CN110734844B - 毛细管辅助玻璃化方法和装置 - Google Patents

毛细管辅助玻璃化方法和装置 Download PDF

Info

Publication number
CN110734844B
CN110734844B CN201911132466.6A CN201911132466A CN110734844B CN 110734844 B CN110734844 B CN 110734844B CN 201911132466 A CN201911132466 A CN 201911132466A CN 110734844 B CN110734844 B CN 110734844B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitrification
capillary
mixture
opening
drying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911132466.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110734844A (zh
Inventor
P·S·莫汉蒂
N·查克拉伯蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Upkara Inc
Original Assignee
Upkara Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upkara Inc filed Critical Upkara Inc
Priority to CN201911132466.6A priority Critical patent/CN110734844B/zh
Publication of CN110734844A publication Critical patent/CN110734844A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110734844B publication Critical patent/CN110734844B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/14—Drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
    • A01N1/0252—Temperature controlling refrigerating apparatus, i.e. devices used to actively control the temperature of a designated internal volume, e.g. refrigerators, freeze-drying apparatus or liquid nitrogen baths
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明的发明名称为毛细管辅助玻璃化方法和装置。公开了用于生物材料的非低温玻璃化的装置和方法，其包括提供一个或多个毛细管通道的步骤，该毛细管通道的第一开口可操作地与由生物材料和玻璃化剂制成的含有水分的玻璃化混合物接触。毛细管通过毛细作用吸收并且传输水分至第二开口，并且水分随后蒸发到周围低湿度气氛直到玻璃化混合物进入到玻璃化状态。

