PT980387E - Sítios antigénicos de prrsv que identificam sequências peptídicas do vírus prrsv para utilização em vacinas ou em ensaios de diagnóstico - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"SÍTIOS ANTIGÉNICOS DE PRRSV QUE IDENTIFICAM SEQUÊNCIAS PEPTÍDICAS DO VÍRUS PRRS PARA UTILIZAÇÃO EM VACINAS OU EM ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO" A invenção refere-se ao agente causador da Doença Mistério de Suíno, o vírus PRRS, às sequências peptídicas identificadas no vírus PRRS, e à incorporação destas sequências em vacinas e testes de diagnóstico. 0 vírus PRRS (PRRSV) é o agente causador de uma doença do porco, habitualmente denominada de síndroma reprodutiva e respiratória do suíno (PRRS). 0 vírus é o agente causador de uma doença do porco, desde aproximadamente 1987 nos EUA e desde 1990 na Europa, conhecido inicialmente sob vários nomes tais como Doença Mistério do Suíno, Síndroma de Infertilidade e Respiratório do Suíno, e muitos mais. Foram também atribuídos vários nomes ao próprio vírus, entre os quais o vírus Lelystad (LV), vírus SIRS, e muitos mais, mas actualmente é essencialmente designado como vírus da síndroma reprodutiva e respiratória do suíno (PRRSV). Causa abortos e disfunção respiratória em porcos e foi isolado, em primeiro lugar, na Europa em 1991 (patente EP 587780, patente US 5620691) e, subsequentemente, nos EUA e muitos outros países em todo o mundo. O PRRSV é um pequeno vírus com envelope contendo um genoma de cadeia positiva de ARN. O PSRRV cresce, de um modo preferido, em macrófagos. Adicionalmente aos macrófagos, o PRRSV pode crescer na linha celular CL2621 e em outras linhas celulares clonadas da linha celular MA-104 de rim de macaco 1 (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4; 127-133, 1992). 0 genoma de PRRSV, um ARN poliadenilado de aproximadamente 15 kb, foi sequenciado em 1993 (Meulenberg et al., Virology 192; 62-74, 1993) . A sequência de nucleótidos, organização do genoma e estratégia de replicação indicou que o PRRSV está relacionado com um grupo de vírus pequenos, com envelope, de ARN de cadeia positiva, designados Arterivírus. Este grupo inclui vírus aumentador de desidrogenase de lactato (LDV), vírus da artrite equina (EAV), e vírus da febre hemorrágica simiana (SHFV). Estes vírus possuem uma organização do genoma, estratégia de replicação, morfologia e sequência de aminoácidos das proteínas virais semelhantes. Os arterivírus contêm um genoma de 12,5 a 15 kb e sintetizam um conjunto de seis ARNs 3' internos subgenómicos durante a replicação. Estes ARNs subgenómicos contêm uma sequência líder que é derivada da extremidade 5' do genoma virai. As ORFs la e lb compreendem aproximadamente dois terços do genoma virai e codificam o ARN dependente da polimerase de ARN. Seis ORF mais pequenas, ORF 2 a 7, estão localizadas na extremidade 3' do genoma virai. As ORF 2 a 6 codificam provavelmente proteínas de envelope enquanto que a 0RF7 codifica a proteína da nucleocápside (Meulenberg et al, Virology 206; 155-163, 1995) . O PRRSV é o primeiro Arterivírus para o qual foi demonstrado que todas as seis proteínas codificadas pelas ORF 2 a 7 estão associadas com o virião. A proteína N de 15 kDa (codificada pela ORF7) e a proteína M integral da membrana de 18 kDa (ORF6) não estão glicolisadas por N, enquanto que a proteína GP2 de 29 a 30 kDa (ORF2), a proteína GP3 de 45 a 50 kDa (ORF3), a proteína GP4 de 31 a 35 kDa (ORF4) e a proteína GP5 de 25 kDa (ORF5) o são. Estas proteínas foram também detectadas em vírus extracelulares e lisados de células infectadas com um 2 isolado Norte Americano de PRRSV, ATCC-VR2332 e outros isolados de PRRSV (outros isolados de PRRSV são, por exemplo, CNCM 1-1140, ECACC V93070108, CNCM 1-1387, CNCM 1-1388, ATCC-VR2402, ATCC-VR2429, ATCC-VR2430, ATCC-VR2431, ATCC-VR2475, ATCC-VR2385, mas são conhecidos muitos outros) .
Foi anteriormente descrito o isolamento e caracterização de um painel de MAbs específicos de PRRSV que foram específicos para GP3, GP4, M e N (van Nieuwstadt et al., J. Virol. 70, 4767-4772, 1996) . De um modo interessante, os MAb direccionados contra GP4 foram neutralizados, sugerindo que pelo menos parte da proteína é exposta à superfície do virião. Além disso, a maioria dos MAb direccionados contra N reagiram com todos os isolados de PRRSV testados. 0 PRRS, ele próprio, é um problema de preocupação principal para a indústria dos suínos na maioria das partes do mundo. A introdução de PRRSV em varas de porcos causará graves prejuízos económicos. O teste de diagnóstico contra o PRRS é praticado extensamente por muitos veterinários e laboratórios. A maioria dos testes de diagnóstico, tais como IPMA, IFT, IFA, ELISA, compreendendo, cada um, meios apropriados de detecção, tais como enzimas conjugadas ou fluorocromos, e outros substratos, utilizam interacções entre antigénio derivado do PRRSV e anticorpos direccionados contra PRRSV para medir a presença de antigénio de PRRSV ou de anticorpos direccionados contra PRRSV numa amostra biológica, tal como sangue, soro, tecido, fluidos do tecido, fluidos de lavagem, urina, fezes, que é amostrada a partir do animal (tal como o porco) a ser testado. O antigénio e/ou anticorpos utilizados neste testes de diagnóstico, ou kits ou ensaios de diagnóstico, para diagnóstico de PRRS são apenas definidos pela sua origem a partir, ou pela sua reactividade, 3 com PRRSV. Em principio isto é suficiente para os ensaios de rastreio em que não é estritamente necessária uma elevada especificidade ou sensibilidade. Contudo, a disseminação sempre continua de PRRS causou uma elevada preocupação entre a industria da suinicultura, até ao ponto de que é considerado haver necessidade de erradicar o PRRS de todas as varas, ou até de áreas completas, regiões, ou paises em que são criados porcos. Um exemplo claro desta necessidade é o programa de erradicação proposto na Dinamarca relacionado com o PRRS. Se for decidido erradicar completamente o PRRS então é necessário que os testes de diagnóstico exibam especificidade ou sensibilidade mais elevada do que os testes utilizados actualmente. A vacinação contra o PRRS é também largamente praticada. São conhecidos vários exemplos de vacinas vivas modificadas que são utilizadas, e também são conhecidas vacinas mortas. Contudo, em geral, existe um problema com as vacinas vivas e, consequentemente, também com as vacinas vivas de PRRS, no qual essas vacinas possuem uma tendência para se disseminarem a porcos não vacinados, disseminando assim em vez de reduzir a infecção detectável em varas de porcos e, logo, sendo contraproducente para a erradicação completa. Se foi utilizada uma vacina marcadora que poderia ser diferenciada serologicamente do vírus de estirpe selvagem, então este problema poderia ser grandemente reduzido. As vantagens adicionais são que as vacinas vivas por vezes causam reacções anafilácticas nos porcos vacinados, por causa de componentes antigénicos não definidos. Embora as vacinas mortas em geral sejam referidas para induzir protecção no porco vacinado, e possuem a vantagem adicional de não se disseminarem de porco para porco, uma desvantagem das vacinas mortas é que pode ser difícil de conseguir massa antigénica suficiente numa dose de 4 uma vacina para provocar uma resposta imunológica mensurável e protectora. Em especial, pode ser vantajoso possuir vacinas mortas que podem induzir títulos de anticorpo neutralizante em porcos uma vez que a medição destes anticorpos neutralizantes em populações de porcos vacinados poderão ajudar a compreender o nível de protecção obtido através da vacinação na vara de porcos. Adicionalmente, se a produção da massa necessária de antigénios for bem sucedida, isto também significa que mais e outra massa antigénica não definida também está presente na vacina, o que pode também fazer crescer as reacções anafilácticas, como anteriormente descrito. Neste sentido, seria benéfico conhecer qual o sítio específico que está envolvido na neutralização no PRRSV, levando à concepção de vacinas mais apropriadas, incorporando as necessárias sequências de péptidos importantes para dar origem aos anticorpos neutralizantes. Uma vantagem das vacinas actualmente utilizadas, originadas de isolados de PSSRV isolados nos EUA, é que tais vacinas, embora completamente protectoras contra e reagindo imunologicamente de modo cruzado com os isolados de PSSRV Europeus, contêm, como até agora indefinido, epitopos ou sítios antigénicos através dos quais estes podem ser diferenciados dos isolados Europeus de PSSRV. Reciprocamente, as vacinas vivas originadas de isolados de PRRSV isolado na Europa, embora completamente protectoras contra e reagindo imunologicamente de modo cruzado com os isolados de PSSRV dos EUA, contêm epitopos semelhantes mas bem como até agora indefinidos ou sítios antigénicos através dos quais estes podem ser discernidos dos isolados de PRRSV dos EUA.
