ES2083764T5

ES2083764T5 - Vacuna para el sindrome respiratorio reproductivo porcino (srrp) y diagnostico.

Info

Publication number: ES2083764T5
Application number: ES92920950T
Authority: ES
Inventors: Nicolaas Visser; Volker Ohlinger
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1991-10-14
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2012-10-09
Also published as: HU220113B; EP0610250A1; DK0610250T3; ES2083764T3; AU2684792A; HUT69803A; HU9401056D0; CA2121241C; EP0610250B1; ATE131067T1; DE69206631D1; GR3019112T3; DK0610250T4; JPH07501049A; DE69206631T2; CA2121241A1; EP0610250B2; US6033844A; WO1993007898A1

Abstract

LA INVENCION SE DIRIGE A LA IDENTIFICACION DEL AGENTE PROVOCADOR DE VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO REPRODUCTOR PORCINO Y A LAS VACUNAS DERIVADAS DEL MISMO. LA INVENCION TAMBIEN SE DIRIGE A AGENTES VIRALES PRODUCIDOS MEDIANTE EL CULTIVO DE TEJIDOS DE CELULAS INFECTADAS CON ESTE VIRUS, Y AL USO DE TALES ANTIGENOS EN PRUEBAS DE DIAGNOSTICO.

Description

Vacuna para el Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino (SRRP) y diagnóstico.

La presente invención se refiere a un método para la detección de anticuerpos frente al virus de SRRP, así como un estuche de ensayo de diagnóstico para utilizarlo en este método.

Una nueva enfermedad porcina ha atacado a más de 5.000 granjas de cerdos de la Europa del Norte desde finales de 1990. Esta enfermedad ahora se llama Síndrome Respiratorio Reproductivo Porcino (SRRP). Identificado por primera en Alemania en diciembre de 1990, el problema se fue haciendo cada vez más crítico a principios de 1991. En enero y febrero de 1991, la enfermedad se extendió a Holanda y Bélgica. También se han descrito brotes en España. Se prevé que la enfermedad llegará a ser muy costosa desde el punto de vista económico, comparable o incluso peor que la Enfermedad de Aujeszky.

Los principales signos clínicos en las cerdas son anorexia y aborto tardío hasta el día 110 de gestación. Con los lechones, se observa una alta incidencia de lechones débiles nacidos muertos además de problemas respiratorios. En cerdos de engorde se observa neumonía crónica y mortalidad incrementada.

Con el fin de desarrollar una vacuna para proteger a los cerdos contra el SRRP o desarrollar un método de diagnóstico para determinar infección en cerdos, se ha de identificar el agente causante de esta enfermedad. Sin embargo, hasta ahora sólo se han descrito unas pocas características del agente causante, tales como su naturaleza viral, propiedades de hemaglutinación, densidad de flotación y características de propagación in vitro (Wensvoort, G. y col., Vet. Quaterly 13, 121-130, 1991).

Las solicitudes de patentes internacionales WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760 y la solicitud de patente europea EP 0529584 (Boehringer Ingelheim Animal Health Inc.) son solicitudes en litigio disponibles como técnica anterior para la presente invención bajo el Artículo 54(3) y (4) EPC. El documento WO 92/21375 (Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut) describe la identificación del agente causante, llamado Agente Lelystad, de la Enfermedad Porcina Misteriosa (EPM). Adicionalmente, se propone el uso de este agente para la preparación de vacunas y ensayos de diagnóstico. Tanto el documento WO 93/03760 (Collins y col.) como el documento EP 0529584 describen el aislamiento de un aislado US, es decir, aislado ATCC-VR 2332, e identifican este aislado como el agente causante de la EPM en los EEUU. También se describe allí la preparación de una vacuna EPM atenuada por pase del aislado en un cultivo de células. El documento WO 93/06211 (Collins y col.) describen el aislamiento de un homogeneizado de tejido infeccioso procedente de un animal enfermo. Sin embargo, no se pudo dar ninguna identificación del agente causante presente en el homogeneizado.

Un objeto de la presente invención es proporcionar características inequívocamente identificativas del nuevo agente causante del SRRP, necesarias con el fin de preparar una vacuna y un ensayo de diagnóstico para el agente causante.