Description

毛细管辅助玻璃化方法和装置
本申请是分案申请，原申请的申请日为2015年6月9日、申请号为201580042589.4、发明名称为“毛细管辅助玻璃化方法和装置”。
相关申请的交叉引用
本申请依赖于2014年6月9日提交的美国临时申请号：62/009,562并且要求其优先权，通过引用其全部内容并入了本文。
技术领域
本发明的一个方面涉及生物材料的非低温玻璃化，具体地涉及通过毛细管辅助快速干燥在玻璃化培养基(介质，medium)中玻璃化的生物材料。
背景技术
玻璃化是从液态直接转变为无定形玻璃态的过程并且通常用于通过以高冷却速率将生物材料冷却至低温来保存它们。在低温下，玻璃化技术避免已知在使用较慢冷却速率的常规深低温保存期间形成的冰晶的损坏作用。然而，为了避免在冷却期间的冰核形成，需要极高和潜在毒性浓度(6–8M)的冷冻保护剂(CPA)。最常用的CPA是二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇(EG)和1,2-丙二醇(PROH)。结果，需要多个步骤和复杂的精巧方案来将CPA负载到细胞和从细胞卸载。因此，多年来一直在寻求实现玻璃化而不需要在非低温下将生物制品暴露于高浓度的CPA的可选途径。
已知的是，为了在较低的CPA浓度下实现低温玻璃化，需要超快速的传热速率。通过减小样品体积和/或通过增加冷却速率可以增加传热速率。已经利用了许多技术以增加冷却速率——诸如采用细吸管(straw)或超薄膜来最小化待玻璃化的体积。2013年6月20日公开的专利申请US2013/0157250A1公开了采用细吸管以低CPA浓度低温玻璃化人精子的方法。最近，利用石英晶体(QC)毛细管的高导热性，2013年10月3日公开的N.Chakraborty为共同发明人的专利申请US2013/0260452A公开了以超快冷却速率在低CPA浓度培养基中玻璃化哺乳动物细胞的方法。
在环境温度下的无水玻璃化也可以是用于保存生物材料的可选策略。在自然界中，各种各样的生物体可以在极端脱水中存活，该极端脱水在许多情况下与细胞内空间中大量的(多达其干重的20％)玻璃形成糖诸如海藻糖和蔗糖的累积相关。这种“玻璃形成”糖需要存在于质膜的两侧上以提供防止干化的损坏作用的保护。干化技术显著地限制或抑制玻璃状基质中材料的生化过程。尽管通过无水玻璃化成功玻璃化许多生物材料诸如蛋白质，但更广泛地应用至细胞材料仍然需要增加细胞的干化耐受性。
增强干化耐受性的方法包括利用含有海藻糖、甘油和蔗糖的改进的玻璃化培养基。虽然用保护剂负载细胞的改进的方法是有帮助的，但是对开发技术以便在干化期间最小化细胞损伤存在进一步的需要。损伤和降解可能源自在干燥处理期间细胞一般对长期暴露于渗透胁迫(osmotic stress)的高敏感性。渗透胁迫可以在相对高的水分含量下甚至在保护性糖如海藻糖的存在下导致细胞死亡。
使细胞干化的最常用的途径包括在具有悬浮细胞的固着液滴中干燥。然而，使用固着液滴的蒸发干燥的干化是固有缓慢的并且本质上不均匀的。当细胞在玻璃形成溶液中干化时玻璃状表层在样品的液/气界面处形成。该玻璃状表层减慢并且最终防止样品进一步干化超过一定的干燥水平并且引起水含量横跨样品的显著的空间不均匀性。结果，在玻璃状表层下面的部分干化样品中捕获的细胞可能不玻璃化而是由于高分子迁移率而降解。
N.Chakraborty为共同发明人的美国专利号7,883,664公开了通过采用微波干燥增强干化率的方法。进一步地，N.Chakraborty为共同发明人的美国专利号8,349,252公开了用于通过微波干燥玻璃化的包括海藻糖的玻璃化组合物。然而，因为生物材料的温度连续地增加至不安全水平并且需要复杂的过程控制，所以该方法不能实现连续干燥。Chakraborty等人也已经采用旋转干燥技术以产生超薄膜并且在海藻糖培养基中成功地玻璃化仓鼠卵巢细胞。然而，该途径仍然遭受不能横跨整个样品表面均匀地进行干化的限制。进一步地，膜必须是超薄的以成功玻璃化。
开发横跨样品实现非常低且均匀的最终水分水平的快速且实用的干化技术可以克服无水玻璃化技术的缺点。由于当玻璃化溶液在细胞外空间中浓缩时遇到的累积化学应力导致的生物材料的降解，干燥保存在长期存储方面遭受主要限制。这在细胞和玻璃化溶液可以达到合适的低水分含量以变成玻璃状之前导致不可逆的细胞损坏。因此，存在对于通过快速干燥玻璃化生物材料同时保持材料生存力的改进的玻璃化培养基的需要。具有改进的细胞生存力的快速干化方法将极大地促进在非低温下生物材料的长期存储并且克服与低温玻璃化和存储技术相关联的挑战。
发明内容
提供以下发明内容以促进理解本发明特有的一些创新特征并且以下发明内容不旨在是充分描述。通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为整体可以获得对本发明的各个方面的充分理解。
通过在至少一个实施方式中提供用于在生物材料的非低温玻璃化期间快速并且均匀的水分去除的方法，本发明的实施方式解决了现有技术的一个或多个问题。
在另一个实施方式中，提供在快速干燥期间保存生物材料的结构完整性(生理的和/或分子的)的优选的玻璃化组合物。所述玻璃化组合物包括海藻糖、甘油和含有一种或多种大有机离子诸如胆碱和甜菜碱(betine)的离子缓冲液。
在又另一个实施方式中，提供非低温玻璃化装置。该玻璃化装置包括提供具有含有多个毛细管通道的壁和需要量的所述生物材料和玻璃化培养基——其与毛细管通道的第一开口可操作地接触——的贮器，并且提供与毛细管通道的第二开口以及与外部环境可操作地连通的壳体(enclosure)，其中可以控制壳体内的压力、温度和湿度。
在又另一个进一步的实施方式中，提供用于所述玻璃化生物材料的玻璃化和长期存储方案。所述方案包括将需要量的所述生物材料与玻璃化培养基放置在包括多个所述毛细管通道的贮器中，采用本公开内容的玻璃化方法，将具有玻璃化生物材料的所述贮器包装在保护壳体中并且在-196℃至60℃温度之间存储所述包装以便长期存储。
附图说明
附图不必要按比例绘制；一些特征可以被放大或缩小以显示特定组件的细节。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性的基础。从具体实施方式和附图将更全面地理解示例性的方面，其中：
图1是根据至少一种已知技术通过在不渗透性基底上干化的固着液滴玻璃化的示例性示意图；
图2是描述根据本公开内容的至少一个实施方式的毛细管辅助干燥机制的示例性示意图，其中毛细管力与重力相反地起作用并且第二开口与干化环境可操作地连通；
图3是描述根据本公开内容的至少一个实施方式的毛细管辅助干燥机制的示例性示意图，其中毛细管力在与重力相同的方向上起作用并且毛细管通道的第二开口是疏水的并且与干化环境可操作地连通；
图4是描述毛细管辅助干燥机制的示例性示意图，其中毛细管力在与重力相同的方向上起作用并且毛细管通道的第二开口是亲水的并且与干化环境可操作地连通；
图5显示了根据本公开内容的教导的由包括多个毛细管通道的基底支撑的固着液滴的毛细管辅助玻璃化的示例性实施方式；
图6A显示了包括通过在基底中制造孔形成的多个毛细管通道的基底的示例性实施方式；
图6B显示了包括通过编织形成的多个毛细管通道的基底的示例性实施方式；
图7A显示了根据本教导进行的小鼠卵母细胞干化的示例性结果，其中玻璃化培养基缺乏玻璃形成剂海藻糖；
图7B显示了根据本教导进行的小鼠卵母细胞干化的示例性结果，其中玻璃化混合物含有海藻糖、HEPES、胆碱和甜菜碱；
图8A图解了在缺乏玻璃化剂海藻糖的情况下在包括中国仓鼠卵巢细胞的超薄膜的快速干燥期间的冰晶形成；
图8B显示了在包括中国仓鼠卵巢细胞和玻璃化培养基的超薄膜的快速干燥期间的完全玻璃化，该玻璃化培养基含有中国仓鼠卵巢细胞、20mM HEPES、120mM ChCl、1.8M海藻糖、60mM甜菜碱和水；
图9显示了含有中国仓鼠卵巢细胞、1.8M海藻糖和水的玻璃化培养基的玻璃化转变温度；
图10显示了含有中国仓鼠卵巢细胞、20mM HEPES、120mM ChCl、1.8M海藻糖、60mM甜菜碱和水的玻璃化培养基的玻璃化转变温度；
图11表明了与HEPES缓冲液相比大有机离子甜菜碱缓冲液对在常规干燥箱中干化的玻璃化中国仓鼠卵巢细胞的生存力的效果，其中亮斑点对应于活细胞(绿色)并且较暗的灰斑点对应于死细胞(红色)；
图12显示了根据本公开内容的教导的毛细管辅助玻璃化装置的示例性实施方式；
图13显示了根据本公开内容的教导的毛细管辅助玻璃化装置的另一个示例性实施方式，其中在玻璃化混合物内提供内毛细管/芯；
图14显示了根据本公开内容的教导的毛细管辅助玻璃化装置的又另一个示例性实施方式，其中提供具有内腔干燥空间的多个腔和一个公用的盖子；
图15显示了与常规干燥箱干化方法相比当根据本教导干化时中国仓鼠卵巢细胞的细胞膜完整性保留效果，其中过程结束时实现的干燥水平以gH2O/gdw为单位表示并且150是指毛细管干燥甜菜碱缓冲液，154是指甜菜碱缓冲液，并且152(空心圆)是指HEPES-海藻糖缓冲液系统；
图16显示了当使用实施例1的方法干化时实现极低的水分水平同时保留中国仓鼠卵巢细胞的细胞膜完整性的能力，其以扩大比例图解了图15的数据150，其中在过程结束时实现的干燥水平以gH2O/gdw为单位表示；和
