TW497973B - Highly virulence and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome - Google Patents

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Description

497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ' . A7 ____ B7_.__五、發明説明（/) ， .… 本案傺為於1992年10月30日提申，且編號為07/969,071 (現已棄放）的專利申請案之一部份延續申請案。 發明背景 本發明是有關一保護豬隻免受由呼吸性及複製性病毒 所引起的疾病、一保護豬隻免受呼吸性及生殖性疾病、一 生産疫苗的方法，以及由導致豬隻呼吸性及生殖性疾病之 病毒所得的DNA。 背景討論 在近些年，北美及歐洲豬群十分容易為呼吸性及生殖 性病毒之新菌株所感染（見於A.A.S.P.,九月/十月 1991, pp.7-ll；The Veterinary Record, February 1, 1992, pp.87-89; Ibid·,十一月 30,1991, pp.495-49 6;Ibid,十月 26, 1993，p, 370; Ibid·,十月 19, 1991, pp.367-368;Ibid，八月 3，1991，ρ· 102-、 103;Ibid,七月 6, 1991;Ibid,六月 22，1991, ρ· 578 ;Ibid,六月 15, 1991，ρ· 574;Ibid,六月 8, 1991, P. 536;Ibid,六月 1，1991, ρ· 511;Ibid,三月 2， 1991，p. 213;)。在這些菌株中第一個體鑑定出的為一結 合著所謂的神祕豬隻疾病（Mystery Swine Disease，MSD) 或〃藍耳症〃（blue-eared syndrome).的病毒，該病徵即 為現今所知的豬隻不繁殖以及呼吸性症狀（SIRS)或豬隻_ 生殖性呼吸性病徽（PRRS)。在歐洲，此種疾病已被諝為豬 隻流行性流産及呼吸性病徵（PEARS)，藍色流産疾病（blue 一 4 ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 ——· A7 ____B7__ 五-、發明説明（2 ) 、… abortion disease)、藍耳疾病（blue ear disease)、 abortus blau (荷蘭）及Seuchenhater Spatabort der schweine (德國），且其對對應的病毒稱為〃萊西斯倍 德（Lelystad)病毒。在美國，此疾病被稱為瓦伯許（ Wabash)疾病、神祕豬隻疾病（MPD)及豬隻斑點症。常 與PRRS相結合的疾病為增殖性且對間質組織有影響 的肺炎。 〃籃耳疾病〃的發生是在大英國協、德國、比利時、 及荷蘭的豬隻中發現。它的發生造成豬隻展示會的取消。 該PRRS的症狀包含不願意吃（厭食症）、輕微發燒（發熱 )、末端為蒼藍症（顯箸的為淡藍色的身朵）、死胎、流 産、對感染的小豬造成高死亡率、生出體弱的小豬以及母 豬不足月即生産。 對已感染的母豬大部份生出還、活著的小豬會在48小 時間死亡。PRRS的臨床徵狀包含類於輕微的流行性感冒徵 狀、呼吸急促（thumping)、一擴散於組織間隙中的局部 急性肺炎。PRRS病毒由與感染動物體接觸後約有二二週的 培育期間，該病毒顯然是一具被膜的動脈病毒（arteri -virus)(Ibid.,二月1,1991)，該病毒成功地在豬肺胞呑 噬細胞中及CL1621細胞中生長（Benfie.Id等人，J. Vet, Diagn* Invest·, 4:127-133，1992; Collins等人，
Swine Interti 1 ity and Respiration Syndrome/ Myster y Swine Disease,. Proc., Minnesota Swime Conferen- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（夕） ce for Veterinarians, ρρ· 200-205, 1991)，且在 MARC -145細胞中生長（Joo，PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine Conmference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993), 20: 53-55)。對可造成SIRS之病毒成功的培養亦 在 W e n s ν ο o r t 等人（M y s t e r y S w i n e D i s e a s e i n t h e Netherlands·· The Isolation of Lelystad Virus. Vet Quart, 13:121-130)中報導。 在美國發生的PRRS已經危害到豬隻農場工業上。在 加拿大，PRRS在母豬上會持續至多二週的厭食及發熱的持 擻，後期為流産、增加死胎率、生出體弱的豬隻以及快速 的腹式呼吸及腹瀉而造成初生小豬死亡。從事於分離該造 成PRRS的病毒、診斷PRRS感染以及對抗PRRS病毒的疫苗的 發展皆已發表出（見於加拿大專利公開案第207.6744號； PCT國際專利公開案W093/03760 ; PCT國際專利公開案W093 /06211 ;及PCT國際專利公開案W093/07898)。 在找尋PRRS的引起因子中發現的第二病毒_株為引起 現今所知的繁殖性及壞死性肺炎（PNP)之疾病。該PNP的症 狀及造成該疾病的病毒之病因學顯然是相似於PRRS及其相 對應的病毒，但是在鑑定上卻有不同：例如，一般相信該 病毒為一非傳統的或非典型的豬隻流行性感染A病毒（ aSIV) 〇 PNP臨床上的主要徵狀為發燒、呼吸困難及腹式呼吸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 - …. A7 ______B7 五，發明説明（V) 。對不同年齡的豬隻皆有影響，但該多的徵狀是發生在4 至16週大的豬隻上。被感染瀦隻的肺部在稠度上為散布著 紅色且為多肉（Collins A.A.S.P.,九月/十月1991，pp 7 -11)。相反的，觀察為PRRS所影響的豬隻主要為初生的豬 隻（少於3週大），對其肺部傷害。 腦髓心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus EMCV )是造成對間質組織有嚴重影響之肺炎的病毒，且其具有 對間質組織有嚴重影響性、壞死性及鈣化性心肌炎。在實 驗上，EMCV造成被感染影響的母豬無法生育（Kim等人J. V e t · D i a g η · I n v e s t · , 1 :101 -10 4 (19 8 9) ; L i n k s 等人，A u s t.Ver· J·, 623:150-152 (1986); Love 等人，Aust· Vet, J,, 63:128-129 (1986)。 近來，在美國中部，發生較具有病毒性形式的PRRS， 且在3-8週大的豬隻中發生率增加。一般而言，健康的3-5 週大豬斷奶，且其後5-7天即生病。對受感染的豬隻的組 織中病毒作例行的鑑定方法而顯示出豬隻流行性感冒病毒 (SIV)、偽狂犬病毒（pseudorabies virus PRV)及肺炎黴 漿菌並無法該新的PRRS形式相結合。 本發明主要是有關一疫苗，其可保護豬隻免受造成該 新且更具病毒性形式的PRRS的傳染因子所傳染，及産生與 施用該疫苗的方法，以及一編碼造成該新的PRRS形式傳染 因子的基因組之部份DNA。但是，一般相信，在發展本發 明的期間所得到的資料是可使用於發展保護豬隻對抗任一 . -7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 〜· A7 B7 五、發明説明（Γ) … 且/或所有的豬隻呼吸性及生殖性疾病的疫苗與方法。例 如，本發明的發明人定出至少一 PRRS病毒的病理學的特性 ，其是不同於見前所公開的PRRS病毒的病理學（見於下表 I )。因此本發明並不須限定於有關造成該新的PRRS形式 傳染性因子的疫苗及方法，然該新的PRRS形式被本發明發 明人稱為PRRS病毒（PRRSV)的〃愛荷華菌株〃（I〇wa strain) ° 然而，在有關發展有效對抗豬病毒之技藝中已有悲觀 論及懷疑論的表示（The Veterinary Record, October 26 ,1991)。然而在此技藝中已存在人類流行性感冒疫苗可能 可提供一些對抗PRRS及PNP效用之保護的信念（例如見於 Ibid.,七月6, 1991)。但是在一餵食的動物中使用人體 疫苗一般為管理機構所阻撓，且因此，該方法在真正的實 施上是不可行的（Ibid.)。 該豬隻養殖工業已為且將會繼續為該些豬生殖性及呼 吸性疾病與其新變化所感染，只要該疾病出現。令人驚訝 的是，在美國及世界各地中動物疫苗市場是大於人體疫苗 市場。因此，有一經濟上的誘因去發展出新的家畜疫苗， 及以因保護農場中動物免受該疾病所衍生出的實質上公眾 健康利益。 本發明摘要 因此，本發明之目的為提供一新穎疫苗，其可保護豬 隻對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病的病毒。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973 · - · A 7 _____B7_, _ 五-、發明説明（石） … 本發明更進一步之目的為提供一疫苗，其可保護豬隻 對抗PRRSV的愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一疫苗，其可引起一有 效的免疫反應，以對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病病毒， 更特別的是對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一新穎方法，其可保護 豬隻對抗造成豬呼吸性及生殖性疾病病毒的感染，更特別 的是對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一新穎方法，其可在豬 隻中引起一有效的免疫反應，以對抗造成豬呼吸性及生殖 性疾病之病毒，更特別的是對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一抗體，其可在免疫上 可結合至造成豬呼吸性及生殖性疾病的病毒，更待別的是 PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為提供一抗體，其可在免疫上 可結合疫苗，該疫苗可保護豬隻對抗造成豬呼吸性及生殖 性疾病的病毒之感染。 本發明更進一步之目的為提供一抗體，其可在免疫上 可結合疫苗，該疫苗可保護豬隻對抗PRRSV之愛荷華菌株。 本發明更進一步之目的為對患有豬隻呼吸性及生殖性 疾病的豬隻提供一治療方法，更特別的是對患有PRRSV之 愛荷華菌株豬隻。 本發明更進一步之目的為提供分析豬隻呼吸性及生殖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） __ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五-、發明説明9 ) 主疾病的診斷組套，更待別的是對PRRSV之愛荷華菌株的 診斷組套。 本發明更進一步之目的為提供由造成豬呼吸性及生殖 性疾病的病毒或傳染性因子之基因組中分離出的聚核苷酸 ，更持別的是由PRRSV之愛荷華菌株所得的聚核苷酸。 本發明更進一步之目的為提供由一或多編碼造成豬呼 吸性及生殖性疾病的病毒或傳染性因子的蛋白質之聚核苷 酸，更特別的是由PRRSV之愛荷華菌株所得的聚核苷酸。 本發明更進一步之目的為提供由一或多編碼造成豬呼 吸性及生殖性疾病的病毒或傳染性因子中，更待別的是由 PRRSV之愛荷華®株中，所得的一或多個抗原性胜肽。 本發明更進一步之目的為提供使用合適的細胞株培養 豬隻生殖性及呼吸性病毒或傳染因子。 在此及其它目的，於下列較佳實施例説明下會被得明 白，該等目的是可藉由保護豬隻對抗由造成豬呼吸性及生 殖性疾病的病毒或傳染性因子之感染、一可對造成該些豬 隻疾病的病毒或傳染因子引起免疫上反應之組合物、保護 豬隻對抗造成該些豬隻疾病的病毒或傳染因子感染而可避 免傳染、及以編碼造成呼吸性及生殖性疾病的病毒或傳染 因子之基因組的部份之DNA。 圔示的簡單說明 第1圖為産生修飾過之活疫苗流程圔； .第2圖為産生修飾過之失去活性疫苗流程圖； -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 五 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 ， -· A 7 ___B7__發明説明（f ) 第3圖為産生次單元疫苗概要步驟的流程圖； 第4圖為産生基因工程疫苗概要步驟的流程圖。 第5及6圖顯示以感染因子樣品感染10天後傳統豬隻 肺部的組織切面，該樣品是由以PRRSV之愛荷華菌株所感 染之豬隻中分離； 第7圖顯示以感染因子樣品感染9天後gnot obi otic豬 隻肺部的組織切面，該樣品是由以PRRSV之愛荷華Μ株所 感染之豬隻中分離； 第8圖顯示以感染因子樣品感染35天後生物有擇的（ gnotobiotic)豬隻心臓損害的情況，該樣品是由以PRRSV 之愛荷華菌株所感染之豬隻中分離； 第9圖顯示顯現出大量合包體的支氣管一肺胞的培養 物，其為以感染因子的肺部過濾樣品感染9天後由生物有 擇的（gnotobiotic)豬隻中製備的，該過濾樣品是由以 PRRSV之愛荷華®株所感染之豬隻中分離； 第1〇圖為具被膜的病毒粒子電子顯微鏡圖，其直徑約 70nm，且具有短的表面針狀體，該病毒是在以與PRRSV之 愛荷華菌株所感染之豬隻的肺包呑噬細胞培養物中發現； 第11圖為多形且具被膜的病毒粒子電子顯微鏡圖，其 大小約為80X320nm，且塗覆著抗體，該病毒是在以與 PRRSV之愛荷華鋪株所感染之豬隻的肺包呑噬細胞培養物 中發現； 第12 (A)至（C)圔為一連串的顯示豬隻胞肺呑噬細胞培 - 11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) § 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 - .. A7 B7 _ 五-、發明説明（f ) … 養物的照片：未感染（A)、以ISU-12感染所得CPE(B)以及 以ISU-12感染所得的IFA(C)(見於下述的實驗2 ); 第13 (A)至（D)圖為一連串的顯示PSP-36細胞培養物的 照片：未感染（A)、在4 DPI下以ISU-12感染所得的CPE(B) 、在5 DPI下以ISU-12感染所得的CPE(C)，以及在5 DPI下 以ISU-984 (為代表PRRSV之愛荷華_株的第二分離病毒） 感染所得的CPE(D); 第14 (A)至（D)圖為一連串的顯示PSP-36細胞培養物的 照片：未感染（A)、以2.5DPI的ISU-12感染PSP-36細胞， 而後以復原期的血清加以染色（B)、以2.5DPI的ISU-12感 染PSP-36細胞而後以抗PRRSV多株抗體染色（C)、以及以 2.5DPI的ISU-12感染PSP-36細胞而後以抗PRRSV單株抗體 染色（D); 第15圖為在PSP-36細胞中繁殖的ISU-12的製備外廓， 其為利定放射性免疫沈澱方法（R IA)加以測定的：第1及 2道為模仿感染的PSP-36細胞，其以抗PRRSV多株血清（1) 、康復期血清（2)作免疫沈澱；第3及4道為病毒感染 PSP-36，其以抗PRRSV多株血清（1)、康復期血清（2)作免 疫沈澱； 第16圖一流程，其為顯示建構造成PRRS感染因子的鋪 株之cDNAA基因庫的一般步驟程； 第17圖為一流程圖，其為顯示藉由差別性雜交鑑定出 與該PRRSV之愛荷華菌株（ISU-12)相結合的感染因子的確 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 . 一 A7 B7 五-、發明説明（/⑺ … 實cDNA殖株； 第18圖顯示出位在ISU-12的核苷酸序列内之開放解讀 架搆（ORF’s)，見於（A)圖；次基因群mRNA’s，其中方塊L 表示引導序列，而U) η表示位在基因群.的最終3 ^末端之 聚（Α)尾部，見於（Β)圖；以及用來獲得ISU-12的3 τ-末端 核苷酸序列所使用之λ cDNΑ純株，其中以實心柱表示的是 經序列分析過的區域，而未經序列分析的區域則以陰影區 表示之，見於（C)圔； 第19圖代表愛荷華菌株（ISU-12)相結合的感染因子的 基因組之31938bp 3’端的核苷酸序列。 第20圖顯示出藉由編碼第18圖的DNA所縯繹出的胺基 酸序列，其列於核苷酸序列下方； 第21圖比較愛荷華菌株（ISU-12)相結合的感染因子的 核苷酸序列，以及萊西斯倍德（Lei ystad)病毒有關開放式 閲讀架構-5(0RF-5)的核苷酸序列； 第22圖比較ISU-12病毒的0RF-6與萊西斯倍德（ L e 1 y s t a d)病毒的0 R F - 6的核脊酸序列； 第23圖比較ISU-12病毒的0RF-7與萊西斯倍德（ L e 1 y s t a d)病毒的0 R F - 7的核苦酸序列； 第24圖比較ISU-12病毒與萊西斯侉德（Lelystad)病毒 _ 的3’非轉譯區的核苷酸序列； 第25圖顯示未感染的Tri chop lus i an蛋細胞均質液（ HI-FIVEH, Invetitrogen, San Diego, California)； -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 五-、發明説明（//) 第26圖顯示以一含有ISU-12 0RF-6基因的重組桿狀病 毒所感染的HI-FIVE細胞，其亦顯示出細胞病態的效用； 第27圖顯示以一含有ISU-12 0RF-7基因的重組桿狀病 毒所感染的HI-FIVE細胞，其亦顯示出細胞病態的效用； 第28圖顯示HI-FIVE細胞，其以含有ISU-12 0RF-6基 因的重組桿狀病毒所感染、以豬隻對ISU-12的抗血清加以 染色、而後以綴合螢光劑的抗豬隻IgG染色之，其中該毘 蟲細胞可藉由編碼該ISU-12 ORP-6基因而産生重組蛋白質 第29圖顯示HI-FIVE細胞，其以含有ISU-12 0RF-7基 因的重組桿狀病毒所感染、以豬隻對ISU-12的抗血清加以 染色、而後以綴合螢光劑的抗豬隻IgG染色之，其中該昆 蟲細胞可藉由編碼該ISU-12 0RP-7基因而産生重組蛋白質 9 第30圖顯示使用ISU-12專一的引子作0RF-5 (道E) 、0RF-6 (道M)及0RF-7 (道NP) PCR放大的結果，其中道 SM含有分子量標準物； 第31圖顯示表現重組桿狀病毒傳遞載體PU1393的結 果，在以BamHI及EcoRI限制酶裂解該質體DNA後，其含有 ISU-12 基因組的 0RF (道 E) 、0RF-6 (·道 M)及 0RF-7 (道 NP)，道SM含有分子量標準物； 第32圖顯不ISU-12 mRNA北方點墨結果；
弟3 3 A及3 3 B圖威不m R Η A北方點墨結果’該m R N A是由P -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、? 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 ... 一 . A 7 B7 五、發明説明（/之） … RRSV之愛荷華菌株之其它分離菌株（ISU-22、ISU-55、ISU -79、ISU-1894 及 ISU-3927)所取得的； 第34圖為平均整個肺部受損程度的長條圖（受影響 的肺％ )，其為對3週大、PRRSV血清陰性反應、且專一為 不具菌原（SPF)的豬隻以鼻腔内接種（IN)或是肌肉注射（IM )施用本發明疫苗的實施例，以及一組控制組的豬隻（NV/ CHALL) 〇 較佳實施例的詳細說明
在本發明中，〃豬隻呼吸性及生殖性疾病〃是指前所 述的PRRS、PNP及EMCV等疾病，該疾病是由PRRSV以及該疾 病十分相關的變種所導致的，該些變種是已出現，且是在 未來將會出現Q 保護豬隻對抗由豬隻呼吸性與生殖性疾病病毒或感染 因子所引起的疾病，若在對感染的豬隻施用該疫苗後，在 肺中的損害程度或該疾病病徵不會出現或不會像感染且未 受保護的豬隻嚴重。且若在將該疫苗施用感染豬隻後，肺 中的損害程度或該疾病病徵是會被消除或是不會如感染且 未受保護的豬隻嚴重。一未感染的豬隻是一不曽暴露於該 呼吸性且生殖性疾病感染感因，或是會暴露於該呼吸性且 生殖性疾病感染感因但無顯示出該疾病病徵的豬隻。一感 染後隻是一顯出該疾病病徵的豬隻。該呼吸性及生殖疾病 可定量或定出級數（例如溫度/發熱、肺的損害程度〔感 染肺組織的百分率〕或半定量（例如壓迫穿迫的嚴重性〔 -15 - ^纸張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 497973 - 一 . A7 B7 五、發明説明（/彡） 詳細解釋如下〕。 "豬隻呼吸性與生殖性疾病病毒或感染因子〃造成如 上所述豬隻呼吸性及生殖性疾病。 造成新且更具病毒性形式的PRRS之因子已稱為PRRS病 毒的〃愛荷華〃菌株，其具有相同於，但比其它豬隻呼吸 性及生殖性疾病更嚴重的的病徵。臨床上的徵兆可能包含 昏睡、呼吸窘迫、〃吸呼急促（thumping) 〃（用力呼氣） 、發燒、打噴涕、咳嗽、眼睛浮腫以及一般的結膜炎。其 損害包含整體且/或微小的肺部損害或心肌炎。感染因子 可為一單一病毒或可與一或多額外的感染因子相結合（例 如其它病毒或細菌）。此外，已發現較低病毒性形式的愛 荷華菌株，其可造成較次級的上述病徵或是根本不造成病 徵，但不論如何，其可依據本發明加以使用，以提供對抗 生殖性及呼吸性疾病。 在各種豬隻疾病中組織上的損害是不同的，表I為比 較由豬隻病毒造成的許多疾病結合的損害之生理上的觀察 以及病菌。 表工 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 豬隻病毒肺炎的病理比較 損害 PRRS(p) PRRS(〇) SIV • PNP PRCV PPMV 愛荷華 型n 組織間質變厚 肺胞滲出液 氣道壞死 合胞饈 腦炎 心肌炎 + ++++ + :ι- + + + -f+ - 4-f-f f -f-f +/--HH- -++ - -H-4* + 4-f -W- 4-f +-l· -Η- -M- 4-H- + + + - -H- 1 f-Hh 4- -r-h-f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） T7/V/3 ^_I___ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明（八/) 〜 其中”PRRS(p)”代表PRRS病毒已公開的病理結果，其中”PR RS(〇)”代表本發明的發明人所觀察到的病理結果，”SIV ” 代表豬隻流行性感冒病毒，”PRCV”代表豬隻呼吸性冠狀病 毒，”PPMV”代表類黏液病毒，〃愛荷華〃是指本案發明人 發現的PRRSV新舖株，〃型Π 〃是指型I肺胞（在感染豬 隻中增殖的），"Inter”是指對間質組織有影響，”空道壞 死"是指在氣道終端上的壞死，且符號（-)及（+ )至（+ + + + ) 是指如下的嚴重性比較程度： (-）： 陰性反應（未觀察到） ( + ): 輕微反應（只比可觀察到略高）: ( + + ): 中等反應 ( + + + ):嚴重反應 ( + + + + ):十分嚴重反應。 PRRSV的愛荷華菌株已為本案發明人在美國中部加以鑑 定，其結合著PRRS。現在還不清楚當PRRSV的愛荷華菌株 自然地被發現是否有疾病與其相結合，而該疾病是因單一 病毒或是一或多額外的感染因子的結合。但是，PRRSV的 愛荷華菌株斑點純化樣品顯然是一單且惟一的病毒。因此 ，PRRSV的愛荷華菌株是指惟一、斑點純化病毒或為由感 染動物體中所得的組織均質液，該動物體含有一病毒以及 一（或多）額外的感染因子，且，以PRRSV的愛荷華菌株 感染的豬隻，如前所述，顯示出由PRRSV的愛荷華菌株造 成的疾病一或多病徽的特徵。 -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（/〇 ‘ 近來的證據顯示PRRSV的愛荷華_株不同於造成傳統 PRRS的感染因子。例如，在感染豬隻中所觀察到的損害， 顯示出由PRRSV的愛荷華菌株所造成的疾病病徵是比單獨 以傳統上、前述的PRRS病毒感染所觀察到的損害更為嚴重 ，且患有PRRSV的愛荷華菌株所造成疾病的豬隻對流行性 感冒，包含結合著PNP之病毒，為血清陰性反應。 見第1至4圖，.其提供製備本發明所包含的各種形式 的疫苗之步驟流程圖，第1至4圖的流程可提供作為産生 本發明疫苗的例示方法，而非欲以任何的方式加以限制本 發明。 在詳述於第1至4圖的每一步驟之第一步驟是鑑定出 一細胞株，其十分容易為豬隻呼吸性及生殖性病毒或感染 因子所感染（為簡化有關疫苗製備的討論，"病毒"一詞 是指結合有豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒且/或感染成 因），而後製備可易感染的宿主細胞的主要細胞儲液（MCS )，下該易感染細胞繼續的轉種超過MCS，工作細胞儲液（ WCK)是由在MCS與MCS + n間的轉種的細胞中加以製備而得的 Ο