Ahora se ha identificado un tipo novedoso de virus, llamado virus del SRRP, responsable de esta enfermedad, caracterizándose el tipo novedoso de virus por el virus depositado en el CNCM con el número de entrada I-1140.

El virus del nuevo tipo se puede aislar de tejidos pulmonares de casos clínicos de SRRP. Se incubó una monocapa de macrófagos alveolares con un homogeneizado al 50% de tejido pulmonar en solución salina tamponada con fosfato (SSTF). El cultivo de células macrófagas se estableció a partir de lavados de pulmón de lechones SPF con SSTF. Los macrófagos se lavaron e incubaron con medio RPM 1640 suplementado con suero vacuno fetal al 10% y antibióticos durante 24 horas en una incubadora con CO_{2} al 5%. Se añade un pequeño volumen del homogeneizado los macrófagos, después de 1 h de incubación a 37ºC se añadió nuevo medio otra vez y los macrófagos infectados se incubaron adicionalmente a 37ºC en atmósfera de CO_{2}. Es evidente un efecto citopático (ECP) total después de 2-3 días de incubación.

El virus también se puede aislar de otras fuentes tales como corazón, amígdalas, cerebro e hígado de cerdos infectados.

Los homogeneizados de tejidos seleccionados de un caso clínico de SRRP, utilizados para el aislamiento del virus novedoso del SRRP, no mostraron consistentemente signos de la presencia de otros agentes virales encontrados corrientemente con cerdos, especialmente no se encontró virus de la pseudorrabia (VPR), parvovirus porcino (PVP), paramixovirus, virus del cólera de los cerdos (VCC) ni virus de la gastroenteritis transmisible.

Otras características del virus novedoso del SRRP se mencionan a continuación:

- Depósito del virus

El virus novedoso del SRRP aislado específicamente como se ha descrito antes concordaba con la descripción interna "Aislado nº 10" y se ha depositado el 6 de septiembre de 1991 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur de París, Francia, con el número de entrada I-1140.

- Características de propagación

El virus novedoso se propaga en macrófagos pero no lo hace a niveles medibles en las líneas celulares establecidas, BHK21, Vero, SK-6 (riñón porcino), PK15 (riñón porcino), ST (testículo porcino), L929 y BEL (pulmón embrionario bovino).

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- Exclusión serológica de agentes conocidos

Utilizando técnicas establecidas, se excluyó que uno de los siguientes agentes fuera el agente causante del SRRP.

1

N.D. =: no determinado

^{a} =: ensayo de neutralización del virus (NV), como se describe en Virologische Arbeitsmethoden, vol. 2, redactado por A. Mayr y col., Fisher Verlag Jena, 1977, págs. 457-535;

^{b} =: ensayo gI Elisa, como se describe en el manual proporcionado con el estuche de Intertest Aujeszky gI Elisa;

^{c} =: ensayo de inhibición de hemaglutinación (IH), Virology, a practical approach, redactado por B.W.J. Mahy, IRL Press, Oxford, 1985, págs. 245-248;

^{d} =: ensayo de inmunofluorescencia; Virologische Praxis, redactado por G. Starke, Fischer Verlag Jena, 1968, pág. 227-241.

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- Correlación serológica del agente infeccioso con el SRRP

Muestras de suero de campo, obtenidas a partir de casos clínicos, se ensayaron en un ensayo de inmunofluorescencia (EIF) utilizando macrófagos infectados.

Además, se ensayaron muestras de suero de cerdos infectados experimentalmente con el nuevo virus.

Placas de microtítulo sembradas con macrófagos alveolares (4.10^{4} por pocillo) se infectaron utilizando Aislado nº 10 e incubaron durante 24 horas. Al cabo de este tiempo, aparecen los primeros signos de ECP. Las células se fijan con etanol del 96%, frío (30 min). Diluciones seriadas, partiendo de 1/10, de las muestras de suero se incubaron sobre los macrófagos infectados fijados durante 1 hora a 37ºC. La segunda incubación se hizo con IgG anti-cerdo de conejo, conjugada a FITC (Nordic, Breda) (dilución 1/40, 30 min, 37ºC). Se determinó la fluorescencia específica con un microscopio de inmunofluorescencia Leitz invertido. La fluorescencia específica se caracteriza por fluorescencia perinuclear falciforme.

