ES2286815T3 - Virus, vacunas y dna viral para la enfermedad respiratoria y reproductiva porcina. - Google Patents

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Abstract

Virus aislado de origen natural que provoca el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), seleccionado del grupo que consiste en los virus depositados en la American Type Culture Collection con los números de acceso VR 2385 y VR 2386.

Description

Virus, vacunas y DNA viral para la enfermedad respiratoria y reproductiva porcina.
Antecedentes de la invención Sector técnico al que pertenece la invención
La presente invención se refiere a un virus aislado que se presenta de modo natural y que provoca el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS); haciendo referencia también a un compuesto que comprende dicho virus aislado; a una vacuna que protege a los cerdos contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) que comprende virus inactivado; se refiere también a un método para la fabricación de dicha vacuna; a un equipo o kit diagnóstico para ensayar un virus que provoca la enfermedad respiratoria porcina, enfermedad reproductiva porcina, o enfermedad reproductiva y respiratoria porcina; haciendo referencia también a un polinucleótido aislado; a una proteína codificada por dicho polinucleótido; a un ácido polinucléico aislado que consiste esencialmente en dicho polinucleótido aislado; y a un método para el cultivo de un virus.
Explicación de los antecedentes
En estos últimos años, las cabañas de cerdos en América del Norte y Europa han sido susceptibles de infección por nuevas cepas de los virus respiratorios y reproductivos (ver A.A.S.P., septiembre/octubre 1991, página 7-11; The Veterinary Record, febrero 1, 1992, página 87-89; Ibid., Noviembre 30, 1991, página 495-496; Ibid., Octubre 26, 1991, página 370; Ibid., Octubre 19, 1991, página 367-368; Ibid., Agosto 3, 1991, página 102-103; Ibid., Julio 6, 1991; Ibid., Junio 22, 1991, página 578; Ibid., Junio 15, 1991, p. 574; Ibid., Junio 8, 1991, página 536; Ibid., Junio 1, 1991, página 511; Ibid., Marzo 2, 1991, página 213). Entre las primeras nuevas cepas a identificar se encontraba un virus asociado con la llamada enfermedad misteriosa de los cerdos (MSD) o "síndrome de las orejas azules", que en la actualidad se conoce como síndrome respiratorio y de infertilidad de los cerdos (SIRS) o síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS). En Europa, esta enfermedad ha sido designada también síndrome epidémico respiratorio y de aborto porcino (PEARS), enfermedad azul de aborto, enfermedad de orejas azules (Inglaterra), abortus blau (Holanda) y seuchenhafter spatabort der schweine (Alemania), y el correspondiente virus ha sido designado "virus Lelystad". En Estados Unidos, esta enfermedad ha sido llamada también síndrome de Wabash, enfermedad misteriosa de los cerdos (MPD) y plaga porcina. Una enfermedad que se asocia en algunos casos con PRRS es la pneumonia intersticial proliferativa (PIP).
Se han observado episodios de la "enfermedad de orejas azules" en cabañas porcinas de Inglaterra, Alemania, Bélgica y Holanda. Su aparición en Inglaterra ha conducido a la cancelación de exposiciones porcinas. Los síntomas de PRRS comprenden el rechazo de la comida (anorexia), fiebre suave (pyrexia), cianosis de las extremidades (orejas notablemente azules), fetos muertos, abortos, elevada mortalidad en las granjas afectadas, lechones débiles de nacimiento y partos prematuros. La mayor parte de lechones nacidos vivos en madres afectadas mueren dentro de las 48 horas. Los signos clínicos de PRRS comprenden señales suaves parecidas a gripe, respiración rápida "latidos rápidos" y neumonitis intersticial difusa. El virus de PRRS tiene un período de incubación de unas dos semanas desde el contacto con un animal infectado. El virus parece ser un arterivirus RNA con envolvente (Ibid., febrero 1, 1992). El virus ha sido cultivado con éxito en macrófogos alveolares de cerdos y en células CL2621 (Benfield y otros, J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133, 1992; Collins y otros, Swine Infertility and Respiratory Sindrome/Mystery Swine Disease ("Síndrome respiratorio y de Infertilidad de cerdos/Enfermedad misteriosa de los cerdos"). Proc., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, página 200-205, 1991), y en células MARC-145 (Joo, PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine Conference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993), 20:53-55). También se ha indicado un cultivo con éxito de un virus que provoca SIRS por Wensvoort y otros (Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus. ("Enfermedad misteriosa de los cerdos en Holanda: aislamiento del virus Lelystad") Vet. Quart. 13:121-130, 1991).
La aparición de PRRS en Estados Unidos ha afectado de manera adversa la industria de cría porcina. En Canadá, la PRRS se ha caracterizado por anorexia y pirexia en madres con una duración hasta 2 semanas, abortos de último momento, mayores tasas de fetos muertos, lechones débiles de nacimiento y muertes neonatales precedidas de respiración abdominal rápida y diarrea. El trabajo realizado para el aislamiento del virus que provoca PRRS, en un método de diagnóstico de la infección de PRRS, y para el desarrollo de una vacuna contra el virus PRRS ha sido publicado (ver publicación de Patente de Canadá Nº 2.076.744; publicación de Patente Internacional PCT Nº. WO 93/03760; publicación de Patente Internacionl PCT Nº. WO 93/06211; y publicación de Patente Internacional PCT Nº WO 93/07898).
Una segunda cepa del virus descubierta durante la búsqueda del agente causante de PRRS provoca una enfermedad conocida en la actualidad como pneumonia proliferativa y necrotizante (PNP). Los síntomas de PNP y la etiología del virus que la provoca parecen similares a PRRS y a su virus correspondiente, pero existen diferencias identificables. Por ejemplo, el virus que provoca PNP se cree que es un virus A de gripe de cerdos no clásico o atípico (aSIV).
Los signos clínicos principales de PNP son fiebre, disnea y respiración abdominal. Se ven afectados cerdos de diferentes edades, pero la mayor parte de síntomas tiene lugar en cerdos con edades entre 4 y 16 semanas. Los pulmones de los cerdos afectados están enrojecidos de manera difusa y tienen una consistencia "carnosa" (Collins, A.A.S.P., Septiembre/Octubre 1991, página 7-11). Como contraste, los cerdos afectados por PRRS no muestran fiebre significativamente, y se observa signos respiratorios principalmente en cerdos neonatales (menos de 3 semanas de edad) con lesiones pulmonares, caracterizándose por una pneumonia intersticial difusa.
El virus de la encefalomiocarditis (EMCV) es otro virus que provoca grave pneumonia intersticial junto con miocarditis intersticial, necrotizante y calcificante. Experimentalmente, el EMCV produce fallo reproductivo en las madres afectadas (Kim y otros, J. Vet. Diagn. Invest., 1:101-104 (1989); Links y otros, Aust. Vet. J., 63-150-152 (1986); Love y otros, Aust. Vet. J., 63:128-129 (1986)).
Recientemente, ha aparecido una forma más virulenta de PRRS con incidencia incrementada en cerdos con edades de 3 a 8 semanas en el medio oeste de Estados Unidos. De manera típica, cerdos sanos con edades de 3-5 semanas son destetados y se ponen enfermos 5-7 días más tarde. Los métodos rutinarios de identificación de virus de tejidos de cerdos afectados han mostrado que no se asocian con esta nueva forma de PRRS: virus de gripe porcino (SIV), virus pseudorrábico (PRV), y Mycoplasma hyopneumoniae.
La presente invención está destinada principalmente a conseguir una vacuna que protege a los cerdos contra infecciones de los agentes que provocan esta nueva forma más virulenta de PRRS, refiriéndose también a un método para la fabricación de la vacuna y con DNA que codifica una parte del genoma del agente infeccioso que provoca esta nueva forma de PRRS. No obstante, se cree que la información adquirida en el curso del desarrollo de la presente invención será útil en el desarrollo de vacunas y métodos para la protección de cerdos contra cualesquiera enfermedades porcinas respiratorias y reproductivas. Por ejemplo, los presentes inventores han caracterizado la patología, como mínimo, de un virus de PRRS que es distinta de la patología anteriormente publicada de virus PRRS (ver Tabla I). Por lo tanto, la presente invención no está necesariamente limitada a vacunas y métodos relacionados con el agente infeccioso que provoca esta nueva forma de PRRS que los presentes inventores han designado "cepa Iowa" del virus PRRS
(PRRSV).
No obstante, se ha expresado pesimismo y excepticismo en este sector referente al desarrollo de vacunas efectivas contra estos virus porcinos (The Veterinary Record, 26 de octubre de 1991). Existe en el sector la creencia de que las vacunas contra la gripe humana pueden proporcionar una cierta protección contra los efectos de PRRS y PNP (ver por ejemplo, Ibid., 6 de julio de 1991). No obstante, la utilización de una vacuna humana en un animal destinado a alimentos es desaconsejada de forma general por las organizaciones normativas y administrativas y, por lo tanto, este enfoque no es factible en la práctica actual (Ibid.).
La cría de cerdos está y continuará estando afectada adversamente por estas enfermedades respiratorias y reproductivas porcinas y por nuevas variantes de las mismas cuando éstas aparezcan. De manera sorprendente, el mercado para vacunas para animales, tanto en Estados Unidos como en el resto del mundo, es mayor que el mercado para vacunas humanas. Por lo tanto, existe un incentivo económico para desarrollar nuevas vacunas veterinarias, además de la ventaja sanitaria sustancial para el público que se deriva de la protección de las granjas contra la enfermedad.
Características de la invención
De acuerdo con lo anterior, el objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un virus aislado que se presenta de forma natural, que provoca el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), seleccionado del grupo que consiste en los virus depositados en la American Type Culture Collection con el número de acceso VR 2385 y VR 2386.
Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer una vacuna que protege a los cerdos contra el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), comprendiendo un virus inactivado o atenuado y un portador fisiológicamente aceptable, en el que antes de la inactivación o atenuación dicho virus es el virus de la presente invención.
Es otro objetivo adicional de la presente invención el dar a conocer una vacuna que aumenta la respuesta inmunológica efectiva contra el virus que provoca la enfermedad reproductiva y respiratoria en los cerdos, particularmente, contra la cepa Iowa de PRRSV.
Un nuevo método para la protección de los cerdos contra la infección por un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, en particular contra la cepa Iowa de PRRSV, se da a conocer pero no se reivindica.
Un nuevo método de provocar una respuesta inmunológica efectiva en los cerdos contra un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, especialmente contra la cepa Iowa de PRRSV, se da a conocer pero no se reivindica.
Un anticuerpo que se une inmunológicamente a un virus que provoca una enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente contra la cepa Iowa de PRRSV, se da a conocer en esta descripción pero no se reivindica.
Un anticuerpo que inmunológicamente se une a una vacuna que protege a los cerdos contra infección por un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina se da a conocer en esta descripción pero no se reivindica.
Un anticuerpo que se une inmunológicamente a una vacuna que protege a los cerdos contra infección por la cepa Iowa de PRRSV se da a conocer en esta descripción pero no se reivindica.
Un método para el tratamiento de cerdos afectados de enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente una enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV, se da a conocer en esta descripción pero no se reivindica.
Un método para el tratamiento de cerdos expuestos a un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente la cepa Iowa de PRRSV, se da a conocer en esta descripción pero no se reivindica.
Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un equipo o kit de diagnóstico para el ensayo de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente una enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV.
Otro objetivo adicional de la presente invención es el de dar a conocer un polinucleótido aislado del genoma de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente la cepa Iowa de PRRSV.
Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un polinucleótido que codifica una o varias proteínas de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente la cepa Iowa de
PRRSV.
Es otro objetivo de la presente invención dar a conocer un polinucleótido que codifica uno varios péptidos antigénicos de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, particularmente la cepa Iowa de PRRSV.
Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un nuevo método para el cultivo de un virus de enfermedad reproductiva y respiratoria porcina utilizando una línea celular apropiada.
Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un nuevo método para el cultivo de la cepa Iowa de PRRSV utilizando una línea celular adecuada.
Estos y otros objetivos que quedarán evidentes durante la siguiente descripción de las realizaciones preferentes han sido conseguidos por una vacuna que protege a los cerdos contra infección por un virus que provoca enfermedad reproductiva y respiratoria porcina, un compuesto que aumenta la respuesta inmunológica efectiva a un virus que provoca dicha enfermedad porcina, y a un DNA que codifica una parte del genoma de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un diagrama de flujo de la producción de una vacuna viva modificada;
la figura 2 es un diagrama de flujo de un proceso para la producción de una vacuna inactivada;
la figura 3 es un diagrama de flujo que describe un procedimiento para la producción de una vacuna subunitaria;
la figura 4 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para producir una vacuna de diseño genético;
las figuras 5 y 6 muestran secciones histológicas de pulmones de cerdos convencionales diez días después de infección con una muestra del agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa Iowa de PRRSV;
la figura 7 muestra una sección histológica del pulmón de un cerdo gnotobiótico a los nueve días después de infección con una muestra de agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa Iowa de PRRSV;
la figura 8 muestra lesiones de corazón de un cerdo gnotobiótico veinticinco días después de infección con la muestra de un agente infeccioso aislada de un cerdo infectado con la cepa Iowa de PRRSV;
la figura 9 muestra cultivos bronquio-alveolares que muestran sincitia estensa, preparados a partir de un cerdo gnotobiótico nueve días después de infección con una muestra de un filtrado de pulmón de un agente infeccioso aislado de un cerdo infectado con la cepa Iowa de PRRSV (ISU-12; ver Experimento I, Sección (II) (C) más adelante);
la figura 10 es una micrografía electrónica de una partícula de virus con envoltura de unos 70 nm de diámetro, que tiene espículas superficiales cortas, encontrada en cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados por un agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV;
la figura 11 es una micrografía electrónica de una partícula de virus con envoltura, pleomórfica, que tiene aproximadamente dimensiones de 80 X 320 nm, con recubrimiento por anticuerpos, que se encuentra en cultivos de macrófagos alveolares de cerdos infectados con la cepa Iowa de PRRSV;
las figuras 12(A)-(C) son una serie de fotografías que muestran cultivos de macrófagos alveolares (SAM) de cerdos: no infectados (A), CPE en los infectados con ISU-12 (B) o IFA en los infectados con ISU-12 (C) (ver Experimento II más adelante);
las figuras 13 (A)-(D) son una serie de fotografía que muestran cultivos celulares PSP-36: sin infectar (A), CPE en los infectados con ISU-12 en 4 DPI (B), CPE en los infectados con ISU-12 en 5 DPI (C), y CPE en los infectados con ISU-984 en 5 DPI (un segundo virus aislado que representa cepas Iowa de PRRSV).
Las figuras 14 (A)-(D) son una serie de fotografías que muestran células PSP-36 infectadas por IFA n ISU-12: no infectadas (A), infectadas con ISI-12 en 2,5 DPI y con tinción de sueros covalescentes (B), infectadas con ISU-12 en 2,5 DPI y con tinción con anticuerpo policlonal anti-PRRSV (C) e infectadas con ISU-12 y con tinción con anticuerpo monoclonal (D).
La figura 15 es un perfil de proteina de ISU-12 propagada en la célula PSP-36 por determinación mediante radioinmunoprecipitación (RIP); las vías 1 y 2 son células PSP-36 con falsa infección e inmunoprecipitadas con sueros policlonales anti-PRRSV (1) y sueros covalescentes (2); las vías 3 y 4 son células PSP-36 infectadas por virus e inmunoprecipitadas con sueros policlonales anti-PRRSV (3) y sueros covalescentes (4).
La figura 16 es un diagrama de flujo que muestra el proceso en general para la construcción de una biblioteca cDNA lambda de una cepa de un agente infeccioso (ISU-12) que provoca PRRS;
la figura 17 es un diagrama de flujo que muestra el procedimiento en general para la identificación de clones de cDNA auténticos del agente infeccioso (ISU-12) asociado con la cepa Iowa de PRRSV por hibridización diferencial;
la figura 18 (A)-(C) muestra los clones cDNA lambda utilizados para obtener la secuencia de nucleótidos de terminal 3' de ISU-12 (C), mRNAs subgenómicos (B) y cuadros de lectura abierta (ORFs) en la secuencia resultante (A);
las zonas secuenciales en los clones de cDNA están representadas de forma sólida, tal como se indicaba por las barras macizas, y las zonas no secuenciadas se han mostrado en sombreado (C). La L recuadrada indicada por la secuencia líder en los mRNA y (A)n indican la cola de poli (A) en el extremo 3' del genoma (B);
la figura 19 muestra la secuencia determinal 3' de 1938-pb del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV;
la figura 20 muestra la secuencia de aminoácido deducida de PRRSV ISU-12 que se muestra más adelante de la secuencia de nucleótido;
la figura 21 efectúa la comparación de las secuencias de nucleótidos del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV (ISU-12) y del virus de Lelystad con respecto al cuadro de lectura abierta-5 (ORF-5);
la figura 22 efectúa la comparación de las secuencias de nucleótidos del ORF-6 del virus ISU-12 con ORF-6 del virus Lelystad;
la figura 23 efectúa la comparación de las secuencias de nucleótidos de ORF-7 del virus ISU-12 y ORF-7 del virus Lelystad;
la figura 24 compara las secuencias de nucleótidos 3'-sin traslación del virus ISU-12 y del virus Lelystad;
la figura 25 muestra homogenados de células de huevos Trichoplusian no infectadas (HI-FIVE^{TM}, Invitrogen, San Diego, California);
la figura 26 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen ISU-12 ORF-6 que muestra efecto citopático;
la figura 27 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen ISU-12 ORF-7, mostrando también efecto citopático;
la figura 28 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen ISU-12 ORF-6 con tinción con antisuero de cerdo pasando a ISU-12, seguido de tinción con IgG anti-cerdo conjugado de fluoresceína en el que las células del insectos producen una proteína recombinante codificada por el gen ISU-12
ORF-6;
la figura 29 muestra células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante que contiene el gen ISU-12 ORF-7 con tinción de antisuero de cerdo pasando a ISU-12, seguido de tinción con IgG anticerdo conjugado de fluoresceína, en el que las células de los insectos producen proteína recombinante codificada por el gen ISU-12 ORF-7;
\newpage
la figura 30 muestra los resultados de amplificación PCR de ORF-6 (vía M), y ORF-7 (vía NP) utilizando cebadores específicos de ISU-12.
la figura 31 muestra los resultados de expresión del vector de transferencia de baculovirus recombinante pVL1393, que contiene ORF-5 (vía E), ORF-6 (vía M) o ORF-7 (vía NP) del genoma de ISU-12, después del fraccionamiento del DNA plásmido con enzimas de restricción BamHI y EcoRI; la vía SM contiene estándares de peso molecular;
la figura 32 muestra una transferencia Northern de ISU-12 mRNA;
las figuras 33A y 33B muestran transferencias Northern de mRNA tomadas de otros aislados de la cepa Iowa de PRRSV (ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927); y
la figura 34 es un gráfico de barras de las calificaciones de lesiones de pulmón graves, en promedio, (porcentaje de pulmón afectado) a los grupos de cerdos de tres semanas, seronegativos a PRRSV, libres de patógenos específicos (SPF) con la administración de una realización de la presente vacuna por vía intranasal (IN) o intramuscular (IM), y un grupo de cerdos de contros (NV/CHALL).
