DE69233270T2

DE69233270T2 - Subeinheits-Impfstoff gegen Hundecoronavirus

Info

Publication number: DE69233270T2
Application number: DE69233270T
Authority: DE
Inventors: Thomas David Kay Huntingdon Brown; Brian Colin Horsburgh
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1991-04-25
Filing date: 1992-04-22
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2012-04-23
Also published as: CA2066940A1; JPH05260976A; ES2213743T3; EP0510773A1; AU645417B2; EP0510773B1; AU1513192A; CA2066940C; DK0510773T3; JP3420258B2; PT510773E; NZ242471A; DE69233270D1; US5661006A; ATE256746T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz kodierend ein CCV Spikeprotein, einen rekombinanten Vektor oder rekombinanten Vektorvirus umfassend solch eine Nukleinsäuresequenz, eine Wirtszelle transformiert mit solch einem rekombinanten Vektor oder infiziert mit dem rekombinanten Vektorvirus, sowie einen Impfstoff gegen CCV Infektion in Hunden.
Das canine Coronavirus (CCV) ist ein Mitglied der bezeichnenden, viralen Familie der Coronaviren. Viren, die zu diesem Genus gehören, sind bekannt dafür, dass sie eine Vielfältigkeit von Tierarten einschliesslich den Menschen infizieren. Sie verursachen verschiedene Krankheiten, wie zum Beispiel Gastroenteritis (im Schwein, Truthähnen, Mäusen, Kälbern, Hunden, Katzen und im Mensch), Speicheldrüseninfektion (in Nagetieren), Atemwegserkrankungen (im Mensch, Schwein, Geflügel und Hunden) und Enzephalitis (im jungen Schwein).
CCV wurde zuerst 1971 von Militärhunden in Deutschland isoliert und wurde als höchst ansteckend befunden und dass es sich rasch unter anfälligen Hunden ausbreitet. Im allgemeinen wird das CCV von mit infektiösen Fäkalien kontaminierten Substanzen eingenommen. Eine orale Infektion führt zu einer viralen Replikation in Epithelzellen des Dünndarms und CCV wurde ebenso in den Darmlymphknoten vorgefunden.
Die Symptome der Krankheit können sich innert 1–3 Tagen nach der Infektion entwickeln und umfassen Erbrechen, Diarrhoe, Magersucht, Depression und Dehydrierung. Die Beständigkeit und Schwere der Symptome ist oft bedingt durch Stress und die Anwe senheit von anderen Viren, Parasiten oder Bakterien. während die enteralen Symptome vorherrschen, wurde auch von respiratorischen Symptomen einschliesslich Ausfluss aus Nase und Auge berichtet.
Hunde sind der einzig bekannte Wirt von CCV. Obwohl eine CCV Inokulation von Katzen und Schweinen zu einer Infektion führt, wird in diesen Arten keine klinische Krankheit durch CCV verursacht. Es gibt keinen Beweis, dass Menschen, Rinder und Mäuse auf CCV anfällig sind.
Präimmunitäts- (Cross Protection) Studien haben gezeigt, dass die Coronaviren untereinander wenig oder keine Immunität induzieren. Zum Beispiel schützt eine experimentelle Infektion von Hunden mit übertragbarem Gastroenteritis-Virus (Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV) von Schweinen oder felinem infektiösem Peritonitisvirus (FIPV) von Katzen diese nicht gegen die Auswirkungen einer anschliessenden CCV Infektion.
Coronaviren bestehen aus einer Gruppe von umhüllten Viren enthaltend ein Genom bestehend aus einer einzelsträngigen RNA von ungefähr 30 Kb: Dieses Genom kodiert unter anderem drei wichtige Strukturproteine: ein Spikeprotein (S), ein Membranprotein (M) und ein Nukleokapsidprotein (N). Das glykosylierte Spikeprotein So wird in gewissen Coronaviren gespalten um S₁ und S₂ zu bilden. Zwei oder drei Kopien von sowohl S₁ wie auch S₂ bilden eine charakteristische CCV Oberflächenstruktur, dem Spike oder Peplomer. Das Spikeprotein und dessen Polypeptid Bestandteile spielen eine wichtige Rolle in der Induktion einer virusneutralisierenden Immunantwort in infizierten Tieren.
Konventionelle CCV Impfstoffe umfassen chemisch inaktivierte Virusimpfstoffe oder modifizierte Lebend-Virusimpfstoffe. Inaktivierte Impfstoffe benötigen jedoch zusätzliche Immunisierungen, enthalten nachteiligerweise Adjuvantien und sind kostspielig herzustellen. Zudem können gewisse infektiöse Viruspartikel den Inaktivierungsprozess überleben und können ein Erkran ken nach der Verabreichung an das Tier verursachen.
Im allgemeinen sind abgeschwächte, lebende Virusimpfstoffe bevorzugt, da diese eine Immunantwort hervorrufen, die oft auf sowohl humoralen wie auch zellulären Reaktionen basiert. Bis anhin können solche auf CCV Stämmen basierenden Impfstoffe nur durch Serienpassagen von virulenten Stämmen in Gewebekultur hergestellt werden. Aufgrund dieser Behandlung werden jedoch unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt, was zu einer Population von Viruspartikeln führt, die in deren Virulent und immunisierenden Eigenschaften heterogen ist. Zusätzlich ist es wohlbekannt, dass solche traditionellen, abgeschwächten, lebenden Virusimpfstoffe ihre Virulenz wiedergewinnen können, was zu einer Krankheit in den inokulierten und zu einer möglichen Ausbreitung des Pathogens in anderen Tieren führt.
Verbesserte Impfstoffe können basierend auf DNS Technologie konstruiert werden, die nur das notwendige und relevante CCV immunogene Material, das fähig ist eine Immunantwort gegen die CCV Pathogene hervorzurufen, enthalten, oder die die genetische, das besagte Material kodierende Information enthalten, und die die obengenannten Nachteile der lebenden und inaktivierten Impfstoffe nicht aufweisen.
In EP 295057 wird ein CCV Impfstoff beschrieben, der ein zellgebundenes CCV Peplomerprotein umfasst. Das in EP 295057 beschriebene, zellgebundene Peplomer kann durch Infizieren einer Zellkultur mit CCV und Aufbrechen der kultivierten Zellen, um das zellgebundene Peplomerprotein zu sammeln, erhalten werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit einer oder mehreren, immunogenen Determinanten eines CCV Spikeproteins kodiert, bereitgestellt, die zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung von Hunden gegen eine CCV Infektion verwendet werden kann.
„Nukleinsäuresequenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeglicher Länge, sowohl auf Ribonukleinsäuresequenzen wie auch Deoxyribonukleinsäuresequenzen. Im Prinzip bezieht sich dieser Begriff auf die Primärstruktur des Moleküls. Demzufolge umfasst dieser Begriff sowohl doppel- und einzelsträngige DNA wie auch doppel- und einzelsträngige RNA sowie Modifikationen davon.
Im allgemeinen bezieht sich der Begriff „Polypeptid" auf eine molekulare Kette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität, bezieht sich nicht auf eine bestimmte Länge des Produktes und kann falls erforderlich in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung; demnach sind unter anderem Peptide, Oligopeptide und Proteine eingeschlossen.
Der Begriff „Polypeptid mit einer oder mehreren, immunogenen Determinanten eines CCV Spikeproteins" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einem oder mehreren Epitopen, die fähig sind, eine schützende Immunantwort in einem Hund gegen CCV Infektion oder Krankheit hervorzurufen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresequenz bereit, die ein Polypeptid mit einer oder mehreren, immunogenen Determinanten des CCV Spikeproteins kodiert, welches eine Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6 hat.
Ebenso eingeschlossen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die eine funktionelle Variante des Polypeptides gemäss SED ID Nr. 2, 4 oder 6 kodieren. Diese funktionellen Varianten sind Polypeptide mit einer Aminosäurensequenz, die von der spezifisch in SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6 offenbarten Aminosäurensequenz hergeleitet ist, die jedoch eine oder mehrere immunogenen Determinanten eines CCV Spikeproteins beibehalten, d. h. besagte Varianten mit einem oder mehreren Epitopen, die fähig sind, eine schützende Immunantwort in einem Hund gegen CCV Infektion oder Krankheit hervorzurufen.
