DK173128B1 - Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA- - Google Patents

Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA- Download PDF

Info

Publication number
DK173128B1
DK173128B1 DK199401028A DK102894A DK173128B1 DK 173128 B1 DK173128 B1 DK 173128B1 DK 199401028 A DK199401028 A DK 199401028A DK 102894 A DK102894 A DK 102894A DK 173128 B1 DK173128 B1 DK 173128B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
virus
prrs
vaccine
vaccine according
adjuvant
Prior art date
Application number
DK199401028A
Other languages
English (en)
Other versions
DK102894A (da
Inventor
Juan Plana Duran
Original Assignee
Iberica Cyanamid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iberica Cyanamid filed Critical Iberica Cyanamid
Publication of DK102894A publication Critical patent/DK102894A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173128B1 publication Critical patent/DK173128B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

DK 173128 B1
Opfindelsen angår en vaccine, som er I stand til at forhindre det porcine reproduktions- og respirationssyndrom, navnlig en inaktiveret vaccine indeholdende den virus, som forårsager denne sygdom, på inaktiveret form, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA-sekvens.
5
Sygdommen med betegnelsen det porcine reproduktions- og respirationssyndrom (PRRS) påvirker drægtige søer, hos hvilke den kan fremkalde anorexl, abort, dødfødsler, mumificerede eller Indtørrede fostre, svagelige smågrise, som dør i en afder af få timer eller dage, respirationsproblemer efter faringen og avlsproblemer (Loula, T.: "Clinical Presentation of Mystery Pig 10 Disease in the breeding herd and suckling piglets," Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 06 0KT1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, Wl, USA). I nogle tilfælde har de inficerede søer haft blå pletter på ørerne, hvorfor man også kalder sygdommen "blå abort" eller "blå-øre svinesygdommen" (Veterinary Record, b. 130, nr. 3, 18 JAN 1992). Sygdommen kaldes også "den mystiske svinesygdom" (Mystery Pig 15 Disease, MPD; Mystery Swine Disease, MSD), "det mystiske reproduktionssyndrom" (Mysterious Reproductive Syndrome, MRS), "svineinfertilitets- og respirationssyndromet" (Swine Infertility and Respiratory Syndrome, SIARS) eller "det porcine epidemiske aborterings-og respirationssyndrom" (Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome. PEARS.
20 De første epizootiske udbrud af denne sygdom kom i USA og Canada i 1987.1 Europa så man det første udbrud i Tyskland i 1990, hvorfra den spredte sig til Holland og Belgien sidst i 1990 og i begyndelsen af 1991. I Spanien så man de første tilfælde af sygdommen i midten af januar 1991, hvor man observerede betydelige resplrative forandringer i en svinebestand på 300 individer, som var Importeret fra Tyskland (Plana et al, Med. Vet., b. 8, nr. 11, 1991). Kort 25 efter konstateredes i to avlsflokke omkring 500 m fra den bestand, hvor problemt oprindeligt opstod, en sygdom, som var karakteristisk ved et unormalt højt antal aborter i den sidste fase af drægtighedsperioden samt ved en dødelighed på 70% blandt smågrlsene. En analyse af de observerede kliniske symptomer, hvor man tog hensyn til, at disse bestande (i) havde været igennem et intensivt vaccinationsprogram mod porcln parvovirus, Aujeszkys syge og svineln-30 fluenza, samt at (ii) laboratorieundersøgelser havde afvist tilstedeværelsen af andre abortsygdomme, førte til mistanke om, at man her stod over for PRRS. Det agens, som har forårsaget sygdommen, er blevet isoleret fra prøver fra disse farme, jf. beskrivelsen nedenfor.
Et antal agenser er blevet korreleret med dette infektionsforløb, bl.a. encephalomyocarditis 35 virus, svineinfluenza, klassisk svinefeber, afrikansk svinefeber, slimhindesygdommen, Aujeszkys syge, brucellose, leptospirose, Q-feber, parvovlrosis og chlamydia-sygdommen, nogle har endda relateret den til mycotoxiner (Loula, T.: "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets," Proceedings of the Mystery Swine Disease Com- 2 DK 173128 B1 » mittee Meeting, supra; Mengeling, W.L. og Lager, K.M.: "Mystery Pig Disease; Evidence and considerations for its etiology" in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Dea et al: "Virus isolation from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems," Proceedings of the Mystery Swine Disease Com-5 mittee Meeting, supra; Van Alstine.W.: "Past diagnostic approaches and findings and potential useful diagnostic strategies" in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Loula, T., Agri-Practice, 12(1), 23-33, 1991; Woolen, N. et ai, J. Am. Vet. Assoc., 197, 600-601,1990).
10 WO-92/21375 i navnet Stitching Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) beskriver isoleringen
af en virus, som kaldes "Lelystad Agenset" (LA) eller "Lelystad Virus" (LV), og som beskrives 3 som værende årsag til den sygdom, der den gang kaldtes MSD. Når man inokulerer Isoleret LV
intranasalt i drægtige søer, observeres appetitløshed og endda spisevægring i dag 4 til 10-12 efter inokuleringen, reproduktionsforstyrrelser og en blåfarvning på ørerne hos nogle af de 15 inficerede søer på dag 9-10 efter inokuleringen. Det observeres imidlertid også, at sygdommen | ikke reproduceres i to af de otte eksperimentelt inficerede søer (se tabel 6 i PCT-ansøgnlngen nævnt ovenfor), da hos en af søerne antallet af levendefødte smågrise, som overlevede den ^ første uge, er højt (seks ud af ni; so nr. 1305), og en anden so havde to dødfødte smågrise, mens de andre ni overlevede den første uge (so nr. 1065). LV virus som isoleret af CDI tilhører 20 genus Arteriviridae og har et genom bestående af et polyadenyleret RNA-moiekyle med en længde på 14,5 til 15,5 kb (bestemt i neutral agarosegel), som replikerer ved hjælp af et sæt subgenome RNA ved 3'-enden. Ovennævnte PCT-ansøgning angiver LV-genomets nu-cleotidsekvens, de otte mulige åbne aflæserammer (ORF, open reading frame), aminosyrese-kvensen som afledt fra de identificerede ORF’er og de formodede sites for N-glycosylering.
25 Efterfølgende er andre vira, som forårsager PRRS, blevet isoleret på tyske, franske og spanske farme. Den virus, som biev isoleret i Tubingen, Tyskland (TV) (Virology, 193, 329-339, 1993) er 99,3% homolog med LV på nucleotidniveau i ORF nr. 2-7 (der er 24 anderledes basepar (bp) ud af et samlet antal på 3316 bp i dette område). Den afledte TV-aminosyresekvens er 99,2% homolog med LV (der er kun ti anderledes aminosyrer i den afledte amlnosyresekvens som 30 kodet i ORF nr. 2-5, da der ikke er nogen forskel i de fra ORF nr. 6 og 7 afledte sekvenser).
På den anden side set er homologien mindre mellem LV og TV set i forhold til den virus, som er isoleret på vort laboratorium (den spanske stamme, SV). Indtil nu er kun nucleotid- og aml-nosyresekvenserne svarende til ORF nr. 3-7 blevet sammenlignet og med følgende resultater: - 35 1. Der er 95,5% homolog! på nucleotidniveau af SV stillet overfor LV eller TV (ud af i alt 2599 bp er 144 anderledes); og ® 2. Der er 94,9% homolog! på amlnosyreniveau af SV stillet overfor LV eller TV (ud af i alt 955 aminosyrer observeres 47 aminosyrer, som er anderledes).
m 'i.
3 DK 173128 B1
Disse aminosyrevariationer kan relateres til højere patogenicitet af nogle stammer end andre, blandt andet er den vims, som er isoleret på vort laboratorium (SV), mere patogen end andre kendte PRRS-vira. Betragtes Eksempel 8 nedenfor, vil man se, at procentdelen af overlevende smågrise hos en so inficeret med den franske stamme er 75%, mens den tilsvarende procent-5 del hos en so inficeret med den spanske stamme er 9,5% (Tabel 12 og 14). Procentdelen er 61%. når søerne er inficeret med LV (Tabel 6, WO-92/21375), da der fødes 58 levende små-grise ud af et samlet antal på 95.
Sygdommen er anledning til svære tab i svineindustrien, da den i akutte udbrud kan fremkalde 10 en dødelighed på 70% af smågrlsene i et kuld. Man kunne ved et passende vaccinationsprogram løse problemet, således at sygdommen forhindres i at opstå. Der er således behov for vacciner, som er effektive mod PRRS.
WO-93/06211 i navnet Collins, J.E. og Benfield, D.A. omtaler en vaccine mod MSD indehol-15 dende et infektiøst agens Isoleret fra lungerne hos svin. der er inficeret med MSD. PCT-an-søgnlngen karakteriserer og identificerer dog ikke det infektiøse agens, som heller ikke er blevet deponeret hos nogen anerkendt deponeringsinstitution. Derfor er der alvorlige problemer med reproducerbarheden af informationen i denne PCT-ansøgning, da det beskrevne produkt ikke kan verificeres, og de opnåede resultater Ikke kan sammenlignes med eksempelvis nær-20 værende ansøgnings resultater. Tilsvarende har man i denne PCT-ansøgning heller ikke klart defineret antigenet eller det adjuvans, som er anvendt i formuleringen af vaccinen, hvilket, som det fremgår nedenfor, spiller en vigtig rolle. Endelig er der heller ingen eksempler, som viser vaccinernes potens og effektivitet.
25 WO-93/07989 omtaler bl.a. identifikationen af det agens, som forårsager PRRS, og heraf af ledte vacciner. Den isolerede vims har karakteristika, som minder om LV. men til forskel fra den virus, som er Isoleret på vort laboratorium, er den ikke i stand til at vokse på ST-celler (svine testis cellet) i påviselig grad. Tilsyneladende har vaccinen haft en effekt, men beskyttelsesgraden har kun været tilstrækkelig i omtrent 52% af de vaccinerede dyr, hvilket må betrag-30 tes som et relativt lavt niveau, især når man betragter den i vaccinationsdosis anvendte høje vlrale titer. Endvidere anfører denne PCT-ansøgning intet om organiseringen af det virale genom eller om de proteiner, det koder for, hvorfor man ikke eller kun med en utilbørlig efterforskningsindsats kan sammenligne denne virus med den vims, som vi har isoleret I vort laboratorium.
35 Følgelig er der fortsat behov for vacciner mod PRRS. Dette problem løses ifølge den foreliggende opfindelse gennem tilvejebringelse af en vaccine, som er i stand til at yde effektiv beskyttelse af søer mod den infektiøse sygdom. Den antigene del af vaccinen består af et inakti- 4 DK 173128 B1 veret spansk Isolat. Gennem opfindelsen tilvejebringes også kombinationer af det isolerede PRRS virale antigen (den spanske stamme) og forskellige porcine patogener med det formål at tilvejebringe bi- eller multivalente vacciner.
5 Opfindelsen skal forklares nærmere under henvisning til sekvenslisten samt ved hjælp af tegningen, hvor flg. 1-5 viser homologien og de eksisterende forskelle mellem LV og den virus, som er isole- Ί ret på vort laboratorium, på aminosyreniveau afledt fra ORF nr. 3 til 7 (SEQ ID NO:1-5). Aminosyreme er udtrykt ved hjælp af en étbogstavkode. Den øverste af hvert li-10 nlesæt bestående af to linier svarer til aminosyresekvensen af LV. mens den nederste linie svarer til den i vort laboratorium isolerede virus (den spanske stamme). De homologe aminosyrer er vist med to lodrette streger anbragt lodret over hinanden, mens to prikker anbragt lodret over hinanden Indikerer, at der er sket en konservativ substitution af nogle aminosyrer med andre, hvor det konservative går på, at der er substi-15 tueret med en funktionelt ækvivalent aminosyre, Fravær af sådanne streger og prik ker mellem to aminosyrer indikerer, at der er sket ikke-konservative substitutioner.
I den følgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen er afsnittene af overskuelighedsgrunde nummereret.
J 20 1. Prøver 1.1 Udvalgte dvr med henblik oå isolation af virus
Der udvælges mumificerede fostre, dødfødte smågrise og levende men svagelige smågrise af en alder på 1-10 dage, som er afkom af søer med kliniske problemer som følge af PRRS.
25 1.2 Præparation af prøver
Ved hjælp af necropsi tages prøver af lunge, milt, lever, nyre, hjerne og hjerte fra smågrisene. I et særligt tilfælde tages prøver fra lungerne af en dødfødt gris, født af en so mistænkt for at have en PRRS-infektion. Med denne lunge fremstilles et homogenisat med DMEM (GIBCO; 30 10 g lunge i 90 ml DMEM), suppleret med en antibiotika-opløsning (PEG) bestående af 1000 lU/ml penicillin, 1 mg/ml streptomycin og 0,5 mg/ml gentamicin. Den resulterende suspension henstår ved 4 "C i 1 time, nedfryses og optøs to gange, centrifugeres, og den fremkomne supernatant opbevares ved -70eC med henblik på anvendelse ved inficering af alveolære makrofager fra griselunger. I et andet tilfælde fremstilles på lignende måde prøver fra " 35 lungerne hos en levendefødt gris, som dog døde få timer efter fødslen.
“W
"N
m 5 DK 173128 B1
Endvidere udtages btod fra dyrene ved punktering af vena cava, hvorved man får (i) blodplasma, som opbevares ved -70X og anvendes ved isolation af virus, og (i·) serum, som anvendes til udførelse af antistof-titrering.
5 2. De alveolære makrofager fra grfselunger 2.1 Fremskaffelse
Der anvendes grise, som er seronegative overfor Aujeszkys syge, porcin parvovirus, mund- og klovesyge, klassisk svinefeber, svlneinfluenza (typer H1N1 og H3N2) og transmitterbar gastroenteritis. De anvendte grise er mellem 7 og 8 uger gamle. Dyrene anæstetiseres med pheno-10 barbital, natrium før ekstraktion af lungerne, som foregår ved først at underbinde trachea (luftrøret) under epiglottis (strubelåget) og snitte over ombindingen. Efter ekstraktion af lungen vaskes eksternt med fysiologisk saltvand, og en antibiotikaopløsning i PBS og PEG indføres ved succesive skylninger. De celler, som fremkommer ved disse skylninger, centrifugeres I 10 min. ved 300 g og genopslemmes I DMEM-mediet (DMEM medium suppleret med ikke-15 essentielle aminosyrer, GIBCO, 1% 1 mM natriumpymvat og 1% 2mM glutamin), 10% føtalt kalveserum (FCS) og en PEG-opløsning af antibiotika 1 %o. Cellerne tælles i Newbauer-kamre.
2.2 Sterilitetskontrol
Ved hjælp af passende testprocedurer bekræftes det, at de alvelære makrofager fra svinelun-20 ger er ukontamlnerede med bakterier, svampe og andre vira. Ligeledes bekræftes cellemes gode almentilstand ved hjælp af optisk mikroskopi.
Fraværet af kontaminering med mycoplasma bekræftes ved anvendelse af en cytokemisk påvisningsmetode med DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol), som selektivt bindes til DNA og 25 danner DNA-DAPI-komplekser med kraftig fluorescens og høj specificitet.
