WO2019207095A1 - Gentechnisch veränderte pestiviren und deren verwendung als markerimpfstoff - Google Patents

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    • C12N2770/24371—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention is directed to a genetically modified pestivirus, characterized in that it is modified such that at least the gene segment coding for the E rns protein is derived from one distantly related pestivirus which is distantly related to the genetically modified pestivirus or of several pestiviruses which are distantly related to the genetically modified pestivirus.
  • an infected host cell or its cell culture supernatant, containing a genetically modified pestivirus according to the invention is described.
  • the present invention is directed to a vaccine and its use and the use of the genetically modified pestiviruses as vaccines, in particular as vaccines for animals and as a vaccine against classical swine fever (CSF), bovine virus diarrhea (BVD), the Border Disease (BD) and other diseases caused by pestiviruses.
  • CSF classical swine fever
  • BVD bovine virus diarrhea
  • BD Border Disease
  • a recombinant chimeric E rns polypeptide is described as well as detection systems for the detection of pestiviruses or the antibodies induced by them, in particular for the differentiation between vaccinated animals and animals after a natural infection with pestiviruses.
  • a method is described for determining to what extent an animal has been vaccinated with a vaccine according to the invention, diagnostic kits therefor and methods for controlling an infection with a pestivirus in a population of animals of the order Artiodactyla.
  • CSF Classical swine fever
  • CSFV classical swine fever virus
  • RNA virus classical swine fever virus
  • Flaviviridae RNA virus
  • Vaccination with attenuated KSPV isolates leads to a fast and long lasting immunity.
  • the gold standard vaccine most commonly used worldwide is based on variants of the so-called "C strain” vaccine virus.
  • a serological distinction of the immune response after vaccination or after surviving field infection is not possible.
  • Vaccines that allow differentiation between vaccinated animals and animals with / after natural infections (field infections) could solve these problems.
  • Such vaccines are also referred to as marker or DIV vaccines (DIVA: differentiation infected from vaccinates animals).
  • DIVA differentiation infected from vaccinates animals.
  • BBD bovine viral diarrhea
  • BVDV bovine viral diarrhea virus
  • This principle applies equally to different pestiviruses such as BVDV and CSFV.
  • This strategy thus includes the production of marker vaccines by means of the genetic engineering of chimeric pestiviruses.
  • the genomic region coding for one of the three abovementioned proteins is exchanged for homologous sequences of a related pestivirus.
  • a variety of different chemical pestiviruses have been generated in the past and, in part, their suitability as a marker vaccine. For example, reference is made here to WO 2016/176624 A2 and WO 2016/097245 A1.
  • BVDV bovine virus diarrhea virus
  • the bovine virus diarrhea virus (BVDV) isolate was altered so that the E2 gene of BVDV was replaced by the E2 gene of a swine virus isolate, so that the chimeric pestivirus induces protective antibodies against the KSPV E2 protein, see also Reimann et al. , 2004, Virology, 322, 143-157.
  • Several studies have shown that although a very good protective effect can be achieved, a relatively high rate of false positive results can be observed in different serological tests, so that field infections in vaccinated populations are only limited can be recognized, see, for. Meyer et al., 2017, Transbound Emerg Dis, 64 (6): 2013-2022, and Meyer et al., 2018, Transbound Emerg Dis, 65 (2): e505-e508.
  • E rns protein (number of amino acids: 227) is one of the immunogenic structural proteins of CSFV in addition to E2 and has the following properties among others:
  • E rns has a ribonuclease activity
  • Membrane association occurs via a C-terminal amphipathic helix
  • the molecular structure of the glycosylated coat protein E rns was first described by Langedijk JP, J Virol, 2002, 76, 10383-10392;
  • E rns • The antigenic structure of E rns has been further characterized by epitope mapping studies. The epitopes of E rns are increasingly discontinuous.
  • a fundamental problem of previous chimeric pestiviruses with regard to a robust DIVA concept is the serological cross-reactivity between antibodies against the classical ruminant pestiviruses, such as BVDV and BDV, and KSPV-specific antibodies. There is a high degree of serological cross-reactivity in genetically closely related pestiviruses.
  • the pestivirus marker vaccine described in WO 2017/1 14778 A1 is distinguished by the fact that the E ms protein is a chimeric E rns protein, wherein the gene coding for it originates in the 5 'range from a pestivirus, the genetic only very little is related to the altered pestivirus and has at the 3 'end a corresponding gene portion of an E gene, derived from a pestivirus closely related to the altered pestivirus.
  • the task is to provide pestiviruses which are suitable as marker vaccines and have a lower serological cross-reactivity with classical pestiviruses (eg KSPV, BVDV, BDV) in relation to the E rns protein.
  • classical pestiviruses eg KSPV, BVDV, BDV
  • the following invention relates to a genetically modified pestivirus, wherein the E rns- encoding gene of the pestivirus is modified such that at least the genome segment encoding the E rns protein is derived from a pestivirus, which is only distantly related to the genetically modified pestivirus.
  • gene or “gene segment” or “genome segment” is understood herein to mean that a nucleic acid sequence or a genomic region coding for a specific protein or part of a protein (hereinafter also generally referred to as peptide or polypeptide) is called.
  • genetically modified pestivirus is understood herein to mean a pestivirus which, by genetic engineering methods, has a gene encoding E rns which at least partially originates from a different pestivirus than the genetically modified pestivirus. That is, the genome portion encoding the original DNA is at least partially replaced by a corresponding E rns gene portion of a heterologous pestivirus distantly related to the genetically modified pestivirus.
  • the pestiviruses which have been genetically modified in this way are suitable as vaccines, eg marker vaccines, while retaining the ability to replicate and, moreover, have a significantly reduced cross-reactivity.
  • the exchange of E rns sequences achieves a different degree of attenuation depending on the sequence used.
  • Whether a pestivirus is closely related or distantly related to another pestivirus is determined according to the invention by the level of identity of the nucleotide sequences of the E rns gene of the original pestivirus and the sequence of the introduced E rns gene of another pestivirus.
  • the KRS of the KSPV is compared to the original E rns gene compared to the introduced gene portion of the distantly related pestivirus, e.g. B. with the E rns coding gene section of the pestivirus from the rat.
  • disantly related is used when the identity determined on the basis of the number of identical or different nucleic acid components is less than 65% compared to the genetically modified pestivirus (eg KSPV, BVDV). If the identity is greater than or equal to 65%, then one speaks of a "close or close affinity”.
  • the genetically modified pestivirus according to the invention is characterized in that the E rns gene portion from the pestivirus which is genetically distantly related, an E rns gene portion of a pestivirus selected from the group consisting of Pronghorn pestivirus, Bungowannah virus; LINDA virus, rat pestivirus, atypical porcine pestivirus (APPV) and bats pestivirus.
  • a pestivirus selected from the group consisting of Pronghorn pestivirus, Bungowannah virus; LINDA virus, rat pestivirus, atypical porcine pestivirus (APPV) and bats pestivirus.
  • the genetically modified pestivirus one wherein the E rns gene segment encoding a chimeric protein E rns gene segment is, with a 5 'portion consisting of the corresponding portion of a E rns gene segment of a first distantly related pestivirus and a second portion located 3 ', also derived from an E rns gene portion of a second distantly related pestivirus, the first and second gene portions being derived from different pestiviruses.
  • the gene segment exchanged in the genetically modified pestivirus for the E rns gene is one consisting of two segments, these segments being derived from two different pestivirus species.
  • one gene section originates from the pestivirus of the rat, while the other gene section originates from the pestivirus of the Pronghorn antelope (Pronghorn).
  • Further examples include one gene portion derived from the rat pestivirus while the other is from APPV or one gene portion from APPV and the other from the pronghorn pestivirus, as well as other combinations as long as both gene portions are distantly related to the E rns Gene portion of the target pestivirus.
  • the genetically modified pestivirus ie the parent pestivirus (or target pestivirus) is a pestivirus selected from the group consisting of the bovine virus diarrhea virus (BVDV); Classical Swine Fever Virus (CSFV), "Hobi-like” Pestivirus and Border Disease Virus (BDV).
  • BVDV bovine virus diarrhea virus
  • CSFV Classical Swine Fever Virus
  • BDV Border Disease Virus
  • the genetically modified pestivirus is one which has a chimeric E rns gene section, this chimeric E rns gene section is one with a part of the E rns gene section of the rat pestivirus and another part of the E Gene section of Pronghorn pestivirus.
  • the E rns genes of these two pestiviruses are the gene sequences according to SEQ ID NO. 3 and 4.
  • the E rns gene segment that is introduced into the genetically modified to pestivirus a 'corresponding to the 5 share' portion of the E rns gene from the rat pestivirus and a 3 'portion corresponding with a 5 the 3 'section from the E rns gene of the Pronghorn pestivirus.
  • the E rns gene segment is one having a sequence according to SEQ ID No. 1.
  • the chimeric E rns gene composed of the 5 'portion of the rat pestivirus E rns gene and the 3' portion of the pron gene pestivirus E rns gene, may be one which has at least a sequence identity of 90%, as 95%, in particular 99% compared to the sequence according to SEQ ID NO. 1 has.
  • These two E rns gene segments meet the requirements that they have less than 65% identity with the corresponding E rns gene sections of the pestivirus to be modified.
  • the E rns coding sequence from the rat pestivirus is described in Firth et. al., 2014, MBio, 5 (5): e01933-14, corresponding to items 1618-2298 of GenBank Accession no.
  • the E rns coding sequence of proghorn pestivirus is one of 681 nucleotides corresponding to positions 1 165-1845 of GenBank No. NC024018 and described in Neill et al., 2014, Genome Announc. 2014 Jun 12; 2 (3).
  • the genetically modified pestivirus is one that is attenuated.
  • attenuated is meant herein that the virus has a reduced virulence.
  • the genetically modified pestivirus is a genetically modified CSFV.
  • This genetically modified CSFV E rns thereby contains a gene segment, composed of a 5 'portion of the E rns kodieren- the gene segment from the rat pestivirus and a 3' gene segment In accordance with the 3 'gene segment coding for E rns from the Pronghorn pestivirus ,
  • the gene sections each comprise at least 20 nucleotides, such as 25 nucleotides, such as 30 nucleotides of each E rns gene portion of the pestivirus.
  • the present invention relates to a host cell which contains a genetically modified pestivirus according to the invention.
  • Suitable host cells for the replication of pestiviruses are well known and are accordingly removable from publications, etc., and are freely available.
  • suitable host cells include cell lines such as porcine cell lines including PK15, SK6, or STE in a genetically modified KSPV virus, bovine cell lines such as MDBK in a genetically modified BVDV, but also other suitable host cells described including bovine cells such as bovine cells - play SFT-R.
  • the present invention is directed to a composition of comprising host cells of the invention or genetically modified according to the invention pestiviruses or components thereof at least comprising a E rns gene segment as defined in the present application, or a polypeptide encoded by one of these E rns gene segments.
  • These components comprise the E rns gene segment or the polypeptide encoded by this E rns gene segment and may be present in appropriate cell culture media or in other forms.
  • the composition can also be used in the form of cell lysates. Of course, the composition may also include combinations of these individual components.
  • the present invention is directed to vaccines for animals, especially pigs but also ruminants such as cattle, and generally for animals of the order Artiodactyla.
