DE60121545T2

DE60121545T2 - Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen syndroms und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60121545T2
Application number: DE60121545T
Authority: DE
Inventors: S. Kay Minneapolis FAABERG; Kurt D. Roseville ROSSOW
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-08
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-02-09
Also published as: EP1255815A1; WO2001059077A1; DE60121545D1; ES2267719T3; CA2400583A1; US7041443B2; US20030086945A1; EP1255815B1; DK1255815T3; ATE333500T1

Description

Diese Anmeldung beansprucht den Nutzen der folgenden Vorläufigen U.S.-Anmeldungen: Seriennr. 60/181,041, eingereicht am 8. Februar, 2000; Seriennr. 60/193, 220, eingereicht am 30. März, 2000; Seriennr. 60/206, 624, eingereicht am 24. Mai, 2000; Seriennr. 60/215, 373, eingereicht am 29. Juni, 2000; und Seriennr. 60/260, 041, eingereicht am 5. Januar, 2001, Aktennummer 110. 0125 0164, mit dem Titel PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS AND METHODS OF USE.
HINTERGRUND
Das Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) ist ein Mitglied der Familie Arteriviridae in der Ordnung Nidovirales (Cavanagh et al., Virol., 176, 306–307 (1990)), das reproduktives Versagen beim Zuchtschwein und respiratorische Probleme bei jungen Schweinen verursacht (siehe Rossow, Vet. Pathol., 35, 1–20 (1998)). Das Syndrom wurde zuerst 1987 als eine „rätselhafte Schweinekrankheit" in den Vereinigten Staaten erkannt und wurde 1990 in Europa entdeckt. Ein Stamm von PRRSV, der in Europa vorherrschend ist, ist isoliert worden und wird als das Lelystad-Virus bezeichnet (Wensvoort et al., Vet. Q., 13, 121–130 (1991)). Ein Nordamerikanisches PRRSV, bezeichnet als VR-2332, ist isoliert worden (Collins et al., J. Vet. Diagn. Investig., 4, 117–126 (1992)). Die Krankheit ist auch als das Wabash-Syndrom, rätselhafte Schweinekrankheit, porcines reproduktives und respiratorisches Syndrom; Schweineseuche, porcines epidemisches Abort- und respiratorisches Syndrom, blaue Abort-Krankheit, Blauohren-Krankheit, Abortus blau und seuchenhafter Spätabort der Schweine bezeichnet worden. Die Krankheit ist durch reproduktives Versagen bei trächtigen Sauen und respiratorische Probleme bei Schweinen in allen Altersgruppen charakterisiert. Die Krankheit hat einen signifikanten, negativen Einfluss auf die Schweineindustrie.
PRRSV ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus mit Hülle. Die 3'-polyadenylierte RNA des Virus mit einer 5'-Kappenstruktur ist polycystronisch, enthaltend (5' zu 3') zwei große offene Replicase-Leserahmen (ORFs), 1a und 1b, und einige kleinere ORFs. In der infizierten Zelle produzieren Arteriviren einen ineinandergeschachtelten Satz von sechs bis acht coterminalen, subgenomischen Haupt-mRNAs (sgmRNAs), wobei angenommen wird, dass jede nur den jeweiligen 5'-terminalen ORF exprimiert. Diese sgmRNAs haben eine Führungssequenz, die vom 5'-Ende des Genoms stammt und die an spezifischen Leaderkörper-Verbindungsstellen, die stromabwärts liegen, durch einen unklaren, diskontinuierlichen Transkriptionsmechanimus verbunden wird (Lai, Adv. Exp. Med. Biol., 380, 463–471 (1995)). Die sgmRNAs von PRRSV codieren vier Glycoproteine (GP2 bis 5, die durch die sgmRNAs 2 bis 5 codiert werden), ein nicht glycosyliertes Membranprotein (M, durch sgmRNA 6 codiert) und ein Nucleokapsid-Protein (N, codiert durch sgmRNA 7). Der Stamm des europäischen Prototyps von PRRSV, Lelystad, enthält alle sechs dieser Proteine im Viruspartikel, aber nur von den Proteinen, die durch die ORFs 5 bis 7 codiert werden, ist schlüssig dargelegt worden, dass sie im Virion der Nordamerikanischen Isolate vorhanden sind.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenz-Vergleiche der 3'-terminalen ORFs 2 bis 7 haben gezeigt, dass es signifikante Unterschiede zwischen den PRRSV-Stämmen gibt, die in Europa beheimatet sind, und jenen, die in Nordamerika gefunden werden (Kapur et al., J. Gen. Virol., 77, 1271–1276 (1996), Murtaugh et al., Arch. Virol., 40, 1451–1460 (1995)). Eine wesentliche Variation erfolgt auch unter den Nordamerikanischen PRRSV-Isolaten. Ein genotypischer Vergleich zwischen den Stämmen VR-2332 und Lelystad hat offengelegt, dass der ORF 1a von VR-2332 sowohl in der Länge als auch in der Sequenz erheblich verschieden von jenem von Lelystad ist, während der ORF 1b relativ konserviert zwischen den zwei Stämmen von PRRSV ist. Die 5'-Leadersequenz von VR-2332 war 31 Basen kürzer als jene von Lelystad und unterschied sich beträchtlich in der Nucleotidsequenz. Regionale Aminosäuresequenz-Vergleiche legten auch offen, dass die Proteine zwischen diesen Domänen nicht gut konserviert waren, obwohl die erkannten funktionellen Domänen der ORF 1a-Proteine in beiden Stämmen vorhanden waren. Daher sind sie in den Genen, die strukturelle Proteine codieren, verschieden, obwohl diese zwei PRRSV-Stämme ähnliche Krankheiten verursachen.
PRRSV verursacht weiterhin signifikante wirtschaftliche Verluste überall in der Welt. Impfstoffe sind erhältlich, aber sie basieren auf einem PRRSV-Stamm, und es gibt Hinweise, dass die PRRSV-Stämme auf den antigenen und genetischen Ebenen variieren. Zusätzlich, da das Virus in Europa und den Vereinigten Staaten identifiziert wurde, sind weiterhin neue Krankheits-Phänotypen aufgetaucht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt die Identifizierung eines neuen Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) dar. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass es ein großes Ausmaß an Nucleotidsequenz-Variation zwischen dem europäischen PRRSV, das mit europäischen Ausbrüchen der rätselhaften Schweinekrankheit (MSD) assoziiert ist, und dem nordamerikanischen PRRSV gibt, das mit nordamerikanischen Ausbrüchen von MSD assoziiert ist. Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „europäisches PRRSV" und „europäischer Stamm" austauschbar verwendet und bezeichnen Stämme von PRRSV, die in Europa vorherrschend sind. Ein Beispiel eines „europäischen PRRSV", das auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist der prototypische europäische Stamm Lelystad, der von der Collection Nationale De Cultures De Microorganisms, Institut Pasteur, Frankreich, als Hinterlegungsnummer I-1102 erhältlich ist (siehe Wensvoort et al., US-Patent 5,620,691). Die Nucleotidsequenz des Lelystad-Stamms ist unter der Genbank-Zugangsnummer NC_002533 erhältlich. Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „nordamerikanisches PRRSV" und „nordamerikanischer Stamm" austauschbar verwendet und bezeichnen Stämme des PRRSV, die in Nordamerika vorherrschend sind. Ein Beispiel eines „nordamerikanischen PRRSV", das auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist der prototypische nordamerikanische Stamm VR-2332, der von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer VR-2332 erhältlich ist. Die Nucleotidsequenz des VR-2332-Stamms ist unter der Genbank-Zugangsnummer U87392 erhältlich.
Das hierin beschriebene PRRSV ist früher nicht beschrieben worden und war mit einem nordamerikanischen Ausbruch von MSD assoziiert, hat aber unerwarteterweise und überraschenderweise eine Nucleotidsequenz, die mehr Ähnlichkeit zu europäischen PRRSV-Stämmen aufweist als zu nordamerikanischen PRRSV-Stämmen. Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck „dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV" und „dem europäischen Stamm ähnlicher Stamm" austauschbar verwendet und bezeichnet das PRRSV der vorliegenden Erfindung. Die Charakteristika des dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV sind hierin beschrieben.
Die vorliegende Erfindung liefert ein isoliertes Virus, das unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-2194 hinterlegt ist, und eine isolierte Zelle, die das Virus umfasst. Durch die Erfindung wird auch ein isoliertes Virus bereitgestellt, das ein RNA-Polynucleotid einschließt, das die RNA-Nucleotidsequenz einschließt, die der SEQ ID NO: 1 entspricht. Die Erfindung liefert ein isoliertes Polynucleotid, das die Sequenz SEQ ID NO: 1 einschließt. Das isolierte Polynucleotid kann mindestens etwa 99% Identität mit einem Polynucleotid aufweisen, das die Sequenz hat, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, wobei ein GAP-Algorithmus mit Standardparametern verwendet wird und wobei das Polynucleotid in einer Zelle repliziert.