3. Isolation af virus 3,1 Isolation af vims oa vækst af virus oå alveolære makrofager fra oriselunaer En kultur af alveolære makrofager fra griselunger, som tidligere er fremstillet i DMEM-medium 30 og FCS i en koncentration på 10%, inficeres med et homogenisat af en prøve mistænkt for at indeholde det agens, som forårsager PRRS. Prøven består i et tilfælde af et lungeisolat fra en lille gis, dødfødt af en so med kliniske symptomer på PRRS, i andre tilfælde anvendes et lungeisolat fra en levendefødt gris, som døde få timer efter fødslen, afkom af en so med PRRS-symptomer, såvel som et isolat fra blodplasma. Homogenlsatet holdes i kontakt med 35 makrofag-kulturen i 1 time ved 37eC, Herefter fjernes Inoculum, og der tilsættes frisk DMEM-medium med 2% FCS og 1%o PEG-opløsning, idet kulturen buffer-påvirkes med C02 og inkuberes ved 37*C i flere dage, i løbet af hvilke man under mikroskopet observerer den cytopati-ske effekt (CPE) fremkaldt af virus hos makrofagerne: 3-4 dage efter infektionen (dpi=days 6 DK 173128 B1 post infection) var CPE 70-80% (tilsynekomst af kæmpe celler og deformerede celler). Kulturerne nedfryses ved -80°C.
Samtidig præpareres en kultur af alveolære makrofager fra griselunger, som ikke er inficeret 5 med PRRS, til anvendelse som negativ kontrol.
Der præpareres subkulturer med den isolerede virus, og man observerer, at der er 100% CPE fra anden dpi. Virus nedfryses ved -80°C med henblik på senere identifikation og karakterisering.
;a 1 o ;a På tilsvarende måde isoleres virus fra blodplasma og andre prøver fra dødfødte smågrlse eller „ levende men svagelige grise født af inficerede søer.
i ] En af de isolerede vira, nemlig den virus, som bærer betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, " 15 er isoleret fra lungen hørende til en dødfødt gris. Den er i stand til eksperimentelt at reprodu cere sygdommen, har de i Afsnit 4 nævnte karakteristika og er deponeret hos European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, United Kingdom, den 29. juni 1993 under deponeringsnummeret V93070108.
M
— 20 3.2 Viral vækst i andre cellesvstemer
Infektioner med den isolerede virus (den spanske stamme) er udført i co-kulturer af alveolære makrofager fra griselunger og ST-celler (svine testis kontinuert cellelinie) ATCC CRL 1745 ST, som el første trin imod at tilpasse virus ST-celler. Efter flere overførsler (serial passages) (5-6) på co-kulturer af ST-celler og makrofager og renkulturer af ST fås en virus-infektions-titer af 25 størrelsesordenen 106 TCIDgo/ml, når der er tale om infektion af co-kulturer af makrofager og ST-celler, og af størrelsesordenen 104 5 TCID^/ml for virus I rene ST-celler. (TCID^, betyder tissue culture infectious dose 50%, vævskultur-infektionsdosis 50%).
Endvidere kan alveolære makrofager fra griselunger også gøres udødelige (immortaliseres) = 30 ved fusionering med ST-celler ved hjælp af hybridisering.
Alternativt kan de alveolære makrofager fra griselunger immortaliseres ved fusionering med L-14-cellelinien (porcine perifere blod-B-celler) ECACC nr. 91012317 eller med cellelinie nr. Jag-1 (porcin trofoblast-cellelinie), som fås fra Dr. Jag Ramsoondar ().
35
Fusioneringen foregår som det er sædvane inden for dette område.
'mm 7 DK 173128 B1
Alternativt kan vira bringes til at vokse på ST-celler eller en hvilken som helst anden porcin cellelinie, som har fået indført de gener, der koder for membranreceptoreme for PRRS-virus fra alveolære makrofager fra griselunger.
5 De vira, som fremstilles med disse cellesystemer kan anvendes til formulering af både levende og inaktiverede vacciner.
4. Identifikation og karakterisering af virus 41 Betegnelse oq deponering af virus 10 Den virus, som er isoleret fra lungen hos en dødfødt gris og benævnes PRRS-CY-218-JPD-P5- 6-91, er deponeret hos European Collection of Animal Celle Cultures (ECACC), Salisbury,
United Kingdom, den 29. juni 1993 med deponeringsnummeret V93070108. I nærværende beskrivelse omtales denne virus lejlighedsvis som "den spanske stammefvirus" (SV) 15 4.2 Karakterisering af den isolerede virus
Denne virus (PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) har følgende karakteristika: a) Produktion af en moderat CPE i en kontinuert ST-cellelinie (ATCC CRL 1748 ST) (føtal svine testis) med en gennemsnitlig titer på 104'5TCID5O/ml og på alveolære makrofager fra griselunger med en gennemsnitlig titer på 105 5 TCID^/ml; 20 b) ved infektion af co-kulturer af alveolære makrofager fra griselunger og ST-celler opnås en gennemsnitlig titer på 106·3 TCID^/ml (hvilket er en logaritmisk enhed større (1 log10), end når en renkultur af alveolære makrofager fra griselunger inficeres); c) cytoplasmatisk replikation; d) produktion af cytoplasmatiske vakuoler; 25 e) lipid-kapsel (envelope); f) en størrelse på 40-50 nm; g) ingen hemadsorption eller hemagglutination observeres med kylling, marsvin, svin eller humane røde blodceller af gruppe O; h) tab af infektionsevne ved surt pH (pHs5); 30 i) fremkaldelse af mikro- (interstitiel pneumoni) og makroskopiske læsioner i 2 måneder gamle smågrlse; j) uheldig indflydelse på reproduktionsevnen hos drægtige søer med dødfødsler, mumificerede fostre og levende men svagelige smågrlse; k) kryds-reaktion med Lelystad-referenceserum (IPMA * Immuno Peroxidase Monolayer 35 Assay); l) kryds-reaktion med sera fra dyr med kliniske Infektioner (field infections) (IPMA); m) serum fra søer inficeret med denne virus kryds-reagerer med LV; n) polyadenyleret RNA-genom af en længde på omtrent 15000 bp (neutral agarose gel); 8 DK 173128 B1 o) replikation ved hjælp af sub-genomiske RNA-sæt ved 3'-enden; p) nucleotidsekvens med 8 ORFs; q) i en oprenset suspension, som underkastes elektroforese i polyacrylamidgel og efterfølgende overførsel ved immunoblot, påvises ved hjælp af et specifikt serum, som er 5 fremstillet i søer fra vort eget laboratorium, og som krydsreagerer med Le- lystad PPRS vims, 4 større bånd svarende til proteiner med en tilsyneladende molekylvægt på 15000, 23000, 54000 og 66000 Dalton, og som ikke påvises i de negative kon-1 trolprøver (uinficerede makrofager); r) når ORF nr. 3-7 af denne virus sammenlignes med LVs og/eJler TVs, observeres 10 95,5% homologi på nucleotidniveau (der er 114 anderledes bp ud af totalt 2599 bp) og 94,9% homologi på aminosyreniveau (51 anderledes aminosyrer ud af totalt 955); og s) vims tilhører genus Arterivims.
i ] 4.3 Anvendt teknik til identifikation af virus p 15 4.3.1 Eksperimentel reproduktion af sygdommen i dræotioe søer I Der anvendes søer avlet som en krydsning af racerne tysk landrace og store hvide og stam mende fra farme med systematisk serologisk kontrol af Aujeszkys syge vims, mund- og klov- τϊ 1 syge vims, porcin parvovirus, klassisk svinefeber virus, svine influenza vims (typerne H1N1 og :s H3N2) og transmitterbar gastroenteritis vims. Desuden udføres antistof-titreringstesten mod 20 den PRRS-forårsagende virus. Dyrene inficeres på et tidspunkt mellem dag 77 og dag 90 i gestationen (drægtighedsperioden) med et isolat fra alveolære makrofager fra griselunger, i et tilfælde intravenøst (IV) og intranasalt (IN), mens der i et andet tilfælde kun inficeres intranasalt (Eksempel 2.1). Under hele eksperimentet overvåges dyrenes fødeindtagelse, rektaltemperatur og kliniske tilstand. For at kunne udelukke de ovenfor nævnte agenser udtages blodprøver fra 1 25 alle søerne før infektionen. De viser sig at være seronegative mod alle agenser. På tilsvarende måde findes alle søerne også efter den eksperimentelle infektion at være seronegative mod 1 alle de nævnte vira og seropositive mod PRRS (målt mod reference LV). De opnåede resulta ter fremgår af Tabel 1.
M
* 9 DK 173128 B1
Tabel 1
Udførte undersøgelser
Infektiøst HAI (1) HAI (2) NPLA (3) ELISA (4) SN (5) SN (6) IPMA (7) agens AS__Ur__Ml__Lu.__:__j.u.__Lu.__i.u, MKS__Ml__Ml__Lu.__Ml__.____Lu.__I.u.
PP__:__Ml__Ml____Ml__Ml___Ml__i.u, KSF__Ml__I.u. -__Ml__Lu.___Ml__i.u.
SI__Ml__-__Ml__Lu___Ml___Ml___i.u.
TG I.u.__Ml___Ml__I.u, I.u,____-___I.u.
PPRS i.u. i.u. i.u. i.u. I.u. I.u. + 5 Anvendte forkortelser: AS Aujeszkys syge MKS Mund· og klovsyge PP Porein parvovirus KSF Klassisk svinefeber 10 SI S vineinfluenza TC Transmitterbar gastroenteritis P R R S Det porcine reproduktions' og respirationssyndrom HAI Hasmagglutlnatlon peroxidase-linket assay NPLA Neutraliserende peroxidase-Enket assay 15 ELISA Enzym-Rnket immunosorbent assay SN Seroneutrallsertng IPMA Immuno peroxidase monolayer assay (t) Vannier et al. Rec Méd Vet. 155(2), 151-158 (1979) (2) Charley, B , doktorafhandling, Alfort (1976) 20 (3) Trepsta et al. Vet. Mcrob., 9,113-120 (1984) (4) Elliot, M., J. Rech. Pore., 20.141-146 (5) Lucam, F., "Diagnostic sero-immunologique des vfroses humain et animals,'' F. Bricout, L. Jouberf, J.M. Hureaux (1977) (6) Jiménez et al, J. Wot.. 60.131-139 (1986) 25 (7) Wensvoort et al. Vet. QUARTERLY, b. 13. nr. 3 (juli 1991) negativ + positiv I.u. ikke udført 30 4.3.2 Eksperimentel reproduktion af sygdommen I smågrise
Formålet med dette forsøg er at undersøge, om den virus, som forårsager de reproduktive ændringer I søer, er i stand til at fremkalde resplrative symptomer og makro- og mikroskopiske læsioner på lungeniveau i 2 måneder gamle smågrise. Et antal smågrise inficeres med denne virus (den spanske stamme), intranasalt, og aflives herefter på et bestemt tidspunkt efter infek-35 tionen (Eksempel 2.2).
10 DK 173128 B1
De mest relevanta resultater viser, at denne virus på makroskopisk niveau giver anledning til multiple (flere) konsoliderings-foci såvel som interstitiel pneumoni på mikroskopisk niveau (Tabel 4). Fra et helbredsmæssigt synspunkt observeres ingen relevante kliniske symptomer.
5 4.3.3 Følsomhed overfor chloroform
Denne undersøgelse foretages med henblik på at afgøre, om den Isolerede virus har en lipid· kapsel (envelope). Der gøres brug af metoden ifølge Feldman, H. og Wang, S.beskrevet i "A manual of basic virological techniques," Prentice-Hall Inc., New Jersey, 146-148 (1978). De opnåede resultater viser, at den ubehandlede virus har en titer på 105·6 TCID^/ml, mens be· 10 handlingen med chloroform fører til en reduceret titer på under 101·3 TCID^/ml, på basis af hvilket man kan fastslå, at den isolerede virus har lipid-kapsel.
4.3.4 Sekvensering af det virale qenom Dette sker i fem trin: 15 i) Oprensning af virus
ii) Oprensning af det virale RNA
iii) Syntese af cDNA
iv) Kloning og karakterisering af cDNA-kloneme * v) Sekvensering og sammenligning af sekvenserne med LVs sekvenser 1 20 j ad i) Oprensning af virus I Virus, som er replikeret på alveolære makrofager fra griselunger, "klares" (is clarified) og op- koncentreres ved filtrering på MILLIPORE® filtre. Herefter centrifugeres virus i en 10-50% me-’ trizamid-gradient (SIGMA). Efter centrifugering fås et bånd, som opkoncentreres ved centrifu- 25 gering. Med denne oprensede virus køres en elektroforese i polyacryiamidgel, og et immu-noblot fremkaldes med et specifikt serum og viser proteiner med en tilsyneladende molekylvægt på 15, 23, 54 og 66 kilo-Dalton (kDa).
ad iii Oprensning af viralt RNA
30 Der gøres brug af en teknik til selektion og oprensning af RNA, som er baseret på det faktum, at RNA’et Indeholder en poly(A)-sekvens ved 3-enden. Der anvendes et kommercielt kit (Pharmacia), som kun tillader binding af RNA-poly(A)-kæden til en cellulose-oligo(dT)-matrix og dens efterfølgende eluering.
35 ad iih Syntese af cDNA
— Der gøres brug af et kommercielt kit (Boehringer Mannheim), idet de medfølgende instruktioner følges. I korthed er der tale om, at det virale, genomiske RNA inkuberes i nærvær af en _L' oligo(dT), dATP, dCTP, dGTP, dTTP og revers transcriptase.
11 DK 173128 B1 ad ivl Klonino oq karakterisering af cDNA-kloneme cDNA klones 1 en vektor, som er afledt af pUC18, og en række kloner fås Indeholdende den komplette nucleotidsekvens svarende til ORF nr. 3-7, jf. sekvenslisten. SEQ ID NO: 1-5.
5 ad v) Sekvenserina oa sekvenssammenlionlnQ med LV v.a. Sekvensering
Sekvenserne SEQ ID NO. 1-5 svarende til ORF nr. 3-7 af den virus, som er isoleret på vort laboratorium, er blevet fuldstændigt sekventeret. I sekvenslisten er angivet de resulterende 10 cDNA-sekvenser, såvel som de aminosyresekvenser, som hver ORF koder for. Længden af den samlede sekvenlerede region er omtrent 2599 nucleotider (nt). Som man kan se, har ORF 3 en længde på omkring 798 nt og koder for et protein på 266 aminosyrer.
ORF 4 har en længde på omtrent 552 nt og koder for et protein på 183 aminosyrer. Starten på 15 denne ORF 4 er lokaliseret i ATG-koden. som ligger omtrent 540 bp fra ATG-start-koden I ORF 3. ORF 3 og ORF 4 deler en sekvens på omkring 246 nt.
ORF 5 har en længde på omkring 606 nt og koder for et protein på 200 aminosyrer. Startkoden for denne ORF 5 overlapper I praksis med ORF 4's endekode (de deler TG-nudeotideme, 20 ATG-koden i starten af ORF 5 og TGA-endekoden i ORF 4). ATG-start-koden i ORF 5 er lokaliseret omkring 1092 nt fra ATG-start-koden i ORF 3.
ORF 6 har en længde på omkring 522 nt og koder for et protein på 173 aminosyrer. Denne ATG-start-kode for ORF 6 er lokaliseret 8 nt opstrøms fra begyndelsen af TAG-slutkoden i 25 ORF 5 (ved omkring 1682 nt fra ATG-start-koden i ORF 3).
ORF 7 har en længde på omkring 387 nt og koder for et protein på 129 aminosyrer. ATG-start-koden for ORF 7 er lokaliseret 5 nt opstrøms fra begyndelsen af TAA-slutkoden for ORF 6 (ved omkring 2193 nt fra ATG-start-koden af ORF 3).
30
De proteiner, som der kodes for af ORF nr. 3-6 er membranproteiner, mens det protein, som der kodes for af ORF 7 er et nucleocapsid-protein.
v.b.1 Sammenligning med LV
35 Når man sammenligner cDNA-sekvenseme af ORF nr. 3-7 af LV med de tilsvarende sekvenser i den virus, som er isoleret på vort laboratorium, ser man følgende: i) på nucleotidniveau er 114 nucleotider ud af 2599 mulige anderledes, hvilket svarer til en homologi på omtrent 95,5%, 12 DK 173128 B1 ii) på aminosyreniveau er 47 aminosyrer ud af 955 mulige anderledes, hvilket svarer til en homologi på omtrent 94,9%, iii) af de 47 anderledes aminosyrer er der 35, der må anses som ikke-konservative substitutioner, af hvilke der findes: 5 12 i produktet fra ORF-3-genet (fig. 1); 9 i produktet fra ORF-4-genet (fig. 2); 10 i produktet fra ORF-5-genet (fig. 3). skønt det må bemærkes, at produktet fra LV-ORF-5-genet indeholder en aminosyre mere end produktet af ORF-5 fra den spanske virus, nærmere bestemt er aminosyre nr. 35 (Asn) i LVs 10 ORF-5-produkt ikke tilstede i det produkt, som eksprlmeres af den spanske virus; 4 i produktet fra ORF-6-genet (fig. 4); mens produktet fra ORF-7-genet ikke indeholder nogen ikke-konservativ substitution (fig. 5).