Descripción detallada de las realizaciones preferentes
En la presente invención una "enfermedad reproductiva y respiratoria porcina" se refiere a las enfermedades PRRS, PNP y EMCV descritas anteriormente, la enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV, y otras variantes íntimamente relacionadas de estas enfermedades que han aparecido y que aparecerán en el futuro.
Una vacuna "protege a un cerdo contra una enfermedad provocada por un virus de la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina" si, después de la administración de la vacuna a un cerdo no afectado, no aparecen lesiones en el pulmón o síntomas de la enfermedad o éstos no son tan severos como en cerdos infectados sin protección, y si después de la administración de la vacuna a un cerdo afectado las lesiones en el pulmón o síntomas de la enfermedad son eliminados o no son tan severos como en cerdos infectados sin protección. Un cerdo no afectado es un cerdo que o bien no ha sido expuesto a un agente infeccioso de enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, o que ha sido expuesto a un agente infeccioso de enfermedad respiratoria y reproductiva porcina pero que no muestra síntomas de la enfermedad. Un cerdo afectado es un cerdo que muestra síntomas de la enfermedad. Los síntomas de la enfermedad respiratoria y reproductiva porcina se pueden cuantificar o calificar (por ejemplo, temperatura/fiebre, lesiones pulmonares [porcentaje de tejidos pulmonares afectados]) o pueden ser semicuantificados (por ejemplo, gravedad de la enfermedad respiratoria [se explica en detalle más adelante]).
Un "virus reproductivo y respiratorio porcino" provoca una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina, tal como se ha descrito en lo anterior.
El agente que provoca la nueva y más virulenta forma de PRRS ha sido designado cepa "Iowa" de PRRSV. La enfermedad provocada por algunos aislados de la cepa "Iowa" del virus PRRS presenta síntomas similares a los de otras enfermedades respiratorias y reproductivas porcinas pero no más graves. Las señales clínicas pueden incluir estado letárgico, inconvenientes respiratorios, "latidos rápidos" fiebre, pelo encrespado, bostezos, toses, edema de ojos y ocasionalmente conjuntivitis. Las lesiones pueden comprender las lesiones grandes y/o microscópicas de los pulmones y miocarditis. El agente infeccioso puede ser un virus único o puede estar combinado con uno o varios agentes infecciosos adicionales (por ejemplo, otros virus o bacterias). Además, se han encontrado también formas menos virulentas y no virulentas de la cepa Iowa que pueden provocar un subconjunto de los síntomas anteriores o pueden no provocar síntomas en absoluto pero que, no obstante, pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para conseguir protección contra enfermedades respiratorias y reproductivas porcinas.
Las lesiones histológicas en las diferentes enfermedades porcinas son diferentes. La Tabla I que se adjunta a continuación efectúa la comparación de las observaciones fisiológicas y patológicas de las lesiones asociadas a una serie de enfermedades provocadas por virus porcinos:
TABLA I
1
en las que "PRRS (p)" representa la patología publicada del virus PRRS, "PRRS (o)" representa la patología del virus PRRS observada por los presentes Inventores, "SIV" representa el virus de gripe A de cerdos, "PRCV" representa coronavirus respiratorio porcino, "PPMV" representa paramixovirus porcino, "Iowa" se refiere a la nueva cepa de PRRSV descubierta por los presentes inventores, "Tipo II" se refiere a pneumocitos de Tipo II (que proliferan en cerdos infectados), "Inter." se refiere a intersticial, "Necrosis de vías aéreas" se refiere a necrosis en las vías aéreas terminales, y los símbolos (-) y (+) hasta (++++) se refiere a la escala comparativa de gravedad del modo siguiente:
(-)
: negativo (no observado)
(+)
: suave (justamente por encima del límite de observación)
(++)
: moderado
(+++)
: severo
(++++)
: muy severo
La cepa Iowa de PRRSV ha sido identificada por los presentes inventores en el medio oeste de Estados Unidos, en asociación con PRRS. No es todavía claro si la enfermedad asociada con la cepa Iowa de PRRSV, tal como se ha encontrado de manera natural, es debida a un virus único, o a una combinación de un virus con uno (o varios) agentes infecciosos adicionales. No obstante, muestras purificadas en placas de la cepa de Iowa de PRRSV muestran ser un solo virus único. Por lo tanto el término "cepa Iowa de PRRSV" se refiere o bien a un virus único purificado en placa o a un homogeneizado de tejidos procedente de un animal infectado, que puede contener una combinación de un virus con uno (o varios) agentes infecciosos adicionales, y un cerdo infectado con la cepa Iowa de PRRSV muestra uno o varios de los síntomas característicos de la enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV, tal como se ha descrito en lo anterior.
Evidencias recientes indican que la cepa Iowa de PRRSV difiere del agente infeccioso que provoca PRRS convencional. Por ejemplo, las lesiones observadas en cerdos infectados muestran síntomas de la enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV más severas que las lesiones observadas en cerdos infectados por un virus convencional PRRS del tipo anteriormente descrito, actuando solo, y los cerdos afectados de la enfermedad provocada por la cepa Iowa de PRRSV son también seronegativos para gripe, incluyendo virus asociados con PNP.
Haciendo referencia a continuación a las figuras 1-4, se facilitan diagramas de flujo de procesos destinados a la preparación de diferentes tipos de vacunas comprendidas dentro de la presente invención. Los diagramas de flujo de las figuras 1-4 se facilitan como métodos a título de ejemplo para la producción de las presentes vacunas y no están destinados a limitar en modo alguno la presente invención.
La primera etapa de cada procedimiento detallado en las figuras 1-4 consiste en identificar una línea celular susceptible de infección con un virus respiratorio o reproductivo porcino o un agente infeccioso. (Para simplificar la explicación referente a la preparación de la vacuna, el término "virus" significa virus y/o otro agente infeccioso asociado con una enfermedad respiratoria y reproductiva porcina). Se prepara, a continuación, un material de células maestras (MCS) de la célula susceptible hospedante. Las células susceptibles hospedantes continúan siendo pasadas más allá
de MCS. El material de célula de trabajo (WCS) es preparado a partir de pasos de células entre MCS y MCS+n.
Un virus de sembrado maestro es propagado en la línea celular hospedante susceptible entre MCS y MCS+n, preferentemente sobre WCS. El virus en bruto es aislado por métodos conocidos en esta técnica a partir de muestras apropiadas de tejidos, preferentemente homogeneizados, tomados de cerdos infectados que muestran síntomas de enfermedad correspondientes a los provocados por los virus de interés. Una célula hospedante adecuada, preferentemente una muestra del WCS, es infectada con el virus en bruto y luego es cultivada. A continuación, el virus de la vacuna es aislado y purificado en placa a partir de la célula hospedante cultivada, infectada, por métodos conocidos en esta técnica. Preferentemente, el virus a utilizar para preparar la vacuna es purificado en placa tres veces.
A continuación, se prepara un virus de sembrado maestro (MSV) a partir del virus purificado-placa por métodos conocidos en esta técnica. El MSV(X) es pasado a continuación en WCS, como mínimo, cuatro veces a través de MSV(X+1), MSV(X+2), MSV(X+3) y MSV(X+4) pasos de virus. El MSV (X+4) es considerado como el virus de sembrado funcional. Preferentemente, el paso de virus a utilizar en los estudios con los cerdos y el producto de vacuna de la presente invención es MSV(X+5), que es el producto de la quinta pasada.
Conjuntamente con el material de células de trabajo, el virus de sembrado de trabajo es cultivado por métodos conocidos en cantidades suficientes para preparar un prototipo de vacuna, preferentemente MSV(X+5). Las vacunas prototipo de la invención pueden ser de cualquier tipo adecuado para su utilización en el sector de la medicina veterinaria. Se incluyen entre los tipos adecuados una vacuna modificada viva o atenuada (figura 1), una vacuna muerta o inactivada (figura 2), una vacuna subunidad (figura 3), una vacuna genéticamente diseñada (figura 4), y otros tipos de vacunas reconocidos en la técnica de vacunas veterinarias. Una vacuna muerta puede ser transformada en inactiva a través del tratamiento químico o de calor, etc. de manera conocida por los técnicos ordinarios en la materia.
En los procedimientos indicados en cada una de las figuras 1-4, después de la preparación de una vacuna prototipo, se llevan a cabo modelos de ataque y ensayos clínicos en cerdos por métodos conocidos en esta técnica. Por ejemplo, antes de llevar a cabo estudios reales de vacuna/ataque, la enfermedad a prevenir y/o tratar se debe definir en términos de sus síntomas, resultados de ensayo clínico, condiciones etc. Tal como se ha descrito en lo anterior, el agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV ha sido identificado en términos de sus síntomas y condiciones. El análisis clínico del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV se describe en los siguientes ejemplos.
Después de que la enfermedad se ha definido y caracterizado del modo suficiente, se puede administrar una vacuna prototipo a un cerdo exponiendo a continuación el cerdo al virus o al agente infeccioso que provoca la enfermedad. Esto es conocido en la técnica como "infección" o "ataque" ("challenging") del cerdo y de su sistema inmunológico. Después de observar la respuesta del cerdo objeto del ataque a la exposición al virus o agente infeccioso y después de analizar la capacidad de la vacuna prototipo para proteger el cerdo, se llevan a cabo a continuación estudios de eficacia por métodos conocidos en esta técnica. A continuación se desarrolla un ensayo de potencia en un proceso separado por métodos conocidos en esta técnica y se producen a continuación ensayos en serie previos a la licencia.
En la preparación de una vacuna viva modificada, tal como se esquematiza en la figura 1, una vez se ha preparado un prototipo de vacuna se optimizan, en primer lugar, las condiciones de crecimiento de las células y la producción del virus y, a continuación, se prepara un esquema de producción por métodos conocidos en la técnica. Una vez que el esquema de producción ha sido ya preparado, se preparan a continuación pruebas en serie previas a la licencia por métodos conocidos en esta técnica. Las pruebas en serie previas a la licencia se refieren a producción en gran escala de una vacuna prototipo prometedora que muestra la capacidad de producir ensayos en serie con normas continuadas. Un enfoque para la preparación de una vacuna viva prototipo consiste en someter las células infectadas con virus (preferentemente, células infectadas con virus de sembrado maestro) a uno o varios ciclos de congelación y descongelación para conseguir la lisis de las células. El material de cultivo de células infectado congelado y descongelado puede ser liofilizado (secado en congelación) para aumentar la capacidad de conservación a efectos de almacenamiento. Después de la rehidratación subsiguiente, el material es utilizado como vacuna viva.
El procedimiento para la preparación de ensayos en serie previos a la licencia para una vacuna inactivada (figura 2) es similar al utilizado para la preparación de una vacuna viva modificada, con una modificación principal. Después de optimización de las condiciones de crecimiento celular y del protocolo de producción de virus se debe optimizar un protocolo de inactivación del virus antes de la preparación de un esquema de producción adecuado. Los protocolos de inactivación de virus y su optimización son conocidos en general por los técnicos en la materia y pueden variar de forma conocida o predictible dependiendo de un virus particular objeto de estudio.
La preparación de una vacuna subunidad (figura 3) difiere de la preparación de una vacuna viva modificada o de una vacuna inactivada. Antes de la preparación de la vacuna prototipo, los componentes protectores o antigénicos del virus de la vacuna deben ser identificados. Estos componentes protectores o antigénicos incluyen ciertos segmentos o fragmentos de aminoácidos de las proteínas del recubrimiento viral que producen una respuesta protectora o inmunológica, especialmente potente, en cerdos (que tienen preferentemente un mínimo de 5 aminoácidos de longitud, de manera especialmente preferente un mínimo de 10 aminoácidos de longitud); proteínas solas o múltiples del recubrimiento viral, oligómeros de las mismas, y asociaciones de orden elevado de las proteínas del recubrimiento viral que forman subestructuras de virus o partes o unidades identificables de dichas subestructuras; oligoglicósidos, glicolípidos o glicoproteínas presentes en la superficie del virus o cerca de la misma o subestructuras virales, tales como el núcleocápsido; lipoproteínas o grupos de lípidos asociados con el virus, etc. Estos componentes son identificados por métodos conocidos en la técnica. Una vez identificadas, las partes protectoras o antigénicas del virus (la "subunidad") son purificadas a continuación y/o clonadas por métodos conocidos en esta técnica.
La preparación de análisis en serie previos a la licencia para una vacuna subunidad (figura 3) es similar al método utilizado para una vacuna inactivada (figura 2), con algunas modificaciones. Por ejemplo, si la subunidad está siendo producida por técnicas genéticas recombinantes, se puede optimizar la expresión de la subunidad clonada por métodos conocidos por los técnicos en la materia (ver, por ejemplo, las partes relevantes de Maniatis y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", ("Clonado molecular: Manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, Massachusetts). Por otra parte, si la subunidad que está siendo utilizada representa una característica estructural intacta del virus, tal como una proteína completa del recubrimiento, se debe optimizar a continuación el procedimiento para su aislamiento del virus. En cualquiera de los casos, después de la optimización del protocolo de inactivación, el protocolo de purificación de la subunidad puede ser optimizado antes de la preparación del esquema de producción.
Las vacunas genéticamente diseñadas (figura 4) empiezan con una modificación del procedimiento general utilizado para la preparación de las otras vacunas. Después de purificación en placa, el virus de tipo salvaje debe ser aislado de un homogeneizado adecuado de tejidos por métodos conocidos en la técnica, preferentemente, por métodos de cultivo de células convencionales utilizando PSP-36 o células macrófago como hospedantes.
El RNA es extraído del virus o agente infeccioso biológicamente puro por métodos conocidos en esta técnica, preferentemente por el método de la guanidina isotiocianato utilizando un equipo de aislamiento de RNA de tipo comercial (por ejemplo, el equipo que se puede conseguir de la firma Stratagene, La Jolla, California), y purificado por métodos conocidos en la técnica, preferentemente por ultracentrifugación en un gradiente de CsCl. El RNA puede ser purificado de modo adicional o enriquecido por cromatografía en columna de oligo (dT)- celulosa.
El genoma viral es clonado a continuación en un hospedante adecuado por métodos conocidos en esta técnica (ver Maniatis y otros, citados anteriormente y el genoma del virus es analizado a continuación para determinar regiones esenciales del genoma para la producción de las partes antigénicas del virus.
Después de ello el proceso es en general el mismo que para vacunas vivas modificadas, una vacuna inactivada o una vacuna subunidad.
La presente vacuna protege a los cerdos contra un virus o agente infeccioso que provoca enfermedad reproductiva y respiratoria porcina. Preferentemente, la presente vacuna protege a los cerdos contra el agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV. No obstante, la presente vacuna se espera también que proteja a los cerdos contra infección por exposición a variantes íntimamente relacionadas del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV.
Hay relativamente pocos virus que se puedan llevar a la producción de vacunas de virus vivos. Las ventajas de las vacunas de virus vivos son que todas las respuestas inmunes posibles son activadas en el receptor de la vacuna, incluyendo respuestas sistémica, local, humoral y respuesta inmune mediada por células. Las desventajas de las vacunas de virus vivos consisten en el potencial de contaminación con agentes circunstanciales vivos, tales como virus SV40 y virus de diarrea viral bovina, contaminante habitual del suero fetal bovino. Este riesgo, además del riesgo de que el virus pueda revertir a estado virulento en la práctica o que pueda no atenuarse con respecto al feto, animales jóvenes y otras especies, puede superar las ventajas de una vacuna viva.
Las vacunas de virus inactivadas pueden ser preparadas por tratamiento de los virus con agentes inactivadores tales como formalina o disolventes hidrofóbicos, ácido, etc., por irradiación con luz ultravioleta o rayos X, por calentamiento, etc. La inactivación es conducida de manera que se conoce en esta técnica. Un virus se considera inactivado si es incapaz de infectar una célula susceptible de infección. Por ejemplo, en inactivación química una muestra de virus adecuado o muestra de suero que contiene el virus es tratada durante un período de tiempo suficientemente prolongado con una cantidad o concentración suficiente de agente inactivante en una muestra suficiente o muestra de suero que contiene el virus, siendo tratadas durante un período de tiempo suficiente de tiempo con una cantidad o concentración suficiente de agente inactivante a una temperatura suficientemente elevada (o baja, dependiendo del agente de inactivación) o pH para inactivar el virus. La inactivación por calentamiento se lleva a cabo a una temperatura y durante un período de tiempo suficiente para inactivar el virus. La inactivación por irradiación es llevada a cabo utilizando una longitud de onda, de luz u otro tipo de energía durante un período de tiempo suficiente para inactivar el virus. Entre los ejemplos de vacunas inactivadas para utilización humana se incluyen vacunas de la gripe, de poliomielitis, de rabia y de hepatitis tipo B. Un ejemplo satisfactorio y eficaz de una vacuna inactivada para su utilización en cerdos es la vacuna de parvovirus porcino.
