DE69334141T2

DE69334141T2 - Schweinevirus, Erreger der sich vermehrenden Erkrankung der Atemwege, Impstoffe und seine virale DNA

Info

Publication number: DE69334141T2
Application number: DE1993634141
Authority: DE
Inventors: Prem S. Ames Paul; Patrick G. Ames Halbur; Xiang-Jin Ames Meng; Melissa A. Mendota Heights Lum; Young S. Ames Lyoo
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC; Iowa State University Research Foundation ISURF
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: US7517976B2; EP0595436A3; BR9304453A; MXPA93006804A; US6110467A; JPH07138186A; US6251404B1; CA2102036A1; CN1096223A; TW517085B; TW497973B; EP0595436A2; CA2102036C; ES2286815T3; CN1087175C; AU672825B2; DE69334141D1; EP0595436B1; DK0595436T3; US20070269445A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein natürlich vorkommendes isoliertes Virus, das das Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) hervorruft; eine Zusammensetzung, die das isolierte Virus umfasst; eine Vakzine, die ein Schwein gegen das Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) schützt, die ein inaktiviertes Virus umfasst; ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine; einen diagnostischen Kit zur Untersuchung eines Virus, das eine Atemwegserkrankung bei Schweinen, eine Reproduktionserkrankung bei Schweinen oder eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft; ein isoliertes Polynukleotid; ein Protein, das durch das Polynukleotid codiert wird; eine isolierte Polynukleinsäure, die im Wesentlichen aus dem isolierten Polynukleotid besteht, und ein Verfahren zur Kultivierung eines Virus.
Diskussion des Hintergrunds
In den vergangenen Jahren waren nordamerikanische und europäische Schweineherden für eine Infektion mit neuen Stämmen von Atemwegs- und Reproduktionsviren anfällig (siehe A.A.S.P., September/Oktober 1991, Seiten 7–11; The Veterinary Record, 1. Februar 1992, Seiten 87–89; Ibid., 30. November 1991, Seiten 495–496; Ibid., 26. Oktober 1991, S. 370; Ibid., 19. Oktober 1991, Seiten 367–368; Ibid., 3. August 1991, Seiten 102–103; Ibid., 6. Juli 1991; Ibid., 22. Juni 1991, S. 578; Ibid., 15. Juni 1991, S. 574; Ibid., 8. Juni 1991, S. 536; Ibid., 1. Juni 1991, S. 511; Ibid., 2. März 1991, S. 213). Zu den ersten der neuen Stämme, die identifiziert werden mussten, gehörte ein Virus, das mit der sogenannten Mystery Swine Disease (MSD) oder dem „Blauohren-Syndrom", jetzt bekannt als Swine Infertility and Respiratory Syndrome (SIRS) oder Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS), verbunden war. In Europa wurde diese Krankheit ebenfalls porcine epidemic abortion and respiratory syndrom (PEARS), blue abortion disease, blue ear disease (U.K.), abortus blau (Niederlande) und seuchenhafter Spätabort der Schweine (Deutschland) genannt, und das entsprechende Virus wurde mit „Lelystad-Virus" bezeichnet. In den USA wurde diese Krankheit ebenfalls Wabash syndrome, mystery pig disease (MPD) und swine plague genannt. Eine Krankheit, welche manchmal mit PRRS verbunden ist, ist die proliferative interstitielle Pneumonie (PIP).
Ausbrüche der „blue ear disease" sind in Schweineherden im Vereinigten Königreich (U.K.), Deutschland, Belgien und den Niederlanden beobachtet worden. Dessen Ausbruch in England hat zu der Absage von Schweineschauen geführt. Die Symptome von PRRS beinhalten eine Abneigung gegen das Fressen (Anorexie), ein schwaches Fieber (Pyrexie), eine Zyanose der Extremitäten (merklich bläuliche Ohren), Totgeburten, Abort, hohe Mortalität bei betroffenen Würfen, kränklich geborene Ferkel und vorzeitiges Ferkeln. Die Mehrzahl der Ferkel, die von betroffenen Sauen lebend geboren werden, stirbt innerhalb von 48 Stunden. Die klinischen Anzeichen von PRRS beinhalten leichte influenzaähnliche Anzeichen, eine schnelle Atmung („Pochen") („thumping") und eine diffuse interstitielle Pneumonitis. Das PRRS-Virus weist eine Inkubationszeit von ca. 2 Wochen ab dem Kontakt mit einem infizierten Tier auf. Das Virus scheint ein umhülltes RNA-Arterivirus zu sein (Ibid., 1. Februar 1992). Das Virus ist erfolgreich in Schweinealveolarmakrophagen und CL2621-Zellen (Benfield et al, J. Vet. Diagn. Invest., 4: 127–133, 1992; Collins et al, Swine Infertility and Respiratory Syndrome/Mystery Swine Disease. Proc., Minnesota Swine Conference for Veterinarians, Seiten 200–205, 1991) und in MARC-145-Zellen (Joo, PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swine Conference, Veterinary Continuing Education and Extension, University of Minnesota (1993), 20: 53–55) kultiviert worden. Eine erfolgreiche Kultivierung eines Virus, welches SIRS hervorruft, ist ebenfalls von Wensvoort et al (Mystery Swine Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelystad Virus. Vet. Quart. 13: 121–130, 1991) berichtet worden.
Das Auftreten von PRRS in den USA hat die Schweinehaltungsindustrie nachteilig beeinflusst. In Kanada wurde PRRS durch Anorexie und Pyrexie bei Sauen, die bis zu 2 Wochen dauerte, spätzeitige Aborte, erhöhte Totgeburtsraten, kränklich geborene Schweine und Todesfälle von Neugeborenen, denen eine schnelle Bauchatmung und Diarrhö vorausgingen, charakterisiert. Arbeiten über die Isolation des PRRS hervorrufenden Virus, über ein Verfahren zum Diagnostizieren einer PRRS-Infektion und über die Entwicklung einer Vakzine gegen das PRRS-Virus sind veröffentlicht worden (siehe kanadische Patentschrift Nr. 2,076,744 ; Internationale PCT-Patentschrift Nr. WO 93/03760 ; Internationale PCT-Patentschrift Nr. WO 93/06211 ; und Internationale PCT-Patentschrift Nr. WO 93/07898 ).
Ein zweiter Virusstamm, der bei der Suche nach dem Erreger von PRRS entdeckt wurde, ruft eine Krankheit hervor, die als Proliferative und Nekrotisierende Pneumonie (PNP) bekannt ist. Die Symptome von PNP und die Ätiologie des Virus, welches diese hervorruft, scheinen zu PRRS und dessen entsprechendem Virus ähnlich zu sein; es gibt aber identifizierbare Unterschiede. Beispielsweise wird von dem Virus, das PNP hervorruft, angenommen, dass dieses ein nicht klassisches oder atypisches Schweineinfluenza A-Virus (aSIV) ist.
Die klinischen Hauptanzeichen von PNP sind Fieber, Atemnot und Bauchatmung. Schweine unterschiedlichen Alters sind betroffen, aber die meisten Anzeichen treten bei Schweinen im Alter zwischen 4 und 16 Wochen auf. Die Lungen der betroffenen Schweine sind diffus gerötet und „fleischig" („meaty") in der Konsistenz (Collins, A.A.S.P., September/Oktober 1991, Seiten 7–11). Im Gegensatz dazu zeigen Schweine, die von PRRS betroffen sind, kein signifikantes Fieber, und Anzeichen bei der Atmung werden hauptsächlich bei neugeborenen Schweinen (weniger als 3 Wochen alt) mit pulmonaren Läsionen beobachtet, die durch eine diffuse interstitielle Pneumonie gekennzeichnet sind.
Das Enzephalomyokarditisvirus (EMCV) ist ein weiteres Virus, welches eine schwere interstitielle Pneumonie, zusammen mit einer schweren interstitiellen, nekrotisierenden und kalzifizierenden Myokarditis, hervorruft. Experimentell erzeugt EMCV bei betroffenen Sauen eine Reproduktionsstörung (Kim et al, J. Vet. Diagn. Invest., 1: 101–104 (1989); Links et al, Aust. Vet. J., 63: 150–152 (1986); Love et al, Aust. Vet. J., 63: 128–129 (1986)).
Vor kurzem ist eine virulentere Form von PRRS mit einer erhöhten Häufigkeit bei 3–8 Wochen alten Schweinen im mittleren Westen der Vereinigten Staaten aufgetreten. Typischerweise werden gesunde 3–5 Wochen alte Schweine entwöhnt und werden 5–7 Tage später krank. Routinemäßige Virusidentifikationsmethoden mit Geweben aus betroffenen Schweinen haben gezeigt, dass Schweineinfluenzavirus (SIV), Pseudorabiesvirus (PRV) und Mycoplasma hyopneumoniae nicht mit dieser neuen Form von PRRS verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft hauptsächlich eine Vakzine, welche Schweine vor dem infektiösen Agens schützt, das diese neue, virulentere Form von PRRS hervorruft, ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine und DNA, welche einen Teil des Genoms des infektiösen Agens, das diese neue Form von PRRS hervorruft, codiert. Jedoch wird angenommen, dass die Informationen, die im Verlauf der Entwicklung der vorliegenden Erfindung gewonnen wurden, nützlich sein werden bei der Entwicklung von Vakzinen und Verfahren zum Schützen von Schweinen gegen jegliche und/oder alle Atemwegs- und Reproduktionserkrankungen von Schweinen. Beispielsweise haben die gegenwärtigen Erfinder die Pathologie von wenigstens einem PRRS-Virus charakterisiert, welche sich von der früher veröffentlichten Pathologie des PRRS-Virus (Viren) unterscheidet (siehe Tabelle I unten). Daher ist die vorliegende Erfindung nicht notwendigerweise auf Vakzinen und Verfahren beschränkt, die mit dem infektiösen Agens, das diese neue Form von PRRS hervorruft, welches die gegenwärti gen Erfinder als den „Iowa-Stamm" des PRRS-Virus (PRRSV) bezeichnet haben, zusammenhängen.
Nichtsdestotrotz sind Pessimismus und Skepsis im Stand der Technik zum Ausdruck gebracht worden, was die Entwicklung effektiver Vakzinen gegen diese Schweineviren betrifft (The Veterinary Record, 26. Oktober 1991). Eine Überzeugung, dass eine Humaninfluenzavakzine einen gewissen Schutz gegenüber den Wirkungen von PRRS und PNP bieten könnte, existiert im Stand der Technik (siehe beispielsweise Ibid., 6. Juli 1991). Jedoch wird die Verwendung einer Humanvakzine in einem Nahrungstier im Allgemeinen durch Regulations- und Verwaltungsbehörden missbilligt, und daher ist dieser Ansatz in der gegenwärtigen Praxis nicht möglich (Ibid.).
Die Schweinehaltungsindustrie ist und wird weiterhin durch diese Reproduktions- und Atemwegserkrankungen bei Schweinen und neue Varianten von diesen, sofern diese auftreten, nachteilig beeinflusst werden. Überraschenderweise ist der Markt für Tiervakzinen in den USA und weltweit größer als der Markt für Humanvakzinen. Somit besteht ein ökonomischer Ansporn, neue Veterinärvakzinen zu entwickeln, zusätzlich zu dem wesentlichen Nutzen für die öffentliche Gesundheit, welcher sich aus dem Schutz von Nutztieren vor Krankheit ableitet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein natürlich vorkommendes isoliertes Virus, das das Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) hervorruft, bereit zu stellen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Viren, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangsnummern VR 2385 und VR 2386 hinterlegt sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vakzine bereit zu stellen, welche ein Schwein gegen das Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) schützt, die ein inaktiviertes oder attenuiertes Virus und einen physiologisch verträglichen Träger umfasst, wobei das Virus vor der Inaktivierung oder Attenuierung das Virus der vorliegenden Erfindung ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vakzine bereit zu stellen, die eine effektive immunologische Antwort auf ein Virus, welches eine Atemwegs- und Repro duktionserkrankung bei einem Schwein hervorruft, insbesondere auf den Iowa-Stamm von PRRSV hervorruft.
Ein neues Verfahren zum Schutz eines Schweins vor einer Infektion durch ein Virus, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere vor dem Iowa-Stamm von PRRSV, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein neues Verfahren des Hervorrufens einer effektiven immunologischen Antwort in einem Schwein auf ein Virus, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere auf den Iowa-Stamm von PRRSV, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein Antikörper, welcher immunologisch an ein Virus bindet, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere gegen den Iowa-Stamm von PRRSV, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein Antikörper, welcher immunologisch an eine Vakzine bindet, welche ein Schwein vor einer Infektion durch ein Virus schützt, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein Antikörper, welcher immunologisch an eine Vakzine bindet, welche ein Schwein vor einer Infektion durch den Iowa-Stamm von PRRSV schützt, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Schweins, das an einer Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen, insbesondere einer Erkrankung, die durch den Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, leidet, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Schweins, das einem Virus, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere dem Iowa-Stamm von PRRSV ausgesetzt ist, wird hierin offenbart aber nicht beansprucht.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen diagnostischen Kit zur Untersuchung eines Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere eine Erkrankung, die durch den Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Polynukleotid, das aus dem Genom eines Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere aus dem Iowa-Stamm von PRRSV isoliert ist, bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Polynukleotid, das eines oder mehrere Proteine eines Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere aus dem Iowa-Stamm von PRRSV codiert, bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Polynukleotid, das eines oder mehrere antigene Peptide aus einem Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, insbesondere aus dem Iowa-Stamm von PRRSV codiert, bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Kultivierung eines Reproduktions- und Atemwegsvirus bei Schweinen unter Verwendung einer geeigneten Zelllinie bereit zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Kultivierung des Iowa-Stamms von PRRSV unter Verwendung einer geeigneten Zelllinie bereit zu stellen.
Diese und andere Aufgaben, welche aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen deutlich sein werden, wurden gelöst durch eine Vakzine, welche ein Schwein vor einer Infektion durch ein Virus schützt, das eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, eine Zusammensetzung, welche eine effektive immunologische Antwort auf ein Virus hervorruft, das eine solche Schweinekrankheit hervorruft, und DNA, welche einen Teil des Genoms eines Virus codiert, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Flussdiagramm zur Herstellung einer modifizierten Lebendvakzine;
2 ist ein Flussdiagramm eines Prozesses zur Herstellung einer inaktivierten Vakzine;
3 ist ein Flussdiagramm, welches ein Vorgehen zur Herstellung einer Untereinheitsvakzine skizziert;
4 ist ein Flussdiagramm, welches ein Vorgehen zur Herstellung einer gentechnisch hergestellten Vakzine skizziert;
5 und 6 zeigen histologische Schnitte aus den Lungen konventioneller Schweine 10 Tage nach Infektion mit einer Probe des infektiösen Agens, das aus einem Schwein isoliert wurde, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert war;
7 zeigt einen histologischen Schnitt aus der Lunge eines gnotobiotischen Schweins 9 Tage nach Infektion mit einer Probe eines infektiösen Agens, das aus einem Schwein isoliert wurde, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert war;
8 zeigt die Herzläsionen eines gnotobiotischen Schweins 35 Tage nach Infektion mit einer Probe eines infektiösen Agens, das aus einem Schwein isoliert wurde, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert war;
9 zeigt Bronchioalveolarspülungskulturen, welche ausgedehnte Synzytien zeigen, die aus einem gnotobiotischen Schwein 9 Tage nach Infektion mit einer Lungenfiltratprobe eines infektiösen Agens, das aus einem Schwein isoliert wurde, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert war, hergestellt wurden (ISU-12; siehe Experiment I, Abschnitt (II) (C) unten);
10 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines umhüllten Viruspartikels, ca. 70 nm im Durchmesser, welcher kurze Oberflächenspikes aufweist, der in Alveolarmakrophagenkulturen von Schweinen gefunden wurde, die mit einem infektiösen Agens infiziert waren, welches mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden war;
11 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines pleomorphen, umhüllten Viruspartikels, ungefähr 80 × 320 nm in der Größe, beschichtet mit Antikörpern, der in Alveolarmakrophagenkulturen von Schweinen gefunden wurde, die mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert waren;
12(A)–(C) sind eine Serie von Photographien, die Schweinealveolarmakrophagen (SAM)-Kulturen zeigen: nicht infiziert (A), CPE bei denen, die mit ISU-12 infiziert waren (B), oder IFA bei denen, die mit ISU-12 infiziert waren (C) (siehe Experiment II unten);
13(A)–(D) sind eine Serie von Photographien, die PSP-36-Zellkulturen zeigen: nicht infiziert (A), CPE bei denen, die mit ISU-12 infiziert waren, nach 4 DPI (B), CPE bei denen, die mit ISU-12 infiziert waren, nach 5 DPI (C), und CPE bei denen, die mit ISU-984 infiziert waren (ein zweites Virusisolat, welches den Iowa-Stamm von PRRSV repräsentiert), nach 5 DPI.
14(A)–(D) sind eine Serie von Photographien, welche IFA n ISU-12 infizierter PSP-36-Zellen zeigen: nicht infiziert (A), infiziert mit ISU-12 nach 2,5 DPI und gefärbt mit Rekonvaleszentenseren (B), infiziert mit ISU-12 nach 2,5 DPI und gefärbt mit polyklonalem anti-PRRSV-Antikörper (C), und infiziert mit ISU-12 und gefärbt mit monoklonalem Antikörper (D).
15 ist ein Proteinprofil von ISU-12, das in PSP-36-Zellen vermehrt wurde, wie es durch Radioimmunpräzipitation (RIP) bestimmt wurde; die Bahnen 1 und 2 sind scheininfizierte PSP-36-Zellen und immunpräzipitiert mit polyklonalen anti-PRRSV-Seren (1) und Rekonvaleszentenseren (2); die Bahnen 3 und 4 sind virusinfizierte PSP-36-Zellen und immumpräzipitiert mit polyklonalen anti-PRRSV-Seren (3) und Rekonvaleszentenseren (4).
16 ist ein Flussdiagramm, welches ein allgemeines Vorgehen zur Konstruktion einer cDNA-Lambda-Bibliothek eines Stammes eines infektiösen Agens (ISU-12), das PRRS hervorruft, zeigt;
17 ist ein Flussdiagramm, welches ein allgemeines Vorgehen zur Identifizierung von authentischen cDNA-Klonen des infektiösen Agens (ISU-12), das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, durch differentielle Hybridisierung zeigt;
18(A)–(C) zeigt die Lambda-cDNA-Klone, die verwendet wurden, um die 3'-terminale Nukleotidsequenz des ISU-12 zu erhalten (C), subgenomische mRNAs (B) und offene Leseraster (ORFs) in der resultierenden Sequenz (A);
Die sequenzierten Bereiche in den cDNA-Klonen sind wie gezeigt durch dicke Balken gefüllt und nicht sequenzierte Bereiche sind schattiert (C). Das eingekästelte L zeigte die Leitsequenz in mRNAs und (A)n zeigte den poly(A)-Schwanz an dem äußersten 3'-Ende des Genoms (B);
19 stellt die 3'-terminale Sequenz mit 1938 bp des Genoms des infektiösen Agens dar, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist;
20 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von PRRSV ISU-12, die unter der Nukleotidsequenz gezeigt ist;
21 vergleicht die Nukleotidsequenzen des infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV (ISU-12) verbunden ist, und des Lelystad-Virus in Bezug auf das offene Leseraster 5 (ORF-5);
22 vergleicht die Nukleotidsequenzen des ORF-6 des ISU-12-Virus mit dem ORF-6 des Lelystad-Virus;
23 vergleicht die Nukleotidsequenzen des ORF-7 des ISU-12-Virus und des ORF-7 des Lelystad-Virus;
24 vergleicht die nichttranslationalen 3'-Nukleotidsequenzen des ISU-12-Virus und des Lelystad-Virus;
25 zeigt nicht infizierte Trichoplusia-Eizellhomogenate (HI-FIVE^TM, Invitrogen, San Diego, Kalifornien);
26 zeigt HI-FIVE-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, der das ISU-12-ORF-6-Gen enthält, die einen zytopathischen Effekt zeigen;
27 zeigt HI-FIVE-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, der das ISU-12-ORF-7-Gen enthält, die ebenfalls einen zytopathischen Effekt zeigen;
28 zeigt HI-FIVE-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, der das ISU-12-ORF-6-Gen enthält, gefärbt mit Schweineantiseren gegen ISU-12, gefolgt von einer Färbung mit Fluorescein-konjugiertem anti-Schwein-IgG, wobei die Insektenzellen ein rekombinantes Protein erzeugen, das durch das ISU-12-ORF-6-Gen codiert wird;
29 zeigt HI-FIVE-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert sind, der das ISU-12-ORF-7-Gen enthält, gefärbt mit Schweineantiseren gegen ISU-12, gefolgt von einer Färbung mit Fluorescein-konjugiertem anti-Schwein-IgG, wobei die Insektenzellen ein rekombinantes Protein erzeugen, das durch das ISU-12-ORF-7-Gen codiert wird;
30 zeigt die Ergebnisse einer PCR-Amplifikation von ORF-6 (Bahn M) und ORF-7 (Bahn NP) unter Verwendung von ISU-12-spezifischen Primern;
31 zeigt die Ergebnisse der Expression des rekombinanten Baculovirustransfervektors pVL1393, welcher ORF-5 (Bahn E), ORF-6 (Bahn M) oder ORF-7 (Bahn NP) des Genoms von ISU-12 enthält, nach Spaltung der Plasmid-DNA mit BamHI- und EcoRI-Restriktionsenzymen; Bahn SM enthält Molekulargewichtsstandards;
32 zeigt einen Northern Blot von ISU-12-mRNA;
33A und 33B zeigen Northern Blots von mRNA, die aus anderen Isolaten des Iowa-Stamms von PRRSV (ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 und ISU-3927) entnommen wurde; und
34 ist ein Balkendiagramm der durchschnittlichen makroskopischen Lungenläsionswerte (Prozent der Lunge, die betroffen sind) für Gruppen von 3 Wochen alten, PRRSV-seronegativen, spezifischen pathogenfreien (SPF) Schweinen, denen eine Ausführungsform der vorliegenden Vakzine intranasal (IN) oder intramuskulär (IM) verabreicht wurde, und eine Gruppe von Kontrollschweinen (NV/CHALL).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bei der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine „Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen" auf die Krankheiten PRRS, PNP und EMCV, die oben beschrieben wurden, die Erkrankung, welche durch den Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, und eng verwandte Varianten dieser Erkrankungen, die schon aufgetreten sind und die in der Zukunft auftreten werden.
Eine Vakzine „schützt ein Schwein vor einer Erkrankung, die durch ein Virus der Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorgerufen wird", wenn nach der Verabreichung der Vakzine an ein nicht betroffenes Schwein Läsionen in der Lunge oder Symptome der Erkrankung nicht auftreten oder nicht so schwer sind wie bei infizierten nicht geschützten Schweinen, und wenn nach der Verabreichung der Vakzine an ein betroffenes Schwein Läsionen in der Lunge oder Symptome der Erkrankung eliminiert werden oder nicht so schwer sind wie bei infizierten nicht geschützten Schweinen. Ein nicht betroffenes Schwein ist ein Schwein, welches entweder nicht an ein infektiöses Agens der Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen ausgesetzt wurde oder welches an ein infektiöses Agens der Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen ausgesetzt wurde aber keine Symptome der Erkrankung zeigt. Ein betroffenes Schwein ist ein Schwein, welches Symptome der Erkrankung zeigt. Die Symptome der Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen können quantifiziert oder bewertet (z.B. Temperatur/Fieber, Lungenläsionen [Prozentsatz des infizierten Lungengewebes]) oder halb quantifiziert werden (z.B. Schwere der Atemnot [wird unten im Detail erklärt]).
Ein „Atemwegs- und Reproduktionsvirus bei Schweinen" ruft eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen wie oben beschrieben hervor.
Das Agens, welches die neue virulentere Form von PRRS hervorruft, wurde der „Iowa"-Stamm von PRRSV genannt. Die Erkrankung, die durch einige Isolate des „Iowa-Stamms des PRRS-Virus hervorgerufen wird, weist Symptome auf, die ähnlich aber schwerer sind als bei anderen Atemwegs- und Reproduktionserkrankungen bei Schweinen. Klinische Anzeichen können Lethargie, Atemnot, „Pochen" (forcierte Expiration), Fieber, aufgeraute Felle, Niesen, Husten, Augenödeme und gelegentlich Konjunktivitis beinhalten. Läsionen können makroskopische und/oder mikroskopische Lungenläsionen und Myokarditis beinhalten. Das infektiöse Agens kann ein einzelnes Virus sein oder kann mit einem oder mehreren zusätzlichen infektiösen Agentien (z.B. anderen Viren oder Bakterien) kombiniert sein. Zusätzlich sind weniger virulente und nicht virulente Formen des Iowa-Stamms gefunden worden, welche eine Untergruppe der obigen Symptome hervorrufen können oder überhaupt keine Symptome hervorrufen können, welche aber gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um nichtsdestotrotz einen Schutz vor Reproduktions- und Atemwegserkrankungen bei Schweinen zu liefern.