15 iv) den partielle homologi for hvert af de produkter, der eksprlmeres af de forskellige ORF’er fra den spanske virus og LV er 93,6% for ORF-3- og ORF-5-produkterne, - 94,0% for ORF-4-produktet, 96,6% for ORF-6-produktet og 99,2% for ORF-7-produktet.
Som nævnt ovenfor kan forskellene i aminosyresekvens stå i forbindelse med den højere pa-20 togenlcitet af den ene stamme i forhold til de andre, da den virus, som er isoleret på vort laboratorium (den spanske stamme) er mere patogen end andre kendtre PRRS-vira som for ek-] sempel den franske virus (Eksempel 8) og LV (Tabel 6 i WO-92/21375).
Ϊ 5 Vacciner _ 25 Gennem opfindelsen tilvejebringes en vaccine, som er i stand til at forhindre det porcine repro duktions- og respirationssyndrom (PRRS). Vaccinen har vist sig effektiv til forhindring af reproduktive forstyrrelser i søer som eksempelvis fødsel af dødfødte, mumificerede eller levende men svagelige smågrise, fornyet bedækning og lignende problemer som følge af den virus, der forårsager PRRS. At vaccinen fremkalder cellulær Immunitet i de vaccinerede dyr er også 30 blevet bekræftet.
Vaccinen indeholder en passende mængde af det virale PRRS-antigen, fra den spanske stamme og på inaktiveret form, samt et adjuvans og et konserveringsmiddel.
35 Undersøgelser foretaget med disse vacciner har bekræftet effektiviteten, som det fremgår af - Eksempel 7 og 8.
'-:'ϋ 13 DK 173128 B1
Endvidere har vaccinen vist sig at være effektiv til at undgå fornyet bedækning, som ellers kræves ved inficerede søer.
Faktisk blev søer, som var vaccineret med vaccinerne ifølge opfindelsen og var inficeret med 5 den PRRS-forårsagende vims, bedækket og blev drægtige ved den første ægløsning efter den foregående fødsel og afvænning af smågrisene.
5.1 Bestanddele 5.1 ,a Den antigene del 10 Som aktiv komponent indeholder vaccinen inaktiveret, viralt PRRS-antigen fra den spanske stamme i en koncentration større end eller lig med 105·5 TCID^ pr vaccine-dosis. Inaktiveringen kan foregå kemisk, blandt andet ved behandling med β-propiolacton eller andre konventionelle inaktiveringsagenser som f.eks, ethylenimin eller formaldehyd, eller fysisk.
15 5.1 .b Adiuvanser
Skønt det ved formuleringen af vaccinen både er muligt at anvende adjuvanser af aluminium-hydroxid-typen, Quil A eller blandinger heraf og olie-adjuvanser. har det vist sig (Eksempel 4), at man opnår de bedste resultater med et olie-adjuvans. Navnlig har et olie-adjuvans bestående af en blanding af Marcol 52, Simulsol 5100 og Montanide 886 givet meget gode resulta· 20 ler.
Marcol 52 er en mineralolie med lav vægtfylde, som forhandles af ESSO Espaftola, S.A.; Simulsol 5100 er en polyethoxyoleat-ether, som forhandles af SEPiC, og Montanide 888 er vandfri mannitol-ether-octadecenoat af høj renhedsgrad, som forhandles af SEPIC.
25
Det har vist sig, at adjuvanset spiller en væsentlig rolle for vaccinens effektivitet. Således beskriver et sammenlignlngseksempel (Eksempel 6) vaccinationen af søer med to forskellige vacciner, en so blev vaccineret under anvendelse af oiie-adjuvanset nævnt ovenfor (Ref. 1), og en anden so blev vaccineret under anvendelse af adjuvanset Munokynin® (Ref. 2). Skønt 30 begge vaccinationer ledte til serokonversion, viste det sig ved en eksperimentel infektion, at søerne, som var blevet vaccineret med vaccinen Ref. 1 blev beskyttet mod eksperimentel infektion med PRRS-virus, mens de andre søer, som var blevet vaccineret med vaccinen Ref. 2, ikke blev beskyttet, på trods af, at de på infektionstidspunktet havde antistoffer mod den aktuelle virus. Dette tyder på eller beviser, at et passende adjuvans kan være af stor betydning i 35 forbindelse med moduleringen og stimuleringen af immun-responset, principielt på det cellulære immunitetsniveau. Dette er yderligere blevet bekræftet i sammenligningsforsøg (Eksempel 7, Tabel 8) under anvendelse af den spanske stamme af PRRS-virus, da søer vac- 14 DK 173128 B1 cineret og genvaccineret med vaccinen Ref. 1 ikke gav noget serologisk respons på infektionstidspunktet, men ikke desto mindre blev beskyttet.
Det kunne dog også tænkes, at vaccinen Ref. 2 (med Munokynin®) er i stand til at fremkalde 5 cellulær immunitet. Hertil ville det være nødvendigt at tilsætte substanser, som forstærker celle-responset (CRP, Cell Response Potentiation), dvs. stoffer som styrker T-helper-celle subpopulationerne (Th-j og Th2), som eksempelvis IL-1 (interleukin-1). IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (gamma-interferon), vævsnekrosefaktoren og lignende substanser. Det er indlysende muligt også til vacciner med olie-adjuvanser at tilsætte disse PRC-substanser, hvorved a 10 man så ville styre disses celle-immunitefs-virkning.
Også andre typer adjuvans kan anvendes, som modulerer og immunostimulerer celleresponset, eksempelvis MDP (muramyldipeptid), ISCOM (Immuno Stimulerende Kompleks) eller liposomer.
jj 15 5.1 .c Konserveringsmidler m Et hvilket som helst konserveringsmiddel, som sædvanligvis finder anvendelse ved formulerin gen af vacciner, kan anvendes. Blandt disse kan nævnes Thimerosal (natriumsaltet af (2-car-boxy-phenylthio)-ethyl-kviksølv (ALDRICH).
20 5.2 Vaccinens fremstilling i
Vaccinerne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at blande den antigene del indeholdende inaktiveret viralt antigen og en anden del, adjuvanset, som kan være på oliebasis, men ikke
..L
behøver at være det, alt afhængigt af det valgte adjuvans. Eventuelt kan også tilsættes CRP-25 substanser til en hvilken som helst af de (o dele eller faser. Når der er tale om et olie-adjuvans, fremkommer en emulsion, fortrinsvis en dobbelt w/o/w (vand/olie/vand)-emulsion (når adjuvanset er en blanding af Marcol 52, Simulsol 5100 og Montanide 888).
5.3 Kontrol af vaccinen 30 Ud over de sædvanlige undersøgelser, som vaccinen må underkastes før indgift, dvs. for (i) renhed (bakterier, svampe, mycoplasmer og andre vira), (ii) identifikation, (iii) sikkerhed, (lv) styrke og (v) fysisk-kemisk kontrol, er der foretaget en række felt-undersøgelser (Eksempel 5.b) i relation til sikkerhed og effektivitet på i alt 5 farme, hvor 508 søer blev vaccineret og genvaccineret med en af vaccinerne ifølge opfindelsen, mens de resterende 472 søer 35 ikke blev vaccineret og indgik som kontrol-søer med henblik på samtidig vurdering af vacci-nens sikkerhed og effektivitet; på en af farmene påvistes nemlig efter vaccinationsprocessen den naturligt forekommende sygdom PRRS i ikke-vacclnerede dyr.
IS
:3f*j 15 DK 173128 B1 5.4 PosolQQi (dosering) og instruktion vedrørende vaccinens Indaift
Det har vist sig, at en dosis på 2 ml olie-vaccine med en koncentration af inaktiveret, viralt antigen større end eller lig med lO^TCID^,. indgivet dybt intramuskulært, medfører beskyttelse af en meget høj procentdel af de vaccinerede dyr mod PRRS.
5 Følgende vaccinationsprogram anbefales: • Første vaccination: Vaccination af alle avlsdyr (søer og omer) med genvaccination efter 21 dage. Herefter giver en dosis under hver laktation (søer) og (for omer) hver 6. måned.
• Efterfølgende vaccinationer: 10 - Dyr som skal bruges til avl: Første vaccination ved 6 måneders alderen, genvac cination efter 21 dage.
- Søer: Det tilrådes at vaccinere under laktationen, om muligt 15 dage før bedækning - Omer: Vaccination to gange årligt (hver 6. måned).
15 Hvis vaccinen ikke indeholder nogle CRP-substanser, kan disse alternativt injiceres et andet sted end inokulationen, men samtidigt.
6 Polyvafente vacciner I et ydertigere aspekt af opfindelsen anvises bi- eller multivalente kombinationsvacciner af for-20 skellige porcine patogener, som ud over det inaktiverede, vira le PRRS-antigen (den spanske stamme) indeholder et eller flere af de nedenfor nævnte patogener.
Således kan der fremstilles bi- eller multivalente vacciner indeholdende det inaktiverede, virale PRRS-antigen og et eller flere af følgende patogener: Actinobacillus pleuropneumonlae, Hæ-25 mophilus parasuls, Porcin parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhuslopathlae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcin respiratorisk coronavirus, Rotavirus eller de patogener, som forårsager Aujeszkys syge, svineinfluenza eller transmitterbar gastroenteritis.
30 EKSEMPLER
Eksempel 1 isolation af virus 1.A PrøvefremstiHina
Ud fra lungerne fra en dødfødt gris, afkom af en so med klassiske symptomer på PRRS (soen 35 havde ikke antistoffer mod Aujeszkys syge, porcin parvovirus, mund- og klovsyge, klassisk svinefeber, svineinfluenza (typerne H1N1 og H3N2) og transmitterbar gastroenteritis), fremstilles en 10% suspension i kultiveringsmediet DMEM, suppleret med en antibiotikaopløsning (PEG) bestående af 1000 lU/ml penicillin, 1 mg/ml streptomycin og 0,5 mg/ml gentamicin i et 16 DK 173128 B1 forhold lunge : DMEM-opløsning på 1 :10 (W/V). Den fremstillede suspension homogeniseres og henstår 1 time ved stuetemperatur (20-22eC). Homogenisatet nedfryses og optøs to gange, centrifugeres, og supematanten opbevares ved -70“C med henblik på anvendelse til infektion af de alveolære makrofager fra griselunger.
5 På lignende måde fremstilles prøver fra lungen af en levendefødt gris, som døde få timer efter fødslen. Endvidere udtages blod, som enten blandes med antikoaguleringsmiddel til Isolation af virus fra blodplasma, eller som ikke blandes med antikoaguleringsmiddel med henblik på opnåelse af serum.
10 1 B Præparation af alveolære makrofager fra ariselunaer
Alveolære makrofager fås fra lungerne af grise, som er seronegative overfor Aujeszkys syge, porcin parvovirus, mund- og klovsyge, klassisk svlnefeber, svineinfluenza (typerne H1N1 og H3N2) og transmitterbar gastroenteritis. De anvendte grise er mellem 7 og 8 uger gamle. Før ^ 15 ekstraktionen af lungerne anæstetiseres dyrene med phenobarbital-natrium og aflives. Straks ^ efter, efter ombinding under strubelåget, ekstraheres lungerne tillige med luftrøret. Den ekstra herede lunge vaskes eksternt med fysiologisk saltvandsopløsning, og der vaskes successivt | med 50 ml PBS suppleret med 2% PEG-opløsning af antibiotika, indtil i alt 500 ml PBS er I anvendt. De celler, som fremkommer ved disse skylninger, centrifugeres i 10 min. ved 300 g.
20 Centrifugerings-vasketrinnet gentages endnu to gange. De fremkomne celler vaskes med PBS
.L
' og PEG-opløsning af antibiotika og genopslemmes i DMEM-mediet (DMEM suppleret med ikke-essentielle aminosyrer (GIBCO), 1% 1 mM natriumpyruvat og 1% 2mM glutamin), 10% føtalt kalvesemm (FCS) og en 1 %o PEG-opløsning af antibiotika. Cellerne tælles i Newbauer kamre og til dette formål fremstilles en 1/1 O-fortynding af makrofagsuspensionen ved tilsætning I 25 af 0.4 ml DMEM-medium og 0,5 ml trypanblå-opløsning til 0,1 ml makrofagsuspension. Der opnås et celletal på 1 -1,2 x 109.
^ 1 .C Isolation af virus
En kultiveringsflaske med en overflade på 25 cm2 indeholdende en kultur af de tidligere frem-30 stillede alveolære makrofager fra griselunger (3 x 106 celler/ml) i DMEM-medium og 10% FCS inficeres med 1 ml af homogenisatet af en prøve stammende fra lungerne på en dødfødt gris (Eksempel 1 A). Man lader homogenisatet henstå i kontakt med makrofagkulturen i 1 time ved 37°C, pH 7,0-7,4 buffret med C02, og inkuberer ved 37eC i flere dage, idet den af virus på makrofagerne fremkaldte CPE observeres. 3-4 dage dpi observeres en CPE på 70-80%, hvorfor 35 kulturerne blev nedfrosset ved -80‘C.
-ym
TI
:ί= Samtidig fremstilles en kultur af alveolære makrofager fra griselunger, som ikke er inficeret, ^ hvilken kultur anvendes som negativ kontrol.
IBS
17 DK 173128 B1
Den isolerede virus subkultiveres, og man observerer, at CPE fra den anden dpi er 100%. Virus nedfryses ved -80'C med henblik på senere identifikation og karakterisering. Efter den fjerde passage i makrofager udføres tilsvarende titreringer i mikroplader med 96 brønde/huller, 5 og man får en gennemsnitlig titer på 1056TCID5o/ml i overensstemmelse med metoden ifølge Reed & Muench (Am. J. Hyg., 27, 493-497,1938 (det skal nok være 1983!!).
En prøve af den Isolerede virus (den spanske stamme) med betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, som er Isoleret fra en dødfødt gris' lunge, er i stand til eksperimentelt at reproducere 10 sygdommen og er deponeret hos ECACC den 29. juni 1993 med nummer V93070108.
På lignende måde isoleres vims fra levende og dødfødte smågrfse, afkom af søer, som er eksperimentelt inficeret.
15 Eksempel 2
Identifikation og karakterisering af virus
Eksempel 2.1 Eksperimentel reproduktion af sygdommen i drægtige søer Der anvendes tolv søer, krydsning af tysk landrace og store hvide, stammende fra farme med systematisk serologisk kontrol af virus fra Aujeszkys syge, mund- og klovsyge, porcin parvovl-20 rus, klassisk svinefeber, svineinfluenza (typer H1N1 og H3N2) og transmitterbar gastroenteritis. Endvidere udføres antistof-evaluerlngs-testen mod den virus, som forårsager PRRS.
Søerne overflyttes til forskningscentrets sikkerhedsstalde en uge før infektionen og anbringes i separate stalde. På et tidspunkt mellem dag 77 og 90 i gestationen inficeres so nr. 53, 76, 8, 25 62, 91, 93 og 19 intravenøst (IV) og intranasalt (IN) med to gange 5 ml af den spanske stamme af PRRS-virus, isoleret på alveolære makrofager fra griselunger og bærende betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91. fra fjerde passage på makrofager filtreret gennem et 200 nm filter og med en titer på 105·6 TCID^/ml. De resterende 5 søer (nr. 14, 40, 13, 30 og 85) inokuleres mellem dag 65 og 85 i gestationen med 5 ml virus, kun IN.
30
Under eksperimentet overvåges fødeindtagelsen, rektaltemperaturen og dyrenes kliniske tilstand dagligt, såvel som reproduktive forstyrrelser eller forandringer (for tidlig eller for sen faring, levende men svagelige smågrise, dødfødte smågrise, mumificerede fostre og sunde smågrise).
For at kunne udelukke de patogener, som er nævnt ovenfor, tages blodprøver fra søerne før og efter infektionen, som viser, at dyrene var seronegative før og efter infektionen, og seropositive overfor PRRS efter infektionen (se Tabel 1, afsnit 4.3.1).
35 18 DK 173128 B1
De reproduktive resultater fremgår af Tabel 2 og 3. Som det fremgår af Tabel 2 var der blandt de fødte 93 smågrise 15 mumificerede, 35 dødfødte, 22, som fødtes levende, men døde på tredjedagen, og 21, som overlevede den første uge.
5