En la Tabla siguiente se da una comparación de un grupo de sueros de ensayo.

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- Reacción cruzada entre aislados de SRRP

Aunque el virus del SRRP no está relacionado antigénicamente con virus porcinos conocidos, se pudo demostrar que diferentes aislados de virus del SRRP son antigénicamente similares ya que experimentan reacciones inmunológicamente cruzadas en el ensayo IF.

La tabla siguiente demuestra que el suero SRRP positivo reacciona con los diversos aislados de SRRP en el EIF. Así, cualquier aislado de virus del SRRP se puede utilizar en la presente invención debido a su fuerte relación antigénica, como se demuestra con el EIF.

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- Otras características

El virus del SRRP es un virus con envolvente (sensible a tratamiento con cloroformo y éter) con pequeñas nudosidades en la superficie y es similar al virus de lactato deshidrogenasa y al virus de la artritis equina. La partícula de virus mide aproximadamente 65 nm y tiene una densidad de flotación de 1,1 g/cm^{3}.

En cultivo de células macrófagas infectadas con el virus, se pueden detectar al menos dos proteínas específicas del virus de aproximadamente 14.000 y 21.000 (Da).

También se pueden concentrar fluidos de SRRP inactivados por cualquiera de las diversas técnicas disponibles, tal como utilizando un dispositivo concentrador Amicon, técnicas de precipitación tales como con cloruro de amonio o polietilenglicol, concentración con Carbowax® o por medio de ultracentrifugación, o técnicas de concentración con un coadyuvante, tal como con fosfato de aluminio.

El objeto de la inactivación de los virus del SRRP es eliminar la reproducción de los virus. En general, esto se puede conseguir por medios químicos o físicos. La inactivación química se puede efectuar tratando los virus con, por ejemplo, formaldehído, \beta-propiolactona, etilenimina o uno de sus derivados, un disolvente orgánico (tal como Tween®, Triton X®, desoxicolato de sodio, sulfobetaína o sales de octiltrimetilamonio). Si es necesario, el compuesto inactivante se neutraliza seguidamente; el material inactivado con formaldehído se puede neutralizar, por ejemplo, con metabisulfito. Preferiblemente, la inactivación física se puede llevar a cabo sometiendo los virus a una radiación rica en energía, tal como luz UV, radiación X o radiación \gamma. Si se desea, el pH se puede llevar de nuevo a un valor de aproximadamente 7 después del tratamiento.

Un método para preparación de antígeno viral del SRRP, que incluye las etapas de

a): inocular células de cultivo de tejido susceptible con el virus del SRRP,

b): cultivar las células, y

c): recolectar el antígeno viral del cultivo.

Preferiblemente, el virus del SRRP se cultiva a títulos elevados, es decir, al menos 10^{6,0} DICT_{50}/ml.

En particular, el Aislado nº 10 del virus del SRRP, nº de entrada en CNCM I-1140 se utiliza para la preparación de altas cantidades de antígeno viral del SRRP.

El antígeno viral se puede preparar por la propagación de los aislados de virus del SRRP en macrófagos (alveolares, peritoneales, periféricos, médula ósea o de cualquier otro sitio). También son útiles otras células con propiedades del estilo de los macrófagos, como los promonocitos, monocitos, células endoteliales vasculares del cerebro y células microgliales. Las células macrófagas o del estilo de los macrófagos pueden ser de origen SPF o no-SPF (v.g., de cerdos del comercio regular). En los últimos casos, hay que tomar precauciones para evitar contaminación no deseada, v.g., por el uso de antibióticos apropiados en el cultivo.

Otro grupo de rutas que pueden conducir a un procedimiento muy útil de propagación de virus es el establecimiento de una línea de células macrófagas. A continuación, se mencionan diversas posibilidades que pueden conducir a dichas líneas deseables de células macrófagas.