图17显示了当根据如本文所述的玻璃化方法干化时胰岛素活性的增强保留，其中在样品的再水化之后通过ELISA测量胰岛素活性，其中170图解了标准品，172图解了在使用1μm胰岛素、100mM海藻糖、5％甘油的样品和25min干化时间的干化之后的结果，其表明极好的活性恢复，174图解了在25min的干化之后的1μm胰岛素，并且176图解了在100mM海藻糖、5％甘油中和0min干化时间的1μm胰岛素。
具体实施方式
根据需要，本文公开了本发明的详细方面；然而，应当理解，公开的方面仅仅是可以以各种和可选的形式体现的本发明的示例。
现在将对构成了实施发明人目前已知的本发明的最佳模式的本发明的示例性的组合物、方面和方法进行详细参考。附图不必须按比例绘制。然而，应当理解，公开的方面仅仅是可以以各种和可选的形式体现的本发明的示例。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制性的，而仅仅作为本发明的任何方面的代表性基础和/或作为教导本领域技术人员以各种方式采用本发明的代表性基础。
还应当理解的是，该发明不限于本文描述的具体的方面和方法，这是因为具体的组件和/或条件当然可以变化。而且，本文使用的术语仅用于描述本发明的具体方面的目的并且不旨在以任何方式为限制性的。
将理解的是，虽然术语“第一”、“第二”、“第三”等可在本文中使用以描述各种要素、组件、区域、层和/或部分，但是这些要素、组件、区域、层和/或部分不应被这些术语限制。这些术语仅用于将一个要素、组件、区域、层或部分与另一个要素、组件、区域、层或部分区分开。因而，以下讨论的“第一要素”、“组件”、“区域”、“层”或“部分”可以被称为第二(或其他)要素、组件、区域、层或部分，而不脱离本文的教导。
本文使用的术语仅仅是出于描述特定的实施方式的目的并且不旨在是限制性的。如本文所使用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”旨在包括复数形式，其包括“至少一个”，除非内容以其他方式清楚地指示。“或者”意思是“和/或”。如本文所使用的，术语“和/或”包括相关所列术语的一个或多个的任意或所有组合。将进一步理解的是，当在本说明书中使用时术语“包括(comprise)”和/或“包括(comprising)”或“包含(include)”和/或“包含(including)”指定存在陈述的特征、区域、整数、步骤、操作、要素和/或组件，但是不排除存在或添加一种或多种其他特征、区域、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其组。术语“或其组合”意思是包括至少一种前述要素的组合。
除非以其他方式限定，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。将进一步理解的是，术语——诸如在常用的字典中定义的那些，应当被解释为具有与它们在相关领域和本公开内容的上下文中的含义一致的含义，并且不会被以理想化的或过度正式的意义解释，除非本文中明确地如此限定。
贯穿本申请，当引用出版物时，这些出版物的公开内容以其全部通过引用并入本申请以更完全地描述本发明所属领域的状态。
本文使用的以下术语或短语具有与至少一个方面有关的以下所列的示例性含义。
“无定形”或“玻璃”是指非结晶材料，其中不存在指0.3或更小的有序参数的原子的位置的长程有序。在玻璃化转变温度Tg下，发生玻璃状固体的固化。在一些方面，玻璃化培养基可以是无定形材料。在其他方面，生物材料可以是无定形材料。
“玻璃化转变温度”意思是高于其材料表现为类似于液体并且低于其材料以类似于固相的方式表现并且进入无定形/玻璃态的温度。这不是温度中的固定点，而是根据所使用的测量的时标(timescale)可变化的。在一些方面中，玻璃态可以指生物组合物在降低至其玻璃化转变温度以下时进入的状态。在其他方面中，玻璃态可以指玻璃化混合物和/或玻璃化剂在降低至其玻璃化转变温度以下时进入的状态。在又其他的方面，玻璃态可以具有晶体的机械刚性，但是分子的随机无序排列具有液体的特征。
“晶体(Crystal)”是指由一个特定的有序几何阵列——周期性重复并被称为晶格或晶胞——组成的三维原子、离子或分子结构。
“结晶(Crystalline)”意思是由在原子水平以有序结构排列的成分组成的物质形式，其与玻璃态或无定形态相反。在结晶温度Tc下，发生结晶固体的固化。
“玻璃化”，如本文所使用的，是将材料转化成无定形材料的过程。无定形固体可以没有任何结晶结构。
“玻璃化混合物”，如本文所使用的，意思是生物材料和含有玻璃化剂和任选的其他材料的玻璃化培养基的多相(heterogeneous)混合物。
“生物材料”，如本文所使用的，是指可以从活的生物体分离或源自活的生物体的材料。生物材料的实例包括，但不限于，蛋白质、细胞、组织、器官、基于细胞的结构或其组合。在一些方面中，生物材料可以指哺乳动物细胞。在其他方面中，生物材料可以指人间充质干细胞、鼠成纤维细胞、血小板、细菌、病毒、哺乳动物细胞膜、脂质体、酶或其组合。在其他方面中，生物材料可以指生殖细胞，其包括精子细胞、精母细胞、卵母细胞、卵子、胚胎、核泡或其组合。在其他方面中，生物材料可以指全血、红细胞、白细胞、血小板、病毒、细菌、藻类、真菌或其组合。
“玻璃化剂”，如本文所使用的，是当玻璃化剂和其他材料(一种或多种)的混合物冷却或干化时形成无定形结构或抑制在其他材料(一种或多种)中晶体形成的材料。玻璃化剂(一种或多种)也可以在脱水(dehydration)期间提供渗透保护或以其他方式使细胞存活。在一些方面中，玻璃化剂(一种或多种)可以是产生用于生物材料存储的合适的无定形结构的任何水溶性溶液。在其他方面中，玻璃化剂可以被吸收在细胞、组织或器官内。
“可存储的或存储”，如本文所使用的，是指生物材料被保存并且保持活的以便以后使用的能力。
“在低温以上”，如本文所使用的，是指在-80℃以上的温度。室温，如本文所使用的，是指在18和37℃之间的温度。
“亲水的”，如本文所使用的，意思是吸引水分子或优先地与水分子缔合。对水具有特定亲和力的亲水材料最大化与水的接触并且与水具有较小的接触角。
“疏水的”，如本文所使用的，意思是缺乏对水的亲和力。疏水的材料自然地排斥水，引起水滴形成，并且与水具有小的接触角。
“毛细管”，如本文所使用的，属于或发生于或好像发生于具有2000μm2或更小的横截面面积的细孔管中。
玻璃化材料通常通过快速冷却液体材料来制备，或者是直接浸入液氮中的小体积的生物材料。冷却降低了材料的分子的迁移率，然后它们可以压紧成更热力学有利的结晶状态。干扰主要成分结晶能力的添加剂可以产生无定形的/玻璃化的材料。在适当的玻璃形成剂的存在下，将生物材料存储在低温以上的玻璃化基质中是可能的，并且通过脱水可以实现玻璃化。
一些动物和许多植物能够完全脱水存活。在干燥状态中存活(失水蛰伏)的这种能力依赖于若干复杂的细胞内生理化学和遗传机制。在这些机制中之一是在干化期间用作保护剂的糖(例如，糖、二糖、寡糖)的细胞内累积，海藻糖是干化耐受性生物体中自然产生的二糖的一个实例。
糖如海藻糖可以以数种不同方式为干化耐受性生物体提供保护。由于海藻糖分子上羟基的独特位置，海藻糖分子可以有效地自折叠蛋白质的表面替代氢束缚的水分子而不改变它的构象几何学和折叠。糖分子也可以通过与脂质双层的磷脂头结合防止在再水化期间细胞质渗漏。而且，许多糖具有高玻璃化转变温度，这允许它们在低温以上或者室温形成低水含量的玻璃。高粘性的‘玻璃状’状态降低了分子迁移率，其又防止导致细胞功能劣化和死亡的降解生物化学反应。
在玻璃形成糖——海藻糖——的存在下通过脱水玻璃化生物材料已被NChakraborty等的Biopreservation and Biobanking,2010,8(2),107-114公开。参考图1，系统10是使生物材料脱水的最常用的途径。固着液滴11被放置在基底12上并且在具有低湿度环境13的壳体16中蒸发干化。在壳体内的湿度、压力和温度可以由控制装置17可操作地控制。然而，使用系统10的蒸发干燥固着液滴的干化是固有缓慢的并且本质上不均匀的。当生物材料在玻璃形成培养基中干化时玻璃状表层15在样品的液/气界面14处形成。该玻璃状表层15减慢并且最终防止使样品进一步干化超过一定的干燥水平并且引起水含量横跨样品的显著的空间不均匀性。结果，在玻璃状表层下面的部分干化样品中捕获的细胞可能不玻璃化而是由于高分子迁移率而降解。
N.Chakraboty为共同发明人的美国专利号7,883,664和美国专利号8,349,252公开了通过采用微波加热增强干化率的方法。然而，因为生物材料的温度连续地增加至不安全水平并且需要复杂的过程控制，该方法不能实现连续干燥。Chakraborty等也已经采用旋转干燥技术以产生超薄膜并且增强干化率。然而，该途径仍遭受图1的系统10的限制，并且干化不能横跨整个样品表面均匀地进行。
鉴于以上描述的限制，本发明的一个方面涉及用于快速并且均匀地使玻璃化混合物干化的方法。本发明的另一个方面的目标是提供有效地进行该方法的装置。本发明的另一个方面提供用于存储玻璃化材料的方案。
参考图2，当均匀线性横截面尺寸(2r，其中r是1/2横截面尺寸)的毛细管24被放置在液体培养基或含有多相混合物的液体(例如多孔培养基)22中时，在毛细管中，液面将升高至由下式给出的高度h；