Die histologischen Läsionen bei den verschiedenen Schweinekrankheiten sind unterschiedlich. Tabelle I unten vergleicht physiologische Beobachtungen und die Pathologie der Läsionen, die mit einer Anzahl von Krankheiten, die von Schweineviren hervorgerufen werden, verbunden sind: TABELLE I

VIRALE PNEUMONIE BEI SCHWEINEN VERGLEICHENDE PATHOLOGIE
LÄSION	PRRS (P)	PRSS (o)	SIV	PNP	PRCV	PPMV	Iowa
Typ II	+	+++	+	+++	++	++	++++
Inter. Verdickung	++++	+	+	+	++	++	+
Alveolares Exudat	+	+++	++	++	++	++	+++
Luftwegsnekrose	–	–	++++	++++	+++	+	–
Synzytien	–	++	+/–	++	+	+	+++
Enzephalitis	+	+++	–	–	–	++	+
Myokarditis	+/–	++	–	–	–	–	+++

wobei „PRRS (p)" für die veröffentlichte Pathologie des PRRS-Virus steht, „PRRS (o)" für die Pathologie des PRRS-Virus steht, die von den gegenwärtigen Erfindern beobachtet wurde, „SIV" für das Schweine-Influenza A-Virus steht, „PRCV" für das Schweine-Atemwegs-Coronavirus steht, „PPMV" für das Schweine-Paramyxovirus steht, „Iowa" sich auf den neuen Stamm von PRRSV bezieht, der von den gegenwärtigen Erfindern entdeckt wurde, „Typ II" sich auf Pneumozyten vom Typ II bezieht (die sich in infizierten Schweinen vermehren), „Inter." sich auf interstitiell bezieht, „Luftwegsnekrose" sich auf eine Nekrose in den terminalen Luftwegen bezieht und die Symbole (–) und (+) bis (++++) sich auf eine vergleichende Skala der Schwere wie folgt beziehen:

(–): :negativ (nicht beobachtet)
(+): :schwach (gerade oberhalb der Beobachtungsschwelle)
(++): :mäßig
(+++): :schwer
(++++): :sehr schwer

Der Iowa-Stamm von PRRSV ist von den gegenwärtigen Erfindern im mittleren Westen der USA in Verbindung mit PRRS identifiziert worden. Es ist bisher nicht klar, ob die Erkrankung, die mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, wie sie natürlicherweise gefunden wird, auf einem einzigen Virus oder einer Kombination von einem Virus mit einem (oder mehreren) zusätzlichen infektiösen Agens (Agentien) beruht. Jedoch scheinen plaquegereinigte Proben des Iowa-Stamms von PRRSV ein einzelnes, einzigartiges Virus zu sein. Daher bezieht sich „der Iowa-Stamm von PRRSV" entweder auf ein einziges plaquegereinigtes Virus oder ein Gewebehomogenat aus einem infizierten Tier, welches eine Kombination eines Virus mit einem (oder mehreren) zusätzlichen infektiösen Agens (Agentien) enthalten kann, und ein Schwein, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert ist, zeigt eines oder mehrere der Symptome, die für die Erkrankung charakteristisch sind, die von dem Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, wie sie oben beschrieben wurden.
Neuere Beweise zeigen, dass sich der Iowa-Stamm von PRRSV von dem infektiösen Agens unterscheidet, welches herkömmliche PRRS hervorruft. Beispielsweise sind Läsionen, die bei infizierten Schweinen beobachtet werden, die Symptome der Erkrankung zeigen, die von dem Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, schwerer als Läsionen, die bei Schweinen beobachtet werden, die nur mit einem herkömmlichen vorher beschriebenen PRRS-Virus infiziert sind, und Schweine, die an der Erkrankung leiden, die von dem Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen wird, sind ebenfalls seronegativ im Hinblick auf Influenza, einschließlich Viren, die mit PNP verbunden sind.
In Bezug nun auf die 1–4 werden Flussdiagramme von Vorgehensweisen bereitgestellt, um verschiedene Typen von Vakzinen herzustellen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Die Flussdiagramme der 1–4 werden als beispielhafte Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Vakzinen bereitgestellt und sind nicht dazu gedacht, die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Der erste Schritt bei jedem Vorgehen, das detailliert in den 1–4 angegeben ist, besteht darin eine Zelllinie zu identifizieren, die für eine Infektion mit einem Atemwegs- und Reproduktionsvirus von Schweinen oder einem infektiösen Agens empfänglich ist. (Um die Diskussion im Hinblick auf die Herstellung der Vakzine zu vereinfachen, bedeutet der Ausdruck „Virus" ein Virus und/oder ein anderes infektiöses Agens, das mit einer Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen verbunden ist). Ein Masterzellmaterial (MCS) der empfänglichen Wirtszelle wird dann hergestellt. Die empfänglichen Wirtszellen werden weiter über das MCS hinaus passagiert. Ein Arbeitszellmaterial (WCS) wird aus Zellpassagen zwischen MCS und MCS+n hergestellt.
Ein Masterimpfvirus wird auf der empfänglichen Wirtszelllinie zwischen MCS und MCS+n, vorzugsweise auf WCS, vermehrt. Das Rohvirus wird durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, aus geeigneten, vorzugsweise homogenisierten, Gewebeproben, die aus infizierten Schweinen entnommen wurden, die Krankheitssymptome zeigten, die denen entsprachen, die durch das Virus von Interesse verursacht wurden, isoliert. Eine geeignete Wirtszelle, vorzugsweise eine Probe des WCS, wird mit dem Rohvirus infiziert, dann kulti viert. Vakzinevirus wird anschließend aus der infizierten, kultivierten Wirtszelle durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, isoliert und plaquegereinigt. Vorzugsweise wird das Virus, das verwendet werden soll, um die Vakzine herzustellen, dreimal plaquegereinigt.
Masterimpfvirus (MSV) wird dann aus dem plaquegereinigten Virus durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt. Das MSV (X) wird dann in WCS wenigstens viermal über MSV (X+1), MSV (X+2), MSV (X+3) und MSV (X+4) Viruspassagen passagiert. Das MSV (X+4) wird als das Arbeitsimpfvirus betrachtet. Vorzugsweise ist die Viruspassage, die in den Schweineuntersuchungen und dem Vakzineprodukt der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, MSV (X+5), das Produkt der fünften Passage.
Zusammen mit dem Arbeitszellmaterial wird das Arbeitsimpfvirus durch bekannte Verfahren in hinreichenden Mengen kultiviert, um eine Prototyp-Vakzine, vorzugsweise MSV (X+5), herzustellen. Die vorliegenden Prototyp-Vakzinen können zu irgendeinem Typ gehören, der zur Verwendung auf dem Gebiet der Veterinärmedizin geeignet ist. Geeignete Typen beinhalten eine modifizierte lebende oder attenuierte Vakzine (1), eine inaktivierte oder abgetötete Vakzine (2), eine Untereinheitsvakzine (3), eine gentechnisch hergestellte Vakzine (4) und andere Typen von Vakzinen, die im Stand der Technik von Veterinärvakzinen anerkannt sind. Eine abgetötete Vakzine kann in einer Weise, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, durch chemische Behandlung oder Wärme usw. inaktiv gemacht werden.
In den Vorgehensweisen, die in jeder der 1–4 skizziert sind, werden nach der Herstellung einer Prototyp-Vakzine Schweinherausforderungsmodelle und klinische Tests durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt. Beispielsweise muss vor der Durchführung tatsächlicher Vakzinierungs-/Herausforderungsuntersuchungen die Erkrankung, die verhindert und/oder behandelt werden soll, im Hinblick auf deren Symptome, klinische Testergebnisse, Bedingungen usw. definiert werden. Wie oben beschrieben wurde, ist das infektiöse Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, im Hinblick auf dessen Symptome und Bedingungen definiert worden. Die klinische Analyse des infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, wird in den Beispielen unten beschrieben.
Nachdem die Erkrankung hinreichend definiert und charakterisiert ist, kann man eine Prototyp-Vakzine einem Schwein verabreichen, dann das Schwein dem Virus oder infektiösen Agens, welches die Erkrankung hervorruft, aussetzen. Dieses ist im Stand der Technik als „Herausfordern" des Schweins und seines immunologischen Systems bekannt. Nach Beob achtung der Antwort des herausgeforderten Schweins auf das Aussetzen an das Virus oder infektiöse Agens und Analysieren der Fähigkeit der Prototyp-Vakzine, das Schwein zu schützen, werden dann Wirksamkeitsstudien durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt. Ein Potenztest wird dann in einem separaten Vorgehen durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, entwickelt und dann werden Vorzulassungsreihen produziert.
Bei der Herstellung einer modifizierten Lebendvakzine, wie sie in 1 skizziert ist, werden, wenn eine Prototyp-Vakzine hergestellt ist, die Zellwachstumsbedingungen und die Virusproduktion zuerst optimiert, dann wird durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, eine Produktionsskizze hergestellt. Wenn die Produktionsskizze hergestellt ist, werden dann anschließend Vorzulassungsreihen durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt. Vorzulassungsreihen beziehen sich auf eine Produktion im großen Maßstab einer vielversprechenden Prototyp-Vakzine, welche die Fähigkeit zeigt, Testreihen (serials) mit beständigen Standards zu produzieren. Ein Ansatz zur Herstellung einer Prototyp-Lebendvakzine ist es, die virusinfizierten Zellen (vorzugsweise mit dem Masterimpfvirus infizierte Zellen) einem oder mehreren Zyklen von Einfrieren und Auftauen zu unterwerfen, um die Zellen zu lysieren. Das Material der eingefrorenen und aufgetauten Kultur der infizierten Zellen kann lyophilisiert (gefriergetrocknet) werden, um die Konservierbarkeit zur Lagerung zu erhöhen. Nach anschließender Rehydratisierung wird das Material dann als eine Lebendvakzine verwendet.
Das Vorgehen zur Herstellung von Vorzulassungsreihen für eine inaktivierte Vakzine (2) ist ähnlich zu dem, das zur Herstellung einer modifizierten Lebendvakzine verwendet wird, mit einer wichtigen Modifikation. Nach Optimierung der Zellwachstumsbedingungen und der Virusproduktionsvorschrift muss dann eine Virusinaktivierungsvorschrift optimiert werden, bevor eine geeignete Produktionsskizze hergestellt wird. Virusinaktivierungsvorschriften und deren Optimierung sind den Fachleuten im Allgemeinen bekannt und können in einer bekannten oder vorhersagbaren Weise variieren, was von dem bestimmten Virus, das untersucht wird, abhängt.
Die Herstellung einer Untereinheitsvakzine (3) unterscheidet sich von der Herstellung einer modifizierten Lebendvakzine oder einer inaktivierten Vakzine. Vor der Herstellung der Prototyp-Vakzine müssen die schützenden oder antigenen Komponenten des Vakzinevirus identifiziert werden. Solche schützenden oder antigenen Komponenten beinhalten gewisse Aminosäuresegmente oder Fragmente der viralen Hüllproteine, welche eine besonders starke schützende oder immunologische Antwort in Schweinen hervorrufen (welche vor zugsweise wenigstens 5 Aminosäuren lang, besonders bevorzugt wenigstens 10 Aminosäuren lang sind); einzelne oder multiple virale Hüllproteine selbst, Oligomere von diesen, und Assoziationen der viralen Hüllproteine höherer Ordnung, welche Substrukturen des Virus oder identifizierbare Teile oder Einheiten solchen Substrukturen bilden; Oligoglycoside, Glycolipide oder Glycoproteine, die auf oder nahe der Oberfläche des Virus oder in viralen Substrukturen wie z.B. dem Nukleocapsid vorliegen; Lipoproteine oder Lipidgruppen, die mit dem Virus verbunden sind, usw. Diese Komponenten werden durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, identifiziert. Wenn sie identifiziert sind, werden die schützenden oder antigenen Bereiche des Virus (die „Untereinheit") anschließend durch Verfahren, die im Star der Technik bekannt sind, gereinigt und/oder kloniert.
Die Herstellung von Vorzulassungsreihen für eine Untereinheitsvakzine (3) ist mit einigen Modifikationen ähnlich zu dem Verfahren, das für eine inaktivierte Vakzine verwendet wird (2). Wenn beispielsweise die Untereinheit durch rekombinante Gentechniken erzeugt wird, kann die Expression der klonierten Untereinheit durch Methoden optimiert werden, die den Fachleuten bekannt sind (siehe z.B. relevante Abschnitte von Maniatis et al, "Molecular Cloning: A Laborstory Manual", Cold Spring Harbor Laborstory (1989), Cold Spring Harbor, Massachusetts). Wenn andererseits die eingesetzte Untereinheit ein intaktes strukturelles Merkmal des Virus wie beispielsweise ein gesamtes Hüllprotein darstellt, muss das Vorgehen zu seiner Isolation aus dem Virus dann optimiert werden. In jedem Fall kann nach der Optimierung der Inaktivierungsvorschrift vor der Herstellung der Produktionsskizze die Untereinheitsreinigungsvorschrift optimiert werden.
Gentechnisch hergestellte Vakzinen (4) beginnen mit einer Modifikation des allgemeinen Vorgehens, das zur Herstellung der anderen Vakzinen verwendet wird. Nach der Plaquereinigung kann das Wildtypvirus aus einem geeigneten Gewebehomogenat durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise durch konventionelle Zellkulturverfahren unter Verwendung von PSP-36- oder Makrophagenzellen als Wirten, aus einem geeigneten Gewebehomogenat isoliert werden.
Die RNA wird aus dem biologisch reinen Virus oder infektiösen Agens durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise durch das Guanidinisothiocyanatverfahren unter Verwendung eines im Handel erhältlichen RNA-Isoaltionskits (beispielsweise der Kit, der von Stratagene, La Jolla, Kalifornien, erhältlich ist) extrahiert und durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise durch Ultrazentrifugation in einem CsCl-Gradienten, gereinigt. RNA kann durch Oligo (dT)-Cellulose-Säulenchromatographie weiter gereinigt oder angereichert werden.
Das virale Genom wird dann durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, in einen geeigneten Wirt kloniert (siehe Maniatis et al., oben zitiert), und das Virusgenom wird dann analysiert, um essentielle Bereiche des Genoms zur Produktion antigener Bereiche des Virus zu bestimmen. Danach ist das Vorgehen im Allgemeinen dasselbe wie für eine modifizierte Lebendvakzine, eine inaktivierte Vakzine oder eine Untereinheitsvakzine.
Die vorliegende Vakzine schützt Schweine vor einem Virus oder infektiösen Agens, das eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft. Vorzugsweise schützt die vorliegende Vakzine Schweine vor dem infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist. Jedoch wird ebenfalls erwartet, dass die vorliegende Vakzine ein Schwein vor einer Infektion durch Aussetzen an eng verwandte Varianten des infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, schützt.
Relativ wenige Viren sind der Produktion von Lebendvirusvakzinen zugänglich. Die Vorteile von Lebendvirusvakzinen sind, dass alle möglichen Immunantworten in dem Empfänger der Vakzine aktiviert werden, einschließlich systemischer, lokaler, humoraler und zellvermittelter Immunantworten. Die Nachteile von Lebendvirusvakzinen liegen in dem Potential zur Kontamination mit lebenden zufällig hinzugekommenen Agentien wie z.B. SV40-Virus und Rindervirendiarrhövirus, einer häufigen Kontamination von fötalem Rinderserum. Dieses Risiko, zuzüglich des Risikos, dass das Virus auf dem Feld zu einer Virulenz zurückkehren kann oder in Bezug auf den Fötus, Jungtiere und andere Spezies nicht attenuiert sein kann, kann die Vorteile einer Lebendvakzine aufwiegen.
Inaktivierte Virusvakzinen können hergestellt werden, indem Viren mit inaktivierenden Mitteln wie z.B. Formalin oder hydrophoben Lösungsmitteln, Säure usw., durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder Röntgenstrahlen, durch Erwärmen usw. behandelt werden. Die Inaktivierung wird in einer Weise durchgeführt, die im Stand der Technik verstanden wird. Ein Virus wird als inaktiviert betrachtet, wenn es nicht in der Lage ist, eine Zelle, die für eine Infektion empfänglich ist, zu infizieren. Beispielsweise wird bei der chemischen Inaktivierung eine geeignete Virusprobe oder Serumprobe, die das Virus enthält, für eine ausreichende Zeitdauer mit einer ausreichenden Menge oder Konzentration eines inaktivierenden Mittels bei einer hinreichend hohen (oder niedrigen, abhängig von dem inaktivierenden Mittel) Temperatur oder pH behandelt, um das Virus zu inaktivieren. Die Inaktivierung durch Erwärmen wird bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer durchgeführt, die ausreicht, um das Virus zu inaktivieren. Die Inaktivierung durch Bestrahlung wird unter Verwendung einer Wellenlänge von Licht- oder anderer Energie für eine Zeitdauer durchgeführt, die ausreicht, um das Virus zu inaktivieren. Beispiele von inaktivierten Vakzinen zur Verwendung beim Menschen beinhalten Influenzavakzine, Poliomyelitis, Tollwut und Hepatitis Typ B. Ein erfolgreiches und effektives Beispiel einer inaktivierten Vakzine zur Verwendung bei Schweinen ist die Schweineparvovirusvakzine.
Untereinheitsvirusvakzinen werden aus halbgereinigten Virusuntereinheiten durch die Verfahren, die oben bei der Diskussion von 3 beschrieben werden, hergestellt. Beispielsweise sind Hämagglutinin, das aus dem Influenzavirus isoliert wurde, und Neuraminidase-Oberflächenantigene, die aus dem Influenzavirus isoliert wurden, hergestellt worden, und es ist gezeigt worden, dass sie weniger toxisch sind als das gesamte Virus. Alternativ können Untereinheitsvakzinen aus hoch gereinigten Untereinheiten des Virus hergestellt werden. Ein Beispiel bei Menschen ist das 22-nm-Oberflächenantigen des menschlichen Hepatitis B-Virus. Untereinheiten des menschlichen Herpes simplex-Virus und viele andere Beispiele von Untereinheitsvakzinen zur Verwendung bei Menschen sind bekannt.
Attenuierte Virusvakzinen können in der Natur gefunden werden und können natürlich vorkommende Gendeletionen aufweisen oder können alternativ durch eine Vielzahl bekannter Verfahren wie z.B. Serienpassage in Zellkulturen oder Gewebekulturen hergestellt werden. Viren können ebenfalls durch Gendeletionen oder Genmutationen attenuiert werden.
Gentechnisch hergestellte Vakzinen werden durch Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, produziert. Solche Techniken beinhalten jene, die rekombinante DNA verwenden, und jene, die lebende Viren verwenden. Beispielsweise können gewisse Virusgene identifiziert werden, welche für Proteine codieren, die für die Induktion einer stärkeren Immun- oder Schutzantwort in Schweinen verantwortlich sind. Solche identifizierten Gene können in Proteinexpressionsvektoren wie z.B. den Baculovirusvektor kloniert werden und verwendet werden, um geeignete Wirtszellen zu infizieren (siehe z.B. O'Reilly et al, "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual", Freeman & Co. (1992)). Die Wirtszellen werden kultiviert, wodurch sie die gewünschten Vakzineproteine exprimieren, welche in einem gewünschten Ausmaß gereinigt werden können und dann verwendet werden können, um die Schweine vor einer Atemwegs- und Reproduktionserkrankung zu schützen.
Gentechnisch hergestellte Proteine können in Insektenzellen, Hefezellen oder Säugerzellen exprimiert werden. Die gentechnisch hergestellten Proteine, welche durch herkömmliche Verfahren gereinigt und/oder isoliert werden können, können direkt in Tieren inokuliert werden, um einen Schutz vor Reproduktions- und Atemwegserkrankungen bei Schweinen zu verleihen. Hüllproteine aus einem Virus einer Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen werden in einer Vakzine verwendet, um neutralisierende Antikörper zu induzieren. Nukleoproteine aus einem Virus einer Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen werden in einer Vakzine verwendet, um zelluläre Immunität zu induzieren.
Vorzugsweise transformiert die vorliegende Erfindung eine Insektenzelllinie (HI-FIVE) mit einem Transfervektor, der Polynukleinsäuren enthält, die aus dem Iowa-Stamm von PRRSV erhalten wurden. Vorzugweise umfasst der vorliegende Transfervektor linearisierte Baculovirus-DNA und ein Plasmid, das Polynukleinsäuren enthält, die aus dem Iowa-Stamm von PRRSV erhalten wurden. Die Wirtszelllinie kann mit der linearisierten Baculovirus-DNA und einem Plasmid cotransfiziert werden, so dass ein rekombinantes Baculovirus erzeugt wird. Besonders bevorzugt codiert die vorliegende Polynukleinsäure eines oder mehrere Proteine des Iowa-Stamms von PRRSV.
Alternativ kann RNA oder DNA aus einem infektiösen Virus einer Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen, die ein oder mehrere Hüllproteine und/oder Nukleoproteine codiert, in lebende Vektoren wie z.B. ein Pockenvirus oder ein Adenovirus eingefügt werden und als eine Vakzine verwendet werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin eine Polynukleinsäure, die aus einem Bereich des Genoms eines Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, isoliert wurde, vorzugsweise eine Polynukleinsäure, die aus einem Bereich des Genoms des Iowa-Stamms von PRRSV isoliert wurde. Der Ausdruck „Polynukleinsäure" bezieht sich auf RNA oder DNA, wie auch RNA und cDNA, die der RNA oder DNA aus dem infektiösen Agens entspricht oder dazu komplementär ist. Die vorliegende Polynukleinsäure weist einen Nutzen als ein Mittel, um die vorliegende Vakzine zu produzieren, als ein Mittel, um infizierte Tiere zu screenen oder zu identifizieren, und als ein Mittel zur Identifizierung verwandter Viren auf.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die Polynukleinsäure ein oder mehrere Proteine eines Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, vorzugsweise eines oder beide von dem viralen Membran (Hüll)-Protein und dem Capsidprotein (Nukleoprotein). Besonders bevorzugt wird die vorliegende Polynukleinsäure aus einem 2 kb-Fragment aus dem 3'-Ende des Genoms entnommen und codiert ein oder mehrere der Hüllproteine, die von ORF-5 und ORF-6 codiert werden, und/oder das Nukleoprotein, das von ORF-7 des Genoms des Iowa-Stamms von PRRSV codiert wird. Am meisten bevorzugt wird die Polynukleinsäure aus dem Genom eines infektiösen Agens isoliert, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist; beispielsweise des Agens, das in den Experimenten I–III unten beschrieben wird (ISU-12), und wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ORF 5 (SEQ ID NO: 10), ORF 6 (SEQ ID NO: 12), ORF 7 (SEQ ID NO: 14) und der 3'-terminalen Sequenz des ISU-12-Genoms mit 1938 bp (SEQ ID NO: 8).
In dem Kontext der vorliegenden Anmeldung werden die Proteine oder Peptide, die von der RNA und/oder DNA aus einem Virus codiert werden, als immunologisch äquivalent" betrachtet, wenn die Polynukleinsäure 90% oder mehr Homologie mit der Polynukleinsäure aufweist, die das immunogene Protein oder Peptid codiert. „Homologie" bezieht sich in dieser Anmeldung auf den Prozentsatz identischer Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zwischen zwei oder mehr Viren oder infektiösen Agentien. Demgemäß umfasst ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine isolierte Polynukleinsäure, welche wenigstens 90% homolog ist zu einer Polynukleinsäure, die aus dem Genom eines Virus erhalten wird, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, vorzugsweise zu einer Polynukleinsäure, die aus dem Genom des infektiösen Agens erhalten wird, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist.
Relativ kurze Segmente einer Polynukleinsäure (ca. 20 bp oder länger) in dem Genom eines Virus können verwendet werden, um durch Verfahren, die hierin beschrieben werden und den Durchschnittsfachleuten bekannt sind, infizierte Tiere zu screenen oder identifizieren, und/oder um verwandte Viren zu identifizieren. Demgemäß umfasst ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine isolierte (und wenn gewünscht gereinigte) Polynukleinsäure, die im Wesentlichen aus isolierten Fragmenten besteht, die aus einem Bereich des Genoms eines Virus erhalten wurden, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, vorzugsweise eine Polynukleinsäure, die aus einem Bereich des Genoms des infektiösen Agens erhalten wurde, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, wobei diese wenigstens 20 Nukleotide in der Länge, vorzugsweise von 20 bis 100 Nukleotide in der Länge aufweist. Besonders bevorzugt werden die vorliegenden isolierten Polynukleinsäurefragmente aus der 3'-terminalen Sequenz mit 1938 bp des ISU-12-Genoms (SEQ ID NO: 8) erhalten und werden am meisten bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7.
Die vorliegenden isolierten Polynukleinsäurefragmente können durch Verdau der cDNA, welche den viralen Polynukleinsäuren entspricht (dazu komplementär ist), mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen erhalten werden oder können synthetisiert werden, indem ein im Handel erhältliches automatisiertes Polynukleotidsynthesegerät verwendet wird.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung [liegen] eines oder mehrere antigene Peptide aus einem Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, vorzugsweise das eine oder mehrere antigene Peptide aus dem infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist. Wie oben beschrieben codiert die vorliegende Polynukleinsäure einen antigenen Bereich eines Proteins aus einem Virus, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, vorzugsweise aus dem infektiösen Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, das wenigstens 5 Aminosäuren in der Länge, besonders bevorzugt wenigstens 10 Aminosäuren in der Länge aufweist. Verfahren zur Bestimmung des antigenen Bereichs eines Proteins sind den Durchschnittsfachleuten bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Protein, das von einem oder mehreren der ORFs des Iowa-Stamms von PRRSV codiert wird. Vorzugsweise wird das Protein von einer Polynukleinsäuresequenz codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 16. Die vorliegenden Proteine und antigenen Peptide sind in serologischen Tests zum Screenen von Schweinen auf eine Exposition an PRRSV, insbesondere an den Iowa-Stamm von PRRSV, nützlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine biologisch reine Probe eines Virus, das eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, die durch die folgenden Symptome und klinischen Anzeichen gekennzeichnet ist: Lethargie, Atemnot, forcierte Expiration, Fieber, aufgeraute Felle, Niesen, Husten, Augenödeme und gelegentlich Konjunktivitis. Die vorliegende biologisch reine Probe eines Virus kann weiterhin dadurch gekennzeichnet werden, dass sie eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, welche die folgenden histologischen Läsionen beinhalten kann: makroskopische und/oder mikroskopische Lungenläsionen, Typ II-Pneumozyte, Myokarditis, Enzephalitis, Bildung von alveolarem Exudat und Synzytienbildung. Der Ausdruck „biologisch rein" bezieht sich auf eine Probe eines Virus oder infektiösen Agens, in welcher alle Nachkommen von einem einzigen Elter abgeleitet sind. Gewöhnlich wird eine „biologisch reine" Probe durch 3malige Plaquereinigung in Zellkultur erreicht. Insbesondere ist das vorliegende biologisch reine Virus oder infektiöse Agens der Iowa-Stamm des Reproduktions- und Atemwegssyndroms bei Schweinen, wobei Proben davon am 28. Oktober 1992 unter den Zugangsnummern VR 2385 und VR 2386 unter dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawen Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt wurden.
Der Iowa-Stamm von PRRSV kann ebenfalls durch Northern Blots seiner mRNA charakterisiert werden. Beispielsweise kann der Iowa-Stamm von PRRSV entweder 7 oder 9 mRNAs enthalten, welche ebenfalls Deletionen darin aufweisen können. Insbesondere können, wie in den Experimenten unten beschrieben werden wird, die mRNAs des Iowa-Stamms von PRRSV bis zu vier Deletionen enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung zum Schutz eines Schweins vor einer viralen Infektion, welche eine Menge der vorliegenden Vakzine, die wirksam ist, um eine immunologische Antwort auf ein Virus hervorzurufen, welches eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, in einem physielogisch verträglichen Träger umfasst.
Eine wirksame Menge der vorliegenden Vakzine ist eine solche, bei welcher eine ausreichende immunologische Antwort auf die Vakzine hervorgerufen wird, um ein Schwein zu schützen, das einem Virus ausgesetzt ist, das eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen oder eine verwandte Erkrankung hervorruft. Vorzugsweise wird das Schwein in einem Ausmaß geschützt, bei welchem von einem bis zu allen der nachteiligen physiologischen Symptome oder Wirkungen (z.B. Lungenläsionen) der Erkrankung, die verhindert werden soll, gefunden wird, dass diese signifikant verringert sind.
Die Zusammensetzung kann in einer einzelnen Dosis oder in wiederholten Dosen verabreicht werden. Die Dosierungen können z.B. von 1 bis 1.000 Mikrogramm virusbasiertes Antigen (Vakzine) enthalten, sollten aber keine Menge an virusbasiertem Antigen enthalten, die ausreicht, um zu einer nachteiligen Reaktion oder physiologischen Symptomen einer Infektion zu führen. Im Stand der Technik sind Verfahren bekannt, um geeignete Dosierungen eines aktiven antigenen Mittels zu bestimmen.
Die Zusammensetzung, welche die vorliegende Vakzine enthält, kann zusammen mit einem Adjuvanz verabreicht werden. Ein Adjuvanz ist eine Substanz, welche die immunologische Antwort auf die vorliegende Vakzine verstärkt, wenn es damit kombiniert wird. Das Adjuvanz kann zur selben Zeit und an derselben Stelle wie die Vakzine verabreicht werden oder zu einer anderen Zeit, beispielsweise als eine Auffrischung (booster). Adjuvanzien können dem Tier ebenfalls vorteilhaft in einer Weise oder an einer Stelle oder einem Ort verabreicht werden, der verschieden ist von der Weise, der Stelle oder dem Ort, an welchem die Vakzine verabreicht wird. Adjuvanzien beinhalten Aluminiumhydroxid, Aluminiumkaliumsulfat, wärmelabiles oder wärmestabiles Enterotoxin, das aus Escherichia coli isoliert wurde, Choleratoxin oder die B-Untereinheit davon, Diphtherietoxin, Tetanustoxin, Pertussistoxin, Freund's unvollständiges Adjuvanz, Freund's vollständiges Adjuvanz und dergleichen. Auf Toxin basierende Adjuvanzien wie z.B. Diphtherietoxin, Tetanustoxin und Pertussistoxin können vor der Verwendung, beispielsweise durch Behandlung mit Formaldehyd, inaktiviert werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt ein Verfahren zur Verfügung, um ein Schwein vor einer Infektion gegen ein Virus zu schützen, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Vakzine, welche eine immunologische Antwort auf ein solches Virus hervorruft, an ein Schwein, das einen Bedarf für einen Schutz vor einer Infektion durch ein solches Virus aufweist, umfasst. Mit „Schützen eines Schweins vor einer Infektion" gegen ein Atemwegs- und Reproduktionsvirus bei Schweinen oder ein infektiöses Agens ist gemeint, dass nach Verabreichung der vorliegenden Vakzine an ein Schwein, das Schwein verminderte (weniger schwere) oder keine klinischen Symptome (wie z.B. Fieber), die mit der entsprechenden Erkrankung verbunden sind, in Bezug auf Kontroll-(infizierte) Schweine zeigt. Die klinischen Symptome können quantifiziert (z.B. Fieber, Antikörperanzahl und/oder Lungenläsionen) oder halb quantifiziert (z.B. Schwere der Atemnot) werden.
Ein System zur Messung der Atemnot bei betroffenen Schweinen ist von den gegenwärtigen Erfindern entwickelt worden. Das vorliegende klinische Atmungsbewertungssystem wertet die Atemnot von betroffenen Schweinen über die folgende Skala aus:

0: = keine Erkrankung; normales Atmen
1: = schwache Dyspnoe und Polypnoe, wenn die Schweine belastet werden (gezwungen mit größeren Volumina und/oder mit beschleunigter Geschwindigkeit zu atmen)
2: = schwache Dyspnoe und Polypnoe, wenn sich die Schweine in Ruhe befinden
3: = mäßige Dyspnoe und Polypnoe, wenn die Schweine belastet werden
4: = mäßige Dyspnoe und Polypnoe, wenn sich die Schweine in Ruhe befinden
5: = schwere Dyspnoe und Polypnoe, wenn die Schweine belastet werden
6: = schwere Dyspnoe und Polypnoe, wenn sich die Schweine in Ruhe befinden

Bei dem vorliegenden klinischen Atmungsbewertungssystem ist ein Wert von „0" normal und zeigt, dass das Schwein nicht von einer Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen betroffen ist. Ein Wert von „3" zeigt eine mäßige Atemwegserkrankung, und ein Wert von „6" zeigt eine sehr schwere Atemwegserkrankung. Eine Menge der vorliegenden Vakzine oder Zusammensetzung kann als wirksam betrachtet werden, wenn eine Gruppe von herausgeforderten Schweinen, denen die Vakzine oder Zusammensetzung gegeben wird, einen niedrigeren durchschnittlichen klinischen Atmungswert zeigt als eine Gruppe von identisch herausgeforderten Schweinen, denen die Vakzine oder Zusammensetzung nicht gegeben wurde. (Ein Schwein wird als „herausgefordert" betrachtet, wenn es einer Konzentration eines infektiösen Agens ausgesetzt wird, die ausreicht, um in einem nicht vakzinierten Tier eine Erkrankung hervorzurufen.)
Vorzugsweise wird die vorliegende Vakzinezusammensetzung direkt einem Schwein verabreicht, das bisher noch keinem Virus ausgesetzt wurde, welches eine Reproduktions- oder Atemwegserkrankung hervorruft. Die vorliegende Vakzine kann oral oder parenteral verabreicht werden. Beispiele für parenterale Wege der Verabreichung beinhalten intradermale, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, subkutane und intranasale Wege der Verabreichung.
Wenn sie als eine Lösung verabreicht wird, kann die vorliegende Vakzine in der Form einer wässrigen Lösung, eines Sirups, eines Elixiers oder einer Tinktur hergestellt werden. Solche Formulierungen sind im Stand der Technik bekannt und werden hergestellt durch Lösen des Antigens und anderer geeigneter Zusätze in den geeigneten Lösungsmittelsystemen. Solche Lösungsmittel beinhalten Wasser, Salzlösung, Ethanol, Ethylenglycol, Glycerol, A1-Fluid usw. Geeignete Zusätze, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten zertifizierte Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Süßstoffe und antimikrobielle Konservierungsmittel wie z.B. Thimerosal (Natriumethylmercurithiosalicylat). Solche Lösungen können beispielsweise durch Zugabe von partiell hydrolysierter Gelatine, Sorbitol oder Zellkulturmedium stabilisiert werden und können durch Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, gepuffert werden, indem Reagenzien, die im Stand der Technik bekannt sind, wie z.B. Natriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat und/oder Kaliumdihydrogenphosphat verwendet werden.
Flüssige Formulierungen können ebenfalls Suspensionen und Emulsionen einschließen. Die Herstellung von Suspensionen, beispielsweise unter Verwendung einer Kolloidmühle, und Emulsionen, beispielsweise unter Verwendung eines Homogenisators, ist im Stand der Technik bekannt.
Parenterale Dosierungsformen, die zur Injektion in Körperflüssigkeitssysteme bestimmt sind, erfordern die richtige Isotonie und pH-Pufferung auf die entsprechenden Niveaus der Körperflüssigkeiten der Schweine. Parenterale Formulierungen müssen ebenfalls vor der Verwendung sterilisiert werden.
Die Isotonie kann nach Bedarf mit Natriumchlorid und anderen Salzen eingestellt werden. Andere Lösungsmittel wie z.B. Ethanol oder Propylenglycol können verwendet werden, um die Löslichkeit von Bestandteilen der Zusammensetzung und die Stabilität der Lösung zu erhöhen. Weitere Zusätze, welche in der vorliegenden Formulierung verwendet werden können, beinhalten Dextrose, herkömmliche Antioxidantien und herkömmliche Chelatbildner wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Vakzine, welches die folgenden Schritte umfasst:

(A) Sammeln einer ausreichend großen Probe eines Virus nach Anspruch 1 und
(B) Behandeln des Virus in einer Weise, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus (i) dem Plaqueaufreinigen des Virus, (ii) dem Erhitzen des Virus bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer, die ausreichend sind, um das Virus zu deaktivieren, (iii) dem Exponieren an oder Mischen des Virus mit eine(r) Menge einer inaktivierenden Chemikalie, die ausreichend ist, um das Virus zu inaktivieren, (iv) dem Aufbrechen des Virus in seine entsprechenden Untereinheiten und dem Isolieren wenigstens einer der Untereinheiten, und (v) dem Synthetisieren oder Isolieren einer Polynukleinsäure, die ein Oberflächenprotein des Virus codiert, dem Infizieren einer geeigneten Wirtszelle mit der Polynukleinsäure, dem Kultivieren der Wirtszelle und dem Isolieren des Oberflächenproteins aus der Kultur.