Nogle søer viste tegn på manglende appetit i 2*4 dage, på dag 6 og 8 efter infektionen, mens andre søer viste tegn på manglende appetit på dag 2 efter Infektionen. Ingen tilfælde af forhøjet temperatur (hypertemni) observeredes. 4 søer (nr. 8, 62, 92 og 93) farede for tidligt (1-6 dage praematurt), mens 3 søer farede 1-2 dage for sent.
10
Blandt de levendefødte smågrise havde 1 eller 2 pr. kuld øjen-ødemer. De svage smågrise udviste mangel på koordination, parese (lammelse) af bagpartiet, strittende børster og myoklonia (muskeltrækninger). Ved nekroskopl af nogle af de dødfødte og svagelige smågrise observeredes tilstedeværelse af en klar væske i rigelige mængder i brysthulheden (thoracic 15 cavity). Raske smågrise født af Inficerede mødre og aflivet på 8. -12. dagen af deres liv udviste grå konsoliderings-områder. Ved mikroskopi observeredes den betydeligste ændring at være en let multifoci interstitiel pneumoni med forstørrelse af de alveolære septi som følge af infiltrering af eller med mononucleære celler. Disse læsioner sås i alle de dyr, som blev undersøgt i dette forsøg.
20
Som det fremgår af Tabel 3, var der ud af 65 smågrise 36 dødfødte, 26 levende, men svage-I lige, der døde på 2. dagen efter fødslen, og 3, som overlevede den første uge. En so farede 12 dage for tidligt (nr. 40), mens de andre farede 1 eller 2 dage for tidligt. De kliniske symptomer på svagelige smågrise ligner de, som observeredes via IN+IV. Også interstitiel pneumoni 25 observeredes. De inficerede søer viste ikke tegn på manglende appetit eller hypertermi.
Den mest relevante forskel på de to infektionssystemer er, at ved infektion IN+IV observeres mumificerede smågrise, og at 1-2 af de levendefødte smågrise i hvert kuld udviser øjenøde-mer.
30
Sammenfattende kan det konkluderes, at der ved omkring 80 dage af gestationen via begge infektionsveje (IN og IV) ved infektion med den virus, som er isoleret fra dyr, der er blevet infl-,,, ceret på naturlig måde (den spanske stamme), observeres reproduktion af sygdommen PRRS i drægtige søer og observeres en høj andel af mumificerede fostre, dødfødte smågrise og le-35 vende men svagelige smågrise i et forhold, som er meget lig det ved akutte naturlige infekti-~ onsudbrud observerede. Det tilrådes at inficere kunstigt IN, da dette er den naturlige felt-infek-
(M
I tionsve] og derfor den bedst egnede måde at vurdere vaccinens effektivitet på.
li i T?i 19 DK 173128 B1 I kraft af dette eksperiment har det også været muligt at opstille en model for eksperimentel infektion i drægtige søer, som tillader vurdering af vaccinens effektivitet.
Tabel 2 5 ^___ IN + IV___
So Infektions- Faring Antal Mumi- Svagelige, død- Tilsyneladende Intersti- tidspunkt (gesta- grise i fice- døde inden- fødte raske grise tiel nr. (gestations- tions- alt rede for 48 timer døde levende pneu- dage) dage) mellem efter 1 monl 2. og 7. uge dag 53 77 115 9 3 2 0 - 4 4/4 76 77 116 11 2 4 1 - 4 f.U.
8 77 110 12 2 4 1 - 5 5/5 62 80 113 16 3 6 4 3 3/3 91 90 109 14 1 8 1 4 i.u.
93 88 110 17 4 2 11 - - i.u.
19 1 88 116 14 4__1__8 - 1 I.u.
93 15 17 35 5 I 21
Tabel 3 |_|_|_i__IN____
So Infektions- Faring Antal Mumi- Svagelige, død- Tilsyneladende Intersti- tidspunkt (gesta- grise i fice- døde inden- fødte raske grise tiel nr. (gestations- tions- alt rede for 48 timer døde levende pneu- dage) dage) mellem efter 1 moni 2. og 7. uge dag 14 65 111 15 - - 12 - 3 i.u.
40 82 102 12 - 12 i.u.
13 80 113 12 10 2 i.u.
30 80 113 15 12 3 i.u.
85 I 85 112 11__4__7 - - i.u.
65 - 26 1 36 1 - 3 10 i.u. betyder I begge tabeller "ikke undersøgt" 20 DK 173128 B1
Eksempel 2.2 Eksperimentel reproduktion af sygdommen i småorise
Dette eksperiment har til formål at undersøge, om den isolerede virus {den spanske stamme), som giver anledning til reproduktionsforstyrrelser i søer, er i stand til at foranledige kliniske symptomer samt makroskopiske og mikroskopiske læsioner i lungerne på 2 måneder gamle 5 smågrise. 10smågrise inficeres IN med 5 ml virus, den spanske stamme, med en titer på 105·6 TCIDjo/ml, og 6 andre smågrise fungerer som kontroldyr (alle stammer fra 2 kuld). Dyrene aflives på dag 3,7. 8, 9 og 11 pi (efter infektionen). I Tabel 4 er de opnåede resultater vist.
Tabe 4
Gris nr. Inficeret / Kontrol dpi (dage efter Antistoffer Interstitiel Isolation af (I /K) infektionen) pneumoni virus 2 I 3-2+ lu.
12 I 3-2+ i.u.
11 K 3 - i.l. i.u.
1 I 7 1:80 4+ + 14 I 7 1:80 2+ + 13 K 7 - i.l.
10 I 8 1:160 4+ + 15 I 8 1:160 2+ + 1 8 K 8 - i.l.
17 K 8 i.l.
4 I 9 1 160 4+ + ,, 5 K 9 - i.l.
] 20 I 11 1:160 4+ + i 18 I 11 1:320 3+ + 9 I 11 1:320 3+ 6 K 11 - i.l.
10 i.l. betyder "ingen læsioner" i.u. betyder "ikke undersegt’ 2+ betyder let interstitiel pneumoni Z 3+ betyder intermediær interstitiel pneumoni 4+ betyder svær Interstitiel pneumoni 15
Under de 11 dage, som eksperimentet varer, observeres hverken kliniske respirationssymptomer eller hypertermi, skønt de inficerede dyr tabte i vægt sammenlignet med de ikke-inficerede dyr. Ved mikroskopi findes det mest relevante aspekt at være tilstedeværelsen af multiple konsolideringsfoci i lungerne, overfyldte eller hævede lymfeknuder i mandibola (underkæben) “ 20 og nogen intestinal hæmorrhagi (blødning). På det mikroskopiske niveau observeres interstitiel pneumoni.
21 DK 173128 B1
Virus isoleres fra de opløsninger, som er fremkommet ved skylning af de inficerede dyrs lunger i en frisk kultur af makrofager, men der isoleres Ikke virus fra kontroldyrene, hvor der heller ikke observeres serokonversion eller makro- eller mikroskopiske læsioner på lungeniveau.
5 Ved celletællinger på skyllevæsken fra de inficerede dyrs lunger findes 30% døde celler (makrofager), hvilket kan være en afgørende faktor ved sekundære infektioner på grund af ødelæggelsen af et immunologisk nøgle-forsvarselement (makrofagerne).
Fraværet af respirationssymptomer kan skyldes, at de eksperimentelle infektioner er udført i 10 stalde, hvor der desinficeres kontinuerligt, og hvor derfor bakterie-koncentrationen er meget lavere end i flokke, som lever under felt-betingelser.
Eksempel 2.3 Følsomhed overfor chloroform
Metoden Ifølge Feldman, H. og Wang, S. (Afsnit 4.3.3) anvendes, og resultatet bliver, at den 15 isolerede virus har en lipidkapsel, da der forekommer et titer-fald på 4 log10 fra kontrolkultu-rerne til de chloroformbehandlede.
Eksempel 2.4 SekvenserinQ af det virale aenom n Oprensning af vims 20 Den på alveolære makrofager fra griselunger replikerede virus oprenses ved filtrering og centrifugering i en 10-50% metrizamid-gradient (SIGMA), hvilket resulterer i et bånd, der atter centrifugeres, jf. afsnit 4.3.4. Der køres en elektroforese I polyacrylamid-gel med den oprensede virus, og et immunoblot fremkaldes med et specifikt serum, der viser proteiner med en tilsyneladende molekylvægt på 15, 23, 54 og 66 kDa (kilo-Dalton).
25
ίΠ Oprensnlno af det virale RNA
Det virale RNA oprenses ved anvendelse af et kommercielt kit (PHARMACIA), idet poly(A)-halen af RNA bindes til en cellulose-oligo(dT)-matrix og efterfølgende elueres,
30 ίίΩ Syntese af cDNA
Der anvendes et kommercielt kit (BOEHRINGER MANNHEIM), jf. afsnit 4.3.4 iii. ivl Kloning qq karakterisering af cDNA-kloneme cDNA klones i en vektor afledt af pUC18, og der fås en række kloner Indeholdende den kom-35 plette nucleotidsekvens svarende til ORF nr. 3-7.
22 DK 173128 B1 v) Sekvensering oq sammenligning af sekvenserne med LVs
Resultaterne af sekvenseringen af cDNA hidrørende fra den virus, som er isoleret i vort laboratorium (ORF nr. 3-7), så vel som sammenligningen med LV-sekvensen, er omtalt i afsnit 4.3.4 v, hvoraf det fremgår, at der på amlnosyrenlveau er omtrent 94,9% homolog! og I alt 5 47 anderledes aminosyrer, hvoraf 35 repræsenterer ikke-konservative substitutioner. Disse forskelle på aminosyrenlveau kan være ansvarlige for den forskellige patogenicitet af diverse isolerede PRRS-virusstammer.
Eksempel 3 10 Formulering af en vaccine
Der fremstilles en vaccine mod PRRS i form af en emulsion, idet fremgangsmåden beskrevet - nedenfor følges.
En kultur af alveolære makrofager fra griselunger inficeres med MOI (multiplicity order infec-15 tion) på 0,001 og inkuberes ved 37eC i 24 timer, hvorefter kulturmediet erstattes med infekti-s onsmediet (DMEM suppleret med 2% FCS). Kulturen inkuberes i 4 dage ved 37eC, indtil der 1 observeeres 70-80% CPE. Herefter udføres en IPMA-test med henblik på at bekræfte identifi kationen. Virus opsamles ved vakuum-aspiration og nedfryses ved -80'C.
' 20 Den virale suspension, som er beregnet på at indgå i vaccinen, bør have en minimun-tåer på 105·5 TCIDøo/ml (før Inaktiveringen) og må ikke være kontamineret med bakterier, svampe, 1 mycoplasmer eller andre vira. Hvis titeren er lavere, må den justeres ved opkoncentrering af antigenet.
25 Til inaktivering af den virale suspension tilsættes 2%* β-propiolacton-opløsning, og der omrøres natten over ved 4*C, idet pH holdes på 7,4 ved tilsætning af 0,5 N NaOH. Efter afsluttet inaktiveringsperiode opbevares den virale suspension ved 37eC i 1 time.
Herefter fremstilles følgende: _ 30 a) en antigen fase af det inaktiverede virale antigen I en minimumkoncentration på _ 105·5 TCID^/dosis og konserveringsmidlet; samt b) en olie-fase bestående af Marcol 52, Simulsol 1500 og Montanid 888.
Den til stadighed omrørte vandfase tilsættes langsomt reaktionsbeholderen indeholdende olie-35 fasen, som også omrøres. Efter afsluttet tilsætning fortsættes omrøringen i 10 minutter.
'"t?· ^ Særligt foretrukne vacciner mod PRRS (som er i stand til at forhindre PRRS) omfatter pr. dosis på 2 ml: m »mi 23 DK 173128 B1 a) 53% af en antigen fase indeholdende: i) det virale PRRS-antigen i DMEM-kulturmediet, den spanske stamme, inaktiveret med β-propiolacton i en minimum-koncentration på ...................................................0,5 x 106 TCIDgo , og 5 ii) thimerosal....................................................................................0,01%; og b) 47% af en olie-fase Indeholdende: i) Marcol 52.................................................................................790,0 mg ii) Simulsol 5100.............................................................................70,0 mg iii) Montanide 888............................................................................80,0 mg 10
Forholdet mellem olie-/vandfase er angivet som vægt/volumen-forhold (W/V).
Denne vaccine bærer betegnelsen MSDRef. 1. Vaccinen underkastes relevant kontrol før anvendelsen.
15 På tilsvarende måde fremstilles en anden vaccine med adjuvanset Munokynin® (aluminiumhydroxid og Quil A, leverandør; American Cyanamid), idet mængden af inaktiveret virus fastholdes. Denne vaccine benævnes MSD Ref. 2.
20 Eksempel 4
Evaluering af adjuvanset
Der foretages en feltundersøgelse med ialt 128 søer, hvoraf 49 vaccineres med en dosis af vaccinen med betegnelsen MSDRef. 1, 50søer vaccineres med en dosis af vaccinen med betegnelsen MSD Ref. 2 (Munokynin®), og de resterende 29 vaccineres ikke og fungerer som 25 kontroldyr. Efter 22 dage genvaccineres søerne med en dosis af den pågældende vaccine.
Følgende parametre undersøges: 1. Serologisk respons ved hjælp af IPMA-bestemmeise til følgende tidspunkter T0: Vaccination og blodprøveudtagning 30 T22 ' Genvaccination og blodprøveudtagning
Tsi: Blodprøveudtagning 50 dage efter vaccinationen 2. Reaktioner af generel type (appetit, hypertermi etc.)
De opnåede resultater er vist i Tabel 5 og 6, som viser andelen af søer med positiv serologisk 35 reaktion (Tabel 5) og det aritmetiske gennemsnit af de opnåede serologiske titre (Tabel 6).
24 DK 173128 B1
Tabel 5
Andelen af dyr med serologisk reaktion + T0 T22 T51 MSP Ref. 1__;___59%______ 100%_ MSP Ref, 2___:___40%__87%_
Kontrol 5
Tabel 6
Aritmetisk gennemsnit af de serologiske titre MSP Ref. 1__;__58 _200_ MSP Ref. 2____;__37___133_
Kontrol - 10 Der observeres ingen lokale eller generelle reaktioner af betydning.
Resultaterne viser, at der opnås en positiv serokonversion med begge vacciner, omend noget Ί højere med MSD Ref. 1 (olle-adjuvans). Ved genvaccinationen observeres en højere serotonin versions-procentdel, og det aritmetiske gennemsnit af de opnåede titre er højere end i dyrene j 15 vaccineret med MSD Ref. 1.
m
Eksempel 5 Sikkerhed for søer
Eksempel 5A På laboratorieniveau 20 Eksempel 5A.1 Førsteoanosdraeotioe søer
Der udvælges 18 førstegangsdrægtige søer (tysk landrace X store hvide) fra en svinefarm, og de fordeles i to stalde med 9 søer pr. stald på en sådan måde, at de søer, som I Eksempel 3 ovenfor blev vaccineret med den samme vaccine (MSD Ref. 1 eller -2), anbringes I samme stald.
25 — Ni søer vaccineres dybt IM med en dosis på 2 ml af vaccinen MSD Ref. 1 indeholdende 105·5 TCIDgø/dosis inaktlveret virus-titer, og genvaccineres med en anden dosis af samme titer zim 25 DK 173128 B1 20 dage senere. De andre ni søer vaccineres og genvaccineres samme dage med vaccinen MSD Ref. 2 (dosis på 2 ml, 105·5 TCID^/dosis inaktivere! virus-titei).
I de første 5 dage efter inokulationen observeres følgende: 5 a) Lokal reaktion
Makroskopisk observation af inokulertngsstedet og palpering, idet graden af inflammation sammenlignes med objekter af kendt størrelse, b) Generel reaktion
Makroskopisk observation af dyrene og vurdering af deres appetit. I negative tilfælde checkes 10 rektaltemperaturen hver 12. time, indtil hypertermien eller de andre negative symptomer er forsvundet.
Det viser sig, at der er en let inflammatorisk reaktion i visse søer, overvejende på inokulations-stedet, men den forsvinder i alle tilfælde Indenfor få dage; der observeres ingen puruiens-dan-15 nelse (pus-). Kun en af søerne nægtede at æde alt foderet ved den første fodring efter inokulationen, men fødeindtagelsen var normal ved de efterfølgende fodringer, således at det ikke var nødvendigt at tage rektal-temperaturen. Der observeres Ingen væsentlige forskelle som reaktion på de forskellige vacciner, der undersøges, og på denne basis kan det konkluderes, at begge vacciner er sikre.
20
Eksempel 5A.2 Dræatioe søer
Syv drægtige søer (tysk landrace X store hvide) fra en svinefarm udvælges tilfældigt: 6 førstegangsdrægtige søer på omkring 9 måneder og 1 flergangsdrægtig so på 3 år og 7 måneder.
25
Kun vaccinen med betegnelsen MSD Ref. 1 anvendes.
Søerne vaccineres dybt IM med en dosis på 2 ml vaccine, som indeholder inaktiveret virus med en titer på 105·5 TCID^/dosIs, og 15 dage senere genvaccineres med en dosis af samme 30 titer.
I de første 5 dage efter inokulationen gøres følgende observationer a) Lokal reaktion