Es wird auch ein Vektor, der ein Polynucleotid einschließt, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz einschließt, und ein Polypeptid geliefert, das eine Aminosäuresequenz einschließt, die aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2–10, ausgewählt wurde. Es ist vorstellbar, dass die Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens etwa 95% Identität zu SEQ ID NO: 2, mindestens etwa 99% Identität zu SEQ ID NO: 3, mindestens etwa 98% Identität zu SEQ ID NO: 4, mindestens etwa 94% Identität zu SEQ ID NO: 5, mindestens etwa 95% Identität zu SEQ ID NO: 6, mindestens etwa 91% Identität zu SEQ ID NO: 7, mindestens etwa 99% Identität zu SEQ ID NO: 9 oder mindestens etwa 99,5% Identität zu SEQ ID NO: 10 aufweist, auch im Bezug auf die vorliegende Erfindung nützlich sein können.
Die Beschreibung beschreibt einen Antikörper, der spezifisch ein dem europäischen Stamm ähnliches Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) bindet, und liefert ein Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers. Das Verfahren schließt das Verabreichen eines Viruspartikels, das ein RNA-Polynucleotid einschließt, das die RNA-Nucleotidsequenz einschließt, die der SEQ ID NO: 1 entspricht, oder eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz einschließt, die aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2–10, ausgewählt wird, oder eines Polynucleotids, das das Polypeptid codiert, an ein Tier ein. Das Partikel, Polypeptid oder Polynucleotid wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Produktion eines Antikörpers zu verursachen, der für das Viruspartikel spezifisch ist. Der Antikörper kann ein polyclonaler Antikörper oder ein monoclonaler Antikörper sein, und das Verfahren kann darüber hinaus das Isolieren des Antikörpers einschließen. Durch die Beschreibung wird auch der Antikörper erwähnt, der durch das Verfahren produziert wird.
Verfahren zum Nachweisen eines PRRSV sind in der Beschreibung beschrieben. Ein in vitro-Verfahren schließt das Inkontaktbringen eines Viruspartikels, zum Beispiel einer biologischen Probe, mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, um einen Komplex mit einem Viruspartikel zu bilden, und Nachweisen des Komplexes ein, wobei das Vorhandensein des Komplexes auf das Vorhandensein eines PRRSV hinweist. Das Verfahren kann auch verwendet werden, um PRRSV in einem porcinen Individuum nachzuweisen. Es wird auch ein Kit für die Verwendung im Nachweisen von PRRSV in einem porcinen Individuum beschrieben. Der Kit schließt den Antikörper der Erfindung und Anweisungen für das Verwenden des Antikörpers ein.
Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines europäischen Stamm ähnlichen PRRSV werden auch geliefert. Die Verfahren schließen Inkontaktbringen eines viralen Polynucleotids mit einem ersten Primer und einem zweiten Primer unter Bendingung ein, die geeignet sind, um ein nachweisbares Amplifikationsprodukt zu bilden. Der erste Primer schließt eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu den Nucleotiden 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1 ist, oder das Komplement davon ein. Das Verfahen schließt des Weiteren das Nachweisen eines Amplifikationsprodukts ein, wobei der Nachweis darauf hinweist, dass das virale Polynucleotid ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV ist. Beispiele der ersten Primer, die verwendet werden können, schließen 5'ATCGGGAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NO: 12) und 5'AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NO: 14) ein. Das Verfahren kann auch für das Nachweisen der Anwesenheit eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV in einem porcinen Individuum verwendet werden und schließt Inkontaktbringen einer biologischen Probe eines porcinen Individuums mit dem ersten Primer und dem zweiten Primer ein. Die biologische Probe schließt vorzugsweise Lungengewebe ein.
Durch die Erfindung wird auch ein Kit für die Verwendung im Nachweisen von PRRSV in einem porcinen Individuum bereitgestellt. Der Kit schließt die ersten Primer und zweiten Primer der Erfindung, die geeignet sind für die Verwendung in der Amplifizierung eines Teils eines PRRSV, und Anweisungen für die Verwendung des Primerpaars ein. Ein anderer Kit, der durch die Erfindung bereitgestellt wird, ist für die Verwendung im Nachweisen des Antikörpers gegen PRRSV in einem porcinen Individuum. Der Kit schließt das Virus der Erfindung und Anweisungen für die Verwendung des Virus ein.
Durch die Erfindung wird des Weiteren eine immunogene Zusammensetzung bereitgestellt. Die Zusammensetzung schließt ein abgeschwächtes oder inaktiviertes PRRSV ein, das ein Polynucleotid einschließt, das unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standardparametern mindestens etwa 99% Identität mit einem Polynucleotid aufweist, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz aufweist. Die immunogene Zusammensetzung kann ein Polypeptid einschließen, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination davon besteht.
Verfahren zum Behandeln eines porcinen Individuums mit einem Risiko einer Infektion mit einem PRRSV eines porcinen Individuums, oder das Symptome einer PRRSV-Infektion zeigt, sind auch in der Beschreibung beschrieben. Die Verfahren schließen das Verabreichen einer immunogenen Zusammensetzung an ein Tier ein, die ein abgeschwächtes oder inaktiviertes PRRSV einschließt, das ein Polynucleotid einschließt, das mindestens etwa 96% Identität mit aufweist, umfassend ein RNA-Polynucleotid, umfassend die RNA-Nucleotidsequenz, die der SEQ ID NO: 1 unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standard-Parametern entspricht. Die immunogene Zusammensetzung wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine Immunantwort auf das PRRSV zu bewirken. Die immunogene Zusammensetzung kann ein Polypeptid einschließen, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, einem immunogenen Analog davon, einem immunogenen Fragment davon oder einer Kombination davon besteht. Alternativ kann dem porcinen Individuum ein neutralisierender Antikörper in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um das porcine Individuum zu behandeln.
Außer wenn es anderweitig beschrieben ist, werden „ein", „eine", „der", „die", „das" und „mindestens ein/e" austauschbar verwendet und bedeuten eins oder mehr als eins.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, die ein abgeschwächtes oder inaktiviertes Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) umfasst, umfassend ein Polynucleotid, das unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standard-Parametern mindestens etwa 99% Identität mit einem RNA-Polynucleotid aufweist, das die RNA-Nucleotidsequenz umfasst, die der SEQ ID NO: 1 entspricht, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Behandlung eines porcinen Individuums mit einem Risiko einer Infektion mit einem PRRSV oder mit Symptomen einer PRRSV-Infektion. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination davon besteht, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung für die Behandlung eines porcinen Individuums mit einem Risiko einer Infektion mit einem Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) oder mit Symptomen einer PRRSV-Infektion.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. DNA-Nucleotidsequenz eines Teils des positiven Strangs des Genoms des dem europäischen Stamm ähnlichen Stamms (SEQ ID NO: 1). Die RNA-Sequenz, die der SEQ ID NO: 1 entspricht und in einem viralen Partikel vorliegt, hat Uracil (U)-Nucleotide anstatt der Thymidin (T)-Reste. Die Reihen 1, 2 und 3 unter der Nucleotidsequenz repräsentieren die drei unterschiedlichen Leserahmen. Die vorhergesagte Aminosäuresequenzen, die durch den dem europäischen Stamm ähnlichen Stamm codiert werden, sind für einige vorhergesagte offene Leserahmen dargestellt, einschließlich SEQ ID NO: 2 (ORF1a), SEQ ID NO: 3 (ORF1b), SEQ ID NO: 4 (ORF2), SEQ ID NO: 5 (ORF3), SEQ ID NO: 6 (ORF4), SEQ ID NO: 7 (ORF5), SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 (ORF6) und SEQ ID NO: 10 (ORF7).