Se preparan vacunas de virus subunidad a partir de subunidades de virus semipurificadas por los métodos escritos anteriormente en la explicación de la figura 3. Por ejemplo, se han preparado hemaglutinina aislada de virus de gripe y antígenos de superficie de neuraminidasa a partir de virus de gripe y se ha demostrado que son menos tóxicos que el virus en su conjunto. De manera alternativa, se pueden preparar vacunas subunidad a partir de subunidades altamente purificadas del virus. Un ejemplo, en humanos es el antígeno de superficie de 22-nm de virus de hepatitis B humana. Se conocen subunidades de virus de herpes simplex humana y muchos otros ejemplos de vacunas subunidad para su utilización en humanos.
Se pueden encontrar vacunas de virus atenuadas en la naturaleza y pueden tener deleciones de genes que se presentan de manera natural o alternativamente pueden ser preparadas por una serie de métodos conocidos, tales como paso en serie en cultivos de células o cultivos de tejidos. Los virus pueden ser también atenuados por deleciones de genes o por mutaciones de genes.
Se producen vacunas diseñadas genéticamente por técnicas conocidas por los técnicos en la materia. Estas técnicas incluyen las que utilizan DNA recombinante y las que utilizan virus vivos. Por ejemplo, ciertos genes de virus pueden ser identificados con código para proteínas responsable para inducción de una respuesta inmune o protectora más potente en cerdos. Estos genes identificados pueden ser clonados en vectores de explosión de proteína, tal como el vector baculovirus, y se pueden utilizar para infectar células hospedantes apropiadas (ver, por ejemplo, O'Reilly y otros, "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual", ("Vectores de expresión de baculovirus: manual de laboratorio" Freeman & Co. (1992)). Las células hospedantes son cultivadas, expresando de esta manera las proteínas de vacuna deseadas que pueden ser purificadas en una extensión deseada y luego utilizadas para proteger a los cerdos contra la enfermedad respiratoria y reproductiva.
Las proteínas genéticamente diseñadas se pueden expresar en células de insectos, células de levadura o células de mamíferos. Las proteínas diseñadas genéticamente, que se pueden purificar y/o aislar con métodos convencionales, pueden ser inoculadas directamente a animales para conferir protección contra enfermedades reproductivas y respiratorias porcinas. Se utilizan proteínas de la envolvente procedentes de virus de enfermedad reproductiva y respiratoria porcina en una vacuna para inducir anticuerpos neutralizantes. Se utilizan nucleoproteínas procedentes de virus de enfermedad respiratoria y reproductiva porcina en una vacuna para inducir inmunidad celular.
Preferentemente, la presente invención transforma una línea celular de insectos (HI-FIVE) con un vector de transferencia que contiene ácidos polinucléicos obtenidos de la cepa Iowa de PRRSV. Preferentemente, el presente vector de transferencia comprende DNA de baculovirus linealizado y un plásmido que contiene ácidos polinucléicos obtenidos a partir de la cepa Iowa de PRRSV. La línea celular hospedante puede ser co-transfectada con el DNA del baculovirus linealizado y un plásmido, de manera que se consigue un baculovirus recombinante. De manera especialmente preferente, el presente ácido polinucléico codifica una o varias proteínas de la cepa Iowa de PRRSV.
De manera alternativa, RNA o DNA de virus infeccioso de enfermedad respiratoria y reproductiva porcina codificando una o varias proteínas y/o nucleoproteínas del envolvente puede ser insertado en vectores vivos, tal como un virus de viruela o un adenovirus, y se puede utilizar como vacuna.
Por lo tanto, la presente invención se refiere además a un ácido polinucléico aislado de una parte del genoma de virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente un ácido polinucléico aislado de una parte del genoma de la cepa Iowa de PRRSV. El término "ácido polinucléico" se refiere a RNA o DNA, así como RNA y cDNA correspondientes o complementarios del RNA o del DNA procedentes del agente infeccioso. El presente ácido polinucléico tiene actividad como medio para la producción de la presente vacuna, como medio para rastrear o identificar animales infectados y como medio para identificar virus relacionados.
En una realización de la presente invención, el ácido polinucléico codifica una o varias proteínas de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente una o ambas proteínas: proteína de membrana viral (envolvente) y proteína de cápsido (núcleoproteina). De manera especialmente preferente, el presente ácido polinucléico es tomado de un fragmento de 2 kb del extremo 3' del genoma y codifica una o varias de las proteínas del envolvente codificadas por ORF-5 y ORF-6 y/o la nucleoproteína codificada por ORF-7 del genoma de la cepa Iowa de PRRSV. De manera más preferente, el ácido polinucléico es aislado del genoma de un agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV; por ejemplo, el agente descrito en los experimentos I-III que se explican a continuación (ISU-12) y es seleccionado a partir del grupo que comprende ORF 5 (SEQ ID NO:10), ORF 6 (SEQ ID NO:12), ORF 7 (SEQ ID NO:14) y la secuencia terminal 3' de 1938-pb del genoma ISU-12 (SEQ ID NO:8).
En el contexto de la presente invención las proteínas o péptidos codificados por RNA y/o DNA procedentes de un virus se consideran "inmunológicamente equivalentes" si el ácido polinucléico tiene 90% o más de homología con ácido polinucléico que codifica la proteína o péptido inmunogénico. El término "homología" en esta invención se refiere al porcentaje de secuencias de nucleótido o de aminoácido idénticas entre dos o más virus de agentes infecciosos. De acuerdo con ello, otro aspecto de la presente invención comprende un ácido polinucléico aislado que es como mínimo 90% homólogo con respecto a un ácido polinucléico obtenido a partir del genoma de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente un ácido polinucléico obtenido a partir del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV.
Se pueden utilizar segmentos relativamente cortos de ácido polinucléico (de unos 20 pb o más) en el genoma de un virus, para rastrear o identificar animales infectados y/o para identificar virus relacionados por métodos que se describen y que son conocidos por los técnicos ordinarios en esta técnica. De acuerdo con ello, otro aspecto de la presente invención comprende un ácido polinucléico aislado (y si se desea purificado) que consiste esencialmente en fragmentos aislados obtenidos a partir de una parte del genoma de un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente un ácido polinucléico obtenido a partir de una parte del genoma del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV, que tienen un mínimo de 20 nucleótidos de longitud, preferentemente de 20 a 100 nucleótidos de longitud. De modo especialmente preferente, los presentes fragmentos de ácido polinucléico aislados son obtenidos a partir de la secuencia del terminal -3'- de 1938 pb del genoma ISU-12 (SEQ ID NO:8), y de manera más preferente se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7.
Los presentes fragmentos de ácido polinucléico aislados pueden ser obtenidos por digestión del cDNA correspondiente (complementario) de los ácidos polinucléicos virales con una o más enzimas de restricción apropiadas o se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de polinucleótidos automático disponible comercialmente.
En otra realización de la presente invención uno o varios péptidos antigénicos de un virus que provoca una enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente el péptido o péptidos antigénicos procedentes del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV. Tal como se ha descrito anteriormente, el presente ácido polinucléico codifica una parte antigénica de una proteína procedente de un virus que provoca una enfermedad respiratoria y reproductiva, preferentemente del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV, con una longitud mínima de 5 aminoácidos, particularmente preferente un mínimo de 10 aminoácidos de longitud. Los métodos para la determinación de la parte antigénica de una proteína son conocidos por los técnicos ordinarios en este sector.
La presente invención se refiere también a una proteína codificada por una o varias de las ORF de la cepa Iowa de PRRSV. Preferentemente la proteína es codificada por una secuencia de ácido polinucléico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:16. Las presentes proteínas y péptidos antigénicos son útiles en pruebas serológicas para el rastreo de cerdos en cuanto a la exposición a PRRSV, particularmente a la cepa Iowa de PRRSV.
La presente invención se refiere además a una muestra biológicamente pura de un virus que provoca enfermedad reproductiva y respiratoria porcina, caracterizándose por los siguientes síntomas y señales clínicas: estado letárgico, alteraciones respiratorias, espiración forzada, fiebre, pelo encrespado, bostezos, tos, edema de ojo y ocasionalmente conjuntivitis. La presente muestra biológicamente pura de un virus se puede caracterizar además por el hecho de que provoca una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina que puede incluir las siguientes lesiones histológicas: lesiones de pulmón grandes y/o microscópicas, neumocitos de tipo II, miocarditis, encefalitis, formación de exodados alveolares y formación de sincitia. La expresión "biológicamente pura" se refiere a una muestra de un virus o agente infeccioso en el que toda la progenie es derivada de un solo origen parental. Usualmente una muestra "biológicamente pura" se consigue por una purificación de placa 3 x en un cultivo celular. En particular, el presente virus o agente infeccioso biológicamente puro es la cepa Iowa de síndrome respiratorio y reproductivo porcino, de la que se han depositado muestras según los términos del Tratado de Budapest en el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., en 28 de octubre de 1992 con los números de acceso VR 2385 y VR 2386.
La cepa Iowa de PRRSV se puede caracterizar también por transferencias Northern de su mRNA. Por ejemplo, la cepa Iowa de PRRSV puede contener 7 ó 9 mRNA que pueden tener también deleciones en los mismos. En particular, tal como se describirá en los experimentos que se explican a continuación, los mRNA de la cepa Iowa de PRRSV pueden contener hasta cuatro deleciones.
La presente invención se refiere además a un compuesto para la protección de cerdos contra infecciones virales, comprendiendo una cantidad efectiva de la presente vacuna para aumentar la respuesta inmunológica en un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina con un portador fisiológicamente aceptable.
Es cantidad efectiva de la presente vacuna aquella en la que se obtiene suficiente respuesta inmunológica a la vacuna para proteger a un cerdo expuesto a un virus que provoca enfermedad respiratoria y reproductiva porcina o enfermedades relacionadas. Preferentemente el cerdo queda protegido en una medida en la que se observan significativamente reducidos de uno a todos los síntomas o efectos fisiológicos adversos (por ejemplo, lesiones de pulmón) de la enfermedad que se desea prevenir.
La composición puede ser administrada en una dosis única o en dosis repetidas. Las dosificaciones pueden contener, por ejemplo, de 1 a 1000 microgramos de antígeno basado en virus (vacuna), pero no deberían contener una cantidad de antígeno basado en virus suficiente para que resultara en una reacción adversa o en síntomas fisiológicos adversos de infección. Se conocen métodos en esta técnica para la determinación de las dosis adecuadas del agente antigénico activo.
La composición que contiene la presente vacuna puede ser administrada conjuntamente con un coadyuvante. Un coadyuvante es una sustancia que incrementa la respuesta inmunológica a la presente vacuna cuando se combina con la misma. El coadyuvante puede ser administrado en el mismo momento y en el mismo lugar que la vacuna o en un momento distinto, por ejemplo como refuerzo. Los coadyuvantes también se pueden administrar ventajosamente al animal en una manera o en un lugar distintos con respecto a la manera o lugar en los que se administra la vacuna. Los coadyuvantes incluyen hidróxido de aluminio, sulfato de potasio y aluminio, enterotoxina labile o estable térmicamente aislada de Escherichia coli, toxina de cólera o su subunidad B, toxina de difteria, toxina de tétanos, toxina de pertusis, coadyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund y similares. Los coadyuvantes basados en toxinas, tales como toxina de difteria, toxina de tétanos y toxina de pertusis, pueden ser inactivados antes de su utilización, por ejemplo, mediante tratamiento mediante formaldehído.
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La presente invención da a conocer un método para la protección de cerdos contra infecciones de virus que provocan enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de una vacuna que aumenta la respuesta inmunológica contra este virus en un cerdo que requiere protección contra infección por dicho virus. Por el término "protección de un cerdo contra la infección" producida por un virus o agente infeccioso respiratorio y reproductivo porcino, se debe comprender que después de la administración de la presente vacuna a un cerdo, éste muestra síntomas reducidos (menos severos) o no presenta síntomas clínicos (tales como fiebre) asociados con la enfermedad correspondiente, con respecto a cerdos de control (infectados). Los síntomas clínicos pueden ser cuantificados (por ejemplo, fiebre, contagio de anticuerpos y/o lesiones pulmonares) o semicuantificado (por ejemplo, gravedad de los problemas respiratorios).
Se ha desarrollado por la presente invención un sistema para la medición de problemas respiratorios en los cerdos afectados. El sistema de valoración respiratoria clínica evalúa los inconvenientes respiratorios de los cerdos afectados según la escala siguiente:
0 =
leyendas sin enfermedad; respiración normal
1 =
disnea y polipnea suaves cuando los cerdos son estresados (obligados a respirar en volúmenes mayores y/o según un ritmo acelerado)
2 =
disnea y polipnea suaves cuando los cerdos se encuentran en reposo
3 =
disnea y polipnea moderadas cuando los cerdos se encuentran estresados
4 =
disnea y polipnea moderadas cuando los cerdos se encuentran en reposo
5 =
disnea y polipnea severas cuando los cerdos se encuentran estresados
6 =
disnea y polipnea severas cuando los cerdos se encuentran en reposo.
En el presente sistema de evaluación respiratoria clínica una calificación de "0" es normal e indica que el cerdo no está afectado por enfermedad respiratoria y reproductiva porcina. Una calificación de "3" indica enfermedad respiratoria moderada y una calificación de "6" indica enfermedad respiratoria muy severa. Se puede considerar efectiva la cantidad de la presente vacuna o composición si un grupo de cerdos objeto de ataque que reciben la vacuna o composición muestran una valoración respiratoria clínica promedio más baja que un grupo de cerdos con idéntica forma de ataque que no reciben la vacuna o composición. (Se considera un cerdo "atacado" cuando está expuesto a una concentración de un agente infeccioso suficiente para provocar enfermedad en un animal no
vacunado).
Preferentemente la siguiente composición de vacuna es administrada directamente a un cerdo que no se ha expuesto todavía a un virus que provoca una enfermedad reproductiva o respiratoria. La presente vacuna puede ser administrada oral o parenteralmente. Entre los ejemplos de rutas parenterales de administración se incluyen las rutas de administración intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea e intranasal.
Cuando se administra en forma de solución la presente vacuna puede ser preparada en forma de una solución acuosa, un jarabe, un elixir o un tinte. Estas formulaciones son conocidas en la técnica y son preparadas por disolución del antígeno u otros aditivos. apropiados en los sistemas disolventes apropiados. Estos disolventes incluyen agua, solución salina, etanol, etilenglicol, glicerol, fluido A1, etc. Los aditivos adecuados conocidos en esta técnica comprenden tintes certificados, sabores, edulcorantes y conservantes antimicrobianos, tales como timerosal (etilmercuriotiosalicilato sódico). Estas soluciones pueden ser estabilizadas, por ejemplo, por adición de una gelatina parcialmente hidrolizada, sorbitol o un medio de cultivo celular, y se pueden tamponar por métodos conocidos en la técnica utilizando reactivos asimismo conocidos, tales como bifosfato sódico, bifosfato ácido de sodio, bifosfato de potasio y/o bifosfato ácido de potasio.
Las formulaciones líquidas pueden incluir también suspensiones y emulsiones. La preparación de suspensiones, por ejemplo utilizando un molino coloidal y emulsiones, por ejemplo utilizando un homogeneizador, son conocidas en esta técnica.
Las formas de dosificación parenteral diseñadas para inyección en sistemas de fluidos corporales requieren una isotonicidad apropiada y tamponado por pH a los niveles correspondientes del cuerpo porcino. Las formulaciones parenterales deben ser también esterilizadas antes de su utilización.
La isotonicidad puede ser ajustada con cloruro sódico y otras sales según sea necesario. Otros disolventes, tales como etanol o propilén glicol, pueden ser utilizados para incrementar la solubilidad de ingredientes en la composición y la estabilidad de la solución. Otros aditivos que pueden ser utilizados en la presente formulación comprenden dextrosa, antioxidantes convencionales y agentes quelatantes convencionales, tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA).
La presente invención se refiere también a un método para la producción de la presente vacuna que comprende las siguientes etapas:
(A)
recoger una muestra suficientemente grande de un virus según la reivindicación 1 y
(B)
tratar el virus de una manera seleccionada entre el grupo que consiste en: (i) purificación del virus en placas, (ii) calentamiento del virus con la temperatura y tiempo suficientes para desactivarlo, (iii) exponer o mezclar el virus con una cantidad de un agente químico de inactivación suficiente para inactivar el virus, (iv) descomponer el virus en sus subunidades correspondientes y aislar como mínimo una de las subunidades, y (v) sintetizar o aislar un ácido polinucleico que codifica una proteína de superficie del virus, infectando una célula hospedante adecuada con el ácido polinucleico, cultivando la célula hospedante y aislando la proteína de superficie con respecto al cultivo.
Preferentemente, el virus es recogido de un medio de cultivo por las siguientes etapas: (i) precipitación de las células hospedantes infectadas, (ii) lisis de las células precipitadas, y (iii) centrifugación del virus antes de la fase de tratamiento subsiguiente. De manera especialmente preferente, las células hospedantes infectadas con el virus son cultivadas en un medio adecuado antes de su recogida.
Preferentemente, después del cultivo de células hospedantes infectadas, las células hospedantes infectadas son precipitadas por adición de una solución de un poli(etilenglicol)(PEG) utilizado convencionalmente al medio de cultivo, en una cantidad suficiente para precipitar las células infectadas. Las células infectadas precipitadas pueden ser purificadas adicionalmente por centrifugación. Las células precipitadas son sometidas a lisis por métodos conocidos por los técnicos en la materia. Preferentemente las células son sometidas a lisis por congelación y descongelación repetidas (tres ciclos de congelación y de descongelación es particularmente preferente). La lisis de las células precipitadas libera el virus, que a continuación puede ser recogido, preferentemente por centrifugación. El virus puede ser aislado y purificado por centrifugación en un gradiente CsCl, recuperando a continuación la banda apropiada, que contiene el virus, del gradiente CsCl.
Alternativamente, el cultivo de células infectadas puede ser sometido a congelación y descongelación para la lisis de las células. El material del cultivo de células congelado y descongelado puede ser utilizado directamente como vacuna viva. No obstante, de modo preferente, el material del cultivo de células congelado y descongelado es liofilizado (para almacenamiento) y a continuación rehidratado para su utilización como vacuna.