  • vaccines include a genetically modified pestivirus or host cell of the invention or a combination thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Suitable materials for the vaccine are known to the person skilled in the art, in particular the further constituents of the vaccines are such that they permit administration via the correspondingly suitable administration route.
  • Suitable routes of administration for the vaccine include oral, nasal, mucosal, cutaneous, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • mammals for which the vaccine according to the invention is suitable are meant animals which are susceptible to an infection with at least one pestivirus. These are predominantly mammals and are mostly members of the order Artiodactyla.
  • Possible animals for vaccination according to the invention are pigs, including wild boars and ruminants, such as cattle, sheep, goats or other ruminants, including wild ruminants (such as deer, fleas, antelopes) or camelids (such as dromedaries, two-humped camels and New World camelids such as alpacas and vikunas).
  • the vaccine according to the invention may comprise a combination of more than one genetically modified pestivirus, e.g. two different genetically modified pestiviruses.
  • the pestiviruses contained can be live, attenuated or inactivated pestiviruses.
  • the attenuation can be determined by the chimerization of the E rns sequences, or a combination of the described invention with further genetic modifications to attenuate the virus or in combination with a naturally attenuated in the target species pestivirus.
  • these are a live vaccine, for example those with attenuated marker vaccines, as described according to the invention.
  • live vaccines are usually in freeze-dried form. Accordingly, the vaccines according to the invention can be formed.
  • the person skilled in the art knows corresponding processes for freeze-drying and for subsequent reconstitution.
  • these vaccines may be part of a kit, namely, a kit or systems with multiple containers, one of these containers comprising the freeze-dried vaccine, and another container comprising means for reconstructing this freeze-dried vaccine.
  • pharmaceutically acceptable carriers includes suitably suitable solvents and liquids such as water, physiological saline solutions or phosphate buffered saline solutions as well as optionally further stabilizers and preservatives.
  • these vaccines may contain adjuvants, those skilled in the art are aware of suitable adjuvants.
  • the vaccine according to the invention can be administered with further antigens or corresponding pestiviruses which express further antigens, as a so-called combination vaccine.
  • the present invention is directed to the use of the genetically modified pestiviruses or the host cells of the invention or the chimeric recombinant E rns polyeptide of the invention alone or in combination for the prevention or reduction of an infection with the pestivirus or corresponding signs pestivirus-induced disease in these animals.
  • a method of vaccinating animals comprising the step of administering the vaccine of the invention.
  • this vaccine is suitable e.g. be used prophylactically or therapeutically as part of a treatment regimen to prevent infection or spread of pestivirus infection
  • a recombinant chimeric E rns polypeptide having an N-terminal portion and a C-terminal portion, wherein both the N-terminal portion and the C-terminal portion are derived from pestiviruses distantly related to KSPV and BVDV ,
  • These distantly related pestiviruses comprise different pestiviruses, in particular from the group consisting of Pronghorn pestivirus, bungowannah virus, LINDA virus, rat pestivirus, atypical porcine pestivirus (APPV) and bat pestivirus.
  • the recombinant chimeric E rns polypeptide according to the invention is characterized in that it has an N-terminal E rns moiety which is encoded by the rat pestivirus and a C-terminal E rns moiety which is encoded by the Pronghorn virus in particular that this polypeptide comprises the sequence according to SEQ No. 2.
  • the sequence coding for the polypeptide also comprises homologous sequences of the sequence according to SEQ ID No. 2, which has an identity at the amino acid level of at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%.
  • a detection system for the detection of pestiviruses or pestivirus specific antibodies comprises a recombinant E rns polypeptide according to the present invention as antigen.
  • the detection system includes a non-chimeric recombinant E rns polypeptide as antigen.
  • this detection system may, on the one hand, comprise the recombinant polypeptide according to the invention as antigen, and in a further embodiment, this detection system has the abovementioned polypeptide according to the invention and, in addition, a second polypeptide which specifically detects a field infection with the pestivirus , in particular KSPV or BVDV.
  • the detection system according to the invention is one which permits a differentiated serological detection of a vaccination of the animal with genetically modified pestivirus according to the invention against infection of the animal with non-genetically modified pestivirus.
  • the vaccinated animals do not have antibodies against the enzymes of the non-genetically modified pestiviruses which cause the field infection, corresponding antibodies to the vaccine-encoded E rns can occur.
  • the detection system is one for the differentiated detection of vaccination of an animal with a vaccine according to the invention, in particular a CSFV or BVDV vaccine, this detection system being characterized in that it contains a recombinant Eros polypeptide as antigen as present namely, a non-chimeric E ms polypeptide derived from pestiviruses distantly related to KSPV and BVDV, these distantly related pestiviruses in particular being derived from the Group consisting of Pronghorn pestivirus, Bungowannah virus, LINDA virus, rat pestivirus, atypical porcine pestivirus (APPV) and bat pestivirus.
  • a recombinant Eros polypeptide as antigen namely, a non-chimeric E ms polypeptide derived from pestiviruses distantly related to KSPV and BVDV, these distantly related pestiviruses in particular being derived from the Group consisting of Pronghorn pestivirus, Bungowannah virus, LINDA virus,
  • the detection system according to the invention is particularly suitable for allowing a corresponding distinction between vaccinated animals and naturally infected animals.
  • the present invention thus relates to the use of the recombinant chimeric E rns peptide for the detection of antibodies against a genetically modified pestivirus according to the invention, in particular a genetically modified virus of classical swine fever (CSFV) or virus of bovine viral diarrhea (BVDV) is.
  • CSFV classical swine fever
  • BVDV virus of bovine viral diarrhea
  • One embodiment is the use for differentiating a natural infection with CSFV, BVDV or other pestiviruses and a vaccination with a genetically modified pestivirus according to the invention. This use is carried out, for example, in the form of a DIVA ELISA.
  • the use according to the invention is a use of the recombinant chimeric E rns polypeptide according to the invention or the use of a non-chimeric E rns polypeptide of pestiviruses distantly related to KSPV and BVDV, said distantly related pestiviruses, in particular from the group comprising Pronghorn Pestivirus, bungowannah virus, LINDA virus, rat pestivirus, atypical porcine pestivirus (APPV) and bat pestivirus.
  • Pronghorn Pestivirus bungowannah virus
  • LINDA virus LINDA virus
  • rat pestivirus atypical porcine pestivirus (APPV) and bat pestivirus.
  • APPV porcine pestivirus
  • the present invention relates to a diagnostic kit comprising a genetically modified pestivirus according to the invention and / or a recombinant chimeric E rns polyeptide according to the invention or parts thereof, as defined herein.
  • these distantly related pestiviruses are pestiviruses in particular from the group consisting of Pronghorn pestivirus, Bungowannah virus, LINDA virus, rat pestivirus, atypical Prozines pestivirus (APPV)
  • the detection system according to the invention and the methods according to the invention may include a conventional detection system or method known to the person skilled in the art, in particular immunological methods and immunological detection systems.
  • the method according to the invention and the detection system according to the invention may in particular be an ELISA system.
  • this system can be used as a DIVA (differentiation of infected from vaccinated animals) ELISA.
  • the detection system according to the invention or the diagnostic test kit according to the invention may contain further customary constituents, such as washing buffer, blocking buffer and substrates for the detection of formed complexes of antigens / antibodies. Possibly. Further secondary antibodies can be used to detect bound antibodies.
  • suitable components in particular suitable secondary antibodies with corresponding markers. These markers are in particular those which allow an enzymatic reaction or other markers, such as dyes.
  • the pictures show:
  • FIG. 1 Genetic identities of the complete neuron- encoding nucleotide sequences of selected pestiviruses. To determine the genetic identities, E rns encoding sequences of classical pestiviruses (eg KSPV and BVDV) or of the pestiviruses distantly related to these classical pestiviruses (eg pestiviruses "Rat” and “Pronghorn”) were used, as well as the chimera E rns sequence "Ra-Pro”. The identities were determined in each case between two mutually compared sequences using MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1, default settings).
  • Figure 2 Shown are the characteristics of the used swine virus and vaccine prototypes.
  • FIG. 3 shows the viral genome loads in the blood, saliva and feces in the first 28 days after vaccination.
  • FIG. 4 shows the determination of the induction of neutralizing antibodies.
  • FIG. 5 Shown are the DIVA properties of the marker vaccine prototypes.
  • Recombinant pestiviruses based on a cDNA clone of the KSPV isolate "Alfort-Tübingen” (genotype 2.3) were generated by directed mutation and cloning of nucleic acid fragments (Meyers et al, 1996, J. Virol.70 (3): 1588-95 ). The entire DNA coding sequence of KSPV Alfort-Tübingen was replaced by the corresponding areas of Pronghorn pestivirus, rat pestivirus and a combination of rat and Pronghorn pestivirus.
  • RNA of the Pronghorn pestivirus isolate or starting from a nucleic acid synthesized on the basis of the published sequence in the rat pestivirus were amplified for this purpose by means of PCR.
  • About 20 primers were fused to both ends of the amplicon, which were complementary to the sequence portions immediately adjacent upstream and downstream of the genome region to be replaced.
  • target-primed plasmid amplification the Pronghorn and rat pestivirus sequences were introduced into the target plasmid containing only parts of the pestiviral cDNA. After disruption of the original plasmid by DpnI digestion, amplification of the newly generated plasmid in E.
  • the modified E rns sequence was removed from the plasmid via an Xho-Bgl ⁇ 'restriction digestion. cut and converted via the same interfaces into the actual infectious cDNA clone.
  • site-directed mutagenesis all Sma ⁇ restriction Interfaces, except for an artificially introduced one, which defines the 3 ' end of the pestivirus genome.
  • the plasmids prepared in this way were linearized by means of SmaI restriction and then rewritten into RNA by means of Sp6 DNA-dependent RNA polymerase.
  • the chimeric pestivirus RNA prepared in this way was transfected by electroporation into porcine porcine kidney cells and subsequently passaged in different cell lines.
  • the successful virus replication was detected by immunofluorescent staining with the pestivirus-specific monoclonal antibody C16.
  • recombinant chimera pestiviruses were harvested after a freeze-thaw cycle of infected cell cultures, titrated, and the complete genome sequences were determined by high-throughput sequencing.
  • the three chimeric pestiviruses were diluted according to their virus titers, and then applied with a uniform dose of about 10 5 TCIDso / pig. The dose was confirmed following back-titration after administration to the pigs.
  • the three vaccine prototypes with different growth behavior in cell culture were subsequently used for a vaccination study in 10-week-old piglets.
  • the vaccine viruses were adjusted to equal titers and administered intramuscularly to a group of 5 piglets.
  • Another group of 5 piglets received an equal dose of the parental KSP wild-type virus "Alfort-Tübingen"("AlfT", genotype 2.3), from which the genetically engineered vaccine viruses were derived to determine the possible attenuation of virulence characteristics (control attenuation).
  • the molecular biological studies were carried out after preparation of the nucleic acids from body fluids using the QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen). For this purpose, the saliva and Kottupfer were previously expressed in one milliliter of cell culture medium and the material from the swab in suspension. For the PCR studies on viremia lysed EDTA blood was used as material after the freeze-thaw cycle.
