DE19549523C2 - Diagnostik-Kits, die rekombinante PRRSV Proteine enthalten - Google Patents
Diagnostik-Kits, die rekombinante PRRSV Proteine enthaltenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf Diagnostik-Kits, die mindestens
eins der rekombinanten Proteine des Erregers des "porcine
reproductive and respiratory syndrome" (PRRS) ("reproduktives und
respiratives Syndrom bei Schweinen") aufweisen.
In Spanien wurden die ersten Fälle respiratorischer
Veränderungen bei Ferkeln in einer 300-Ferkel-Partie,
die aus Deutschland importiert wurde, Mitte Januar 1991
festgestellt, (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, No. 11,
1991). Kurz danach wurde bei zwei Zuchtherden auf zwei
landwirtschaftlichen Betrieben, die sich in der Nähe der
Herde befanden, in der das anfängliche Problem aufgetre
ten war, eine Krankheit festgestellt, die durch eine ab
normal hohe Zahl von Abortionen in der letzten Phase der
Trächtigkeit sowie 70% Sterblichkeit bei Ferkeln ge
kennzeichnet war.
Die Ursache dieser epizootischen Ausbruchereignisse war
nicht bekannt, aber ihre Symptomatologie war den klini
schen Anzeichen ähnlich, die für eine Schweinekrankheit
beschrieben worden war, die zuerst in Europa in
Deutschland festgestellt wurde (1990) und mit der Krank
heit, die "Mystery Swine Disease" genannt wurde und in
den Vereinigten Staaten und Kanada 1987 festgestellt
wurde, (Hill, Proceedings of the Mystery Swine Disease
Committee Meeting, 06. Oktober 1990, Denver, USA). Diese
Krankheit beeinträchtigt trächtige Mutterschweine, wobei
bei ihnen Appetitlosigkeit, Abortionen, Totgeburten, mu
mifizierte Föten, schwächliche Ferkel, die wenige
Stunden nach dem Werfen eingingen, und respiratorische
Probleme nach dem Werfen, unter anderen, hervorgerufen
wurden. Derzeit ist die Krankheit als "Porcine Reproduc
tive and Respiratory Syndrome" (PRRS) bekannt, obwohl
man sie zuvor bezeichnete als "Blue-eared Pig Disease",
"Mysterious Reproductive Syndrome" (MRS), "Swine Infer
tility and Respiratory Syndrome" (SIARS) und "Porcine
Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" (PEARS).
Derzeit ist bekannt, daß der Erreger dieser Krankheit
ein Virus ist, das PRRS-Virus (PRRSV) genannt wird.
Dieses Virus wurde erstmals in den Niederlanden durch
eine Gruppe von Forschern von CDI/Lelystad isoliert, die
es als Lelystad-Virus (LV) bezeichnete, (Wesvoort, G.,
et al., Vet. Quarterly, Vol. 3, 121-130, 1991). Einige
Monate später wurde ein anderes Isolat in Spanien er
langt durch Laboratorios Sobrino/Cyanamid, (Plana et
al., Vet. Microbiol., 33: 203.211, 1992), das in dieser
Beschreibung als PRRS-Olot identifiziert werden wird.
Von jenem Zeitpunkt an sind neue Isolate dieses Virus
beschrieben worden, (EP Requests No. 0 529 584 A2, PCT
Requests No. WO 93/06211 und No. WO 93/07898).
Die strukturellen Charakteristika des PRRS-Virus sind in
zwei neueren Publikationen beschrieben worden:
- a) Meulenberg, J. J. M., et al., "Lelystad Virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV". Virology, 192: 62-72, (1993), und
- b) Cozelmann, K.-K., et al., "Molecular charac terization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the Arterivirus group". Virology, 193: 329-339, (1993).
Das PRRS-Virus hat eine Größe von 50-60 nm, mit einer
Hülle von ungefähr 30-35 nm, in dem Nucleocapsid enthal
ten, und ein einziges RNA-Molekül als genomisches Mate
rial. Auf der Grundlage dieser morphologischen Daten
wurde das PRRSV zunächst als ein Togavirus klassifi
ziert, obwohl es, auf seiner genomischen Struktur und
seinen Transkriptions- und Translationsmechanismen ba
sierend, näher an der Coronaviridae-Familie war. Kürz
lich wurde, und auf Differenzen und/oder Ähnlichkeiten
beim Vergleich mit den früheren Gruppen basierend, seine
Klassifizierung vorgeschlagen innerhalb einer neuen
Familie, die mit Arteriviridae bezeichnet wurde,
(Cavanagh, D., et al., Arch. Virology, 1994). Zusammen
mit dem PRRSV sind in dieser Gruppe eingeschlossen die
Arteritisviren bei Pferden (EAV), das Milchdehydroge
nasevirus (LDV) und das hemorrhagische Fiebervirus bei
Affen (SHFV).
Kürzlich wurden das gesamte Lelystad-Virus-(LV)-Genom
(Meulenberg et al., oben aufgeführt), ein genomisches
Segment des Tübingen-(Deutschland)-PRRS-Virusisolats
(TV) (Cozelmann et al., oben aufgeführt) und ein Segment
des PRRS-Olot-Virus (spanischer Patentanspruch No. ES
P9301973, entspricht DE 44 32 336)
geklont und sequenziert. Auf der Grundlage all
der Ergebnisse, die erzielt wurden, kann festgestellt
werden, daß das PRRSV-Genom aus einem Einzelstrang-RNA-
Molekül besteht, das am 3'-Ende einen Poly-A-Schwanz
enthält. Die Länge des Genoms ist ungefähr 15000 "base
pairs" (bp) (Basispaare), und in seiner Struktur enthält
es sieben "Open Reading Frames" (ORFs) (offene Ablese
rahmen), die für die viralen Proteine kodieren. Die ORFs
sind als ORF1 bis ORF7 bezeichnet worden, und sie zeigen
kleine überlappende Segmente zwischen sich. Es ist vor
gebracht worden, daß die Synthese der viralen Proteine
aus einer Gruppe subgenomischer Transkripte unterschied
licher Länge (mRNA) erstellt wird, aber mit ähnlichem 3'
polyadenilierten Ende, und einer 5'-Führersequenz, die
aus der nichtkodierenden 5'-Endsequenz herrührt. Diese
Form eines viralen Proteinausdrucks wurde als inein
andergesetzte mRNAs bezeichnet und ist zuvor für
Coraniviren beschrieben worden (Spaan, W. J. M.,
Cavanagh, D., und Horzineck, M. C., J. Gen. Virol., 69:
2939-2952, 1988). Basierend auf der Lelystad-(LV)- und
Tübingen-(TV)-PRRSV-Viralisolat-Nukleotidsequenz und
durch Homologie mit dem, was bei anderen Arteriviren
beobachtet worden ist, ist vorgebracht worden, daß bei
dem viralen Genom, ORF1 (a und b) für virale Polymerase
und Replicase kodieren. Die ORFs 2 bis 6 würden für die
Viralhüllenproteine kodieren, und ORF7 würde für das
Nucleocapsidprotein kodieren. Virale Replicase und Poly
merase sind großbemessene Proteine, 260 bzw. 163 kDa,
und beide von diesen enthalten drei mögliche Glyko
silationsstellen. Die Hüllenproteine (ORFs 2 bis 6), am
3'-Ende angeordnet, sind klein, zwischen 30 und 19 kDa.
Alle von diesen enthalten mehr als zwei mögliche Glyko
silationsstellen, insbesondere ORF3, der 7 Stellen ent
hält. Alle diese Proteine enthalten hydrophobische Se
quenzen an den Amino-(N-)- und Carboxy-(C-)-Terminal
enden, die als Führersequenz und Membrananker funktio
nieren könnten. Allgemein sind hydrophobische Pro
teine gemäß ihrer Lokation mit einer Membran assozi
iert. ORF6 sollte hervorgehoben werden, mit 3 hydro
phobischen Segmenten, innerhalb der 90 Aminosäurereste
an dem N-Terminalende angeordnet. Andererseits ist das
Protein, durch ORF7 kodiert, möglicherweise dem viralen
Nucleocapsid entsprechend, extrem basisch mit Arginin-,
Lysin- und Histidinresten an dem N-Terminalende. Die
Aminosäuresequenzen der LV- und TV-Viralpolymerase, die
strukturellen Proteine und Nucleocapsid zeigen eine
Identität von zwischen 29% und 67% im Vergleich mit
dem LDV-Virus und zwischen 20% und 36% im Vergleich
mit dem EAV-Virus. Dies legt nahe, daß die Evolution des
PRRS-Virus enger am LDV als am EAV ist.
Die durch PRRSV hervorgerufene Krankheit ist für erheb
liche Verluste in der Schweine-Industrie verantwortlich.
Aus diesem Grund sind Vakzinen, welche die durch das
PRRSV hervorgerufene Infektion zu verhindern vermögen,
entwickelt worden.
Im allgemeinen handelt es sich bei den Vakzinen gegen
das bekannte PRRSV (WO
92/21375, WO 93/06211, WO 93/07898 und ES P9301973) um
Vakzinen, die aus Viren gewonnen wurden, die an Makro
phagen wuchsen und anschließend inaktiviert wurden. Die
Patentanmeldung ES P9301973 sieht eine Vakzine vor, die
fähig ist, das reproduktive und respiratorische Syndrom
bei Schweinen (PRRS) zu vermeiden. Es hat sich gezeigt,
daß die Vakzine wirksam ist beim Vermeiden reproduktiver
Veränderungen bei Mutterschweinen, wie beispielsweise
das Werfen totgeborener, mumifizierter oder lebender,
aber schwächlicher Ferkel, Wiederholung von Estrus und
ähnlicher Probleme, durch den Viruserreger von PRRS her
vorgerufen. Ferner wurde verifiziert, daß die Vakzine
zellulare Immunität in den vakzinierten Tieren hervor
ruft. Die genannte Vakzine enthält eine geeignete Menge
von PRRS-Viralantigen, spanische Abstammung (PRRS-Olot),
inaktiviert, zusammen mit einem Adjuvans und einem
Schutzmittel.
Die vorliegende Erfindung sieht
neue PRRSV-Diagnostiksysteme oder -Kits vor,
welche die Verwendung enzymatischer Immunprüfungstech
niken (ELISA) mit sich bringen, die rekombinante PRRSV-
Proteine verwenden.
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen mittels
"Genetic Engineering" ist eine Tatsache, die früher be
schrieben worden ist. Zahlreiche Ausdrucks- und Herstel
lungssysteme rekombinanter Proteine sind bekannt. Eines
der effektivsten Systeme für die Großproduktion rekom
binanter Proteine basiert auf der Replikation rekombi
nanter Baculoviren, die von dem "Autographa californica
nuclear polyhedrosis virus" (AcNPV), in Insektenzellen
in einer Kultur, abstammen. Die Beschreibung der Baculo
virus-Ausdrucksstechnik ist in den folgenden Artikeln
beschrieben:
- a) LucKow, V. A., & Summers, M. D., "Trends in the
development of baculovirus expression vectors".
Bio/Technology, 6: 47-55, (1988), und - b) Bishop, D. H. L., "Baculovirus expression
vectors".
Seminare in VIROLOGY, 3: 253-264, (1992).
Die Erfindung sieht ein Diagnostik-Kit vor, um das
Vorhandensein von Antikörpern zu ermitteln, die das
PRRSV in einer biologischen Probe von Schweinen (z. B.:
Blut, Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit oder Milch)
spezifisch erkennen. Das Kit weist mindestens ein rekom
binantes PRRSV Protein auf
und adäquate Feststellungsver
fahren.
Die Erfindung sieht auch ein Diagnostik-Kit vor für die
Feststellung des Vorhandenseins eines Antigens (PPRSV)
in einer biologischen Probe von Schweinen (z. B.: Blut,
Serum, Sputum, Speichelflüssigkeit, Milch oder Gewebe).
Das Kit weist mindestens einen Antikörper auf, der das
PRRSV spezifisch erkennt, durch Immunisieren der Tiere
erhalten, mit mindestens einem rekombinanten Protein von PRRSV
und
adäquate Feststellungsmittel.
Fig. 1 zeigt die konsekutive Sequenz der 3383 bp, aus
dem PRRS-Olot-Isolat geklont.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz, die den Proteinen
entspricht, die durch ORF2 (Fig. 2A), ORF3
(Fig. 2B), ORF4 (Fig. 2C), ORF5 (Fig. 2D),
ORF6 (Fig. 2E) und ORF7 (Fig. 2F) kodiert
sind.