Makroskopisk observation af inokuleringsstedet og palpering, idet graden af inflammation note-35 res og sammenlignes med objekter af kendt størrelse.
b) Appetitløshed
Makroskopisk observation af dyrene og undersøgelse af appetitløshed c) Rektaltemperatur 26 DK 173128 B1 Måling af rektaltemperaturen 24 timer efter vaccinationen og 24 timer efter genvaccinationen.
Der konstateres en let lokal reaktion hos to af dyrene, men som dog ikke er alvorlig på grund af ringe størrelse og forsvinder i løbet af få dage. Ingen tilfælde af appetitløshed og hypertermi 5 observeres. På basis heraf kan det konstateres, at vaccinen er sikker.
Eksemoel 5.B Sikkerhed qq effektivitet i felten
Denne undersøgelse foretages på 5 farme anført nedenfor. Et variabelt antal søer fra hver farm vaccineres dybt IM med en dosis på 2 ml af vaccinen MSD Ref. 1 indeholdende en titer af 10 inaktiveret virus på 105·5 TCID^/dosis med genvaccination 21 dage senere med en anden dosis af samme titer, mens de andre søer ikke vaccineres og anvendes som kontroldyr:
Farm Antal vaccinerede Antal kontroldyr Dyr i alt j RAMON DEL QUINTA 19 11 30 _(Banyoles)_________ CAL SABATER 46 34 80 _(Orriols)________ E. CANELA 153 147 300 - (Preixana)_____ R. CUNILLERA 127 123 250 _(L’AIbi)___________________ INVERSORS PICBER 163 157 320 (Bellpuig)____ SUM 508 472 980
Efter observation af lokale og generelle reaktioner må vaccinen betegnes som sikker. Lokale 15 reaktioner observeres kun i 1% af dyrene. Ingen ændringer observeredes på farmene nævnt ovenfor med hensyn til de observerede produktive parametre, når der sammenlignes med deres kliniske historie.
Med hensyn til serologisk respons ses der på nogle farme serokonverslon I forhold til eller som 20 reaktion på vaccinen, mens responset på andre farme er negativt. Dette indikerer imidlertid ikke lav beskyttelsesgrad. da seronegative dyr ved eksperimentel infektion i laboratoriet modstår eksperimentel infektion (Eksempel 7 og 8).
|jj I forbindelse med overføring af immunitet fra vaccinerede modersøer til deres afkom ses et ” 25 stort fald i antistof-titer ved 1 måneds-alderen.
ttI
ffi mim 27 DK 173128 B1 I vaccinerede og genvaccinerede søer, som er serologisk positive, er der et stort fald i antistof-titer 2 måneder efter genvaccinationen.
5 Eksempel 6
Undersøgelse af celle-immuniteten
Der anvendes fem drægtige søer (tysk landrace X store hvide) fra en svinefarm. Dyrene overflyttes til forskningscenterets sikkerhedsstalde.
10 Tilfældigt udvælges to søer, som vaccineres med vaccinen med betegnelsen MSD Ref. 1. En anden so vaccineres med vaccinen MSD Ref. 2. De to resterende søer vaccineres ikke.
Søerne vaccineres dybt IM med en dosis på 21 af vaccinen MSD Ref. 1 eller -2 indeholdende inaktiveret virus med en titer på 105·5 TCID^, og 20 dage efter vaccineres søerne med en an-15 den dosis af samme titer.
Senere, mellem drægtighedsperiodens dag 77 og 90, inficeres alle søerne IN med 5 ml af virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 med en titer på 105 θ TCID^/ml. På infektionstidspunktet bekræftes det, at alle de vaccinerede søer har antistoffer mod den PRRS-forårsagende virus (positiv 20 serologi). I Tabel 7 er vist de samlede reproduktive resultater:
Tabel 7
Antal Vaccin Antal Antal raske, Antal svagelige, Antal grise Antal søer e smågrise levendefødte levendefødte stadig i live efter dødfødte smågrise smågrise den første uge smågrlse 2 MSD 23 20 - 20 3 __Ref. 1_______ 1 MSD 12 - 6 6 __Ref. 2_________________ 2 - 24 7 - 17 25 Det fremgår, at de søer, som er vaccineret med vaccinen MSD Ref. 1 (olie-adjuvans) modstår infektion bedre end de søer, som er vaccineret med vaccinen MSD Ref. 2 (vandigt adjuvans), hvilket kunne betyde, at adjuvanset spiller en betydelig rolle for etableringen af den cellulære immunitet.
28 DK 173128 B1
Eksempel 7
Effektivitet i drægtige seer
Der anvendes elleve avlssøer (tysk landrace X store hvide) fra en svinefarm. Dyrene overføres til forskningscenterets sikkertiedsstalde.
5
Tilfældigt udvælges tre søer (so nr. 57, 63 og 74), som vaccineres med vaccinen MSD Ref. 1.
Tre søer (nr. 15, 18 og 23) vaccineres med vaccinen MSD Ref. 2, og de resterende 5 søer (nr. 14,40,13, 30 og 85) vaccineres ikke.
10 Søerne vaccineres dybt IM med en dosis på 2 ml af vaccinerne MSD Ref. 1 eller -2 indeholdende inaktivere! virus med en titer på lO^TCID^dosis, og genvaccineres med en anden dosis af samme titer 20 dage senere.
Lokale og generelle reaktioner noteres.
15
Dyrenes serologiske respons undersøges ved IPMA-testen efter følgende skema: TQ : Blodprøveudtagning og vaccination
Tjo : Blodprøveudtagning og genvaccination 1 T42: Blodprøveudtagning ] 20 T7e: Blodprøveudtagning og eksperimentel infektion ' T8: Blodprøveudtagning efter den eksperimentelle infektion T25: Blodprøveudtagning efter den eksperimentelle infektion
Tgo: Blodprøveudtagning efter den eksperimentelle infektion *' 25 Den eksperimentelle infektion foretages i forskningscenterets sikkerhedsstalde. Alle dyrene
.L
inficeres IN med 5 ml af den virulente virus PPRS-CY-218-JPD-P5-6-91 med en titer på lO^TCIDsc/ml. Det serologiske respons, såvel som antallet af levendefødte og dødfødte smågrise fra hver so, noteres. Der udtages blodprøver fra smågrisene præ og post colostrum, og fra de dødfødte og de til forskellige tidspunkter aflivede smågrise udtages prøver af lunge 30 og hjerne med henblik på isolation af virus og histologisk undersøgelse.
Tabel 8-10 nedenfor viser de opnåede resultater: -ϊϋ 29 DK 173128 B1
Tabel 8
Serologiske resultater
Nr. To T20 T42 T78 T8 T25 T50 _15_____:___1/160 1/160 1/640 1/1280 i.u.
18__;___-___1/80. _ 1/80 1/320 1/640 1/320 23__:__1/160 1/160 i.d.__Ιό,__Ld.__Ld.
57__-__1/160 1/160 1 /320___1/320 1/1280 1/160 63__-___1/80 1/80 1/160 1/640 1/1280 1/160 74____:__1/80 i.u. 1/160 1/640 1/2560 Lu._ c14__- ___-_________ 1/1280 1/2560 i.u.
c40__-__-__-__-__i.u. 1/1280 i.u.
c13__:___-____-____-____Lir___1/320___i.u.
c30__:__- -___-___i.u. 1/320 Lu.__ c85 i.u. 1/320 i.u.
I.u. betyder "ikke undersøgt" 5 i.d. betyder "ikke drægtig" DK 173128 B1 0 g £
S § c EJ
*C C ® 3 CT — "Ό O ifSJ »CM· · 1 i I" ^
1 i s I
ω ® S
lis 5 S r ? g ^ ·· 111·. il.
i « e i ® » ^ T3
TI
2 _0> ,1 I Μ . 53 J! N O S
I E
0 w £ 0) iff 1 I ? o> 2r — ico to cm i co 111 6 I &
Si .g1 ' ·* 1 1 2 S! ·* I
1 s “1 “ - ϊ ·» i * I i
1 S I? If ..........I
: ε 1 I - I
* £ S £ f ® -c SC CD „
s o S C , t— CO CO Ifl (Μ (Μ Λ r- B
I E w o f
CO (Λ c S
: ------------------Ϊ 111 „ i ? ^ S " ‘ . · CD ... * * E E Ϊ e*
« « jc S
w ° -
_ .j. 3 I
c § co cm T- »^N-rNnnn J
Γ B ϋ Ί— Οτ-τ-τ— o»— T-T— ._
CO ft) 2 t— t— S
S § I
___________________i ~ 18 , ® -o i i 1 IS g ^ « 5 C S CO 00 cOO)COtf)CMOQtf> “ .2 5 .2 oo r~- coi^oocooooococo v s a. « 1
II f I
™; ”3 I S
” 4 Si»?>5:SV?S!2S8li ,rn Z t-^cn10^^ υυ o o o.
—— CQ i "ψ%
^HI
"ΊΗ1 31 DK 173128 B1
Tabel 10
Smégrisenes serologi A. Vaccinerede søer
Dyr Afkom nr. Serologi Serologi Isolation af nr. (nummeret i præ-colo- post-colostrum virus fødselsorden) strum 15® i.u. i.u. i.u.
_^__3 dage__10 dage__ 18__1___:___Lu.___Lu.___:_ __2__- _____i.u.__Lu___:_ __7 i.u. 1/640 1/160__- __8__i.u. 1/2560 1/320 - __9___i.u, 1/1260 1/640 - __10 i.u. 1/1280__1/320 __11__i.u.___1/1280-1/2560 1/640 -_ __12 i.u.__1/2560 ___1/640 _ " _ ____13___Lu.__£1/2560__1/160 - __14 Lu.__1/1280 1/160 ^___ 15 Lu. 1/2560 1/160 23 lå. ' LcL i.d. Ld ' ^^__4 dage__8 dage__ 57 I 1 I - 1/320-1/640__1/320__- __2___ 1/320-1/640 1/160-1/320 - __3_____;___1/640___Lu__- __4___-__1/320-1/640___Lu___- 5 - 1/640 i.u.
____1 dag__8 dage__ 63 I 1 I i.u. £1/2560 __1/640______-_ __2 Ju___£1/2560 1/320 -_ __3___|U__1/2560 1/320-1/640 __4__iu__1/2560 1/640-1/1280__- __5__ 1/1280__ 1/320__- __6__ 1/2560__1/640___- __7___Lu__1/640-1/1280 1/320____- 8 i.u. 1/1280 Lu.
74a Lu - * 32 DK 173128 B1 B. Kontrolsøer (ikke vaccineret)
Dyr nr. Afkom nr. Serologi Serologi Isolation (fødsels- præ-colo- post-colo- af vi- række- strum strum rus følge) __=4— _i___12t__38t__5 dage 9 dage__ C14 I 1 I i.u. ^1/2560 >1/2560 1/1280 1/640 __2 - >1/2560 >1/2560 1/1280 1/1280 3 >1/2560 >1/2560 1/1280 1/1280 1/1280 c40 - i.u.
____9 dage__ c13 I 1 I - ____1/160__+ __2__:__1/160__- __3__-___1/320__- 4 - 1/320 c30 - I.u. i.u.
c85 i.u. i.u. i.u.
a: Disse søer døde på grund af aN for høj temperatur t omgivelserne Der foretoges kejsersnit svarende til 1 112 gestationsdage 5 Lu.: Ikke undersøgt 1 ·: Negativ J +: Positiv ' I: Timer i.d . Ikke drægtig 10
Det fremgår af de opnåede resultater, at der er positiv serokonversion mod den virus, som forårsager PRRS. Der er desuden en tilfredsstillende reaktion på eksperimentel infektion, når sammenlignes med kontroldyrene, hvor de fleste fostre døde.
1 15 Man må altså konkludere, at denne vaccination er en effektiv forholdsregel mod PRRS.
Eksempel 8
Vaccinens effektivitet mod eksperimentel infektion, når der anvendes et andet PRRS· forårsagende agens (kryds-beskyttelse) 20
Dette eksperiment har til formål at undersøge effektiviteten af vaccinen med betegnelsen ~ MSD Ref. 1 ved en eksperimentel infektion, hvor der anvendes 2 patogene stammer af den PRRS-fremkaldende virus.
!M
~ 25 De anvendte PRRS-stammer er: = i) den spanske stamme, PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91; og ΊΒΪ
H
33 DK 173128 B1 ii) den franske stamme, SDRP II 8B, leveret af Dr. E. Albina på Taboratoire Central de Recherches Avicole et Porcine," Ploufragan, Frankrig.
Den anvendte vaccine er MSD Ref. 1, hvis formulering er givet i Eksempel 5.
5
Der anvendes 30 søer, som er seronegative mod de PRRS-fremkaldende vira, og som er på et stade i deres cyklus, som ikke omfatter perioden 10dage før til 10 dage efter bedækning og heller ikke perioden 10 dage før til 10 dage efter faring.
10 Dyrene Inddeles i fire grupper: A: 10 søer vaccineres og genvaccineres !M og inficeres IN med den spanske stamme PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91.
B: 5 søer vaccineres ikke og inficeres IN med den spanske stamme PRRS-CY-218-JPD- P5-6-91.
15 C: 10 søer vaccineres og genvaccineres iM og inficeres IN med den franske stamme SDRP II 8B.
D: 5 søer vaccineres ikke og inficeres IN med den franske stamme SDRP II8B.
Tyve søer fra gruppe A og C ovenfor vaccineres med en dosis på 2 ml af vaccinen med beteg-20 nelsen MSD Ref. 1 dybt IM og genvaccineres 21 dage senere med samme dosis af vaccinen.
Herefter, mellem dag nr. 70 og 80 i gestationen, inficeres alle søer eksperimentelt IN med Gruppe A og B: 5 ml virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 med en titer på 105·8 TCID^ml; og Gruppe C og D:5 ml virus SDRP II 8B med en titer på 105·8 TCID^/ml.
25
Undersøgte parametre 1. Serologisk respons ved IPMA-assay til tidspunkterne: T0: Blodprøveudtagning og vaccination Τ2Γ· Blodprøveudtagning og genvaccination 30 T41: Blodprøveudtagning T,: Blodprøveudtagning og infektion Τμ7: Blodprøveudtagning 7 dage efter infektionen.
2. Måling af rektaltemperatur, lokal reaktion og generel reaktion i 4 dage efter vaccination og genvaccination, eller indtil (den forhøjede) temperaturen) eller eventuelle kliniske sympio- 35 mer forsvinder.
3. Måling af rektaltemperatur, observation af fødeindtagelse og kliniske symptomer i 6 dage efter den eksperimentelle infektion.
34 DK 173128 B1 4. Påvisning af antistoffer i serum og isolation af virus I serum og i monocytter ekstraheret fra fuldblod.
5. Reproduktionsparametre på faringstidspunktet, eksempelvis antallet af levendefødte små-gri5e, antallet af dødfødte eller mumificerede smågrlse og antallet af levende men svage- 5 lige smågrise, som dør inden for den første uge.
6. Bestemmelse af koncentrationen i serum af tilstedeværende virus ved titrering på makrofager baseret på CPE.
7. Bestemmelse af virus i smågrisenes pleurafvæske (pteura=lungehinden) og lunger.
10 Resultaterne af reproduktionsparameter-undersøgelsen er vist i Tabel 11-12 (infektion med PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) og 13-14 (infektion med SDRP li 8B).
Tabel 11
Vaccinerede søer 15 Infektion med PRRS-CY-218-JPD-P5-8-91
So nr. Antal små- Heraf Heraf sva- Heraf levende, Heraf Heraf i live grise i alt raske gelige skævbenede dødfødte efter den første ' _______ (splay-legged) uge I 37a 14_________________ ] 39__6___6 - :__:______5_ II 86__12___8________2 1_______1____7 45__10_______7________1___:_______2_________8,___ 19__10___9________1__:_________-___________8__ _38__9__8_____________^____- 1___8 41__7__5__:________2___5 71__y______6______1____;_________4___6 36 10__8_____1__1_____2_____6____ 26b_______
Ialt 75 55 6 2 12 51 a: En anden sygdom (ikke PRRS) b: Syg. døde før infektionen %-del levende smågrise: 88% (51 overlevende ud af 75) 20
Her opnås en beskyttelsesgrad på 68%, når man sammenligner antallet af levendefødte små-“ grise med antallet af grise, der overlever den første uge. Det faktum, at den eksperimentelle infektion er langt kraftigere end den naturlige infektion i felten, gør, når man betragter resulta-Ti terne ovenfor, at man har endnu større forventning til de fremtidige beskyttelsesmuligheder.
59 τπ mem 35 DK 173128 B1
Tabel 12
Ikke-vaccinerede søer Infektion med PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91
So nr. Anlal små- Heraf Heraf sva- Heraf levende, Heraf Heraf i live grise i alt raske gelige skævbenede dødfødte efter den første ____ (splay-legged) uge 63__9____-______ - 1_____8__-_ 88__6___-__3___:___3__-_ 79 8____-_______3____-__5______-_ 22__12____2________ - ______-______10__ ________1_ 28__7__3__:__-__4__3 I alt 42 5 6 1 30 4 %-del levende smågrise: 9,5% (4 overlevende ud af 42)
Den spanske stamme, som er anvendt ved infektionen, er ekstremt patogen (90,5%), da kun 4 smågrise ud af 42 overlever den første uge.
Tabel 13
Vaccinerede søer
Infektion med SDRP II 8B
So nr. Antal små- Heraf Heraf sva- Heraf levende. Heraf Heraf i live grise i alt raske gelige skævbenede dødfødte efter den første ________________r__(splay-legged)__uge 51__13___10____2_____________1__10 27__14______12___1 -____1__11 16 __9___8__:__:_ 1__7 17 __15____13____:__ -_____2__12 1__7___^_ ;__:__________-______7_______ 8__15__13____:__:__2___13 57__10__9___-__-__1___8 61__12__8__1____;__3 8 78__10 I 10 I - _I - I 10 52°_______ I alt 105 I 83 | 4 | - | 11 | 86 0 : Syg, død af anden irsag %-del levende smågrise: 82% (86 overlevende ud af 105) 36 DK 173128 B1
Der observeres omkring 82% beskyttelse.
Tabel 14
Ikke-vaccinerede søer
5 Infektion med SDRP II 8B