一主要的種子病毒在容易感染的細胞，在MCS及MCS + n 間，較佳是WCS中增殖。該原始病毒是.藉由該技術中已知 的方法，由合適的且較佳是均質化的組織樣品中分離出， 該樣品是採自於顯示出相對於由該有興趣的病毒中所造成 的疾病病徵之感染豬隻。一合適的宿主細胞，較佳是WCS -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 ’ - A 7 __B7 五、發明説明（/6) … 的樣品，以原始病毒感染，而後培養之。其後由該感染的 培養細胞中藉由巳知方法分離且斑點純化出該疫苗病毒。 較佳是，使用於製備疫苗的病毒為斑點純化三次的。 而後藉由已知方法，由該斑點純化病毒中製備出主要 的種子病毒（MSV)。該MSV (X)在WCS中，經由MSV (X + l)、MS C(X + 2)、MSC(X + 3)及MSC(X + 4)病毒的轉種而作至少四次轉 種。該MSC(X + 4)被認為是工作的種子病毒。較佳的，使用 豬隻研究及本發明的疫苗産物的轉種之病毒為MSC (X + 5)， 第五次轉種的産物。 在與工作細胞儲液結合，該工作種子病毒是藉由已知 方法用一足夠量加以培養，以製備一原型疫苗，較佳是 MSC(X + 5)。在此的原型病毒疫苗可為任何合適使用於獸醫 醫學上之型。合適的型包含修飾過的活或減毒疫苗（第1 圖）、一失去活性或已死的疫苗（第2圖）、一次單元疫 苗（第3圖）、一基因工程疫苗（第4圖）、以及其它在 獸醫學疫苗技技中所認知的其它型疫苗。一死的疫苗可藉 由化學處理或加熱等，以熟習此技藝人士所知的方式，使 其失去活性。 在第1至4圔中每一個所列出的步驟，而後製備一原 型的疫苗，豬隻有效模式及臨床分析是以在該技術中已知 的方法加以進行。例如，在進行真正的疫苗接種/有效研 究，被預防且/或被處理的疾病必須以其病徵、臨床分析 結果、及病況等加以界定。如上所述，結合於PRRSV愛荷 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 • . A7 —___B7__ 五、發明説明（/?) … 華菌株的感染因子以病徵及病況加以界定。該結合於 PRRSV愛荷華g株的感染因子的臨床分析在下的實施例中 描述。 在疾病充份界定出及定出特性後，可對豬隻施用一 原型疫苗，而後將該豬隻暴露於造成該疾病的病毒或感染 因子中。此為已知技術中的挑戰（cha 11 eng ing)豬隻及其 免疫条統的有效性的方法。在觀察已受挑戰且暴露於病毒 或感染因子的豬隻，且分析該原型疫苗保護豬隻的能力後 ，可用在該技術中已知的方法作效力的研究。而级藉由在 該技術i已知方法，在一分離步驟中發展出可能的分析 方法，且後可産生出一連串大量被認知的疫苗（prelicenc ing s e i a 1 s) ° 在製備列大綱於第1圖的修飾活疫苗中，一旦製備出 原型疫苗，細胞生長條件及病毒産生首先是要最適宜的， 而後藉由該技術中已知方法製備出産生的概要。一旦該生 産概要製備出，其後可藉由在技術中已知的方法作一連串 大量被認知的疫苗（prelicensing serials) °産生一連串 大量被認知的疫苗（prelicencing seials)是指大量産生 一許可的原型疫苗，該疫苗可顯示作一連串的生産且合乎 標準。一製備原型活病毒的方法是使該病毒感染的細胞（ 較佳是主要種子細胞）經歴一或多次的冷凍及多凍的循環 ，以使該細胞溶胞。該冷凍且解冷的感染細胞培養物質可 冷凍乾燥以增強儲存上的保存性。在再度覆水後’該物質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五-、發明説明（/Γ) … 可使用作為一活疫苗。 製備一連串大量被認知的失去活性疫苗的步驟（第2 圖）是相似於使用於修飾性活疫苗的製備方法，僅具有一 基本上的修飾。在使細胞生長條件及病毒産生步驟最適宜 化後，一病毒失去活性的步驟是必須在製備該合適的産生 概要前使其最最適宜化。使病毒失去活性的步驟及其最適 宜的方法一般為熟習此技藝人士所知曉的，其可能以一已 知或預期的方法加以變化，此與所研究的特殊病毒有有關 〇 製備一次單元疫苗（第3圖）是不同於修飾過活疫苗 或是失去活性的疫苗製備方法。在製備該原型疫苗前，該 疫苗病毒的保護性或抗原性成份必須先鑑定出。，該保護性 或抗原性成份包含一些胺基酸片斷或在病毒鞘蛋白的片斷 ，其可在豬隻中引起特別強的保護性或免疫性反應（其較 佳至少長度為5胺基酸，待別佳是長度為10胺基酸）。單 或多病毒鞘蛋白自己或其寡聚物，以及形成該病毒次結構 或可鑑定出的部份的病毒鞘蛋白之高级組合，或該次結構 的單元；在病毒表面或接近表面上存在的寡醣苷酸、醣苷 化脂質或醣苷化蛋白，例如核蛋白；脂蛋白或與病毒相 結合的脂質等。該些成份藉由在該技術中已知的方法加以 鑑定。一旦鑑定出，其後藉由在該技術中已知的方法純化 且/或選殖出該保護性或抗原性的病毒部份（該"次單元 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 ， .. A 7 __B7 五-、發明説明（/f) … 製備一連串大量被認知的次單元疫苗的步驟（第3圖 )是相似於使用失去活性疫苗的製備方法，但有些修飾。 例如，該次單元是藉由重組基因技術産生的，該選殖出的 次單元表現是可藉由在該技術中已知的方法使其最佳化的 (見於，例如Maniatis 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory (1989)，Cold Spring Harbor, Massachusetts相關部份 )。在另一方面，若所使用的次單元為代表該病毒整體結 構特性者，如鞘蛋白，由病毒中分離的步驟必須使其最適 宜化。在任何情況，在使其失去活性的步驟最適宜化徵， 該次單元純化步驟可在製備該産生概要前使其最適宜化。 基因工程疫苗（第4圖）使用製備其它疫苗一般的步 驟作修飾開始，在斑點純化後，該野生型病毒可由一合適 的組織均質液中藉由該技術中已知的方法分離出，較佳是 藉由使用PSP-36或呑噬細胞作為宿主的傳統細胞培養方法 Ο 該RNA是藉由該技術中已知的方法，由生物上為純的病 毒或感染因子萃取出，較佳是使用商業上可取得的RN A分 析套組（例如，得自 Stratagene, La Jolla, Califrnia) 藉由異硫氡酸胍方法，且藉由在該技術中已知的方法純化 ，較佳是藉由在CsCl梯度中作超高度離心。RN A可藉由寡（ dT)-纖維素管柱層析法純化或增多。 該病毒基因組選藉由在該技術中已知的方法殖入一合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 - 〜. A7 __B7 _ 五-、發明説明（>β) 適易宿主中（見上所引述的Maniatis等人），而後分析該 病毒基因以決定出産生病毒抗原部份的基因組中的必須區 域。此後，該步驟是相同於飾修過的活疫苗、失去活性的 疫苗或次單元疫苗的步驟。 本發明的疫苗可保護豬隻對抗造成豬隻生殖性及呼吸 性疾病的病毒或感染因子。較佳是本發明疫苗可保護豬隻 對抗與PRRSV愛荷華菌株結合的感染因子。且，本發明的 疫苗亦可預期可保護豬隻對抗藉由將其暴露於與PRRSV愛 荷華菌株相結合之感染因子的十分接近的變種所感染。 相當少病毒是可作於製備活病毒疫苗。該活病毒疫苗 的優點是在得至該疫苗後，可能活化免疫反應，其包含条 統性、局部性、體液及細胞居間的免〜疫反應。該活病毒疫 苗的缺點在於其有為活的偶發因子，如SV40或牛病毒性痢 疾的病毒（一通常污染胎牛血清）所污染的可能。此危險 ，再加上該病毒可在該領域中可轉變成具病毒性或對胎兒 或幼動物不具減毒性的危險，是可能比活疫苗的優點更重 要。
失去活性病毒疫苗是藉由以失活試劑，如福馬林或有 機溶劑、酸等處理該病毒，藉由以紫外光或X-光照射、藉 由加熱等方法而加以製備。使其失去活性是以在該技術中 已知的方法加以進行。若一病毒不能感染易感染細-胞’該 病毒被認為失去活性。例如，在化學失去活性中’合適的 病毒或含有病毒的血清樣品在足夠高（或低）的溫度或pH -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五，發明説明（>/) 〜 下’以足夠量或濃度的失活試劑處理足夠長的時間，以使 該病毒失去活性。藉由加熱而失去活性是可在一溫度下進 行足夠使病毒失去活性的足夠長時間。藉由使用光的一 波長或其能源照射進行足夠的長度，以使病毒失去活性。 人體之失去活性的疫苗之例子包含流行性感冒疫苗、小兒 麻痺症、狂犬病、B型肝炎。使用於豬隻中的失去活性疫 苗之一成功且有效的例子為猪隻小病毒（p a r V ο V i r u S)疫苗 Ο 次單元病毒疫苗是藉由如在第3圖所討論的方法，由 純化病毒次單元中加以製備而得的，例如由流行性感冒病 毒中所分離的紅血球凝集素以及由流行性感冒病毒中分離 出的神經氨酸苷酶表面抗原皆可製備出，且顯示出比整體 病毒更低的毒性。或者，該次單元可由高度純化的病毒次 單元中加以製備，在人體中的例子為人體Β型肝炎的22-η m表面抗原。人體單純疱疹病毒的次單元及其許多其它使 用於人體中次單元疫苗的例子已知的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 減毒病毒疫苗可在自然中發現且為自然發生的基因刪 除（gene deletion)或者，可藉由各種已知方法，如在細 胞培或組織培養中作一連串的轉種，加以製備。病毒可藉 由基因刪除或基因突變而造成減毒。 基因工程疫苗可藉由在該技術中已知方法加以産生， 該些技術包含使用重組DNA技術及使用活病毒技術。例如 ，一些病蛋白質毒基因可鑑定出為編碼在豬隻中引發較能 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印製 497973 . A7 ____B7 五胃、發明説明（>為 … 免疫或保護性反應的蛋白質基因。該鑑定出的基因可選殖 入一合適的表現載體，例如捍狀病毒載體，且使用其去感 染合適的宿主細胞（見於，例如〇，Reilly等人”Baculo-virus Expression Vecors ^ A Lab Manual, T, Freeman &
Co· (1992)。培養該宿主細胞，而後表現出所欲的疫苗蛋 白質，其可純化至所欲的程度，再使用於保護豬隻避免呼 吸性及生殖性疾病。。 基因工程的蛋白質可在毘蟲細胞中、酵母菌或哺乳動 物細胞中表現。該基因工程蛋白質，其藉由傳統方法純化 且/或分離，而後可直接接種於動物中而使動物受保護以 對抗豬隻生殖性及呼吸疾病。由豬隻生殖性及呼吸疾病感 染因子或病毒所得的被膜蛋白可使用於疫苗中以産生可中 和的抗體。豬隻生殖性及呼吸疾病感染因子所得的核蛋白 亦可使用於疫苗中以引發細胞性免疫反應。 較佳是，本發明以一含有由PRRSV愛荷華菌株所得的 聚核苷酸的轉移載體性狀轉變昆蟲細胞株（HI-FIVE)，較 佳的是，本發明的轉移載體包含直線形的桿狀病毒DNA及 一含有由PRRSV愛荷華菌株所得的聚核苷酸的質體。該宿 主細胞可與一直線形的捍狀病毒DNA及一質體共同作性狀 感染，如此可製出重組的桿狀病毒。更特別且較佳的是’ 本發明的聚核苷酸編碼一或多PRRSV愛荷華菌株的蛋白質 -0 或者，由一豬隻生殖性及呼吸性疾病感染因子或病毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（>彡） … 中所得之編碼一或多被膜蛋白且/或核蛋白的RNA或DNA可 以插入活載體中，例如天花病毒或痲瘆病毒，且可使用作 為一疫苗。 因此，本發明更進一步是有關一由含有造成呼吸性及 生殖性疾病的病毒之基因組的一部份所分離出的聚核苷酸 ，較佳是該聚核苷酸是由PRRSV愛荷華菌株的基因組所分 離而得。此一詞"聚核苷酸〃是指RNA或DNA，以及相對應 或互補於由感染因子所得的RNA或DNA之RNA或cDNA。本發 明的聚核苷酸可作為産生本發明疫苗的工具、篩選或鑑定 感染動物的工具，以及鑑定出相關的病毒及感染因子等實 用性。 在本發明的一實施例中，該聚核苷酸編碼一或多造成 呼吸性及性殖性疾病的病毒的蛋白質，較佳是一或多該病 毒的膜（被膜）蛋白以及該鞘蛋白（核蛋白4)。更特別佳 的是，本發明聚聚合物是由基因組3’-端的2kb片斷所取得 ，且編碼一或多由0RF-5及0RF-6所編碼的被膜蛋白且/或 由PRRSV愛荷華菌株基因組的0RF-7所編碼的核蛋白質。最 佳的是，該聚核苷酸是由一與PRRSV愛荷華菌株相結合的 感染因子之基因組分離而得的；例如，在下實驗I 一 I ( ISU-12)如所述的因，子以及選自由0R.F-5 (序列辨識編號 ：10) 、0RF-6 (序列辨識編號：13) 、0RF-7 (序列辨識 編號：16)及ISU-12基因組的1938bp之3’端序列（序列辨 識編號：8)。 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五、、發明説明（>的 … 在本申請案的下文中，由病毒或感染因子得至的RNA 且/或DNA所編碼之蛋白質或胜呔，若該聚核苷酸與編碼 免疫抗原蛋白質或胜肽的聚核苷酸有大於90%的相似性， 則被認為是〃在免疫上是相當的〃。在本申請案中的〃相 似性〃是指在二或多因感染因子病毒中完全相同的核苷酸 或胺基酸序列。因此，本發明的另一方面包含一分離的聚 核苷酸，其至少有90%相似於由造成呼吸性及生殖性疾病 病毒的基因組所得的聚核苷酸，較佳是由與PRRSV愛荷華 麵株相結合的感染因子基因組所得的聚核苷酸。 在病毒基因組中聚核苷酸相當短的片斷（約20bp或更 長）可使用於篩選或鑑定感染動物，且/或鑑定出相關病 毒，其可藉由在此所述或熟習此技藝人士已知的方法加以 達成。因此，本發明的另一方面包含一分離（且若想要的 活，為純）的聚核苷酸，其基本上是由造成呼吸性及生殖 性疾病病毒的基因組之一部份得到的片斷所組成，較佳是 由與PRRSV愛荷華鋪株相結合的感染因子基因組所得的聚 核苷酸，其長度至少為20核苷酸，較佳是長度為20至100 核苷酸。更佳的是，本發明之分離聚核苷酸是由ISU-12基 因（序列辨識編號：8)的1938bp之3’端序列，最佳的則 為選自由序列辨識編號：1、序列辨識.編號：2、序列辨識 編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、序列辨 識編號：6及序列辨識編號：7所組成的一族。 本發明的分離聚核苷酸片斷可由以合適的限制酶對相 -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五-、發明説明（>ry 對應（互補於）病毒聚核苷酸之cDNiU乍分解而得，或可使 用商業上可得的自動聚核苷酸合成器加以合成而得。 .在本發明另一實施例中，聚核苷酸編碼一或多由造成 呼吸性及生殖性疾病病毒所得的抗原性肽，較佳是一或多 由與PRRSV的愛荷華菌株相結合的感染因子所得胜肽。如 上所述，本發明的聚核苷酸編碼一或多由造成呼吸性及生 殖性疾病病毒所得蛋白質的抗原一部份，較佳由與PRRSV 的愛荷華菌株相結合的感染因子所得者，其長度至少為5 胺基酸，較佳為長度至少10胺基酸。決定蛋白質上抗原部 份是熟習此技藝人士所熟知的。 本發明侑關藉由一或多PRRSV的愛荷華菌株之ORF f 3編 碼的蛋白質，較佳的是，該蛋白質為由選自序列辨識編號 :8、序列辨識編號：13、序列辨識編號：15、序列辨識 編號：18及序列辨識編號：19 (見於序列辨識編號：9、11 、14與17)所組成之一族之聚核苷酸序列所編碼者。本發 明的蛋白質及抗原胜肽可使用於對對暴露於PRRSV ，待別 是PRRSV的愛荷華菌株，的豬隻作血清測試。 本發明更進一步是有關造成豬隻生殖性及呼吸性疾病 的病毒或感染因子之生物上純的樣品，該疾病可藉由下列 病徵加以定出待性：昏睡、呼吸窘迫、.用力呼氣、發燒、 毛髮變粗、打噴涕、咳嗽、眼睛浮腫以及一般的結膜炎 。本發明病毒及感染因子的生物上純樣品可更進一步的特 徵在於其可造成豬隻生殖性及呼吸性疾病，該疾病包含下 -28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（2Η)Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（乂） … 列組織上的損害··含整體且/或微小的肺部損害、型I[肺 細胞、心肌炎、腦髓炎、肺胞流出物的形成以及合胞體的 形成。〃生物上純的〃的一詞是指一病毒或感染因子樣品 ，其是由單一親代所衍生的子代。通常，一〃生物純〃的 樣品可藉由在細胞培養作3X斑點純化加以達成。更特別的 是，本發明的生物上純病毒或感染因子是豬隻生殖性及呼 吸性病徵的愛荷華菌株，其樣品已寄存在布達佩斯協約下 的American Type Culture Collection， 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 美國，其於 1992年 10月28日寄存，所取得的編號VR 2385、VR 2386以及在 1993年9月29日寄存者為的VR 2428、VR 2429、VR 2430及 VR 2431 〇 PRRSV的愛荷華菌株亦可以其mRNA的北方點墨法定出 特徵，例如* PRRSV的愛荷華菌株含有7或9 niRNA、，其 在此為可能已刪除者。更特別的，在下實驗中述及的，該 PRRSV的愛荷華菌株的mRNA含有至多4個可刪除區。 本發明是有關一保護豬隻避免病毒感染的組合物，其 為在一生理上可接受的載體中·包含有效量之本發明疫苗， 以引起對造成豬隻生殖性及呼吸性疾病的病毒的免疫反應 〇 本發明疫苗一有效量是可足份地對疫苗作免疫反應的 一量，其可引起保護一暴露於造成豬隻生殖性及呼吸性疾 病或相關疾病的病毒下之豬隻。較佳者，該豬隻是可保護 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .9 訂 497973 五，、發明説明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 (^?) 至一程度，可其顯著降低所預防疾病的一或所有的在生理 上有害的病徵或作用（例如肺部損害）。 該組合物以單一劑量或以重覆的劑量施給病人。該劑 量包含，例如1至1000微克的病毒為基礎的抗原（疫苗） ，且應不含有足夠造成一有害反應或感染生理上病徵的病 毒為基礎的抗原量。在該技術中用於決定活性抗原劑之合 適劑量的方法是已知的。 包含本發明疫苗的組合物可與佐劑一起施用，佐劑為 一物質，當結合於疫苗時，其可增加對本發明疫苗的免疫 反應。該佐劑可與疫苗在同時、同處加以施用或是不同時 ，例如，追加注射加以施用。佐劑較佳是對一動物於不同 於疫苗施用的方式、位置或定位之一方式或一位置或一定 位加以施用。佐劑包含氫氧化鋁、硫酸鋁鉀、熱不安定或 熱安定之由大腸桿_所得的外毒素、霍亂毒素或其B次單 元、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、Freund’s不完 全佐劑、Freund’s完全佐劑及其類似物。毒素為基礎的佐 劑，如白喉毒素、破傷風毒素及百日咳毒素可在使用前使 其失去活性，例如以甲醛處理。 本發明亦有關保護一豬隻避免感染而可對抗造成豬隻 呼吸性及生殖性疾病的病毒的方法，其包含施予有效量的 疫苗，該疫苗可對須要保護的豬隻引起抗該病毒的免疫反 應，而可對抗該病毒的感染。藉由〃保護豬隻避免感染〃 以對抗該豬隻呼吸性及性殖性病毒或感染因子，其意味著 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（>F) … 在本發明的疫苗施用於豬隻後’該豬隻顯示’與控制組（ 感染豬隻）相比，可使該相對應疾病的病徵降低較不嚴重 或是不具臨床病徵（如發熱）。該臨床病徵可定量（例如 ，發燒、計算抗體且/或肺部的損害），或半定量（例如 呼吸窘迫的嚴重性）。 在本發明中，計算在感染豬隻中呼吸窘迫的条統是發 展出來的，本發明的臨床上呼吸分級条統是藉由下例標準 評估受感染豬隻的呼吸窘迫性： 〇=無疾病，正常呼吸 ι=當該豬隻受壓迫時（在大量的積髏且/或在一加 快的速度強迫下）有輕徼的呼吸困難及呼吸急促 2 =當豬隻在休息時，有輕微的呼吸困難及呼吸急促 3 =當豬隻受壓迫時，有中等的呼吸困難及呼吸急促 4二當豬隻在休息時，有中等的呼吸困難及呼吸急促 5 =當豬隻受壓迫時，有嚴重的呼吸困難及呼吸急促 6 =當豬隻在休息時，有單重的呼吸困難及呼吸急促 本發明臨床上呼吸分級条統，分數"〇 〃為正常’且 顯示該豬隻並未為豬隻呼吸性及生殖性疾病所感染’分數 〃 3 〃顯示該豬隻中等的呼吸性及生殖性疾病，分數〃 6 〃顯示該豬隻嚴重的呼吸性及生殖性疾病。若給予疫苗或 組合物之同樣相受挑戰的一組豬隻顯示比不給予疫苗或組 合物之同樣受挑戰的一組豬隻更低的平均臨床上病徵，則 本發明疫苗或組合物的量是認為有效的。（一豬隻被認為 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 • 一 · A7 B7 五。發明説明（>f) … "受挑戰〃乃為當其暴露於足夠在一非接種疫苗的動物中 造成疾病的感染因子的濃度）。 較佳者為，本發明疫苗組合物為直接施予一尚未暴露 於造成生殖性及呼吸性疾病病毒之豬隻。本發明疫苗可口 服或腸1道外施用。例如以腸胃道外路徑加以施用的例子 包含皮膚内、肌肉内、靜脈内、腹膜内、皮下及鼻内路徑 加以施用。 當以溶液加以施用時，本發明疫苗可以水溶液的形式 加以製備，可為一糖漿、香油或一酊劑。該配方是在該技 術中已知的，且可藉由在合適的溶劑条統中溶解抗原及其 它合適的添加劑加以製備。該溶劑包含水、鹽水、乙醇、 乙二醇、甘油、A1流體等。在該技術中的合適的添加劑包 含一合格的染劑、香料、甜味劑及抗微生物的防腐劑，如 th i mrosa 1 (乙基汞硫代水楊酸鈉）。該溶液可安定化， 例如藉由加入部分水解的凝膠、山梨醇或細胞培養培養基 ，其可使用該技術中已知的試劑，例如磷酸氫鈉、磷酸二 氫鈉、磷酸氫鉀且/或磷酸二氫鉀，藉由已知的方法加以 緩衝。 液體配方可包含懸浮液及乳化液。在該技術中，懸浮 液的製備，例如使用一膠體粉碎器，及乳化液，例如使用 一均質器，皆為已知的。 等張性質是可以以氯化鈉及其它所需的鹽加以調整。 其它溶劑，如乙醇或丙二醇，可使用以增加該組合物成份 -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 . A7 _ ___B7 . 五-、發明説明〇0) 的溶解度及該溶液的安定性。更進一步可使用於本發明配 方中的添加劑包含®萄糖、傳統的抗氧化劑及傳統的螯合 劑’如乙撑基二胺四乙酸（EDTA)。 本發明亦有關一産生本發明疫苗的方法，其包含下列 步驟： U)收集造成豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因 子，且 (B)以下列所述的方式加以處理該病毒或感染因子，該 方式是選自由（i)斑點純化病毒或感染因子，（ii)在一溫 度下加熱該病毒及感染因子一段時間以使該病毒或感染因 子失去活性，（iii )將該病毒或感染因子暴露於一足夠使該 病毒或感染因子失去活性量的失活化學物或是與該量的失 活化學物混合，（iv)將該病毒或感染因子分解成其相對應 的次單元，且分離出至少該次簞元之一者，及（v)合成或 分離出編碼該病毒或感染因子的表面蛋白之聚核苷酸，以 該聚核苷酸感染一合適的宿主細胞，培養該宿主細胞，且 由該培養物中分離出該表面蛋白，等方式組成的一族。 較佳者，該病毒或感染因子是由培養物的培養基中藉 由下列步驟收集，該步驟（i )沈澱受感染的細胞，（ii )將 該沈澱細胞溶胞以及（iii )在其後的處理前，先將該病毒或 感染因子離心。更佳的是，該病毒或感染因子所感染的宿 主細胞在收集前，先培養在一合適的培養基中。 較佳的是，在培養該受感染的宿主細胞後，該受感染 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（$/) … 的宿主細胞藉由將傳統上使用的聚（乙二醇）（PEG)溶液 以一足夠使該受感染細胞沈澱的量加入該培養基中，以使 其沈澱。該沈澱的受感染細胞可更進一步藉由離心純化。 該沈澱的細胞可藉由熟習此技藝人士己知的方法加以溶胞 。較佳的，該細胞藉由重覆的冷凍及解凍（較佳的是三次 的冷凍與解凍循璟）使其溶胞。溶胞的沈澱細胞會釋出病 毒，而後將病毒收集，較佳藉由是離心收集。該病毒可藉 由在CsCl梯度下離心加以分離及純化，而後由該CsCl梯度 中回收合適的含有病毒帶。 或者，該病毒培養物可冷凍及解凍的方式以溶胞該細 胞，該冷凍及解凍細胞培養物可直接作為一活疫苗。但是 ，較佳是，該冷凍及解凍細胞培養物的物質冷凍乾燥（作 儲存），而後作為一 S苗時再將其再度水化。 該培養物的培養基可含有緩衝鹽水、基本的營養物及 在該技術中認知的合適的碳及氮源，其濃度為可使病毒感 染的細胞生長。合適的培養用的培養基包含Dul becoo’s基 本培養基（DMEM)、Eagle’s基本培養基（MEM)、Ham’s培養 基、培養基199、胎牛血清（fetal bovine serum)、胎牛 血清（fetal calf serum)、及其它可支持病毒感染細胞生 長的相當培養基。該培養用的培養基可添加胎牛血清（直 多10%)且/或L-麩胺酸（至多2mM)，或其它合適的添加 物，如傳統上生長添加物或/且抗生素。較佳的培養基為 DMEM 〇 -34 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（多2) 較佳的是，本發明疫苗為培養在合適細胞株中的病毒 或感染因子。該細胞株較佳的是PSP-3&或可為病毒 所感染之相當的細胞株，且將其培養。一相當於PSP-36的 細胞株的例子為細胞株PSP-36-SAH，其寄存在布達佩斯協 約下的 American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852 美國，其 於1992年10月28日寄存，寄存編號CRL 11171。另一相當 的細胞株為MA-104，其可在商業上由Whittaker Bio-products, Inc (Walkersville， Maryland)取得。 初步的 結果顯示該與PRRSV的愛荷華菌株相結合的感染因子可在 豬隻的鼻甲細胞中培養。在斑點純化後，該與PRRSV的愛 荷華菌株相結合的感染因子産生具有如上表1所列之以〃 愛荷華"標題者相同特性的損害，且顯示於第5 — 8圖。 因此，本發明亦有關培養一病毒或感染因子的方法， 較佳是在選自由PSP-36及及可為病毒所感染之相當的細胞 株所組成的一族，且將其培養。依據本發明的培養病毒或 感染因子之方法包含感染PSP-36及可為造成豬隻呼吸性及 生殖性疾病的病毒所感染之相當的細胞株，且在合適的培 養基中培養該受感染的細胞株。 細胞株MA-104是由猴子腎臓細胞所得的，為其類似上 皮細胞。MA-104細胞在含有Dubecco’s基本培養基及10% FBS(胎牛血清）的培養瓶中可形成匯合的單層。當該單層 形成時，該細胞以10%均質化的組織樣品加以接種，該樣 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五胃、發明説明（彡今） … 器胃$自於一感染豬隻的合適組織（如肺臓且/或心臓） 。較彳圭的是有合適的抗生素存在，以使可病毒及宿主細胞 生長’且可抑制並非宿主細胞的細胞生長且/或存活（例 如細菌或酵母菌）。