Vorzugsweise wird das Virus aus einem Kulturmedium gesammelt durch die Schritte (i) des Ausfällens infizierter Wirtszellen, (ii) des Lysierens der ausgefällten Zellen und (iii) des Zentrifugierens des Virus vor dem anschließenden Behandlungsschritt. Besonders bevorzugt werden die Wirtszellen, die mit dem Virus infiziert sind, vor dem Sammeln in einem geeigneten Medium kultiviert.
Vorzugsweise werden nach dem Kultivieren von infizierten Wirtszellen die infizierten Wirtszellen ausgefällt, indem eine Lösung eines herkömmlicherweise verwendeten Poly(ethylenglycols) (PEG) zu dem Kulturmedium in einer Menge, die ausreicht, um die infizierten Zellen auszufällen, zugegeben wird. Die ausgefällten infizierten Zellen können durch Zentrifugation weiter gereinigt werden. Die ausgefällten Zellen werden dann durch Verfahren lysiert, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Vorzugsweise werden die Zellen durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen lysiert (drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen sind besonders bevorzugt). Das Lysieren der ausgefällten Zellen setzt das Virus frei, welches dann, vorzugsweise durch Zentrifugation, gesammelt werden kann. Das Virus kann durch Zentrifugieren in einem CsCl-Gradienten isoliert und gereinigt werden, wobei dann die geeignete das Virus enthaltende Bande aus dem CsCl-Gradienten gewonnen wird.
Alternativ kann die infizierte Zellkultur eingefroren und aufgetaut werden, um die Zellen zu lysieren. Das eingefrorene und aufgetaute Zellkulturmaterial kann direkt als eine Lebendvakzine verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch das eingefrorene und aufgetaute Zellkulturmaterial lyophilisiert (zur Lagerung) und dann zur Verwendung als eine Vakzine rehydratisiert.
Die Kulturmedien können gepufferte Salzlösung, essentielle Nährstoffe und geeignete Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die im Stand der Technik anerkannt sind, in Konzentrationen enthalten, die ausreichen, um ein Wachstum von virusinfizierten Zellen zu erlauben. Geeignete Kulturmedien beinhalten Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM), Eagle's Minimal Essential Medium (MEM), Ham's Medium, Medium 199, fötales Rinderserum, fötales Kalbsserum und andere äquivalente Medien, welche das Wachstum von virusinfizierten Zellen unterstützen. Das Kulturmedium kann mit fötalem Rinderserum (bis zu 10%) und/oder L-Glutamin (bis zu 2 mM) oder anderen geeigneten Zusätzen wie z.B. herkömmlichen Wachstumszusätzen und/oder Antibiotika ergänzt werden. Ein bevorzugtes Medium ist DMEM.
Vorzugsweise wird die vorliegende Vakzine aus einem Virus hergestellt, das in einer geeigneten Zelllinie kultiviert wird. Die Zelllinie ist vorzugsweise PSP-36 oder eine äquivalente Zelllinie, die in der Lage ist, mit dem Virus infiziert und kultiviert zu werden. Ein Beispiel für eine Zelllinie, die zu PSP-36 äquivalent ist, ist die Zelllinie PSP-36-SAH, die unter dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawen Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 28. Oktober 1992 unter der Hinterlegungsnummer CRL 11171 hinterlegt wurde. Eine andere äquivalente Zelllinie ist MA-104, die im Handel von der Whittaker Bioproducts, Inc. (Walkersville, Maryland) erhältlich ist. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass das infektiöse Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, in Nasenmuschelzellen (turbinate cells) von Schweinen kultiviert werden kann. Nach Plaquereinigung erzeugt das infektiöse Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, die Läsionen, die unter der Überschrift „Iowa" in Tabelle I oben charakterisiert wurden und in den 5–8 gezeigt sind.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Kultivierung des Virus der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in einer Zelllinie, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus PSP-36 und äquivalenten Zelllinien, die in der Lage sind, mit dem Virus infiziert und kultiviert zu werden. Das Verfahren zur Kultivierung eines Virus oder infektiösen Agens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Infizieren der Zelllinie PSP-36 oder einer äquivalenten Zelllinie, die in der Lage ist, mit einem Virus oder infektiösen Agens infiziert zu werden, das eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, und kultiviert zu werden, und das Kultivieren der infizierten Zelllinie in einem geeigneten Medium.
Die Zelllinie MA-104 wird aus Affennierenzellen erhalten und ist epithelähnlich. MA-104-Zellen bilden eine konfluente Einzelschicht in Kulturkolben, die Dulbecco's Minimal Essential Medium und 10% FBS (fötales Rinderserum) enthalten. Wenn die Einzelschicht gebildet ist, werden die Zellen mit einer Probe von 10% homogenisiertem Gewebe inokuliert, das aus einem geeigneten Gewebe (wie z.B. Lunge und/oder Herz) eines infizierten Schweins entnommen wurde. Vorzugsweise liegen geeignete Antibiotika vor, um ein Wachstum von Virus und Wirtszellen zu erlauben und um das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit von Zellen außer den Wirtszellen (z.B. Bakterien oder Hefe) zu unterdrücken.
Sowohl PSP-36- als auch MA-104-Zellen lassen einige Isolate des PRRS-Virus zu hohen Titern wachsen (über 10⁷ TCID₅₀/ml). PSP-36- und MA-104-Zellen werden ebenfalls das infektiöse Agens wachsen lassen, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist. MA-104-Zellen sind ebenfalls in der Lage, Rotaviren, Polioviren und andere Viren wachsen zu lassen.
Von CL2621-Zellen wird angenommen, dass sie nicht von Schweinen abstammen und epithelähnlich sind, und diese sind proprietär (Boehringer-Mannheim). Im Gegensatz zu PSP-36 und MA-104 sind einige Proben des Virus, welches PRRS hervorruft, in CL2621-Zellen erfolglos kultiviert worden (Bautista et al, American Association of Swine Practitioners Newsletter, 4: 32, 1992).
Die Hauptkennzeichen von CL2621 sind, dass diese nicht von Schweinen abstammen und epithelähnlich sind, wobei sie in MEM-Medium wachsen. Jedoch haben Benfield et al (J. Vet. Diagn. Invest., 1992; 4: 127–133) berichtet, dass CL2621-Zellen verwendet wurden, um das PRRS-Virus zu vermehren, aber MA-104-Zellen verwendet wurden, um die Vermehrung des Poliovirus zu steuern, woraus sie folgerten, dass CL2621 nicht dasselbe ist wie MA-104, und dass dieselbe Zelle nicht beide Viren vermehren kann.
Das infektiöse Agens, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden ist, kann im Allgemeinen nicht in Zelllinien wachsen, die von PSP-36, PSP-36-SAH und MA-104 verschieden sind. Wie oben beschrieben ist jedoch von einigen Viren, die PRRS hervorrufen, berichtet worden, dass sie sowohl in CL2621 als auch primären Alveolarmakrophagen von Schweinen wachsen, obwohl einige Stämme des PRRS-Virus nicht in PSP-36-, MA-104- oder CL2621-Zellen wachsen.
Die vorliegende Vakzine kann verwendet werden, um Antikörper herzustellen, welche einem Patienten (in diesem Fall einem Schwein), der einem Virus oder einem infektiösen Agens ausgesetzt ist, eine immunologische Resistenz verleihen können. Antikörper, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, binden immunologisch entweder an (1) eine Vakzine, welche ein Schwein vor einem Virus oder infektiösen Agens, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung hervorruft, schützt oder (2) an das Atemwegs- und Reproduktionsvirus von Schweinen oder das infektiöse Agens selbst. Die vorliegenden Antikörper weisen ebenfalls einen Nutzen als ein diagnostisches Mittel, um zu bestimmen, ob ein Schwein einem Atemwegs- und Reproduktionsvirus oder einem infektiösen Agens ausgesetzt wurde, und bei der Herstellung der vorliegenden Vakzine auf. Der Antikörper kann verwendet werden, um durch bekannte Verfahren eine Immunaffinitätssäule herzustellen, und die Immunaffinitätssäule kann verwendet werden, um das Virus oder infektiöse Agens oder ein Protein davon zu isolieren.
Um Antikörper gegen solche Vakzinen oder Viren hervorzurufen, muss man ein geeignetes Wirtstier wie z.B. eine Maus, ein Kaninchen oder andere Tiere, die für eine solche Inokulation verwendet werden, mit dem Protein, das verwendet wird, um die Vakzine herzustellen, immunisieren. Das Wirtstier wird dann mit einem der oben beschriebenen Typen der Vakzinen immunisiert (injiziert), wobei gegebenenfalls ein immuhverstärkendes Mittel (Adjuvanz) wie z.B. jene, die oben beschrieben wurden, verabreicht wird. Das Wirtstier wird vorzugsweise anschließend von 1 bis 5mal in gewissen Zeitintervallen, vorzugsweise alle 1 bis 4 Wochen, am meisten bevorzugt alle 2 Wochen, immunisiert. Die Wirtstiere werden dann geopfert, und ihr Blut wird gesammelt. Serum wird dann durch bekannte Techniken aus dem gesammelten Vollblut abgetrennt. Das Serum enthält Antikörper gegen die Vakzinen. Antikörper können ebenfalls durch bekannte Verfahren gereinigt werden, um Immunglobulin G (IgG)-Antikörper zu liefern.
Die vorliegende Offenbarung stellt ebenfalls monoklonale Antikörper gegen die vorliegenden Vakzinen und/oder Viren bereit. Monoklonale Antikörper können durch das Verfahren von Köhler et al (Nature, Bd. 256 (1975), Seiten 495–497) erzeugt werden. Im Grunde werden die Immunzellen aus einer Ganzzellpräparation der Milz des immunisierten Wirtstieres (oben beschrieben) mit Myelomzellen durch ein herkömmliches Vorgehen verschmolzen, um Hybridome zu erzeugen. Die Hybridome werden kultiviert, und die resultierende Kulturflüs sigkeit wird gegen die Flüssigkeit oder das Inokulum, welches das infektiöse Agens (Virus oder Vakzine) trägt, gescreent. Die Einführung des Hybridoms in den Bauchraum des Wirtstieres erzeugt ein peritoneales Wachstum des Hybridoms. Die Sammlung der Aszitesflüssigkeit des Wirtstieres liefert eine Probe des monoklonalen Antikörpers gegen das infektiöse Agens, der von dem Hybridom erzeugt wird. Ebenso kann Überstand von der Hybridomzellkultur als eine Quelle des monoklonalen Antikörpers verwendet werden, welcher durch Verfahren isoliert wird, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Vorzugsweise gehört der vorliegende Antikörper zum Immunglobulintyp IgG oder IgM.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Schweins, das an einer Atemwegs- und Reproduktionserkrankung leidet, wird hierin ebenfalls offenbart. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers, welcher immunologisch an ein Virus, welches eine Atemwegs- und Reproduktionserkrankung bei Schweinen hervorruft, oder eine Vakzine, welche ein Schwein vor einer Infektion durch ein Atemwegs- und Reproduktionsvirus von Schweinen schützt, bindet, in einem physiologisch verträglichen Träger an ein Schwein, das dessen bedarf.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen diagnostischen Kit zur Untersuchung eines Virus, das eine Atemwegserkrankung bei Schweinen, eine Reproduktionserkrankung bei Schweinen oder eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, umfassend den vorliegenden oben beschriebenen Antikörper und ein diagnostisches Mittel, das eine positive immunologische Reaktion mit dem Antikörper anzeigt.
Der vorliegende diagnostische Kit basiert vorzugsweise auf Modifikationen an bekannten Immunfluoreszenztest (IFA)-, Immunperoxidasetest (IPA)- und enzymverknüpfter Immunsorbenstest (ELISA)-Verfahren.
Beim IFA werden infizierte Zellen mit Aceton und Methanollösungen fixiert, und Antikörper für die Rekonvaleszentenseren von infizierten Schweinen werden mit den infizierten Zellen, vorzugsweise für ca. 30 min bei 37°C, inkubiert. Eine positive immunologische Reaktion ist eine, bei welcher der Antikörper an die virusinfizierten Zellen bindet, aber nicht durch die anschließenden Waschschritte (gewöhnlich 3 × mit PBS-Puffer) herausgewaschen wird. Ein zweiter Antikörper (ein anti-Antikörper), der mit einem fluoreszierenden Reagens (FITC) markiert ist, wird dann zugegeben und, vorzugsweise für weitere 30 min, inkubiert. Eine positive immunologische Reaktion führt zu der Bindung des zweiten Antikörpers an den ersten, der nach dem Waschen zurückgehalten wird, und führt zu einem fluoreszierenden Signal, welches nachgewiesen und halb quantifiziert werden kann. Eine negative immunologi sche Reaktion führt zu einer geringen oder keiner Bindung des Antikörpers an die infizierte Zelle. Daher bindet der zweite, fluoreszenzmarkierte Antikörper nicht, die fluoreszierende Markierung wird ausgewaschen, und eine geringe oder keine Fluoreszenz wird nachgewiesen, im Vergleich zu einer geeigneten positiven Kontrolle.
IPA- und ELISA-Kits sind ähnlich zu dem IFA-Kit, außer dass der zweite Antikörper mit einem spezifischen Enzym anstelle eines fluoreszierenden Reagenzes markiert ist. So gibt man ein geeignetes Substrat für das Enzym, das an den zweiten Antikörper gebunden ist, zu, was zu der Erzeugung eines gefärbten Produkts führt, welches dann z.B. durch Kolorimetrie nachgewiesen und quantifiziert wird.
Andere Merkmale der Erfindung werden im Verlauf der folgenden Beschreibungen von beispielhaften Ausführungsformen deutlich werden, welche zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden und nicht dazu gedacht sind, diese zu beschränken.
EXPERIMENT 1
In Beispiel 1 wurde ein Fall von endemischer Pneumonie bei 5–8 Wochen alten Schweinen untersucht. Mikroskopische Läsionen des Iowa-Stamms von PRRSV, die bei den Schweinen beobachtet wurden, waren mit einer viralen Ätiologie vereinbar. (Dementsprechend werden sich, um die Diskussion zu vereinfachen, im Folgenden die Begriffe "Virus" und "viral" auf ein Virus oder infektiöses Agens in der für die vorliegende Anmeldung oben beschriebenen Bedeutung oder eine Eigenschaft von diesen beziehen.). Die Erkrankung wurde experimentell auf konventionelle und gnotobiotische Schweine übertragen, indem ein Lungenhomogenat verwendet wurde, das aus infizierten Schweinen isoliert wurde, welches durch einen 0,22 μm-Filter filtriert wurde. Gewöhnliche virale Atemwegspathogene von Schweinen wurden nicht gezeigt. Zwei Typen von Viruspartikeln wurden in der Zellkultur mit dem Elektronenmikroskop beobachtet. Ein Typ wies ca. 70 nm im Durchmesser auf, war umhüllt und wies kurze Oberflächenspikes auf. Der andere Typ war umhüllt, länglich, pleomorph, maß 80 × 320 nm und war mit Antikörpern beschichtet.
(I) MATERIALIEN UND METHODEN
(A) Material aus Schweinen, die mit natürlich vorkommender Pneumonie infiziert waren
Gewebe aus drei infizierten 6 Wochen alten Schweinen aus einer Ferkel-bis-Mast-schwein-Herde (farrow-to-feeder-pig herd) mit 900 Sauen im Südwesten Iowas wurden gesammelt und untersucht. Frühere Beobachtungen der Herde zeigten, dass fünf bis sieben Tage nach der Entwöhnung 50–70% der in ähnlicher Weise infizierten Schweine anorektisch wurden, ein raues Fell aufwiesen und Lethargie, Husten, Fieber und "Pochen" erfuhren. Ungefähr 10–25% der infizierten Schweine wiesen eine Konjunktivitis auf. Die meisten der infizierten Schweine erholten sich in 7–10 Tagen, aber 10–15% waren aufgrund von sekundären bakteriellen Infektionen schwer beeinträchtigt und waren nicht zum Verkauf als Mastschweine geeignet. Eine Reproduktionsstörung der Schweine, einschließlich erhöhter Totgeburten, mumifizierter Föten und Unfruchtbarkeit, war zu der Zeit des ursprünglichen Ausbruchs der Krankheit in dieser Herde aufgetreten, verschwand aber später im Laufe der Zeit. Eine Atemwegserkrankung war in der Stillphase persistent.
Lungenläsionen, die durch proliferative Bronchiolitis und Alveolitis gekennzeichnet waren, wurden in mit Formalin fixierten Geweben aus vier verschiedenen 6 Wochen alten Schweinen beobachtet. Versuche, SIV, Pseudorabiesvirus (PRV) und Enzephalomyokarditisvirus (EMCV) zu isolieren, waren nicht erfolgreich. Eine Immunfluoreszenzuntersuchung von gefrorenen Schnitten der Lunge im Hinblick auf Schweineinfluenzavirus (SIV), Pseudorabiesvirus (PRV) und Mycoplasma hyopneumoniae war negativ. Pasteurella multocida Typ D wurde aus den Nasenhöhlen isoliert, und Haemophilus parasuis wurde aus den Lungen isoliert. Fünf akut betroffene 5–6 Wochen alte Schweine, welche für 10 Tage entwöhnt worden waren, wurden anschließend aus der Herde erhalten. Alle Schweine hatten Fieber mit wenigstens 40,5°C. Die Schweine wurden nekropsiert, und Lugengewebeproben aus dem Schwein mit makroskopischen Läsionen, die für eine virale Pneumonie sehr typisch waren, wurden gesammelt und zur unmittelbaren Inokulation in konventionelle spezielle pathogenfreie (SPF) Schweine vorbereitet. Lungen-, Leber-, Nieren-, Milz-, Gehirn- und Herzgewebeproben aus allen fünf akut betroffenen 5–6 Wochen alten Schweinen wurden im Hinblick auf häufige bakterielle und virale Pathogene kultiviert. Schnitte derselben Gewebe wurden gesammelt und in 10% neutral gepuffertem Formalin für eine histopathologische Untersuchung fixiert.
(B) Experimentelle Übertragung in konventionelle Schweine
(1) Versuchsschweine
Sechzehn fünf Wochen alte Schweine wurden aus einer Herde erhalten, die frei von Mycoplasmen, PRV, Atemwegs-Coronavirus von Schweinen (PRCV) und übertragba rem Gastroenteritisvirus (TGEV) waren. Acht Schweine wurden in jedem von zwei isolierten 4 × 5 Meter-Räumen mit Betonböden und automatischer Belüftung platziert. Die Schweine wurden mit einer 18% Protein-Mais-Sojabohnenmehl-Ration und Wasser ad libitum gefüttert.
(2) Versuchsgestaltung
Unmittelbar nach der Nekropsie der Schweine mit natürlich vorkommender Pneumonie wurde ein 10%-iges Lungenhomogenat in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Minimal Essential Medium hergestellt, bei 1000 × g für 10 Minuten aufgeklart, worauf eine Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten folgte. Der aufgeklarte Überstand wurde durch einen 0,22 μm-Filter filtriert. Acht Schweine wurden intranasal mit 5 ml des filtrierten Lungenhomogenats inokuliert. Acht Kontrollschweine wurden intranasal mit 5 ml von filtrierten Lungenhomogenat inokuliert, das wie oben beschrieben aus einem normalen nicht infizierten gnotobiotischen Schwein hergestellt wurde.
Klinische Anzeichen und die Temperaturen wurden überwacht und täglich aufgezeichnet. Ein Schwein aus jeder Gruppe wurde nach 5, 7, 10 bzw. 15 Tagen nach der Inokulation (DPI) eingeschläfert und nekropsiert. Gewebe wurden zur Zeit der Nekropsie für aerobe und anaerobe bakterielle Isolationsverfahren, Mycoplasmaisolation, Nachweis von Antigenen für Mycoplasma hyopneumoniae, SIV, PRV, Parainfluenzavirus Typ 3 (PI-3) und respiratorisches Synzytialvirus von Rindern (BRSV) und zur Virusisolation gesammelt. Die Gewebe wurden zur histopathologischen Untersuchung in 10%-igem neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Lungen wurden zur Zeit der Nekropsie durch Füllen mit Formalin fixiert.
(C) Experimentelle Übertragung in gnotobiotische Schweine
(1) Versuchsschweine
Acht kolostrumarme, durch Kaiserschnitt geborene (CDCD), gekreuzte, einen Tag alte gnotobiotische Schweine wurden zufällig auf zwei Isolatoren verteilt (4 Schweine in jedem Isolator). Die Schweine wurden mit einem sterilisierten, flüssigen Milchersatz mit erhöhtem Eisengehalt aus der Dose gefüttert (SPF-LAC, Pet-Ag Inc, Elgin, Illinois.)
(2) Versuchsgestaltung
Vier Hauptschweine (principal pigs) wurden mit filtriertem (0,22 μm) Lungenhomogenat intranasal (3 ml) und oral (1 ml) im Alter von 3 Tagen inokuliert. Dieses Filtrat wurde aus einer experimentell infizierten konventionellen Schweinelunge hergestellt, welche 7 Tage nach der Infektion (DPI) gesammelt worden war. Vier Kontrollschweine wurden mit Lungenhomogenatinokuliert, das aus einem normalen gnotobiotischen Schwein hergestellt wurde.
Ein Schwein aus jeder Gruppe wurde nach 5, 9, 28 bzw. 35 DPI getötet. Lunge, Leber, Niere, Gehirn, Milz, Thymus, Nasenmuscheln, Herz und Darm wurden gesammelt und zur histopathologischen Untersuchung in 10%-igem neutralem gepufferten Formalin fixiert. Lunge, Gehirn, Milz und Herz wurden zur Virusisolation gesammelt. Lunge, Leber und Milz wurden zur bakteriologischen Isolation gesammelt. Lunge wurde zur Mycoplasmaisolation unmittelbar in Friis-Medium gesammelt oder wurde bei –70°C eingefroren.
(D) Mikrobiologische Tests
(1) Virusisolation
Gewebesuspensionen (10% w/v), die bei 1000 × g aufgeklart wurden, wurden auf Zelleinzelschichten inokuliert und im Hinblick auf eine zytopathische Wirkung untersucht. Primäre fötale Schweinenierenkulturen, primäre Alveolarmakrophagenkulturen von Schweinen und etablierte Zelllinien von PK15, Rindernasenmuschel, Baby-Hamster-Niere (BHK), Vero und Schweinetestes (ST) wurden für die Virusisolationsversuche verwendet. Direkte Bronchioalveolarspülungskulturen wurden aus infizierten und als Kontrolle dienenden gnotobiotischen Schweinen hergestellt. Versuche, das Virus nachzuweisen, wurden durch indirekte Immunfluoreszenz durchgeführt, indem als Referenz gnotobiotisches Hyperimmun- oder Rekonvaleszentenschweineserum gegen das Schweineparvovirus (PPV), SIV, das Rindervirendiarrhövirus, das hämaglutinierende Enzephalomyelitisvirus (HEV), TGEV und EMCV verwendet wurde. Die Filtrate wurden dreimal durch intra-allantoische Inokulation von 10 Tage alten embryonierten Hühnereiern blind passagiert, und die Allantoisflüssigkeit nach jeder Passage auf hämagglutinierende Aktivität getestet.
(2) Mycoplasmaisolation
Lungensuspensionen wurden in Mycoplasmanährmedium Friis (Friis (1975), Acta Vet. Scand., 27, 337), BHI-TS, D-TS (Ross et al (1971), Journal of Bacteriology, 103, 707) und BHL (Yamamoto et al (1982), Proc. Int. Pig Vet. Society Congress, S. 94) inokuliert. Die Kulturen wurden passagiert, wenn Wachstum sichtbar war, oder am Tag 3, 7, 14 und 21 und durch Epiimmunfluoreszenz identifiziert (Del Giudice et al (1967), Journal of Bacteriology, 93, 1205).
(3) Bakterienisolation
Nasenmuschelabstriche wurden auf zwei Blutagarplatten wie auch auf MacConkey-, Tergitol-7- und PMD (zur Isolation von P. multocida)-Agar inokuliert. Eine der Blutagarplatten wurde bei 37°C in einer anaeroben Umgebung von CO₂ und H₂ inkubiert. Die zweite Platte wurde mit einer Nährkolonie von Staphylococcus epidermidis kreuzweise ausgestrichen und mit den anderen Platten in Luft bei 37°C inkubiert.
Lungen wurden genauso wie die Nasenmuschelabstriche plattiert. Leber und Milz wurden auf 2 Blutagarplatten (aerob und anaerob) und einer Tergitol-7-Platte kultiviert. Alle Bakterienisolate wurden durch Standardverfahren identifiziert (Biberstein (1990), in: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, Herausg. Carter et al, 5. Ausg., Seiten 129–142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.; und Carter (1990) in: Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, Herausg. Carter G.R. und Cole J.R., 5. Ausg., Seiten 129–142, Academic Press Inc., San Diego, Cal.).
(4) Serologie
Der Serumneutralisationstest wurde verwendet, um auf Serumantikörper gegen PRV, TGEV und EMCV zu testen. Der Hämagglutinierungsinhibitionstest wurde verwendet, um auf Serumantikörper gegen EMCV und HEV zu testen. Der indirekte Immunfluoreszenztest wurde verwendet, um Serumantikörper gegen BRSV, PI-3, SIV und TGEV nachzuweisen. Gnotobiotische Seren wurden auf Antikörper gegen PRRSV getestet. Ein indirekter Immunfluoreszenztest unter Verwendung der Zelllinie CL2621 wurde zum Nachweis von PRRSV-Antikörpern verwendet.
(II) ERGEBNISSE
(A) Natürlich vorkommende Pneumonie
Die Lungen von akut betroffenen Schweinen kollabierten nicht. Makroskopisch wiesen die Lungen ein mäßiges interlobuläres Ödem und multifokale bis verschmelzende lineare Bereiche von Atelektase, die alle Lungenflügel betraf, auf. Es gab 5–15% einer kranioventralen Konsolidierung der kranialen und mittleren Flügel.
Die histopathologische Untersuchung zeigte eine mäßige akute diffuse proliferative Bronchiolitis und Alveolitis. Es gab eine schwache multifokale lymphoplasmazytische Myokarditis. In anderen Organen wurden keine Läsionen beobachtet.
Virusisolationsversuche im Hinblick auf Adenovirus, PRV, SIV, HEV, Atemwegs-Coronavirus von Schweinen (PRCV), Schweineparvovirus (PPV), EMCV und Enteroviren waren negativ bei der ursprünglichen Einreichung des Falls wie auch bei den akut betroffenen Schweinen, die später aus der Herde erhalten wurden. Die Immunfluoreszenzuntersuchung von Schnitten eingefrorener Lunge zeige keine Antigene von Mycoplasma hyopneumoniae, SIV, respiratorischem Synzytialvirus von Rindern (BRSV), Parainfluenzavirus-3 (PI-3), PRV oder TGEV.
Serum von einem der fünf konventionellen SPF-Schweine aus Abschnitt (I) (A) oben ergab eine positive immunologische Reaktion bei einer Verdünnung von 1:20 für PRRSV durch indirekte Immunfluoreszenz. Pasteurella multocida Typ D und Haemophilus parasuis wurden aus den Nasenmuscheln bzw. der Lunge dieses Schweins isoliert. Keine aeroben oder anaeroben Bakterien wurden aus der akut betroffenen Schweinelunge isoliert, die zur Homogenisierung und für das Inokulum ausgewählt wurde (siehe Methoden und Materialien Abschnitt (C) (2) oben).
(B) Untersuchung an konventionellen Schweinen
Nach 7 DPI wiesen alle Hauptschweine Fieber von 40–41,1°C auf und erfuhren eine mäßige Atemnot. Die Schweine waren anorektisch und lethargisch. Nach 15 DPI hatten sich die Schweine erholt.
Makroskopische Veränderungen in den Lungen waren gekennzeichnet durch das Versagen zu kollabieren, ein schwaches interlobuläres Ödem und bräunlich-graue lineare Bereiche von Atelektase, die multifokal von 20–40% der Lunge betrafen.
Die mikroskopische Untersuchung von 7 DPI-Lungen zeigte eine ungleichmäßige interstitielle Pneumonie, die gekennzeichnet war durch Typ II-Pneumozytenproliferation, Akkumulation von gemischten entzündlichen Zellen und nekrotischen Zelltrümmern in den Alveolarlumen und Infiltration von Makrophagen und Lymphozyten in Alveolarsepten. Alveolarlumen enthielten eine proteinartige Flüssigkeit. Gelegentlich wurden synzytiumähnliche Zellen innerhalb von Alveolarlumen und entlang von Septen beobachtet.
5 zeigt einen histologischen Schnitt aus der Lunge eines konventionellen Schweins 10 DPI unter Verwendung einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Es gibt eine intensive Typ II-Pneumozytenproliferation (Pfeil) und nekrotische Zelltrümmer in Alveolarräumen (Pfeilspitzen). Der Zustand und das Erscheinungsbild der Läsionen, die am Tag 10 beobachtet wurden, waren ähnlich zu denen, die am Tag 7 beobachtet wurden.
6 zeigt einen zweiten histologischen Schnitt aus der Lunge eines konventionellen Schweins 10 DPI unter Verwendung einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Synzytiumähnliche Zellen (Pfeile) liegen in Alveolarräumen vor. Eine ausgeprägte Typ II-Pneumozytenproliferation und mehr Synzytien werden am Tag 10 als am Tag 7 beobachtet.
Die Läsionen waren nach 15 DPI immer noch mäßig schwer, auch wenn die Schweine klinisch normal erschienen. Keine Bakterien oder Mycoplasmen wurden aus den Lungen isoliert. Virusisolationsversuche im Hinblick auf EMCV, PRV, PRCV, Adenovirus und SIV waren negativ. Eine Immunfluoreszenzuntersuchung von Schnitten eingefrorener Lunge zeigte keine BRSV-, PI-3-Virus-, PRV-, SIV-, TGEV- oder Mycoplasma hyopneumoniae-Antigene.
Keine makroskopischen oder mikroskopischen Läsionen wurden bei den Kontrollschweinen beobachtet.
(C) Untersuchung von gnotobiotischen Schweinen
Alle inokulierten Hauptschweine erfuhren schwere Atemnot und "Pochen" nach 5 DPI. Die Temperaturen waren 40,5°C oder größer, und die Schweine waren anorektisch und lethargisch. Die Schweine waren nach 8 DPI klinisch verbessert und schienen nach 15 DPI klinisch normal. Keine Schweine starben. Kontrollschweine, die mit normalem Lungenhomogenatfiltrat inokuliert wurden, blieben klinisch normal.
Makroskopische Läsionen nach 5 DPI waren gekennzeichnet durch eine Lunge, die versagte zu kollabieren, schwache multifokale bräunlich-rote Atelektase und ein schwaches interlobuläres Ödem.
Mikroskopisch gab es eine schwache diffuse interstitielle Pneumonie mit multifokalen Bereichen einer mononuklearen Zellinfiltration von alveolaren Septen und eine mäßige Typ II-Pneumozytenproliferation. Es gab eine Akkumulation von entzündlichen Zellen, nekrotischen Zelltrümmern und proteinartiger Flüssigkeit in Alveolarlumen. In anderen Organen wurden keine Läsionen beobachtet.
Nach 9 DPI versagte die Lunge zu kollabieren, wies ein mäßiges interlobuläres Odem und multifokale 1–3 cm-Bereiche einer festen bräunlich-roten Atelektase auf. 7 zeigt einen histologischen Schnitt aus der Lunge eines gnotobiotischen Schweins nach 9 DPI unter Verwendung einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Es gibt eine mäßige Typ II-Pneumozytenproliferation (Pfeilspitzen) und eine synzytiumähnliche Zellbildung (Pfeile). Mikroskopisch waren die Läsionen ähnlich zu denen, die am Tag 5 DPI beobachtet wurden, außer dass die Typ II-Pneumozytenproliferation ausgeprägter war und es mäßige Zahlen von synzytiumähnlichen Zellen entlang Alveolarsepten und in Lumen gab. Die Niere wies erweiterte Nierentubuli auf, von denen einige ein lymphoplasmazytisches Exudat und Zelltrümmer enthielten.
Nach 28 DPI gab es 20% einer kranioventralen bilateralen Atelektase, welche die apikalen und mittleren Flügel traf, mit fokalen 1–2 cm-Bereichen an Atelektase in anderen Flügeln. Mikroskopisch waren die Lungenläsionen ähnlich zu denen, die nach 9 DPI beobachtet wurden, aber zusätzlich gab es eine schwache peribronchiolare und periarteriolare lymphoplasmazytische Akkumulation. Schwache bis mäßige Infiltrate von Lymphozyten und Plasmazellen waren multifokal in dem Hirnplexus, Meninges, Myokard und den Nasenmuscheln vorhanden.
8 zeigt, dass nach 35 DPI die Lungenläsionen weniger schwer waren, aber die multifokale lymphoplasmazytische Myokarditits ausgeprägt war. Virusisolationsversuche im Hinblick auf PRV, SIV, Adenovirus, EMCV, HEV, PPV, Enteroviren und PRCV waren nicht erfolgreich. Eine zytopathische Wirkung wurde in Schweinealveolarmakrophagen beobachtet, welche durch eine Rundung der Zellen, Lyse und Zelltod gekennzeichnet war. Direkte Bronchioalveolarspülungskulturen, die ausgedehnte Synzytien zeigten, sind in 9 gezeigt, welche nicht in ähnlichen Kulturen, die aus Kontrollschweinen hergestellt wurden, beobachtet wurden. Die Untersuchung dieser Kulturen durch Negativfärbungs-Immun-Elektronenmikroskopie zeigte zwei Typen von virusähnlichen Partikeln. Ein Typ, der in 10 gezeigt ist, war ca. 70 nm im Durchmesser, umhüllt und wies kurze Oberflächenspikes auf. Der andere Typ, der in 11 gezeigt ist, war umhüllt, pleomorph, ungefähr 80 × 320 nm und war mit Antikörpern beschichtet. Es wurden keine Bakterien aus Lunge, Leber, Milz oder Gehirn isoliert.
Serum, das nach 28 und 35 DPI gesammelt wurde, wies keine Antikörpertiter gegen SIV, EMCV, PRV, TGEV, BRSV, HEV oder PI-3-Virus auf. Diese Seren waren positiv (1:1280) für einen Antikörper gegen das PRRS-Virus.
Die Kontrollschweine blieben über die gesamte Untersuchung hinweg normal und wiesen in keinem Gewebe makroskopische oder mikroskopische Läsionen auf. Keine Bakterien oder Viren wurden aus den Kontrollschweinen isoliert.
(III) DISKUSSION
Lungenfiltrate aus Schweinen mit natürlich vorkommender endemischer Pneumonie erzeugten Lungen- und Herzläsionen in experimentell inokulierten konventionellen und gnotobiotischen Schweinen. Die Läsionen, die sowohl bei der natürlichen als auch der experimentellen Erkrankung beobachtet wurden, waren mit einer viralen Ätiologie konsistent.
Es wurden keine gewöhnlichen, früher identifizierten viralen Atemwegspathogene von Schweinen isoliert. Eine zytopathische Wirkung wurde beobachtet, die durch Zelllyse von primären Alveolarmakrophagenkulturen von Schweinen gekennzeichnet war, was mit dem Bericht über PRRS-Virusinfektionen von Yoon et al konsistent war (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Bd. 4 (1992), S. 139). Jedoch wurden die großen Synzytien in direkten Bronchioalveolarspülungskulturen, die bei dieser Untersuchung beobachtet werden, früher bei PRRS nicht berichtet.
Eine Elektronenmikroskopie einer infizierten Zellkultur zeigt zwei virusähnliche Partikel. Ein umhüllter virusähnlicher Partikel von 70 nm mit kurzen Oberflächenspikes scheint vereinbar mit dem PRRS-Virus, wie es von Benfield et al berichtet wurde (Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Bd. 4 (1992), S. 117), aber der andere virusähnliche Partikel scheint verschieden zu sein. Keines der Schweine entwickelte Antikörpertiter gegen SIV, PRV, TGEV (PRCV) oder EMCV. Die gnotobiotischen Schweine machten jedoch eine Serokonversion gegen das PRRS-Virus durch.
Die klinische Erkrankung, die in Experiment I reproduziert wird, ist durch mäßige bis schwere Atemnot bei allen inokulierten gnotobiotischen und konventionellen Schweinen innerhalb von 5 DPI gekennzeichnet. Die Erkrankung in diesem Experiment ist schwerer als die, die in früheren Experimenten beobachtet wurde (Collins et al und Yoon et al, supra).
Eine Epithelnekrose der terminalen Luftwege und eine Proliferation, welche für die kürzlich identifizierte Typ A-SIV-Variante (aSIV oder eine damit verwandte Erkrankung, supra) von Morin et al beschrieben wurde (Canadian Veterinary Journal, Bd. 31 (1990), S. 837), wurden in Experiment I nicht beobachtet. Die Fibrinablagerungen und Hyalinmembranen entlang alveolarer Septen, die mit aSIV verbunden sind (Morin et al und Girard et al, supra), wurden nicht beobachtet. Die schwere nicht eitrige Myokarditis, die bei Schweinen in Experiment I beobachtet wurde, die über 15 DPI hinaus lebten, hängt nicht mit aSIV zusammen (Morin et al und Gerad et al, supra). Die Schweine machten keine Serokonversion gegen SIV durch, und es wurde kein SIV durch Passage in embyonierten Hühnereiern nachgewiesen.
Die vorherrschende Lungenläsion, die man bei PRRS-Ausbrüchen und experimentellen Inokulationen sieht, ist eine deutliche interstitielle Infiltration mit mononuklearen Zellen (Collins et al, Pol et al, supra). Typ II-Pneumozytenproliferation, Synzytienzellbildung und Myokarditis, die bei den infizierten Schweinen von Experiment I beobachtet wurden, wurden von anderen nicht beobachtet. Die Läsionen, die beständig mit dem filtrierbaren infektiösen Agens von Experiment I reproduziert werden, legen nahe, dass die Erkrankung, die in dieser Untersuchung beschrieben wird, welche wir den Iowa-Stamm von PRRSV nennen, durch entweder ein einziges virales Agens oder eine Kombination eines PRRS-Virus mit einem anderen infektiösen Agens hervorgerufen wird.
EXPERIMENT II
(I) Materialien und Methoden
(A) Fallmaterial vom Feld und Geschichte
Ein Schwein wurde aus einer Herde erhalten, welche an PRRS mit persistenter schwerer Pneumonie im Kindesalter litt, und welche nur 20 lebensfähige Schweine bei den letzten 42 geborenen Ferkeln aufwies. Das Schwein wurde nekropsiert, und Proben von Lungengewebe wurden gesammelt und unter Verwendung von standardmäßigen sterilen Homogenisationstechniken homogenisiert. Das Lungenhomogenat (10% w/v), das in Eagle's Minimal Essential Medium (MEM) hergestellt wurde und durch einen 0,22 μm-Filter filtriert wurde, wurde als Inokulum verwendet.
(B) Zellen