2. Die DNA-Nucleotidsequenz eines Teils des positiven Strangs des Genoms des dem europäischen Stamm ähnlichen Stamms (Nucleotide 1830 bis 2618 von SEQ ID NO: 1) im Vergleich zu einem Teil der DNA-Nucleotidsequenz des prototypischen europäischen Stamms Lelystad (SEQ ID NO: 11, der den Nucleotiden 1981 bis 2820 der Genbank-Zugangsnummer NC_002533 entspricht). In der SEQ ID NO: 11 bezeichnen die Großbuchstaben ausgerichtete, nicht identische Nucleotide; Kleinbuchstaben-Nucleotide bezeichnen nicht-ausgerichtete Nucleotide; Bindestriche bezeichnen ausgerichtete, identische Nucleotide; und Punkte bezeichnen eine Lücke.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Polynucleotide
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung eines neuen Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV), ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus mit Hülle. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung isolierte Polynucleotide. Vorzugsweise kann ein isoliertes Polynucleotid in einer Zelle replizieren. Vorzugsweise ist ein isoliertes Polynucleotid der vorliegenden Erfindung nicht größer als etwa 15,3 Kilobasen. Ob ein isoliertes Polynucleotid in einer Zelle replizieren kann, kann durch Inserieren des Polynucleotids in einen Expressionsvektor, der eine infektiöse RNA produziert, Einbringen der infektiösen RNA in eine Zelle und Bewerten, ob die infektiöse RNA bewirkt, dass die Zelle Viruspartikel produziert, bestimmt werden. Diese Verfahren sind hierin detaillierter beschrieben. Ein bevorzugtes Beispiel eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung ist SEQ ID NO: 1 (1). Dieses Polypeptid ist ein Teil eines Polynucleotids, das von einem dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV erhalten wurde. Vorzugsweise ist das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV eines, das die Stamm-Bezeichnung MND99-35186 aufweist und bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, USA, am 7. Juli 2000 hinterlegt wurde (dem die ATCC-Zugangsnummer PTA-2194 gewährt wurde). Die Hinterlegung wurde unter dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Zwecken eines Patentverfahrens gemacht. Es wird erwartet, dass die vollständige Nucleotidsequenz des PRRSV, die in SEQ ID NO: 1 offenbart ist, zusätzliche Nucleotide am 5'-Ende des Polynucleotids einschließen wird. Insbesondere wird erwartet, dass etwa 100 bis etwa 200, vorzugsweise etwa 150 zusätzliche Nucleotide am 5'-Ende von SEQ ID NO: 1 vorhanden sein können, wenn die Nucleotidsequenz des gesamten PRRSV, das durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, bestimmt wird. Es sollte bemerkt werden, dass, während SEQ ID NO: 1 eine DNA-Sequenz ist, die vorliegende Erfindung die entsprechende RNA-Sequenz und auch RNA- und DNA-Komplemente davon in Betracht zieht.
Wie hierin verwendet, ist eine „isolierte" Substanz eine, die von ihrer natürlichen Umgebung entfernt, unter Verwendung von rekombinanten Techniken produziert oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert worden ist. Zum Beispiel kann ein Polypeptid, Polynucleotid oder Viruspartikel dieser Erfindung isoliert sein. Vorzugsweise ist ein Polypeptid, Polynucleotid oder Viruspartikel dieser Erfindung aufgereinigt, d.h. im Wesentlichen frei von irgendeinem anderen Typ von Polypeptid, Polynucleotid oder Viruspartikel und assoziierten zellulären Produkten oder anderen Unreinheiten. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Polynucleotid" eine polymere Form von Nucleotiden von jeglicher Länge, entweder Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden, und schließt sowohl doppel- als auch einzelsträngige DNA und RNA ein. Außer wenn es anderweitig erwähnt wird, schließt ein Polynucleotid das Komplement davon ein. Die Nucleotidsequenz des Komplements eines Polynucleotids kann leicht durch einen Fachmann bestimmt werden. Ein Polynucleotid kann Nucleotidsequenzen einschließen, die unterschiedliche Funktionen haben, einschließlich zum Beispiel codierende Sequenzen und nicht-codierende Sequenzen wie regulatorische Sequenzen und/oder nicht-translatierte Regionen. Ein Polynucleotid kann direkt von einer natürlichen Quelle erhalten werden oder kann mit der Hilfe von rekombinanten, enzymatischen oder chemischen Techniken hergestellt werden. Ein Polynucleotid kann linear oder zirkulär in der Topologie sein. Ein Polynucleotid kann zum Beispiel ein Teil eines Vektors wie eines Expressions- oder Clonierungsvektors oder ein Fragment sein.
„Polypeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polymer von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine bestimmte Länge eines Polymers von Aminosäuren. Daher sind zum Beispiel die Begriffe Peptid, Oligopeptid, Protein und Enzym in der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Begriff schließt auch post-Expressions-Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen ein.
Die Begriffe „codierende Region" und „codierende Sequenz" werden austauschbar verwendet und bezeichnen eine Polynucleotidregion, die ein Polypeptid codiert und, wenn unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gesetzt, das codierte Polypeptid exprimiert. Die Grenzen einer codierenden Region werden im Allgemeinen durch ein Translations-Startcodon an ihrem 5'-Ende und ein Translations-Stoppcodon an ihrem 3'-Ende bestimmt. Eine regulatorische Sequenz ist eine Polynucleotidsequenz, die die Expression einer codierenden Region reguliert, mit der sie funktionell verknüpft ist. Nicht-limitierende Beispiele von regulatorischen Sequenzen schließen Promotoren, Transkriptions-Startstellen, Translations-Startstellen, Translations-Stoppstellen und Terminatoren ein. „Funktionell verknüpft" bezeichnet eine Nebeneinanderstellung, in der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Weise zu wirken. Eine regulatorische Sequenz ist „funktionell verknüpft" mit einer codierenden Region, wenn sie auf eine solche Weise verbunden ist, dass die Expression der codierenden Region unter Bedingungen erzielt wird, die mit der regulatorischen Sequenz kompatibel sind.
„Komplement" und „komplementär" bezeichnen die Fähigkeit von zwei einzelsträngigen Polynucleotiden, miteinander Basenpaarungen einzugehen, d.h. zu hybridisieren, wobei ein Adenin von einem Polynucleotid mit einem Thymin eines zweiten Polynucleotids eine Basenpaarung eingehen wird und ein Cytosin von einem Polynucleotid mit einem Guanin eines zweiten Polynucleotids eine Basenpaarung eingehen wird. Zwei Polynucleotide sind komplementär zueinander, wenn eine Nucleotidsequenz in einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz in einem zweiten Polynucleotid eine Basenpaarung eingehen kann. Zum Beispiel sind 5'-ATGC und 5'-GCAT komplementär. Die Begriffe Komplement und komplementär umspannen auch zwei Polynucleotide, wobei ein Polynucleotid mindestens ein Nucleotid enthält, das nicht mit mindestens einem Nucleotid, das auf einem zweiten Polynucleotid vorhanden ist, unter den unten beschriebenen Hybridisierungsbedingungen eine Basenpaarung wird. Zum Beispiel wird das dritte Nucleotid von jedem der zwei Polynucleotide 5'-ATTGC und 5'-GCTAT nicht eine Basenpaarung eingehen, aber diese zwei Polynucleotide sind komplementär, wie hierin definiert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch isolierte Polynucleotide, die den codierenden Regionen, die in SEQ ID NO: 1 vorhanden sind, entsprechen. Diese codierenden Regionen sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Codierende Regionen der SEQ ID NO: 1
Die vorliegende Erfindung schließt auch Polynucleotide ein, die strukturelle Ähnlichkeit zu SEQ ID NO: 1 oder zu einer codierenden Region, die in SEQ ID NO: 1 vorhanden ist, aufweisen. Die Ähnlichkeit wird als „Prozent-Identität" bezeichnet und wird durch Ausrichten der Reste der zwei Polynucleotide (d.h. die Nucleotidsequenz eines Kandidaten-Polynucleotids und die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer codierenden Region von SEQ ID NO: 1) bestimmt, um die Zahl von identischen Nucleotiden entlang der Längen ihrer Sequenzen zu optimieren; Lücken in einer oder beiden Sequenzen sind beim Herstellen der Ausrichtung erlaubt, um die Zahl der geteilten Nucleotide zu optimieren, obwohl die Nucleotide in jeder Sequenz nichtsdestotrotz in ihrer richtigen Reihenfolge bleiben müssen. Ein Kandidaten-Polynucleotid ist das Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz aufweist, die mit SEQ ID NO: 1 oder mit einer codierenden Region, die in SEQ ID NO: 1 vorhanden ist (z.B. Nucleotide 71 bis 7210 von SEQ ID NO: 1), verglichen wird. Ein Kandidaten-Polynucleotid kann von einem Tier, vorzugsweise einem Schwein, das mit PRRSV infiziert ist, isoliert werden oder kann unter Verwendung von rekombinanten Techniken produziert oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Vorzugsweise werden die zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms des GCG Wisconsin Package (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), Version 10.0 (Update Januar 1999) verglichen.
Das GAP-Programm verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 443–453 (1970)), um die Ausrichtung von zwei vollständigen Sequenzen zu finden, die die Zahl von Anpassungen maximiert und die Zahl von Lücken minimiert.
Vorzugsweise werden die Standardwerte für alle GAP-Suchparameter verwendet, einschließlich Bewertungsmatrix = NewsgapDNA. cmp, Lückengewicht = 50, Längengewicht = 3, durchschnittliche Paarung = 10, durchschnittliche Fehlpaarung = 0. Im Vergleich der zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Suchalgorithmus wird eine strukturelle Ähnlichkeit als „Prozentidentität" bezeichnet. Vorzugsweise schließt ein Polynucleotid eine Nucleotidsequenz ein, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer codierenden Region von SEQ ID NO: 1 von mindestens etwa 99% Identität aufweist.