Es versteht sich, dass für das hierin eingeschlossene Poly peptid, das vom CCV-6, Insavc-1 oder Liverpool C54 Stamm hergeleitet ist, natürliche Variationen zwischen individuellen Viren oder Stämmen der caninen Coronaviren bestehen können. Diese variationen können durch (eine) Aminosäurensubstitution(en) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen (einer) Aminosäure(n) in der besagten Sequenz veranschaulicht werden. Aminosäurensubstitutionen, von denen erwärtet werden kann, dass sie biologische und immunologische Aktivitäten nicht wesentlich ändern, wurden beschrieben. Aminosäureersetzungen zwischen verwandten Aminosäuren oder Ersetzungen, die während der Evolution häufig vorgekommen sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhof, M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D. C., 1978. Vol. 5, Suppl. 3). Ausgehend von dieser Information entwickelten Lipman und Pearson eine Methode für einen raschen und sensitiven Proteinvergleich (Science, 227, 1435–1441, 1985) und um die funktionelle Ähnlichkeit zwischen homologen Polypeptiden zu bestimmen. Nukleinsäuresequenzen, die solche homologen, funktionellen Varianten kodieren, sind im Rahmen der Erfindung eingeschlossen. Zudem besteht die Möglichkeit, die rekombinante DNA Technologie zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen, die diese verschiedenen, funktionellen Varianten kodieren, zu verwenden.
Nukleinsäuresequenzen gemäss der Erfindung können von Isolaten von CCV Stämmen, wie zum Beispiel CCV-6, Insavc-1 ( EP 396,193 ), CCV 1–71 (ATCC VR-809) oder CCV TN449 (ATCC VR-2068), hergeleitet werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden hierin zuvor beschriebene Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, die zur Herstellung eines Impfstoffes, um Katzen gegen FIPV Infektion zu schützen, verwendet werden können.
Die in SEQ ID Nr. 1–6 bereitgestellte Information erlaubt es einem Fachmann die Nukleinsäuresequenzen, die die verschiede nen, hierin zuvor erwähnten, funktionellen Polypeptidvarianten, die die entsprechenden, immunologischen Merkmale mit dem spezifisch hierin offenbarten CCV Spikeprotein haben, zu isolieren und zu identifizieren. Die im allgemeinen angewandte Southern Blotting Methode oder Koloniehybridisierung kann zu diesem Zweck verwendet werden (Experiments in Molecular Biology, ed. R. J. Slater, Clifton, U.S.A., 1986; Singer-Sam J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 802–806, 1983; Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). Zum Beispiel wird eine von einem spezifischen CCV Stamm hergeleitete RNA oder cDNA der Elektrophorese unterzogen und transferiert oder danach auf ein Stück Nitrozellulosefilter geblottet. Es ist nun möglich, Nukleinsäuresequenzen des CCV Spikeproteins auf dem Filter mittels Hybridisierung an ein definiertes, markiertes DNA Fragment oder „Sonde" zu identifizieren, d. h. ein (synthetisches) Poly- oder Oligonukleotidsequenzfragment der Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5, das unter spezifischen Bedingungen von Salzkonzentration und Temperatur an die auf dem Filter vorhandenen, homologen Nukleinsäurensequenzen hybridisiert. Nach Waschen des Filters, kann das hybridisierte Material mittels Autoradiographie nachgewiesen werden. Das entsprechende DNA Fragment kann nun vom Agarosegel eluiert werden und dazu verwendet werden, die Synthese einer funktionellen Variante des in SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6 offenbarten Polypeptides zu steuern.
Demzufolge ist eine bevorzugte funktionelle Variante gemäss der Erfindung ein Polypeptid umfassend eine oder mehrere immunogene Determinanten eines CCV Spikeproteins und ist von einer Nukleinsäuresequenz kodiert, die an eine DNA Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1, 3 oder 5 hybridisiert.
Auf eine andere Weise kann die CCV cDNA in einen wie von Huynh et al. beschriebenen (In: D. Glover (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press Oxford, 49–78, 1985) κgt11 Phagen kloniert werden und in einem bakteriellen Wirt exprimiert werden. Rekombinante Phagen können dann mit polyklonalem Serum, das gegen das in SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6 offenbarte, gereinigte CCV Spikeprotein hervorgerufen wurde, gescreent werden, um das Vorhandensein von entsprechenden immunologischen Abschnitten of der Polypeptidvariante zu bestimmen. Die Herstellung des hierin zu verwendenden, polyklonalen Serums, das gegen das CCV Spikeprotein hervorgerufen wurde, wird im Nachfolgenden beschrieben.
Wie in Fachkreisen wohlbekannt erlaubt die Degeneration des genetischen Codes Substitutionen von Basen in einem Codon, was zu einem anderen Codon führt, jedoch nach wie vor dieselbe Aminosäure kodiert, d. h. das Codon für die Aminosäure Glutaminsäure ist sowohl GAT wie auch GAA. Somit ist klar, dass zur Expression eines Polypeptides mit der Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID Nr. 2, 4 oder 6, eine abgeleitete Nukleinsäuresequenz mit einer solchen alternativen Codonzusammensetzung, die sich von der Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID Nr. 1, 3 beziehungsweise 5 unterscheidet, verwendet werden kann.
Zudem sind auch Fragmente der Nukleinsäurensequenzen, die das spezifisch offenbarte CCV Spikeprotein oder funktionelle varianten davon wie hierin zuvor erwähnt kodieren, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Der Begriff „Fragment" wie er hierin verwendet wird bedeutet eine DNA- oder Aminosäurensequenz, die eine Untersequenz der Nukleinsäuresequenz oder des Polypeptides der Erfindung umfasst.
Das besagte Fragment ist oder kodiert ein Polypeptid mit einer oder mehreren immunogenen Determinanten eines CCV Spikeproteins, d. h. mit einem oder mehreren Epitopen, die fähig sind, eine schützende Immunantwort in einem Hund hervorzurufen. Verfahren zur Bestimmung nützlicher PolyPeptidfragmente werden im Nachfolgenden beschrieben. Fragmente können unter anderem durch enzymatische Spaltung von Vorläufer-Molekülen unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen für DNA und Proteasen für Polypep tide hergestellt werden. Andere Verfahren umfassen chemische Synthese der Fragmente oder Expression von Polypeptidfragmenten durch DNA Fragmente.
Typische Sequenzen, die den CCV Spikeprotein Vorläufer kodieren, sind in SEQ ID Nr. 1, 3 und 5 aufgezeigt. Diese cDNA Sequenzen sind ungefähr 4328, 4352 beziehungsweise 4358 Nukleotide lang und kodieren ein Polypeptid von 1443, 1451 beziehungsweise 1453 Aminosäuren.
Eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Sequenz mindestens teil der DNA Sequenz gemäss SEQ ID No. 1, 3 oder 5 besitzt.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung kann von einem bestimmten CCV Stamm isoliert werden und mittels rekombinanter DNA Methoden einschliesslich der Polymerase Kettenreaktion (PCR) Technology vervielfacht werden oder kann in vitro mittels in Fachkreisen wohlbekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden.
Alle Modifikationen, die zu den oben erwähnten funktionellen Varianten der spezifisch exemplifizierten Polypeptide führen, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, so lange die erhaltenen Polypeptide eine oder mehrere immunogenen Determinanten eines CCV Spikeproteins beibehalten.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann an verschiedene DNA Sequenzen, die eine Replikation bewirken und mit denen sie von Natur aus nicht assoziiert oder verknüpft ist, ligiert werden, was zu einem sogenannten rekombinanten Vektormolekül führt, das für die Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet werden kann. Nützliche rekombinante Vektormoleküle werden vorzugsweise zum Beispiel von Plasmiden, Bakteriophagen, Cosmiden oder Viren abgeleitet.