  • the preparation of nucleic acids from organ material was carried out using NucleoSpin ® RNA kit (Macherey and Nagel), starting from a pea g Rossen organ piece. To quantify genome loads, a quantitative Taqman-based real-time RT-PCR was performed.
  • QuantiTect Probe RT-PCR kit (Qiagen) was used using primers and probes according to Hoffmann et al., 2005, J Virol Methods, 130 (1-2): 36-44.
  • the discrimination of vaccine viruses and challenge virus in the organ samples was carried out by comparison of 150 nucleotide sequence fragments in the 5 'untranslated region and subsequent assignment to the KSPV genotype 1.1 (challenge virus) or 2.3 (vaccine viruses).
  • the haematological and serological tests were carried out on EDTA blood or serum samples.
  • the determination of white blood cells was done from fresh EDTA blood using a blood analyzer (Abacus Junior Vet) according to manufacturer's recommendations.
  • VNTs virus neutralization tests
  • the titer determination was carried out after testing and evaluation of quadruplicates of each serum dilution step, on the one hand tested with the genetically unmodified wild-type virus "AlfT" (genotype 2.3), on the other hand with the genetically heterologous CSFV ("Koslov", genotype 1.1).
  • the sera from all pigs were analyzed in an E2-based commercial ELISA
  • FIG. 1 shows how an identity comparison between pestivirus sequences takes place.
  • the identities between E rns coding sequences from KSPV Isolate "Alfort-Tübingen"("AUT"), BVDV isolate CP7, a distantly related pestivirus from the rat and a distantly related pestivirus from a pronghorn antelope and from the chimeric pestivirus "RaPro" are shown for the complete E rns coding area.
  • the identities were each determined between two compared sequences using MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1, default settings).
  • FIG. 2 shows an overview of the characteristics of the three prepared marker vaccine prototypes "Pronghorn”, “Rat” and “RaPro” in which, based on the KSPV "Alfort-Tübingen”("AlfT", genotype 2.3), the E rns sequences correspond to Several homologous E rns sequences of distant pestiviruses have been exchanged.
  • the prototype "Pronghorn” showed surprisingly no difference to CSFV "AlfT” with regard to replication and propagation in cell culture and could be propagated to similar virus titers (titre 10 6 0 TCID 50 / ml).
  • the vaccine prototype "rat” showed a comparatively reduced replication (titre 10 44 TCIDso / ml).
  • the excellent replicative properties of the vaccine candidate Pronghorn should be exploited to produce a vaccine virus with a chimeric E rns possessing improved replication properties.
  • the chimä- rillone E rns thereby contains the antigenically active region of the E rns protein from the RAT ten-pestivirus (N-terminally located) and a C-terminal localized portion of the E rns from Pronghorn pestivirus.
  • control group attenuation intramuscularly infected with CSFV "AlfT", unvaccinated control group: orally infected with CSFV “Koslov”
  • Attenuation control group three animals had to be euthanized on day 18 of the experiment due to serious illness for animal welfare reasons, as well as unvaccinated animals six days after loading infection.
  • the vaccinated animals showed no symptoms of CSF or other health problems 12-13 days after challenge infection.
  • group "Pronghorn” some animals showed slight fever between the 3rd and 4th day after vaccination (more than 40 ° C for more than two days).
  • Blood cell parameters such as leucocyte count and platelet count, are useful in assessing the severity of KSPV infection. Both cell types are significantly reduced after KSPV infection (leukopenia, thrombocytopenia). Both control groups show pronounced leukopenia a few days after the infection. In the "Pronghorn" vaccine group, transient (temporary) leukopenia occurred in three out of five pigs. For the other "Rat” and “Ra Pro” vaccination groups, leucocyte counts were in the expected reference range, with one animal showing lower limit values for a few days in each case. The numbers of leucocytes confirm the attenuation of all prototype vaccines in comparison to the source virus "AlfT". A comparable picture can be seen in platelet counts.
  • the "Pronghorn” vaccine virus shows the least attenuation, so that a correlation to the replication and the growth behavior in cell culture can be determined (FIG. 2).
  • the vaccine prototype "RaPro” again has an intermediate phenotype compared to the "Pronghorn” and "Rat” viruses.
  • Genomes of the rat vaccine virus could never be detected in the blood, faeces or saliva (FIG. 3).
  • these analyzes confirm a weakening of virulence in pigs analogous to observations in cell culture, with the vaccine virus "Pronghorn” being the least attenuated, while the "rat” vaccine virus has a very strong attenuation and "RaPro” an inter mediate attenuation.
  • VNT virus neutralization tests
  • a significant aspect of the invention is a reliable differentiation of vaccinated animals from infected animals (DIVA principle). While the pigs of the unvaccinated group (control challenge infection) died before the induction of a humoral immune response and the wild-type virus "AlfT" (control attenuation), the induction of antibodies partially inhibited, all vaccinated animals have high antibody titers against the E2 antigen, regardless from the vaccine prototype used ( Figure 5, above). Thus, a diagnostic detection of KSPV E2-specific antibodies is clearly documented. The same serum samples of the vaccinated animals showed no reactivity in an E.
  • E rns antigens of genetically distantly related pestiviruses are very promising for a robust DIVA concept, since a reduced or, ideally, completely lacking cross-reactivity is to be expected here.
  • the vaccine candidates "RaPro” and “Rat” are particularly suitable.

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Abstract

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus, dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es derart modifiziert ist, dass zumindest der für das Ems Peptid kodierende Genabschnitt aus einem entfernt verwandten Pestivirus oder aus mehreren Pestiviren stammt, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind. In einem weiteren Aspekt wird eine infizierte Wirtszelle oder ihr Zellkulturüberstand, ein erfindungsgemäß gentechnisch modifiziertes Pestivirus enthaltend, beschrieben. Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Vakzine und deren Verwendung sowie die Verwendung der gentechnisch modifizierten Pestiviren als Vakzine, insbesondere als Vakzine für Tiere sowie als Vakzine gegen die Klassische Schweinepest (KSP), die Bovine Virus Diarrhöe (BVD), die Border Disease (BD) sowie andere durch Pestiviren verursachte Erkrankungen. Weiterhin wird ein rekombinantes chimäres Ems Peptid beschrieben sowie Nachweissysteme zum Nachweis von Pestiviren oder den von ihnen induzierten Antikörpern, insbesondere zur Differenzierung zwischen geimpften Tieren und Tieren nach einer natürlichen Infektion mit Pestiviren. Schließlich wird ein Verfahren zur Bestimmung beschrieben, inwieweit ein Tier mit einem erfindungsgemäßen Vakzin vakziniert wurde sowie diagnostische Kits hierfür und Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ordnung der Artiodactyla.

Description

Gentechnisch veränderte Pestiviren und deren Verwendung als Markerimpfstoff In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus, dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es derart modifiziert ist, dass zumindest der für das Erns Protein kodierende Genabschnitt stammt aus ei- nem entfernt verwandten Pestivirus das entfernt verwandt zu dem gentechnisch mo- difizierten Pestivirus ist oder aus mehreren Pestiviren, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind. In einem weiteren Aspekt wird eine infi zierte Wirtszelle oder ihr Zellkulturüberstand, ein erfindungsgemäß gentechnisch mo- difiziertes Pestivirus enthaltend, beschrieben. Darüber hinaus richtet sich die vorlie- gende Erfindung auf eine Vakzine und deren Verwendung sowie die Verwendung der gentechnisch modifizierten Pestiviren als Vakzine, insbesondere als Vakzine für Tiere sowie als Vakzine gegen die Klassische Schweinepest (KSP), die Bovine Virus Diarrhöe (BVD), die Border Disease (BD) sowie andere durch Pestiviren verursachte Erkrankungen. Weiterhin wird ein rekombinantes chimäres Erns Polypeptid beschrie- ben sowie Nachweissysteme zum Nachweis von Pestiviren oder den von ihnen indu- zierten Antikörpern, insbesondere zur Differenzierung zwischen geimpften Tieren und Tieren nach einer natürlichen Infektion mit Pestiviren. Schließlich wird ein Ver- fahren beschrieben zur Bestimmung, inwieweit ein Tier mit einem erfindungsgemä- ßen Vakzin vakziniert wurde sowie diagnostische Kits hierfür und Verfahren zur Kon- trolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ord- nung der Artiodactyla.
Stand der Technik
Die Klassische Schweinepest (KSP) wird durch ein RNA-Virus (Virus der Klassi- schen Schweinepest; KSPV) verursacht, dieses gehört zu der Gattung der Pestiviren innerhalb der Familie der Flaviviridae. Es stellt eines der weltweit bedeutendsten Tierseuchenerreger dar. Eine Impfung mit attenuierten KSPV Isolaten führt zu einer schnellen und lang anhaltenden Immunität. Das Goldstandard-Vakzin, das weltweit am häufigsten eingesetzt wird, basiert auf Varianten des sogenannten„C-Stamm“- Impfvirus. Eine serologische Unterscheidung der Immunantwort nach Impfung bzw. nach überstandener Feldinfektion ist jedoch nicht möglich. Diese Tatsache erschwert zum einen die Bekämpfung der KSP, da serologische Methoden in einer geimpften Population nicht eingesetzt werden können, zum anderen hat dies auch gravierende wirtschaftliche Konsequenzen, da geimpfte Tiere nicht oder schlechter vermarktungs- fähig sind und weitreichende Handelsrestriktionen auferlegt werden. Impfstoffe, die eine Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und Tieren mit/ nach natürlichen In- fektionen (Feldinfektionen) ermöglichen, könnten diese Probleme lösen. Solche Impf- stoffe werden auch als Marker- oder Dl VA- Impfstoffe (DIVA: differentiation infected from vaccinates animals) bezeichnet. Für eine weitere wirtschaftlich relevante Tier- seuche beim Rind, die Bovine Virus Diarrhöe (BVD) ist die Situation vergleichbar. Sie wird ebenfalls durch ein Pestivirus, das Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) aus- gelöst, und auch hier könnten Marker-Impfstoffe eine Möglichkeit bieten, zwischen geimpften und infizierten Rindern mittels serologischer Methoden zu unterscheiden.
Üblicherweise wird bei einer pestiviralen Infektion, z. B. mit KSPV oder BVDV, eine Immunantwort gegen die glykosylierten Hüllproteine E2 und Erns, sowie gegen das Nichtstruktur-Protein NS3 induziert. Insbesondere die Virus-neutralisierenden E2-spezifischen Antikörper spielen eine Schlüsselfunktion in der protektiven Immun- antwort und bilden daher die Grundlage für die Entwicklung von entsprechenden Mar-kerimpfstoffen gegen KSP, BVD und andere durch Pestiviren verursachte Er- krankungen. Das DIVA-Prinzip beruht meist auf dem Nachweis von Antikörpern ge- gen das pestivirale Erns. Mit einem E2 basierten Markerimpfstoff immunisierte Tiere bilden eine protektive E2 spezifische Immunantwort aus und sind Erns Antikörper ne- gativ. Dieses Prinzip gilt gleichermaßen für unterschiedliche Pestiviren wie BVDV und KSPV. Diese Strategie umfasst somit die Herstellung von Markerimpfstoffen mit- tels gentechnischer Herstellung chimärer Pestiviren. Hierzu wird der für eines der drei oben genannten Proteine kodierende Genombereich durch homologe Sequen- zen eines verwandten Pestivirus ausgetauscht. Eine Vielzahl unterschiedlicher chi märer Pestiviren wurde in der Vergangenheit erzeugt und zum Teil auf ihre Eignung als Marker-Impfstoff hin untersucht. Beispielhaft wird hier auf die WO 2016/176624 A2 und WO 2016/097245 A1 verwiesen.