Fig. 3 zeigt die verschiedenen Extensionen der Klone
pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132,
pPPRS-146, pPPRS-147, pPPRS-148, pPRRS-153 und
pPRRS-3, im Vergleich mit LV, sowie die ORFs,
die in jedem einzelnen von diesen enthalten
sind. In dieser Figur wird Bezug genommen auf
das PRRSV-Genom (a), Größe im Kb (b) und Anzahl
der Klone (c).
Fig. 4 zeigt den pPRRS-3-Klon, der das Gen des
Proteins, durch ORF2 kodiert, enthält.
Fig. 5 zeigt den pPRRS-121-Klon, der das Gen des
Proteins, durch ORF3 kodiert, enthält.
Fig. 6 zeigt den pPRRS-146-Klon, der das Gen des
Proteins, durch ORF4 kodiert, enthält.
Fig. 7 zeigt den pPRRS-132-Klon, der das Gen des
Proteins, durch ORF5 kodiert, enthält.
Fig. 8 zeigt den pPRRS-8-Klon, der die Gene des
Proteins, durch ORF6 und ORF7 kodiert, enthält.
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse aus einer Antigentitra
tion durch ELISA (Absorbanz überwacht bei 405
nm). In der Figur wird Bezug genommen auf die
Antigentitration (a), die Absorbanzwerte, bei
405 nm abgelesen (b), und die Antigenverdün
nungen [in Einheiten von 1/] (c).
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse aus der Titration durch
ELISA, eines PRRS-Feldserums, in einem infi
zierten Tier erzielt. Die Figur bezieht sich
auf die Titration des Serums (a), die Absor
banzwerte, bei 405 nm abgelesen, (b), und die
Serumverdünnungen [in Einheiten von 1/]
(c).
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse, aus einem Probenahme
experiment erzielt, mit einigen Dutzend Feld
sera. Die Figur bezieht sich auf die Titration
der Sera (a), die Absorbanzwerte, bei 405 nm
abgelesen, (b) und die Sera (c).
Unser Labor hat in den letzten Jahren Forschungsarbeiten
hinsichtlich des PRRS-Erregers geleistet. Die hauptsäch
liche Folge hiervon war die Isolation des Virus, das mit
PRRS-CY-JPD-P5-6-91 bezeichnet wurde. Es wurde bei der
ECACC (mit der Zugangsnummer V93070108) deponiert, und
eine Vakzine wurde gegen das PRRSV entwickelt, die das
inaktivierte Virus enthielt (Patentanmeldung ES
P9301973).
Seitdem waren unsere Forschungsbemühungen auf die Isola
tion und das Klonen des PRRSV-(PRRS-CY-JPD-P5-6-91)-
Genoms gerichtet, das in dieser Beschreibung mit PRRS-
Olot bezeichnet ist.
Zu diesem
Zweck ist ein Genomsegment des genannten PRRS-Olot-
Genoms geklont worden. Das geklonte Fragment entspricht
dem 3'-Viralgenom und stellt eine konsekutive Sequenz
von 3.3838 bp dar. Dieses Segment enthält die sechs
"Open Reading Frames" (offene Ableserahmen), die den für
das LV und das TV beschriebenen ORFs 2 bis 7 ent
sprechen. Sie kodieren für die strukturellen Proteine
des Virus (Nucleocapsid und Hülle), die möglicherweise
mit der viralen Antigenizität und Immunogenizität
zusammenhängen. Die Proteine, die durch PRRS-Olot ORFs 2
bis 7 kodiert sind, sind den entsprechenden LV- und
TV-Proteinen ähnlich. Ihre Charakteristika sind in
Tabelle 1 zusammengefaßt, in der, in Relation zu jedem
ORF, die relativen Positionen der Nukleotide, die Anzahl
der Basispaare (bp), die Anzahl der Aminosäuren (Aac),
das Molekulargewicht jedes Proteins (in KDa) und die
Glykosilationsstellen angegeben sind.
Fig. 1, die dieser Beschreibung beigefügt ist, zeigt
die vollständige konsekutive Sequenz der 3.383 bp des
geklonten Fragments entsprechend dem 3'-Ende des PRRS-
Olot-Viralgenoms. Diese Nukleotidsequenz zeigt 95%
Homologie im Vergleich mit den entsprechenden Sequenzen
der LV- und TV-Isolate. Diese zwei letzten Isolate zei
gen, unter sich, 99% Homologie. Die Veränderungen bei
der Nukleotidsequenz des PRRS-Olot-Isolats finden sich
über die gesamte Sequenz, sind aber besonders im 5'-Ende
konzentriert. Im Vergleich mit LV sei auf den Wegfall
der drei Nukleotide an Postion 1860 des PRRS-Olot beson
ders hingewiesen.
Die Fig. 2 (2A-2F) dieser Beschreibung zeigt die Amino
säuresequenzen der Proteine, die durch die ORFs 2 bis 7
des PRRS-Olot-Virus kodiert sind. Auf Proteinebene ist
99% Homologie festzustellen zwischen PRRS-Olot und LV
ORF7, wie für ein Nucleocapsid-Viralprotein erwartet,
und daher das konserviertere. Der Prozentsatz an Homolo
gie für den Rest der Proteine beläuft sich zwischen 93%
für die ORFs 3, 4 und 5, wobei ein Wert von 96,5% für
die ORFs 2 und 6 erreicht wird. Alle von diesen lassen
Glykosilationsstellen erkennen ähnlich jenen, die für LV
beschrieben wurden, außer für ORF4 des PRRS-Olot-Virus,
das eine Extraglykosilationsstelle aufweist. In bezug
auf die oben aufgeführten Veränderungen bei den PRRS-
Olot-Protein-Aminosäuren sind 50% der Veränderungen zu
chemisch ähnlichen Aminosäuren vorhanden, während der
Rest der Veränderungen zu unterschiedlichen Aminosäuren
vorhanden ist. Wie für LV, ausgenommen ORF7, erwähnt,
stellt der Rest der Proteine ein hohes Maß an Hydropho
bizität dar, möglicherweise in Übereinstimmung mit ihrer
Assoziation zu Membranen, da sie Viralhüllenproteine
sind.
Rekombinante Proteine entsprechend dem Ausdruck PRRS-
Olot ORFs 2 bis 7 können in einem entsprechenden Aus
druckssystem produziert werden und vorteilhaft in einem
Ausdruckssystem rekombinanter Baculoviren, in einer per
missiven Gastzellenkultur vervielfacht. Das globale Ver
fahren für die Erlangung dieser rekombinanten Proteine
weist im Grunde die folgenden allgemeinen Stufen auf:
- A) Vorbereitung der cDNA-Sequenz, die in ein Baculo virus einzufügen ist, und
- B) Erlangung rekombinanter Baculoviren, welche die rekombinanten Proteine ausdrücken.
Diese allgemeinen Stufen sind wiederum in andere Unter
stufen unterteilt. In dieser Weise weist die Präparation
der cDNA-Sequenz, die einzufügen ist, folgende Unter
stufen auf:
- 1. I.a Isolation und Purifikation des PRRS-Olot-Virus;
- 2. I.b Isolation des viralen RNA des PRRS-Olot-Virus, und
- 3. I.c Synthetisieren der cDNA aus der PRRS-Olot-Genom- RNA.
Andererseits weist die Erlangung rekombinanter Baculo
viren, welche die rekombinanten Proteine ausdrücken, die
den PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7 entsprechen, folgende
Unterstufen auf:
- 1. II.a Präparation des PRRS-Olot-ORF-Gens, das einzufü gen ist.
- 2. II.b Einfügen des genannten Gens in einen Baculovirus- Transfer-Vektor.
- 3. II.c Transfektion permissiver Gastzellen mit dem genannten Transfer-Vektor, dem das entsprechende PRRS-Olot-ORF-Gen eingefügt wurde.
- 4. II.d Selektion der rekombinanten Baculoviren, die das rekombinante Protein ausdrücken, das dem einge setzten ORF entspricht.
Die Charakterisierung der rekombinanten Baculoviren und
die Analyse und Purifikation der rekombinanten Proteine
wird dann durchgeführt.
Alle diese Stufen werden nachfolgend in dieser Beschrei
bung im einzelnen beschrieben.
Das Verfahren, das für die Erlangung der rekombinanten
Proteine, die durch diese Erfindung vorgesehen werden,
angewendet wird, beginnt mit der Isolation und Purifika
tion des PRRSV, spezifisch PRRS-Olot, gemäß dem in Bei
spiel 1 beschriebenen Protokoll. Sobald das PRRS-Olot
isoliert und purifiziert worden war, wurde die virale
RNA isoliert, und zu diesem Zweck wurde ein im Handel
erhältliches Kit (Pharmacia) verwendet, das eine Methode
anwendet, die auf der Selektion und Purifikation der
viralen RNA basiert, die eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende
enthält (Beispiel 2). Die erhaltene RNA wurde in neutra
len Agarose-Gels mit 0,7% analysiert, durch Beflecken
mit Ethidiumbromid, und nur ein einziges Materialband
mit einem Molekulargewicht zwischen 5000 und 23000 bp
wurde festgestellt.
Danach wurde die cDNA, die der 3'-End-Viral-RNA ent
spricht, synthetisiert (Beispiel 3), mit einem im Handel
erhältlichen Kit (Boehringer), durch eine Strategie, die
einen Vorteil aus dem Vorhandensein eines Poly(A)-
Schwanzes zieht und ein Oligo d(T) als Extensionsprimer
verwendet, der fähig ist, mit einem umgekehrten Trans
kriptase-Enzym verlängert zu werden, und die cDNA-Mole
küle synthetisiert. Um die 3'-stromaufwärts-RNA-Regio
nen zu klonen, wurde ein Oligonukleotid an eine spezi
fische virale Genomsequenz, die ungefähr bei 2500 bp vom
3'-Ende her angeordnet ist, verwendet. Eine zweite Syn
these wurde durchgeführt, unter Verwendung eines Oligo
nukleotids von 20 Nukleotiden statt des Oligo d(T)12
(Beispiel 3.1). Eine cDNA-Synthese wurde verifiziert und
quantifiziert durch Zählung der Radioaktivität, die in
dem synthetisierten Material vorhanden ist, und Elektro
phorese in alkalischen und neutralen Agarose-Gels. Da
nach wurde das Klonen und Sequenzieren der cDNA durchge
führt (Beispiel 3.2). Zu diesem Zweck wurde als erstes
eine Größenselektion der synthetisierten cDNA-Fragmente
von zwischen 1000 und 5000 nt (Nukleotide) durchgeführt.
Die purifizierte cDNA wurde geklont in den stumpfen
Enden im Vektor pMTL25. Die Analyse der PRRSV-positiven
Klone wurde mittels Plasmid-DNA-Präparationen und Dar
stellung bzw. Zuordnung der Restriktionsstellen, auf der
Grundlage der LV-Sequenz, vorgenommen. Nur 9 der 300
analysierten Plasmide waren positiv und enthielten Ein
fügungen zwischen 800 und 2600 bp. Die definitive Veri
fikation der Authentizität dieser cDNA-Klone wurde durch
ihr direktes Sequenzieren durchgeführt, unter Verwendung
der Dideoxys-Methode, auf doppelsträngige Plasmide ange
wendet.
Die Majorität der erhaltenen positiven PRRS-Klone ent
hielt ein gemeinsames Poly(A)-Ende und unterschiedliche
5'-Enden. Die Klone wurden bezeichnet mit pPRRS-8,
pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147,
pPRRS-148 und pPRRS-153.
Der Klon pPRRS-3 wurde aus der zweiten Synthese extra
hiert.
Um die rekombinanten Baculoviren zu erhalten, welche die
Gene der Proteine ausdrücken, durch PRRSV-Olot ORFs 2
bis 7 kodiert, wurde dem folgenden Verfahren allgemein
und separat gefolgt:
Zuerst wurde das Gen aus jedem einzufügenden ORF präpa
riert, ausgenommen das ORF3-Gen, das keine vorherige
Präparation benötigte. Für die Präparation dieser Gene
und abhängig von jedem besonderen Fall wurden die
pMTL25-, pMTL24- und pMTL22-Plasmide verwendet, bevor
sie in Baculovirus-Transfer-Vektoren transferiert wur
den. Die den ORFs 2 bis 7 entsprechenden Gene wurden aus
den Klonen erlangt, die vorher erlangt worden waren.