Spezifische Vektoren oder Klonierungsvehikel, die verwendet werden können um Nukleisäuresequenzen gemäss der Erfindung zu klonieren, sind in Fachkreisen wohlbekannt und umfassen unter anderem Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pBR322, die verschiedenen pUC, pGEM und Bluescript Plasmide, Bakteriophagen, z. B. κgt-Wes, Charon 28 und die M13 hergeleiteten Phagen oder virale Vektoren wie zum Beispiel SV40, Adenovirus oder Polyomavirus (siehe auch Rodriguez, R. L. und D. T. Denhardt, Ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Buttersworth, 1988; Lenstra, J. A. et al., Arch. Virol. 110, 1–24, 1990). Die Verfahren, die zur Konstruktion eines rekombinanten Vektormoleküls gemäss der Erfindung verwendet werden, sind in Fachkreisen bekannt und sind unter anderem in Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) wiedergegeben.
Zum Beispiel kann die Insertion der Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in einen Klonierungsvektor einfach erzielt werden, wenn beide Gene sowie das erwünschte Klonierungsvehikel mit demselben Restriktionsenzym(en) geschnitten wurden, da dadurch komplementäre DNA-Termini hergestellt werden.
Andrerseits kann es erforderlich sein, die Restriktionsstellen, die in Form von stumpfen Enden („blunt ends") hergestellt wurden, entweder durch Verdauen der einzelsträngigen DNA oder durch Einfüllen der einzelsträngigen Termini mit einer geeigneten DNA-Polymerase, zu modifizieren. Anschliessend kann eine „Blunt End"-Ligation mit einem Enzym, wie zum Beispiel der T4 DNA Ligase, durchgeführt werden.
Falls erwünscht kann jegliche Restriktionsstelle durch Ligieren von Linkern an die DNA Termini hergestellt werden. Solche Linker können spezifische Oligonukleotidsequenzen, die spezifische Restriktionssstellensequenzen kodieren, umfassen. Der durch ein Restriktionsenzym gespaltene Vektor und die Nukleinsäuresequenz können ebenso mittels Anpolymerisieren von Homopolymeren (homopolymeric tailing) modifiziert werden.
„Transformation" wie hierin verwendet bezieht sich auf das Einführen einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirts zelle, ungeachtet des verwendeten Verfahrens, zum Beispiel direkte Aufnahme oder Transduktion. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann durch autonome Replikation beibehalten werden oder kann andrerseits in das Wirtsgenom integriert werden. Falls erwünscht werden die rekombinanten Vektormoleküle mit geeigneten Kontrollsequenzen, die mit dem designierten Wirt kompatibel sind und die die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenzen regulieren können, bereitgestellt. Zusätzlich zu Mikroorganismen können ebenso von multizellulären Organismen hergeleitete Zellkulturen als Wirte verwendet werden.
Die rekombinanten Vektormoleküle gemäss der Erfindung enthalten vorzugsweise eine oder mehrere Markierungs-Aktivitäten, die dazu verwendet werden können um für die erwünschten Transformanten zu selektionieren, wie zum Beispiel Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz in pBR322, Ampicillin-Resistenz und β-Galaktosidase Aktivität in pUC8.
Eine geeignete Wirtszelle ist ein Mikroorganismus oder eine Zelle, die mit einer ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder mit einem rekombinanten Vektormolekül umfassend solch eine Nukleinsäuresequenz transformiert werden kann und die, falls erwünscht, dazu verwendet werden kann, das besagte, durch die besagte Nukleinsäuresequenz kodierte Polypeptid zu exprimieren. Die Wirtszelle kann prokaryotischen Ursprungs sein, z. B. Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonas Arten; oder eukaryotischen Ursprungs sein wie Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder höhere eukaryotische Zellen wie Insekten, Pflanzen oder Säugetierzellen, einschliesslich HeLa Zellen und Chinese Hamester Ovary (CHO) Zellen. Insektenzellen umfassen die Sf9 Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47–55, 1988). Informationen bezüglich der Klonierung und Expression der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in eukaryotischen Expressionssystemen kann in Esser, K. et el. (Plasmids of Eukaryotes, Springer Verlag, 1986) gefunden werden.
Im allgemeinen werden Prokaryoten zur Konstruktion der für die Erfindung nützlichen, rekombinanten Vektormoleküle bevorzugt. Zum Beispiel sind E. coli K12 Stämme wie DH5α oder JM101 besonders nützlich.
Für eine Expression werden die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in einen Expressionsvektor eingeführt, d. h. die besagten Sequenzen werden funktionell mit Expressions-Kontrollsequenzen verknüpft. Solche Kontrollsequenzen können Promotoren, Enhancer, Operatoren, Inducer, Ribosom-Bindungsstellen etc. umfassen. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vektormolekül bereit umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die das CCV Spikeprotein kodiert, welches funktionell mit Expressions-Kontrollsequenzen verknüpft ist, das fähig ist, die darin enthaltenden DNA Sequenzen in (einer) transformierten Wirtszelle(n) zu exprimieren.
Es versteht sich natürlich, dass die an der ausgesuchten Stelle des Klonierungsvektors eingeführten Nukleotidsequenzen Nukleotide umfassen können, die nicht Teil des tatsächlichen Strukturgens für das erwünschte Polypeptid umfassen oder die nur ein Fragment des kompletten Strukturgens für das erwünschte Protein umfassen, so lange der transformierte Wirt ein Polypeptid mit mindestens einer oder mehreren immunogenen Determinante eines CCV Spikeproteins herstellt.
Wenn die Wirtszellen Bakterien darstellen, umfassen illustrative, nützliche Expressions-Kontrollsequenzen den Trp-Promotor und Operator (Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); den lac-Promotor und Operator (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); den "Outer Membrane Protein"-Promotor (Nakamura, K. und Inouge, M., EMBO J., 1, 771–775, 1982); die Bakteriophagen-κ-Promotoren und Operatoren (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677–4688, 1983); den α-Amylase (B. subtilis)-Promotor und Operator, Terminationssequenzen und andere Expressionssteige rung- und Kontrollsequenzen, die mit der ausgewählten Wirtszelle verträglich sind. wenn die Wirtszelle Hefe ist, umfassen illustrative, nützliche Expressions-Kontrollsequenzen z. B. das α-Paarungshormon. Für Insektenzellen können die Polyhedrin oder p10-Promotoren der Bakuloviren verwendet werden (Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156–65, 1983). Wenn die Wirtszelle von Säugetieren stammt, umfassen illustrative, nützliche Expressions-Kontrollsequenzen den SV-40-Promotor (Berman, P. W. et al., Science, 222, 524–527, 1983) oder z. B. den Metallothionein-Promotor (Brinster, R. L., Nature, 296, 39–42, 1982) oder einen Hitzeschock-Promoter (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949–53, 1985). Um die Genexpression zu maximieren, siehe auch Roberts und Lauer (Methods in Enzymology, 68, 473, 1979).
Demzufolge umfasst die Erfindung ebenso (eine) Wirtszelle(n) transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz oder einem rekombinanten Vektormolekül wie hierin zuvor beschrieben, die fähig ist, das CCV Spikeprotein durch Expression der Nukleinsäuresequenz herzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Polypeptids bereit, das die immunologischen Charakteristika eines CCV Spikeproteins aufweist, d. h. das Polypeptid besitzt eine oder mehrere immunogenen Determinanten eines CCV Spikeprotein, im wesentlichen frei von ganzen Viren oder anderem Protein, mit welchem es normalerweise assoziiert ist.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptid umfassend mindestens Teil der Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID No. 2, 4 oder 6 oder einer funktionellen Variante davon bereit.
Zusätzlich wird in der vorliegendem Erfindung ein Polypeptid hergestellt, das im wesentlichen ein immunogenes Fragment des CCV Spikeproteins umfasst, welches zur Immunisierung von Hunden gegen CCV Infektion oder für diagnostische Zwecke verwendet werden kann. Zum Nachweis solcher brauchbaren immunogenen Fragmente innerhalb einer Aminosäurensequenz sind verschiedene Verfahren bekannt.
Geeignete, immunochemisch aktive Polypeptidfragmente eines Polypeptids gemäss der Erfindung enthaltend (ein) Epitop(e) können mittels des in der Patentanmeldung WO 86/03487, Geysen, H. M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998–4002, 1984), Geysen, H. M. et al. (J. Immunol. Meth. 102, 259–274, 1987) beschriebenen, auf dem sogenannten Pepscan Verfahren basierenden Verfahren gefunden werden, in dem eine Serie von teilweise überlappenden Peptiden, die den Teilsequenzen des kompletten, berücksichtigten Polypeptids entsprechen, synthetisiert und deren Reaktivität mit Antikörpern untersucht wird.