Se os testes serológicos estiverem disponíveis que possam podem discriminar (baseados nas pequenas diferenças do epitopo entre os isolados de PSSRV) entre porcos que estão vacinados com uma vacina derivada dos EUA ou infectados com uma estirpe 5 selvagem da Europa de PSSRV (estando ou não vacinados), ou que podem discriminar porcos que estão vacinados com uma vacina derivada da Europa ou infectados com uma estirpe selvagem de PSSRRV dos EUA (estando ou não vacinados) , então podem ser desenvolvidas vacinas marcadoras e testes de diagnóstico correspondentes (incorporando os referidos epitopos diferenciadores ou sítios antigénicos) os quais podem ser utilizados com larga segurança em programas de erradicação para o PRRS. Por exemplo, na Dinamarca poderia, então, ser possível vacinar com uma vacina derivada dos EUA e medir o conjunto de anticorpos nos porcos Dinamarqueses que estão isoladamente direccionados contra epitopos únicos nos tipos selvagens Europeus de PRRSV e não reagem de modo cruzado com estirpes dos EUA. Isto poderia aumentar a detecção inequívoca e remoção subsequente de porcos infectados com o tipo selvagem de varas Dinamarquesas. Actualmente, tal discriminação não é possível devido à extensa reactividade cruzada imunológica global entre isolados de PSSRV. Tal ocorre sem referir que tais programas combinados de teste por vacinação serão a base para a erradicação de PRRS, e podem também ser utilizados em outros países, se necessário com sítios antigénicos de PSSRV distintos a serem utilizados em vacinas e/ou testes de diagnóstico.
A invenção proporciona agora um sítio antigénico compreendendo as sequências de péptidos da reivindicação 1 que permite a melhoria das vacinas, sendo estas vacinas mortas ou atenuadas ou derivadas através da tecnologia de ADN recombinante, e sítios antigénicos que permitem a melhoria de métodos de diagnóstico, testes e kíts e a produção de novos métodos de diagnóstico, testes e kits. As mudanças artificiais ou substituições de resíduos de aminoácidos que mantêm a antigenicidade (como por exemplo definido pela reactividade com 6 soro policlonal ou MAb) e, consequentemente, a funcionalidade do sitio antigénico, podem ser facilmente derivadas de sequências conhecidas para constituir um sitio antigénico de um isolado especifico por um especialista na técnica de concepção e síntese de péptidos. Por exemplo, certos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos convencionalmente por outros de natureza comparável, e. g. um resíduo básico por outro resíduo básico, um ácido por um ácido, um volumoso por um volumoso, um hidrofóbico ou hidrofílico por outro resíduo hidrofóbico ou hidrofílico, e assim sucessivamente. Também, outras mudanças menos convencionais mas mais específicas são também possíveis, as quais mantêm ou até melhoram a antigenicidade da sequência seleccionada. Tais mudanças podem por exemplo, ser preparadas por PEPSCAN baseado em técnicas de substituição de aminoácidos ou de mapeamento por substituição (van Amerongen et al., Peptide Research (1992) 5, 269-274. Resumidamente, os resíduos de aminoácidos dentro dos sítios antigénicos proporcionados pela invenção podem, e. g., ser substituídos convencionalmente ou sobre orientação do mapeamento por substituição, por meio do qual as sequências de péptidos resultantes são funcionalmente equivalentes ao sítio antigénico. Os aminoácidos de substituição podem ser resíduos de aminoácidos L- ou D-. Adicionalmente, as sequências de péptidos proporcionadas pela invenção são tornadas ainda mais imunogénicas conjugando-as com adjuvantes (tais como KLH) conhecidos na técnica. Adicionalmente, os péptidos são tornados ainda mais imunogénicos fazendo péptidos com uma ou mais sequências repetidas (tais como péptidos em tandem) ou através da polimerização ou circularização.
Embora tenha sido demonstrado anteriormente que a proteína N é imunogénica (Meulenberg (1995), J. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, documento GB 2289279 A) e que existem 7 regiões conservadas e não conservadas entre a proteína N de estirpes Europeias (LV) e estirpes dos EUA (VR2332) (documento WO96/04010), é aqui demonstrado pela primeira vez que as reqiões conservadas e não conservadas são antigénicas as quais podem ser utilizadas individualmente ou em combinações, como antigénios para os ensaios de imunização ou diagnóstico. Para além disso é aqui identificado que as regiões antigénicas na proteína N consistem ambas de epitopos lineares e dependentes da conformação. A proteína GP4 é a primeira proteína estrutural de PRRSV para a qual é demonstrado que esta dá origem a anticorpos que podem neutralizar o vírus. Foi identificada e definida uma região específica de aproximadamente 40 aminoácidos que deveria ser exposta à superfície do virião como um alvo para neutralizar anticorpos, que a seguir evitam a infecção das células pelo vírus. Isto é uma empolgante nova verificação uma vez que é geralmente assumido que a proteína GP5, a estrutura principal de PRRSV, é o candidato mais importante envolvido na ligação da célula hospedeira.
Este documento descreve a localização de um sítio de neutralização principal, importante para a concepção de vacinas marcadoras eficazes que compreendem sequências de aminoácidos centrais e sequências de aminoácidos flanqueando as sequências centrais dos isolados de PRRSV cujas sequências compreendem o sítio de neutralização da proteína de ORF4 de PRRSV. Através da incorporação de sequências do sítio de neutralização relevantes em vários tipos de vacinas, é possível induzir especificamente anticorpos neutralizantes no porco vacinado. As vacinas mortas compreendendo o sítio de neutralização proporcionado pela invenção são preparadas para induzir anticorpos neutralizantes 8 quantificáveis. Em especial, compreendem o sitio de neutralização, as sequências localizadas em posições na proteína codificada pela 0RF4 de PRRSV correspondendo àquelas verificadas perto do aminoácido 40 a 79 como verificado no isolado 1-1102 de PRRSV. Para além disso, as sequências de péptidos seleccionadas tornam-se ainda mais imunogénicas misturando os péptidos com adjuvantes ou com outros veículos conhecidos na técnica. As composições de péptidos assim obtidas são utilizadas como uma vacina. Contudo, também as sequências de péptidos seleccionadas compreendendo o sítio de neutralização são incorporadas em sistemas de vectorização de vacina, sendo vectores recombinantes distintos derivados de vírus ou bactérias heterólogas, mas as sequências de péptidos seleccionadas são também incorporadas selectivamente em vector de vírus PRRSV ou suas vacinas derivadas.