PSP-36及MA-104二者可使PRRS病毒的分離株生長成高 價數（超過107TCID5Q/ml)。PSP-36及MA-104亦可使與 PRRSV的愛荷華鍾株相結合的感染因子生長。MA-101亦可 使螺旋病毒（rotaviruses)、脊髓灰質炎病毒及其它病毒 生長Q CL2621細胞一般相信是非豬隻來源，且為類似上皮細 胞的，並為專利的（Boehringer-Mannheim)。與 PSP-36 及 MA-104相反的，造成PMS的病毒樣品無法成功地在CL2621 細胞中培養（B a u s t i s t a 等人，A m e r i c a n A s s 〇 c i a t i ο η 〇 f Swine Practitioners Newsletteer, 4,:32, 1992)° CL2621細胞的基本特徵為非豬隻來源，且為類似上皮 細胞的，生長於MEM培養基中。但是，Benfie Id等人（J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4:127-133)已報導使用 CL2621細胞繁衍PRRS病毒，但是MA-104是使用於控制脊髓 灰質炎病毒的繁衍，因此推論.該CL2621是不同於MA-104, 且相同的細胞不繁衍二種病毒° -PRRSV的愛荷華_株相結合的感染因子一般無法在非 PSP-36、PSP-36-SAH及MA-104細胞株中生長。但是’如上 所述，造成PRRS的病毒已報導可在CL2621及原始肺胞_隻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 497973 ' _ A7 _____B7__ 五-發明説明（％¾ … 呑噬細胞中生長，雖然PRRS病毒的一些並不在PSP-36、 Mi\_104或CL2621細胞中生長。 本發明疫苗可使用於製備抗體，該抗體對一暴露於病 毒或感染因子的病患（在此例中，為1隻豬）可提供免疫 抗性。本發明所包含的抗體可在免疫上（1)與可保護一豬 隻對抗造成呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因子相結合 者，或是（2)與造成豬隻呼吸性及生殖性疾病的病毒或感 染因子相結合者。本發明抗體具有作為決定一豬隻是否已 暴露於呼吸性及生殖性疾病的病毒或感染因子上之診斷劑 以及在本發明疫苗製備上的使用性。該抗體藉由已知方法 製備為免疫親和管柱，且該免疫親和管柱可使用於分離該 病毒或感染因子或其之蛋白質。 為引發對該疫苗或病毒的抗體，必須對一合適的宿主 種物，如老鼠、免子或其它可用於接種的動物，以使用於 製備疫苗的蛋白質加以免疫。該宿主動物而後以如上所述 的疫苗中之一型加以免疫（注射），適意的施用如上所述 免疫增強劑（佐劑）。該宿主動物其後較佳是在一定的一 段期間，較佳為每1至4週，最佳是每2週，作1至5次的免 疫。而後將該宿主動物犧性，收集其血清。再藉由已知技 術由收集的全血中分離出血清，該血清含有對該疫苗的抗 體。該抗體可藉由已知的方法加以純化以提供免疫球蛋白 G (IgG)抗體。 本發明亦包含對抗本發明疫苗且/或病毒的單株抗體 、 -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 ___— _ B7___ 五-、發明説明… ’該單株抗髏可藉由Kohler等人（Nauture vol· 256 (19 495-497)的方法加以産生，基本上，免疫化宿主動 物之脾臓的全細胞製備而得的免疫細胞（如上所述）藉由 傳統步驟與骨髓瘤細胞融合以産生融合瘤，培養該融合瘤 ’所得的培養液，而以其對抗帶有感染因子（病毒或疫苗 )@ ί夜體或接種物加以篩選。將該融合瘤送入宿主動物的 Κ 8莫中以使該融合瘤在腹膜中生長。收集該宿主動物的腹 以提供由融合瘤所産生的可對抗感染因子之單株抗體 樣Sr °同時，由融合瘤細胞培養物中所得的懸浮液亦可使 用為作單株抗體的來源，其藉由熟習此技藝人士已知的方 法加以分離，較佳是，本發明的抗髏為免疫球蛋白之IgG 或IgM型。 本發明亦有關一治療一患有呼吸性及生殖性疾病的豬 隻之方法，其包含施用有效量的抗體，該抗體在免疫上可 與造成豬隻呼吸性及生殖性疾病結合，或是與可保護豬隻 對抗藉由豬隻呼吸性及生殖性病毒感染的疫苗結合，若有 所需其可在一對豬隻為生理上可接受的載體中。 本發明的疫苗亦有關一分析造成豬隻呼吸性疾病、豬 隻生殖性疾病或豬隻呼吸性及生殖性疾病的診斷套組，其 包含如上所述的抗體及一可與該抗體反應而顯示出陽性免 疫反應的診斷劑試。 本發明診斷套組較佳是基於對已知免疫螢光分析（IF A )、免疫過氣化氫酶分析（IPA)羽與酵素結合的免疫吸附分 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五-、發明説明 析（ELISA)步驟加以修飾。 ' 在IFA中，受感染細胞以乙酮及甲醇溶液加以固定，且 受感染豬隻在復原期的抗體與受感染細胞培育，較佳是在 3 7 C下約3 0分鐘。一陽性免疫反應為可病毒感染細胞相結 合者’但其不會經由其後的清洗步驟（通常以pBS緩衝液 清洗三次）加以洗去，而後加入以一螢光劑（F ITC)作標記 的二级抗體（抗一抗體）培育，較佳為另一次30分鐘。一 陽性免疫反應可使得二級抗體在清洗後與依然保存的一級 抗體相結合，且會導致螢光的發生，該螢光可撿測且半定 量。一陰性免疫反應為造成很少或沒有抗原與感染細胞相 結合。因此，該螢光劑標記的二级抗體無法與之結合，該 螢光標記會被清洗出，且若與一合適的陽性控制組比較， 其為撿測出很少或沒有螢光。 IPA及ELIS A套組是相似於IFA套組，除了該二級抗體 是以特定酵素取代該螢光劑。因此，當加入合適的結合於 二級抗體的酵素的酶質，可造成呈色産物的産生，而後例 如利用呈色計量加以撿測且定量。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的其它特徵在下例示實施例說明下會變得明白 ，該些實施例僅為例示說明本發明，而非想要限制本發明
實驗I 在實施例1中，調查在5-8週大豬隻的地方性肺炎的 -39 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 497973 五，發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 例子°在緒隻中所觀察之P R R S V愛荷華菌株的微部損害是 與病毒的病因學相配合（因此，在此，為簡化討論，〃病 毒〃及"病毒性〃是在本發明中如上所述的指病毒或感染 因子，或其特性）。在實驗上使用由感染豬隻且藉由〇 . 22 um過濾加以分離而得的肺部均質液，將該疾病傳給傳統及 生物有擇（gnotobiotic)豬隻。非未顯示出一般豬隻病毒 性呼吸性病因。在細胞培養中得到二型的病毒粒子。一型 直徑約為7 0 n m，其為具有被膜，且具有小的表面針狀物。 另一型具有被1吴、長形、多形，計算約8 0 X 3 2 0 n m，且為抗 體所包圍。 (I )物質及方法 (A )由自然發生肺炎感染的豬隻中得到的物質 收集且研究在西南部的愛荷華州上餵養900隻豬的濃 場上之6週大受感染之豬隻中所得的組織。先觀察該農場 豬隻，其顯示在斷奶後5至7天，50-70%相同受感染的豬 隻變得厭食、毛髮變粗且經過昏睡、咳嗽、發燒及〃呼吸 急促（thumping) 〃。約10-25%的受感染感染具有結膜炎 。大部份的感染豬隻在7-10天内恢復。但是10至15%由於 細_的二次感染而造成嚴重的生長阻礙，且不合適作為餵 養的豬隻加以銷售。豬隻無法生育，包含死胎、木乃伊化 的胎兒及不孕症，是在豬隻農場上該疾病發生原始點上發 生，其後會隨時間而減少。在餵奶期間呼吸性疾病是會持 續的。 -40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五，、發明説明（>Γ) … 觀察藉由增生的細支氣管炎及肺胞定出具特徵之肺部 的損害，該組織是由四隻不同6週大豬隻且以福馬林加以 固定而得的組織。嘗試要去分離出S IV、、偽狂犬病毒（ pseudorabies virus PRV)及腦髓心肌炎病毒（Encephalo - m y 〇 c a r d i t i s v i r u s E M C V)但不成功。對於発隻流行性感 冒病毒（SIV)、偽狂犬病毒（pseudorabies virus PRV)及 肺炎黴漿_的肺部冷凍切片之免疫螢光撿查為陰性反應。 Pastfiurl 1 la multocida型是由鼻腔由離而得，
Haemorph i 1 us parasuis是由肺中分離而得 其後由該農場中得到五隻真正受感染的5-6週大的豬 隻（其已斷奶10天），所有的豬隻皆發燒且溫度至少40.5 °C。將該等豬隻解剖，且收集由該豬隻所得的整體具有典 型病毒性肺炎之損害的肺部組織樣品，加以製備以馬上接 種至傳統上為專一不具病原（SPF)的豬隻中。由所有五隻 真正受感染的5-6週大豬隻所得肺部、肝臓、腎臓、脾臓 、腦及心臓組織加以培養作一般細鐘性及病毒性病原培養 。收集相同的組織切片，且在10%中性緩衝液中福馬林中 作組織病原撿驗。 (B )在傳統上豬隻實驗上的傳染 (1)實驗上的豬隻 -10隻5週大由農上上所得的不具有黴漿菌、PRV、 豬隻呼吸性冠狀病毒及傳染性腸胃炎病毒（TGEV)。將八豬 隻置於每一個為4X5尺的分離的二間中，其具有水泥牆及 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 … .. A7 _B7 ,__ 五-、發明説明（>/) … 自動通風裝置°該豬隻餵食10 %蛋白質玉米一大豆餵食配 額及任意的水。 (2)實驗設計 在對具有自然發生肺炎的豬隻作馬上解剖後，製備出 在Dulbecco ’s修飾過$Eagle/s基本培養基中的10%均質液 ，在lOOOxg澄清10分鐘，而後在l〇〇〇〇xg 10分鐘ϋ該澄清 的上清液經由0.22um濾紙加以過濾。將八隻控制組的豬隻 加以5m 1由一正常感染未的豬隻生物有擇的豬隻中藉由如 上所述加以製備的肺部均質液作鼻腔内接種。每天監測及 記錄臨床上的徵兆及溫度。在接種後（DPI)第5、7、10及1 5天分別由每一組中取一隻作安樂死，且解剖。在解剖時 收集組織以作噻氧及厭氧細菌的分離步驟、黴漿菌分離、 對肺炎黴漿菌、SIV、PRV、對流行性感冒病毒型3 (PI-3) ，及牛呼吸性合胞性病毒（BRSV)的抗原撿測及病毒的分離 。該組織以10%中性緩衝之福馬林加以固定以作組織病原 性的撿驗。在解剖時，該肺部以福馬林灌注。 (C )在生物有擇瀦隻實驗上的傳染 (1) 實驗上的豬隻 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8隻斷初乳，且剖腹生産（CDCD)而得雜種一天大的生 物有擇豬隻隨機分生二個分離體中（一分離體4隻豬隻） 。該豬隻以鐵強化、無_、罐頭液體牛乳替代品加以餵食 (SPF-LAC，Pet-Ag, Elgin， Illinois)。 (2) 實驗設計 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 . ——· A7 _______B7___ 五-、發明説明（和9) … 四隻主要的豬隻在3天大時，以過濾過（0.22um)的均 質液作鼻腔内接種（3ml)及口服接種（lml)。該過濾液是由 一實驗上受感染的豬隻肺部加以製備而得，該肺部是在感 染後（DPI)第7天收集。四隻控制組豬隻是以正常的生物有 擇豬隻製得的肺部均質液加以接種。 每一組的一豬隻是分別在第5、9、28及35DPI下殺死 ◦收集肺、肝、腦、脾、胸腺、鼻部的鼻甲、心臓及小腸 ，且將其固定於10%中性緩衝的福馬林中加以固定。收集 肺、腦、脾及心臓作病毒的分離。收集肺、肝及脾臓作噬 菌體的分離。將肺臓收集至Friis培養基以作黴漿顏的分 離或在-70°C下冷凍。 (D )微生物分析 (1)病毒分離 (10% w/v)在lOOOxg下澄清的組織懸浮液接種至細胞 單層上，且觀察細胞病理上的作用。初级胎兒豬隻腎臓培 養、初級豬隻肺胞呑噬細胞的培養及所建立的PK15細胞株 、胎牛的鼻甲、幼黃金鼠的腎臓（BHK)、Vero及豬睪九皆 嘗試使用去分離病毒。直接的支氣管一肺胞灌洗培養物是 由受感染及控制組的生物有擇的豬隻中加以製備而得。使 用參考用的生物有擇之過度免疫或恢復間豬隻血清（該血 清是對抗豬-隻小病毒（parvovirus PPV)、S IV、胎牛病毒 性腹瀉病毒、紅血球凝集化腦脊髓病毒（HEV)、TGEA及EMC V)，藉由間接免疫螢光嘗試作病毒撿測。該過濾藉由在 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β/Ο … ίο天大的雞蛋胚胎尿膜内及尿囊液中接種，以在每次轉種 後作紅血球凝集活性測試。 (2) 黴漿菌的分離 肺部懸浮液被接種至黴漿菌内汁培養基Fr i i s (Fr i i s (1975 , Acta V e t · Scand. 27 , 337)BΗ I-TS,D_TS (Ross等 人（1971), Joural of Bacterology, 103, 707)及BHL( Yamamoto 等人（1982) Proc. Int. Pig Vet· SocietyCon gress, p.94)。當生長是明顯的或是在第3、7、14及21天 藉由外免疫螢光法加以鑑定其（Del giud ice等人（1967) Jounal of Bacteriology, 93, 1205)為生長時，將該培 .養物轉種。 (3) 細鋪的分離 擦拭鼻部的鼻甲棉花棒在二血液瓊脂培養盤以及 MacConkey, Tergitol-7及 PMD瓊脂培養盤（作 h mu 1 toe i ds的分離）上接種。該血液瓊脂培養盤之一者為 在37°C下於(：〇2及112的厭氧環境下接種。該第二培養盤是 以一金黃葡萄球菌（Staohlococcus e p i d e r m i d i s )的保育 菌落加以交錯劃線，再以另一培養盤於空氣中且37 °C下作 接種。 肺部如鼻部鼻甲棉花棒於培養盤上培養。肝及脾臓是 在2個血液瓊脂培養盤（好氧及厭氧）以及T_ergi to 1-7培 養盤上培養。所有的細菌分離株是藉由標準方法（
Bibersteiη(1990), In- Diagnostic Procedures in -44 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 ——· A7 ___ B7_._ 五·、發明説明（么>)
Veterinary Bacteriology and Mycology ed. Carter等 人，5th et.pp. 139-142, Academic Press Inc·，San D i a g o , C a 1 ·及 C a r t e r (19 9 0) , I n : D i a g η o s t i c P r o c e-dures in Veterinary Bacteriology and Mycology ed. Carter G.R·及Cole J· R*， 5th ed·， pp· 129-142,
Academic Press Inc·, San Diego, Cal.)加以鑑定 ϋ (4)血清學 血清中和測試是使用去測試對PRV、TGEV及EMCV的抗 體。紅血球凝集作用的抑制性測試是使用去測試血清對 EMCV及HEV的抗體。間接的免疫螢光測試是使用檢測血清 對BRSV、PI-3、SIV及TGEV的抗體。使用細胞株CL2621作 間接的免疫螢光分析是使用作對PRRSV抗體的撿測。 (I )結果 、 (A )自然發生的肺炎 由真正受感染的豬隻中所得的的肺部並未陷落。大 體上，該肺部有中等程度的肺葉中間的浮腫以及有關肺葉 陷落的線性區域的癒合之多個病巢處。有5-15%的具有顱 部及中間部份的肺葉之顱腹部強化。 組織原病原上的撿查顯示中等程度、急性且為擴散的 增生性細支氣管炎及齒槽炎。有輕微的多處病巢性的淋巴 漿細胞（lymphop lasntacyt ic)心肌炎。觀察其它官器並無 損害。 盲試由原始的案例以及其後由農場中所得的嚴重感染 -45 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 497973 一 · A7 __, B7_-_ 五、發明説明（么多） … 豬隻中受分離出腺病毒、PRV、SIV、HEV、豬隻呼吸性冠 病毒（PRCV)、豬隻小病毒（parvovirus PPV)、EMCV及腸病 毒，結果為陰性反應。免疫螢光撿查該冷凍的肺臓切片並 未顯示出其具有肺炎黴漿菌、S IV、胎牛呼及性合胞體病 毒（BRSV)、偽流行性感冒病毒-3(PI-3)、PRV或TGEV)的抗 原。 由上第I節（A)中的五隻傳統SPF豬隻之一隻中所 得的血清以稀釋度為1 : 20下利用間接免疫螢光法對PRRSV 件測定，産生出陽性的免疫反應。且分別由該豬隻的鼻部 的鼻甲部及肺部中分離出Pasterel—Ii multocida型D及 Haemophilus p a r a s u i s。由所選用的嚴重感染的_隻之肺 部作均質化且接種，並未分離出任何好氧及厭氧的細菌（ 見於方法及物質，上述第（C ) (2)節）。 (B )傳統的豬隻研究 在7 DPI時，所有的豬隻基本上皆發燒至40至41.1 °C， 且經歴過中等程度的呼吸窘迫，該豬隻厭食且昏睡。在第 15 DPI，該豬隻則恢復。 . 巨觀在肺部的改變之持徵在於無法陷落、中等程度的 肺葉間的浮腫及肺部20-40%為病巢性之陷落灰褐線性區 域。 微觀撿視7 DP I的肺部顯示出一片片的組織間質肺炎-，其以在肺胞管中型I肺炎細胞的生殖、混合著發炎細胞 壤死細胞的碎屑之累積以及在肺胞隔膜中的呑噬細胞及淋 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 497973 ' 〜. A7 __B7_;___ 五、發明説明- 巴球的滲入。一般而言，類偶合胞體細胞是在肺胞管及沿 著該隔膜可見。 第5圖顯示由傳統豬隻10 DP I的肺部得到的切片所顯 示出的組織切片、其在肺胞間隙中（箭頭處）有延長型E 肺炎細胞增生（箭頭）及壤死細胞的碎屑。在第10天所 觀察到的損害的情況及外表是相似於第7天所觀察到的。 第6圖顯示由傳統豬隻10 DP I的肺部得到的第二組織 •切片，其使用蘇木紫及伊紅作染劑，其在肺胞間隙中（箭 頭處）出現有類似合胞體細胞。在第10天所觀察到的肺炎 增生及合胞體是比第7天所觀察到的為多。 在15 DPI僅為中等嚴重的損害，但該豬隻在臨床上為 正常。無有細菌或是黴漿菌可由該肺部份分離出。作對 EMVC、PRV、PRCV、腺病毒及SIV等病毒之分離結果皆為陰 性反應。作冷凍肺部切片的免疫螢光檢視並未顯示出具有 BRSV、PI-3病毒、PRV、SIV、TGEG或肺炎黴漿麵之抗原。 在控制組豬隻中無有觀察到整體或微觀的損害。 (C )生物有擇豬隻的研究 所有接種過的豬隻在5 DPI前是經歴過嚴重的吸呼窘 迫及呼吸急促。溫度是在40.52°C或更高，且該豬隻厭食 且昏睡。在8 DPI時就有臨床上的改進·，且在15 DPI時在 臨床上顯得正常。無有豬隻死亡。控-制組的豬隻以正常 的均質過濾液加以接種，其依然保持臨床上為正常的。 5 DP I的巨觀損害之特徵在於無法陷落、肺部有多個 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 -- A7 -- ---B7_.__ 五，、發明説明（名广y .… _胃之陷落灰褐線性區域及中等程度的肺葉間的浮腫。微 Ml fra胃’其為具有肺胞隔膜的單核細胞的滲入之多個病巢 μ @ φ等擴散性的組織間質肺炎以及中等程度的型][肺炎 i：曾4 ◦在肺胞管中具有發炎細胞、壞死細胞的碎屑以及蛋 白質性的流體。在其它器管中無觀察到損害。 ΐ£ 9 DP I，該無法陷落的肺部具有中等程度的肺葉間 的浮腫，以多病巢性的l-3cni之堅固的灰红血陷落區。第 7圖顯示由在9 DP〗生物有擇的豬隻肺部中所得的組織切 片’其使用蘇木紫及伊紅染色，其具有型I肺炎的增生（ 箭頭處）及類似合胞體細胞形成處（箭頭）。微觀而言， 該損害是相似於在5 DP I所觀察到的，除了其型I肺炎增 生是較顯著的，且在沿著肺胞及隔膜及在肺胞管中有中等 數目的類似合胞體細胞。腎臓有膨脹的腎小管，其含有一 些淋巴漿細胞滲出物及細胞碎屑。 在28 DPI，在其它的肺葉中有20%的顱腹部二側的 陷落，其是有關在肺葉的頂部及中間，且具有l_2cm多病 巢的陷落處。微觀而言，該肺部的損害是相似於在9DP I 所觀察者，但此外，其會有中等程度的細支氣管周圍及肺 胞周圍淋巴漿細胞的聚集0輕微至中等程度的淋巴細胞及 漿細胞的滲入是在脈絡網狀組織、腦膜、肌心及鼻部鼻甲 組織上多病巢的存在。
第8圖顯示35DP I，該肺部的損害是較不嚴重的，但 有顯示的多病巢性的淋巴漿細胞心肌炎。嘗試作對PRV、S -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五-、發明説明（#) 〜 IV、腺病毒、EMCV、HEV、PPV、腸病毒及PRCV的病毒分離 皆未成功。在豬隻肺胞的呑噬細胞中可觀察到細胞病原的 作用，其待徵在於在細胞變圓、溶胞以及細胞死亡。顯示 出延伸性的合胞體之直接支氣管肺胞灌洗培養物是在第6 圖顯示，而由控制組豬隻所得的相似培養中未觀察該現象 。利用免疫電子顯微鏡作負染色加以撿驗該等培養物顯示 有二型的類似病毒的粒子。一型，顯示於第10圖，其直徑 約70nm，具被膜且具有短的表面突起。另一型，顯示於第 11圖，其具被膜，多形體，約80χ320ηπι，其以抗體包圍。 f由肺、肝、脾及或腦中無有分離出細菌。 在28及35 PUI下所收集的血清對SIV、EMCV、TGEV、 BRSV、HEV或PI-3病毒無有抗體價數。這些血清對PRRS病 毒為陽性反應（1:1280)。 控制組的豬隻難整個研究中依然保持正常，且在任何 組織中無整體或微觀的損害。無細菌或病毒由控制組中分 離出。 (I )討論 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由具有自然發生的地區性肺炎的豬隻所得的肺過濾濾 物可在實驗上接種過的傳統及生物有擇的豬隻中造成肺部 及心臓的損害。在二者自然與實驗上的疾病所觀察到的損 害是與一病毒之病因學相互吻合。 _ 不同地，先前所鑑定出的豬隻病毒呼吸性病原分離出 。且觀察到其細胞病因的作用，其特徵在於對初级豬隻肺 -49 - 本1氏張尺度適财關家縣（（：]^以4規格（21()><297公釐) ~ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 - -.. A7 __B7 五，發明説明（0) _ 胞呑噬細胞培養物可造成細胞溶胞，其與Y〇on等人（ Journal of Veter i nary Diagnostic Investigation, vo 1· 4 (1992) ρ·139)之PRRS病毒感染的報告相吻合。但是 ，在本研究中所觀察到的在直接灌洗友氣管肺胞培養物中 的大量合胞體卻是無在先前有關PRRS中報導中提出。 感染細胞培養物的電子顯微鏡的觀察顯示出二型類似 病毒的粒子，一為具有fe小表面突起之7 0 n m被膜類似病毒 粒子顯然是與Benfield 等人（Jounal of Veterinary Dia gnostic Investigation, vol· 4 (1992), ρ·117)有關 PR RV病毒的報造相吻合，其是另一類似病毒粒子的顯然是有 分別的。無有一豬隻發展出對SIV、PRV、TGEV(PRCV)或 EMCV之抗體價數。但是，該生物有擇豬隻將血清轉為對抗 PRRS病毒的。 在實驗I中的臨床上疾病是藉由在接種過的生物有擇 及傳統的豬隻中在5 DP I下有中等到嚴重的呼吸窘迫加以 分類的。在該實驗中的疾病是比以前實驗（Collins等人 及Υ ο ο η等人，s u p r a)中所觀察到的為嚴重。 近用來鑑定型A SIV變異種（aS IV或與其相關的疾病 )的氣道終端上表面的壞死以及增生（MOrin等人 Canandian Veterinary JOunal, νο 1 . . 31 (1991) , ρ.837) 是未在實驗I中觀察到。血纖維蛋白沈積，且該透明的膜 沿著該肺胞隔膜與sS IV相結合（Mor i η等人及G i rard等人， supra)皆本觀察到。在實驗該些存活超過15 DP I的豬隻 -50 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7_ . __ 五-、發明説明（么幻 … 中觀察到非化膿性的心肌炎，該心肌炎不與aS IV相結合（M orin等人及(}irard等人，supra) °猪隻不會血清轉變成對 S IV的，藉由在胚胎化的雞蛋中轉種亦撿測無有SIV。 在PRRS疾病的發生及實驗上的接種中所見的主要肺部 損害是顯著地有以單核細胞在組織間質中滲入（C〇 1 Π ns等 人，Pol等人，supra)。在實驗I中受感染豬隻所觀察到 的型]I肺炎細胞的增殖、合胞體細胞形成及心肌炎是在其 它的豬隻未觀察到的。以實驗I中過濾的感染因子所産生 的損害教示該在此研究所描述的疾病，即為所稱的PRRSV 的愛荷華株_，是由一單一病毒性因子或是一PRRS病毒與 另一感染因子結合所引起的。