Inmortalización de macrófagos utilizando medio acondicionado de células L(929), células SK6, ST, Vero o BHK. En estos medios acondicionados, es importante al menos la presencia de linfocinas del estilo del Factor Estimulador de Colonias (FEC) de macrófagos (Stanley, E.R., Methods Enzymology 116, 564-587, 1985).

Tratamiento de macrófagos de cualquier fuente con productos químicos para inducir inmortalización, v.g., \beta-propiolactona como un ejemplo de un agente alquilante que afecta al metabolismo del ADN (Logrippo, G.A. y Harman, F.W., J. Immunol. 75, 123-128, 1955).

Un modo más definido de inmortalización es el uso de virus transformantes. Hasta ahora, se han descrito especialmente, pero sin limitarse a ellos, retrovirus (v.g., virus de leucemia), virus SV40 y Papiloma, para inmortalizar macrófagos de otras especies, como hombres y ratones. (Robinson, D.H. y col., Blood 77, 294-305, 1991; Righi, M. y col., Oncogene 6, 103-111, 1991; Choi, C.S. y col., Arch. Virol. 115, 227-237, 1990; Gendelman, H.E. y col., Lab. Invert. 51, 547-555, 1984; catálogo ATCC de líneas macrófagas humanas y de ratón disponibles).

Un modo aun más preciso de inmortalización es el uso de genes de cualquier virus mencionado anteriormente, u otros, que sean responsables de la inmortalización, por ejemplo, se pueden utilizar genes Vmyc o Vmsf y/o el gen T grande de SV40. La construcción de un vector retroviral que permita la integración de un gen no transformante, como el gen T grande de SV40, en el genoma de la célula hospedadora sería la solución más preferible para que se obtenga inmortalización sin la replicación y excreción reales de partículas virales o del estilo de las virales. También, un plásmido que contuviera un marcador seleccionable (v.g., Neo®) y el gen T grande de SV40 sería un método para inmortalización.

Como fuente de inmortalización, se pueden tomar macrófagos maduros, sin embargo, también son muy útiles fases celulares antes de la diferenciación a los macrófagos maduros, ya que estas son células en división con características de macrófagos y tienen marcadores de macrófagos tales como CD1, CD11 y CD14. Las fases previas se pueden seleccionar y obtener en forma pura libre de contaminación por otros linfocitos utilizando diversas técnicas de separación, por ejemplo, recuento de células con un CCAF (Contador de Células Activadas por Fluorescencia) y anticuerpos específicos, marcados con fluorocromos, contra los marcadores CD.

La demanda de métodos específicos, sensibles, para rastrear e identificar vehículos de virus del SRRP es importante.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un ensayo rápido y sensible para la detección de anticuerpos frente al virus del SRRP.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar estuches de pruebas de diagnóstico para realizar el método de ensayo de la invención.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la detección de anticuerpos frente al virus del SRRP, que comprende:

a): incubar una muestra sospechosa de contener anticuerpos anti-virus del SRRP con reactivo antigénico viral del SRRP, derivado de virus de un tipo novedoso de virus caracterizado por el virus depositado en la CNCM con el nº de entrada I-1140, en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, y

b): detectar el complejo de anticuerpo-antígeno.

El antígeno viral de células infectadas con SRRP, que reacciona inmunológicamente con suero que contiene anticuerpos anti-virus del SRRP, es útil como reactivo en inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos frente al virus del SRRP en muestras biológicas. El reactivo antigénico viral puede ser, entre otros, partículas de virus purificados o parcialmente purificados o polipéptidos virales, virus fragmentados o células infectadas o lisado de dichas células. El diseño del inmunoensayo puede variar. Por ejemplo, el inmunoensayo se puede basar en una reacción de competición o directa, o en ensayos de tipo sandwich. Más aún, los protocolos pueden utilizar soportes sólidos o se pueden hacer por inmunoprecipitación. La detección del complejo de anticuerpo-antígeno puede implicar el uso de anticuerpo marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimiluminiscentes, radiactivos, moléculas de tinte o marcadores enzimáticos.