Nach sukzessiven Manipulationen ließen sie neue rekombi
nante Plasmide entstehen. Die rekombinanten Plasmide,
welche die Gene enthielten, jedem eingefügten ORF ent
sprechend, wurden purifiziert gemäß der alkalischen
Lösungstechnik, und wurden gekennzeichnet durch Dar
stellen mit Restriktions-Endonucleasen und Sequenzieren
der Einfügungsregionen. Die neuen Vektoren, die erzielt
wurden, wurden mit pPRRS-ORFN bezeichnet, wobei N die
Anzahl jedes ORF (N = 2 bis 7) bedeutet.
Dann wurde jedes ORF-Gen in einen geeigneten Trans
fer-Vektor geklont. Der Transfer-Vektor, der verwendet
wurde, war pAcYM1 (Matsuura et al., J. Gen Virol. 68,
1233-50). Nach sukzessiven Manipulationen entstanden
neue rekombinante Plasmide, wobei jeweils eins von
diesen das eingefügte ORF-Gen enthielt. Die rekom
binanten Plasmide, die erzielt wurden, wurden purifi
ziert gemäß der alkalischen Lösungstechnik und ge
kennzeichnet durch Darstellen mit Restriktions-Endonu
cleasen. Die Einfügungsenden wurden sequenziert, um die
richtige Einfügungsregionsequenz zu verifizieren. Die
neuen Transfer-Vektoren, die erzielt wurden, wurden ana
lysiert, um zu verifizieren, daß die eingefügten Gene
die richtige Ausrichtung für ihren Ausdruck durch den
AcNPV-Virus-Polyhedrin-Promoter hatten. Die Transfer-
Vektoren, die erlangt wurden, waren:
Bezeichnung | |
ORF | |
pPRRS-Bac8 | 2 |
pPRRS-Bac2 | 3 |
pPRRS-Bac9 | 4 |
pPRRS-Bac3 | 5 |
pPRRS-Bac5 | 6 |
pPRRS-Bac7 | 7 |
Spodoptera-Frugiperda-Zellen, Klon Sf 9, wurden dann
transfektiert bzw. transfiziert mit Mischungen purifi
zierter, infektiöser DNA des AcRP23-lacZ-Stammvirus und
des entsprechenden Transfer-Vektors. Sobald diese Trans
fektion durchgeführt worden war, wurden die
rekombinanten Baculoviren identifiziert durch Plaque-
Farben-Phenotyp-Untersuchung nach dem Beizen der viralen
Nachkommenschaft mit X-Gal und dann purifiziert.
Die rekombinanten Baculoviren, die erzielt wurden, wur
den in der European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG,
(Vereinigtes Königreich), deponiert.
Die Beispiele 4 bis 9 beschreiben im einzelnen die Er
langung der rekombinanten Baculoviren, welche die Gene
ausdrücken, die entsprechend durch ORFs 2 bis 7 kodiert
sind.
Die PRRS-Olot-ORF-2-bis-7-Rekombinant-Proteine können zu
Diagnosezwecken verwendet werden, um das Vorhandensein
spezifischer PRRSV-Antikörper festzustellen (Beispiel
12), und um das Vorhandensein von Antigen (PRRSV) fest
zustellen, mittels Antikörpern, die das PRRSV spezifisch
identifizieren, durch Immunisierung von Tieren mit min
destens einem rekombinanten Protein, entsprechend einem
der PRRS-Olot-ORFs 2 bis 7.
Für die Präparation der antigenen Phase wurden Insek
tenzellen - vorzugsweise Zellen der Spodoptera frugi
perda - mit den diversen rekombinanten Baculoviren
infiziert, die fähig sind, die rekombinanten Proteine,
die den PRRSV ORFs 2 bis 7 entsprechen, zu produzieren,
und unter Bedingungen, die für den Ausdruck der genann
ten Proteine geeignet sind, inkubiert. Unmittelbar da
nach wurden die Zellen gesammelt, gewaschen, in einem
geeigneten Puffer resuspendiert und dann für die Präpa
ration der vorgenannten rekombinanten Vakzinen verwen
det.
Bei einer spezifischen Realisierung setzt sich die
antigene Phase aus einem Homogenat von Insektenzellen
zusammen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert
wurden, die ein einzelnes rekombinantes PRRSV-Protein,
wie, vorzugsweise, ORF3, ORF5 und ORF7 ausdrücken, (Bei
spiel 13). Bei einer anderen spezifischen Realisierung
setzt sich die antigene Phase aus einem Homogenat einer
Mischung von Insektenzellen zusammen, die mit unter
schiedlichen rekombinanten Baculoviren infiziert wurden,
wobei jedes von diesen ein unterschiedliches rekombinan
tes PRRSV-Protein ausdrückt, wie beispielsweise eine
Mischung aus Insektenzellen, die mit den rekombinanten
Baculoviren infiziert wurden, die, zum Beispiel, die
Proteine ausdrücken, die ORF3, ORF5 und ORF7 ent
sprechen.
Im allgemeinen wurden Vakzinen formuliert, die als anti
gene Phase einen Betrag von etwa 50 × 106 Insektenzellen
enthalten, die mit Baculoviren infiziert wurden, wodurch
das betreffende rekombinante Protein ausgedrückt wurde.
Wenn die Vakzine diverse rekombinante Proteine enthält,
setzt sich die antigene Phase aus einer Menge von etwa
50 × 106 Insektenzellen zusammen, die mit Baculoviren ge
mäß dem betreffenden rekombinanten Protein infiziert
wurden, d. h., für eine Formulierung einer Vakzine, wel
che die Proteine enthält, die den ORFs 3, 5 und 7 ent
sprechen, setzt sich die antigene Phase zusammen aus
etwa 50 × 106 Insektenzellen, die mit Baculoviren infi
ziert wurden, die das ORF3 rekombinante Protein aus
drücken, 50 × 106 Insektenzellen, die mit Baculoviren in
fiziert wurden, die das ORF5 rekombinante Protein aus
drücken, und 50 × 106 Insektenzellen, die mit Baculoviren
infiziert wurden, die das rekombinante ORF7 Protein
ausdrücken, (Beispiel 13).
Phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS) oder andere ähn
liche Salzlösungen können als immunologisch akzeptable
Verdünnungsmittel verwendet werden.
Als Adjuvans können im allgemeinen irgendwelche der Ad
juvanzien, die üblicherweise verwendet werden, um Vakzi
nen zu formulieren, verwendet werden, entweder wäßrige -
wie beispielsweise Aluminiumhydroxid-, Aluminiumoxid-
Gel-Suspensionen, QuilA - oder andere, wie ölige Adju
vanzien auf der Grundlage von Mineralölen, Glyceriden
und ölhaltigen Äthersäurederivaten. Insbesondere ist be
stätigt worden, daß ein öliges Adjuvans, das aus einer
Mischung von Marcol® 52, Simulsol® 5100 und Montanide®
888 besteht, sehr gute Ergebnisse mit sich bringt.
Marcol® 52 ist sein Mineralöl geringer Dichte, das durch
ESSO Española S. A. hergestellt wird, Simulsol® 5100 ist
ein Polyäthoxyoleatäther, durch SEPIC vertrieben, und
Montanide® 888 ist ein Anhydromannitoctadecenoatäther
hoher Reinheit, durch SEPIC vertrieben. Vakzine
können auch Zellreaktions-Potentiator-
(CRP)-Substanzen enthalten, d. h., Substanzen, die
Helfer-T-Zell-Subpopulationen (Th1 und Th2) potenzieren,
wie beispielsweise IL-1 (interleukin-1), IL-2, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (gamma interferon), Zellnekro
sefaktor, und ähnliche Substanzen, die theoretisch
Zellimmunität in vakzinierten Tieren hervorrufen könn
ten. Diese CRP-Substanzen könnten in Vakzine-Formulie
rungen mit wäßrigen wie auch öligen Adjuvanzien ver
wendet werden.
Gleichermaßen können andere Arten von Adjuvanzien, wel
che die Zellreaktion modulieren und immunostimulieren,
verwendet werden, wie beispielsweise MDP (muramyl
dipeptide), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) oder
Liposome.
Vakzine können dadurch erzielt
werden, daß die antigene Phase mit dem immunologisch
akzeptablen Verdünnungsmittel und dem Adjuvans suspen
diert oder gemischt wird. Wenn das Adjuvans ölig ist,
bildet sich eine Emulsion, die - in einem spezifischen
und bevorzugten Fall -, falls das Adjuvans eine Mischung
aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 ist, die
Vakzine eine doppelte Wasser/Öl/Wasser-Emulsion, Typ
w/o/w, sein wird.
In dem Fall, daß die Vakzine CRP-Substanzen enthalten
wird, können diese Substanzen der antigenen Phase wie
auch dem Adjuvans beigegeben werden. Alternativ können,
falls die Vakzine keine CRP-Substanzen enthält, diese
injiziert werden, falls gewünscht, gleichzeitig in eine
separate Stelle unterschiedlich von der Einimpfung
stelle.
Darüber hinaus können diese Vakzinen Kombinationen von
verschiedenen Schweinekrankheitserregern sein, die, außer
einem rekombinanten PRRSV-Protein oder mehr, einen oder
mehr der nachfolgend aufgeführten Krankheitserreger auf
weisen, wodurch die Präparation von polyvalenten Vak
zinen ermöglicht wird. Unter diesen Pathogenen, aber
nicht ausschließlich auf diese beschränkt, sind
Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis,
porcine parvovirus, Leptospira, Escherichia coli,
Erysipelothrix rhusiopatiae, Pasteurella multocida,
Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory corona
virus, Rotavirus, oder gegen die Pathogene, welche die
Aujeszkysche Krankheit, Schweine-Influenza und die an
steckende Gastroenteritis auslösen.
Sicherheits- und Wirksamkeitserprobungen mit den Vakzi
nen haben den Beweis er
bracht, daß die genannten Vakzinen sicher und gleich
zeitig wirksam sind.
Es ist möglich gewesen, zu bestätigen, daß eine Dosis
von 2 ml einer Menge des viralen Antigens oder der anti
genen Phase, gleich oder höher als 50 × 106, Insekten
zellen infizierte, die ein oder mehrere der rekombinan
ten PRRSV-Proteine ausdrückten, über die tiefe intramus
kuläre Bahn verabreicht, von einer Nachimpfung mit einer
Dosis von 2 ml der Vakzine gefolgt, vakzinierte Tiere
vor der durch das PRRSV hervorgerufenen Infektion wirk
sam zu schützen vermag.
Gleichermaßen ist es möglich gewesen, zu verifizieren,
daß einige der Vakzinen, die Gegenstand der Erprobung
waren, - jene, die als rPRRS C und rPRRS D identifiziert
sind -, fähig sind, zellulare Immunität in vakzinierten
Tieren einzubringen, auf der Grundlage der Tatsache, daß
Mutterschweine, mit den genannten Vakzinen geimpft und
nachgeimpft, zum Zeitpunkt der Herausforderung keine
serologischen Ergebnisse zeigten, und trotzdem waren sie
geschützt, (Beispiel 14, Tabellen 4 und 10).
Mit dem Zweck, die Wirksamkeit der präparierten rekombi
nanten Vakzinen bei der Verhütung von PRRS bei trächti
gen Mutterschweinen festzustellen und zu bewerten, wurde
eine Erprobung ausgearbeitet, die aus der Vakzinierung
trächtiger Mutterschweine mit den verschiedenen Vakzinen
bestand, und danach wurden sie einem Discharge-Test mit
einem virulenten Virus unterzogen. Auf der Grundlage der
erzielten Ergebnisse ist es möglich gewesen, die Wirk
samkeit der Vakzinen, die Gegenstand dieser Erprobung
waren, auszuwerten. Um die Wirksamkeit dieser Vakzinen
zu bewerten, wurden die reproduktiven Resultate, die
Anzahl der Ferkel, lebend und tot, auf den verschiedenen
Stufen des Lebenszeitraums der Ferkel, sowie die Analyse
der serologischen Ergebnisse bei Mutterschweinen und
Ferkeln berücksichtigt, (Beispiel 14).
7 bis 8 Wochen alte Schweine, eine Kreu
zung zwischen Belgische Landrasse und Large-White-Züch
tungen, wurden verwendet. Die Tiere, von unseren eigenen
landwirtschaftlichen Betrieben, waren seronegativ gegen
über den folgenden Krankheiten: Aujeszkysche Krankheit,
Schweine-Parvovirose, Maul- und Klauenseuche, klassi
sches Schweinefieber, Schweine-Influenza (Typen H1N1 und
H3N2) und ansteckende Gastroenteritis.