Insbesondere die Abwesenheit von Erns kodierenden Sequenzen oder deren Austausch durch homologe Sequenzen anderer Pestiviren ist eine vielversprechende Strategie, um einen serologischen Negativmarker zu entwickeln. Für die Herstellung von Lebendimpfstoffen ist die Deletion der von Ems-kodierenden Sequenzen aller- dings nicht möglich, da es sich um ein für Pestiviren essentielles Protein handelt. Vor kurzem wurde durch die europäische Arzneimittelagentur (EMA) weltweit erstmals ein chimäres Pestivirus als KSP-Marker Impfstoff zugelassen, hierzu handelt es sich um Suvaxyn® CSF Marker, Zoetis, Deutschland. Es handelt sich hierbei ebenfalls um die Strategie eines serologischen Negativmarkers, basierend auf dem Ausbleiben der Immunantworten gegen das Erns Protein von KSPV. Hier wurde das Bovine Virus Diarrhoe Virus (BVDV) Isolat dahingehend verändert, dass das E2 Gen von BVDV durch das E2 Gen eines Schweinepestvirusisolates ersetzt wurde, so dass das Chi märe Pestivirus protektive Antikörper gegen das KSPV E2 Protein induziert, siehe auch Reimann et al., 2004, Virology, 322, 143-157. Es zeigte sich in mehreren Stu- dien, dass zwar eine sehr gute Schutzwirkung erzielt werden kann, jedoch in unter- schiedlichen serologischen Tests eine relativ hohe Rate an falsch positiven Ergebnis- sen zu beobachten ist, so dass Feldinfektionen in geimpften Populationen nur einge- schränkt erkannt werden können, siehe z. B. Meyer et al., 2017, Transbound Emerg Dis, 64(6): 2013-2022 und Meyer et al., 2018, Transbound Emerg Dis, 65(2): e505- e508. Die beobachteten falsch-positiven Reaktionen sind wahrscheinlich verursacht durch serologische Kreuzreaktivität, da BVDV und KSPV genetisch und antigene- tisch eng miteinander verwandt sind. Neben den falsch-positiven Resultaten bereitet auch die tierseuchenrechtlich bedeutende Unterscheidung von Infektionen bei Schweinen mit KSPV gegenüber Infektionen mit ruminanten Pestiviren (Pestiviren der Wiederkäuer), wie BVDV oder Border Disease virus (BDV), bei Anwendung von Suvaxyn® Probleme, da der Impfstoff auf dem BVDV Isolat„CP7“ beruht.
Für BVD ist bislang kein Markerimpfstoff zugelassen. Ein chimäres BVD-Virus, wel- ches die Erns-Sequenz des Pronghorn-Pestivirus trägt, ist beschrieben (Luo, et al, 2012). Eine Verwendung des Pronghorn Erns im Kontext eines CSFV-Vakzins sowie experimentelle Daten zur Erzeugung einer KSPV-Chimäre und zur Immunantwort ge- gen ein solches Impfvirus in der Tierart Schwein sind bislang nicht beschrieben. Das Erns Protein (Anzahl an Aminosäuren: 227) zählt neben dem E2 zu den immuno- genen Strukturproteinen des KSPV und weist unter anderem folgende Eigenschaften auf:
• Erns besitzt eine Ribonukleaseaktivität;
• die Hälfte der molekularen Masse des Erns ist auf Glykosylierung zurückzu- führen;
• die Membranassoziation erfolgt über eine C-terminale amphipathische Helix;
• die molekulare Struktur vom glykosylierten Hüllprotein Erns wurde erstmals von Langedijk J.P., J Virol, 2002, 76, 10383-10392, beschrieben;
• die Antigenstruktur des Erns wurde mittels Epitope Mapping Studien näher charakterisiert. Die Epitope des Erns liegen dabei vermehrt diskontinuierlich vor.
Ein grundlegendes Problem bisheriger chimärer Pestiviren im Hinblick auf ein robustes DIVA-Konzept ist die serologische Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern gegen die klassischen ruminanten Pestiviren, wie BVDV und BDV, und KSPV-spezi- fischen Antikörpern. Es besteht ein hoher Grad von serologischer Kreuzreaktivität bei genetisch eng verwandten Pestiviren.
In den letzten Jahren wurden mehrere neue„atypische“ Pestiviren entdeckt, die sich genetisch stärker von klassischen, oben genannten Pestiviren (wie z.B. KSPV, BVDV, BDV und HoBi-like Pestiviren) unterscheiden. Die in WO 2017/1 14778 A1 be- schriebene Pestivirus Marker Vakzine zeichnet sich dadurch aus, dass das Ems Pro- tein ein chimäres Erns Protein ist, wobei das dafür kodierende Gen im 5‘ Bereich von einem Pestivirus stammt, das genetisch nur sehr wenig mit dem veränderten Pestivi- rus verwandt ist und am 3‘ Ende einen entsprechenden Genabschnitt eines Erns Gens aufweist, der von einem mit dem veränderten Pestivirus eng verwandten Pesti- virus stammt. Hierzu wird in dieser Schrift weiter ausgeführt, dass ein vollständiger Austausch des originalen Erns in dem Pestivirus durch ein heterologes Erns von einem genetisch entfernt verwandten Pestivirus die Replikation des erhaltenen Chimären Pestivirus entweder stark reduziert oder sogar stoppt. Dieses Dokument lehrt, dass ein vollständiger Austausch des Erns Gen des zu modifizierendes Pestivirus durch ein Erns Gen aus einem entfernt verwandten Pestivirus in Bezug auf die virale Replikation und damit die Herstellung und Vermehrung eines Lebend Impfstoffes sehr nachteilig ist. Insbesondere Erns Sequenzen von entfernt verwandten Pestiviren würden die oben erwähnten Probleme einer serologischen Kreuzreaktivität minimieren und damit eine Anwendung als serologischer Negativmarker in der Tierseuchenbekämpfung maßgeblich verbessern.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe ist die Bereitstellung von Pestiviren, die als Marker Vakzine geeignet sind, und eine bezogen auf das Erns Protein geringere serologische Kreuzreaktivität mit klassischen Pestiviren (z.B. KSPV, BVDV, BDV) aufweisen.
In einem ersten Aspekt bezieht sich die folgende Erfindung auf ein gentech- nisch modifiziertes Pestivirus, wobei das für Erns kodierende Gen des Pestivirus der- art modifiziert ist, dass zumindest der für das Erns-Protein kodierende Genomab- schnitt aus einem Pestivirus stammt, das nur entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus ist.
Unter dem Ausdruck„Gen“ oder„Genabschnitt“ oder„Genomabschnitt“ wird vorliegend verstanden, dass eine Nukleinsäure-Sequenz oder eine genomische Re- gion kodierend für ein spezifisches Protein bzw.Teil eines Proteins (im Folgenden auch allgemein als Peptid oder Polypeptid bezeichnet) genannt wird.
Unter dem Ausdruck„gentechnisch modifiziertes Pestivirus“ wird vorliegend verstanden, ein Pestivirus, das durch gentechnische Verfahren ein für Erns kodieren- des Gen aufweist, das zumindest teilweise aus einem anderen Pestivirus stammt als das gentechnisch modifizierte Pestivirus. D. h., der ursprüngliche Erns kodierende Ge- nomabschnitt ist zumindest teilweise durch einen entsprechenden Erns Genabschnitt eines heterologen, zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus entfernt verwand- ten Pestivirus ersetzt.
Es zeigte sich nun überraschend, dass einerseits die so gentechnisch modifi- zierten Pestiviren unter Beibehaltung der Replikationsfähigkeit als Vakzine, z.B. Mar- ker Vakzine, geeignet sind und darüber hinaus eine deutlich verringerte Kreuzreakti- vität aufweisen. Gezeigt werden konnte dies bei einem gentechnisch modifizierten Pestivirus, bei dem Teilbereiche der Erns kodierenden Sequenz von zwei unterschied- lichen jeweils entfernt verwandten Pestiviren miteinander kombiniert wurden. Zusätz- lich wird durch den Austausch von Erns-Sequenzen je nach verwendeter Sequenz ein unterschiedlicher Grad der Attenuierung erreicht. Ob ein Pestivirus mit einem anderen Pestivirus eng verwandt oder entfernt ver- wandt ist, wird erfindungsgemäß bestimmt durch das Niveau der Identität der Nukleo- tidsequenzen des Erns Gens des ursprünglichen Pestivirus und der Sequenz des ein- gebrachten Erns Gens eines anderen Pestivirus. Im Falle eines KSPV als gentech- nisch modifiziertes Pestivirus wird das Erns des KSPV als ursprüngliches Erns Gen verglichen mit dem eingebrachten Genabschnitt des entfernt verwandten Pestivirus, z. B. mit dem für das Erns kodierenden Genabschnitt des Pestivirus aus der Ratte.
Bei der Herstellung von Lebendimpfstoffen in Form von Chimären Pestiviren, ist es von Bedeutung, dass die ausgetauschten Sequenzen unterschiedlich genug sind, um eine Nutzung als serologischen Negativmarker zu erlauben, andererseits müssen die neu kombinierten Sequenzen biologisch kompatibel sein und nach Möglichkeit eine effiziente Vermehrung des Impfvirus erlauben.
Hierbei wird differenziert zwischen„eng verwandt“ und„entfernt verwandt“ auf Basis der Identität zwischen den entsprechenden Erns kodierenden Sequenzen. Von „entfernt verwandt“ wird gesprochen, wenn die auf Basis der Anzahl an identischen oder verschiedenen Nukleinsäurebausteinen ermittelte Identität im Vergleich zum gentechnisch modifizierten Pestivirus (z.B. KSPV, BVDV) kleiner als 65 % ist. Ist die Identität größer oder gleich 65 %, so wird von einer„nahen bzw. engen Verwandt- schaft“ gesprochen.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäß gentechnisch modifizierte Pestivirus dadurch gekennzeichnet, dass der Erns Genabschnitt aus dem Pestivirus, das genetisch entfernt verwandt ist, ein Erns Genabschnitt von einem Pestivirus aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus; LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fleder- maus-Pestivirus ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das gentech- nisch modifizierte Pestivirus eines, wobei der das Erns Protein kodierende Genab- schnitt ein chimärer Erns Genabschnitt ist, mit einem 5‘ Anteil bestehend aus dem ent- sprechenden Anteil eines Erns Genabschnitts eines ersten entfernt verwandten Pesti- virus und einem zweiten Anteil, der 3‘ angeordnet ist, ebenfalls stammend von einem Erns Genabschnitt eines zweiten entfernt verwandten Pestivirus, wobei der erste und der zweite Genabschnitt von unterschiedlichen Pestiviren stammen. In dieser Ausführungsform ist somit der Genabschnitt, der in dem gentechnisch modifizierten Pestivirus das Erns Gen betreffend ausgetauscht wurde, einer der aus zwei Abschnitten besteht, wobei diese Abschnitte aus zwei unterschiedlichen Pestivi- rus-Spezies stammen. Beispielhaft sei hier genannt, dass ein Genabschnitt aus dem Pestivirus der Ratte stammt, während der andere Genabschnitt aus dem Pestivirus der Pronghorn-Antilope (Gabelbock) stammt. Weitere Beispiele schließen ein, dass ein Genabschnitt aus dem Ratten-Pestivirus stammt, während der andere aus APPV stammt oder ein Genabschnitt aus APPV und der andere aus dem Pronghorn-Pesti- virus, sowie andere Kombinationen solange beide Genabschnitte entfernt verwandt sind zu dem Erns Genabschnitt des Ziel-Pestivirus.
