクチンで、以前に成人に
与えた同じロフトのものであった。

親にワクチン法を説明し、親の同意書を得て、乳児又は
幼児が臨床的に健康であることを確認した後、次のプロ
トコールを行った。子供を指を突き刺すか、静脈穿刺に
より出血させた。直腸スワップ又は糞便を得る。そして
２０％チェリー芳香シロップ１．５ｍｌと混ぜた１、０
＋１のワクチンを子供に与えた。子供の健康を接種後７
日間毎日の電話連絡によりモニターした。免疫後の血液
試料及び糞便試料をワクチン投与後２８日日にとった。

（日本の子供全員から糞便試料を得ることはできなかっ
た。） 実施例１のＷＣ３ワクチンを先ず、６オの子供に１０３
ｐｆｕ、ｊｉ与えた。次に９ケ月、５ケ月の２人の乳児
に１０５ｐｆｕ量を与えた。病気になった者も、糞便中
に排出した者も１人もいなかった。そこでＷＣ３ワクチ
ン１０マｐｆｕの完全投与試験を開始した。１０’ｐｆ
ｕを与えた最初の子供は０才及び６オで、彼等は臨床的
に健康を保った。続いてＷＣ３ワクチン完全量を残る２
７人の６ケ月から６オまでの子供に与えた。

病気の臨床的徴候を示した者はなく、検出可能レベルの
ウィルスを糞便に排泄した者もいなかった。これらのデ
ータを完成したワクチン被接種幼児の血清中和（ＳＮ）
試験の結果を５．６表に示す。出願人及びその他の人々
（Ｖｅｓｔｋａｒｉｅｔ　ａｌ、＋　Ｌａｎｃｅｔ、　
１９８３＋　ｉｉ＋　ｐ８０４）は先夜する血清型−特
異的ＳＮ抗体が活性免疫反応に阻害効果を有する可能性
を認めたので、出願人はワクチン接種を受けた人々がＷ
Ｃ３０−タウィルスに対する免疫前−血清ＳＮ抗体をも
っていたかどうかに基づいてデータを分けた。

Ｗ　Ｃｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ乳幼児のＷＣ３ワクチ
ン経口免疫の結果を５表に示す。ＳＮ値は、試験血清の
５倍逓減希釈による５０％プラーク減少に基づいて決め
られた。この試験ではＳＮ値の３倍の上昇が真実である
と考えられた。このクリテリアを用いて１６人のワクチ
ン被接種者中１４人が１又はそれ以上のロータウィルス
血清型に対してＳＮ反応を示した。２才以下の７人の乳
児全員が同種（及びその他の）ロータウィルスに対する
ＳＮ反応の強い（〉５倍）増加を示した。２才及び３５
ケ月、夫々１人づつのワクチン被接種者はＳＮ反応を示
さなかった。しかし６オの２人は強いＳＮ反応を示した
。

５ＡＩＩ（血清型３）に対する異種ＳＮ反応は、以前に
５ＡＩＩウイルスに５ｅｒｏｐｏｓｆｔｉｖｅであった
３人を含む、２才以下の７人全員におきた。ＷＣ３ウィ
ルスに対する滴定値が〉５倍増加した年長のワクチン被
接種者は５ＡＩＬウイルスに対するＳＮ抗体増加も示し
た。１０人のワクチン被接種者に、Ｗａ（血清型１）ロ
ータウィルスに対するＳＮ値の増加がおきた；しがしこ
れらの反応者の中、以前に血清型Ｑロータウィルスに対
するＳＮ抗体がｓｅｒｏｎｅｇａｔｔｖｅであったのは
２人だけであった。２人の１才ワクチン被接種者には、
血清型２（株３２）ロータウィルスに対する抗体上昇の
発生が確認された。

ＷＣウィルスに対するＳＮ抗体が以前はｓｅｒ。

ｐｏｓｉｔｉｖｅであった５人の子供の、実施例１のＷ
Ｃ３ワクチンを経口投与した時の反応を６表に示す。た
った１人の１０才の子供は反応しなかった。４才又はそ
れ以下の４人の子供の中２人は、ＷＣ３ウィルス及び５
ＡＩＩウイルスに対するＳＮ抗体の増加を示した。これ
らの中の１人とその他の１人の子供はＷａロータウィル
スに対するＳＮ抗体の増加を示した。

乳幼児で行った研究の総括 現在までの研究は、本発明のＷＣ３ワクチンが、免疫ウ
シウィルス及び異種ヒトロータウィルス血清型の両方に
特異的なＳＮ抗体反応をひきおこすことができる有効な
免疫原であることを示している。先夜する特異的ＳＮ抗
体プロフイル及びワクチン被接種者の年齢両方共免疫効
果に影響するようにみえる。２才より小さい９人の乳児
の中８人が強いＳＮ抗体反応を示した。