Também são descritas sequências de aminoácidos localizadas nas posições correspondendo desde cerca de 52 a 75 que, mais especificamente, constituem um sítio de neutralização amplamente reactivo. Outras formas de realização do sítio de neutralização proporcionadas pela invenção podem ser encontradas entre os vários isolados de PRRSV conhecidos ou a serem verificados (ver por exemplo a parte experimental desta descrição). É fácil para qualquer pessoa que trabalha no campo da biologia molecular comparar as sequência compreendendo o sítio de neutralização proporcionado pela invenção com a sequência de aminoácidos da proteína codificada pela 0RF4 de ainda outro isolado de PRRSV. A invenção também proporciona sequências de péptidos da reivindicação que melhoram os testes de diagnóstico, sendo estes testes de detecção de antigénio ou anticorpo. A invenção proporciona vários grupos de sítios antigénicos que são 9 utilizados isolados ou em combinação em testes de diagnóstico. Deste modo, os testes de diagnóstico são proporcionados pela invenção que serve as várias necessidades que existem no campo no que diz respeito ao diagnóstico e diagnóstico diferencial. As interacções antigénio-anticorpo requerem sempre interacções epitopo-paratopo de reacção cruzada de sequências de aminoácidos que são sequências desde 5 a 15 aminoácidos de comprimento. Assim as sequências de aminoácidos de 5 a 15 aminoácidos de comprimento e parcialmente ou completamente sobrepondo-se com as sequências centrais dos sítios antigénicos da invenção são proporcionadas pela invenção para incorporação em testes de diagnóstico. Estas sequências de péptidos são utilizadas para seleccionar ou conceber antigénio ou substancia antigénica contendo as sequências no teste a ser utilizado. Alternativamente, e proporcionado pela invenção, os anticorpos sintéticos são reactivos com os sítios antigénicos proporcionados pela invenção. Estes sítios ou sequências relacionadas reagem com o anticorpo sintético obtido de sistemas tais como bibliotecas de apresentação de fagos ou selecção clonal de anticorpos (cadeia pesada) que constituem moléculas do tipo de anticorpo que podem facilmente ser expressas em sistemas de expressão heterólogos.
Um grupo compreende a sequência de péptidos correspondendo ao referido sítio de neutralização, como já explicado anteriormente. Os testes de diagnóstico compreendendo este sítio e/ou anticorpos especificamente direccionados contra este sítio detectam anticorpos neutralizantes no porco. 0 grupo proporcionado pela invenção compreende um sítio antigénico conservado na proteína N. Dentro do sítio antigénico conservado, a invenção proporciona uma sequência central 10 VNQLCQLLGA ou VNQLCQMLGK. Os testes de diagnóstico compreendendo este sitio e/ou anticorpos especificamente direccionados contra este sitio detectam estes anticorpos em porcos que reagem especificamente com a maioria dos isolados de PRRSV. Também, são proporcionados testes de diagnóstico que utilizam anticorpos direccionados contra o sítios conservado para detectar o antigénio de PRRSV, permitindo deste modo o teste para detectar isolados de PRRSV, independentemente da sua origem.
Outro grupo compreende um sítio antigénico de diferenciação não conservado na proteína N. Os testes de diagnóstico compreendendo este sítio e/ou anticorpos especificamente direccionados contra este sítio, detectam aqueles anticorpos em porcos que reagem especificamente com isolados de PRRSV distintos, através dos quais, por exemplo, os porcos vacinados podem ser discriminados a partir de porcos infectados com PRRSV do tipo selvagem. Além disso, os testes de diagnóstico podem ser preparados de modo a utilizarem anticorpos direccionados contra o sítio não conservado para detectar o antigénio PRRSV, permitindo assim que o teste distinga isolados de PRRSV diferentes. Dentro de um sítio, tal como um sítio não conservado, uma sequência principal é PRGGQAKKKK ou PRGGQAKRKK ou PRGGQAKKRK ou GPGKKNKKKN ou GPGKKNKKKT ou GPGKKNRKKN ou GPGKKFKKKN ou GPGKKIKKKN ou GPGQINKKIN. Dentro de outro sítio não conservado uma sequência principal é MAGKNQSQKK ou MPNNNGKQTE OU MPNNNGKQPK ou MPNNNGKQQK ou MPNNNGKQQN OU MPNNNGKQQK ou MPNNNGRQQK. Além disso, as mudanças artificiais que mantém a antigenicidade e assim a funcionalidade das sequências principais anteriores na proteína GP4 ou N podem ser facilmente introduzidas por qualquer especialista na técnica da concepção e síntese de péptidos, como descrito anteriormente. 11 A invenção também descreve um grupo compreendendo epitopos conformacionais (que podem variar muito entre os vários isolados) que podem ser encontrados em posições correspondendo aquelas encontradas no isolado 1-1102 desde a posição do aminoácido 51 até cerca da 68 (na sequência principal PKPHFPLAAEDDIRHHL do isolado 1-1102) ou desde 79 até cerca de 90 (na sequência principal SIQTAFNQGAGT do isolado 1-1102) ou desde 111 até 124 (na sequência principal HTVRLIRVTSTSAS do isolado 1-1102) na proteína N. Os sítios conservados e não conservados e de diferenciação e conformacionais na proteína N, proporcionam testes de diagnóstico que diagnosticam inequivocamente infecções com PRRSV. São efectuados testes que evitam o emprego de sítios não conservados evitando assim resultados falsos negativos. Adicionalmente, os vários sítios não conservados são utilizados no desenvolvimento de testes de diferenciação que podem, e. g., discriminar porcos vacinados de porcos infectados com isolados da estirpe selvagem de PRRSV. De novo, como referido, é fácil para qualquer pessoa que trabalhe no campo da biologia molecular alinhar as sequências compreendendo os sítios do epitopo conservados ou não conservados ou conformacionais com sequências de aminoácidos da proteína codificada por ORF7 de ainda outro isolado de PRRSV. Os sítios proporcionados pela invenção são utilizados em novos pares de testes de diagnóstico discriminatórios de vacina para utilização em programas de erradicação de PRRS. 12
Parte experimental
Materiais e Métodos Células e virus A estirpe Ter Huurne (CNCM 1-1102) de PRRSV foi isolada em 1991 (Wensvoort et al., 1991). A estirpe US ATCC-VR2332 foi isolada por Benfield et al. (1992). A estirpe NL1 (Holanda, 1991) foi isolada no laboratório, Estirpe NY2 (Inglaterra, 1991) foi amavelmente proporcionada por T. Drew, estirpe DEN (Dinamarca, 1992) foi amavelmente proporcionada por A. Botner, estirpe LUX (Luxemburgo, 1992) foi amavelmente proporcionada por Losch, SPA1 e SPA2 (Espanha, 1992) foram amavelmente proporcionadas por Shokouhi e Espuna, respectivamente, e a estirpe FRA (França, 1992) foi amavelmente proporcionada por Y. Leforban. PRRSV e VR2332 foram crescidos em células CL2621 como descrito anteriormente (van Nieuwstadt et al., 1996). Os sete isolados Europeus diferentes foram crescidos em macrófagos alveolares de suinos. Os macrófagos foram mantidos como anteriormente descrito (Wensvoort et al, 1991) . As células BHK-21 foram mantidas em Meio Essencial Minimo de Dulbecco suplementar com soro fetal bovino a 5% e antibióticos. Para as experiências de transfecção, foram crescidas células BHK-21 em Meio Essencial Minimo de Glasgow (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd) . 13
Antisoro
Foi utilizado soro 21 anti-PRRSV de suino e soro 698 e 700 anti-péptido de coelho em experiências anteriores. O soro 700 está direccionado contra aminoácidos 106 a 122 (CLFYASEMSEKGFKVIF) codificados por ORF4 do PRRSV e foi obtido a partir de um coelho. Foi descrita a produção e caracterização de MAbs (van Nieuwstadt et al, 1996). Os hibridomas foram derivados a partir de cinco experiências de fusão consecutivas e direccionados contra a proteína ORF4 (MAb 121,4, 122,1, 122,12, 122,20, 122,29, 122,30, 122,59, 122,66, 122,68, 122,70, 122,71, 126.1, 126,7, 130,7, 138,28) ou proteína ORF7 (MAb 122,17, 125.1, 126,9, 126,15, 130,2, 130,4, 131,7, 138,22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17); Os MAb WBE foram atenciosamente proporcionados pelo Dr. Drew, Weybridge, RU; O Mab SDOW17 foi atenciosamente proporcionado pelo Dr. Benfield, South Dakota, EU.