So nr. Antal små- Heraf Heraf sva- Heraf levende, Heraf Heraf i live grise i alt raske gelige skævbenede dødfødte efter den første (splay-legged) _uge 62__12___7_______1_______4 - ?______ 81__15___13___............................2____________J3_______ 4__12 12L___;___________:____________;__11 94__14___9____1 _______-______4___9 1__13__8__1__4__:__8 I alt 66 49 3 8 6 50 %-del levende smågrise: 75,7% (50 overlevende ud af 66) m
Der observeres en mortalitet på omkring 24,3%. Patogeniciteten af den franske stamme er 10 meget svag (24,3%), sammenlignet med de tilsvarende resultater for den spanske stamme (mortalitet 90,5%). Med hensyn til sammenligning af vaccinerede og ikke-vacclnerede søer i tilfældet med den franske stamme er resultaterne ikke særligt signifikante. I hvert fald kan man dog bemærke, af patogeniciteten i de vaccinerede dyr er reduceret til 17,8%.
|
"TH
37 DK 173128 B1 SEKVENSLISTE Antal sekvenser. 5
Information om SEQ ID no: 1 (i) Sekvensens egenskaber: (A) Længde: 798 basepar 265 (266) aminosyrer (B) Type:
Nucieotid- samt tilhørende aminosyresekvens (ii) Molekyltype: cDNA fra genom RNA samt protein (vi) Naturlig oprindelse: (A) Organisme:
Arterivlrus sp.; PRRS-virus (PRRS = det Porcine Reproduktions- og Respirations Syndrom) (B) Stamme: "Den spanske stamme” (C) 1 ndfvid/isolat: PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 svarende til V93070108 deponeret hos ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures den 29 JUN 1993 (ix) Egenskaber (A) Navn/kode: ORF nr. 3 (ORF = Open Reading Frame, åben aflæseramme) (D) Subcellulær placering af genproduktet:
Membranprotein (x) Sekvensbeskrivelse: SEQ ID N0:1 38 DK 173128 B1 ATG GCT CAT CAG TGT GCA CGC TTC CAT TTT TTC CTC TGT AGC TTC ATC 48
Met Ala His Gin Cys Ala Arg Phe His Phe Phe Leu Cye Ser Phe Ile 15 10 15 TGT TAC C TT GTf CAT AGT GCT TTG GCT TCG AAT TCC AAT TCT ACG CTA 96
Cys Tyr Leu Val His Ser Ala Leu Ala Ser Asn Ser Asn Ser Thr Leu 20 25 30 TGT TTT TGG TTT CCA TTG GCC CAC GGC AAC ACA TCA TTC GAG CTA ACC 144
Cys Phe Trp Phe Pro Leu Ala His Gly Asn Thr Ser Phe Glu Leu Thr 35 40 45 ATC AAC TAC ACC ATA TGT ATG CCC TGC TCT ACC AGT CAA GCG GCT CAC 192
Ile Asn Tyr Thr Ile Cys Met Pro Cys Ser Thr Ser Gin Ala Ala Kis 50 55 60 CAA AGA CTC GAG CCC GGT CGT AAC ATG TGG TGC AGA ATA GGG CAC GAC 240
Gin Arg Leu Glu Pro Gly Arg Asn Met Trp Cys Arg Ile Gly His Asp 65 70 75 80 AGG TGT GAG G AA CGT GAC CAT GAT GAG TTG TCA ATG TCC ATT CCG TCT 288
Arg Cys Glu Glu Arg Asp His Asp Glu Leu Ser Met Ser Ile Pro Ser Θ5 90 95 GGG TAC GAT AAC CTC AAA C TT GAG GGT TAT TAT GCT TGG C TG GCC TTT 336
Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe 100 105 110 TTG TCC TTT TCC TAC GCG GCC CAA TTC CAT CCG GAG TTG TTC GGA ATA ' 384
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gin Phe His Phe Glu Leu Phe Gly Ile 115 120 125 GGA AAC GTG TCG CGC GTC TTC GTG GAC AAG CAA CAC CAG TTC ATT TGC 432
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Gin Hi? Gin Phe Ile Cys 130 135 140 GCC GAG CAT GAT GGA CGA AAT TCA ACC ATA TCT ACC G AA TAT AAC ATC 480
Ala Glu His Asp Gly Arg Asn Ser Thr Ile Ser Thr Glu Tyr Asn Ile 145 150 155 160 j TCC GCA TTA TAT GCG TCG TAC TAC CAT CAC CAA ATA GAC GGG GGC AAC 528 ! Ser Ala Leu Tyr Ala Ser Tyr Tyr His His Gin Ile Asp Gly Gly Asn 165 170 175 TGG TTC CAT TTG GTG CTC AAC ATT TCA G AA TGG C TG CGG CCA TTC TTT 576
Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu Val 180 185 190 TCC TCC TGG CTG TGG TTT CTG AGG CGT TCG CCT GTA AGC CCT G TT TCT 624
Leu Asn Ile Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Val Ser Pro Val Ser 195 200 205 CGA CGC ATC TAT CAG ATA TTA AGA CCA ACA CGA CCG CGG CTG CCG GTT 672
Arg Arg Ile Tyr Gin Ile Leu Arg Pro Thr Arg Pro Arg Leu Pro Val 210 215 220 TCA TGG TCC TTC AGA ACA TCA ATT GTC TCC GAC CTC ACG GGG TCT CAA 720
Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Thr Gly Ser Gin 225 230 235 240 CAG CGC AAG AGA ACA TTT CCT TCG GGA AGC CGT CTC AAT GTC GTG AAG 768
Gin Arg Lys Arg Thr Phe Pro Ser Gly Ser Arg Leu Asn Val Val Lys * 245 250 225 'Xi » CCG TCG GTA TTC CCC AGT ACA TTA CGA TAA 798
Pro Ser Val Phe Pro Ser Thr Leu Arg End 260 265 S| 39 DK 173128 B1
Information om SEQ ID no: 2 (i) Sekvensens egenskaber: (A) Længde: 552 basepar 183 aminosyrer (B) Type:
Nucleotid- samt tilhørende aminosyresekvens (ii) Molekyltype: cDNA fra genom RNA samt protein (vi) Naturlig oprindelse: (A) Organisme:
Arterivims sp.; PRRS-virus (PRRS = det Porcine Reproduktions- og Respirations Syndrom) (B) Stamme: "Den spanske stamme* (C) Individ/isolat: PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 svarende til V93070108 deponeret hos ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures den 29 JUN 1993 (ix) Egenskaber: (A) Navn/kode: ORF nr. 4 (ORF = Open Reading Frame, åben aflæseramme) (B) Placering: omkring 540 basepar fra start-ATG-koden i ORF nr. 3 (SEQ ID NO:1) deler en sekvens på omkring 246 basepar med SEQ ID NO:1 (D) Subcellulær placering af genproduktet:
Membranprotein (x) Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO:2 40 DK 173128 B1 ATG GCT GCG GCC ATT CTT TTC CTC CTG GCT GGT GCT CAA CAT TTC ATG 48
Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gin His Phe Met 15 10 15 GTT TCT GAG GCG TTC GCC TGT AAG CCC TGT TTC TCG ACG CAT CTA TCA 96
Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser 20 25 30 GAT ATT AAG ACC AAC ACG ACC GCG GCT GCC GGT TTC ATG GTC CTT CAG 144
Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Gly Phe Met Val Leu Gin 35 40 45 AAC ATC AAT TGT CTC CGA CCT CAC GGG GTC TCA ACA GCG CAA GAG AAC 192
Asn Ile Asn Cys Leu Arg Pro His Gly Val Ser Thr Ala Gin Glu Asn 50 55 60 ATT TCC TTC GGG AAG CCG TCT CAA TGT CGT G AA GCC GTC GGT ATT CCC 240
Ile Ser Phe Gly Lys Pro Ser Gin Cys Arg Glu Ala Val Gly Ile Pro 65 70 75 80 CAG TAC ATT ACG ATA ACG GCT AAT GTG ACC GAT GAA TCG TAT TTG TAC 288
Gin Tyr Ile Thr Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Ser Tyr Leu Tyr 85 90 95 AAC GCG GAC TTG CTG ATG CTT TCT GCG TGC CTT TTC TAC GCT TCA GAA 336
Asn Ala Asp Leu Leu Met Leu Ser Ala Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu , 100 105 110 ^ ATG AGC GAA AAA GGC TTC AAA GTT ATC TTT GGG AAC GTC TCT GGC GTT 384
Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Ile Phe Gly Asn Val Ser Gly Val 1 115 120 125 Ί GTT TCT GCT TGT GTC AAT TTT ACA GAT TAT GTG GCC CAT GTG ACC CAA 432 ! Val Ser Ala Cys Val Asn Phe Thr Asp Tyr Val Ala His Val Thr Gin 130 135 140 i CAT ACC CAG CAG CAT CAT CTG GTA ATT GAT CAC ATT CGG TTG CTG CAT 480
His Thr Gin Gin His His Leu Val Ile Asp His Ile Arg Leu Leu His 145 150 155 160 TTC TTG ACA CCA TCT ACA ATG AGG TGG GCT ACA ACC ATT GCT TGT TTG 528
Phe Leu Thr Pro Ser Thr Met Arg Trp Ala Thr Thr Ile Ala Cys Leu 165 170 175 TTC GCC ATT CTC TTG GCG ATA TGA 552
Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile End 180 m 41 DK 173128 B1
Information om SEQ 10 no: 3 (i) Sekvensens egenskaber: (A) Længde: 603 (606) basepar 200 aminosyrer (B) Type:
Nucleotid- samt tilhørende amlnosyresekvens (ii) Molekyltype: cDNA fra genom RNA samt protein (vi) Naturlig oprindelse: (A) Organisme:
Arterivirus sp.; PRRS-virus (PRRS = det Porcine Reproduktions- og Respirations Syndrom) (B) Stamme: "Den spanske stamme" (C) Individ/isolat: PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 svarende til V93070108 deponeret hos ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures den 29 JUN 1993 (ix) Egenskaber: (A) Navn/kode: ORF nr. 5 (ORF 1 Open Reading Frame, åben aflæseramme) (B) Placering: start-ATG-koden beliggende omkring 1092 basepar fra start-ATG-ko-den i ORF nr. 3 (SEQ ID NO:1); start-ATG-koden overlapper delvist TGA-slut-koden i ORF nr. 4 = SEQ ID NO:2 (TG fælles) (D) Subcellulær placering af genproduktet:
Membranprotein (x) Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO:3 42 DK 173128 B1 ATG AGA TGT TCT CAC AAA TTG GGG CGT TTC TTG ACT CCT CAC TCT TGC 48
Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys 15 10 15 TTC TGG TGG C TT TTT TTG CTG TGT ACC GGC TTG TCC TGG TCC TTT GTC 96
Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Val 20 25 30 GCT GGC GGC AGC AGC TCG ACA TAC CAA TAC ATA TAT AAC TTA ACG ATA 144
Ala Gly Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Gin Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr Ile 35 40 45 TGC GAG CTG AAT GGG ACC GAC TGG TTG TCC AAC CAT TTT GAT TGG GCA 192
Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Asn His Phe Asp Trp Ala 50 55 60 GTC GAG ACC TTT GTG CTT TAC CCG GTT GCC ACT CAT ATC CTC TCA CTG 240
Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser Leu 65 70 75 80 GGT TTT CTC ACA ACA AGC CAT TTT TTT GAC GCG CTC GGT CTC GGC GCT 288
Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly Ala 85 90 95 I GTG TCC ACT ATA GGA TTT GTT GGC GGG CGG TAT GTA CTC AGC AGC GTG 336
Val Ser Thr Ile Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val 100 105 110
Tj TAC GGC GCT TGT GCT TTC GCA GCG TTC GTA TGT TTT GTC ATC CGT GCT 384
Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg Ala 115 120 125 GTT AAA AAT TGC ATG GCT TGC CGC TAT GCC CAC ACC CGG TTT ACC AAC 432
Val Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala His Thr Arg Phe Thr Asn 130 135 140 TTC ATT GTG GAC GAC CGG GGG AGA ATC CAT CGG TGG AAG TCT CCA ATA 480
Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Ile His Arg Trp Lys Ser Pro Ile 145 150 155 160 GTG GTA GAG AAA TTG GGC AAA GCT G AA GTC GGT GGC GAC CTT GTC ACC 528
Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Gly Gly Asp Leu Val Thr 165 170 175 T ATC AAA CAT GTC GTC CTC GAA GGG GTT AAA GCT CAA CCC TTG ACG AGG 576
Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gin Pro Leu Thr Arg 180 185 190 1 in ACT TCG GCT GAG CAA TGG GAA GCC TAG 603
Thr Ser Ala Glu Gin Trp Glu Ala End 195 200 43 DK 173128 B1
Information om SEQ ID no: 4 (i) Sekvensens egenskaber: (A) Længde: 522 basepar 173 aminosyrer (B) Type:
Nucleotid- samt tilhørende aminosyresekvens (ii) Molekyltype: cDNA fra genom RNA samt protein (vi) Naturlig oprindelse: (A) Organisme:
Arterivirus sp.; PRRS-virus (PRRS = det Porcine Reproduktions- og Respirations Syndrom) (B) Stamme: "Den spanske stamme" (C) Individ/isolat: PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 svarende til V93070108 deponeret hos ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures den 29 JUN 1993 (ix) Egenskaber: (A) Navn/kode: ORF nr. 6 (ORF = Open Reading Frame, åben aflæseramme) (B) Placering: omkring 1682 basepar fra start-ATG-koden i ORF nr. 3 (SEQ ID NO:1) eller 8 basepar opstrøms fra begyndelsen af TAG-slut-koden i ORF nr. 5 = SEQ ID NO:4 (D) Subcellulær placering af genproduktet:
Membranprotein (x) Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO:4 44 DK 173128 B1 ATG GGA AGC CTA GAC GAT TTT TGC AAT GAT TCT ACC GCC GCA CAA AAG 48
Met Gly Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Ala Gin Lys 15 10 15 CTT GTG CTA GCC TTT AGC ATT ACA TAT ACA CCT ATA ATG ATA TAC GCC 96
Leu Val Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile Met Ile Tyr Ala 20 25 30 CTT AAG GTG TCA CGC GGC CG A CTC CTG GGG CTG TTG CAC ATC CTA ATA 144
Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Ile Leu Ile 35 40 45 TTC CTG AAT TGT TCT TTC ACA TTC GGA TAC ATG ACA TAT GTG CGT TTT 192
Phe Leu Asn Cys Ser Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Tyr Val Arg phe 50 55 60 CAA TCC ACC AAC CGT GTC GCA CTT ACT CTG GGG GCT G TT GTC GCC CTT 240
Gin Ser Thr Asn Arg Val Ala Leu Thr Leu Gly Ala Val Val Ala Leu 65 70 75 80 CTG TGG GGT GTT TAC AGC TTC ACA GAG TCA TGG AAG TTT GTT ACT TCC 288
Leu Trp Gly Val Tyr Ser Phe Thr Glu Ser Trp Lys Phe Val Thr Ser 85 90 95 AGA TGC AGA TTG TGT TGC CTA GGC CGG CGA TAC ATT CTG GCC CCT GCC 336
Arg Cys Arg Leu Cys Cys Leu Gly Arg Arg Tyr Ile. Leu Ala Pro Ala „ 100 105 110 CAT CAC GTA G AA AGT GCT GCA GGT CTC CAT TCA ATC CCA GCG TCT GGT 384 2 His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Leu His Ser Ile Pro Ala Ser Gly i 115 120 125 j AAC CGA GCA TAC GCT GTG AGA AAG CCC GGA CTA ACA TCA GTG AAC GGC 432 i Asn Arg Ala Tyr Ala Val Arg Lys Pro Gly Leu Thr Ser Val Asn Giv ,, 130 135 140 y i m fli STT SP S?A CGG AGC CTC GTG CTG GGC GGC AAA CGA GCT 480 L u Val Pro Giy Leu Ser Leu Val Leu Gly Gly Lys Arg Ala 145 150 155 160 GTT AAA CGA GGA GTG GTT AAC CTC GTC AAG TAT GGC CGG TAA 522
Val Lys Arg Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Gly Arg End 165 170 m 45 DK 173128 B1
Information om SEQ ID no: 5 (i) Sekvensens egenskaber: (A) Længde: 387 basepar 128 (129) aminosyrer (B) Type:
Nucleotid- samt tilhørende amlnosyresekvens (ii) Molekyltype: cDNA fra genom RNA samt protein (vi) Naturlig oprindelse: (A) Organisme:
Arterivlrus sp.; PRRS-vlrus (PRRS = det Porcine Reproduktions· og Respirations Syndrom) (B) Stamme: "Den spanske stamme" (C) Individ/isolat: PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 svarende til V93070108 deponeret hos ECACC, European Collection of Animal Cell Cultures den 29 JUN 1993 (ix) Egenskaber: (A) Navn/kode: ORF nr. 7 (ORF = Open Reading Frame, åben aflæseramme) (B) Placering: omkring 2193 basepar fra start-ATG-koden I ORF nr. 3 (SEQ ID NO:1); ATG-start-koden beliggende omkring 5 basepar fra starten af TAA-slut-koden i ORF nr. 6 = SEQ ID NO:4; deler en sekvens på omkring 246 basepar med SEQ ID NO:1 (D) Subcellulær placering af genproduktet: nucleocapsidprotein (x) Sekvensbeskrivelse: SEQ ID N0:5 46 DK 173128 B1 ATG GCC GGT AAA AAC CAG AGC CAG AAG AAA AAG AAA AGT GCA GCT CCG 48
Met Ala Gly Lys Asn Gin Ser Gin Lys Lys Lys Lys Ser Ala Ala Pro 15 10 15 ATG GGG AAT GGC CAG CCA GTC AAT CAA CTG TG C CAG TTG C TG GGT GCA 96
Met Gly Asn Gly Gin Pro Val Asn Gin Leu Cys Gin Leu Leu Gly Ala 20 25 30 ATG ATA AAG TCC CAG CGC CAG CAA CCT AGG GGA GGA CAG GCC AAA AAG 144
Met Ile Lys Ser Gin Arg Gin Gin Fro Arg Gly Gly Gin Ala Lys Lys 35 40 45 AAA AAG CCT GAG AAG CCA CAT TTT CCC TTA GCT GCT G AA GAT GAC ATC 192
Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile 50 55 60 CGG CAC CAC CTC ACC CAG ACC G AA CGT TCC CTC TGC TTG CAA TCG ATC 240
Arg His His Leu Thr Gin Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gin Ser Ile 65 70 75 80 CAG ACG GCT TTT AAT CAA GGC GCA GGA ACT GCG TCG CTT TCA TCC AGC 288
Gin Thr Ala Phe Asn Gin Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 GGG AAG GTC AGT TTT CAG GTT GAG TTC ATG CTG CCG GTT GCT CAT ACG 336
Gly Lys Val Ser Phe Gin Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr 100 105 110 GTG CGC CTG ATT CGC GTG ACT TCT ACA TCC GCC AGT CAG GGT GCA AGC 384
Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gin Gly Ala Ser 115 120 125 TAA 387
End