Los presentes métodos útiles para la detección de anticuerpos frente al virus del SRRP incluyen el ensayo del inmunosorbente unido a una enzima (ELISA; del inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), el ensayo de inmunofluorescencia (EIF) y la técnica de Manchado Western.

La técnica ELISA implica la reacción de una muestra de ensayo con reactivo antigénico viral obtenido a partir de virus del SRRP. Preferiblemente, el reactivo antigénico es un lisado celular de macrófagos infectados con el virus del SRRP. Típicamente, el reactivo antigénico se aplica sobre una fase sólida, v.g., una microplaca o copa de plástico. Después de lavar para separar los anticuerpos no unidos, se añade anti-inmunoglobulina marcada con enzima a la fase sólida, se incuba y lava de nuevo. Las enzimas adecuadas para marcaje son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. A continuación, se añade un sustrato enzimático a la mezcla y se forma un producto de color medible, detectable, en presencia de anticuerpos frente al virus del SRRP.

Además, se puede utilizar la técnica EIF de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, macrófagos infectados con el virus del SRRP se cultivan en placas de microtítulo durante 24 horas. A continuación, las células se fijan, por ejemplo, con acetona o etanol, o por congelación-descongelación en combinación con tratamiento con formalina. Después, se añade la muestra de ensayo a las células fijadas y se incuba durante 1 h a 37ºC. Subsiguientemente, se añade anti-inmunoglobulina conjugada con un compuesto fluorescente tal como fluoresceína a las células fijadas. Después se examinan las mezclas de reacción para determinar la fluorescencia bajo un microscopio. Se puede demostrar un modelo típico de fluorescencia de macrófagos infectados con el virus del SRRP, incubados con un suero positivo de un cerdo infectado con SRRP.

El método de diagnóstico preferido de acuerdo con la invención está enfocado a la detección de anticuerpos frente al SRRP utilizando la técnica de Manchado Western.

En esta técnica, se resuelve electroforéticamente el antígeno viral del SRRP sobre geles de DSS-poliacrilamida. Preferiblemente, el antígeno viral del SRRP es el lisado celular de macrófagos infectados con virus del SRRP. Las bandas de proteína resultantes se electro-transfieren, preferiblemente a papel de nitrocelulosa. También son adecuados otros tipos de papel, conocidos por los expertos en la técnica, tales como papel diazo. (Tsang y col., En: Methods in Enzymology 92, capítulo 29, 1983). Después, las tiras de nitrocelulosa que contienen el antígeno viral resuelto se incuban con las muestras de ensayo y, si se desea, con muestras de referencia positivas y negativas. Si se desea, también se incuban con la muestra de ensayo tiras de referencia negativas, que contienen, por ejemplo, lisado de macrófagos, resuelto electroforéticamente, obtenido a partir de macrófagos no infectados con el virus del SRRP. Típicamente, la muestra de referencia positiva es una muestra que se sabe que contiene anticuerpos frente al virus del SRRP, v.g., suero procedente de casos clínicos de SRRP o de animales infectados experimentalmente con el virus del SRRP. La muestra de referencia negativa es una muestra que se sabe que está desprovista de anticuerpos frente al virus del SRRP. Después, se puede llevar a cabo la detección del complejo de anticuerpo-antígeno ya sea por ELISA o por técnicas de radioinmunoensayo en tiras de fase sólida. Se pueden llevar a cabo lavados después de cada incubación.

Preferiblemente, la incubación de las tiras se lleva a cabo en contenedores.

Sorprendentemente, la técnica de manchado Western es particularmente adecuada para la detección de polipéptidos específicos del virus del SRRP, obtenidos a partir de un cultivo de células in vitro debido a la presencia de dos o tres proteínas pequeñas, específicas del virus, identificables separadamente a partir de otro material reactivo con suero SRRP. Como se indica en la Figura 1, la reactividad inmune principal o especificidad se dirige contra una proteína de aproximadamente 14.000 y 21.000 (Da) del virus del SRRP (manchado Western de virus del SRRP cultivado en macrófagos, purificado en un gradiente de glicerol). La banda de 21.000 (Da) es difusa y, por lo tanto, la designación 21.000 (Da) sólo representa una indicación del tamaño de esta proteína. Otras proteínas específicas del virus, reconocidas por anticuerpos frente al virus del SRRP, en el manchado Western, tienen pesos moleculares de aproximadamente 46.000, 49.000 y 55.000 (Da).