Construção de plasmídeos
Foram utilizados anteriormente dois oligonucleótidos localizados a montante (PRRSV13) e a jusante (PRRSV14) da ORF4 previamente a amplificar e clonar a ORF4 do isolado 1-1102 em pGEM-4Z utilizando os sítios BamEI e HindIII introduzidos nos iniciadores (Meulenberg et al. 1995). O plasmídeo resultante foi denominado pABV209. Foram utilizados dois oligonucleótidos localizados numa posição similar no que diz respeito ao codão de iniciação (PRRSV4) e ao codão de terminação (PRRSV5) da ORF4 de VR2332 para amplificar ORF4 de VR2332 através de RT-PCR como descrito em estudos anteriores. O fragmento de PCR foi digerido com BamEI e parcialmente com HindIII uma vez que a ORF de VR2332 14 contém um sítio HindIII interno, e clonado em pGEM-4Z resultando em plasmídeo pABV270. As técnicas de ADN recombinante foram realizadas essencialmente como descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, NY, 1989). A sequência de nucleótidos da 0RF4 de VR2332 em pABV270, determinada num sequenciador automático de ADN (Applied Biosystems), era idêntica à sequência publicada (Murtaugh et al., Arch. Virol. 140; 1451-1460, 1995). Subsequentemente, as ORF de 1-1102 e VR2332 foram transferidas para o vector de expressão pSFVl do vírus da floresta de Semliki. O pABV209 e pABV270 foram digeridos com BamRI e HindIII (parcialmente para pABV270), os fragmentos de ORF4 foram tratados com polimerase Klenow (Pharmacia) para criar extremidades rombas e estes foram ligados no sítio Smal de pSFVl, desfosforilados com fosfatase alcalina intestinal de vitela (Pharmacia). Os plasmídeos contendo a 0RF4 de 1-1102 (pABV265) e VR2332 (pABV271) na orientação correcta foram testados posteriormente para a expressão de proteína GP4. Adicionalmente, foram preparados quatro genes ORF4 quiméricos diferentes de 1-1102 e VR2332. A sequência de nucleótidos de ORF4 que codifica os aminoácidos 1 até 39 da proteína GP4 de VR2332 foi amplificada a partir do plasmídeo pABV270 com os oligonucleótidos PRRSV4 e PRRSV6. 0 fragmento obtido foi digerido com BamRI e SacII. Este fragmento foi ligado em pABV209, digerido com BamRI e SacII para criar uma fusão em grelha entre os aminoácidos 1 até 39 da proteína GP4 de VR2332 e 40 até 183 da proteína GP4 de 1-1102 em pABV306. A sequência de nucleótidos de ORF4 que codifica os aminoácidos 1 até 75 da GP4 de VR2332 foi amplificada com os oligonucleótidos PRRSV4 e PRRSV9 (ver Tabela 2) . Este fragmento foi digerido com ΚρηI e BamRI. A sequência de nucleótidos de ORF4 que codifica os aminoácidos 80 a 183 da proteína GP4 de 1-1102 foi amplificada 15 com PRRSV46 e PRRSV14 e o fragmento amplificado foi digerido com Kpnl e BamEl. Ambos os fragmentos foram ligados em conjunto em pGEM-4Z digeridos com BamEl e Híndlll, resultando no plasmideo pABV308. Do mesmo modo foi criada uma construção complementar em pABV314, consistindo da sequência de nucleótidos que codifica os aminoácidos 1 até 79 da proteína GP4 de 1-1102 amplificada com PRRSV13 e PRRSV57, ligada a um fragmento que codifica os aminoácidos 7 6 até 178 de VR2332, que foi amplificada com PRRSV10 e PRRSV5, em pGEM-4Z. Uma quarta construção quimérica consistiu de um fragmento que codifica os aminoácidos 40 até 79 da proteína GP4 de PRRSV fundida com fragmentos que codificam os aminoácidos 1 até 39 e aminoácidos 76 até 178 da proteína GP4 de VR2332. Isto foi alcançado ligando o fragmento ORF4 EamHI/SacII de pABV270 e o fragmento ORF4 Sacl 1/Hindi II de pABV314 em pGEM-4Z digerido com BamEl e HindiII. Este plasmideo foi designado pABV325. Os plasmídeos pABV306, pABV308, pABV314, e pABV325 foram verificados quanto à sequência correcta através da sequenciação dos oligonucleótidos. Os genes quiméricos de ORF4 foram transferidos de pABV306, pABV308, pABV314, e pABV325 para PSVVI, de modo idêntico ao descrito anteriormente para os qenes ORF4 de VR2332 e PRRSV, resultando em pABV296, pABV305, pABV321, e pABV326, respectivamente (Fig. 3).