In einer Ausführungsform ist dabei das gentechnisch modifizierte Pestivirus, also das Ausgangs-Pestivirus (oder Ziel-Pestivirus), ein Pestivirus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Bovinen Virusdiarrhöe Virus (BVDV); Klassischen Schweinepest Virus (KSPV),„Hobi-like“ Pestiviren und Border Disease Virus (BDV).
In einer Ausführungsform ist dabei das gentechnisch modifizierte Pestivirus ei- nes, das einen Chimären Erns Genabschnitt aufweist, wobei dieser Chimäre Erns Gen- abschnitt einer ist mit einem Teil aus dem Erns Genabschnitt des Ratten-Pestivirus und einem weiteren Teil aus dem Erns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus. Die Erns Gene dieser beiden Pestiviren sind die Genabschnitte gemäß SEQ ID Nr. 3 und 4.
In einer Ausführungsform ist dabei der Erns Genabschnitt, der in das gentech- nisch zu modifizierende Pestivirus eingebracht wird, einer mit einem 5‘ Anteil ent- sprechend dem 5‘ Abschnitt des Erns Gens aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3‘ Abschnitt entsprechend dem 3‘ Abschnitt aus dem Erns Gen des Pronghorn-Pestivi- rus. In einer Ausführungsform ist dabei der Erns Genabschnitt einer mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 . Das Chimäre Erns Gen, zusammengesetzt aus dem 5‘ Abschnitt des Erns Gens des Ratten-Pestivirus und dem 3‘ Abschnitt des Erns Gens des Prong- horn-Pestivirus,, kann dabei eines sein, das mindestens eine Sequenzidentität von 90 %, wie 95 %, insbesondere 99 % gegenüber der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 aufweist. Dabei erfüllen diese beiden Erns Genabschnitte die Anforderungen dahinge- hend, dass sie weniger als 65 % Identität mit den entsprechenden Erns Genabschnit- ten des zu modifizierenden Pestivirus aufweisen. Die Erns kodierende Sequenz aus dem Ratten-Pestivirus ist beschrieben in Firth et. al., 2014, MBio, 5(5): e01933-14, entsprechend den Positionen 1618-2298 der GenBank Accession No. NC025677. Die für Erns kodierende Sequenz des Prong- horn-Pestivirus ist eine mit 681 Nukleotiden, entsprechend den Positionen 1 165- 1845 gemäß GenBank Nr. NC024018 und beschrieben in Neill et al., 2014, Genome Announc. 2014 Jun 12;2(3).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das gentechnisch modifizierte Pestivirus eines, das attenuiert ist. Unter dem Ausdruck„attenuiert“ wird vorliegend verstanden, dass das Virus eine reduzierte Virulenz aufweist.
In einer Ausführungsform ist das gentechnisch modifizierte Pestivirus ein gen- technisch modifiziertes KSPV. Dieses gentechnisch modifizierte KSPV enthält dabei einen Erns Genabschnitt, zusammengesetzt aus einem 5‘ Abschnitt des Erns kodieren- den Genabschnitts aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3‘ Genabschnitt entspre- chend dem 3‘ Genabschnitt kodierend für Erns aus dem Pronghorn-Pestivirus.
Die Genabschnitte, wie der 5‘ Genabschnitt und der 3‘ Genabschnitt umfassen dabei jeweils mindestens 20 Nukleotide, wie jeweils 25 Nukleotide, wie jeweils 30 Nukleotide des jeweiligen Erns Genabschnitts des Pestivirus.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirts- zelle, die ein erfindungsgemäß gentechnisch modifiziertes Pestivirus enthält.
Geeignete Wirtszellen für die Replikation der Pestiviren sind allgemein bekannt und sind entsprechend aus Publikationen etc. entnehmbar und frei erhältlich. Bei- spiele für geeignete Wirtszellen schließen Zelllinien ein wie Schweinezelllinien ein- schließlich PK15, SK6, oder STE bei einem gentechnisch modifizierten KSPV Virus, bovine Zelllinien, wie MDBK bei einem gentechnisch modifizierten BVDV, aber auch andere beschriebene geeignete Wirtszellen einschließlich bovine Zellen wie zum Bei- spiel SFT-R.
Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Zusammenset- zung umfassend erfindungsgemäße Wirtszellen oder erfindungsgemäße gentech- nisch modifizierte Pestiviren oder Bestandteile hiervon mindestens umfassend ein Erns Genabschnitt wie in der vorliegenden Anmeldung definiert oder ein Polypeptid kodiert durch einen dieser Erns Genabschnitte. Diese Bestandteile umfassen den Erns Genabschnitt oder das Polypeptid kodiert durch diesen Erns Genabschnitt und kön- nen dabei in entsprechenden Zellkulturmedien oder in anderen Formen vorliegen. Die Zusammensetzung kann ebenfalls in Form von Zelllysaten eingesetzt werden. Natürlich kann die Zusammensetzung auch Kombinationen dieser einzelnen Be- standteile aufweisen.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Vakzine für Tiere, insbesondere Schweine aber auch Wiederkäuer wie Rinder und allgemein für Tiere der Ordnung der Artiodactyla. Diese Vakzine umfassen ein erfindungsgemäßes gentechnisch modifiziertes Pestivirus oder eine erfindungsgemäße Wirtszelle oder eine Kombination hiervon und ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial.
Dem Fachmann sind geeignete Materialien für das Vakzin bekannt, insbeson- dere sind die weiteren Bestandteile der Vakzine derart, dass sie eine Verabreichung über den entsprechend geeigneten Verabreichungsweg erlauben. Geeignete Verab- reichungswege für das Vakzin schließen ein: orale, nasale, mukosale, kutane, subku- tane, intramuskuläre oder intravenöse Applikation.
Unter dem Ausdruck„Tiere“, für die das erfindungsgemäße Vakzin geeignet ist, werden Tiere verstanden, die für eine Infektion mit mindestens einem Pestivirus emp- fänglich sind. Dieses sind überwiegend Säugetiere und sind meist Mitglieder der Ordnung der Artiodactyla. Mögliche Tiere für die erfindungsgemäße Vakzinierung sind Schweine inklusive Wildschweine und Wiederkäuer, wie zum Beispiel Rinder, Schafe, Ziegen oder andere Wiederkäuer einschließlich Wildwiederkäuer (wie zum Beispiel Rehe, Flirsche, Antilopen) oder Kameliden (wie zum Beispiel Dromedare, zweihöckrige Kamele und Neuwelt-Kameliden wie zum Beispiel Alpakas und Vikun- jas).
Das erfindungsgemäße Vakzin kann dabei eine Kombination von mehr als ei- nem gentechnisch modifizierten Pestivirus aufweisen, wie z.B. zwei unterschiedliche gentechnisch modifizierte Pestiviren.
Die enthaltenen Pestiviren können dabei lebende, attenuierte oder inaktivierte Pestiviren sein. Die Attenuierung kann dabei durch die Chimärisierung der Erns Se- quenzen bestimmt werden oder es erfolgt eine Kombination der beschriebenen Erfin- dung mit weiteren genetischen Veränderungen zur Attenuierung des Virus oder in Kombination mit einem natürlicher weise in der Zieltierart attenuierten Pestivirus.
Dem Fachmann sind die geeigneten Variationen bekannt.
In einer Ausführungsform handelt es sich dabei um eine Lebendvakzine, z.B. solche mit attenuierten Markervakzinen, wie erfindungsgemäß beschrieben. Diese Lebendvakzine liegen üblicherweise in gefriergetrockneter Form vor. Ent- sprechend können die erfindungsgemäßen Vakzine ausgebildet sein. Dem Fach- mann sind entsprechende Verfahren zur Gefriertrocknung und zur anschließenden Rekonstitution bekannt.
In einer Ausführungsform können diese Vakzine Teil eines Kits sein, nämlich ei- nes Kits oder Systeme mit mehreren Behältnissen, wobei einer dieser Behältnisse das gefriergetrocknete Vakzin umfasst und ein anderes Behältnis entsprechende Mit- tel zum Rekonstruieren dieses gefriergetrockneten Vakzins.
Der Ausdruck„pharmazeutisch annehmbare T räger“ beinhaltet entsprechend geeignete Lösungsmittel und Flüssigkeiten, wie Wasser, physiologische Salzlösun- gen oder phosphatgepufferte Salzlösungen genauso wie gegebenenfalls weitere Sta- bilisatoren und Konservierungsmittel.
Darüber hinaus können diese Vakzine Adjuvanzien enthalten, dem Fachmann sind geeignete Adjuvanzien bekannt.