Die Tiere wurden
anästhesiert durch Injizieren, in die Halsader, von
0,1 g Natriumthiopental für jeweils 10 kg Körpergewicht.
Dann wurden sie schmerzlos getötet, und die Lungen wur
den extrahiert, nachdem die Trachea unterhalb der Epi
glottis abgebunden worden war und über der Abbindung ab
geschnitten worden war. Die extrahierte Lunge wurde ex
tern mit PBS gewaschen. Sukzessive interne Waschungen
wurden vorgenommen (4 bis 5) mit einer Gesamtheit von
500 ml PBS, durch Antibiotika mit 1 : 500 ergänzt (PEG-
Lösung: 1000 IU/ml Penicillin, 1 mg/ml Streptomyzin und
0,5 mg/ml Gentamizin), um Makrophagen zu erhalten. Diese
Waschungen wurden gemeinsam gesammelt und 15 Minuten
lang mit 300 g zentrifugiert. Der folgende Schritt be
stand darin, die Zellen zweimal mit PBS zu waschen durch
konsekutive Zentrifugierung/Sedimentation, um schließ
lich in einem DMEMs-Medium zu resuspendieren (DMEM er
gänzt durch nichtessentielle Aminosäuren mit 100x,
GIBCO), das Natriumpyruvat 1 mM und Antibiotika (1 : 1000
PEG) enthielt.
Die Zellen wurden gezählt durch Färben mit Trypanblau in
einer Newbauer-Kammer. 0,1 ml einer 10-1 Makrophagen-
Suspension wurde 0,4 ml von DMEMs hinzugefügt und 0,5 ml
Trypanblau-Lösung. Bei der Mehrheit der Fälle war die
Anzahl der Zellen, die erlangt wurden, zwischen 1 bis
1,2 × 109.
Sterilitätskontrollen wurden durchgeführt an den Makro
phagenzellen mittels Keimen in Kulturmedien, die für die
Feststellung von Bakterien und Pilzen geeignet sind. Das
Nichtvorhandensein von Mykoplasma wurde verifiziert
durch zytochemische Ermittlung mit DAPI (4',6-diamidino-
2-phenylindole), das sich selektiv an die DNA anfügt und
DNA-DAPI-Fluoreszenz-Komplexe hoher Spezifizität bildet.
Zellkultur-Glasschalen (150 cm2) wurden
verwendet, die 100 ml einer Makrophagensuspension
(3 × 106 Zellen/ml) in dem oben beschriebenen DMEMs-
Medium enthielten, abgesehen von der Hinzufügung föta
len Kalbsserums (FCS) bei 5%. Die Zellen wurden mit dem
PRRS-Olot-Virus infiziert, durch Laboratorios Sobrino
isoliert und bezeichnet mit PRRS-JPD-P5-6-91 (ECACC, Zu
gangsnummer V93070108). Eine Infektion wurde durchge
führt mit 10-3 Infektionsmultiplizität, und die infi
zierten Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inku
biert. Nachdem diese Zeit vergangen war, wurde das
Medium entnommen und durch frische DMEMs ersetzt, die
2% FCS und Antibiotika enthielten; die Inkubation wurde
bei 37°C fortgesetzt.
Die Kulturen wurden periodisch mit dem Mikroskop beob
achtet, um die zytopathische Wirkung [cytopathic effect]
(CPE) festzustellen, die durch das Virus an den Makro
phagen hervorgerufen wurde. Im allgemeinen war der CPE
nach 3-4 Infektionstagen 70-80%. Sehr große deformierte
Zellen erschienen. Normalerweise war der Titer dieser
Präparationen 106,55 TCID50/ml (Gewebekultur-Infektions
dosis 50 pro Milliliter). Die mit 10-4 Multiplizität in
fizierten Makrophagen brachten virale Ausbeuten, um eine
Größenordnung kleiner, hervor.
Das Vorhandensein des Virus in diesen Zellen wurde durch
die Immunoperoxidase in Mono-Schicht-Erprobung an
Schweinemakrophagenzellen, die erlangt wurden, wie in
Beispiel 1 (1.1.2) beschrieben, ermittelt,. Kurz zusam
mengefaßt, dies wurde in folgender Weise durchgeführt:
In Titrations-Probenträgern mit 96er Raster wurden 100
µl der Makrophagen infiziert mit 50 µl des PRRS-Olot-
Virus, an Makrophagen repliziert. Die Probenträger
wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Sobald die
Inkubation durchgeführt war, wurde das Medium entzogen,
und die Probenträger zweimal mit Salzlösung (0,1 M NaCl)
gewaschen. Anschließend wurden sie mit 20% Formaldehyd
fixiert, nach konsekutiven Inkubationen bei 37°C, -30°C
und Formaldehyd bei 20%. Nach zweimaligem Waschen
mit Salzlösung 50 µl eines Verdünnungsmittels 1 : 50 eines
Anti-PRRS-Serums von einem experimentell infizierten
Tier. Gleichzeitige Inkubationen wurden durchgeführt mit
einem
negativen Serum von einem nichtinfizierten Tier. Die
Inkubation dauerte 1 Stunde bei 37°C. Nach Entfernung
der vorherigen Lösung wurden sie zweimal mit Salzlösung
gewaschen. Sofort wurde 0,1 µg des Proteins A (Sigma) in
50 µl beigegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Erprobung wurde mit AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole)
entwickelt, in Dimethylformamid gelöst, bei Vorhanden
sein eines Acetat-Puffermittels und Wasserstoffsuper
oxid. Nach 15-30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunklen
wurden die Platten mikroskopisch untersucht. Die
infizierten Zellen erschienen dunkelrot gefärbt, ver
glichen mit nichtinfizierten Zellen, die farblos waren.
Das Virus wurde von
PRRSV-infizierten Zellkulturen her purifiziert. Die Kul
tur wurde mittels Zentrifugierung geklärt (20 Minuten,
6500 g). Der Überstand wurde 10 × konzentriert, unter
Verwendung eines Millipore-Minitan-Ultrafiltrationssy
stems (4,5 pSi, Filter 300 kDa Porengröße). Dann wurde
das Virus sedimentiert mittels Zentrifugation (5 Stun
den, 20000 g). Der Überstand wurde entfernt, und das
Präzipitat wurde mit PBS, das 1 mM Phenylmetylsulfonyl
fluorid (PMSF) (Sigma) enthielt, über Nacht löslich ge
macht bei 4°C. Das Virus wurde purifiziert in einem
diskontinuierlichen Sucrosegradienten (20-50% w/v in
PBS), mittels Zentrifugierung mit 95000 g, 3 Stunden
lang. Sobald die Zentrifugierung durchgeführt worden
war, wurde das Band, welches das Virus enthielt, aus dem
Gradienten extrahiert, mit einem Tris/EDTA-Puffermittel
verdünnt und schließlich über Nacht zentrifugiert mit
26000 g, zur Virus-Sedimentation.
Das purifizierte Virus wurde analysiert mittels Elek
trophorese in Polyacrilamid-SDS-Gels bei 12% (Laemmli,
U. K., Nature, 227: 680, 1970). Das Gesamtprotein wurde
ermittelt durch Färben mit "coomassie blue" und Immuno
blots (Towbin, H., Staehelin, T., und Gordon, J., 1979.
Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Die Blots
wurden entwickelt mit Peroxidase-Protein-A-(Sigma)-Kon
jugat, unter Verwendung eines konvaleszenten Anti-PRRSV-
Serums. Es war nicht möglich, irgendein spezifisches
Band festzustellen, das mit PRRSV zusammenhing, in
coomassiegefärbten Gels, wegen der Verseuchung mit Pro
teinen von den Makrophagen her. Jedoch wurden verschie
dene virale Proteine mit Molekulargewichten zwischen
15,5 und 30 KDa durch Immunoblot identifiziert. Bei
längeren Entwicklungszeiten war es auch möglich, Bänder
mit Molekulargewichten über 60 KDa festzustellen, aber
da diese auch in nichtinfizierten Makrophagen ermit
telt wurden, wurde gefolgert, daß es sich dabei nicht um
PRRS-Virus-bezogene Proteine handelte.
Ein im Handel erhältliches Pharmacia P-L Biochemicals
Kit wurde verwendet.
Die Methode basiert auf der Selektion und Purifizierung
der viralen RNA, die einen 3'-End-Poly(A)-Schwanz ent
hält. Der virale Capsid-Bruch wurde durchgeführt mit
einer Guanidiniumchlorid-Purifizierung der RNA-Poly(A)
mit einer Oligo-Cellulose-(dT)-Matrix.
Kurz zusammengefaßt, die Isolierung der PRRS-Olot-
Virus-RNA wurde in folgender Weise durchgeführt: Das
purifizierte Virus wurde durch Übernacht-Zentrifugierung
mit 40000 g sedimentiert. Danach wurde der Überstand
entfernt und das Präzipitat mit 4,0 ml des Kit-
Extraktions-Puffermittels löslich gemacht. Nach Adsorp
tion in die Cellulose-d(T)-Matrix und anschließenden
Waschungen mit Puffermitteln niedriger und hoher Salz
konzentration wurde die RNA-Poly(A) mit hoher ClNa-Kon
zentration eluiert. Die RNA wurde präzipitiert durch
Hinzufügen eines 1 : 10-Volumens von 2,5 M Kaliumacetat,
0,25 mg/ml Glykogen und 2 Volumen Äthanol (< 2 Stunden
bei -20°C). Sobald diese Zeit verstrichen war, wurde
die RNA rückgewonnen durch Zentrifugierung bei 16000 g,
30 Minuten lang. Nach Waschen des Präzipitats mit
Äthanol von 75% wurde es in 20 µl eines TE-Puffer
mittels (10 mM Tris-ClH, pH = 8,0, und 1 mM EDTA)
resuspendiert.
Die erhaltene RNA wurde in 0,7% neutralen Agarose-Gels
analysiert durch Färben mit Ethidiumbromid. Ein einzel
nes Materialband innerhalb eines Molekulargewichts von
5000 bis 23000 bp wurde festgestellt. Das Nichtvorhan
densein von Material mit niedrigem Molekulargewicht muß
hervorgehoben werden und daher die Möglichkeit einer
zellularen DNA oder RNA. Jedoch war der Betrag des Mate
rials, der erzielt wurde, gering, nicht höher als 100 ng
RNA/250 ml der mit dem Virus infizierten Makrophagen
kultur. Diese geringe Ausbeute stimmt mit der geringen
Ausbeute des purifizierten Virus überein, wie durch die
Elektrophorese in Polyacrilamid-Gels und Elektronenmi
kroskopie bewiesen (Daten nicht dargestellt).
Die cDNA, die dem 3'-End-RNA
des PRRS-Olot-Viral-Isolats entspricht, wurde syntheti
siert. Die Strategie zieht einen Vorteil aus dem Vorhan
densein eines Poly(A)-Schwanzes, um die Oligo-d(T) als
Extensionsprimer zu verwenden, der mit umgekehrter
Transkriptase verlängert werden kann und DNA Molekül
kopien synthetisieren kann. Um die RNA-Regionen vor dem
3'-Ende zu klonen, wurde ein Oligonukleotid mit spezi
fischer Sequenz des viralen Genoms, bei ungefähr 2500 bp
des 3'-Endes angeordnet, verwendet.
Eine cDNA-Synthese wurde durchgeführt, unter Verwendung
eines im Handel erhältlichen Kits (Boehringer). Kurz zu
sammengefaßt, das Verfahren war: 0,1 µg des PRRS-RNA-
Poly(A), erlangt, wie in dem vorherigen Beispiel be
schrieben, wurde bei Vorhandensein von jeweils 1 mM
dNTPs (dATP, dCTP [5-10 µCi des 32P-α-dCTP] dGTP und
dTTP), 25 Einheiten eines RNase-Inhibitors, 0,8 µg
Oligo-d(T)12 und 40 Einheiten einer umgekehrten Trans
kriptase in 20 µl Endvolumen inkubiert. Die Reaktion
wurde 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert, und dann wurde
die Synthese des zweiten Stranges in derselben Röhre
begonnen. Zu diesem Zweck wurden ein Puffermittel,
RNasa, und 25 Einheiten von E.-Coli DNA-Polymerase
beigegeben. Es fand 1 Stunde lang bei 22°C und 10
Minuten bei 65°C eine Inkubation statt. Um stumpfe
Enden hervorzurufen, wurden schließlich 4 Einheiten der
DNA-T4-Polymerase beigegeben. Nach 10 Minuten bei 37°C
wurde die Reaktion dadurch gestoppt, daß EDTA und
Sarkosyl beigegeben wurden. Eine zweite cDNA-Synthese
wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, mit
Ausnahme der Tatsache, daß 5'CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3'-
Oligonukleotid verwendet wurde statt Oligo-d(T)12. In
beiden Fällen wurde die Mischung extrahiert mit Phenol:
Chloroform, und das Material wurde mit Äthanol präzi
pitiert, wie in dem vorherigen Beispiel beschrieben.