Dois oligonucleótidos localizados a montante (LV108; 5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') e a jusante (LV112;5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3') da ORF7 foram utilizados para amplificar e clonar o gene ORF7 no pGEM-T, resultando em pABV431. As sequências e posição destes e outros oligonucleótidos utilizados para amplificar fragmentos de ORF7 estão listados na Tabela 1. Adicionalmente, foram preparadas quatro construções quiméricas diferentes por mutagénese direccionada por PCR. As sequências que codificam os aminoácidos 16 25-26, 28-30 (sítio B; figura 3) foram substituídas pelas
sequências correspondentes da proteína N de EAV. Isto foi alcançado por amplificação por PCR da ORF7 com LV108 e LV134 (5' TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAAGTCC 3'). O fragmento de ADN mutado foi introduzido em pABV431 utilizando o sítio MscI e PacI, o que resultou em pABV455. A região de ORF7 que codifica os aminoácidos 51 a 67 foi substituída pela região correspondente de ORF7 de LDV. O pABv431 foi digerido com EcoNI e Ciai e ligado a um fragmento de PCR produzido com os iniciadores LV98 (5' CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTCCCAT GGCTGGTCCATCTGAC 3') e LV99 (5' CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGG AGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC 3'), digerido com os mesmos enzimas. Este plasmídeo foi designado de pABV463. A região da ORF7 que codifica os aminoácidos 80 a 90 foi substituída pela região correspondente do gene ORF de LDV. O gene ORF de LV foi mutado num PCR com iniciadores LV101 (5' GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTCATCCA 3') e LV112. O fragmento obtido foi digerido com Narl e PacI e ligado a pABV431 digerido com Ciai e PacI. Isto resultou em pABV453. Finalmente, a região que codifica a parte do terminal C da proteína N (aminoácidos 111-128) foi substituída por uma sequência que codifica os aminoácidos correspondentes da proteína N de LDV. 0 gene ORF7 foi amplificado com os iniciadores LV108 e LV102 (5' ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAG CAACCGGCAG 3') e clonado no vector pGEM-T, que resultou no pABV456. Os genes ORF7 mutados e do tipo selvagem foram excisados a partir de pABV431, pABV453, pABV455, e pABV463 por digestão com PacI (extremidades rombas) e Hpal e a partir de pABV456 através de digestão com Hpal e SwaI. Estes genes foram inseridos subsequentemente no sítio Smal desfosforilado do 17 vector de expressão pSFVl do vírus da floresta Semliki. Os plasmídeos pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 e pABV471 contendo os respectivos genes 0RF7 na orientação correcta foram testados ainda para a expressão da proteína N. A transcrição e transfecção in vitro do ARN de 0RF7 do vírus da floresta de Semliki foi efectuada, como descrito anteriormente, para as construções SFV-ORF4.
Para clonar os genes 0RF4 de sete isolados Europeus de macrófagos diferentes foram infectados com NLl, NY2, DEN, FRA, SPAl, SPA2, e LUX, e o ARN foi isolado como descrito por
Meulenberg et al. (1993). Os genes 0RF4 foram amplificados por meio de RT-PCR com os oligonucleótidos PRRSV13 e PRRSV14, e clonados com BamRI e HindiII em pGEM-4Z. Para cada estirpe, foi determinada a sequência de nucleótidos de 0RF4 dos dois clones derivados de dois PCRs independentes. As sequências de proteínas derivadas da sequência de nucleótidos foram alinhadas utilizando o programa de alinhamento de sequências múltiplas CLUSTAL da PCGene (Intelligenetics Tm) .
Transcrição e transfecção in vitro do ARN de SFV-0RF4.
Foram linearizados plasmídeos pSFVl contendo diferentes construções de 0RF4 por digestão com Spel e transcritos in vitro. 0 ARN sintetizado foi transfeccionado para células BHk-21 em poços de 15 mm de placas de vinte e quatro poços utilizando lipofectina. As células foram fixas com metanol/acetona a 50% (v/v) arrefecido em gelo e a proteína GP4 expressa pelas diferentes construções de ORF4 foi corada com MAbs no ensaio de imunoperoxidase em monocamada (IPMA). Para analisar os produtos de expressão de ORF4 por imunoprecipitação, foram 18 transfeccionadas in vitro 107 células BH K-21 com 10 yg de ARN de SFV-ORF4 por electroporação. As células sujeitas a electroporação foram plaqueadas em três poços de 35 mm de placas de seis poços e 18 h depois as células transfeccionadas foram marcadas. Método pepscan
Foi sintetizado um conjunto completo de nonapéptidos ou dodecapéptidos sobrepostos a partir de aminoácidos derivados da sequência ORF4 ou ORF7 de PRRSV, tal como foi determinado anteriormente (Meulenberg et al., 1993). A síntese de péptidos de fase sólida em bastonetes de polietileno e rastreio imunológico com um tipo de análise de ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) foram realizados de acordo com processos de PEPSCAN estabelecidos (Geysen et al., PNAS, 81, 3998-4002, 1984) .
RESULTADOS
Foi descrito anteriormente um painel de MAbs neutralizantes que reagiram com uma proteína de 31 a 35 kDa de PRRSV, designada GP4, e um painel de Mabs que reagem com a proteína N, através de análise de imunotransferência por Western. A GP4 foi demonstrada ser uma glicoproteína estrutural codificada por ORF4, N foi demonstrada ser uma proteína da nucleocápside codificada por ORF7. Em experiências de imunoprecipitação com Mabs específicos de GP4, a proteína GP4 derivada de lisados de células infectadas com PRRSV, migrou como uma banda discreta de 28 kDa conjuntamente com um ligeiro arrastamento com peso molecular 19 aparentemente um pouco superior. Os MAbs imunoprecipitaram uma proteína GP4 (glicolisada) difusa de cerca 31 kDa a partir do meio extracelular infectado com PSSRV mas não a partir do meio extracelular infectado com células simuladas.
Identificação do domínio neutralizante em GP4.
Foi demonstrado anteriormente que os MAbs específicos para a proteína GP4 reconheciam 1-1102 mas não o isolado VR2332 dos EUA (van Nieuwstadt et al., 1996). De modo a identificar o domínio de ligação dos MAbs neutralizantes na proteína GP4, foram preparadas proteínas de fusão da proteína GP4 de 1-1102 e VR2332. Estas proteínas foram expressas no sistema de expressão do vírus da floresta de Semliki, desenvolvido por Liljestrõm et al., [Biotechnol, 9, 1356-1362, 1991). Em primeiro lugar, a ORF4 de 1-1102 foi clonada em pSFVl resultando no plasmídeo pABV265 (Fig. 1). O ARN transcrito a partir de pABV265 foi transfectado para células BHK-21 e 24 h após a transfecção das células, foram coradas positivamente com o painel de quinze MAbs neutralizantes. Os MAbs não reagiram com células BHK-21 transfectadas com ARN de pSFVl. A proteína recombinante GP4 foi imunoprecipitada com MAb 126,1 a partir de células BHK-21 marcadas com L-[35S]metionina transfectadas com ARN de pABV265. Possuíam um tamanho semelhante tal como a GP autêntica, proteína sintetizada em células CL2621 infectadas com 1-1102 e também continham glicanos ligados a N sensíveis a PNGaseF e EndoH. A proteína GP4 de VR2332 foi também clonada em pSFVl, mas esta proteína não foi reconhecida pelos MAbs após expressão em células BHK-21 (Fig. 1) . Para localizar posteriormente a região na proteína GP4 reconhecida pelos MAbs, foram construídos em pSFVl quatro genes ORF4 quiméricos de 1-11022 e VR2332 (Fig. 1) . 20 0 ARN transcrito dos plasmídeos pABV296, pABV305, pABV321, e pABV326 foi transfectado para células BHK-21 e a reactividade das proteinas expressas foi testada por IPMA com MAb específicos de GP4. 0 padrão de reacção destes quinze MAb foi idêntico e indicou que estes MAb foram direccionados para uma região de 40 aminoácidos na proteina GP4; O produto da expressão de pABV326, consistindo dos aminoácidos 40 até 79 derivou da proteína GP4 do isolado 1-1102 e rodeado por sequências derivadas da proteína GP4 de VR2332 foi, contudo, reconhecido pelo painel de MAb. Para assegurar que as diferentes proteinas GP4, especialmente aquelas que não foram reconhecidas pelos MAb, foram expressas apropriadamente em células BHK21, estas foram imunoprecipitadas de lisados de células BHK-21 que foram transfectadas com ARN transcrito in vitro de plasmideos pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV32l e pABV326. A imunoprecipitação foi realizada com soro 21 anti-PRRSV de suíno, Mab 126,1 e soro 698 e 700 anti-péptido. O soro 700 está direccionado contra os aminoácidos 106-122 da proteína GP4 de PRRSV do isolado CNCN 1-1102, uma sequência que é idêntica na proteína GP4 do isolado ATCC-VR2332, à parte do aminoácido 121. Portanto, todas as proteínas GP4 foram imunoprecipitadas com soro 700. Estas não foram distinguíveis em tamanho, quando analisadas por SDS-PAGE, excepto para as proteínas GP4 expressas por pABV305 e pABV271, que migraram ligeiramente mais depressa. Isto é mais provavelmente devido à eliminação de 4 aminoácidos na sequência de VR2332 relativa à sequência 1-1102, entre os aminoácidos 62-64 (Fig. 3) . O conjunto completo de MAb específicos de GP4 reconhecido pelas proteínas GP4 expressos de pABV265, pABV296, pABV321, pABV326, mas não aqueles expressos de pABV305 e pABV271, o que confirmou os resultados obtidos através de IPMA (Fig. 3) . O soro 698 possui o mesmo perfil de reacção como os MAbs. O soro 698 está direccionado contra os aminoácidos 62 a 77 de GP4 de PSSRV, que 21 estão localizados dentro do domínio de neutralização da proteína GP4 agora identificado. Esta região é altamente heterogénea na 0RF4 de VR2332 e, por isso, os produtos da expressão contendo a sequência VR2332 nesta região não foram reconhecidos por este soro. Contudo, o soro policlonal neutralizante de porco reconhece a proteína GP4 de 1-1102 e as proteínas GP4 quiméricas e a proteína GP4 de VR2332, indicando que no soro anti-PRRSV de suíno está presente uma variedade de anticorpos neutralizantes que estão direccionados contra o sítio neutralizante formado pelos aminoácidos 40 a 79 da proteína GP4.