Claims (30)

1. Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom (PRRS), kendetegnet ved at omfatte en passende mængde af det virale PRRS-antigen eller -virus, fra den spanske 5 stamme med betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, som er deponeret hos ECACC med deponeringsnummeret V93070108, på inaktiveret form, samt et passende adjuvans og om ønsket et konserveringsmiddel.
2. Vaccine ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det indeholder en dosis af inaktiveret virus 10 på mindst 105·5 TCID^j/dosis.
3. Vaccine ifølge krav 1,kendetegnet ved, at virus har været dyrket i en kultur af alveolære makrofager fra griselunger.
4. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at virus har været dyrket i en co-kultur af alveolære makrofager fra grlselunger og ST-celler (ATCC CRL1746 ST).
5. Vaccine ifølge krav 1,kendetegnet ved, at virus har været dyrket i en kultur af ST-celler (ATCC CRL 1746 ST). 20
6. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved at virus har været dyrket i hybridceller af alveolære makrofager fra griselunger, hvilke celler er fusioneret med ST-celler ved hybridise-rfng.
7. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at virus har været dyrket i hybridceller af alveolære makrofager fra griselunger, hvilke celler er fusioneret med L-14-cet!e!inien (ECACC nr. 91012317) eller med cellelinien Jag-1.
8. Vaccine ifølge krav 1,kendetegnet ved. at virus har været dyrket i ST-celler eller I en 30 anden porcln cellelinie, som har fået indført generne kodende for membranreceptorer for PRRS- virus fra de alveolære makrofager fra griselunger.
9. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adjuvanset er et olie-adjuvans.
10. Vaccine ifølge krav 9, kendetegnet ved, at olie-adjuvanset består af en blanding af Marcol 52, Simulsol 5100 og Montanide 888. DK 173128 B1
11. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er en emulsion af (i) en vandig antigen-fase indeholdende den inaktiverede vims og (ii) en oliefase indeholdende adjuvanset.
12. Vaccine ifølge krav H.kendetegnet ved, at emulsionen består af 53 volumenprocent 5 af en vandig fase indeholdende den inaktiverede virus og 47 vægtprocent af en olie-fase indeholdende adjuvanset.
13. Vaccine ifølge krav 1-12, kendetegnet ved, at den er i stand til at inducere cellulær : immunitet i vaccinerede dyr. 10
14. Vaccine ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder substanser til forstærkning af celle-responset (CRP, Cell Response Potentiation), som forstærker cellens immun-effekt, såsom IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, li-6, IL-12, g-IFN, vævsnekrosefaktoren og lignende substanser. 15
15. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adjuvanset er vandigt.
16. Vaccine ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det yderligere Indeholder substanser til ! forstærkning af celle-responset (CRP, Cell Response Potentiation), som inducerer cellens ij 20 immun-effekt, såsom IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, li-6, IL-12, g-IFN, vævsnekrosefaktoren og lignende ij substanser.
17. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at adjuvanset er i stand til at modulere og I immunostimulere celle-responset, eksempelvis MDP, ISCOM eller liposomer. 25
18. Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom (PRRS), kendetegnet ved, at den er en emulsion omfattende a) 53% af en vandig fase Indeholdende det virale PRRS-antlgen fra den spanske stamme med betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, deponeret hos ECACC med deponeringsnum- 30 meret V93070108, på inaktiveret form i dyrkningsmediet DMEM I en mlnlmumkoncentratlon på 105·5 TCIDso/dosis, og b) 47% af en olie-fase indeholdende en blanding af Marcol52, Simulsol5100 og Monta-nide 888.
19. Vaccine følge krav 18, kendetegnet ved, at den kan inducere celle-immunitet i * vaccinerede dyr. 5*9 m DK 173128 B1
20 ECACC med deponeringsnummeret V93070108, på inaktiveret form, samt et passende ad-Juvans og om ønsket er konserveringsmiddel, kendetegnet ved at omfatte følgende trin: 1. dyrkning af den PRRS-fremkaldende virus, som bærer betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, og som er deponeret hos ECACC med deponeringsnummeret V93070108, i et passende cellesystem, 25 2) opsamling af virus fra cellesystemet, når en mfnimum-titer på 105·5 TCID^/ml er opnået, 3. inaktivering af virus ved fysiske eller kemiske metoder, og 4. blanding af den Inaktiverede virus med adjuvanset og konserveringsmidlet.
20. Vaccine ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder substanser til forstærkning af celle-responset (CRP), som forstærker cellens immun-effekt, såsom IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, vævsnekrosefaktoren og lignende substanser.
21. Bi- eller multivalent vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom og en eller flere andre porcine infektioner, kendetegnet ved, at det indeholder en passende mængde af det virale PRRS-antigen eller -virus, fra den spanske stamme med betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, som er deponeret hos ECACC med deponeringsnummeret V93070108, på inaktiveret form plus en eller flere porcine patogener. 10
22. Vaccine ifølge krav 21,kendetegnet ved, at det indeholder mindst et porcint patogen udvalgt fra gruppen bestående af Actinobacillus pieuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Porcin parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurelia multo-cida, Bordetelia bronchiseptica, Porcin respiratorisk coronavirus, Rotavirus eller mod de pato- 15 gener, som forårsager Aujeszkys syge, svlneinfiuenza eller transmitterbar gastroenteritis.
23. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom (PRRS), som indeholder en passende mængde af PRRS-virus, fra den spanske stamme, som bærer betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, og som er deponeret hos
24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at virus har været dyrket i: 30 i) en kultur af alveolære makrofager fra griselunger, eller i ii) en co-kultur af alveolære makrofager fra griselunger og ST-celler (ATCC CRL1746 ST), eller I iii) en ST-celle-kultur (ATCC CRL 1746 ST), eller i iv) en kultur af hybridceller af alveolære makrofager fra griselunger fusioneret med ST-celler, 35 eller I v) en kultur af hybridceller af alveolære makrofager fra griselunger fusioneret med cellelinien L-14 (ECACC nr. 91012317) eller med cellelinien Jag-1, eller i DK 173128 B1 vi) ST-ce!Ier eller en hvilken som helst anden porcln cellelinie, som har fået indført generne kodende for PRRS-virus-membranreceptorerne fra de alveolære makrofager fra griselunger.
25. PRRS-fremkaldende virus, den spanske stamme med egenskaber svarende i alt væsentligt til egenskaberne af den virus, som bærer betegnelsen PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 og er deponeret hos ECACC med deponeringsnummeret V93070108.
26. Virus ifølge krav 25, kendetegnet ved at omfatte en væsentlig del af mindst en af 10 DNA-sekvenserne ifølge fig. 1-5.
27. Virus ifølge krav 25 eller 26 på inaktiveret form og anvendelig f vaccineformuleringer mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom.
28. Virus ifølge krav 25 eller 26 på inaktiveret form og anvendelig i bi-eller muitivalente vacci neformuleringer mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom og andre porcine infek-~ tioner.
29. DNA-sekvens afledt af PRRS-firemkaldende virus, den spanske stamme med betegnelsen 20 PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, som er deponeret hos ECACC med deponeringsnummeret :| " V93070108.
30. DNA-sekvens ifølge krav 29, kendetegnet ved at omfatte en væsentlig del af mindst :ii ! en af DNA-sekvenserne ifølge fig. 1-5. 25 «Μ mm
DK199401028A 1993-09-17 1994-09-06 Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA- DK173128B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES9301973A ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1993-09-17 Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
ES9301973 1993-09-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK102894A DK102894A (da) 1995-03-18
DK173128B1 true DK173128B1 (da) 2000-01-31

