DE4432338A1

DE4432338A1 - Impfstoff zur Verhinderung des reproduktiven und respiratorischen Syndroms bei Schweinen

Info

Publication number: DE4432338A1
Application number: DE19944432338
Authority: DE
Inventors: Duran Juan Plana
Original assignee: Cyanamid Iberica SA
Current assignee: Wyeth Farma SA
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-10
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2014-09-11
Also published as: GB2282811A; DE4432338C2; ES2074950B1; GB9418775D0; ITTO940713A0; IT1267448B1; GB2282811B; NL9401414A; DK173128B1; ES2074950A1; FR2709966B1; NL194940B; FR2709966A1; ITTO940713A1; NL194940C; DK102894A

Description

Umfang der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff, der geeignet ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen zu verhindern, insbesondere auf einen inaktivierten Impfstoff, der das kausative Virus der genannten Krankheit in inaktivierter Form enthält.

Historie der Erfindung

Die als reproduktives und respiratorisches Syndrom bei Schweinen (PRRS) bekannte Krankheit beein trächtige Mutterschweine, bei welchen sie Appetitlosig keit, Fehl-, Früh- bzw. Mißgeburten, Totgeburten, mumifizierte Föten, schwächliche Ferkel, die nach weni gen Stunden oder Tagen eingehen, respiratorische Nach ferkelungsprobleme und Züchtungsprobleme (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling picklets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 06. Oktober 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA). Einige Fälle sind be schrieben worden, bei denen infizierte Mutterschweine blaue Flecken an den Ohren aufweisen; aus diesem Grund wurde die Krankheit auch als "Blue abortion" ("Blaue Abortion") oder "Blue-eared pig disease" ("Blauohr- Schweinekrankheit") bekannt, (Veterinary Record. Vol. 130, No. 3, 18. Januar 1992). Andere Namen, die der Krankheit gegeben wurden, sind: "Mystery Pig Disease" (MPD), "Mystery Swine Disease" (MSD), "Mysterious Reproductive Syndrome (MRS), "Swine Infertility and Respiratory Syndrome" (SIARS), oder "Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" (PEARS).

Das erste epizootische Ausbrechen dieser Krankheit trat 1987 in den Vereinigten Staaten von Amerika und in Kanada auf. In Europa wurde der erste Ausbruch 1990 in Deutschland festgestellt, von wo sie sich Ende 1990 und Anfang 1991 nach den Niederlanden und Belgien ausbrei tete. In Spanien wurden die ersten Fälle der Krankheit Mitte Januar 1991 festgestellt, als wesentliche respi ratorische Veränderungen bei einer aus Deutschland im portierten Partie von 300 Ferkeln festgestellt wurden, (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, No. 11, 1991). Kurz danach trat bei zwei Zuchtherden, die sich 500 Meter von der Herde befanden, wo das anfängliche Problem auf getreten war, eine Krankheit auf, die durch eine abnor mal hohe Zahl von Abortionen in der letzten Phase der Trächtigkeit sowie 70% Sterblichkeit bei den Ferkeln gekennzeichnet war. Wenn man die beobachteten klini schen Anzeichen analysiert und berücksichtigt daß (i) diese Herden einem intensiven Impfungsprogramm gegen Schweine-Parvovirose, Aujeszkysche Krankheit und Schweine-Influenza unterzogen wurden, und daß (ii) Laborversuche das Vorhandensein anderer abortiver Krankheiten ausgeschlossen hatten, wurde das klinische Vorhandensein von PRRS vermutet. In Proben von diesen Farmen her wurde der Erreger der Krankheit isoliert, wie nachfolgend im einzelnen beschrieben wird.

Eine Anzahl Erreger wurde mit diesem infektiösen Prozeß in Korrelation gebracht, und zwar sind darunter: das Encephalomyocarditis-Virus, Schweine-Influenza, klassi sches Schweinefieber, afrikanisches Schweinefieber, Mu kosalkrankheit, Aujeszkysche-Krankheit, Brucellose, Leptospirose, Q-Fieber, Parvovirose und chlamydiale Krankheit, obwohl einige Autoren sie auch mit Myco toxinen in Verbindung gebracht haben. (Loula, T., "Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets", Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra, Mengeling, W. L. und Lager, K. M., "Mystery Pig Disease: Evidence and considerations for its etiology", in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Dea et al., "Virus isolation from farms in Quebec experiencing severe outbreaks of respiratory and reproductive problems" Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Van Alstine, W., "Past diagnostic approaches and findings and potential useful diagnostic strategies", in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, supra; Loula, T., Agri-Practice, 12(1) 23-33, 1991; Woolen, N. et al., J. Am. Vet. Assoc. 197: 600-601, 1990).

Die PCT-Patentanmeldung, unter der Veröffentlichungs nummer WO 92/21375 veröffentlicht, im Namen des Stitching Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI), beschreibt die Isolierung eines Virus, mit "Lelystad Agent" (LA) oder "Lelystad Virus" (LV) bezeichnet, das durch sie als der Erreger der Krankheit, zu jener Zeit als MSD bezeichnet, identifiziert wird. Das LV, iso liert, bringt, wenn es intranasal in trächtige Mutter schweine eingeimpft wird, Appetitlosigkeit und sogar Verweigerung der Nahrungsaufnahme während der Tage 4 bis 10-12 nach Impfung, reproduktive Störungen und eine blaue Färbung an den Ohren einiger der infizierten Mutterschweine in den Tagen 9-10 nach der Impfung mit sich. Jedoch ist auch beobachtet worden, daß bei 2 der 8 experimentell infizierten Mutterschweine sich die Krankheit nicht reproduziert, (siehe Tabelle 6 der ge nannten PCT-Anmeldung), zumal bei einem der Mutter schweine die Zahl der Ferkel, die lebend geboren wurden und die erste Woche überlebten, groß ist, (6 von 9, Mutterschwein 1305), und ein anderes Mutterschwein zwei totgeborene Ferkel hatte, während die anderen 9 die erste Woche überlebten (Mutterschwein 1065). Das durch CDI isolierte LV-Virus gehört zu dem Arteriviridae- Genus, hat ein Genom, das aus einem polyadenylierten RNA-Molekül besteht, 14,5 bis 15,5 kb lang, (in neu tralem Agarose-Gel ermittelt), das mittels eines Satzes subgenomischer RNAs an Ende 3′ repliziert. Die oben aufgeführte PCT-Anmeldung zeigt die LV-Genom-Nukleo tid-Sequenz, die 8 möglichen "Open Reading Frames" (ORF) (Offene Ableserahmen), die Aminosäuresequenz, von den identifizierten ORFs abgeleitet, und die mutmaßli chen Stellen von N-Glykosilation. Später sind andere Viren, Erreger von PRRS, auf deutschen, französischen und spanischen landwirtschaftlichen Betrieben isoliert worden. Das Virus, das in Tübingen, Deutschland, isoliert wurde, (TV), [(Virology, 193, 329-339, (1993)], stellt 99,3% Homologie mit LV auf der Neuklotid-Ebene (Nukleotid-Ebene) dar, in ORFs 2 bis 7 enthalten, (es sind 24 verschiedene Basispaare (bp) aus einer Gesamtheit von 3316 bp vorhanden, in jener Region eingeschlossen). Die abgeleitete TV-Aminosäuresequenz stellt 99,2% Homologie mit LV dar, (es gibt nur 10 verschiedene Aminosäuren in den abgeleiteten Amino säuresequenzen, codiert durch die ORFs 2 bis 5, zumal keine Unterschiede bei den von den ORFs 6 und 7 abge leiteten Sequenzen vorhanden sind).

Andererseits ist die zwischen LV und TV festgestellte Homologie gegenüber dem in unserem Labor isolierten Vi rus (Spanish strain/Spanische Abstammung oder SV) ge ringer. Bislang sind nur die Nukleotid- und Amino säuresequenzen entsprechend den ORFs 3 bis 7 verglichen worden, mit den folgenden Resultaten:

1. Es gibt 95,5% Homologie auf Nukleotid-Ebene von SV vor LV oder TV, (aus einer Gesamtheit von 2599 bp sind 144 vorhanden, die verschieden sind); und
2. Es gibt 94,9% Homologie auf Aminosäure-Ebene von SV vor LV oder TV, (aus einer Gesamtheit von 955 Aminosäuren wurde eine Gesamtheit von 47 Amino säuren als unterschiedlich festgestellt).

Diese Aminosäurevariationen können in Relation gesetzt werden zu der höheren Pathogenizität einer Abstammung im Vergleich miteinander, aus dem Grund, daß der in unseren Labors isolierte Virus (Spanische Abstammung) pathogener ist als andere bekannte PRRS-Viren. Zum Bei spiel, bei dem in Frankreich isolierten Virus (French strain/Französische Abstammung), wie in Beispiel 8 dieser Beschreibung dargestellt, kann bewiesen werden, daß der Prozentsatz von Ferkeln, die von einem Mutter schwein lebend geboren wurden, das mit der Französi schen Abstammung infiziert wurde, bei 75% liegt wäh rend der Prozentsatz bei 9,5% liegt wenn Mutter schweine mit dem Spanischen Abstammung infiziert wer den, (Tabellen 12 und 14). Der Prozentsatz beträgt 61%, wenn die Mutterschweine mit LV infiziert werden, (Tabelle 6 der PCT-Anmeldung No. WO 92/21375), da 58 Ferkel lebend geboren wurden, aus einer Gesamtheit von 95 Ferkeln.

Die Krankheit verursacht hohe Verluste bei der Schwei nezucht, da sie bei akuten Ausbrüchen eine Sterblich keit von 70% der Ferkel bei einem Wurf mit sich brin gen kann. Ein Mittel, das Problem, das auftritt, zu lösen, wäre, ein geeignetes Impfungsprogramm durchzu führen, das die Prävention des Auftretens der Krankheit ermöglichen würde. Zu diesem Zweck würden Impfstoffe benötigt, die geeignet sind, eine effektive Prävention von PRRS zustande zu bringen.

Die unter der No. WO 93/06211 veröffentlichte PCT-Pa tentanmeldung, im Namen von J. E. Collins und D. A. Benfield, bezieht sich auf einen Impfstoff gegen MSD, der ein infektiöses Agens enthält, das aus den Lungen von mit MSD infizierten Schweinen isoliert wurde. Jedoch beschreibt die genannte PCT-Anmeldung nicht die Charakterisierung oder Identifikation des infektiösen Agens noch wurde es bei irgendeiner autorisierten De ponierungsinstitution deponiert. Durch all dies schließt die Realisierung der aus jener PCT-Anmeldung abgeleiteten Kenntnisse schwerwiegende Reproduzierbar keitsprobleme in sich, weil das in der PCT-Anmeldung beschriebene Produkt nicht verifiziert werden kann und die erhaltenen Ergebnisse auch nicht mit jenen vergli chen werden können, welche durch die Antragsteller der PCT erreicht wurden. Auch sind in dieser PCT-Anmeldung weder das Antigen noch das Adjuvans, das bei der For mulierung des Impfstoffes verwendet wurde, deutlich zum Ausdruck gebracht, die, wie später verifiziert wird, eine sehr wesentliche Rolle spielen, noch sind Beispie le beschrieben, welche die Wirksamkeit und Effizienz der genannten Impfstoffe demonstrieren.

Die PCT-Anmeldung, unter No. WO 93/07898 veröffent licht, bezieht sich unter anderem auf die Identifizie rung des Agens, das für PRRS ursächlich ist, und auf von diesem abgeleitete Impfstoffe. Das isolierte Virus hat Charakteristiken ähnlich dem LV, ist aber, im Ge gensatz zu dem in unserem Labor isolierten Virus, nicht fähig, auf ST-Zellen (Schweinetestikelzellen) auf fest stellbares Niveau zu wachsen. Anscheinend war der Impf stoff wirksam, aber das Ausmaß des Schutzes war nur bei etwa 52% der geimpften Tiere effektiv, was als ein relativ geringes Ausmaß an Schutz angesehen werden kann, insbesondere, wenn man den hohen viralen Titer berücksichtigt der bei der Impfdosis verwendet wird.

Außerdem liefert diese PCT-Anmeldung keinerlei Infor mation über die Organisation des Virusgenoms noch über die Proteine, codiert; aus diesem Grund kann der Vergleich zwischen diesem Virus und dem in unseren Labors erhaltenen Viren nicht durchgeführt werden und könnte nur durchgeführt werden mit unverhältnismäßig hohen Forschungsanstrengungen.

Daher dauert der Bedarf an Impfstoffen, die geeignet sind, PRRS zu verhindern, an. Um dieses Problem zu lö sen, sieht diese Erfindung einen Impfstoff vor, der ge eignet ist, Mutterschweine gegen die infektiöse Krank heit wirkungsvoll zu schützen. Die antigenische Phase dieses Impfstoffes setzt sich aus einem inaktivierten spanischen Isolat zusammen. Die Erfindung sieht auch Kombinationen des isolierten PRRS-Viralantigens (Spa nische Abstammung) vor, zusammen mit verschiedenen Schweinepathogenen, mit dem Zweck, bi- oder multivalen te Impfstoffe vorzusehen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 bis 5 zeigen die cDNA-Sequenzen entspre chend den ORFs 3 bis 7 des PRRS-Virus (Spanische Abstammung) sowie die von Aminosäuren, codiert, durch jedes ORF abgeleitete Sequenz.

Die Fig. 6 bis 10 zeigen die Homologie und vorhan dene Unterschiede zwischen dem LV und dem in unseren Labors isolierten Virus, auf der Ebene der Aminosäure sequenzen, von den ORFs 3 bis 7 abgeleitet. Die Amino säuren sind gemäß einem Ein-Buchstaben-Code zum Aus druck gebracht. Die obere Zeile, alle 2 Zeilen, entspricht der LV-Aminosäuresequenz, während die unter Zeile dem in unseren Labors isolierten Virus (Spanische Abstammung) entspricht. Die homologen Aminosäuren sind durch zwei vertikale Linien dargestellt, während, wenn sie als Substitutionen einiger Aminosäuren durch andere vorhanden sind, sie durch zwei vertikale Striche im Falle von konservativen Substitutionen dargestellt sind, das heißt die Substitution einer Aminosäure durch eine andere, die funktional äquivalent ist. Das Nichtvorhandensein vertikaler Linien und Striche zwi schen zwei Aminosäuren stellt das Vorhandensein nicht- konservativer Substitutionen dar. Detaillierte Beschreibung der Erfindung.

1. Beispiele 1.1 Für die Isolation des Virus ausgewählte Tiere

Mumifizierte Föten, totgeborene Ferkel und lebende, aber schwächliche Ferkel mit einem Alter von 1 bis 10 Tagen, die Nachkommenschaft von Feld-Mutterschweinen mit klinischen Problemen infolge PRRS, wurden aus gewählt.

1.2 Vorbereitung der Proben

Lungen-, Milz-, Leber-, Nieren-, Hirn- und Herzproben von den Ferkeln wurden durch Nekropsie entnommen. In einem besonderen Fall wurden Proben präpariert aus der Lunge eines totgeborenen Ferkels, durch ein Mutter schwein geboren, das vermutlich durch PRRS beeinträch tigt war. Mit dieser Lunge wurde ein Homogenat präpa riert mit DMEM (GIBCO), (10 g Lunge in 90 ml DMEM), durch eine Lösung Antibiotika (PEG) ergänzt, in der Zu sammensetzung 1000 IU/ml Penicillin, 1 mg/ml Strepto myzin und 0,5 mg/ml Gentamicin. Die resultierende Sus pension wurde 1 Stunde bei 4°C stehen gelassen, gefro ren und zweimal aufgetaut, zentrifugiert, und der er haltene Überstand wurde bei -70°C gelagert, um bei der Infektion alveolärer Makrophagen der Lunge eines Schweins verwendet zu werden. In einem anderen Fall wurden Lungenproben von einem lebend geborenen Ferkel, das aber wenige Stunden nach der Geburt einging, durch einen ähnlichen Prozeß präpariert.

Darüber hinaus wurde den Tieren Blut entnommen durch Punktieren der Vena Cava, um (i) Blutplasma, das bei -70°C gelagert wurde und zur Virusisolation verwendet wurde, und (ii) Serum, das verwendet wurde, um Antikör pertitrierung durchzuführen, zu erhalten.

2. Alveoläre Makrophagen der Lunge eines Schweins 2.1 Erlangung

Schweine, die seronegativ waren gegenüber der Aujeszky schen Krankheit, Schweine-Parvovirose, Maul- und Klau enseuche, klassisches Schweinefieber, Schweine-In fluenza (Typen H1N1 und H3N2) und ansteckender Ga stroenteritis wurden verwendet. Das Alter der Schweine, die verwendet wurden, war zwischen 7 und 8 Wochen. Die Tiere wurden mit Phenobarbitalnatrium anästhesiert, vor der Extraktion der Lungen, was dadurch vorgenommen wurde, daß zuerst die Trachea unterhalb der Epiglottis abgebunden wurde, und durch Inzidieren oberhalb der Ab bindungsschnur. Sobald die Lunge extrahiert war, wurde sie mit physiologischer Salzlösung extern gewaschen, und dann wurde PBS- und PEG-Lösung aus Antibiotika mit tels sukzessiver Wäschen eingebracht. Die aus diesen Wäschen erhaltenen Zellen wurden 10 Minuten lang mit 300 g einer Zentrifugierung unterworfen und in DMEMs- Medium [(DMEM-Medium, mit nichtessentiellen Aminosäuren (GIBCO) ergänzt, 1% Natriumpyruvat 1 mG und 1% Glutamin 2 mM)], 10% fötales Kalbsserum (FCS) und PEG-Lösung aus Antibiotika bei 1‰ resuspendiert. Die Zellenzählung wurde in Newbauer-Kammern durch geführt.

2.2 Sterilitätskontrolle

Es wurde mittels geeigneter Tests verifiziert, daß die alveolären Makrophagen der Schweinelunge frei sind von Verseuchung durch Bakterien, Fungi und andere Viren. Ebenso wurde der gute Allgemeinzustand der Zellen verifiziert durch optische Mikroskopie.

Das Nichtvorhandensein einer Verseuchung durch Myko plasmen wurde ebenfalls verifiziert durch zytochemische Feststellung mit DAPI (4.6-Diamidin-2-phenyl-indol), das selektiv an DNA bindet und DNA-DAPI-Komplexe hoher Fluoreszenz und hoher Spezifizität bildet.

3. Isolierung des Virus 3.1 Isolierung des Virus und virales Wachstum auf alveolären Makrophagen von Schweinelungen

Ein Nährboden aus alveolären Makrophagen der Schweine lunge, zuvor präpariert in DMEMs-Medium und FCS bei 10%, wurde mit einem Homogenat einer Probe infiziert, die vermutlich den Erreger von PRRS enthielt. Die Probe setzte sich zusammen, in dem einen Fall, aus einem Lun genisolat von einem totgeborenen Ferkel her, das von einem Mutterschwein geboren wurde, das klinische Anzei chen von PRRS aufwies, während in anderen Fällen ein Lungenisolat aus einem Ferkel verwendet wurde, das le bend geboren wurde, das aber nach wenigen Stunden ein gegangen war, Nachkommenschaft eines Mutterschweins mit PRRS-Symptomen, sowie ein Isolat aus Blutplasma. Das Homogenat wurde 1 Stunde lang bei 37°C mit dem Makro phagenährboden in Kontakt gehalten. Danach wurde das Inoculum entfernt, und frische DMEMs mit 2% FCS und 1‰ PEG-Lösung wurden zugegeben, wobei der Nährboden mit CO₂ gepuffert wurde und man ihn einige Tage lang bei 37°C inkubieren ließ, in denen die zytopathische Wirkung (CPE), die durch das Virus an den Makrophagen hervorgerufen wurde, unter dem Mikroskop beobachtet wurde: an 3-4 Tagen nach Infektion (dpi) war CPE 70-80%, (Riesenzellen und deformierte Zellen traten auf). Die Kulturen wurden bei -80°C eingefroren.

Gleichzeitig wurde ein alveolärer Makrophagenährboden einer Schweinelunge, frei von PRRS, präpariert, um als negative Kontrolle verwendet zu werden.

Tochterkulturen wurden präpariert mit dem isolierten Virus, und es wurde festgestellt, daß 100% CPE von dem zweiten dpi her vorhanden war. Das Virus wurde bei -80°C eingefroren, für seine spätere Identifizierung und Charakterisierung.

Ähnlich wurde das Virus aus Blutplasma und anderen Pro ben aus totgeborenen Ferkeln oder lebenden, aber schwächlichen Ferkeln, die von experimentell infizier ten Mutterschweinen geboren wurden, isoliert.

Eines der isolierten Viren, insbesondere das mit PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 bezeichnete Virus, wurde aus der Lunge eines totgeborenen Ferkels isoliert. Es ist fähig, die Krankheit experimentell zu reproduzieren, hat die in Abschnitt 4 erwähnten Charakteristiken und wurde in der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury. (United Kingdom/Vereinig tes Königreich/), am 01. Juli 1993 mit der Zugangs-No. V93070108 deponiert.

3.2 Virales Wachstum in anderen Zellsystemen

Infektionen mit dem isolierten Virus (Spanische Abstam mung) sind in alveolärer Makrophage von Schweinelungen und ST-Zell-[Schweinetestikel kontinuierliche Zell-Li nie) ATCC CRL 1745 ST]-Kokulturen durchgeführt worden als erster Schritt für das Adaptieren des Virus an ST-Zellen. Nach verschiedenen serienmäßigen Durchgängen (5-6) auf den ST-Zell- und Makrophage-Kokulturen und Kulturen von ST allein waren die virusinfektiösen Titer in der Größenordnung 10⁶ TCID₅₀/ml, wenn Makrophage-ST- Zell-Kokulturen infiziert wurden, und in der Größenord nung 10^4.5 TGID₅₀/ml für das Virus, in ST-Zellen allein erhalten. (TCID₅₀, Gewebekultur infektiöse Dosis 50%].

Darüber hinaus können alveolare Makrophagen der Schwei nelunge auch dadurch immortalisiert werden, daß sie mit ST-Zellen mittels Hybridisierung verschmolzen werden.

Alternativ können alveoläre Makrophagen der Schwei nelunge dadurch immortalisiert werden, daß sie mit der L-14-Zell-Linie (periphere Blut-B-Zellen von Schweinen) ECACC No. 91012317, oder mit der Zell-Linie Jag-1 (Trophoblast-Zell-Linie von Schweinen), durch Dr. Jag Ramsoondar geliefert, verschmolzen werden [ ].

Die Verschmelzungsprozeduren werden gemäß herkömmlichen Techniken, die auf diesem Gebiet üblich sind, durch geführt.

Alternativ kann man Viren auf ST-Zellen oder auf irgendeinem anderen Zell-Linie von Schweinen wachsen lassen, in welche die Gene eingeführt worden sind, die für alveoläre Makrophagen-Membranrezeptoren der Schwei nelunge für das PRRS-Virus codiert sind.

Die mit diesen Zellsystemen produzierten Viren sind suszeptibel, bei der Formulierung lebender wie auch in aktivierter Vakzinen verwendet zu werden.

4. Identifizierung und Charakterisierung des Virus 4.1 Bezeichnung und Deponierung des Virus

Das aus der Lunge eines totgeborenen Ferkels isolierte Virus, mit der Bezeichnung PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, wurde am 01. Juli 1993 mit der Zugangs-No. V93070108 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, (United Kingdom/Vereinigtes König reich/), deponiert. In der vorliegenden Beschreibung wird das Virus gelegentlich ohne genaue Bezeichnung als "Spanish virus" (SV) oder "Spanish strain" (übersetzt etwa: Spanisches Virus (SV) oder Spanische Abstammung) beschrieben.

4.2 Charakteristiken des isolierten Virus

Dieses Virus (PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) weist die fol genden Charakteristiken auf:

a) die Entstehung einer leichten CPE auf einer kon tinuierlichen ST-Zell-Linie (ATCC CRL 1746 ST) (fötale Schweinetestikel) mit einem durchschnitt lichen Titer von 10^4.5 TCID₅₀/ml und auf alveolären Makrophagen der Schweinelunge mit durchschnitt lichen Titern von 10^5.5 TCID₅₀/ml;
b) wenn es alveoläre Makrophagen der Schweinelunge und ST-Zellen-Kokulturen infiziert, erhält man durch schnittliche Titer von 10^6.3 TCID₅₀/ml, [diese Titer repräsentieren eine Logarithmuseinheit (1 log₁₀) höher als wenn nur alveoläre Makrophagen der Schweinelunge infiziert werden];
c) zytoplasmische Replikation;
d) Entstehung zytoplasmischer Vakuolenbildung;
e) Lipidhülle;
f) 40-50 nm Größe
g) keine Hämadsorption oder Hämagglutination beobach tet bei Hühnchen/Hähnchen, Meerschweinchen, bei Schwein oder Mensch, rote Blutkörperchen, Gruppe 0;
h) Verlust der Infektivität bei Säure pH (pH 5);
i) Entstehung mikroskopischer (interstitielle Pneu monie) und makroskopischer krankhafter Veränderun gen bei 2 Monate alten Ferkeln;
j) Entstehung nachteiliger reproduktiver Wirkungen bei trächtigen Mutterschweinen mit Totgeburten, mumifi zierten Föten und lebenden, aber schwächlichen Ferkeln;
k) Wechselreaktion mit Lelystad-Bezugsserum (IPMA = Immuno peroxidase monolayer assay) (übersetzt etwa: Immunoperoxidasemonomolekularschichtananlyse);
l) Wechselreaktion mit Sera von Tieren mit klinischen Feldinfektionen (IPMA);
m) Serum von Mutterschweinen, mit diesem Virus infi ziert, wechselreagiert mit LV;
n) RNA Polyadeniliertes Genom von ungefähr 15 000 bp Länge (neutrales Agarose-Gel);
o) Replikation mittels eines Subgenomischen RNA-Satzes, an Ende 3′ vorhanden;
p) Nukleotidsequenz mit 8 ORFs;
q) in gereinigter Suspension, einer Elektrophorese in Polyacrilamid-Gel unterworfen und späterer Übertra gung durch Immunoblot, wurden festgestellt, mit tels eines spezifischen Serums, präpariert in Mut terschweinen aus unserem eigenen Labor, und welches mit dem Lelystad-PRRS-Virus wechselreagiert, 4 Majoritätsbänder, entsprechend Protein mit schein baren Molekulargewichten von 15 000, 23 000, 54 000 und 66 000 Dalton, welche nicht festgestellt wurden bei negativen Kontrollen (nichtinfizierte Makro phagen);
r) wenn die ORFs 3 bis 7 dieses Virus mit jenen des LV und/oder TV verglichen werden, wird auf Nukleo tid-Ebene 95,5% Homologie, (es sind 114 verschie dene bp aus einer Gesamtheit von 2599 bp vorhan den), und auf Aminosäure-Ebene 94,9% Homologie, (51 verschiedene Aminosäuren aus einer Gesamtheit von 955), festgestellt, und
s) das Virus gehört zu dem Arterivirus-Genus.

4.3 Für die Virusidentifizierung verwendete technische Verfahren 4.3.1 Experimentelle Reproduktion der Krankheit in trächtigen Mutterschweinen

Mutterschweine, Kreuzung Deutsche Landrasse x "Large White" (groß, weiß), wurden verwendet, die aus landwirtschaftlichen Betrieben stammten, mit systemati scher serologischer Kontrolle in bezug auf Viren der Aujeszkyschen Krankheit, der Maul- und Klauenseuche, der Schweine-Parvovirose, dem klassischen Schweinefie ber, der Schweine-Influenza (Typen H1N1 und H3N2) und der ansteckenden Gastroenteritis. Darüber hinaus wurde der Antikörpertitrationstest gegen das verursachende Virus von PRRS durchgeführt. Zwischen den Tagen 77 und 90 der Trächtigkeit wurden die Tiere infiziert, mit ei nem Isolat, das an alveolären Makrophagen der Schweine lunge erzielt wurde, in einem Fall, intravenös (IV) und intranasal (IN), dagegen in einem anderen Fall nur über den intranasalen Weg (Beispiel 2.1.). Während des ge samten Experiments wurden die Futteraufnahme, die rektale Temperatur und der klinische Zustand der Tiere überwacht. Mit der Absicht, die oben aufgeführten Erre der auszuschließen, wurden Blutproben von allen Mutter schweinen entnommen, vor der Infektion. Sie erwiesen sich als seronegativ gegenüber all den Erregern. Nach der experimentellen Infektion waren all die Mutter schweine ebenfalls noch seronegativ gegenüber all den genannten Viren und seropositiv gegenüber PRRS, (mit dem Bezugvirus LV verifiziert). Die Ergebnisse, die erzielt wurden, sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Durchgeführte Versuche

Key
AD = Aujeszky's disease.
FMD = Foot-and-mouth disease.
PP = Porcine parvovirosis.
CSF = Classic swine fever.
SF = Swine influenza (H1N1, H2N3).
TG = Transmissible gastroentetritis.
PRRS = Porcine reproductive and respiratory syndrome.
HAI = Hemagglutination Peroxidase-linked Assay.
NPLA = Neutralizing Peroxidase-linked Assay.
ELISA = Enzyme-linked Immunosorbent Assay.
SN = Seroneutralization.
IPMA = Immuno peroxidase monolayer assay.
(1) = Vannier et al., Rec. M´d. Vet. 155 (2), 151-158 (1979).
(2) = Charley B., Thesis Doctoral, Alfort (1976).
(3) = Trepsta et al., Vet. Microb. 9, 113-120 (1984).
(4) = Elliot M., J. Rech. Porc., 20, 141-146.
(5) = Lucam F., "Diagnostic sero-immunologique des viroses humains et animals", F. Bricout; L. Joubert; J.M. Huraux (1977).
(6) = Jim´nez et al., J. Virol., 60, 131-139 (1986).
(7) = Wensvoort et al., Vet. QUARTERLY, Vol. 13, n° 3 (July 1991)
(-) = Negative.
(+) = Positive.
ND = Not done

Schlüssel
AD = Aujeszkysche Krankheit.
FMD = Maul- Und Klauenseuche.
PP = Schweine-Parvovirose.
CSF = Klassisches Schweinefieber.
SF = Schweine-Influenza (H1N1, H2N3).
TG = Ansteckende Gastroenteritis.
PRRS = Reproduktives und respiratorisches Syndrom bei Schweinen.
HAI = Hämagglutination peroxidaseverkettete Analy se.
NPLA = Neutralisierende peroxidaseverkettete Analy se.
ELISA = Enzymverkettete Immunosorbentanalyse.
SN = Seroneutralisation.
IPMA = Immunoperoxidasemonomolekularschichtanalyse.
(1) = Vannier et al., Rec. Med. Vet. 155 (2), 151-158 (1979).
(2) = Charley B. Thesis Doctoral, Alfort (1976).
(3) = Trepsta et al., Vet. Microb. 9, 113-120 (1984).
(4) = Elliot M., J. Rech. Porc., 20, 141-146.
(5) = Lucam F., "Diagnostic sero-immunologique des viroses humains et animals" F. Bricout; L. Joubert; J. M. Huraux (1977).
(6) = Jim´nez et al., J. Virol. 60, 131-139 (1986).
(7) = Wensvoort et al., Vet. QUARTERLY, Vol 13, No. 3, (Juli 1991).
(-) = Negativ.
(+) = Positiv.
ND = Not done.

4.3.2 Experimentelle Reproduktion der Krankheit bei Ferkeln

Das Ziel dieses Experiments bestand darin, zu verifi zieren, ob das Erregervirus von reproduktiven Ver änderungen bei Mutterschweinen fähig war, bei 2 Monate alten Ferkeln respiratorische Symptome und makroskopi sche und mikroskopische krankhafte Veränderungen auf Lungenebene hervorzurufen. Zu diesem Zweck wurden eine Anzahl Ferkel mit dem Virus (Spanische Abstammung) "en route" infiziert, die dann an verschiedenen Postinfek tionstagen schmerzlos getötet wurden (Beispiel 2.2.).

Die meisten relevanten resultierenden Daten zeigen, daß dieses Virus auf makroskopischer Ebene vielfache Kon solidierungsherde sowie interstitielle Pneumonie auf mikroskopischer Ebene hervorruft (Tabelle 4). Vom ge sundheitlichen Standpunkt aus wurden keine relevanten klinischen Anzeichen beobachtet.

4.3.3 Sensitivität gegenüber Chloroformtest

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das isolierte Virus eine Lipidhülle aufwies. Zu diesem Zweck wurde die Methode H. Feldman und S. Wang ange wendet, die in "A manual of basic virological techni ques", Prentice-Hall Inc. New Jersey, 146-148 (1978), beschrieben ist. Die Ergebnisse, die erreicht wurden, zeigen, daß das unbehandelte Virus einen Titer von 10^5.6 TCID₅₀/ml aufweist, während nach Behandlung mit Chloroform der Titer kleiner ist als 10^1.3 TCID₅₀/ml; auf dieser Basis kann davon ausgegangen werden, daß das isolierte Virus eine Lipidhülle aufweist.

4.3.4 Sequenzieren des viralen Genoms

Fünf Phasen wurden durchgeführt:

i) Purifikation des Virus
ii) Purifikation des viralen RNA
iii) cDNA-Synthese
iv) Klonen und Charakterisierung der cDNA-Klone
v) Sequenzierung und Vergleich der Sequenzen mit jenen des LV

i) Purifikation des Virus

Das auf alveolären Makrophagen der Schweinelunge repli zierte Virus wurde klarifiziert und unter Verwendung von MILLIPORE-Filtern durch Filtration konzentriert. Danach wurde das Virus einer Zentrifugierung in 10%igem bis 50%igem Metrizamidgradient (SIGMA) unterworfen. So bald die Zentrifugierung durchgeführt war, wurde ein Band erzielt, das durch Zentrifugierung konzentriert wurde. Mit dem purifizierten Virus wurde eine Elektro phorese in Polyacrilamid-Gel (Polyacrylamid-Gel?) vor genommen, und ein Immunoblot wurde mit einem spezi fischen Serum entwickelt, das Proteine erkennen ließ, deren scheinbare Molekulargewichte 15, 23, 54 und 66 K Dalton betrugen.

ii) Purifikation des viralen RNA

Ein technisches Verfahren wurde angewendet für die Selektion und Purifikation des RNA, auf der Tatsache beruhend, daß das RNA eine Poly-(A)-Sequenz an Ende 3′ enthält. Zu diesem Zweck wurde ein kommerzieller Koffer (Pharmacia) verwendet, der das Anbinden der RNA-Poly- (A)-Kette an eine Cellulose-Oligo-(dT)-Matrix und ihre spätere Elution exklusiv ermöglichte.

iii) cDNA-Synthese

Ein kommerzieller Koffer wurde verwendet (Boehringer, Mannheim), wobei den Anweisungen des Herstellers ge folgt wurde. Zusammengefaßt, das virale genomische RNA wurde inkubiert bei Vorhandensein einer Oligo (dT), dATP, dCTP, dGTP, dTTP und Umkehr-Transkriptase.

iv) Klonen und Charakterisierung der cDNA-Klone

Das cDNA wurde in einem Vektor geklont, abgeleitet von pUC18, und eine Serie von Klonen wurde erzielt, welche die komplette Sequenz von Nukleotiden enthielt, ent sprechend den ORFs 3 bis 7.

v) Sequenzierung und Vergleich der Sequenzen mit jenen des LV v.a.) Sequenzierung

Die Region, die den ORFs 3-7 des Virus entspricht, in unseren Labors isoliert, ist komplett sequenziert wor den. Die Fig. 1 bis 5 zeigen die Sequenzen von cDNA, die erzielt wurden, sowie die Sequenzen, die von Amino säuren abgeleitet wurden, codiert durch jedes ORF. Die gesamte sequenzierte Regionlänge weist ungefähr 2599 Nukleotide (nt) auf.

Wie ersichtlich ist, hat ORF 3 eine Länge von etwa 798 nt und Codes für ein Protein von 266 Aminosäurerück ständen.

ORF 4 hat eine Länge von ungefähr 552 nt und Codes für ein Protein von 183 Aminosäurerückständen. Der Anfang dieses ORF 4 befindet sich in dem ATG-Codon (Anmerkung: Codon = drei aufeinanderfolgende Basen einer Nukleinsäure, die den Schlüssel für eine Aminosäure im Protein darstellen), das sich bei etwa 540 bp von dem anfänglichen ORF-3-ATG-Codon befindet. ORF 3 und ORF 4 teilen sich eine Sequenz von etwa 246 nt.

ORF 5 hat eine Länge von etwa 606 nt und Codes für ein Protein von 200 Aminosäurerückständen. Das anfängliche Codon dieses ORF 5 überlappt praktisch das ORF-4- End-Codon, (sie teilen sich die TG-Nukleotide, das ATG-Codon am Anfang von ORF 5 und das ORF 4 TGA-End- Codon). Das ORF-5-ATG-Anfangs-Codon befindet sich etwa 1092 nt von dem ORF-3-Anfangs-ATG-Codon.

ORF 6 hat eine Länge von etwa 522 nt und Codes für ein Protein von 173 Aminosäurerückständen. Dieses ORF-6- Anfangs-ATG-Codon befindet sich 8 nt stromaufwärts von dem Anfang des ORF-5-Terminations-TAG-Codon, (bei etwa 1682 nt ungefähr von dem Anfangs-ORF-3-ATG-Codon).

ORF 7 hat eine Länge von etwa 387 nt und Codes für ein Protein von 129 Aminosäurerückständen. Dieses ORF-7- Anfangs-ATG-Codon befindet sich 5 nt stromaufwärts von dem Anfang des ORF-6-Terminations-TAA-Codon, (bei etwa 2193 nt ungefähr von dem ORF-3-Anfangs-ATG-Codon).

Die Proteine, durch die ORFs 3 bis 6 codiert, sind Mem branproteine, während das Protein, durch ORF 7 codiert, ein Nukleocapsidprotein ist.

v.b.) Vergleich mit LV

Wenn man die cDNA-Sequenzen der ORFs 3-7 des LV mit jenen des Virus, das in unseren Labors isoliert wurde, vergleicht, ist festzustellen, daß

i) auf Nukleotid-Ebene aus den 2599 Nukleotiden, die verglichen wurden, 114 verschieden sind, was ungefähr 95,5% Homologie darstellt,
ii) auf Aminosäure-Ebene aus den 955 Aminosäuren, die verglichen wurden, 47 verschiedene Amino säuren vorhanden sind, was ungefähr 94,9% Homologie darstellt,
iii) von den 47 verschiedenen Aminosäuren 35 als nichtkonservative Substitutionen angesehen wer den, von denen vorhanden sind:
- - 12 in dem Produkt des ORF-3-Gens (Fig. 6);
- - 9 in dem Produkt des ORF-4-Gens (Fig. 7);
- - 10 in dem Produkt des ORF-5-Gens (Fig. 8), obwohl es angebracht ist, hervorzuheben, daß das Produkt des LV-ORF-5-Gens eine Aminosäure mehr enthält als das Produkt des Spanischen Virus ORF 5; spezifisch, die Aminosäure 35 (Asn) des LV-ORF-5-Produktes ist in dem durch das Spanische Virus ausgedrückten Produkt nicht vorhanden;
- - 4 in dem Produkt des ORF-6-Gens (Fig. 9), während
- - das Produkt des ORF-7-Gens keine nichtkonser vative Substitution enthält (Fig. 10),
iv) eine teilweise Homologie jedes Produktes der Produkte, durch die verschiedenen ORFs des Spanischen Virus und LV ausgedrückt, von 93,6% für die ORF-3- und ORP-5-Produkte, 94,0% für das ORF-4-Produkt, 96,6% für das ORF-6-Produkt und 99,2% für das ORF-7-Produkt vorhanden ist.

Wie oben erwähnt, können die Änderungen bei den Amino säuren in Verbindung gebracht werden mit der höheren Pathogenizität einer Abstammung im Vergleich mit einer anderen Abstammung, da das in unseren Labors isolierte Virus (Spanische Abstammung) pathogenischer ist als andere bekannte PRRS-Viren, wie - zum Beispiel - das in Frankreich isolierte Virus (Beispiel 8) und das LV (Tabelle 6 der PCT-Anmeldung No. WO 92/21375).

5. Die Vakzine

Die Erfindung sieht eine Vakzine vor, die fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen (PRRS) zu verhindern. Die Vakzine hat bewie sen, daß sie wirksam ist beim Verhindern reproduktiver Veränderungen bei Mutterschweinen, wie beispielsweise totgeborene Ferkel, mumifizierte Ferkel oder lebende, aber schwächliche Ferkel, Rückkehr zur Pflege( return to service?) und ähnliche Probleme, die durch das Virus hervorgerufen werden, das für PRRS ursächlich ist. Gleichfalls ist verifiziert worden, daß die Vakzine zellulare Immunität bei geimpften Tieren bewirkt.

Die Vakzine enthält einen geeigneten Betrag von PRRS-Viral-Antigen, Spanische Abstammung, inaktiviert, sowie ein Adjuvans und ein Vorbeugungsmittel.

Versuche, die mit diesen Vakzinen durchgeführt wurden, haben die Wirksamkeit der Vakzine bewiesen, wie durch die Beispiele 7 und 8 deutlich zum Ausdruck gebracht ist.

Darüber hinaus hat die Vakzine bewiesen, daß sie wirk sam ist, eine Rückkehr zur Pflege zu vermeiden, die bei infizierten Mutterschweinen auftrat. Tatsächlich paarten sich die Mutterschweine, die mit den Vakzinen, die aus dieser Erfindung resultieren, geimpft wurden und mit dem Erregervirus von PRRS infiziert wurden und wurden nach der ersten Post-Partum-Ovulation trächtig und entwöhnten die Ferkel.

5.1 Komponenten 5.1.a) Antigenische Phase

Als aktive Komponente enthält die Vakzine inaktiviertes PRRS-Viralantigen, Spanische Abstammung, mit einer Kon zentration höher als oder gleich 10^5.5 TCID₅₀ pro vak zinale Dosis. Die Inaktivierung kann durchgeführt wer den durch chemische Mittel, welche eine Behandlung mit β-Propiolacton oder mit anderen herkömmlichen Inak tivierungsagenzien, wie beispielsweise Äthylenimin bzw. Piperazin oder Formaldehyd, einschließen, oder durch physikalische Mittel.

5.1.b) Adjuvanzien

Obwohl es möglich ist, Adjuvanzien des Aluminiumhy droxidtyps, Quil A oder deren Mischungen wie auch ölige Adjuvanzien, für die Formulation der Vakzine zu verwen den, ist es möglich gewesen, zu verifizieren, daß die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn ein öliges Adju vans verwendet wird (Beispiel 4). Insbesondere ist ve rifiziert worden, daß ein öliges Adjuvans, das aus einer Mischung aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 besteht, sehr gute Ergebnisse mit sich bringt.

Marcol 52 ist ein Mineralöl geringer Dichte, durch ESSO ESPAÑOLA, S. A. hergestellt; Simulsol 5100 ist ein Po lyäthoxyloleatäther, durch SEPIC auf den Markt ge bracht, und Montanide 888 ist ein anhydrisches Mannit ätheroctadecenoat hoher Reinheit, durch SEPIC auf den Markt gebracht.

Es ist möglich gewesen, zu verifizieren, daß das Adju vans eine wesentliche Rolle spielt bei der Wirksamkeit der Vakzine. Daher wurde ein "Challenge-Test" (Beispiel 6) durchgeführt, unter Verwendung von Mutterschweinen, die mit zwei verschiedenen Vakzinen geimpft wurden, das eine Mutterschwein mit dem öligen Adjuvans, das oben angegeben wurde (Ref. 1), und das andere Mutterschwein, unter Verwendung des Adjuvans Munokynin® (Ref. 2). Ob wohl beide Vakzinen Serokonversion hervorbringen, wurde in einem experimentellen Infektionstest verifiziert, daß die Mutterschweine, die mit der Vakzine Ref. 1 geimpft wurden, gegen eine experimentelle Infektion mit dem PRRS-Virus geschützt waren, während die anderen Mutterschweine, jene, die mit der Vakzine Ref. 2 ge impft wurden, nicht geschützt waren, trotz der Tat sache, daß zu dem Zeitpunkt der Herausforderung (Challenge), sie Antikörper gegen das Virus hatten. Dies begründet, daß ein geeignetes Adjuvans eine sehr wichtige Rolle spielen kann in Zusammenhang mit der Modulation und Stimulation der immunen Reaktion, hauptsächlich auf zellularer Immunitätsebene. Darüber hinaus ist dieser Aspekt durch den Challenge-Test, der durchgeführt wurde, unter Verwendung der Spanischen Ab stammung des PRRS-Virus, bestätigt worden, da die Mutterschweine, die mit der Vakzine Ref. 1 geimpft und nachgeimpft wurden, keine serologische Reaktion zum Zeitpunkt der Infektion zeigten, aber dennoch geschützt waren (Beispiel 7, Tabelle 8).

Es könnte jedoch auch möglich sein, daß die Vakzine Ref. 2 (mit Munokynin®) zellulare Immunität bewirken könnte. Zu diesem Zweck würde es notwendig sein, Substanzen beizugeben, welche die Zellreaktion (CRP) verstärken, das heißt Substanzen, die Helfer-T-Zell- Subpopulationen (Th₁ und Th₂) verstärken, wie bei spielsweise IL-1 (Interleukine-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 g-IFN (Gamma-Interferon), zellularer Necro sefaktor und ähnliche Substanzen. Offensichtlich wäre es auch möglich, diese PRC-Substanzen Vakzinen mit öligem Adjuvans beizugeben; in diesem Fall würde deren Zellimmunwirkung verstärkt werden.

Andere Arten von Adjuvans können ebenfalls verwendet werden, die eine Zellreaktion modulieren und immuno stimulieren, wie beispielsweise MDP (Muramyldipeptid), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) oder Liposome (Fetttröpfchen in Zellen).

5.1.c) Vorbeugungsmittel

Alle Vorbeugungsmittel, die gewöhnlich bei der Formu lation von Vakzinen verwendet werden, können verwendet werden. Eines davon ist Thimerosal [Natriumsalz von (2-Carboxvphenylthio)-Äthylquecksilber] (ALDRICH).

5.2 Verfahren zur Herstellung der Vakzine

Die aus dieser Erfindung resultierenden Vakzinen können erlangt werden durch Mischen einer antigenischen Phase, die ein intaktiviertes virales Antigen enthält, und einer anderen Phase, als Adjuvans, das ölig sein kann oder nicht, abhängig von dem gewählten Adjuvans. Optio nal könnten CRP-Substanzen beigegeben werden zu irgend einer (jeder?) der beiden Phasen. Wenn das Adjuvans ölig ist, bildet sich eine Emulsion, die in einem be sonderen bevorzugten Fall, (wenn es sich bei dem Adju vans um eine Mischung aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 handelt), eine doppelte Emulsion "w/o/w" (water/oil/water) (Wasser/Öl/Wasser) ist.

5.3 Vakzinekontrollversuche

Zusätzlich zu den herkömmlichen Tests muß die Vakzine vor ihrer Verabreichung Kontrollen durchlaufen hin sichtlich: (i) Reinheit (gegenüber Bakterien, Fungi, Mykoplasmen und Fremdviren), (ii) Identifizierung, (iii) Sicherheit, (iv) Wirksamkeit und (v) physiko chemische Kontrollen; eine Anzahl Feldversuche (Bei spiel 5.b) ist durchgeführt worden in bezug auf die Sicherheit und Wirksamkeit der Vakzine bei einer Ge samtheit von 5 landwirtschaftlichen Betrieben, wobei 508 Mutterschweine mit einer der aus dieser Erfindung resultierenden Vakzinen geimpft und nachgeimpft wurden, während die übrigen 472 Mutterschweine nicht geimpft wurden und als Kontroll-Mutterschweine gehalten wurden, wodurch es möglich wurde, festzustellen, daß die Vak zine sicher und gleichzeitig wirksam ist, denn in eini gen der landwirtschaftlichen Betriebe wurde die natür liche Krankheit PRRS bei nicht geimpften Tieren fest gestellt, nach dem Impfungsprozeß.

5.4 Posologie (Posology) und Anweisungen für die Ver abreichung der Vakzine

Es war möglich, zu verifizieren, daß eine (einzige) Dosis von 2 ml ölige Vakzine mit einer Konzentration von inaktiviertem viralen Antigen gleich oder höher als 10^5.5 TCID₅₀, über den tiefen intramuskulären Weg ver abreicht, fähig ist, einen sehr hohen Prozentsatz ge impfter Tiere gegen PRRS zu schützen.

Das folgende Impfungsprogramin wird empfohlen:

* Erste Impfung: alle Zuchtschweine (Mutterschweine und Eber) impfen und nach 21 Tagen nachimpfen. Da nach eine Dosis während jeder Säugezeit (Mutter schweine) und alle 6 Monate (Eber) verabreichen.

* Spätere Impfungen

- für die Züchtung vorgesehene Tiere: Die erste Impfung sollte im Alter von 6 Monaten durchgeführt werden, Nachimpfung nach 21 Tagen.
- Mutterschweine: Es wird empfohlen, während der Säugeperiode zu impfen, falls möglich, 15 Tage vor der Paarung.
- Eber: Zweimal pro Jahr (alle 6 Monate) impfen.

Alternativ, wenn keine CRP-Substanz in die Vakzine ein geschlossen worden ist, können diese Substanzen an einer anderen Stelle als der Stelle der Inokulation, aber gleichzeitig, injiziert werden.

6. Polyvalente Vakzinen

Durch ein zusätzliches Ziel, das durch diese Erfindung erreicht wird, werden Kombinationen der verschiedenen Pathogene bei Schweinen vorgesehen, die zusätzlich zu dem inaktivierten viralen PRRS-Antigen (Spanische Ab stammung) ein oder mehrere der nachfolgend aufgeführten Pathogene enthalten, um die Herstellung bi- oder multi valenter Vakzinen zu ermöglichen.

Auf diese Weise können bi- oder multivalente Vakzinen hergestellt werden, die ein inaktiviertes virales PRRS-Antigen und ein oder mehrere der folgenden Pathogene enthalten: Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Porcine Parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory (respiratorisches) Coronavirus, Rotavirus, oder gegen die Pathogene, welche die Aujeszkysche Krankheit, Schweine-Influenza oder die ansteckende Gastroenteritis hervorrufen.

BEISPIELE Beispiel 1 - Isolation des Virus 1.A Präparierung der Proben

Aus der Lunge eines totgeborenen Ferkels Nachkommen schaft eines Mutterschweins mit den klassischen PRRS-Symptomen, [das Mutterschwein war frei von Antikörpern gegen die Aujeszkysche Krankheit, Schweine-Parvovirose, Maul- und Klauenseuche, klassisches Schweinefieber, Schweine-Influenza (Typen H1N1 und H3N2) und anstecken de Gastroenteritis], wurde eine 10%ige Suspension in einem DMEM-Nährbodenmedium hergestellt, mit einer Lö sung aus Antibiotika (PEG) ergänzt, die aus 1000 IU/ml Penicillin, 1 mg/ml Streptomycin und 0,5 mg/ml Genta micin bestand, mit einem Verhältnis Lunge : DMEM-Lösung von 1 : 10 (W/V). Die Suspension, die hergestellt wur de, wurde homogenisiert und 1 Stunde lang bei Raumtem peratur (20-22°C) stehen gelassen. Das Homogenat wurde eingefroren und zweimal aufgetaut, zentrifugiert und der Überstand, der erreicht wurde, bei -70°C gelagert, um bei der Infektion alveolärer Makrophagen der Schwei nelunge verwendet zu werden.

Ähnlich wurden Proben präpariert aus der Lunge eines Ferkels das lebend geboren wurde, aber innerhalb weniger Stunden einging. Darüber hinaus wurde Blut ent nommen und mit und ohne Antikoagulans gemischt und zur Virusisolation (aus Blutplasma) verwendet und um ent sprechend Serum zu erhalten.

1.B Erlangung alveolärer Makrophagen der Schweinelunge

Alveoläre Makrophagen wurden aus den Lungen von Schwei nen entnommen, die seronegativ waren gegen die Aujesz kysche Krankheit, Schweine-Parvovirose, Maul- und Klau enseuche, klassisches Schweinefieber, Schweine-In fluenza (Typen H1N1 und H3N2) und ansteckende Gastro enteritis. Das Alter der Schweine, die verwendet wur den, war zwischen 7 und 8 Wochen. Vor der Extraktion der Lungen wurden die Tiere mit Phenobarbitalnatrium anästhesiert und schmerzlos getötet. Sofort wurden die Lungen zusammen mit der Trachea entnommen, nachdem sie unterhalb der Epiglottis abgebunden wurde. Die extra hierte Lunge wurde mit physiologischer Salzlösung ex tern gewaschen, und bei sukzessiven Wäschen wurden 50 ml PBS, mit 2‰ PEG-Lösung aus Antibiotika ergänzt, eingebracht, bis eine Gesamtheit von 500 ml PBS ein gebracht worden war. Die aus diesen Wäschen gewonnenen Zellen wurden 10 Minuten lang mit 300 g zentrifugiert. Dieser Waschungsschritt durch Zentrifugierung wurde zwei weitere Male wiederholt. Die erhaltenen Zellen wurden mit PBS- und PEG-Lösung aus Antibiotika gewa schen und in DMEMs-Medium [DMEM, mit nichtessentiellen Aminosäuren (GIBCO), 1% Natriumpyruvat 1 mM und 1% Glutamin 2 mM ergänzt], 10% fötales Kalbsserum (FCS) und PEG-Lösung von Antibiotika bei 1‰ resuspen diert. Die Zellzählung wurde in Newbauer-Kammern durch geführt, und zu diesem Zweck wurde 1/10 Verdünnung der Makrophagen-Suspension dadurch hergestellt, daß 0,4 ml DMEMs und 0,5 ml einer Trypanblaulösung auf 0,1 ml Makrophagen-Suspension beigegeben wurden. Eine Anzahl Zellen, die zwischen 1 und 1,2×10⁹ rangierten, wurde erzielt.

1.C Isolation des Virus

Ein Kulturkolben (Eine Nährbodenschale) mit 25 cm² Oberfläche, der eine zuvor präparierte Kultur aus al veolären Makrophagen der Schweinelunge enthielt, (3×10⁶ Zellen/mg), in DMEMs-Medium und 10% FCS wurde mit 1 ml des Homogenats einer Probe, die aus der Lunge eines totgeborenen Ferkels stammte, infiziert, (Bei spiel 1.A). Das Homogenat wurde 1 Stunde lang bei 37°C in Kontakt gelassen mit der Makrophagenkultur, mit CO₂ bei pH 7,0-7,4 gepuffert und einige Tage bei 37°C in kubiert; während dieser Tage wurde die CPE, die durch das Virus an den Makrophagen hervorgerufen wurde, be obachtet. An 3-4 dpi wurde beobachtet, daß die CPE 70-80% war; aus diesem Grund wurden die Kulturen bei -80°C eingefroren.

Gleichzeitig wurde ein Nährboden mit nichtinfizierten alveolären Makrophagen der Schweinelunge präpariert, und zwar als negative Kontrolle verwendet.

Tochterkulturen mit dem isolierten Virus wurden vorge sehen, bei welchen beobachtet wurde, daß die CPE, die von dem zweiten dpi an begann, 100% war. Das Virus wurde bei -80°C eingefroren, zu seiner späteren Iden tifizierung und Charakterisierung. Nach dem vierten Durchgang in Makrophagen wurden die entsprechenden Titrationen in Probenträgern mit 96er Raster durchge führt, wobei ein durchschnittlicher Titer von 10^5.6 TCID₅₀/ml nach der Methode von Reed & Muench [Am. J. Hyg., 27 : 493-497 (1938)] erzielt wurde.

Eine Probe des isolierten Virus (Spanische Abstammung), mit der Bezeichnung PRRS-CY-218-JPD-PS-6-91, aus der Lunge einem totgeborenen Ferkels isoliert, ist fähig, die Krankheit experimentell zu reproduzieren und wurde am 01. Juli 1993 bei der ECACC deponiert, unter der entsprechenden Zugangs-No. V93070108.

In ähnlicher Weise wurde das Virus in lebenden und tot geborenen Ferkeln isoliert, Nachkommenschaft von expe rimentell infizierten Mutterschweinen.

Beispiel 2 Identifizierung und Charakterisierung des Virus Beispiel 2.1 Experimentelle Reproduktion der Krank heit bei trächtigen Mutterschweinen

Zwölf Mutterschweine, eine Kreuzung aus Deutsche Land rasse X "Large White", wurden verwendet, die von land wirtschaftlichen Betrieben mit Systematischer serolo gischer Kontrolle gegen die Viren der Aujeszkyschen Krankheit, Maul- und Klauenseuche, Schweine-Parvovi rose, klassisches Schweinefieber, Schweine-Influenza (Typen H1N1 und H3N2) und ansteckende Gastroenteritis stammten. Darüber hinaus wurde der Antikörperauswer tungstest gegen das verursachende Virus von PRRS durch geführt.

Die Mutterschweine wurden eine Woche vor Infektion in die Sicherheitsställe des Forschungszentrums gebracht und in separaten Ställen untergebracht. Zwischen den Tagen 77 und 90 der Trächtigkeit wurden die Mutter schweine, durch die Nummern 53, 76, 8, 62, 91, 93 und 19 identifiziert, mit 5 ml, intravenöser Weg (IV), und 5 ml, intranasaler Weg (IN), des PRRS-Virus, Spani sche Abstammung, an alveolären Makrophagen der Schwei nelunge isoliert, als PRRS-Cy-218-JPD-P5-6-91 identifi ziert, infiziert, von einem vierten Durchgang auf Ma krophagen an durch ein 200-nm-Filter hindurch gefil tert und mit einem Titer von 10^5.6 TCID₅₀/ml. Die 5 verbleibenden Mutterschweine (No. 14, 40, 13, 30 und 85) wurden zwischen den Tagen 65 und 85 der Träch tigkeit mit 5 ml (nur) via IN des Virus inokuliert.

Während des Experiments wurden die Futteraufnahme, die rektale Temperatur und der klinische Zustand der Tiere wie auch reproduktive Veränderungen (Frühgeburten, ver zögerte Geburten, lebende, aber schwächliche Ferkel, totgeborene Ferkel, mumifizierte Ferkel und gesunde Ferkel) täglich überwacht.

Um mit dem Ausschluß der oben erwähnten Pathogene fort zuschreiten, wurden von den Mutterschweinen Blutproben entnommen, vor und nach Infektion, mit dem Ergebnis, daß die Tiere seronegativ waren, gegenüber den Patho genen vor und nach Infektion, und seropositiv gegen PRRS nach Infektion (siehe Tabelle 1, Abschnitt 4.3.1.).

Die reproduktiven Ergebnisse erscheinen in den Tabellen 2 und 3. Wie in Tabelle 2 dargestellt, waren von den 93 Ferkeln, die geworfen wurden, 15 mumifiziert, 35 totge boren, 22 wurden lebend geboren, gingen aber am dritten Tag ein, und 21 überlebten 7 Tage.

Einige Mutterschweine zeigten 2-4 Tage lang Freßunlust, an den Tagen 6 und 8 nach Infektion, während andere Mutterschweine an dem zweiten Tag nach Infektion Freß unlust zeigten. Hyperthermie wurde in keinem Fall fest gestellt. Bei 4 Mutterschweinen (No. 8, 62, 92 und 93) war der Wurf jeweils 1 bis 6 Tage zu früh, während sich bei den anderen 3 Mutterschweinen das Werfen um 1 oder 2 Tage verzögerte.

Bei den Ferkeln, die lebend geboren wurden, zeigten 1 oder 2 Ferkel pro Wurf Odem in den Augen. Die schwäch lichen Ferkel zeigten Inkoordination, Parese des Hin terviertels, sich sträubende Borsten und Myoclonia. Bei der Nekropsie, die bei einigen der totgeborenen und schwächlichen Ferkel bewirkt wurde, wurde das Vorhan densein von abundanter klarer Flüssigkeit in der Thoraxhöhle festgestellt Gesunde Ferkel, die durch in fizierte Mütter geboren wurden und nach 8-12 Lebens tagen schmerzlos getötet wurden, zeigten graue Foci einer Konsolidation. Unter dem Mikroskop war die signi fikanteste Veränderung eine leichte, Multifoci aufweisende interstitielle Pneumonie mit Vergrößerung alveolärer Septi wegen der Infiltration mononuklearer Zellen. Diese krankhaften Veränderungen zeigten sich bei allen Tieren, die bei dem Experiment analysiert wurden.

Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, waren von 65 Fer keln, die geworfen wurden, 36 totgeboren, 26 wurden le bend geboren, aber schwächlich, und gingen am zweiten Lebenstag ein, und 3 überlebten die erste Lebenswoche. Ein Mutterschwein ferkelte 12 Tage zu früh (No. 40), während die anderen Mutterschweine 1 oder 2 Tage zu spät warfen. Die klinischen Anzeichen der Ferkel, die schwächlich geboren wurden, sind jenen ähnlich, die via IN + IV erreicht wurden. Interstitielle Pneumonie wurde ebenfalls beobachtet. Die infizierten Mutterschweine zeigten keine Freßunlust und keine Hyperthermie.

Der relevanteste Unterschied zwischen den beiden Infek tionssystemen besteht darin, daß via IN + IV mumifi zierte Ferkel beobachtet wurden und daß 1 bis 2 der Ferkel, die bei jedem Wurf lebend geboren wurden, Ödem um die Augen herum erkennen ließen.

Im Hinblick auf die Ergebnisse, die erzielt wurden, kann geschlossen und angegeben werden, daß das Modell für eine experimentelle Infektion bei Mutterschweinen, an etwa 80 Tagen der Trächtigkeit, via beide Infek tionswege (IN und IV) mit dem Virus, das von Tieren, die natürlich infiziert wurden, isoliert wurde, (Spani sche Abstammung), die Krankheit PRRS bei trächtigen Mutterschweinen reproduziert und einen hohen Anteil mumifizierter Föten, totgeborener Ferkel und lebender, aber schwächlicher Ferkel hervorruft, sehr ähnlich dem Anteil, der bei akuten natürlichen Infektionsausbrüchen beobachtet wurde. Es ist zu empfehlen, über den IN-Weg künstlich zu infizieren, aus dem Grund, daß dies der natürliche Weg einer Infektion auf dem Feld ist und daher der geeignetste Weg ist, die Wirksamkeit der Vak zinen zu bewerten.

Durch dieses Experiment ist es auch möglich geworden, ein Modell für die experimentelle Infektion bei träch tigen Mutterschweinen zu etablieren, das die Verifi kation der Wirksamkeit der Vakzinen ermöglicht.

Tabelle 2

IN + IV

Tabelle 3

IN

A: Mutterschwein
B: Zeitpunkt der Infektion (Tage der Trächtigkeit)
C: Ferkeln (Tage der Trächtigkeit)
D: Gesamtzahl der Ferkel
E: Mumifizierte Ferkel
F: Schwächliche Ferkel, nach 48 h tot.
G: Totgeborene Ferkel
H: Ferkel, anscheinend bei guter Gesundheit.
h1: Tot zwischen den Tagen 2 und 7
h2: Lebend nach einer Woche
I: Interstitielle Pneumonie.
NT: Not tested/Nicht getestet

Beispiel 2.2 Experimentelle Reproduktion der Krank heit bei Ferkeln

Dieses Experiment wurde vorgesehen mit dem Zweck, zu verifizieren, daß das isolierte Virus (Spanische Ab stammung), das reproduktive Veränderungen bei Mutter schweinen hervorruft, fähig ist, klinische Anzeichen wie auch makroskopische und mikroskopische krankhafte Veränderungen in den Lungen von 2 Monate alten Ferkeln hervorzurufen. Zu diesem Zweck wurden 10 Ferkel über den IN-Weg mit 5 ml des Virus, Spanische Abstammung, mit einem Titer von 10^5.6 TCID₅₀/ml infiziert, und 6 andere Ferkel wurden als Kontrollen gelassen, (alle diese Ferkel stammten aus 2 Würfen). Die Tiere wurden an den Tagen 3, 7, 8, 9 und 11 nach Infektion schmerz los getötet. Die Resultate, die erzielt wurden, sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

No.: Pig number
I/C: Infected (I) or Control (C)
DPI: Days Post infection
I.P.: Interstitial pneumonia
V.I.: Virus isolation
2+: Slight interstitial pneumonia
3+: Intermediate interstitial pneumonia
4+: Serious interstitial pneumonia
NT: Not tested
NL: No lesions

No.: Nummer des Schweins
I/C: Infiziert (I) oder Kontrolle (C)
DPI: Tage nach Infektion
I.P.: Interstitielle Pneumonie
V.I. : Virusisolation
2+: Leichte interstitielle Pneumonie
3+: Mittlere interstitielle Pneumonie
4+: Schwere interstitielle Pneumonie
NT: Not tested/Nicht getestet
NL: No lesions/Keine krankhaften Veränderungen

Während der 11 Tage des Experiments wurden keine klini schen respiratorischen Anzeichen und keine Hyper thermie beobachtet, obwohl Gewichtsverlust bei den in fizierten Tieren im Vergleich mit nichtinfizierten Tie ren auftrat. Unter mikroskopischer Beobachtung war der relevanteste Aspekt das Vorhandensein von Mehrfachher den einer Konsolidation in den Lungen, mit Blut über füllte Lymphknoten in der Mandibel und einige Darmblu tungen. Auf mikroskopischer Ebene wurde interstitielle Pneumonie beobachtet.

Das Virus wurde aus Lösungen isoliert, die aus den Wäschen infizierter Tierlungen an einer frischen Makro phagenkulter erlangt wurden, aber das Virus wurde nicht isoliert von den Kontrolltieren her, bei welchen keine Serokonversion und auch keine makroskopischen oder mikroskopischen krankhaften Veränderungen auf Lungen ebene beobachtet wurden.

Wenn Zellzählungen aus den Wäschen infizierter Tier lungen vorgenommen wurden, wurden 30% tote Zellen (Ma krophagen) beobachtet, was einen Faktor von besonderer Bedeutung bei sekundären Infektionen bilden kann, wegen der Destruktion eines einen Schlüssel bildenden immuno logischen Abwehrelements (Makrophagen).

Das Nichtvorhandensein respiratorischer Anzeichen könn te auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß experi mentelle Infektionen in Ställen mit kontinuierlichen Desinfektionsbehandlungen durchgeführt wurden und daher eine bakterielle Konzentration viel kleiner war, ver glichen mit jener, die in Herden unter Feldbedingungen vorhanden ist.

Beispiel 2.3 Sensitivität gegenüber dem Chloroform test

Die Methode H. Feldman und S. Wang (Abschnitt 4.3.3) wurde angewendet, die in dem Wissen resultierte, daß das isolierte Virus eine Lipidhülle besitzt da ein Abfall im Titer von 4 log₁₀ von den Kontrollkulturen zu jenen, die mit Chloroform behandelt wurden, vorhanden ist.

Beispiel 2.4 Sequenzieren des viralen Genoms i) Purifikation des Virus

Das Virus, an alveolären Makrophagen der Schweinelunge repliziert, wurde durch Filtrierung und Zentrifugierung in einem 10%igen bis 50%igen Metrizamidgradienten (SIGMA) purifiziert, was ein Band zur Folge hatte, das nochmals zentrifugiert wurde, wie in Abschnitt 4.3.4 erwähnt. Mit dem purifizierten Virus wurde eine Elektrophorese in Polyacrylamid-Gel durchgeführt und ein Immunoblot entwickelt mit einem spezifischen Serum, das Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 15, 23, 54 und 66 K Dalton erkennen ließ.

ii) Purifikation der viralen RNA

Die virale RNA wurde purifiziert, unter Verwendung eines kommerziellen Koffers (PHARMACIA), der das Binden des RNA-Poly-(A)-Schwanzes an eine Zellulose-Oligo- (dT)-Matrix ermöglicht und ihre spätere Elution.

iii) cDNA-Synthese

Ein kommerzieller Koffer wurde verwendet (BOEHRINGER, MANNHEIM) (Abschnitt 4.3.4 iii).

iv) Klonen und Charakterisierung der cDNA-Klone

Das cDNA wurde in einem Vektor geklont, der aus pUC18 abgeleitet war, und eine Serie von Klonen wurde er zielt, welche die komplette Nukleotid-Sequenz enthielt, die den ORFs 3 bis 7 entsprach.

v) Sequenzieren und Vergleichen der Sequenzen mit jenen des LV

Die Resultate des Sequenzierens der cDNA des in unseren Labors isolierten Virus (ORFs 3-7) sowie der Vergleich zwischen jener Sequenz und der LV-Sequenz sind in Abschnitt 4.3.4 v) erwähnt, in dem ersichtlich ist, daß auf Aminosäure-Ebene ein Homologiegrad von ungefähr 94,9% und eine Gesamtheit von 47 verschiedenen Amino säuren vorhanden ist, von denen 35 nichtkonservativen Substitutionen entsprechen. Diese Unterschiede auf Ami nosäure-Ebene können für die verschiedenen Pathoge nizitäten, die zwischen den verschiedenen PRRS-Virusab stammungen, die isoliert wurden, vorhanden sind, ver antwortlich sein.

Beispiel 3 Formulation einer Vakzine

Eine Vakzine, die fähig ist, vor PRRS zu schützen, wird in Emulsionsform präpariert, gemäß der nachfolgend be schriebenen Prozedur.

Eine alveoläre Makrophagenkultur der Schweinelunge wird mit MOI (multiplicity order infection/übersetzt etwa: Mehrfach-Reihenfolge-Infektion) von 0,001 infiziert und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert; am Ende davon wird das Nährbodenmedium durch ein Infektionsmedium (DMEM, mit 2% FCS ergänzt) substituiert. Der Nährboden wird 4 Tage lang bei 37°C inkubiert, bis 70-80% CPE beobach tet wird. Sobald diese Periode vervollständigt ist, wird ein IPMA-Test durchgeführt, um die Identifizierung zu bestätigen. Das Virus wird durch Vakuumaspiration gesammelt und bei -80°C eingefroren.

Die virale Suspension, die für die Formulation einer Vakzine prädestiniert ist, sollte einen Mindesttiter von 10^5.5 TCID₅₀/ml (vor ihrer Inaktivierung) aufweisen und sollte nicht verseucht sein durch Bakterien, Fungi, Mykoplasmen oder andere Viren. In dem Fall, daß der Titer niedriger ist, sollte er durch Konzentrieren des Antigens eingeregelt werden.

Für die Inaktivierung der viralen Suspension wird 2‰ β-Propiolactonlösung beigegeben und eine Nacht lang bei 4°C verrührt, wobei der PH-Wert bei 7,4 durch Beigeben von 0,5 N NaOH aufrechterhalten wird. Sobald die Inaktivierungsperiode vervollständigt ist, wird die virale Suspension 1 Stunde lang bei 37°C aufrechter halten.

Dann wird folgendes präpariert:

a) eine antigenische Phase des viralen Antigens, inaktiviert mit einer Mindestkonzentration von 10^5.5 TCID₅₀/Dosis, und des Aufrechterhalters (preserver), und
b) eine ölige Phase, aus Marcol 52, Simulsol 1500 und Montanide 888 zusammengesetzt.

Die wäßrige Phase, durch Umrühren aufrechterhalten, wird dem Reaktor, welcher die ölige Phase enthält, die ebenfalls durch Umrühren aufrechterhalten wird, langsam beigegeben. Sobald die wäßrige Phase vollständig bei gegeben worden ist, wird das Umrühren 10 Minuten lang fortgesetzt.

In einem besonderen bevorzugten Fall sind Vakzinen prä pariert worden, die fähig sind, PRRS zu verhindern, pro Dosis von 2 ml aufweisend:

a) 53% einer antigenischen Phase, enthaltend:
- i) PRRS virales Antigen in DMEM-Nährbodenme dium, Spanische Abstammung, inaktiviert mit β-Propiolacton, mit einer Mindestkonzentra tion von: 10^5.5 TCID₅₀, und
- ii) Thimerosal: 0,01% und
b) 47% einer öligen Phase, enthaltend:
- i) Marcol 52: 790,0 mg
- ii) Simulsol 5100: 70,0 mg
- iii) Montanide 888: 80,0 mg

Das Verhältnis ölige Phase/wäßrige Phase ist ein Ver hältnis Gewicht/Volumen (W/V). Diese Vakzine ist mit MSD Ref. 1 bezeichnet worden. Die erhaltene Vakzine wird den entsprechenden Kontrollversuchen unterworfen, vor Anwendung.

Eine andere Vakzine wurde ähnlich bereitet, unter Verwendung von Munokynin® (Aluminiumhydroxid und Quil A, durch AMERICAN CYANAMID geliefert) als Adjuvans, wobei der gleiche Betrag von inaktiviertem Virus beibe halten wird. Diese Vakzine ist mit MSD Ref. 2 be zeichnet worden.

Beispiel 4 Bewertung des Adjuvans

Ein Feldversuch wurde durchgeführt mit einer Gesamtheit von 128 Mutterschweinen, von denen 49 mit einer Dosis der mit MSD Ref. 1 bezeichneten Vakzine vakziniert wurden, 50 Mutterschweine mit einer Dosis der mit MSD Ref. 2 (Munokynin®) bezeichneten Vakzine vakziniert wurden und die verbleibenden 29 nicht vakziniert wurden und als Kontrollen gehalten wurden. Nach 22 Tagen wur den die Mutterschweine mit einer Dosis der entspre chenden Vakzine nachgeimpft.

Die folgenden Parameter wurden bewertet:

1. Serologische Reaktion mittels einer IPMA-Be stimmung zu den folgenden Zeitpunkten:
T_o: Vakzinierung und Aderlaß
T₂₂: Nachvakzinierung und Aderlaß
T₅₁: Aderlaß 50 Tage nach Vakzinierung
2. Reaktionen allgemeiner Art (Verlangen nach Fut ter, Hyperthermie etc.).

Die Resultate, die erzielt wurden, sind in den Tabellen 5 und 6 angegeben, die den Prozentsatz von Mutter schweinen mit positiver serologischer Reaktion (Tabelle 5) und das arithmetische Mittel der serologischen Titer, die erreicht wurden, (Tabelle 6), wiedergeben.

Tabelle 5

% Der Tiere mit serologischer Reaktion (+)

Tabelle 6

Arithmetisches Mittel der serologischen Titer

Signifikante lokale Reaktionen oder Reaktionen allge meiner Art wurden nicht beobachtet.

Von den Resultaten, die erzielt wurden, ausgehend, kann bestätigt werden, daß eine positive Serokonversion mit beiden Vakzinen hervorgerufen wird, wenn auch etwas höher, wenn die Vakzine MSD Ref. 1 (öliges Adjuvans) verwendet wird. Bei Nachvakzinierung wurde ein höherer Serokonversions-Prozentsatz beobachtet, und das arith metische Mittel der Titer, die erzielt wurden, ist bei Tieren, die mit MSD Ref. 1 vakziniert wurden, höher.

Beispiel 5 Sicherheit bei Mutterschweinen Beispiel 5.A Auf Laborebene Beispiel 5.A.1 Erstmalig werfende Mutterschweine

Achtzehn erstmalig werfende Mutterschweine (Kreuzung Deutsche Landrasse x Large White) wurden aus einem Schweinezuchtbetrieb ausgewählt und wurden in zwei Ställe verteilt, mit der Rate von 9 Mutterschweinen pro Stall, so daß Mutterschweine, die mit der gleichen Vak zine (MSD Ref. 1 oder MSD Ref. 2) vakziniert wurden, in Beispiel 3, oben, erhalten, in dem gleichen Stall untergebracht waren.

Neun Mutterschweine wurden über den tiefen IM-Weg vak ziniert, mit einer Dosis von 2 ml Vakzine MSD Ref. 1, enthaltend 10^5.5 TCID₅₀/Dosis inaktivierter Virustiter und wurden mit einer anderen Dosis des gleichen Titers 20 Tage später nachvakziniert. Die anderen 9 Mutter schweine wurden an den gleichen Tagen mit der Vakzine MSD Ref. 2 (2 ml Dosen, 10^5.5 TCID₅₀/Dosis inaktivier ter Virustiter) vakziniert und nachvakziniert.

Während der ersten 5 Tage nach Inokulation wurden die folgenden Beobachtungen gemacht:

a) Lokale Reaktion

Bestehend aus makroskopischer Beobachtung der Stelle der Inokulation und Abtastung, wobei das Ausmaß einer Entzündung im Vergleich mit Objekten bekannter Größe notiert wurde.

b) Allgemeine Reaktion

Bestehend aus makrospkopischer Beobachtung der Tiere und Verifikation ihres Verlangens nach Futter. Im nega tiven Fall wird alle 12 Stunden die rektale Temperatur geprüft, bis Hyperthermie oder irgendwelche anderen un günstigen Anzeichen verschwunden sind.

Die erzielten Resultate lassen erkennen, daß eine leichte entzündliche Reaktion bei einigen Mutterschwei nen vorhanden war, an der Stelle der Inokulation deut lich sichtbar, die in jedem Fall innerhalb weniger Tage verschwand; eitrige Formationen wurden nicht beobach tet. Nur eines der Mutterschweine weigerte sich, die Gesamtheit der Fütterung bei der ersten Postinokula tions-Fütterung aufzunehmen, aber die Futteraufnahme war bei der folgenden Fütterung normal, so daß es nicht notwendig war, die rektale Temperatur zu messen. Keine wesentlichen Unterschiede bei der Reaktion auf die ver schiedenen getesteten Vakzine wurden festgestellt; auf dieser Grundlage kann bestätigt werden, daß beide Vakzine sicher sind.

Beispiel 5.A.2 Trächtige Mutterschweine

Sieben trächtige Mutterschweine (Kreuzung Deutsche Landrasse x Large White) aus einem Schweinezuchtbetrieb wurden willkürlich ausgewählt: 6 erstmalig werfende Mutterschweine, etwa 9 Monate alt, und 1 mehrwerfendes Mutterschwein, 3 Jahre und 7 Monate alt.

Die mit MSD Ref. 1 bezeichnete Vakzine wurde aus schließlich verwendet.

Die Mutterschweine wurden über den tiefen IM-Weg mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine, die einen inakti vierten Virustiter von 10^5.5 TCID₅₀/ml enthielt, vakzi niert, und 15 Tage später wurden sie mit einer Dosis des gleichen Titers nachvakziniert.

Während der ersten 5 Tage nach der Inokulation wurden die folgenden Beobachtungen gemacht:

a) Lokale Reaktionen

Bestehend aus makroskopischen Beobachtungen der Inoku lationsstelle und Abtastung, wobei das Ausmaß der Ent zündung im Vergleich mit Objekten wohlbekannter Größe notiert wurde.

b) Freßunlust

Bestehend aus makroskopischer Beobachtung der Tiere und Prüfung hinsichtlich Verlust des Verlangens nach Futter.

c) Rektale Temperatur

Messen der rektalen Temperatur 24 Stunden nach Vakzi nierung und 24 Stunden nach Revakzinierung.

Die Resultate, die erzielt wurden, lassen erkennen, daß eine leichte lokale Reaktion bei zweien der Tiere vor handen war, die wegen ihrer geringen Größe nicht ernst war und nach wenigen Tagen verschwand. Freßunlust oder Hyperthermie wurden in keinem Fall beobachtet. Auf dieser Grundlage kann bestätigt werden, daß die Vakzine sicher ist.

Beispiel 5.B Feldversuch in bezug auf Sicherheit und Wirksamkeit

Dieses Experiment wurde auf den nachfolgend aufgeführ ten 5 Farmen durchgeführt. Eine variable Anzahl von Mutterschweinen von jeder Farm wurde über den tiefen IM-Weg mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine MSD Ref. 1, die einen Titer von 10^5.5 TCID₅₀/Dosis des inakti vierten Virus enthielt, vakziniert und 21 Tage später mit einer anderen Dosis des gleichen Titers nachvak ziniert, während die anderen Mutterschweine nicht vakziniert wurden und als Kontrollen verwendet wurden:

Es ist möglich gewesen, zu verifizieren, daß die Vak zine sicher ist, nach der Beobachtung allgemeiner und lokaler Reaktionen. Lokale Reaktionen wurden nur bei 1% der Tiere beobachtet. In Zusammenhang mit den pro duktiven Parametern, die auf den oben aufgeführten Far men beobachtet wurden, wurden keine Variationen beob achtet, verglichen mit ihren klinischen Historien.

Bezüglich einer serologischen Reaktion haben einige Farmen eine Serokonversion in bezug auf die Vakzine, während bei anderen Farmen die Reaktion negativ ist. Dies ist nicht indikativ für eine geringe Höhe an Schutz, da bei den experimentellen Infektionsversuchen in dem Labor seronegative Tiere einer experimentellen Infektion widerstehen (Beispiele 7 und 8).

In Zusammenhang mit der Übertragung mütterlicher Immu nität von vakzinierten Tieren her auf ihre Nachkommen schaft ist ein großer Abfall bei den Antikörpertitern im Alter von einem Monat vorhanden.

Bei vakzinierten und nachvakzinierten Mutterschweinen, die serologisch positiv sind, ist ein großer Abfall bei den Antikörpertitern 2 Monate von der Nachvakzinierung an vorhanden.

Beispiel 6 Verifizierung der Zellimmunität

Fünf trächtige Mutterschweine (Kreuzung Deutsche Land rasse x Large White) von einem Schweinezuchtbetrieb wurden verwendet. Die Tiere wurden zu den Sicherheits ställen des Forschungszentrums gebracht.

Zwei Mutterschweine wurden willkürlich ausgewählt und wurden mit der Vakzine, mit der Bezeichnung MSD Ref. 1, vakziniert. Ein anderes Mutterschwein wurde mit der Vakzine, mit der Bezeichnung MSD Ref. 2, vakziniert. Die 2 verbleibenden Mutterscheine wurden nicht vakzi niert.

Die Mutterschweine wurden über den tiefen IM-Weg mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine MSD Ref. 1 oder der Vakzine MSD Ref. 2, die einen inaktivierten Virustiter 10^5.5 TCID₅₀ enthielten, vakziniert, und 20 Tage später wurden die Mutterschweine mit einer anderen Dosis des gleichen Titers vakziniert.

Danach wurden, zwischen den Tagen 77 und 90 der Träch tigkeit, alle Mutterschweine über den IN-Weg mit 5 ml des Virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, mit einem Titer von 10^5.8 TCID₅₀/ml, infiziert. Zum Zeitpunkt der Infektion wurde verifiziert, daß alle vakzinierten Mutterschweine Antikörper gegen das verursachende Virus der PRRS auf wiesen (positive Serologie). Die Tabelle 7 zeigt die reproduktiven Resultate, die erzielt wurden, als Ganzes:

Tabelle 7

(A): Anzahl der Mutterschweine
(B): Verwendete Vakzine
(C): Gesamtzahl der Ferkel
(D): Anzahl der Ferkel, die lebend geboren wurden, bei guter Gesundheit
(E): Anzahl der Ferkel, die lebend geboren wurden, aber schwächlich waren
(F): Anzahl der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten
(G): Anzahl der totgeborenen Ferkel

Die Resultate, die erzielt wurden, zeigen, daß die Mut terschweine, die mit der Vakzine MSD Ref. 1 (öliges Adjuvans) einer Infektion besser widerstanden als die Mutterschweine, die mit der Vakzine MSD Ref. 2 (wäßri ges Adjuvans) vakziniert wurden; dies könnte bedeuten, daß das Adjuvans eine wichtige Rolle spielt bei dem Aufbau der Zellimmunität.

Beispiel 7 Wirksamkeit bei trächtigen Mutterschweinen

Elf trächtige Zuchtmutterschweine (Kreuzung Deutsche Landrasse x Large White) aus einem Schweinezuchtbetrieb wurden verwendet. Die Tiere wurden zu den Sicherheits ställen des Forschungszentrums gebracht.

Drei Mutterschweine wurden willkürlich ausgewählt (die Mutterschweine No. 57, 63 und 74) und wurden mit der Vakzine, mit der Bezeichnung MSD Ref. 1, vakziniert. Drei Mutterschweine (No. 15, 18 und 23) wurden mit der Vakzine, mit der Bezeichnung MSD Ref. 2, vakziniert und die verbleibenden 5 Mutterschweine (No. 14, 40, 13, 30 und 85) wurden nicht vakziniert.

Die Mutterschweine wurden über den tiefen IM-Weg mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine mit der Bezeichnung MSD Ref. 1 oder der Vakzine MSD Ref. 2, die einen inaktivierten Virustiter von 10^5.5 TCID₅₀/Dosis ent hielt, vakziniert und mit einer anderen Dosis des glei chen Titers 20 Tage später nachvakziniert. Lokale und allgemeine Reaktionen wurden beobachtet.

Die serologische Reaktion bei den Tieren wurde verifi ziert durch den IPMA-Test gemäß dem folgenden Programm:

T₀: Aderlaß und Vakzinierung
T₂₀: Aderlaß und Nachvakzinierung
T₄₂: Aderlaß
T₇₈: Aderlaß und experimentelle Infektion
T₈: Aderlaß nach experimenteller Infektion
T₂₅: Aderlaß nach experimenteller Infektion
T₅₀: Aderlaß nach experimenteller Infektion

Eine experimentelle Infektion wurde in den Sicherheits ställen des Forschungszentrums durchgeführt. Alle Tiere wurden mit der Rate von 5 ml des virulenten Virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 mit einem Titer von 10^5.8 TCID₅₀/ml über den IN-Weg infiziert. Die serolo gische Reaktion wurde notiert wie auch die Anzahl der Ferkel, die durch jedes Mutterschwein lebend geboren und tot geboren wurden. Prä- und Post-Kolostrum-Blut entnahmen wurden bei den Ferkeln vorgenommen, und Lun gen- und Hirnproben wurden den totgeborenen Ferkeln und den Ferkeln, die an verschiedenen Tagen schmerzlos ge tötet wurden, entnommen, zur Isolation des Virus und histologische Schnitte.

Die Resultate, die erzielt wurden, sind in den nachfolgenden Tabellen 8-10 aufgeführt:

Tabelle 8

Serologische Resultate

Tabelle 9

Resultate des Werfens

a: Nicht trächtig
*: Diese Mutterschweine gingen ein wegen übermäßig hoher Umgebungstemperatur. Kaiserschnitt wurde nach 112 Tagen Trächtigkeit vorgenommen.
(A): Datum der Infektion (Tage der Trächtigkeit)
(B): Werfen (Tage der Trächtigkeit)
(C): Gesamtzahl der Ferkel (Kaiserschnitt)
(D): Gesamtzahl der Ferkel (geworfen)
(E): Ferkel, bei normaler Gesundheit geboren
(F): Ferkel, schwächlich geboren
(G): Lebende Ferkel, mit Spreizbeinen geboren
(H): Totgeborene Ferkel (tot)
(I): Totgeborene Ferkel (mumifiziert)
(J): Ferkel, in der ersten Woche tot

Tabelle 10

Serologie der Ferkel

A. Vakzinierte Mutterschweine

B. Kontroll-Mutterschweine (nicht vakziniert)

Schlüssel
a): Diese Mutterschweine gingen ein wegen über mäßig hoher Umgebungstemperatur. Kaiser schnitt wurde durchgeführt nach 112 Tagen Trächtigkeit.
1: Nummer, die jedem Tier zugeordnet wurde.
2: Ferkel, (die Nummer, die jedem Ferkel zuge ordnet wurde, entspricht der Reihenfolge der Geburt).
3: Prä-Kolostrum-Serologie
4: Post-Kolostrum-Serologie
5: Isolierung des Virus
NT: Not tested/Nicht getestet
-: Negativ
+: Positiv
H: Hours/Stunden
NP: Not Pregnant/Nicht trächtig

Aus den Resultaten, die erzielt wurden, ist ersicht lich, daß eine positive Serokonversion gegen das ver ursachende Virus der PRRS vorhanden ist. Darüber hinaus ist ein zufriedenstellendes Verhalten gegen experimen telle Infektion vorhanden, im Vergleich mit den Kon trolltieren, bei denen Tod bei der Mehrzahl der Föten hervorgerufen wurde.

Folglich kann bestätigt werden, daß es sich bei dieser Vakzinierung um eine wirkungsvolle Maßnahme zur Verhin derung der PRRS handelt.

Beispiel 8 Wirksamkeit der Vakzine gegen experimen telle Infektionen mit einem anderen Agens, das für PRRS ursächlich ist (Querschutz)

Dieses Experiment wurde für die Verifizierung der Wirk samkeit der Vakzine, als MSD Ref. 1 identifiziert, bei einem experimentellen Infektionstest vorgesehen, unter Verwendung von 2 pathogenischen Stämmen des Erreger virus der PRRS.

Die Pathogenischen PRRS-Abstammungen, die verwendet wurden, waren:

i) Spanische Abstammung, PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, und
ii) Französische Abstammung, SDRP II 8B, durch Dr. E. Albina des "Laboratoire Central de Recherches Avicole et Porcinef", Ploufragan, Frankreich, zur Verfügung gestellt.

Die Vakzine, die verwendet wurde, war die Vakzine mit der Bezeichnung MSD Ref. 1, deren Formel in Beispiel 5 angegeben ist.

Dreißig Mutterschweine, seronegativ gegen die Verur sacherviren der PRRS, wurden verwendet, in einem repro duktiven Zyklus, der nicht zwischen 10 Tage vor bis 10 Tage nach der Paarung und auch nicht 10 vor bis 10 Tage nach dem Werfen bestand.

Vier Gruppen von Tieren wurden gebildet:

A: 10 Mutterschweine, über den IM-Weg vakziniert und nachvakziniert und über den IN-Weg mit der Spanischen Abstammung PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 des Virus infiziert.
B: 5 Mutterschweine, keiner Vakzinierung unter zogen und über den IN-Weg mit der Spanischen Abstammung PRRS-CY-218-JPD-PS-6-91 infiziert.
C: 10 Mutterschweine, über den IM-Weg vakziniert und nachvakziniert und über den IN-Weg mit der Französischen Abstammung SDRP II 8B infi ziert.
D: 5 Mutterschweine keiner Vakzinierung unter zogen und über den IN-Weg mit der Franzö sischen Abstammung SDRP II 8B infiziert.

Experiment, das durchgeführt wurde
Zwanzig Mutterschweine der oben erwähnten Gruppen A und C wurden mit einer Dosis von 2 ml der Vakzine mit der Bezeichnung MSD Ref. 1 über den tiefen IM-Weg vakzi niert und 21 Tage später mit der gleichen Dosis der Vakzine nachvakziniert.

Danach wurden, zwischen den Tagen 70 und 80 der Träch tigkeit, alle Mutterschweine experimentell infiziert mit:
Gruppen A und B: 5 ml des Virus PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, mit einem Titer von 10^5.8 TCID₅₀/ml, über den IN-Weg, und
Gruppen C und D: 5 ml des Virus SDRP II 8B, mit einem Titer von 10^5.8 TCID₅₀/ml, über den IN-Weg.

Parameter, die bewertet wurden

1. Serologische Reaktion durch IPMA-Analyse, und zwar:
T₀: Aderlaß und Vakzinierung
T₂₁: Aderlaß und Nachvakzinierung
T₄₁: Aderlaß
T_I: Aderlaß und Infektion
T_I+7: Aderlaß nach 7 Tagen nach der Infektion
2. Bewertung rektale Temperatur, lokale Reaktion und allgemeine Reaktion während der 4 Tage nach der Vakzinierung und Nachvakzinierung, oder bis die Temperatur oder klinische Anzeichen, wenn über haupt, verschwanden.
3. Bewertung rektale Temperatur, Futteraufnahme und klinische Anzeichen während der 6 Tage, die der experimentellen Infektion folgten.
4. Ermittlung von Antikörpern im Serum und Isolierung des Virus im Serum und in den Monozyten, aus dem gesamten Blut extrahiert.
5. Reproduktive Parameter zum Zeitpunkt des Werfens, wie beispielsweise die Anzahl der lebend geborenen Ferkel, die Anzahl der tot geborenen oder mumi fizierten Ferkel und die Anzahl der Ferkel, die lebend, aber schwächlich geboren wurden, die in nerhalb der ersten Woche eingingen.
6. Bestimmung des Virusbetrages, der im Serum vor handen ist, mittels Titrierungen an Makrophagen, auf CPE basierend.
7. Bestimmung des Virus in der pleuralen Flüssigkeit und in den Lungen der Ferkel.

Die reproduktiven Parameter-Resultate sind in den Tabellen 11-12 angegeben (Herausforderung mit PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91) und 13-14 (Herausforderung mit SDRP II 8B).

Tabelle 11

(Vakzinierte Mutterschweine)

Herausforderung mit PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91

TL = Total
% der lebenden Ferkel: 68% (75 geboren/51 überleben)

68% Schutz wird festgestellt, wenn man die Ferkel, die lebend geboren wurden, mit den Ferkeln, die 7 Tage überlebten, vergleicht. Die Tatsache, daß eine experi mentelle Infektion viel stärker ist als eine natürliche Infektion auf dem Feld, zu den obigen Resultaten hinzu gerechnet, macht es möglich, vorherzusagen, daß die Aussichten für einen Schutz sogar noch besser sind.

Tabelle 12

(Nichtvakzinierte Mutterschweine)

Herausforderung mit PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91

TL = Total
% der lebenden Ferkel: 9,5% (42 geboren/4 überleben)

Die spanische Abstammung, die für die Infektion verwen det wurde, hat eine extrem hohe pathogenische Potenz (90,5%), da nur 4 Ferkel von den 42 Ferkeln, die gebo ren wurden, die erste Woche überlebten.

Tabelle 13

(Vakzinierte Mutterschweine)

Herausforderung mit SDRP II 8B

TL = Total
% der lebenden Ferkel: 82% (105 geboren/86 überleben)
82% ungefährer Schutz wird festgestellt.

Tabelle 14

(Nichtvakzinierte Mutterschweine)

Herausforderung mit SDRP II 8B

TL = Total
% der lebenden Ferkel: 75,7% (66 geboren/50 überleben)

24,3% ungefähre Sterblichkeit wird festgestellt. Die Pathogenizität der Französischen Abstammung ist sehr schwach (24,3%, im Vergleich zu den Resultaten, die durch die Herausforderung mit der Spanischen Abstammung erzielt wurden (Sterblichkeit 90,5%). Die Resultate, die für die Bewertung der Wirksamkeit verwendet wurden, wenn man vakzinierte und nichtvakzinierte Mutterschwei ne vergleicht, sind im Fall der Französischen Abstam mung nicht sehr signifikant. Jedoch und in jedem Fall wird die Pathogenizität bei den vakzinierten Tieren auf 17,8% reduziert.

Schlüssel zu den Tabellen 11-14
a): Eine andere Krankheit (nicht PRRS), (die Ferkel sind nicht eingeschlossen)
b): Krank, starb vor Infektion.
c): Krank, starb aus einem anderen Grund.
(1): Nummer des Mutterschweins
(2): Gesamtzahl der Ferkel
(3): Anzahl der gesunden Ferkel, die geboren wurden
(4): Anzahl der schwächlichen Ferkel, die geboren
wurden
(5): Anzahl der lebenden, spreizbeinigen Ferkel, die geboren wurden
1(6): Anzahl der totgeborenen Ferkel
1(7): Anzahl der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten.

Claims

1. Vakzine, fähig, das reproduktive und respiratori sche Syndrom bei Schweinen (PRRS = Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) zu verhindern, dadurch ge kennzeichnet, daß sie eine geeignete Quantität von PRRS-Viral-Antigen oder -Virus, spanische Abstammung, inaktiviert, sowie ein geeignetes Adjuvans und optional einen Aufrechterhalter (Preserver) aufweist.

2. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte PRRS-Virus, Spanische Abstammung, die mit PRRS-CV-218-JPD-P5-6-91 bezeichnete Abstammung ist, die bei ECACC mit der Zugangsnummer V93070108 deponiert wurde.

3. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Quantität eines inaktivierten Virus von mindestens 10^5.5 TCID₅₀/Dosis enthält.

4. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das genannte Virus auf einem alveolaren Makro phagennährboden der Schweinelunge entwickelt hat.

5. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das genannte Virus auf einer alveolären Schweinelungen-Makrophagen und ST-Zellen-(ATCC CRL 1746 ST)-Kokultur entwickelt hat.

6. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das genannte Virus auf einer ST-Zellen-(ATCC CRL 1746 ST)-Kultur entwickelt hat.

7. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das genannte Virus an alveolären Schweine lungen-Makrophagen-Hybridzellen, die durch Hybridisie rung mit ST-Zellen verschmolzen wurden, entwickelt hat.

8. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das genannte Virus an alveolären Schweine lungen-Makrophagen-Hybridzellen, die mit der L-14-Zell- Linie (ECACC No. 91012317) oder mit der Zell-Linie Jag-1 verschmolzen wurden, entwickelt hat.

9. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Virus sich an ST-Zellen oder irgend einer anderen Schweine-Zell-Linie, in welche die Gene eingebracht wurden, die für alveoläre Schweinelungen- Makrophagen-Membranrezeptoren für das PRRS-Virus codie ren, entwickelt hat.

10. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Adjuvans ein öliges Adjuvans ist.

11. Vakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Öladjuvans aus einer Mischung von Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 besteht.

12. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Emulsion ist mit (i) einer wäßrigen antigenischen Phase, die das inaktivierte Virus enthält, und (ii) einer öligen Phase, die das Adjuvans enthält.

13. Vakzine nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die genannte Emulsion aus 53 Volumenprozent einer wäßrigen Phase, die das inaktivierte Virus ent hält, und 47 Gewichtsprozent einer öligen Phase, die das Adjuvans enthält, zusammensetzt.

14. Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, zellulare Immunität in dem vakzinierten Tier zu bewirken.

15. Vakzine nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Zellreaktionsverstärkungssubstanzen (CRP = Cell Response Potentiation) enthält, welche die Zellimmunwirkung verstärken, wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, Zell-Necrose- Faktor, und ähnliche Substanzen.

16. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein wäßriges Adjuvans ist.

17. Vakzine nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Zellreaktionsverstärkungssubstanzen (CRP) enthält, welche die Zellimmunwirkung hervorrufen, wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, Zell-Necrose-Faktor, und ähnliche Substanzen.

18. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein Adjuvans ist, das eine Zell reaktion modulieren und immunostimulieren kann, wie beispielsweise MDP, ISCOM oder Liposome.

19. Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, Rückkehr zur Pflege bei dem vakzinierten Tier zu vermeiden.

20. Vakzine, die fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen (PRRS) zu verhin dern, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Emulsion ist, die aufweist:

a) 53% einer wäßrigen Phase, die das PRRS-Viral-Antigen in DMEM-Nährbodenmedium, Spanische Abstam mung, inaktiviert, mit einer Mindestkonzentration von 10^5.5 TCID₅₀/Dosis, enthält, und
b) 47% einer öligen Phase, die eine Mischung aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 ent hält.

21. Vakzine nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte virale Antigen das PRRS-Virus, Spani sche Abstammung, ist, mit der Bezeichnung PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, das bei ECACC mit der Zugangsnummer V93070108 deponiert wurde.

22. Vakzine nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, Zellimmuni tät bei dem vakzinierten Tier zu bewirken.

23. Vakzine nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich Zellreaktionsverstärkungssubstanzen (CRP) enthält, welche die Zellimmunwirkung verstärken, wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, Zell-Necrose-Faktor, und ähnliche Substanzen.

24. Vakzine nach einem der Ansprüche 20 bis 23, da durch gekennzeichnet, daß sie fähig ist, Rückkehr zur Pflege bei dem vakzinierten Tier zu vermeiden.

25. Bi- oder multivalente Vakzine, fähig, das repro duktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen und eine andere oder andere Infektionen bei Schweinen zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine geeig nete Quantität des PRRS-Viral-Antigens oder -Virus, Spanische Abstammung, inaktiviert, plus ein oder mehre re Schweine-Pathogene, enthält.

26. Vakzine nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte virale Antigen das PRRS-Virus, Spanische Abstammung, ist, mit der Bezeichnung PRRS-CV-218-JPD-P5-6-91, das bei ECACC mit der Zugangsnummer V93070108 deponiert wurde.

27. Vakzine nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Schweine-Pathogen einschließt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Actinoba cillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Porcine Parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelo thrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory (respiratorisches) Coronavirus, Rotavirus besteht, oder gegen die Patho gene, welche die Aujeszkysche Krankheit, Schweine-In fluenza oder die ansteckende Gastroenteritis hervor rufen.

28. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine, die fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen (PRRS) zu verhindern, enthaltend eine ge eignete Quantität des PRRS-Virus, Spanische Abstammung, inaktiviert, plus ein geeignetes Adjuvans, und optional ein Vorbeugungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

1) das Wachstum des verursachenden Virus von PRRS, Spanische Abstammung, in einem geeigneten Zell system,
2) das Sammeln des Virus aus dem genannten Zellsy stem, wenn ein Mindesttiter von 10^5.5 TCID₅₀/ml erreicht wurde,
3) die Inaktivierung des Virus durch physikalische oder chemische Methoden, und
4) das Mischen des inaktivierten Virus mit dem Adju vans und dem Vorbeugungsmittel

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich net, daß das genannte PRRS-Virus, Spanische Abstammung, das Virus ist, mit der Bezeichnung PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, das bei ECACC mit der Zugangsnummer V93070108 deponiert wurde.

30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich net, daß das genannte Virus sich entwickelt hat an:

i) einer alveolären Schweinelungen-Makrophagenkultur, oder an
ii) einer Kokultur von alveolären Schweinelungen-Makrophagen- und ST-Zellen (ATCC CRL 1746 ST), oder an
iii) einer ST-Zell-Kultur (ATCC CRL 1746 ST), oder an
iv) alveolären Schweinelungen-Makrophagen-Hybridzel len, mit den ST-Zellen verschmolzen, oder an
v) alveolären Schweinelungen-Makrophagen-Hybridzel len, mit der L-14-Zell-Linie (ECACC No. 91012317) oder mit der Zell-Linie Jag-1 verschmolzen, oder an
vi) ST-Zellen oder an irgendeiner anderen Schweine-Zell-Linie, in welche Gene eingebracht wurden, die für alveoläre Schweinelungen-Makrophage-Membran rezeptoren für das PRRS-Virus codieren.

31. DNA-Sequenz des Virus, das Erreger von PRRS, Spa nische Abstammung, ist, im wesentlichen die in den Fig. 1 bis 5 angegebenen DNA-Sequenzen aufweisend.

32. Virus, Erreger von PRRS, Spanische Abstammung, dessen Charakteristiken im wesentlichen jenen des Virus entsprechen, mit der Bezeichnung PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91, das bei ECACC mit der Zugangsnummer V93070108 depo niert wurde.

33. Virus nach Anspruch 32, inaktiviert, fähig, bei der Formelbildung von Vakzinen verwendet zu werden, die fähig sind, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen zu verhindern.

34. Virus nach Anspruch 32, inaktiviert, fähig, bei der Formelbildung von bi- oder multivalenten Vakzinen verwendet zu werden, die fähig sind, das reproduktive und respiratorische Syndrom bei Schweinen und andere Infektionen bei Schweinen zu verhindern.