Zusätzlich können eine Zahl von Abschnitten des Polypeptides mit der festgesetzten Aminosäurensequenz auf der Basis von theoretischen Betrachtungen und struktureller Übereinstimmung mit bereits bekannten Epitopen als Epitope designiert werden. Die Bestimmung dieser Abschnitte basiert auf einer Kombination von Hydrophilizitäts-Kriterien gemäss Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824–3828, 1981) und den Sekundärstruktur-Aspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymology 47, 45– 148, 1987).
T-Zell Epitope, die notwendig sein können, können gleichermassen ausgehend von theoretischen Gründen hergeleitet werden, z. B. mithilfe des Berzofsky Amphilizitäts-Kriteriums (Science 235, 1059–62, 1987).
In einer weiteren Variante der Erfindung wird ein Polypeptid mit einer Aminosäurensequenz, die von einer hierin zuvor erwähnten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, verwendet.
Immunisierung von Hunden gegen eine CCV Infektion kann zum Beispiel erreicht werden, indem man den Tieren ein gemäss des hierin zuvor erwähnten Verfahrens hergestelltes Polypeptid in einem immunologisch relevanten Rahmen in Form eines sogenannten Spalt-Impfstoffes ("Subunit-Impfstoff") verabreicht. Der erfindungsgemässe Subunit-Impfstoff kann ein Polypeptid in reiner Form umfassen, gegebenenfalls in Gegenwart eines pharmazeutisch verträglichen Trägers. Das Polypeptide kann gegebenenfalls kovalent an ein nicht-verwandtes Protein gebunden sein, was zum Beispiel bei der Reinigung des Fusionsproduktes von Vorteil sein kann. Beispiele sind β-Galaktosidase, Protein A, Prochymosin, Blutgerinnungsfaktor Xa, etc.
In gewissen Fällen kann die Fähigkeit, neutralisierende Antikörper gegen diese Polypeptide per se hervorzurufen, gering sein. Kleine Fragmente werden vorzugsweise an Trägermoleküle gekoppelt, um deren Immunogenität zu erhöhen. Für diesen Zweck geeignete Träger sind Makromoleküle, wie zum Beispiel natürliche Polymere (Proteine wie Key Hole Limpet Hemocyanin, Albumin, Toxine), synthetische Polymere wie Polyaminosäuren (Polylysin, Polyalanin), oder Mizellen amphiphiler Verbindungen wie Saponine. Andernfalls können diese Fragmente als Polymere davon, vorzugsweise lineare Polymere, bereitgestellt werden.
Polypeptide, die in solchen Subunit-Impfstoffen verwendet werden, können mittels wohlbekannter Verfahren hergestellt werden, d. h. durch Isolieren der besagten Polypeptide von CCV mittels rekombinanter DNA Methoden oder mittels chemischer Synthese.
Falls notwendig können die Polypeptide, die zum Gebrauch in einem Impfstoff vorgesehen sind, in vitro oder in vivo, beispielsweise durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung, modifiziert werden.
Als Alternative zu Subunit-Impfstoffen gibt es lebende Vektorimpfstoffe. Eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz wird mittels rekombinanter DNA-Methoden in einen Mikroorganismus (z. B. ein Bakterium oder Virus) auf solche Weise eingeführt, dass der rekombinante Mikroorganismus immer noch fähig ist sich zu replizieren und dadurch ein Polypeptid, das durch die eingegliederte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zu exprimieren und eine Immunreaktion im infizierten Wirtstier hervorzurufen.
Eine bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektorvirus umfassend eine wie oben beschriebene, heterologe Nukleinsäuresequenz, die fähig ist die DNA Sequenz in (einer) Wirtszelle(n) oder einem mit dem rekombinanten Vektrovirus infizierten Wirtstier zu exprimieren. Der Begriff „heterolog" bedeutet, dass die erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz normalerweise in der Natur im Vektorvirus nicht vorhanden ist.
Zudem umfasst die Erfindung ebenfalls (eine) Wirtszelle(n) oder Zellkultur, die mit dem rekombinanten Vektorvirus infiziert ist, und die fähig ist das CCV Protein durch Expression der Nukleinsäuresequenz zu produzieren.
Zum Beispiel kann die wohlbekannte Methode der in vivo homologen Rekombination verwendet werden, um eine heterologe Nukleinsäurensequenz, z. B. eine erfindungsgemässe Nukleinsäurensequenz, in das Genom des Vektorvirus einzuführen.
Zuerst wird ein DNA Fragment, das einer Insertionsregion des Vektorgenoms entspricht, d. h. eine Region, die zum Einbau einer heterologen Sequenz verwendet werden kann ohne wesentliche Vektorfunktionen zu unterbrechen, wie zum Beispiel diejenigen die für die Infektion oder Replikation notwendig sind, in einen Klonierungsvektor gemäss Standard recDNA-Methoden eingefügt. Insertionsregionen wurden für eine grosse Anzahl von Mikroorganismen beschrieben (z. B. EP 80,806 , EP 110,385 , EP 83,286 , EP 314,569 , WO 88/02022, WO 88/07088, US 4,769,330 und US 4,722,848 ).
Zweitens kann, falls erwünscht, eine Deletion in die Insertionsregion, die im ersten Schritt erhaltenen, rekombinanten Vektormolekül vorhanden ist, eingeführt werden. Dies kann zum Beispiel durch entsprechende Verdauung mit einer Exonuclease III oder durch Behandlung mit einem Restriktionsenzym des rekombinanten Vektormoleküls des ersten Schrittes erzielt werden.
Drittens wird die heterologe Nukleinsäuresequenz entweder in die im rekombinanten Vektor des ersten Schrittes vorhandene Insertionsregion oder anstelle der vom besagten rekombinanten Vektor getilgten DNA eingegliedert. Die DNA Sequenz der Insertionsregion sollte von entsprechender Länge sein, um das Auftreten einer homologen Rekombination mit dem Vektorgenom zu ermöglichen.
Danach können geeignete Zellen mit dem Wildtyp-Vektorvirus infiziert oder mit genomischer Vektor DNA in Gegenwart des rekombinanten Vektors, der die mit den entsprechenden Vektor DNA Sequenzen flankierte Insertion enthält, transformiert werden, wodurch die Rekombination zwischen den entsprechenden Regionen im rekombinanten Vektor und dem Vektorgenom eintritt. Die Generationenfolge des rekombinanten Vektors kann dann in Zellkultur hergestellt werden und kann zum Beispiel genotypisch oder phenotypisch selektiert werden, beispielsweise durch Hybridisierung, durch Ermittlung einer Enzymaktivität, die durch ein mit der heterologen Nukleinsäuresequenz co-integriertes Gen kodiert wird, oder durch Nachweis des antigenen, heterologen Polypeptides, das durch den rekombinanten Vektor auf immunologische Weise exprimiert wurde.
Als nächstes können diese rekombinanten Mikroorganismen den Hunden zur Immunisierung gegeben werden, wonach diese entweder für einige Zeit selber weiter bestehen oder sich sogar im Körper des inokulierten Tieres replizieren, und dadurch in vivo ein Polypeptid, das durch die eingefügte, erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz kodiert wurde, exprimieren, was eine Stimulierung des Immunsystems des inokulierten Tieres zur Folge hat. Die für den Einbau der erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz geeigneten Vektoren können von Viren, wie zum Beispiel den Pockenviren, z. B. dem Vaccinia Virus ( EP 110,385 , EP 83,286 , US 4,769,330 und US 4,722,848 ), Herpesviren, wie zum Beispiel dem felinen Herpesvirus, (caninen) Adenovirus (WO 91/11525) oder Influenzavirus, oder Bakterien, wie zum Beispiel E, coli oder spezifischen Salmonellenarten, hergeleitet werden. Mittels rekombinanter Mikroorganismen dieser Art kann das im Wirt synthetisierte Polypeptid als Oberflächenantigen präsentiert werden. Unter diesen Umständen ist eine Fusion des besagten Polypeptides mit OMP Proteinen oder Pilus Proteinen von zum Beispiel E. coli oder eine synthetische Erbringung von Signal- und Ankersequenzen, die vom Organismus erkannt werden, denkbar. Es ist ebenso möglich, dass das besagte immunogene Polypeptid, falls erwünscht, als Teil eines grösseren Ganzen, im zu impfenden Tier freigegeben wird. In all diesen Fällen ist es ebenso möglich, dass ein oder mehrere immunogene Produkte zur Expression kommen, die Schutz gegen verschiedene Pathogene und/oder gegen verschiedene Antigene eines gegebenen Pathogens erzeugen.