Family

ID=8283072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK199401028A DK173128B1 (da) 1993-09-17 1994-09-06 Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA-

Country Status (7)

Country Link
DE (1) DE4432338C2 (da)
DK (1) DK173128B1 (da)
ES (1) ES2074950B1 (da)
FR (1) FR2709966B1 (da)
GB (1) GB2282811B (da)
IT (1) IT1267448B1 (da)
NL (1) NL194940C (da)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA27788C2 (uk) * 1991-06-06 2000-10-16 Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
US6251397B1 (en) * 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
ES2078187B1 (es) * 1994-05-13 1996-07-16 Cynamid Iberica S A Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes.
DK53595A (da) * 1994-05-13 1995-11-14 Iberica Cyanamid Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
CO4600644A1 (es) * 1996-03-01 1998-05-08 Schering Corp Vacuna contra el sindrome reproductivo y respiratorio porcino
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
SK286063B6 (sk) 1997-05-06 2008-02-05 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Peptid vyvolávajúci tvorbu protilátok, protilátkareaktívna s týmto peptidom a diagnostická súpravaobsahujúca peptid a protilátku
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
NZ501264A (en) 1998-12-22 2001-09-28 Pfizer Prod Inc Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS
AU3198200A (en) 1999-03-08 2000-09-28 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Prrsv vaccines
ATE474041T1 (de) 1999-04-22 2010-07-15 Us Agriculture Auf dem isolat ja-142 basierender impfstoff gegen das reproduktive-und-respiratorische syndrom beim schwein
KR20070028547A (ko) 2004-06-18 2007-03-12 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
CN103285387B (zh) 2004-12-30 2017-07-25 勃林格殷格翰动物保健有限公司 Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
CA2894069C (en) 2005-06-24 2019-02-26 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
EP3320919B1 (en) 2005-12-29 2020-05-27 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
WO2011128415A1 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Universiteit Gent Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus
US8765142B2 (en) 2011-02-17 2014-07-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh European PRRSV strain
BR112013020966B1 (pt) 2011-02-17 2020-05-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Processo em escala comercial para produção do prrsv
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
WO2013017570A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
CN105073130A (zh) 2013-03-15 2015-11-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
MX2016007737A (es) 2013-12-20 2016-09-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Variante del virus prrs, clon de adnc del virus europeo y sus usos.

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA27788C2 (uk) * 1991-06-06 2000-10-16 Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла
AU2684792A (en) * 1991-10-14 1993-05-21 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
KR100374295B1 (ko) * 1993-02-08 2003-12-24 바이엘 코포레이션 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도

Also Published As

Publication number Publication date
GB2282811A (en) 1995-04-19
ES2074950B1 (es) 1996-03-16
GB9418775D0 (en) 1994-11-02
GB2282811B (en) 1998-02-18
NL9401414A (nl) 1995-04-18
DK102894A (da) 1995-03-18
DE4432338C2 (de) 1997-10-30
IT1267448B1 (it) 1997-02-05
DE4432338A1 (de) 1995-05-04
FR2709966B1 (fr) 1997-05-23
NL194940C (nl) 2003-08-04
FR2709966A1 (fr) 1995-03-24
NL194940B (nl) 2003-04-01
ITTO940713A1 (it) 1996-03-09
ITTO940713A0 (it) 1994-09-09
ES2074950A1 (es) 1995-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173128B1 (da) Vaccine mod det porcine reproduktions- og respirationssyndrom fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en virus og en DNA-
JP7445375B2 (ja) ブタサーコウイルス３型免疫原性組成物、その製造方法、およびその使用方法
ES2286815T3 (es) Virus, vacunas y dna viral para la enfermedad respiratoria y reproductiva porcina.
CN108064165B (zh) 猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物
US7223854B2 (en) Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), proteins encoded by the polynucleic acids, vaccines based on the proteins and/or polynucleic acids, a method of protecting a pig from a PRRSV and a method of detecting a PRRSV
JP3128133B2 (ja) 豚の奇病の原因体であるレリスタドエイジェント、それを含むワクチン組成物、豚の奇病の診断キット及び診断方法
TWI358455B (en) Nucleic acids encoding tgev and prrsv sequences fo
JP3068204B2 (ja) ブタの生殖・呼吸症候群（ｐｒｒｓ）を惹起するウイルスの新規弱毒化株、それに由来するワクチンおよび診断キットならびにそれらの取得方法。
TWI445715B (zh) 新穎之鳥類星狀病毒
US20030003112A1 (en) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) recombinant poxvirus vaccine
KR20140006040A (ko) 신규 유럽형 ｐｒｒｓｖ 스트레인
CN107287218B (zh) 鸡传染性支气管炎强毒株s1基因及其强毒株和应用
JP6874023B2 (ja) 伝染性気管支炎ウイルスに対するワクチン
TW201522643A (zh) 豬生殖與呼吸道症候群病毒、組合物、疫苗及使用方法
CN109922825A (zh) 抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法
RU2755345C2 (ru) Эффективная вакцинация против европейских штаммов вируса репродуктивного и респираторного синдрома (prrs) до отлучения от матери
KR101102271B1 (ko) 약독화된 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신
KR101092977B1 (ko) 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신
JP7350864B2 (ja) 異種スパイクタンパク質を有するｈ５２ ｉｂｖワクチン
CN104388399B (zh) 一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的prrsv减毒株及其疫苗
Abisheva et al. AK‐2011 strain for the development of a vaccine against equine rhinopneumonitis
TWI602918B (zh) 含病毒載體之抗ｐｒｒｓ重組疫苗
RU2817873C2 (ru) Схема вакцинации "прайм-буст"
Ashraf Studies on infectious bursal disease virus
Harris Characterization of infectious bursal disease viruses isolated from commercial chickens

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired

Expiry date: 20140906