Figure BDA0002278707950000091
其中，p是液体的密度，σ是表面张力，α是接触角，g是重力，并且在蒸发表面处的压力Po＝液体中的压力Pi。被称为吸力势(suction potential)的负压将存在于毛细管内的液体中。紧靠弯月面26下面，吸力势将相当于液柱高度h。这是重力头平衡最大毛细管驱动力引起流动停止的高度，并且也可以被视为给定毛细管的特征长度。当液体蒸发时，毛细管弯月面26将下降，导致毛细管压力下降或头h下降。液体将流入毛细管以弥补头损失。来自具有总横截面面积A的一个(或多个)毛细管的干燥速率e0依赖于流动通过毛细管的通量密度q，可以表示为：
e0A＝qπr2 (方程式2)
如果通量密度q不能跟上干燥速率，则空气越来越深地进入到毛细管，并且减小毛细管压力以及干燥速率。进一步地，在高蒸发速率下通过细毛细管，液体流动可以包括具有与流动速度成比例的压头损失(head loss)的显著的粘性耗散。
因而，毛细管辅助蒸发速率受到气氛需求(atmospheric demand)(在蒸发表面处空气/气体的湿度、温度和速度)以及(i)生成驱动毛细管力的毛细管通道的特性、(ii)液体弯月面深度和(iii)流动通过毛细管的粘性阻力的影响。因此，毛细管性能、传输过程和边界条件之间的复杂的且高度动力学的相互作用导致广泛的蒸发行为。对于快速干燥，关键参数是：(1)在蒸发表面处支持形成并且维持液体网络的条件和(2)促进引起充分流动以在蒸发表面处供应水的毛细管压力形成的特性。在图2的方面20中，朝向表面的毛细管压力梯度与重力和粘性耗散相反，然而毛细管压力梯度由更小的毛细管直径以及更小的接触角或亲水的毛细管材料支持。应当注意，毛细管直径越小，粘性耗散越高。为了实现最佳的蒸发速率，接触角或可湿性、毛细管通道的长度和直径必须仔细平衡。
参考图3，方面30提供毛细管干燥方法，其中干燥在包括毛细管通道34的载体上进行。因而，重力变为加和的，而不是与毛细管压力梯度相反。结果，毛细管直径可以被扩大，这减小控制蒸发速率的粘性耗散。进一步地，液体/蒸汽弯月面一直保留在毛细管外，防止空气进入到毛细管，因而使能够稳定干燥直到完全干化。如前面所提到的，较小的接触角或亲水毛细管材料有利于较高的毛细管头并且是优选的。然而，完全亲水的毛细管材料对于最佳干燥不是优选的。参考图4，在方面40中，亲水毛细管材料将促进水在尖端46上扩展并且形成水分边界层，减小蒸发速率。相反，图3中方面30的具有疏水尖端36的亲水毛细管34提供用于干燥的改进的特性。然而，显著的干燥仍然可以在不存在这种组合的情况下实现并且不限制本公开内容的范围。
参考方程式1，基于在界面两侧上的压力相等的假设，即Po＝Pi，估算毛细管高度。然而，在蒸发界面处减小的压力，即Po<Pi，可以进一步辅助毛细管力并且改进干燥速率以及干燥水平。当水分水平很低并且毛细管力不能单独在蒸发表面处保留液体网络时，这对于过程的最后是特别重要的。
参考图5，图解了用于毛细管辅助干燥的有利条件，方面50公开了用于玻璃化生物材料的方法，该方法包括：提供形成毛细管板/膜53的多个毛细管通道，该毛细管通道具有第一开口54和第二开口56；将玻璃化混合物52放置在第一开口54上，进一步地将第二开口56和玻璃化混合物的表面59暴露于具有比玻璃化混合物更低湿度的周围气氛58；并且通过毛细作用将所述玻璃化混合物干化直到所述玻璃化混合物进入到玻璃态。通过控制机构57控制壳体55内的化学、湿度、压力和温度。
控制机构57仅仅为了说明的目的而被简化并且可以具有多个系统和机构以达到用于干化和玻璃化的最有利的条件。在一些方面中，类似于53的第二毛细管板/膜被直接放置在玻璃化混合物52之上以在玻璃化混合物52的顶表面处从本公开内容的毛细管辅助干燥方法获益。然而，重力将不利于在顶部上的毛细管力。在一些方面中，低湿度气体(小于30％的相对湿度)的流动被提供横跨毛细管板/膜的第二开口56以便增强毛细管效果。惰性或相对惰性的气体诸如氮气、氩气、氙气或其他气体可以被用作低湿度气体。在一些方面中，在壳体55内保持减小的压力或真空。在一些方面中，横跨第二开口56提供吸入力/压力以实现增加的干化速度。应注意，保持低湿度环境(任选地5％相对湿度或更小)是必要的，以防止在已经进行干化之后再水化。
参考图6A，在方面60中，毛细管板/膜包括具有形成多个毛细管通道的圆柱孔64的基底62。必须注意直的、基本上平行的通道仅仅为了说明的目的而显示，实际使用的通道可以是适合于该目的的任意横截面形状和构造，其说明性地为椭圆形、圆形、多边形、不规则形状或其它形状。为了图解的目的，图6B显示了方面65，其中通过编织线67形成正方形横截面通道69。毛细管干燥板/膜是足够薄且坚固的以便提供低粘性耗散但在干化过程期间还包含生物材料。
毛细管通道具有任选地由形成通道的基底的厚度或由一个或多个单独的通道本身限定的长度。毛细管通道长度任选地是一毫米或更小，但是不限于该规格。任选地，毛细管通道长度是在0.1微米至1000微米之间，或者其间的任何值或范围。任选地，毛细管通道长度是5-100微米，任选地1-200微米，任选地1-100微米。毛细管通道长度任选地是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微米。在一些方面中，毛细管通道的长度遍及多个毛细管通道变化，任选地不均匀地变化。
毛细管通道(一个或多个)的横截面面积将是2000μm2或更小。任选地，横截面面积是从0.01μm2至2000μm2，任选地100μm2至2000μm2，或在其间的任何值或范围。任选地，毛细管通道(一个或多个)的横截面面积是100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μm2或更小。
任选地，本发明的毛细管通道(一个或多个)将具有线性横截面尺寸，任选地0.1-10微米的直径，或在其间的任何值或范围。对于横截面不是圆形的通道，这将对应于0.01平方微米至100平方微米的横截面面积。
毛细管干燥板/膜可以由对生物材料无毒并且不与玻璃化培养基发生化学或物理反应的材料制成。这可以是合适的聚合物、金属、陶瓷、玻璃或其组合。惰性聚合物或其复合材料是优选的。在一些方面中，毛细管膜由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二酯)等等形成。在本文提供的装置和过程中适合作为表面的含有毛细管通道的膜的说明性实例包括亲水的过滤膜，诸如由EMD Millipore,Bellerica,MA销售的那些。毛细管干燥板/膜任选地由与生物材料或玻璃化剂非反应性的材料或系统中使用的其他试剂/材料形成。非反应性的毛细管干燥板/膜将基本上不结合、改变或以其他方式产生与玻璃化培养基(例如生物样品)的组分的化学或物理缔合。毛细管干燥板/膜任选地不被衍生化(derivitized)。任选地，毛细管通道可以通过PDMS形成技术、激光钻孔或本领域已知的其他孔形成技术在所需材料和厚度的基底中形成。
当混合物干化时在玻璃化混合物中存在适当的玻璃化剂是关键的。自身快速干化方法不保证细胞或其他玻璃化生物材料的生存力。需要形成玻璃或者抑制在其他材料中形成晶体的玻璃化材料/剂。玻璃化剂(一种或多种)也可以提供渗透保护或者以其他方式使细胞能够在脱水期间生存。参考图7A，当在不存在任何玻璃形成玻璃化剂的情况下采用当前公开内容的方法干化样品时，在样品中可以看见表示结晶以及受损/损坏的卵母细胞70的不需要的且有害的树枝状结构72。在实施例2中提供该实验方案的细节。
玻璃化剂的说明性的实例包括但不限于二甲亚砜、甘油、糖、多元醇、甲胺、甜菜碱、抗冻蛋白、合成的抗成核剂、聚乙烯醇、环己三醇、环己二醇、无机盐、有机盐、离子液体或其组合。玻璃化培养基任选地含有1、2、3、4或更多种玻璃化剂。
玻璃化培养基包括依赖于玻璃化剂的特性(identity)的浓度的玻璃化剂。任选地，玻璃化剂的浓度是处于将低于对被玻璃化的生物样品有毒的浓度，其中有毒的是使得随后的样品使用中不能实现功能或生物生存力。玻璃化剂的浓度任选地是500M至6M，或者其间的任何值或范围。对于玻璃化剂海藻糖，浓度任选地是从1M至6M。任选地，当组合时所有玻璃化剂的总浓度任选地是从1M至6M。
玻璃化培养基任选地包括水或其他溶剂、缓冲剂、一种或多种盐或其他组分。缓冲剂是在25℃下具有6至8.5的pKa的任何试剂。缓冲剂的说明性实例包括HEPES、TRIS、PIPES、MOPS等等。缓冲剂以适合将玻璃化培养基的pH稳定至所需水平的浓度提供。
参考图7B，当利用含有海藻糖(1.8M)、甘油、胆碱和甜菜碱(60mM)的玻璃化混合物采用本公开内容的方法干化小鼠卵母细胞时实现完全玻璃化。卵母细胞75的完整性是明显的并且表示本文公开的毛细管77辅助玻璃化方法的益处。在图8A和8B中进一步图解了适当的玻璃化培养基的重要性。甚至在超薄膜(旋转干燥诸如在如图1中图解的现有方法上使用的)中可能的快速干化速率下不能保证均匀玻璃化，并且图8A显示在包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞但没有玻璃形成剂的玻璃化混合物中形成冰晶84。相反，如图8B中所示，包括海藻糖、HEPES、ChCl和甜菜碱的玻璃化培养基在超薄膜(旋转干燥)构造下产生均匀玻璃化86生物材料。与旋转干燥相比，本文公开的毛细管辅助干化方法不限制生物材料混合物符合超薄膜形式以实现3gH2O/gdw/min-2gH2O/gdw/min的非常快速的干化速率。