Con viriones marcados con ^{35}S-Met/Cys, se observó que eran prominentes las proteínas 14K, 24K, 33K y 46K. La radioinmunoprecipitación de lisados celulares infectados, marcados con ^{35}S-Met/Cys dio como resultado la demostración de dos proteínas específicas del virus, de aproximadamente 24K y 33K. Las proteínas específicas del virus, indicadas anteriormente, también se pueden utilizar para la diagnosis de infección con SRRP.

En una realización preferida de la invención, la proteína del virus del SRRP, de 14.000 y/o 21.000 (Da), purificada, se puede utilizar en la técnica de ELISA y manchado Western como reactivo antigénico viral con el fin de proporcionar un ensayo más sensible.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un estuche de ensayo de diagnóstico, que permite rastrear "en el sitio" anticuerpos frente al virus del SRRP. El estuche de ensayo incluye al menos una tira que contiene antígeno viral del SRRP resuelto, (electro-)transferido a partir de un gel de EGPA-DSS. Además, el estuche puede comprender una tira de referencia de control negativo, v.g., que contiene antígeno resuelto a partir de un cultivo de células in vitro, v.g. cultivo de células macrófagas, no infectado con el virus del SRRP.

Preferiblemente, las tiras están contenidas en contenedores individuales, facilitando las etapas subsiguientes de incubación.

Más aún, es ventajoso incluir en el estuche de ensayo las muestras de referencia positiva y negativa con el fin de facilitar la evaluación de los resultados del ensayo por comparación con los resultados obtenidos para la muestra de ensayo.

Si se desea, también se proporcionan en el estuche tiras de referencia positivas y negativas previamente desarrolladas. Las tiras previamente desarrolladas se utilizan para evaluar los resultados del ensayo por una comparación visual con las tiras de ensayo después de acondicionar una reacción de color. Las tiras previamente desarrolladas facilitan la lectura de los resultados del ensayo y prácticamente eliminan la necesidad de un técnico experto para evaluar los resultados.

En el estuche, también se pueden incluir viales de reactivo antisuero conjugado con una enzima, preferiblemente inmunoglobulinas conjugadas con peroxidasa de rábano picante, sustrato o indicador de cambio de color, tampones de lavado y solución para detener la reacción de color. El sustrato, el agente para detener la reacción y los tampones de lavado preferidos son DAB, agua destilada y SSTF Tween® y SSTF, respectivamente.

En una realización de las más preferidas de este estuche de ensayo, las bandas de proteína de aproximadamente 14.000 y 21.000 (Da) de las tiras de ensayo del virus del SRRP que contienen el antígeno viral del SRRP, resuelto, son identificables separadamente, es decir, estas bandas están separadas de otros antígenos virales o no virales, reactivos con el suero SRRP.

Para medir el antígeno viral del SRRP en una muestra de ensayo, se utilizan antisuero o anticuerpos específicos contra SRRP, conocidos, como reactivo, preferiblemente fijados a una fase sólida. Se añade la muestra de ensayo que contiene antígeno y, después de la incubación dejando que se forme un complejo de antígeno-anticuerpo, se lava la fase sólida y se añade un segundo anticuerpo marcado para detectar el complejo de antígeno-anticuerpo.

Más aún, la presente invención se refiere a estuches de ensayo que se utilizan de acuerdo con el método para la detección del antígeno viral del SRRP en una muestra de ensayo como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 1 Aislamiento y propagación del virus del SRRP

Lechones SPF mantenidos en instalaciones con aislamiento se anestesian y se realiza lavado pulmonar utilizando solución salina tamponada con fosfato (SSTF) templada. Se recogen aproximadamente 100 ml de suspensión de macrófagos en botellas de vidrio silicónico. Los macrófagos se lavan con SSTF y se incuban con medio RPM 1640 (Flow Labs) suplementado con suero vacuno fetal al 10% y antibióticos durante 24 horas en una incubadora con CO_{2} al 5%. Las células se sembraron en matraces Roux de 25 cm^{2} (Falcon) a una densidad de 3 x 10^{5} por cm^{2}.