Gegebenenfalls kann das erfindungsgemäße Vakzin mit weiteren Antigenen o- der entsprechenden Pestiviren, die weitere Antigene exprimieren, verabreicht wer- den, als sogenanntes Kombinationsvakzin.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwen- dung der gentechnisch modifizierten Pestiviren oder der erfindungsgemäßen Wirts- zellen oder des erfindungsgemäßen Chimären rekombinanten Erns Polyeptids allein oder in Kombination zur Vorbeugung oder Reduktion einer Infektion mit dem Pestivi- rus oder entsprechender Anzeichen einer von einem Pestivirus induzierten Erkran- kung in diesen Tieren.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Vakzinieren von Tieren bereit- gestellt umfassend den Schritt des Verabreichens des erfindungsgemäßen Vakzins. Insbesondere ist dieses Vakzin geeignet z.B. im Rahmen eines entsprechenden Be- handlungsverfahrens, prophylaktisch oder therapeutisch eingesetzt zu werden, um die Infektion oder das Ausbreiten einer Infektion mit Pestiviren zu verhindern
In einem weiteren Aspekt wird ein rekombinantes chimäres Erns Polypeptid mit einem N-terminalen Abschnitt und einem C-terminalen Abschnitt bereitgestellt, wobei so- wohl der N-terminale Abschnitt als auch der C-terminale Abschnitt aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammen, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren unterschiedliche Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypi- sches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Das erfindungsgemäße rekombinante Chimäre Erns Polypeptid ist in einer Aus- führungsform dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen N-terminalen Erns Anteil, der vom Ratten-Pestivirus kodiert wird, und einen C-terminalen Erns Anteil, der vom Pronghorn-Virus kodiert wird, insbesondere dass dieses Polypeptid die Sequenz ge- mäß SEQ Nr. 2 umfasst. In einer Ausführungsform umfasst dabei die das Polypeptid kodierende Sequenz auch homologe Sequenzen der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2, wobei diese eine Identität auf Aminosäureebene von mindestens 90%, 93%, 95 %, 96%, 97%, 98% aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird ein Nachweissystem zum Nachweis von Pestivi- ren oder Pestivirus spezifischen Antikörpern bereitgestellt. Dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es ein rekombinantes Erns Polypeptid gemäß der vorliegenden Er- findung als Antigen aufweist. In einer Ausführungsform beinhaltet das Nachweissys- tem ein nicht-chimäres rekombinantes Erns Polypeptid als Antigen. In einer Ausfüh- rungsform kann dieses Nachweissystem einerseits das erfindungsgemäße rekombi- nante Polypeptid als Antigen aufweisen und in einer weiteren Ausführungsform weist dieses Nachweissystem das oben genannte erfindungsgemäße Polypeptid auf und darüber hinaus ein zweites Polypeptid, das dem spezifischen Nachweis einer Feldin- fektion mit dem Pestivirus, insbesondere KSPV oder BVDV dient. In einer Ausfüh- rungsform ist das erfindungsgemäße Nachweissystem eines, das einen differenzier- ten serologischen Nachweis einer Vakzinierung des Tieres mit erfindungsgemäßem gentechnisch modifiziertem Pestivirus gegenüber einer Infektion des Tieres mit nicht gentechnisch modifiziertem Pestivirus erlaubt. Während die vakzinierten Tiere keine Antikörper gegen das Erns der nicht gentechnisch modifizierten, die Feldinfektion aus- gelösten Pestiviren aufweisen, können entsprechende Antikörper gegen das vom Va- kzin kodierte Erns auftreten. In einer Ausführungsform ist das Nachweissystem eines zum differenzierten Nachweis einer Vakzinierung eines Tieres mit einem erfindungs- gemäßen Vakzin, insbesondere ein KSPV oder BVDV Vakzin, wobei dieses Nach- weissystem gekennzeichnet ist dadurch, dass es ein rekombinantes Erns Polypeptid als Antigen, wie es vorliegend beschrieben wird, aufweist, nämlich ein nicht chimäres Ems Polypeptid aus im Vergleich zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammend, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Entsprechend ist das erfindungsgemäße Nachweissystem insbesondere geeig- net, eine entsprechende Unterscheidung von vakzinierten Tieren und natürlich infi zierten Tieren zu erlauben. In einer entsprechenden Ausführungsform betrifft somit die vorliegende Erfindung die Verwendung des rekombinanten Chimären Erns Peptids zum Nachweis von Antikörpern gegen ein erfindungsgemäßes gentechnisch modifi- zierten Pestivirus, das insbesondere ein gentechnisch modifiziertes Virus der Klassi- schen Schweinepest (KSPV) oder Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) ist. Eine Ausführungsform ist dabei die Verwendung zur Differenzierung einer natürlichen In- fektion mit KSPV, BVDV oder anderen Pestiviren und einer Vakzinierung mit einem erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Pestivirus. Diese Verwendung er- folgt dabei z.B. in Form eines DIVA ELISA.
In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verwendung eine Verwen- dung des erfindungsgemäßen rekombinanten Chimären Erns Polypeptids oder die Verwendung eines nicht Chimären Erns Polypeptids aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA- Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus- Pestivirus sind.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Kit umfas- send ein erfindungsgemäßes, gentechnisch modifiziertes Pestivirus und/oder ein er- findungsgemäßes rekombinantes chimäres Erns Polyeptid oder Teile hiervon wie hie rin definiert.
Schließlich wird ein Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren der Ordnung der Artiodactyla unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vakzins oder eines erfindungsgemäßen diagnostischen Testkits oder eines erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Pestivirus oder eines re- kombinanten Chimären Erns Polypeptid oder einer erfindungsgemäßen Zelle, oder ei- ner erfindungsgemäßen Zusammensetzung, oder eines Erns Polypeptids von nicht Chimären Erns Peptid aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren Pestiviren insbesondere aus der Gruppe beste- hend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivi- rus, Atypisches Prozines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Das erfindungsgemäße Nachweissystem und die erfindungsgemäßen Verfah- ren können dabei ein übliches, dem Fachmann bekanntes Nachweissystem oder Verfahren, insbesondere immunologische Verfahren und immunologische Nachweis- systeme beinhalten.
Dem Fachmann sind geeignete Verfahren und Nachweissysteme, insbesondere immunologische Verfahren und immunologische Nachweissysteme bekannt. Diese Nachweissysteme und Verfahren beruhen insbesondere auf dem Nachweis von Anti- körpern des Wirtes, gerichtet gegen das Virus bzw. das Vakzin.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Nach- weissystem kann es sich insbesondere um ein ELISA-System handeln. In einer Aus- führungsform kann dieses System als DIVA- (differentiation of infected from vaccina- ted animals) ELISA verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Nachweissystem bzw. das erfindungsgemäße diagnos- tische Testkit kann dabei weitere übliche Bestandteile enthalten, wie Waschpuffer, Blockierungspuffer sowie Substrate zum Nachweis gebildeter Komplexe aus Anti- gen/Antikörpern. Ggf. können weitere Sekundärantikörper zum Nachweis gebunde- ner Antikörper eingesetzt werden. Dem Fachmann sind geeignete Bestandteile, ins- besondere auch geeignete Sekundärantikörper mit entsprechenden Markern be- kannt. Diese Marker sind insbesondere solche, die eine enzymatische Reaktion er- lauben oder andere Marker, wie Farbstoffe.
Die Abbildungen zeigen:
Figur 1 : Genetische Identitäten der kompletten Erns kodierenden Nukleotidse- quenzen ausgewählter Pestiviren. Für die Ermittlung der genetischen Identitäten wur- den Erns kodierende Sequenzen von klassischen Pestiviren (z.B. KSPV und BVDV) bzw. von den zu diesen klassischen Pestiviren entfernt verwandten Pestiviren (z.B. Pestiviren„Ratte“ und„Pronghorn“) verwendet, sowie die Chimäre Erns Sequenz„Ra- Pro“. Die Identitäten wurden jeweils zwischen zwei miteinander verglichenen Se- quenzen mittels MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1 , default Einstellungen) be- stimmt. Figur 2: Gezeigt sind die Charakteristika der verwendeten Schweinepestviren und Vakzin-Prototypen.
Figur 3: Figur 3 zeigt die viralen Genomlasten im Blut, Speichel und Kot in den ersten 28 Tagen nach Impfung.
Figur 4: Figur 4 zeigt die Bestimmung der Induktion neutralisierender Antikör- per.
Figur 5: Gezeigt sind die DIVA Eigenschaften der Marker-Impfstoffprototypen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen näher erläutert. Ohne auf diese beschränkt zu sein.
Beispiele
Über gerichtete Mutation und Klonierung von Nukleinsäure-Fragmenten wurden rekombinante Pestiviren auf Basis eines cDNA Klons des KSPV Isolates„Alfort-Tü- bingen“ (Genotyp 2.3) erzeugt (Meyers et al, 1996, J Virol. 70(3):1588-95). Dabei wurde die komplette Erns kodierende Sequenz von KSPV Alfort-Tübingen durch die entsprechenden Bereiche des Pronghorn-Pestivirus, des Ratten-Pestivirus und einer Kombination aus Ratten-und Pronghorn-Pestivirus ersetzt. Ausgehend von RNA des Pronghorn-Pestivirus Isolates bzw. ausgehend von einer auf Basis der veröffentlich- ten Sequenz synthetisierten Nukleinsäure beim Ratten-Pestivirus, wurden die ent- sprechenden Erns Genabschnitte, zu diesem Zweck mittels PCR amplifiziert. Über die Primer wurde an beide Enden des Amplikons etwa 20 Nukleotide fusioniert, die kom- plementär zu den Sequenzabschnitten waren, die unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts des zu ersetzen Genom-Bereichs angrenzten. Über die Methode der „target-primed Plasmid-Amplifikation“ wurden die Pronghorn- bzw. Ratten-Pestivirus Sequenzen in das Ziel-Plasmid eingeführt, welches lediglich Teile der Pestiviralen cDNA enthielt. Nach Zerstörung des Ursprungsplasmids durch Dpnl-Verdau, Ver- mehrung des neu erzeugten Plasmids in E. coli und Bestätigung der erfolgreichen genetischen Manipulation über Nukleinsäuresequenzierung wurde die modifizierte Erns-Sequenz über einen Xho\-Bgl\\- Restriktionsverdau aus dem Plasmid herausge- schnitten und über die gleichen Schnittstellen in den eigentlichen infektiösen cDNA Klon umgesetzt. Mittels gerichteter Mutagenese wurden alle Sma\ Restriktions- Schnittstellen entfernt, bis auf eine künstlich eingeführte, die das 3'Ende des Pestivi- rusgenoms definiert. Die so hergestellten Plasmide wurden mittels Smal-Restriktion linearisiert und anschließend mittels Sp6 DNA-abhängiger RNA-Polymerase in RNA umgeschrieben. Die auf diese Weise hergestellte Chimäre Pestivirus-RNA wurde über Elektroporation in porzine Schweinenierenzellen transfiziert und anschließend in unterschiedlichen Zelllinien passagiert. Die erfolgreiche Virusreplikation wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit dem Pestivirus-spezifischen monoklonalen Antikörper C16 nachgewiesen. Schließlich wurden rekombinante Chimäre Pestiviren nach einem Gefrier-Tau-Zyklus infizierter Zellkulturen geerntet, titriert und die kompletten Ge- nomsequenzen wurden mittels Hochdurchsatzsequenzierung bestimmt.
Die drei Chimären Pestiviren wurden ihren Virustitern entsprechend verdünnt, um sie anschließend mit einer einheitlichen Dosis von etwa 105 TCIDso/Schwein zu applizieren. Die Dosis wurde nach Applikation in die Schweine anhand einer Rück- stellprobe über Rücktitration bestätigt.
Die drei Impfstoff-Prototypen mit unterschiedlichem Wachstumsverhalten in Zellkultur wurden nachfolgend für eine Impfstudie bei 10 Wochen alten Ferkeln ein- gesetzt. Hierzu wurden die Impfviren auf gleiche Titer eingestellt und jeweils einer Gruppe von 5 Ferkeln intramuskulär verabreicht. Eine weitere Gruppe von 5 Ferkeln erhielt eine gleiche Dosis des parentalen KSP Wildtypvirus„Alfort-Tübingen“ („AlfT“, Genotyp 2.3), aus dem die gentechnisch erzeugten Impfviren hervorgegangen sind, um die mögliche Abschwächung der Virulenzeigenschaften zu bestimmen (Kontrolle Attenuierung). Nach 28 Tagen erfolgte eine orale Belastungsinfektion mit einer sehr hohen Dosis (2x106 0 TCIDso) eines hoch virulenten, genetisch heterologen KSPV (Isolat„Koslov“, Genotyp 1 .1 ). Zur Überprüfung der Belastungsinfektion wurde au- ßerdem eine nicht-geimpfte Gruppe bestehend aus 3 Ferkeln mit der gleichen Dosis infiziert (Kontrolle Belastungsinfektion).