Eine kontinuierliche Zelllinie, die mit PSP-36 bezeichnet wurde, wurde von MA-104-Zellen abgeleitet, welche von der Whittaker Bioproducts, Inc. (Walkersville, Maryland) gekauft wurden. Eine Probe von PSP-36-Zellen wurde separat vermehrt, und diese Zelllinie wurde mit PSP-36-SAH bezeichnet. Schweinealveolarmakrophagen und ungefähr 90 andere Zelllinien, von denen Beispiele in der nachstehenden Tabelle II beschrieben werden, wurden zur Virusisolation verwendet. TABELLE II

Schwein	Affe	Hund	Katze	Maus	Human	Hamster
ST-SAH	Vero 76	NLDK	CRFK	MT	U937	BHK-21
ST-ATCC	BGM-70	CK65D	FKCU	P388D1	Hep 2	CHO-K1
ST-ISU	BSC-1	MDCK	FL	IC-21
ST-UNE	PSP 36	CT-60	NCE	PU5-18
PD5			3201	L929
SL∅
PSP 29
PSP 30
PSP 31
IBRS2D10
AGO8114
AGO8116
Rind	Invertebrat	Wachtel	Huhn	Hase	Fledermaus
MDBK	ASE	QT-6	CU10	RK13	Tb1 Lu
	TAE	QT-35	LMH
	AVE		HD11
	BGE		BM2L
	HZM
	IDE2
	IDE8
	RAE