Ein anderes isoliertes Polynucleotid, das hierin beschrieben ist, ist ein RNA-Polynucleotid, an das ein Oligonucleotid hybridisiert, das die Sequenz AGAGCGGGAACAGAATCCTTCCCACCTTTAGCGGTACGCTTG (SEQ ID NO: 18) aufweist. Vorzugsweise repliziert das RNA-Polynucleotid in Zellen, um Viruspartikel zu bilden. Solch eine RNA wird als eine infektiöse RNA bezeichnet. Die Produktion und Testung von infektiösen RNAs werden unten detaillierter beschrieben.
Vorzugsweise schließen die Hybridisierungsbedingungen die Denaturierung von etwa 1 μg Gesamt-RNA mit Glyoxyl und die Elektrophorese durch ein 2% Agarosegel, das Transferieren auf eine Nylonmembran (MagnaGraph, MSI, Westboro, MA) und die Querverenetzung mit der Membran durch ultraviolettes Licht ein. Vorzugsweise wird das Oligonucleotid am 3'-Ende radioaktiv markiert, zum Beispiel mit [α³²P]dATP (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) und terminaler Desoxynucleotid-Transferase (TdT) (Promega Corporation, Madison, WI). Vorzugsweise schließen die Hybridisierungsbedingungen die Inkubation der Membran, die die quervernetzte RNA mit dem markierten Oligonucleotid enthält, in einer Hybridisierungslösung, zum Beispiel QuikHyb (Stratagene, La Jolla, CA), bei 68°C für 16 Stunden ein. Die Membran wird dann drei mal in einer Lösung, enthaltend 0,9 M Natriumchlorid/0,09 M Natriumcitrat/pH 7,0 (6 × SSC) und 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), bei 78°C gewaschen und dann einem Autoradiographie-Film (NEN Life Science Products, Boston, MA) oder einem Phosphoabbildungs-Schirm (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA) ausgesetzt. Es wird erwartet, dass unter diesen Bedingungen das Oligonucleotid nicht an das europäische PRRSV Lelystad oder an das nordamerikanische PRRSV VR-2332 hybridisieren wird.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung schließt im Vergleich zu der Nucleotidsequenz des europäischen Stamms Lelystad, der unter der Genbank Zugangsnummer NC 002533 verfügbar ist, eine Deletion ein. Wenn die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 und die Genbank-Zugangsnummer NC 002533 verglichen werden, sind die Nucleotide 2419 bis 2470 der Genbank-Zugangsnummer NC 002533 in der SEQ ID NO: 1 nicht vorhanden. Die Nucleotide 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1 sind unmittelbar 5' (stromaufwärts) und 3' (stromabwärts) von dieser Deletion. Daher schließen jene Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, die die Nucleotide 2268 und 2269 der SEQ ID NO: 1 einschließen, diese Deletion ein. Das Vorliegen dieser Deletion ist nützlich im Unterscheiden zwischen einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung und einigen klinischen PRRSV-Isolaten (hierin detaillierter beschrieben).
Die isolierten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können von einem Viruspartikel erhalten werden. Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Viruspartikel" und „virales Partikel" austauschbar verwendet und bezeichnen ein PRRSV-Partikel. Ein Viruspartikel schließt ein RNA-Polynucleotid ein, das in einer Zelle, zum Beispiel einer Zelle in einem Schwein und/oder einem gezüchteten, primären (d.h. frisch isolierten) porcinen alveolären Makrophagen, unter den geeigneten Bedingungen reproduzieren wird. Ein Viruspartikel schließt auch eine Hülle ein, die das Polynucleotid umgibt. Ein Viruspartikel wird typischerweise von einem Schwein erhalten, das Symptome der rätselhaften Schweinekrankheit (MSD), einschließlich Abort, Anorexie, Fieber, Lethargie, Pneumonie, rote/blaue Verfärbung der Ohren, erschwerte Atmung (Dyspnoe) und eine erhöhte Atmungsfrequenz (Tachypnoe) zeigt. Während es nicht limitierend sein soll, kann ein Viruspartikel von solch einem Schwein durch das Entfernen von Gewebe, vorzugsweise Lungengewebe, gefolgt von mikroskopischer Untersuchung des Gewebes auf verdickte alveoläre Septen, die durch das Vorliegen von Makrophagen, degenerierenden Zellen und Zertrümmern in den alveolären Plätzen verursacht werden, erhalten werden.
Diese Charakteristika weisen auf das Vorliegen einer Infektion durch ein PRRSV hin. Das Lungen- oder ein anderes porcines Gewebe wird dann mit einer pharmazeutisch verträglichen, wässrigen Lösung (wie physiologische Salzlösung, Ringerlösung, balancierte Hank-Salzlösung, minimales essentielles Medium und dergleichen) homogenisiert, so dass das Gewebe eine Menge von etwa 10 Prozent Gewicht/Volumen des Homogenats einschließt. Das Virus kann durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert werden, um ein Homogenat zu bilden. Alternativ kann das Virus durch Passieren des Homogenats durch Filter mit Porendurchmessern im Bereich von 0,05 bis 10 Mikron, vorzugsweise durch eine Reihe von 0,45, 0,2 und 0,1 Mikron-Filtern isoliert werden, um ein Homogenat zu produzieren, das das PRRSV enthält. Als ein Ergebnis enthält das Homogenat virale Partikel, die eine Größe von nicht mehr als etwa 1,0 Mikron, vorzugsweise nicht mehr als etwa 0,2 bis 0,1 Mikron aufweisen. Andere Gewebe, einschließlich fötales Gewebe, können auch verwendet werden, um das Virus zu gewinnen. Typischerweise wird solch ein Viruspartikel dann in vivo (d.h. im Körper eines Individuums) oder in Zellkultur (d.h. in vitro) gezüchtet, um mehr Viruspartikel zu produzieren. Dieser Vorgang des Infizierens eines Tieres oder einer Zelle in Kultur, was dem Virus erlaubt, zu reproduzieren, und dann des Erntens des neu produzierten Virus wird hierin als Passagieren des Virus bezeichnet. Optionell wird das Virus aufgereinigt.
Das oben beschriebene Homogenat kann in Zellkultur durch Beimpfen einer Reihe von kultivierten Zellen passagiert werden. Die kultivierten Zellen können Säugerorgan-Zellen wie Nieren-, Leber-, Herz- und Gehirn-, Lungen-, Milz-, Hoden-, Nasenmuschel-, weiße und rote Blutzellen und Lymphknotenzellen so wie Insekten- und Vogelembryo-Präparate sein. Vorzugsweise ist die Zelle ein primärer porciner alveolärer Makrophage. Vorzugsweise werden die primären porcinen alveolären Makrophagen von mindestens zwei Schweinen isoliert, und die primären porcinen alveolären Makrophagen von jedem Schwein werden nicht kombiniert. Es ist beobachtet worden, dass es eine gewisse Variabilität in der Fähigkeit des Virus der vorliegenden Erfindung gibt, in primären porcinen alveolären Makrophagen zu replizieren, und die Verwendung von primären porcinen alveolären Makrophagen von mehr als einem Schwein erhöht die Fähigkeit, das Virus in den Makrophagen zu passagieren, signifikant. Kulturmedien, die für diese Zellpräparationen geeignet sind, schließen jene ein, die Säuger-Zellwachstum unterstützen, wie Serum (zum Beispiel fötales Kälberserum oder Schweineserum) und Agar, Blutinfusions-Agar, Gehirn-Herz-Infusions-Glucosebrühe und Agar und dergleichen. Nach dem Beimpfen von kultivierten Zellen mit dem Homogenat und Züchten der Kultur können individuelle Klumpen von kultivierten Zellen geerntet und wieder in steriles Kulturmedium mit Zellen eingebracht werden. Alternativ und vorzugsweise werden die Überstände von kultivierten Zellen einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit ausgesetzt und verwendet, um steriles Kulturmedium, das Zellen enthält, zu beimpfen.
Ob ein isoliertes, vorzugsweise aufgereinigtes Viruspartikel, das auf diese Weise erhalten wurde, in der Lage ist, MSD zu verursachen, kann durch Beimpfen von 3 bis 4 Wochen alten Schweinen, wie in Beispiel 1 beschrieben, oder durch die Verfahren von Terpstra et al. (Vet. Q., 13, 131–136 (1991)) und Collins et al. (US-Patent 5,846,805) festgestellt werden. Diese Verfahren testen experimentell, ob das virale Partikel Spätabort und reproduktives Versagen bei trächtigen Schweinen oder klinische Zeichen und mikroskopische Läsionen in gnotobiotischen Ferkeln ähnlich zu Ausbrüchen im Feld reproduziert. Schweine, die experimentell auf diese Weise beimpft wurden, können auch für die in vivo-Passage des Virus durch Gewinnen von Gewebe und Verarbeiten für die Isolierung des Virus, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet werden.
Nach der Isolierung, vorzugsweise Aufreinigung des Viruspartikels kann das Polynucleotid im Partikel zum Beispiel durch Behandeln des Partikels, um die Hülle zu entfernen, isoliert werden. Verfahren für das Entfernen der Hülle sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel Löslichmachen mit Phenol:Chloroform oder Guanidunium ein. Optionell wird das Polynucleotid unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Präzipitieren des Polynucleotids, aufgereinigt.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in einem Vektor vorhanden sein. Ein Vektor ist ein replizierendes Polynucleotid wie ein Plasmid, ein Phage, ein Cosmid oder ein künstliches Chromosom, an das/den ein anderes Polynucleotid (z.B. ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung) angehängt sein kann, um die Replikation des angehängten Polynucleotids zu bewirken. Wenn ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in einem Vektor ist, ist das Polynucleotid eine DNA. Wenn in einem Vektor vorhanden, kann ein Polynucleotid der Erfindung als ein „rekombinantes Polynucleotid" bezeichnet werden. Die Konstruktion der Vektoren, die ein Polynucleotid der Erfindung enthalten, wendet Standard-Ligierungstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, an. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) oder Ausubel, R. M., Hrsg. Current Protocols in Molecular Biology (1994).
Ein Vektor kann eine weitere Clonierung (Amplifizierung des Polynucleotids), d.h. ein Clonierungsvektor, oder die Expression des Polypeptids, das durch eine codierende Region codiert wird, die im Polynucleotid vorhanden ist, d.h. ein Expressionsvektor gewährleisten. Die Auswahl eines Vektors hängt von einer Vielzahl von erwünschten Charakteristika im resultierenden Konstrukt wie einem Selektionsmarker, der Vektor-Replizierungsrate und dergleichen ab. Geeignete Wirtszellen für das Clonieren oder Exprimieren der Vektoren hierin sind prokaryontische oder eukaryontische Zellen, und geeignete Vektoren für die Clonierung und/oder Expression in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Wenn der Vektor verwendet wird, um ein Polynucleotid zu clonieren, ist die Wirtszelle typischerweise ein Prokaryont. Geeignete Prokaryonten schließen Eubakterien wie Gram-negative oder Ggram-positive Organismen ein. Vorzugsweise wird E. coli verwendet. Wirtszellen, die für die Expression der Polypeptide der Erfindung geeignet sind, sind unten detaillierter beschrieben.
Das Polynucleotid, das verwendet wird, um die Wirtszelle zu transformieren, schließt optionell eine oder mehrere Markersequenzen ein, die typischerweise ein Molekül codieren, das eine Verbindung im Kulturmedium inaktiviert oder anderweitig nachweist oder durch sie nachgewiesen wird. Zum Beispiel kann der Einschluss einer Markersequenz die transformierte Zelle resistent gegen ein Antibiotikum machen, oder er kann einen Verbindungs-spezifischen Metabolismus an die transformierte Zelle verleihen. Beispiele einer Markersequenz sind Sequenzen, die die Resistenz gegen Kanamycin, Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Neomycin und Präparate von Phleomycin D1, einschließlich zum Beispiel das Präparat, das unter dem Handelsnamen ZEOCIN (Invitrogen) erhältlich ist, verleihen.
Ein Expressionsvektor schließt optionell regulatorische Sequenzen ein, die funktionell mit der codierenden Sequenz verknüpft sind. Die Erfindung ist nicht durch die Verwendung von einem bestimmten Promotor eingeschränkt, und eine breite Vielfalt ist bekannt. Promotoren wirken als regulatorische Signale, die eine RNA-Polymerase in einer Zelle binden, um die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) liegenden codierenden Sequenz zu initiieren. Der in der Erfindung verwendete Promotor kann ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor sein. Er kann heterolog in Bezug auf die Wirtszelle sein, muss es aber nicht sein. Beispiele von Promotoren für die Verwendung in Vektoren, die in prokaryontischen Zellen vorliegen, schließen lac, lacUV5, tac, trc, T7, SP6 und ara ein.
Promotorsequenzen sind für Eukaryonten bekannt. Die meisten eukaryontischen codierenden Sequenzen haben eine AT-reiche Region, die ungefähr 25 bis 30 Basen stromaufwärts der Stelle liegt, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromaufwärts vom Start der Transkription von vielen Genen gefunden wird, ist die CXCAAT-Region, wobei X jedes Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryontischen Gene ist eine AATAAA-Sequenz, die ein Signal für das Anfügen eines poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der codierenden Sequenz sein kann. All diese Sequenzen werden passend in eukaryontische Expressionsvektoren inseriert.
Die Transkription einer codierenden Sequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in einer Säuger-Wirtszelle kann zum Beispiel durch Promotoren kontrolliert werden, die von den Genomen von Viren wie Polyomavirus, Geflügelpockenvirus, Adenovirus (wie Adenovirus 2), Papillomvirus des Rindes, Vogel-Sarkom-Virus, Cytomegalie-Virus, einem Retrovirus und dem Hepatitis-B-Virus erhalten werden.
Die Transkription einer codierenden Sequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, durch Eukaryonten kann durch Inserieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente der DNA, die normalerweise etwa 10 bis 300 bp haben und die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, die 5' und 3' von codierenden Sequenzen innerhalb eines Introns so wie innerhalb der codierenden Sequenz selbst gefunden worden sind. Viele Enhancersequenzen sind von Säuger-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, alpha-Fetoprotein und Insulin). Enhancer von eukaryontischen Zell-Viren sind auch bekannt und schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs, den frühen Cytomegalievirus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' der codierenden Sequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, gespleißt werden, ist aber vorzugsweise an einer Stelle 5' des Pomotors gelegen.
Ein Expressionsvektor kann optionell eine Ribosomenbindungsstelle (eine Shine Dalgarno-Stelle für prokaryontische Systeme oder eine Kozak-Stelle für eukaryontische Systeme) und eine Startstelle (z.B. das Codon ATG) einschließen, um die Translation der transkribierten Botschaft zu initiieren, um das Enzym zu produzieren. Er kann auch eine Terminierungssequenz einschließen, um die Translation zu beenden. Eine Terminierungssequenz ist typischerweise ein Codon, für das es keine entsprechende Aminoacetyl-tRNA gibt, was daher die Polypeptid-Synthese beendet. Das Polypeptid, das verwendet wird, um die Wirtszelle zu transformieren, kann darüber hinaus optionell eine Transkriptions-Terminierungssequenz einschließen. Die rrnB-Terminatoren, die ein DANN-Abschnitt sind, der zwei Terminatoren, T1 und T2, enthält, ist ein oft verwendeter Terminator, der in bakterielle Expressionssysteme inkorporiert ist. Transkriptions-Terminierungssequenzen in Vektoren für eukaryontische Zellen schließen typischerweise ein Polyadenylierungssignal 3' der codierenden Sequenz ein.
Geeignete Wirtszellen für den Expressionsvektor, der ein Polynucleotid einschließt, das ein Polypeptid der Erfindung codiert, können von multizellulären Organismen stammen. Solche Wirtszellen sind zu Verarbeitungs- und Glycosylierungsaktivitäten in der Lage. Eine Vertebraten- oder Nichtvertebraten-Kultur kann verwendet werden. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insekten-Wirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster, Trichoplusia ni und Bombyx mori sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Vertebratenzellen können auch als Wirte verwendet werden. Beispiele von nützlichen Säuger-Wirtszelllinien sind eine Affennieren-CV1-Linie, die durch SV40 transformiert ist (CAS-7, ATCC CRL-1651); eine menschliche, embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen, die für das Wachstum in Suspensionskultur subcloniert wurden, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinesische Hamsterovarzellen/-DHFR (CHO); CHO-K1 (ATCC CCL-61); CHO-D; Maus-Sertolizellen (TM4); Affen-Nierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche zervikale Karzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (WI 38, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Brustdrüsentumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen; MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133, 477–483 (1993)) und MA-104 (ATCC CRL-2378).
Ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in einer Zelle repliziert. Ein Polynucleotid der Erfindung repliziert in einer Zelle, wenn die Zellkultur Zeichen einer cytopathischen Wirkung (CPE), wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigt und/oder wenn Viruspartikel von den Zellen isoliert werden können. Das Polynucleotid, das im Expressionsvektor vorhanden ist, kann in vitro (d.h. Zell-frei) transkribiert werden, um RNA-Transkripte zu produzieren. Die RNA-Transkripte können in kultivierte Zellen eingebracht werden und unter Bedingungen inkubiert werden, die für die Replikation eines PRRSV geeignet sind. Die RNA-Transkripte, die replizieren, werden die zelluläre Maschinerie (einschließlich zum Beispiel Ribosomen und tRNAs) verwenden, um zu replizieren.