Ein erfindungsgemässer Impfstoff kann durch Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten, eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz umfassenden Vektorvirus infiziert ist, erzeugt werden, wonach Virus enthaltende Zellen und/oder in den Zellen gewachsene rekombinante Vektorviren gegebenenfalls in reiner Form gesammelt werden können, und zu einem Impfstoff, gegebenenfalls in lyophyilisierter Form, entwickelt werden können.
Wirtszellen, die mit einem rekombinanten, erfindungsgemässen Vektormolekül transformiert sind, können ebenso unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression eines durch die besagte Nukleinsäuresequenz kodiertes Polypeptid günstig sind. Impfstoffe können unter Verwendung von Proben der unbearbeiteten Kultur, Wirtszelllysaten oder Wirtszellextrakten hergestellt werden, wenn auch in einer anderen Variante reinere, erfindungsgemässe Polypeptide, bedingt durch deren vorgesehene Verwendung, zu einem Impfstoff entwickelt werden. Um die hergestellten Po lypeptide zu reinigen, werden Wirtszellen, die mit einem rekombinanten, erfindungsgemässen Vektor transformiert wurden, in einem angemessenen Volumen kultiviert und die erzeugten Polypeptide werden von solchen Zellen oder vom Medium, falls das Protein ausgeschieden wird, isoliert.
In das Medium ausgeschiedene Polypeptide können isoliert und mittels Standardmethoden, z. B. Salzfraktionierung, Zentrifugation, Ultrafiltration, Chromatographie, Gelfiltration oder Immunaffinitätschromatographie, gereinigt werden, während intrazelluläre Polypeptide durch anfängliches Sammeln der besagten Zellen, Aufbrechen der Zellen, zum Beispiel mittels Ultraschallaufschluss oder mittels anderer mechanisch aufbrechenden Mittel, wie zum Beispiel der French Press, isoliert werden, gefolgt von Trennung der Polypeptide von den anderen intrazellulären Komponenten und Formieren des Polypeptides zu einem Impfstoff. Zellaufschluss kann ebenso durch chemische (z. B. EDTA) oder enzymatische Mittel, wie zum Beispiel Lysozym-Verdauung, erzielt werden.
Der erfindungsgemässe Impfstoff kann mittels eines konventionellen, aktiven Immunisierungsschemas verabreicht werden: einmalige oder wiederholte Verabreichung auf eine Weise, die mit der Formulierungsdosis verträglich ist, und in solchen Mengen, wie sie prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam und immunogen sind, d. h. die Menge des immunisierenden Antigens oder des rekombinanten Mikroorganismus, die fähig ist das besagte Antigen, das in Hunden eine Immunität gegen einen Challenge durch das virulente CCV induziert, zu exprimieren. Immunität wird definiert als Induktion eines signifikanten Niveaus an Schutz in einer Population von Hunden nach der Impfung im Vergleich zu einer nicht-geimpften Gruppe.
Für lebende, virale Vektorimpfstoffe kann sich die Dosisrate pro Hund zwischen 10⁵–10⁸ pfu bewegen.
Ein typischer Subunit-Impfstoff gemäss der Erfindung um fasst 10 μg–1 mg des erfindungsgemässen Polypeptides.
Die Verabreichung des Impfstoffes kann z. B. intradermal, subkutan, intramuskulär, intraperitonal, intravenös, oral oder intranasal vorgenommen werden.
Zusätzlich kann der Impfstoff auch ein wässriges Medium oder eine wasserenthaltende Suspension enthalten, oft vermischt mit anderen Bestandteilen, z. B. um die Aktivität und/oder die Lagerfähigkeit zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salze, pH-Puffer, Stabilisatoren (wie zum Beispiel Magermilch oder Caseinhydrolysate), Emulgatoren, Adjuvantien zur Verbesserung der Immunreaktion (z. B. Öle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid, Saponin, Polyanionen und amphipatische Substanzen) und Konservierungsmittel.
Es versteht sich, dass ein erfindungsgemässer Impfstoff ebenfalls Immunogene enthalten kann, die mit anderen Pathogenen von Hunden verwandt sind, oder Nukleinsäurensequenzen, die diese Immunogen kodieren, enthalten, wie Antigene des caninen Parvovirus (CPV), caninen Distempervirus, caninen Adenovirus I, caninen Adenovirus II, caninen Parainfluenzavirus, caninen Rotavirus oder Leptospira canicola, um einen multivalenten Impfstoff herzustellen.
Beispiel 1
A.
1. Herstellung von genomischer viraler RNA des CCV-6 und des Liverpool C54 Stammes
Konfluente A-72 Zellen, die in Plastik-Gewebekulturflaschen unter Verwendung der Wellcome Modifikation des Minimal Eagle's Medium (MEM) und 10% fötalem Kälberserum gezüchtet wurden, wurden mit CCV (NVSL Challenge Virus CCV-6 des National Veterinary Service Laboratory, PO Box 844, Ames, Iowa 50010, USA) mit einer Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection, MOI) von ungefähr 0.1 infiziert. Nach 24 Std wurde der Überstand der Kultur gesammelt, auf 4°C gekühlt und Zellmaterial mittels Zentrifugation bei 3000 × g während 15 Min entfernt. Das Virus wurde vom Überstand bei 53.000 × g während 2 Std in einem Beckman Typ 19 Rotor pelletiert. Das Pellet wurde in 5 ml TNE (10 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) unter Verwendung eines Dounce Homogenisators resuspendiert und auf einen 32 ml linearen 20–60% Sucrose-Gradienten in TNE aufgebracht. Das Virus wurde isopyknisch mittels Zentrifugation bei 100.000 × g in einem Beckman SW28 Rotor über Nacht bandiert. Der Gradient wurde fraktioniert und die A₂₈₀ und Dichten der Fraktionen bestimmt. Ein Peak wurde bei der charakteristischen Dichte von 1.18 g/cc identifiziert. Die Peakfraktionen wurden gepoolt, in TNE verdünnt und das vermeintliche Virus mittels Zentrifugation bei 100.000 × g für 2 Std in einem Beckman SW28 Rotor pelletiert. RNA wurde vom Virus-Pellett mittels zweier Vorgehen isoliert:

A. Das Pellet wurde in 0.1 M Tris-Cl pH 8.0 enthaltend 0.1% SDS resuspendiert und für 3 Std bei 50°C mit 20 μg/ml Proteinase K verdaut. Das Gemisch wurde unter Verwendung von mit TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) gesättigtem Phe nol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 49 : 1) deproteinisiert und die Nukleinsäure wurde mittels Ausfällung mit 2.5 Volumina Ethanol/0.3 M Natriumacetat pH 5.2 rückgewonnen. Die Aufbereitung wurde auf einem Tris-borat EDTA 1% Agarosegel enthaltend 0.1% SDS analysiert; eine RNA Bande von hohem Molekulargewicht wurde mit der charakteristischen Mobilität von genomischer RNA von Coronaviren identifiziert.
B. Das Virus-Pellet wurde in 6 M Guanidinium-isothiocyanat/5 mM Natriumcitrat (pH 7.0)/0.1 M Mercaptoethanol/0.5% N-Lauroylsarcosinat homogenisiert und 1 g/ml CsCl wurde zu je 2.5 ml des Homogenats hinzugegeben. Das Gemisch wurde dann auf ein 5.7 M CsCl/0.1 M EDTA Kissen aufgetragen und bei 108.000 × g für 12 Std bei 20°C zentrifugiert. Das RNA Pellet wurde in TE enthaltender 0.1% SDS gelöst. Die Aufbereitung wurde wie hierin zuvor beschrieben analysiert.

