DE69206631T2 - Impfstoff gegen das Fortpflanzungs- und Atmungssyndrom bei Schweinen (PRRS) und Diagnose. - Google Patents
Impfstoff gegen das Fortpflanzungs- und Atmungssyndrom bei Schweinen (PRRS) und Diagnose.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung umfasst einen Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen das porcine reproduktive Respirationssyndrom (PRRS), eine biologische Zusammensetzung aus Viren eines neuen Virustyps, ein Verfahren zur Herstellung von viralem Antigen des neuen Virustyps, ein Nachweisverfahren für Antikörper gegen das PRRS-Virus, sowie eine diagnostische Testgarnitur zur Anwendung in diesem Verfahren.
- Seit Ende 1990 befällt eine neue Schweinekrankheit über 5000 nordeuropäischen Schweinemästereien. Diese Krankheit wird jetzt porcines reproduktives Respirationssyndrom (PRRS) genannt. In Deutschland erstmals im Dezember 1990 erkannt, wurde das Problem anfangs 1991 zunehmend kritisch. Im Januar und Februar des Jahres 1991 breitete sich die Krankheit in Holland und Belgien aus. Auch aus Spanien wurde der Ausbruch der Krankheit gemeldet.
- Man nimmt an, dass die Krankheit, ökonomisch gesehen, sehr kostspielig werden könnte, vergleichbar mit oder noch schlimmer als die Aujeszky Krankheit.
- Die hervorstechendsten klinischen Merkmale bei Schweinen sind Anorexie und bei Schwangerschaft ein später Abort bis zum 110-ten Tag. Bei Ferkeln sind neben einer hohen Anzahl totgeborener schwacher Ferkel, Atemprobleme zu beobachten. Bei Masttieren treten chronische Lungenentzündung und erhöhte Sterblichkeit auf.
- Für die Entwicklung eines Impfstoffs zum Schutz von Schweinen gegen PRRS, oder eines diagnostischen Verfahrens zur Bestimmung einer Infektion, muss das verursachende Agens der Krankheit identifiziert werden.
- Bis jetzt waren jedoch nur wenige Eigenschaften des verursachenden Agens beschrieben, wie seine virale Natur, die Eigenschaft zur Haemagglutination, die geringe Dichte und die in vitro Wachstumseigenschaften (Wensvoort, G. et al., Vet. Quaterly 13, 121-130, 1991> .
- Die internationalen Patentanmeldungen WO 92/ 21375, WO 93/06211, WO 93/03760 und die europäische Patentanmeldung EP 0529584 (Boehringer Ingelheim Animal Health Inc.) sind widersprüchliche Anwendungen, die als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung unter Artikel 54 (3) und (4) EPC zur Verfügung stehen.
- WO 92/21375 (Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut) offenbart die Identifizierung des verursachenden Agens der mysteriösen Schweinekrankheit (MSD), das sogenannte Lelystad Agens. Ausserdem wird die Verwendung des Agens zur Herstellung von Impfstoffen und diagnostischen Tests vorgeschlagen. Sowohl WO 93/03760 (Collins et al.) als auch EP 0529584 offenbaren die Isolierung eines Isolates aus den USA, das sogenannte Isolat ATCC 2332 und identifizieren dieses als das verursachende Agens der MSD in den Vereinigten Staaten. Die Herstellung eines abgeschwächten MSD-Impfstoffes durch Passagieren des Isolates in einer Zellkultur wird dort ebenfalls beschrieben. WO 93/06211 (Collins et al.) beschreibt die Isolation von infektiösem Gewebehomogenat aus einen erkrankten Tier. Die Identifikation des im Homogenat befindlichen verursachenden Agens konnte jedoch nicht vorgenommen werden.
- Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung hinreichend und eindeutig identifizierbare Eigenschaften des neuen verusachenden Agens von PRRS zu liefern, welche für die Herstellung eines Impfstoffes und eines diagnostischen Tests für das verursachende Agens notwendig sind.
- Wir haben nun einen neuen Virustyp, genannt PRRS-Virus, identifiziert, der für diese Krankheit verantwortlich ist, der neue Virustyp ist durch den unter der Hinterlegungsnummer NR. I-1140 in der CNCM hinterlegten Virus, gekennzeichnet.
- Der Virus des neuen Typs kann aus Lungengewebe klinischer Fälle von PRRS isoliert werden. Ein 24-Stunden alter Monolayer aus alveolären Makrophagen wurde mit einem 50 %igen Homogenat auf Lungengewebe in mit Fhosphat gepufferter Salzlösung (PBS) inkubiert. Die Makrophagen-Zellkultur wurde aus Lungenspülungen von SPF-Ferkeln mit PBS, etabliert. Die Makrophagen wurden gewaschen und in RPM 1640 Medium, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika 24 Stunden in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; inkubiert.
- Ein kleines Volumen des Homogenates wurde zu den Makrophagen gegeben und nach einer Stunde bei 37ºC neues Medium zugegeben und die infizierten Makrophagen wurden weiterhin bei 37ºC in einer CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Totaler cytophatiscber Effekt (CPE) trat nach zwei bis drei Tagen Inkubation auf.
- Der Virus kann auch aus anderen Quellen wie Herz, Tousillen, Hirn und Leber infizierter Schweine isoliert werden.
- Die für die Isolation des neuen PRRS-Virus gewählten Gewebehomogenate klinischer Fälle von PRRS, zeigten keine zuverlässigen Zeichen anderer, bei Schweinen üblicherweise auftretender Viren, vor allem nicht Pseudorabies Virus (PRV), Porcines Parvovirus (PPV), Paramyxovirus, Schweinecholeravirus (HCV) und transmissibler Gastroenteritisvirus.
