JP2007320963A - ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス(prrsv)のヨーロッパワクチン株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、マクロファージに対し非感染性である独特の特徴を持ったブタ生殖および呼吸症候群(PRRS)ウィルスのヨーロッパ株である。
【選択図】なし
Description
1. I−1140 MA 104細胞にて第88継代
2. I−1140 ベロ細胞にて第61継代
3. I−1387 MA 104細胞にて第20継代
2. I−1387 ベロ細胞にて第49継代。
ベロ細胞に対するPRRSV分離物I−1140の適応:
1991年にオランダ国で分離された病原性PRRSV株I−1140[上記した通りであって、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にこの番号にて寄託]を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養し、次いで次のようにMA 104細胞にて増殖させた。
CV1細胞を標準細胞増殖条件下で増殖させた。
分離物I−1387を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養した。次いでI−1387の第5継代を上記方法によりMA 104細胞に載せた。
この試験において、表1に挙げた4種のウィルス株(上記)を次のようにマクロファージ感染性につき検査した:
次のようにブタ肺胞マクロファージを得た:SPFブタを殺し、その肺を剔出して3000mLのPBSで洗浄した。細胞を遠心分離により集め、MEM−培地(ギブコ)+10%FCSに0.3×106細胞/mLの濃度まで再懸濁させた。最後に細胞を225μL細胞懸濁物/ウェルにて96ウェル微小培養プレートにシーディングすると共にプレートをCO2培養器にて4日間貯蔵した。
これら細胞に対するウィルスの適応が毒力の積極的弱毒化を誘発したかどうかを試験するため、全てのウィルス株を次の方法により妊娠雌ブタにて試験した:PRRSウィルスおよびPRRSV特異性抗体に対し陰性である雌ブタに上記PRRSV株の1種を妊娠の約90日にて感染させた。上記株の毒力を測定するため、流産した小ブタおよび1週間以内に死亡した小ブタの頭数を測定した。次の結果が得られた:
(I)5〜6週令の小ブタにおける株DVの安全性、単一投与および高投与
3種の実験は標的動物(すなわち若い小ブタ)のワクチン接種を含んだ。これら実験の設定を表3に要約する。
これら実験において、ワクチン接種の後にはワクチン接種に起因する臨床的徴候は認められなかった。
本発明によるウィルス株は標的動物、すなわち若い小ブタに対し完全に安全である。
妊娠雌ブタを安全性試験のための最も敏感な動物と見なす。何故なら、妊娠の約90日にてPRRSウィルスでの感染が高比率の流産およびミイラ化(30〜100%)並びに生存出産小ブタの出産第1週後における高比率の死亡をもたらすからである。
−各雌ブタにおける局部的および全身的反応
−ワクチンの「取入れ」を示す出産時の雌ブタにおける抗体レベル
−雌ブタの生殖性能
−出産日に採取した小ブタの血清試料からのウィルス再分離物。
免疫蛍光分析で測定した抗体レベルは全ての雌ブタにて>8(log2)であり、これはウィルスが採取されたことを示す。ワクチン接種の後、5日間にわたり温度を監視すると共に14日間にわたり臨床観察を行って全身的反応が観察されなかった。筋肉内ワクチン接種後の7日における1頭のブタでのみ僅かな局部的反応が観察された。皮膚内投与の1週間後に局部的皮膚反応が見られた:赤色化、発熱、触診しうる斑点、および幾つかの病巣。これら局部的皮膚反応は急速に消失し、もはや第2週目には見られなかった。
この実験にて流産を誘発する妊娠の最適時点における極めて高い投与量にて投与したが、PRRSウィルス感染の臨床徴候は観察されなかった。
2回のワクチン接種−チャレンジ実験にて、本発明によるPRRSウィルスでワクチン接種した保護特性につき検査した。両実験にて10頭のPRRS抗体フリーの小ブタの群に5〜6週令にて103.5〜106.9TCID50の範囲で変化するタイターにてワクチン株DV PRRSウィルスをワクチン接種した(表2参照:群131および135)。これら実験において、安全性および伝染性の面も検査した。ワクチン接種の4週間後、これら小ブタには鼻腔内にて105TCID50の異質野性型PRRSウィルスを接種した。ワクチン接種およびウィルス接種の後、血清学的反応をワクチン接種動物にて監視すると共に、ワクチン接種動物と直接接触させたセンチネル動物および同じ建物内であるが物理的に分離した場所(異なるブタ小屋)に入れた対照についても監視した。
血清学的反応
ワクチン接種およびチャレンジの後にlog2単位にてIFAで測定した抗体タイターをワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表5に示す。
血清に見られた平均PRRSVタイター(log10)(各群につき平均)をワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表6に示す。
明瞭な抗体反応がワクチン接種の2週間後に既に検出でき、これは高タイターである。
Claims (13)
- マクロファージに対し感染性でないことを特徴とするヨーロッパ血清型の生弱毒化ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス(PRRSV)。
- コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(フランス国、パリ)にNo.I−1401として寄託したハイブリドーマA27により産生されたモノクローナル抗体A27に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール(フランス国、パリ)にNo.I−1402として寄託したハイブリドーマA35により産生されたモノクローナル抗体A35に対しては反応性でないことを特徴とする請求項1に記載の生弱毒化PRRSV。
- インスチチュート・パッスールに受託番号I−1758として寄託された株であることを特徴とする請求項2に記載の生弱毒化PRRSV。
- ヨーロッパ血清型のMA 104増殖PRRSVを非−MA104哺乳動物細胞に適応させることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の生弱毒化PRRSVの製造方法。
- 非−MA 104霊長類細胞を非−MA 104哺乳動物細胞として使用することを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ベロ細胞を非−MA 104霊長類細胞として使用することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の生弱毒化PRRSVと医薬上許容しうるキャリヤとからなることを特徴とするPRRSV感染に対しブタを保護するためのワクチン。
- 1種もしくはそれ以上の非−PRRSV弱毒化もしくは失活病原体またはその抗原物質をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載のワクチン。
- 非−PRRSV病原体がシュードラビエスウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エッシェリチア・コリ、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエから選択されることを特徴とする請求項8に記載のワクチン。
- 皮膚内もしくは筋肉内の投与に適するキャリヤを含むことを特徴とする請求項7〜9のいずれか一項に記載のワクチン。
- 凍結乾燥型であることを特徴とする請求項7〜10のいずれか一項に記載のワクチン。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の生弱毒化PRRSVを医薬上許容しうるキャリヤと混合することを特徴とするPRRSVに対処するための生弱毒化ワクチンの製造方法。
- インスチチュート・パッスールに受託番号I−1758として寄託された生弱毒化PRRSVを混合のため使用することを特徴とする請求項12に記載の方法。
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