Die Kultur kann, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf CPE getestet werden. Das Vorliegen einer CPE weist darauf hin, dass das Virus in der Lage ist, in einer Zelle zu replizieren. Optionell können die Viruspartikel, die durch die Zellen produziert werden, isoliert werden. Dieser Typ von Expressionsvektor wird oft in dem Fachgebiet als ein infektiöser cDNA-Clon bezeichnet, und die RNA, die durch den Expressionsvektor produziert wird, wird als eine infektiöse RNA bezeichnet. Verfahren für die Clonierung des europäischen PRRSV Lelystad und das Inserieren davon in einen Vektor sind auf dem Fachgebiet bekannt (Meulenberg et al., J. Virol., 72, 380–387 (1998)), und es wird erwartet, dass die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung auf diese Weise verwendet werden können, um infektiöse RNAs zu produzieren. Darüber hinaus kann das Verfahren von Meulenberg et al. verwendet werden, um virale Partikel herzustellen. Dementsprechend kann ein Fachmann ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel SEQ ID NO: 1, liefern, das Polynucleotid in einen Expressionsvektor einbringen und infektiöse RNAs produzieren, die in Zellen eingebracht werden könnten, um in der Produktion von Viruspartikeln zu resultieren. Die Zellen, die mit einer infektiösen RNA transfiziert sind, können zum Beispiel BHK-21-Zellen, CL2621-Zellen, MA-104-Zellen, MARC-145-Zellen oder primäre porcine alveoläre Makrophagen, vorzugsweise primäre porcine alveoläre Makrophagen sein. Verfahren für das wirksame Transfizieren von Zellen schließen die Verwendung von Calciumchlorid und kommerziell erhältlichen Produkten, die unter den Handelsnamen LIPOFECTIN und LIPOFECTAMINE bekannt sind, ein. Verfahren für das wirksame Transfizieren von primären porcinen alveolären Makrophagen sind auf dem Fachgebiet bekannt (Groot Bramel-Verheige et al., Virol., 278, 380–389 (2000)).
Polypeptide
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf Polypeptide, die unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standardparametern mindestens etwa 99% Identität mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz aufweisen, wobei das Polynucleotid in einer Zelle repliziert, vorzugsweise isolierte Polypeptide, die durch Polynucleotide der vorliegenden Erfindung codiert werden. Vorzugsweise hat ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine immunogene Aktivität. „Immunogene Aktivität" bezeichnet eine Aminosäuresequenz, die in einem Individuum eine immunologische Antwort hervorruft. Eine immunologische Antwort auf ein Polypeptid ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort auf das Polypeptid in einem Individuum. Normalerweise schließt eine immunologische Antwort eine oder mehrere der folgenden Wirkungen ein, ist aber nicht darauf limitiert: die Produktion von Antikörpern, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Supressor-T-Zellen und/oder cytotoxischen T-Zellen (siehe zum Beispiel de Antonio et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 61, 265–277 (1998), und Kwang et al., Res. Vet. Sci., 67, 199–201 (1999)), die spezifisch gegen ein Epitop oder Epitope des Polypeptidfragments gerichtet sind. Wie hierin verwendet, ist ein Antikörper, der „spezifisch binden" kann oder „spezifisch für" ein Viruspartikel und/oder ein Polypeptid ist, ein Antikörper, der nur mit einem Epitop des Antigens interagiert, das die Synthese des Antikörpers induziert hat, oder mit einem strukturell verwandten Epitop interagiert. Ein Antigen, das ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV „spezifisch bindet", ist ein Antikörper, der ein europäisches PRRSV, vorzugsweise ein europäisches PRRSV, das die Hinterlegungsnummer I-1102 hat, oder ein nordamerikanisches PRRSV, vorzugsweise ein nordamerikanisches PRRSV, das die Hinterlegungsnummer VR-2332 hat, nicht spezifisch bindet. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Komplex" auf die Kombination eines Antikörpers und eines Viruspartikels und/oder eines Polypeptids, der resultiert, wenn ein Antikörper spezifisch an ein Viruspartikel und/oder ein Polypeptid bindet.
Bevorzugte Beispiele von Polypeptiden der Erfindung sind SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 (siehe Tabelle 1). Die vorliegende Erfindung erwähnt auch Polypeptide, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung aufweisen. Die strukturelle Ähnlichkeit wird als die Prozentidentität bezeichnet und wird im Allgemeinen durch Ausrichten der Reste der zwei Aminosäuresequenzen (d.h. einer Kandidaten-Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz von einer der SEQ ID NOs: 2–10) bestimmt, um die Zahl von identischen Aminosäuren entlang der Längen ihrer Sequenzen zu optimieren; Lücken in einer oder beiden Sequenzen sind beim Erstellen der Ausrichtung erlaubt, um die Zahl von identischen Aminosäuren zu optimieren, obwohl die Aminosäuren in jeder Sequenz nichtsdestotrotz in ihrer richtigen Reihenfolge bleiben müssen. Eine Kandidaten-Aminosäuresequenz ist die Aminosäuresequenz, die mit einer Aminosäuresequenz, die in einem bevorzugten Polypeptid der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, verglichen wird. Vorzugsweise werden zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des GAP-Programms des GCG Wisconsin Package (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), Version 10.0 (Update Januar 1999) verglichen. Das GAP-Programm verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 443–453 (1970), um die Ausrichtung von zwei vollständigen Sequenzen zu finden, die die Zahl von Paarungen maximiert und die Zahl der Lücken minimiert.
Vorzugsweise werden die Standardwerte für alle GAP-Suchparameter verwendet, einschließlich Bewertungsmatrix = BLOSUM62. cmp, Lückengewicht = 8, Längengewicht = 2, durchschnittliche Paarung = 2, 912 und durchschnittliche Fehlpaarung = –2, 003. Im Vergleich der zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des GAP-Suchalgorithmus wird eine strukturelle Ähnlichkeit als „Prozent Identität" bezeichnet. Die Beschreibung erwähnt Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 2 von mindestens etwa 95%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 99% Identität aufweist. Es werden auch Polypeptide erwähnt, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 3 von mindestens etwa 99% Identität aufweist.
Es werden auch Polypeptide erwähnt, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 4 von mindestens etwa 98%, mindestens etwa 99% Identität aufweist. Es werden auch Polypeptide erwähnt, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 5 von mindestens etwa 94%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 99% Identität aufweist.
Auch erwähnt werden Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 6 von mindestens etwa 95%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 99% Identität aufweist. Auch erwähnt werden Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 7 von, mit steigendem Grad der Bevorzugung, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 99% Identität aufweist. Auch erwähnt werden Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 9 von mindestens etwa 99% Identität aufweist.
Auch erwähnt werden Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 10 von mindestens etwa 99,5% Identität aufweist.
Die vorliegende Erfindung erwähnt darüber hinaus Polypeptidanaloge und Polypeptidfragmente, vorzugsweise immunogene Polypeptidanaloge und immunogene Polypeptidfragmente. Ein Polypeptidfragment ist mindestens etwa 8, mindestens etwa 12, mindestens etwa 20 Aminosäuren lang. Immunogene Analoge von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung schließen Polypeptide ein, die Aminosäuresubstitutionen haben, die nicht die Fähigkeit des Polypeptids eliminieren, eine immunologische Antwort hervorzurufen.
Substitute für eine Aminosäure können von anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen nicht-polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin ein. Polare, neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Aspartat und Glutamat ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparginsäure und Glutaminsäure ein. Beispiele von bevorzugten konservativen Substitutionen schließen Lys für Arg und vice versa ein, um eine positive Ladung beizubehalten; Glu für Asp und vice versa, um eine negative Ladung beizubehalten; Ser für Thr, so dass ein freies -OH beibehalten wird; und Gln für Asn, um ein freies NH₂ beizubehalten.