Für die Beurteilung der Tiere während des Impfversuches wurden fortlaufend klinische Untersuchungen durchgeführt. Zur Beurteilung der klinischen Schwere von KSPV spezifischen Symptomen wurde ein nach Mittelholzer et al., 2000, Vet Micro- biol., 74(4): 293-308 modifiziertes Punkteschema angewandt. Des Weiteren wurde die rektale Körpertemperatur aufgezeichnet. Des Weiteren wurden im Abstand von drei bis sieben Tagen Probenentnahmen (EDTA-Blut, Serum, oraler Tupfer, Kot-Tup- fer) für weiterführende Laboranalysen durchgeführt. Nach Belastungsinfektion und einem anschließenden Beobachtungs- und Beprobungszeitraum von weiteren 12 bzw. 13 Tagen wurden die geimpften Schweine getötet, pathologisch untersucht und Organproben entnommen.
Die molekularbiologischen Untersuchungen erfolgten nach Präparation der Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten mittels QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Hierzu wurden die Speichel- und Kottupfer zuvor in einem Milliliter Zellkulturmedium ausgedrückt und das Material aus dem Tupfer in Suspension gebracht. Für die PCR Untersuchungen zur Virämie wurde als Material nach Gefrier-Tau-Zyklus lysiertes EDTA-Blut eingesetzt. Die Präparation von Nukleinsäuren aus Organmaterial erfolgte mittels NucleoSpin® RNA Kit (Macherey und Nagel), ausgehend von einem Erbsen- g roßen Organstück. Zur Quantifizierung von Genomlasten wurde eine quantitative Taqman-basierte real-time RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurde das QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Qiagen) eingesetzt unter Verwendung von Primern und Sonden nach Hoffmann et al., 2005, J Virol Methods, 130(1 -2): 36-44. Die Diskriminierung von Impfviren und Challenge-Virus in den Organproben erfolge durch Vergleich von 150 Nukleotiden großen Sequenzfragmenten in der 5’ nicht translatierten Region und anschließender Zuordnung zum KSPV Genotyp 1.1 (Challenge-Virus) bzw. 2.3 (Impf- viren).
Die hämatologischen und serologischen Untersuchungen erfolgten an EDTA- Blut bzw. Serum-Proben. Die Bestimmung von weißen Blutzellen erfolgte ausgehend von frischem EDTA-Blut mit Hilfe eines Blutanalysegerätes (Abacus Junior Vet) nach Herstellerempfehlungen. Für die Bestimmung neutralisierender Antikörper wurden je Serum-Probe drei Virusneutralisationstests (VNTs) durchgeführt. Die Titer-Bestim- mung erfolgte dabei nach Testung und Auswertung von Quadruplikaten jeder Serum- verdünnungsstufe, zum einem getestet mit dem gentechnisch unveränderten Wild- typvirus„AlfT“ (Genotyp 2.3), zum anderen mit dem genetisch heterologen KSPV („Koslov“, Genotyp 1.1 ). Des Weiteren wurde zur Untersuchung des DIVA Prinzips die Verlaufsseren aller Schweine in einem E2 basierten kommerziellen ELISA
(IDEXX CSFV Ab Test) und in einem Erns Antikörper-ELISA ( PIGTYPE ® CSFVAb, Qiagen) nach Herstellerangaben getestet.
Die wesentlichen Ergebnisse werden im Folgenden zusammengefasst.
In der Figur 1 ist dargestellt, wie ein Identitätsvergleich zwischen Pestivirus-Se- quenzen erfolgt. Die Identitäten zwischen Erns kodierenden Sequenzen aus KSPV Isolat„Alfort-Tübingen“ („AUT“), BVDV Isolat CP7, einem entfernt verwandten Pestivi- rus aus der Ratte und einem entfernt verwandten Pestivirus aus einer Pronghorn-An- tilope sowie aus dem Chimären Pestivirus„RaPro“ sind dargestellt für den kompletten Erns kodierenden Bereich. Die Identitäten wurden jeweils zwischen zwei miteinander verglichenen Sequenzen mittels MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1 , default Einstellungen) bestimmt.
Die Figur 2 zeigt eine Übersicht über die Charakteristika der drei hergestellten Marker-Impfstoffprototypen„Pronghorn“,„Ratte“ und„RaPro“ bei denen ausgehend vom KSPV„Alfort-Tübingen“ („AlfT“, Genotyp 2.3) die Erns Sequenzen durch entspre- chende homologe Erns Sequenzen entfernt verwandter Pestiviren ausgetauscht wor- den sind. Der Prototyp„Pronghorn“ zeigte bezüglich Replikation und Ausbreitung in Zellkultur überraschender Weise keine Unterschiede zu KSPV„AlfT“ und konnte zu ähnlichen Virustitern vermehrt werden (Titer 106 0 TCIDso/ml). Des Weiteren zeigte es sich, dass auch der Austausch von KSPV Erns mit dem Erns von einem entfernt ver- wandten Ratten-Pestivirus zu einem replikationsfähigen rekombinanten Virus führte. Dabei wies der Impfstoff-Prototyp„Ratte“ eine vergleichsweise reduzierte Replikation auf (Titer 1044 TCIDso/ml). Die sehr guten replikativen Eigenschaften des Impfstoff- kandidaten„Pronghorn“ sollten genutzt werden, um ein Impfvirus mit einem Chimären Erns herzustellen, welches verbesserte Replikationseigenschaften besitzt. Das chimä- risierte Erns enthält dabei den antigen wirksamen Bereich des Erns Proteins vom Rat- ten-Pestivirus (N-terminal lokalisiert) sowie einen C-terminal lokalisierten Anteil des Erns vom Pronghorn-Pestivirus. Eine Kombination von den beiden Erns Sequenzen führte in Zellkultur tatsächlich zu einem intermediären Phänotyp des Prototyps„Ra- Pro“. Das Impfvirus„RaPro“ zeigte keinen durchgängig infizierten Zellrasen wie nach Infektion mit dem Impfvirus„Pronghorn“, jedoch im Vergleich zum Impfvirus„Ratte“ deutlich größere Foki infizierter Zellen. Dementsprechend konnte für„RaPro“ im Ver- gleich zum Impfvirus„Ratte“ durch die Chimärisierung des Erns eine Steigerung des Titers auf etwa 105 3 TCIDso/ml erreicht werden (Figur 2).
Im Impfversuch mit Belastungsinfektion zeigten nur die Kontroll-Gruppen (Kon- trollgruppe Attenuierung: intramuskulär infiziert mit KSPV„AlfT“, ungeimpfte Kontroll- gruppe: oral infiziert mit KSPV„Koslov“) Symptome der KSP. In der Kontrollgruppe Attenuierung mussten am Tag 18 des Versuchs drei Tiere aufgrund schwerer Erkran- kung aus Tierschutzgründen euthanasiert werden, ebenso die ungeimpften Tiere sechs Tage nach Belastungsinfektion. Die geimpften Tiere zeigten auch 12-13 Tage nach Belastungsinfektion keine Symptome einer KSP oder andere gesundheitliche Beeinträchtigungen. In der Gruppe„Pronghorn“ zeigten einige Tiere etwa ab dem 3.- 4. Tag nach Impfung leichtes Fieber (mehr als 40°C über mehr als zwei Tage). Eine leichte Erhöhung der Körpertemperatur (kein Fieber) wiesen zwei Tiere der Impf- Gruppe„Ratte“ etwa 3-4 Tage nach der Belastungsinfektion auf. Damit zeigten alle gentechnisch modifizierten Pestiviren eine deutliche Attenuierung im Vergleich zum Wildtyp KSPV„AlfT“, wenn auch in unterschiedlichem Maße. Die Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass im Kontext eines mäßig virulenten KSPV Isolates wie „AlfT“ bei Einführung der Erns Sequenz aus dem Pronghorn Pestivirus eine zusätzli- che Attenuierung oder Verwendung eines an sich weniger bzw. nicht virulenten Isola- tes erforderlich ist. Eine Schutzwirkung gegen klinische Symptome einer KSP nach heterologer Belastungsinfektion konnte durch alle Marker-Impfstoffprototypen er- reicht werden.
Blutzellparameter, wie die Leukozytenzahl und die Thrombozytenzahl, sind ge- eignet, um die Schwere einer KSPV Infektion zu beurteilen. Beide Zelltypen sind nach KSPV Infektion deutlich herabgesetzt (Leukopenie, Thrombozytopenie). Beide Kontrollgruppen zeigen eine ausgeprägte Leukopenie wenige Tage nach der Infek- tion. In der Impfgruppe„Pronghorn“ kam es bei drei von fünf Schweinen zu einer transienten (vorübergehenden) Leukopenie. Bei den anderen Impfgruppen„Ratte“ und„Ra Pro“ bewegten sich die Leukozytenzahlen im erwarten Referenzbereich, wo bei jeweils ein Tier für einige Tage Werte im unteren Grenzbereich aufwies. Die Leu- kozytenzahlen bestätigen eine Attenuierung aller I m pfstoff-Prototypen im Vergleich zum Ursprungsvirus„AlfT“. Ein vergleichbares Bild zeigt sich bei den Thrombozyten- zahlen. Das„Pronghorn“ Impf-Virus zeigt sich wiederum am wenigsten attenuiert, so dass eine Korrelation zur Replikation und zum Wachstumsverhalten in Zellkultur fest- zustellen ist (Figur 2). Der Impfstoff-Prototyp„RaPro“ weist im Vergleich zu den Vi- ren„Pronghorn“ und„Ratte“ wiederum einen intermediären Phänotyp auf.
Untersuchungen von Voll-Blut, Speichel und Kotproben wurden durchgeführt um festzustellen, in wieweit sich die Impfviren und das KSPV nach Belastungsinfektion durch das Blut (Virämie) im Organismus ausbreiten können und in welchem Ausmaß eine Virusausscheidung erfolgt (Figur 3). Nach Verabreichung des„Pronghorn“ Impf- virus kam es bei zwei von fünf Schweinen zu einer lang anhaltenden Virämie bis zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion an Tag 28 nach Impfung. Diese Tiere waren die einzigen, die Impfvirus auch mit dem Kot ausschieden. Darüber hinaus schieden alle Tiere der„Pronghorn“ Impf-Gruppe das Impfvirus für einige Tage auch mit dem Spei- chel aus. In der Impfgruppe„RaPro“ zeigte sich bei drei von fünf Tieren eine kurze Virämie mit niedrigen Genomlasten, zu keinem Zeitpunkt jedoch eine Ausscheidung von Impfvirus Genom über Kot oder Speichel. Genome des Impfvirus„Ratte“ konnten zu keinem Zeitpunkt im Blut, Kot oder Speichel nachgewiesen werden (Figur 3). Da- mit bestätigen diese Analysen eine Abschwächung der Virulenz im Schwein analog zu den Beobachtungen in Zellkultur, wobei das Impfvirus„Pronghorn“ am wenigsten attenuiert ist, das Impfvirus„Ratte“ hingegen eine sehr starke und„RaPro“ eine inter- mediäre Attenuierung aufweist.
Nach der Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten KSPV konnte bei kei nem der geimpften Tiere, mit Ausnahme der zwei Schweine aus der„Pronghorn“- Impfgruppe, die anhaltend virämisch waren, KSPV Genom im Blut nachgewiesen werden. Auch eine Ausscheidung über den Kot war nicht nachweisbar. Ein Genom- nachweis im Speichel war aufgrund der oro-nasalen Applikation bei der Belastungs- infektion zunächst möglich, wobei die Genomlasten schnell sanken und am Ver- suchsende keine KSPV Genome mehr nachweisbar waren. Die Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass trotz hoher Virusmengen bei der Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten Virus-Isolat in allen Impfgruppen die Schutzwirkung so gut war, dass eine Ausbreitung von KSPV im Organismus und nachfolgend eine Ausschei- dung wirksam unterbunden wurde.