實驗I (工）物質及方法 (A )領域中病症物質及歴史 由經歷PRRS且在哺乳期持績著有嚴重的肺炎的農場 中所得的豬隻，其所生産的42小豬隻中僅有20隻存活。將 該豬隻解剖，且該肺部組織樣品加以收集，且以標準的方 式，即為無麵的均質化技術，加以均質化。該肺部的均質 液（10w/v)在Eag le · s基本培養基（MEM)中加以製備，且經 由0.22um的濾紙過濾，而後用來接種。 - (B )細胞 在由MA-104中衍生之稱為PSP-36的連續細胞株中（其 -51 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇:<297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 ST-SAH Vero 76 NLDK CRFK MT U937 3KX-21 ST-ATCC BGM-70 CK65D FKCU P388D1 Hep 2 CHO-K1 ST-ISU BSC-1 HDCK FL IC-21 ST-UNE PSP 36 CT-60 NCE PU5-18 PD5 3201 L929 SL0 PSP 29 PSP 30 PSP 31 工BRS2D10 AG08114 AG08116 五，、發明説明（#) 購自 Whittaker Bioproduct, Inc( Walkersville, Maryland)) 。 PSP-36 細胞樣品增殖 ，且該細胞株稱為 PSP-36-SAH。豬隻肺胞呑噬細胞及約九種其它的細胞株，例如在 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 牛
HDBK 無脊椎動物 tl鶉 ASE TAE AVE BGE HZM IDE2 IDE8 QT-6 QT-35 m
CU10 LKH HD 11 BM2L 兔子 RK13 mm
TblLu 表I所述的例子， 使用作病毒的分離。 表I 発 猴： 狗 編 鼠 λ類 黃金鼠 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (c)病毒分離 上述製備而得的肺部均質液於4 °C下在2000xg或 3000rpmTl5分，鐘加以澄清。該上清液經_〇.22um的濾紙加 以過濾。將該過濾液接種到在第（B )節所述的每一細胞 株中。在合適且含有0-4%胎牛血清（FBS)及抗生素之培養 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 - 〜· A 7 B7_._ 五γ、發明説明（ft?) … 基中維持其生存。每天監測該細胞的細胞病理效用（CPE) 。若CPE在8-9天内未觀察到，該培養物盲目地作2-3次的 轉種。若觀察到可能的CPE，該培養以復原期豬隻之對ISU -12的抗血清作間接的免疫螢光分析（IFA)加以撿查。 (D )病毒價數 ISU-12分離株一連串10倍的稀釋液是在含有2%FBS及 lx抗生素之Dulbecco’基本培養基（DMEM)。每一稀釋液（ 0.2m 1二重覆地接種於在Lak-Te 1槽中作為種子的PSP-36細 胞以及豬隻肺胞呑噬細胞培養物的每孔中，在感染後3天（ 3 DPI)，該該槽以冷的80%丙酮及20%甲醇在4°C下加以 固定15分鐘。而後該鎮槽使用復原期ISU-12抗血清及抗PR RS病毒血清在一 IFA中加以染色。 (E )間接免疫螢光分析（IFA) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該PSP-36細胞及豬隻肺胞呑噬細胞培養物以ISU-12分 離株加以感染，在感染後20及48小時，該培養物以冷的80 %丙酮及20%甲醇溶液在4°C下固定1〇分鐘。使用ISU-12 復原期血清、抗-PRRSV血清及購自South Dakota State Universitu，Brookings, South Dakota的抗 PRRSV單株 抗體進行IFA。未受感染的PSP-36細胞及呑噬細胞培養使 用作為控制組。 (F )放射免疫沈-澱分析（RIP) 分離株及模擬受感染PSP-36細胞是以35 S-甲硫胺酸及 35S-胱胺酸加以標記。在25cm3三角瓶中的3天大PSP-36細 -53 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 • -- A 7 一 _B7_.__ 五、發明説明（f/) … 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 胞以0.5ml的10 4 TC IDs α之ISU-12病毒加以感染。感染後 24小時，該培養基以缺甲硫胺酸及缺胱胺酸的DMEM取代， 該培養在37°C培養14小時。而後該培養基以新鮮的具有 100uci/ml的35S-甲硫胺酸及35-S胱胺酸之甲硫胺酸缺少 及胱胺酸缺少的培養基加以取代。在加入35Met及35Cys五 小時後，該細胞以冰冷的磷酸緩衝溶液（PBS PH7.2)清洗 三次，而後由三角瓶中將其剝落下，且在lOOOxg離心410 分鐘使其形成塊狀物，含有標示的病毒蛋白質及模擬感染 細胞塊狀物的細胞塊狀物以溶胞緩衝液加以破壞，而後該 細胞殘餘物依據 Z h u 等人（A m · J · V e t · R e s ·，51 - 2 3 2 - 2 3 8 (1990))的步驟離心加以澄清。該溶胞液以復原期的血清 及抗PRRS病毒血清加以培育（該血清先以冷的正常PSP-36 細胞溶胞液在4°C下預吸附過夜），。藉由加入Sepharose蛋 白質 A 粒子（得自 sigma Chemical Co., St.Louis· Missouri)帶室溫下2小時後，收集該免疫複合體，且該S e p h a r 〇 s e蛋白質A粒子與免疫複合體之混合液以溶胞緩 衝液清洗三次，以蒸餾水清洗三次，該混合液再懸浮於 5 Oul樣品緩衝液，且如Zhu等人uspra所述的在SDS-PAGE 凝膠上進行電泳。 ’ (G )電子顯微鏡（EM) 該PSP-36細胞在25cm2三角瓶中以ISU-12病毒加以感 染，感染後48小時，該感染細胞以3%戊二醛（PH7.2)在4°C 下固定2小時，該細胞後而由三角瓶中剝落，且離出形成 -54 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7___ 五·、發明説明（^) 〜 塊狀物，該細胞塊狀物加工且使塑膠埋入其中，該塑膠埋 入的細胞塊狀物作薄層切片。染色，在一如Paul等人（Am· J· Vet· Res·, 38: 31 1 -315 (1976))之穿透性電子顯微 鏡可見到。
(2 )該豬隻生殖性及疾病在實驗上的再現性 (A )實驗 92. 1 SPF 由ISU-12所的肺部過濾液在六隻為專一不具病原（SPF )的五週大豬隻中作鼻腔内接種。該豬隻在接種後（DPI) 3 、5、10、28及43天殺死。
(B )實驗 92.3SPF 六隻雜交豬隻在五週大時以受USU-12肺部過濾液所感 染的豬隻肺胞作呑噬細胞物質加以作鼻腔雨接種，該ISU-12接種的豬隻在10及28天解剖之。
(C )實驗 92.10 SPF 三隻5週大的4豬隻以在PSP-363ml增殖的ISU-12 (含 有TCID5Q/ml病毒）加以作鼻腔内接種◦二豬隻作為未接 種的控制組。一心A豬隻在DP I 5、10及28時解剖，控制組 的豬隻在DPI 5及10加以解剖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
(D )實驗 92.12 SPF 22隻五週大的豬隻分成六組，組I.，六隻是以3m 1在 含有105TICD5Q/ml病毒之PSP-36中增殖之的斑點純化的 ISU-12 (斑點代號1 )病毒加以接種。組I，6豬隻是以 控制組的細胞培養物培養其加以接種。在組I (斑點代號 -55 - I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7 五-、發明説明（^) … 3 )及組V (斑點代號5 )的每一組中，二豬隻以斑點純 化的ISU-12接種。在組V中，2豬隻是以未作斑點純化的 加以接種，在0在組VI，中三豬隻以ISU-12的組織過濾液 加以接種。 由組I及E中的二隻主要及二隻控制組豬隻在5、0 及25 DP I下解剖，該以斑點代號2及代號3所接種的二豬 隻每一隻在10 DPI下解剖，由組V及VT每一組中所得的一 豬隻是在5、10及25 DPI下解剖。 (E )微觀的檢查 肺、腦、心及脾是在解剖時收集，以10%緩衝中和的 福馬林加以固定，埋入石蠟中，且以蘇木紫及伊紅加以染 色。 (U )結果 (A)細胞的培養 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (1) ISU-12在豬隻肺胞呑噬細胞培養物中的培養 以在開始2-3DP I的ISU-12肺部過濾物感染的豬隻肺胞 呑噬細胞培養物中觀察細胞病理作用（CPE)。CPE之特徵在 於由其呑噬細胞的聚集及溶胞。在ISU-12感染的培養物中 約90%的吞噬細胞培養物在4-5DPI時顯示出CPE。第12(A) 圖顯示在未感染呑噬細胞培養物中觀察到無有CPE。該ISU -12病毒在呑噬細胞培養物中第三次轉種的價數為104-10 5 TCISD5〇/nd。 病毒性抗原是藉由在ISU-12感染的豬隻肺胞呑噬細胞 -56 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 497973 . A7 --^ * ___B7____ 又、發明説明（例 、·- 培養物之胞體漿中，使用得自生物有擇的豬隻之ISU-12復 原期血清而作的IFA撿測，其顯示於第12 (C)圖。 (2)在連續細胞株中ISU-12分離株的培養 約90細胞株作測試（見於上述節（B)的物質及方法） ，病毒複製的的證據是顯著顯示於六個細胞株中，值得注 意的為PSP -36、PSP-36-SAH、MA-104、滑液細胞、肺胞 呑噬細胞及豬隻鼻甲細胞。 第13(B)圖顯示在2 DPI該CPE開始，且具有下列特徵： 降低、細胞變圓以及細胞聚集。在3-4 DP I，圓形的細胞 聚集叢數目增加，該聚集叢融合在一起。許多圓的細胞由 該細胞單層中分離出，且後其導致該單層的崩解。在5DP I 後CPE變得十分廣泛，且典型地是超過95%的單層為如此 ，在控制PSP-36細胞中未觀察到CPE，其顯示於第13 (A)圖 中。該ISU-12分離株在PSP-36細胞中生長成高價數，在第 11次細胞轉種培養物中約10 6 -10 7 1'(：105〇/1111。 病毒的抗原在受感染的細胞中胞漿體中以由實驗上以 ISU-12肺部過濾液接種的生物有擇的豬隻於恢復期所得的 血清加以作撿測（見於第14(B)圖）。在控制組PSP-36中 無有觀察到螢光（第14(A)圖）。 (Μ )病毒特性 (A) ISU-12對PRRS病毒在抗原上的相關性 對PRRS病毒分離株VR-2332 (購自Dr. Benfiled,
S o u t h D a k o t a)的單株抗f豊及抗P R R S V血清（得自U S D A -57 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 497973 ——· A7 ____— —_B7 五，、發明説明〜
National Veterinary Seervices Laboratory, Ames, Iowa)與isi]:12感染PSP-36細胞反應，其證據為在IFA 期間有光亮的胞漿體螢光反應（見於第14((：)圖），但不 與未感染的PSP-36細胞反應。 (B )病毒蛋白 抗-ISU-12恢復期的血清及抗PRRS病毒血清是使用去 分析病毒蛋白，該二血清認知至少4蛋白質，其分別為分 子量為19、24、32及61kD (第15圖）。在第15圖，模擬的 感染（道1及2)或ISU-12感染（道3與4)者皆以抗-PRRSV多株型抗血清（道1及3)或復原期的血清（道2 及4 )予以免疫沈澱之。 (C )病毒結構 典型病毒粒子是在55-85nm間，其亦在ISU-12感染PSP -36細胞中觀察到。該病毒粒子為具被膜，為球形且存在 於ISU感染之PSP-36細胞之細胞質載體中。
(IV)疾病在實驗上的再現性 (A )實驗 92.1SPF 由上ISU-12所得的肺部過濾液作鼻内接種至6隻專 一不具病原（SPF)的五週大豬隻。該豬隻在接種後（DP 13、 5、10、28及43天殺死Q在3 DPI時，該ISU-12的猪隻顯示 出嚴重的呼吸窘迫以及發熱。這些徵兆持績10-14天’整 體肺部的損害是分類為60%的肺部單重的多病巢性的灰褐 色的強化。此亦有中等的心臓擴大症及腹水的聚集°微觀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五、發明説明（0) … 的改變的特徵為嚴重的具有型η肺炎細胞增殖的增殖性組 織間質肺炎、合胞體細胞的形成肺胞的滲出及輕微具有單 核細胞的組織間質變薄。其具有非化膿性的心肌炎、嚴重 的腦炎以及中等的淋巷巴漿細胞腎炎°該1511-12實驗上的 豬隻在10及28天解剖，其血清轉變成對PRRS因子的，當其 藉由NVSL加以確認。
(B )實驗92.3 SPF 所有ISU-12接種的SPF豬隻在3天内顯示嚴重的呼吸性 疾病，其持繼超過14天，整體的損害可分為肺部的充血、 浮腫以及顯著的多個病巢性一擴散性肝變化。微觀而言， 嚴重的增殖性組織間質肺炎、中等的腎炎及輕微的腦炎皆 可被觀察到0該ISU-12接種的豬隻在10及28 DPI解剖，其 具有血清轉變成對PRRS，其由NVSL加以確認。
(C )實驗 92·10 SPF 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 接種的豬隻之臨床上的徵兆包含嚴重的昏睡、發燒及 中等的厭食，中等到嚴重的呼吸性窘迫，在5-22 DPI觀察 到。帶整個實驗中該豬隻為中等的狂暴。微觀的損害包含 在5 DP I輕微的增殖性組織間質肺炎及嚴重的化膿性扁桃 腺炎。中等程度具有型E增殖性的多個病巢之P IP，肺胞 滲出物、多核化的巨大細胞及合胞體形成是在10DPI時觀 察到。具有血管周圍袖口及膠質變樣的中等病巢性腦炎_亦 在10 DP I時觀察到，中等的門靜脈周圍的淋巴呑噬細胞肝 變樣、輕微非化膿性心肌炎以及鼻炎在10 DP I撿測。在26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7 發明説明（7) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 DP I，其有嚴重的組織間質肺炎，其可分為多個病巢性的 組織間質薄層，其具有單層細胞、中等的多病巢性型I[肺 炎細胞的增殖，中等量的混合之肺胞滲出液以及淋巴細胞 及呑噬細胞之鬆支氣管周圍袖口。其亦有中等病巢性心肌 炎、中輕微的肝炎I一微輕的腎炎以及扁桃腺炎。該二ISU -12接種的豬隻在10 DPI血清轉變成對PRRS。 該控制組豬隻在實驗期間保然為臨床上正常，且顯示 無整體或微觀的損害，其亦保持對PRRS血清陰性反應。 (D )實驗 92.12SPF 生物上未選殖的ISU12對SPF豬隻為病原性，且産生如 上實驗92 .10SPF中所産生的組織間質肺炎、心肌炎及腦炎 。以ISU-12生物上的殖株（斑點代號1、2及3 )接種的 豬隻産生輕微組織間質肺炎，但在該些豬隻中並未檢測 出有型I[的肺炎細胞增殖、肺胞滲出物且/或腦炎。所有 以ISU-12接種的豬隻，無論選殖或未選殖，皆在10DPI血 清轉變為對PRRS。該控制組的豬隻依然保持不具有病毒感 染及疾病。 (V )㈣ 具有自然發生感染的豬隻（ISU-12)所得的肺及心過濾 液（0.22mu)之五週大的SPF豬隻可在實.驗上再現出嚴重的 肺炎。該肺炎是由PRRSV愛荷華菌株（ISU-12)所産生，其 待徵為組織間質肺炎、型I肺炎細胞增殖以及合胞體的形 成。在受感染豬隻中觀察到心肌炎及腦炎。ISU-12在豬隻 60 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i------、玎------^. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五，、發明説明（ΘΠ 、· 肺胞呑噬細胞培養物以及一連續的細胞株PSP-36中産生細 胞病理效用。病毒的抗體可藉由間接免疫螢光法在ISU-12 -感染培養物中撿測出，但在未感染的細胞則撿測不出。 使用多株及單株抗體藉由免疫螢光法得知ISU-12在抗原性 上是與PRRS病毒_株VP-2330有關。但是在以非斑點純化I SU-12的感染的豬隻中之徼觀損害上是觀察出有不同處， 此教示在PSP-36中可能有另一病毒或感染因子生長，且該 另一病毒或感染因子可能是愛荷華菌株所造成疾病與損害 不同於且比在文獻中對PRRS病毒更嚴重之原因。所有以IS U-12接種的豬隻，無論選殖或無選殖，在10DPI皆血清轉 變為對PRRS的。該控制組的豬隻依然無有病毒感染或疾病 0 實驗瓜 與豬隻呼吸及生殖病症的愛荷華_株相結合的感染因 3 ’端之分子上的選殖以及核苷酸序列 (工）物質及方法 (A )病毒的繁殖及純化 此後，為了解化討論，本申請案中〃病毒〃或〃病毒 性〃等詞為上述的一病毒或感染因子的意思或是一病毒或 感染因子的特性。 一連續的細胞株，PSP-36，使用於分離以及繁殖ISU-12分離株（與PRRSV愛荷華菌株相結合者）。該ISU-12病 毒在PSP-36細胞中斑點純化三次，而後該PSP-36細胞是以 -61 - ^氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五，發明説明… 斑點純化後的病毒加以感染。當70%的感染細胞顯示出細 胞病理上的改變時，該培養物冷凍且解凍三次。藉由在4 °C下低速離心（ 5000Xg) 10分鐘而使該培養物培養基澄清 ，而後以7%PEG-8000 2.3%NaCl在4°C下攪拌過夜加以沈澱 ，且該沈澱物藉由離心而結成塊狀。再將病毒塊狀物懸浮 於2ml的tHs-EDTA緩衝郷液。是倒在CsCl梯度（0.1245-1.2858g/ml)的頂上。於20°C下在28000rpm下超高速離心8 小時後，清楚可觀察到具有密度為1.15-1.18g/ial帶，且 可回收，該帶的感染價數藉由IFA加以決定，該價數為106 TC ID 5 a /m 1。典型的病毒粒子可藉由負染色電子顯微鏡加 以觀察。 (B )病毒RNA的分離 整體RN A是由在CsC丨梯度中含有病毒帶中以一商業上 的RN A分離套組（得自Stratagene)加以分離出。聚（A) RNA可藉由寡（dT)-纖維管柱層析法依然該管柱（Invitro-gen) 製 造者所 述的步 驟加以 處理而 增加。 (D ) ISU-12cDNAA基因庫的建立 一般建立cDN Α λ基因庫的流程步驟是顯示於第16圖。 由mRNA合適第一股cDNA是使用具有Xho I限制區的寡（dT) 引子藉由反轉錄酶加以進行。該核苷酸含有正常的dATP、 . dGTP、dTTP;a bba 5-甲基-dCTP (可保護cDNA避免其後選 殖步驟中制限酶的作用）。 第二股cDNA的合成是以RNase Η及DNA聚合酶I加以進 -62 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（如） 行。該cDNA以T4 DNA聚合酶使其平頭化（端點為平頭）， 而以T4連接酶與EcoRI接合子（adaptor)接合，而後以丁 4 聚核苷酸激酶作使活化（也就是磷酸化）。該cDKA以 Xho分解，該分解過的cDNA在瓊脂凝膠上作大小的選擇。 選用大小大於Ikb之分解過DNA，且藉由一商業上可得的 DNA 純化套組（Geneclean,得自 BI0 101, Inc., La Jolla ,C a 1 i f o r n i a)加以純化。 純化的cDNA接合至λ噬菌體載體臂，經由基因工程修 飾而具有Xhol與EcoRI的連接端。以λ萃取物將連接後的 載體包裝入感染性的λ噬菌體中。該大腸桿菌細胞的SURE 菌株（得自Stratagene)是使用作性狀感染，而將該入基 因庫放大且在XL-1藍色細胞株中測定出價數。 (D)藉由區別性雜合方式篩選出λ基因庫 藉由區別性雜合加以鑑定出P IP病毒ISU-12菌株的可 信殖株之流程步驟是顯示於第17圖，且如上所述。該人基 因庫是培養於XL-1藍細胞中，該噬_體吸在耐龍膜上二重 覆，且以以傳統的方法變性。由病毒感染的PSP-36細胞以及未感染的PSP-36所得的記號RNA是藉由寡（dT) 纖維管柱層析法（如管柱製造者所述的，Invitrogen)加 以分離。 . _ 互補DHA探針是由分離於病毒感染的PSP-36細胞以及 正常PSP-36細胞mRNA，利用隨機引子且在32P-dCTP存在下 ，依據製造者所述的步驟（Amer>Shain)加以合成的。二種探 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五-、發明説明（外） … 針（第一是由病毒感染的PSP-36細胞，另一為正常且非感 染PSP-36細胞所合成的）分別使用Sephadex-G50管柱層析 法加以純化。該探針於50%甲醯胺下’於42 °C下分別與該 二重覆的耐龍膜雜交。分離出與由該感染細胞所製得的探 針雜交但不與由正常細胞所製得者雜交的斑點。含有cDNA 插入體的的噬小體（Phagemids)藉由試管中以G408輔助噬 菌體加以輔助解救。該解求的噬小體Phagem ids在XL-1籃 細胞中放大。該含有病毒DNA插入體的質體藉由Qiagen管 柱層析法純化，其後定出序列。 (E )定出序列及序列分析 含有病毒cDNA插入體的質體藉由Qiagen管柱層析法純 化，藉由Sanger’s去二氧方法使用一般引子與反引子，以 及各種内祁的寡核苷酸引子定出引子。序列是至少由二個 分別的殖株加以得到的。當所得的序列資料不清楚時是須 定出額外的殖株或區域的序列該核苷酸序列資料可使用二 電腦軟程式 GENE WORKS (IntelliGenetics, Inc·, Mountain Biotechnologies, Inc. , New Haven, Conncticut)組合 分別的分析（View, California)及 MACVETOR (International Biotechnologies, Inc. , New Haven, Connecticut) 組合且分別的分析。 (F )寡核苷酸引子 使用自動化DNA合成器（Applied Biosystems)合適作 單股DNA之寡核苷酸，且以HPLC純化。寡核苷酸PP284 ( 5’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29<7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五-、發明説明（么Θ … -CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3，；及 PP285 ( 5f-CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-5’；序列辨識編號 ·· 2 )合成作PCR的放大。一 DNA探針是以由該病毒基因 組;T端所得二引子産生以作北方點墨分析（見下述討論） 。寡核苷酸 PP286 (5’-GCCGCGGAi\C CATCAAGCAC-3’； 序列辨識編號：3 )及PP287 ( 5f-CAACTTGACG CTATGTGAGCy ;序列辨識編號：4 )合成作PCR放大。由 該二引子産生的DNA探針更進使用於篩選該λ基因庫。寡 核苷酸（5^GCGGTCTGGA TTGACGACAG-3’ ；序列辨識編號： 5 ) ,PP289 (5 ^GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3、序列辨識編 號：6) ,PP386 (5f-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3，；序列辨 識編號：7) ，PP286及PP287是使用作為定出序列的引子 以得内部的序列。 (G )北方點墨分析 由ISU-12 cDNA殖株的3 ’端所得的專一 DNA片斷藉由PC R以引子PP284及PP285放大。該DNAS片斷是可藉由一商業 上可取得的DNA純化套組（GENECLEAN，得自Bio 101)由瓊 脂凝膠中得回，且藉由引隨引子的延長方法（使用得自 Ameersham的套組）以32P-dCTP作標記。整體RNA是由ISU -12感染的PSP-36細胞於感染後36小時.加以分離的（其使 用一商業上可得之整體RNA分離套組，其可依然製造所述 的步驟（Stratagene)加以進行）ϋ該ISU-12次基因組mRNA 種類是以6 Μ戊二醛及DMS0加以變性，且在1¾的瓊脂凝膠 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五：發明説明（έ令） … 上分離。（以1. 5%瓊脂凝膠進行相似的步驟所得的結果是 述於下實驗VI且顯示於第35圖）。而後將該分離出的次基 因組mRNA使用POSTBLOT壓力點墨器（Stratagene)轉至耐龍 膜上。雜交是在42 °C及50%甲醱胺下於一雜交的烤箱中用 管狀的瓶子進行。 結果 (A ) ISU-12 3 ’端基因組的選殖、鑑定及序列的定出 由得自ISU-12感染的PSP-36細胞所得的部份純化之病 毒加以建構出寡（dT)作為引子的cDNA λ基因庫。在以基於 萊西斯倍德病毒序列的探針作該cDNA λ基因庫篩選是會面 對一些問題。製備三組引子，第一組為（ΡΡ105及ΡΡ106， 序列辨識編號：21-22)，其相對應於萊西斯倍德病毒基因 組序列（位於核鞘基因區域）的14577至14596以及14977 至14995。第二組為（ΡΡ106及ΡΡ107，序列辨識編號23-23) ，其相對應於萊西斯倍德病毒基因組序列（側面的PRF’s 6及7)的14977至14995以及14054至14072。第三組為（ PM541及PM542，序列辨識編號24-25)，其相對應於萊西斯 倍德病毒基因組序列（位在〇RF-lb區域）的11718至11737 以及 11394至 11413。 PP105: 5, -CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3, 序列辨識編號：21 PP106: 5, -GCCATTCGCC TGACTGTCA-3 # 序列辨識編號：22 PP107: 5/ -TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3r 序列辨識編號：23 PM541: 5f -GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3 7 序列辨識編號：24 PM542： 5, -GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3 f 序列辨識編號：25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 …. A7 ____ _B7_____ 五、發明説明（έ% … 所有藉由使用該三組引子而利用PCR方法，由ISU-12 感染因産生探針的嘗試皆不成功，在使用區別性雜交技 術的嘗試後，該代表ISU-12專一的cDM之可信斑點是可使 用由ISU-12-感染的PSP-36細胞及正常PSP-36細胞所製備 的探針加以分離出。有關區別性的雜交步驟是述於且列於 第17圔。 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 開始先鑑定三個陽性反應的斑點（λ -4、人-5及人-91) ϋ在α噬菌體中含有病毒c D Μ Α插入體的噬小體P h a g e m i d以 C405輔助噬菌體的幫助藉由在試管中刪除作用的加以解救 。該陽性反性殖株的插入體限制酶分解以及端部的序列定 出加以分析。該cDNA殖株的專一性更進一步藉由與由以 PRRSV的愛荷華菌株感染的PSP-36細胞所得的mRNA雜交， 但不與正常PSP-36細胞所的mRNA雜交的技術加以確認。一 DNA探針由該殖株λ -75的5’端藉由使用引子PP286與PP287 作PCR加以生産生。所有使用去得到3 ’端核苷酸序列的 入cDNΑ是呈現於第18圖中。至少是三個不同的殖株加以定 出序列以消除任何的錯誤，有任何不清楚的序列資料情況 下，額外的殖株以及内部的引子（PP288、PP289、PP286、 ΡΡ2δ7及PP386)是使用去定出該序列。該1938bp3’端的序 列（序列辨識編：8 )是呈現於第19圖，且其推縯出的胺 基酸序列SEQ ID N0S:9、11、14與17是呈現於第20圖。 (B )次基因組的mRNA的巢狀組 由病毒感染的PSP-36細胞在1%戊二醛/ DMS0瓊脂凝 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 ' - A 7 _____B7_:_ 五-、發明説明 膠整體分別，且點墨至耐龍膜上。一 cDNA探針藉由在病毒 基因組的3 ’端點區或上的引子（PP284及PP285.)使用PCR方 法加以産生。該探針含有3 ’非轉譯序列以及大多的ORF-7 序列。北方點墨雜合的結果顯示由以PRRSV愛荷華菌株感 染的PSP-36細胞中所得的mRNA種類之形式是相似於由萊西 斯倍德病毒（LV)、馬動脈炎病毒（EAV)、乳酸去氫酶病毒 (LDV)及冠狀病毒所得者，在該等病毒的複製需至次基因 組inRNA的形成。 該結果顯示ISU-12-專一的次基因組mRNA代表該mRNA 的巢狀組，因為該北方點墨探針只代表該3f端之端部的序 列。ISU-12病毒基因（14kb)及六次基因組mRNA (RNA2(3.0 kb)、RNA3 (2.5kb)、RNA4 (2.2kb)、RNA5 (I8kb)、RNA6 (1.6kb)及RNA7(0.9^kb)的大小相似於LV者（第18圖）雖 然在該基因組上及次基因組RNA的種類上有不同。該相當 量的次基因組mRNA可觀察出其不同處，RNA7為主要的次基 因組m R Η A。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (C)由次基因組的RNA編碼的開放式閲讀書架之分析 該三個PRF是發現於序列辨識編號：8 :ORF-5(nt 239-901，序列辨識編號：1〇) 。〇RF-6(nt 889-1403，序列辨 識編號：13)及0RF-7(nt 1403-1771，·序列辨識編號：16) 。0RF-4位在所得序列的5，端，在序列辨識編號1938 bp 3 f端的序列中為不完整的。〇RF 5、6及7每個皆有編碼 多於100個胺基酸的能力，且0RF 5與6是有彼此有l〇bp的 -68 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（έ石） … 交集處，ORF 6與7是有彼此有5bp的交集處。完全位在ORF 7内二個小ORF亦被發現，其分別僅編碼37aa及43aa。另 二個短的ORF完全與ORF 5相交集。該二ORF的編碼能力分 別為2 9 a a及4 4 a a ϋ由北方點墨分析，沒有專一的次基因組 mRNA征與標的PRF相關連的。ORF 6及7—般相信為分別編 碼病毒膜蛋白及鞘蛋白。 (D )引導子（leader)接合處之一致（consensus)的序列 序列分析顯示該一短的序列動因處（mot i f) AACC可作 為在次基因組mRNA處，該處引導子於轉錄時加入（接合處 )。0RF 6的接合處是由ATG起始碼上游21bp處發現，0RF 7的接合處是由ATG起始碼上游13bp處發現。在0PR 5中無 鑑定出AACC—致的序列，雖然在LV的0RF 5中是有發現的 。相似的接合處序列亦是在LDV及EAV中發現。 (E) 3’-非轉譯區的序列及聚U)尾端 在0RF 7的停止碼後的核苷酸長之非轉譯區序列在ISU -12病毒的基因組中鑑定出（其為與在LV中的114nt、LDV 中80nt以及EAV中的59nt相比）。該聚（A)尾端的長度至少 13核苷酸。在PIP病毒、ISU-12、LV及LDV在接近該聚（A) 的尾端處有一致的序列CCGG/AAATT-聚（A)。 (卩）在〇{^5,6及7與非轉譯區序列上1$1]-12與1^基因組 的序列比較 胃 1$11-12與萊西斯倍德病毒的基因中〇1^-5區的比較是 顯示於第21圖。0RF-6區、0RF-7區以及非轉譯區序列的相 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 一 · A7 _ B7 五、發明説明（0) 對比較分別顯示於第22、23及24圖。 比較的結果代於下表EI。與上述相符的，一病毒被認 為是免疫上相等的，若與一免疫原性的病毒其有90%或更 高相似性。在LV及ISU-12之0RF 5、0RF6、0RF7上的核苷 酸序列以及非轉譯區序列相似性分別為60%、68%、60%以 及 58%。 在LV中的0RF 5及6的大小為61nt，其比在ISU-12中的 0RF 5及6分別小3nt。相反的，在LV中0RF 7是比在ISU-12 中的大15nt。同時V端的非轉譯區的序列在長度上是不同 的（在ISU-12中為150nt，但在LV中為114nt)。同於LV， 該接合處序列AACC亦是在PRRS病毒分離株ISU-12的基因組 中鑑定出（除了0RF 5外）。在ISU-12中0RF 6接合處序 列是由起ATG始碼的上游21nt處，然而在LV中0RF 6的接合 處序列是在ATG上游處28nt。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表Μ萊西斯倍德病毒以及ISU-12之ORFs與非轉譯序列的特徵 萊西斯倍德病毒「us PRRSV ISU- 1 2 大小（bp) 接合序列~ Seq.( nt 由 ATG) 序列同源性 (%) 大小（bp) 接合序列 Seq. ( nt 由 ATG) ORF-5 6 0 5 AACC (ATG-36) 6 0 6 6 6 No ? 0 R F - 6 (Env) 5 2 1 AACC (ATG-28) 6-8 5 2 5 AACC (ATG-21) ORF-7 (NP) 3 8 6 AACC (ATG-1 3) 60 3 7 1 AACC (ATG-1 3) NT 113 5 8 15 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五：發明説明β 20
實驗IV 在毘蟲細胞中愛荷華_株的感染因子的表現 (A )重組挥狀病毒的産生 0RF-5、0RF-6及0RF-7的序列是分別地藉由使用基於 131]-12基因組核苷酸序列的引子作？01?加以放大。01^-5的 放大是使用下列引子： 5 f -GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3 9 (序歹(J 辨識編號：26) 3 〜GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5'(序列辨識編號：27) ORF-6的放大是使用下列引子： 5 f-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3, (序列辨識編號：2 8 ) 3,-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5/ (序列辨識編號：29) 0RF-7的放大是使用下列引子： 5;-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-2f (序列辨識編 5虎：30) 3 ,-GGGAATTCAC CACGCATTC-5, (序列辨識編號·· 3 1) 放大的DNA片斷選殖入桿狀病毒傳遞載體PVL1393 (得自 I n v i t r 〇 g e n e )。將一微克的直線化的桿狀病毒A c Μ N P V ( ί辱 自 Pharmingen, San Diego, Calfornia)及 2微克的 PCR放 大選殖之含有cDNA載體建構體與50ul的lipofetiri混合’ 且在22 °C下培育10分鐘，以製備一性狀感染的混合物° 在播灑HI-FIVE細胞後1小時，該培養基以新鮮的Exc ell 400昆蟲細胞培養基（得自JR Scientific Co·)取代 ，且該性狀感染混合物是以滴入的加式加入。所得的混合 物在28 °C下培育6小時，而後，去除該性狀感染培養基’ -71 - . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 -， _一 . _ A7 B7 ____ 五，、發明説明 加入新鮮的Excell 400昆蟲細胞培養基。而後所得的混合 在2 8 °C下培育。 性狀感染後五天，收集該培養基且使其澄清。上清液 10倍的稀釋液接種至HI-FIVE細胞且在室溫下培育60分鐘 ，將1.25¾的瓊脂覆蓋層應用於該細胞上，在28 °C下進行 培育4天，此後，選擇出澄清的斑點，且以無菌的巴氏德 滴管挑出。每一斑點是與lml的Grace、昆蟲培養基混合至 一 5 m 1之可關上蓋子的試管中，且置於一冷藏室中過夜， 以由該瓊脂中釋出病毒。試管在2000g下離心30分鐘以去 除瓊脂，且該上清液轉至一新的無_試管中。重覆斑點純 化步驟三次去避免可能發生的野生種病毒的污染。純的重 組的殖株在-80 °C下保存以作更進一步的調查。 (B )重組愛荷華菌株感染因子蛋白質的純化。 間接的免疫螢光反應分析以及放射性性免疫沈澱測試 為使用作其表現的評估。 間接的免疫螢光分析：顯示於第25圖之在24孔細胞培 養盤上的H i - F i v e昆蟲細胞以野生型的挥狀病毒或重組桿 狀病毒作感染或作模擬感染。在72小時後，固定該細胞且 以合適稀釋度的豬隻抗-ISU-12多株抗體件染色’而後以 螢光素-異氡酸酯標記的（FITC-標記）抗豬隻IgG染色。 如第26-29圖所示，在以重組病毒所感染的細胞中可産生 免疫螢光反應，但在模擬的感染細胞以及以野生型桿狀病 毒接種者則不會産生。例如，第2 6圔顯示以含有IS U - 1 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 - …- A7 __B7___ 五，發明説明（^0) 0RF-6基因重組桿狀病毒（Baculo.PRRSV.6)感染的HI -FIVE可顯示出一細胞病理效用。第27圖以含有IS U-12 0RF-7基因重組桿狀病毒 （Baculo.PRRSV.7)感染的HI-FIVE其亦顯示出一細胞病理效用。相似的結果可以含有以 含有ISU-12 0RF-6基因重組捍狀病毒（Baculo.PRRSV.6) 感染的HI-FIVE可顯示出一細胞病理效用。第27圖以含有I SU-120RF-5基因重組捍狀病毒（Bacul〇.PRRSV.5，結果 未顯示）可得相似的結果。第28及29圖顯示以分別含有ISU -12 0RF-6以及ISU-12 0RF-7基因的重組桿狀病毒所感染 的HI-FIVE以豬隻對ISU-12的抗血清加以染色，而後以螢 光素-綴合的抗-豬IgG加以染色，其中該毘蟲細胞會産生 重組愛荷華_株感染因子蛋白。相同的結果是可以含有 0RF-5之重組桿狀病毒中得到。 放射性免疫沈澱法：放射性免疫沈澱法是以每一重組 病毒（Baculo.PRRSV.5、Baculo.PRRSV.6及 Baculo.PRRSV· 7)加以進行，以更進一步決定該重組蛋白的抗原性以及真 實性。H I-F IVWE毘蟲細胞是模擬感染或是以每一種重組捍 狀病毒感染。感染後2天，加入不含甲硫胺酸的培養基加 入。每一混合物培育2小時，而後加入標記蛋白質的3 5S-甲硫胺酸（Amersham)，且該混合物額外再於28°C下培育四 小時。藉由三次的冷凍解冷的循環製備出放射性標記的細 胞溶胞液，且該細胞溶胞液與預免疫或免疫的抗-ISU - 1 2 抗血清培育。該免疫複合物以蛋白質A瓊脂加以沈澱，且 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五、發明説明（0/) 於沸騰後在SDS-PAGE上作分析。於-80%下將X-光片暴露 於該凝膠上，且展開。預期大小的染色帶撿測出為0RF-6 (第30圖）以及0RF-7(第31圖）産物。 實驗V 如在下表4所列的其它PRRSV樣品是斑點純化三次的， 斑點純化的進行是藉由在PSP-36-SAH細胞中培養澄清的組 織均質液，且選出一單一的斑點，且推論該斑點是由單一 病毒所産生的。培養該選出的斑點，且再選出一單一的斑 點，而後培養，再度再選出單一斑點，而後作第三次的培 養。IFA是使用購自 South Dakota State University, Brookings, South Dakota的抗- PRRSV單株抗體加以進行 一選用作更進一步研究的些分離樣品是郷鑑定出如下 表5，且以其病原性以及mRNA數目加以分類。 表4 PRRSV三次斑點純化的分離株 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PRRSV分離株 ISU-22 ISU-28 ISU-12 ISU-3927 ISU-984 ISU-7229 ISU-92-11581 ISU-695 ISU-79 ISU-412 ISU-55 ISU-33 ISU-1894 ISU-04 ISU-51 ISU-30262 裂備冷凍儲 液之曰期 9/15/92 9/15/92 9/17/92 9/21/92 9/21/92 9/22/92 9/22/92 10/01/92 10/01/92 10/01/92 10/01/92 10/05/92 10/27/92 10/27/92 2/07/93 4/01/93 PRRS單株抗ii IFA结果 價數 TCID5〇/ml 10H 10^ 10： 10： 10' 10-101 IQ1 10-10! 10 ‘ 10! 2S 21 56 89 39 69 31 36 59 99 ;主意：所有的分雞株是斑點纯化過且在PSP-35-SAH魂孢Φ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X 297公釐）一 74 - 24 20
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7 7 A B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明pi) 表 5 分離株 .mRHA、的數目 ISU-12 非常具病原性 7 ISU-984 非常具病原性 7 工SU-3927 輕徼病原性 Ί* ISU-51 輕微病原性 f Ί ISU-22 非常具病原性 9 ISU-55 «輕微病原性 9 ISU-79 非常具病原性 9 未斑點純化的ISU-12、斑點純化ISU-12、ISU-22、ISU-51以及ISU-3927皆在布達佩斯協約在寄存於Amercian Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, R o c k v i 1 1 e , M a r y 1 a n d 2 0 8 5 0 , U · S · A ·，前二者是在 1 9 9 2 年10月28日寄存，且寄存編號為VR 2385、VR2386，且後 四者是在1992年九月30日寄存，且寄存編號分別為VR 2428 > VR 2429 - VR 2430及 VR 2431 - 在ISϋ-3927之mRNA中顯示在七個mRNA中的四値有刪除 的現象。ISU-3927的inRNA 4、5、6、及7之移動比ISU - 12者為快，因此，是比ISU-12為小。該特徵可能是與該 -75 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五，發明説明（;？令） ISϋ-3927具有較低的病毒性有關。 六個分離株的病原是是在五週大的CDCD豬隻中作比較 ，15隻豬隻接種105TCID5(^5病毒。10隻豬隻在10 DPI時 解剖，五隻在28 DPI時解剖。病毒分離株IDU-12、ISU-22 以及ISU-28是最具病原性的，然而ISSU-51以及ISU-55是 具有低的病原性。在先前的研究中，該ISU-3928對五週大 的豬隻僅為輕微病原性的。 由ISU-22以及未斑點純化（也就是未斑點純化之分離 出的感染因子）ISU-12所造成的損害持續較長的斑點純化 的分離株産生輕微的心肌炎以及腦炎。未斑點-純化病毒 産生稍微比其相對斑點純化分離株嚴重的疾病。 CDCD小豬提供一對病原性以及可能作為疫苗之效用上 的評估之一良好模式。該分離株ISU-12、ISU-22以及ISU-984産生相似損害，且可使用以評估疫苗效用（基於整體 以及微觀上的損害之撿驗）。該ISU-3927較不具病毒性， 怛是一足以評估作為對抗PRRSV病原菌株的疫苗。 以斑點純化ISU-12感染的豬在28天内所得到的重量約 為9.9磅，比控制組為少（以未感染的PSP-36細胞加以 作用）。初期的結果顯示在2-10DP I有淋巴球減少症以及 嘻中性白血球增多症。 僅該些以未斑點純化ISU-12感染的豬隻發展出顯著的 腦炎。在任何以生物上選殖出（斑點-純化）愛荷華菌株 分離株作用的豬隻中並無鼻炎的發生。相反的，當組織過 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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7 R 王、發明説明 . 據液（未斑點-純化分離株）使用作為接種物，鼻炎是十 分嚴重的。 以ISU-12未斑點斑點、ISU-12斑點純化、ISU-22、IS 〇_98 4、1$11-3927以及未感染的？$?-36細胞所感染的00〇0 猪隻之病原性以及組織學上結果是摘錄於下表6 — 1 2。 在該些表中，整體肺部損害分數代表肺結實化的的膾分率 (也就是具有肺炎疾病的肺部組織百分率，顯示出損害性 )。分數是基於0至100%的肺結實化的程度。”ND”是指整 體肺部的損害的分數是未定出的。 表6 分離株 平均_分藪 3 DPI 平均分數 Ί DPI 平均_分數 10 DPI 平均分數 21 DPI 平均分數 28 DPI _均分數 36 DPI 未斑點純化之 ISU-12 29 56.3 77.3 37.25 6.0 ND ISU-12 20.5 35.5 77.5 25.0 0.0 0 ISU-22 26.5 35.0 64.75 36.5 11.0 0 ISU-984 7.25 21.7 5 7 6.0 21.0 0.5 0 ISU-3927 13.5 20.0 10.5 0 0.0 0 PSP-36 0 0 0 0 0 0 未接種 0 〇 0 0 0 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在上表6中，” u n p 1 ”是指未斑點純化者’ ” u n i 〇 c · ”是 -77 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7 五，、發明説明（乂τΤ 指未接種。 在上表6的結果中顯示ISU-12以及ISU-22産生的損害 是比其它分離株持續更長。由1su_12以及1sl]-22以及1SU_ 984産生的損害性具有相似的損害性°由IS U-392 7産生的 損害是不太嚴重’且是比其它分離株所産生的損害更早可 解決。所有整體的損害是可在36 DOPI時解決。 該病原性的結果是呈現於下表7 -12 (其基於在上表 1所提出的嚴重程度為基礎）。在下表7 -12，”Int. thi c k ”意指組織間質變厚，” a 1 v · e x u d . ”意指肺胞滲出液， 且” e n c e p h a 1 ”意指腦炎° (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在3 的徼觀損害 損害 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU- 934 ISU -3927 PSP-36 控制組 型I · + + + + + - + 一 合胞證 + + + 丨- 一 組織間質變厚 + + + 一 + - 肺胞滲出疲 + + + - - 心肌炎 - - - - - - 腦炎 - - - - - - -78 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7 五~、發明説明（；；〆） 表 3 在7 DPI的微觀損害 損害 ISU-12 ，斑點纯化 丨 ISU-12 ISU-22 ISU -934 ISU -3927 PSP-35 控制組 型I + + + + + + + + + + + + + + + + - 合胞證 + + + + + + 七1 - - 組織間質變厚 + + + + +十+ + + + + + + - 肺胞滲出液 + + + + + + + + + + + ' 十+ - 心肌炎 - - - - - - 腦炎 - - - - - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表 9 在10 DPI的微觀損害 損害 ISU-12 (斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU- 984 ISU -3927 PSP-36 控制組 型I + + + + + + + + + + + + + + - 合胞體 + + + + + + + + - - 組織間質變厚 + + + + + + + + + + + + + + - 扁胞滲岀詨： + +十 +十+ + + + + + + + - 心肌炎 + 一 一 - - - 腦炎 + - - - - - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 A7 B7 五、發明説明 表 10 在21 DPI的徹觀損害 損害 ISU-12 斑點純化1 ISU-12 ISU-22 ISU-: 934 ISU- 3927: PSP-35 控制組 型E + + + + + + + + + + + + + + - 合胞證 + + + + + + + + - 組織間質變厚 + + + + + + + + + + 十+ + + - 陆胞滲岀痕: + + + + + + + + 丨 + + + - 心肌炎 + + + + + i + + + + + - 腦炎 + + ! 1 - - - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表 11 在DPI的徼觀損害 損 害 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU-丨984 ISU -3927 PSP-36 控制組 型I + + + + + α. + - 合胞體 + + + + + JL - 組識間質變厚 十+ + + + + - 肺胞滲出液 十+ + + + + + + - 心肌炎 + + + + + + + + + + + + + 一 腦炎 + - - - - - -80 - 本纸浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 …. A7 ___ B7 五-、發明説明（^) 表 12 在36 DPI的徼觀損害 損寄 ISU-12 斑點純化 ISU-12 ISU-22 ISU -934 ISU -3927 PSP-36 控制組 型]I HD + /- + /- + /- - 合胞證 HD - - - - - 組織間質變厚 ND + /~ + /_ + - - 肺胞滲出液 HD - + /- - - - 心肌炎 ND + /- 一 - - - 腦炎 : ND - - + /- - - 在7 DPI，由ISU-12、ISU-22以及ISU-984産生的肺部 損害是嚴重的，且彼此相似的。在7DPI時，由ISU-3927産 生的肺部損害僅是輕微或是中等嚴重的 在 10 DPI，由 ISU-12、ISU-22以及 ISU-984産生的肺 部損害相似於7 DP I，更為嚴重。僅有以未斑點純化ISU-12感染的豬隻顯示出輕微的腦炎以及心肌炎。在10 DPI， 由ISU-3927産生的損害是近乎被解決的。 在21 DPI，由末斑點純化的ISD-12産生的心肌炎是嚴 重的，而由ISU-12、ISU-22以及ISU-984産生的心肌炎是 中等的。在21 DPI，僅有由未斑點純化的ISU-12之豬隻具 有中等程度的腦炎。 ^ 在28 DPI，肺部損害在以未斑點純化的ISU-12以及 ISU-22所感染的豬隻中具有中等程度的肺部損害。該些分 -81 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育)
497973 A7 B7 五 腦炎 離株在28 DPI産生嚴重的心肌炎。但是，由ISU-1 2、ISU -984以及ISU-3927所産生的肺部損害是在28 DPI時近乎解 決。 在36 DP I，所有的損害基本上皆被解決，每組僅有一 隻豬隻在36 DPI撿驗。
實驗VI 在活體中進行交叉中和研究，CDCD豬隻首先在内鼻腔 内以選自ISU-12、ISU-984以及ISU-3927之菌株接種，然 後四週後，該豬隻再以ISU-12加以作用。在以ISU-12作用 後，於8 DP I時檢查其肺部損害以及其它疾病病症。控制 組僅以ISU-12作用，其結果呈現於下表13。 下表13所呈現的病原性結果是基於相同於表1所呈現 的嚴重程度。在下表13中，，”Int. thick”意指組織間質 變厚，” alv. exud.”意指肺胞滲出液，且” encephal”意指 表 13 在活體中交叉相和反應 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 損害 : 1_12 而 後 I-12 控制組1 而後I-121 I - 22 而 後 I-12 I-984而 後 I-12 3927 而 後 1-12 型E + + + + + + + + + + 合胞體 - + + + + + + 組織間質變厚 + /- + “ + + + + 肺胞滲出液 1 + + + + + + + + + + 心肌炎 + - + + + + + /- + 腦炎 ： + + - 1 - - - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -- 82 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 497973 -· A7 _ B7 五，發明説明（<?D) … 在上表13中的資料中顯示ISU-12提供保護以對抗由 ISU-12所引起的豬隻疾病病症。ISU-984提供保護，以對 抗由ISU-12引起的PRRS—些病症以及臨床上的徵兆，ISU-12是已知的PRRSV病毒中最具病毒性的菌株之一。 但是，ISU-3927，是PRRS病毒愛荷華_株輕徼病原性 的變種，其可提供該等分離株的最大的保護，該分離株可 研讀作為對抗其後以ISU-12作用疫苗。因此，ISU-3927 使用作為活疫苗的商業上使用的潛力。
實驗VB 10 CDCD豬隻的一組以列於下表14的PRRSV愛荷華菌株 的分離株加以接種，或以未感染的PSP-36細胞作為控制組 ，該豬隻五週大時，以列於下表14的每一種病毒分離株 10 5 TC IDs α自鼻腔内接種，該豬隻在10 DPI時解剖。 在10 DPI時的平均整體肺部損害分數是提供於下表13 作為該分離株的病原性的指標。該標準偏差（SD)是提供作 為該平均整體肺部損害分數在統計意義上的指標。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
耒Ϊ4 接-種 Ν 在10 DPI平均整 體肺部損害分數 SD PSP-36 10 0.0 0.0 ISU-28 10 62.4 20.9 ISU-12 10 54.3 '9.8 ISU-79 10 51.9 13.5 ISU-1894 10 27.4 11.7 ISU-55 10 20.8 15.1 ISU-51 10 16.7 9.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）-83- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 * B7 五_、發明説明（<ργ) 下蒂15提供整Μ肺部損害分數统計上的比較。 表15 整證肺部損害分數的比較 比 較 -t的值丨t P > 1七1 控制組與 12 9.43 p < .001 控制組舆 28 10.83 p < .001 控韌組與 51 2.89 p < . 01 控制組與 55 3 . 61 p < .001 控制組與1894 ’ 4 · 7 6 p < .001 控制組與 79 9.00 p < .001 12 舆 28 1.41 ρ < ·2 12 m 51 6.54 ρ < .001 12 舆 55 5.82 ρ < .001 12 79 0.43 ρ > . 5 12 ,舆 1894 4.76 ρ < .001 28 ^ 51 7,94 ρ < .001 28 與 55 7.22 ρ < ·001 28 舆 79 1.83 Ρ. < ·1 28 與 1894 6.06 ρ < .001 51 與 55 0.72 ρ < . 5 51 與 79、 6.11 ρ < .001 51 · 與 1894 1.8 7 . ρ < ·1 55 與 79 5.39 ρ < .001 55 與 1894 1.15 ρ < ·3 79 與 1894 4.24 ρ < .001 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-84 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五-、發明説明Gf» 、 此外’每組的豬隻作呼吸窘迫的撿驗，該呼吸窘迫的 檢驗為依如上所述的據臨床上呼吸分级条統（見於下表i 6 臨床上分數平均值）。整體分數是指如上所述的整體肺部 損害的分數。”Enceph· ”，”myocard· ”及”rhinit is”是指在 每組分別顯示出腦炎、心肌炎以及鼻炎的豬隻數目。”徼 數目（Micro sc〇re) ”是指基於下列程度而評定的分數，其 使用於評估且比較在肺組織中組織間質肺炎的微觀損害： 〇 =無疾病；肺部組織正常 1 =輕微多個病巢性的微觀損害 2 =輕微擴散性的微觀損害 3 =中等多個病巢性的微觀損害 4 =中等擴散性的微觀損害 5 =嚴重多個病巢性的微觀損害 6 =嚴重擴散性的微觀損害 微觀的損害是可在不顯示出整體損害的組織中觀察到 ，因此，該”微數目”提供一額外的平均值，號以評估且比 較該些分離株的病原性，此外，亦可評估且比較整體肺部 的損周、呼吸窘迫、發熱等。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（HO、〆297公* ) - 85 - 497973 A7 B7 五-發明説明（<?今） 91 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 β炎 in — rH CN «Η in v〇 in CN u〇 in rH 1—* a 心肌炎 LD rH CN rH cs in rH v〇 11/15 in i rn 10/15 鉍‘ m in rH fH CN rH CN in CO · u-j 卜 in κΩ m r-H 10/15 28 DPI微 觀分數平 均值 CN o 〇 o i-H rr CN o n o rn ON •H 28 DPI整 體分數平 均值 Ιι__ o o o r-i f—* o o o CN n VO m CO 掛. o in cs in CN m CN CN n O CO 10 DPI整 體分數平 均值 〇 々 fH o CN r-4 〇 CN CTn rH un m tn o ίο d?m 床上分i 的平均值 o CN 〇 in rH rH i—1 CN CN y * rH rn SDPI皡库 上分滅尚 平均值 〇 o r-H »-H un CN m tn r-i O 分離株 UD m 息 Cu 00 & rH 1 D c/l M LH L〇 1 D cn f-H ISU-1894 σ\ r- 1 D H-l CN rH 1 o C/i ISU-20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-86 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 • …· A7 __B7 一 五-、發明説明（<5% …
實驗VI .由每一 ISU-12、ISU-22、ISU-55、ISU-79、ISU-1894 以及ISU-3927所感染之PSP-36細胞中分離出mRNA，且在 1 · 5%的瓊脂上作分離，去達成較佳次基因組的分離。可觀 察到二組的移動型式。 組 I 包含 ISU-12、ISU-1894、ISU-3927以及可能的 ISU-51。ISU-12的北方點墨結果顯示於第32圖，ISU-1894 、ISU-3927以及ISU-51的北方點墨結果顯示於第33圖，類 似於萊西斯倍德病毒七個次基因組的mRNA (在第32及33圖 中標記1至7)為該分離株的每一値，該次基因組mRNA的大 小（sgRNA)是相似於萊西斯倍德病毒者。 組I包含分離株ISU-22、ISU-55及ISU-79，其具有 九個SgRNA而非七個，組I SgRNA 1、2、3、6及7是相同於 組I ，但二値額外的SgRN8AS是在組I SgRNA 3及6間的， 在第33圔以箭頭加以顯不。 初始的結果顯示組I的病毒比4組I的分離株複製的 更佳，但可能在PSP-36細胞的ISU-12為例外。然而，在一 些例子中，若與組I[的分離株相比，ISU-12的複製是非常 差的。
實驗IX 在三週大的PRSSV血清陰性反應的SPF豬隻中進行豬隻 生殖性以及呼吸性病症病毒（PRRSV)修飾過的活疫苗較力 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公齋） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五？發明説明（<?ry 的研究。該疫苗由每2ml中為105. 8了(：1〇5(1斑點純化？1^3\/ ISH2 (愛荷華菌株）的劑量所組成。九隻豬隻藉由鼻腔 内路彳莖（IN)施予單一的疫苗劑量，且九隻作不接種疫苗的 之作用以作為控制組（NV/CHALL)。接種疫苗組以及控制組 $胃_後35天作效用對有效性作測試，而後在有效性測試 後10天計算出整體肺部損害的分數（肺部受感染的百分率 )。 每一組豬隻的平均肺部整體損害的分數是藉由在第34 圖中的[每一長條之數目加以顯示出。疫苗的效力評估是藉 由在肺部損害分數的降低加以評估。受接種的二組顯著的 比無接種的控制組更低（P<〇. 01)整體肺部損害分數。在接 種的二組中分數上並無顯著的不同，ISU-12 PRRSV疫苗被 證實在三週大的豬隻中以10「8TC IDs σ劑量是具有效用的 其它的觀察 ISU-12病毒為具被膜的，且是對氯仿處理敏感，ISU-12的複製對5-溴去氯尿苷處理是具有抗性，因此，ISU-12 並非一 DNA病毒。ISU-12缺少紅血球凝集活性。 顯然的，因上述的教示使得本發明可能有許多修飾與 變化，其是可被了解的，且在所附的申請專利範圍中，除 非在此有待別的敘述，一般本發明是可實施的。 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） m m ml ts nm —i^i am— ms===1A ml m -HI In mmmamm§m n In - : - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >
497973 A7 B7 五、發明説明（p¥) 序列差 (1) 一般資料： (i )申請人：普倫S .保羅 派屈克G .哈伯 孟祥進 楊格S ·來歐 梅麗莎A.蘭姆 (ii )發明名稱： 引起對抗導致豬呼吸性及生殖性疾病病毒之免疫 反應的疫苗，保護豬免受由呼吸性及生殖性病毒 所引起的疾病之方法，引起對抗導致豬呼吸性及 生殖性疾病的病毒之免疫反應的疫苗之製法，以 及培養病毒的方法 . (註：本案之發明名稱與本案之美國相關申請案的 發明名稱不盡相同，因此，上述發明名稱傺 以本案所具者為準） (ώ )序列數目：3 1 (iv )聯絡住址： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) U)聯絡人：oblon，spivAK，McClelland,
MAIER & NEUSTADT (B) 街名：S.傑弗遜戴維斯高路1755號400室 (C) 市名：阿靈頓市 (D) 州名：維吉尼亞 (E )國家名：美國 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐？ 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 A7 B7 五、-發明説明（P；7) (F)郵遞區號：22202 (v )電腦可讀取的型式： (A) 媒體型式：軟碟 (B) 電腦：IBM PC可相容的
(C) 操作条統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release tfl.O，販本tfl.25 (vi )現今的申請資料： (A) 申請案號：USSN 08/ 1 3 1 , 625 (B) 申請日：1993年10月5曰 (C) 分類： (νϋ )先前申請資料·· (Α)申請案號：USSN 07/969, 071 (Β)申請日：1992年10月30日 Ui )專利代理人資料： (A) 姓名：拉維雷依，珍-保羅M.P. (B) 註冊號碼：31，451 (C) 參考 / 檔案編號：4625-016-55X CIP (ix )電傳資料： (A) 電話：（703) 413-3000 (B) 傳真：（703) 413-2220 (C) 電報：248855 OPAT UR (2)序列辨識編號1之資料·· (i )序列的特徵： (A)長度：22値氮鹼對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973 A7 B7 五、發明説明（W) … (Β)種類··核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 0株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號1 CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT (2)序列辨識編號2之資料： (ί )序列的特徵： (Α)長度：22個氮鹼對 (Β)種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· c D N A (vi )原始來源： (A) 器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號2 CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG (2)序列辨識編號3之資料·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 一ff广 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ+ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ff) … (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii)分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官♦•豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 鐘株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 · (X i)序列的‘描述：序列辨識編號3 GCCGCGGAAC CATCAAGCAC (2)序列辨識編號4之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i )序列的描述：序列辨識編號4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 一f么一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ 、言 497973 A7 B7 五、發明説明（％?) CAACTTGACG CTATGTGAGC (2)序列辨識編號5之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·♦ cDNA (νί )原始來源： (Α)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (Β)菌株：愛荷華 (C)各別的分離株：ISU_12 (X i)序列的描述··序列辨識編號5 GCGGTCTGGA TTGACGACAG (2)序列辨識編號6之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類··核苷酸 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五'發明説明（夕/) (C)各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號6 GACTGCTAGG GCTTCTGCAC (2)序列辨識編號7之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (U )分子型式：cDNA (νί )原始來源： (Α)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (8)_株：愛荷華 (C)各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號7 GCCATTCAGC TCACATAGCG (2)序列辨識編號8之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：2062個氮鹼對 (B) 種類··核苷酸 (C) 股型：雙股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：c D N A (vi )原始來源： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一？莩一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 497973 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五'發明説明（fa) (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )特徵： (A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：2· · 412 (X i)序列的描述：序列辨識編號8 46 94 142 190 | 238 I 1 } 286 j I 334 j 382 ! ΐ i I ί 432 ί 492 552 612 672 732 792
G GCA GGC TTT GCT GTC CTC CAA GAC ATC AGT TGC CTT AGG CAT CGC Ala Gly Phe Ala Val Leu Gin Asp lie Ser Cys Leu Arg His Arg 15 10 15 AAC TCG GCC TCT GAG GCG ATT CGC AAA GTC CCT CAG TGC CGC ACG GCG Asn Ser Ala Ser Glu Ala lie Arg Lys Val Pro Gin Cys Arg Thr Ala 20 25 30 ATA GGG ACA CCC GTG TAT ATC ACT GTC ACA GCC AAT GTT ACC GAT GAG He Gly Thr Pro Val Tyr He Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 AAT TAT TTG CAT TCC TCT GAT CTT CTC ATG CTT TCT TCT TGC CTT TTC Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 TAT GCT TCT GAG ATG AGT GAA AAG GGA TTT AAG GTG GTA TTT GGC AAT Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 70 75 GTG TCA GGC ATC GTG GCA GTG TGC GTC AAC TTC ACC AGT TAC GTC CAA Val Ser Gly lie Val Ala Val Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gin 80 85 90 95 CAT GTC AAG GAA TTT ACC CAA CGT TCC TTG GTA GTT GAC CAT GTG CGG His Val Lys Glu Phe Thr Gin Arg Ser Leu Val Val Asp His Val Arg 100 105 110 CTG CTC CAT TTC ATG ACG CCC GAG ACC ATG AGG TGG GCA ACT GTT TTA Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu 115 120 125 GCC TGT CTT TTT GGC ATT CTG TTG GCA ATT TGAATGTTTA AGTATGTTGG Ala Cys Leu Phe Gly lie Leu Leu Ala lie 130 135 -GGAAATGCTT GACCGCGGGC TGTTGCTCGC AATTGCTTTT TTTGTGGTGT ATCGTGCCGT CTTGTTTTGT TGCGCTCGTC AGCGCCAACG GGAACAGCGG CTCAAATTTA CAGCTGATTT