Pepscan da proteína ORF4 e 0RF7
Uma vez que todos os quinze MAbs que reagem com a proteína 0RF4 reagiram com a proteína GP4 na análise por transferência de Western, era esperado que estes reconhecessem um epitopo linear numa região envergando os aminoácidos 40 até 79 de GP4 do isolado 1-1102. Para mapear posteriormente a região de ligação dos MAbs, foi realizada uma análise por PEPSCAN utilizando nonapéptidos de sobreposição ou dodecapéptidos nesta região. Os péptidos foram considerados representar sítios antigénicos se os picos nesse conjunto somam de um modo reprodutível mais do que o dobro do fundo. Os MAbs 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7, 138-28, reagiram positivamente com um sítio antigénico específico consistindo dos aminoácidos 59 até 67 (SAAQEKISF) (Fig. 2) . O MAb 122-12 reagiu apenas fracamente com este sítio antigénico, uma vez que os 7 MAbs restantes foram negativos na análise por PEPSCAN. O soro policlonal de porco também identificou este sítio no PEPSCAN. O soro 21 neutralizante, recolhido na semana 6 após a infecção do porco 21 com PRRSV reagiu fortemente e extensivamente com o sítio e a suas regiões flanqueadoras. 22
Adicionalmente, o soro de porco policlonal neutralizante (val2 e val4), recolhido 54 dias após a vacinação com vector de vírus PRV-0RF4 e na eutanásia a 30 dias após desafio ao dia 54 com PRRSV, reagiu fortemente e mais extensivamente com o sítio de neutralização identificado no PEPSCAN.
No isolado 1-1102, a sequência principal do sítio de neutralização compreende a sequência aa SAAQEKISF localizada desde a posição aa 59-67. Em outros isolados a sequência principal pode ser encontrada a ou à volta da posição aa correspondente, que é uma sequência de aminoácidos correspondente ao sítio de neutralização da proteína GP4, compreendendo por exemplo sequências tais como SAAQEEISF, ou STAQENISF ou STAQENIPF OU SEESQSVT ou SASEAIR ou SASEAFR ou PAPEAFR ou PAPEAIR ou SAFETFR ou STSEAFR, mas não é esperado que outros isolados de PRRSV possuam sequências principais correspondentes mas ligeiramente diferentes do sítio de neutralização localizado a ou cerca da posição aa correspondente ao aa 59-67 da sequência de aminoácidos ORF4 do isolado 1-1102 de PRRSV. Além disso, as mudanças artificiais que mantém a antigenicidade e assim a funcionalidade das sequências nucleares anteriores podem ser facilmente introduzidas por um especialista na técnica de concepção e síntese de péptidos. Além disso, tal como é claramente demonstrado, no PEPSCAN, pela reactividade bastante extensa do soro policlonal neutralizante, as sequências de ar compreendendo sequências principais de aa e sequências de aa flanqueando as sequências principais dos vários isolados de PRRSV constituem adicionalmente o sítio de neutralização na proteína ORF4 de PRRSV. Em especial sequências localizadas nas posições de aa correspondendo a cerca de 40 a 79 constituem o sítio de neutralização (Fig. 1) . De novo, mudanças artificiais que mantém a antigenicidade e assim a funcionalidade dos sítios 23 antigénicos anteriores podem ser facilmente introduzidas pelo especialista na técnica da concepção e sintese de péptidos. Além disso, considerando a reactividade extensa do soro neutralizante policlonal val2 e val4 (Fig 2), sequências de aa localizadas nas posições correspondendo desde cerca de o aa 52 a 75, constituem mais especificamente um sitio de neutralização extensivamente reactivo.
Os MAbs direccionados contra a proteina 0RF7 reagiram em quatro grupos diferentes em PEPSCAN, grupo A (4), B(2), C (3) e D(l). 0 grupo 1 (D) (no qual entre outros Mabs 122,17, 130,3, 130,4, 131,7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17 e compreendendo sitios reactivos conservados e não conservados) reagiu com um epitopo conformacional não detectável em PEPSCAN. O grupo 2 (B) (no qual entre outros 125,1, 126,9, NS95 e NS99 e que reage com todos os isolados de PRRSV testados, identificando assim um sitio antigénico conservado) identifica uma sequência nuclear VNQLCQLLGA (verificado no isolado 1-1102 desde o aa na posição 22 a cerca de 32) ou VNQLCQMLGK. O grupo 3 (C) (no qual, entre outros, Mab 126,15 e os que reagem principalmente com estirpes de PRRSV isoladas na Europa, identificando assim um sítio antigénico diferenciador) identifica uma sequência nuclear PRGGQAKKKK (verificado no isolado 1-1102 do aa na posição 42 até cerca de 50) ou PRGGQAKRKK ou PRGGQAKKRK ou GPGKKNKKKN ou GPGKKNKKKT ou GPGKKNRKKN ou GPGKKFKKKN ou GPGKKIKKKN ou GPGQINKKIN. O grupo 4 (A) (no qual entre outros Mab 138,22 e aqueles que reagem principalmente com estirpes de PRRSV isoladas na Europa, identificando assim um sítio antigénico diferenciador) identifica uma sequência nuclear MAGKNQSQKK (verificado no isolado 1-1102 a partir do aa na posição 1 até cerca de 10) ou MONNNGKQTE ou MONNNGKQPK ou MPNNNGKQQK ou MONNNGKQQN ou MONNNGKQQK ou MPNNNGRQQK. Além disso, as mudanças 24 artificiais que mantém a antigenicidade e assim a funcionalidade dos sítios antigénicos anteriores na proteína N podem ser facilmente introduzidas por um especialista na técnica da concepção e síntese de péptidos. Embora o grupo 1 não constitua epitopos lineares, a comparação das sequências de aa de PRRSV com sequências de LDV demonstra que os epitopos conformacionais (que variam grandemente entre os vários isolados) podem ser encontrados nas posições correspondendo aqueles encontrados no isolado 1-1102 desde a posição aa 51 até cerca de 68 (no isolado 1-1102 a sequência de aa PKPHFPLAAEDDIRHHL) ou desde 79 até cerca de 90 (no isolado 1-1102 a sequência de aa SIQTAFNQGAGT) ou desde 111 até 124 (no isolado 1-1102 a sequência de aa HTVRLIRVTSTSAS). Também, podem ser facilmente introduzidas mudanças artificiais que mantém a antigenicidade e assim a funcionalidade dos sítios do epitopo conformacional na proteína por um especialista na técnica da concepção e síntese de péptidos, especialmente com informação obtida através de comparação de sequências de isolados de PRRSV, e através de comparação com sequências de proteína N ou outros Arteriviridae. Isto foi determinado na expressão de proteínas ORF7 quiméricas de LDV/PRRSV no sistema de expressão SFV (efectuado como anteriormente para ORF4) e determinando a sua reactividade com Mabs a partir do grupo 1.