El medio de cultivo puede contener una solución salina tamponada, nutrientes esenciales y fuentes adecuadas de carbono y de nitrógeno reconocidas en la técnica, en concentraciones suficientes para permitir el crecimiento de células infectadas por virus. Los medios de cultivo adecuados incluyen medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio de Ham, medio 199, suero bovino fetal, suero fetal de vaca y otros medios equivalentes que soportan el crecimiento de células infectadas con el virus. El medio de cultivo puede ser suplementado con suero bovino fetal (hasta 10%)y/o L-glutamina (hasta 2 mM) u otros aditivos apropiados, tales como suplementos de crecimiento y/o antibióticos convencionales. Un medio preferente es DMEM.
Preferentemente, la presente vacuna es preparada a partir de un virus cultivado en una línea celular apropiada. La línea celular es preferentemente PSP-36 o una línea celular equivalente capaz de ser infectada con el virus y cultivada. Un ejemplo de una línea celular equivalente a PSP-36 es la línea celular PSP-36-SAH, que fue depositada según los términos del tratado de Budapest en la American Type Culture Collections, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, en 28 de Octubre de 1992, con el número de depósito CRL 11171. Otra línea celular equivalente es MA-104, que se puede disponer comercialmente de la firma Whittaker Bioproducts, Inc. (Walkersville, Maryland). Los resultados preliminares indican que el agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV puede ser cultivado en células porcinas de turbinato. Después de purificación en placas, el agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV produce las lesiones caracterizadas bajo el encabezamiento "Iowa" de la anterior tabla I y que se han mostrado en las figuras 5-8.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención hace referencia también a un método para el cultivo del virus de la presente invención, preferentemente en una línea celular seleccionada entre el grupo que consiste en PSP-36 y líneas celulares equivalentes capaces de ser infectadas con el virus y cultivadas. El método de cultivo de un virus o agente infeccioso de acuerdo con la presente invención comprende la infección de la línea celular PSP-36 o una línea celular equivalente capaz de ser infectada por un virus o agente infeccioso que provoca enfermedad reproductiva y respiratoria porcina y cultivando la línea celular infectada en un medio adecuado.
La línea celular MA-104 es obtenida a partir de células de riñón de mono y tiene parecido epitelial. Las células MA-104 forman una monocapa confluente en recipientes de cultivo que contienen medio esencial mínimo de Dulbecco y 10% de FBS (suero bovino fetal). Cuando la monocapa se ha formado las células son inoculadas con una muestra de tejidos homogeneizados al 10% tomados de un tejido apropiado (tal como tejidos de pulmón y/o corazón) en un cerdo infectado. Preferentemente se encuentran presentes antibióticos apropiados para permitir el crecimiento de virus y células hospedantes y para suprimir el crecimiento y/o viabilidad de células distintas de las células hospedantes (por ejemplo, bacterias o levadura).
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Tanto las células PSP-36 como MA-104 producen el crecimiento de algunos aislados de virus PRRS hasta elevadas concentraciones (más de 10^{7} TCID_{50}/ml). Las células PSP-36 y MA-104 producen también el crecimiento de agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV. Las células MA-104 son también capaces del crecimiento de rotavirus, poliovirus y otros virus.
Las células CL2621 se cree que son de origen no porcino y que tienen parecido epitelial siendo objeto de propiedad (Boehringer-Mannheim). Como contraste con las células PSP-36 y MA-104, algunas muestras del virus que provoca PRRS han sido cultivadas sin éxito en células CL2621 (Bautista y otros, American Association of Swine Practitioners Newsletter, 4:32, 1992).
Las características principales de CL2621 son que no es de origen de cerdo y que tiene similitud epitelial creciendo en medio MEM. No obstante, Benfield y otros (J.Vet. Diagn. Invest., 1992; 4:127-133) han informado que se utilizaron células CL2621 para propagar virus PRRS, pero las células MA-104 fueron utilizadas para controlar la propagación de virus de polio, deduciéndose por lo tanto que las células CL2621 no son las mismas que MA-104, y que la misma célula puede no propagar ambos virus.
El agente infeccioso asociado con la cepa Iowa de PRRSV no puede crecer de manera general en líneas celulares distintas a PSP-36, PSP-36-SAH y MKA-104. Tal como se ha descrito anteriormente, no obstante, se ha informado que algunos virus que provocan PRRS crecen tanto en CL2621 como en macrófagos primarios alveolares de cerdos, si bien algunas cepas de virus PRRS no crecen en células PSP-36, MA-104 o CL2621.
La presente vacuna puede ser utilizada para preparar anticuerpos que pueden proporcionar resistencia inmunológica a un paciente (en este caso un cerdo) expuesto a un virus o agente infeccioso. Anticuerpos comprendidos en la presente invención se unen inmunológicamente y de manera alternativa a (1) una vacuna que protege a un cerdo contra un virus o agente infeccioso que provoca una enfermedad respiratoria y reproductiva o (2) al virus respiratorio y reproductivo porcino o al propio agente infeccioso. Los presentes anticuerpos tienen asimismo utilidad como agente de diagnóstico para determinar si un cerdo ha sido expuesto a virus reproductivo y respiratorio o a un agente infeccioso, y en la preparación de la presente vacuna. El anticuerpo puede ser utilizado para preparar una columna de inmunoafinidad por métodos conocidos y la columna de inmunoafinidad puede ser utilizada para aislar el virus o agente infeccioso, o una proteína del mismo.
Para conseguir anticuerpos para dichas vacunas o virus se debe inmunizar un animal hospedante apropiado, tal como un ratón, conejo u otros animales utilizados para esta inoculación, con la proteína utilizada para preparar la vacuna. El animal hospedante es inmunizado a continuación (inyectado) con uno de los tipos de vacunas que se han descrito anteriormente, administrando opcionalmente un agente de incremento de inmunidad (coadyuvante) tal como los que se han descrito anteriormente. El animal hospedantes es preferentemente inmunizado a continuación de 1 a 5 veces, con ciertos intervalos de tiempo, preferentemente cada 1 a 4 semanas, más preferentemente cada dos semanas. Los animales hospedantes son sacrificados a continuación y se recoge su sangre. Se separan los sueros con técnicas conocidas del conjunto de la sangre recogida. Los sueros contienen anticuerpos con respecto a las vacunas. Los anticuerpos pueden ser también purificados por métodos conocidos para conseguir anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG).
La presente invención da a conocer también anticuerpos monoclonales para las presentes vacunas y/o virus. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por el método de Kohler y otros (Nature, vol. 256 (1975), páginas 495-497). Básicamente las células inmunes de una preparación de células completa del bazo del animal hospedante inmunizado (anteriormente descrito) son fusionadas con células de mieloma con un procedimiento convencional para producir hibridomas. Los hibridomas son cultivados y el fluido de cultivo resultante es rastreado con respecto al fluido o inoculo que soporta al agente infeccioso (virus o vacuna). La introducción del hibridoma en el peritoneo del animal hospedante produce un crecimiento peritoneal del hibridoma. La recogida del fluido de ascitis del animal hospedante proporciona una muestra del anticuerpo monoclonal al agente infeccioso reducido por el hibridoma. Asimismo el sobrenadante de cultivo de células de hibridoma puede ser utilizado como fuente del anticuerpo monoclonal, que es aislado por métodos conocidos por los técnicos en la materia. Preferentemente el presente anticuerpo del tipo de inmunoglobulina IgG o IgM.
También se da a conocer un método para el tratamiento de un cerdo que sufre de enfermedad reproductiva y respiratoria. Dicho método comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo que inmunológicamente une a un virus que provoca una enfermedad reproductiva y respiratoria porcina o a una vacuna que protege a un cerdo contra la infección por virus reproductivo y respiratorio porcino en un portador fisiológicamente aceptable, a un cerdo que lo necesite.
La presente invención se refiere también a un equipo o kit de diagnóstico para ensayar un virus que provoca enfermedad respiratoria porcina, enfermedad reproductiva porcina o enfermedad reproductiva y respiratoria porcina, comprendiendo el presente anticuerpo descrito en lo anterior y un agente de diagnóstico que indica una reacción inmunológica positiva con dicho anticuerpo.
El presente equipo de diagnóstico se basa preferentemente en modificaciones de los procesos conocidos de ensayo de inmunofluorescencia (IFA), ensayo de inmunoperoxidasa (IPA) y ensayo inmunoabsorbente relacionado con encimas (ELISA).
En IFA se fijaron células infectadas con soluciones de acetona y metanol, y anticuerpos para los sueros convalescentes de cerdos infectados son incubados con las células infectadas preferentemente durante unos 30 minutos a 37ºC. Una reacción inmunológica positiva es una reacción en la que el anticuerpo se une a las células infectadas por el virus, pero no es eliminado por las etapas de lavado subsiguientes (usualmente 3 X con tampón PBS). Un segundo anticuerpo (un anti-anticuerpo) marcado con un reactivo fluorescente (FITC) es añadido a continuación e incubado preferentemente durante otros 30 minutos. Una reacción inmunológica positiva resulta en el segundo anticuerpo uniendo al primero, siendo retenido después de lavado y resultando en una señal fluorescente que puede ser detectada y semi-cuantificada. Una reacción inmunológica negativa resulta en poca o ninguna unión del anticuerpo a la célula infectada. Por lo tanto, el segundo anticuerpo marcado de forma fluorescente no produce la unión, la etiqueta fluorescente es eliminada por lavado y se detecta poca o ninguna fluorescencia en comparación con un control positivo
apropiado.
Los equipos IPA y ELISA son similares al equipo IFA, excepto que el segundo anticuerpo es marcado por una encima específica en vez de un reactivo fluorescente. De este modo se añade un sustrato apropiado para la encima unida al segundo anticuerpo, lo que tiene como resultado la producción de un producto coloreado que es detectado a continuación y cuantificado, por ejemplo, por colorimetría.
Otras características de la presente invención quedarán evidentes en el curso de las decisiones siguientes de realizaciones a título de ejemplo, que tienen carácter demostrativo de la invención, pero que no están destinadas a limitar la misma.
Experimento 1
En el ejemplo 1, se investigó un caso de neumonía endémica en cerdos de 5-8 semanas de edad. Lesiones microscópicas de la cepa Iowa de PRRSV observadas en los cerdos eran compatibles con una etiología viral. (De acuerdo con ello, a continuación, para simplificar la explicación, los términos "virus" y "viral" se referirán a un virus o agente infeccioso con el significado que se ha descrito anteriormente para la presente solicitud o para una característica de la misma). La enfermedad fue transmitida experimentalmente a cerdos convencionales y gnotobióticos utilizando un homogeneizado de pulmón aislado de cerdos infectados filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum. No se demostró la existencia de patógenos respiratorios virales comunes del cerdo. Se observaron dos tipos de partículas de virus en cultivo de células por medio de microscopio electrónico. Un tipo tenía unos 70 nm de diámetro, tenía envoltura y cortas espículas superficiales. El otro tipo era pleomórfico, alargado, con envolvente, tenía medidas de 80 X 320 nm y estaba dotado de un recubrimiento de anticuerpos.
(I) Materiales y métodos (A) Material procedente de cerdos infectados por neumonía de tipo natural
Se recogieron y estudiaron tejidos de tres cerdos infectados de seis semanas procedentes de una granja de 900 cabezas con cerdas madre hasta lechón en el suroeste de Iowa. Las observaciones anteriores de la granja mostraron que de cinco a siete días después del destete, 50-70% de los cerdos infectados de modo similar se volvieron anoréxicos, presentaban pelo áspero y experimentaron estado letárgico, tos, fiebre y "palpitaciones". Aproximadamente 10-25% de los cerdos infectados tenía conjuntivitis. La mayor parte de los cerdos infectados se recuperaron en 7-10 días pero 10-15% quedaron severamente afectados por infecciones bacterianas secundarias y no fueron adecuados para su venta como cerdos de cría. Se habían observado fallos reproductivos en las madres, incluyendo un mayor número de fetos muertos, fetos momificados e infertilidad, en el momento de la aparición de la enfermedad en esta granja, pero posteriormente disminuyeron con el tiempo. Las enfermedades respiratorias en la etapa de crianza habían sido persistentes.
Se observaron lesiones de pulmón caracterizadas por bronquiolitis proliferativa y alveolitis en tejidos fijados con formalina procedentes de cuatro diferentes cerdos de seis semanas. Los intentos de aislar SIV, virus de seudorabia (PRV) y virus de encefalomiocarditis (EMCV) no tuvieron éxito. Los exámenes por inmunofluorescencia de secciones congeladas de pulmón para hallar virus de gripe de cerdos (SIV), virus de seudorabia (PRV) y Mycoplasma hypneoumoniae fueron negativos. Se aisló pasteurella multocida tipo D, de las cavidades nasales y se aisló haemophilus parasuis de los pulmones. Cinco cerdos afectados de forma aguda, de 5-6 semanas, que habían sido destetados durante 10 días, fueron obtenidos a continuación de la granja. Todos los cerdos tenían fiebre de un mínimo de 40,5ºC. Los cerdos fueron necropsicados y se recogieron muestras de tejidos de pulmón de cerdos con grandes lesiones típicas de neumonía viral y se prepararon para inoculación inmediata en cerdos convencionales específicos libres de patógenos (SPF). Se cultivaron para encontrar patógenos bacterianos y virales comunes, muestras de tejidos de pulmón, hígado, riñón, bazo, cerebro y corazón de todos los cinco cerdos afectados de forma aguda de 5-6 semanas. Se recogieron secciones de los mismos tejidos y se fijaron en formalina tamponada 10% neutra para examen histopatológico.
(B) Transmisión experimental en cerdos convencionales (1) Cerdos experimentales
Se obtuvieron dieciséis cerdos de cinco semanas de un rebaño libre de microplasmas, PRV, coronavirus respiratorio porcino (PRCV) y virus de gastroenteritis transmisible (TGEV). Se colocaron ocho cerdos en cada uno de dos recintos aislados de 4 X 5 metros, con piso de hormigón y ventilación automatizada. Los cerdos fueron alimentados con una dieta de raciones de maíz-soja con 18% de proteínas y agua ad libitum.
(2) Diseño experimental
Inmediatamente después de la necrosis de los cerdos con neumonía natural se preparó un homogeneizado de pulmón al 10% en medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco, clarificado a 1000 X g durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 X g durante 10 minutos. El sobrenadante clarificado fue filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum. Ocho cerdos fueron inoculados por vía intranasal con 5 ml de homogeneizado de pulmón filtrado. Ocho cerdos de control fueron inoculados por vía intranasal con 5 ml de homogeneizado de pulmón filtrado preparado tal como se ha descrito anteriormente a partir de un cerdo gnotobiótico normal no infec-
tado.
Se controlaron las señales clínicas y temperatura y se registraron diariamente. Un cerdo de cada grupo fue eutanizado y necropsiado a los cinco, siete, diez y quince días después de la inoculación (DPI) respectivamente. Se recogieron tejidos en el momento de la necropsia para procedimientos aeróbicos y aneróbicos bacterianos de aislamiento, aislamiento de micoplasma, detección de antígenos para Mycoplasma hyopneumoniae, SIV, PRV, virus de paragripe tipo 3 (PI-3) y virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) y para aislamiento de virus. Los tejidos fueron fijados en formalina tamponada neutra al 10% para examen histopatológico. Se fijaron los pulmones por hinchado con formalina en el momento de la necropsia.
(C) Transmisión experimental en cerdos gnotobióticos (1) Cerdos experimentales
Ocho cerdos de un día de edad, gnotobióticos, a los que se había suprimido el calostro, derivados por cesárea (CDCD), híbridos, de un día de edad, fueron divididos al azar en dos aisladores (cuatro cerdos en cada aislador). Los cerdos fueron alimentados con un sustitutivo de leche líquida en botes reforzado con hierro, esterilizados (SPF-LAC, Pet-Ag Inc, Elgin, Illinois).
(2) Diseño experimental
Cuatro cerdos principales fueron inoculados con homogeneizado de pulmón filtrado (0,22 \mum) por vía intranasal (3 ml) y oralmente (1 ml) a los 3 días de edad. Este filtrado fue preparado a partir de pulmón de cerdo de tipo convencional infectado experimentalmente, que había sido recogido 7 días después de la infección (DPI). Cuatro cerdos de control fueron inoculados con homogeneizado de pulmón preparado a partir de cerdo gnotobiótico normal.
Un cerdo de cada grupo fue sacrificado a los 5, 9, 28, y 35 DPI, respectivamente. Se recogieron muestras de pulmón, hígado, riñón, cerebro, bazo, timo, turbinatos nasales, corazón, e intestino, y se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra para examen histopatológico. Se recogieron muestras de pulmón, cerebro, bazo y corazón para aislamiento de virus. Se recogieron muestras de pulmón, hígado y bazo para aislamiento bacteriológico. Se recogió pulmón inmediatamente en medio Friis para aislamiento de micoplasma, o fue congelado a -70ºC.
(D) Ensayos microbiológicos (1) Aislamiento de virus
Se inocularon suspensiones de tejidos (10% peso/volumen) clarificadas a 1000 X g sobre monocapas de células y se observaron en cuanto a efecto citopático. Se utilizaron para los intentos de aislamiento de virus cultivos de riñón de cerdo fetal primario, cultivos de macrófagos alveolares porcinos primarios, y líneas establecidas de células PK15, turbinatos bovinos, ratón de hámster baby (BHK), testículos de vero y de cerdo (ST). Se prepararon cultivos de lavado brónqueoalveolar directo a partir de cerdos infectados y gnotobióticos de control. Se llevaron a cabo los intentos de detectar virus por inmunofluorescencia indirecta utilizando suero de cerdo hiperinmune o convalescente gnotobiótico de referencia para parvovirus porcino (PPV), SIV, virus de diarrea viral bovina, virus de encefalomielitis hemaglutinante (HEV), TGEV y EMCV. Se hicieron pasar a ciegas filtrados tres veces por inoculación intra-allantoica de huevos de pollo embrionados de 10 días, y se comprobaron con fluido allantoico para actividad hemaglutinante después de cada pasada.
(2) Aislamiento de micoplasma
Se inocularon suspensiones de pulmón en un medio de caldo de micoplasma Friis (Friis (1975), Acta Vet. Scand., 27, 337), BHI-TS, D-TS (Ross y otros (1971), Journal of Bacteriology, 103, 707) y BHL (Yamamoto y otros (1982), Proc. Int. Pig Vet. Society Congress, página 94). Se hicieron pasar cultivos cuando el crecimiento era evidente, o bien en los días 3, 7, 14, y 21, y se identificó por epiinmunofluorescencia. (Del Giudice y otros (1967), Journal of Bacteriology, 93, 1205).
(3) Aislamiento de bacterias
Se inoculó turbinato nasal en dos placas de agar de sangre, y también en agares MacConkey, Tergitol-7 y PMD (para aislamiento de P. multocida). Una de las placas de agar de sangre fue incubada a 37ºC en un ambiente anaeróbico de CO_{2} y H_{2}. La segunda placa fue extraída de forma cruzada con una colonia cultivada de Stafilococcus epidermidis, y se incubó con otras placas en el aire a 37ºC.
Los tejidos de pulmón fueron aplicados en placas, exactamente igual que en las torundas de turbinato nasal. Se cultivaron hígado y bazo en dos placas de agar de sangre (aeróbica y anaeróbica) y una placa de Tergitol-7. Todos los aislados bacterianos fueron identificados por métodos estándar (Biberstein (1990), En: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology (Procesos Diagnósticos en Bacteriología y Micología Veterinaria), ed. Carter y otros, 5ª ed., páginas 129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.; y Carter (1990) En: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology (Procesos Diagnósticos en Bacteriología y Micología Veterinaria), ed. Carter G.R. y Cole J.R., 5ª ed., páginas 129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.).
(4) Serología
Se utilizó la prueba de neutralización de suero para comprobar anticuerpos del suero en cuanto a PRV, TGEV, y EMCV. La prueba de inhibición de hemaglutinación fue utilizada para comprobar anticuerpos del suero a EMCV y HEV. La prueba de inmunofluorescencia indirecta fue utilizada para detectar anticuerpos del suero con respecto a BRSV, PI-3, SIV, y TGEV. Los sueros gnotobióticos fueron comprobados en cuanto a anticuerpos con respecto a PRRSV. Se utilizó un ensayo indirecto de inmunofluorescencia, utilizando la línea celular CL2621 para la detección de anticuerpos de PRRSV.
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(II) Resultados (A) Neumonía natural
Los pulmones de cerdos afectados de forma aguda no se colapsaron. De modo general, los pulmones tenían un edema interlobular moderado y áreas lineales multifocales a coalescentes de atelectasis, afectando a todos los lóbulos del pulmón. Existía una consolidación cranioventral 5-15% de los lóbulos craneal y medio.
El examen histopatológico reveló bronqueolitis y alveolitis aguda difusa proliferativa. Se observó miocarditis linfoplasmacítica multifocal. No se apreciaron lesiones en otros órganos.
Los intentos de aislamiento de virus para adenovirus, PRV, SIV, HEV, coronavirus respiratorio porcino (PRCV), parvovirus porcino (PPV), EMCV, y enterovirus fueron negativos desde la presentación del caso original y también en cerdos afectados de forma aguda, obtenidos más adelante del mismo rebaño. El examen por inmunofluorescencia de secciones congeladas del pulmón no reveló Micoplasma hiopneumoniae, SIV, virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus de paragripe-3 (PI-3), antígenos PRV o TGEV.
El suero de uno de los cinco cerdos convencionales SPF de la sección (I) (A) anteriormente indicada proporcionó una reacción inmunológica positiva con una dilución 1:20 para PRRSV por inmunofluorescencia indirecta. Se aislaron Pasteurella multocida tipo D y Haemophilus parasuis, respectivamente, de los turbinatos nasales y el pulmón de este cerdo. No se aislaron bacterias aeróbicas o anaeróbicas del pulmón del cerdo afectado de forma aguda, escogido para homogeneización e inóculo (ver en Métodos y Materiales, Sección (C) (2) anterior).
(B) Estudio de un cerdo convencional
A los 7 DPI, todos los cerdos principales tenían fiebre de 40-41,1ºC y experimentaron alteraciones respiratorias moderadas. Los cerdos eran anoréxicos y letárgicos. A los 15 DPI, los cerdos se habían recuperado.
Cambios macroscópicos en los pulmones se caracterizaron por inexistencia de colapso, edema interlobular suave, y áreas lineales marrón-gris de atelectasis, afectando multifocalmente de 20 a 40% del pulmón.
El examen microscópico de pulmones a los 7 DPI reveló una neumonía intersicial por zonas ("patchy") caracterizada por proliferación de neumocitos tipo II, acumulación de células inflamatorias mixtas, y restos de células necróticas en cámaras alveolares, e infiltración de macrófagos y linfocitos en septos alveolares. Las cámaras alveolares contenían fluido proteináceo. Ocasionalmente se apreciaron células similares a sincitiales dentro de las cámaras alveolares y a lo largo de los septos.
La figura 5 muestra una sección histológica del pulmón de un cerdo convencional a los 10 DPI, utilizando tinción de hematoxylineosina. Se presentó una extensa proliferación de neumocitos de tipo II (vector) y restos de células necróticas en los espacios alveolares (puntas de flecha). El estado y aspecto de las lesiones observadas en el día 10 fueron similares a los observados en el día 7.
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La figura 6 muestra una segunda sección histológica del pulmón de un cerdo convencional a los 10 DPI, utilizando tinción de hematoxilin-eosina. Existían células similares a sincitiales (vectores) en los espacios alveolares. Se observó una pronunciada proliferación de neumocitos de tipo II y mayor sincitia en el día 10 que en el día 7.
Las lesiones eran todavía moderadamente severas a los 15 DPI, pero los cerdos tenían aspecto clínicamente normal. No se aislaron bacterias ni micoplasmas de los pulmones. Los intentos de aislamiento de virus de EMCV, PRV, PRCV, adenovirus, y SIV fueron negativos. El examen por inmunofluorescencia de secciones congeladas de los pulmones no mostraron antígenos de BRSV, virus PI-3, PRV, SIV, TGEV, o Mycoplasma hyopneumoniae.
No se observaron en los cerdos de control lesiones grandes ni microscópicas.
(C) Estudio de un cerdo gnotobiótico
Todos los cerdos principales inoculados experimentaron fuertes alteraciones respiratorias y "respiración forzada" ("thumping") a los 5 DPI. Las temperaturas eran de 40,5ºC o superiores, y los cerdos se mostraban anoréxicos y en estado letárgico. Los cerdos mejoraron clínicamente a los 8 DPI, y se mostraron clínicamente normales a los 15 DPI. No hubo cerdos muertos. Los cerdos de control inoculados con filtrado de homogeneizado de pulmón normal siguieron clínicamente normales.
Las lesiones macroscópicas a los 5 DPI se caracterizaron por un pulmón que falló hasta colapsarse, suave atelectasis multifocal marrón-roja y edema interlobular suave.
Microscópicamente, se observaba una suave neumonía intersticial difusa con áreas multifocales de infiltración de células mononucleares de septos alveolares y proliferación moderada de neumocitos de tipo II. Se observó acumulación de células inflamatorias, residuos de células necróticas y fluido proteinoso en la cámara alveolar. No se apreciaron lesiones en otros órganos.
A los 9 DPI, el pulmón falló hasta colapso, presentó edema interlobular moderado y áreas multifocales de 1-3 cm de atelectasis firme de color marrón-rojo. La figura 7 muestra una sección histológica del pulmón de un cerdo gnotobiótico a los 9 DPI, utilizando tinción de hematoxilin-eosina. Se presenta una proliferación moderada de neumocitos de tipo II (puntas de flecha) y de formación de células parecidas a sincitiales (flechas).
Microscópicamente, las lesiones eran similares a las observadas en el día 5 DPI, excepto que la proliferación de neumocitos de tipo II era más pronunciada, y había un número moderado de células similares a sincitiales en el septo alveolar y en las cámaras o lumina. El riñón tenía los tubos renales dilatados, conteniendo algunos de ellos un exudado linfoplasmacítico y residuos celulares. A los 28 DPI, se tenía 20% de atelectasis cráneo-vental bilateral involucrando los lóbulos apical y medio con áreas focales de 1-2 cm de atelectasis en otros lóbulos. Microscópicamente, las lesiones de pulmón eran similares a las observadas a los 9 DPI, pero además, existía una suave acumulación peribronquiolar y periarteriolar limfoplasmacítica. Se encontraban presentes infiltrados desde suaves a moderados de linfocitos y plasma multifocalmente en el plexo coroide, meninges, miocardio y turbinatos nasales. La figura 8 muestra que, a los 35 DPI, las lesiones de pulmón eran menos severas pero la miocarditis limfoplasmacítica multifocal era pronunciada. Los intentos de aislamiento de virus PRV, SIV, adenovirus, EMCV, HEV, PPV, enteroviruses, y PRCV no tuvieron éxito. Se observó un efecto citopático en macrófagos alveolares porcinos, caracterizado por redondeo de las células, lisis y muerte celular. Los cultivos de lavado directo bronquioalveolar mostraron sincitia extensa mostrándose en la figura 9, que no se observaron en cultivos similares preparados a partir de cerdos de control. El examen de estos cultivos por microscopio electrónico de tinción negativa inmune reveló dos tipos de partículas similares a virus. Un tipo, mostrado en la figura 10, tenía aproximadamente 70 nm de diámetro, con envolvente y cortas espículas superficiales. El otro tipo, mostrado en la figura 11, era un virus con envolvente, pleomórfico, aproximadamente de 80 X 320 nm y con recubrimiento de anticuerpos. No se asilaron bacterias del pulmón, hígado, bazo o cerebro. El suero recogido a los 28 y 35 DPI no tenía concentraciones de anticuerpos con respecto a virus SIV, EMCV, PRV, TGEV, BRSV, HEV, o PI-3. Estos sueros eran positivos (1:1280) para anticuerpos con respecto a virus
PRRS.
Los cerdos de control siguieron normales en otro periodo del estudio y no tenían lesiones grandes o microscópicas en ningún tejido. No se aislaron bacterias o virus de los cerdos de control.
(III) Comentario
Los filtrados de pulmón procedentes de cerdos con neumonía endémica de tipo natural produjeron lesiones de pulmón y de corazón en cerdos experimentalmente inoculados convencionales y gnotobióticos. Las lesiones observadas en la enfermedad natural y experimental se correspondían con una etiología viral.
No se aislaron, patógenos respiratorios virales previamente identificados de cerdo. Se observó un efecto citopático caracterizado por lisis de células de cultivos de macrófagos alveolares porcinos, correspondientes con el informe de infecciones por virus PRRS por Yoon y otros (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol. 4 (1992), p.139). No obstante, los sincitios grandes en cultivos de lavado bronquio-alveolar directo, apreciados en este estudio, no han sido informados anteriormente con PRRS.
El examen al microscopio electrónico de cultivo de células infectadas muestra dos partículas similares a un virus. Una partícula similar a un virus con envolvente de 70 nm con cortas espículas superficiales se muestra compatible con el virus PRRS tal como se ha informado por Benfield y otros (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, vol. 4 (1992), p. 117), pero la otra partícula parecida a un virus parece ser distinta. Ninguno de los cerdos desarrolló concentraciones de anticuerpos con respecto a SIV, PRV, TGEV (PRCV) o EMCV. Los cerdos gnotobióticos, no obstante, se convirtieron séricamente al virus PRRS.
La enfermedad clínica reproducida en el experimento I se caracteriza por alteraciones respiratorias desde moderadas a severas en todos los cerdos gnotobióticos y convencionales inoculados dentro de los 5DPI. La enfermedad en este experimento es más severa que la observada en experimentos anteriores (Collins y otros y Yoon y otros, ver cita anterior).
No se observaron en el experimento I necrosis y proliferación epitelial de las vías aéreas terminales, descritas para el tipo recientemente identificado A variante SIV (aSIV o enfermedad relacionada con el mismo, ver cita anterior), por Morin y otros (Canadian Veterinary Journal, vol. 31 (1990), p. 837). Los depósitos de fibrina y membranas de hialina a lo largo de septos alveolares asociados con aSIV (Morin y otros, y Girard y otros, ver cita anterior), no fueron observados. La fuerte miocarditis no supurativa observada en cerdos que vivieron más allá de los 15 DPI en el experimento I no es asociada a aSIV (Morin y otros, y Girard y otros, ver cita anterior). Los cerdos no se convirtieron séricamente en SIV, y no se detectó SIV por paso en huevos de pollo embrionados.
La lesión de pulmón predominante apreciada en los episodios de PRRS e inoculaciones experimentales es una marcada infiltración intersicial con células mononucleares (Collins y otros, Pol y otros, ver cita anterior). La proliferación de neumocitos de tipo II, formación de células sincitiales y miocarditis observadas en los cerdos infectados del experimento I no han sido observadas por otros. Las lesiones reproducidas de manera continuada con el agente infeccioso filtrable del experimento I sugieren que la enfermedad descrita en este estudio, que los inventores designan cepa Iowa de PRRSV, es provocada por un agente viral único o una combinación de virus PRRS con otro agente infeccioso.
Experimento II
(I) Materiales y métodos (A) Material de campo del caso e historial
Se consiguió un cerdo de un rebaño que experimentó PRRS con fuerte neumonía persistente, y tenía solamente 20 cerdos viables de las últimas 42 camadas destetadas. El cerdo fue necropsiado, y se recogieron muestras de tejidos del pulmón y se homogeneizaron utilizando técnicas de homogeneización estéril estándar. El homogeneizado de pulmón (10% peso/volumen) preparado en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) y filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum fue utilizado como inoculante.
(B) Células
Se derivó una línea celular continua, designada PSP-36, de células MA-104 adquiridas a Whittaker Bioproducts, Inc. (Walkersville, Maryland). Una muestra de células PSP-36 se propagaron separadamente y esta línea celular, fue designada PSP-36-SAH. Se utilizaron para aislamiento de virus macrófagos alverolares de cerdos y aproximadamente otras 90 líneas celulares, de las que se describen ejemplos en la siguiente Tabla II.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA II
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(C) Aislamiento de virus
Se clarificaron homogeneizados de pulmón descritos en lo anterior a 2.000 x g o 3.000 rpm a 4ºC durante 15 min. Los sobrenadantes fueron filtrados a través de un filtro de 0,22 \mum. Los filtrados fueron incolulados a cada una de las líneas celulares descritas en la anterior sección (B). Entonces los cultivos se mantuvieron en medios apropiados con 0-4% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos. Se controlaron las líneas celulares diariamente para ver los efectos citopáticos (CPE). Si no se observó CPE dentro de los ocho o nueve días, los cultivos fueron pasados de modo ciego 2-3 veces. Si se observó CPE sospechoso, los cultivos fueron examinados en un ensayo de inmunoflorescencia indirecto (IFA) utilizando antisuero de cerdo convalescente con respecto a ISU-12.
(D) Trituración del virus
Se prepararon diluciones de 10 veces en serie de aislado de ISU-12 en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con 2% de FBS y 1 x antibióticos. Cada una de las diluciones (0,2 ml) fue inoculada por duplicado en cada uno de los pocillos de células PSP-36 y se sembraron cultivos de macrófagos alveolares de cerdo en cámaras Lab-Tek. A los tres días después de la infección (DPI), las cámaras fueron fijadas con acetona en frío al 80% y 20% de solución de metanol a 4ºC durante 15 min. Las cámaras fueron sometidas posteriormente a tinción en un IFA utilizando el antisuero ISU-12 convalescente y suero de virus anti-PRRS.
(E) Ensayo de Inmunoflorescencia Indirecta (IFA)
Las células PSP-36 y cultivos de macrófagos alverolares de cerdo fueron infectados con aislado ISU-12. A las 20 y 48 horas después de la infección, los cultivos fueron fijados con acetona en frío al 80% y solución de metanol 20% a 4ºC durante 15 min. Se llevó a cabo IFA utilizando suero convalescente ISU-12, suero anti-PRRS y anticuerpo monoclonal anti-PRRSV adquirido de South Dakota State University, Brookings, South Dakota. Se utilizaron como controles células PSP-36 no infectadas y cultivos de macrófagos.
(F) Ensayo de radioinmunoprecipitación (RIP)
Se marcó aislado ISU-12 y células PSP-36 falsamente infectadas con ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína. Se infectaron células PSP-36 de 3 días en frascos de 25 cm^{3} con 0,5 ml de 10^{4} TCID_{50} de virus ISU-12. 24 horas después de la infección, el medio fue sustituido por DMEM deficiente en metionina y en cisteína, y los cultivos fueron incubados a 37ºC durante 1 h. El medio fue sustituido a continuación con medio reciente de DMEM deficiente en metionina y en cisteína con 100 \muci/ml de la ^{35}S-metionina (^{35}Met)y ^{35}S-cisteína (^{35}Cys). Cinco horas después de la adición de ^{35}Met y ^{35}Cys, las células fueron lavadas tres veces con solución salina (PBS) con tampón de fosfato en frío, pH 7,2, y a continuación se liberaron por rascado de los flascos y se transformaron en pastillas por centrifugación a 1.000 x g 410 min. Las pastillas de células conteniendo proteínas virales marcadas y pastillas de células falsamente infectadas fueron alteradas por tampón de lisis, y los residuos celulares fueron clarificados por centrifugación de acuerdo con el procedimiento de Zhu y otros (Am. J. Vet. Res., 51:232-238 (1990)). Los lisados fueron incubados a continuación con suero convalescente ISU-12 y suero de virus anti-PRRS, fueron preabsorbidos con lisados de células PSP-36 normales en frío a 4ºC durante una noche. Se recogieron complejos inmunes por adición de perlas de sefarosa-proteína A (obtenidas de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de perlas de sefarosa-proteína A y complejo inmune fue lavada tres veces con tampón de lisis y tres veces con agua destilada. La mezcla fue resuspendida en 50 \mul de tampón de muestra, y se hizo pasar sobre SDS-PAGE gel, tal como se describe por Zhu y otros, ver cita anterior.
(G) Exploración mediante microscopio electrónico (EM)
Las células PSP-36 fueron infectadas con virus ISU-12 en un frasco de 25 cm^{3}. A las 48 h después de la infección, las células infectadas fueron fijadas con 3% de glutaraldehído (pH 7,2) a 4ºC durante 2 h. Las células fueron separadas por rascado de los frascos y transformadas en pastillas por centrifugación. Las pastillas de células fueron procesadas y embebidas en plástico. Las pastillas de células embebidas en plástico fueron cortadas en elementos delgados, sometidas a tinción y a continuación visualizadas con un microscopio electrónico de transmisión, tal como se describe por Paul y otros (Am. J. Vet. Res., 38:311-315 (1976)).
(II) Reproducción experimental de la enfermedad reproductiva y respiratoria porcina (A) Experimento 92.1 SPF
Se inoculó el filtrado de pulmón anteriormente mencionado ISU-12 por vía intranasal en seis cerdos específicos libres de patógenos (SPF) de 5 semanas de edad. Los cerdos fueron sacrificados a los 3, 5, 10, 28, y 43 días después de la inoculación (DPI).
(B) Experimento 92.3 SPF
Seis cerdos de raza cruzada SPF fueron inoculados por vía intranasal a las 5 semanas de edad con material macrófago alveolar porcino, infectado con filtrado de pulmón ISU-12. Los cerdos inoculados con ISU-12 fueron necropsizados a los 10 y 28 DPI.
(C) Experimento 92.10 SPF
Tres cerdos de 5 semanas de edad fueron inoculados por vía intranasal con 3 ml de ISU-12 propagado en PSP-36, conteniendo 10^{5} TCID_{50}/ml de virus. Dos cerdos sirvieron como controles no inoculados. Un cerdo principal fue necropsizado a los 5, 10 y 28 DPI. Un cerdo de control fue necropsizado en cada uno de 5 y 10 DPI.
(D) Experimento 92.12 SPF
Veintidós cerdos de 5 semanas de edad fueron divididos en seis grupos. En un grupo I, 6 cerdos (principal) fueron inoculados por vía intranasal con 3 ml de virus ISU-12 de placa purificada (placa no. 1), propagado en PSP-36 conteniendo 10^{5} TCID_{50}/ml de virus. En el grupo II, 6 cerdos fueron inoculados con un medio de cultivo de células de control. En cada uno de los grupos III (placa no.2) y grupo IV (placa no.3), se inocularon 2 cerdos con ISU-12 purificado en placa. En el grupo V, se inocularon 3 cerdos con ISU-12 que no estaba purificado en placa. En el grupo VI, se inocularon 3 cerdos con filtrado de tejido ISU-12.
Dos cerdos principal y dos de control fueron necropsizados de cada uno de los grupos I y II en los días 5, 10 y 25 DPI. Dos cerdos inoculados con placas no. 2 y no. 3 fueron recropsizados a los 10 DPI. Un cerdo de cada uno de los grupos V y VI fue necropsizado en cada uno de 5, 10 y 25 DPI.
(E) Examen microscópico
Se recogieron pulmón, cerebro, corazón y bazo en la necropsia, se fijaron con 10% de formalina tamponada neutra, embebidos en parafina, y se efectuó tinción con hematoxilina y eosina.
(III) Resultados (A) Cultivo de virus (1) Cultivo de aislado ISU-12 en cultivos de macrófagos alveolares de cerdo
Se observó un efecto citopático (CPE) en cultivos de macrófagos alveolares de cerdo, infectados con filtrado de pulmón ISU-12 empezando en 2-3 DPI. El CPE se caracterizó por grumos de los macrófagos y lisis de células. Aproximadamente el 90% de los cultivos de macrófagos en cultivos infectados por ISU-12 mostraron CPE en 4-5 DPI. La figura 12(A) muestra que no se observó CPE en cultivos de macrófagos no infectados. La titulación de virus ISU-12 en cultivos de macrófagos en el tercer paso fue de 10^{4}-10^{5} TCID_{50}/ml.
Se detectaron antígenos virales por IFA en el citoplasma de cultivos de macrófagos alveolares de cerdo, infectados por ISU-12 utilizando suero convalescente de ISU-12 de cerdos gnotobióticos, tal como se ha mostrado en la figura 12(C). No se detectó inmunofluorescencia en cultivos de macrófagos no inoculados.
(2) Cultivo de aislado de ISU-12 en líneas celulares continuas
De las aproximadamente noventa líneas celulares comprobadas (ver sección (B) de "Materiales y Métodos"), no se observó evidencia de replicación viral en 6 líneas de células, especialmente PSP-36, PSP-36-SAH, MA-104, células sinoviales, células de macrófago alveolares y células de turbinato porcino.
La figura 13 (B) muestra el CPE empezado a los 2 DPI, y se caracterizó por la degeneración, redondeo de células y aglomeración de células. A los 3-4 DPT, el número de grumos de células redondeadas aumentó, y se fusionaron algunos grumos. Muchas células redondeadas se desacoplaron de la monocapa de células, y condujeron a la subsiguiente desintegración de la monocapa. Después de los 5 DPI, el CPE se hizo muy generalizado, y afectó más del 95% de la monocapa, de manera típica. No se observó CPE en células PSP-36 de control, tal como se ha mostrado en la figura 13 (A).
El aislado de ISU-12 aumentó a elevadas titulaciones en células PSP-36, aproximadamente 10^{6}-10^{7} TCID_{50}/ml en el paso de cultivo de células de orden 11.
Se detectaron antígenos virales en el citoplasma de células infectadas con sueros convalescentes de cerdos gnotobióticos inoculados experimentalmente con filtrado de pulmón ISU-12 (ver figura 14 (B)). No se observó fluorescencia en las células PSP-36 de control (figura 14 (A)).
(III) Características del virus (A) Relación antigénica de ISU-12 a virus PRRS
Anticuerpo monoclonal con respecto a aislado VR-2332 del virus PRRS (adquirido al Dr. Benfield, South Dakota State University, Brookings, South Dakota) y sueros anti-PRRSV (obtenidos del USDA National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa) reaccionaron con células PSP-36 infectadas con ISU-12, lo cual quedó evidenciado por una fluorescencia citoplásmica brillante durante IFA (ver figura 14 (C)), pero no reaccionaron con células PSP-36 no infectadas.
(B) Proteínas virales
Se utilizaron sueros convalescentes anti-ISU-12 y virus anti-PRRS para analizar las proteínas virales. Ambos sueros reconocieron como mínimo 4 proteínas que tenían, respectivamente, pesos moleculares de 19, 24, 32 y 61 kD (figura 15). En la figura 15, proteínas falsamente infectadas (vías 2 y 3), o proteínas infectadas con ISU-12 (vías 4 a 7) fueron inmunoprecipitadas con suero anti-ISU-12 (vías 2 y 5), suero anti-PRRSV (vías 3 y 4), anticuerpo monoclonal anti-PRRSV (vía 6), o suero de conejo anti-PRRSV (obtenido del Dr. Benfield, South Dakota State University, Brookings, South Dakota). Las vías 1 y 8 tienen marcadores de peso. Estas proteínas no fueron evidentes en células PSP-36 infectadas falsamente.
(C) Estructura viral
Se observaron partículas de virus típicas comprendidas entre 55-85 nm en células PSP-36 infectadas con ISU-12. Las partículas de virus tenían envolvente, eran esféricas y se encontraban presentes en vesículas citoplásmicas de células PSP-36 infectadas con ISU-12.
(IV) Reproducción experimental de la enfermedad (A) Experimento 92.1 SPF
Se inoculó filtrado de pulmón de ISU-12, que se ha indicado anteriormente, por vía intranasal en seis cerdos específicos libres de patógenos (SPF) con 5 semanas de edad. Los cerdos fueron sacrificados a los 3, 5, 10, 28, y 43 días después de la inoculación (DPI). A los 3 DPI, los cerdos con ISU-12 habían mostrado fuertes alteraciones respiratorias y pirexia. Estas señales persistieron durante 10-14 días. Las lesiones pulmonares graves se caracterizaron por severa consolidación multifocal de color gris-marrón en 60% aproximadamente de los pulmones. También se presentó cardiomegalia moderada y acumulación de fluido abdominal. Los cambios microscópicos se caracterizaron por severa neumonía intersticial proliferativa con proliferación de neumocitos de tipo II, formación de células sincitiales, exudación alveolar, y aumento suave de grosor intersticial con células mononucleares. Se presentó una miocarditis no supurativa suave, fuerte encefalitis y nefritis linfoplasmacítica moderada. Los cerdos experimentales ISU-12 necropsizados a los 10 y 28 días se habían seroconvertido al agente PRRS, tal como se confirmó por NVSL.
(B) Experimento 92.3 SPF
Todos los cerdos SPF inoculados con ISU-12 mostraron fuerte enfermedad respiratoria dentro de los 3 días, persistiendo más de 14 días. Las lesiones graves se caracterizaron por congestión pulmonar, edema y marcada hepatización multifocal difusa. Microscópicamente, se observaron fuerte neumonía intersticial proliferativa, nefritis moderada, miocarditis moderada, y encefalitis suave. Los cerdos inoculados con ISU-12, necropsizados a los 10 y 28 DPI, se habían seroconvertido en PRRS según confirmación por NVSL.
(C) Experimento 92.10 SPF
Los signos clínicos en cerdos inoculados incluían letargia y pirexia severas, anorexia moderada, y alteraciones respiratorias desde moderadas a severas, observadas a los 5-22 DPI. Se presentó lacrimación moderada en estos cerdos en todo el experimento. Las lesiones microscópicas incluían neumonía intersticial proliferativa suave y fuerte tonsilitis necropurulenta a los 5 DPI.
Se observaron a los 10 DPI, PIP multifocal moderado con proliferación de tipo II, exudación alveolar, células gigantes multinucleadas, y formación de células sincitiales. Se observó también a los 10 DPI encefalitis multifocal moderada con manguitos perivasculares y gliosis. Se detectó hepatitis linfomacrofágica periportal suave, miocarditis no supurativa suave y rinitis a los 10 DPI. A los 26 DPI, se observó neumonía intersticial severa, caracterizada por aumento notable de grosor intersticial multifocal con células mononucleares, proliferación moderada multifocal de neumocitos de tipo II, cantidades moderadas de exudados alveolares mixtos, y manguitos peribronquiolares sueltos de linfocitos y macrófagos. También se presentó miocarditis multifocal moderada, hepatitis suave, suave nefritis y tonsilitis. Los dos cerdos inoculados con ISU-12 se seroconvirtieron a PRRS a los 10 DPI. Los cerdos de control permanecieron clínicamente normales durante todo el experimento, y no mostraron lesiones grandes ni microscópicas. También siguieron siendo seronegativos para PRRS.
(D) Experimento 92.12 SPF
El ISU-12 no clonado biológicamente era patogénico para cerdos SPF, y produjo neumonía intersticial, miocarditis y encefalitis, tal como se ha descrito anteriormente para el experimento 92.10 SPF. Los cerdos inoculados con tres clones biológicos de ISU-12 (placas números 1, 2 y 3) produjeron neumonía intersticial suave, pero no se detectó en estos cerdos prueba de la proliferación de neumocitos del tipo II, de exudación alveolar, de miocarditis y/o encefalitis. Todos los cerdos inoculados con ISU-12, clonados o no clonados, se seroconvirtieron a PRRS a los 10 DPI. Los cerdos de control permanecieron libres de infección de virus y de enfermedad.
(V) Resumen
Se reprodujo experimentalmente neumonía severa en cerdos SPF de cinco semanas con filtrados de pulmón y de corazón (0,22 \mum) a partir de cerdos afectados de forma natural (ISU-12). La neumonía producida por la cepa Iowa de PRRSV (ISU-12) se caracteriza por neumonía intersticial, proliferación de neumocitos de tipo II, y formación de células sincitiales. Se observan miocarditis y encefalitis en los cerdos afectados. El ISU-12 produjo efectos citopáticos (CPE) en cultivos de macrófagos alveolares de cerdo y una línea celular continua, PSP-36. Se detectaron antígenos virales por inmunofluorescencia indirecta en cultivos infectados por ISU-12, pero no en células no infectadas. El ISU-12 se relaciona antigénicamente a la cepa VR-2332 del virus PRRS por inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales. No obstante, se observaron diferencias en lesiones microscópicas de los cerdos infectados con ISU-12 no purificado en placas, indicando por lo tanto que otro virus o agente infeccioso puede ser desarrollado en PSP-36, y que otros virus o agentes infecciosos pueden ser la razón de que la enfermedad y lesiones provocadas por la cepa Iowa de PRRSV sean distintas y más graves que las indicadas para el virus PRRS en la literatura. Todos los cerdos inoculados con ISU-12, clonados o no clonados, se seroconvirtieron a PRRS a los 10 DPI. Los cerdos de control permanecieron libres de infección de virus y de enfermedad.
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Experimento III
Clonado molecular y secuenciado de nucleótidos de la región del terminal 3' del agente infeccioso asociado con la cepa Iowa del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (I) Materiales y métodos (A) Propagación y purificación del virus
A continuación, para simplificar la explicación, los términos "virus" y "viral" se referirán a un virus o agente infeccioso con el significado descrito en lo anterior para la presente solicitud, o a una característica del virus o agente infeccioso.
Se utilizó una línea celular continua, PSP-36, para aislar y propagar el aislado ISU-12, asociado con la cepa Iowa de PRRSV. El virus ISU-12 fue purificado en placa 3 veces sobre células PSP-36. Las células PSP-36 fueron infectadas a continuación con el virus purificado en placa. Cuando más del 70% de las células infectadas mostraron cambios citopáticos, el cultivo fue congelado y descongelado tres veces. El medio de cultivo fue clarificado a continuación por centrifugación a baja velocidad, a 5.000 X g durante 15 minutos a 4ºC. El virus fue precipitado a continuación con 7% PEG-8000 y 2,3% NaCl a 4ºC durante una noche con agitación, y el precipitado fue reducido a pastillas por centrifugación. Las pastillas del virus fueron resuspendidas en 2 ml de tampón tris-EDTA, y aplicada en forma de capas sobre un gradiente CsCl (1,1245-1,2858 g/ml). Después de ultracentrifugación a 28.000 rpm durante unas 8 horas a 20ºC, se observó y se recogió una banda transparente con una densidad de 1,15-1,18 g/ml. La concentración de infectividad de esta banda se determinó por medio de IFA, y se halló un valor de 10^{6} TCID_{50}/ml. También se observaron partículas de virus típicas por microscopio electrónico de tinción negativa (EM).
(B) Aislamiento de RNA viral
El RNA total fue aislado de la banda que contenía virus del gradiente CsCl con un equipo de aislamiento de RNA comercial (obtenido de la firma Stratagene). A continuación se enriqueció poli(A) RNA por cromatografía de columna de oligo (dt) celulosa, de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante de la columna (Invitrogen).
(C) Construcción de una biblioteca de ISU-12 cDNA \lambda
Se muestra en la figura 16 un proceso general esquemático para la construcción de una biblioteca de cDNA \lambda. Se llevó a cabo síntesis de la primera columna de cDNA del mRNA por transcripción inversa utilizando un cebador oligo (dt) que tiene un sitio de restricción Xho I. La mezcla de nucleótidos contenía dATP, dGTP, dTTP normal y el análogo de 5-metilo dCTP, que protege el cDNA con respecto a las encimas de restricción utilizadas en las etapas posteriores de clonado.
A continuación se llevó a cabo la síntesis de la segunda columna de cDNA con Rnasa H y DNA polimerasa I. Los términos de cDNA se hicieron romos ("blunt-ended") con polimerasa T4 DNA, se ligó a adaptadores EcoR I con T4 DNA ligasa, y a continuación se quinasó (es decir, se fosforiló) con quinasa de T4 polinucleótido. El cDNA fue digerido con Xho I, y el cDNA digerido fue seleccionado sobre gel de agarosa. El cDNA digerido mayor de 1 kb de dimensiones fue seleccionado y purificado mediante un kit de purificación de DNA de tipo comercial (GENECLEAN, disponible de la firma BIO 101, Inc., La Jolla, California).
El cDNA purificado fue ligado a continuación en los brazos de vector fago lambda, diseñado con extremos cohesivos Xho I y EcoR I. El vector ligado fue empaquetado en fagos lambda infecciosos con extractos lambda. La cepa SURE (de la firma Stratagene) de células de E. Coli fue utilizada para transfección, y la biblioteca lambda fue amplificada a continuación y concentrada en la cepa de células azules XL-1.
(D) Rastreo de la biblioteca \lambda por hibridación diferenciada
Se muestra en la figura 17 un proceso esquemático general para identificar clones auténticos de la cepa ISU-12 del virus PIP por hibridación diferencial, y se describe a continuación. La biblioteca \lambda fue aplicada en placas sobre células azules XL-1, se levantaron placas sobre membranas de nilón en duplicados, y se desnaturalizó con 0,5 N NaOH por metodología convencional. Se aislaron RNA mensajeros de células PSP-36 infectadas por virus, y células PSP-36 no infectadas mediante cromatografía de columna de oligo (dT)-celulosa, tal como se ha descrito por el fabricante de la columna (Invitrogen).
Se sintetizaron sondas de DNA complementarias a partir de los mRNA aislados de células PSP-36 infectadas por virus, y células normales PSP-36 utilizando cebadores al azar en presencia de ^{32}P-dCTP de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante (Amersham). Dos sondas (la primera sintetizada de células PSP-36 infectadas por virus, la otra procedente de células PSP-36 normales, no infectadas) fueron purificadas a continuación individualmente mediante cromatografía de columna Sefadex G-50. Las sondas fueron hibridadas con membranas de nilón duplicadas, respectivamente, a 42ºC en 50% de formamida. Se aislaron placas que hibridizaron con la sonda preparada a partir de células infectadas por virus, pero no con la sonda preparada a partir de células normales. Los fagémidos conteniendo insertos virales cDNA fueron recuperados por excisión in vitro con ayuda del fago helper G408. Los fagémidos recuperados fueron amplificados a continuación sobre células azules XL-1. Los plásmidos conteniendo insertos de cDNA viral fueron aislados por cromatografía de columna Qiagen, y a continuación fueron secuenciados.
(E) Secuenciado de nucleótidos y análisis de secuencia
Se purificaron plásmidos conteniendo insertos de cDNA viral por cromatografía de columna Qiagen, y se secuenciaron por el método dideoxi de Sanger con cebadores universales e inversos, así como una serie de cebadores de oligonucleótidos internos. Las secuencias fueron obtenidas a partir de tres clones separados como mínimo. Se secuenciaron clones o regiones adicionales cuando se obtuvieron datos de secuencia ambiguos. Los datos de secuencia de nucleótidos fueron reunidos y analizados independientemente utilizando dos programas de software de ordenador, GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, California) y MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut).