Die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern wurde anhand von Se- rumproben in Virusneutralisationstests (VNT) bestimmt (Figur 4). Es zeigte sich, dass der intermediäre Phänotyp des Impfstoffprototypen„RaPro“, im Vergleich zu dem stark attenuierten„Ratten“-Impfvirus und dem wenig attenuierten„Pronghorn“- Impfvirus am besten neutralisierende Antikörper zu induzieren vermag. Diese Be- obachtung deckt sich mit Wissen, das ein Mindestmaß an viraler Replikation erfor- derlich ist, um eine gute Schutzwirkung durch einen Impfstoff zu erzielen, sowie mit der Tatsache, dass virulente Pestiviren in der Lage sind, die Immunantwort des Wir- tes zu unterdrücken und damit auch die effiziente Induktion neutralisierender Antikör- per. Neben der effizienten Induktion neutralisierender Antikörper, ist ein maßgebli- cher Aspekt der Erfindung eine sichere Unterscheidung geimpfter Tiere von infizier ten Tieren (DIVA Prinzip). Während die Schweine der ungeimpften Gruppe (Kontrolle Belastungsinfektion) vor der Induktion einer humoralen Immunantwort verstarben und das Wildtypvirus„AlfT“ (Kontrolle Attenuierung), die Induktion von Antikörpern teilweise hemmte, haben alle geimpften Tiere hohe Antikörpertiter gegen das E2 An- tigen gebildet, unabhängig vom verwendeten Impfstoff-Prototyp (Figur 5, oben). Da- mit ist ein diagnostischer Nachweis KSPV E2-spezifischer Antikörper eindeutig doku- mentiert. Dieselben Serum-Proben der geimpften Tiere zeigten vor der Belastungsin- fektion, unabhängig vom Zeitpunkt nach Impfung, keine Reaktivität in einem Erns Anti- körper-ELISA (pigtype ELISA, Qiagen), so dass das Marker-Prinzip eines serolog i- schen Negativmarkers für alle eingeführten Erns Antigene bei den unterschiedlichen Marker-Impfstoffkandidaten gut funktionierte. Erst eine Woche nach Belastungsinfek- tion wurden im DIVA-ELISA erste Anstiege der Erns-spezifischen Antikörper bei eini gen Schweinen beobachtet (Figur 5, unten). Insbesondere Erns Antigene von gene- tisch entfernt verwandten Pestiviren sind für ein robustes DIVA-Konzept sehr vielver- sprechend, da hier mit verminderter oder im Idealfall mit einer komplett ausbleiben- den Kreuz-Reaktivität zu rechnen ist. Vor diesem Hintergrund erscheinen die Impf- stoff-Kandidaten„RaPro“ und„Ratte“ besonders geeignet.
Nachdem alle Kontrolltiere aufgrund schwerer KSP Symptome euthanasiert werden mussten und alle geimpften Tiere frei von klinischen Symptomen geblieben sind, wurde der Versuch 12 bzw. 13 Tage nach Belastungsinfektion beendet. Alle Tiere wurden einer pathologischen Untersuchung unterzogen, wobei sich bei keinem der geimpften Tiere Veränderungen im Sinne einer KSP feststellen ließen. Es wur- den im Bereich des Kopfes Proben von lymphatischem Gewebe (Tonsille, Lympho- nodus mandibularis) gewonnen, um sie auf Anwesenheit von KSPV- oder Impfvirus- genom zu untersuchen. Des Weiteren wurde die Parotis (Speicheldrüse), Milz und Niere auf Anwesenheit von Virusgenom untersucht, um eine eventuelle Viruspersis- tenz nach virämischer Ausbreitung zu überprüfen. Bei den zwei Tieren aus der Gruppe, die mit dem Impfstoffprototyp„Pronghorn“ geimpft wurden und daraufhin eine langanhaltende Virämie entwickelten, waren in der Milz und Niere Impfvirusge- nom bzw. KSPV Genom nachweisbar. Das Impfvirus konnte zum Versuchsende dar- über hinaus lediglich bei Tieren der„Pronghorn“-Gruppe in den Tonsillen nachgewie- sen werden. Alle anderen geimpften Tiere lieferten keinen Hinweis auf eine systemi- sche Ausbreitung von Impfvirus oder KSPV und es war auch lokal in den lymphati- schen Geweben des Kopfes kein Genom von Impfvirus mehr nachweisbar. Lokal wa- ren bei mehreren Tieren noch geringe Mengen KSPV Genom zu detektieren (Tons- ille und Ln. mandibularis), wobei bei drei Schweinen in der Gruppe„Ra Pro“ bereits kein Virusgenom mehr nachweisbar war. Dies bestätigt die Beobachtung, dass die Schutzwirkung des I m pfstoff-P rototy ps„RaPro“ am besten war und die Belastungsin- fektion effektiv unterbunden werden konnte.

Claims

Patentansprüche
1. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus, wobei das für Erns kodierende Gen des Pestivirus derart modifiziert ist, dass zumindest der für das Erns-Protein kodie- rende Genabschnitt aus mindestens einem Pestivirus stammt, das entfernt ver- wandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus ist.
2. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 1 , wobei der das Erns Pro- tein kodierende Genabschnitt ein chimärer Erns Genabschnitt ist, der aus zwei oder mehr Erns Genabschnitten unterschiedlicher Pestiviren besteht, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind.
3. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das gentechnisch modifizierte Pestivirus ein Pestivirus ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bovines Virusdiarrhöe Virus (BVDV); Klassisches Schweinepest Virus (KSPV), Hobi-like Pestiviren und Border Disease Virus (BDV).
4. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Erns Genabschnitt aus dem Pestivirus, das gentechnisch entfernt verwandt ist, ein Erns Genabschnitt von einem Pestivirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowan- nah-Virus; LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus ist.
5. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 4, wobei dieses eines ist ausgewählt aus KSPV und BVDV.
6. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Chimäre Erns Genabschnitt mit einem Teil aus dem Erns Genabschnitt des Ratten-Pestivirus und einem Teil aus dem Erns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus hergestellt wurde, insbesondere wobei der Erns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus am 3‘-Ende lokalisiert ist.
7. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 6 enthaltend einen chimä- ren Erns Genabschnitt mit einem 5‘ Genabschnitt entsprechend dem 5‘ Genab- schnitt des Erns Genabschnitts aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3‘ Genab- schnitt entsprechend dem 3‘ Genabschnitt des Erns Genabschnitts aus dem Pronghorn-Virus, insbesondere ein Erns Genabschnitt mit einer Sequenz gemäß Seq. ID. NO. 1.
8. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses gentechnisch modifizierte Pestivirus ein attenuiertes Pestivirus ist.
9. Wirtszelle, umfassend ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Zusammensetzung umfassend eine Wirtszelle nach Anspruch 9 oder ein gen- technisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder Be- standteile hiervon mindestens umfassend einen Erns Genabschnitt wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert oder ein Polypeptid kodiert durch diesen Erns Genabschnitt.
11. Vakzine für Tiere, insbesondere Paarhufer wie Schweine oder Rinder, umfas- send ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 9, oder eine Zusammensetzung nach An- spruch 10 oder eine Kombination hiervon, und einem pharmazeutisch annehm- baren Trägermaterial.
12. Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung zur Vorbeugung oder zur Reduktion einer Infektion mit einem Pes- tivirus oder zur Reduktion entsprechender Anzeichen einer von einem Pestivi- rus induzierten Erkrankung in diesen Tieren.
13. Rekombinantes chimäres Erns Polypeptid mit einem N-terminalen Abschnitt und einem C-terminalen Abschnitt, wobei sowohl der N-terminale Abschnitt als auch der C-terminale Abschnitt aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestivi- ren stammen, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren unterschiedliche Pes- tiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pes- tivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
14. Rekombinantes chimäres Erns Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekenn- zeichnet, dass dieses einen N-terminalen Erns Genabschnitt aus dem Ratten- Pestivirus und einen C-terminalen Erns Genabschnitt aus dem Pronghorn-Virus aufweist, insbesondere dass dieses Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ Nr. 2 umfasst.
15. Nachweissystem zum Nachweis von Pestiviren oder Pestivirus-spezifischen An- tikörpem, insbesondere von KSPV und BVDV, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nachweissystem ein rekombinantes chimäres Erns Polypeptid als Anti- gen nach einem der Ansprüche 13 bis 14 aufweist.
16. Nachweissystem zum differenzierten Nachweis einer Vakzinierung eines Tieres mit einem Vakzin nach Anspruch 11 , insbesondere ein KSPV oder BVDV Vak- zin, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nachweissystem ein rekombinantes Ems Polypeptid als Antigen nach einem der Ansprüche 13 oder 14 aufweist oder ein nicht-chimäres Erns Polypeptid, das aus zu KSPV und BVDV entfernt ver- wandten Pestiviren stammt, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren, insbe- sondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah- Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
17. Verwendung des rekombinanten Chimären Erns Polypeptides nach Anspruch 13 oder 14 oder Verwendung eines nicht-chimären Erns Polypeptides wie in An- spruch 16 definiert zum Nachweis von Antikörpern gegen ein Vakzin nach An- spruch 11 zur Differenzierung einer natürlichen Infektion mit KSPV oder BVDV und einer Vakzinierung mit einem gentechnisch modifizierten Pestivirus, das insbesondere ein KSPV oder BVDV ist, insbesondere in Form eines DIVA ELI- SAs.
18. Diagnostisches Test Kit umfassend ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein rekombinantes Erns Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 oder 14 oder ein nicht-chimäres Erns Polypeptid wie in Anspruch 16 definiert.
19. Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ordnung der Artiodactyla unter Verwendung eines Vakzins nach Anspruch 11 oder eines diagnostischen Test Kits nach Anspruch 18 oder eines gentechnisch modifizierten Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder eines rekombinanten Chimären Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 oder 14, oder eines nicht-chimären Erns Polypeptids wie in Anspruch 16 defi niert, oder einer Wirtszelle nach Anspruch 9 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 10.
20. Verfahren zum Vakzinieren von Tieren umfassend den Schritt des Verabrei- chens eines Vakzins nach Anspruch 11 , von gentechnisch modifiziertem Pesti- virus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 9, oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder von rekombinantem chi- märem Erns Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 oder 14 oder eine Kom- bination hiervon.
21. Verfahren zum Vakzinieren von Tieren nach Anspruch 20 zur Vorbeugung oder zur Reduktion einer Infektion mit einem Pestivirus oder zur Reduktion entspre- chender Anzeichen mit einer von einem Pestivirus produzierten Erkrankung in diesen Tieren.
22. Verfahren zur Verhinderung einer Infektion oder das Ausbreiten einer Infektion mit Pestiviren umfassend den Schritt des Verabreichens eines Vakzins nach Anspruch 11 , gentechnisch modifiziertem Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 9, oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder von rekombinantem chimärem Erns Polypeptid nach ei- nem der Ansprüche 13 oder 14 oder einer Kombination hiervon.
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