ACAACTTGAC GCTATGTGAG CTGAATGGCA CAGATTGGCT AGCTAATAAA TTTGACTGGG CAGTGGAGTG TTTTGTCATT TTTCCTGTGT TGACTCACAT TGTCTCTTAT GGTGCCCTCA CTACTAGCCA TTTCCTTGAC ACAGTCGGTC TGGTCACTGT GTCTACCGCT GGGTTTGTTC ACGGGCGGTA TGTTCTGAGT AGCATGTACG CGGTCTGTGC CCTGGCTGCG TTGATTTGCT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） .一一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) β. 、?Τ 497973 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（？3) TCGTCATTAG GCTTGCGAAG AATTGCATGT CCTGGCGCTA CTCATGTACC AGATATACCA 852 ACTTTCTTCT GGACACTAAG GGCAGACTCT ATCGTTGGCG GTCGCCTGTC ATCATAGAGA 912 AAAGGGGCAA AGTTGAGGTC GAAGGTCACC TGATCGACCT CAAAAGAGTT GTGCTTGATG 972 GTTCCGCGGC TACCCCTGTA ACCAGAGTTT CAGCGGAACA ATGGAGTCGT CCTTAGATGA 1032 CTTCTGTCAT GATAGCACGG CTCCACAAAA GGTGCTCTTG GCGTTTTCTA TTACCTACAC 1092 GCCAGTGATG ATATATGCCC TAAAGGTGAG TCGCGGCCGA CTGCTAGGGC TTCTGCACCT 1152 TTTGGTCTTC CTGAATTGTG CTTTCACCTT CGGGTACATG ACATTCGTGC ACTTTCAGAG 1212 TACAAATAAG GTCGCGCTCA CTATGGGAGC AGTAGTTGCA CTCCTTTGGG GGGTGTACTC 1272 AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCTC CAGATGCCGT TTGTGCTTGC TAGGCCGCAA 1332 GTACATTCTG GCCCCTGCCC ACCACGTTGA AAGTGCCGCA GGCTTTCATC CGATTGCGGC 1392 AAATGATAAC CACGCATTTG TCGTCCGGCG TCCCGGCTCC ACTACGGTCA ACGGCACATT 1452 GGTGCCCGGG TTAAAAAGCC TCGTGTTGGG TGGCAGAAAA GCTGTTAAAC AGGGAGTGGT 1512 AAACCTTGTT AAATATGCCA AATAACACCG GCAAGCAGCA GAAGAGAAAG AAGGGGGATG 1572 GCCAGCCAGT CAATCAGCTG TGCCAGATGC TGGGTAAGAT CATCGCTCAC CAAAACCAGT 1632 CCAGAGGCAA GGGACCGGGA AAGAAAAATA AGAAGAAAAA CCCGGAGAAG CCCCATTTCC 1692 CTCTAGCGAC TGAAGATGAT GTCAGACATC ACTTTACCCC TAGTGAGCGT CAATTGTGTC 1752 TGTCGTCAAT CCAGACCGCC TTTAATCAAG GCGCTGGGAC TTGCACCCTG TCAGATTCAG 1812 GGAGGATAAG TTACACTGTG GAGTTTAGTT TGCCTACGCA TCATACTGTG CGCCTGATCC 1872 GCGTCACAGC ATCACCCTCA GCATGATGGG CTGGCATTCT TGAGGCATCC CAGTGTTTGA 1932 ATTGGAAGAA TGCGTGGTGA ATGGCACTGA TTGACATTGT GCCTCTAAGT CACCTATTCA 1992 ATTAGGGCGA CCGTGTGGGG GTAAGATTTA ATTGGCGAGA ACCACACGGC CGAAATTAAA 2052 AAAAAAAAAA. 2062 (2)序列辨識編號9之資料： (i )序列的特徵·· (A) 長度：137個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編號9 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（务Ο
Ala Gly Phe Ala Val Leu Gin Asp 工le Ser Cys Leu Arg His Arg Asn 1 5 10 15
Ser Ala Ser Glu Ala lie Arg Lys Val Pro Gin Cys Arg Thr Ala lie 20 25 30
Gly Thr Pro Val Tyr 工le Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn 35 40 45
Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe Tyr 50 55 60
Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val 65 70 75 ^ 80
Ser Gly lie Val Ala Val Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gin His 85 90 95
Val Lys Glu Phe Thr Gin Arg. Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu 100 105 110
Leu His Phe Met Thr Pro Glu Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala 115 120 125
Cys Leu Phe Gly 工le Leu Leu Ala lie 130 135 —— (2)序列辨識編號10之資料： (i )序列的特徵： U)長度：603個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B )菌株：愛荷華 (C)各別的分離株：ISU-12 . (be)特徵：
(A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：1 · · 600 (X i)序列的描述：序列辨識編號1〇 ATG TTG GGG AAA TGC TTG ACC GCG GGC TGT TGC TCG CAA TTG CTT TTT 48
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr· Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15 本纸張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一一 β m_l K si ttmMmf ϋϋ· infl I 1—^ϋϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 '發明説明（f厂) TTG TGG TGT ATC GTG CCG TCT TGT TTT GTT GCG CTC GTC AGC GCC AAC 36
Leu Trp Cys 工le Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn 20 25 30 GGG AAC AGC GGC TCA AAT TTA CAG CTG ATT TAC AAC TTG ACG CTA TGT 144
Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 GAG CTG AAT GGC ACA GAT TGG CTA GCT AAT AAA TTT GAC TGG GCA GTG 192 ‘
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Txp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 GAG TGT TTT GTC ATT TTT CCT GTG TTG ACT CAC ATT GTC TCT TAT GGT 240
Glu Cys Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 GCC CTC ACT ACT AGC CAT TTC CTT GAC ACA GTC GGT CTG GTC ACT GTG 288
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 TCT ACC GCT GGG TTT GTT CAC GGG CGG TAT GTT CTG AGT AGC ATG TAC 336
Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 GCG GTC TGT GCC CTG GCT GCG TTG ATT TGC TTC GTC ATT AGG CTT GCG 384
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val 工le Arg Leu Ala |
115 120 125 I AAG AAT TGC ATG TCC TGG CGC TAC TCA TGT ACC AGA TAT ACC AAC TTT 432
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 CTT CTG GAC ACT AAG GGC AGA CTC TAT CGT TGG CGG TCG CCT GTC ATC 480
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160 ATA GAG AAA AGG GGC AAA GTT GAG GTC GAA GGT CAC CTG ATC GAC CTC 528
He Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu He Asp Leu 165 170 175 AAA AGA GTT GTG CTT GAT GGT TCC GCG GCT ACC CCT GTA ACC AGA GTT 576
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 190 TCA GCG GAA CAA TGG AGT CGT CCT TAG 603
Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (2)序列辨識編號11之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：200個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii)分子型式：蛋白質 (X i)序列的描述：序列辨識編號11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) M. 497973 A7B7 五、發明説明n … Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gin Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys 工le Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn 20 25 30 Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Cys Phe Val He Phe Pro Val Leu Thr His He Val Ser Tyr Gly 65 · 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 i6〇 lie Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Asp Leu .165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val 180 185 i9〇 Ser Ala Glu Gin Trp Ser Arg Pro 195 200 (2)序列辨識編號12之資料·· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T )序列的特徵 (A) 長度：606個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (D)型態：不詳 (ii )分子型式·· cDNA (vi )原始來源 (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) Μ株：萊西斯倍德 (X [)序列的描述：序列辨識編號1 2 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 497973 —— A 7 _B7_;_ 五、發明説明（0；) … ATGAGATGTT CTCACAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC ACTCTTGCTT CTGGTGGCTT 60 TTTTTGCTGT GTACCGGCTT GTCCTGGTCC TTTGCCGATG GCAACGGCGA CAGCTCGACA 120 TACCAATACA TATATAACTT GACGATATGC GAGCTGAATG GGACCGACTG GTTGTCGAGC 180 CATTTTGGTT GGGCAGTCGA GACCTTTGTG CTTTACCCGG TTGCCACTCA TATCCTCTCA 240 CTGGGTTTTC TCACAACAAG CCATTTTTTT GACGCGCTCG GTCTCGGCGC TGTATCCACT 300 GCAGGATTTG TTGGCGGGCG GTACGTACTC TGCAGCGTCT ACGGCGCTTG TGCTTTCGCA 360 GCGTTCGTAT GTTTTGTCAT CCGTGCTGCT AAAAATTGCA TGGCCTGCCG CTATGCCCGT 420 ACCCGGTTTA CCAACTTCAT TGTGGACGAC CGGGGGAGAG TTCATCGATG GAAGTCTCCA 480 ATAGTGGTAG AAAAATTGGG CAAAGCCGAA GTCGATGGCA ACCTCGTCAC CATCAAACAT 540 GTCGTCCTCG AAGGGGTTAA AGCTCAACCC TTGACGAGGA CTTCGGCTGA GCAATGGGAG 600 GCCTAG 606 (2)序列辨識編號13之資料： (ί )序列的特徵： (Α)長度：526個氪鹼對 (Β)種類··核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： U)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 議株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )持徵：
- U)名稱/索引：CDS (B)位置：2. ·523 (X i)序列的描述：序列辨識編號13 A ATG GAG TCG TCC TTA GAT GAC TTC TGT CAT GAT AGC ACG GCT CCA 4
Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro 15 l〇 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X挪公釐） 一 f DO — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
497973 A7 B7 五、發明説明（你) CAA AAG GTG CTC TTG GCG TTT TCT ATT ACC TAC ACG CCA GTG ATG ATA 94 Gin Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser lie Thr Tyr Thr Pro Val Met lie 20 25 30 TAT GCC CTA AAG GTG AGT CGC GGC CGA CTG CTA GGG CTT CTG CAC CTT 142 Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 35 40 45 TTG GTC TTC CTG AAT TGT GCT TTC ACC TTC GGG TAC ATG ACA TTC GTG 190 Leu Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val 50 55 6Q CAC TTT CAG AGT ACA AAT AAG GTC GCG CTC ACT ATG GGA GCA GTA GTT 238 His Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val 65 70 75 GCA CTC CTT TGG GGG GTG TAC TCA GCC ATA GAA ACC TGG AAA TTC ATC 286 Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie 80 85 90 95 ACC TCC AGA TGC CGT TTG TGC TTG CTA GGC CGC AAG TAG ATT CTG GCC 334 Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr lie Leu Ala 100 105 110 CCT GCC CAC CAC GTT GAA AGT GCC GCA GGC TTT CAT CCG ATT GCG GCA 382 Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro lie Ala Ala 115 120 125 AAT GAT AAC CAC GCA TTT GTC GTC CGG CGT CCC GGC TCC ACT ACG GTC 430 Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val 130 135 140 AAC GGC ACA TTG GTG CCC GGG TTA AAA AGC CTC GTG TTG GGT GGC AGA 478 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg 145 150 155 AAA GCT GTT AAA CAG GGA GTG GTA AAC CTT GTT AAA TAT GCC AAA TAA 526 Lys Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 160 165 170 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • Lr.
訂 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 (2)序列辨識編號14之資料： (i )序列的特徵： (A)長度：174個胺基酸 * (B)種類：胺基酸 (D)型態··直線形 (ϋ )分子型式：蛋白質 (xi)序列的描述：序列辨識編號14 Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gin 15 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser lie Thr Tyr Thr Pro Val Met lie Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met .Thr Phe Val His 50 55 60
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 叫Ο (― 497973 A7 B7 五，發明説明（ff)
Phe Gin Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala lie Glu Thr Trp Lys Phe lie Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr lie Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro He Ala Ala Asn 115 , 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160
Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 (2)序列辨識編號15之資料： (i )序列的特徵： U)長度：522個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型 (D) 型態 (ii )分子型式 (vi )原始來源 (A) 器官 (B) 菌株 不詳 不詳 ：cDNA 豬生殖性與呼吸性症候群病毒 愛荷華 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製
(C)各別的分離株：ISU-12 Ui)序列的描述：序列辨識編號15 ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC TTTAGCATCA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG AACTGTTCCT TTACATTCGG ATACATGACA TATGTGCATT TTCAATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAA.CCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACTAACA TCAGTGAACG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCAAG TATGGCCGGT AA 60 120 180 240 300 360 420 480 522
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 497973
經濟部中央標準局員工消費合作社印I A7 B7 五 '發明説明（/⑽） (2)序列辨識編號16之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：372値氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 U )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (ix )特徵： U)名稱/索引：CDS. (B)位置：1 · . 369 (X i)序列的描述：序列鑑識編號16 ATG CCA AAT AAC ACC GGC AA.G CAG CAG AAG AGA AAG AAG GGG GAT GGC 48
Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG ATG CTG GGT AAG ATC ATC GCT CAC 96
Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys lie 工le Ala His 20 25 30 CAA AAC CAG TCC AGA GGC AAG GGA CCG GGA AAG AAA AAT AAG AAG AAA 144
Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTC CCT CTA GCG ACT GAA GAT GAT GTC AGA 192