海藻糖——玻璃形成糖——已被在无水玻璃化中采用并且可以以数种方式提供干化耐受性。参考图9，差式扫描量热法显示水中玻璃化的1.8M海藻糖具有-15.43℃的玻璃化转变温度90。为了在水凝固点0℃以上实现玻璃化，该浓度是不理想的并且需要可能损坏生物材料的更高的浓度(6–8M)。参考图10，包括1.8M海藻糖、20mM HEPES、120mM ChCl和60mM甜菜碱的玻璃化的混合物显示+9℃的玻璃化转变温度100。缓冲剂的影响引起进一步的注意。如图11中所示，与使用也含有大有机离子的HEPES 112相比，使用含有大有机离子的甜菜碱缓冲液显示了在常规干燥箱中40分钟的干化之后对活/死的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的计数110的显著影响。板114和116在55分钟之后在生和死计数方面进一步强调了这一点。
用于本文公开的毛细管辅助玻璃化方法的示例性玻璃化培养基可以包括海藻糖、和含有大有机离子(>120kDa)诸如胆碱或甜菜碱或HEPES的一种或多种缓冲剂以及含有小离子诸如K或Na或Cl的缓冲剂(一种或多种)。在图15和16中进一步图解了在当前公开内容的快速干化方法——其中可以瞬时实现超低水分水平(例如0.1gH2O/gdw或更少)——下该玻璃化培养基组合物对细胞膜完整性的影响，其使用包括海藻糖(保存/稳定大生物分子)、甘油(保存/稳定小生物分子并且防止在胞间隙的分子迁移率)和氯化胆碱缓冲液的培养基。该示例性组合物不限制使用对于本文公开的方法的可选制剂的范围。
毛细管辅助玻璃化方法可以在从-80℃至+60℃的温度下进行。温度范围是任选的，其中样品中水分子的迁移率较高并且温度对生物材料的健康和生存力不是有害的。这将随材料以及玻璃化培养基的组成而变化。在一些方面中，玻璃化温度是0.1℃至40℃。任选地，玻璃化温度是4℃至26℃。任选地，玻璃化温度是25℃。
毛细管辅助玻璃化方法可以在干燥气氛或环境中进行。干燥环境是具有低于饱和的湿度水平的环境。在一些方面中，环境的湿度水平，诸如毛细管第二侧上的环境，是30％相对湿度或更小，任选地20％或更小，任选地10％或更小，任选地5％或更小。干燥环境任选地具有在1％和30％之间或其间的任何值或范围的湿度，任选地在1％和5％之间的湿度。
毛细管辅助玻璃化方法可以在低压环境(小于1atm(760mmHg))中进行。低压环境将对玻璃化速率具有有利影响。环境压力任选地是100mmHg或0.1atm。任选地，环境压力是从10mmHg至760mmHg，或其间的任何值或范围。任选地，环境压力是从10mmHg至200mmHg。
可以进行毛细管辅助玻璃化方法持续干化时间。干化时间是足以促进合适的干燥以将玻璃化培养基玻璃化的时间。干化时间任选地是1秒至1小时。任选地，干化时间是1秒至50min，任选地5秒至60min。干化时间可以依赖于样品类型或物理特性和毛细管通道的细节而变化。
在图17中进一步图解了本文公开的毛细管辅助玻璃化方法的益处。与存在玻璃化剂的情况下干化，172相比，当在不存在玻璃化剂的情况下同样地干化，174时，胰岛素样品出现显著的活性损失。进一步地，存在玻璃化剂本身而没有干化不足以保留胰岛素活性，176。一般地，在本发明公开的毛细管辅助玻璃化方法之后可以保存显著水平的胰岛素活性。在本发明中公开的毛细管辅助玻璃化方法之后，可以稳定各种蛋白质材料。应当领会，这些玻璃化生物材料可以被密封在保护包装中，用于运输和长期存储。进一步地，一些玻璃化生物样品可以被存储在环境温度而不需要冷链。在再水化化可以利用它们。实例包括但不限于胰岛素、白细胞介素1、白细胞介素2、破伤风和肝炎疫苗等。
参考图12，方面120图解了采用如本文提供的毛细管辅助玻璃化方法的益处的示例性非低温生物材料玻璃化装置，其包括：本公开内容的毛细管干燥板/膜构成的贮器126，其具有在贮器内的第一毛细管开口和在贮器外的第二毛细管开口；由本公开内容的毛细管干燥板/膜构成的可去除的盖子127以在贮器内填充必要量的所述玻璃化混合物125，其中所述玻璃化混合物与毛细管通道的第一开口可操作地连接；和与毛细管通道的第二开口以及与外部环境可操作地气体连通的壳体121，其中壳体内的压力、温度和湿度可以被可操作地控制。通过放置穿孔的隔板124，贮器126的外表面保持与壳体121边界的间隙128以促进气体流动和干化作用。在1245处显示了隔板124的放大的视图。
方面120的壳体对水分和气体是不可渗透的并且具有可密封的入口(一个或多个)122和出口(一个或多个)123。可密封的入口(一个或多个)和出口(一个或多个)能够使气体流过贮器的外表面或横跨贮器的外表面保持减小的压力以便增强干化作用。可以存在单个或多个入口或出口。密封机构可以是基于机械或粘合剂或热固结(热密封)。通过将入口(一个或多个)和出口(一个或多个)连接至可以控制壳体内湿度、压力和温度的适当装置可以原位进行毛细管辅助玻璃化方法。由于从所有面与玻璃化混合物的增强的毛细管接触面积，实现非常快速的干化。这也使能够玻璃化更大体积的玻璃化混合物，这是现有方法和系统的严重限制。一般地，样品的厚度将是1厘米或更小。任选地，厚度将是大约1毫米或更小。应当理解，方面120的厚度规格是沿着图片的垂直轴并且可以在三维结构中互换。可以横跨大面积进行该方法。
在完成干化过程至需要的湿度水平之后，入口和出口被密封以防止玻璃化材料的再水化。可选地，可以利用贮器以在采用此处公开的方法的单独的室中使玻璃化混合物干化并且然后密封在壳体121中。装置120可以被配置成可穿戴的装置，任选地其中沿着密封线122和123，顶盖127和外壳体可以被去除并且粘附地附着至应用表面。许多可能的构造和应用是可能的。可以在美国专利申请公开号2011/0054285A1中找到可穿戴的装置的说明性实例。
参考图13，在另一个方面130中，提供对该装置的进一步增强，其中提供与玻璃化混合物和壳体环境可操作地连通的多个毛细管/芯139以便增强干化作用。另外的特征将使能够干化更厚体积的玻璃化混合物。必须进行本公开内容的毛细管通道和毛细管139之间的区分。毛细管装置139可以是包括如1395中所示的贮器136的特性的中空圆筒。因此，管可以被设想为毛细管通道的基本上管状的基底，其延伸到样品中以便有效地增加样品外部环境的表面积。与玻璃化混合物接触的管的末端被任选地封闭。可选地，也可以利用包括毛细管通道的芯，然而，管是优选的。关于方面120的大部分的讨论也适用于方面130并且被重复。
参考图14，提供另外的方面140，其包括由具有内腔干燥空间的多个腔144和一个公用的盖子142形成的贮器，以便增强干化作用。可选地，每个腔也可以具有单独的盖子。规格141和145构成外壳体并且143是包括样品的玻璃化混合物。虽然在图中没有显示装置的入口和出口，但是装置根据本公开内容的教导运行，并且关于方面120和130的讨论适用于该方面。进一步地，方面130的毛细管/芯也可以被部署在该方面中。方面120、130和140中的装置是足够柔性的并且可以重新配置以成为可穿戴的装置。
在低温以上储存期间，生物材料在玻璃化状态下可以保持存活的持续时间可以随样品材料而变化。在一些方面中，在低温以上存储持续2-20天时生物材料可以保持存活。在其他方面中，在低温以上存储持续10周时生物材料可以保持存活。在其他方面中，在低温以上存储长达一年时生物材料可以保持存活。在其他方面中，在低温以上存储长达10年时生物材料可以保持存活。
可选地，在采用本公开内容的教导和装置在低温以上玻璃化之后，玻璃化生物材料可以在低温下存储非常长的时间段。对于许多生物材料，这是避免在低温下直接玻璃化期间通常发生的冷冻损伤的优选的途径。在一个方面中，优选的途径是为了利用低浓度的玻璃化剂(例如<2M海藻糖)在室温下玻璃化生物材料并且然后立即在低温下存储。因此，所述装置任选地由根据当前公开内容的教导玻璃化之后可在-196℃至60℃之间的温度存储的材料制成。
在图15和16中图解了公开的方法和装置的进一步的益处。参考图15，在不同的水分水平比较了干化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞膜完整性。空心圆152表示当在常规干燥箱中干化包括1.8M海藻糖与HEPES缓冲液的玻璃化混合物时的膜完整性vs水分水平。可见，到水分水平达到1gH2O/gdw时细胞膜被完全破坏。当在干燥箱干化过程中利用甜菜碱缓冲液时，由闭环154表示的膜完整性与HEPES缓冲液相比得到改进，然而当水分达到1gH2O/gdw水平时膜几乎被破坏。本文公开的毛细管辅助快速干化方法的益处由闭环150图解，其显示了即使当水分水平已经达到在常规干燥箱干化过程中不可行的极低水平时，膜完整性也被很大程度地保持。图16中进一步图解了通过该公开的方法可实现的水分水平。虽然甜菜碱缓冲液有助于保持膜完整性，但是当前公开内容的快速干化过程甚至在它们实现之前使生物材料玻璃化，其很大程度上负责保持它们的完整性。
实施例