(F) Cebadores de oligonucleótidos
Se sintetizaron oligonucleótidos en forma de DNA de columna única utilizando un sintetizador de DNA automatizado (Applied Biosystems) y se purificaron por HPLC. Se sintetizaron los oligonucleótidos PP284 (5'-CGGCCGTG
TG GTTCTCGCCA AT-3'; SEQ ID NO:1) y PP285 (5'-CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-3'; SEQ ID NO:2) para amplificación por PCR. Se generó una sonda de DNA con esos dos cebadores a partir del extremo 3' del genoma viral por análisis de transferencia Northern (ver explicación más adelante). Los oligonucleótidos PP286 (5'-GCCGCG
GAAC CATCAAGCAC-3'; SEQ ID NO:3) y PP287 (5'-CAACTTGACG CTATGTGAGC-3'; SEQ ID NO:4) fueron sintetizados para amplificación por PCR. Se utilizó una sonda de DNA generada por estos dos cebadores para rastrear adicionalmente la biblioteca \lambda. Se utilizaron los oligonucleótidos PP288 (5'-GCGGTCTGGA TTGACGACAG-3'; SEQ ID NO:5), PP289 (5'- GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3'; SEQ ID NO:6), PP386 (5'-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3'; SEQ ID NO:7), PP286 y PP287 fueron utilizados como cebadores de secuenciado para obtener secuencias internas.
(G) Análisis de transferencia Northern
Un fragmento específico de DNA del extremo 3' del clon cDNA de ISU-12 fue amplificado por PCR con los cebadores PP284 y PP285. El fragmento de DNA fue cortado de un gel de agarosa con un equipo de purificación de DNA de tipo comercial (GENECLEAN, de la firma Bio 101), y se marcó con ^{32}P-dCTP por extensión de cebador al azar (utilizando un equipo de la firma Amersham). Se aisló el RNA total de células de PSP-36 infectadas con ISU-12 a las 36 horas después de la infección, utilizando un equipo de tipo comercial para aislamiento de RNA total con el proceso descrito por el fabricante (Stratagene). Se desnaturalizaron especies subgenómicas mRNA de ISU-12 con 6 M glioxal y DMSO, y se separaron sobre un gel de agarosa al 1%. (Resultados de un proceso similar sustituyendo un gel de agarosa al 1,5% se describen en el experimento VIII que se indica más adelante y que se muestra en la figura 32). Los mRNA subgenómicos separados fueron transferidos entonces sobre membranas de nylon utilizando un dispositivo de transferencia a presión POSIBLOT^{TM} (Stratagene). La hibridación fue llevada a cabo en una estufa de hibridación con botellas "roller" a 42º y 50% de formalmida.
Resultados (A) Clonación, identificación y secuenciado del genoma del terminal 3' de ISU-12
Se construyó una biblioteca de cDNA \lambda con cebado por oligo (dT), a partir de un virus parcialmente purificado, obtenido a partir de células PSP-36 infectadas con ISU-12. Se encontraron problemas en el rastreo de la biblioteca de cDNA \lambda con sondas basadas en las secuencias de virus Lelystad. Se prepararon tres equipos de cebadores. El primer equipo (PP105 y PP106; SEQ ID NOS: 18-19) corresponde a las posiciones 14577 a 14596 y 14977 a 14995 de la secuencia genómica de Lelystad, situada en la zona del gen nucleocápsido. El segundo juego (PP106 y PP107; SEQ ID NOS: 19-20) corresponde a las posiciones 14977 a 14995 y 14054 a 14072 de la secuencia genómica de Lelystad, flanqueando los ORF 6 y 7. El tercer juego (PM541 y PM542; SEQ ID NOS: 21-22) corresponde a las posiciones 11718 a 11737 y 11394 a 11413 de la secuencia genómica de Lelystad, situada en la región ORF-1b.
PP105: 5' -CTCGTCAAGT ATGGCCGGT- 3' (SEQ ID NO: 18)
PP106: 5' -GCCATTCGCC TGACTGTCA- 3' (SEQ ID NO: 19)
PP107: 5' -TTGACGAGGA CTTCGGCTG- 3' (SEQ ID NO: 20)
PM541: 5' -GCTCTACCTG CAATTCTGTG- 3' (SEQ ID NO: 21)
PM542: 5' -GTGTATAGGA CCGGCAACCG- 3' (SEQ ID NO: 22) 
\newpage
Todos los intentos de generar sondas por PCR a partir del agente infeccioso de ISU-12 utilizando esos tres conjuntos de cebadores fracasaron. Después de varios intentos utilizando la técnica de hibridación diferencial, no obstante, se aislaron las placas auténticas representando cDNA de específico de ISU-12 utilizando sondas preparadas a partir de células PSP-36 infectadas con ISU-12 y células PSP-36 normales. Los procesos involucrados en la hibridación diferencial se describen y se indican en la figura 17.
Se identificaron inicialmente tres placas positivas (\lambda-4, \lambda-75 y \lambda-91). Flagémidos manteniendo insertos de cDNA viral dentro del \lambda fago fueron recuperados por excisión in vitro con la ayuda de fagos helper G408. Los insertos de los clones positivos fueron analizados por digestión de enzima de restricción y con un secuenciado terminal. La especificidad de los clones de cDNA fue confirmada además por hibridación con RNA a partir de células PSP-36 infectadas con la cepa Iowa de PRRSV, pero no con el RNA de células PSP-36 normales. A continuación, se generó una sonda de DNA a partir del extremo 5' del clon \lambda-75 por PCR con los cebadores PP286 y PP287. Se identificaron otras placas positivas (\lambda-229, \lambda-268, \lambda-275, \lambda-281, \lambda-323 y \lambda-345) utilizando esta sonda. Todos los clones de \lambda cDNA utilizados para obtener las secuencias de nucleótido del terminal 3' se presentan en la figura 18. Como mínimo, tres clones separados fueron secuenciados para eliminar errores. En el caso de cualesquiera datos de secuencia ambiguos, se utilizaron clones adicionales y cebadores internos (PP288, PP289, PP286, PP287 y PP386) para determinar la secuencia. La secuencia del terminal 3' de 1938-pb (SEQ ID NO: 8) es presentada en la figura 19, y la secuencia deducida de aminoácido (SEQ ID NO: 9) es presentada en la figura 20.
(B) Conjunto encajado ("nested") de mRNA subgenómico
Se separó RNA total de células PSP-36 infectadas con virus sobre gel 1% glyoxal/DMSO agarosa, y se transfirió sobre membranas de nylon. Se generó una sonda de cDNA por PCR con un conjunto de cebadores (PP284 y PP285) flanqueando la zona terminal del extremo 3' del genoma viral. La sonda contiene una secuencia no traslacional 3' y la mayor parte de la secuencia ORF-7. Los resultados de la hibridación por transferencia Northern muestran que el patrón de la especie de mRNA de las células PSP-36 infectadas con la cepa Iowa de PRRSV es muy similar al del virus Lelystad (LV), virus de arteritis equina (EV), virus elevador de lactato dehidrogenasa (LDV) y coronavirus, por el hecho de que la replicación del virus requirió la formación de mRNA subgenómicos.
Los resultados indican también que el mRNA subgenómico específico de ISU-12 representa un conjunto encajado en 3' de mRNA, porque la sonda de transferencia Northern representa solamente la secuencia terminal del extremo 3'. Las dimensiones del RNA genómico viral de ISU-12 (14 kb) y 6 mRNA subgenómicos (RNA 2 (3,0 kb), RNA 3 (2,5 kb), RNA 4 (2,2 kb), RNA 5 (1,8 kb), RNA 6 (1,3 kb) y RNA 7 (0,98 kb)) se parecen a los de LV (figura 18), si bien hay diferencias tanto en la especie de genoma como en el RNA subgenómico. También se han observado diferencias en las cantidades relativas de los mRNA subgenómicos, siendo el RNA 7 el mRNA subgenómico más
predominante.
(C) Análisis de marcos de lectura abiertos codificados por RNA subgenómico
Tres ORF grandes han sido encontrados en SEQ ID NO:8:ORF-5 (nt 239-901; SEQ ID NO:10), ORF 6 (nt 889-1403; SEQ ID NO:12) y ORF 7 (nt 1403-1771; SEQ ID NO:14). ORF 4, situado en el extremo 5' de la secuencia resultante, es incompleto en la secuencia terminal 3' de 1938-pb de SEQ ID NO:8. Cada uno de los ORF 5, 6 y 7 tiene una capacidad de codificación superior a 100 aminoácidos. Los ORF 5 y ORF 6 se solapan entre sí en 10 pb, y ORF 6 y ORF 7 se solapan entre sí en 5 pb. Dos ORF más pequeños situados enteramente dentro del ORF 7 han sido encontrados también, codificando solamente para 37 aa y 43 aa, respectivamente. Otros dos ORF cortos se solapan de manera completa con ORF 5. La capacidad de codificación de estos dos ORF es solamente de 29 aa y 44 aa, respectivamente. No se han correlacionado mRNA subgenómicos con estos ORF más pequeños por análisis de transferencia Northern. Los ORF 6 y ORF 7 se cree que codifican la proteína de la membrana viral y la proteína de cápsido, respectivamente.
(D) Secuencia de consenso para unión conductora
El análisis de secuencia muestra que un motivo de secuencia corto, AACC, puede servir como lugar para los mRNA subgenómicos en el que el conductor es añadido durante la transcripción (lugar de unión). El lugar de unión de ORF 6 se encuentra 21 pb más arriba del codón de inicio ATG y el lugar de unión de ORF 7 se encuentra 13 pb más arriba del codón de inicio ATG, respectivamente. No se ha identificado secuencia de consenso AACC en ORF 5, si bien se ha observado en ORF 5 de LV. Se han encontrado secuencias de unión similares en LDV y EAV.
(E) Secuencia no traslacional 3' y cola poli (A)
Una secuencia no traslacional de 150 nucleótidos de longitud (150 nt) que sigue al codón de interrupción de ORF 7 ha sido identificada en el genoma del virus ISU-12, en comparación con 114 nt en LV, 80 nt en LDV y 59 nt en EAV. La longitud de la cola de poli (A) es como mínimo de 13 nucleótidos. Existe una secuencia de consenso CCGG/AAATT-poli (A) entre el virus PIP ISU-12, LV y LDV en la zona adyacente a la cola de poli (A).
(F) Comparación de secuencia de genomas de ISU-12 y LV entre los ORF 5, 6 y 7, y entre secuencias no translacionales
Se muestra en la figura 21 una comparación de las regiones ORF-5 de los genomas de ISU-12 y de los virus de Lelystad. Las correspondientes comparaciones de la región ORF-6, la región ORF-7 y las secuencias no translacionales se muestran, respectivamente, en las figuras 22, 23 y 24.
Los resultados de la comparación se indican en la tabla III a continuación. De modo correspondiente con la anterior descripción, se considera que un virus es inmunológicamente equivalente si tiene una homología del 90% o superior con un virus inmunogénico. Las homologías de secuencias de nucleótidos entre LV e ISU-12 de ORF5, ORF6, ORF7 y las secuencias no translacionales son de 60%, 68%, 60% y 58%, respectivamente. De acuerdo con ello, LV e ISU-12 son equivalentes no inmunogénicos.
Las dimensiones de las ORF5 y 6 en LV son 61 nt y 3 nt menores que las de ORF5 y 6 en ISU-12, respectivamente. Como contraste, las dimensiones de ORF7 en LV son 15 nt mayores que en ISU-12. Asimismo, la secuencia no translacional del terminal 3' es distinta en longitud (15 nt en ISU-12, pero solamente 114 nt en LV). Igual que LV, la secuencia de unión, AACC, ha sido identificada también en el genoma de la cepa Iowa del aislado ISU-12 del virus PRRS, excepto en lo que respecta a ORF5. La secuencia de unión de ORF6 en ISU-12 se encuentra 21 nt con respecto al codón inicial ATG, mientras que la secuencia de unión de ORF6 se encuentra 28 nt más arriba con respecto a ATG en LV.
TABLA III
3
Experimento IV
Expresión de genes de agente infeccioso de cepa Iowa en células de insectos (A) Producción de baculovirus recombinante
Las secuencias ORF-5, ORF-6 y ORF-7 fueron amplificadas individualmente por PCR utilizando cebadores basados en la secuencia de nucleótidos genómica de ISU-12. El ORF-5 fue amplificado utilizando los siguientes cebadores:
5' -GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3'
(SEQ ID NO:23)
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3' -GGGAATTCGC CAAGACACC TTTTGTGG-5'
(SEQ ID NO:24)
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El ORF-6 fue amplificado utilizando los siguientes cebadores:
5' -GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3'
(SEQ ID NO:25)
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3' -GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5'
(SEQ ID NO:26)
\vskip1.000000\baselineskip
El ORF-7 fue amplificado utilizando los siguientes cebadores:
5' -GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3'
(SEQ ID NO:27)
\vskip1.000000\baselineskip
3' -GGGAATTCAC CACGCATTC -5'
(SEQ ID NO:28)
Los fragmentos de DNA amplificados fueron clonados en un vector de transferencia de baculovirus pVL1393 (de la firma Invitrogen). Se mezclaron un \mug de baculovirus linealizado AcMNPV DNA (disponible comercialmente de Pharmingen, San Diego, California) y 2 \mug de constructos de vector conteniendo cDNA clonado y amplificado PCR con 50 \mul de lipofectina (Gibco) y se incubó a 22ºC durante 15 minutos para preparar una mezcla de transfección. Una hora después de sembrado con células HI-FIVE, el medio fue sustituido con un medio de cultivo de células de insectos Excell 400 (de la firma JR Scientific Co.), y la mezcla de transfección fue añadida gota a gota. La mezcla resultante fue incubada a 28ºC durante seis horas. Después de ello, el medio de transfección fue retirado, y se añadió medio de cultivo fresco de células de insectos Excell 400. La mezcla resultante fue incubada a continuación a 28ºC.
Cinco días después de la transfección, el medio de cultivo fue recogido y clarificado. Se inocularon diluciones con multiplicidad diez en células HI-FIVE, y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de descartar el inóculo, se aplicó una capa de 1,25% de agarosa sobre las células. Se llevó a cabo incubación a 28ºC durante cuatro días. Después de ello, se seleccionaron placas transparentes y se recogieron utilizando una pipeta Pasteur estéril. Cada una de las placas fue mezclada con 1 ml de medio de insectos Grace en un tubo de 5 ml con tapón a presión, y se colocó en un refrigerador durante una noche para liberar virus de la agarosa. Se centrifugaron tubos durante 30 minutos a 2.000 g para eliminar la agarosa, y los sobrenadantes fueron transferidos a nuevos tubos estériles. Se repitieron las etapas de purificación en placa tres veces para evitar posible contaminación con virus de tipo salvaje. Los clones recombinantes puros fueron almacenados a -80ºC para investigación adicional.
(B) Expresión de agentes infecciosos de cepa Iowa recombinantes Proteínas del agente
Se realizaron ensayos de inmunofluorescencia indirecta y pruebas de radio inmunoprecipitación para evaluar la expresión.
Ensayo de inmunofluorescencia indirecta: células de insectos Hi-five, mostradas en la figura 25, en una placa de agrupación de cultivo de células de 24 pocillos, fueron infectadas con baculovirus o baculovirus recombinante de tipo salvaje, o fueron infectadas de modo falso. Después de 72 horas, se fijaron las células y se efectuó tinción con diluciones apropiadas de anticuerpos policlonales anti-ISU-12 de cerdo, seguido de IgG anti cerdo (marcado FITC), marcado con fluoresceína isotiocianato. Tal como se ha mostrado en las figuras 26-29, se detectó inmunofluorescencia en células infectadas con los virus recombinantes, pero no en las células infectadas falsamente o células inoculadas con baculovirus de tipo salvaje. Por ejemplo, la figura 26 muestra células HI-FIVE infectadas con baculovirus recombinante conteniendo el gen ISU-12 ORF-6 (Baculo.PRRSV.6), que muestran efecto citopático. La figura 27 muestra células HI-FIVE infectadas con otro baculovirus recombinante conteniendo el gen ISU-12 ORF-7 (Baculo.PRRSV.7), que muestra también efecto citopático. Se obtuvieron resultados similares con baculovirus recombinante conteniendo ORF-5 (Baculo.PRRSV.5, no se muestran datos). Las figuras 28 y 29 muestran células HI-FIVE infectadas con un baculovirus recombinante conteniendo el gen ISU-12 ORF-6 y el gen ISU-12 ORF-7, respectivamente, con tinción con antisuero de cerdo para ISU-12, seguido de IgG anti cerdo conjugado con fluoresceína, en el que las células de insectos producen proteína del agente infeccioso de la cepa Iowa recombinante. Se obtuvieron resultados similares con baculovirus recombinante conteniendo ORF-5.
Radioinmunoprecipitación: Se llevó a cabo radioinmunoprecipitación con cada uno de los virus recombinantes (Baculo.PRRSV.5, Baculo. PRRSV.6 y Baculo. PRRSV.7) para determinar adicionalmente la antigenicidad y autenticidad de las proteínas recombinantes. Se infectaron en falso células de insectos HI-FIVE o alternativamente infectadas con cada uno de los baculovirus recombinates. Dos días después de la infección, se añadió medio libre de metionina. Cada una de las mezclas fue incubada durante dos horas, y a continuación se añadieron proteínas marcadas con ^{35}S-metionina (Amersham), y la mezcla fue incubada durante otras cuatro horas a 28ºC. Se prepararon lisados de células radioenmarcadas por tres ciclos de congelación y descongelación, y los lisados de células fueron incubados con antisuero pre-inmune o inmune anti-ISU-12. Los complejos inmunes fueron precipitados con proteína A agarosa y analizados sobre SDS-PAGE después de ebullición. Se expuso una película de rayos X a los geles a -80ºC y se reveló. Se detectaron bandas de las dimensiones esperadas con productos ORF-6 (Figura 30) y ORF-7 (Figura 31).