- Weitere charakteristische Eigenschaften des neuen PRRS-Virus werden im Folgenden aufgezeichnet:
- - Virus Hinterlegung
- Der neue PRRS-Virus mit der internen Bezeichnung "Isolat Nr. 10", auf spezifische Weise isoliert wie oben beschrieben, wurde am 6. September 1991 in der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Zugangsnummmer I-1140 hinterlegt.
- - Wachstumseigenschaften
- Der neue Virustyp wächst auf Makrophagen, wächst jedoch nicht messbar in den etablierten Zelllinien BHK21, Vero, SK-6 (Schweineniere), PK15 (porcine Niere), ST (Schweinetestis), L929 und BEL (bovine Embryolunge).
- - Serologischer Ausschluss bekannter Agentien
- Unter Anwendung anerkannter Verfahren wurde die Möglichkeit ausgeschlossen, dass eines der folgenden, das verursachende Agens von PRRS sein könnte. Test-Verfahren Agens Pseudorabies Virus Porcines Parvovirus Porcines Paramyxovirus Porcine Circovirus Chlamydia Elisa
- N.D.= nicht bestimmt;
- a = Virusneutralisationstest (VN) nach Virologische Arbeitsmethoden Vol. Hsg.: A. Mayr et al., Fisher Verlag Jena, 1977, p. 457-535;
- b = gI Elisa-Test nach Handbuch zum Intertest Aujeszky gI Elisa test kit;
- c = Haemagglutinationsinhibitionstest (HI) nach Virology, a practical approach, HSG.: B.W.J. Mahy, IRL Press Oxford, 1985, p. 245-248;
- d = Immunofluoreszenztest; Virologische Praxis, Hsg.: Starke, Fischer Verlag Jena, 1968, Seite 227-241.
- - Serologische Korrelation zwischen dem infektiösen Agens und PRRS
- In einem Immunfluoreszenztest (IFT) wurden Feldserumproben mit infizierten Makrophagen klinischer Fälle getestet.
- Weitere Serumproben wurden von experimentell mit dem neuen Virus infizierten Schweinen getestet.
- Mikrotiterplatten mit alveolären Makrophagen (4.10&sup4; Zellen pro Loch) wurden mit Isolat Nr.10 infiziert und 24 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt traten erste Zeichen von CPE auf. Die Zellen wurden mit eiskaltem, 96% Ethanol gewaschen (30 Min.). Eine Verdünnungsreihe der Serumproben, beginnend bei 1/10 wurden auf den fixierten, infizierten Makrophagen während einer Stunde bei 37ºC inkübiert. Die zweite Inkubation wurde mit Hasen-anti-Schwein IgG konjugiertem FITC (Nordic, Breda) durchgeführt (1/40 verd., 30 Min., 37ºC). Mit einem Leitz Phasenumkehr-Immunofluoreszenz-Mikroskop wurde die spezifische Fluoreszenz bestiinmt. Spezifische Fluoreszenz ist gekennzeichnet durch sichelförmige perinukleare Fluoreszenz.
- Die folgende Tabelle zeigt einen Vergleich einer Testreihe von Seren. Serum Experimentelle Infektion Präserum Experimentelle Infektion ein Monat nach Infektion Feldserum
- - Kreuzreaktion zwischen PRRS-Isolaten
- Obwohl der PRRS-Virus bezüglich seiner Antigenität nicht mit anderen bekannten Schweineviren verwandt ist, konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Isolate des PRRS-Virus im IF-Test immunologisch kreuzreagieren und daher bezüglich ihrer Antigene ähnlich sind.
- Die folgende Tabelle zeigt, dass PRRS-positives Serum mit verschiedenen PRRS-Isolaten im IFT reagiert.
- Wie im IFT gezeigt wird, können in der vorliegenden Erfindung, aufgrund ihrer grossen antigenischen Ähnlichkeit, beliebige PRRS-Virusisolate eingesetzt werden. Isolat IFT pos. Serum Intervet Geld B. 2 Geld B. 3
- - Weitere Eigenschaften
- Der PRRS-Virus besitzt eine Hülle (empfindlich auf Chloroform- und Ätherbehandlung) mit kleinen Knoten auf der Oberfläche und ist den Laktat-Dehydrogenase-Viren und dem Pferde-Arteritis Virus ähnlich. Der Viruspartikel ist etwa 65 nm lang und hat eine geringe Dichte von 1.1 g/cm³.
- In den, mit Virus infizierten Makrophagen-Zellkulturen, können mindestens zwei virusspezifische Proteine von 14000 Da und 21000 Da nachgewiesen werden.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde ein Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen PRRS hergestellt, der ein virales Antigen umfasst das von Viren eines neuen Virustyps abstammt, welche durch den, unter Hinterlegungsnummer I-1140 in der CNCM abgelegten Virus, gekennzeichnet sind.
- Aus dem oben gezeigten wird klar, dass der vorliegende Impfstoff sowohl aus Isolat Nr. 10, hinterlegt in der CNCM unter Nr. I-1140, als auch aus jedem anderen zur Verfügung stehenden oder isolierbaren immunologisch verwandten PRRS- Virusisolat, hergestellt werden kann.
- Vorzugsweise wird der Impfstoff aus viralem Antigen hergestellt, das mindestens teilweise seine pathogenen Eigenschaften verloren hat ohne seine antigenen Eigenschaften zu verlieren, d.h., die Fähigkeit das Immunsystem der Schweine zu stimulieren bleibt erhalten. Dies kann durch Abschwächung oder Inaktivierung des Virus erreicht werden, wobei im letzteren Fall der Virus auch seine Fähigkeit zur Vermehrung verliert.
- Im Besonderen liefert die vorliegende Erfindung einen inaktivierten Impfstoff welcher eines oder mehrere Isolate des neuen Virus in inaktivierter Form umfasst.
- Vorzugsweise umfasst der inaktivierte Imfpstoff gemäss der Erfindung eine Menge an PRRS-Viren, die einem Äquivalent des prä-inaktivierten Virus-Titers grösser als ungefähr 106.5 TCID&sub5;&sub0;/ml (Dosis) entspricht, besser aber grösser als 107.5 TCID&sub5;&sub0;/ml (Dosis) ist, wie mit den in A. Mayr et al., Hsg., Virologische Arbeitsmethoden Vol. 1, Fischer Verlag Jena, 1974, S. 36-39 beschriebenen Verfahren gemessen wurde.
- Inaktivierte PRRS-Lösungen können mit den üblichen Techniken konzentriert werden. Es können Amicon-Zellen, Präzipitationsmethoden wie Aznmoniumchlorid oder Polyethylenglykol, Konzentrationen mit Carbowax oder mittels Ultrazentrifugation, oder Adjuvanskonzentrationsmittel wie Aluminiumphosphat angewendet werden.
- Das Ziel der Inaktivierung der PRRS-Viren ist das Ausschalten der Reproduktion der Viren. Im allgemeinen kann dies durch chemische oder physikalische Mittel erreicht werden. Chemische Inaktivierung kann beispielsweise durch Behandlung der Viren mit Formaldehyd, β-Propiolakton, Ethylenimin oder einem Derivat derselben oder organischen Lösungsmitteln (wie Tween , Triton-X , Natriumdeoxycholat, Sulphobetain oder Octyltrimethyl-Ammoniumsalzen) erreicht werden. Wenn nötig wird die Inaktivierungssubstanz danach neutralisiert, mit Formaldehyd inaktiviertes Material kann beispielsweise mit Metabisulphit neutralisiert werden. Physikalische Inaktivierung wird vorzugsweise durch Aussetzen der Viren energiereicher Strahlung, wie UV-Licht, Röntgenstrahlen oder γ-Strahlung ausgeführt. Wenn gewünscht, kann der pH nach der Behandlung auf einen Wert von etwa 7 zurückgebracht werden
- Gewöhnlich werden ein Adjuvans und, wenn gewunscht, ein oder mehrere Emulgatoren wie Tween und Spann ebenfalls zum inaktivierten Impfstoff gegeben. Geeignete Adjuvantien sind beispielsweise, Vitamin E-Acetat, Öl/Wasser- Emulsionen, Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, (Mineral) Öl-Emulsionen wie Bayol und Markol 52 , und Saponine.
- Für die Produktion des abgeschwächten Virus-Impfstoffs stehen gemäss der Erfindung zahlreiche im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Verfügung, zum Beispiel Adaption eines spezifischen Virus-Isolates an das Wachstum in embryonierten Eiern, oder an eine Kultur aufnahmefähiger Schweinegewebszellen oder andere suszebtible Gewebezellen und Abschwächung zum Beispiel durch 10 bis 200 Passagen in Eiern oder Kulturen, wonach der Virus vermehrt wird und durch Sammeln des Eimaterials oder Gewebekulturüberstände und/oder - Zellen geerntet wird.
- Verfahren wie zum Beispiel Ultraschallbehandlung fördern die Ablösung der infektiösen Partikel vom Wachstums- Substrat und erhöhen damit die Virusausbeute während der Ernte. Es ist von Vorteil den lebenden Viren einen Stabilisator bei zugeben, insbesondere wenn eine trockene Präparation lyophilisiert wird. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA ( Bovarnik et al. J. Bacteriology 59, 509, 1950), Kohlenhydrate (wie Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glukose), Proteine (wie Albumin oder Casein) oder deren Abbauprodukte und Puffer (wie Phosphate von Alkalimetallen). Wenn gewünscht können auch ein, oder mehrere Substanzen mit Adjuvanseigenschaft, wie oben beschrieben, beigefügt werden.
- Für die Lebendimpfstoffe kann sich die Dosisrate zwischen 101.0 und 107.0 TCID&sub5;&sub0; pro Schwein bewegen.
- Ein Impfstoff gemäss der Erfindung, kann durch intramuskuläre oder sübcutane Injektion, beziehungsweise durch intranasale, intratracheale, orale, cutane, percutane oder intracutane Verabreichung gegeben werden.
- Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann bei Schweinen je nach Impfstatus der weiblichen Schweine in der 1., 5. oder 10. Lebenswoche, vor der Paarung und/oder 4 bis sechs Wochen vor dem Werfen (Booster-Impfung), beziehungsweise bei Ebern jedes halbe Jahr (Boosters) verabreicht werden.
- Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise Impfstoffe mit inaktivierten PRRS-Viren, können Kombinationen der PRRS-Komponente und einen oder mehrere nichtverwandte Schweinepathogene enthalten, wie zum Beispiel Actinobacillus pleuropneumonia, Pseudorabiesvirus, porcines Influenzavirus, porcines Parvovirus, transmissibles Gastro-enteritisvirus, Rotavirus, E. coli, Erysipelo rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica.
- Obwohl ein Impstoff gemäss dieser Erfindung von einem beliebigen, mit Isolat Nr.10 immunologisch verwandten PRRS- Virusisolat stammen kann, wird ein Impfstoff, der direkt von PRRS Isolat Nr. 10, mit CNCM-Hinterlegungsnummer I-1140 stammt, bevorzugt.