Eine cDNA-Synthese wurde geprüft und quantifiziert mit
tels Zählung der Radioaktivität, die in dem syntheti
sierten Material eingebracht war, und Elektrophorese in
alkalischen und neutralen Agarose-Gels.
Zuerst wurde die synthe
tisierte cDNA nach der Größe selektiert, um das Klonen
übermäßig kleiner Segmente zu vermeiden. Zu diesem Zweck
wurde das Material von der cDNA-Synthese her durch Zen
trifugierung (30 Minuten, 16000 g) rückgewonnen. Das
Präzipitat wurde vakuumgetrocknet, mit Tris-EDTA-Puffer
mittel (TE), pH = 8,0, gelöst, und in 1% Agarose-Gel
belastet. Die cDNA-Fragmente zwischen 1000 und 5000 bp
wurden mit DEAE-Cellulosepapier aus dem Gel und von dem
letzteren durch Elution mit ClNa und anschließende
Präzipitation rückgewonnen. Die purifizierte cDNA wurde
geklont in stumpfen Enden in dem pMTL25-Vektor, ein von
dem pUC18 abgeleiteten Vektor. Zu diesem Zweck wurde der
Vektor linearisiert mit SmaI und mit alkalischer
Phosphatase behandelt, um den Vektor-Hintergrund zu re
duzieren. Nach Ligation mit DNA-T4-Ligase wurden
E.-Coli-XL-1Blue-Kompetent-Zellen mit der Ligationsmi
schung transformiert, bei Vorhandensein von X-gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)
(Boehringer) und IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyra
noside) (Gold Bioch), was die anfängliche Selektion re
kombinanter Kolonien durch Farbe gestattet, (blaue
Kolonien ohne Einfügung im Vergleich mit weißen Kolonien
mit Einfügung).
Die Analyse der positiven PRRS-Klone wurde durchgeführt
mittels Plasmid-DNA-Präparationen (Birnboim & Doly,
Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523, 1979), und Darstellung
der Restriktionsstellen, auf der Grundlage der LV-Se
quenz. Nur 9 aus den 300 Plasmiden, die analysiert wur
den, waren positiv und enthielten Einfügungen zwischen
800 und 2600 bp. Die definitive Verifikation der Authen
tizität dieser cDNA-Klone wurde durch ihr direktes Se
quenzieren durchgeführt, unter Verwendung der Dideoxy-
Ketten-Terminationsmethode, auf die doppelstrangige DNA
angewendet, (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol., 94:
441-448, 1975). Die universalen Oligonukleotide
(5'GTAAAACGACGGCCAGT3') und umgekehrten Oligonukleotide
(5'AACAGCTATGACCATG3') wurden verwendet, um all die
Klone zu sequenzieren. Die Majorität der erhaltenen
PRRS-Klone enthielt einen gemeinsamen Poly(A)-Schwanz
und unterschiedliche 5'-Enden. Die Klone wurden bezeich
net mit pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132,
pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148, und pPRRS-153. Aus der
zweiten cDNA-Synthese wurde der Klon PRRS-3 erlangt. Die
Fig. 3 zeigt die unterschiedliche Verlängerung dieser
Klone im Vergleich mit LV wie auch die ORFs, die in
jedem enthalten waren. Andererseits zeigt die Fig. 1
die konsekutive Sequenz der 3.383 bp, die aus dem PRRS-
Olot-Isolat geklont wurde, und die Fig. 2 (2A-2F) zeigt
die Aminosäure-Sequenzen, die den Proteinen entsprechen,
durch jeden ORF kodiert.
Die Gene pMTL25, pMTL24 und pMTL22, von dem pUC18-Vektor
abgeleitet, wurden für die Präparation der verschiedenen
ORFs verwendet, die in dieser Beschreibung erwähnt sind,
bevor sie in Baculovirus-Transfer-Vektoren geklont wur
den. Der Vektor, der verwendet wurde, ist für jeden be
sonderen Fall angegeben. Das ORF2-Gen hat eine Größe von
747 bp und wurde von dem cDNA-pPRRS-3-Klon erlangt
(Fig. 4). Die DNA wurde mit MaeI verschmolzen, und die
Einfügung von ungefähr 900 bp wurde in Agarose-Gel puri
fiziert. Die kohäsiven Einfügungsenden wurden in stumpfe
Enden transformiert mittels Behandlung mit dem Klenow-
Fragment der E.-Coli-DNA-Polymerase. Das Klonen wurde
durchgeführt in dem pMTL25, behandelt mit SmaI, alkali
sche Phosphatase und purifiziert in 1% niedrigschmel
zendem Agarose-Gel. Nach Ligation mit DNA-T4-Ligase
(Boehringer) wurden E.-Coli-XL-1Blue-Zellen transfor
miert mit der Ligationsmischung und die positiven Klone
anfänglich durch Farbe selektiert. Die rekombinanten
Plasmide, die das eingefügte ORF2-Gen enthielten, wurden
purifiziert gemäß der alkalinen Auflösungsmethode
(Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523,
1979), und durch Darstellen mit Restriktions-Endo
nucleasen und Sequenzieren der Einfügungsregionen ge
kennzeichnet.
Der neu erlangte Vektor wurde mit pPRRS-ORF2 bezeichnet.
In ihm ist das ORF2-Initiations-Codon (ATG) angeordnet,
ungefähr bei 50 bp von dem Anfang der Einfügung und der
BamHI-Stelle an.
Der Baculovirus-Transfer-Vektor, der bei all den Experi
menten verwendet wurde, die in diesem Patentanspruch be
schrieben wurden, war der pAcYM1-Vektor (Matsuura et
al., J. Gen Virol. 68, 1233-50), der eine einzelne
BamHI-Einfügungsstelle hat.
Der Vektor wurde durch Professor D. H. L. Bishop (I. V.
E. M., Oxford, Vereinigtes Königreich) gestiftet. Für
die Einfügung wurde der Vektor mit der BamHI-Endo
nuclease sorgfältig verschmolzen und dann mit dem
alkalischen Phosphatase-Enzym behandelt, um Vektor-
Religation zu vermeiden. Der ORF2 kodiert für ein 28,4
KDa Protein. Kurz zusammengefaßt, die Einführung des
entsprechenden Gens in den pAcYM1-Vektor verwendete das
pPRRS-ORF2-Plasmid als Ausgangsmaterial. In diesem
Plasmid ist das ORF2-Gen durch 2 BamHI-Stellen flan
kiert. Somit wird der pPRRS-ORF2 mit BamHI verschmolzen
und in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel belastet, um
das 935-bp-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde
in die BamHI-Stelle des pAcYM1 eingesetzt gemäß der
Struhlschen Methode (Biotechniques 6, 452-453, 1985),
unter Verwendung der DNA-T4-Ligase (Boehringer), um die
Einfügung des Vektors zu ligatieren. Die Ligations
mischung wurde verwendet, um die E.-Coli-DH5-Zellen zu
transformieren. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide,
die das eingefügte ORF2-Gen enthalten, wurden purifi
ziert gemäß der alkalischen Auflösungsmethode (Birnboim
& Doly, supra), durch Darstellung mit Restriktions-
Endonukleasen gekennzeichnet, und die Einfügungsränder
wurden sequenziert, um die richtige Sequenz der Einfü
gungsregionen zu bekräftigen. Der neu erhaltene Trans
fer-Vektor wurde mit pPRRS-Bac8 bezeichnet, und es wurde
bewiesen, daß er das pPRRS-Gen in der richtigen Ausrich
tung hat, für seinen Ausdruck durch den AcNPV-Baculo
virus-Polyhedrin-Promoter.
Spodoptera-frugiperda-Zellen, Sf-9-Klon, wurden mit
einer Mischung aus purifizierter, infektiöser DNA des
Stammvirus AcRP23-lacZ (500 ng), durch Dr. Posee (I. V.
E. M., Oxford, Vereinigtes Königreich) gestiftet, und
dem Transfer-Vektor pPRRS-Bac8-DNA (2 µg) kotransfi
ziert. Das Stammvirus DNA wurde linearisiert mit dem
BSsu36I-Enzym innerhalb des lacZ-Gens (Kitts et al.,
Nuc. Acids Res. 18, 5667-72. 1990), um die Wirksamkeit
der Rekombination zu erhöhen. Zur Kotransfektion wurde
die Lipofectin-(Gibco-BRL)-Methode verwendet, (Felgner
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413-7417,
(1987)). Nach der Kotransfektion wurden die Zellen 5
Tage lang inkubiert in einem vollständigen TNMFH-Medium,
durch 5% fötales Kalbsserum (FCS) und Antibiotika er
gänzt, bis eine zytopathische Wirkung festgestellt
wurde.
Dann wurde der Transfektionsüberstand rückgewonnen, und
die rekombinanten Viren wurden durch Probenträger-
Untersuchung identifiziert. Das AcRP23-lacZ-Stammvirus
zeigt blaue Auflösungsflecken bei Vorhandensein des
X-gal-Substrats, weil das β-Galactosidase-Gen ausge
drückt wird. Die rekombinanten Viren wurden anfänglich
identifiziert durch die deutlichen Flecken, nachdem die
viralen Nachkommen mit X-gal gefärbt worden waren. Eine
Anzahl Flecken jedes Virus wurden herausgepickt und 3
Purifizierungsrunden unterworfen, bevor ein Virusbestand
mit hohem Titer präpariert wurde. Das schließlich er
zielte rekombinante Baculovirus wurde mit AcNPV, PRRS 2,
bezeichnet. Es wurde bei der European Collection of
Animal Cell Cultures (ECACC) deponiert, mit der
Zugangsnummer V94021007.
Der ORF3 kodiert für ein Protein mit einem geschätzten
Molekulargewicht von 30,8 KDa. Die pPRRS-121-Plasmid-DNA
wurde verwendet als Ausgangsmaterial für die Einfügung
des entsprechenden Gens in den pAcYM1-Transfer-Vektor
(Fig. 5). In diesem Vektor ist das ORF3-Initiations-
Codon 10 bp von der BamHI-Stelle angeordnet. Das Gen
kann durch Doppelverschmelzung mit den BamHI- und
Sau3A-Enzymen herausgeschnitten werden, welches kohäsive
Enden hervorbringt, mit BamHI-kompatibel. Nach der
Verschmelzung wurde die Mischung in 1% niedrigschmel
zendem Agarose-Gel belastet, und ein 1009-bp-Fragment
wurde purifiziert. Es wurde isoliert und dann mit dem
pAcYM1-Vektor abgebunden, mit BamHI und alkalischer
Phosphatase behandelt, unter Verwendung des T4-Ligase-
DNA-Enzyms. Anschließend wurden E.-Coli-DH5-Zellen
transformiert und die rekombinanten Plasmide purifiziert
und gemäß den oben beschriebenen Verfahren gekenn
zeichnet. Sobald die richtige Sequenz und Einfügungsaus
richtung nach dem Polyhedrin-Promoter hin verifiziert
worden war, wurde der neue Transfer-Vektor mit pPRRS-
Bac2 bezeichnet.
Das Verfahren, das für die Transfektion und Selektion
rekombinanter Baculoviren verwendet wurde, war dem Ver
fahren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde,
(Beispiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das er
zielt wurde, wurde mit AcNPV, PRRS 3 bezeichnet. Es
wurde bei der ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer
V94011325.