この中には前にＷＣ３ウィルスに対してｓｅｒｏｎｅｇ
ａ−ｔｉｖｅであった７人の乳児全員が含まれる。全体
として、ワクチン接種を受け、ＷＣ３に対してｓｅｒｏ
ｎａｇａｔｔｖｅであった１６人の乳児中１４人にＳＮ
抗体反応が発生した。ＷＣ３ワクチンは、以前に５ＡＩ
Ｉに対するＳＮ抗体をもっていた、またはもっていない
ワクチン被接種者に、５Ａ１１（血清型３）に対するＳ
Ｎ抗体反応を効率的にひきおこした。ＷＣ３ワクチンは
、前にＷａ株ロータウィルスに対する抗体をもっていた
ワクチン被接種者に最も効率的に、Ｗａ（血清型１）に
対する抗体反応をひきおこした。

１泉 （４１及び４２頁参照） ｌｋＷＣ３−ウィスター研究所でのウシ・ロータウィル
ス分離物 ＮＣＤＶ−ウシ・ロータウィルス／ネブラスカ子ウシ下
痢ウィルス Ｗａ−ヒトロータウィルス−血清型１ ＳＡＩＩ−サルロータウィルス−血清型３Ｓ２−ヒトロ
ータウィルス−血清型２ ＊＊　　−ＰＡ−ワクチン被接種者はフィラデルフィア
、ＰＡで接種 ＪＡ−ワクチン被接種者は日本で接種 ＊＊　　−ＲＩＰ−ロータウィルス蛋白質のラジオ免疫
沈澱 １東 （４３頁参照） ＊　５表の説明参照 本発明のワクチンは、ウシＮＣＤＶロータウィルスワク
チンを接種した乳児の公表された考察（Ｖｅｓｉｋａｒ
ｉ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｌａｎｃｅｔ　０ｃｔｏｂ
ｅｒ　８１９８３．８０７−８１１頁＋　Ｌａｎｃｅｔ
　Ｍａｙ　５、１９８４．９７７−９８０頁）に比較し
、特に、高い血清変換パーセント−特にヒトロータウィ
ルスに関して−の点で予想外の結果をもたらす。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３種類のウシロータウィルス株、ＷＣ３；　
ＣＢＶ及びＮＣＤＶ（７）ＲＮＡ移動移動−ターン較を
示し、第２図は、ＮＣＤＶ及びＣＢＶ株と比較したＷＣ
３株のプラーク形を示す。 ３表 ＊ ＊　単位：　２表の脚注参照 ４表 血清　　　　　　　唾液　　　　　　　糞便５表 ＷＣ３０−タウィルスワクチンを接種したＷＣ３＊＊ホ ５表のつづき ６表 ＷＣ３０−タウィルスワクチンを接種したＷＣ３に関し
て５ｅｒｏｐｏｓｉｔｔｖｅ　　であった子供の反応血
清抗体反応 傘３７頁参照 手続補正書（自発） １．事件の表示　　　特願昭　６１−２９９３６３、補
正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人 ５、補正の対象　　　図面（第１〜２図）手続補正書く
方式） ％式％ １、事件の表示　　　　特願昭　６１−２９９３６名称
　　ザ・ウィスター・インスティチェート・オプ・アナ
トミー・アンド・バイオロジー４、代理人 ５、補正の対象　　明細書　及び　図面７、添付書類