- Ein Verfahren zur Herstellung des als Impfstoff anwendbaren PRRS Antigens enthält folgende Schritte:
- a> das Animpfen suszebtibler Gewebezellkulturen mit PRRS- Viren
- b) Kultivieren dieser Zellen und
- c) Ernten des viralen Antigens aus der Kultur
- Vorzugsweise wird der PRRS-Virus bis zu hohen Titern gezüchtet, d.h. mindestens 106.0 TICD &sub5;&sub0;/ml.
- Für die Herstellung grosser Mengen an viralem PRRS-Antigen wird insbesondere Isolat Nr.10, CNCM Nr. I-1140 verwendet.
- Gemäss der Erfindung als Impfstoff einsetzbares, virales PRRS-Antigen, kann durch Wachstum der PRRS-Virusisolate auf Makrophagen (alveoläre, peritoneale, periphere, vom Knochenmark oder jeder anderen Stelle> hergestellt werden. Zellen mit Makrophagen-ähnlichen Eigenschaften können ebenfalls verwendet werden, nämlich Promozyten, Monozyten, vaskuläre Endothelzellen des Hirns und Mikrogliazellen. Die Makrophagen oder makrophagenähnlichen Zellen können, müssen aber nicht SPF-Ursprungs sein (z.B. von normal im Handel erhältlichen Schweinen> . Im letzteren Fall werden den Zellkulturen als Vorkehrung z.B. Antibiotika zugegeben, um unerwünschte Kontaminationen zu verhindern.
- Eine andere Möglichkeit erfolgreich Viruswachstum zu erhalten, besteht in der Etablierung einer Makrophagen- Zelllinie. Einige Möglichkeiten eine solche Zelllinie zu erhalten werden im Folgenden beschrieben.
- Für die Immortalisation der Zellen wird konditioniertes Medium der Zelllinien L(929), SK6, ST, Vero oder BHK verwendet. In diesen konditionierten Medien sind zumindest die darin vorhandenen Lymphokine, etwa der koloniestimulierende Faktor (CSF) (Stanley, E.R., Methods Enzymology 116, 564-587, 1985) von Bedeutung.
- Um Immortalisation von Makrophagen beliebigen Ursprungs chemisch zu erreichen, kann eine alkylierende Substanz mit Wirkung auf die DNA-Replikation, zum Beispiel β- Propiolacton, eingesetzt werden (Logrippo, G.A., und Harmann, F.W., J. Immunol. 75, 123-128, 1955).
- Besser definiert ist der Einsatz von transformierenden Viren zur Immortalisation. Insbesondere, jedoch nicht ausschliesslich, werden zur Immortalisation von Makrophagen anderer Spe), SV40 und Papilloma Viren beschrieben. (Robinson, D.H. et al. , Blood 77, 294-305, 1991; Righi, M. et al., Oncogene 6, 103-111, 1991; Choi, C. S. et al., Arch. Virol. 115, 227-237, 1990; Gendelmann, H.E. et al., Lab. Invert. 51, 547-555, 1984; ATCC-Katalog für erhältliche Maus- und menschliche Makrophagenlinien).
- Ein noch präziserer Weg zur Imznmortalisation ergibt sich durch Einsatz von Genen der oben erwähnten oder anderer, zur Immortalisation fähiger Viren, z.B die Gene Vmyc oder Vmfs und/oder das grosse T-Gen des SV40 können eingesetzt werden. Für die Immortalisation wäre die Konstruktion eines retroviralen Vektors wünschenswert, der den Einbau des transformierenden Gens wie das grosse T-Gen von SV40 in das Wirtsgenom ohne Replikation sowie Exkretion viraleroder virusähnlicher Partikel erlaubt. Ein Plasmid mit einem Selektionsmarker (z.B. Neo ) und dem grossen T-Gen von SV40 wäre eine weitere Möglichkeit für ein Immortalisations-Verfahren.
- Als Quelle für die Immortalisation können reife Makrophagen verwendet werden, jedoch sind auch die Zellstadien vor der Differenzierung zum reifen Makrophagen sehr nützlich, weil sie sich teilende Zellen mit Makrophageneigenschaften sind und Makrophagenmarker wie CD1, CD11 und CD14 besitzten. Mit verschiedenen Trennungsmethoden können die Vorstufen, frei von anderen kontaminierenden Lymphozyten, in reiner Form erhalten werden, zum Beispiel durch Sortieren der Zellen mit FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) und mit Fluorochrom markierten, spezifischen Antikörpern gegen die CD Marker.
- Es besteht ein wesentlicher Bedarf nach sensitiven, spezifischen Methoden zum Screening und zur Identifizierung von PRRS-Virusträgern.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich folglich auch auf einen schnellen und empfindlichen Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das PRRS-Virus.
- Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, diagnostische Testgarnituren zur Durchführung der Assayverfahren zu liefern.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das PRRS-Virus zur Verfügung gestellt, welches umfasst;
- a) Inkübieren einer Probe mit Verdacht auf anti-PRRS-Antikörper mit viralem PRRS-Antigen-Reagens, das von Viren eines neuen Virustyps stammt, der durch das Virus gekennzeichnet ist, das unter der Hinterlegungsnummer Nr.I-1140 bei der CNCM hinterlegt wurde, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben.
- b) Nachweisen des Antikörper-Antigenkomplexes.
- Für den Nachweis von PRRS-Virus-Antikörpern in biologischen Proben erweist sich das Antigen von mit PRRS infizierten Zellen, das immunologisch mit anti-PRRS-Virusantikörpern im Serum reagiert, im Immunoasssay als nützliches Reagens. Das virale Antigenreagens kann unter anderem aus ganz oder teilweise gereinigten Viruspartikeln oder viralen Polypeptiden, aufgeschlossenem Virus oder infizierten Zellen, beziehungsweise deren Zelllysat bestehen.