Die Größe des ORF4-Gens ist 549 bp. Es wurde erzielt aus
dem pPRRS-146-Klon (Fig. 6), mit den BamHI-, AflIII-
und PstI-Enzymen verschmolzen. Die ersten zwei Enzyme
flankieren die Einfügung, und PstI wurde verwendet, um
ein Vektor-DNA-Fragment von ähnlicher Größe wie das
ORF4-Gen zu spalten, was eine Gen-Isolation schwierig
gemacht hätte. Ein 1112-bp-Fragment wurde in niedrig
schmelzendem Agarose-Gel purifiziert und im pMTL22-Vek
tor geklont, mit BamHI und NcoI verschmolzen, (mit
AflIII kompatibel). Nach Ligation mit der T4-Ligase-DNA
und Transformierung der E.-Coli-DH5-Zellen wurden die
rekombinanten Plasmide purifiziert gemäß der alkalinen
Auflösungsmethode (Birnboim & Doly, supra), und durch
Restriktions-Endonuclease-Darstellung gekennzeichnet.
Der neu erzielte Vektor wurde pPRRS-ORF4 genannt. Er
enthält das ORF4-Initiations-ATG-Codon, das 5 bp von der
BamHI-Stelle angeordnet ist.
ORF4 kodiert für ein 20,0 KDa Protein. Das entsprechende
Gen wurde aus dem pPRRS-ORF4-Plasmid erzielt, durch Ver
schmelzung mit BamHI plus BglII. Das 1112-bp-Fragment
wurde purifiziert in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel
und direkt geklont in pAcYMI-BamHI. Die Verfahren für
die Identifizierung und Charakterisierung der rekombi
nanten Klone waren mit jenen identisch, die oben be
schrieben wurden, (Beispiel 4.2). Sobald die richtige
Ausrichtungs- und Einfügungssequenz verifiziert worden
war, wurde das neue Plasmid mit pPRRS-Bac9 bezeichnet.
Dieses Plasmid wurde für spätere Transfektions-Experi
mente und die Präparation rekombinanter Baculoviren ver
wendet.
Das Verfahren, dem für die Transfektion und Selektion
rekombinanter Baculoviren gefolgt wurde, war dem Verfah
ren ähnlich, das oben für ORF2 beschrieben ist, (Bei
spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus wurde mit
AcNPV, PRRS4 bezeichnet. Es wurde beim ECACC deponiert,
mit der Zugangsnummer V94021008.
Die Größe von ORF5 ist 600 bp. Es wurde aus dem Klon
pPRRS-132 erzielt, (Fig. 7). Die DNA wurde verschmolzen
mit den BstXI- und BfrI-Enzymen, und ein 700-bp-Frag
ment, das ORF5 enthält, wurde in 1% niedrigschmelzendem
Agarose-Gel purifiziert. Nach Umwandeln der Fragment
enden von kohäsiv in stumpf mittels Behandlung mit
T4-Polymerase-DNA wurde das Fragment in dem pMTL25/SmaI-
Vektor geklont. Die Methode, die verwendet wurde, war
den in Beispiel 4.1 beschriebenen Verfahren ähnlich. Der
neu erzielte Vektor wurde mit pPRRS-ORF5 bezeichnet. Er
enthält das ORF5-Initiation-ATG-Codon, 15 bp von dem
Anfang des Gens angeordnet.
ORF5 kodiert für ein 22,4 KDa Protein. Um das ent
sprechende Gen in den Transfer-Vektor einzufügen, wurde
der pPRRS-ORF5-Vektor mit dem Enzym BamHI verschmolzen.
Das 706-bp-Fragment wurde in 1% niedrigschmelzendem
Agarose-Gel purifiziert und an dem pAcYM1-BamHI-Trans
fer-Vektor direkt abgebunden. Die rekombinanten Plasmide
wurden gekennzeichnet, wie oben beschrieben. Der neue
Transfer-Vektor wurde mit pPRRS-Bac3 bezeichnet. Er
wurde bei anschließenden Transfektions-Experimenten
verwendet.
Das Verfahren, dem für die Transfektion und Selektion
rekombinanter Baculoviren gefolgt wurde, war dem Verfah
ren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Bei
spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erzielt
wurde, wurde mit AcNPV, PRRS5 bezeichnet und wurde bei
ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011326.
Die Größe des ORF6-Gens ist 519 bp. Es wurde aus dem
pPRRS-8-Gen-Klon präpariert, (Fig. 8). Zuerst wurde die
DNA mit dem AflIII-Enzym verschmolzen, was die Elimi
nierung von Bändern ermöglichte, in der Größe dem ORF6-
Gen angenähert. Ein-990-bp-AflIII-AflIII-Fragment wurde
in 1% niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert und
mit TaqI verschmolzen. Das neue 790-bp-Fragment wurde in
niedrigschmelzendem Agarose-Gel purifiziert und in dem
pMTL24-Vektor geklont, mit AccI und alkalischer Phospha
tase behandelt. Anschließend wurden die in Beispiel 4.1
beschriebenen Schritte durchgeführt. Der neue Vektor
wurde mit pPRRS-ORF6 bezeichnet. Er enthält das ORF6-
Initiations-Codon, das bei 46 bp von dem Anfang des Gens
her angeordnet ist.
ORF6 kodiert für ein 19,0 KDa Protein. Hierbei handelt
es sich vermutlich um das Hüllenprotein, und im Hinblick
auf seine hydrophobe Art wird es als membranspannendes
Protein angesehen. Für die Einfügung des entspre
chenden Gens in den Transfer-Vektor wurde der pPRRS-
ORF6-Vektor, der das ORF6-Gen enthält, das an der
pMTL24-AccI-Stelle geklont wurde, mit dem BamHI-Enzym
verschmolzen. Das 790-bp-Fragment wurde aus dem 1%
Agarose-Gel purifiziert und nach dem Vektor pAcYM1-BamHI
hin direkt abgebunden. Der neue Transfer-Vektor wurde
mit pPRRS-Bac5 bezeichnet. Er wurde bei anschließenden
Transfektions-Experimenten verwendet.
Die Methode, die für die Transfektion und Selektion re
kombinanter Viren verwendet wurde, war dem Verfahren
ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Beispiel
4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erzielt wurde,
wurde mit AcNPV, PRRS6 bezeichnet. Es wurde beim ECACC
deponiert, mit der Zugangsnummer V94011327.
Die Größe des ORF7-Gens ist 384 bp. Es wurde aus dem
pPRRS-8-Gen-Klon präpariert, (Fig. 8). Das in Beispiel
8.1 beschriebene Fragment AflIII-AflIII wurde mit dem
HpaI-Enzym verschmolzen. Das 430-bp-AflIII-HpaI-Frag
ment, welches das ORF7-Gen enthielt, wurde in niedrig
schmelzendem Agarose-Gel purifiziert und anschließend in
dem pPMTL25-Vektor geklont, mit NcoI-SmaI verschmolzen.
Die Analyse und Charakterisierung rekombinanter Kolonien
wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4.1 beschrieben. Der
neue Vektor wurde mit pPRRS-ORF7 bezeichnet. Er enthält
das ORF7-Initiations-Codon, bei 16 bp von dem Anfang des
Gens her angeordnet.
ORF7 kodiert für ein 13,8 KDa-Protein. Hierbei handelt
es sich vermutlich um das virale Nucleoprotein. Für die
Einfügung des entsprechenden Gens in den Transfer-Vektor
wurde das pPRRS-ORF7-Plasmid mit den BglII- und
BamHI-Enzymen verschmolzen. Das resultierende 430-bp-
Fragment wurde aus einem niedrigschmelzenden Agarose-Gel
isoliert und innerhalb des pAcYM1-BamHI-Vektors direkt
abgebunden. Nach den geeigneten Charakterisierungen wur
de der neue pPRRS-Bac7-Transfer-Vektor erzielt. Er wurde
bei anschließenden Transfektions-Experimenten verwendet.
Die Methode, die für die Transfektion und Selektion re
kombinanter Baculoviren verwendet wurde, war dem Verfah
ren ähnlich, das für ORF2 oben beschrieben wurde, (Bei
spiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus, das erlangt
wurde, wurde mit AcNPV, PRRS7 bezeichnet. Es wurde beim
ECACC deponiert, mit der Zugangsnummer V94011328.
Sf9-Zellen wurden mit verschiedenen rekombinanten
Baculoviren infiziert, mit einer Infektionsmultiplizität
von 1 PFU/Zelle, und bei 27°C inkubiert, bis die Kul
turen geerntet wurden. Verschiedene Zellkulturen wurden
einschichtig und in Suspension ausgeführt. In all den
Fällen waren die Resultate ähnlich. Die Kulturen wurden
zu verschiedenen Nachinfektionszeiten geerntet. Die op
timale Erntezeit für jedes rekombinante Virus wurde er
mittelt. Diese reichte von 48 bis 96 p.i.h. (post
infection hours/Nachinfektionsstunden). Die Zellen wur
den geerntet durch Zentrifugierung mit 1500 UpM 10 Min.
lang, zweimal mit PBS, pH: 7,4, gewaschen und anschlies
send resuspendiert und mit 25 mM Bikarbonatlösung
aufgelöst. Sie wurden mit 10000 UpM 10 Minuten zentrifu
giert und die lösliche zytoplasmische Fraktion wurde von
der verbleibenden unlöslichen Zell-Debris separiert. Die
gesamten Zellextrakte sowie die verschiedenen Fraktionen
wurden durch Elektrophorese in 11% Polyacrilamid-Gels
analysiert und mit "coomassie-blue" eingefärbt oder auf
Nitrocellulose-Membranen übertragen, zur immunologischen
Feststellung. Bänder wurden beobachtet durch Färben mit
"coomassie-blue", mit Molekulargewichten von 28,4, 30,8,
20,0, 22,4, 19,0 und 13,8 KDa. Diese Größen stimmen
entsprechend mit den Größen überein, die für die Prote
ine erwartet wurden, die durch die ORFs 2, 3, 4, 5, 6
und 7 kodiert wurden. Es gibt eine signifikante Varia
tion bei den Ausdrucks-Levels der verschiedenen Gene:
die ORFs 3, 5 und 7 auf beträchtlichem Level, die ORFs 2
und 4 auf nennenswertem Level und ORF 6 auf niedrigem
Level. Die Gene mit niedrigeren Ausdrucks-Levels, ent
sprechend den ORFs 2 und 6, könnten entstanden sein
infolge der größeren Distanz, 42 bzw. 39 Nukleotide,
zwischen dem
Protein-Initiations-ATG-Codon und dem Polyhedrin-Baculo
virus-Promoter. Bei verschiedenen Gelegenheiten ist be
wiesen worden, daß diese Distanz im wesentlichen auf
einem Minimum gehalten werden sollte, um einen guten
Ausdruck zu erhalten. Ein anderer Faktor, der für gerin
gen Ausdruck verantwortlich ist, könnte die hohe hydro
phobische Art dieser Proteine sein.
Wenn die löslichen und unlöslichen Fraktionen der infi
zierten Zellen separat analysiert werden, ist festge
stellt worden, daß, außer für ORF7, die meisten der aus
gedrückten PRRS-Proteine unlöslich sind und mit der
Membran-Debris assoziiert bleiben. Dies kann auf die
hydrophobe und glykosilierte Natur dieser Proteine
zurückzuführen sein. Die Majorität dieser Glykoproteine
enthält Transmembranregionen, welche sie an den
Membranen verankern. Solche Charakteristika machen die
Purifizierung dieser Proteine aus Zellextrakten schwie
rig. Zur Immunodetektion wurden die Proteine auf Nitro
cellulose-Membranen übertragen, gemäß Standardmethoden
(Burnette, Anal. Biochem. 112, 195-203, 1981; Towbin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4350-4354, 1979).
Die Proteinübertragung wurde in einer halbtrockenen
Vorrichtung (Bio-Rad) bei 22 V 30 Minuten lang durchge
führt. Dann wurden die Nitrocellulose-Streifen blockiert
mit 3% Pulver von entrahmter Milch in Tris-HCl 20 mM,
pH 7,5, NaCl 500 mM (TBS), 1 Stunde lang bei Raumtempe
ratur. Anschließend wurden die Streifen zuerst für zwei
Stunden bei Raumtemperatur mit einem Anti-PRRS-Schweine-
Antiserum (C-45), inkubiert, 1/100 in TBS-0,05% Tween
20 verdünnt, mit TBS-0,05% Tween 20, 30 Minuten lang
bei Raumtemperatur gewaschen und dann mit Anti-Schwein-
IgG, mit alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1/1000)
(Sigma) konjugiert, 1 Stunde lang inkubiert. Die Strei
fen wurden noch einmal gewaschen und schließlich mit
einem NBT (nitro blue tetrazolium) (Sigma) und BCIP
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) (Sigma) Lösung in
NaCl 100 mM, MGCL2 5 mM, Diethanolamin 100 mM, pH: 9,5,
entwickelt, bis zum Erscheinen sichtbarer Bänder. Die
Reaktion wurde mit destilliertem Wasser gestoppt. In all
den Fällen, in denen spezifische Reaktionen durch Im
munoblot sichtbar wurden, wurden Proteine mit einem
Molekulargewicht, äquivalent mit den geschätzten ORF-
Größen, erzielt. In einigen Fällen, speziell bei den
ORFs 3 und 5, wurde das Vorhandensein anderer größer
bemessener Bänder, bis 45 KDa, festgestellt. Diese
Bänder würden verschiedene Protein-Glykosilationsformen
darstellen, in Übereinstimmung mit den vorhergesehenen
potentiellen Stellen.