1.使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的实验
细胞培养：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞从American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)获得，并且在补加有10％胎牛血清(Atlanta Biologicals,Norcross,GA)和2％青霉素-链霉素(10U/mL青霉素G和10μg/mL链霉素硫酸盐，Invitrogen,Carlsbad,CA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。将培养物在37℃下保持在25-cm2 T-烧瓶(Corning Incorporated,NY)中并且用10％CO2–90％空气平衡。在细胞培养至70％的所需的汇合(confluency)之后，细胞被胰蛋白酶化、沉淀并且再分散以产生DMEM中1×105个细胞/mL的浓度。
装置装配：产生PDMS管状物(cast)，其具有0.25英寸×0.38英寸的尺寸，具有中心圆腔(0.05英寸)，并且具有5μm的孔径和100μm的厚度的聚丙烯膜(从SterlitechCorporation,Kent,WA获得)被放置在其上。这些孔提供使细胞干化的所需的毛细管作用。该装配被用作毛细管装置。将整个装置容纳在含有低水分气氛(～2％RH)的定制的壳体(聚苯乙烯，6×8×6英寸)内并且用医用级氮气吹扫以防止通过样品的开放表面的水分提取(pickup)。将附接至计算机控制的微泵(Dolomite,Charlestown,MA)的盖子放置在腔上以促进通过毛细管通道从样品快速去除水分。
干化：在将以1x105个细胞/mL的浓度悬浮的20μL细胞样品放置在毛细管基底之上后，启动微泵(1mL/min)以使样品干化。生物样品的干化在5秒内发生。使用没有玻璃形成剂——诸如海藻糖——的细胞样品以及使用包括HEPES：20mM、ChCl：120mM、海藻糖：1.8M、甜菜碱：60mM的玻璃化培养基——并且使用钾盐将pH调节至7.2(SAMADHI)——进行干化实验。在含有低水分的常规干燥箱中在石英基底上没有采用毛细管装置的情况下也进行比较实验并且用医用级氮气吹扫。在干化之后，去除细胞样品并且评估膜完整性。
残余水分的定量：使用高精度分析天平(Metler Toledo XP UltraMicrobalance,Columbus,OH)进行样品的水含量的整体重量分析(bulk gravimetricanalysis)。初始和最终样品重量被测量并且用于计算水分含量。通过在低于海藻糖(～90℃)的玻璃化转变温度的温度下在真空烘箱中烘烤8h确定样品的干重。
生存力评估：使用Syto-13/溴化乙锭膜完整性试验(Molecular Probes,Eugene,OR)确定膜完整性。通过添加10μL的1mg/mL Syto-13溶液(aq.)和5μL的1.0mg/mL溶液溴化乙啶溶液(aq.)至8mL没有酚红或血清的DMEM(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)制备用于Syto-13/溴化乙啶染色的母液。在再水化之后，500μL的Syto-13/溴化乙啶溶液被添加至附着在盖玻片上的细胞，并且样品在37℃下孵化5min。然后使用利用FITC和PI滤光器的倒置显微镜(Carl Zeiss Biosystems,Oberkochen,Germany)使这些样品成像。在用该技术再水化之后通过计算在载玻片上不同位置处拍摄的七个有代表性的图像中活的(绿色)和死亡的(红色)细胞立即确定细胞生存力。说明性的结果提供于图11中。
2.使用小鼠卵母细胞的实验：
动物：六周龄B6D2F1雌性小鼠购自Charles River Laboratories(Boston,MA,USA)。所有动物实验在动物护理和使用委员会的批准下进行。
卵母细胞的提取：用7.5IU的孕马血清促性腺激素(Sigma–Aldrich,St.Louis,MO,USA)和7.5IU的人绒毛膜促性腺激素(Sigma–Aldrich)间隔48h通过腹膜内注射给药使6周龄B6D2F1雌性小鼠超排卵。人绒毛膜促性腺激素注射后的14小时，用阿佛丁(Sigma–Aldrich)将雌性小鼠麻醉，然后通过颈脱位法处死并且移出它们的输卵管。通过用27号针刺穿输卵管从每个输卵管的壶腹区域释放卵丘-卵母细胞复合体。通过暴露于透明质酸酶(80IU/ml)(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)3min去除卵丘细胞并且用具有10％胎牛血清(FBS；Gibco,Carlsbad,CA,USA)的人输卵管液(HTF)培养基(Irvine Scientific)洗涤三次。将卵母细胞转移并且在含有10％FBS的HTF培养基(Quinn等，1995)中在37℃下和5％CO2的空气中培养直到它们通过干化被玻璃化。
干化：采用以上实施例1中描述的毛细管装置并且按照相同的方案进行干化实验。
3.使用胰岛素的实验：
材料和方法：从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得化学限定的，来自酿酒酵母人胰岛素溶液的浓度为10mg/mL的重组体，并且在4℃下存储。从Pfanstiehl(Cleveland,OH)获得高纯度、低内毒素海藻糖二水合物并且甘油购自Sigma-Aldrich。将胰岛素连续地稀释以产生UltraPureTM蒸馏水中25μg/mL胰岛素浓度的母液并且将溶液添加至先前涡旋的基于海藻糖的溶液。将不含海藻糖或甘油的单独的基于胰岛素的蒸馏水溶液指定为对照组。将实验溶液和对照溶液二者在4℃下存储。具有0.22μm孔径的EMD Millipore(Billerica,MA)亲水膜被用作毛细管基底。所有样品被放置在真空室内，所述真空室被连接至EdwardsRV3两级旋转叶片泵(Crawley,United Kingdom)和Drierite干燥塔。然后，将基于胰岛素的样品在以Hg计-27和-30之间的压力下在真空中连续干燥25分钟的持续时间。干燥后，移出样品并重新称重以确定由于干燥造成的水损失的量。计算所有干化样品的水分残余率(gH2O/gdw)以量化干化过程的效率。在干化之后，将所有样品在4倍量的由于干燥而损失的蒸馏水中再水化。同时，将基于海藻糖的胰岛素溶液的“未干化的”样品在蒸馏水中再水化以用作干化样品的蛋白质活性基准。接着是由供应商(Life Technologies)提供的ELISA方案，其后读取含有标准品和所有样品组的微量滴定板并且通过具有相关的Gen5数据分析软件的Epoch 2微板光谱仪(BioTek Instruments，Winooski，VT)分析，其产生表示蛋白质活性的光密度(OD)读数。结果在图17中示出。
虽然已经图解和描述了本发明的多个方面，但是这些方面不旨在图解和描述本发明的所有可能的形式。相反，说明书中使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且应当理解可以对其进行各种修改和替换，而不脱离本发明的精神和范围。
专利文件参考文献
6,808,651 B1 10/2004 Katagiri,et al.
7,883,664 B2 2/2011 G.Elliott；N.Chakraborty.
8,349,252 B2 1/2013 G.Elliott；N.Chakraborty.
US 2013/0157250 A1 6/2013 Gutierrez et al.
US 2013/0260452 A1 10/2013 Toner et al.
非专利参考文献
Chakraborty N,Menze MA,Malsam J,Aksan A,Hand SC等(2011)Cryopreservation of Spin-Dried Mammalian Cells,PLoS ONE 6(9):e24916.
Chakraborty N,Biswas D,Elliott GD(2010)A Simple Mechanistic Way toIncrease the Survival of Mammalian Cells During Processing for Dry Storage,Biopreservation and Biobanking,8(2),107-114.
除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种更改对于以上描述的领域的技术人员也将是显而易见的。这种更改也旨在落入所附的权利要求的范围内。
应当领会的是，除非以另外的方式说明，所有试剂可以通过本领域已知的来源获得。
说明书中提到的专利、出版物和申请指示本发明所属领域技术人员的水平。这些专利、出版物和申请通过引用并入本文，好像每个单独的专利、出版物或申请通过引用被具体地并且单独地并入本文一样。
前述描述是对本发明具体实施方式的说明，但是不意味着对其实践的限制。所附权利要求，包括其所有等同形式，旨在限制本发明的范围。