- Die Form des Immunassays kann variieren. Zum Beispiel können die Immunassays auf kompetitiver, direkter oder Sandwichtyp-Reaktion basieren. Zudem können Protokolle mit fester Phase oder Immunpräzipitation verwendet werden. Der Nachweis des Antikörper-Antigenkomplexes kann die Verwendung markierter Antikörper einschließen; die Marker können zum Beispiel fluoreszierend, chemielumineszierend, radioaktiv beziehungsweise Farbstoffmoleküle oder Enzymmarker sein.
- Gegenwärtige Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das PRRS-Virus schliessen den enzymgebundenen Immunabsorbtionsassay (ELISA), den Immunofluoreszenz-Test (IFT) und das Westernblot-Verfahren ein.
- Die ELISA-Technik schliesst die Reaktion einer Probe mit viralem Antigenreagens ein, das man vom PRRS-Virus erhalten hat. Vorzugsweise besteht das Antigenreagens aus Zelllysat der mit PRRS-Virus infizierten Makrophagen. Normalerweise wird das Antigenreagens an eine feste Phase gekoppelt, zum Beispiel eine Mikroplatte oder einen Plastikbehälter. Nach dem Waschen, um die nichtgebundenen Antikörper zu entfernen, wird mit Enzym markiertes Anti-Immunglobulin zu der festen Phase gegeben, inkubiert und abermals gewaschen. Enzyme die sich für das Markieren eignen sind im Stand der Technik bekannt und schliessen zum Beispiel Rettich-Peroxidase ein. Danach wird das Enzymsubstrat zu der Mischung gegeben und ein nachweis- und messbares Farbprodukt wird in Anwesenheit von PRRS-Virusantikörpern gebildet.
- Gemäss der Erfindung kann ebenfalls die IFT-Methode angewendet werden. Zum Beispiel werden mit PRRS-Virus infizierte Makrophagen 24 Stunden in Mikrotiterplatten kultiviert. Danach werden die Zellen z.B. mit Azeton, Ethanol oder durch Einfrieren/Auftauen in Verbindung mit Formaldehydbehandlung fixiert. Die Probe wird zu den fixierten Zellen gegeben, und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Anti-Immunglobulin konjugiert mit einer fluoreszierenden Verbindung, wie Fluoreszin, wird anschliessend auf die fixierten Zellen gegeben. Der Reaktionsansatz wird dann unter einem Mikroskop auf Fluoreszenz untersucht. Ein typisches Fluoreszenzmuster von PRRS-Virus infizierten Makrophagen, die mit positiven Serum eines PRRS-infizierten Schweines inkubiert wurden, lässt sich so veranschaulichen.
- Das gemäss der Erfindung bevorzugte diagnostische Verfahren, richtet sich auf den Nachweis der PRRS-Antikörper mit der Westernblot-Technik.
- Bei dieser Technik wird das virale Antigen elektrophoretisch auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Vorzugsweise besteht das Antigenreagens aus dem Zelllysat der, mit PRRS-Viren infizierten Makrophagen. Die erhaltenen Proteinbanden werden elektrisch transferiert, vorzugsweise auf Nitrozellulosepapier. Andere, dem Fachmann bekannte Papierarten, wie Diazopapier, sind ebenfalls geeignet. (Tsang et al., in: Methods in Enzymologie 92, Kapitel 29, 1983).
- Die Nitrozellulose-Streifen, die das aufgetrennte virale Antigen enthalten, werden mit den Proben und wenn gewünscht, zusammen mit positiven und negativen Referenzproben inkübiert. Wenn gewünscht werden als negative Referenzstreifen, z.B. elektrophoretisch aufgetrenntes Makrophagenlysat, das aus nicht mit PRRS Viren infizierten Makrophagen stammt, zusammen mit den Proben inkubiert. Die positive Referenzprobe ist typischerweise eine Probe die bekanntermassen Antikörper gegen das PRRS-Virus enthält, zum Beispiel Serum von klinischen PRRS-Fällen oder von Tieren, die experimentell mit PRRS-Virus infiziert wurden.
- Die negative Referenzprobe enthält bekantermassen keine PRRS-Virusantikörper. Der Nachweis des Antikörper-Antigenkomplexes geschieht entweder mit ELISA oder Festphasenstreifen-Radioimmunassay-Verfahren. Nach jeder Inkubation wird gewaschen.
- Vorzugsweise wird die Inkübation in Behältern durchgeführt.
- Überraschenderweise ist das Westernblot-Verfahren besonders zum den Nachweis von PRRS-virusspezifischen Polypeptiden, die aus in vitro Zellkulturen erhalten werden, geeignet, da von anderem Material, das mit PRRS Serum reagiert, zwei oder drei kleine, virusspezifische Proteine, identifizierbar sind. Wie in Figur 1 gezeigt, ist die Hauptimmunreaktionsfähigkeit oder Spezifität gegen die etwa 14'000 und 21'000 Da grosse Proteine des PRRS-Virus gerichtet (Westernblot eines auf Makrophagen kultivierten und im Glyzerol-Gradienten gereinigten PRRS-Virus).
- Die 21'000 Da Bande ist diffus und die Bezeichnung 21'000 Da dient desshalb nur als Hinweis auf die Grösse des Proteins.
- Weitere virusspezifische Proteine, die im Westernblot von den Antikörpern gegen den PRRS-Virus erkannt werden, besitzen Molekulargewichte von etwa 46'000, 49'000 und 50'000 Da.