La cerda 266 que padecía síntomas clínicos de SRRP (aborto, falta de hambre) diagnosticada por un veterinario del Instituto Regional de la Salud Animal se tomó para hacer la autopsia.

Se preparó un homogeneizado al 50% de tejido pulmonar en SSTF, utilizando un Ultraturrax®. Se utilizó centrifugación a baja velocidad para clarificar la suspensión. Se sacó un ml del sobrenadante clarificado y se inoculó en una monocapa de 24 horas de macrófagos alveolares. Después de la incubación durante 1 h a 37ºC, el medio se añadió de nuevo y los macrófagos infectados se incubaron además a 37ºC en atmósfera de CO_{2}. Después de dos días fueron evidentes los primeros signos de ECP. El día 3, los macrófagos mostraron lisis completa, lo que se confirmó por la captación de azul de tripano. Las células viables excluyen el tinte azul de tripano, como lo hacían los macrófagos control no infectados. La recolección de este primer pase se guardó a -70ºC. Se hicieron pases adicionales de este aislado por incubación de 1 ml de virus prediluido 1:10 - 1:100 en cultivos adicionales de macrófagos. El ECP total es evidente después de 2-3 días de incubación. A este aislado de SRRP, se le asignó el código interno "Aislado nº 10". Una muestra de este aislado se ha depositado en la CNCM con el nº de entrada I-1140.

El método para la preparación del antígeno viral del SRRP, que se ha descrito anteriormente, da como resultado la capacidad de propagación del virus a altos títulos in vitro. La Tabla 1 muestra los resultados del rendimiento de virus después de varios niveles de pase del Aislado nº 10.

TABLA 1 Características de propagación en macrófagos

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Ejemplo 4 Inmunoensayo de manchado Western

Sobrenadantes de cultivos de macrófagos infectados así como no infectados se clarificaron a 3.000 g. Los sobrenadantes se centrifugaron en un rotor SW 28.1 a 25.000 rpm durante 3 horas. Los sedimentos se resuspendieron en tampón TEN y utilizaron en electroforesis en gel.

El material se separó por electroforesis en condiciones reductoras en un gel de dodecilsulfato de sodio (DSS)-poli-acrilamida al 10%. Los geles se equilibraron en tampón renaturalizante (urea 4 M, NaCl 50 mM, Tris-hidrocloruro 10 mM, ditiotreitol 0,1 mM [pH 7]) durante 30 min y después se incubaron en tampón de electroforesis sin DSS durante 30 minutos adicionales. La transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, FRG) se realizó en una cuba de transferencia electroforética Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Munich, FRG) a 2 A durante 1 h. La unión no específica de proteínas a la membrana se bloqueó por incubación con una solución de leche en polvo en SSTF durante 2 h. Los antisueros de cerdo positivos en VSRRP diluidos en solución de leche en polvo en SSTF se dejaron estar durante una noche para que transcurriera la unión, y la unión específica se detectó utilizando un antisuero conjugado con peroxidasa anti-porcina de cabra (Dianova) y 2,3-cloronaftol (Sigma) como el sustrato.

Claims

1. Un método para la supresión de anticuerpos del virus del SRRP, cuyo método es un ensayo de inmunoabsorbente unido a una enzima (ELISA) o un ensayo inmunológico de tipo Manchado Western, que comprende las etapas de:

a.: incubar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos anti-virus del SRRP con un reactivo antigénico viral del SRRP derivado de un virus del SRRP depositado en la CNCM con el nº de entrada I-1140 o un aislado de virus del SRRP relacionado inmunológicamente con aquel, en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, y

b.: detectar el complejo de anticuerpo-antígeno que implica el uso de un anticuerpo marcado, seleccionándose el marcador a partir del grupo formado por marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, marcadores radiactivos, marcadores de moléculas de tinte y marcadores enzimáticos siempre que el marcador enzimático no se utilice en un inmunoensayo de monocapa de peroxidasa (IEMP).