Immunogene Analoge, wie der Begriff hierin verwendet wird, schließen auch modifizierte Polypeptide ein. Modifikationen von Polypeptiden der Erfindung schließen chemische und/oder enzymatische Derivatisierungen an einer oder mehreren einzelnen Aminosäuren ein, einschließlich Seitenketten-Modifizierungen, Gerüst-Modifizierungen und N- und C-terminale Modifizierungen, einschließlich Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung und die Anlagerung von Kohlenhydrat- oder Lipid-Einheiten, Cofaktoren und dergleichen. Immunogene Fragmente eines Polypeptids schließen einen Teil des Polypeptids ein, das Deletionen oder Additionen von einer oder mehreren benachbarten oder nicht-benachbarten Aminosäuren enthält, so dass das resultierende Polypeptid immunogen ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können von zum Beispiel einer biologischen Probe eines porcinen Individuums, das mit einem dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV infiziert ist, das das Polypeptid codiert, erhalten werden. Vorzugsweise ist das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV eines, das die SEQ ID NO: 1 einschließt, mehr bevorzugt ist es das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV, das die ATCC-Nummer PTA-2194 hat. Das Polypeptid kann von kultivierten Zellen, vorzugsweise primären porcinen alveolären Makrophagen, erhalten werden, die zum Beispiel mit einem dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV infiziert worden sind, das das Polypeptid codiert oder ein rekombinantes Polynucleotid, vorzugsweise ein Polynucleotid der Erfindung, das ein Polypeptid der Erfindung codiert, enthält.
Alternativ kann das Polypeptid von einer prokaryontischen Zelle oder einer eukaryontischen Zelle, die einen Expressionsvektor enthält, der ein Polynucleotid einschließt, das ein Polypeptid der Erfindung codiert, erhalten werden. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch durch chemische Synthese erhalten werden.
Viren
Die dem europäischen Stamm ähnlichen Viruspartikel der vorliegenden Erfindung umfassen ein RNA-Polynucleotid, das die RNA-Nucleotidsequenz umfasst, die der SEQ ID NO: 1 entspricht. Ein bevorzugtes Beispiel eines Viruspartikels ist eines, das die SEQ ID NO: 1 einschließt. Das Viruspartikel der vorliegenden Erfindung ist das Virus, das die ATCC-Zugangsnummer PTA-2194 hat. Ein Viruspartikel der vorliegenden Erfindung schließt eine Hülle ein und kann, wenn es zu einer kultivierten Zelle zugefügt wird, replizieren, um in der Produktion von mehr viralen Partikeln zu resultieren.
Wie oben diskutiert, kann ein Viruspartikel der vorliegenden Erfindung von einem Schwein erhalten werden, das Symptome der MSD zeigt. Ein Viruspartikel kann durch Passage in vivo oder in Zellkultur gezüchtet werden. Die Passage in vivo schließt das Impfen eines Schweins, zum Beispiel wie im Beispiel 1 beschrieben, ein. Die Passage in Zellkultur schließt das Aussetzen von kultivierten Zellen gegenüber dem Viruspartikel und Inkubieren der Zellen unter Bedingungen ein, die für das Virus geeignet sind, um zu reproduzieren und mehr Viruspartikel zu produzieren.
Vorzugsweise sind die kultivierten Zellen nicht eine immortalisierte oder transformierte Zelllinie (d.h. die Zellen sind nicht in der Lage, sich unendlich zu teilen). Vorzugsweise werden primäre porcine alveoläre Makrophagen für die Passage in der Zellkultur verwendet. Die Verwendung von primären porcinen alveolären Makrophagen ist in Beispiel 2 beschrieben. Ein Viruspartikel kann auch von Zellen erhalten werden, die mit einer infektiösen RNA transfiziert sind, wie hierin beschrieben.
Ein Virus der vorliegenden Erfindung kann inaktiviert, d.h. unfähig zum Reproduzieren in vivo und/oder in Zellkultur gemacht werden. Verfahren der Inaktivierung sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel die Behandlung eines Virus der Erfindung mit einem chemischen Standard- Inaktivierungsmittel wie einem Aldehyd-Reagenz, einschließlich Formalin, Acetaldehyd und dergleichen; reaktiven sauren Alkoholen, einschließlich Cresol, Phenol und dergleichen; Säuren wie Benzoesäure, Benzolsulfonsäure und dergleichen; Lactonen wie beta-Propiolacton und Caprolacton; und aktivierten Lactamen, Carbodiimiden und diheteroaromatischen Carbonyl-Verbindungen wie Carbonyldiimidazol ein. Bestrahlung wie mit ultravioletter und gamma-Bestrahlung kann auch verwendet werden, um das Virus zu inaktivieren.
In der vorliegenden Erfindung sind auch abgeschwächte dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV (d.h. Viren, die eine reduzierte Fähigkeit aufweisen, die Symptome von MSD in Schweinen hervorzurufen) und Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV eingeschlossen. Verfahren zum Produzieren eines abgeschwächten Virus sind auf dem Fachgebiet bekannt. Typischerweise wird ein Virus der vorliegenden Erfindung passagiert, d.h. verwendet, um eine Zelle in Kultur zu infizieren, dann läßt mann es reproduzieren und dann wird es geerntet. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die Virulenz des Virus in Schweinen vermindert ist. Zum Beispiel kann das Virus zehnmal in Zellkultur passagiert und dann die Virulenz des Virus gemessen werden. Wenn die Virulenz nicht abgenommen hat, wird das Virus, das nicht in das Tier injiziert wurde, zusätzliche zehnmal in Zellkultur passagiert. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die Virulenz abgenommen hat. Im Allgemeinen wird die Virulenz durch Beimpfen von Schweinen mit dem Virus und Bewerten des Vorliegens von klinischen Symptomen und/oder der LD₅₀ (siehe zum Beispiel Beispiel 1, Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8, 11–20 (1996), und Halbur et al., Vet. Pathol., 32, 200–204 (1995), und Park et al., Am. J. Vet. Res., 57, 320–323 (1996)) gemessen. Vorzugsweise ist die Virulenz vermindert, so dass das abgeschwächte Virus nicht den Tod von Tieren verursacht und vorzugsweise keine klinischen Symptome der Krankheit verursacht.
Typischerweise schließt eine Zellkultur, die für das Produzieren eines abgeschwächten Virus der vorliegenden Erfindung nützlich ist, Zellen von nicht-porcinem Säuger-Ursprung ein. Beispiele von nicht-porcinen Säuger-Zellkulturen schließen zum Beispiel die Zelllinie MA-104 (ATCC CRL-2378), die Zelllinie MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133, 477–483 (1993)) und die Zelllinie CL-2621 (Baustia et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163–165 (1993)) ein. Vorzugsweise wird eine gemischte Zellkultur für das Produzieren eines abgeschwächten Virus der vorliegenden Erfindung verwendet. In einer gemischten Zellkultur sind mindestens zwei Typen von Zellen vorhanden. Vorzugsweise schließt eine gemischte Zellkultur eine immortalisierte oder transformierte Zelllinie und eine primäre Zellkultur ein. Eine gemischte Zellkultur ist besonders nützlich, wenn ein Virus langsam oder gar nicht in einer immortalisierten oder transformierten Zelllinie reproduziert. Bevorzugte Beispiele einer immortalisierten oder transformierten Zelllinie für die Verwendung in einer gemischten Zellkultur schließen zum Beispiel die Zelllinie MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133, 477–483 (1993)) und die Zelllinie MA-104 (ATCC CRL-2378) ein. Vorzugsweise sind die primären Zellkulturen für die Verwendung in einer gemischten Zellkultur von porcinem Ursprung. Ein bevorzugtes Beispiel einer primären Zellkultur für die Verwendung in einer gemischten Zellkultur sind primäre porcine alveoläre Makrophagen.
Verfahren der Verwendung
Die Viruspartikel, Polynucleotide, Polypeptide und immunogenen Analoge und immunogenen Fragmente davon der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Antikörper zu produzieren. Laborverfahren zum Produzieren, Charakterisieren und optionell Isolieren von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Harlow E. et al. Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988). Zum Beispiel kann ein Virus der vorliegenden Erfindung an ein Tier, vorzugsweise einen Säuger in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um die Produktion eines Antikörpers zu verursachen, der spezifisch für das verabreichte Virus ist. Polypeptide der vorliegenden Erfindung und immunogene Analoge und immunogene Fragmente davon können auch an ein Tier, vorzugsweise einen Säuger verabreicht werden, um Antikörper zu produzieren. Optionell wird ein Viruspartikel oder eine Polypeptid mit einem Adjuvans, zum Beispiel inkomplettem Freundschem Adjuvans gemischt, um die Produktion von Antikörpern nach der Verabreichung zu stimulieren. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.
Vorzugsweise ist ein Antikörper, der unter Verwendung eines Virus der vorliegenden Erfindung produziert wird, oder ein Polypeptid oder immunogenes Analog oder immunogenes Fragment davon ein neutralisierender Antikörper. Ein neutralisierender Antikörper ist einer, der ein Virus der vorliegenden Erfindung vom Reproduzieren in Zellkultur, vorzugsweise in primären porcinen Makrophagen abhält.