- Bei gereinigten ³&sup5;S-Met/Cys markierten Virionen traten 14K-, 24K-, 33K- und 46K-Proteine hervor. Radioimmunfällung von ³&sup5;S-Met/Cys makierten infizierten Zelllysaten resultierte in der Darstellung von zwei virusspezifischen Proteinen von etwa 24K und 33K. Die oben genannten Proteine können ebenfalls zur Diagnose der PRRS-Infektion verwendet werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die gereinigten 14'000 und/oder 21'000 Da PRRS-Virusproteine in den ELISA und Westernblot-Verfahren als das virale Antigenreagens verwendet, um einen empfindlicheren Assay zur Verfügung zu stellen.
- Gemäss einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wird eine diagnostische Testgarnitur zur Verfügung gestellt, die "on site"- Screening von Antikörpern gegen PRRS- Viren erlaubt.
- Die Testgarnitur enthält mindestens einen Streifen mit aufgetrenntem PRRS-Virusantigen, das von einem SDS-PAGE-Gel (elektro-)transferiert wurde. Zusätzlich kann die Test-Garnitur einen negativen Kontroll-Referenzstreifen enthalten, der zum Beispiel aufgetrenntes Antigen aus einer in vitro- Zellkultur, z.B. einer nicht mit PRRS-Virus infizierten Makrophagen Zellkultur, enthält.
- Vorzugsweise werden die Streifen in individuellen Behältern aufbewahrt, um die anschliessenden Inkubationsschritte zu erleichtern. Es ist ausserdem von Vorteil die positiven und negativen Referenzproben in der Testgarnitur mitzuliefern, um die Ermittlung der Testresultate durch Vergleich mit den Resultaten der Probe zu erleichtern.
- Wenn gewünscht, werden in der Testgarnitur auch vorentwickelte, positive und negative Referenzstreifen mitgeliefert. Die vorentwickelten Streifen dienen zur Ermittlung der Testresultate durch visuellen Vergleich mit den Teststreifen nach Zustand einer Farbreaktion. Das Ablesen der Assayresultate wird durch die vorentwickelten Streifen erleichtert und der Bedarf nach einem erfahrenen Laboranten zur Ermittlung der Resultate fällt weg.
- In der Test-Garnitur Kit können auch die Fläschchen von mit Enzym konjugiertem Antiserumreagens, vorzugsweise Rettich-Peroxidase konjugierte Immunglobuline, Substratoder Farbumschlags- Indikator, Waschpuffer und Stopplösung für die Farbreaktion enthalten sein. Die bevorzugten Substrate, Reaktions-Terminierungs-Lösungen und Waschpuffer
- sind DAB, destilliertes Wasser, PBS Tween beziehungsweise PBS.
- In der bevorzugten Ausführungsform dieser Test-Garnituren sind die ungefähr 14'000 und 21'000 Da grossen Proteinbanden der PRRS-Virusteststreifen, welche die aufgetrennten PRRS viralen Antigene enthalten, einzeln identifizierbar, d.h., diese Banden erscheinen getrennt von anderen viralen oder nicht viralen Antigenen, die mit dem PRRS-Serum reagieren.
- Für die Messung von viralem PRRS-Antigen in einer Probe werden bekanntes PRRS spezifisches Antiserum oder Antikörper, die vorzugsweise auf einer festen Phase fixiert sind, als Reagens verwendet. Die Probe, die das Antigen enthält, wird hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit, die die Bildung des Antikörper-Antigenkomplexes erlaubt, wird die feste Phase gewaschen und ein zweiter markierter Antikörper für den Nachweis des Antigen-Antikörperkomplexes dazugegeben.
- Die vorliegende Erfindung ist ferner auf Testgarnituren ausgerichtet, die in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis von viralem PRRS-Antigen in einer Probe verwendet werden können.
- In Isolation gehaltene SPF-Ferkel werden betäubt und eine Lungenspülung mit warmer, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgeführt. Etwa 100 ml Makrophagensuspension wird in silikonisierten Glassflaschen gesammelt. Die Makrophagen werden mit PBS gewaschen und mit RPM 1640-Medium (Flow Labs), das mit 10% fetalem Kälberserum und Antibiotika angereichert wurde, 24 Stunden im Inkübator mit 5% CO² belassen. Die Zellen wurden in einer Dichte von 3.10&sup5;/cm2 in 25cm² Roux-Flaschen (Falcon) ausgesät.
- Schwein 266, dessen klinische PRRS-Symptome (Abort, Nahrungsverweigerung) von einem Tierarzt des regionalen Animal Health Institut diagnostiziert wurde, wurde als post mortem Beispiel genommen.
- Ein 50%-iges Lungengewebe-Homogenat in PBS wurde mit dem Ultraturrax hergestellt. Die Suspension wurde durch langsames Zentrifugieren geklärt. Ein ml des klaren Überstandes wurde auf einem 24 Stunden alten Monolayer aus alveolären Makrophagen inokuliert. Nach 1 Stunde Inkübation bei 37ºC wurde wieder Medium zugefügt und die infizierten Makrophagen wurden weiter bei 37ºC in C0&sub2;-Atmosphere inkubiert. Nach zwei Tagen zeigten sich erste Zeichen von CPE. Am dritten Tag zeigten die Makrophagen vollständige Lyse, was durch die Aufnahme von Trypanblau bestätigt wurde.
- Lebens fähige Zellen schlossen den Farbstoff Trypanblau ebenso aus, wie die nicht infizierten Kontroll-Makrophagen.
- Die Ernte dieser ersten Passage wurde bei -70ºC gelagert. Weitere Passagen dieses Isolates wurden durch Inkubation von einem ml 1:10 bis 1:100 vorverdünnter Viruslösung auf weiteren Makrophagenkulturen erhalten. Totaler CPE erscheint nach zwei bis drei Tagen Inkubation. Dieses Isolat wurde intern "Isolat Nr. 10" genannt. Eine Probe dieses Isolates wurde bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-1140 hinterlegt.
- Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung des viralen PRRS-Antigens ergibt die Möglichkeit, den Virus in vitro in einem hohen Titer zu züchten.
- Tabelle 1 zeigt die Resultate der Virusausbeute nach mehreren Passage-Durchgängen des Isolates Nr.10. Tabelle 1 Wachstumseigenschaften in Makrophagen Anzahl Passagen Titer (TCID&sub5;&sub0;/ml)
- Zwei vier Wochen alte Schweine, die mit einer Kontaktkontrolle in einer Koje gehalten wurden, wurden intranasal mit Isolat Nr.10 (105.0 TCID&sub5;&sub0;) inokuliert. Klinisch wurden ein leichter Temperaturanstieg und während vier Tagen Anorexie beobachtet. Weiter waren sie sechs Tage lang dumpf und langsam. Acht Tage post infectionem wurden die Tiere betäubt und eine Lungenwaschung durchgeführt. Durch Co-Kultivation mit SPF-Makrophagen konnte das verursachende Agens aus einem der Schweine zurückgewonnen werden.
- Darüber hinaus konnte Serokonversion sowohl bei beiden infizierten Schweinen, als auch bei der Kontaktkontrolle nachgewiesen werden.
- Die Serokonversion wurde im Immunfluoreszenzassay (IFA) bestimmt. Makrophagen-Monolayer wurden 24 Stunden nach der Infektion mit Isolat Nr. 10, mit -70ºC kaltem 95 %igem Ethanol eine Stunde fixiert und mit den Testseren eine Stunde bei 37ºC inkubiert. FITC-konjugiertes Hasen-anti- Schwein-IGG wurde zugefügt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Die Proben wurden mit einem UV-Fluoreszenzmikroskop (Leitz) abgelesen. Der Antikörper-Titer der Geimpften war vier Wochen nach der Impfung höher als 1280.
- Zehn Wochen vor dem Wurf wurden fünf Schweine in Isolation gehalten. Drei Schweine wurden intramuskulär mit inaktiviertem Isolat Nr.10 (Prä-inaktivierungstiter 107.2 TICD&sub5;&sub0;/ml) in einer Wasser-in-Öl-Emulsion (1 ml) als Adjuvans (Freund'sches unvollständiges) in den Hals geimpft und vier Wochen später geboostert. Am Tage 80 der Schwangerschaft, etwa drei Wochen vor der Geburt, wurde mit den Geimpften und den Kontrollen intranasal mit Isolat Nr.10 eine Challenge-Infektion (105.0 TICD&sub5;&sub0;/ml) durchgeführt.
- Die serologische Reaktion der Schweine wurde aufgezeichnet.
- Der Challenge der geimpften Schweine vor dem Werfen offenbarte einen Schutz. Die geimpften Schweine hatten wesentlich mehr gesunde Ferkel als die Kontrollen (Tabelle 2). Die Tabelle zeigt die Wirkung des Challenge auf die Nachkommen von geimpften- und Kontrollschweinen zur Zeit der Geburt und auf die lebend Geborenen während der ersten Wochen nach der Geburt. Tabelle 2 Behandlung Geborene Ferkela Mumien Tote Neugeborene Ferkela Schwache Gesunde Geeimpfte Kontrollen aDurchschnittliche Anzahl Ferkel pro Schwein
- Überstände infizierter und auch nicht infizierter Makrophagenkulturen wurden bei 3000 g geklärt. Die Überstände wurden in einem SW 28.1-Rotor bei 25'000 UpM drei Stunden zentrifugiert. Die Pellets wurden für die Gel-Elektrophorese in TEN Puffer resuspendiert.
- Das Material wurde mittels Elektrophorese in einem 10% Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Gele wurden in Renaturierungs-Puffer (4 M Harnstoff, 50 mM NaCl, 10 mM Tris- Salzsäure , 0.1 mM Dithiothreitol, pH 7) während 30 Minuten aequilibriert und dann in Elektrophoresepuffer ohne SDS weitere 30 Minuten inkubiert. Der elektrophoretische Transfer auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Dassei, BRD) wurde in Mini-Trans-Blot-Elektrophorese-Transferzellen (Bio-Rad, München, BRD) 1 Stunde bei 2 A durchgeführt.
- Unspezifische Bindung von Proteinen an die Membran wurde durch Inkubation während 2 Stunden in Trockenmilchpulver/PBS-Lösung verhindert. PRRS-positives Schweine-Antiserum in Trockenmilchpulver/PBS-Lösung verdünnt, wurde über Nacht inkubiert und spezifische Bindung wurde mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Schwein-Antiserum (Dianova) und 2,2-Chlornaphtol (Sigma) als Substrat, nachgewiesen.
Claims (14)
1. Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen
porcines reproduktives Respirationssyndrom (PRRS), der ein
ein virales Antigen, welches von dem unter
Hinterlegungsnummer 1-1140 bei CNCM hinterlegten PRRS-Virus, oder von
einem PRRS-Virusisolat, das mit diesem immunologisch
verwandt ist, stammt, worin das virale Antigen aus
inaktiviertem PRRS-Virus besteht und der Impfstoff umfasst:
a. Menge des inaktivierten viralen Antigens, welche
äquivalent zu einem prä-Inaktivationsvirustiter von
mindestens 106.5 TCID&sub5;&sub0;/ml ist, vorzugsweise mindestens
107.5TCID&sub5;&sub0;/ml, oder
b. ein Adjuvans, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Vitamin E-Azetat-Ö/W-Emulsion,
Aluminiumphosphat,
-oxid, eine Öl-Emulsion, vorausgesetzt, die Öl-Emulsion
ist nicht Freund'sches Adjuvans, und Saponine, oder
c. den PRRS-Virus der in CNCM unter der
Hinterlegungsnummer 1-1140 hinterlegt wurde.
2. Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen
porcines reproduktives Respirationssyndrom (PRRS), der ein
virales Antigen umfasst, das von einem unter der
Hinterlegungsnummer I-1140 in CNCM hinterlegten Virus oder einem
Virusisolat, welches immunologisch mit diesem verwandt ist,
stammt, worin das virale Antigen aus lebendem Virus besteht
und der Impfstoff umfasst:
a. den PRRS-Virus in lyophilisierter Form oder
b. einen Stabilisator oder
c. eine Menge an 101.0-107.0 TCID&sub5;&sub0; des PRRS-Virus pro Dosis
oder
d. ein Adjuvans ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Vitamin E-Azetat-Ö/W-Emulsion,
Aluminiumphosphat, -oxid, eine Öl-Emulsion und Saponine oder
e. den PRRS-Virus der unter der Hinterlegungsnummer I-
1140 in CNCM hinterlegt wurde.
3. Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen
porcines reproduktives Respirationssyndrom (PRRS), der mehr
als eine Antigenkomponente umfasst, dadurch gekennzeichnet,
dass die erste Komponente, in CNCM unter der
Hinterlegungsnummer I-1140 hinterlegte PRRS-Virus oder ein mit diesem
immunologisch verwandtes Virusisolat umfasst, und eine
weitere
Antigenkomponente, die von einem nichtverwandten
porcinen Krankheitserreger stammt.
4. Unter Hinterlegungsnummer I-1140 in CNCM
hinterlegtes PRRS-Virus oder ein mit diesem immunologisch
verwandtes PRRS-Virusisolat, das in Zellkultur zu einem
Titer von mindestens 106.0TCID&sub5;&sub0;/ml und vorzugsweise bis
mindestens 107.0TCID&sub5;&sub0;/ml vermehrt werden kann.
5. Biologische Zusammensetzung die den PRRS-
Virus gemäss Anspruch 4 umfasst.
6. Verfahren zur Herstellung eines lebenden
Impfstoffs zum Schutz von Schweinen gegen PRRS, welches die
folgenden Schritte umfasst
a. 10- 200-faches Passagieren des in CNCM unter
Hinterlegungsnummer I-1140 hinterlegten Virus oder eines mit
diesem immunologisch verwandten Virusisolates auf
einem suszebtiblen Substrat;
b. Vermehren des geschwächten Virus auf einem
suszebtiblen Substrat; und
c. Sammeln und Verarbeiten des Virus zu einem
Impfstoffpräparat.
7. Verfahren zur Herstellung eines
inaktivierten Impfstoffs zum Schutz von Schweinen gegen PRRS, welches
den Schritt der Inaktivierung des unter Hinterlegungsnummer
I-1140 in CNCM hinterlegten, kultivierten PRRS-Virus oder
eines mit diesem immunologisch verwandten Virusisolates
umfasst,
mit einem inaktivierenden Agens, das aus der Gruppe
bestehend aus β-Propiolakton, Ethylenimin oder ein Derivat
davon, einem organischen Lösungsmittel, Röntgenstrahlen und
γ-Strahlung gewählt wird.
8. Verfahren zur Herstellung von viralem
Antigen, das von einem in der CNCM unter Hinterlegungsnummer
I-1140 hinterlegten PRRS-Virus oder einem mit diesem
immunologisch verwandten Virusisolat stammt, welches die Schritte
umfasst:
a. Animpfen suszebtibler Gewebezellen mit dem Virus,
b. Kultivieren der Zellen, und
c. Ernten des viralen Antigens aus der Kultur, wobei der
Titer vor der Ernte mindestens 106.0TCID&sub5;&sub0;/ml beträgt.
9. Nachweisverfahren für Antikörper gegen
PRRS-Virus, welches die Schritte umfasst:
a. Inkubieren einer auf anti-PRRS-Virus-Antikörper
verdächtigen Probe mit viralem PRRS-Antigenreagens, das
von einem, unter Hinterlegungsnummer I-1140 in der
CNCM hinterlegten PRRS-Virus oder einem mit diesem
immunlogisch verwandten PRRS-Virusisolat stammt, unter
Bedingungen, welche die Bildung eines
Antikörper-Antigenkomplexes erlauben und
b. Nachweisen des Antikörper-Antigenkomplexes durch
Verwendung eines markierten Antikörpers, wobei Marker aus
einer Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmarker,
Chemilumineszenzmarker, radioaktive Marker, Farbmoleküle und
Enzymmarkern gewählt wird, vorausgesetzt, der
Enzymmarker
wird nicht in einem Immun-Peroxidase-Monolayer-
Assay (IPMA) angewendet.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, dass das virale Antigenreagens ein virales
Polypeptid ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, dass das virale Antigenreagens ein
Viruspartikel ist.
12. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, dass das Verfahren aus einem enzymgebundenen
Immunabsorbtionsassay (ELISA) besteht.
13. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, dass das Verfahren aus einem
Immunofluoreszenztest (IFT) besteht.
14. Nachweisverfahren für virales PRRS-Antigen
in einer Probe, welches die Schritte umfasst:
a. Inkubieren der Probe mit Antikörpern, die für den
unter Hinterlegungsnummer I-1140 in der CNCM
hinterlegten PRRS-Virus oder ein mit diesem immunologisch
verwandtes PRRS-Virusisolat spezifisch sind, unter
Bedingungen, die die Bildung eines
Antkörper-Antigenkomplexes erlauben, wobei genannte Antikörper auf einer
festen Phase fixiert sind,
b. Waschen der festen Phase,
c. Zufügen des markierten Antikörpers und
d. Nachweisen des Antigen-Antikörper-Komplexes.
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