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 CAT CAC TTT ACC CCT AGT GAG CGT CAA TTG TGT CTG'TCG TCA ATC CAG 240
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin 65 70 75 80 ACC GCC TTT AAT CAA GGC GCT GGG ACT TGC ACC CTG TCA GAT TCA GGG 288
Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCT ACG CAT CAT ACT GTG 336
Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA CCC TCA GCA TGA 372
Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -i. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 . A7 ___ _B7 五、發明説明（Λ/) … (2)序列辨識編號17之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：123値胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (D)型態：直線形 (ii )分子型式··蛋白質 (xi)序列的描述：序列辨識編號17
Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gin Gin Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 15 10 . 15
Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Met Leu Gly Lys lie lie Ala His 20 25 30 i
Gin Asn Gin Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys | 35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 1 50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gin Leu Cys Leu Ser Ser lie Gin 65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly ； 85 90 95
Arg lie Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val j 100 105 110 I
Arg Leu lie Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 (2)序列辨識編號18之資料： (i )序列的特徽： (A) 長度：387個氮鹼對 (B) 種類··核苷酸 (C) 股型：不詳 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源·· (A)器官··豬生殖性與呼吸性症候群病毒 本紙張尺度適用中國國( CNS ) A4規格7 210'/297公釐1 一/Ο仏一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五、發明説明（/Oq (&)_株：萊西斯倍德 (X i)序列的描述：序列辨識編號18 ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGAAA AAGAAAAGTA CAGCTCCGAT GGGGAA.TGGC 60 CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC CCTGGCTGCT 180 GAAGATGACA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTT GCAATCGATC 240 CAGACGGCTT TCAATCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGCTTT CATCCAGCGG GAAGGTCAGT 300 TTTCAGGTTG AGTTTATGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG CGTGACTTCT 3G0 ACATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA 387 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (2)序列辨識編號19之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：16 4個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號19 TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AGAATGCGTG GTGAATGGCA 60 CTGATTGACA TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA 120 TTTAATTGGC GAGAACCACA CGGCCGAAAT ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑ 1β4 (2)序列辨識編號20之資料： (i )序列的特徵： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)、 M.
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)Α4規格（210x297公釐） 一 一 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（A9) (A)長度：127個氮鹼對 (B )種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：不詳 (ii )分子型式：cDNA (vi )原始來源： (A) 器官：豬隻生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：萊西斯倍德 (X i)序列的描述：序列辨識編號20 TTTGACAGTC AGGTGAATGG CCGCGATTGG CGTGTGGCCT CTGAGTCACC TATTCAATTA 60 GGGCGATCAC ATGGGGGTCA TACTTAATCA GGCAGGAACC ATGTGACCGA AATTAAAAAA 120 AAAAAAA 127 (2)序列辨識編號21之資料： (1 )序列的特徵： U)長度：19個氮鹼對 (B )種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源：
(A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B )菌株：萊西斯倍德 (X i )序列的描述：序列辨識編號2 1 CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/0必 (2)序列辨識編號22之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：1 9値氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (U )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：D N A (合成的） (VI )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號22 GCCATTCGCC TGACTGTCA (2)序列辨識編號23之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：19個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源：
(A)器官；豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號23 TTGACGAGGA CTTCGGCTG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 497973
經濟部中央標準局員工消費合作社印I A7 B7 五'發明説明（/么々 (2)序列辨識編號24之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號24 . GCTCTACCTG CAATTCTGTG (2)序列辨識編號25之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：20個氮鹼對 (B) 種類：核苦酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式··其它的核苷酸； (A)說明：DHA (合成的） . (vi )原始來源： -
(A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (X i)序列的描述：序列辨識編號25 GTGTATAGGA CCGGCAACAG
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2l〇x297公釐]~~ -f〇S (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（/¥) … (2)序列辨識編號26之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度·· 2 6個氮驗對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)說明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號26 GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC (2)序列辨識編號27之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：28個氮_對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一/ 〇γ — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
I 497973 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五 '發明説明（/… (B) _株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號27 GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG (2)序列辨識編號28之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：21個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (u )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號28 GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G (2)序列辨識編號29之資料： (i )序列的特徵： (A)長度：25個氮鹼對 (B )種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 f广Ο — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -口 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 497973 …. A7 B7 五、發明説明（/W) … (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成的） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號29 CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG (2)序列辨識編號30之資料： (i )序列的特徵： (A) 長度：22個氮鹼對 (B) 種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DHA (合成） (vi )原始來源： (A) 器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B) 菌株：愛荷華 (C) 各別的分離株：ISU-12 (X ί)序列的描述：序列辨識編號30 GGGGATCCTT GTTAAATATG CC (2)序列辨識編號31之資料： (i )序列的特徵： 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一，//一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
497973 A7 B7 五、發明説明（/cf) (A)長度：19個氮鹼對 (B )種類：核苷酸 (C) 股型：單股 (D) 型態：直線形 (ii )分子型式：其它的核苷酸； (A)説明：DNA (合成） (vi )原始來源：
(A)器官：豬生殖性與呼吸性症候群病毒 (B ) _株：愛荷華 (C)各別的分離株：ISU-12 (X i)序列的描述：序列辨識編號31 CTTACGCACC ACTTAAGGG (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 〆//> 一

Claims (1)

  1. 497973 1 ·.，’ ，一 1 A8 -^ ' 1 ______ _ .六、申請專4 第86101249號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：91年06月 1· 一種用於防止豬隻感染病毒疾病之藥學組成物，其包 含一有效量配於一生理上可接受的載劑内且會在豬隻 暴露於一會造成豬生殖性與呼吸性症候群（PRRS)之病 毒時會提引出一保護性反應的疫苗， 其中該疫苗係由一種自然發生之經分離並去活化的豬 生殖性與呼吸性症候群病毒所製成，將該病毒以105 TCID50接種於未給予初乳且是剖腹產所獲得之豬隻， 在感染後10天會造成肺部組織至少51.9%之損害，其 中該病毒是PRRS病毒之愛荷華（l〇wa)菌株，相較於其 它豬病毒，其在受該病毒感染之豬隻中產生下列病狀和 臨床徵兆：形成嚴重第II型肺炎細胞、心肌炎、形成肺 泡滲出液以及形成融合細胞體、輕度組織間變厚和腦炎 以及無氣道壞死。 2·如申請專利範圍第1項之組成物，其中，相對於萊西 斯倍德（Lelystad)病毒開放閱讀架構5(序列辨識編號 12)、6(序列辨識編號15)或7(序列辨識編號18)任一 者中，該病毒在具有低於90%之聚核苷酸相同性； 序列辨識編號12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公楚） 497973 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 ATGAGATGTT CTCACAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC ACTCTTGCTT CTGGTGGCTT 60 TTTTTGCTGT GTACCGGCTT GTCCTGGTCC TTTGCCGATG GCAACGGCGA CAGCTCGACA 120 TACCAATACA TATATAACTT GACX3ATATGC GAGCTGAATG GGACCGACTG GTTGTCCAGC 130 CATTTTGGTr GGGCAGTCGA GACCTTTGTG CTTTACCCGG TTGCCACTCA TATCCTCTCA 240 CTGGGTTTTC TCACAACAAG CCATTTTTTT GACGCGCTCG GTCTCGGCGC TGTATCCACT 300 GCAGGATTTG TTGGCGGGCG GTACGTACTC TGCAGCGTCT ACGGCGCTTG TGCTTTCGCA 3 SO GCGTTCGTAT GTTTTGTCAT CCGTGCTGCT AAAAATTGCA TGGCCTGCCG CTATGCCCGT 420 ACCCGGTTTA CCAACTTCAT TGTGGACGAC CGGGGGAGAG TTCATCGATG GAAGTCTCCA 480 ATAGTGGTAG AAAAATTGGG CAAAGCCGAA. GTCGATGGCA ACCTCGTCAC GVTCAAACAT 540 GTCGTCCTCG AAGGGGTTAA AGCTCAACCC TTGACGAGGA CTTCGGCTGA GCAATGGGAG 600 GCCTAG δ06 序列辨識編號15 .~ — 一 · ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC 60 TrrAGCAITCA catacacacc TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC 120 CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG AACrGTTCCT TTAC^TTCGG ATACATGACA 130 TATGTGCATT TTCAATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT 240 CTGTGGGGTG TTrACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG 300 TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT 350 CTCC^TTCAA TCTCAGCGTC TGGTA^CCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACTAACA. 420 TCAGTGA^CG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT 430 GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCAAG TATGGCCGGT AA S22 序列辨識編號18 ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGAAA AAGAAAAGTA CAGCTCCGAT GGGGAATGGC SO CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC CCTGGCrGCr 180 GAAGATGACA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTr GCAATCGATC 240 CAGACGGCTT TCAATCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGdTT CATCCAGCGG GAAGGTCAGT 300 TTTCAGGTTG AGTTTATGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG CGTGACTTCT 360 ACATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA 387 3. —種用於防止豬隻感染病毒疾病之藥學組成物，其包 本紙張尺度適用中圖國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— 497973 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 含一有效量配於一生理上可接受的載劑内且會在豬隻 暴露於一會造成豬生殖性與呼吸性症候群之病毒時會 提引出一保護性反應的疫苗， 其中該疫苗係由一種經去活化的豬生殖性與呼吸性 症候群病毒所製成，其中該病毒係選自由被寄存於美 國維吉尼亞州馬那沙大學路10801號的美國類型培養 收集中心（ATCC)，寄存編號為VR2385、VR2386、 VR2429、VR2474或VR2549之豬生殖性與呼吸性症 候群病毒的愛荷華菌株所構成之群組，或為展現出在 該群中之一病毒之鑑定特徵的病毒。 4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其中該病毒係選自 由被寄存於美國維吉尼亞州馬那沙大學路10801號美 國類型培養收集中心（ATCC)，寄存編號為VR2385、 VR23 86、VR2429或VR24749之豬生殖性與呼吸性症 候群病毒的愛荷華菌株所構成之群組。 5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該病毒係選自 由被寄存於美國維吉尼亞州馬那沙大學路10801號美 國類型培養收集中心（ATCC)，寄存編號為VR2385或 VR2386之豬生殖性與呼吸性症候群病毒的愛荷華菌株 所構成之群組。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之組成物，其中 該病毒係利用在細胞培養中之連續傳代（serial passage) 方式而被去活化或被減毒。 7. 如申請專利範圍第6項之組成物，其中相對於未經接 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） AS B8 C8 —--—-------^_ 、申請相類 — 種之未給予初乳且是剖腹產所獲得之豬隻，在該未給 予初乳且是剖腹產所獲得之豬隻内的肺部損害係降低 統什上顯著之數量，其中該數量係具低於G.G1之p值 的顯著性。 如申咕專利範圍第6項之組成物，其中，相較於對未 接種該疫苗而以活的PRRS病毒所挑戰之未給予初乳 且是剖腹產所獲得之豬隻，對該等經接種該疫苗而後 再以活的PRRS病毒來挑戰之給予初乳且是剖腹產所 獲彳于之豬隻而言，該被去活化或被減毒之病毒可以降 低此群未給予初乳且是剖腹產所獲得之豬隻之平均臨 床呼吸分數。 9·如申請專利範圍第6項之組成物，其進一步包含有一 佐劑。 10.如申請專利範圍第6項之組成物，其中該豬生殖性與 呼吸性症候群病毒係培養於一選自於下列群中之細胞 内：PSP-36、PSP-36-SAH 與 MA-104。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項之組成物，其中該豬生殖性與 呼吸性症候群病毒在細胞株内至少被生物性地選殊三 次。 12·如申請專利範圍第1至6項中任一項之組成物，其中 該組成物要被口服地或非經腸道地投藥。 13·如申請專利範圍第π項之組成物，其中該組成物要被 肌肉内地、皮膚内地、靜脈内地、腹膜内地、皮下地 或鼻内地投藥。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂· $ 497973 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 14. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之組成物，其中 該組成物要被投藥至一需要對抗由該病毒所引起的感 染之保護的小豬體内。 15. —種用於防止豬隻感染病毒疾病之藥學組成物，其包 含一有效量配於一生理上可接受的載劑内且會在豬隻 暴露於一會造成豬生殖性與呼吸性症候群（PRRS)之病 毒時會提引出一保護性反應的疫苗， 其中該疫苗係從選自下列之病毒所製成：（i)由寄存於 位於美國馬利蘭州洛克菲立帕克隆道12301號的美國類 型培養中心（ATCC)，寄存編號為VR2385、VR2386、 VR2428、VR2429、VR2430 或 VR2431 之豬生殖性與呼 吸性症候群病毒的愛荷華菌株所構成之群組，或（ii)展現 出該寄存的豬生殖性與呼吸性症候群病毒之愛荷華菌 株之鑑定特徵的病毒。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐）
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