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウシ及びヒトロータウィルスに対する生きたロータ
   ウィルスワクチンを製造する方法であって、霊長類動物
   赤血球を凝集せず、抗血清で中和した時異種ウシ及び霊
   長類ロータウィルスに比べて最低約２０倍高いタイター
   （滴定値）を与え、ＰＡＧＥにより測定した時第１図の
   レーンＷＣ３に示されるようなＲＮＡゲノム分節の移動
   パターンをもつ生きたウシロータウィルスの一菌株を霊
   長類動物腎組織培養に連続継代接種する段階を含み、継
   代接種の回数は、ワクチンがヒトに与えられた時病気を
   誘発することなく免疫原性をもつようになる回数である
   方法。 ２、前記ウシロータウィルスが約５回〜約２５回連続的
   に継代接種される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記ウシロータウィルスが約１０回〜約２０回連続
   的に継代接種される、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ４、前記組織培養がサル腎細胞から成る、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５、前記サル腎細胞が、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＣＣＩ　８
   １）、ＭＡ−１０４、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ　７０
   ）及びＢＳＣ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）から成る
   群から選ばれる細胞系及び、前記細胞系の中の異なる細
   胞系と、異なる継代接種に用いられる異なる細胞系との
   組合せである、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記細胞系がＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　８１）
   と指定される、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記サル腎細胞がアフリカミドリザル、赤毛猿又は
   カニクイザルからの第一次、第二次又は第三次細胞であ
   る、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ８、前記のロータウィルス株がＷＣ３と名づけられる分
   離物（ＡＴＣＣＶＲ　２１　０１）から成る特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ９、前記ウシロータウィルスが１回は霊長類尾長猴属腎
   細胞で、３回は細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７
   ０）の細胞で連続継代接種され、その後細胞系ＭＡ−１
   ０４の細胞で２回連続プラーク精製にかけられ、それか
   ら６回細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）の細
   胞で連続継代接種される、特許請求の範囲第８項記載の
   方法。 １０、ウシ及びヒトロータウィルスに対する生ロータウ
   ィルスワクチンであって、霊長類動物赤血球を凝集せず
   、抗血清で中和した時異種ウシ−または霊長類ロータウ
   ィルスに比較して最低約２０倍高いタイターを与え、Ｐ
   ＡＧＥにより測定した時、ほぼ第１図のレーンＷＣ３に
   示されるＲＮＡゲノム分節移動パターンをもつ生きたウ
   シロータウィルスの一菌株から成り、前記ウシロータウ
   ィルス菌株はヒトに投与されたワクチンが病気を誘発す
   ることなく免疫原性であるために充分な回数だけ霊長類
   動物腎組織培養に連続継代接種される、生ロータウィル
   スワクチン。 １１、前記ウシロータウィルスが約５〜約２５回連続継
   代接種される、特許請求の範囲第１０項記載のワクチン
   。 １２、前記ウシロータウィルスが約１０〜約２０回連続
   継代接種される、特許請求の範囲第１０項記載のワクチ
   ン。 １３、前記組織培養がサル腎細胞から成る、特許請求の
   範囲第１０項記載のワクチン。 １４、前記サル腎細胞がＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　
   ８１）ＭＡ１０４、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０
   ）及びＢＳＣ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）から成る
   群から選ばれた細胞系及び前記細胞系の中の異なる細胞
   系と異なる継代接種において用いられる異なる細胞系と
   の組合せから成る、特許請求の範囲第１３項記載のワク
   チン。 １５、前記細胞系がＶＥＲＯと指定される、特許請求の
   範囲第１４項記載のワクチン。 １６、前記サル腎細胞がアフリカミドリザル、赤毛猿、
   またはカニクイザルからの第一次、第二次または第三次
   細胞である、特許請求の範囲第１３項記載のワクチン。 １７、前記ロータウィルス菌株がＷＣ３と名づけられた
   分離物（ＡＴＣＣＶＲ−２１０１）を含む、特許請求の
   範囲第１０項記載のワクチン。 １８、前記ワクチンが水酸化アルミニウム及び水酸化マ
   グネシウムを含む、特許請求の範囲第１０項のワクチン
   。 １９、前記ウシロータウィルスが１回は霊長類尾長猴属
   腎細胞で、３回は細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　
   ７０）の細胞で連続継代培養され、その後細胞系ＭＡ−
   １０４の細胞で２回連続プラーク精製にかけられ、それ
   から細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）の細胞
   で６回連続継代接種される、特許請求の範囲第１７項記
   載のワクチン。 ２０、ヒトおよびウシロータウィルス感染に対して人間
   にワクチン接種をする方法であって、特許請求の範囲第
   １０項記載のワクチンを最低、約１０＾５〜約１０＾６
   ｐｆｕから成る１回量を人間に経口的にまたは経鼻的に
   投与することから成る方法。 ２１、用量が約１０＾７ｐｆｕから成る、特許請求の範
   囲第２０項記載の方法。 ２２、特許請求の範囲第１２項のワクチンを用いる、特
   許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、第１回投与後約３〜６週間経った時に、前記ワク
   チンを追加的に最低１回経口または経鼻的に投与する、
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４、前記用量が経口的に投与される、特許請求の範囲
   第２１項記載の方法。 ２５、特許請求の範囲第１９項のワクチンを用いる、特
   許請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６、前記ワクチンが水酸化アルミニウム及びマグネシ
   ウムの水性懸濁液と組合せて経口的に投与される、特許
   請求の範囲第２０項記載の方法。 ２７、前記懸濁液が１ｍｌにつき約４０ｍｇの水酸化マ
   グネシウムと約４５ｍｇの水酸化アルミニウムを含み、
   体重１ｋｇにつき約１ｍｌ与えられる、特許請求の範囲
   第２６項記載の方法。