Claims (19)

1.一种用于在一种或多种生物材料的低温以上玻璃化所述生物材料的方法，所述方法包括：
a)提供包含多个邻近的毛细管通道的膜，所述毛细管通道的每个具有第一开口和第二开口；
b)提供玻璃化混合物，所述玻璃化混合物包括一种或多种生物材料和玻璃化培养基；
c)将所述膜与所述玻璃化混合物接触使得所述膜接触所述玻璃化混合物的表面，所述膜接触所述玻璃化混合物使得所述毛细管通道的所述第一开口与所述玻璃化混合物可操作地接触；
d)与周围气氛直接可操作地连通的所述毛细管通道的所述第二开口，所述周围气氛具有低于所述玻璃化混合物湿度的湿度；和
e)在低温以上通过毛细管作用使所述玻璃化混合物干化直到所述玻璃化混合物进入玻璃态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个邻近的毛细管通道的一个或多个由亲水材料制备。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛细管通道的每个具有不大于2000平方微米的横截面面积。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛细管通道的每个具有0.01-100平方微米的横截面面积。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜具有1微米至500微米的厚度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述玻璃化混合物至少含有一种玻璃化剂、一种生物材料和水。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述玻璃化混合物包括海藻糖、甘油和甜菜碱和/或胆碱。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供穿过所述第二开口的气体流动的另外步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述气体是具有30％或更小的相对湿度水平的空气或惰性气体。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供穿过所述第二开口的吸入压力的另外步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将玻璃态的所述玻璃化混合物封闭在保护壳体中的另外步骤，所述壳体对水和空气是不可渗透的，并且在-196℃至+60℃之间的温度下存储所述保护壳体持续20天或更多的存储时间。
12.一种非低温生物材料玻璃化装置，其包括：
a)贮器，其包括包含多个邻近的毛细管通道的膜，所述多个邻近的毛细管通道的每个具有第一开口和第二开口，所述膜被布置以在被放置在所述贮器中或上时能够接触玻璃化混合物，使得所述毛细管通道的所述第一开口与所述玻璃化混合物可操作地接触；和
b)壳体，其与所述毛细管通道的所述第二开口可操作地流体连通以形成壳体环境，所述壳体与外部环境流体连通，其中所述壳体环境内的压力、温度、湿度或其组合可以被可操作地控制。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述多个邻近的毛细管通道的一个或多个由亲水材料制备。
14.根据权利要求12所述的装置，其中所述壳体的外表面包括一个或多个可密封的入口和一个或多个可密封的出口以促进气体流动和干化作用。
15.根据权利要求14所述的装置，所述一个或多个可密封的入口和一个或多个可密封的出口能够使气体流动穿过所述第二开口或横跨所述第二开口维持减小的压力以便增强干化作用。
16.根据权利要求12所述的装置，其中所述壳体对水分和气体是不可渗透的。
17.根据权利要求12所述的装置，进一步包括一个或多个毛细管或毛细管芯，其与所述玻璃化混合物和壳体环境可操作地连通以便增强干化作用。
18.根据权利要求12所述的装置，其中所述贮器包括包含内腔干燥空间的多个腔。
19.一种非低温生物材料玻璃化装置，其包括：
a)贮器，其包括包含多个毛细管通道的膜，所述多个毛细管通道的每个具有第一开口和第二开口，所述多个毛细管通道由亲水材料制备，所述膜被布置以在被放置在所述贮器中或上时能够接触玻璃化混合物，使得所述毛细管通道的所述第一开口与所述玻璃化混合物可操作地接触；和
b)壳体，其与所述毛细管通道的所述第二开口可操作地流体连通以形成壳体环境，所述壳体与外部环境流体连通，其中所述壳体环境内的压力、温度、湿度或其组合可以被可操作地控制。
CN201911132466.6A 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置 Active CN110734844B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911132466.6A CN110734844B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462009562P 2014-06-09 2014-06-09
US62/009,562 2014-06-09
CN201911132466.6A CN110734844B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置
CN201580042589.4A CN106574221B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置
PCT/US2015/034887 WO2015191570A1 (en) 2014-06-09 2015-06-09 Capillary assisted vitrification processes and devices