Die richtige Antigenizität der rekombinanten Proteine,
im Baculovirus ausgedrückt, wurde geprüft durch ihre
Reaktion auf verschiedene Tier-Sera in einer Immuno
blotting-Untersuchung.
Rekombinante Proteine, auf Nitrocellulose gemäß der
obigen Methode ausgedrückt und übertragen, wurden dazu
gebracht, mit einer Kollektion der zuvor charakteri
sierten Schweine-Sera, die Anti-PRRSV-Antikörper ent
hielten, zu reagieren. Die Sera waren in Tieren erzielt
worden, die experimentell (# 1-4) oder natürlich (# 5-8)
infiziert wurden.
Die Proteine, die den ORFs 3, 5 und 7 entsprechen, waren
die ersten, die geprüft wurden. Die Resultate sind in
Tabelle 2 dargestellt.
Diese Untersuchung bewies, daß die rekombinanten Pro
teine 3, 5 und 7 antigenisch sind ähnlich den ursprüng
lichen viralen Proteinen 3, 5 und 7.
Wenn die Untersuchung mit rekombinanten Proteinen 2, 4
und 6 durchgeführt wurde, waren die Resultate von grös
serer Variabilität, was die Erkennung durch Feldsera an
geht. Die Gründe für diese Variabilität können ihr
geringer Ausdrucks-Level und/oder ihre hohe Hydrophobi
zität sein.
Diese Untersuchungen zeigen, daß die PRRSV-rekombinanten
Proteine, im Baculovirus-System ausgedrückt, von den ur
sprünglichen viralen Proteinen nicht antigenisch unter
scheidbar sind.
Die für die Purifikation rekombinanter Proteine entwor
fene Strategie sollte die strukturellen Charakteristika
der Proteine berücksichtigen. Zwei dieser Charakteri
stika sollten hervorgehoben werden:
- 1. die hydrophobe Art, die sie unlöslich macht, und
- 2. das Vorhandensein einer großen Zahl von Transmem branregionen, die ihnen eine große Affinität zu Membra nen verleiht. In den meisten Fällen machen diese Charak teristika eine Proteinextraktion und -purifizierung nicht zweckmäßig, z. B.: für ihre Verwendung als Vak zine, wenn komplette infizierte Zellen verwendet werden können, wie durch verschiedene Autoren beschrieben, (Hall, S. L., et al., Vaccine, 9, 659-667, Sept. (1991); Tordo, N., et al., Virology, 194, 5269 (1993)). Trotzdem sind einige Versuche unternommen worden, diese Proteine zu purifizieren, unter Verwendung des ORF3-Proteins als Modell.
Sf9-Zellen wurden mit dem rekombinanten Virus AcNPV,
PRRS3 infiziert, gemäß der Methode, die in dem früheren
Beispiel beschrieben wurde. Die infizierten Zellen wur
den durch Zentrifugierung mit 400 g, 10 Min. lang, ge
sammelt, mit PBS gewaschen und resuspendiert bei
20 × 106 Zellen/ml in PBS. Die Zellen wurden durch
Gefrieren/Auftauen zerbrochen, und die lösliche Fraktion
wurde durch Zentrifugierung von der unlöslichen Fraktion
getrennt. In all den Fällen wurde die unlösliche Frak
tion für die anschließenden Behandlungen verwendet.
Nachfolgend eine Beschreibung einiger Methoden, die ver
wendet wurden:
Die unlösliche Fraktion wurde zuerst mit 1 M NaCl und
dann mit 2 M oder 4 M Guanidiniumchlorid gewaschen. Die
Zell-Pellets wurden in den verschiedenen Puffermitteln
resuspendiert und 1 Stunde lang auf Raumtemperatur ge
halten. Dann wurde die Präparation mit 15000 UpM 5 Minu
ten lang zentrifugiert. Das Vorhandensein des rekombi
nanten Proteins in den verschiedenen Fraktionen wurde
durch Elektrophorese in 15% Polyacrylamid-SDS-Gels
(Natriumdodecylsulfat) analysiert.
Die erzielten Resultate lassen erkennen, daß die sequen
tielle Behandlung mit diesen Salzen ein Protein von 30%
bis 50% Reinheit hervorbringt. Dieses purifizierte
Protein hat sich als antigenisch analog mit ursprüngli
chem Protein herausgestellt, da es durch Sera von infi
zierten Tieren her erkennbar ist, entweder durch Immuno
blotting oder indirekt ELISA bestimmt.
Detergenzien mit den folgenden Konzentrationen wurden
verwendet:
- - NP40: 0,5%
- - Octylglucosid 2%
- - SDS 0,5%, 1% und 2%
- - Natriumdeoxycholat 0,5%, 1% und 2%
In allen Fällen wurden die Zellpräparationen analog der
oben beschriebenen Zellpräparation durchgeführt. Zell-
Debris, die das rekombinante Protein enthielt, wurde mit
den obigen Detergenskonzentrationen und unter den be
schriebenen Bedingungen behandelt. Allgemein kann an
gegeben werden, daß unter diesen Bedingungen die Behand
lung mit den verschiedenen Detergenzien den Aufschluß
eines signifikanten Betrages des rekombinanten Proteins
nicht ermöglichte. Nur 0,5%iges SDS erzielte Protein
mit 50% geschätzter Reinheit, wenn auch mit sehr gerin
ger Ausbeute. Antigenisch reagiert dieses Protein mit
infizierten Tiersera durch indirekte ELISA, obwohl die
Wirksamkeit geringer ist als das, was mit dem Protein,
mit chaotropen Agenten purifiziert, erreicht wird.
Zusammengefaßt, diese teilweise purifizierten Proteine
könnten in Anti-PRRSV-Vakzinen verwendet werden.
Eine der Hauptanwendungen der rekombinanten Proteine,
die durch diese Erfindung vorgesehen werden, ist deren
Verwendung bei der Präparation von Kits für die Diagnose
von PRRSV-Feldinfektionen.
Sf9-Zellen, einschichtig oder in Suspension gezüchtet,
wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 0,5 bis 1
mit den entsprechenden rekombinanten Baculoviren infi
ziert. Abhängig davon, welches rekombinante Virus ver
wendet wurde, wurden die Kulturen 48 bis 72 Stunden nach
der Infektion geerntet. Sie wurden 10 Minuten lang mit
400 g bei 15°C zentrifugiert und mit PBS gewaschen.
Schließlich wurden die Zell-Pellets, welche die rekom
binanten Proteine enthielten, in PBS mit 2% Octyl
glucosid (Sigma) resuspendiert und eine Stunde lang auf
Eis stehen gelassen. Sie wurden dann 10 Minuten lang mit
1000 g zentrifugiert, um Zell-Debris zu beseitigen. Die
überstände wurden gegen PBS erschöpfend dialysiert, um
das Detergens zu entfernen, 30 Minuten lang mit 10000 g
zentrifugiert, um Präzpitate zu entfernen, und bei
-70°C gelagert, zur späteren Verwendung.
Polystyrol-ELISA-Immunoplatten mit 96er Raster (Poli
sorp, NUNC) wurden mit verschiedenen Verdünnungen der
Mischung der rekombinanten Extrakte (ORF2, ORF3, ORF4,
ORF5, ORF6 und ORF7) bedeckt, in 50 mM Karbonat-
Puffermittel, pH: 9,6 (100 µl/Raster) hergestellt, durch
Inkubation bei 4°C über Nacht. Wie in Fig. 9 darge
stellt, war die optimale Verdünnung, die für die Plat
tenbedeckungen gewählt wurde, 1/100. Die Platten wurden
mit einem blockierenden Puffermittel durchtränkt (1%
entrahmte Milch in PBS), 30 Minuten lang bei Raumtem
peratur. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen
der Anti-PRRSV-Antisera, im blockierenden Puffermittel
hergestellt, beigegeben. Die Inkubation wurde 1 Stunde
lang bei 37°C fortgesetzt. Nach dem Waschen mit PBS,
das 0,05% Tween 20 enthielt, wurde peroxidasemarkiertes
Protein A (1/5000 Verdünnung) beigegeben, 1 Stunde lang
bei 37°C inkubiert. Waschen, wie vorher, wurde durchge
führt, und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei Raum
temperatur entwickelt, unter Verwendung von ABTS
[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6 sulfonic acid)]
als Substrat. Die Reaktion wurde mit 1% SDS gestoppt,
und die Absorbanz wurde bei 405 nm überwacht.
Die üblichen ELISA-Titrationsresultate von einem Feld
serum eines infizierten Tieres her sind in Fig. 10
dargestellt. Die Feldsera-Titrationen haben normaler
weise Verdünnungen von 1/100 bis 1/800. Die Resultate,
die bei einem Stichprobenexperiment mit einigen Dutzend
Feldsera erzielt wurden, sind in Fig. 11 dargestellt.
Es ist ersichtlich, daß die für eindeutig positive Sera
erhaltenen Titer von 0,4 bis 1,7 reichen. Titer von
unbestimmten Sera reichen von 0,2 bis 0,3. Negative Sera
ergeben Titer unter 0,1. Somit lautet die Schlußfol
gerung, die zu ziehen ist: die Verwendung dieser rekom
binanten Proteine, in Baculovirus ausgedrückt, ist eine
sichere, zuverlässige und reproduzierbare Methode, die
es möglich macht, infizierte Tiere von nichtinfizierten
Tieren endgültig zu unterscheiden.
Verschiedene Vakzinen wurden präpariert, die verschie
dene rekombinante PRRSV-Proteine enthielten, spezifisch
PRRS-Olot [ECACC V93070108] in Emulsionsform, gemäß der
nachfolgend beschriebenen Methode.
Spodoptera-frugiperda-Zellen, Klon Sf9 - nachfolgend
Sf9 - wurden mit der Rate von 1 × 106 Zellen/ml mit den
rekombinanten Baculoviren infiziert:
- - AcNPV, PRRS3, [ECACC V94011325];
- - AcNPV, PRRS5, [ECACC V94011326], und
- - AcNPV, PRRS7, [ECACC V94011328],
die fähig sind, entsprechend die rekombinanten Proteine
zu produzieren, die ORF3, ORF5 und ORF7 des vorgenannten
PRRSV entsprechen (
Fig.
2, 4 und 6), mit einer Infek
tionsmultiplizität von 0,1 "plaque forming units" [flec
kenbildende Einheiten] (PFU)/ Zelle. Sie wurden bei 27°C
inkubiert, mit Umrühren bei 100 UpM und 30% pO2
, 72
Stunden lang, in einem 2-Liter-Braun-MD-Fermentor. Dann
wurden die infizierten Insektenzellen gesammelt durch
Zentrifugieren mit 1000 UpM, 10 Minuten lang, mit
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH: 7,4, gewaschen
und mit 5 × 107
Zellen/ml in dem gleichen PBS-Puffer
mittel suspendiert.
Die Vakzinen wurden formuliert durch Mischen eines infi
zierten Sf9-Zellhomogenats, das 50 × 106 Sf9-Zellen ent
hielt, die jedes der rekombinanten Proteine ORF3, ORF5
und ORF7 ausdrücken, mit einem öligen Adjuvans, oder
einer öligen Phase, die sich zusammensetzt aus einer
Mischung von:
Marcol® 52: 790,0 mg
Simulsol® 5100: 70,0 mg
Montanide® 888: 80,0 mg
Marcol® 52: 790,0 mg
Simulsol® 5100: 70,0 mg
Montanide® 888: 80,0 mg
Unter diesen Bedingungen wurden 4 rekombinante Vakzinen
präpariert, in Dosen von 2 ml, zusammengesetzt aus 53%
antigene Phase und 47% ölige Phase, wie oben beschrie
ben, bei denen die Relation ölige Phase/antigene Phase
eine Gewicht/Volumen-Relation (W/V) ist. Die präparier
ten Vakzinen ergaben die folgende Formulierung:
- 1. Vakzine, identifiziert als rPRRS C:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF3, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben. - 2. Vakzine, identifiziert als rPRRS D:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF5, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben. - 3. Vakzine, identifiziert als rPRRS E:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF7, und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben. - 4. Vakzine, identifiziert als rPRRS F:
53%, Volumenprozent, antigene Phase, zusammenge setzt aus 50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF3;
50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF5, und 50 × 106 Sf9-Zellen, Ausdruck ORF7, (gesamt 150 × 106 Sf9- Zellen), und
47%, Gewichtsprozent, der öligen Phase, wie oben beschrieben.
