NL9401414A - Vaccin ter voorkoming van varkensreproductie- en -respiratiesyndroom. - Google Patents
Vaccin ter voorkoming van varkensreproductie- en -respiratiesyndroom. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9401414A NL9401414A NL9401414A NL9401414A NL9401414A NL 9401414 A NL9401414 A NL 9401414A NL 9401414 A NL9401414 A NL 9401414A NL 9401414 A NL9401414 A NL 9401414A NL 9401414 A NL9401414 A NL 9401414A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- virus
- prrs
- vaccine
- vaccine according
- adjuvant
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 110
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 title claims description 12
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 title claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 147
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 64
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 56
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 41
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 34
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 claims description 31
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 claims description 8
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 8
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 claims description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 5
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 claims description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 2
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims 1
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 claims 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 claims 1
- 241000711493 Porcine respiratory coronavirus Species 0.000 claims 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710126256 Hydrolase in agr operon Proteins 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 7
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 6
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 6
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 6
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 6
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 6
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 6
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 6
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 6
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 6
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 6
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 6
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 244000144980 herd Species 0.000 description 6
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 101000977065 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 11.6 kDa protein in mobS 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000787133 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 12.3 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000827603 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 10.2 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000765604 Bacillus subtilis (strain 168) FlaA locus 22.9 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000964402 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized protein in xynC 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000861180 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0147 Proteins 0.000 description 5
- 101000977779 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 33.9 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000977786 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 9.7 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000827630 Narcissus mosaic virus Uncharacterized 10 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101001113905 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P4 Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 5
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 4
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 3
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 3
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical group [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002409 epiglottis Anatomy 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- PYOZTOXFQNWBIS-UHFFFAOYSA-N phenol;sodium Chemical compound [Na].OC1=CC=CC=C1 PYOZTOXFQNWBIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008213 Brosimum alicastrum Species 0.000 description 1
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 1
- 101100137193 Cassava vein mosaic virus ORF 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100286205 Cassava vein mosaic virus ORF 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000186811 Erysipelothrix Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- -1 IL -4 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010022653 Intestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 1
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000081511 Matthiola lunata Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 206010027925 Monoparesis Diseases 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 description 1
- 241001080180 Quinta Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 description 1
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 235000021316 daily nutritional intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011999 immunoperoxidase monolayer assay Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-M octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000027317 positive regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000005828 ramon Nutrition 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2770/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
VACCIN TER VOORKOMING VAN VARKENSREPRODUCTIE- EN -RESPIRATIESYNDROOM. GEBIED VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een vaccin dat in staat is varkensreproductie- en -respiratiesyndroom te voorkomen. In het bijzonder heeft de uitvinding betrekking heeft op een geïnactiveerd vaccin dat het causatieve virus van de ziekte in geïnactiveerde vorm bevat.
GESCHIEDENIS VAN DE UITVINDING
De ziekte die bekend staat als varkensreproductie- en -respiratiesyndroom (PRRS) heeft een uitwerking op zwangere zeugen waarbij anorexia, abortussen, geboorte van dode biggen, gemummificeerde foetussen, zwakke biggen die een aantal uur of dagen na geboorte sterven, respiratiepro-blemen na de bevalling en voortplantingsproblemen, kunnen worden veroorzaakt (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 6 oktober 1990» Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA). Er is een aantal gevallen beschreven waarbij geïnfecteerde zeugen blauwe stippen op oren vertoonden zodat de ziekte eveneens bekend staat als blauwe abortus of blauworige varkensziekte (Veterinary Record, Vol. 130, no. 3» 18 januari 1992).
Andere namen die aan de ziekte zijn gegeven zijn "Mystery Pig Disease" (MPD), Mystery Swine Disease" (MSD), "Mysterious Reproductive Syndrome" (MRS), "Swine Infertility and Respiratory Syndrome" (SIARS) of "Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" (PEARS).
De eerste epizoötie-uitbarstingen van deze ziekte verschenen in de Verenigde Staten en Canada in 1987· In Europa werd de eerste uitbarsting in 1990 in Duitsland gedetecteerd van waaruit het zich aan het eind van I99O en in het begin van 1991 verspreidde naar Nederland en België. In Spanje werden de eerste gevallen van de ziekte midden januari 1991 gedetecteerd toen belangrijke respiratieveranderingen werden waargenomen in een lading van 300 biggen die vanuit Duitsland waren geïmporteerd (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, no. 11, 1991). Kort daarna werd een ziekte in twee voortplantingskudden, die zich op een afstand van 500 m van de kudde waarbij zich het oorspronkelijke probleem had voorgedaan waren gelegen gedetecteerd, welke ziekte werd gekenmerkt door een abnormaal hoog abortusaantal tijdens de laatste fase van de zwangerschap alsmede 70# sterfte bij biggen. Na analyse van de waargenomen klinische aanduidingen en met het oog op het feit dat i) deze kudden aan een intensief vaccinatieprogramma tegen varkens-parvovirus, ziekte van Aujeszky en zwijninfluenza waren onderworpen en dat ii) laboratoriumtesten de aanwezigheid van andere abortus veroorzakende ziekten uitsloten bleef de verdenking rusten op klinische aanwezigheid van PRRS. In monsters van deze boerderijen werd het causatieve middel van de ziekte geïsoleerd zoals verder in detail hieronder wordt beschreven.
Een aantal middelen is gecorreleerd met dit infectieuze proces onder andere encefalomyocarditis-virus, zwijninfluenza, klassieke zwijnkoorts, Afrikaanse zwijnkoorts, mucosale ziekte, ziekte van Aujeszky, brucellosis, leptospirosis, Q-koorts, parvovirosis en chlamydiale ziekte, hoewel sommige auteurs dit in verband hebben gebracht met mycotoxinen (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra, Mengeling, W.L. en Lager, K.M., "Mystery Pig Disease: Evidence and considerations for its etiology", in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Dea et al., "Virus isolation from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Van Alstine, W., "Past diagnostic approaches and findings and potential useful diagnostic strategies", in proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Loula, T. Agri-Practice, 12(1): 23-33» 1991; Woolen, N. et al., J.Am. Vet. Assoc. 197:600-601, 1990).
In de PCT-octrooiaanvrage die onder publicatienummer W092/21375 op naam van Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) is gepubliceerd wordt de isolatie van een virus, genaamd "Lelystad Agent" (LA) of "Lelystad Virus" (LV) beschreven dat door hen als het causatieve middel van de ziekte die toen als MSD werd aangeduid is geidentificeerd. Het geïsoleerde LV veroorzaakt bij intranasale inoculatie bij zwangere zeugen een verlies aan eetlust en zelfs een weigering tot ingestie gedurende 4 tot 10-12 dagen na inoculatie, reproductie-afwijkingen en blauwkleuring van de oren van sommige geïnfecteerde zeugen 9~10 dagen na inoculatie. Het is echter eveneens waargenomen dat bij 2 van de 8 experimenteel geïnfecteerde zeugen geen reproductie van de ziekte ontstaat (zie tabel 6 van de PCT-octrooiaanvrage) gezien het feit dat in één van de zeugen het aantal biggetjes dat levend werd geboren en de eerste week overleefde groot was (6 van de 9, zeug 1305) en een andere zeug twee doodgeboren biggetjes kreeg terwijl de overige 9 de eerste week overleefden (zeug IO65). Het door CDI geïsoleerde virus behoort tot de genus Arteriviridae met een genoom van tenminste één gepolyadenyleerd RNA-molecuul met een lengte van 14,5 tot 15,5 kb (zoals is bepaald in een neutrale agarose-gel), dat zich repliceert door middel van een groep subgenome RNA's aan het 3'-uiteinde. De hierboven geciteerde PCT-octrooiaanvrage toont de nucleotidesequentie van het LV-genoom met de 8 mogelijke open leesramen (opwn reading frames = ORF's), de aminozuursequentie die van de geïdentificeerde ORF's is afgeleid en de mogelijke N-glycosyleringsplaatsen.
Daarna zijn andere PRRS veroorzakende virussen in Duitse, Franse en Spaanse boerderijen geïsoleerd. Het in Tubingen, Duitsland geïsoleerde virus (TV) [(Virology, 193, 329~339 (1993)] vertoont van ORF's 2 tot 7 39,3% homologie met LV op nucleotide-niveau (waarbij er 24 baseparen (bp) uit een totaal van 3316 baseparen in dat gebied verschillen). De afgeleide TV-aminozuursequentie vertoont 99,2% homologie met LV (waarin slechts 10 aminozuren in de afgeleide aminozuursequenties die door ORFs 2 tot 5 worden gecodeerd verschillen, terwijl er geen verschillen zijn in de sequenties die van ORF's 6 en 7 zijn afgeleid).
Aan de andere kant is de homologie die gevonden is tussen LV en TV in vergelijking met het bij ons laboratorium geïsoleerde virus (Spaanse stam of SV) kleiner. Tot nu zijn slechts de nucleotide- en aminozuursequenties die overeenkomen met ORFs 3 tot 7 vergeleken waarbij de volgende resultaten zijn verkregen: 1. Er bestaat 95,5% homologie van SV in vergelijking met LV of TV op nucleotide-niveau (met 144 verschillen op een totaal van 2599bp); en 2. er bestaat 94,9# homologie van SV t.o.v. LV of TV op aminozuurniveau (uit een totaal van 955 aminozuren wordt een totaal van 47 aminozuren gevonden die verschillen).
Deze aminozuurvariaties kunnen zijn gekoppeld aan de hogere pathoge-niciteit van een stam in vergelijking met een andere stam, waardoor het in onze laboratoria geïsoleerde virus (Spaanse stam) meer pathogeen is dan andere bekende PRRS-virussen. Van het in Frankrijk geïsoleerde virus bijvoorbeeld (Franse stam) kan worden gezien, zoals in voorbeeld 8 van de onderhavige beschrijving wordt getoond, dat het percentage biggen die worden geboren uit een zeug die met de Franse stam is geïnfecteerd 75# bedraagt terwijl het percentage 9,5# bedraagt wanneer zeugen met de Spaanse stam (tabellen 12 en 14) zijn geïnfecteerd. Bij infectie met LV bedraagt het percentage 6l# wanneer de zeugen daarmee zijn besmet (tabel 6 van PCT-octrooiaanvrage WO 92/21375) aangezien 58 biggen uit een totaal van 95 biggen levend werden geboren.
De ziekte veroorzaakt ernstige verliezen in de varkensindustrie omdat het bij acute uitbarsting een biggensterfte van J0% in een worp kan veroorzaken. Een middel om het hierdoor gecreërde probleem op te lossen zou liggen in het uitvoeren van een geschikt vaccinatieprogramma dat het voorkomen van de ziekte mogelijk zou maken. Hiertoe zouden vaccins die effectieve voorkoming van PRRS kunnen bewerkstelligen vereist zijn.
De octrooiaanvrage die onder WO 93/06211 in naam van Collins, J.E., en Benfield, D.A., is gepubliceerd heeft betrekking op een vaccin tegen MSD dat een infectief middel bevat dat uit longen van met MSD geïnfecteerde varkens is geïsoleerd. De genoemde PCT-octrooiaanvrage beschrijft echter geen karakterisatie of identificatie van het infectieve middel, evenmin als een depot daarvan bij enig geautoriseerd depotinstituut. Hierdoor is de realisatie van de kennis die van de PCT-octrooiaanvrage kan worden afgeleid zeer moeilijk omdat het produkt dat beschreven is in de PCT-octrooiaanvrage niet kan worden geverifieerd en de verkregen resultaten evenmin kunnen worden vergeleken met de resultaten van de aanvragers van de PCT-octrooiaanvrage. Evenmin worden in de genoemde octrooiaanvrage het antigeen noch het adjuvans dat bij de formulering van het vaccin is gebruikt duidelijk beschreven, terwijl dit zoals hierna zal worden uiteengezet een zeer belangrijke rol speelt. Evenmin worden voorbeelden beschreven die de kracht en werkzaamheid van de vaccins beschrijven.
De PCT-octrooiaanvrage die onder WO 93/07898 is gepubliceerd heeft betrekking op o.a. de identificatie van het causatieve middel van PRRS en op vaccins die daarvan zijn afgeleid. Het geïsoleerde virus heeft kenmerken die vergelijkbaar zijn met LV maar verschillen van het virus dat in ons laboratorium is geïsoleerd, dat niet in staat is op detecteerbare niveau’s op ST- (zwijn-testis-) cellen te groeien. Klaarblijkelijk is het vaccin werkzaam geweest maar is de mate van bescherming slechts bij ongeveer 52% van de gevaccineerde dieren bereikt, hetgeen als een betrekkelijk lage mate van bescherming kan worden beschouwd, in het bijzonder gezien de hoge virustiter die bij de vaccindosering werd toegepast. Daarnaast verschaft de PCT-octrooiaanvrage geen informatie over de organisatie van het virusgenoom of de -eiwitten waarvoor wordt gecodeerd, waardoor vergelijking tussen dit virus en het virus dat in onze laboratoria is verkregen niet kan worden uitgevoerd of slechts met een te grote mate van onderzoek kan worden uitgevoerd.
Derhalve blijft er een behoefte bestaan aan vaccins die in staat zijn PRRS te voorkomen. Teneinde dit probleem op te lossen verschaft de onderhavige uitvinding een vaccin dat in staat is op effectieve wijze zeugen tegen de infectieziekte te beschermen. De antigene fase van dit vaccin omvat een geïnactiveerd Spaans isolaat. De uitvinding verschaft eveneens combinaties van het geïsoleerde PRRS virale antigeen (Spaanse stam) samen met verschillende varkenspathogenen met het doel bi- of mul-tivalente vaccins te verschaffen.
KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN.
Figuren 1 tot 5 tonen de cDNA-sequenties die overeenkomen met respectievelijk ORFs 3 tot 7 van bet PRRS-virus (Spaanse stam) alsmede de sequentie die van aminozuren die door elk ORF worden gecodeerd is afgeleid.
Figuren 6 tot 10 tonen de homologie en de bestaande verschillen tussen LV en het op onze laboratoria geïsoleerde virus op het niveau van aminozuursequenties die van ORFs 3 tot 7 zijn afgeleid. De aminozuren worden uitgedrukt in overeenstemming met de één-lettercode. De bovenste regel van elke twee regels komt overeen met de LV-aminozuursequentie terwijl de onderste regel overeenkomt met het bij onze laboratoria geïsoleerde virus (Spaanse stam). De homologe aminozuren worden aangegeven met twee verticale lijnen terwijl substitutie van aminozuren door andere aminozuren wordt aangegeven door twee verticale stippen bij conservatieve substituties, d.w.z. wanneer de substitutie van een aminozuur met een ander aminozuur dat functioneel equivalent is plaatsvindt. De afwezigheid van verticale lijnen en stippen tussen twee aminozuren geeft niet-conser-vatieve substituties aan.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING 1. Monsters 1.1. Voor de isolatie van het virus gekozen dieren.
Gemummificeerde foetussen, doodgeboren biggen en levende maar zwakke biggen met een leeftijd van 1 tot 10 dagen, en nageslacht van veldzeugen met klinische problemen vanwege PRRS werden gekozen.
1.2. Bereiding van de monsters.
Long-, milt-, lever-, nier-, hersen- en hartmonsters van de biggen werden door middel van necropsie verkregen. In één bepaald geval werden monsters bereid van de long van een doodgeboren big die door een van infectie met PRRS verdachte zeug was geworpen. Met die long werd een homogenaat met DMEM (GIBCO) (10 g long in 90 ml DMEM) dat met een oplossing van antibiotica (PEG) dat bestond uit 1000 IU/ml penicilline, 1 mg/ml streptomycine en 0,5 mg/ml gentamicine was aangevuld bereid. De resulterende suspensie liet men gedurende 1 uur bij 4°C staan en de suspensie werd vervolgens ingevroren, 2 maal ontdooid en gecentrifugeerd, waarna het verkregen supernatant bij -70°C werd bewaard voor gebruik bij infectie van alveolaire macrofagen van een varkenslong. In een ander geval werden volgens een soortgelijke werkwijze longmonsters bereid uit een big die levend werd geboren maar binnen een paar uur na geboorte stierf.
Daarnaast werd bloed uit de dieren gehaald door de vena cava te doorboren ter verkrijging van (i) bloedplasma dat bij ~70°C werd bewaard en voor virusisolatie werd toegepast en (ii) serum, dat voor het uitvoeren van antilichaamtitratie werd gebruikt.
2. Alveolaire macrofagen van een varkenslong.
2.1. Verkrijging.
Er werden varkens gebruikt die seronegatief waren voor de ziekte van Aujeszky, varkensparvovirosis, mond-en-klauwziekte, klassieke zwijn- koorts, zwijninfluenza (types H1N1 en H3N2) en overdraagbare gastroenteritis. De leeftijd van de gebruikte biggen bedroeg tussen 7 en 8 weken. De dieren werden voor extractie van de longen aan anesthesie met natriumfenolbarbital onderworpen, waarna de extractie werd uitgevoerd door eerst de trachea onder de epiglottis te ligeren en vervolgens door boven de ligature te snijden. Wanneer de long eenmaal was verwijderd werd deze extern met fysiologische zoutoplossing gewassen en werden vervolgens PBS en een PEG-oplossing van antibiotica door middel van achtereenvolgende wasstappen toegevoegd. De cellen die uit deze wasstappen werden verkregen werden aan centrifigatie gedurende 10 min. bij 300 g onderworpen en in DMEM-medium geresuspendeerd (DMEM-medium was aangevuld met niet essentiele aminozuren (GIBCO)), 1% natriumpyruvaat 1 mM en 1% glutamine 2 mM, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en PEG-oplossing van antibiotica bij lfc. Het tellen van de cellen werd in Newbauer-kamers uitgevoerd.
2.2. Steriliteitscontrole.
Er werd door middel van geschikte testen geverifieerd dat de alveolaire macrofagen van de varkenslong vrij waren van besmetting met bacteriën, schimmels en andere virussen. Eveneens werd de algemene goede staat van de cellen door optische microscopie geverifieerd,
De afwezigheid van besmetting door mycoplasma's werd eveneens geverifieerd door cytochemische detectie met DAPI (4,6-diamidine-2-fenyl-indool) dat selectief aan DNA bindt en DNA-DAPI-complexen met hoge fluorescentie en hoge specificiteit vormt.
3. Isolatie van het virus 3.1. Isolatie van het virus en groei van het virus op alveolaire macro-faeen van een varkenslong.
Een kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong die eerder in DMEM-medium en 10# FCS was bereid werd met een homogenaat van een monster waarvan vermoed werd dat dit het causative middel van PRRS bevatte geïnfecteerd. Het monster omvatte in één geval een longisolaat van een doodgeboren big van een zeug die klinische tekenen van PRRS vertoonde terwijl in andere gevallen een longisolaat van een levend geboren big die na een paar uur was gestorven, het nageslacht van een zeug met PRRS-symp-tomen alsmede een isolaat van bloedplasma werden gebruikt. Het homogenaat werd gedurende 1 uur bij 37°C in contact gehouden met de macrofaagkweek bij 37°C. Daarna werd het inoculum verwijderd en werden vers DMEM met 2% FCS en 1¾ PEG-oplossing toegevoegd, werd de kweek met C02 gebufferd en werd gedurende een aantal dagen bij 37°C geincubeerd gedurende welke het cytopatische effect (CPE) dat door het virus op de macrofagen werd geproduceerd onder de microscoop werd waargenomen: 3 tot 4 dagen na infectie (dpi) was CPE 70-80# (waarbij reuze- en gedeformeerde cellen verschenen). De kweken werden bij -80°C ingevroren.
Tegelijkertijd werd een alveolaire macrofaagkweek van een varkenslong die van PRRS vrij was bereid om als negatieve controle te worden gebruikt.
Subkweken werden met het geïsoleerde virus bereid en er werd waargenomen dat er 100# CPI vanaf de tweede DPI bestond. Het virus werd bij -80°C ingevroren voor identificatie en karakterisatie achteraf.
Op soortgelijke wijze werd het virus uit het bloedplasma en andere monsters van doodgeboren biggen of levende, doch zwakke biggen die uit experimenteel geïnfecteerde zeugen geboren werden geïsoleerd.
Eén van de geïsoleerde virussen, in het bijzonder het virus dat aangeduid is met PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 werd uit de long van een doodgeboren big geïsoleerd. Het is in staat experimenteel de ziekte te reproduceren, heeft de kenmerken die in onderdeel 4 worden genoemd en werd op 29 juni 1993 bij de European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),
Salisbury (Verenigd Koninkrijk) met toegangsnummer V93070108 gedeponeerd.
3.2. Virale groei bii andere celsvstemen.
Infecties met het geïsoleerde virus (Spaanse stam) zijn uitgevoerd in co-kweken van alveolaire macrofagen van een varkenslong en ST-cel (Swine Testis continuous cell line ATCC CRL 1745 ST) als een eerste stap voor het aanpassen van het virus voor ST-cellen. Na een aantal doorgangen in serie (5-6) bij de ST-cel- en macrofaag co-kweken en bij kweken van ST afzonderlijk bedroegen de virusinfectietiters in de orde van 106 TCID50/ml wanneer macrofaag-ST-cel-co-kweken werden geïnfecteerd en in de orde van 10*’5 TCID50/ml voor het virus dat in DT-cellen afzonderlijk werd verkregen [TCIDjo, weefselkweekinfectiedosering 50#].
Daarnaast kunnen alveolaire macrofagen van een varkenslong eveneens onsterfelijk worden gemaakt door fusie daarvan met STC-cellen door middel van hybridisatie. Anderzijds kunnen alveolaire macrofagen van een varkenslong onsterfelijk worden gemaakt door fusie daarvan met L-l4-cellijn-B-cellen van perifeer varkensbloed (ECACC No. 91012317. of met cellijn Jag-1 (varkenstrofoblastcellijn) verstrekt door Dr. Jag Ramsoondar [].
De fusievoorschriften omvatten gebruikelijke technieken op dit gebied. Anderzijds kunnen virussen op ST-cellen of op andere varkenscel-lijnen worden gekweekt, waarin de genen die voor membraanreceptoren van alveolaire macrofagen van de varkenslong voor het PRRS virus coderen zijn opgenomen.
De virussen die met deze celsystemen worden geproduceerd kunnen worden gebruikt bij de formulering van zowel levende als geïnactiveerde vaccins.
4. Identificatie en karakterisatie van het virus.
4.1. Benoeming en depot van het virus.
Het uit de long van een doodgeboren big geïsoleerde virus dat aangeduid is als PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 werd bij de European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (Verenigd Koninkrijk) op 29 juni 1993 gedeponeerd onder toegangsnummer V93070108. In de onderhavige beschrijving wordt af en toe het virus zonder deze aanduiding beschreven als Spaans virus (SV) of Spaanse stam.
4.2. Kenmerken van het geïsoleerde virus.
Dit virus (PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) vertoont de volgende kenmerken:
a) de produktie van een gering CPE op een continue ST-cellijn (ATCC CRL
1746 ST) (foetaal zwijntestis) met een gemiddelde titer van 104,5 TCID50/ml en op alveolaire macrofagen van een varkenslong met gemiddelde titers van 105,5 TCID50/ml; b) bij infectie van alveolaire macrofagen van een varkenslong en STC in co-kweek daarmee worden gemiddelde titers van 106’3 TCID50/ml verkregen [welke titers een logaritme-eenheid voorstellen (1 log10) hoger dan wanneer slechts alveolaire macrofagen van een varkenslong afzonderlijk werden geïnfecteerd]; c) cytoplasmareplicatie; d) produktie van cytoplasmavacuolering; e) lipidemantel; f) grootte van 40-50 nm; g) geen haemadsorptie of haemagglutinatie werd waargenomen met cellen van de kip, marmot, varken of rode bloedcellen van humane groep 0; h) verlies van infectiviteit bij zure pH (pH 1 5)'.
i) produktie van microscopische (interstitiele pneumonie) en macroscopische lesies bij biggen met een leeftijd van 2 maanden; j) produktie van negatieve reproduktie-effecten bij zwangere zeugen met doodgeboorte, gemummificeerde foetussen en levende maar zwakke biggen; k) kruisreactie met een Lelystad-referentieserum (IPMA = Immuno-peroxidasemonolaagtest); l) kruisreactie met sera van dieren met klinische veldinfecties (IPMA), m) serum van met dit virus geïnfecteerde zeugen vertoont kruisreactie met LV; n) polygeadenyleerd RNA-genoom met een lengte van ongeveer 15000 bp (neutrale agarosegel); o) replicatie door middel van een subgenome RNA-groep die aan het 3’~ uiteinde aanwezig is; p) nucleotidesequentie met 8 ORFs; q) in een gezuiverde suspensie die aan elektroforese in polyacrylamide-gel wordt onderworpen en na overdracht door immunoblot door middel van een specifiek serum dat in zeugen van ons eigen laboratorium is bereid en kruisreacties vertoont met het Lelystad-PRRS-virus werden 4 grote banden gedetecteerd die overeenkomen met eiwit met molecuul-gewichten van 15000, 23000, 54000 en 66000 Daltons die niet in negatieve controles (niet geïnfecteerde macrofagen) werden gedetecteerd; r) wanneer ORFs 3 tot 7 van dit virus worden vergeleken met die van LV en/of TV wordt 95,5# homologie waargenomen op nucleotideniveau (waarbij 114 bp verschillen op een totaal van 2599 bp) en 94,95· homologie op aminozuurniveau (51 aminozuren verschillen op een totaal van 955); en s) het virus behoort tot de genus Arterivirus.
4.3· Technieken die ziin gebruikt voor virusidentificatie.
4.3.1. Experimentele reproductie van de ziekte bij zwangere zeugen.
German Landrace x Large White Cross zeugen werden gebruikt die afstammen van boerderijen met systematische serologische controle tegen ziekte van Aujeszky, mond-en-klauwziekte, varkensparvovirus, klassieke zwijnkoorts, zwijninfluenza (types H1N1 en H3N2) en overdraagbare gastroenteritis. Daarnaast werd een antilichaamtitratietest uitgevoerd tegen het causatieve virus van PRRS. Tussen dagen 77 en 90 van de zwangerschap werden de dieren met een isolaat dat op alveolaire macrofagen van een varkenslong werd verkregen in het ene geval intraveneus en intranasaal geïnfecteerd (IN) terwijl in een ander geval slechts infectie via de intranasale route plaatsvond (voorbeeld 2.1.). Gedurende het gehele experiment werd opname van voedsel, rectale temperatuur en de klinische toestand van de dieren waargenomen. Met het doel de bovengenoemde middelen uit te sluiten werden bloedmonsters van alle zeugen vóór infectie genomen. Deze bleken seronegatief voor alle middelen te zijn. Eveneens bleken na experimentele infectie de zeugen alle nog steeds seronegatief voor de genoemde virussen te zijn, alsmede seropositief voor PRRS te zijn (zoals geverifieerd werd met de referentie LV). De verkregen resultaten worden in tabel 1 getoond.
Legenda AD = ziekte van Aujeszky FMD = mond-en-klauwzeer PP = varkensparvovirosis CSF = klassieke zwijnkoorts SF = zwijninfluenza (H1N1, H2N3) TG = overdraagbare gastro-enteritis PRRS = varkensreproductie- en -respiratiesyndroom HAI = haemagglutinatie aan peroxidase gekoppelde test NPLA = neutraliserende aan peroxidase gekoppelde test ELISA= aan enzym gekoppelde immunosorptietest SN = seroneutralisatie IPMA = immunoperoxidasemonolaagtest (1) = Vannier et al., Ree. Méd. Vet. 155 (2), 151-158 (1979) (2) = Charley B., Thesis Doctoral, Alfort (1976) (3) = Trepsta et al., Vet. Microb. 3, 113“120 (1984) (4) = Elliot M., J. Rech. Porc., 20, 141-146.
(5) = Lucam F., "Diagnostic sero-immunologique des viroses humains et animals", F. Bricout; L. Joubert; J.M. Huraux (1977) (6) = Jiménez et al., J. Virol., 60, 131-139 (1986) (7) = Wensvoort et al., Vet. QUARTERLY, Vol. 13, No. 3 (juli 1991) (-) = negatief (+) = positief ND = niet uitgevoerd.
4·3·2. Experimentele reproductie van de ziekte bi.i biggen.
Het doel van dit experiment was om te bevestigen of het causatieve virus van reproductiewijzigingen in zeugen in staat was bij biggen van 2 maanden oud respiratiesymptomen en macroscopische en microscopische lesies op longniveau te veroorzaken. Hiertoe werd een aantal biggen via de IN-route met het virus geïnfecteerd (Spaanse stam) welke biggen vervolgens op verschillende dagen na infectie (voorbeeld 2.2.) werden gedood.
De meest relevante gegevens die hieruit resulteren tonen aan dat dit virus op macroscopisch niveau meervoudige consolidatiefoci alsmede op microscopisch niveau interstitiële pneumonie veroorzaakte (tabel 4). Wat de gezondheid betreft konden geen relevante klinische tekenen worden waargenomen.
4.3.3. Chloroformgevoeligheidstest.
Deze test werd uitgevoerd om te bepalen of het geïsoleerde virus een lipide-mantel had. Hiertoe werd de werkwijze van Feldman, H. en Wang, S., gebruikt zoals deze beschreven is in "A manual of basic virological techniques", Prentice-Hall Inc., New Jersey, l46-l48 (1978)· De verkregen resultaten tonen aan dat het niet behandelde virus een titer van 105’6 TCID50/ml heeft terwijl na behandeling met chloroform de titer lager is dan 101,3 TCID50/ml op basis waarvan gesteld kan worden dat het geïsoleerde virus een lipide-mantel heeft.
4.3.4. Het seauencen van het virale genoom.
Vijf fasen werden uitgevoerd: i) zuivering van het virus
ii) zuivering van het virale RNA
iii) cDNA-synthese iv) klonering en karakterisering van de cDNA-klonen
v) het sequencen en vergelijken van de sequenties met die van LV
i) zuivering van het virus
Virus dat op alveolaire macrofagen van een varkenslong was gerepliceerd werd gezuiverd en door filtratie geconcentreerd onder toepassing van MILLIPORE-filters. Daarna werd het virus aan centrifugatie in 10 tot 50% metrizamidegradient (SIGMA) onderworpen. Na voltooiing van centrifugatie werd een band verkregen die door centrifugatie werd geconcentreerd. Met het gezuiverde virus werd een elektroforese op polyacrylamidegel uitgevoerd en werd een imunoblot ontwikkeld met een specifiek serum dat eiwitten vertoonde waarvan de blijkbare molecuulgewichten 15. 23. 5^ en 66 K Daltons bedroegen.
ii) Zuivering van het virale RNA
Een techniek voor selectie en zuivering van het RNA werd toegepast op basis van het feit dat het RNA een poly(A)sequentie aan het 3'“ uiteinde bevat. Hiertoe werd een in de handel verkrijgbare kit (Pharmacia) toegepast die exclusieve binding van de RNA-poly(A)keten aan een cellulose-oligo(dT)-matrix alsmede de elutie daarna mogelijk maakte.
iii) cDNA-synthese
Een in de handel verkrijgbare kit werd toegepast (Boehringer Mannheim), waarbij de voorschriften van de producent werden gevolgd. In het kort werd het virale genome RNA bij aanwezigheid van een oligo(dT), dATP, dCTP, dGTP, dTTP en omgekeerde transcriptase geïn-cubeerd.
iv) Klonering en karakterisering van de cDNA-klonen
Het cDNA werd gekloneerd in een van pUCl8 afgeleide vector en een reeks klonen werd verkregen die de volledige nucleotidesequentie die met ORFs 3 tot 7 overeenkomt bevatte.
v) Het sequencen en vergelijken van de sequenties met die van LV v.a.) Het sequencen
Het gebied dat overeenkomt met ORFs 3~7 van het virus dat bij onze laboratoria werd geïsoleerd is volledig gesequenced. Fig. 1 tot 5 tonen de sequenties van verkregen cDNA alsmede de sequenties die van aminozuren die door elk ORF worden gecodeerd zijn afgeleid. De totale lengte van het gebied waarvan de sequence is bepaald bedraagt ongeveer 2599 nucleotiden (nt). Zoals gezien kan worden heeft ORF 3 een lengte van ongeveer 789 nt en codeert het voor een eiwit van 266 aminozuurgroepen. ORF 4 heeft een lengte van ongeveer 552 nt en codeert voor een eiwit van 183 aminozuurgroepen. De aanvang van dit 0RF4 bevindt zich in het ATG-codon dat zich ongeveer 540 bp van het initiële 0RF-3-ATG-codon bevindt. ORF 3 en ORF 4 delen een sequentie van ongeveer 246 nt. ORF 5 heeft een lengte van ongeveer 6θ6 nt en codeert voor een eiwit van 200 aminozuurgroepen. Het initiële codon van deze ORF 5 overlapt praktisch het eindcodon van ORF 4 (zij delen de TG nucleotiden, het ATG-codon aan het begin van ORF 5 en het ORF 4 tGA-eindcodon). Het initiële ATG-codon van ORF 5 bevindt zich ongeveer 1092 nt van het initiële ATG-codon van ORF 3· ORF 6 heeft een lengte van ongeveer 522 nt en codeert voor een eiwit van 173
aminozuurgroepen. Dit initiële ATG-codon van ORF 6 bevindt zich 8 nt stroomafwaarts van het begin van het terminatie-TAG-codon van ORF 5 (op ongeveer 1682 nt van het initiële ATG-codon van ORF 3) · ORF 7 heeft een lengte van ongeveer 387 nt en codeert voor een eiwit van 129 aminozuurgroepen. Dit initiële ATG-codon van ORF 7 bevindt zich 5 nt stroomafwaarts van het begin van het terminatie-TAA-codon van ORF 6 (op ongeveer 2193 nt van het initiële ATG-codon van ORF 3)· De eiwitten die door ORFs 3 tot 6 worden gecodeerd zijn membraaneiwit-ten, terwijl het eiwit dat door ORF 7 wordt gecodeerd een nucleocap-side-eiwit is. v.b.) Vergelijking met LV
Bij vergelijking van de cDNA-sequenties van ORFs 3“7 van LV met die van het virus dat in onze laboratoria is geïsoleerd kan worden waargenomen dat: i) op nucleotide-niveau 114 van de 2599 nucleotiden verschillen vertonen, hetgeen overeenkomt met ongeveer 95<5# homologie, ii) op aminozuurniveau 47 aminozuren van de 955 aminozuren die zijn vergeleken verschillen, hetgeen ongeveer 94,9?· homologie voorstelt, iii) van de 47 aminozuren die verschillen worden 35 beschouwd als niet-conservatieve substituties waarvan 12 zich in het produkt van het ORF 3-gen bevinden (fig. 6); 9 zich in het produkt van het ORF 4-gen bevinden (fig. 7); 10 zich in het produkt van het ORF 5“gen (fig. 8) bevinden, hoewel opgemerkt moet worden dat het produkt van het LV-ORF 5_gen 1 aminozuur meer bevat dan het produkt van het Spaanse virus-ORF 5. specifiek ontbreekt aminozuur 35 (Asn) van het LV-ORF 5-produkt in het produkt dat door het Spaanse virus tot expressie wordt gebracht; 4 zich in het produkt van het ORF 6-gen bevinden (fig. 9)‘> terwijl het produkt van het ORF 7“gen geen enkele niet-conservatieve substitutie bevat (fig. 10), iv) gedeeltelijke homologie van elk produkt dat door de verschillende ORFs van het Spaanse virus en LV tot expressie wordt gebracht bedraagt 93.6# voor de produkten van ORF 3 en ORF 5» 94,0# voor het produkt van ORF 4, 96,6# voor het produkt van ORF 6 en 99*2# voor het produkt van ORF 7·
Zoals hierboven is aangegeven kunnen de veranderingen in de aminozuren samenhangen met de hogere pathogeniciteit van de ene stam in vergelijking met de andere, aangezien het virus dat in onze laboratoria (Spaanse stam) meer pathogeen is dan andere bekende PRRS-virussen, zoals bijvoorbeeld het virus dat in Frankrijk is geïsoleerd (voorbeeld 8) en LV
(tabel 6 van PCT-octrooiaanvrage WO 92/21375)· 5. Vaccins
De uitvinding verschaft een vaccin dat varkensreproductie- en -respiratiesyndroom (PRRS) kan voorkomen. Het vaccin is werkzaam gebleken bij het voorkomen van reproductiewijzigingen bij zeugen zoals doodgeboren biggen, gemummificeerde biggen of levende doch zwakke biggen, "return to service" en soortgelijke problemen die door het causatieve virus van PRRS worden veroorzaakt. Op soortgelijke wijze is bevestigd dat het vaccin cellulaire immuniteit bij gevaccineerde dieren induceert.
Het vaccin bevat een geschikte hoeveelheid geïnactiveerd Spaanse stam PRRS viraal antigeen, alsmede een adjuvans en een conserveermiddel. Testen die met deze vaccins zijn uitgevoerd hebben de werkzaamheid van het vaccin, zoals door voorbeelden 7 en 8, wordt getoond. Daarnaast is aangetoond dat het vaccin werkzaam is bij het voorkomen van "return to service" dat voorkomt bij geïnfecteerde zeugen. Inderdaad konden de zeugen die met de vaccins resulterend uit de onderhavige uitvinding waren gevaccineerd en met het causatieve virus van PRRS waren geïnfecteerd paren en werden zij bij de eerste post-partum ovulatie en het zogen van de biggen zwanger.
5.1. Bestanddelen 5.1. a) Antigene fase
Als werkzaam bestanddeel bevat het vaccin geïnactiveerd Spaanse stam PRRS viraal antigeen bij een concentratie hoger of gelijk aan 105,5 TCID50 per vaccindosis. De inactivering kan geschieden door middel van chemische middelen die behandeling met β-propiolacton of andere conventionele in-activeringsmiddelen zoals ethyleenimine of formaldehyde, omvatten of door fysische middelen.
5.1. b) Adjuvantia
Hoewel het mogelijk is adjuvantia van het aluminiumhydroxydetype, Quil A of mengsels daarvan alsmede olieachtige adjuvantia voor het formuleren van het vaccin te gebruiken is bevestiging mogelijk geweest van het feit dat de beste resultaten worden verkregen bij toepassing van een olieachtig adjuvans (voorbeeld 4). In het bijzonder is bevestigd dat een olieachtig adjuvans dat gevormd wordt door een mengsel van Marcol 52, Simulson 5100 en Montanide 888 zeer goede resultaten verschaft. Marcol 52 is een anorganische olie met een lage dichtheid die door ESSO ESPANOLA, S.A. wordt geproduceerd; Simulsol 5100 is een polyethoxyoleaatether die door SEPIC in de handel wordt gebracht en Montanide 888 is een watervrije mannitoletheroctadecanoaat met hoge zuiverheid die door SEPIC in de handel wordt gebracht.
Bevestiging van het feit dat het adjuvans een essentiële rol speelt bij de werkzaamheid van het vaccin is mogelijk geweest. Aldus is een uitdagingstest (voorbeeld 6) onder toepassing van zeugen die met twee verschillende vaccins zijn gevaccineerd waarbij één zeug met het olieachtige adjuvans dat boven is aangegeven (ref. 1) en de andere zeug onder toepassing van het adjuvans Munokynir® (ref. 2) is gevaccineerd uitgevoerd. Hoewel beide vaccins seroconversie produceren werd bij een experimentele infectietest aangetoond dat de zeugen die met vaccin ref. 1 werden gevaccineerd beschermd waren tegen experimentele infectie met PRRS-virus terwijl de andere zeugen die waren gevaccineerd met vaccin ref. 2 niet beschermd waren, niettegenstaande het feit dat ten tijde van de uidaging zij antilichamen tegen het virus bezaten. Dit geeft aan dat een geschikt adjuvans een zeer belangrijke rol kan spelen in samenhang met de modulatie en stimulatie van immuunrespons met name op het niveau van cellulaire immuniteit. Daarnaast is dit aspect bevestigd door middel van de uitdagingstest die is uitgevoerd onder toepassing van de Spaanse stam van het PRRS-virus, aangezien de zeugen die met ref. 1 vaccin waren gevaccineerd en opnieuw waren gevaccineerd geen serologische respons ten tijde van infectie toonden maar, niettegenstaande, beschermd waren (voorbeeld 7. tabel 8).
Het is echter eveneens mogelijk dat ref. 2 vaccin (met Munokynir®) cellulaire immuniteit kan veroorzaken. Hiertoe zal het nodig zijn middelen toe te voegen die celrespons versterken (CRP), d.w.z. middelen toe te voegen die helper-T-cel-subpopulaties (1¾ en Th2) versterken zoals IL-1 (interleukine-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-12, g-IFN (gamma interferon), cellulaire necrosefactor en soortgelijke stoffen. Het moge duidelijk zijn dat het mogelijk is deze PRC-stoffen aan vaccins met olieachtig adjuvans toe te voegen in welk geval hun celimmuuneffect versterkt zal worden. Andere types adjuvantia die celrespons moduleren en immunostimuleren, zoals MDP (muramyldipeptide), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) of liposomen kunnen eveneens worden gebruikt .
5.1.c) Conserveermiddelen
Elk van de conserveermiddelen die gebruikelijk worden toegepast bij de formulering van vaccins kan worden toegepast. Eén hiervan is thimerosal [natriumzout van {2-carboxyfenylthio)ethyl-kwik] (ALDRICH).
5.2. Werkwijze voor de bereiding van het vaccin.
De vaccins resulterend uit deze uitvinding kunnen worden verkregen door een antigene fase die het geïnactiveerde virale antigeen en een andere fase, zoals adjuvans dat al of niet olieachtig kan zijn, afhankelijk van het gekozen adjuvans, te mengen. Eventueel kunnen CRP-stoffen aan één van de twee fasen worden toegevoegd. Wanneer het adjuvans olieachtig is kan een emulsie worden gevormd dat in een bijzondere en voor-keursuitvoeringsvorm (wanneer het adjuvans een mengsel van Marcol 52, Simulsol 5IOO en Montanide 888 is) een dubbele w/o/w- (water/olie/water-) emulsie is.
5.3. Vaccincontroletesten.
Naast de gebruikelijke testen die het vaccin moet halen voor toediening daarvan qua (i) zuiverheid (met het oog op bacteriën, schimmels en vreemde virussen), (ii) identificatie, (iii) veiligheid, (iv) kracht en (v) fysisch-chemische controles zijn een aantal veldproeven op een totaal van vijf boerderijen (voorbeeld 5b) met betrekking tot de veiligheid en werkzaamheid van het vaccin uitgevoerd. Hierbij werden 508 zeugen gevaccineerd en opnieuw gevaccineerd met één van de vaccins van de onderhavige uitvinding, terwijl de resterende 472 zeugen niet werden gevaccineerd en als controlezeugen werden gehouden, waarbij waargenomen werd dat het vaccin veilig en tegelijkertijd effectief is aangezien op sommige van de boerderijen de natuurlijke PRRS-ziekte in niet-gevaccineerde dieren werd waargenomen nadat vaccinatie had plaatsgevonden.
5.4. Posologie en instructies voor toediening van het vaccin.
Het is bevestigd dat één dosis van 2 ml olieachtig vaccin met een concentratie van geïnactiveerd viraal antigeen gelijk aan of hoger dan IO5,5 TCID50, dat door middel van diepe intramusculaire route wordt toegediend een zeer hoog percentage gevaccineerde dieren tegen PRRS kan beschermen. Het volgende vaccinatieprogramma wordt aangeraden: * le vaccinatie:
Vaccineer alle fokdieren (zeugen en beren) en vaccineer opnieuw na 21 dagen. Dien vervolgens 1 dosis gedurende elke lactatie (zeugen), en elke 6 maanden (beren) toe.
* Post-vaccinaties:
Bij dieren die bestemd zijn voor reproductie dient de eerste vacci- natie 6 maanden plaats te vinden met hervaccinatie na 21 dagen.
Het is aan te raden gedurende de lactatieperiode te vaccineren, indien mogelijk 15 dagen vóór kruising.
Beren: vaccineer 2 maal per jaar (iedere 6 maanden).
Anderzijds, wanneer geen CRP-stof in het vaccin is opgenomen kunnen deze stoffen tegelijkertijd op een plaats verschillend aan de inoculatie-plaats worden geïnjecteerd.
6. Polyvalente vaccins.
Teneinde een additioneel doel met de onderhavige uitvinding te bereiken worden combinaties verschaft van verschillende varkenspathogenen, die naast het geïnactiveerde viraal PRRS antigeen (Spaanse stam) één of meer van de hieronder genoemde pathogenen bevatten teneinde de bereiding van bi- of multivalente vaccins mogelijk te maken. Op deze manier kunnen bi- of multivalente vaccins worden bereid die geïnactiveerd viraal PRRS-antigeen en één of meer van de volgende pathogenen: Actïnobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Varkensparvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Varkensrespiratie-coronaiu'rus, Rotavirus of iets tegen de pathogenen die de ziekte van Aujeszky, zwijninfluenza of overdraagbare gastro-enteritis veroorzaken, bevatten.
VOORBEELDEN
VOORBEELD 1
Isolatie van het virus.
l.A. Bereiding van de monsters.
Uit de long van een doodgeboren big, nageslacht van een zeug met de klassieke PRRS-symptomen [waarbij de zeug vrij was van antilichamen tegen de ziekte van Aujeszky, varkensparvovirosis, mond-en-klauwziekte, klassieke zwijnkoorts, zwijninfluenza (types H1N1 en H3N2) en overdraagbare gastro-enteritis] werd een 10#'s suspensie in DMEM-kweekmedium gemaakt dat was aangevuld met een oplossing van antibiotica (PEG) die bestond uit 1000 IU/ml penicilline, 1 mg/ml streptomycine en 0,5 mg/ml gentamicine, in een verhouding long:DMEM oplossing van 1:10 (gew./vol.). De geproduceerde suspensie werd gehomogeniseerd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (20-22°C) gelaten. Het homogenaat werd gevroren en 2 maal ontdooid, gecentrifugeerd en het verkregen supernatant werd bij -70°C be- waard om te worden gebruikt bij de infectie van alveolaire macrofagen van een varkenslong. Op soortgelijke wijze werden monsters bereid van de long van een big die levend werd geboren maar binnen een paar uur stierf. Daarnaast werd bloed verwijderd en met en zonder antistollingsmiddel gemengd en toegepast voor isolatie van het virus (uit bloedplasma) en ter verkrijging van serum.
l.B. Verkrijging van alveolaire macrofagen van een varkenslong.
Alveolaire macrofagen werden verkregen uit de longen van varkens die seronegatief waren voor de ziekte van Aujeszki, varkensparvovirosis, mond-en-klauwziekte, klassieke zwijnkoorts, zwijninfluenza (types H1N1 en H3N2) en overdraagbare gastroenteritis. De leeftijd van de varkens die werden gebruikt bedroeg tussen 7 en 8 weken. Voor extractie van de longen werden de dieren aan anesthesie met natriumfenolbarbital onderworpen en vervolgens gedood. Onmiddellijk werden de longen samen met de trachea verwijderd na ligatie onder de epiglottis. De verwijderde long werd extern met fysiologische zoutoplossing gewassen en in achtereenvolgende spoelstappen werd 50 ml PBS die met PEG-oplossing van antibiotica is aangevuld opgenomen tot in totaal 500 ml PBS was opgenomen. De cellen die verkregen zijn uit deze wasstappen werden gedurende 10 minuten bij 300 g gecentrifugeerd. Deze wasstap door centrifugatie werd 2 maal herhaald. De verkregen cellen werden met PBS en een PEG-oplossing van antibiotica gewassen en in DMEM-medium [DMEM, dat aangevuld was met niet-essentiele aminozuren (GIBC0), 1% natriumpyruvaat 1 mM en 1% glutamine 2 mM], 10% foetaal kalfsserum (FCS) en PEG-oplossing van antibiotica bij Va geresus-pendeerd. Het tellen van de cellen werd uitgevoerd in Newbauer-kamers en hiertoe werd een 1/10 verdunning van de macrofaagsuspensie bereid door toevoeging van 0,4 ml DMEM en 0,5 ml trypaan blauw oplossing aan 0,1 ml macrofaagsuspensie. Een celaantal tussen 1 en 1,2 x 109 werd verkregen.
l.C. Isolatie van het virus.
Een kweekfles met een oppervlakte van 25 cm2 die een kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong die eerder was bereid (3 x 106 cellen/ml) in DMEM-medium en 10#'s FCS bevatte werd met 1 ml van het homogenaat van een monster dat afkomstig was uit de long van een doodgeboren big geïnfecteerd (voorbeeld I.A.). Het homogenaat bleef gedurende 1 uur bij 37°C in contact met de macrofaagkweek werd gebufferd met C02 bij pH 7.0-7.4 en gedurende een aantal dagen bij 37"C geincubeerd en tijdens deze periode werd het door het virus op de macrofagen geprodu ceerde CPE waargenomen. Na 3“^ dpi werd een CPE waargenomen van 70-80% waarna de kweken bij -80°C werden bevroren. Tegelijkertijd werd een kweek van alveolaire macrofagen van niet-geinfecteerde varkenslong bereid en als negatieve controle gebruikt. Subkweken met het geïsoleerde virus werden uitgevoerd waarbij werd waargenomen dat het CPE, uitgaande van de tweede DPI IOC# was. Het virus werd bij -80°C bevroren voor identificatie achteraf en karakterisatie. Na de vierde doorgang in macrofagen werden de overeenkomstige titraties in microtiterplaten met 96 putjes uitgevoerd waarbij een gemiddelde titer van 105’6 TCID50/ml in overeenstemming met de Reed & Muench werkwijze [Am. J. Hyg., 27: ^93~^97 (1938)] werd verkregen. Een monster van geïsoleerd virus (Spaanse stam) dat aangeduid is met PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 dat uit de long van een doodgeboren big werd geïsoleerd is in staat tot experimentele reproduktie van de ziekte en werd gedeponeerd bij de ECACC op 29 juni 1993 onder toegangsnummer V93070108. Op soortgelijke wijze werd het virus geïsoleerd uit levende en doodgeboren biggen, het nageslacht van zeugen die experimenteel waren geïnfecteerd.
VOORBEELD 2
Identificatie en karakterisatie van het virus
Voorbeeld 2.1. Experimentele reproductie van de ziekte bi.i zwangere zeugen.
Twaalf zeugen, German Landrace x Large White Cross die afstammen van boerderijen met een systematische serologische controle tegen de virussen van ziekte van Aujeszki, mond-en-klauwziekte, varkensparvovirosis, klassieke zwijnkoorts, zwijninfluenza (types H1N1 en H3N2) en overdraagbare gastro-enteritis werden toegepast. Daarnaast werd de antilichaam-evalu-atietest tegen het causatieve virus van PRRS uitgevoerd.
De zeugen werden 1 week vóór infectie naar de veilige stallen van het onderzoekscentrum verplaatst en in afzonderlijke stallen geplaatst. Tussen dagen 77 en 90 van de zwangerschap werden zeugen met nummers 53» 76, 8, 62, 91. 93 en 19, met 5 ml via de intraveneuze route (IV) en met 5 ml via de intranasale route (IN) geïnfecteerd met PRRS-virus, Spaanse stam, dat uit de alveolaire microfagen van de varkenslong, dat als PRRS-CY-218 JPD-P5-6-91 uit een vierde doorgang van macrofagen, door een 200 nm filter gefiltreerd en met een titer van 105,6 TCID50/ml was geïsoleerd. De 5 resterende zeugen (nummers 14, 40, 13. 30 en 85) werden tussen dagen 65 en 85 van de zwangerschap geïnfecteerd met 5 “1 van het virus via slechts IN. Gedurende het experiment werden dagelijks voedselopname, rectale temperatuur en de klinische toestand van de dieren waargenomen alsmede de reproduktiewijzigingen (premature geboortes, vertraagde geboortes, levende maar zwakke biggen, doodgeboren biggen, gemummificeerde en gezonde biggen).
Teneinde de bovengenoemde pathogenen verder te kunnen uitsluiten werden bloedmonsters van de zeugen vóór en na infectie genomen met als resultaat dat de dieren vóór en na infectie seronegatief waren voor de pathogenen en na infectie seropositief waren voor PRRS (zie tabel 1, 4.3.I.).
De reproductieresultaten verschijnen in tabellen 2 en 3· Zoals in tabel 2 wordt getoond waren 15 van de 93 biggen die geboren werden gemummificeerd, 35 doodgeboren, 22 levend geboren maar stierven zij op de derde dag en overleefden 21 biggen 7 levensdagen.
Sommige zeugen vertoonden gebrek aan eetlust gedurende 2 a 4 dagen, op dagen 6 en 8 na infectie, terwijl andere zeugen gebrek aan eetlust op de 2e dag na infectie vertoonden. Hyperthermie werd in geen enkel geval waargenomen. Bij 4 zeugen vond de bevalling 1 tot 6 dagen te vroeg plaats (no. 8, 62, 92 en 93)» terwijl bij de andere 3 zeugen bevalling 1 a 2 dagen werd vertraagd. Van de biggen die levend werden geboren vertoonde 1 of 2 per nest oedeem van de ogen. De zwakke biggen vertoonden incoördina-tie, parese van de achterpoten, rechtopstaand haar en myoclonie. Bij de necropsie die op sommige van de doodgeboren en zwakke biggen werd uitgevoerd werd een overvloed heldere vloeistof in de thoraxholte geconstateerd. Gezonde biggen die geboren werden uit geïnfecteerde moeders en na 8 tot 12 dagen werden gedood vertoonden grijze consolidatiefoci. Bij microscopische waarneming was de meest significante verandering een geringe multifoci interstitiële pneumonie met vergroting van alveolaire septi vanwege de infiltratie van mononucleaire cellen. Deze lesies verschenen bij alle dieren die in het experiment zijn geanalyseerd.
Zoals in tabel 3 waargenomen kan worden zijn van de 65 biggen die zijn bevallen 36 doodgeboren, 26 levend maar zwak geboren, waarbij sterfte op de tweede levensdag plaatsvindt en waarbij 3 de eerste levensweek overleefden. Eén zeug beviel 12 dagen te vroeg (nr. 4) terwijl de andere 1 a 2 dagen te vroeg bevielen. De klinische tekenen van de biggen die zwak zijn geboren zijn vergelijkbaar met die verkregen via IN + IV. Interstitiële pneumonie werd eveneens waargenomen. De geïnfecteerde zeugen vertoonden geen gebrek aan eetlust of hyperthermie.
Het meest relevante verschil tussen de twee systemen van infectie is dat via IN + IV gemummificeerde biggen werden waargenomen en dat één of twee van de biggen die levend werden geboren in elk nest oedeem rond de ogen vertoonden. Met het oog op de verkregen resultaten kan worden geconcludeerd dat het model voor experimentele infectie bij zeugen bij ongeveer 80 dagen zwangerschap via beide infectieroutes (IN en IV) met het uit dieren die langs natuurlijke weg zijn geïnfecteerd geïsoleerde virus (Spaanse stam) de ziekte PRRS in zwangere zeugen reproduceert en een hoog gehalte aan gemummificeerde foetussen, doodgeboren biggen en levende doch zwakke biggen veroorzaakt in een verhouding vergelijkbaar met die welke bij acute natuurlijke infectieuitbarstingen plaatsvindt. Het is raadzaam kunstmatig via de IN-route te infecteren omdat dit de natuurlijke infec-tieroute in het veld is en derhalve de meest geschikte wijze is om de werkzaamheid van het vaccin te evalueren. Door middel van dit experiment is het eveneens mogelijk geweest een model op te zetten voor experimentele infectie bij zwangere zeugen de werkzaamheid van het vaccin bevestigt.
Tabel 3 IN
A: Zeug B: Tijdstip van infectie {dagen zwangerschap) C: Bevalling (dagen zwangerschap) D: Biggen totaal E: Gemummificeerde biggen F: Zwakke biggen, dood na 48 uur G: Doodgeboren biggen H: Biggen met klaarblijkelijk goede gezondheid hl: dood tussen 2 en 7 dagen h2: levend na 1 week I: Interstitiële pneumonie NT: Niet getest.
Voorbeeld 2.2. Experimentele reproductie van de ziekte bi.i biggen.
Dit experiment werd ontwikkeld ter bevestiging van het feit dat het geïsoleerde virus (Spaanse stam) dat reproductiewijzigingen bij zeugen veroorzaakt in staat is klinische tekenen alsmede macroscopische en microscopische lesies in de longen van 2 maand oude biggen te produceren. Hiertoe werden 10 biggen via IN-route met 5 “1 Spaanse stam virus met een titer van 105,6 TCID50 ml geïnfecteerd en werden 6 andere biggen als controles gebruikt waarbij alle biggen afstamden van twee nesten. De dieren werden op dagen 3. 7. 8. 9 en 11 na infectie gedood. De verkregen resultaten worden in tabel 4 getoond.
Nr. : varkensnummer I/C : geïnfecteerd (I) of controle (C) DPI : dagen na infectie I.P. : interstitiële pneumonie V.I. : virusisolatie 2+ : enige interstitiële pneumonie 3+ : intermediaire interstitiële pneumonie 4+ : ernstige interstitiële pneumonie NT : niet getest NL : geen lesies.
Gedurende de 11 dagen van het experiment werden geen klinische respiratie -tekenen of hyperthermie waargenomen hoewel er gewichtsverlies bij de geïnfecteerde dieren optrad in vergelijking met de niet geïnfecteerde dieren. Onder microscopische waarnemingen was het meest relevante aspect de aanwezigheid van meervoudige consolidatiefoci in de longen, geconges-teerde lymfklieren in de kaak en enige intestinale bloedingen. Op microscopisch niveau werd interstitiële pneumonie waargenomen.
Er werd virus geïsoleerd uit de oplossingen die uit het wassen van longen van geïnfecteerde dieren op een verse macrofaagkweek waren verkregen, maar er werd geen virus geïsoleerd uit de controledieren waarin geen seroconversie werd waargenomen noch werden macroscopische of microscopische lesies op longniveau’s waargenomen. Wanneer celtellingen werden uitgevoerd op het wasprodukt van de longen van geïnfecteerde dieren werd 30% dode cellen (macrofagen) waargenomen hetgeen een factor van belang kan vormen bij secundaire infecties vanwege vernietiging van een sleutel-immuundefensie-element (macrofagen). De afwezigheid van respiratie-teke-nen kan te wijten zijn aan het feit dat de experimentele infecties in stallen met continue disinfectiebehandeling werden uitgevoerd waardoor de bacteriële concentratie veel kleiner was in vergelijking met die, welke bestaat bij een kudde onder veldomstandigheden.
Voorbeeld 2.3· Chloroformgevoeligheidstest.
De werkwijze van Feldman, H. en Wang, S. (4.3·3·) werd toegepast, hetgeen de kennis leverde dat het geïsoleerde virus een lipide-mantel heeft, aangezien een titerverval van 4 log10 bij de controlekweken in vergelijking met de kweken die met chloroform zijn behandeld, plaatsvindt.
Voorbeeld 2.4. Seauencen van het virale genoom.
i) Zuivering van het virus
Het virus dat op alveolaire macrofagen van een varkenslong repliceerde werd gezuiverd door filtratie en centrifugatie in 10 tot 30% metrizamide-gradient (SIGMA) hetgeen resulteerde in een band die nogmaals werd gecentrifugeerd zoals genoemd is in 4.3*4. Met het gezuiverde virus werd een elektroforese in polyacrylamidegel uitgevoerd en werd een immunoblot ontwikkeld met een specifiek serum dat eiwitten vertoonde met een klaarblijkelijk molecuulgewicht van 15, 23, 54 en 66 K Daltons.
ii) Zuivering van het virale RNA
Het virale RNA werd gezuiverd onder toepassing van een in de handel verkrijgbare kit (PHARMACIA) dat de binding van de RNA-poly-(A)-staart aan een cellulose-oligo-(dT)-matrix en daarop volgende elutie mogelijk maakt.
iii) cDNA-synthese.
Een in de handel verkrijgbare kit werd toegepast (Boehringer
Mannheim) (zie 4.3.4. iü) · iv) Klonering en karakterisatie van de cDNA-klonen.
Het cDNA werd in een vector gekloneerd dat was afgeleid van pUCl8 en een reeks klonen werd verkregen die de volledige nucleotidesequentie die met ORFs 3_7 overeenkomt, bevat.
v) Het sequencen en vergelijken van de sequenties met die van LV.
De resultaten van het sequencen van het cDNA van het virus dat in onze laboratoria is geïsoleerd (ORFs 3“7K alsmede de vergelijking tussen die sequentie en de LV-sequentie wordt in 4.3·4.ν genoemd waar gezien kan worden dat op aminozuurniveau ongeveer 94,9# homologie bestaat met in totaal 47 verschillen in aminozuren, waarvan 35 overeenkomen met niet conservatieve substituties. Deze verschillen op aminozuurniveau kunnen verantwoordelijk zijn voor de verschillen in pathogeniciteit die bestaan tussen de diverse geïsoleerde PRRS-virusstammen.
VOORBEELD 3
Formulering van een vaccin
Een vaccin dat bescherming tegen PRRS kan bieden wordt bereid in emulsievorm volgens de werkwijze die hieronder wordt uiteengezet. Een kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong wordt geïnfecteerd met MOI (multiplicity order infection) van 0,001 en wordt gedurende 24 uur bij 37°C geincubeerd waarbij aan het eind het kweekmedium wordt vervangen door infectiemedium (DMEM dat is aangevuld met 2# FCS). De kweek wordt gedurende 4 dagen bij 37°C geincubeerd tot 70-80# CPE wordt waargenomen. Wanneer deze periode eenmaal voltooid is wordt een IPMA-test uitgevoerd teneinde identificatie te bevestigen. Het virus wordt door vacuumaspiratie verzameld en bij -80°C bevroren. De virale suspensie die bestemd is voor vaccin moet 105’5 TCID50/ml minimum-titer hebben, voorafgaande aan inactivering daarvan en dient niet te zijn besmet met bacteriën, schimmels, mycoplasma's of andere virussen. Wanneer de titer lager is dient deze te worden bijgesteld door het antigeen te concentreren. Voor de inactivatie van de virale suspensie wordt 2& β-propiolacton-op-lossing toegevoegd en gedurende 1 nacht bij 4°C geroerd waarbij de pH op 7,4 wordt gehouden door toevoeging van 0,5 N NaOH. Wanneer de inactiva-tieperiode eenmaal is voltooid wordt de virale suspensie gedurende 1 uur op 37°C gehouden. Het volgende wordt daarna bereid: a) een antigene fase van het virale antigeen dat geïnactiveerd is met een minimale concentratie van 105,5 TCID50/dosering en het conserveermiddel ; en b) een olieachtige fase die bestaat uit Marcol 52, Simulsol 1500 en Montanide 888.
De waterige fase, die continu wordt geroerd, wordt langzaam aan de reactor toegevoegd die de olieachtige fase welke ook wordt geroerd bevat. Wanneer de waterige fase helemaal is toegevoegd wordt roeren gedurende 10 minuten voortgezet. In een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm zijn vaccins bereid die in staat zijn PRRS te voorkomen die per dosis van 2 ml: a) 53# van een antigene fase, die i) Spaanse stam PRRS viraal antigeen in DMEM-kweekmedium, die met β-propiolacton is geïnactiveerd met een minimum concentratie van 105·5 TCID5o, en ii) thimerosal 0,01# bevat; en b) 47# van een olieachtige fase die i) Marcol 52 ....... 790,0 mg ii) Simulsol 5100 ... 70,0 mg iii) Montanide 888 ... 80,0 mg bevat, omvat.
De verhouding van olieachtige fase/waterige fase is een gewicht/volume (gew./vol.) verhouding. Dit vaccin wordt aangeduid als MSD ref. 1. Het verkregen vaccin wordt onderworpen aan de overeenkomstige controletesten, voorafgaand aan gebruik. Een ander vaccin werd op soortgelijke wijze bereid onder toepassing van MunokynirfD (aluminiumhydroxyde en Quil A, zoals verschaft door American Cyanamid) als adjuvans waarbij dezelfde hoeveelheid geïnactiveerd virus werd gebruikt. Dit vaccin is MSD ref. 2 genoemd.
VOORBEELD 4
Evaluatie van het adjuvans.
Een veldproef werd uitgevoerd met een totaal van 128 zeugen waarvan 49 werden gevaccineerd met 1 dosis van het vaccin dat aangeduid is met MSD Ref. 1 en 50 zeugen werden met 1 dosis van het vaccin dat aangeduid is met MSD ref. 2 (Munokyniri®) gevaccineerd, terwijl de resterende 29 niet werden gevaccineerd en als controles werden gehouden. Na 22 dagen werden de zeugen opnieuw met 1 dosis van het overeenkomstige vaccin gevaccineerd. De volgende parameters werden onderzocht.
1. Serologisch respons door middel van IPMA-bepaling op de volgende tijdstippen: T0 : vaccinatie en bloedafname T22 : vaccinatie opnieuw en bloedafname T51 : bloedafname 50 dagen na vaccinatie 2. Algemene type reacties (eetlust voor voedsel, hyperthermie enz.)
De resultaten die werden verkregen worden getoond in tabellen 5 en 6, welke de percentages aangeven van zeugen met positieve serologische reactie (tabel 5) en het rekenkundige gemiddelde van de serologische titers die bereikt is (tabel 6).
Tabel 5 % dieren met serologische reactie ( + )
Tabel 6
Rekenkundig gemiddelde van de serologische titers
Er werden geen significante locale of algemene type reacties waargenomen. Het kan worden bevestigd op basis van de verkregen resultaten dat positieve seroconversie met beide vaccins kan worden bereikt, hoewel deze enigszins hoger zijn met het vaccin MSD ref. 1 (olieachtige adjuvans). Bij revaccinatie wordt een hoger seroconversiepercentage waargenomen en is het rekenkundige gemiddelde van de verkregen titers bij dieren die met MSD ref. 1 zijn gevaccineerd hoger.
94 o 1 u 1 & VOORBEELD 5
Veiligheid bij zeugen.
Voorbeeld 5·Α. Op laboratoriumniveau
Voorbeeld 5.A.I. - Voor de eerste maal barende zeugen.
Achttien voor de eerste maal barende zeugen (German Landrace x Large White Cross) uit een varkensproduktieboerderij werden gekozen en werden over twee stallen verdeeld met 9 zeugen per stal, zodat zeugen die met hetzelfde vaccin werden gevaccineerd (MSD ref. 1 of MSD ref. 2) die in voorbeeld 3 hierboven zijn verkregen, in dezelfde stal werden gehuisvest. Negen zeugen werden via diepe-IM-route gevaccineerd met 1 dosis vaccin MSD ref. 1 van 2 ml dat 105,5 TCID50/dosis geïnactiveerd virustiter bevatte en werden 20 dagen later met een andere dosis van hetzelfde titer opnieuw gevaccineerd. De andere negen zeugen werden met het vaccin MSD ref 2 (2 ml dosis 105’5 TCID50/dosis geïnactiveerde virustiter) gevaccineerd en op dezelfde dagen opnieuw gevaccineerd. Gedurende de eerste 5 dagen na in-oculatie werden de volgende waarnemingen verricht: a) Locale reactie
Deze bestaat uit macroscopische waarneming van de inoculatieplaats en betasting daarvan, waarbij de mate van ontsteking in vergelijking met objecten van bekende grootte wordt waargenomen, b) Algemene reactie
Deze bestaat uit macroscopische waarneming van de dieren en verificatie van hun eetlust. In het negatieve geval wordt rectale temperatuur elke 12 uur gecontroleerd tot hyperthermie of andere ongunstige tekenen zijn verdwenen. De verkregen resultaten geven aan dat er een enigszins inflammatoire reactie bij sommige zeugen plaatsvindt, welke duidelijk is bij de inoculatieplaats en in elk geval binnen een paar dagen verdwijnt; er werden geen etterende formaties waargenomen. Slechts één van de zeugen weigerde al het eten in de eerste voeding na inoculatie op te nemen, maar de voedselopname was bij de volgende voeding normaal zodat rectale temperatuurmeting onnodig was. Er waren geen substantiële verschillen in respons op de verschillende geteste vaccins op basis waarvan bevestigd kan worden dat beide vaccins veilig zijn.
Voorbeeld 5·Α.2. - Zwangere zeugen
Zeven zwangere zeugen (German Landrace x Large White Cross) van een varkensproduktieboerderij werden willekeurig gekozen: 6 voor het eerst bevallende zeugen van ongeveer 9 maanden en 1 zeug die reeds vaker was bevallen, met een leeftijd van 3 jaar en 7 maanden.
Het vaccin, dat aangeduid wordt als MSD ref. 1 werd als enige toegepast. De zeugen werden via de diepe-IM-route gevaccineerd met een vaccin-dosis van 2 ml dat geïnactiveerde virustiter van 105’5 TCID50/ml bevatte en na 15 dagen werden zij opnieuw met 1 dosis van hetzelfde titer gevaccineerd. Gedurende de eerste 5 dagen na inoculatie werden de volgende waarnemingen verricht: a) locale reacties die bestaan uit het doen van macroscopische waarnemingen van de grootte van inoculatie en het betasten daarvan waarbij de mate van ontsteking in vergelijking met objecten met een algemeen bekende grootte wordt genoteerd.
b) Ontbreken van eetlust welke bestaat uit het macroscopisch waarnemen van de dieren en het controleren op verlies aan eetlust.
c) Rectale temperatuur
Het meten van de rectale temperatuur 24 uur na vaccinatie en 24 uur na hervaccinatie. De verkregen resultaten tonen dat er een enigszins locale reactie bij twee van de dieren plaatsvond die niet ernstig was blijkens de kleine grootte en het na een paar dagen verdwijnen daarvan. Ontbreken van eetlust of hyperthermie werd in geen enkel geval waargenomen. Op basis hiervan kan worden bevestigd dat het vaccin veilig is.
Voorbeeld 5-b· Veiligheid en werkzaamheid in een veldproef.
Dit experiment werd uitgevoerd op de 5 boerderijen die hieronder zijn aangegeven. Een variabel aantal zeugen van elke boerderij werd gevaccineerd via diepe-IM met 1 dosis van 2 ml van het vaccin MSD ref. 1 dat een titer van 105’5 TCID50/dosis geïnactiveerd virus bevat en werd 21 dagen later opnieuw gevaccineerd met een andere dosis van hetzelfde titer waarbij de andere zeugen niet werden gevaccineerd en als controles werden toegepast:
TL = totaal I : Boerderij "Ramon del Quinta" (Banyoles) II : Boerderij "Cal Sabater" (Orriols) III : Boerderij "E. Canela" (Preixana) IV : Boerderij "R. Cunillera" (L'Albi) V : Boerderij "Inversors Picber" (Bellpuig)
Er is na waarneming van algemene en locale reacties bevestigd dat het vaccin veilig is. Locale reacties werden slechts in 1% van de dieren waargenomen. In samenhang met de productieparamters die in de bovengenoemde boerderijen zijn waargenomen konden geen variaties worden waargenomen in vergelijking met hun klinische geschiedenis. Met betrekking tot serologisch respons vertonen sommige boerderijen seroconversie naar het vaccin, terwijl in andere het respons negatief was. Dit duidt echter niet op een lage mate van bescherming, aangezien bij de experimentele infec-tietest in het laboratorium seronegatieve dieren experimentele infectie konden tegengaan (voorbeelden 7 en 8). In samenhang met de overdracht van moederimmuniteit van gevaccineerde dieren naar hun nageslacht wordt er een grote val in antilichaamtiters bij een leeftijd van 1 maand waargenomen. Bij gevaccineerde en opnieuw gevaccineerde zeugen die serologisch positief zijn vindt een grote afname in antilichaamtiters plaats 2 maanden na hervaccinatie.
VOORBEELD 6
Verificatie van celimmuniteit
Vijf zwangere zeugen (German Landrace x Large White Cross) van een varkensproduktieboerderij werden toegepast. De dieren werden verplaatst naar de veilige stallen van het onderzoekscentrum. Twee zeugen werden naar willekeur gekozen en werden met het vaccin dat als MFD ref.l wordt aangeduid gevaccineerd. Een andere zeug werd gevaccineerd met het vaccin dat is aangeduid met MSD ref. 2. De twee resterende zeugen werden niet gevaccineerd. De zeugen werden gevaccineerd via de diep-IM-route met 1 dosis van 2 ml vaccin MSD ref. 1 of vaccin MSD ref. 2 dat geïnactiveerde virustiter van 105,5 TCID50 bevatte en 20 dagen later werden de zeugen met nog een dosis van hetzelfde titer gevaccineerd. Daarna werden via de IN-route alle zeugen tussen dagen 77 en 90 van de zwangerschap geïnfecteerd met 5 ml van het virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 met een titer van 105,8 TCID50/ml. Ten tijde van de infectie werd geverifieerd dat alle gevaccineerde zeugen antilichaam tegen het causatieve virus van PRRS vertoonden (positieve serologie). Tabel 7 toont de reproduktieresultaten die als geheel werden verkregen:
(A) : aantal zeugen (B) : gebruikt vaccin (C) : totaal aantal biggen (D) : aantal biggen die levend en in goede gezondheid werden geboren (E) : aantal biggen die levend maar zwak werden geboren (F) : aantal biggen die na de eerste week leefden (G) : aantal doodgeboren biggen
De verkregen resultaten demonstreren dat de zeugen die met vaccin MSD ref.l (olieachtig adjuvans) zijn gevaccineerd beter bestand zijn tegen infectie dan de zeugen die met vaccin MSD ref. 2 (waterig adjuvans) zijn gevaccineerd, hetgeen kan betekenen dat het adjuvans een belangrijke rol speelt bij het vestigen van celimmuniteit.
VOORBEELD 7
Werkzaamheid bij zwangere zeugen.
Elf fokzeugen werden toegepast (German Landrace x Large White Cross) afkomstig van een varkensproduktieboerderij. De dieren werden verplaatst naar de veilige stallen van het onderzoekscentrum.
Drie zeugen werden naar willekeur gekozen (zeugen nrs. 57, 63 en 74) en werden met het vaccin dat als MSD ref. 1 wordt aangeduid gevaccineerd. Drie zeugen (nrs. 15» 18 en 23) werden met het vaccin dat als MSD ref. 2 wordt aangeduid gevaccineerd en de resterende vijf zeugen (nrs. l4, 40, 13, 30 en 85) werden niet gevaccineerd.
De zeugen werden via de diep-IM-route gevaccineerd met 1 dosis van 2 ml van het vaccin dat als MSD ref. 1 of het vaccin MSD ref. 2 wordt aan— geduid dat geïnactiveerd virus met een titer van 105’5 TCID50/dosis en werden 20 dagen later opnieuw gevaccineerd met een andere dosis met hetzelfde titer. Locale en algemene reacties werden waargenomen. Serologisch respons bij de dieren werd geverifieerd door middel van de IPMA-test in overeenstemming met het volgende programma: T0 : bloedafname en vaccinatie T20 : bloedafname en revaccinatie
Ti,2 : bloedafname T7g : bloedafname en experimentele infectie T8 : bloedafname na experimentele infectie T25 : bloedafname na experimentele infectie T50 : bloedafname na experimentele infectie
Experimentele infectie werd uitgevoerd in de veilige stallen van het onderzoekscentrum. Alle dieren werden geïnfecteerd met 5 ml PPRS-CY-218-JPD-P5-6-91 virulent virus met een titer van 105’5 TCID50/ml door middel van de IN route. Serologisch respons werd genoteerd, evenals het aantal biggen die levend en dood aan elke zeug werden geboren. Pre- en post-colostrum-bloedafname werd bij de biggen uitgevoerd en long- en hersen-monsters werden van de doodgeboren biggen en de gedode biggen genomen op verschillende dagen ter isolatie van het virus en voor histologische preparaten. De verkregen resultaten worden in tabellen 8-10 hieronder getoond.
a : niet zwanger : deze zeugen stierven vanwege uitzonderlijk hoge omgevings-temperatuur. Een keizersnede werd na 112 dagen zwangerschap uitgevoerd.
(A) : datum van infectie (dagen zwangerschap) (B) : het baren (dagen zwangerschap) (C) : totaal aantal biggen (keizersnede) (D) : totaal aantal biggen (geboren) (E) : biggen die met gewone gezondheid zijn geboren (F) : biggen die zwak zijn geboren (G) : biggen die levend zijn geboren met naar buiten gedraaide poten (H) : doodgeboren biggen (dood) (I) : doodgeboren biggen (gemummificeerd) (J) : biggen die binnen de eerste week dood waren.
Legenda: a) : Deze zeugen stierven vanwege uitzonderlijk hoge omgevings-tempera tuur. Na 112 dagen zwangerschap werd een keizersnede uitgevoerd.
1 : Getal dat aan elk dier werd toegewezen 2 : Biggen (het getal dat aan elke big is toegewezen komt overeen met de geboortevolgorde) 3 : Pre-colostrum serologie k : Post-colostrum serologie 5 : Isolatie van het virus NT : Niet getest : Negatief + : Positief H : Uren NP : Niet zwanger.
Het is duidelijk uit de resultaten die zijn verkregen dat er positieve seroconversie ontstaat tegen het causatieve virus van PRRS. Daarnaast vindt bevredigend gedrag tegen experimentele infectie plaats in vergelijking met de controledieren, waarbij sterfte bij de meerderheid van de foetussen werd geproduceerd. Dientengevolge kan worden bevestigd dat deze vaccinatie een werkzame maatregel is ter voorkoming van PRRS.
VOORBEELD 8
Werkzaamheid van het vaccin tegen experimentele infecties met een ander middel dat PRRS veroorzaakt (kruislingse bescherming)
Dit experiment werd ontwikkeld met het oog op verificatie van de werkzaamheid van het vaccin dat aangeduid is als MSD Ref. 1 in een experimentele infectietest onder toepassing van 2 pathogene stammen van het causatieve virus van PRRS. De toegepaste pathogene PRRS-stammen waren: i) Spaanse stam, PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91; en ii) Franse stam, SDRP II 8B, die door Dr. E. Albina van "Laboratoire Central de Recherches Avicole et Porcine", Ploefragan, Frankrijk werd verschaft.
Het gebruikte vaccin was het vaccin dat aangeduid is als MSD ref. 1 waarvan de formule in voorbeeld 5 is gegeven. Dertig zeugen die sero-negatief waren voor de causatieve virussen van PRRS werden toegepast in een reproductiecyclus die niet gelegen was tussen 10 dagen vóór of 10 dagen na kruising, noch 10 dagen vóór noch 10 dagen na het baren. Vier groepen dieren werden gevormd: A: 10 zeugen die via de IM-route waren gevaccineerd en opnieuw waren gevaccineerd en via de IN-route waren geïnfecteerd met Spaanse stam PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 van het virus B: 5 zeugen die niet aan enige vaccinatie waren onderworpen en via de IN-route met Spaanse stam PRRS-CY-JPD-P5-6-9I zijn geïnfecteerd C: 10 zeugen die gevaccineerd zijn en opnieuw zijn gevaccineerd via de IM-route en via de IM-route zijn geïnfecteerd met Franse stam SDRP II 8b D: 5 zeugen die niet aan enige vaccinatie waren onderworpen en via de IN-route met Franse stam SDRP II 8b zijn geïnfecteerd.
Uitgevoerd experiment
Twintig zeugen van de groep A en C die hierboven zijn genoemd werden met 1 dosis van 2 ml van het vaccin dat als MSD ref 1 is aangeduid via de diep-IM-route gevaccineerd en 21 dagen later opnieuw met dezelfde dosis vaccin gevaccineerd. Daarna werden tussen dagen 17 en 80 van de zwangerschap alle zeugen experimenteel geïnfecteerd met:
Groepen A en B: 5 ml virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-9I met een titer van 105'8 TCID50/ml via de IN-route; en
Groepen C en D: 5 ml virus SDRP II 8B met een titer van 105,8 TCID50/ml via de IN-route.
De geevalueerde parameters.
1. Serologisch respons door IPMA test bij: T0 : bloedafname en vaccinatie T21 : bloedafname en revaccinatie T;,! : bloedafname Tj : bloedafname en infectie T1+7: bloedafname 7 dagen na infectie 2. Evaluatie van rectale temperatuur, locale reactie en algemene reactie gedurende 4 dagen na vaccinatie en revaccinatie of tot de verhoging of klinische tekenen, indien aanwezig, verdwijnen.
3. Evaluatie van rectale temperatuur, voedselopname en klinische tekenen gedurende 6 dagen na experimentele infectie.
4. Detectie van antilichamen in serum en isolatie van virus in serum en in monocyten die uit heel bloed zijn geextraheerd.
5. Reproduktieparameters ten tijde van het baren zoals het aantal biggen die levend zijn geboren, het aantal biggen die dood zijn geboren of het aantal gemummificeerde biggen en het aantal biggen die levend maar zwak zijn geboren, die binnen de eerste week stierven.
6. Bepaling van de hoeveelheid virus dat in het serum aanwezig is door middel van titraties op macrofagen op basis van CPE.
7. Bepaling van virus in pleurale vloeistof en longen van de biggen.
De reproduktieparameterresultaten worden getoond in tabellen 11-12 (uitdaging met PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) en 13-14 (uitdaging met SDRP II 8B).
Tabel 11 (gevaccineerde zeugen)
Uitdaging met PRRS-CY-218-JPD-PS-6-Q1
TL = totaal # levende biggen: 68# (75 geboren / 51 die overleven) 68# bescherming wordt waargenomen bij vergelijking van de biggen die levend zijn geboren met de biggen die 7 dagen hebben overleefd. Het feit dat experimentele infectie veel krachtiger is dan natuurlijke infectie in het veld, naast de bovengenoemde resultaten doet vermoeden dat de vooruitzichten voor bescherming nog veel beter zijn.
Tabel 12 (niet gevaccineerde zeugen)
Uitdaging met PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91
TL = totaal # levende biggen: 9.5# (42 geboren / 4 die overleven)
De Spaanse stam die voor infectie is gebruikt heeft een extreem hoge pathogene kracht 00,5%) aangezien slechts 4 biggen van de 42 die geboren werden de eerste week overleefden.
Tabel 13 (gevaccineerde zeugen)
Uitdaging met SDRP II 8B
TL = totaal % levende biggen: 82% (105 geboren / 86 die overleven) ongeveer 82% bescherming wordt waargenomen.
Tabel 14 (niet gevaccineerde zeugen)
Uitdaging met SDRP II 8B
tl = totaal % levende biggen: 75.7# (66 geboren / 50 die overleven)
Ongeveer 2b,8% sterfte wordt waargenomen. De pathogeniciteit van de
Franse stam is zeer zwak (24,3#) in vergelijking met de resultaten die verkregen werden met de uitdaging met Spaanse stam (sterfte 90,5#)· De resultaten die zijn toegepast voor de evaluatie van de werkzaamheid bij het vergelijken van gevaccineerde en niet gevaccineerde zeugen zijn in het geval van de Franse stam niet zeer significant. De pathogeniciteit in de gevaccineerde dieren wordt echter wel tot 17.8# verlaagd.
Legenda voor Tabellen 11-14 a) : Een andere ziekte (niet PRRS) (de biggen worden niet gebruikt) b) : Ziek, stierf vóór infectie c) : Stierf vanwege een andere oorzaak (1) : Zeugreferentie (2) : Totaal aantal biggen (3) : Aantal gezonde biggen die geboren zijn (4) : Aantal zwakke biggen die geboren zijn (5) : Aantal levende biggen met naar buiten gedraaide poten (6) : Aantal doodgeboren biggen (7) : Aantal biggen die na de eerste week leefden
Claims (27)
1. Vaccin dat varkensreproduktie- en respiratie-syndroom (PRRS) kan voorkomen, met het kenmerk, dat het een geschikte hoeveelheid PRRS viraal antigeen of virus van de Spaanse stam dat geïnactiveerd is alsmede een geschikt adjuvans en eventueel een conserveermiddel omvat.
2. Vaccin volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het Spaanse stam PRRS-virus de stam is die aangeduid wordt met PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91» zoals gedeponeerd is bij het ECACC met toegangsnummer V93070108.
3. Vaccin volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het een hoeveelheid geïnactiveerd virus van tenminste 105,5 TCID50/dosis bevat.
4. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het virus gekweekt is in een kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong.
5. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies met het kenmerk, dat het virus gekweekt is op een co-kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong en ST-cel (ATCC CRL 1746 ST).
6. Vaccin volgens één van de conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het virus gekweekt is op ST-cel-(ATCC CRL 1746 ST-) kweek.
7. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het virus gekweekt is op hybride-cellen van alveolaire macrofagen van een varkenslong die zijn gefuseerd door middel van hybridisatie met ST-cellen.
8. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het virus gekweekt is op hybride-cellen van alveolaire macrofagen van een varkenslong met L-l4-cellijn (ECACC No. 91012317) of met cellijn Jag-1 zijn gefuseerd.
9. Vaccin volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het virus gekweekt is op ST-cellen of een andere varkenscellijn waarin de genen zijn opgenomen die voor de membraanreceptoren voor het PRRS-virus van alveolaire macrofagen coderen.
10. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het in staat is cellulaire immuniteit bij het gevaccineerde dier te induceren.
11. Vaccin volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het daarnaast celrespons versterkende stoffen (CRP) die het celimmuuneffect versterken zoals IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, celnecrosefactor en soortgelijke stoffen bevat.
12. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het ken merk, dat het adjuvans een adjuvans is dat celrespons kan moduleren en immunostimuleren zoals MDP, ISCOM of liposomen.
13. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het "return to service" van het gevaccineerde dier kan voorkomen.
14. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het adjuvans een olieachtig adjuvans is.
15. Vaccin volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het olieachtige adjuvans wordt gevormd door een mengsel van Marcol 52, Simulsol 5100 en Montanide 888.
16. Vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het een emulsie is van (i) een waterige antigene fase die het geïnactiveerde virus bevat en (ii) een olieachtige fase die het adjuvans bevat.
17. Vaccin volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de emulsie 53 vol.# waterige fase die geïnactiveerd virus bevat en 47 gew.# olieachtige fase die het adjuvans bevat, omvat.
18. Vaccin dat varkensreproduktie en respiratoir syndroom (PRRS) kan voorkomen met het kenmerk, dat het een emulsie is omvattende: a) 53% van een waterige fase die PRRS viraal antigeen in DMEM kweekme- dium, Spaanse stam die geïnactiveerd is in een minimum concentratie van 105,5 TCID50/dosis bevat en b) 47# van een olieachtige fase die een mengsel van Marcol 52, Simulsol 5IOO en Montanide 888 bevat.
19. Vaccin volgens één van de conclusies 1-13. met het kenmerk, dat het adjuvans een waterig adjuvans is.
20. Een bi- of multivalent vaccin dat in staat is varkensreproductie en respiratoir syndroom en één of meer andere varkensinfecties te voorkomen met het kenmerk, dat het een geschikte hoeveelheid PRRS viraal antigeen of virus van de Spaanse stam dat geïnactiveerd is eventueel inclusief bestanddelen volgens één van de voorgaande conclusies plus één of meer varkenspathogenen, omvat.
21. Vaccin volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het tenminste een varkenspathogeen uit de groep Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, varkensparvovirus, Leptospira, Escherichia colt, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, varkensrespiratiecoronavirus, Botavirus, of iets tegen de pathogenen die de ziekte van Aujeszky veroorzaken, zwijninfluenza of overdraagbare gastro-enteritis omvat.
22. Een werkwijze voor de bereiding van een vaccin volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat deze werkwijze de volgende stappen omvat: 1. het kweken van het causatieve virus van PRRS, Spaanse stam in een geschikt celsysteem, 2. het verzamelen van het virus uit het celsysteem na bereiken van een minimale titer van 105,5 TCID50/ml, 3. inactivatie van het virus door middel van fysische of chemische werkwijzen en 4. het mengen van het geïnactiveerde virus met het adjuvans en het conserveermiddel.
23· Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat het virus is gekweekt op i) kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong of op ii) een co-kweek van alveolaire macrofagen van een varkenslong en ST-cellen (ATCC CRL 1746 ST) of op iii) ST-celkweek (ATCC CRL 1746 ST), of op iv) hybridecellen van alveolaire macrofagen van een varkenslong gefuseerd met ST-cellen of op v) hybridecellen van alveolaire macrofagen van een varkenslong die met L-l4-cellijn (ECACC no. 91012317) of met cellijn Jag-1 zijn gefuseerd of op vi) ST-cellen of enige andere varkenscellijn waarin genen zijn opgenomen die voor membraanreceptoren tegen het PRRS-virus van alveolaire macrofagen van de varkenslong coderen.
24. DNA-sequentie die in hoofdzaak overeenkomt met een DNA-sequen-tie van een ORF van figuur 1 tot 5 of codeert voor een produkt met de activiteit van het produkt van het ORF.
25. Virus dat PRRS, Spaanse stam veroorzaakt waarvan de kenmerken in hoofdzaak overeenkomen met die van het virus aangeduid als PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 dat bij ECACC met toegangsnummer V93070108 is gedeponeerd .
26. Virus volgens conclusie 25 dat geïnactiveerd is en in staat is gebruikt te worden bij formulering van vaccins voor het voorkomen van varkensreproduktie- en -respiratiesyndroom.
27. Virus volgens conclusie 24 dat geïnactiveerd is en in staat is gebruikt te worden bij de formulering van bi- of multivalente vaccins die bruikbaar zijn bij het voorkomen van varkensreproduktie- en -respiratiesyndroom in combinatie met andere varkensinfecties.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES9301973 | 1993-09-17 | ||
| ES9301973A ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1993-09-17 | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9401414A true NL9401414A (nl) | 1995-04-18 |
| NL194940B NL194940B (nl) | 2003-04-01 |
| NL194940C NL194940C (nl) | 2003-08-04 |
Family
ID=8283072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9401414A NL194940C (nl) | 1993-09-17 | 1994-08-31 | Virusstam en vaccin ter voorkoming van varkensreproductie- en -respiratiesyndroom. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4432338C2 (nl) |
| DK (1) | DK173128B1 (nl) |
| ES (1) | ES2074950B1 (nl) |
| FR (1) | FR2709966B1 (nl) |
| GB (1) | GB2282811B (nl) |
| IT (1) | IT1267448B1 (nl) |
| NL (1) | NL194940C (nl) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2103460C (en) | 1991-06-06 | 2000-09-26 | Gert Wensvoort | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| US6042830A (en) * | 1992-08-05 | 2000-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Viral agent associated with mystery swine disease |
| US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6251397B1 (en) | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
| US6380376B1 (en) | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| GB2289279B (en) * | 1994-05-13 | 1998-09-16 | Iberica Cyanamid | Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins |
| ES2078187B1 (es) * | 1994-05-13 | 1996-07-16 | Cynamid Iberica S A | Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes. |
| US5866401A (en) * | 1996-03-01 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
| PL328627A1 (en) * | 1996-03-01 | 1999-02-15 | Schering Corp | Vaccine against the syndrome of reproductive and respiratory disorders among swine |
| EP0839912A1 (en) | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| ATE365746T1 (de) | 1997-05-06 | 2007-07-15 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Prrsv-antigene, die auf peptidsequenzen des prrs- virus basieren, für die verwendung als impfstoff und für diagnostische tests |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| NZ513289A (en) | 1998-12-22 | 2003-04-29 | Pfizer Prod Inc | Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| CA2366072C (en) | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
| ES2348159T3 (es) | 1999-04-22 | 2010-11-30 | United States Department Of Agriculture | Vacuna contra el sindrome respiratorio y reproductivo porcino basada en el aislado ja-142. |
| RU2007101725A (ru) | 2004-06-18 | 2008-07-27 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота (Us) | Идентификация инфицированных вирусом и вакцинированных вирусом организмов |
| US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| EP2460818A3 (en) | 2004-12-30 | 2013-01-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| CA2894069C (en) | 2005-06-24 | 2019-02-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use |
| EP2275132B1 (en) | 2005-12-29 | 2021-03-03 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Multivalent PCV2 immunogenic compositions and methods of producing them |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| EP2558118B1 (en) * | 2010-04-16 | 2019-06-05 | Universiteit Gent | Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
| EA038012B1 (ru) | 2011-02-17 | 2021-06-23 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх | Композиция на основе нового штамма prrsv или его белков, продукт, их применение, вирус prrsv, выделенная нк и рекомбинантный вектор экспрессии для получения этого вируса |
| SG192821A1 (en) | 2011-02-17 | 2013-09-30 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Commercial scale process for production of prrsv |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| EP2737058A1 (en) | 2011-07-29 | 2014-06-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF |
| UA114503C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae |
| US9120859B2 (en) | 2012-04-04 | 2015-09-01 | Zoetis Services Llc | Mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| UA114504C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
| US9579373B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
| JP6886291B2 (ja) | 2013-12-20 | 2021-06-16 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ | ＰＲＲＳウイルス変異株、ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスｃＤＮＡクローンおよびそれらの使用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992021375A1 (en) * | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| WO1993007898A1 (en) * | 1991-10-14 | 1993-04-29 | Akzo Nobel N.V. | Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic |
| WO1993014196A1 (fr) * | 1992-01-14 | 1993-07-22 | Rhone Merieux S.A. | Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE197314T1 (de) * | 1993-02-08 | 2000-11-15 | Bayer Ag | Verfahren zum vermehren des das reproduktions- und atemwegs-syndrom verursachenden schweinevirus und dessen verwendung als impfstoff. |
-
1993
- 1993-09-17 ES ES9301973A patent/ES2074950B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-08-31 NL NL9401414A patent/NL194940C/nl not_active IP Right Cessation
- 1994-09-06 DK DK199401028A patent/DK173128B1/da not_active IP Right Cessation
- 1994-09-07 FR FR9410722A patent/FR2709966B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-09 IT ITTO940713 patent/IT1267448B1/it active IP Right Grant
- 1994-09-10 DE DE19944432338 patent/DE4432338C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-16 GB GB9418775A patent/GB2282811B/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992021375A1 (en) * | 1991-06-06 | 1992-12-10 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| WO1993007898A1 (en) * | 1991-10-14 | 1993-04-29 | Akzo Nobel N.V. | Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic |
| WO1993014196A1 (fr) * | 1992-01-14 | 1993-07-22 | Rhone Merieux S.A. | Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "CYANAMID REPORTS ON ISOLATION OF PRRS VIRUS.", ANIMAL PHARM, no. 238, 25 October 1991 (1991-10-25), pages 20, XP002006440 * |
| J. PLANA ET AL.: "PORCINE EPIDEMIC ABORTION AND RESPIRATORY SYNDROME (MYSTERY SWINE DISEASE). ISOLATION IN SPAIN OF THE CAUSATIVE AGENT AND EXPERIMENTAL REPRODUCTION OF THE DISEASE.", VETERINARY MICROBIOLOGY, vol. 33, no. 1-4, 1992, AMSTERDAM, NL, pages 203 - 211, XP000572731 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4432338C2 (de) | 1997-10-30 |
| FR2709966B1 (fr) | 1997-05-23 |
| ES2074950A1 (es) | 1995-09-16 |
| DE4432338A1 (de) | 1995-05-04 |
| GB2282811A (en) | 1995-04-19 |
| ITTO940713A1 (it) | 1996-03-09 |
| ES2074950B1 (es) | 1996-03-16 |
| IT1267448B1 (it) | 1997-02-05 |
| NL194940B (nl) | 2003-04-01 |
| ITTO940713A0 (it) | 1994-09-09 |
| DK102894A (da) | 1995-03-18 |
| GB9418775D0 (en) | 1994-11-02 |
| GB2282811B (en) | 1998-02-18 |
| DK173128B1 (da) | 2000-01-31 |
| FR2709966A1 (fr) | 1995-03-24 |
| NL194940C (nl) | 2003-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL194940C (nl) | Virusstam en vaccin ter voorkoming van varkensreproductie- en -respiratiesyndroom. | |
| AU703084B2 (en) | Low pathogenicity prrs live virus vaccines and methods of preparation thereof | |
| ES2353952T3 (es) | Ácidos nucleicos que codifican para vacunas contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv). | |
| Cook et al. | Preliminary antigenic characterization of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado, USA | |
| ES2349041T3 (es) | Derivados de hidantoina para el tratamiento de trastornos inflamatorios. | |
| US8277814B2 (en) | Avian Astrovirus | |
| PT835930E (pt) | Estirpes europeias de vacina do virus do sindroma reprodutivo e respiratorio porcino (prrsv) | |
| JPH09500544A (ja) | 組換えｐｒｒｓｖタンパク、該組換えｐｒｒｓｖタンパクを含有する診断キットおよびワクチン | |
| TW201300538A (zh) | 新穎歐洲型ｐｒｒｓｖ株 | |
| WO2008110056A1 (fr) | Vaccin contre le syndrome dysgénésique reproductif et respiratoire porcin, son procédé de préparation et son utilisation | |
| CN106554944A (zh) | 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用 | |
| CN109922825A (zh) | 抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法 | |
| IE63006B1 (en) | "Canine coronavirus vaccine" | |
| RU2403063C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота | |
| RU2403061C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота | |
| CN111686246B (zh) | 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 | |
| MXPA04009050A (es) | Celulas de pulmon de rata del algodon para cultivo de virus. | |
| EP1035205A1 (en) | Non-spreading pestivirus | |
| RU2395299C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и лептоспироза крупного рогатого скота | |
| RU2269361C2 (ru) | Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней | |
| RU2825899C1 (ru) | Вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней живая культуральная сухая и способ изготовления вакцины | |
| RU2817873C2 (ru) | Схема вакцинации "прайм-буст" | |
| RU2796988C1 (ru) | Штамм "Рич" вируса коронавирусного энтерита собак для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак | |
| RU2395297C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота | |
| RU2806164C1 (ru) | Ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции собак |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1A | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BI | The patent application has been withdrawn | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20140831 |