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580042589.4A Division CN106574221B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110734844A CN110734844A (zh) 2020-01-31
CN110734844B true CN110734844B (zh) 2023-05-30

Family

ID=54834187

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911132466.6A Active CN110734844B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置
CN201580042589.4A Active CN106574221B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580042589.4A Active CN106574221B (zh) 2014-06-09 2015-06-09 毛细管辅助玻璃化方法和装置

Country Status (9)

Country Link
US (4) US10433540B2 (zh)
EP (2) EP3909427A1 (zh)
CN (2) CN110734844B (zh)
AU (3) AU2015274813B2 (zh)
CA (1) CA2951692A1 (zh)
DK (1) DK3152291T3 (zh)
ES (1) ES2894846T3 (zh)
WO (1) WO2015191570A1 (zh)
ZA (3) ZA201708442B (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110734844B (zh) 2014-06-09 2023-05-30 索姆尼尔环球控股有限公司 毛细管辅助玻璃化方法和装置
US11998003B2 (en) 2015-10-13 2024-06-04 Fertilesafe Ltd. Devices and methods for preparation of a biological sample for a cryoprocedure
US11617365B2 (en) 2015-10-13 2023-04-04 Fertilesafe Ltd. Devices and methods for preparation of a biological sample for a cryoprocedure
EP3367791B1 (en) * 2015-10-29 2021-07-21 Asymptote Ltd Methods for cryopreservation
WO2017160835A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 The Regents Of The University Of Michigan A surface tension mediated lyo-processing technique for preservation of biologics
EP3870125A4 (en) * 2018-10-24 2022-08-03 Somnio Global Holdings, LLC FUNCTIONAL WOUND HEALING DRESSINGS
CN109997841B (zh) * 2019-04-09 2021-02-02 上海交通大学 维持常压空气氛围的人类配子快速冻融可视化环境舱
WO2021173983A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Somnio Global Holdings, Llc Capillary assisted vitrification processes and materials for preservation of biological samples
WO2021189001A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 The General Hospital Corporation High aspect ratio devices and methods for vitrification of biological samples by rapid cooling
KR20220161465A (ko) * 2020-03-31 2022-12-06 업카라 인코포레이티드 생물학적 시료에서 표적 분석물의 신속 검출을 위한 장치 및 방법
WO2022109310A1 (en) * 2020-11-19 2022-05-27 Somnio Global Holdings, Llc Ambient temperature lipid particle storage systems and methods
AU2021381425A1 (en) * 2020-11-19 2023-06-22 Ambient Biosciences, Inc. Methods of stable vitrification
US20240277840A1 (en) * 2021-07-01 2024-08-22 Upkara, Inc. Superconcentrated formulations of bioactive agents
CN114020077B (zh) * 2021-11-02 2022-08-09 上海理工大学 细胞组织样品的低温保护剂加载设备及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1342043A (zh) * 1998-10-14 2002-03-27 卡特里娜T·福雷斯特 生物样品的玻璃化方法
WO2013026160A1 (en) * 2011-08-22 2013-02-28 Peever Brian Dewatering method using a wicking material

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3732627A (en) * 1970-11-23 1973-05-15 R Wertheim Removal of a liquid phase from a material
US6509146B1 (en) * 1996-05-29 2003-01-21 Universal Preservation Technologies, Inc. Scalable long-term shelf preservation of sensitive biological solutions and suspensions
CN1113690C (zh) 1997-10-31 2003-07-09 范培昌 室温玻化机
US6300130B1 (en) 1998-11-16 2001-10-09 The General Hospital Corporation And University Of Massachusetts Ultra rapid freezing for cell cryopreservation
CN1340710A (zh) 2000-08-29 2002-03-20 上海正源生命技术有限公司 应用室温玻化技生产室温稳定的免疫层析试条
US7422726B2 (en) * 2002-10-23 2008-09-09 Blood Cell Storage, Inc. Integrated container for lyophilization, rehydration and processing of biological materials
NZ550119A (en) 2004-04-08 2009-10-30 Biomatrica Inc Method for storing biological material in a dissolvable matrix
ATE479096T1 (de) 2004-07-29 2010-09-15 Relia Diagnostic Systems Llc Querstromsystem und assay
US20060177426A1 (en) 2005-02-09 2006-08-10 Cecil Gibson Method of preserving lyophilized microorganisms for transport, storage and recovery of viable microorganisms
GB0523638D0 (en) 2005-11-21 2005-12-28 Cambridge Biostability Ltd Pharmaceutical device for the administration of substances to patients
US9538745B2 (en) 2006-04-14 2017-01-10 The General Hospital Corporation Methods for the cryopreservation of cells
US7883664B2 (en) 2007-06-27 2011-02-08 University Of North Carolina At Charlotte Microwave drying process for vitrification of biologics
US8349252B2 (en) 2007-06-27 2013-01-08 University Of North Carolina At Charlotte Vitrified composition which preserves biological materials
CN102803507B (zh) * 2009-06-12 2016-05-25 精密公司 用于微流体装置中在板反应剂的脱水储存的组合物及方法
US10092691B2 (en) 2009-09-02 2018-10-09 Becton, Dickinson And Company Flexible and conformal patch pump
WO2011047380A2 (en) 2009-10-16 2011-04-21 Mehmet Toner Methods for the cryopreservation of mammalian cells
CL2010000920A1 (es) 2010-08-30 2010-12-17 Metodo para criopreservar espermatozoides humanos libres de plasma seminal, mediante un proceso rapido y simple de vitrificacion - desvitrificacion aseptica; un kit portable para el montaje del metodo.
WO2013001461A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Koninklijke Philips Electronics N.V. Preparation of reaction chambers with dried proteins
LT2741740T (lt) 2011-08-12 2017-08-10 Merial, Inc. Biologinių produktų, ypatingai vakcinų, vakuuminis konservavimas
US20130309656A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 David C. Davis Antibody detection method and device for a saliva sample from a non-human animal
WO2014185457A1 (ja) 2013-05-16 2014-11-20 三菱製紙株式会社 細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具
WO2015064380A1 (ja) 2013-10-29 2015-05-07 学校法人北里研究所 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具
CN110734844B (zh) 2014-06-09 2023-05-30 索姆尼尔环球控股有限公司 毛细管辅助玻璃化方法和装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1342043A (zh) * 1998-10-14 2002-03-27 卡特里娜T·福雷斯特 生物样品的玻璃化方法
WO2013026160A1 (en) * 2011-08-22 2013-02-28 Peever Brian Dewatering method using a wicking material

Also Published As

Publication number Publication date
US20190200603A1 (en) 2019-07-04
DK3152291T3 (da) 2021-10-18
CN106574221A (zh) 2017-04-19
US11576374B2 (en) 2023-02-14
ZA201803683B (en) 2019-07-31
EP3152291A4 (en) 2018-02-21
AU2015274813A1 (en) 2017-01-05
EP3909427A1 (en) 2021-11-17
AU2020244494A1 (en) 2020-10-29
AU2019261829B2 (en) 2020-07-02
US10433540B2 (en) 2019-10-08
ZA201708442B (en) 2019-08-28
CN106574221B (zh) 2019-12-10
US12075773B2 (en) 2024-09-03
AU2019261829A1 (en) 2019-12-05
CA2951692A1 (en) 2015-12-17
US20170135336A1 (en) 2017-05-18
US20200068875A1 (en) 2020-03-05
CN110734844A (zh) 2020-01-31
AU2020244494B2 (en) 2021-07-29
US20230172192A1 (en) 2023-06-08
WO2015191570A1 (en) 2015-12-17
ES2894846T3 (es) 2022-02-16
EP3152291B1 (en) 2021-07-21
AU2015274813B2 (en) 2019-08-22
ZA201901434B (en) 2021-01-27
EP3152291A1 (en) 2017-04-12
US10568318B2 (en) 2020-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110734844B (zh) 毛细管辅助玻璃化方法和装置
Jin et al. High survival of mouse oocytes/embryos after vitrification without permeating cryoprotectants followed by ultra-rapid warming with an IR laser pulse
ES2232624T3 (es) Microinyeccion de crioprotectores para la conservacion de celulas.
KR101883813B1 (ko) 세포 또는 조직의 유리화 동결보존용 도구
US12058996B2 (en) High subzero cryopreservation
JP6667903B2 (ja) 中空糸凍結保存用具及び細胞凍結保存方法
Amini et al. Technologies for vitrification based cryopreservation
US20230413807A1 (en) Methods of stable vitrification
AU2021381425A9 (en) Methods of stable vitrification
JP7341847B2 (ja) 凍結保存用治具の固定具
JP7471836B2 (ja) 凍結保存用治具の固定具
US20190008142A1 (en) Automatic devices configured to perform a cryoprocedure on at least one biological sample carried by one or more carriers
CA3199526A1 (en) Ambient temperature lipid particle storage systems and methods
Franks Cold survival: A physicochemical analysis
BRPI1106685A2 (pt) Técnica de vitrificação de oócitos em suporte metálico

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant