ES2626297T3 - Preservación asistida por vacío de productos biológicos, en particular de vacunas - Google Patents

Abstract

Un proceso de vitrificación de material biológico que comprende las etapas de formular una preparación biológica líquida, someter la preparación a cambios controlados en la presión y temperatura para reducir el contenido de humedad de la formulación a menos de aproximadamente el 5 % en peso, vitrificando así el material biológico; en el que el proceso comprende además las etapas de: (a) añadir a la preparación líquida componentes biológicos activos, estabilizadores, que reducen o eliminan el daño inducido sometiendo los componentes biológicos a medios de preservación criogénica, que incluyen granulación en perlas, vitrificación y liofilización, y opcionalmente añadir uno o más adyuvantes; (b) llenar viales con la preparación biológica de la etapa (a); (c) cargar viales en recipiente de temperatura controlada, en el que la temperatura es entre -15 ºC y 10 ºC, particularmente entre -10 ºC y 5 ºC, e incluso más particularmente aproximadamente 5 ºC; (d) reducir la presión del aire del recipiente de temperatura controlada hasta que se obtiene una presión dentro del intervalo de 15-30 mbar; (e) mantener la presión obtenida durante la etapa (d) durante entre 5 y 20 minutos, particularmente entre 10 y 15 minutos, para permitir que la temperatura del producto se estabilice y para permitir que los gases volátiles, que incluyen carbonatos, sean liberados de la preparación biológica, en el que la temperatura del recipiente sigue a aproximadamente 4 ºC a aproximadamente 6 ºC, o aproximadamente 5 ºC durante esta etapa; (f) disminuir la presión del aire del recipiente a aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mbar, o aproximadamente 5 mbar, durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos; (g) mantener la presión de la etapa (f) durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, que permite que la preparación biológica llegue a concentrarse más; (h) aumentar la temperatura del recipiente de temperatura negativa a positiva (entre aproximadamente 30 ºC y aproximadamente 50 ºC) durante el transcurso de entre 45 y 85 minutos, o aproximadamente 60 minutos, y mantener la presión constante hasta que llegue a aproximadamente 10 ºC a aproximadamente 20 ºC, o aproximadamente 15 ºC; (i) reducir la presión del aire del recipiente a aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4 mbar, o aproximadamente 3 mbar, para acelerar la concentración, y hasta que la temperatura del recipiente alcance y mantenga aproximadamente 30 ºC durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 90 minutos, o 60 minutos; (j) reducir adicionalmente la presión a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4,0 mbar, o aproximadamente 1 mbar, y mantener la presión constante hasta que se haya completado la espumación; (k) reducir adicionalmente la presión a entre aproximadamente 5 μbar y aproximadamente 100 μbar, o aproximadamente 25 μbar, mientras que se mantiene la temperatura a aproximadamente 30 ºC durante aproximadamente 400 a aproximadamente 2400 o más minutos, hasta que se obtiene la humedad deseada de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 4 %; (l) tapar los viales mientras están en el recipiente del liofilizador, completándose así el método de vitrificación.

Description

DESCRIPCION

Preservation asistida por vaclo de productos biologicos, en particular de vacunas 5 SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional USSN 61/490.987, presentada el 27 de mayo de 2011.

10 CAMPO TECNICO

[0002] La presente description se refiere generalmente a los campos de la inmunologla y la tecnologla de las vacunas. Mas especlficamente, la presente description se refiere a estabilizadores para composiciones inmunogenicas y/o de vacuna atenuadas vivas liofilizadas que pueden comprender, entre otros, paramixovirus canino.

15 La description se refiere ademas a composiciones inmunogenicas y/o de vacuna atenuadas vivas liofilizadas estabilizadas de, por ejemplo, paramixovirus canino, que pueden contener estos estabilizadores. Otros aspectos de la description se describen en o son obvios de la siguiente divulgation, y estan dentro del ambito de la description.

ANTECEDENTES

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[0003] Las composiciones inmunogenicas y composiciones de vacuna que comprenden componentes biologicos, tales como virus, bacterias, parasitos, hongos, protelnas, polipeptidos, glucoprotelnas, y especialmente, microorganismos vivos atenuados, son notablemente sensibles a las condiciones por las que se preparan, formulan y almacenan.

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[0004] Tales componentes biologicos pueden modificarse y degradarse por reacciones qulmicas (por ejemplo, hidrolisis, desaminacion, reaction de Maillard), muchas de las cuales estan mediadas por agua. El agua llquida permite movimientos moleculares y puede producir modification de las conformaciones de protelna en composiciones que comprenden componentes biologicos. Limitando el acceso al agua o eliminando el agua, se reduce un factor

30 importante de modification y degradation. Metodos previos para conferir estabilidad a componentes biologicos han implicado principalmente la congelation del agua o elimination del agua por liofilizacion.

[0005] La liofilizacion, o el proceso de liofilizacion, es una tecnica comunmente usada para eliminar agua en la preparation de productos deshidratados. Generalmente, "liofilizar" una composition acuosa implica tres etapas.

35 Primera, la composition acuosa se congela en condiciones de baja temperatura. En segundo lugar, el agua congelada se elimina por sublimation en condiciones de presion reducida y baja temperatura. En esta etapa, la composition normalmente contiene aproximadamente el 15 % de agua. Tercera, el agua residual se elimina adicionalmente por desorcion en condiciones de presion reducida y temperaturas mas altas. Al final del proceso de liofilizacion, se produce un producto liofilizado, tambien llamado una "pastilla" o "torta". El producto liofilizado contiene agua residual 40 muy baja (de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 5 % en peso/peso) y material seco en una forma amorfa. Este estado especlfico se clasifica como "vltreo".

[0006] Sin embargo, se observa perdida sustancial de actividad inmunogenica de componentes biologicos durante las etapas de preparation, tales como antes y durante la liofilizacion, y tambien durante el almacenamiento de

45 las composiciones inmunogenicas y composiciones de vacuna. La integridad de los componentes biologicos debe salvaguardarse para garantizar que se retiene la eficiencia de inmunizacion de las composiciones inmunogenicas y composiciones de vacuna. La actividad inmunogenica de componentes biologicos se mide por la capacidad para inducir y estimular una respuesta inmunologica cuando se administra a un huesped o sujeto.

50 [0007] Para limitar la manipulation de sujetos y el numero de administraciones, hay una fuerte necesidad en la

materia de proporcionar composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna multivalentes. Por definition, una composition inmunogenica o composition de vacuna multivalente comprende mas de un componente inmunogenico activo que se origina a partir de, o se deriva de, al menos dos patogenos diferentes. Virus de diferentes generos pueden variar en estabilidad durante la etapa de liofilizacion y posterior periodo de almacenamiento, produciendo una 55 perdida de viabilidad o infectividad. En el caso de virus tales como paramixovirus caninos, los componentes inmunogenicos comunmente activos administrados son virus atenuados vivos. Para estimular eficientemente el sistema inmunitario, los virus atenuados vivos debe reproducirse en el sujeto inmunizado. La perdida de viabilidad o infectividad puede producirse durante el proceso de liofilizacion de composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna multivalentes, durante el almacenamiento de las composiciones, o antes de la administration de las

composiciones despues de la reconstitucion. Asl, se han anadido estabilizadores a tales composiciones liofilizadas. Sin embargo, para obtener composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna multivalentes que retengan su infectividad y/o viabilidad, serla particularmente ventajoso un estabilizador comun que es capaz de preservar la viabilidad e infectividad de diferentes patogenos atenuados vivos.

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[0008] La estabilizacion de componentes biologicos en forma seca ha implicado normalmente la preservacion de antitoxinas, antlgenos y bacterias (Flosodort et al (1935) J. Immunol. 29, 389). Sin embargo, una limitacion en este proceso incluyo la desnaturalizacion parcial de protelnas cuando se secaron de un estado acuoso a temperatura ambiente. El secado del estado congelado ayudo a reducir la desnaturalizacion y condujo a una mejor preservacion,

10 aunque incompleta, de componentes biologicos que incluyen bacterias y virus (Stamp et al. (1947) J. Gen. Microbiol. 1, 251; Rightsel et al. (1967) Cryobiology 3, 423; Rowe et al. (1971) Cryobiology 8, 251).

[0009] Mas recientemente, se han anadido azucares tales como sacarosa, rafinosa y trehalosa en diversas combinaciones como estabilizadores antes de la liofilizacion de virus. Se ha probado un gran numero de compuestos

15 para su capacidad para estabilizar diferentes vacunas que contienen componentes biologicos atenuados vivos, en particular virus. Tales compuestos incluyen SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato y albumina; Bovarnick et al. (1950) J. Bacteriol. 59, 509-522; patente de EE.UU. N.° 4.000.256), albumina de suero bovino o humano, sales de metales alcalinos de acido glutamico, sales de aluminio, sacarosa, gelatina, almidon, lactosa, sorbitol, Tris-EDTA, hidrolizado de caselna, lactobionato de sodio y potasio, y fosfato de metal alcalino monometalico o dimetalico. Otros compuestos 20 incluyen, por ejemplo, la amina SPG-NZ (por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 3.783.098) y mezclas de polivinilpirrolidona (PVP) (por ejemplo, la patente de Ee.UU. N.° 3.915.794). Recientemente, se han estabilizado flavivirus atenuados vivos usando una mezcla compleja de multiples compuestos, que incluyen sorbitol, sacarosa, opcionalmente trehalosa y/u otros disacaridos o trisacaridos, urea, y una combinacion especlfica de aminoacidos (documento US 2010/0015180A1, a Sanofi Pasteur).

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[0010] La vacuna y las composiciones inmunogenicas han tenido un tremendo impacto sobre la salud publica, reduciendo la morbilidad y mortalidad de una variedad de patogenos virulentos. Sin embargo, efectos secundarios involuntarios que surgen de los aditivos en las composiciones inmunogenicas y composiciones de vacuna continuan planteando un posible riesgo que puede sopesar cualquier atributo protector y terapeutico de las composiciones

30 inmunogenicas y composiciones de vacuna.

[0011] En la forma frecuentemente usada en vacunas en los Estados Unidos, la gelatina puede provocar graves reacciones alergicas en aproximadamente 1 de 2 millones de dosis. Las reacciones alergicas que previamente se pensaba que resultaban de la albumina (protelna del huevo) son mas probablemente producidas por la gelatina en la

35 misma vacuna. En el caso de la albumina de suero humano, aunque nunca se ha asociado enfermedad a la albumina de suero humano en vacunas, hay una probabilidad de transmision de un virus mediante esta protelna, que se deriva de sangre humana.

[0012] Los productos derivados de bovino, tales como albumina bovina y gelatina, conllevan el riesgo de 40 transmision de CJD (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, tambien conocida como la "enfermedad de las vacas locas") a

traves de la sangre de res y productos de tejido conjuntivo usados en la fabrication de vacunas. Sin embargo, no se ha informado de casos en los que la CJD se transmitiera a traves de la sangre o productos de tejido conjuntivo, los priones que producen CJD no han sido encontrados en sangre o tejido conjuntivo, y esta prohibido el uso de productos derivados de bovino de vacas importadas de palses donde hay casos conocidos de la enfermedad de las vacas locas. 45 Sin embargo, en vista de estos riesgos, se han hecho esfuerzos para eliminar el uso de tales productos en las composiciones inmunogenicas que se ha observado que provocan efectos inmunitarios no deseados.

[0013] De Rizzo (de Rizzo et al. (1989) Bull. Pan. Am. Health Organ. 23(3), 299-305) informaron de preparaciones para el virus del sarampion liofilizadas que contenlan disoluciones de sorbitol-gelatina o acido

50 glutamico-lactosa. Estas preparaciones se almacenaron a -20 °C y sus tltulos virales se determinaron durante un periodo de almacenamiento de 21 meses. Los datos resultantes indicaron que los virus liofilizados sin estabilizador son estables cuando se almacenan a -20 °C durante un periodo de 21 meses. Ademas, es muy sabido que los virus del sarampion liofilizados son estables cuando se almacenan a -20 °C y pueden retener potencia con practicamente ninguna perdida durante muchos anos (Gray A., (1978) Dev. Biol. Stand. 41, 265-266). Sin embargo, estos resultados 55 se obtuvieron a -20 °C donde los virus del sarampion liofilizados son estables y no demuestran un efecto estabilizante adicional. Estos resultados muestran solo que las disoluciones de sorbitol-gelatina y acido glutamico-lactosa no tienen efecto negativo sobre la estabilidad de los virus del sarampion que se almacenan en forma liofilizada a -20 °C.

[0014] Precausta (Precausta et al (1980) J. Clin. Microbiol. 12(4), 483-489) examinaron los efectos de la

humedad residual y el sellado de la atmosfera sobre el tltulo de infectividad del virus del moquillo canino (CDV) y virus de la bronquitis infecciosa (IBV) despues de la liofilizacion. Se anadio una disolucion de lactosa a la preparacion de CDV a una concentration final de 75 mg/ml, mientras que la vacuna de IBV contuvo 40 mg de manitol por ml. Cuando se comparo el tltulo de CDV antes de la liofilizacion con el tltulo despues de la liofilizacion y despues de 12 meses de 5 almacenamiento a 6 °C, el tltulo de CDV disminuyo de 10116 a 1020 CCID5o/ml, que refleja una reduction muy significativa en el tltulo de CDV.

[0015] Se conocen en la tecnica varios metodos para eliminar la humedad con el fin de preservar la preparacion biologica. El termino "liofilizacion por pulverization" se entiende que significa la pulverization con un fluido en un

10 entorno criogenico, seguido de liofilizacion de las partlculas congeladas obtenidas. El "secado por espuma" se entiende que significa el secado, en forma de una espuma vltrea, mediante evaporation de agua, de una disolucion concentrada. Y "secado de espuma congelada" pretende significar el secado, en forma de una espuma vltrea por sublimation de hielo, de una disolucion previamente congelada, a una temperatura por debajo de la temperatura de transition vltrea y la temperatura de colapso de la matriz.

15

[0016] Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos estabilizadores y metodos para preservar la viabilidad e infectividad de los componentes biologicos en forma liofilizada, que sean seguros y adecuados para inyeccion a sujetos y que tengan un buen aspecto.

20 [0017] La citation o identification de cualquier documento en la presente solicitud no es una admision de que tal

documento este disponible como estado de la tecnica para la presente invention.

SUMARIO DE LA INVENCION

25 [0018] La presente invencion proporciona un proceso de vitrification de material biologico que comprende las etapas de formular una preparacion biologica llquida, someter la preparacion a cambios controlados en la presion y temperatura para reducir el contenido de humedad de la formulation a menos de aproximadamente el 5 % en peso, vitrificando as! el material biologico; en el que el proceso comprende ademas las etapas de: (a) anadir a la preparacion llquida componentes biologicos activos, estabilizadores, que reducen o eliminan el dano inducido sometiendo los 30 componentes biologicos a medios de preservation criogenica, que incluyen granulation en perlas, vitrificacion y liofilizacion, y opcionalmente anadir uno o mas adyuvantes; (b) llenar los viales con la preparacion biologica de la etapa (a); (c) cargar viales en recipiente de temperatura controlada, en el que la temperatura es entre -15 °C y 10 °C, particularmente entre -10 °C y 5 °C, e incluso mas particularmente aproximadamente 5 °C; (d) reducir la presion del aire del recipiente de temperatura controlada hasta que se obtiene una presion dentro del intervalo de 15-30 mbar; (e) 35 mantener la presion obtenida durante la etapa (d) durante entre 5 y 20 minutos, particularmente entre 10 y 15 minutos, para permitir que la temperatura del producto se estabilice y para permitir que los gases volatiles, que incluyen carbonatos, sean liberados de la preparacion biologica, en el que la temperatura del recipiente sigue a aproximadamente 4 °C a aproximadamente 6 °C, o aproximadamente 5 °C durante esta etapa; (f) disminuir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mbar, o aproximadamente 5 mbar, durante entre 40 aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos; (g) mantener la presion de la etapa (f) durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, que permite que la preparacion biologica llegue a concentrarse mas; (h) aumentar la temperatura del recipiente de temperatura negativa a positiva (entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 50 °C) durante el transcurso de entre 45 y 85 minutos, o aproximadamente 60 minutos, y mantener la presion constante hasta que llegue a aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, o aproximadamente 15 °C; (i) reducir 45 la presion del aire del recipiente a aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4 mbar, o aproximadamente 3 mbar, para acelerar la concentracion, y hasta que la temperatura del recipiente alcance y mantenga aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 90 minutos, o 60 minutos; (j) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4,0 mbar, o aproximadamente 1 mbar, y mantener la presion constante hasta que se haya completado la espumacion; (k) reducir adicionalmente la presion a entre 50 aproximadamente 5 pbar y aproximadamente 100 pbar, o aproximadamente 25 pbar, mientras que se mantiene la temperatura a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 400 a aproximadamente 2400 o mas minutos, hasta que se obtiene la humedad deseada de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 4 %; (l) tapar los viales mientras estan en el recipiente del liofilizador, completandose as! el metodo de vitrificacion.

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[0019] La presente description trata la necesidad en la materia proporcionando, entre otras cosas, nuevos metodos de production de preparaciones vitrificadas de biologicos que incluyen protelnas, peptidos, anticuerpos, bacterias, virus, parasitos unicelulares, o cualquier tejido de animal humano o no humano. Los virus pueden comprender virus del moquillo canino (CDV) atenuado vivo, paragripe canina tipo 2 (cPi2), adenovirus canino,

enfermedad de Marek, enfermedad infecciosa de la bolsa o enfermedad de Newcastle. Las bacterias pueden incluir Pasteurella spp. o Avibacterium spp., y los biologicos pueden incluir el polipeptido KSAC de Leishmania,

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En una realizacion, el metodo generalizado de vitrificacion comprende las etapas de:

(1) formular una preparacion biologica, que incluye las etapas de anadir componentes biologicos activos, anadir estabilizadores, que reducen o eliminan el dano inducido sometiendo los componentes biologicos a medios de preservacion criogenica, que incluyen granulacion en perlas, vitrificacion y liofilizacion, y opcionalmente anadir uno o mas adyuvantes, que aumentan la inmunogenicidad del biologico en el caso de preparaciones inmunologicas;

(2) llenar viales con la preparacion biologica de la etapa (1);

(3) cargar viales en recipiente de temperatura controlada, en el que la temperatura es entre -15 °C y 10 °C, particularmente entre -10 °C y 5 °C, e incluso mas particularmente aproximadamente 5 °C;

(4) reducir la presion del aire del recipiente de temperatura controlada hasta que se obtiene una presion dentro del intervalo de 15-30 mbar;

(5) mantener la presion obtenida durante la etapa (4) durante entre 5 y 20 minutos, particularmente entre 10 y 15 minutos, para permitir que la temperatura del producto se estabilice y para permitir que los gases volatiles, que incluyen carbonatos, sean liberados de la preparacion biologica, en el que la temperatura del recipiente sigue a aproximadamente 4 °C a aproximadamente 6 °C, o aproximadamente 5 °C durante esta etapa;

(6) disminuir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mbar, o aproximadamente 5 mbar, durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos;

(7) mantener la presion de la etapa (6) durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, que permite que la preparacion biologica llegue a concentrarse mas;

(8) aumentar la temperatura del recipiente de temperatura negativa a positiva (entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 50 °C) durante el transcurso de entre 45 y 85 minutos, o aproximadamente 60 minutos, y mantener la presion constante hasta que llegue a aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, o aproximadamente 15 °C;

(9) reducir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4 mbar, o aproximadamente 3 mbar, para acelerar la concentracion, y hasta que la temperatura del recipiente alcance y mantenga aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 90 minutos, o 60 minutos;

(10) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4,0 mbar, o aproximadamente 1 mbar, y mantener la presion constante hasta que se haya completado la espumacion;

(11) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 5 pbar y aproximadamente 100 pbar, o aproximadamente 25 pbar, mientras que se mantiene la temperatura a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 400 a aproximadamente 2400 o mas minutos, hasta que se obtiene la humedad deseada de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 4 %;

(12) tapar los viales mientras estan en el recipiente del liofilizador, completandose as! el metodo de vitrificacion.

[0021] Una persona con conocimientos basicos puede llevar a cabo el metodo descrito usando cualquier aparato de secado adecuado conocido o aun por ser fabricado. Ejemplos no limitantes de un aparato de secado adecuado incluyen: 1) una secadora pequena (un estante, capacidad de viales 200 X 3 cc); 2) una secadora piloto (2 45 estantes, capacidad de viales 3000 X 3 cc), o una secadora grande BERLIN (3 estantes, 10000 X 3 cc). Pueden hacerse modificaciones rutinarias al bucle de regulation del aparato de secado de forma que el liofilizador pueda operar durante un intervalo mas amplio en comparacion con su intervalo usual.

[0022] Estas y otras realizaciones se desvelan o son obvias a partir de y estan englobadas por la siguiente 50 Description detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0023] La siguiente Descripcion detallada, dada a modo de ejemplo, pero no prevista para limitar la invention a 55 realizaciones especlficas descritas, puede entenderse conjuntamente con las Figuras adjuntas, en las que:

La FIG. 1 muestra una fotografla de masas vitrificadas que tienen un aspecto de algodon de azucar.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0024] En la presente divulgacion, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado atribuido a ellos en la ley de patentes de EE.UU. y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente", asimismo tiene el significado

5 atribuido en la ley de patentes de EE.UU. y el termino es de extremos abiertos, que permite la presencia de mas de lo que se cita mientras que caracterlsticas basicas o novedosas de lo que se cita no se cambia por la presencia de mas de lo que se cita, pero excluye realizaciones del estado de la tecnica.

[0025] Un "sujeto" en el contexto de la presente descripcion puede ser un vertebrado, tal como un mamlfero, 10 ave, reptil, anfibio o pez; mas ventajosamente un ser humano, un animal de companla o domesticado; un animal

productor de alimento o productor de pienso; ganado, presa, animal de carreras o deportivo tal como, pero no se limita a, bovinos, caninos, felinos, caprinos, ovinos, porcinos, equinos y aviares. Preferentemente, el vertebrado es un canino.

15 [0026] Como se usa en el presente documento, "recombinante" se refiere a un acido nucleico sintetizado o de otro modo manipulado in vitro (por ejemplo, "acido nucleico recombinante"), a metodos de uso de acidos nucleicos recombinantes para producir productos genicos en celulas, en sujetos, o en otros sistemas biologicos, o a un polipeptido ("proteina recombinante") codificada por un acido nucleico recombinante. "Medios recombinantes" tambien engloban el corte y la union de acidos nucleicos que tienen diversas regiones codificantes, dominios, o secuencias 20 promotoras de diferentes fuentes en un casete de expresion o vector para, por ejemplo, expresion inducible o constitutiva de secuencias codificantes de acido nucleico.

[0027] Como se usa en el presente documento, el termino "operativamente unido" significa que los componentes descritos estan en una relacion que les permite funcionar en su manera prevista.

25

[0028] El termino "heterologo", cuando se usa con referencia a un acido nucleico, indica que el acido nucleico esta en una celula, un virus, un sujeto, o una bacteria donde normalmente no se encuentra en la naturaleza; o comprende dos o mas subsecuencias de acido nucleico que no se encuentran en la misma relacion entre si como normalmente se encuentran en la naturaleza, o se manipula recombinantemente de manera que su nivel de expresion,

30 o relacion flsica con otros acidos nucleicos u otras moleculas en una celula, sujeto, o estructura, no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, puede producirse recombinantemente un acido nucleico heterologo que tiene dos o mas secuencias de genes no relacionados dispuestos de un modo no encontrado en la naturaleza; por ejemplo, un gen canino operativamente unido a una secuencia promotora insertada en, por ejemplo, un vector de virus de la viruela o adenovirus. Como un ejemplo, un acido nucleico heterologo de interes puede codificar un producto 35 genico inmunogenico, en el que el acido nucleico heterologo de interes contenido en un vector se administra terapeuticamente o profilacticamente como una composicion inmunogenica o composition de vacuna. Secuencias heterologas pueden comprender diversas combinaciones de promotores y secuencias, numerosos ejemplos de los cuales se describen en detalle en el presente documento.

40 [0029] Como se usa en el presente documento, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. A modo de ejemplo, algunos vectores usados en tecnicas de acido nucleico recombinante permiten que entidades, tales como un segmento de acido nucleico (tal como un segmento heterologo de acido nucleico, tal como un segmento de ADNc heterologo), se transfieran en una celula diana. Tambien se usa en el presente documento el termino "vector de expresion". La presente descripcion comprende vectores 45 recombinantes que pueden incluir, sin limitation, vectores virales, vectores bacterianos, vectores fungicos, vectores protozoicos, vectores plasmldicos, o recombinantes de los mismos.

[0030] Con respecto a acidos nucleicos heterologos para la expresion en un vector (por ejemplo, que codifica un epitope de interes y/o un antlgeno y/o inmunogen y/o un terapeutico) y documentos que proporcionan tales acidos 50 nucleicos heterologos, ademas de con respecto a la expresion de factores de transcription y/o traduction para potenciar la expresion de moleculas de acidos nucleicos, y en cuanto a terminos tales como "epitope de interes", "terapeutico", "respuesta inmunitaria", "respuesta inmunologica", "respuesta inmunitaria protectora", "composicion inmunologica", "composicion inmunogenica" y "composicion de vacuna", entre otros, se hace referencia a la patente de EE.UU. N.° 5.990.091 concedida el 23 de noviembre de 1999, y los documentos WO 98/00166 y WO 99/60164, y 55 los documentos citados en su interior y los documentos de registro en el seguimiento de esa patente y aquellas solicitudes PCT. Asi, la patente de EE.UU. N.° 5.990.091 y los documentos WO 98/00166 y WO 99/60164 y los documentos citados su interior y documentos o registro en el seguimiento de esa patente y aquellas solicitudes pCt, y otros documentos citados en el presente documento o que pueden ser consultados en la practica de esta descripcion; y todas las moleculas heterologas de acidos nucleicos, promotores y vectores citados en su interior, pueden usarse en

la practica de esta descripcion. A este respecto, tambien se hace mencion de las patentes de EE.UU. N.° 6.706.693; 6.716.823; 6.348.450; solicitudes de patente de EE.UU. N.° de serie 10/424.409; 10/052.323; 10/116.963; 10/346.021; y WO99/08713, publicada el 25 de febrero de 1999, de PCT/US98/16739.

5 [0031] Un "antigeno" es una sustancia que es reconocida por el sistema inmunitario e induce una respuesta inmunitaria. El antlgeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porcion de un organismo; un vector recombinante que contiene una insertion con propiedades inmunogenicas; un trozo de acido nucleico o fragmento capaz de inducir una respuesta inmunitaria tras la presentation a un animal huesped; una protelna, un polipeptido, un peptido, una glucoprotelna, un epitope, un hapteno, un hidrato de carbono, un azucar, o 10 cualquier combination de los mismos. Alternativamente, el antlgeno puede comprender una toxina o antitoxina. Un termino similar usado indistintamente en este contexto es "inmunogen". Un "patogeno" se refiere a un agente causante especifico de enfermedad, tal como una bacteria, hongo, protozoo, parasito o virus.

[0032] El termino "vitrification", como se usa en el presente documento, pretende significar secar una 15 preparation biologica liquida a una baja humedad (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 4 %), aspecto similar a

"algodon de azucar", usando una serie de reducciones de presion controlada realizadas durante longitudes de tiempo especificas y durante intervalos de temperatura especificos. La vitrificacion puede llevarse a cabo en cualquier camara o recipiente, que incluye un liofilizador, en la que pueden ajustarse la presion del aire y la temperatura para acomodar los intervalos presentados en la presente divulgation. El termino "composition vitrificada" y "preparacion vitrificada" 20 pueden usarse indistintamente, y pretenden significar en el presente documento cualquier composicion, preparacion o formulation que ha sido sometida al metodo de vitrificacion desvelado en el presente documento.

[0033] Como se usa en el presente documento, los terminos "composicion inmunogenica" y "composicion inmunologica" y "composicion inmunogenica o inmunologica" cubren cualquier composicion que provoca una

25 respuesta inmunitaria contra el antlgeno o inmunogen de interes expresado de vectores; por ejemplo, despues de la administration en un sujeto, provoca una respuesta inmunitaria contra el inmunogen elegido como diana o antlgeno de interes. Los terminos "composicion vacunal " y "vacuna" y "composicion de vacuna" cubren cualquier composicion que induce una respuesta inmunitaria protectora contra el antlgeno de interes, o que protege eficazmente contra el antigeno; por ejemplo, despues de la administracion o inyeccion en el sujeto, provoca una respuesta inmunitaria 30 protectora contra el antigeno elegido como diana o inmunogen o proporciona protection eficaz contra el antigeno o inmunogen expresado de vectores.

[0034] Como se usa en el presente documento, el termino "multivalente" significa una composicion inmunogenica o composicion de vacuna que contiene mas de un antlgeno, tanto de la misma especie, de especies

35 diferentes, como una composicion inmunogenica o composicion de vacuna que contiene una combinacion de antlgenos de diferentes generos.

[0035] Un "componente inmunogenico activo" en el contexto de la presente descripcion incluye patogenos atenuados vivos, tales como virus atenuados vivos, bacterias atenuadas vivas, hongos, o parasitos. Cuando el

40 componente inmunogenico activo es parte de una composicion inmunogenica de CDV y cPi2 atenuados vivos multivalente, suspension, o disolucion de la descripcion, el componente inmunogenico activo puede derivarse ventajosamente de un patogeno distinto de un paramixovirus. Tambien estan englobados por la descripcion inmunogenos heterologos recombinantes o antlgenos derivados de o que se originan de uno o mas patogenos descritos en el presente documento, que pueden estar contenidos y expresarse en, entre otros, vectores virales, 45 vectores bacterianos, vectores fungicos y vectores plasmidicos. La descripcion tambien comprende epitopes de inmunogenos heterologos o antlgenos derivados de uno o mas patogenos, inmunomoduladores tales como citocinas, agentes terapeuticos, toxinas, anticuerpos, fragmentos de union al antigeno de un anticuerpo, adyuvantes, u otras especies tales como ARN antisentido, ARN catallticos, ARN interferentes pequenos, entre otros.

50 [0036] El termino "composicion veterinaria" significa cualquier composicion que comprende un vector para uso veterinario que expresa una protelna terapeutica como, por ejemplo, eritropoyetina (EPO) o una protelna inmunomoduladora, tal como, por ejemplo, interferon (IFN). Similarmente, el termino "composicion farmaceutica" significa cualquier composicion que comprende un vector para expresar una proteina terapeutica.

55 [0037] Las composiciones y metodos de la presente descripcion pueden aplicarse apropiadamente en la estabilizacion y vitrificacion de cualquier sustancia biologica/agente o sustancia biologica/agente de combinacion mas agente farmaceutico/veterinario. "Biologicos" incluyen, pero no se limitan a, inmunomoduladores tales como citocinas, agentes terapeuticos, toxinas, anticuerpos, fragmentos de union al antigeno de un anticuerpo, adyuvantes, u otras especies tales como ARN antisentido, ARN catallticos, ARN interferentes pequenos, entre otros. Despues de la

reconstitucion de los materiales vitrificados/sustancias, estos compuestos pueden usarse para la prevencion de enfermedades como inmunizacion profilactica o proporcionar alivio contra slntomas de enfermedad como inmunizacion terapeutica.

5 [0038] La descripcion engloba un metodo de vitrificacion de composiciones inmunogenicas atenuadas vivas que pueden comprender al menos un estabilizador, por ejemplo azucares no reductores o compuestos antioxidantes. En algunas realizaciones, los estabilizadores de vitrificacion pueden comprender opcionalmente al menos un oligosacarido no reductor y/o al menos un agente de carga y/o al menos un alcohol de azucar. Estos estabilizadores pueden preservar o ayudar en la retencion de la inmunogenicidad, infectividad y viabilidad de componentes biologicos 10 que incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, parasitos, protelnas, polipeptidos, entre otros. Los estabilizadores usados en los metodos de vitrificacion descritos pueden tener un buen aspecto, que incluye, por ejemplo, forma y color uniformes, y son seguros para administration en un sujeto.

[0039] Un "monosacarido reductor" es un sacarido que es capaz de donar electrones, y asl, capaz de reducir 15 otro compuesto durante las reacciones de oxidation-reduction. Generalmente, un monosacarido reductor tiene grupos

aldehldo o cetona en su estructura. Estan disponibles pruebas colorimetricas para identificar azucares reductores, tales como la prueba del reactivo de Fehling, que da un cambio de color de azul oscuro a rojo a medida que el reactivo de ion cobre se reduce al metal cobre en presencia de un azucar reductor. En la presente descripcion, el monosacarido reductor comprende preferentemente glucosa, galactosa, fructosa, manosa, sorbosa, o combinaciones 20 de las mismas. En una realization de la descripcion, se proporciona una combination de al menos dos monosacaridos reductores. Los monosacaridos reductores son importantes para la protection de composiciones, en particular de protelnas y patogenos atenuados vivos, durante el proceso de liofilizacion, particularmente durante la etapa de sublimation (es decir, primera y segunda etapas de desecacion), en la que los monosacaridos reductores toman el lugar del agua sublimada y mantienen la cohesion de la estructura biologica.

25

[0040] Opcionalmente, pueden anadirse alcoholes de azucar y/u oligosacaridos no reductores para estabilizar preparaciones vitrificadas segun la presente descripcion. Las combinaciones de monosacaridos reductores y alcoholes de azucar, combinaciones de monosacaridos reductores y oligosacaridos no reductores, y combinaciones de monosacaridos reductores, alcoholes de azucar y oligosacaridos no reductores, se contemplan por la presente

30 divulgation. El alcohol de azucar puede ser, a modo de ejemplo no limitante, sorbitol, manitol, xilitol o maltitol. Combinacion

[0041] "Oligosacaridos no reductores" en el contexto de la descripcion son azucares que comprenden de dos a diez unidades de sacarido y son incapaces de reducir otro compuesto durante las reacciones de oxidacion-reduccion.

35 En la presente descripcion, el oligosacarido no reductor puede ser un disacarido no reductor o trisacarido no reductor, que comprende ventajosamente trehalosa, sacarosa o rafinosa. Los estabilizadores descritos tambien pueden comprender una mezcla de al menos dos oligosacaridos no reductores.

[0042] Un compuesto "antioxidante acido" se define como un compuesto qulmico que reacciona con y neutraliza 40 oxidantes, radicales libres (es decir, moleculas con electrones no emparejados), o productos qulmicos que liberan

radicales libres. En el contexto de la presente descripcion, el compuesto antioxidante puede estar en forma acido. Los antioxidantes acidos incluyen, pero no se limitan a, acido ascorbico y/o aminoacidos acidos, tales como acido aspartico y acido glutamico. Combinaciones de mas de un compuesto antioxidante acido son componentes adecuados de preparaciones vitrificadas segun los metodos de la presente divulgacion.

45

[0043] Agentes de carga tambien son componentes adecuados de composiciones vitrificadas segun la presente divulgacion. Los agentes de carga pueden ser pollmeros farmaceutica o veterinariamente aceptables tales como, pero no se limitan a, dextrano, maltodextrina, polivinilpirrolidona (PVP), crospovidona e hidroxietilalmidon. Otros ejemplos no limitantes de derivados de almidon incluyen celulosa microcristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa,

50 hidroxipropilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. Los agentes de carga aumentan el valor de T'g de las composiciones biologicas, permitiendo el uso de temperaturas mas altas durante la congelation. El "valor T'g" se define como la temperatura de transition vltrea, que se corresponde con la temperatura por debajo de la cual la composition congelada se vuelve vltrea. El agente de carga puede ayudar en proporcionar el buen aspecto observado en las masas vitrificadas de la presente divulgacion, masas que tienen el aspecto general de algodon de 55 azucar esponjoso ligero.

[0044] Si se usa dextrano como agente de carga, su peso molecular puede ser de aproximadamente 5000 Da a aproximadamente 70000 Da, preferentemente de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 40.000 Da. Si se usa PVP como un agente de carga, su peso molecular puede ser de aproximadamente 8.000 Da a aproximadamente

360.000 Da, particularmente de aproximadamente 10.000 Da a aproximadamente 60.000 Da.

[0045] Si se usa maltodextrina como agente de carga, su valor equivalente de dextrosa (DE, que es una medida cuantitativa del grado de hidrolisis del pollmero de almidon) puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 20,

5 preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 18, mas preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 15. Si se usa hidroxietilalmidon como agente de carga, su peso molecular puede ser de aproximadamente 70.000 Da a aproximadamente 450.000 Da, preferentemente de aproximadamente 130.000 Da a aproximadamente 200.000 Da. El grado de sustitucion del hidroxietilalmidon puede ser de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,7, particularmente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6. El grado de sustitucion se 10 define como el numero de grupo hidroxietilo por unidad de glucosa.

[0046] Algunos componentes, que incluyen estabilizadores, de las preparaciones biologicas pueden no ser facilmente solubles. Sin embargo, esta perfectamente dentro del alcance del experto sustituir adecuadamente componentes analogos (por ejemplo, seleccionando un componente mas soluble) y/o adaptar las cantidades o

15 cantidades del componente insoluble presente en el estabilizador con el fin de obtener un estabilizador soluble. La solubilidad de un componente puede comprobarse facilmente por una prueba de solubilidad visual. Una prueba de solubilidad comprende las etapas de anadir todos los componentes del estabilizador a una temperatura de aproximadamente 55 °C, y mezclar durante aproximadamente 30 minutos. Despues de aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente y sin ninguna agitacion, el estabilizador puede comprobarse visualmente para el aspecto de 20 precipitados. Si el estabilizador es transparente o claro, entonces todos los componentes del estabilizador son solubles.

[0047] Preparaciones biologicas vitrificadas segun la presente divulgacion pueden contener cualquier numero de estabilizadores. La Tabla 1 proporciona varios ejemplos. "Dextrano" comprende dextrano-40.000 que tiene un peso

25 molecular de 40.000 Da.

Tabla 1: Composiciones de los estabilizadores

Estabilizadores

Monosacarido(s) reductor(es) o mezcla Antioxidante acido Agente de carga Disolvente

F2

Glucosa (5 % en peso/volumen) Rafinosa (5 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (10 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

F2B

Glucosa (3 % en peso/volumen) Rafinosa (3 % en peso/volumen) acido aspartico (0,20 % en peso/volumen) Dextrano (6 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

F6B

Galactosa (3 % en peso/volumen) Manitol (6 % en peso/volumen) acido aspartico (0,40 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

F33

Glucosa (5 % en peso/volumen) Fructosa (5 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (10 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

F37

Glucosa (5 % en peso/volumen) Rafinosa (5 % en peso/volumen) Sorbitol (10 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

A

Glucosa (1 % en peso/volumen) Galactosa (5 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (6 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

H

Glucosa (5 % en peso/volumen) Rafinosa (5 % en acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (6 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

Estabilizadores

Monosacarido(s) reductor(es) o mezcla Antioxidante acido Agente de carga Disolvente

peso/volumen)

K

Glucosa (5 % en peso/volumen) Sacarosa (1 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (6 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

U

Glucosa (1 % en peso/volumen) Galactosa (1 % en peso/volumen) acido aspartico (0,50 % en peso/volumen) Dextrano (6 % en peso/volumen) Agua para inyeccion (c.s.p. 100 % v/v)

[0048] Tambien se proporciona por la divulgacion una composicion inmunogenica vitrificada, que se produce produciendo primero una suspension inmunogenica o disolucion que comprende un virus atenuado vivo, tal como, pero no se limita a, paramixovirus, seguido de vitrificacion del mismo segun los metodos de la presente divulgacion. El

5 paramixovirus canino puede comprender, entre otros, virus del moquillo canino (CDV) y virus paragripal canino tipo 2 (cPi2), ambos en forma de virus atenuados vivos.

[0049] En una realizacion, la presente divulgacion engloba paramixovirus atenuados vivos vitrificados, en particular paramixovirus caninos. El paramixovirus canino es un virus de la familia paramyxoviridae, que incluye virus

10 del moquillo canino (CDV) y virus paragripal canino tipo 2 (cPi2). Los paramixovirus caninos son responsables de una amplia variedad de enfermedades en muchas especies de carnlvoros, en particular animales domesticos, tales como perros, o animales no domesticos, tales como hurones, leones, tigres y leopardos.

[0050] En el contexto de la presente divulgacion, el termino "composicion de vacuna a granel" pretende 15 significar una composicion que sale en la etapa final de la produccion de antlgeno, purificada o no purificada,

monovalente, o despues de la mezcla multivalente. El termino "una composicion de vacuna seca" pretende significar una composicion de la que el contenido de agua residual es inferior o igual a aproximadamente el 4 %, o aproximadamente el 3 %, y que esta lista para ser reconstituida con una disolucion acuosa con el fin de usarse como una vacuna o directamente en forma de partlculas secas. La composicion de vacuna seca tambien puede molerse y 20 formularse con excipientes apropiados, que incluyen aglutinantes, para producir unidades de dosificacion adecuadas por via oral, por ejemplo, comprimidos y plldoras.

[0051] La presente descripcion tambien se refiere a un metodo de estabilizacion de uno o mas paramixovirus atenuados vivos. En la etapa final en la produccion de los paramixovirus atenuados vivos (por ejemplo, cultivo en

25 celulas, infeccion y cultivo viral, seguido de purificacion en una o mas etapas), la cosecha viral purificada o no purificada y concentrada o no concentrada que comprende un paramixovirus atenuado vivo se diluye anadiendo estabilizador, seguido de vitrificacion.

[0052] Una vacuna atenuada viva o composicion inmunogenica tiene las siguientes ventajas: puede 30 administrarse en bajas dosis, particularmente si es auto-replicante; imita estrechamente la infeccion natural/no

mutante en un sujeto, y proporciona al sujeto todos los posibles antlgenos inmunologicamente importantes al mismo tiempo, es decir, en una unica administracion.

[0053] Generalmente, se coincide con que las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna 35 basadas en microorganismos atenuados vivos tienen la capacidad de inducir un tipo altamente eficaz de respuesta

inmunitaria. Tales composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna tienen la ventaja de que, una vez el animal huesped se ha inmunizado, la entrada del patogeno en el huesped induce una memoria acelerada de inmunidad temprana, mediada por celula o humoral, que es capaz de controlar el crecimiento adicional del organismo antes de que la infeccion pueda asumir proporciones cllnicamente significativas. Las composiciones inmunogenicas o 40 composiciones de vacuna basadas en un patogeno muerto (vacuna muerta) son generalmente admitidas en la materia por ser incapaces o menos probables de lograr este tipo de respuesta. Sin embargo, las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna que contienen un patogeno vivo, dependiendo del nivel de atenuacion, presentan el peligro de que el huesped inmunizado, tras la inmunizacion, puede contraer la enfermedad contra la proteccion que se busca. Por tanto, serlan altamente deseables composiciones inmunogenicas o composiciones de 45 vacuna que poseyeran los atributos inmunizantes de un patogeno vivo, pero que fueran incapaces de causar efectos secundarios no deseables tras la administracion a un sujeto.

[0054] Pueden generarse patogenos atenuados vivos incorporando una amplia variedad de mutaciones, que

incluyen cambios de un solo nucleotido, mutaciones especlficas de sitio, inserciones, sustituciones, deleciones o transposiciones. Estas mutaciones pueden afectar un pequeno segmento del genoma del patogeno, por ejemplo, 15 a 30 nucleotidos, o grandes segmentos del genoma del patogeno, por ejemplo, 50 a 1000 nucleotidos, dependiendo de la naturaleza de la mutacion. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en la direction 5' o en la direction 3' de la 5 region reguladora no codificante de un patogeno o elemento para abolir o alterar su actividad, produciendo as! un fenotipo atenuado.

[0055] Mutaciones de regiones reguladoras no codificantes del genoma del patogeno que pueden producir regulation por disminucion de la replication de un gen de patogeno, y/o regulation por disminucion de la transcription

10 de un gen de patogeno, pueden producir la production de patogenos defectuosos en cada ronda de replicacion; es decir, patogenos que contienen menos del complemento completo de regiones genomicas o segmentos requeridos para un patogeno completamente infeccioso. Por tanto, el patogeno alterado demostrara caracterlsticas atenuadas en las que el patogeno dara lugar a patogenos mas defectuosos que los patogenos no mutantes en cada ronda de replicacion. Sin embargo, como la cantidad de protelna, antlgeno, o inmunogen sintetizado en cada ronda, es similar 15 para tanto el patogeno no mutante como el patogeno defectuoso, es probable que tales patogenos atenuados sean capaces de inducir una buena respuesta inmunitaria en un sujeto.

[0056] Donde el gen de patogeno codifica una protelna estructural, por ejemplo, en el caso de patogenos tales como virus, una capside, matriz, superficie o protelna de la envuelta, el numero de partlculas producidas durante la

20 replicacion se reducira de forma que el patogeno mutado demuestre caracterlsticas atenuadas; por ejemplo, un tltulo que produce niveles subcllnicos de infection. Por ejemplo, una disminucion en la expresion de la capside viral reducira el numero de nucleocapsides encapsidadas durante la replicacion, mientras que una disminucion en la expresion de la protelna de la envuelta puede reducir el numero y/o la infectividad de viriones de progenie. Alternativamente, una disminucion en la expresion de las enzimas virales requeridas para la replicacion, por ejemplo, la polimerasa, 25 replicasa, helicasa, y similares, debe disminuir el numero de genomas de progenie generados durante la replicacion. Como el numero de partlculas infecciosas producidas durante la replicacion se reduce, los virus alterados demuestran caracterlsticas atenuadas. Sin embargo, el numero de partlculas de virus antigenico producidas generalmente sera suficiente para inducir una vigorosa respuesta inmunitaria en un sujeto.

30 [0057] Una forma alternativa de manipular patogenos atenuados implica la introduction de una mutacion, que incluye, pero no se limita a, una insertion, deletion o sustitucion de uno o mas restos de aminoacidos y/o epitopes en una o mas de las proteinas de patogeno. Esto puede realizarse facilmente manipulando la mutacion apropiada en la secuencia de genes correspondiente del patogeno. Cualquier cambio que altere la actividad de la proteina de patogeno de manera que se modifique o reduzca la replicacion esta englobado por la presente description.

35

[0058] Por ejemplo, en el contexto de virus atenuados, pueden manipularse mutaciones que interfieren con, pero no suprimen completamente la union viral a receptores de celula huesped y la infeccion resultante, en antigenos de la superficie viral o proteasas virales implicadas en el procesamiento para producir una cepa atenuada. Pueden modificarse los antigenos de la superficie viral o factores de virulencia para contener inserciones, sustitucion o 40 deleciones de uno o mas aminoacidos o epitopes que interfieren con o reducen la afinidad de union del antigeno viral por los receptores de celula huesped. Este enfoque ofrece una ventaja anadida porque puede producirse un virus quimerico, que expresa un epitope extrano o heterologo, que tambien demuestra caracterlsticas atenuadas. Tales virus son candidatos ideales para su uso como vacunas recombinantes vivas.

45 [0059] Mutaciones manipuladas en cualquiera de las enzimas virales incluyen, pero no se limitan a, inserciones, deleciones y sustituciones en la secuencia de aminoacidos del sitio activo de la enzima. A modo de ejemplo, el sitio de union de una enzima podria alterarse de forma que su afinidad de union por su sustrato se redujera, y como resultado, la enzima fuera menos especifica y/o eficiente. Por ejemplo, una diana de election es el complejo de polimerasa viral, ya que existen mutaciones sensibles a la temperatura en todas las proteinas polimerasa. Por tanto, pueden 50 manipularse cambios introducidos en las posiciones de aminoacidos asociadas a tal sensibilidad a la temperatura en el gen de polimerasa viral de manera que se produzca una cepa viral atenuada.

[0060] El CDV es un virus de ARN monocatenario envuelto de aproximadamente 100-300 nm de diametro y que pertenece al genero Morbillivirus. El nucleo del virion de CDV contiene un peptido de nucleoproteina (NP) que esta 55 estrechamente asociado a ARN viral. Un segundo peptido de nucleo es una fosfoproteina (P). La envoltura de CDV contiene tres peptidos, proteina M (proteina de la matriz) y dos glucoproteinas. Las glucoproteinas son las glucoproteinas hemaglutinina (H) y una glucoproteina de fusion (F). La glucoproteina de fusion se degrada en subunidades mas pequenas, designadas F1 y F2. La proteina H es principalmente responsable de la adsorcion viral a celulas diana y la glucoproteina de fusion es responsable de la fusion celula a celula. Hasta la fecha, todas las cepas

cilnicas del virus del moquillo contenlan estos polipeptidos virales comunes. La via de infeccion para el perro es por gotitas de aerosol infecciosas, y la transmision del virus se facilita por la tos, estornudos y el estrecho confinamiento en un entorno cerrado humedo caliente. Estudios sugieren que la infeccion viral se produce primero en el epitelio respiratorio del tracto oronasal superior con posterior diseminacion al parenquima pulmonar profundo (Gorham 5 "Canine Distemper", (1960) Advance Veterinary Science, Brandley and Jungher Editors, 6: 288-315).

[0061] Los macrofagos y monocitos de tejido localizados en o a lo largo del epitelio respiratorio en las amlgdalas parecen ser el primer tipo de celula en captar y replicar el CDV. El virus se disemina entonces en la circulacion sangulnea a tejidos linforreticulares distantes. Esto se lleva a cabo por viremia y se produce en cualquier 10 parte de dos a cuatro dlas despues de la infeccion inicial. Entre ocho y nueve dlas despues de la infeccion, el virus se disemina mas alla de los tejidos linforreticulares para implicar a tejidos epiteliales y mesenquimatosos (Appel, (1969) Am. J. Vet. Res. 30, 1167-1182). Es en esta etapa de infeccion viral que las respuestas inmunitarias de huesped especlficas para antlgenos virales influyen en el desenlace de la enfermedad. La forma mortal aguda de la enfermedad se caracteriza por diseminacion viral no restringida a practicamente cualquier tejido en el cuerpo. El virus 15 puede encontrarse en cada excrecion y secrecion en el sujeto infectado, y usando metodos de inmunofluorescencia o tecnicas de trazado de antlgenos, puede observarse la presencia de antlgeno en practicamente cualquier tipo de celula dentro del perro. Para la mayorla de estos animales, la causa mas probable de muerte es la participacion neurologica letal fulminante y/o encefalitis.

20 [0062] Algunos perros infectados con CDV presentan progresion cllnicamente retrasada de la enfermedad y modestas respuestas inmunitarias convalecientes. Signos cllnicos, si estan presentes, son imperceptibles pronto en la enfermedad y son una reflexion de la persistencia viral dentro del sistema nervioso central (SNC). El posterior desarrollo con respecto a la enfermedad del SNC es variable. La mayorla de los perros infectados por CDV no presentan esencialmente signos cllnicos abiertos de la enfermedad y son reconocidos como perros cllnicamente 25 normales convalecientes. Se ha mostrado que perros activamente infectados que con el tiempo se recuperan de la infeccion por CDV demuestran anticuerpos antivirales circulantes libres en o aproximadamente el dla despues de la infeccion seis o siete (Krakowka, et al., (1975) J. Infect. Dis. 132, 384-392). Los tltulos aumentan rapidamente a altos niveles en la convalecencia temprana.

30 [0063] Perros afectados agudamente con CDV muestran grados variables de depresion, anorexia y fiebre. La piel puede estar variablemente deshidratada, ponerse aspera por sequedad y ser inelastica. Una proporcion de estos animales muestra fotofobia y evidencia de descarga ocular-nasal mucopurulenta. La diarrea intermitente es un signo cllnico comun. Durante esta fase viremica aguda de la enfermedad, el virus se libera en cada secrecion y excrecion. A medida que progresa la enfermedad, puede desarrollarse neumonla, frecuentemente debida a invasores bacterianos 35 secundarios. Los perros en esta de enfermedad son de moderadamente a gravemente linfopenicos, dependiendo del grado o cantidad de infeccion secundaria. Aunque los perros agudamente afectados pueden mostrar practicamente cualquier combinacion de signos neurologicos, en su presentacion mas comun, un perro presenta convulsiones de pequeno mal o de gran mal. Estos episodios convulsivos se producen con el tiempo y con frecuencia creciente.

40 [0064] La segunda forma neurologica del moquillo canino es la que se produce con encefalitis del perro viejo (ODE), o se produce despues de infeccion sub-cllnica y aparente recuperacion. Los signos del SNC pueden ser de presentacion extremadamente variada y pueden ser confundidos con tumor cerebral, traumatismo craneoencefalico, meningitis bacteriana, hidrocefalo y discopatla de la medula espinal. Una manifestacion no neural importante de la infeccion por CDV en perros es la inmunosupresion asociada a CDV (Krakowka, et al., (1980) Am. J. Vet. Res. 41, 45 284-292). Muchos de los signos de la infeccion por el virus del moquillo canino son atribuibles a procesos infecciosos secundarios coincidentes que se producen en este animal debilitado.

[0065] La enfermedad en perros tambien puede asociarse a patogenos bacterianos, tales como especies bacterianas neumonicas que incluyen, pero no se limitan a, Bordetella bronchiseptica, especies de Pasteurella,

50 Staphylococcus y especies de Streptococcus. Estas bacterias son responsables de la conjuntivitis purulenta, rinitis y bronconeumonla indicada cllnicamente en perros infectados por CDV. Tambien son comunes infecciones virales mixtas, principalmente del tipo respiratorio. Ademas de la infeccion por adenovirus canino II, reovirus, virus paragripal canino, y supuestamente otros virus tales como el virus del herpes canino, pueden todos estar implicados en infecciones mixtas duales o multiples.

55

[0066] cPi2 es un virus de ARN que induce una enfermedad respiratoria que es una de las enfermedades virales mas comunmente encontradas en el perro. Cuando la combinacion de virus paragripal, adenovirus canino-2 y las bacterias Bordetella bronchiseptica se producen juntas, resulta la "tos de las perreras". cPi2 tambien produce traqueobronquitis que, en algunos animales, produce neumonla exudativa. Los signos de la tos se desarrollan 7 a 9

dlas despues de la exposicion al virus. Los signos cllnicos son leves y de corta duracion, a menos que se produzcan infecciones secundarias.

[0067] cPi2 es un virus envuelto esferico con un diametro promedio de 150-200 nm, con una nucleocapside 5 helicoidal rodeada por una bicapa de llpido cubierta con esplculas de glucoprotelna. Cada partlcula de virus contiene un genoma de ARN monocatenario, no segmentado, de sentido negativo, con nucleoprotelna (NP) y fosfoprotelna (P) y las protelnas grandes (L). La infeccion por cPi2 se adquiere mediante la inhalacion de nucleos de gotitas respiratorias infectadas. La nariz y la nasofaringe son los sitios de infeccion primarios. El virus inicia la infeccion principalmente uniendose a las celulas epiteliales ciliadas de estas areas mediante protelnas de hemaglutinina- 10 neuraminidasa, que se combinan especlficamente con receptores de acido neuramlnico en las celulas huesped. Posteriormente, los virus entran en la celula mediante fusion con la membrana celular mediada por receptores de F1 y F2. Los virus se multiplican e invaden otras celulas tanto intracelularmente como extracelularmente. La multiplication de virus se produce mediante los tejidos traqueobronquiolares, causando la potenciada production de moco.

15 [0068] La laringotraqueltis es una inflamacion de la laringe y la traquea que, cuando se produce en perros, se conoce comunmente como la "tos de las perreras". El principal slntoma es la tos manifestada por una corta "tosecilla" seca o por una serie de tales toses. En su punto mas grave, la tos puede ser paroxlstica, y la infeccion implica a las vlas respiratorias enteras, produciendo frecuentemente neumonla. La tos tambien se caracteriza por ser profunda, persistente, no productiva, y generalmente va acompanada de ojos llorosos y rinorrea. La temperatura puede ser 20 normal, aunque es generalmente elevada. La aparicion de la enfermedad puede ser repentina y puede producirse sin signos preliminares. Como la enfermedad es muy contagiosa, los perros infectados deben aislarse para prevenir la infeccion de poblaciones completas. La enfermedad produce perdidas economicas importantes a los propietarios de perreras y, aunque normalmente no es mortal, puede debilitar tanto a los perros que produzca graves efectos de otras enfermedades.

25

[0069] Los virus cPi2 vivos y otros virus, tales como CDV, adenovirus canino tipo 2 (CAV2) y parvovirus canino (CPV) pueden propagarse en cultivos de tejido animal hasta que ambos virus se conviertan en patogenos, es decir, los virus se vuelvan inactivos o se atenuen de otro modo. El virus cPi2 es capaz de propagation en una amplia variedad de sistemas de cultivo de tejido, tales como, por ejemplo, embrion de pollito, embrion de pato, rinon porcino, testlculos

30 porcinos, rinon bovino embrionario, rinon felino, rinon canino y rinon de mono; y tambien en llneas celulares establecidas, tales como, por ejemplo, rinon bovino de Madin Darby (MDBK), rinon canino de Madin Darby (MDCK) y cornea de conejo del Serum Institute (SIRC).

[0070] Para la propagacion de, por ejemplo, adenovirus canino tipo 2 (CAV2), se prefieren cultivos de tejido de 35 rinon, particularmente aquellos derivados de bovinos y caninos, ya que el CAV2 no se reproduce favorablemente en

otros sistemas de cultivo de tejido animal como lo hace el virus cPi2. La atenuacion de cada virus puede llevarse a cabo por pases en serie estandar, que incluyen tecnicas de pases de dilution terminal, en las que puede emplearse un numero suficiente de pases en un cultivo de tejido susceptible hasta que el virus se vuelva no patogeno sin perdida de inmunogenicidad. Un inmunogen, composition inmunogenica, o suspension inmunogenica o disolucion preparada a 40 partir del mismo, puede estimular una respuesta inmunitaria en perros susceptible a enfermedad sin producir los slntomas cllnicos normalmente debidos al agente virulento a cualquier grado significativo. La propagacion puede realizarse en los mismos tejidos o diferentes que aquellos descritos anteriormente.

[0071] Los intervalos de tiempo de pases deben permitir suficientemente que el virus se duplique entre pases, y 45 las temperaturas de incubation se mantienen preferentemente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 38 °C.

El intervalo de tiempo de pases optimo depende del sistema de cultivo particular y la temperatura que se emplea. En cualquier caso, tanto si se ha producido como si no suficiente replication del virus, puede determinarse facilmente por tecnicas convencionales tales como la tecnica de hemoadsorcion descrita en Shelokov, A. (1958) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 97, 802; que es particularmente util para el virus cPi2, o por observaciones citopaticas, tales como permitiendo 50 que el virus crezca durante un pase particular antes del punto donde puede observarse un efecto citopatico macroscopico mientras continua la incubacion.

[0072] Un metodo de propagacion ventajosa utiliza celulas de rinon canino, particularmente llneas celulares continuas de MDCK. Por ejemplo, para fines inmunogenicos o de vacuna, pueden hacerse aproximadamente al

55 menos 15 y preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 pases de aislamiento a traves de cultivos de tejido de rinon de perro de los virus a intervalos de aproximadamente tres dlas y a temperaturas de incubacion de aproximadamente 30 a aproximadamente 38 °C. Se prefiere usar el material de pase mas alto, ya que este beneficiara la produccion de respuestas inmunitarias favorables en sujetos en necesidad de las mismas.

[0073] En la preparation de las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna, puede cultivarse

CDV virulento en celulas de mamlfero cultivadas en condiciones de crecimiento de virus convencionales. Las celulas huesped pueden sembrarse con virus en el momento de la siembra de las celulas, o con un cambio de medio que contiene CDV cuando la monocapa de celulas es el 90-100 % confluente. La relacion de multiplicidad de infeccion (MOI) puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05, preferentemente aproximadamente 0,01. 5 Puede usarse cualquier medio de crecimiento celular de mamlfero apropiado, tal como, pero no se limita a, medio esencial mlnimo de Eagle, medio Eagle modificado por Dulbecco, medio Dulbecco modificado con Iscove, medio Ham's F12, medio F15, medio RPMI 1640, que contiene suero de animal, tal como suero de ternero fetal, suero de ternero, suero de caballo, suero canino y similares, a de aproximadamente el 0 % a aproximadamente el 10 %, suplementos tales como L-glutamina y otros aminoacidos tanto esenciales como no esenciales, solucion salina 10 equilibrada con Hanks (HBSS), solucion saliva de Earle, piruvato de sodio, bicarbonato sodico, insulina, transferrina y antibioticos y agentes antimicoticos, tales como, pero no se limitan a, gentamicina, penicilina, estreptomicina, polimixina B, anfotericina y FUNGIZONE®, para producir el virus o los virus. Tambien estan comprendidos por la presente descripcion medios de cultivo celular libres de suero.

15 [0074] Los cultivos celulares infectados se mantuvieron en un intervalo de temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 °C durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 dlas despues de la siembra, momento en el que virus puede recogerse. Los cultivos infectados pueden inocularse con medio de crecimiento celular, que puede recogerse despues de un periodo de incubacion adicional de 2 a 5 dlas. Los fluidos de virus se recogen en recipientes esteriles y pueden ser clarificados por filtracion. Los fluidos de virus pueden concentrarse 20 adicionalmente usando tecnologla de ultrafiltracion convencional (por ejemplo, sistemas de Millipore Pellicon) con filtros que tienen llmites de exclusion de tamano de partlcula de 105 Daltons.

[0075] Otros virus atenuados vivos que pueden mezclarse con los estabilizadores de la presente descripcion incluyen, sin limitacion, virus de la rabia, virus de la gripe, virus paragripales, virus de las paperas, adenovirus tales

25 como adenovirus canino tipo 2 (CAV2), virus respiratorio sincitial, virus de Epstein-barr, rinovirus, virus de la viruela tales como virus de la variolovacuna, viruela porcina, viruela del mapache, avipoxvirus tales como viruela aviar, viruela del canario, viruela de las palomas mensajeras, viruela de las palomas, virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, ecovirus, coronavirus, virus del sarampion, virus de la rubeola, virus de la varicela zoster, virus del herpes (humano y animal), virus del herpes simple, parvovirus tales como parvovirus canino (CPV), citomegalovirus, virus de la hepatitis 30 tales como virus de la hepatitis contagiosa canina, virus del papiloma humano, alfavirus tales como virus del bosque de Semliki, virus de Sindbis, virus del rlo Ross, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de O'nyong-nyong, flavivirus tales como virus de la fiebre del dengue y virus del Nilo occidental, bunyavirus, adenovirus, rotavirus, hepadnavirus tales como ortohepadnavirus y avihepadnavirus, filovirus, retrovirus tales como retrovirus endogeno porcino, HTLV-1, HTLV-2, FeLV, BLV, MLV, 35 MMSV, virus del mono Mason-Pfizer, lentivirus tales como HIV-1, HTV-2, FIV, SIV, BIV, calicivirus felino, virus de la panleucopenia felina, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la rinotraqueltis felina, virus de TGE (cerdo) y virus de la enfermedad de pies y boca.

[0076] Las composiciones inmunogenicas o suspensiones o disoluciones que comprenden, por ejemplo, 40 paramixovirus caninos, se mezclan con estabilizadores y se vitrifican usando metodos segun la presente divulgacion.

Un volumen de la suspension o disolucion de paramixovirus canino puede mezclarse con un volumen del estabilizador.

[0077] Preparaciones adecuadas que pueden ser vitrificadas usando los metodos desvelados incluyen una 45 suspension inmunogenica o disolucion de paramixovirus canino y al menos un componente inmunogenico activo que

se origina o deriva de un patogeno distinto de paramixovirus. El componente inmunogenico activo como se define en el presente documento puede comprender patogenos atenuados vivos, tales como virus atenuados vivos, bacterias, hongos o parasitos. Sin embargo, un componente inmunogenico activo tambien puede comprender virus muertos, inmunogenos heterologos recombinantes, antlgenos, subunidades inmunogenicas (por ejemplo, protelnas, 50 polipeptidos, peptidos, epitopes, haptenos) o epitopes de inmunogenos o antlgenos derivados de o que se originan de uno o mas patogenos descritos en el presente documento, que pueden expresarse a partir de vectores virales, vectores bacterianos, vectores plasmldicos, y similares.

[0078] El componente inmunogenico activo de la presente descripcion puede comprender uno o mas 55 inmunogenos seleccionados de un patogeno canino que incluye, pero no se limita a, virus de la rabia, adenovirus

canino tipo 2 (CAV2), virus del herpes canino (CHV), parvovirus canino (CPV), coronavirus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemarragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica y similares, que incluyen combinaciones de los mismos.

[0079] El componente inmunogenico activo puede incluir los genes HA, F, NP del CDV, el gen de la capside de

CPV, los genes de esplcuia, M, N de coronavirus canino, los genes HN y F de cPi2, genes de Leptospira, genes de Bordetella, genes de Borrelia, y los genes gB, gC y gD del virus del herpes canino, entre otros. Estos componentes pueden ser utiles como composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna para proteger caninos contra la enfermedad producida por estos patogenos.

5

[0080] El adenovirus canino tipo 2 (CAV2) esta extendido y es altamente contagioso para los perros. Produce slntomas que se parecen al resfriado. Generalmente, los primeros signos de la enfermedad contagiosa son fiebre, que normalmente disminuye en uno a dos dlas. Los perros afectados pueden tener amigdalitis, dolor abdominal con la palpacion, hlgado agrandado, vomitos y diarrea. La enfermedad aguda normalmente es mortal. El CAV2 puede

10 inactivarse o atenuarse y combinarse con el CDV (y/o cPi2) para producir una vacuna multivalente. Alternativamente, pueden usarse inmunogenos o antlgenos de CAV2, o epitopes de inmunogenos de CAV2, tales como protelnas de la capside, matriz, o de hexon.

[0081] El parvovirus canino (CPV) es un virus intestinal comun que puede producir vomitos, diarrea, 15 gastroenteritis, miocarditis y hepatitis en perros jovenes. Se ha encontrado que esta extendido en perros. El CPV

puede estar presente en las composiciones inmunogenicas, suspensiones, o

disoluciones de la description como inactivados, atenuados vivos, o inmunogenos de CPV, antlgenos, o epitopes de inmunogenos de CPV, tales como los productos genicos de VP1, VP2 (capside).

20 [0082] Dos infecciones bacterianas comunes de perros tambien pueden combinarse en su forma atenuada en las composiciones inmunogenicas estabilizadas, suspensiones o disoluciones de la presente descripcion; estos son Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae. Las infecciones por lepto son comunes en perros y especialmente en perros infectados por CDV, cPi2, o combinaciones de virus como se observa frecuentemente en perros que padecen moquillo o tos de las perreras, y asi, sus inclusiones en las composiciones inmunogenicas 25 estabilizadas, suspensiones, o disoluciones de la presente descripcion son de utilidad significativa.

[0083] Otro componente inmunogenico activo util en las composiciones y metodos de la presente descripcion puede comprender uno o mas inmunogenos seleccionados de patogenos aviares que incluyen, pero no se limitan a, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la enfermedad de

30 Newcastle (NDV), virus del sindrome de caida del huevo (EDS), virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), virus del pavo, virus de la gripe aviar, virus de la enfermedad de Marek, virus del herpes tales como virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la bronquitis infecciosa aviar, reovirus aviar, virus de la viruela que incluye avipox, viruela aviar, viruela del canario, viruela de la paloma, viruela de la perdiz y viruela de la paloma mensajera, virus del polioma aviar, neumovirus aviar, virus de la rinotraqueitis aviar, virus de la reticuloendoteliosis aviar, retrovirus aviares, 35 virus endogeno aviar, virus de la eritroblastosis aviar, virus de la hepatitis aviar, virus de la anemia aviar, virus de la enteritis aviar, virus de la enfermedad de Pacheco, virus de la leucemia aviar, parvovirus aviar, rotavirus aviar, virus de la leucosis aviar, virus del fibrosarcoma musculoaponeurotico aviar, virus de la mieloblastosis aviar, virus asociado a la mieloblastosis aviar, virus de la mielocitomatosis aviar, virus del sarcoma aviar, virus de la necrosis del bazo aviar y combinaciones de los mismos.

40

[0084] En cuanto a inmunogenos especificos, los componentes inmunogenicos activos tambien puede ser los genes HN y F del virus de la enfermedad de Newcastle, la poliproteina y genes de VP2 del virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, los genes S y N del virus de la bronquitis infecciosa y los genes gB y gD del virus de la enfermedad de Marek. Estos componentes pueden usarse como las composiciones inmunogenicas o composiciones

45 de vacuna para proteger aviares contra la enfermedad producida por estos patogenos.

[0085] Alternativamente, el componente inmunogenico activo comprende uno o mas inmunogenos de un patogeno felino tal como, pero no se limita a, virus del herpes felino (FHV), calicivirus felino (FCV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la panleucopenia felina, virus de la inmunodeficiencia

50 felina (FIV), virus de la rabia, y similares, y combinaciones de los mismos.

[0086] El componente inmunogenico activo tambien puede incluir los genes gB, gC y gD del virus del herpes felino, los genes env y gag/pro de FeLV, los genes env, gag/pol y tat del virus FIV, el gen de la capside del calicivirus felino, el gen modificado S, el gen M y N del virus de la peritonitis infecciosa felina, y el gen VP2 del parvovirus felino.

55 Estos componentes pueden ser utiles como composiciones inmunogenicas o de vacuna para proteger gatos contra la enfermedad producida por estos patogenos.

[0087] El componente inmunogenico activo puede comprender uno o mas inmunogenos de un patogeno equino, tal como el virus del herpes equino (tipo 1 o tipo 4), virus de la gripe equina, virus de la encefalomielitis equina (EeV),

tetanos, virus del Nilo occidental, y similares o combinaciones de los mismos.

[0088] El componente inmunogenico activo tambien puede incluir, los genes gB, gC, gD e inmediatos- tempranos del virus del herpes equino tipo 1, genes gB, gC, gD e inmediatos-tempranos del virus del herpes equino

5 tipo 4, los genes HA, NA, M y NP del virus de la gripe equina, genes del virus de la encefalitis equina oriental, genes del virus de la encefalitis equina occidental, genes del virus de la encefalitis equina venezolana, los genes prM-M-E del virus del Nilo occidental, y los genes del virus de la arteritis equina, pero no se limitan a estas secuencias. Estos componentes pueden ser utiles como composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna para proteger caballos contra la enfermedad producida por estos patogenos.

10

[0089] El componente inmunogenico activo puede comprender uno o mas inmunogenos de un patogeno bovino, tal como virus de la rabia, rotavirus bovino, virus paragripal bovino tipo 3 (bCPI2-3), coronavirus bovino, virus de la diarrea viral bovina (BVDV), virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV), virus respiratorio sincitial bovino (BRSV), virus de la rinotraqueltis bovina infecciosa (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, y

15 similares, y combinaciones de los mismos.

[0090] El componente inmunogenico activo tambien puede seleccionarse de los genes gB, gC, gD e inmediatos- tempranos del virus del herpes bovino tipo 1, los genes F y G de BRSV, la poliprotelna, genes E1, E2 de BVDV, los genes HN y F del virus Pl3 o genes de rotavirus. Estos componentes pueden ser utiles como composiciones

20 inmunogenicas o de vacuna para proteger ganado vacuno contra la enfermedad producida por estos patogenos.

[0091] Ademas, el componente inmunogenico activo puede comprender uno o mas inmunogenos de un patogeno porcino tal como, pero no se limitan a, virus de la gripe porcina (SlV), circovirus porcino tipo 2 (PCV-2), virus del slndrome respiratorio reproductivo porcino (PRRSV), virus de la pseudorrabia (PRV), parvovirus porcino (PPV),

25 virus del colera porcino (HCV), FMDv, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, y similares, y combinaciones de los mismos.

[0092] El componente inmunogenico activo tambien puede incluir los genes gB, gC, gD e inmediatos-tempranos de PRV, los genes HA, NA, M y NP del virus de la gripe porcina, la poliprotelna, E1, E2 del virus del colera porcino, los

30 genes ORF1 y ORF2 del virus PCV2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 u ORF7 del virus PRRSV o genes de Mycoplasma hyopneumoniae. Estos componentes pueden ser utiles como composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna para proteger cerdos contra la enfermedad producida por estos patogenos.

[0093] El componente inmunogenico activo puede comprender secuencias que codifican una protelna 35 expresada en patogenos tales como virus de ARN o ADN como HIV, HCV, HBV, HPV, EBV, HSV, CMV, HTLV,

hantavirus, virus del Ebola, virus de Marburgo, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de Lassa y virus de la gripe, virus de enteritidis hemorragica (HEV), virus de la rinotraqueltis infecciosa (IBRV), entre otros. Tales inmunogenos pueden usarse ventajosamente como composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna para proteger sujetos, tales como seres humanos, contra la enfermedad producida por estos patogenos.

40

[0094] El componente inmunogenico activo tambien puede ser, por ejemplo, de una cualquiera de las siguientes bacterias patogenas y sus antlgenos: especies de Actinobacillus tales como Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella avium, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, especies de Klebsiella tales como Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium

45 tuberculosis, Mycobacterium pseudotuberulosis, Mycobacterium pneumoniae, Streptococcus del grupo A, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Neisseria gonorrhoea, especies de Erysipelothrix, Escherichia coli enterotoxigenica, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, especies de Salmonella, Salmonella agona, Salmonella blockley, Salmonella enteriditis, Salmonella radar, Salmonella Heidelberg, Salmonella montevideo, 50 Salmonella senftenberg, Salmonella cholerasuis, especies de Rickettsia, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, especies de Shigella, especies de Listeria, Legionella pneumoniae, especies de Pseudomonas, especies de Borrelia, Borellia burgdorferi, Neisseria meningitides, especies de Clostridium, Clostridium difficile, Ureaplasma urealyticum, especies de Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pasteurella pestis, especies de Campylobacter, Campylobacter jejuni, especies de Treponema, especies de Leptospir, Corynebacterium diphtheria, 55 Hemophilus ducreyi, Hemophilus influenza, especies de Erlichhia, entre otras.

[0095] El componente inmunogenico activo tambien puede derivarse de un hongo o moho tal como Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatis, especies de Penicillium, especies de Fusarium, especies de Candida tales como Candida trichophyton, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida dubliniensis y Candida albicans, especies de Rhizopus,

especies de Cryptococcus tales como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus grubii, Cryptococcus gattii, Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum, y otros hongos y mohos.

[0096] El componente inmunogenico activo tambien puede seleccionarse de antlgenos paraslticos derivados de 5 especies paraslticas que incluyen, pero no se limitan a, especies de Plasmodium, especies de Trypanosome, especies

de Giardia, especies de Boophilus, especies de Babesia, especies de Entamoeba, especies de Eimeria, especies de Leishmania, especies de Schistosoma, especies de Brugia, especies de Fascida, especies de Dirofilaria, especies de Wuchereria, especies de Onchocerea, especies de Treponema, especies de Toxoplasma, especies de Cryptococcus, especies de Coccidia, especies de Histomoniasis, especies de Hexamitiasis, especies de Giardia, entre otros; 10 nematodos que incluyen especies de Ascaris, especies de Trichinella, y similares, helmintos tales como trematodos, tenias, entre otros; y otros organismos patogenos similares. Metodos de preparacion de inmunogenos derivados de virus, bacterias, hongos, mohos, protozoos, nematodos y helmintos se conocen en la tecnica.

[0097] Otros inmunogenos utiles pueden ser, por ejemplo, factores de virulencia de antlgeno secretados 15 purificados, tales como toxinas, citotoxinas, y similares. Antlgenos de toxina que se desintoxican por modificacion

(toxoides), que pueden administrarse en combinacion con un adyuvante tal como hidroxido de aluminio, y pueden usarse para estimular la formacion de anticuerpos neutralizantes de toxina. Ejemplos de toxinas que pueden usarse como inmunogen incluyen endotoxinas y exotoxinas bacterianas tales como lipopolisacarido, enterotoxinas que incluyen enterotoxinas labiles al calor (LT), enterotoxinas estables al calor (ST), verotoxina (VT), y similares. 20 Inmunogenos de exotoxina bacteriana son secretados en el medio circundante, e incluyen, por ejemplo, toxina difterica (Corynebacterium diphtheria), toxina del tetanos (Clostridium tetani), enterotoxinas secretadas por Staphylococcus aureus, toxinas botullnicas (Clostridium botulinum); y toxinas producidas por algas tales como neurotoxinas; y similares. Las endotoxinas estables al calor, liberadas por autolisis de las bacterias incluyen, por ejemplo, toxinas del colera liberadas de Vibrio cholerae Gram-negativas, colicinas producidas por bacterias intestinales tales como E. coli 25 (bacteriocina).

[0098] Inmunogenos derivados de, o que se originan de virus, bacterias, hongos y similares, pueden producirse por metodos de cultivo in vitro usando medio de cultivo apropiado o llneas de celulas huesped y metodos convencionales muy conocidos para aquellos expertos habituales en la materia. Por ejemplo, puede cultivarse PRRSV

30 en una llnea celular apropiada, tal como la llnea celular MA-104 (veanse las patentes de EE.UU. N.° 5.587.164; 5.866.401; 5.840.563; 6.251.404, entre otras). En un modo similar, puede cultivarse PCV-2 usando la llnea de celulas PK-15 (vease la patente de EE.UU. N.° 6.391.314); SIV puede cultivarse en huevos (patente de EE.UU. N.° 6.048.537); y Mycoplasma hyopneumoniae puede cultivarse en un medio de cultivo apropiado (patentes de EE.UU. N.° 5.968.525; 5.338.543; Ross R. F. et al., (1984) Am. J. Vet. Res. 45: 1899-1905). Ventajosamente, puede cultivarse 35 CDV en celulas de pulmon de vison, tales como aquellas descritas en la patente de EE.UU. N.° 5.178.862. Otras tecnicas para la preparacion de inmunogenos derivados de virus se conocen en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993); Male et al., Advanced Immunology, paginas 14.1-14.15, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1989).

40 [0099] Tambien son utiles peptidos sinteticos inmunogenicos que imitan secuencias de peptidos antigenicas. Tales inmunogenos pueden sintetizarse usando una tecnica en fase solida como se describe, por ejemplo, en R. B. Merrifield, Science 85:2149-2154 (1963), purificarse, y opcionalmente acoplarse a una protelna transportadora tal como muramildipeptido (MDP), albumina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), y similares, usando un agente de acoplamiento bifuncional tal como glutaraldehldo, y similares.

45

[0100] Tambien estan incluidos antlgenos sinteticos dentro de la definicion, por ejemplo, poliepltopes, epitopes flanqueantes, y otros antlgenos recombinantes o sinteticamente derivados. Veanse, por ejemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157, 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. Cell Biol. 75, 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de

50 julio de 1998. Fragmentos inmunogenicos, para los fines de la presente descripcion, pueden normalmente incluir al menos aproximadamente 3 aminoacidos, preferentemente al menos aproximadamente 5 aminoacidos, mas preferentemente al menos aproximadamente 10-15 aminoacidos, y lo mas preferentemente 25 o mas aminoacidos, de la molecula. No hay limite superior critico a la longitud del fragmento, que podria comprender casi la secuencia de proteinas de longitud completa, o incluso una proteina de fusion que comprende dos o mas, o al menos un epitope de 55 la proteina.

[0101] Por consiguiente, una estructura minima de un acido nucleico que expresa un epitope puede comprender nucleotidos para codificar un epitope, inmunogen o antlgeno de una proteina o poliprotelna. Un acido nucleico que codifica un fragmento de la proteina total o poliprotelna, mas ventajosamente, comprende o consiste

esencialmente en o consiste en un mlnimo de aproximadamente 21 nucleotidos, ventajosamente al menos aproximadamente 42 nucleotidos, y preferentemente al menos aproximadamente 57, aproximadamente 87 o aproximadamente 150 nucleotidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica la protelna total o poliprotelna. Procedimientos de determinacion de epitopes, tales como generacion de bibliotecas de peptidos 5 solapantes (Hemmer B. et al., (1998) Immunology Today 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 178-182; Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol. 19, 43-47; Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 21, 523-533; kits de slntesis de peptidos Multipin® de Chiron) y algoritmos (De Groot A. et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17, 533-561), y en la solicitud PCT N.° de serie PCT/US2004/022605; todos los cuales pueden usarse en la practica de la description, 10 sin excesiva experimentation. Otros documentos citados en el presente documento tambien puede ser consultados para metodos de determinacion de epitopes de un inmunogen o antigeno y asi moleculas de acidos nucleicos que codifican tales epitopes.

[0102] En la presente descripcion, el componente inmunogenico activo tambien puede comprender un agente 15 terapeutico, una citocina, una toxina, un inmunomodulador, una proteina, un peptido, un anticuerpo, un fragmento de

union al antigeno de un anticuerpo, un adyuvante, o cualquier otra molecula codificable por ADN y deseada para la administration a un animal o celula o tejido de animal.

[0103] Tambien se contemplan por la presente descripcion la inclusion de especies de ARN antisentido, 20 catalitico, o interferente pequeno, en las composiciones inmunogenicas y composiciones de vacuna de la presente

descripcion, que pueden ser dirigidas contra cualquier molecula presente dentro de la celula receptora o probablemente estar presentes dentro de la celula receptora. Estas incluyen, pero no se limitan a, especies de ARN que codifican moleculas reguladoras de celulas, tales como interleucina-6, agentes causantes de cancer tales como virus del papiloma humano, enzimas, ARN viral y ARN derivado de patogeno, tal como ARN de HIV-1. Los ARN 25 tambien pueden ser dirigidos a secuencias de ADN no transcritas, tales como regiones promotoras o potenciadoras, o a cualquier otra molecula presente en celulas receptoras, tales como, pero no se limitan a, enzimas implicadas en la sintesis de ADN o moleculas de ARNt.

[0104] Ademas, pueden co-expresarse citocinas e inmunomoduladores en las composiciones inmunogenicas y 30 composiciones de vacuna de la presente descripcion. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-4, TNF-a, GM-

CSF, IL-10, IL-12, IGF-1, IFN-a, IFN-p e IFN-y.

[0105] Pueden insertarse motivos de secuencia especificos, tales como el motivo RGD, en el bucle H-I de un vector viral o plasmidico para potenciar su infectividad. Se ha mostrado que esta secuencia es esencial para la

35 interaction de ciertas proteinas de matriz extracelular y de adhesion con una superfamilia de receptores de la superficie celular llamadas integrinas. La insertion del motivo RGD puede ser ventajosamente util en sujetos inmunodeprimidos. Puede construirse un vector recombinante clonando antigeno especifico o inmunogen o fragmentos de los mismos en cualquiera de los vectores, tales como aquellos descritos en el presente documento. El vector recombinante puede usarse para transducir celulas de un vertebrado para su uso como un agente inmunizante 40 (vease, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. N.° de serie 10/424.409).

[0106] Preferentemente, codones que codifican los componentes inmunogenicos activos, tales como antigenos, inmunogenos y epitopes, son codones "optimizados", es decir, los codones son aquellos que aparecen frecuentemente en, es decir, expresan altamente genes caninos, en lugar de aquellos codones que se usan

45 frecuentemente por, por ejemplo, CDV o cPi2. Tal uso de codones proporciona expresion eficiente del componente inmunogenico activo en celulas. En otras realizaciones, por ejemplo, cuando el componente inmunogenico activo se expresa en bacterias, levadura u otro sistema de expresion, el patron de uso de codones se altera para representar la preferencia codonica para genes altamente expresados en el organismo en que el antigeno o inmunogen esta siendo expresado. Se conocen patrones de uso de codones en la bibliografia para genes altamente expresados de muchas 50 especies (por ejemplo, Nakamura et al., 1996; Wang et al, 1998; McEwan et al. 1998).

[0107] En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia codificante de manera que pueda unirse a las secuencias de control con la orientation apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura apropiado. Tambien puede desearse producir mutantes o analogos de los componentes inmunogenicos activos deseados.

55 Pueden prepararse mutantes o analogos por la deletion de una portion de una secuencia que codifica una proteina, por insercion de una secuencia, y/o por sustitucion de uno o mas nucleotidos dentro de una secuencia. Tecnicas para modificar las secuencias de nucleotidos, tales como mutagenesis dirigida al sitio, se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., arriba; donation de ADN, arriba; hibridacion de acidos nucleicos, arriba.

[0108] Inmunogenos utiles como componentes inmunogenicos activos segun la presente descripcion pueden

ser vectores contenidos. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresion recombinantes in vivo tales como un vector de acido nucleico o un plasmido (solicitud EP N.° 1001025; Chaudhuri P, (2001) Res. Vet. Sci. 70, 255-6), vectores de virus tales como, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores de virus de la viruela tales como viruela aviar (patentes de EE.Uu. N.° de serie 5.174.993; 5.05.941; y 5.766.599), vectores de la viruela de 5 canario (patente de EE.Uu. N.° de serie 5.756.103), vectores retrovirales, vectores del virus del herpes, vectores basados en alfavirus, vectores fungicos, o vectores bacterianos (Escherichia coli o especie de Salmonella). Ejemplos especlficos de vectores utiles en la descripcion se describen en el presente documento.

10 [0109] El vector puede ser un vector viral, ventajosamente un vector de avipox que contiene al menos un

componente inmunogenico activo, o un epitope del mismo, o un fragmento del mismo. En una realization particularmente ventajosa, el vector de avipox es un vector de viruela aviar, ventajosamente, un vector de viruela de canario atenuado tal como ALVAC. Los virus de viruela de canario atenuados se describen en la patente de EE.UU. N.° 5.756.103 (ALVAC) y WO01/05934. El vector avipox puede ser un vector de la viruela aviar, ventajosamente un 15 vector de la viruela aviar atenuado tal como TROVAC. Tambien se hace referencia a la patente de EE.UU. N.° 5.766.599 que se refiere a la cepa de la viruela aviar atenuada TROVAC. A este respecto, se hace referencia a la viruela de canario disponible de la ATCC con el numero de acceso VR-111. Tambien estan disponibles numerosas cepas de inmunizacion del virus de la viruela aviar, por ejemplo la cepa DIFTOSEC CT comercializada por Merial y la vacuna NOBILIS VARIOL comercializada por Intervet; y, tambien se hace referencia a la patente de EE.UU. N.° 20 5.766.599 que se refiere a la cepa de la viruela aviar atenuada TROVAC.

[0110] Un vector viral tambien util para administrar componentes inmunogenicos activos incluye un virus de la viruela, por ejemplo un virus de la variolovacuna o un virus de la variolovacuna atenuado (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida despues de mas de 570 pases de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos de embrion

25 de pollo; vease Stickl & Hochstein-Mintzel, (1971) Munch. Med. Wschr. 113, 1149-1153; Sutter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 10847-10851; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, vease la patente de EE.UU. N.° 5.494.807, por ejemplo, Ejemplos 1 a 6 de la patente de EE.UU. N.° 5.494.807 que tratan la construction de NYVAC, ademas de variaciones de NYVAC con ORF adicionales delecionados del genoma del virus de la variolovacuna de la cepa de Copenhague, ademas de la insertion de secuencias codificantes heterologas de acido nucleico en sitios de 30 este recombinante, y por tanto, el uso de promotores coincidentes; vease tambien el documento WO96/40241), un virus de avipox o un virus de avipox atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela aviar, viruela de la paloma mensajera, viruela de la vaca, viruela de la paloma, viruela de la perdiz, ALVAC o TROVAC; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.505.941, 5.494.807), viruela porcina, viruela del mapache, viruela del camello, o virus de la mixomatosis.

35

[0111] Para information sobre el metodo de generation de recombinantes de los mismos y como administrar recombinantes de los mismos, el experto puede referirse a los documentos citados en el presente documento y al documento WO90/12882, por ejemplo, en cuanto al virus de la variolovacuna se hace mention de las patentes de EE.UU. N.° 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 y 5.762.938, entre otros; en cuanto a la viruela

40 aviar se hace mencion de las patentes de EE.UU. N.° 5.174.993, 5.505.941 y US-5.766.599, entre otras; en cuanto a la viruela del canario se hace mencion de la patente de EE.UU. N.° 5.756.103, entre otras; en cuanto a la viruela porcina se hace mencion de la patente de EE.UU. N.° 5.382.425, entre otros; y, en cuanto a la viruela del mapache se hace mencion del documento WO00/03030, entre otros.

45 [0112] Cuando el vector de expresion es un virus de la variolovacuna, el sitio de insercion o sitios para el acido

nucleico o acidos nucleicos que codifican componentes inmunogenicos activos tales como inmunogenos, antlgenos, epitopes y similares, que van a expresarse estan ventajosamente en el gen de timidina cinasa (TK) o sitio de insercion, el gen de hemaglutinina (Ha) o sitio de insercion, la region que codifica el cuerpo de inclusion del tipo A (ATI); veanse tambien los documentos citados en el presente documento, especialmente aquellos referentes al virus 50 de la variolovacuna. En el caso de la viruela del canario, ventajosamente el sitio de insercion o sitios son ORF(s) C3, C5 y/o C6; veanse tambien los documentos citados en el presente documento, especialmente aquellos referentes al virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela aviar, ventajosamente el sitio de insercion o sitios son ORF F7 y/o F8; veanse tambien los documentos citados en el presente documento, especialmente aquellos referentes al virus de la viruela aviar. El sitio de insercion o sitios para el virus de MVA son ventajosamente como en diversas 55 publicaciones, que incluyen Carroll M. W. et al. (1997) Vaccine 15(4), 387-394; Stittelaar K.J. et al. (2000) J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al. (1994) Vaccine 12(11), 1032-1040; y, a este respecto tambien se indica que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., (1998) Virology 244, 365-396, que permite al experto usar otros sitios de insercion u otros promotores.

[0113] Ventajosamente, el acido nucleico que va a expresarse puede insertarse bajo el control de un promotor

de virus de la viruela especlfico, por ejemplo, el promotor de la variolovacuna 7,5 kDa (Cochran et al., (1985) J. Virology 54, 30-35), el promotor de la variolovacuna I3L (Riviere et al., (1992) J. Virology 66, 3424-3434), el promotor de la variolovacuna HA (Shida, (1986) Virology 150, 451-457), el promotor de la variolovacuna 42K (Cooper J.A. et al, (1981) J. Virol. 37(1), 284-94), el promotor de la viruela de la vaca ATI (Funahashi et al (1988) J. Gen. Virol. 69, 355 47), el promotor de la variolovacuna 11K (patente de EE.UU. N.° 5.017.487); el promotor de la variolovacuna H6 (Taylor J. et al., (1988) Vaccine 6, 504-508; Guo P. et al. (1989) J. Virol. 63, 4189-4198; Perkus M. et al. (1989) J. Virol. 63, 3829-3836), o promotores sinteticos de la variolovacuna o poxvirales, entre otros.

[0114] Ventajosamente, para la inmunizacion de mamlferos, el vector de expresion puede ser un vector de 10 viruela del canario o de viruela aviar. De esta forma, puede ser expresion de las protelnas heterologas con replicacion

limitada o no productiva.

[0115] Otro vector viral util para administrar y expresar componentes inmunogenicos activos es adenovirus. El adenovirus es un virus de ADN no envuelto. Los vectores derivados de adenovirus tienen varias caracterlsticas que

15 los hacen particularmente utiles para transferencia genica. Un vector de adenovirus recombinante es un vector de adenovirus que lleva una o mas secuencias de nucleotidos heterologas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o mas secuencias de nucleotidos heterologas). Por ejemplo, la biologla de los adenovirus se caracteriza en detalle, el virus es extremadamente eficiente en introducir su ADN en la celula huesped, el virus puede infectar una amplia variedad de celulas y tiene un amplio intervalo de huespedes, el virus puede producirse en grandes cantidades con facilidad 20 relativa, y el virus pueden convertirse en defectuoso en la replicacion por deleciones en la region 1 temprana ("E1") del genoma viral.

[0116] A diferencia de, por ejemplo, los retrovirus, los adenovirus no se integran en el genoma de la celula huesped, son capaces de infectar celulas no divisoras y son capaces de transferir eficientemente genes

25 recombinantes in vivo (Brody et al., 1994). Estas caracterlsticas hacen que los adenovirus sean candidatos atractivos para la transferencia genica in vivo de, por ejemplo, un acido nucleico heterologo de interes en celulas, tejidos o sujetos en necesidad del mismo.

[0117] Se prefieren vectores de adenovirus que contienen multiples deleciones para tanto aumentar la 30 capacidad portadora del vector como reducir la verosimilitud de recombinacion para generar adenovirus competentes

en la replicacion (RCA). Donde el adenovirus contiene multiples deleciones, no es necesario que cada una de las deleciones, si estan presentes solas, produzca un adenovirus defectuoso en la replicacion. En tanto que una de las deleciones convierta el adenovirus en defectuoso en la replicacion, las deleciones adicionales pueden incluirse para otros fines, por ejemplo, para aumentar la capacidad portadora del genoma del adenovirus para secuencias de 35 nucleotidos heterologas. Preferentemente, mas de una de las deleciones previene la expresion de una protelna funcional y convierte el adenovirus en defectuoso en la replicacion. Mas preferentemente, todas las deleciones son deleciones que convertirlan el adenovirus en defectuoso en la replicacion.

[0118] Las realizaciones de la descripcion que emplean recombinantes de adenovirus pueden incluir vectores 40 de adenovirus defectuosos en E1 o delecionado, defectuosos en E3 o delecionado y/o defectuosos en E4 o

delecionado, o el vector de adenovirus "destripado" en el que todos los genes virales estan delecionados. Los vectores de adenovirus pueden comprender mutaciones en los genes E1, E3 o E4, o deleciones en estos o todos los genes adenovirales. La mutacion de E1 eleva el margen de seguridad del vector debido a que se dice que mutantes de adenovirus defectuosos en E1 son defectuosos en la replicacion en celulas no permisivas, y estan, por lo menos, 45 altamente atenuados. La mutacion de E3 potencia la inmunogenicidad del antlgeno alterando el mecanismo por el cual el adenovirus regula por disminucion las moleculas de clase I de MHC. La mutacion de E4 reduce la inmunogenicidad del vector de adenovirus suprimiendo la expresion genica tardla, puede as! permitir la re-inmunizacion repetida utilizando el mismo vector. La presente descripcion comprende vectores de adenovirus de cualquier serotipo o serogrupo que estan delecionados o mutados en E1, E3, E4, E1 y E3, y E1 y E4.

50

[0119] Un vector de adenovirus "destripado" es el ultimo modelo en la familia de los vectores de adenovirus y se deriva de secuencias de adenovirus humanas. Su replicacion requiere un virus auxiliar y una llnea celular 293 humana especial que expresa tanto E1a como Cre, a condicion de que no exista en el entorno natural; el vector esta privado de todos los genes virales, as! el vector como vehlculo de vacuna es no inmunogenico y puede inocularse

55 multiples veces para la reinmunizacion. El vector de adenovirus "destripado" tambien contiene espacio de 36 kb para acomodar acido(s) nucleico(s) heterologo(s) de interes, permitiendo as! la co-administracion de un gran numero de antlgeno o inmunogenos en celulas.

[0120] Asl, el vector en la descripcion puede ser cualquier virus recombinante adecuado o vector de virus, que

incluye, sin limitation, un virus de la viruela (por ejemplo, virus de la variolovacuna, virus de avipox, virus de la viruela del canario, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.), adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino), virus del herpes, baculovirus, retrovirus; o el vector puede ser un plasmido. Los documentos citados en el presente documento, ademas

5 de proporcionar ejemplos de vectores utiles en la practica de la description, tambien pueden proporcionar fuentes para otros componentes inmunogenicos activos que van a expresarse por vector o vectores en, o incluirse en, las composiciones inmunogenicas estabilizadas, suspensiones, o disoluciones de la descripcion.

[0121] Elementos para la expresion de los componentes inmunogenicos activos pueden estar ventajosamente

10 presentes en un vector plasmldico. El termino plasmido cubre cualquier unidad de transcription de ADN que

comprende

un acido nucleico segun la descripcion y los elementos necesarios para su expresion in vivo en una celula o celulas del huesped deseado o diana; y, a este respecto, se observa que un plasmido circular superenrollado o no superenrollado, ademas de una forma lineal, pretenden estar dentro del alcance de la descripcion.

15

[0122] En una manera minima, la expresion de un componente inmunogenico activo, tal como un antlgeno, un inmunogen, y un epitope, comprende un codon de initiation (ATG), un codon de termination y un promotor, y opcionalmente tambien una secuencia de poliadenilacion para ciertos vectores tales como plasmido y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de poxvirus. Cuando el acido nucleico codifica un fragmento de

20 poliprotelna en el vector, un ATG se pone en el extremo 5' del marco de lectura y se pone un codon de terminacion en el extremo 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresion, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizadoras y secuencias senal que permiten la expresion, modification y secretion de la protelna.

25 [0123] Una "secuencia codificante" de acido nucleico o una "secuencia de nucleotidos que codifica" una

protelna particular es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los llmites de la secuencia codificante se determinan por un codon de iniciacion en el extremo 5' y un codon de terminacion de la traduction en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias

30 de ADN genomico de eucariotas (por ejemplo, de mamlfero) aDn, e incluso secuencias de ADN sintetico. Una secuencia de terminacion de la transcripcion normalmente se localizara 3' con respecto a la secuencia codificante.

[0124] "Elementos de control" de acido nucleico se refieren conjuntamente a promotores, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de union a ribosoma, senales de poliadenilacion (por ejemplo, senales de poliadenilacion

35 derivadas de hormona de crecimiento bovina, senal de poliadenilacion de SV40), secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores en la direction 5', potenciadores, orlgenes de replication (que pueden ser orlgenes bacterianos, por ejemplo, derivados de vectores bacterianos tales como pBR322, u orlgenes eucariotas, por ejemplo, secuencias que se replican autonomamente (ARS)), senales de encapsidacion, secuencias conductoras que pueden o pueden no estar contenidas en la secuencia codificante de un componente inmunogenico activo, tal como un

40 inmunogen, antlgeno o epitope. Si se incluye una secuencia senal, puede tanto ser la secuencia nativa, homologa, como una secuencia heterologa. Las secuencias conductoras pueden ser eliminadas por el huesped en procesamiento post-traduccional. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397, y similares, que proporcionan conjuntamente la transcripcion y traduccion de una secuencia codificante en una celula huesped.

45

[0125] No todas de estas secuencias de control necesitan siempre estar presentes en un vector recombinante, mientras que el gen deseado sea capaz de ser transcrito y traducido. Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripcion" de una secuencia codificante en una celula cuando la ARN polimerasa se une al promotor y transcribe la secuencia codificante en ARN. El ARNm resultante se traduce posteriormente en el polipeptido codificado

50 por la secuencia codificante.

[0126] Puede usarse una variedad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y la expresion especlfica de tejido deseada. El promotor puede ser constitutivo o inducible (por ejemplo, el promotor de la metalotionelna, el promotor inducible de tetraciclina y el promotor inducible de ecdisona, entre otros), dependiendo del

55 patron de expresion deseado. El promotor puede ser nativo o heterologo y puede ser una secuencia natural o una sintetica. "Heterologo", en este contexto, describe una region de iniciacion de la transcripcion que no se encuentra en el huesped no mutante en el que se introduce la region de iniciacion de la transcripcion. El promotor se elige de manera que funcione en la(s) celula(s) diana o tejido(s) de interes. Se contemplan promotores especlficos de cerebro, especlficos hepaticos y especlficos de musculo (incluyendo especlficos de esqueletico, cardlaco, liso y/o de

diafragma) por la presente descripcion. Tambien se prefieren promotores de mamlfero y aviares, particularmente promotores caninos.

[0127] El promotor puede ser ventajosamente un promotor "temprano". Un promotor "temprano" se conoce en 5 la tecnica y se define como un promotor que conduce la expresion de un gen que es rapidamente y transitoriamente

expresado en ausencia de slntesis de protelnas de novo. El promotor tambien puede ser un promotor "fuerte" o "debil". Los terminos "promotor fuerte" y "promotor debil" se conocen en la tecnica y pueden definirse por la frecuencia relativa de iniciacion de la transcripcion (veces por minuto) en el promotor. Un promotor "fuerte" o "debil" tambien puede definirse por su afinidad por ARN polimerasa.

10

[0128] El gen heterologo puede ponerse bajo el control de un promotor, sitio de union a ribosoma (para expresion bacteriana) y, opcionalmente, un potenciador u operador, de manera que la secuencia de ADN que codifica la protelna deseada se transcriba en ARN en una celula huesped o sujeto transformado por un vector que contiene el componente inmunogenico activo.

15

[0129] Pueden unirse elementos de control y otras secuencias reguladoras a la secuencia codificante antes de la insercion en un vector, tales como los vectores de clonacion descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresion que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restriccion apropiado.

20

[0130] Mas preferentemente, los antlgenos o inmunogenos estan operativamente asociados a, por ejemplo, un promotor inmediato-temprano mayor del citomegalovirus humano (CMV), un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor de p-actina, un promotor de albumina, un promotor del factor de elongacion 1-a (EF1-a), un promotor de PyK, un promotor de MFG, o un promotor del virus del sarcoma de Rous. Otras secuencias de control de la expresion

25 incluyen promotores derivados de genes de inmunoglobina, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del herpes, etc. Tambien puede usarse cualquier promotor viral de mamlfero en la practica de la descripcion, ademas de cualquier promotor viral canino. Entre los promotores de origen viral canino, pueden usarse los promotores de genes inmediatos-tempranos del virus del herpes canino infeccioso, promotores tempranos (es decir, timidina cinasa, ADN helicasa, ribonucleotido reductasa) o tardlos, en los metodos y vectores de la presente descripcion. Otros promotores 30 incluyen el promotor E1 de adenovirus canino, ademas del promotor del complejo mayor de histocompatibilidad I canino. Ademas, esta perfectamente dentro del alcance del experto seleccionar un promotor adecuado que exprese el antlgeno o inmunogen de interes a niveles suficientemente altos para inducir o provocar una respuesta inmunogenica al antlgeno o inmunogen, sin excesiva experimentacion.

35 [0131] Se ha especulado que conducir la transcripcion de nucleotidos heterologos con el promotor del CMV

puede producir la regulacion por disminucion de la expresion en animales inmunocompetentes (vease, por ejemplo, Guo et al., 1996). Por consiguiente, tambien se prefiere asociar operablemente las secuencias de antlgeno o inmunogen con, por ejemplo, un promotor del CMV modificado que no produce esta regulacion por disminucion de la expresion de antlgeno o inmunogen.

40

[0132] Los vectores de la descripcion tambien pueden comprender un policonector o sitio de clonacion multiple ("MCS"), que puede localizarse ventajosamente en la direction 3' de un promotor. El policonector proporciona un sitio para la insercion del antlgeno o moleculas de inmunogen que estan "en marco" con la secuencia promotora, produciendo "union operativa" de la secuencia promotora con el antlgeno o inmunogen de interes. Sitios de clonacion

45 multiple y policonectores son muy conocidos para aquellos expertos en la materia.

[0133] Los vectores descritos en el presente documento tambien pueden comprender genes de resistencia a antibioticos. Ejemplos de tales genes de resistencia a antibioticos que pueden incorporarse en los vectores de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, ampicilina, tetraciclina, neomicina, zeocina, kanamicina, bleomicina,

50 higromicina, cloranfenicol, entre otros.

[0134] En realizaciones donde hay mas de un antlgeno o inmunogen, las secuencias de antlgeno o inmunogen pueden estar operativamente asociadas a un unico promotor en la direccion 5' y una o mas secuencias de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) en la direccion 3' (por ejemplo, la secuencia IRES del picornavirus EMC). Una

55 secuencia IRES permite la traduction multicistronica de dos o mas secuencias codificantes a partir de una unica secuencia de ARNm.

[0135] Los vectores de la descripcion pueden entonces usarse para transformar una celula huesped apropiada o sujeto. Se conocen en la tecnica varias llneas celulares de mamlfero e incluyen llneas celulares inmortalizadas

disponibles de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), tales como, pero no se limitan a, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de rinon de hamster bebe (BHK), celulas de rinon de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), celulas de rinon bovino Madin-Darby ("MDBK"), celulas de rinon canino Madin-Darby ("MDCK"), ademas de otras. Similarmente, huespedes bacterianos tales como E. coli, 5 Bacillus subtilis, Salmonella spp., Shigella spp. y Streptococcus spp., encontraran uso en la presente descripcion. Huespedes de levadura utiles en la presente descripcion incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Huespedes de insecto utiles en la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a, celulas de Spodoptera frugiperda.

10

[0136] Alternativamente, los vectores pueden usarse para infectar una celula en cultivo para expresar un

producto genico deseado, por ejemplo, para producir una protelna o peptido de interes. Preferentemente, la protelna o peptido es secretado en el medio y puede purificarse del mismo usando tecnicas rutinarias conocidas en la tecnica. Secuencias de peptidos senal que dirigen la secrecion extracelular de protelnas se conocen en la tecnica y secuencias

15 de nucleotidos que codifican las mismas pueden estar operativamente unidas a la secuencia de nucleotidos que codifica el peptido o protelna de interes por tecnicas rutinarias conocidas en la tecnica. Alternativamente, las celulas pueden lisarse y la protelna recombinante expresada puede purificarse a partir del lisado celular. Preferentemente, la celula es una celula de vertebrado, mas preferentemente una celula de mamlfero.

20

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[0137] Metodos de preparacion y/o administracion de un vector o recombinantes o plasmido para la expresion

de productos genicos de genes de la descripcion tanto in vivo como in vitro pueden ser cualquier metodo deseado, por ejemplo, un metodo que es por o analogo a los metodos desvelados en, o desvelados en los documentos citados en las patentes de EE.UU. N.° 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807 5.514.375; 5.744.140; 5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599; 5.990.091; 5.174.993; 5.505.941; 5.338.683

5.494.807; 5.591.639; 5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859; 6.130.066; 6.004.777; 6.130.066

6.497.883; 6.464.984; 6.451.770; 6.391.314; 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603; 6.348.196; 6.306.400; 6.228.846

6.221.362; 6.217.883; 6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199; 6.090.393; 6.074.649; 6.045.803; 6.033.670:

6.485.729; 6.103.526; 6.224.882; 6.312.682; 6.348.450 y 6.312.683; solicitud de patente de EE.UU. N.° de serie 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986; documentos WO 90/01543; WO91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1131311318; Ballay et al. (1993) EMBO J. 4, 3861-65; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Frolov et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11371-11377; Graham, F.L. (1990) Trends Biotechnol. 8, 85-87; Grunhaus et al. (1992) Sem. Virol. 3, 237-52; Ju et al. (1998) Diabetologia 41, 736-739; Kitson et al. (1991) J. Virol. 65, 3068-3075; McClements et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11414-11420; Moss, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11341-11348; Paoletti, E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11349-11353; Pennock et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 399-406; Richardson (Ed), (1995) Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols", Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165; Robertson et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11334-11340; Robinson et al. (1997) Sem. Immunol. 9, 271; y Roizman, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11307-11312.

[0138] La expresion en el sujeto de la secuencia heterologa puede producir una respuesta inmunitaria en el

sujeto a los productos de expresion del antlgeno o inmunogen. Asl, los componentes inmunogenicos activos de la presente descripcion pueden usarse en una composicion inmunogenica o composicion de vacuna para proporcionar un medio para inducir una respuesta inmunitaria, que puede, pero necesita ser, protectora. Las tecnicas de biologla molecular usadas en el contexto de la descripcion se describen por Sambrook et al. (2001).

[0139] Incluso ademas alternativamente o adicionalmente, en las composiciones inmunogenicas o de vacuna

englobadas por la presente descripcion, la secuencia de nucleotidos que codifica los antlgenos o inmunogenos puede tener delecionada de la misma una porcion que codifica un dominio transmembranario. Aun incluso ademas 50 alternativamente o adicionalmente, el vector o composicion inmunogenica puede contener ademas y expresar en una celula huesped una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia senal de tPA heterologa tal como una tPA de mamlfero y/o un intron estabilizante, tal como el intron II del gen de p-globina de conejo.

[0140] Puede administrarse un vector a un sujeto en una cantidad para lograr las cantidades establecidas para

55 las composiciones de producto genico (por ejemplo, epitope, antigeno, terapeutico y/o anticuerpo). La descripcion preve dosificaciones por debajo y por encima de aquellas ejemplificadas en el presente documento, y para cualquier composicion que va a administrarse a un sujeto, que incluye los componentes de la misma, y para cualquier metodo de administracion particular, se prefiere determinar la toxicidad, tal como determinando la mediana de la dosis infectiva del cultivo celular (CCID50), la dosis letal (LD) y la LD50 en un sujeto adecuado; y la dosificacion de la composicion,

concentracion de componentes en ella y el momento exacto de administrar la composicion, que provocan una respuesta adecuada, tal como por valoraciones de sueros y analisis de los mismos, por ejemplo, por ELISA y/o analisis de seroneutralizacion. Tales determinaciones no requieren excesiva experimentacion del conocimiento del experto, la presente divulgacion y los documentos citados en el presente documento.

5

[0141] Composiciones inmunogenicas multivalentes y/o composiciones de vacuna y/o suspensiones o disoluciones inmunogenicas que comprenden CAV2 atenuados vivos, CDV atenuados vivos, cPi2 atenuados vivos, y CPV atenuados vivos, y que comprenden un estabilizador segun la presente description, han sido probadas en los ejemplos en el presente documento. Estas vacunas multivalentes mostraron buena estabilidad para CDV, cPi2, CAV2

10 y CPV. Esto demuestra que los estabilizadores de la presente descripcion son capaces de preservar la viabilidad e infectividad de CDV, cPi2, CAV2 y CPV. Esto tambien demuestra que los estabilizadores de la presente descripcion son capaces de preservar la viabilidad e infectividad de una variedad de virus distintos de paramixovirus caninos, en particular de parvovirus caninos y adenovirus canino. Los estabilizadores segun la presente descripcion tambien pueden usarse como composicion inmunogenica monovalente o composicion de vacuna que comprende CAV, CPV, 15 CDV o cPi2.

[0142] La etapa de enfriamiento (b) puede producirse a temperaturas inferiores a aproximadamente -40 °C (etapa de congelation de agua). El secado de las suspensiones inmunogenicas estabilizadas o disolucion por sublimation de hielo a baja presion (c) puede producirse a, por ejemplo, presion mas baja de o igual a

20 aproximadamente 200 pbar, mientras que otra reduction en la presion puede producirse a presiones mas bajas de o iguales a aproximadamente 100 pbar. Finalmente, la temperatura de la suspension o disolucion inmunogenica estabilizada durante la elimination del exceso de agua residual (d) se produce a, por ejemplo, temperaturas entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 30 °C.

25 [0143] El proceso de liofilizacion tambien puede realizarse con una suspension o disolucion inmunogenica que

comprende paramixovirus canino atenuado vivo y al menos un componente inmunogenico activo derivado de un patogeno distinto de un paramixovirus, que se mezcla con un estabilizador segun la descripcion para obtener una composicion inmunogenica o de vacuna multivalente estabilizada liofilizada.

30 [0144] El contenido de humedad del material vitrificado puede oscilar de aproximadamente el 0,5 % a

aproximadamente el 5 % en peso/peso, preferentemente de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 3 % en peso/peso, y mas preferentemente de aproximadamente el 1,0 % a aproximadamente el 2,6 % en peso/peso.

[0145] Para su uso y administration en un sujeto, la composicion inmunogenica estabilizada vitrificada o 35 composicion de vacuna puede reconstituirse por rehidratacion con un disolvente. El disolvente normalmente es agua,

tal como agua desmineralizada o destilada, agua para inyeccion, pero tambien puede comprender disoluciones o tampones fisiologicos, tales como, por ejemplo, disolucion de tampon fosfato (PBS), o adyuvantes que incluyen, pero no se limitan a, emulsiones de agua en aceite, Corynebacterium parvum, bacilo de Calmette Guerin, hidroxido de aluminio, glucano, sulfato de dextrano, oxido de hierro, alginato de sodio, bacto-adyuvante, ciertos pollmeros sinteticos 40 tales como poliaminoacidos y copollmeros de aminoacidos, saponina, "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), "AVRIDINE" (N, N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina), aceite de parafina, muramildipeptido y similares. Otros ejemplos especlficos de adyuvantes y composiciones de adyuvante se detallan en el presente documento.

[0146] Adyuvantes adecuados incluyen fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; patente de EE.UU. N.° 45 6.017.537) y/o pollmero de acido acrllico o acido metacrllico y/o un copollmero de anhldrido maleico y de derivado de

alquenilo. Los pollmeros de acido acrllico o acido metacrllico pueden estar reticulados, por ejemplo, con polialquenil eteres de azucares o de polialcoholes. Estos compuestos son conocidos con el termino "carbomero" (Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, junio de 1996). Un experto en la materia puede tambien referirse a la patente de EE.UU. N.° 2.909.462, que trata tales pollmeros acrllicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos 3 grupos 50 hidroxilo; un compuesto polihidroxilado no contiene mas de 8 grupos hidroxilo; como otro ejemplo, los atomos de hidrogeno de al menos 3 hidroxilos se sustituyen con radicales alifaticos insaturados que contienen al menos 2 atomos de carbono. Los radicales pueden contener de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 atomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden ellos mismos contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados con el nombre Carbopol® (Noveon 55 Inc., Ohio, EE.UU.) son particularmente adecuados para su uso como adyuvantes. Estan reticulados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritiol, respecto a los que se hace mencion de los productos Carbopol® 974P, 934P y 971P.

[0147] En cuanto a los copollmeros de anhldrido maleico y de derivado de alquenilo, se hace mention de los

productos EMA® (Monsanto), que son copollmeros de anhldrido maleico y de etileno, que pueden ser lineales o estar reticulados, por ejemplo, reticulados con divinil eter. Por tanto, puede hacerse referencia a la patente de EE.UU. N.° 6.713.068 y Regelson, W. et al., 1960.

5 [0148] Llpidos cationicos que contienen una sal de amonio cuaternario se describen en la patente de EE.UU.

N.° 6.713.068, tambien pueden usarse en los metodos y composiciones de la presente descripcion. Entre estos llpidos cationicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-prapanoamonio; documento WO96/34109), ventajosamente asociado a un llpido neutro, ventajosamente DoPe (dioleoil- fosfatidiletanolamina; Behr J. P. et al, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

10

[0149] El contenido total de componentes en las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna listas para inyectar reconstituidas de la descripcion puede usarse para proporcionar una inyeccion a una concentration isotonica, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 100-600 mOsm, generalmente dentro de aproximadamente 250-450 mOsm, y preferentemente aproximadamente 330 mOsm.

15

[0150] Dosificaciones de patogenos atenuados vivos, en particular CDV y cPi2, en una composition inmunogenica o composicion de vacuna estabilizada liofilizada, o en composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna listas para inyectar reconstituidas, pueden oscilar de aproximadamente 102 a aproximadamente 107 CCID50/dosis. Para protelnas, polipeptidos o glucoprotelnas en una composicion inmunogenica o composicion de

20 vacuna multivalente estabilizada liofilizada, o en las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna multivalentes listas para usar reconstituidas, puede oscilar en un tltulo equivalente antes de la inactivation de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 CCID50 por dosis, preferentemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 CCID50 por dosis.

25 [0151] Las composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna listas para uso reconstituidas pueden

administrarse a un animal mediante inyeccion a traves de la via parenteral o mucosa, preferentemente intramuscular y subcutanea. Sin embargo, la administration de tales composiciones inmunogenicas o composiciones de vacuna listas para uso reconstituidas tambien puede comprender administracion intranasal, epicutanea, topica o por via oral. El volumen de una dosis para inyeccion puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2,0 ml, y 30 preferentemente aproximadamente 1,0 ml.

[0152] La invention se describira ahora ademas a modo de los siguientes ejemplos no limitantes, dada a modo de ilustracion de diversas realizaciones de la invencion, y no pretende limitar la presente invencion en ningun modo.

35 EJEMPLOS

Ejemplo 1: Proceso de vitrification - Material biologico (general seguido de especifico)

[0153] Se vitrificaron las composiciones biologicas segun las siguientes etapas generales:

40

(1) formular una preparation biologica, que incluye las etapas de anadir componentes biologicos activos, anadir estabilizadores, que reducen o eliminan el dano inducido sometiendo los componentes biologicos a medios de preservation criogenica, que incluyen granulation en perlas, vitrificacion y liofilizacion, y opcionalmente anadir uno o mas adyuvantes, que aumentan la inmunogenicidad del biologico en el caso de

45 preparaciones inmunologicas;

(2) llenar viales con la preparacion biologica de la etapa (1);

(3) cargar viales en recipiente de temperatura controlada, en el que la temperatura es entre -15 °C y 10 °C, particularmente entre -10 °C y 5 °C, e incluso mas particularmente aproximadamente 5 °C;

(4) reducir la presion del aire del recipiente de temperatura controlada hasta que se obtiene una presion

50 dentro del intervalo de 15-30 mbar;

(5) mantener la presion obtenida durante la etapa (4) durante entre 5 y 20 minutos, particularmente entre 10 y 15 minutos, para permitir que la temperatura del producto se estabilice y para permitir que los gases volatiles, que incluyen carbonatos, sean liberados de la preparacion biologica, en el que la temperatura del recipiente sigue a aproximadamente 4 °C a aproximadamente 6 °C, o aproximadamente 5 °C durante esta etapa;

55 (6) disminuir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mbar, o

aproximadamente 5 mbar, durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos;

(7) mantener la presion de la etapa (6) durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, que permite que la preparacion biologica llegue a concentrarse mas;

(8) aumentar la temperatura del recipiente de temperatura negativa a positiva (entre aproximadamente 30 °C

y aproximadamente 50 °C) durante el transcurso de entre 45 y 85 minutos, o aproximadamente 60 minutos, y mantener la presion constante hasta que llegue a aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, o aproximadamente 15 °C;

(9) reducir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4 mbar, o

5 aproximadamente 3 mbar, para acelerar la concentracion, y hasta que la temperatura del recipiente alcance y

mantenga aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 90 minutos, o 60 minutos;

(10) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4,0 mbar, o aproximadamente 1 mbar, y mantener la presion constante hasta que se haya completado la espumacion;

10 (11) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 5 pbar y aproximadamente 100 pbar, o

aproximadamente 25 pbar, mientras que se mantiene la temperatura a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 400 a aproximadamente 2400 o mas minutos, hasta que se obtiene la humedad deseada de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 4 %;

15 (12) tapar los viales mientras estan en el recipiente del liofilizador, completandose as! el metodo de

vitrificacion.

20

Tabla 2. Vitrificacion de RECOMBITEK® (EURICAN, Merial) Virus del moquillo canino (CDV) y paragripe tipo 2 (PI2);

HR 4 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 238 refrig. placas 0 -10 refrig. trampa 20 -70

disminuir vaclo

10 30 calentar placa 20 -4

vaclo estable

20 30 estable 35 -4

disminuir vaclo

10 5 calentar placa 60 30

vaclo estable

40 5 estable 1275 30

disminuir vaclo

10 3

vaclo estable

15 3

disminuir vaclo

5 1,5

vaclo estable

160 1,5-1

alto vaclo

1050 /

Tabla 3. Vitrificacion de IB88: HR 3,9 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la trampa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 247 refrig. placas 0 -7 refrigerar trampa 20 -70

disminuir vaclo

10 20 calentar placa 25 -4

vaclo estable

15 20 estable 20 -4

disminuir vaclo

5 5 calentar placa 60 30

vaclo estable

50 5 estable 1375 30

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

disminuir vaclo

10 3

vaclo estable

30 3

disminuir vaclo

5 2

vaclo estable

85 2-1,5

alto vaclo

1270 /

Tabla 4. Cellules CEP-parquet MO23; Cellules EB66; Vitrificacion de CEP 50/50 S32+S 325 g/l; Vitrificacion de EB66 ______________________________________50/50 S32+S 325 g/l _______________________________

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 780 refrigerar placas 0 -11 refrigerar trampa 30 -70

disminuir vaclo

10 22 calentar placa 5 -5

vaclo estable

10 22 estable 40 -5

disminuir vaclo

5 5 calentar placa 70 30

vaclo estable

50 5 estable 1335 30

disminuir vaclo

5 3

vaclo estable

40 3

disminuir vaclo

10 2

vaclo estable

5 2

disminuir vaclo

10 1,5

vaclo estable

10 1,5

disminuir vaclo

10 1

vaclo estable

125 1

alto vaclo

1150 /

5 _______________Tabla 5. Cellules CEP-parquet 09/17; Vitrificacion de CEP 50/50 S32+S 325 g/l

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la trampa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 660 refrigerar placas 0 -5 refrigerar trampa 30 -70

disminuir vaclo

10 15 estable 45 -5

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

vaclo estable

10 15 calentar placa 60 30

disminuir vaclo

10 5 estable 1330 30

vaclo estable

50 5

disminuir vaclo

10 3

vaclo estable

20 3

disminuir vaclo

10 2,5

disminuir vaclo

10 2

disminuir vaclo

10 1,5

vaclo estable

20 1,5

alto vaclo

1275 /

Tabla 6. Vitrificacion de MAREK: HR 5,4 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 780 refrigerar placas 0 -5 refrigerar trampa 20 -70

disminuir vaclo

10 23 estable 45 -5

vaclo estable

10 20 calentar placa 65 30

disminuir vaclo

10 5 estable 1325 30

vaclo estable

50 5

disminuir vaclo

10 3

vaclo estable

10 3

disminuir vaclo

10 2

vaclo estable

10 2

disminuir vaclo

10 1,5-1

vaclo estable

50 1,5-1

alto vaclo

1255 /

Tabla 7. Vitrificacion de vCP97 50/50 S11+S 325 g/l: HR 8,42 %; Vitrificacion de vCP2017 50/50 S11+S 325 g/l: HR 7,61 %; Vitrificacion de vCP97 50/50 F2+S 325 g/l: HR 8,76 %; Vitrificacion de vCP2017 50/50 F2+S 325 g/l: HR ___________________________________________7,06 %___________________________________________

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 122 refrigerar placas 0 -10 refrigerar trampa 30 -70

disminuir vaclo

10 23 calentar placa 10 -5

vaclo estable

20 23 estable 20 -5

disminuir vaclo

15 5 calentar placa 100 30

vaclo estable

45 5 estable 1325 30

disminuir vaclo

10 3

vaclo estable

10 3

disminuir vaclo

5 2

vaclo estable

5 2

disminuir vaclo

10 1,5

disminuir vaclo

10 1

vaclo estable

10 1

alto vaclo

1295 /

5 Tabla 8. Vitrificacion de vCP97 50/50 S11+S 325 g/l: HR 13,1 %; Vitrificacion^de vCP97 50/50 F2+S 325 g/l: HR 8,2 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la trampa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 412 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 30 -70

disminuir vaclo

5 17 estable 20 4

vaclo estable

10 17 calentar placa 70 30

disminuir vaclo

5 14 estable 1620 30

vaclo estable

10 14

disminuir vaclo

5 12

disminuir vaclo

5 10

disminuir vaclo

10 8

vaclo estable

10 8

disminuir vaclo

5 6

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa | Tps Min | Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

vaclo estable

10 6

disminuir vaclo

5 4

vaclo estable

5 4

disminuir vaclo

5 2

disminuir vaclo

5 1,3

vaclo estable

60 1,3

alto vaclo

1570 /

Tabla 9. Vitrificacion de PA Newcastle: HR 4,6 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 520 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 20 -70

disminuir vaclo

5 22 calentar placa 90 30

disminuir vaclo

5 17 estable 1410 30

vaclo estable

10 17

disminuir vaclo

5 14

disminuir vaclo

5 12

disminuir vaclo

5 10

disminuir vaclo

5 8

vaclo estable

5 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

25 6

disminuir vaclo

5 4

vaclo estable

5 4

disminuir vaclo

5 2

vaclo estable

5 2

disminuir vaclo

5 1,3

vaclo estable

95 1,3

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa | Tps Min | Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

alto vaclo

1310 /

Tabla 10. Vitrificacion de PA IB88: HR 4,6 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 490 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 25 -70

disminuir vaclo

5 22 estable 10 4

disminuir vaclo

5 17 calentar placa 85 30

vaclo estable

10 17 estable 1030 30

disminuir vaclo

5 12

vaclo estable

5 12

disminuir vaclo

5 10

disminuir vaclo

5 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

40 6

disminuir vaclo

5 4

vaclo estable

5 4

disminuir vaclo

5 2

vaclo estable

5 2

disminuir vaclo

5 1

vaclo estable

150 1

alto vaclo

865 /

Tabla 11. Vitrificacion Pasteurella 50/50 S54+S (325 g/l): HR 5,5 %; Vitrificacion Pasteurella 50/50 F2+S (325 g/l): HR 5 ___________________________________________6,1 %___________________________________________

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la trampa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 715 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 30 -70

disminuir vaclo

5 30 estable 15 4

disminuir vaclo

5 18 calentar placa 75 30

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

vaclo estable

10 18 estable 1455 30

disminuir vaclo

5 14

vaclo estable

5 14

disminuir vaclo

5 12

disminuir vaclo

5 10

vaclo estable

5 10

disminuir vaclo

5 8

vaclo estable

10 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

30 6

disminuir vaclo

5 4

disminuir vaclo

5 2

disminuir vaclo

5 1

vaclo estable

1015 1

alto vaclo

460 /

Tabla 12. Vitrificacion Avibacterium 50/50 S54+S (325 g/l): HR 4,8 %; Vitrificacion Avibacterium 50/50 F2+S (325 g/l):

HR 6 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 404 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 15 -70

disminuir vaclo

5 23 estable 15 4

disminuir vaclo

5 17 calentar placa 80 30

vaclo estable

10 17 estable 1705 30

disminuir vaclo

5 14

vaclo estable

5 14

disminuir vaclo

5 12

disminuir vaclo

5 10

vaclo estable

5 10

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa | Tps Min | Temp °C

disminuir vaclo

5 8

vaclo estable

15 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

20 6

disminuir vaclo

5 4

disminuir vaclo

5 2

disminuir vaclo

5 1

vaclo estable

1255 1

alto vaclo

385 /

Tabla 13. Vitrificacion de vCP2017 50/50 S11+S 325 g/l: HR 7,5 %; Vitrificacion de vCP2017 50/50 F2+S 325 g/l: HR ____________________________________________7,1 %_________________________________________

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 372 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 15 -70

disminuir vaclo

5 18 estable 10 4

disminuir vaclo

5 17 calentar placa 75 30

vaclo estable

10 17 estable 1625 30

disminuir vaclo

5 13

disminuir vaclo

5 10

disminuir vaclo

5 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

30 6

disminuir vaclo

5 4

disminuir vaclo

5 2

disminuir vaclo

5 1

vaclo estable

170 1

alto vaclo

1455 /

Tabla 14. Vitrificacion de ERN: HR 4,1 %

Presion

Temperatura del estante de la secadora Temperatura de la tram pa

etapa

Tps Min Presion mbar etapa Tps Min Temp °C etapa Tps Min Temp °C

disminuir vaclo

0 372 refrigerar placas 0 4 refrigerar trampa 10 -70

disminuir vaclo

5 17 estable 15 4

disminuir vaclo

5 15 calentar placa 75 30

vaclo estable

10 15 estable 1625 30

disminuir vaclo

5 12

disminuir vaclo

5 10

disminuir vaclo

5 8

disminuir vaclo

5 6

vaclo estable

50 6

disminuir vaclo

5 4

disminuir vaclo

5 2

disminuir vaclo

5 1

vaclo estable

135 1

alto vaclo

1415 /

Ejemplo 2: Estudios de estabilidad despues de la liofilizacion

5 [0154] Se sometio EURICAN (CDV y PI2) a liofilizacion, vitrificacion (segun el metodo desvelado

anteriormente), o granulacion en perlas. Las tablas proporcionan detalles resumen para las formulaciones inmunologicas probadas.

Tabla 15. Estudio de estabilidad de nueve meses, RECOMBITEK® (EURICAN, Merial)

Tltulo en log10CCID50/ml

Ciclo

Liofilizacion de EURICAN Vitrificacion de EURICAN Granulacion en perlas de EURICAN

Valencia

CDV PI2 CDV PI2 CDV PI2

Formulacion diana

0,48 ml 6,73 0,48 ml 6,73 0,48 ml 6,73

T 0

5,41 6,14 5,88 6,47 5,07 6,02

T 3 meses

5,33 5,95 5,71 6,47 4,72 5,9

T 6 meses

5,4 5,99 5,78 6,39 4,68 5,6

T 9 meses

5,39 5,71 5,76 6,6 4,69 5,88

Tabla 16. Estudio de estabilidad de seis meses, vCP97 (antlgenos FeLV con vector de la viruela del canario, Merial ____________________________________FeLV®)____________________________________

Tltulo en log10CCID50/ml

Liofilizacion en estabilizador S11 Liofilizacion en estabilizador F02 Vitrificacion en estabilizador S11 Vitrificacion en estabilizador F02

Formulacion diana

8,1 8,1 8,1 8,1

T 0

7,91 7,87 8,2 7,94

T 6 meses

7,56 7,6 7,48 7,65

Tabla 17. Estudio de estabilidad de seis meses, vCP2017 (WNV con vector de la viruela del canario, Merial 5 ______________________________RECOMBITEK® WNV)______________________________

Tltulo en loc 10CCID50/ml

Liofilizacion en estabilizador S11 Liofilizacion en estabilizador F02 Vitrificacion en estabilizador S11 Vitrificacion en estabilizador F02

Formulacion diana

7,5 7,5 7,5 7,5

T 0

6,87 6,93 7,07 7

T 6 meses

6,34 6,52 6,9 6,53

Tabla 18. Estudio de estabilidad de seis meses, avibacterium atenuado

Pasteurella Avibacterium

Liof. en estab. 54 Liof. en estab. F02 Vitrif. en estab. 54 Vitrif. en estab. F02 Liof. en estab. 54 Liof. en estab. F02 Vitrif. en estab. 54 Vitrif. en estab. F02

T 0 antes de liof. o vitrif.

9,73 9,73 9,45 9,45 8,97 8,97 9,01 9,01

T0 despues de liof. o vitrif.

8,8 8,88 7,83 7,82 8,15 8,15 4,76 4,58

T 1 semana

8,8 8,88 7,84 7,83 / / / /

T 1 meses

/ / / / 7,58 7,87 5,56 5,63

T 3 meses

8,76 8,66 7,78 7,18 / / / /

Tabla 19. Estudio de estabilidad de dieciocho meses, enfermedad de MAREK, vitrificado segun la presente divulgacion

Tltulo en log10PFU/ml

091023-1 S32 50 %/50 % de PA 091023-4 S32 1/3-2/3 PA 091126-8 S32+Sac 30 %/70 % de PA

T 0

4,75 4,65 4,88

T 6 meses

5,11 5,07 5,25

T 12 meses

4,05 3,96 4,37

T 18 meses

4,17 4,05 ???

10

[0155] Tambien se vitrificaron satisfactoriamente enfermedad infecciosa de la bolsa (coronavirus), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), polipeptido KSAC de Leishmania y celulas de fibroblasto embrionarias de pollo (CEF) segun el metodo de la presente divulgacion.

15 Ejemplo 4: Vacunas de prueba en perros

[0156] Las vacunas vitrificadas descritas en el Ejemplo 1 se administran a animales despues de la rehidratacion en agua inyectable esteril. Se asignan aleatoriamente cuatro perros libres de patogenos especlficos (SPF) de edades 3 a 5 meses de edad y 4 perros convencionales de edad 3 a 5 meses de edad a 4 grupos de dos

20 animales, en los que cada grupo tuvo un perro SPF y un perro convencional. Para cada grupo, se inmunizan dos perros por via subcutanea en el dla 0 con una dosis doble (2 ml) de su vacuna vitrificada/estabilizada correspondiente. En el dla 14, los perros se inmunizan por via subcutanea con una dosis unica (1 ml) de la misma vacuna estabilizada. Se observan reacciones locales inmediatas y reacciones generales inmediatas, temperaturas rectales, reacciones locales, reacciones generales y slntomas cllnicos. No se observa reaccion local o general tras la administracion. Por 25 tanto, la seguridad de las vacunas vitrificadas/estabilizadas parece ser alta.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un proceso de vitrificacion de material biologico que comprende las etapas de formular una preparacion biologica llquida, someter la preparacion a cambios controlados en la presion y temperatura para reducir el contenido

   5 de humedad de la formulacion a menos de aproximadamente el 5 % en peso, vitrificando as! el material biologico; en el que el proceso comprende ademas las etapas de:

   (a) anadir a la preparacion llquida componentes biologicos activos, estabilizadores, que reducen o eliminan el dano inducido sometiendo los componentes biologicos a medios de preservacion criogenica, que incluyen

   10 granulacion en perlas, vitrificacion y liofilizacion, y opcionalmente anadir uno o mas adyuvantes;

   (b) llenar viales con la preparacion biologica de la etapa (a);

   (c) cargar viales en recipiente de temperatura controlada, en el que la temperatura es entre -15 °C y 10 °C, particularmente entre -10 °C y 5 °C, e incluso mas particularmente aproximadamente 5 °C;

   (d) reducir la presion del aire del recipiente de temperatura controlada hasta que se obtiene una presion dentro 15 del intervalo de 15-30 mbar;

   (e) mantener la presion obtenida durante la etapa (d) durante entre 5 y 20 minutos, particularmente entre 10 y 15 minutos, para permitir que la temperatura del producto se estabilice y para permitir que los gases volatiles, que incluyen carbonatos, sean liberados de la preparacion biologica, en el que la temperatura del recipiente sigue a aproximadamente 4 °C a aproximadamente 6 °C, o aproximadamente 5 °C durante esta etapa;

   20 (f) disminuir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mbar, o

   aproximadamente 5 mbar, durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 minutos;

   (g) mantener la presion de la etapa (f) durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos, que permite que la preparacion biologica llegue a concentrarse mas;

   (h) aumentar la temperatura del recipiente de temperatura negativa a positiva (entre aproximadamente 30 °C y 25 aproximadamente 50 °C) durante el transcurso de entre 45 y 85 minutos, o aproximadamente 60 minutos, y

   mantener la presion constante hasta que llegue a aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, o aproximadamente 15 °C;

   (i) reducir la presion del aire del recipiente a aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4 mbar, o aproximadamente 3 mbar, para acelerar la concentration, y hasta que la temperatura del recipiente alcance y

   30 mantenga aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 90 minutos, o 60 minutos;

   (j) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 4,0 mbar, o aproximadamente 1 mbar, y mantener la presion constante hasta que se haya completado la espumacion;

   (k) reducir adicionalmente la presion a entre aproximadamente 5 pbar y aproximadamente 100 pbar, o 35 aproximadamente 25 pbar, mientras que se mantiene la temperatura a aproximadamente 30 °C durante

   aproximadamente 400 a aproximadamente 2400 o mas minutos, hasta que se obtiene la humedad deseada de entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 15 %, o aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 4 %;

   (l) tapar los viales mientras estan en el recipiente del liofilizador, completandose as! el metodo de vitrificacion.

   40
2. 2. El proceso de la reivindicacion 1, en el que el biologico activo es un inmunogen, un polipeptido, un nucleotido, un virus vivo, bacterias vivas, un protista vivo, o una subunidad que se origina de una enfermedad o patogeno causante de trastorno.

   45 3. El proceso de la reivindicacion 2, en el que el biologico activo es un virus atenuado vivo.
3. 4. El proceso de la reivindicacion 3, en el que el virus es virus del moquillo canino (CDV), virus paragripal

   tipo 2 canino (Pl2), o combinaciones de los mismos.

   50 5. El proceso de la reivindicacion 3 en el que el virus atenuado es viruela del canario, virus de la

   enfermedad de Marek, virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, virus del Nilo occidental (WNV) o virus de la leucemia felina (FeLV).
4. 6. El proceso de la reivindicacion 2, en el que la bacteria es avibacterium.

   55
5. 7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la preparacion contiene al menos un adyuvante.
6. 8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material biologico vitrificado

   es estable a 4 °C durante al menos un ano.
7. 9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material biologico vitrificado

   es estable a -20 °C y -80 °C durante al menos un ano.