(C) Virusisolation
Lungenhomogenste, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden entweder bei 2.000 × g oder 3.000 Upm bei 4°C für 15 min aufgeklart. Die Überstände wurden durch einen 0,22 μm-Filter filtriert. Die Filtrate wurden auf jeder der in Abschnitt (B) oben beschriebenen Zelllinien inokuliert. Kulturen wurden dann in geeigneten Medien mit 0–4% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika aufrechterhalten. Die Zelllinien wurden täglich im Hinblick auf zytopathische Wirkungen (CPE) überwacht. Wenn innerhalb von acht oder neun Tagen keine CPE beobachtet wurde, wurden die Kulturen 2–3-mal blind, passagiert. Wenn eine verdächtige CPE beobachtet wurde, wurden die Kulturen in einem indirekten Immunfluoreszenzassay (IFA) unter Verwendung von Rekonvaleszentenschweineantiserum gegen ISU-12 untersucht.
(D) Virustitration
10-fache Serienverdünnungen von ISU-12-Isolat wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) mit 2% FBS und 1 × Antibiotika hergestellt. Jede Verdünnung (0,2 ml) wurde doppelt in jeder Vertiefung von PSP-36-Zellen und Schweinealveolarmakrophagenkulturen inokuliert, die in Lab-Tek-Kammern angesetzt wurden. Drei Tage nach der Infektion (DPI) wurden die Kammern mit kaltem 80%-igem Aceton und 20%-iger Methanollösung bei 4°C für 15 min fixiert. Die Kammern wurden dann in einer IFA gefärbt, wobei Rekonvaleszenten-ISU-12-Antiserum und anti-PRRS-Virusserum verwendet wurden.
(E) Indirekter Immunfluoreszenzassay (IFA)
Die PSP-36-Zellen und Schweinealveolarmakrophagenkulturen wurden mit ISU-12-Isolat infiziert. 20 und 48 Stunden nach der Infektion wurden die Kulturen mit kaltem 80%-igem Aceton und 20%-iger Methanollösung bei 4°C für 15 min fixiert. Der IFA wurde durchgeführt, indem ISU-12-Rekonvaleszentenserum, anti-PRRSV-Serum und monoklonaler anti-PRRSV-Antikörper, der von der South Dakota State University, Brookings, South Dakota gekauft wurde, verwendet wurden. Nicht infizierte PSP-36-Zellen und Makrophagenkulturen wurden als Kontrollen verwendet.
(F) Radioimmunpräzipitationsassay (RIP)
ISU-12-Isolat und scheininfizierte PSP-36-Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein markiert. 3 Tage alte PSP-36-Zellen in 25 cm³-Kolben wurden mit 0,5 ml 10⁴ TCID₅₀ des ISU-12-Virus infiziert. 24 h nach der Infektion wurde das Medium durch DMEM ohne Methionin und ohne Cystein ersetzt, und die Kulturen wurden bei 37°C für 1 h inkubiert. Das Medium wurde dann mit frischem DMEM ohne Methionin und ohne Cystein mit 100 μci/ml ³⁵S-Methionin (³⁵Met) und ³⁵S-Cystein (³⁵Cys) ersetzt. Fünf Stunden nach der Zugabe von ³⁵Met und ³⁵Cys wurden die Zellen dreimal mit kalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, gewaschen, dann aus den Kolben gekratzt und durch Zentrifugation bei 1.000 × g 410 min pelletiert. Die Zellpellets, welche markierte virale Proteine enthielten, und Pellets scheininfizierter Zellen wurden dann mit Lysepuffer aufgebrochen, und die Zellrückstände wurden durch Zentrifugation gemäß dem Verfahren von Zhu et al (Am. J. Vet. Res., 51: 232–238 (1990)) aufgeklart. Die Lysate wurden dann mit ISU-12-Rekonvaleszentenserum und anti-PRRS-Virusserum inkubiert, das vorher mit kalten normalen PSP-36-Zelllysaten bei 4°C über Nacht absorbiert worden war. Immunkomplexe wurden durch Zugabe von Sepharose-Protein A-Kügelchen (erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) für 2 h bei Raumtemperatur gesammelt. Die Mischung von Sepharose-Protein A-Kügelchen und Immunkomplex wurde dann dreimal mit Lysepuffer und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Mischung wurde in 50 μl Probenpuffer resuspendiert und wie von Zhu et al, supra beschrieben auf einem SDS-Page-Gel laufen gelassen.
(G) Elektronenmikroskopie (EM)
Die PSP-36-Zellen wurden in einem 25 cm²-Kolben mit ISU-12-Virus infiziert. 48 h nach der Infektion wurden die infizierten Zellen mit 3% Glutaraldehyd (pH 7,2) bei 4°C für 2 h fixiert. Die Zellen wurden dann aus dem Kolben gekratzt und durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellpellets wurden verarbeitet und in Kunststoff eingebettet. Die in Kunststoff eingebetteten Zellpellets wurden dünn geschnitten, gefärbt und dann unter einem Transmissionselektronenmikroskop wie von Paul et al (Am. J. Vet. Res., 38: 311–315 (1976)) beschrieben sichtbar gemacht.
(II) Experimentelle Reproduktion der Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen
(A) Experiment 92.1 SPF
Lungenfiltrat von ISU-12 oben wurde intranasal in sechs speziellen pathogenfreien (SPF) Schweinen inokuliert, die 5 Wochen alt waren. Die Schweine wurden 3, 5, 10, 28 und 43 Tage nach der Inokulation (DPI) getötet.
(B) Experiment 92.3 SPF
Sechs gekreuzte SPF-Schweine wurden intranasal im Alter von 5 Wochen mit Schweinealveolarmakrophagenmaterial, das mit ISU-12-Lungenfiltrat infiziert war, inokuliert. Die mit ISU-12 inokulierten Schweine wurden nach 10 und 28 DPI nekropsiert.
(C) Experiment 92.10 SPF
Drei 5 Wochen alte Schweine wurden intranasal mit 3 ml von ISU-12, das auf PSP-36 vermehrt wurde, welches 10⁵ TCID₅₀/ml Virus enthielt, inokuliert. Zwei Schweine dienten als nicht inokulierte Kontrollen. Ein Hauptschwein wurde nach 5, 10 und 28 DPI nekropsiert. Ein Kontrollschwein wurde nach jeweils 5 und 10 DPI nekropsiert.
(D) Experiment 92.12 SPF
Zweiundzwanzig 5 Wochen alte Schweine wurden in 6 Gruppen aufgeteilt. In Gruppe I wurden 6 Schweine (Hauptschweine) intranasal mit 3 ml plaquegereinigtem ISU-12 (Plaque Nr. 1)-Virus, das auf PSP-36 vermehrt worden war, welche 10⁵ TCID₅₀/ml Virus enthielten, inokuliert. In Gruppe II wurden 6 Schweine mit Kontrollzellkulturmedium inokuliert. In jeder der Gruppe III (Plaque Nr. 2) und Gruppe IV (Plaque Nr. 3) wurden 2 Schweine mit plaquegereinigtem ISU-12 inokuliert. In Gruppe V wurden 3 Schweine mit ISU-12, welches nicht plaquegereinigt wurde, inokuliert. In Gruppe VI wurden 3 Schweine mit ISU-12-Gewebefiltrat inokuliert.
Zwei Haupt- und zwei Kontrollschweine wurden aus jeder der Gruppen I und II nach jeweils 5, 10 und 25 DPI nekropsiert. Zwei Schweine, die mit den Plaques Nr. 2 und Nr. 3 inokuliert waren, wurden jeweils nach 10 DPI nekropsiert. Ein Schwein aus jeder der Gruppen V und VI wurde nach jeweils 5, 10 und 25 DPI nekropsiert.
(E) Mikroskopische Untersuchung
Lunge, Gehirn, Herz und Milz wurden bei der Nekropsie gesammelt, mit 10%-igem neutralem gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
(III) Ergebnisse
(A) Viruskultivierung
(1) Kultivierung von ISU-12-Isolat in Schweinealveolarmakrophagenkulturen
Eine zytopathische Wirkung (CPE) wurde in Schweinealveolarmakrophagenkulturen beobachtet, die mit ISU-12-Lungenfiltrat infiziert waren, beginnend nach 2–3 DPI. Die CPE war gekennzeichnet durch ein Klumpen der Makrophagen und eine Zelllyse. Cirka 90% der Makrophagenkulturen bei ISU-12-infizierten Kulturen zeigten nach 4–5 DPI eine CPE. 12(A) zeigt, dass bei nicht infizierten Makrophagenkulturen keine CPE beobachtet wurde. Der Titer des ISU-12-Virus in Makrophagenkulturen bei der dritten Passage betrug 10⁴–10⁵ TCID₅₀/ml.
Virale Antigene wurden durch IFA in dem Zytoplasma von ISU-12-infizierten Schweinealveolarmakrophagenkulturen unter Verwendung von ISU-12-Rekonvaleszentenserum aus gnotobiotischen Schweinen nachgewiesen, wie in 12(C) gezeigt ist. Bei nicht inokulierten Makrophagenkulturen wurde keine Immunfluoreszenz nachgewiesen.
(2) Kultivierung von ISU-12-Isolat auf kontinuierlichen Zelllinien
Bei den ungefähr 90 getesteten Zelllinien (siehe Abschnitt (B) von "Materialien und Methoden" oben) wurden Anzeichen für eine Virusreplikation in sechs Zelllinien festgestellt, nämlich PSP-36, PSP-36-SAH, MA-104, Synovialzellen, Alveolarmakrophagenzellen und Schweinenasenmuschelzellen.
13(B) zeigt, dass die CPE nach 2 DPI begann und durch die Degeneration, Zellrundung und ein Klumpen der Zellen gekennzeichnet war. Nach 3–4 DPI stieg die Anzahl an Klumpen gerundeter Zellen an, und einige Klumpen verschmolzen. Viele gerundete Zellen lösten sich von der Zelleinzelschicht ab, und dieses führte zu der anschließenden Auflösung der Einzelschicht. Nach 5 DPI wurde die CPE sehr intensiv und betraf typischerweise über 95% der Einzelschicht. Keine CPE wurde bei Kontroll-PSP-36-Zellen beobachtet, wie in 13(A) gezeigt ist.
Das ISU-12-Isolat wuchs bis zu hohen Titern auf PSP-36-Zellen, ca. 10⁶–10⁷ TCID₅₀/ml bei der 11. Zellkulturpassage.
Virale Antigene wurden in dem Zytoplasma von infizierten Zellen mit Rekonvaleszentenseren von gnotobiotischen Schweinen nachgewiesen, die experimentell mit ISU-12-Lungenfiltrat inokuliert wurden (siehe 14(B)). Keine Fluoreszenz wurde bei Kontroll-PSP-36-Zellen beobachtet (14(A)).
(III) Viruscharakteristika
(A) Antigene Verwandtschaft von ISU-12 mit dem PRRS-Virus
Monoklonaler Antikörper gegen das PRRS-Virus-Isolat VR-2332 (gekauft von Dr. Benfield, South Dakota State University, Brookings, South Dakota) und anti-PRRSV-Seren (erhalten von dem USDA National Veterinary Services Laborstory, Ames, Iowa) reagierten mit ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen, was durch eine helle zytoplasmatische Fluoreszenz während des IFA bewiesen wurde (siehe 14(C)), reagierten aber nicht mit nicht infizierten PSP-36-Zellen.
(B) Virale Proteine
Anti-ISU-12-Rekonvaleszentenseren und anti-PRRS-Virusseren wurden verwendet, um virale Proteine zu analysieren. Beide Seren erkannten wenigstens 4 Proteine, welche Molekulargewichte von 19, 24, 32 bzw. 61 kD aufwiesen (15). In 15 wurden Scheininfizierte (Bahnen 2 und 3) oder ISU-12-Infizierte (Bahnen 4–7) mit anti-ISU-12-Serum (Bahnen 2 und 5), anti-PRRSV-Serum (Bahnen 3 und 4), monoklonalem anti-PRRSV-Antikörper (Bahn 6) oder Kaninchen-anti-PRRSV-Serum (erhalten von Dr. Benfield, South Dakota State University, Brookings, South Dakota) immunpräzipitiert. Die Bahnen 1 und 8 weisen Gewichtsmarker auf. Diese Proteine waren in scheininfizierten PSP-36-Zellen nicht sichtbar.
(C) Virale Struktur
Typische Viruspartikel, die von 55–85 nm reichten, wurden in ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen beobachtet. Die Viruspartikel waren umhüllt, kugelförmig und in zytoplasmatischen Vesikeln von ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen vorhanden.
(IV) Experimentelle Reproduktion der Erkrankung
(A) Experiment 92.1 SPF
Lungenfiltrat von ISU-12 oben wurde intranasal in sechs speziellen pathogenfreien (SPF) Schweinen inokuliert, die 5 Wochen alt waren. Die Schweine wurden 3, 5, 10, 28 und 43 Tage nach der Inokulation (DPI) getötet. Nach 3 DPI hatten die ISU-12-Schweine schwere Atemnot und Pyrexie gezeigt. Diese Anzeichen blieben für 10–14 Tage bestehen. Makroskopische pulmonare Läsionen waren durch eine schwere multifokale grau-bräunliche Konsolidierung von 60% der Lungen gekennzeichnet. Es gab ebenfalls eine mäßige Kardiomegalie und eine Akkumulation von Abdominalflüssigkeit. Mikroskopische Veränderungen waren gekennzeichnet durch schwere proliferative interstitielle Pneumonie mit Typ II-Pneumozytenproliferation, Synzytienzellbildung, alveolarer Exudation und schwacher interstitieller Verdickung mit mononuklearen Zellen. Es gab eine schwache nicht eitrige Myokarditis, eine schwere Enzephalitis und eine mäßige lymphoplasmazytische Nephritis. Die ISU-12-Versuchsschweine, die nach 10 und 28 Tagen nekropsiert wurden, hatten eine Serokonversion gegen das PRRS-Agens durchgemacht, wie von der NVSL bestätigt wurde.
(B) Experiment 92.3 SPF
Alle ISU-12-inokulierten SPF-Schweine zeigten innerhalb von 3 Tagen eine schwere Atemwegserkrankung, die für mehr als 14 Tage bestehen blieb. Makroskopische Läsionen waren gekennzeichnet durch pulmonare Kongestion, Ödem und deutliche multifokal-diffuse Hepatisierung. Mikroskopisch wurden schwere proliferative interstitielle Pneumonie, mäßige Nephritis, mäßige Myokarditis und schwache Enzephalitis beobachtet. Die ISU-12-inokulierten Schweine, die nach 10 und 28 DPI nekropsiert wurden, hatten eine Serokonversion gegen PRRS durchgemacht, wie von der NVSL bestätigt wurde.
(C) Experiment 92.10 SPF
Klinische Anzeichen bei inokulierten Schweinen umfassten schwere Lethargie und Pyrexie, mäßige Anorexie und mäßige bis schwere Atemnot, die nach 5–22 DPI beobachtet wurden. Ein mäßiges Tränenträufeln (tearing) lag bei diesen Schweinen während des gesamten Experiments vor. Mikroskopische Läsionen beinhalteten schwache proliferative interstitielle Pneumonie und schwere nekropurulente Tonsillitis nach 5 DPI. Mäßige multifokale PIP mit Typ II-Proliferation, alveolarer Exudation, multinukleären Riesenzellen und Synzytienzellbildung wurden nach 10 DPI beobachtet. Mäßige multifokale Enzephalitis mit perivaskulären Ausstülpungen und Gliose wurden ebenfalls nach 10 DPI beobachtet. Schwache periportale lymphomakrophagische Hepatitis, schwache nicht eitrige Myokarditis und Rhinitis wurden nach 10 DPI nachgewiesen. Nach 26 DPI gab es eine schwere interstitielle Pneumonie, die durch deutliche multifokale interstitielle Verdickung mit mononukleären Zellen, mäßige multifokale Typ II-Pneumozytenproliferation, mäßige Mengen von gemischtem alveolarem Exudat und lose peribronchiolare Ausstülpungen von Lymphozyten und Makrophagen gekennzeichnet war. Es gab ebenfalls eine mäßige multifokale Myokarditis, eine schwache Hepatitis, eine schwache Nephritis und Tonsillitis. Die zwei ISU-12-inokulierten Schweine machten eine Serokonversion gegen PRRS nach 10 DPI durch. Die Kontrollschweine blieben während der Dauer des Experiments klinisch normal und zeigten weder makroskopische noch mikroskopische Läsionen. Sie blieben ebenfalls seronegativ für PRRS.
(D) Experiment 92.12 SPF
Das biologisch nicht klonierte ISU-12 war für SPF-Schweine pathogen und erzeugte interstitielle Pneumonie, Myokarditis und Enzephalitis, wie oben für das Experiment 92.10 SPF beschrieben wird. Schweine, die mit den drei biologischen Klonen von ISU-12 (Plaques Nr. 1, 2 und 3) inokuliert waren, erzeugten eine schwache interstitielle Pneumonie, aber Anzeichen einer Typ II-Pneumozytenproliferation, alveolaren Exudation, Myokarditis und/oder Enzephalitis wurden bei diesen Schweinen nicht nachgewiesen. Alle Schweine, die mit ISU-12, entweder kloniert oder nicht kloniert, inokuliert waren, machten nach 10 DPI eine Serokonversion gegen PRRS durch. Die Kontrollschweine blieben frei von einer Virusinfektion und Erkrankung.
(V) Zusammenfassung
Eine schwere Pneumonie wurde experimentell bei 5 Wochen alten SPF-Schweinen mit Lungen- und Herzfiltraten (0,22 μm) aus natürlicherweise betroffenen Schweinen (ISU-12) reproduziert. Die Pneumonie, die von dem Iowa-Stamm von PRRSV (ISU-12) erzeugt wird, ist gekennzeichnet durch interstitielle Pneumonie, Typ II-Pneumozytenproliferation und Synzytienzellbildung. Myokarditis und Enzephalitis werden bei betroffenen Schweinen beobachtet. ISU-12 erzeugte zytopathische Wirkungen (CPE) in Schweinealveolarmakrophagenkulturen und einer kontinuierlichen Zelllinie, PSP-36. Virale Antigene wurden durch indirekte Immunfluoreszenz in ISU-12-infizierten Kulturen, nicht aber in nicht infizierten Zellen nachgewiesen. ISU-12 ist im Hinblick auf das Antigen mit dem PRRS-Virusstamm VR-2332 durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern verwandt. Jedoch wurden Unterschiede bei den mikroskopischen Läsionen der Schweine beobachtet, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12 infiziert waren, was zeigt, dass ein anderes Virus oder infektiöses Agens in PSP-36 wachsen kann, und dass das andere Virus oder infektiöse Agens der Grund sein kann, dass die Krankheit und die Läsionen, die von dem Iowa-Stamm von PRRSV hervorgerufen werden, verschieden sind von denen und schwerer sind als die, die für das PRRS-Virus in der Literatur berichtet wurden. Alle Schweine, die mit ISU-12, entweder kloniert oder nicht kloniert, inokuliert wurden, machten nach 10 DPI eine Serokonversion gegen PRRS durch. Die Kontrollschweine blieben frei von einer Virusinfektion und Erkrankung.
EXPERIMENT III
MOLEKULARE KLONIERUNG UND NUKLEOTIDSEQUENZIERUNG DES 3'-TERMINALEN BEREICHS DES INFEKTIÖSEN AGENS, DASS MIT DEM IOWA-STAMM DES ATEMWEGS- UND REPRODUKTIONSSYNDROMS BEI SCHWEINEN VERBUNDEN IST
(I) Materialien und Methoden
(A) Virusvermehrung und Reinigung
Um die Diskussion zu vereinfachen werden sich im Folgenden die Begriffe "Virus" und "viral" auf ein Virus oder infektiöses Agens in der oben für die vorliegende Anmeldung beschriebene Bedeutung oder eine Eigenschaft des Virus oder infektiösen Agens beziehen.
Eine kontinuierliche Zelllinie, PSP-36, wurde verwendet, um ISU-12-Isolat zu isolieren und vermehren, das mit dem Iowa-Stamm von PRRSV verbunden war. Das ISU-12-Virus wurde 3-mal auf PSP-36-Zellen plaquegereinigt. Die PSP-36-Zellen wurden dann mit dem plaquegereinigten Virus infiziert. Wenn mehr als 70% der infizierten Zellen zytopathische Veränderungen zeigten, wurde die Kultur eingefroren und 3-mal aufgetaut. Das Kulturmedium wurde dann durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 5.000 × g für 15 min bei 4°C aufgeklart. Das Virus wurde dann mit 7% PEG-8000 und 2,3% NaCl bei 4°C über Nacht unter Rühren ausgefällt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation pelletiert. Die Viruspellets wurden dann in 2 ml Tris-EDTA-Puffer resuspendiert und oben auf einen CsCl-Gradienten (1,1245–1,2858 g/ml) geschichtet. Nach Ultrazentrifugation bei 28.000 Upm für ca. 8 Stunden bei 20°C wurde eine klare Bande mit einer Dichte von 1,15–1,18 g/ml beobachtet und geerntet. Der Infektivitätstiter dieser Bande wurde durch IFA bestimmt, und es wurde gefunden, dass der Titer 10⁶ TCID₅₀/ml betrug. Typische Viruspartikel wurden ebenfalls durch Negativfärbungs-Elektronenmikroskopie (EM) beobachtet.
(B) Isolation der viralen RNA
Die gesamte RNA wurde aus der virushaltigen Bande in dem CsCl-Gradienten mit einem im Handel erhältlichen RNA-Isolations-Kit isoliert (erhalten von Stratagene). Poly(A)-RNA wurde dann durch Oligo-(dT)-Cellulose-Säulenchromatographie gemäß dem Verfahren, das von dem Hersteller der Säule (Invitrogen) beschrieben wird, angereichert.
(C) Konstruktion der ISU-12-cDNA-λ-Bibliothek
Ein allgemeines schematisches Verfahren zur Konstruktion einer cDNA-λ-Bibliothek ist in 16 gezeigt. Die cDNA-Synthese des ersten Strangs von der mRNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung eines Oligo (dT)-Primers mit einer Xho-I-Restriktionsstelle durchgeführt. Die Nukleotidmischung enthielt normales dATP, dGTP, dTTP und das Analogon 5-Methyl-dCTP, welches die cDNA vor Restriktionsenzymen schützt, die in den anschließenden Klonierungsschritten verwendet werden.
Die cDNA-Synthese des zweiten Strangs wurde dann mit RNase H und DNA-Polymerase I durchgeführt. Die cDNA-Termini wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet (mit glatten Enden versehen), mit T4-DNA-Ligase mit EcoRI-Adaptoren ligiert und anschlie ßend mit T4-Polynukleotidkinase kinasiert (d. h. phosphoryliert). Die cDNA wurde mit XhoI verdaut, und die verdaute cDNA wurde auf einem Agarosegel nach der Größe selektiert. Verdaute cDNA, die in der Größe größer als 1 kb war, wurde selektiert und durch ein im Handel erhältliches DNA-Reinigungskit (GENECLEAN, erhältlich von der BIO 101, Inc., La Jolla, Kalifornien) gereinigt.
Die gereinigte cDNA wurde dann in Lambdaphagen-Vektorarme ligiert, welche gentechnisch mit kohäsiven XhoI- und EcoRI-Enden versehen wurden. Der ligierte Vektor wurde in infektiösen Lambdaphagen mit Lambdaextrakten verpackt. Der SURE-Stamm (erhältlich von Stratagene) von E. coli-Zellen wurde zur Transfektion verwendet, und die Lambdabibliothek wurde dann amplifiziert und in den XL-1-Blue-Zellenstamm titriert.
(D) Screenen der λ-Bibliothek durch differenzielle Hybridisierung
Ein allgemeines schematisches Verfahren zum Identifizieren authentischer Klone des PIP-Virus ISU-12-Stamms durch differenzielle Hybridisierung ist in 17 gezeigt und wird im Folgenden beschrieben. Die λ-Bibliothek wurde auf XL-1-Blue-Zellen plattiert, Plaques wurden in Duplikaten auf Nylonmembranen gehoben und mit 0,5 N NaOH durch eine herkömmliche Methodik denaturiert. Boten-RNA's aus sowohl virusinfizierten PSP-36-Zellen und nicht infizierten PSP-36-Zellen wurden durch Oligo (dT)-Cellulose-Säulenchromatographie wie von dem Hersteller der Säule (Invitrogen) beschrieben isoliert. Komplementäre DNA-Sonden wurden aus mRNA's synthetisiert, die aus virusinfizierten PSP-36-Zellen und normalen PSP-36-Zellen isoliert wurden, indem Zufallsprimer in der Gegenwart von ³²P-dCTP gemäß dem Verfahren, das von dem Hersteller (Amersham) beschrieben wird, verwendet wurden. Zwei Sonden (die erste synthetisiert von virusinfizierten PSP-36-Zellen, die andere von normalen, nicht infizierten PSP-36-Zellen) wurden dann individuell durch Sephadex G-50-Säulenchromatographie gereinigt. Die Sonden wurden mit den duplizierten Nylonmembranen entsprechend bei 42°C in 50% Formamid hybridisiert. Plaques, welche mit der Sonde, die aus den virusinfizierten Zellen hergestellt wurde, nicht aber mit der Sonde, die aus den normalen Zellen hergestellt wurde, hybridisierten, wurden isoliert. Die Phagemids, welche virale cDNA-Inserts enthielten, wurden durch in vitro-Exzision mit der Hilfe des G408-Helferphagen geborgen. Die geborgenen Phagemids wurden dann auf XL-1-Blue-Zellen amplifiziert. Die Plasmide, welche virale cDNA-Inserts enthielten, wurden durch Qiagen-Säulenchromatographie isoliert und wurden anschließend sequenziert.
(E) Nukleotidsequenzierung und Sequenzanalyse
Plasmide, welche virale cDNA-Inserts enthielten, wurden durch Qiagen-Säulenchromatographie gereinigt und durch das Dideoxyverfahren von Sanger mit universellen und reversen Primern wie auch einer Vielzahl von inneren Oligonukleotidprimern sequenziert. Sequenzen wurden von wenigstens drei separaten Klonen erhalten. Zusätzliche Klone oder Bereiche wurden sequenziert, wenn unklare Sequenzdaten erhalten wurden. Die Nukleotidsequenzdaten wurden zusammengesetzt und analysiert, indem unabhängig zwei Computersoftwareprogramme, GENEWORKS (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, Kalifornien) und MACVECTOR (International Biotechnologies, Inc., New Haven, Connecticut), verwendet wurden.
(F) Oligonukleotidprimer
Oligonukleotide wurden als einzelsträngige DNA unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems) synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Die Oligonukleotide PP284 (5'-CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3'; SEQ ID NO: 1) und PP285 (5'-CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG-3'; SEQ ID NO: 2) wurden zur PCR-Amplifikation synthetisiert. Eine DNA-Sonde wurde mit diesen zwei Primern von dem äußersten 3-Ende des viralen Genoms zur Northern Blot-Analyse erzeugt (siehe Diskussion unten). Die Oligonukleotide PP286 (5'-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3'; SEQ ID NO: 3) und PP287 (5'-CAACTTGACG CTATGTGAGC-3'; SEQ ID NO: 4) wurden zur PCR-Amplifikation synthetisiert. Eine DNA-Sonde, welche durch diese zwei Primer erzeugt wurde, wurde verwendet, um die λ-Bibliothek weiter zu screenen. Die Oligonukleotide PP288 (5'-GCGGTCTGGA TTGACGACAG-3'; SEQ ID NO: 5), PP289 (5'-GACTGCTAGG GCTTCTGCAC-3'; SEQ ID NO: 6), PP386 (5'-GCCATTCAGC TCACATAGCG-3'; SEQ ID NO: 7), PP286 and PP287 wurden als Sequenzierprimer verwendet, um innere Sequenzen zu erhalten.
(G) Northern Blot-Analyse
Ein spezifisches DNA-Fragment von dem äußersten 3'-Ende des ISU-12-cDNA-Klons wurde durch PCR mit den Primern PP284 und PP285 amplifiziert. Das DNA-Fragment wurde mit einem im Handel erhältlichen DNA-Reinigungskit (GENECLEAN, erhalten von Bio 101) aus einem Agarosegel ausgeschnitten und durch Verlängerung mit zufälligen Primern mit ³²P-dCTP markiert (unter Verwendung eines Kits, der von Amersham erhältlich ist). Die gesamte RNA wurde aus ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen 36 Stun den nach der Infektion isoliert, indem ein im Handel erhältlicher Kit zur Isolation der gesamten RNA gemäß dem Verfahren, das von dem Hersteller (Stratagene) beschrieben wird, verwendet wurde. Subgenomische ISU-12-mRNA-Spezies wurden mit 6 M Glyoxal und DMSO denaturiert und auf einem 1%-Agarosegel getrennt. (Ergebnisse aus einem ähnlichen Verfahren, bei welchem ein 1,5%-Agarosegel als Ersatz verwendet wurde, werden im Experiment VIII unten beschrieben und sind in 32 gezeigt.) Die abgetrennten subgenomischen mRNA's wurden dann unter Verwendung eines POSIBLOT^TM-Druckblotters (Stratagene) auf Nylonmembranen überführt. Eine Hybridisierung wurde in einem Hybridisierungsofen mit Rollflaschen bei 42°C und 50% Formamid durchgeführt.
ERGEBNISSE
(A) Konierung, Identifizierung und Sequenzierung des 3'-terminalen ISU-12-Genoms
Eine Oligo (dT)-geprimte cDNA-λ-Bibliothek wurde aus einem partiell gereinigten Virus, das aus ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen erhalten wurde, konstruiert. Es wurden beim Screenen der cDNA-λ-Bibliothek mit Sonden, die auf der Sequenz des Lelystad-Virus basierten, Probleme angetroffen. Drei Sätze von Primern wurden hergestellt. Der erste Satz (PP105 und PP106; SEQ ID NOS: 18–19) entspricht den Positionen 14577 bis 14596 und 14977 bis 14995 der genomischen Lelystad-Sequenz, die in dem Nukleocapsid-Genbereich lokalisiert sind. Der zweite Satz (PP106 und PP107, SEQ ID NOS: 19–20) entspricht den Positionen 14977 bis 14995 und 14054 bis 14072 der genomischen Lelystad-Sequenz, welche die ORF's 6 und 7 flankieren. Der dritte Satz (PM541 und PM542; SEQ ID NOS: 21–22) entspricht den Positionen 11718 bis 11737 und 11394 bis 11413 der genomischen Lelystad-Sequenz, die in der ORF-1b-Region lokalisiert sind.
PP105: 5'-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3' (SEQ ID NO: 18)
PP106: 5'-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3' (SEQ ID NO: 19)
PP107: 5'-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 20)
PM541: 5'-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3' (SEQ ID NO: 21)
PM542: 5'-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3' (SEQ ID NO: 22)
Alle Versuche, Sonden durch PCR unter Verwendung dieser drei Sätze von Primern aus dem infektiösen ISU-12-Agens zu erzeugen, waren erfolglos. Nach mehreren Versuchen unter Verwendung der differenziellen Hybridisierungstechnik wurden jedoch die authentischen Plaques, welche ISU-12-spezifische cDNA repräsentierten, unter Verwendung von Sonden isoliert, die aus ISU-12-infizierten PSP-36-Zellen und normalen PSP-36-Zellen hergestellt wurden. Die an der differenziellen Hybridisierung beteiligten Verfahren werden beschrieben und sind in 17 angegeben.
Drei positive Plaques (λ-4, λ-75 und λ-91) wurden anfangs identifiziert. Phagemids, welche virale cDNA-Inserts innerhalb des λ-Phagen enthielten, wurden durch in vitro-Exzision mit der Hilfe von G408-Helferphagen geborgen. Die Inserts der positiven Klone wurden durch Restriktionsenzymverdau und terminale Sequenzierung analysiert. Die Spezifität der cDNA-Klone wurde weiter durch Hybridisierung mit RNA aus PSP-36-Zellen, die mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert waren, nicht aber mit RNA aus normalen PSP-36-Zellen, bestätigt. Eine DNA-Sonde wurde dann aus dem 5'-Ende des Klons λ-75 durch PCR mit den Primern PP286 und PP287 erzeugt. Weitere positive Plaques (λ-229, λ-268, λ-275, λ-281, λ-323 und λ-345) wurden unter Verwendung dieser Sonde identifiziert. Alle λ-cDNA-Klone, die verwendet wurden, um die 3'-terminale Nukleotidsequenz zu erhalten, sind in 18 dargestellt. Wenigstens drei separate Klone wurden sequenziert, um jegliche Fehler auszuschließen. Im Fall von irgendwelchen unklaren Sequenzdaten wurden zusätzliche Klone und innere Primer (PP288, PP289, PP286, PP287 und PP386) verwendet, um die Sequenz zu bestimmen. Die 3'-terminale Sequenz mit 1938 bp (SEQ ID NO: 8) ist in 19 dargestellt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 9) ist in 20 dargestellt.
(B) Ein ineinander geschachtelter Satz subgenomischer mRNA
Die gesamte RNA aus virusinfizierten PSP-36-Zellen wurde auf einem 1%-Glyoxal/-DMSO-Agarosegel getrennt und auf Nylonmembranen geblottet. Eine cDNA-Sonde wurde durch PCR mit einem Satz von Primern (PP284 und PP285) erzeugt, die den äußersten 3'-terminalen Bereich des Virusgenoms flankierten. Die Sonde enthält eine nicht translationale 3'-Sequenz und das meiste der ORF-7-Sequenz. Ergebnisse einer Northern Blot-Hybridisierung zeigen, dass das Muster der mRNA-Spezies aus PSP-36-Zellen, die mit dem Iowa-Stamm von PRRSV infiziert sind, sehr ähnlich ist wie das des Lelystad-Virus (LV), des Pferdearteritisvirus (EAV), des Lactatdehydrogenasevirus (LDV) und des Coronavirus, in der Hinsicht, dass die Virusreplikation die Bildung subgenomischer mRNA's erforderte.
Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass ISU-12-spezifische subgenomische mRNA's einen an 3' ineinander geschachtelten (nested) Satz von mRNA's repräsentieren, da die Northern Blot-Sonde nur die äußerste 3'-terminale Sequenz repräsentiert. Die Größe der viralen genomischen ISU-12-RNA (14 kb) und der 6 subgenomischen mRNA's (RNA 2 (3,0 kb), RNA 3 (2,5 kb), RNA 4 (2,2 kb), RNA 5 (1,8 kb), RNA 6 (1,3 kb) und RNA 7 (0,98 kb)) ähnelt denen des LV (18), auch wenn es Unterschiede sowohl bei dem Genom als auch bei den subgenomischen RNA-Spezies gibt. Unterschiede wurden ebenfalls bei den relativen Mengen der subgenomischen mRNA's beobachtet, wobei RNA 7 die vorherrschendste subgenomische mRNA war.
(C) Analyse der offenen Leseraster, die von subgenomischer RNA codiert wurden
Drei große ORF's sind in SEQ ID NO: 8 gefunden worden: ORF-5 (nt 239–901; SEQ ID NO: 10), ORF 6 (nt 889–1403; SEQ ID NO: 12) und ORF 7 (nt 1403–1771; SEQ ID NO: 14). ORF 4, das an dem 5'-Ende der resultierenden Sequenz lokalisiert ist, ist in der 3'-terminalen Sequenz mit 1938 bp von SEQ ID NO: 8 unvollständig. Die ORF's 5, 6 und 7 weisen jeweils ein Codierungsvermögen für mehr als 100 Aminosäuren auf. ORF 5 und ORF 6 überlappen einander um 10 bp, und ORF 6 und ORF 7 überlappen einander um 5 bp. Zwei kleinere ORF's, die vollständig innerhalb von ORF 7 lokalisiert sind, sind ebenfalls gefunden worden, die für nur 37 aa (Aminosäuren) bzw. 43 aa codieren. Weitere zwei kurze ORF's überlappen vollständig mit ORF 5. Das Codierungsvermögen dieser zwei ORF's beträgt nur 29 aa bzw. 44 aa. Keine spezifischen subgenomischen mRNA's wurden mit diesen kleineren ORF's durch Northern Blot-Analyse korreliert. Es wird angenommen, dass ORF 6 und ORF 7 das virale Membranprotein bzw. das Capsidprotein codieren.
(D) Konsensussequenz für eine Leader-Verbindung
Die Sequenzanalyse zeigt, dass ein kurzes Sequenzmotiv, AACC, als die Stelle in den subgenomischen mRNA's dienen kann, wo der Leader während der Transkription angefügt wird (die Verbindungsstelle). Die Verbindungsstelle von ORF 6 wird 21 bp stromaufwärts des ATG-Startcodons gefunden, und die Verbindungsstelle von ORF 7 wird entsprechend 13 bp stromaufwärts des ATG-Startcodons gefunden. Keine AACC-Konsensussequenz wurde in ORF 5 identifiziert, obwohl diese in ORF 5 von LV gefunden wurde. Ähnliche Verbindungssequenzen wurden in LDV und EAV gefunden.
(E) 3'-Nichttranslationale Sequenz und Poly (A)-Schwanz
Eine 150 Nukleotide lange (150 nt) nichttranslationale Sequenz, welche auf das Stoppcodon von ORF 7 folgte, ist in dem Genom des ISU-12-Virus identifiziert worden, im Vergleich zu 114 nt bei LV, 80 nt bei LDV und 59 nt bei EAV. Die Länge des Poly (A)-Schwanzes beträgt wenigstens 13 Nukleotide. Es gibt eine Konsensussequenz, CCGG/AAATT-Poly (A), bei dem PIP-Virus ISU-12, LV und LDV in dem Bereich, der zu dem Poly (A)-Schwanz benachbart ist.
(F) Sequenzvergleich von ISU-12- und LV-Genomen bei den ORF's 5, 6 und 7 und bei den nichttranslationalen Sequenzen
Ein Vergleich der ORF-5-Regionen der Genome von ISU-12 und von den Lelystad-Viren ist in 21 gezeigt. Die entsprechenden Vergleiche der ORF-6-Region, der ORF-7-Region und der nichttranslationalen Sequenzen sind entsprechend in den 22, 23 und 24 gezeigt.
Die Ergebnisse des Vergleichs sind in Tabelle 111 unten dargestellt. In Übereinstimmung mit der Beschreibung oben wird ein Virus als immunologisch äquivalent betrachtet, wenn dieses 90% oder mehr Homologie mit einem immunogenen Virus aufweist. Die Nukleotidsequenzhomologien zwischen LV und ISU-12 der ORF 5, ORF 6, ORF 7 und der nichttranslationalen Sequenzen betragen 60%, 68%, 60% bzw. 58%. Dementsprechend sind LV und ISU-12 keine immunogenen Äquivalente.