Proteínas N quiméricas O domínio D foi mapeado posteriormente com construções de ORF7 expressando proteínas N quiméricas. Uma vez que 6 de 10 MAbs direccionados contra o domínio D reconheceram ambos os isolados de PRSSV Europeus e Norte Americanos, as regiões que foram mais conservadas entre a proteína N de LV e o protótipo 25 VR2332 Norte Americano estavam mutadas (Fig. 4). A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos 51 a 67, 80 a 90, e 111 a 128 foi substituída para uma sequência que codifica para os aminoácidos correspondentes de LDV (Fig. 4) . Para conclusão, o sítio B (aminoácidos 25-30) que é também conservado nos isolados Europeus e Norte Americanos, estava mutado. Uma vez que a sequência de aminoácidos da proteína N de LV era muito semelhante aquela da proteína LV N no sítio B, esta região da proteína N de LV foi substituída para uma região que codifica os aminoácidos correspondentes da proteína N de EAV (Fig. 4) . Quando as proteínas N mutadas e do tipo selvagem foram expressas em células BHK-21 utilizando o sistema de expressão do vírus da floresta Semliki, e estes foram testados com os MAbs específicos de N em IPMA, os MAbs específicos de D reagiram de modo idêntico (Tabela 1) . A sua ligação foi rompida através de mutações entre os aminoácidos 51-67 e 80-90, mas não através de mutações entre os aminoácidos 111-128 ou aminoácidos 25-30 (sítio B) . Como foi esperado, as proteínas N com sequências LDV entre os aminoácidos 51-67 e 80-90 foram ainda coradas através de MAbs direccionados contra os sítios A, B, e C. Contudo, o número de células que foram coradas e o brilho desta coloração foi inferior do que a observada para a proteína N do tipo selvagem e as proteínas N mutadas nos aminoácidos 25-30 (sítio B) ou nos aminoácidos 111-128 (Tabela 1) . Isto foi devido mais provavelmente a expressão mais reduzida da proteínas N contendo mutações ente os aminoácidos 51-67 ou 80-90, uma vez que foi também obtido um rendimento mais reduzido destas proteínas N mutantes comparado com as outras proteínas N, quando quantidade iguais de transcriptos foram traduzidos in vitro (dados não apresentados). Como foi esperado, a proteína N que continha sequências EAV no sítio B não foi reconhecida pelos MAbs mapeados para o sítio B (através de análise por pepscan), mas foi ainda reconhecida 26 através de MAbs que mapearam para os sítios A, C, ou domínio D. Estes dados indicam que os epitopos mapeados para o domínio D estão dependentes da conformação e consistem (parcialmente) dos aminoácidos 51-67 e 80-90.
Análise de sequências da proteína GP4 de diferentes estirpes de PRRSV.
Para analisar se o sítio de neutralização antigénico principal, reconhecido pelos anticorpos específicos de GP4, era conservado entre os diferentes isolados de PRRSV, a reactividade e a actividade neutralizante dos MAbs foi testada posteriormente em sete estirpes Europeias diferentes. Os resultados indicaram que estes MAbs reconheceram e neutralizaram outra estirpe NL1 Holandesa e estirpe NY Inglesa, mas não o isolado DEN Dinamarquês, duas estirpes SPA1 e SPA2 Espanholas, um isolado FRA Francês, e Lux isolado no Luxemburgo. Consequentemente, havia interesse na sequência de aminoácidos, na região do sítio de neutralização da proteína GP4 destes isolados. Os genes ORF4 foram clonados por meio de RT-PCR utilizando iniciadores derivados da sequência de PRRSV sendo determinada a sequência de nucleótidos. A sequência de aminoácidos da proteína GP4 dos diferentes isolados derivada desta sequência de nucleótidos apresentou 86 a 97% de identidade com a de 1-1102. O alinhamento destas sequências de aminoácidos mostrou que o sítio de neutralização (aminoácidos 40 até 79) é muito mais divergente do que a parte restante da proteína. Nesta região, em especial as sequências de aminoácidos das estirpes DAN, SPAl, SPA2 e FRA são diferentes. Isto está de acordo com a evidência de que estas estirpes não são neutralizadas pelos MAbs específicos de 1-1102 e ainda confirma que este sítio não é altamente conservado entre 27 os isolados Europeus. Foi observada outra região de elevada heterogeneidade na parte terminal N da proteína GP4. A comparação da sequência de aminoácidos da proteína GP4 de PRRSV e aquela de VR2332 e outras estirpes Norte Americanas demonstra que as ultimas são também heterogéneas no sítio de neutralização da proteína. 0 alinhamento das sequências de aminoácidos resulta na introdução de um intervalo no sítio de neutralização dos isolados Norte Americanos (Fig. 3) , o que está de acordo com a observação que nenhum destes isolados é reconhecido pelos MAbs. Globalmente, foi observada uma diversidade mais elevada entre as sequências dos isolados Americanos do que entre as sequências dos isolados Europeus.
Isto está de acordo com as características tipo para o típico envelope virai, identificado e. g. na sequência de aminoácidos de GP4. 0 potencial do sítio de neutralização para o desenvolvimento da vacina é de grande importância no que diz respeito à heterogeneidade do sítio de neutralização. A comparação da sequência de aminoácidos das proteínas GP4 de estirpes Europeias diferentes indicou que o sítio de neutralização foi muito mais variável do que outras partes da proteína, sugerindo que este sítio é susceptível à selecção imunitária. A comparação das sequências do sítio de neutralização das estirpes Europeias e Norte Americanas apresentou um intervalo de 4 aminoácidos nas sequências Norte Americanas relativamente às Europeias, ilustrando ainda a extensa variabilidade de aminoácidos do sítio de neutralização de PRRSV agora identificado. 28 0 sítio de neutralização na proteína GP4, aqui descrita, é o primeiro sítio identificado para o vírus Lelystad. Para outros dois arterivírus, EAV e LDV, os MAbs neutralizantes que foram isolados, foram todos direccionados contra a proteína Gi/VP3 codificada por 0RF5 (Dereqt et al, 1994; Glaser et al, 1995; Balasuriya et al, 1995; Harty e Plagemann, 1988) . Utilizando mutantes que escapam à neutralização, 0 sítio de neutralização de EAV foi mapeado para aminoácidos específicos no ectodomínio de Gi.