2. cDNA Klonierung von CCV genomischer RNA
Erststrang-Synthese von 2 μg CCV genomischer RNA, hergestellt wie hierin zuvor in 1A beschrieben, wurde mit 1 ng eines spezifischen Oligonukleotides (5' TTTTCAAATTGTCTTCTACTT 3') unter Verwendung von 40 Einheiten an AMV reverse Transcriptase in einem Reaktionsvolumen von 25 ml enthaltend 20 mM Tris-Cl (pH 8.3 bei 42°C) , 0.14 M KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dNTP's, 4 mM Dithiothreitol, 25 Einheiten menschlicher plazentaler Ribonuklease Inhibitor geprimt. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 Std bei 42°C inkubiert. Zweitstrang-Synthese wurde durch Zugabe von 46 μl eines Reaktionsgemischs enthaltend 7.6 mM MgCl₂, 0.109 M Tris-Cl pH 7.4, 16.3 mM (NH₄)₂SO₄, 1000 Einheiten/ml RNaseH, 10.000 Einheiten/ml E. coli DNA Polymerase 1 zu der Erststrang-Reaktion und Inkubation bei 12°C für 1 Std gefolgt von Inkubation bei 22°C für eine 1 weitere Std erzielt.
Die Reaktionsprodukte wurden mittels zweier Extraktionen mit mit TE gesättigtem Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 49 : 1) deproteinisiert und mit 2 Volumina an Ethanol/0.3 M Natriumacetat pH 5.2 ausgefällt. Die cDNA wurde mit C-Resten unter Verwendung von terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase mithilfe des vom Hersteller gelieferten Puffers und Bedingungen (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland 20877, USA) ittels Tailing ergänzt. Sie wurde dann auf einer 2 ml Sephacryl S-1000 Säule nach Gösse fraktioiert und cDNA von einer Grösse über 500 Basenpaare wurde gepoolt, mit Ethanol gefällt und in TE gelöst. 50 ng dieser cDNA wurde an 250 ng dG-ergänztes PstI geschnittenes pUC119 angelagert. Das Gemisch wurde in E. coli TG-1 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden herausgesucht und unter Verwendung einer cDNA Sonde, die durch Random Priming der reversen Transkription von CCV genomischer RNA erhalten wurde, auf CCV cDNA Einschübe geprüft. Positive Kolonien wurden mittels PstI Verdauung einer mini-prep DNA auf die Grösse der cDNA Einschübe geprüft. Die Beziehungen zwischen Einschüben wurde durch Restriktionsenzym-Analyse erwiesen. Der Klon pBH1 wurde für eine Sequenzanalyse selektiert. Die Grösse des pBH1 Einschubes (4.0 Kb) war ungenügend um die gesamte CCV Spike Kodierungsregion abzudecken und eine weitere Runde an cDNA Synthese und Klonierung wurde unter Verwendung eines anderen spezifischen Primers (5' CTAGGTAGTAACAC 3') durchgeführt. Die verwendete RNA wurde wie unter 1B hierin zuvor beschrieben isoliert. cDNA Synthese wurde unter Verwendung eines Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim UK, Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG) cDNA Synthese Kits gemäss den Instruktionen des Herstellers erzielt. Zusammenfassend wurde die Erststrangsynthese wiederum unter Verwendung der AMV reversen Transcriptase, die Zweitstrangsynthese mittels Wirkung von E. coli DNA Polymerase I und RNaseH erzielt. Die Enden der cDNA wurden unter Einwirkung von T4 DNA Polymerase abgestumpft (blunt ended). Die cDNA wurde unter Verwendung von T4 DNA Ligase in SmaI-geschnittenes, phosphatiertes pUC18 ligiert und die DNA wurde in E. coli TG1 transformiert. Ampicillin resistente Klone wurden anfänglich unter Verwendung von blau/weisser Selektion auf X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) Platten auf Einschübe geprüft. Weisse Kolonien wurden herausgesucht und wie oben beschrieben auf die Anwesenheit von CCV cDNA Einschübe geprüft. Klon pBH2 (Grösse 2.8 Kb) wurde für eine Sequenzanalyse selektiert.
Die gleiche Strategie wie in Beispiel 1.1.B und 1.2 für den CCV Stamm CCV beschrieben, wurde zur Isolation des Spikegens des CCV C54 Stammes durchgeführt. Die überlappenden Klone pBH3, pBH4 und pBH11 deckten das Spike-Gen bis zum stumpfen Ende ab.
3. DNA Sequenzierung
Die cDNA Einschübe der Klone pBH1, pBH2 und pBH3, pBH4 und pBH11 wurden mittels dem Sanger Dideoxy Kettenterminations-Verfahren sequenziert. Dieser Shotgun-Approach wurde falls erforderlich durch Sequenzieren von spezifischen Oligonukleotid-Primern an doppelsträngigen Plasmid-DNA-Matrizen ergänzt. Für die Shotgun Analyse wurde die eingeschobene DNA von den Vektorsequenzen herausgeschnitten, zirkularisiert, Ultraschallaufschluss ausgesetzt, nach Grösse auf Agarosegelen selektiert und in SmaI-geschnittenes, phosphatiertes M13mp8 kloniert. Die Shotgun Sequenzdaten wurden unter Verwendung der DBUTIL und DBAUTO Programme von Staden zusammengestellt und mittels der ANALYSESEQ/NIP Packungen von Staden analysiert. A VAX 8350 und micro VAX 3100 (Digital Equipment Corporation) wurden verwendet. Die Sequenzdaten sind in SEQ ID NO: 1 und 5 dargestellt.
B.
1. Herstellung genomischer viraler RNA des Insavc-1 Stammes
Konfluente A-72 Zellen, die in Plastik-Gewebekulturflaschen unter Verwendung der Wellcome Modifikation des Minimal Eagle's Medium (MEM) und 10% F.C.S. gezüchtet wurden, wurden mit dem CCV Stamm Insavc-1 (Bert) (Intervet Labs.) mit einer m.o.i. von ungefähr 0.1 infiziert. Nach 48 Std wurde der Überstand der Kultur gesammelt, auf 4°C gekühlt und Zellmaterial mittels Zentrifugation bei 3000 × g während 15 Min entfernt. Das Virus wurde vom Überstand bei 53.000 × g während 2 Std in einem Beckman Typ 19 Rotor pelletiert. Das Pellet wurde in 3.5 mls 6 M Guanidinium Isothiocyanat/5 mM Natriumcitrat (pH 7.0), 1 M Mercaptoethanol, 0.5% N-Lauroylsarcosinat) homogenisiert.
Das Homogenat wurde auf ein 5.7 M CsCl Kissen (1 ml) aufgetragen und bei 108000 × g für 18 Std bei 18°C zentrifugiert. Das RNA Pellet wurde in TE enthaltender 0.1% SDS gelöst, dann zweimal mit 2.5 Volumina Ethanol/0.3 M NaOAc pH 5.2 gefällt. Die Aufbereitung wurde auf einem Trisborat EDTA 1% Agarosegel enthaltend 0.1% SDS analysiert; eine RNA Bande von hohem Molekulargewicht wurde mit der charakteristischen Mobilität von genomischer RNA von Coronaviren identifiziert.
2. cDNA Klonierung von CCV genomischer RNA
Erst- und Zweitstrang-Synthese von 2 μg CCV genomischer RNA wurde, hergestellt wie hierin zuvor beschrieben, mit oligo dT und Zufalls-Pentanukleotiden des Boehringer cDNA Synthesekits unter den durch das Protokoll des Herstellers spezifizierten Bedingungen geprimt.
Die durch diese Reaktion hergestellte, resultierende cDNA mit stumpfen Enden (blunt ended) wurde unter Verwendung von T4 DNA Ligase in SmaI-geschnittenes, phosphatiertes pUC 119 ligiert und die DNA wurde in E. coli TG-1 transformiert. Ampicillin resistente Klone wurden anfänglich unter Verwendung von blau/weisser Selektion auf X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) Platten auf Einschübe geprüft. Weisse Kolonien wurden herausgesucht und unter Verwendung von zufallsgeprimter CCV RNA als Sonde auf die Anwesenheit von CCV cDNA Einschübe geprüft. Fünf positive Klone wurden identifiziert.
Plasmid pBH6 wurde unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) generiert. Sequenzinformation der Enden von pBH5 und pBH7 ermöglichte das Design der Primer pBH7 und pBH8. Eine Not 1. Stelle wurde in die Oligos eingefügt um das Klonieren zu erleichtern. Kurz gesagt wurde ungefähr 1 ng der Erstrang-Reaktion wie hierin zuvor beschrieben mittels zwei Extraktionen mit mit TE gesättigter Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 49 : 1) deproteinisiert, über eine G50 Spinsäule passiert und mit 2 Volumina Ethanol/0.3 M Natriumacetat pH 5.2 gefällt. Die DNR : RNA Hybride wurden in 15 μl TE resuspendiert. Die PCR Reaktion wurde mittels des Techne programmierbaren Dri-block PHC-1 durchgeführt.
Das erhaltene Fragment wurde in Phenol/Chloroform Ethanol wie zuvor gefällt und in 20 μl TE gefällt. Die DNA wurde mit Not 1 unter den vom Enzymhersteller empfohlenen Bedingungen gespalten und auf einem Gel eluiert. Das Not 1 Fragment wurde dann in einen Not 1-geschnitten, phosphatierten Vektor unter Verwendung von T4 DNA Ligase ligiert und die DNA in E. coli TG-1 transformiert. Klone, die Ein schübe enthielten, wurden wie zuvor beschrieben identifiziert.
3. DNA Sequenzierung
Die cDNA Einschübe der Klone pBH5, pBH7, pBH8, pBH9 und pBH10 und der PCR Einschub pBH6 wurden mittels der Sanger Dideoxy Kettenterminations-Verfahren wie von Barrell und Bankier beschrieben (Methods in Enzymology 155, 51–93, 1987) sequenziert. Dieser Shotgun-Approach wurde falls erforderlich durch Sequenzieren von spezifischen Oligonukleotid-Primern an doppelsträngiger oder einzelsträngiger (f1 Ursprung in pUC 119) Plasmid-DNA ergänzt.
Für die Shotgun Analysen wurde der DNA-Einschub von den Vektorsequenzen herausgeschnitten, mit sich selbst ligiert, Ultraschallaufschluss ausgesetzt, nach Grösse auf 1% Agarosegelen selektiert, in Sma I-geschnittenes, phosphatiertes M13mp8 kloniert. Die Shotgun Sequenzdaten wurden unter Verwendung der SAP Programme von Staden zusammengestellt und analysiert: A Vax 8350 und MicroVax 3100 (Digital Equipment Corporations) wurden verwendet. Die Sequenzdaten sind in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Beispiel 2
2.1 Herstellung des Vaccinia Virus Vac4b-C6
2.1.1 Zusammenstellung des CCV6 Spike Protein-Gens in voller Länge
Die kodierende Region in voller Länge des S Gens von CCV wurde von 2 überlappenden cDNA Klonen, BH1 und BH2, rekonstruiert. Die Klonierungsstrategie ist in 1 dargestellt. Der 3.0 Kb Einschub von pBH1 ist identisch zu S und 1b. Um S zu exprimieren, musste die Polymerse Kodierungssequenz entfernt werden. Die Sequenz unmittelbar 5' des beginnende Methionin CTAAACTTTGGTAATCACTTGG TTAATGTGCC ATG wurde durch zielgerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis) modifiziert. Vier Basen, ATCC wurden zwischen die Basen TGG und TTA eingeschleift um eine einzigartige BamHI Stelle, GGATCC, zu erzeugen. Mutanten wurden mittels Restriktionsenzym Verdauung gescreent. Positive Klone wurden über diese Stelle sequenziert, da das in der Mutagenesereaktion verwendete Klenow Fragment von E. coli DNA Polymerase unspezifische Mutationen in einer sehr geringen Häufigkeit einführen kann. Eine Mutante, die die eingeführte BamHI Stelle enthielt, wurde selektiert und pBH1-bam benannt. Dieses Plasmid überlappte pBH2 um ungefähr 300 Bp. Eine einzigartige AflII Stelle wurde in dieser Überlappungsregion lokalisiert. Die proximale S Kodierungssequenz wurde von pBH1-bam als ein 1.5 Kb AflII-SphI Fragment isoliert und in AflII-SphI verdautes pBH2 ligiert um pCCV6 zu generieren. Die S Kodierungssequenz in voller Länge wurde als ein 4.4 Kb BamHI Fragment isoliert, dann in die BamHI Stelle des Übertragungsvektors RK19 ligiert um pRKCCV6 zu bilden. Korrekte Orientierung des Gens wurde durch Restriktionsenzym-Verdauung bestätigt. Demzufolge enthält das Plasmid RKCCV6 das CCV6 S Gen downstream des 4b Promotors und ist von TK Kodierungssequenzen flankiert.
2.1.2 Isolierung des rekombinanten Virus
Rekombinante Vaccinia Viren wurden durch konventionelle Verfahren konstruiert (Mackett & Smith, J. Gen. Virol. 67, 2067–2082, 1986). PRKCCV6 wurde in Vaccinia Virus infizierte Zellen transfektiert und rekombinante Viren wurden mittels Dot-Blot Hybridisierung unter Verwendung von zufallsgeprimtem, ³²P markiertem CCV Spike-Gen als Sonde identifiziert. Plaque Reinigung und Screening wurden 3 mal wiederholt bevor Bestände hergestellt wurden. Die von pRKCCV6 hergeleitete Rekombinante wurde Vac4b-C6 be nannt.
2.2. Herstellung des Vaccinia Virus Vac4b-IN
2.2.1. Zusammenstellung des CCV6 Insavc-1 Spike Protein-Gens in voller Länge
Das Insavc-1 (Bert) S Gen wurde von 3 überlappenden cDNA Klonen, BH8, BH9 und BH10, zusammengesetzt. Die Klonierungsstrategie ist in 2 wiedergegeben. Verdauung von pBH8, das sich über die Mitte des S Gens erstreckt, mittels PvuII und HindIII ergab ein 1.4 Kb Fragment. Dieses Fragment wurde in einen PvuII-HindIII geschnittenen Vektor, pING14.2 ligiert, um pINGMS zu bilden. Dieses Plasmid wurde mittels HindIII linearisiert, phosphatiert und gel-eluiert. Die 3' S Gen-Kodierungssequenz, die als ein 1.1 Kb HindIII Fragment von pBH10 isoliert wurde, wurde in HindIII geschnittenes pINGMS subkloniert um pINGM3'S zu ergeben. Die korrekte Orientierung des klonierten HindIII Fragmentes wurde mittels Restriktionsenzym Verdauung bestätigt. Bevor die restliche Kodierungssequenz von pBH9 herausgeschnitten wurde wurde eine einzigartige BaHIm Stelle 10 Bp upstream des Peplomer AUG Startcodons mittels zielgerichteter Mutagenese eingeführt (2). Die 5' Kodierungssequenz des S Gens wurde als ein 1.9 Kb PvuII Fragment isoliert und die restliche S Gen-Kodierungssequenz, die als ein 2.5 Kb PvuII partielles EcoR1 Fragment von pING3'S isoliert wurde, wurde in einer Zwei-Fragment Ligation an BamHI-EcoRI verdautes pUC118 ligiert. Die vollständige S Protein Gen-Kodierungssequenz wurde als ein 4.4 Kb BamHI Fragment isoliert und in den BamHI geschnittenen Übertragungsvektor pRK19 subkloniert, um pRKINSAVC-1 zu erzeugen. Die korrekte Orientierung des Genes wurde mittels Restriktionsenzym Verdauung bestätigt. Demzufolge enthält das Plasmid RKINSAVC-1 das CCV-INSAVC-1 S Gen downstream des Vaccinia 4b Promotors und ist von TK Kodierungssequenzen flankiert.
2.2.2 Isolierung des rekombinanten Vaccinia Virus
Plasmid RKINSAVC-1 wurde verwendet, um die S Gen-Kodierungssequenz mittels Transfektion in das Vaccinia Virus einzuführen und Selektion für TK^– Rekombinante wurde wie von Mackett and Smith (1986, ibid) beschrieben durchgeführt. Rekombinante Virus Isolate, die mittels Dot-Blot Hybridisierung mit einer ³²P markiertem CCV6 S DNA Sonde identifiziert wurden, wurden drei Runden von Plaque Reinigung unterzogen und Virusbestände wurden hergestellt. Die von RKINSAVC-1 hergeleitete Rekombinante wurde Vac4b-IN benannt.
2.3. Herstellung des Vaccinia Virus Vac4b-C54
2.3.1. Zusammenstellung des CCV6 54 S Protein-Gens in voller Länge
Die C54 S Genkodierungssequenz wurde von 3 überlappenden Klonen, pBH3, pBH4 und pBH11, zusammengesetzt. Eine einzigartige BamHI Stelle wurde 10 Bp upstream des Peplomer AUG Startcodons mittels zielgerichteter Mutagenese im proximalen Klon pBH3 erzeugt, um pBH3-bam zu ergeben (3). Ein 2.0 Kb AflIII-EcoRI Fragment wurde von diesem Plasmid isoliert und mit AflIII-EcoRI verdautem pBH4 ligiert um pBH5'MS zu ergeben. Dieses Plasmid wurde mittels HindIII geschnitten, phosphatiert und geleluiert. Die 3' Gen-Kodierungssequenz wurde als ein 1.1 Kb HindIII Fragment von pBH11 isoliert, dann mit HindIII verdautem pBH5'MS ligiert, um pBHC54 zu ergeben. Die korrekte Orientierung des subklonierten HindIII Fragmentes wurde mittels Restriktionsenzym Verdauung bestätigt. Das C54 S Gen in voller Länge wurde mittels Verdauung mit BamHI aus pBHC54 herausgeschnitten und. in den BamHI geschnittnen Übertragungsvektor RK19 ligiert, um pRKC54 zu erzeugen. Gleichermassen wurde die Orientierung des S Genes mittels Restriktionsenzym Verdauung bestimmt. Demzufolge enthält das Plasmid RKC54 das CCV C54 S Gen downstream des 4b Promotors und ist von TK Kodierungssequenzen flankiert. Die Klonierungsstrategie ist in 3 dargestellt.
2.3.2 Isolierung des rekombinanten Vaccinia Virus
Plasmid RKC54 wurde in Vaccinia Virus infizierte Zellen transfektiert. TK^– Rekombinante wurden unter Verwendung von BUdR (Mackett and Smith, 1986, ibid) selektiert. Rekombinante Virus Isolate wurden mittels Dot-Blot Hybridisierung identifiziert und drei Runden von Plaque Reinigung unterzogen bevor Bestände hergestellt wurden. Die von pRKC54 hergeleitete Rekombinante wurde Vac4b-C54 benannt.
Beispiel 3
Immunisierungsexperimente mit lebendem rekombinantem Vaccinia Impfstoff
3.1. Immunisierung
Katzen wurden mit den folgenden Impfstoffen (10⁷ pfu/Katze) geimpft:

(a) 4 Katzen – Vac4b-IN
(b) 4 Katzen – Vac4b-C6
(c) 2 Katzen – Vac4b-gB (Vac4b-gB ist rekombinantes Vaccina Virus das das Cytomegalovirus Glykoprotein gB unter Kontrolle des 4b Promotors exprimiert)
(d) 2 Katzen – nicht geimpft

Allen Katzen wurde vor der Impfung Blut abgenommen (Bleed A). 3 Wochen nach der Impfung wurde den Katzen wiederum Blut abgenommen (Bleed B) und anschliessend wiederholt wie zuvor geimpft.
2 Wochen nach der wiederholten Impfung wurde allen Katzen Blut abgenommen (Bleed C).
3.2. Immuno-Präzipitation
Canine A72 Zellen wurden mit einer m.o.i. von ungefähr 10 mit den rekombinanten Viren oder zum Schein infiziert, für 16 Stunden inkubiert und für 1 Stunde wurde Methionin enthalten. Infizierte Zellen wurden mit ³⁵S Methionin markiert und für 30 Min inkubiert, gewaschen und anschliessend in R.l.P.A. Puffer lysiert. 1 μl Katzen Antiserum (Bleed C) wurde zu dem radiomarkierten Lysat hinzugegeben und für 60 Min auf Eis inkubiert. Protein G wurde hinzugegeben und für 60 Min auf Eis inkubiert. Nach Waschen des Proteins G in R.l.P.A. Puffer und PBS Puffer, wurden die gebundenen Proteine mit 2% SDS 2% 2-Mercaptoethanol rückgewonnen. Die Proteine wurden auf einem 10% SDS Polyacrylamid Gel aufgetrennt.
Seren von Bleed C fällten das Spike Protein falls den Katzen Vac4b-C6 und Vac4b-IN gegeben wurde. Demzufolge antworteten die Katzen, die mit dem Vaccinia Virus enthaltend die Spike Gene immunisiert wurden, mit Antikörpern gegen die Spike Gene.
Legenden zu den Figuren
1: zeigt die Klonierungsstrategie für die Konstruktion des Plasmids pRKCCV6 von den Plasmiden pBH1 und pBH2.
2: zeigt die Klonierungsstrategie für die Konstruktion des Plasmids pRKINSAVC-1 von den Plasmiden pBH8, pBH10 und pBH9.
3: zeigt die Klonierungsstrategie für die Konstruktion des Plasmids pRKC54 von den Plasmiden pBH3, pBH4 und pBH11.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein DNS Molekül kodierend ein Polypeptid mit mindestens einer immunogenen Determinante des CCV Spikeproteins, wobei das besagte CCV Spikeprotein eine Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID No. 2, 4 oder 6 besitzt, wobei das besagte Polypeptid fähig ist; eine schützende Immunantwort in einem Hund gegen CCV Infektion oder Erkrankung hervorzurufen.
Ein DNS Molekül gemäss Anspruch 1, wobei das besagte DNS Molekül die Nukleinsäuresequenzgemäss SEQ ID No. 1, 3 oder 5 besitzt.
Ein rekombinantes Vektormolekül umfassend ein DNS Molekül gemäss Anspruch 1 oder 2, funktionell verbunden mit einer Expressions-Kontrollsequenz.
Ein rekombinantes Vektorvirus enthaltend ein heterologes DNS Molekül gemäss Anspruch 1 oder 2.
Eine Wirtszelle transformiert mit einem rekombinanten Vektormolekül gemäss Anspruch 3.
Eine Wirtszelle infiziert mit einem rekombinanten Vektorvirus gemäss Anspruch 4.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides mit einem oder mehreren Epitopen, das fähig ist eine schützende Immunantwort in einem Hund gegen CCV Infektion oder Erkrankung hervorzurufen, wobei das Verfahren (a) das Kultivieren von Wirtszellen gemäss Anspruch 5 oder 6 unter Bedingungen unter denen die Nukleinsäuresequenzexprimiert wird, und (b) das Isolieren des Polypeptides von der Kultur umfasst.
Ein Impfstoff zum Schutz von Hunden gegen CCV Infektion oder Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass es ein rekombinantes Vektorvirus gemäss Anspruch 4 oder eine Wirtszelle gemäss Anspruch 5 oder 6 zusammen mit einem verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines CCV Impfstoffes umfassend die Schritte des Kultivierens einer infizierten Wirtszelle gemäss Anspruch 6, des Sammelns des rekombinanten Vektorvirusmaterials und des Formulierens des Materials in eine pharmazeutische Zubereitung mit immunisierender Aktivität umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines CCV Impfstoffes, wobei das Verfahren (a) das Kultivieren von Wirtszellen gemäss Anspruch 5 oder 6 unter Bedingungen unter denen die Nukleinsäuresequenzexprimiert wird, und (b) das Isolieren des Polypeptides von der Kultur, und (c) das Formulieren des isolierten Polypeptides in eine pharmazeutische Zubereitung mit immunisierender Aktivität umfasst.