Die Größe der ORF's 5 und 6 bei LV ist 61 nt bzw. 3 nt kleiner als die ORF's 5 und 6 bei ISU-12. Im Gegensatz dazu ist die Größe von ORF 7 bei LV 15 nt größer als die bei ISU-12. Ebenso ist die 3'-terminale nichttranslationale Sequenz in der Länge verschieden (150 nt bei ISU-12 aber nur 114 nt bei LV). Wie bei LV ist die Verbindungssequenz, AACC, ebenfalls in dem Genom des Iowa-Stamms des PRRS-Virusisolats ISU-12 gefunden worden, außer für ORF 5. Die Verbindungssequenz von ORF 6 bei ISU-12 befindet sich 21 nt stromaufwärts des ATG-Startcodons, wogegen sich die Verbindungssequenz von ORF 6 bei LV 28 nt stromaufwärts von ATG befindet. TABELLE III

	Lelystad-Virus			PRRS	ISU-12
	Größe (bp)	Verbindungsseq. (nt von ATG)	Sequenzhomologie (%)	Größe (bp)	Verbindungsseq. (nt von ATG)
ORF-5	605	AACC	60	666	Nr. ?
ORF-6 (Env)	521	AACC (ATG-28)	68	525	AACC (ATG-21)
ORF-7 (NP)	386	AACC (ATG-28)	60	371	AACC (ATG-13)
NT	113		58	150

EXPERIMENT IV
EXPRESSION DER GENE DES INFEKTIÖSEN AGENS DES IOWA-STAMMS IN INSEKTENZELLEN
(A) Produktion von rekombinantem Baculovirus
Die ORF-5-, ORF-6- und ORF-7-Sequenzen wurden einzeln durch PCR amplifiziert, indem Primer verwendet wurden, die auf der genomischen ISU-12-Nukleotidsequenz basierten. ORF-5 wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
5'-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3' (SEQ ID NO: 23)
3'-GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5' (SEQ ID NO: 24)
ORF-6 wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
5'-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3' (SEQ ID NO: 25)
3'-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5' (SEQ ID NO: 26)
ORF-7 wurde unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
5'-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3' (SEQ ID NO: 27)
3'-GGGAATTCAC CACGCATTC-5' (SEQ ID NO: 28)
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in den Baculovirustransfervektor pVL1393 (erhältlich von Invitrogen) kloniert. Ein μg linearisierte Baculovirus-AcMNPV-DNA (im Handel erhältlich von Pharmingen, San Diego, Kalifornien) und 2 μg PCR-amplifizierte klonierte cDNA enthaltende Vektorkonstrukte wurden mit 50 μl Lipofectin (Gibco) gemischt und bei 22°C für 15 min inkubiert, um eine Transfektionsmischung herzustellen. Eine Stunde nach dem Ansetzen der HI-FIVE-Zellen wurde das Medium durch frisches Excell 400-Insektenzellkulturmedium (erhältlich von JR Scientific Co.) ersetzt, und die Transfektionsmischung wurde Tropfen für Tropfen zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei 28°C für sechs Stunden inkubiert. Danach wurde das Transfektionsmedium entfernt, und frisches Excell 400-Insektenzellkulturmedium wurde zugegeben. Die resultierende Mischung wurde dann bei 28°C inkubiert.
Fünf Tage nach der Transfektion wurde das Kulturmedium gesammelt und aufgeklart. Zehnfache Verdünnungen der Überstände wurden auf HI-FIVE-Zellen inokuliert und für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem das Inokulum verworfen worden war, wurde eine Überschichtung mit 1,25% Agarose auf die Zellen aufgetragen. Eine Inkubation bei 28°C wurde für vier Tage durchgeführt. Danach wurden klare Plaques selektiert und unter Verwendung einer sterilen Pasteurpipette gepickt. Jeder Plaque wurde mit 1 ml Grace's Insektenmedium in einem 5 ml-Röhrchen mit Schnappdeckel gemischt, und über Nacht in einen Kühlschrank gestellt, um das Virus aus der Agarose freizusetzen. Die Röhrchen wurden für 30 min bei 2000 × g zentrifugiert, um Agarose zu entfernen, und die Überstände wurden in neue sterile Röhrchen überführt. Die Plaquereinigungsschritte wurden dreimal wiederholt, um eine mögliche Kontamination mit Wildtypvirus zu vermeiden. Reine rekombinante Klone wurden bei –80°C zur weiteren Untersuchung gelagert.
(B) Expression von rekombinanten Proteinen des infektiösen Agens des Iowa-Stamms
Indirekter Immunfluoreszenzassay und Radioimmunpräzipitationstests wurden verwendet, um die Expression auszuwerten.
Indirekter Immunfluoreszenzassay: HI-FIVE-Insektenzellen, die in 25 gezeigt sind, in einer Zellkultur-Clusterplatte mit 24 Vertiefungen wurden mit Wildtyp-Baculovirus oder rekombinantem Baculovirus infiziert oder wurden scheininfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen fixiert und mit geeigneten Verdünnungen von polyklonalen Schweine-anti-ISU-12-Antikörpern, worauf mit Fluoresceinisothiocyanat markierte (FITC-markierte) anti-Schwein-IgG folgten, gefärbt. Wie in den 26–29 gezeigt ist, wurde Immun fluoreszenz in Zellen, die mit den rekombinanten Viren infiziert waren, nicht aber in scheininfizierten Zellen oder Zellen, die mit dem Wildtyp-Baculovirus inokuliert wurden, nachgewiesen. Beispielsweise zeigt 26 HI-FIVE-Zellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert wurden, welcher das ISU-12-ORF-6-Gen enthielt (Baculo.PRRSV.6), welche eine zytopathische Wirkung zeigen. 27 zeigt HI-FIVE-Zellen, die mit einem anderen rekombinanten Baculovirus infiziert wurden, welcher das ISU-12-ORF-7-Gen enthielt (Baculo.PRRSV.7), welche ebenfalls eine zytopathische Wirkung zeigen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit rekombinantem Baculovirus erhalten, welcher ORF-5 enthielt (Baculo.PRRSV.5, Daten nicht gezeigt). Die 28 und 29 zeigen HI-FIVE-Zellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert wurden, welcher das ISU-12-ORF-6-Gen bzw. das ISU-12-ORF-7-Gen enthielt, gefärbt mit Schweineantiseren gegen ISU-12, gefolgt von mit Fluorescein konjugiertem anti-Schwein-IgG, wobei die Insektenzellen rekombinantes Protein des infektiösen Agens des Iowa-Stamms produzieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit rekombinantem Baculovirus, der ORF-5 enthielt, erhalten.
Radioimmunpräzipitation: Eine Radioimmunpräzipitation wurde mit jedem rekombinanten Virus durchgeführt (Baculo.PRRSV.5, Baculo.PRRSV.6 und Baculo.PRRSV.7), um weiterhin die Antigenizität und Authentizität der rekombinanten Proteine zu bestimmen. HI-FIVE-Insektenzellen wurden scheininfiziert oder alternativ mit jedem der rekombinanten Baculoviren infiziert. Zwei Tage nach der Infektion wurde methioninfreies Medium zugegeben. Jede Mischung wurde für zwei Stunden inkubiert, und dann wurden Proteine, die mit ³⁵S-Methionin (Amersham) markiert waren, zugegeben, und die Mischung wurde für vier zusätzliche Stunden bei 28°C inkubiert. Radiomarkierte Zelllysate wurden durch drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen hergestellt, und die Zelllysate wurden mit Präimmun- oder Immun-anti-ISU-12-Antiseren inkubiert. Die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Agarose ausgefällt und nach Aufkochen auf SDS-PAGE analysiert. Die Gele wurden bei –80°C an einen Röntgenfilm exponiert und dieser entwickelt. Banden der erwarteten Größe wurden mit ORF-6-(30) und ORF-7 (31)-Produkten nachgewiesen.
EXPERIMENT V
Andere Proben von PRRSV, die in Tabelle 4 unten beschrieben werden, wurden dreimal plaquegereinigt. Die Plaquereinigung wurde durchgeführt, indem ein aufgeklartes Gewebehomogenat auf PSP-36-SAH-Zellen kultiviert wurde und ein einzelner Plaque unter der Annahme, dass ein Plaque von einem einzigen Virus produziert wird, ausgewählt wurde. Der ausgewählte Plaque wurde dann kultiviert, und ein einzelner Plaque wurde wieder ausgewählt und dann ein drittes Mal kultiviert. Ein IFA wurde durchgeführt, indem ein monoklonaler anti-PRRSV-Antikörper verwendet wurde, der von der South Dakota State University, Brookings, South Dakota gekauft wurde.