Foram efectuados comparações de sequências semelhantes para a proteína 0RF7 de PRRSV (Fig. 4) ilustrando ainda a grande variabilidade de aminoácidos do sítio conservado antigenicamente agora identificado e sítios não conservados de PSSRV. Neste trabalho foram identificados quatro sítios antigénicos distintos na proteína N de PRRSV. Três sítios denominados, A, B, e C contém epitopos lineares e estes foram mapeados entre os aminoácidos 2-12, 25-30, e 40-46, respectivamente. Em contraste, o quarto sítio, designado domínio D, contém epitopos dependentes da conformação que são (parcialmente) compostos dos aminoácidos 51-67 e 80-90. Os sítios A e C contém epitopos que são conservados nos isolados de PRRSV Europeus mas não nos Norte Americanos, o sítio B contém epitopos que são conservados nos isolados de PRRSV Europeus e Norte Americanos, uma vez que o sítio D contém ambos os epitopos que são conservados e não conservados nos isolados de PRRSV Europeus e Norte Americanos. Os sítios conservados na proteína N aqui descritos, são da maior importância no desenvolvimento de testes de diagnóstico com o objectivo do diagnóstico inequívoco de infecções de PRRSV, devendo evitar estes testes a utilização de sítios não conservados evitando assim resultados falsos negativos. Adicionalmente, o conhecimento acerca dos vários sítios não 29 conservados é altamente valioso no desenvolvimento de testes de diferenciação que podem e. g. discriminar porcos vacinados de porcos infectados com isolados do tipo selvagem de PRRSV.
Legendas.
Fig. 1. Diagrama esquemático das proteínas G expressas em pSFVl e sua reactividade com MAbs específicos de GP4. São indicados os nomes dos plasmídeos contendo os diferentes genes 0RF4. As barras abertas representam as sequências de aminoácidos derivadas da proteína G codificada por 0RF4 de PSSRV, as barras negras representam as sequências de aminoácidos derivadas da proteína G codificada por 0RF4 de VR2332. Os números dos aminoácidos estão indicados por cima das barras. Os genes foram inseridos em primeiro lugar em PGEM-4Z e depois transferidos para pSFVl, como descrito em detalhe na secção de Materiais e métodos. 0 conjunto completo de 14 MAbs específicos para GP4 reagiu de modo idêntico com as diferentes construções em IPMA sendo a reactividade indicada como positiva (+) e negativa (-).
Fig. 2. Análise de pepscan de MAbs específicos de GP4 e soro policlonal com péptidos 12-mer sobrepostos abrangendo os resíduos 25 até 94 da GP4. É apresentado o varrimento de MAbs 130,7 e Mab 138,28 que reconhece quatro péptidos consecutivos (2A). Cinco outros MAbs (122,29, 122,30, 122,66, 122,71 e 138,28) exibiram especificidade semelhante. São apresentados os varrimentos do soro policlonal a partir de dois porcos antes da imunização (val2-0 e val4-0), após a imunização com um vector do vírus pseudoraiva expressando ORF4 (val2-54 e val4-54) e após subsequente desafio com PRRSV (val2-sl e val2-sl) (2A e 2B) , e é apresentado o varrimento do soro 21 anti-LV polivalente de suíno 30 (va21) (2D) . A sequência de aminoácidos dos péptidos reactivos é apresentada com a parte nuclear dos resíduos comuns numa caixa.
Fig. 3. Alinhamento das sequências de aminoácidos de GP4 (A) e proteínas (B) N de várias estirpes de PRRSV. Apenas são apresentados os aminoácidos que diferem da sequência 1-1102. Estão sublinhadas as sequências peptídicas nucleares reconhecidas pelos MAbs e/ou soro policlonal na análise de pepscan.
Fig. 4. Localização dos sítios de ligação antigénicos na sequência da proteína N e comparação da sequência da proteína N com aquelas da estirpe VR2332 Norte Americana e LDV. Os sítios antigénicos A, B, C, e o domínio D são apresentados a sombreado. Os sítios A, B, e C foram identificados em análise de pepscan, tendo sido o sítio D identificado através de construção de proteínas N quiméricas. Encontram-se sublinhadas as sequências de aminoácidos de LV que foram substituídas para as sequências de aminoácidos correspondentes de LDV de modo a mapear o domínio D. Os aminoácidos da proteína N de EAV que foram inseridos entre os aminoácidos 25-30 para mutar o sítio B são apresentados por baixo da sequência LDV. Os aminoácidos idênticos estão ligados com barras verticais. 31
Tabela 1. Coloração de proteínas N quiméricas expressas pelo vírus da floresta de Semliki em células BHK-21 por IPMA
Plasmídeo Mutação Coloração com MAbs em IPMA 138,22 125,1/126,9/NS95/NS99 126,15 122,15/130,2/130,4/131,7/131,9/WBE1/WBE4/WBE5/WBE6/ SDOW17 32 A B C D pABV470 - +++ +++ ++ +++ pABV462 25-30 +++ - ++ +++ pABV518 51-67 ++ ++ + - pABV460 80-90 ++ ++ + - pABV471 111-124 +++ +++ ++ +++
Tabela 2. Sequência dos iniciadores utilizados na PCR para clonar os genes ORF de LV e VR2332 e genes 0RF4 quiméricos em vectores de plasmídeo pGEM-4Z e pSFVl
Nome Sequência3 Sítio de restrição incorporado LV13 5' GGCAATTGGATCCATTTGGA3' BamEI LV14 5'AGAAGCAAGC7TGCGGAGTC 3' HindIII LV4 6 5'GCCGTCGGrACCCCTCAGTACAT3' Kpnl LV57 5'ATGTACTGAGGGGTÃCCGACGGC3' Kpnl PRRSV4 5'GGCAATTGGATCCACCTAGAATGGC3' BamEI PRRSV5 5'GCGAGCAAGCTreCGCGGTCAAGCATTTCT3' HindIII PRRSV6 5'CTTGCCGCCGCGGTGGTGTTG3' SâClI PRRSV9 5'ACAGCTGGTACCTATCGCCGTACGGCACTGA3' Kpnl PRRSV10 5' GCGATAGGTACCCCTGTGTATGTTACCAT3' Kpnl a Os nucleótidos sublinhados nestes iniciadores estão mutados no que diz respeito à sequência original para criar sítios de restrição ou sequências protuberantes ou para evitar grandes extensões de uma nucleótido particular. Os sítios de restrição nos iniciadores são apresentados em itálico.
Lisboa, 19 de Julho de 2007 33
Claims (4)
- REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de 10-15 resíduos de aminoácidos originando anticorpos que reagem com pelo menos dois isolados de PRRSV diferentes, compreendendo o péptido a sequência VNQLCQLLGA ou VNQLCQMLGK, ou o péptido compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada por mudanças artificiais ou substituição de aminoácidos, de uma sequência de aminoácidos correspondendo a um sítio conservado da proteína N de PRRSV, o sítio conservado seleccionado a partir de VNQLCQLLGA ou VNQLCQMLGK, em que o referido péptido reage com anticorpos monoclonais ligados a péptidos possuindo a sequência VNQLCQLLGA ou VNQLCQMLGK.
- 2. Anticorpo que reage com um péptido de acordo com a reivindicação 1.
- 3. Kit de teste de diagnóstico para a detecção ou identificação de anticorpos direccionados contra um isolado de PRRSV compreendendo pelo menos um péptido da reivindicação 1, conjuntamente com meios adequados para a detecção.
- 4. Kit de teste de diagnóstico para a detecção ou identificação de anticorpos direccionados contra um antigénio derivado do isolado de PRRSV compreendendo um anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em conjunto com meios apropriados para a detecção. Lisboa, 19 de Julho de 2007 1
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