Diese Erprobung wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit
der rekombinanten Vakzine zu bewerten, die präpariert
wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben. Zu diesem Zweck
wurden insgesamt 12 Mutterschweine - eine Kreuzung Land
rasse X Large White - verwendet. Die Tiere wurden in die
Sicherheitsställe des Forschungszentrums gebracht.
Zwei Mutterschweine wurden willkürlich ausgewählt (Mut
terschweine No. 400398 und No. 400298) und wurden mit
der Vakzine, als rPRRS C identifiziert, vakziniert. Zwei
Mutterschweine (Mutterschweine No. 400118 und No.
400307) wurden mit der Vakzine, als rPRRS D identi
fiziert, vakziniert. Mit der Vakzine, als rPRRS E iden
tifiziert, wurden drei Mutterschweine (Mutterschweine
No. 314010, No. 313426 und No. 400059) vakziniert, und
mit der Vakzine, als rPRRS F identifiziert, wurden drei
Mutterschweine (Mutterschweine No. 313524, No. 401236
und No. 401426) vakziniert. Die zwei verbleibenden Mut
terschweine (Mutterschweine No. 1 und No. 20) wurden
nicht vakziniert und wurden als Kontrolltiere verwendet.
Die Mutterschweine wurden über die tiefe intramuskuläre
Bahn (IM) in den Nacken, nahe dem Ohr, vakziniert, mit
einer Dosis von 2 ml Vakzine, und 21 Tage später mit der
gleichen Dosis nachgeimpft.
Die lokalen und allgemeinen Reaktionen wurden beobach
tet, wie beispielsweise: rektale Temperatur, Futterauf
nahme und klinische Anzeichen nach der Vakzinierung und
nach der künstlichen Infektion. Darüber hinaus wurden
die reproduktiven Resultate nach der künstlichen Infek
tion in den Mutterschweinen wie auch die serologischen
Resultate bei den Mutterschweinen und auch den Ferkeln
überwacht. Die Analyse der Resultate wurde bei der
Bewertung der Wirksamkeit der Vakzine verwendet (Tabelle
1).
Die künstliche Infektion wurde in den Sicherheitsställen
des Forschungszentrums durchgeführt. Alle Tiere wurden
mit der Rate von 5 ml des
PRRSV-218-P6-Mø-F22055-29/10/94 infiziert, eine
Abstammung isoliert und in dem Depot des
Forschungszentrums aufbewahrt, mit einem Titer von 106,1
TCID50/ml (Gewebekultur, infektiöse Dosis 50%) über die
intranasale Bahn (IN).
Für die Bewertung der reproduktiven Resultate der Mut
terschweine am Tage des Werfens wurden die folgenden
Daten notiert (Tabelle 3):
- - Anzahl der Ferkel, lebend geboren und bei guter Gesundheit
- - Anzahl der Ferkel, lebend geboren, aber schwäch lich
- - Anzahl der totgeborenen Ferkel
- - Anzahl der Ferkel mit teilweiser Autolyse (ödem artig)
- - Anzahl der mumifizierten Ferkel
- - Ferkel, die nach der 1. Lebenswoche lebten, und
- - Ferkel, die zum Zeitpunkt der Entwöhnung (25-30 Tage alt) lebten.
Dann wurde die serologische Reaktion in den
Mutterschweinen (Tabelle 4) und Ferkeln (Tabellen 5, 6,
7, 8 und 9) mittels einer "Peroxidase Monolayer Assay"
/Immuno-Peroxidase-Monoschicht-Untersuchung/(IPMA)
[Immuno Peroxidase Monolayer Assay, Wensvoort et al.,
Vet. Quarterly, Vol. 13, No. 3, (Juli 1991)] analy
siert, gemäß dem folgenden Programm:
D 0 (Tag 0): Blutentnahme und Vakzinierung
D + 14: Blutentnahme [14 Tage nach der Vakzinierung]
D + 21: Blutentnahme und Nachimpfung [21 Tage nach der Vakzinierung]
D + 28: Blutentnahme [28 Tage nach der Vakzinie rung]
D + 35: Blutentnahme [35 Tage nach der Vakzinierung]
D I: Blutentnahme und Herausforderung
D I + 7: Blutentnahme [7 Tage nach der Infektion]
D + 14: Blutentnahme [14 Tage nach der Vakzinierung]
D + 21: Blutentnahme und Nachimpfung [21 Tage nach der Vakzinierung]
D + 28: Blutentnahme [28 Tage nach der Vakzinie rung]
D + 35: Blutentnahme [35 Tage nach der Vakzinierung]
D I: Blutentnahme und Herausforderung
D I + 7: Blutentnahme [7 Tage nach der Infektion]
Die serologischen Resultate bei den Mutterschweinen
(Anti-PRRSV-Antikörper) sind in Tabelle 4 dargestellt.
Mit dem Ziel, die Vakzinen einzuschätzen, Aufgabe der
Erprobung, wurden die serologischen Resultate sowie die
reproduktiven Resultate bewertet. Die Tabelle 8 zeigt
einige serologische Daten, während die Tabelle 9 die
reproduktiven Daten der Mutterschweine, die bei den
Erprobungen verwendet wurden, zusammenfaßt, einschließ
lich Informationen über die Gesamtzahl der Ferkel, die
geworfen wurden, die Anzahl der Ferkel, die nach der 1.
Woche lebten, die Anzahl der Ferkel, die entwöhnt waren,
und die Anzahl der Ferkel, die über 40 Tage alt waren.
Die Resultate machen in ihrer Gesamtheit deutlich, daß
bei der Vakzine rPRRS C ein Mutterschwein serokonver
tierte (400298) und ein Mutterschwein nicht serokonver
tierte (400398); bei der Vakzine D serokonvertierte kei
nes der Mutterschweine; für die Vakzinen E und F ist
eine starke Serokonversion vorhanden, hauptsächlich in
folge des Proteins, für ORF 7 kodiert.
Es gibt ein günstiges Verhalten gegenüber der
künstlichen Infektion, wenn die vakzinierten Tiere mit
jenen verglichen werden, die nicht vakziniert wurden,
wodurch es möglich wird, positiv geltend zu machen, daß
die rekombinanten Vakzinen, Gegenstand der Erprobung,
ein wirksames Mittel zur Verhinderung des PRRS bilden.
Es ist verifiziert worden, daß vakzinierte Mutterschwei
ne, ohne Antikörper, mit der IPMA-Technik titriert, ge
schützt werden, was beweist, daß die genannten Vakzinen
(rPRRS C und rPRRS D) fähig sind, zellulare Immunität zu
induzieren.
Die Wirksamkeit der Vakzinen wurde bewertet durch Ver
gleichen:
- a) des Prozentsatzes der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden,
- b) des Prozentsatzes der entwöhnten Ferkel, gegen über der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wurden, und
- c) des Prozentsatzes der Ferkel, über 40 Tage alt, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen wur den.
Die Tabelle 12 zeigt die Daten, die sich auf den Pro
zentsatz der Ferkel, die nach der 1. Woche lebten, den
Prozentsatz der Ferkel, die entwöhnt waren und den Pro
zentsatz der Ferkel, die über 40 Tage alt waren, bezie
hen, gegenüber der Gesamtzahl der Ferkel, die geworfen
wurden.
Es ist verifiziert worden, daß die Tiere ohne Anti
körper, mit der IPMA-Technik ausgewertet, geschützt
sind.
Die rekombinanten Baculoviren, die erlangt wurden, wur
den bei der European Collection of Animal Cell Cultures
(ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 0JG,
Vereinigtes Königreich, deponiert. Die Bezeichnung und
die Zugangsnummern der rekombinanten Baculoviren sind:
Bezeichnung | |
ECACC-Zugangsnummer | |
AcNPV, PRRS2 | V94021007 |
AcNPV, PRRS3 | V94011325 |
AcNPV, PRRS4 | V94021008 |
AcNPV, PRRS5 | V94011326 |
AcNPV, PRRS6 | V94011327 |
AcNPV, PRRS7 | V94011328 |
Alle diese Baculoviren wurden am 13. Januar 1994 depo
niert, ausgenommen AcNPV, PRRS2, (V94021007) und AcNPV,
PRRS4, (V94021008), die am 10. Februar 1994 deponiert
wurden.
Fig. 3:
- a) PRRSV-Genom
- b) Größe (Kb)
- c) Klon-Nummer
Fig. 9:
- a) Antigen-Titration durch ELISA
- b) Absorbanz bei 405 nm
- c) Antigen-Verdünnungen (1/ )
- d) Serum mit 1/200
- -.- -.- - Feld
- - + - - + - - experimentell
- - * - - * - - negativ
Fig. 10:
- a) Serum-Titration durch ELISA
- b) Absorbanz bei 405 nm
- c) Serum-Verdünnungen (1/ )
- d) positiv - -.- -.- -
negativ - - + - - + - -
Fig. 11:
- a) Feldsera-Titration
- b) Absorbanz bei 405 nm
- c) Mutterschwein-Sera
Claims (4)
1. Diagnose-Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen PRRSV in
einer biologischen Probe, in dem mindestens ein rekombinan
tes Protein, das einem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot ent
spricht, und geeignete Nachweismittel vorhanden sind.
2. Diagnose-Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die genannten rekombinanten Proteine durch Genetic Enginee
ring in einem Expressionssystem rekombinanter Baculoviren
erhältlich sind, die in einer permissiven Gastzellkultur
multipliziert werden.
3. Diagnose-Kit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die rekombinanten Baculoviren, welche die genannten rekom
binanten Proteine exprimieren, ausgewählt sind aus:
Bezeichnung
ECACC-Zugangsnummer
AcNPV, PRRS2 V94021007
AcNPV, PRRS3 V94011325
AcNPV, PRRS4 V94021008
AcNPV, PRRS5 V94011326
AcNPV, PRRS6 V94011327
AcNPV, PRRS7 V94011328
4. Diagnose-Kit zum Nachweis von PRRSV in einer biologischen
Probe, der Antikörper, die in der Lage sind, das PRRS spe
zifisch zu identifizieren, und die dadurch erhalten wurden,
daß Tiere mit mindestens einem rekombinanten Protein immu
nisiert wurden, das einem der ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot
entspricht, und geeignete Nachweismittel enthält.
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---|---|---|---|
ES09401027A ES2078187B1 (es) | 1994-05-13 | 1994-05-13 | Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes. |
ES09500815A ES2085837B1 (es) | 1994-05-13 | 1995-04-27 | Proteinas recombinantes de prrsv, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes |
DE19517773A DE19517773A1 (de) | 1994-05-13 | 1995-05-15 | Rekombinante PRRSV-Proteine, Diagnostik-Kits und solche rekombinanten PRRSV-Proteine enthaltenden Vakzinen |
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Publication Number | Publication Date |
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ID=8286221
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19549523A Expired - Lifetime DE19549523C2 (de) | 1994-05-13 | 1995-05-15 | Diagnostik-Kits, die rekombinante PRRSV Proteine enthalten |
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---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
-
1994
- 1994-05-13 ES ES09401027A patent/ES2078187B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-27 ES ES09500815A patent/ES2085837B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-10 SI SI9530711T patent/SI0717108T1/xx unknown
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- 1995-05-12 MY MYPI95001259A patent/MY126289A/en unknown
- 1995-05-15 DE DE19549523A patent/DE19549523C2/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4432338A1 (de) * | 1993-09-17 | 1995-05-04 | Iberica Cyanamid | Impfstoff zur Verhinderung des reproduktiven und respiratorischen Syndroms bei Schweinen |
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---|---|
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ES2085837A1 (es) | 1996-06-01 |
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SI0717108T1 (en) | 2005-02-28 |
ES2078187B1 (es) | 1996-07-16 |
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