Einige isolierte Proben, die für eine weitere Untersuchung ausgewählt wurden, sind in Tabelle 5 unten identifiziert, und diese werden durch ihre Pathogenität und Anzahl an mRNA's charakterisiert. TABELLE 4 3 X PLAQUEGEREINIGTE PRRSV-ISOLATE


PRRSV-ISOLAT	HERSTELLUNGSDATUM DES EINGEFRORENEN MATERIALS	PRRS ERGEBNIS MONOKLONALER IFA	TITER TCID₅₀/ml
ISU-22	15.9.92	+	10^5.57 ± 0,15
ISU-28	15.9.92	+	10^5.14 ± 0,28
ISU-12	17.9.92	+	10^4.33 ± 0,21
ISU-3927	21.9.92	+	10^3.58 ± 0,17
ISU-984	21.9.92	+	10^3.88 ± 0,24
ISU-7229	22.9.92	+	10^3.45 ± 0,20
ISU-92-11581	22.9.92	+	10^2.39 ± 0,17
ISU-695	01.10.92	+	10^4.49 ± 0,20
ISU-79	01.10.92	+	10^5.69 ± 0,25
ISU-412	01.10.92	+	10^5.31 ± 0,50
ISU-55	01.16.92	+	10^5.54 ± 0,10
ISU-33	05.10.92	+	10^5.36 ± 0,21
ISU-1894	27.10.92	+	10^5.18 ± 0,33
ISU-04	27.10.92	+	10^5.78 ± 0,24
ISU-51	07.2.93	+	10^4.59 ± 0,15
ISU-30262	01.4.93	+	10^5.99 ± 0,24

Anmerkung: Alle Virusisolate wurden plaquegereinigt und auf PSP-36-SAH-Zellen vermehrt.

Isolat	Pathogenität	Anzahl an mRNA's
ISU-12	sehr pathogen	7
ISU-984	sehr pathogen	7
ISU-3927	schwach pathogen	7*
ISU-51	schwach pathogen	7
ISU-22	sehr pathogen	9
ISU-55	schwach pathogen	9
ISU-79	sehr pathogen	9

* = einige mRNA's zeigten Deletionen.

Proben von jedem des nicht plaquegereinigten ISU-12, plaquegereinigten ISU-12, ISU-22, ISU-51, ISU-55 und ISU-3927 wurden unter dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawen Drive, Rockville, Maryland 20852, USA am 28. Oktober 1992 unter den Zugangsnummern VR 2385, VR 2386 und am 29. September 1993 unter den Zugangsnummern (müssen noch zugeteilt werden) VR 2429, VR 2428, VR 2430 bzw. VR 2431 hinterlegt.
Die mRNA's von ISU-3927 zeigten Deletionen bei vier der sieben mRNA's. Die mRNA's 4, 5, 6 und 7 von ISU-3927 wanderten schneller als jene von ISU-12 und sind daher kleiner als jene von ISU-12. Dieses Merkmal kann möglicherweise mit der niedrigeren Virulenz von ISU-3927 zusammenhängen.
Die Pathogenität der sechs Isolate wurde bei 5 Wochen alten CDCD-Schweinen verglichen.
Fünfzehn Schweine wurden mit 10⁵ TCID₅₀ des Virus inokuliert. Zehn Schweine wurden nach 10 DPI nekropsiert, und fünf Schweine wurden nach 28 DPI nekropsiert. Die Virusisolate ISU-12, ISU-22 und ISU-28 waren die pathogensten, wogegen ISU-51 und ISU-55 eine geringe Pathogenität aufwiesen. In einer früheren Studie war ISU-3927 für 5 Wochen alte Schweine nur schwach pathogen.
Läsionen, die durch ISU-22 und nicht plaquegereinigten (d.h. isoliertes infektiöses Agens, welches nicht plaquegereinigt wurde) ISU-12 verursacht wurden, blieben für längere Zeiträume bestehen als jene, die von plaquegereinigten Viren verursacht wurden. Die plaquegereinigten Isolate erzeugen eine schwache Myokarditis und Enzephalitis. Die nicht plaquegereinigten Isolate erzeugten eine etwas schwerere Erkrankung als die entsprechenden plaquegereinigten Isolate.
CDCD-Ferkel liefern ein ausgezeichnetes Modell für die Auswertung der Pathogenität und Wirksamkeit von Kandidatenvakzinen. Die Isolate ISU-12, ISU-22 und ISU-984 erzeugen ähnliche Läsionen und können verwendet werden, um die Wirksamkeit der Vakzine auf der Grundlage von Untersuchungen der makroskopischen und mikroskopischen Läsionen auszuwerten. ISU-3927 ist weniger virulent, ist aber zur Auswertung einer Vakzine gegenüber pathogenen Stämmen von PRRSV ausreichend.
Schweine, die mit plaquegereinigtem ISU-12 infiziert waren, erreichten über einen Zeitraum von 28 Tagen einen Durchschnitt von 9,9 Pfund weniger als Kontrollschweine (herausgefordert mit nicht infizierten PSP-36-Zellen). Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass eine Lymphopenie und Neutrophilie bei 2–10 DPI erscheinen.
Nur jene Schweine, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12 infiziert waren, entwickelten eine signifikante Enzephalitis. Bei keinem Schwein, das mit biologisch klonierten (plaquegereinigten) Isolaten des Iowa-Stamms herausgefordert wurde, wurde eine Rhinitis beobachtet. Im Gegensatz dazu war die Rhinitis schwer, wenn Gewebefiltrate (nicht plaquegereinigte Isolate) als Inokula verwendet wurden.
Die Pathologie und Histologie von CDCD-Schweinen, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12, plaquegereinigtem ISU-12, ISU-22, ISU-984, ISU-3927 und nicht infizierten PSP-36-Zellen infiziert waren, sind in den Tabellen 6–12 unten zusammengefasst. In diesen Tabellen repräsentieren die Werte der makroskopischen Lungenläsionen den Prozentsatz der Lungenkonsolidierung (d.h. den Prozentsatz an Lungengewebe, das durch Pneumonie erkrankt ist, welcher Läsionen zeigt). Ein Wert basiert auf einer Skala von 0 bis 100% Konsolidierung. "ND" bedeutet, dass der Wert der makroskopischen Lungenläsionen nicht bestimmt wurde.
In Tabelle 6 oben bedeutet "unpl." nicht plaquegereinigt, und "Uninoc." bedeutet nicht inokuliert.
Die Ergebnisse in Tabelle 6 oben zeigen, dass ISU-12 und ISU-22 Läsionen erzeugen, die länger bestehen bleiben als bei den anderen Isolaten. Die Läsionen, die durch ISU-12, ISU-22 und ISU-984 erzeugt werden, weisen eine ähnliche Schwere auf. Die Läsionen, die durch ISU-3927 erzeugt werden, sind sehr viel weniger schwer und lösen sich eher auf als die Läsionen, die durch andere Isolate erzeugt werden. Alle makroskopischen Läsionen wurden nach 36 DPI aufgelöst.
Die Ergebnisse der Pathologie, die in den Tabellen 7–12 unten dargestellt sind, basieren auf derselben Skala der Schwere, die für Tabelle 1 oben dargestellt ist. In den Tabellen 7–12 unten bedeutet "Int. thick." interstitielle Verdickung, "alv. exud." bedeutet alveolares Exudat und "encephal." bedeutet Enzephalitis.
Nach 7 DPI sind die Lungenläsionen, die von ISU-12, ISU-22 und ISU-984 erzeugt werden, schwer und ähnlich zueinander. Lungenläsionen, die von ISU-3927 erzeugt werden, sind nach 7 DPI nur schwach oder mäßig schwer.
Nach 10 DPI sind die Lungenläsionen, die von ISU-12, ISU-22 und ISU-984 erzeugt werden, ähnlich zu denen nach 7 DPI, aber etwas schwerer. Nur Schweine, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12 infiziert sind, zeigen schwache Enzephalitis und Myokarditis. Nach 10 DPI sind die Läsionen, die von ISU-3927 erzeugt werden, nahezu aufgelöst.
Nach 21 DPI ist die Myokarditis, welche durch nicht plaquegereinigten ISU-12 erzeugt wird, schwer, wogegen die Myokarditis, die von ISU-12, ISU-22 und ISU-984 erzeugt wird, mäßig ist. Nur Schweine, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12 infiziert sind, zeigen nach 21 DPI eine mäßige Enzephalitis.
Nach 28 DPI sind die Lungenläsionen bei Schweinen, die mit nicht plaquegereinigtem ISU-12 und ISU-22 infiziert sind, immer noch mäßig. Diese Isolate erzeugen ebenfalls nach 28 DPI eine schwere Myokarditis. Jedoch sind die Lungenläsionen, die von ISU-12, ISU-984 und ISU-3927 erzeugt werden, nach 28 DPI nahezu aufgelöst.
Nach 36 DPI sind alle Läsionen im Wesentlichen aufgelöst. Nur 1 Schwein pro Gruppe wurde nach 36 DPI untersucht.
EXPERIMENT VI
Es wurde eine in vivo-Kreuzneutralisationsstudie durchgeführt. CDCD-Schweine wurden intranasal zuerst mit einem Isolat inokuliert, das aus ISU-12, ISU-22, ISU-984 und ISU-3927 ausgewählt wurde, dann wurden die Schweine vier Wochen später mit ISU-12 herausgefordert. Lungenläsionen und andere Krankheitssymptome wurden 8 DPI nach der Herausforderung mit ISU-12 untersucht. Kontrollschweine wurden nur mit ISU-12 herausgefordert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 unten dargestellt.
Die Ergebnisse der Pathologie, die in Tabelle 13 unten dargestellt sind, basieren auf derselben Schwereskala, die für Tabelle 1 oben dargestellt wurde. In Tabelle 13 unten bedeutet "Int. thick." interstitielle Verdickung, "alv. exud." bedeutet alveolares Exudat und "encephal." bedeutet Enzephalitis.
Die Daten in Tabelle 13 oben zeigen, dass ISU-12 einen Schutz für Schweine gegen die meisten Symptome der Erkrankung, die von ISU-12 hervorgerufen wird, bietet. ISU-984 bietet Schutz gegen einige Symptome und klinische Anzeichen von PRRS, das durch ISU-12, welcher zu den virulentesten Stämmen des PRRSV-Virus gehört, die bekannt sind, hervorgerufen wird.
Jedoch bietet ISU-3927, eine schwach pathogene Variante des Iowa-Stamms des PRRS- Virus, den größten Schutz der als eine Lebendvakzine untersuchten Isolate gegen eine anschließende Herausforderung mit ISU-12. Somit kann sich ISU-3927 zur Verwendung als eine Lebendvakzine als kommerziell vielversprechend erweisen.
EXPERIMENT VII
Gruppen von 10 CDCD-Schweinen wurden mit Isolaten des Iowa-Stamms von PRRSV, die in Tabelle 14 unten aufgelistet sind, oder mit nicht infizierten PSP-36-Zellen als einer Kontrolle inokuliert. Die Schweine waren 5 Wochen alt, wenn sie intranasal mit 10⁵ TCID₅₀ von jedem Virusisolat, das in Tabelle 14 unten aufgelistet ist, herausgefordert wurden. Die Schweine wurden nach 10 DIP nekropsiert.

Der mittlere Wert der makroskopischen Lungenläsionen nach 10 DPI wird in Tabelle 13 unten als ein Hinweis auf die Pathogenität des Isolats angegeben. Die Standardabweichung (SD) wird als ein Hinweis auf die statistische Bedeutung des mittleren Werts der makroskopischen Lungenläsionen angegeben. TABELLE 14

inokula	N	Mittlerer makroskopischer Lungenwert nach 10 DPI	SD
PSP-36	10	0,0	0,0
ISU-28	10	62,4	20,9
ISU-12	10	54,3	9,8
ISU-79	10	51,9	13,5
ISU-1894	10	27,4	11,7
ISU-55	10	20,8	15,1
ISU-51	10	16,7	9,0

Ein statistischer Vergleich der Werte der makroskopischen Lungenläsionen ist in Tabelle 15 unten angegeben. TABELLE 15 Statistischer Vergleich der Werte der makroskopischen Lungenläsionen

Vergleich	Wert von t	p > \|t\|
Kontrolle vs 12	9,43	p < ,001
Kontrolle vs 28	10,83	p < ,001
Kontrolle vs 51	2,89	p < ,01
Kontrolle vs 55	3,61	p < ,001
Kontrolle vs 1894	4,76	p < ,001
Kontrolle vs 79	9,00	p < ,001
12 vs 28	1,41	p < ,2
12 vs 51	6,54	p < ,001
12 vs 55	5,82	p < ,001
12 vs 79	0,43	p > ,5
12 vs 1894	4,76	p < ,001
28 vs 51	7,94	p < ,001
28 vs 55	7,22	p < ,001
28 vs 79	1,83	p < ,1
28 vs 1894	6,06	p < ,001
51 vs 55	0,72	p < ,5
51 vs 79	6,11	p < ,001
51 vs 1894	1,87	p < ,1
55 vs 79	5,39	p < ,001
55 vs 1894	1,15	p < ,3
79 vs 1894	4,24	p < ,001

Zusätzlich wurde jede Gruppe der Schweine im Hinblick auf Atemnot gemäß dem oben beschriebenen klinischen Atmungsbewertungssystem untersucht (siehe "Mittel des klinischen Werts" in Tabelle 16 unten). "Makroskopischer Wert" bezieht sich auf den oben beschriebenen makroskopischen Wert der Lungenläsionen. "Enceph.", "Myocard." und "Rhinitis" beziehen sich auf die Anzahl an Schweinen in jeder Gruppe, welche Läsionen von Enzephalitis, Myokarditis bzw. Rhinitis zeigen. "Mikrowert" bezieht sich auf einen Wert, der auf der folgenden Skala basiert, welcher verwendet wurde, um mikroskopische Läsionen interstitieller Pneumonie im Lungengewebe auszuwerten und zu vergleichen:

0: = keine Erkrankung; normales Lungengewebe
1: = schwache multifokale mikroskopische Läsionen
2: = schwache diffuse mikroskopische Läsionen
3: = mäßige multifokale mikroskopische Läsionen
4: = mäßige diffuse mikroskopische Läsionen
5: = schwere multifokale mikroskopische Läsionen
6: = schwere diffuse mikroskopische Läsionen

Mikroskopische Läsionen können in Geweben beobachtet werden, welche keine makroskopischen Läsionen zeigen. Somit liefert der "Mikrowert" ein zusätzliches Mittel, um die Pathogenität dieser Isolate zusätzlich zu makroskopischen Lungenläsionen, Atemnot, Fieber usw. auszuwerten und zu vergleichen.
EXPERIMENT VIII
Die mRNA von PSP-36-Zellen, die mit jedem von ISU-12, ISU-22, ISU-55, ISU-79, ISU-1894 und ISU-3927 infiziert waren, wurden auf einem 1,5%-Agarosegel isoliert und getrennt, um eine bessere Trennung der subgenomischen mRNA's zu erreichen. Zwei Gruppen von Migrationsmustern wurden beobachtet.
Die Gruppe I beinhaltet die Isolate ISU-12, ISU-1894, ISU-3927 und möglicherweise ISU-51. Der Northern Blot von ISU-12 ist in 32 gezeigt, und die Northern Blots von ISU-1894, ISU-3927 und ISU-51 sind in 33 gezeigt. Wie bei dem Lelystad-Virus wurden sieben subgenomische mRNA's (bezeichnet mit 1–7 in den 32 und 33) in jedem dieser Isolate gefunden. Die Größen der subgenomischen mRNA's (SgRNA's) sind ähnlich zu denen des Lelystad-Virus.
Die Gruppe II beinhaltet die Isolate ISU-22, ISU-55 und ISU-79. Jedes dieser Isolate weist neun SgRNA's anstelle von sieben auf. Die SgRNA's 1, 2, 3, 6 und 7 der Gruppe II sind dieselben wie jene in der Gruppe I, aber zwei zusätzliche SgRNA's wurden zwischen den SgRNA's 3 und 6 der Gruppe I gefunden, welche durch die Pfeile in 33 angezeigt werden.
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass das Virus der Gruppe II mit der möglichen Ausnahme von ISU-12 in PSP-36-Zellen besser replizieren kann als die Isolate der Gruppe I. In manchen Fällen kann jedoch sogar ISU-12 im Vergleich zu den Isolaten der Gruppe II schlecht replizieren.
EXPERIMENT VIII
Eine modifizierte Wirksamkeitsstudie der Lebendvakzine mit dem Virus des Reproduktions- und Atemwegssyndroms bei Schweinen (PRRSV) wurde in 3 Wochen alten PRRSV-seronegativen SPF-Schweinen durchgeführt. Die Vakzine bestand aus 10^5.8 TCID₅₀ plaquegereinigtem PRRSV-ISU-12 (Iowa-Stamm) pro 2 ml-Dosis. Neun Schweinen wurde eine einzelne Vakzinedosis über den intranasalen Weg (IN) gegeben, 7 Schweinen wurde eine einzelne Vakzinedosis über den intramuskulären Weg (IM) gegeben, und 9 Schweine dienten als nicht vakzinierte Herausforderungskontrollen (NV/CHALL). Vakzinierte und Kontrollen wurden am Tag 35 nach der Vakzinierung herausgefordert und dann im Hinblick auf makroskopische Lungenläsionen (Prozent der Lunge, die betroffen waren) am Tag 10 nach der Herausforderung bewertet.
Die durchschnittlichen makroskopischen Lungenläsionswerte für jede Gruppe von Schweinen sind durch die Zahl über jedem Balken in 34 gezeigt. Die Wirksamkeit der Vakzine wurde anhand einer Verringerung bei dem Lungenläsionswert ausgewertet. Beide Gruppen der Vakzinierten zeigten signifikant niedrigere (p < 0,01) makroskopische Lungenläsionswerte als die nicht vakzinierten Kontrollen. Signifikante Unterschiede bei den Werten wurden zwischen den Gruppen der Vakzinierten nicht gefunden. Die ISU-12-PRRSV-Vakzine hat sich bei drei Wochen alten Schweinen in einer Dosis von 10^5.8 TCID₅₀ als wirksam erwiesen.
ANDERE BEOBACHTUNGEN
Das ISU-12-Virus ist umhüllt, ebenso ist es empfindlich gegenüber einer Chloroformbehandlung. Die Replikation von ISU-12 ist resistent gegenüber einer 5-Bromdeoxyuridinbehandlung. Daher ist ISU-12 kein DNA-Virus. ISU-12 fehlt eine hämagglutinierende Aktivität.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Natürlich vorkommendes, isoliertes Virus, das das Reproduktioris- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) hervorruft, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Viren, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangsnummern VR 2385 und VR 2386 hinterlegt sind.
Zusammensetzung, umfassend das isolierte Virus nach Anspruch 1 und einen physiologisch verträglichen Träger.
Vakzine, die ein Schwein gegen das Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen (PRRS) schützt, umfassend ein inaktiviertes oder attenuiertes Virus und einen physiologisch verträglichen Träger, wobei das Virus vor der Inaktivierung oder Attenuierung das Virus nach Anspruch 1 ist.
Vakzine nach Anspruch 3, ferner umfassend ein Adjuvanz.
Verfahren zur Herstellung der Vakzine nach Anspruch 3, umfassend die Schritte: (a) Sammeln einer ausreichend großen Probe eines Virus nach Anspruch 1, und (b) Behandeln des Virus durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) dem Plaqueaufreinigen des Virus, (ii) dem Erhitzen des Virus bei einer Temperatur und für eine Zeitdauer, die ausreichend sind, um das Virus zu inaktivieren, (iii) dem Inkontaktbringen oder Mischen des Virus mit einer Menge einer inaktivierenden Chemikalie, die ausreichend ist, um das Virus zu inaktivieren, (iv) dem Aufbrechen des Virus in seine entsprechenden Untereinheiten und dem Isolieren wenigstens einer der Untereinheiten, und (v) dem Synthetisieren oder Isolieren einer Polynukleinsäure, die ein Oberflächenprotein des Virus codiert, dem Infizieren einer geeigneten Wirtszelle mit der Polynukleinsäure, dem Kultivieren der Wirtszelle und dem Isolieren des Oberflächenproteins aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Virus aus einer Quelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Kulturmedium, mit dem Virus infizierten Zellen und sowohl einem Kulturmedium als auch mit dem Virus infizierten Zellen, gesammelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, ferner umfassend vor dem Sammelschritt den Schritt des Kultivierens des Virus in einem geeigneten Medium.
Diagnostischer Kit zur Untersuchung eines Virus, das eine Atemwegserkrankung bei Schweinen, eine Reproduktionserkrankung bei Schweinen oder eine Reproduktions- und Atemwegserkrankung bei Schweinen hervorruft, umfassend einen Antikörper gegen das Virus nach Anspruch 1 und ein diagnostisches Mittel, das eine positive immunologische Reaktion mit dem Antikörper anzeigt.
Isoliertes Polynukleotid, bestehend im Wesentlichen aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 16.
Protein, codiert durch das isolierte Polynukleotid nach Anspruch 9.
Isoliertes Polynukleotid, bestehend im Wesentlichen aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7.
Verfahren zur Kultivierung eines Virus nach Anspruch 1, umfassend: Infizieren einer Zelllinie, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ATCC CRL 11171 und dazu äquivalenten Zelllinien, die mit dem Virus infiziert und kultiviert werden kann, und Kultivieren der infizierten Zelllinie in einem geeigneten Medium.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die geeignete Zelllinie ATCC CRL 11171 ist.