Experimento V
Otras muestras de PRRSV, descritas en la siguiente tabla 4, se purificaron mediante placas tres veces. La purificación mediante placas se llevó a cabo cultivando un homogeneizado de tejidos clarificado sobre células PSP-36-SAH y seleccionando una placa única, suponiendo que una placa es producida por un virus único. La placa seleccionada fue cultivada a continuación, y se seleccionó nuevamente una placa única, y a continuación se cultivó una tercera vez. Se llevó a cabo IFA utilizando anticuerpo monoclonal anti-PRRSV adquirido de South Dakota State University, Brookings, South Dakota.
Algunas muestras aisladas seleccionadas para estudio adicional se identifican en la siguiente tabla 5, y se caracterizan por su patogeneicidad y número de mRNA.
TABLA 4
4
TABLA 5
5
Se han depositado muestras de cada uno de los ISU-12 purificados sin placa, ISU-12 purificados en placa, ISU-22, ISU-51, ISU-55 e ISU-3927 según los términos del tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, en 28 de Octubre de 1992 con los números de accesión VR 2385, VR 2386, y el 29 de Septiembre de 1993 con los números de accesión (pendientes de asignar) VR 2429, VR 2428, VR 2430 y VR 2431, respectivamente.
Los mRNA de ISU-3927 mostraron deleciones en cuatro de los siete mRNA. Los mRNA 4, 5, 6 y 7 de ISU-3927 migraron con mayor rapidez que los de ISU-12 y, por lo tanto, son más pequeños que los de ISU-12. Esta característica puede ser relacionada posiblemente a la menor virulencia de ISU-3927.
La patogeneicidad de seis aislados fue comparada en cerdos CDCD de cinco semanas. Quince cerdos fueron inoculados con 10^{5} TCID_{50} de virus. Diez cerdos fueron necropsizados a los 10 DPI y cinco cerdos fueron necropcizados a los 28 DPI. Los virus aislados de ISU-12, ISU-22, e ISU-28 fueron los más patogénicos, mientras que ISU-51 y ISU-55 tenían una baja patogeneicidad. En un estudio anterior, ISU-3927 tenía solamente una patogeneicidad suave en cerdos de cinco semanas.
Las lesiones provocadas por ISU-22 y ISU-12 purificados sin placa (es decir, agente infeccioso aislado no purificado en placa) persisten durante periodos más prolongados que los provocados por virus purificados en placa. Los aislados purificados en placa producen miocarditis y encefalitis suave. Los aislados purificados sin placa producen enfermedad ligeramente más severa que los aislados correspondientes purificados en placa.
Los lechones CDCD proporcionan un modelo excelente para la evaluación de la patogenicidad y eficacia de las vacunas candidato. Los aislados ISU-12, ISU-22 y ISU-984 producen lesiones similares, y pueden ser utilizados para evaluar la eficacia de la vacuna basándose en exámenes de lesiones graves y microscópicas. El ISU-3927 es menos virulento pero es adecuado para evaluar una vacuna contra cepas patogénicas de PRRSV.
Cerdos infectados con ISU-12 purificado en placa ganaron un promedio de 9,9 libras menos que los cerdos de control (atacados con células PSP-36 no infectadas) durante un periodo de tiempo de 28 días. Los resultados preliminares indican que aparece linfopenia y neutrofilia de 2-10 DPI.
Solamente los cerdos infectados con ISU-12 no purificados en placa desarrollaron encefalitis significativa. No se observó rinitis en ninguno de los cerdos atacados con aislados de cepa Iowa clonada biológicamente (purificada en placa). Como contraste, la rinitis fue severa cuando se utilizaron como inóculo filtrados de tejidos (aislados no purificados en placa).
La patología e histología de los cerdos CDCD infectados con ISU-12 no purificados en placa, ISU-12 purificado en placa, ISU-22, ISU-984, ISU-3927 y células PSP-36 no infectadas se resumen en las siguientes tablas 6-12. En estas tablas, las lesiones graves de pulmón representan el porcentaje de consolidación del pulmón (es decir, el porcentaje de tejidos del pulmón con enfermedad de neumonía mostrando lesiones). La puntuación se basa en una escala de 0 a 100% de consolidación. "ND" significa que la calificación de la lesión grave de pulmón no fue determinada.
TABLA 6
6
En la tabla 6 anterior, "sin placa" significa purificado sin placa y "uninoc." significa no inoculado.
Los resultados de la tabla 6 muestran que ISU-12 e ISU-22 producen lesiones que persisten durante más tiempo que con otros aislados. Las lesiones producidas por ISU-12, ISU-22 y ISU-984 son de gravedad similar. Las lesiones producidas por ISU-3927 son mucho menos graves, y se resuelven antes que las lesiones producidas por otros aislados. Todas las lesiones graves fueron resueltas a los 36 DPI.
Los resultados de la patología presentados en las tablas 7-12 se basan en la misma escala de gravedad presentada para la anterior tabla 1. En las siguientes tablas 7-12 "Int. thick." significa aumento de grosor intersticial, "alv. exud." significa exudado alveolar y "encephal" significa encefalitis.
TABLA 7 Lesiones microscópicas de los 3 DPI
7
TABLA 8 Lesiones microscópicas de los 7 DPI
8 
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TABLA 9 Lesiones microscópicas de los 10 DPI
9 
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TABLA 10 Lesiones microscópicas de los 21 DPI
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TABLA 11 Lesiones microscópicas de los 28 DPI 
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TABLA 12 Lesiones microscópicas de los 36 DPI 
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A los 7 DPI, las lesiones de pulmón producidas por ISU-12, ISU-22 e ISU-984 son severas y similares entre sí. Las lesiones de pulmón producidas por ISU-3927 son solamente suaves o moderadamente severas a los 7 DPI.
A los 10 DPI, las lesiones de pulmón producidas por ISU-12, ISU-22 e ISU-984 son similares a las de los 7 DPI, pero algo más severas. Solamente los cerdos infectados por ISU-12 no purificado en placa muestran encefalitis suave y miocarditis. A los 10 DPI, las lesiones producidas por ISU-3927 se han resuelto prácticamente.
A los 21 DPI, la miocarditis producida por ISU-12 no purificado en placa es severa, mientras que la miocarditis producida por ISU-12, ISU-22 y ISU-984 es moderada. Solamente cerdos infectados por ISU-12 no purificado en placas muestran encefalitis moderada a los 21 DPI.
A los 28 DPI, las lesiones de pulmón son todavía moderadas en cerdos infectados por ISU-12 e ISU-22 no purificado en placa. Estos aislados producen también miocarditis severa a los 28 DPI. No obstante, las lesiones de pulmón producidas por ISU-12, ISU-984 e ISU-3927 están prácticamente resueltas a los 28 DPI.
A los 36 DPI, todas las lesiones se encuentran esencialmente resueltas. Solamente 1 cerdo por grupo fue examinado a los 36 DPI.
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Experimento VI
Se llevó a cabo un estudio de neutralización cruzada in vivo. Se inocularon cerdos CDCD por vía intranasal, en primer lugar, con un aislado seleccionado entre ISU-12, ISU-22, ISU-984 e ISU-3927, y a continuación, cuatro semanas más tarde, los cerdos fueron atacados con ISU-12. Se examinaron las lesiones de pulmón y síntomas de enfermedades a los 8 DPI después del ataque con ISU-12. Los cerdos de control fueron atacados solamente con ISU-12. Los resultados se indican en la siguiente Tabla 13.
Los resultados patológicos que se presentan en la siguiente Tabla 13 se basan en la misma escala de severidad presentada para la anterior Tabla 1. En la Tabla 13, "Int. thick." significa aumento de grosor intersticial, "alv. exud." significa exudado alveolar, y "encephal." significa encefalitis.
TABLA 13 Neutralización cruzada in vivo
13
Los datos de la Tabla 13 demuestran que el ISU-12 proporciona protección para los cerdos contra la mayor parte de síntomas de enfermedad provocados por ISU-12. ISU-984 proporciona protección contra algunos síntomas y señales clínicas de PRRS provocados por ISU-12, que se encuentra entre las cepas más virulentas conocidas del virus PRRSV.
No obstante, ISU-3927, una variante suavemente patogénica de la cepa Iowa del virus PRRS, proporciona la mayor protección de los aislados estudiados como vacuna viva contra un ataque posterior con ISU-12. Por lo tanto, el ISU-3927 puede mostrar perspectivas comerciales para su utilización como vacuna viva.
Experimento VII
Inocular grupos de 10 cerdos CDCD fueron aislados de la cepa Iowa de PRRSV relacionados en la siguiente Tabla 14, o con células PSP-36 no infectadas como control. Los cerdos tenían 5 semanas cuando fueron atacados por vía intranasal con 10^{5} TCID_{50} de cada aislado de virus indicado en la siguiente Tabla 14. Los cerdos fueron necropsizados a los 10 DPI.
La calificación de las lesiones de pulmón graves como promedio a los 10 DPI se indica en la siguiente Tabla 14 como indicación de la patogenicidad del aislado. La desviación estándar (SD) se facilita como indicación de la significancia estadística de la calificación de las lesiones graves de pulmón como promedio.
TABLA 14
14
En la siguiente Tabla 15 se facilita una comparación estadística de las calificaciones de las lesiones graves de pulmón.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 15 Comparación estadística de calificaciones de lesiones graves de pulmón 
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15 
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Además, cada grupo de cerdos fue examinado en cuanto a alteraciones respiratorias de acuerdo con el sistema clínico de calificación respiratoria anteriormente descrito (ver "Media de calificaciones clínicas" en la siguiente Tabla 16). "Calificación global" se refiere a la calificación de lesiones de pulmón graves que se han descrito anteriormente. "Enceph.", "myocard." and "rhinitis" se refieren al número de cerdos en cada grupo que mostró lesiones de encefalitis, miocarditis y rinitis, respectivamente. "Microcalificación" se refiere a una calificación basada en la escala siguiente, utilizada para evaluar y comparar lesiones microscópicas de pneumonía intersticial en tejidos pulmonares:
0 = sin enfermedad; tejidos pulmonares normales
1 = lesiones microscópicas multifocales suaves
2 = lesiones microscópicas difusas suaves
3 = lesiones microscópicas multifocales moderadas
4 = lesiones microscópicas difusas moderadas
5 = lesiones microscópicas multifocales severas
6 = lesiones microscópicas difusas severas
Se pueden observar lesiones microscópicas en tejidos que no muestran lesiones graves. Por lo tanto, la "micro calificación" proporciona un medio adicional de evaluación y comparación de la patogenicidad de estos aislados, en adición a las lesiones graves de pulmón, alteraciones respiratorias, fiebre, etc.
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(Tabla pasa a página siguiente)
16
Experimento VIII
El mRNA de células PSP-36 infectadas con cada uno de ISU-12, ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 e ISU-3927 fue aislado y separado sobre 1,5% de gel de agarosa, para conseguir una mejor separación de los mRNA subgenómicos. Se observaron dos grupos de modelos de emigración.
El grupo I comprende los aislados ISU-12, ISU-1894, ISU-3927 y, posiblemente, ISU-51. La transferencia Northern de ISU-12 se muestra en la figura 32, y las transferencias Northern de ISU-1894, ISU-3927 e ISU-51 se muestran en la figura 33. Igual que en el virus Lelystad, se encontraron siete mRNA subgenómicos (marcados 1-7 en las figuras 32 y 33) en cada uno de estos aislados. Las dimensiones de los mRNA subgenómicos (SgRNA) son similares a los del virus Lelystad.
El grupo II comprende los aislados ISU-22, ISU-55, e ISU-79. Cada uno de estos aislados tiene nueve SgRNA, en vez de siete. Los SgRNA 1, 2, 3, 6 y 7 del grupo II son los mismos que los del grupo I, pero se encontraron dos SgRNA adicionales entre los SgRNA 3 y 6 del grupo I, indicados por las flechas de la figura 33.
Los resultados preliminares indican que el virus de grupo II puede replicar mejor que los aislados del grupo I, con la posible excepción de ISU-12 en células PSP-36. No obstante, en algunos casos, incluso ISU-12 puede replicar de manera escasa, en comparación con los aislados del grupo II.
Experimento VIII
Se llevó a cabo un estudio de eficacia de la vacuna viva modificada contra el virus (PRRSV) del síndrome respiratorio y reproductivo porcino en cerdos SPF, seronegativos PRRSV, de tres semanas. La vacuna consistía en 10^{5,8} TCID_{50} de ISU-12 PRRSV purificado en placas (cepa Iowa) por cada dosis de 2 ml. Nueve cerdos recibieron una dosis de vacuna única por ruta intranasal (IN), 7 cerdos recibieron una vacuna única por ruta intramuscular (IM), y 9 cerdos sirvieron como controles de ataque no vacunados (NV/CHALL). Los animales vacunados y los controles fueron atacados en el día 35 después de la vacunación, y a continuación fueron calificados en cuanto a lesiones pulmonares graves (porcentaje de pulmón afectado) en el día 10 después del ataque.
Las calificaciones de las lesiones de pulmón graves como promedio para cada grupo de cerdos se han mostrado por el número situado encima de cada una de las barras de la figura 34. La eficacia de la vacuna fue evaluada por reducción en la calificación de la lesión de pulmón. Ambos grupos vacunados demostraron calificaciones de lesión de pulmón graves significativamente más bajas (p < 0,01) que los controles no vacunados. No se encontraron entre grupos de vacunados diferencias significativas en las calificaciones. La vacuna ISU-12 PRRSV se demostró eficaz en cerdos de tres semanas de edad con una dosis de 10^{5,8} TCID_{50}.
Otras observaciones
El virus ISU-12 tiene envolvente, dado que es sensible al tratamiento con cloroformo. La replicación de ISU-12 es resistente a tratamiento de 5-bromodeoxiuridina. Por lo tanto, ISU-12 no es un virus DNA. El ISU-12 carece de actividad hemaglutinante.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SOLVAY ANIMAL HEALTH, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: NORTHLAND DRIVE, 1201
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: MENDOTA HEIGHTS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: MINNESOTA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 55120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 214 OFFICE AND LAB
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: AMES
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: IOWA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 500011-3020
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VACUNAS CONTRA ENFERMEDAD REPRODUCTIVA Y RESPIRATORIA PORCINA, MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LAS MISMAS, Y DNA OBTENIDO A PARTIR DE UN VIRUS QUE PROVOCA ENFERMEDAD REPRODUCTIVA Y RESPIRATORIA PORCINA.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SOLVAY (Société Anonyme)
\vskip0.500000\baselineskip
\hskip2,6cm
Département de la Propiété Industrielle
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: rue de Ransbeek, 310
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: BRUSELAS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 1120
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: EP 93203042.2
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE SOLICITUD: 29-OCT-1993
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 969.071
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-OCT-1992
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 131.625
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-OCT-1993
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: LECHIEN, Monique
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 27810
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE ARCHIVO: SAH 92/03
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 32(2) 264-21-11
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 32(2) 264-29-55
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 23678 SOLNOH B
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCGCGGAAC CATCAAGCAC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACTTGACG CTATGTGAGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGTCTGGA TTGACGACAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACTGCTAGG GCTTCTGCAC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCATTCAGC TCACATAGCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1938 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 85 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteina
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 667 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 605 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lelystad
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 526 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 522 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lelystad
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 372 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 387 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lelystad
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
27
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 164 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 127 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lelystad
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Lelystad
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCATTCGCC TGACTGTCA 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGACGAGGA CTTCGGCTG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTCTACCTG CAATTCTGTG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGTATAGGA CCGGCAACAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGATCCTT GTTAAATATG CC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CARACTERÍSTICAS COLUMNAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: DNA (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: ISU-12
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTACGCACC ACTTAAGGG 
\hfill
19

Claims (13)

1. Virus aislado de origen natural que provoca el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), seleccionado del grupo que consiste en los virus depositados en la American Type Culture Collection con los números de acceso VR 2385 y VR 2386.
2. Composición que comprende el virus aislado de la reivindicación 1 y un portador fisiológicamente aceptable.
3. Vacuna que protege a los cerdos contra el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) que comprende un virus inactivado o atenuado y un portador fisiológicamente aceptable, en el que antes de la inactivación o atenuación, dicho virus es el virus de la reivindicación 1.
4. Vacuna, según la reivindicación 3, que comprende además un coadyuvante.
5. Método para la producción de la vacuna de la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas:
-a) recoger una muestra suficientemente grande de un virus según la reivindicación 1, y
-b) tratar dicho virus de forma seleccionada del grupo que consiste en (i) purificación en placas del virus, (ii) calentar dicho virus a una temperatura y un tiempo suficientes para inactivar dicho virus, (iii) exponer o mezclar dicho virus con una cantidad de un producto químico inactivante suficiente para inactivar dicho virus, (iv) fraccionar dicho virus en sus subunidades correspondientes y aislar como mínimo una de dichas subunidades y (v) sintetizar o aislar un ácido polinucleico que codifica una proteína de superficie de dicho virus, infectando una célula hospedante adecuada con dicho ácido polinucleico, cultivando dicha célula hospedante y aislando dicha proteína superficial de dicho cultivo.
6. Método, según la reivindicación 5, en el que dicho virus es recogido de una fuente seleccionada entre el grupo que consiste en un medio de cultivo, células infectadas con dicho virus y conjuntamente un medio de cultivo y células infectadas con dicho virus.
7. Método, según la reivindicación 6, que comprende además la etapa de cultivar dicho virus en un medio adecuado antes de dicha fase de recogida.
8. Equipo de diagnóstico para el ensayo de un virus que provoca enfermedad respiratoria porcina, enfermedad reproductiva porcina o enfermedad respiratoria y reproductiva porcina, que comprende un anticuerpo dirigido al virus de la reivindicación 1 y un agente de diagnóstico que indica la reacción inmunológica positiva con dicho anticuerpo.
9. Polinucleótido aislado que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:10, SEQ ID Nº:12 Y SEQ ID Nº:16.
10. Proteína codificada por el polinucleótido aislado de la reivindicación 9.
11. Polinucleótido aislado que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3, y SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5, SEQ ID Nº:6 Y SEQ ID Nº:7.
12. Método para el cultivo de un virus, según la reivindicación 1, que comprende:
infectar una línea celular seleccionada entre el grupo que comprende ATCC CRL 11171, y líneas celulares equivalentes capaz de ser infectada con dicho virus y cultivada, y cultivar dicha línea celular infectada en un medio adecuado.
13. Método, según la reivindicación 12, en el que dicha línea celular adecuada es ATCC CRL 11171.
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