Optionell und vorzugsweise binden Antikörper, die unter Verwendung eines Viruspartikels der vorliegenden Erfindung produziert wurden, ein Polypeptid oder Polynucleotid der vorliegenden Erfindung oder immunogene Analoge und immunogene Fragmente davon nicht spezifisch an das europäische PRRSV, das als I-1102 bei der Collection Nationale De Cultures De Microorganisms, Institute Pasteur, Frankreich, hinterlegt wurde, oder das nordamerikanische PRRSV, das als VR-2332 bei der ATCC hinterlegt wurde. Ob ein Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifisch an eines oder beide jener Viren bindet, kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschreibt Verfahren zum Nachweisen eines PRRSV, vorzugsweise eines Virus der vorliegenden Erfindung. Diese Verfahren sind zum Beispiel für das Nachweisen eines PRRSV in einem Tier, das Nachweisen eines PRRSV in einer Zellkultur oder das Diagnostizieren einer Krankheit, die durch ein PRRSV verursacht wird, nützlich. Vorzugsweise liegen solche diagnostischen Systeme in Kit-Form vor. Die Kits werden unten detaillierter beschrieben. In manchen Aspekten der Erfindung schließt das Nachweisen eines PRRSV das Nachweisen von Antikörpern ein, die spezifisch an ein Virus der vorliegenden Erfindung, ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und/oder ein immunogenes Analog oder immunogenes Fragment davon binden.
Das Verfahren schließt das Bereitstellen einer biologischen Probe, vorzugsweise eines flüssigen Homogenats einer Gewebeprobe, von einem porcinen Individuum ein. Das Individuum kann verdächtigt werden, das PRRSV zu beherbergen, oder kann ein Mitglied einer Herde sein, die auf das Vorliegen des PRRSV durchmustert wird. Ein Antikörper wird zu der biologischen Probe zugefügt und unter Bedingungen inkubiert, um einen Komplex mit einem PRRSV in der biologischen Probe zu bilden. Vorzugsweise wird der Antikörper unter Verwendung eines Viruspartikels der vorliegenden Erfindung, eines Polypeptids oder Polynucleotids der vorliegenden Erfindung oder eines immunogenen Analogs oder immunogenen Fragments davon produziert. Vorzugsweise bindet der Antikörper ein europäisches PRRSV oder ein nordamerikanisches PRRSV nicht spezifisch. Der Komplex wird dann nachgewiesen, und die Anwesenheit des Komplexes weist auf die Anwesenheit eines PRRSV in der biologischen Probe hin. Der Nachweis von Antikörpern ist auf dem Fachgebiet bekannt und kann zum Beispiel Immunfluoreszenz und Peroxidase einschließen. Typische Formate, in denen die Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen zum Beispiel den enzymverknüpften Immunadsorptionstest (ELISA); den Radioimmuntest (RIA), den Immunfluorezenztest (IFA) und den Western-Immuntest ein.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine „biologische Probe" eine Probe eines Gewebes oder einer Flüssigkeit, die von einem Individuum erhalten wurde, einschließlich, aber nicht limitiert auf, zum Beispiel Lunge oder Atmungstrakt. Eine „biologische Probe" schließt auch Proben von Zellkultur-Komponenten ein, einschließlich der Zellen und der Medien, die aus dem Wachstum der Zellen und Gewebe im Kulturmedium resultieren, aber nicht limitiert darauf. Die Zellen können mit PRRSV infiziert sein oder können einen Vektor enthalten, der ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung einschließt und vorzugsweise eine codierende Region, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einschließt.
Andere Verfahren, die für das Nachweisen eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV geliefert werden, schließen die Amplifizierung eines Polynucleotids, vorzugsweise durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines dem europäischen Stamm ähnlichen Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV), umfassend: Inkontaktbringen eines viralen Polynucleotids mit einem ersten Primer und einem zweiten Primer unter Bedingungen, die geeignet sind, um ein nachweisbares Amplifizierungsprodukt zu bilden, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil der SEQ ID NO: 1 ist, der die Nucleotide 2268 und 2269 von der SEQ ID NO: 1 oder das Komplement davon umfasst; und Nachweisen eines Amplifizierungsprodukts, wobei der Nachweis darauf hinweist, dass das virale Polynucleotid ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV ist. Das Polynucleotid kann eines sein, das zum Beispiel in einer biologischen Probe eines porcinen Individuums, das verdächtigt wird, das PRRSV zu beherbergen, oder eines Mitglieds einer Herde vorhanden ist, die auf das Vorliegen des PRRSV gescreent wird. Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines dem europäischen Stamm ähnlichen Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV) in einem porcinen Individuum, umfassend:
Inkontaktbringen einer biologischen Probe eines porcinen Individuums mit einem ersten Primer und einem zweiten Primer und Inkubieren unter Bedingungen, die geeignet sind, ein nachweisbares Amplifizierungsprodukt zu bilden, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil von SEQ ID NO: 1 ist, der die Nucleotide 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1 oder das Kompliment davon umfasst; und
Nachweisen eines Amplifizierungsprodukts, wobei der Nachweis darauf hinweist, dass das porcine Individuum ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV aufweist.
Das Polynucleotid kann von einem isolierten, vorzugsweise aufgereinigten Viruspartikel erhalten werden. Wenn das Polynucleotid von einem Viruspartikel erhalten wird, wird das Polynucleotid durch reverse Transkription von einem RNA-Polynucleotid zu einem DNA-Polynucleotid umgewandelt (siehe zum Beispiel Beispiel 3). In manchen Aspekten der vorliegenden Erfindung nutzen die Verfahren zum Nachweisen eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV und seines Unterscheidens von einem europäischen PRRSV und einem nordamerikanischen PRRSV das Vorliegen einer Deletion aus, die in dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV vorhanden ist. Diese Deletion wird oben im Abschnitt, der mit „Polynucleotide" bezeichnet ist, beschrieben.
In einem Aspekt des Nachweisens eines PRRSV durch das Amplifizieren eines Polynucleotids richtet sich die Erfindung auf das Nachweisen eines Virus der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, mit denen europäische PRRSV und nordamerikanische PRRSV nicht nachgewiesen werden. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen eines viralen Polynucleotids, das verdächtigt wird, ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV zu sein, mit einem Primerpaar und Inkubieren unter Bedingungen, um ein nachweisbares, amplifiziertes Polynucleotid zu bilden, ein. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „Primerpaar" zwei einzelsträngige Polynucleotide, die zusammen verwendet werden können, um eine Region eines Polynucleotids vorzugsweise durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Das Polynucleotid, das aus dem Amplifizieren einer Region eines Polynucleotids resultiert, wird als ein „Amplifizierungsprodukt" oder ein „amplifiziertes Polynucleotid" bezeichnet. Der Ausdruck "unter Bedingungen, die geeignet sind, ein nachweisbares Amplifizierungsprodukt zu bilden" bezeichnet die Reaktionsbedingungen, die in einem Amplifizierungsprodukt resultieren. Zum Beispiel schließen im Fall einer PCR die Bedingungen, die geeignet sind, ein nachweisbares Amplifizierungsprodukt zu bilden, die geeigneten Temperaturen, Ionen und Enzyme ein.
Einer der Primer des Primerpaars ist komplementär zu einem Teil des viralen Polynucleotids, der den Nucleotiden 2268 und 2269 der SEQ ID NO: 1 oder dem Komplement davon entspricht. Die Verwendung eines solchen Primers resultiert in der Produktion eines amplifizierten Polynucleotids, wenn eine Deletion vorliegt. Im Gegensatz dazu wird die Verwendung eines solchen Primers bei einem europäischen PRRSV nicht in der Produktion eines amplifizierten Polynucleotids resultieren, weil etwa 51 Nucleotide zwischen den Nucleotiden vorhanden sind, die den Nucleotiden 2268 und 2269 der SEQ ID NO: 1 oder dem Komplement davon entsprechen. Zum Beispiel wird die Verwendung eines solchen Primerpaars nicht in einem amplifizierten Polynucleotid resultieren, wenn das virale Polynucleotid vom Lelystad-PRRSV stammt. Ein Beispiel eines Primerpaars, das in diesem Verfahren verwendet werden kann, schließt den Vorwärtsprimer 5'ATCGGGAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NO: 12), der den Nucleotiden 2255 bis 2276 von SEQ ID NO: 1 entspricht, und den Rückwärtsprimer Euro2714 5'-GCGCATAAGACAGATCCA (SEQ ID NO: 13) ein, wobei erwartet wird, dass ein amplifiziertes Polynucleotid von etwa 467 Nucleotiden resultiert. Ein anderes Primerpaar ist der Rückwärtsprimer: 5'-AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NO: 14), der dem Komplement der Nucleotide 2257 bis 2276 von SEQ ID NO: 1 entspricht, und der Vorwärtsprimer Euro20/5'-CAGAAGGGTTCGAGGAAG (SEQ ID NO: 15), wobei erwatet wird, dass ein amplifizierten Polynucleotid von etwa 170 Nucleotiden resultiert.
In einem anderen Aspekt des Nachweisens eines PRRSV durch die Amplifizierung eines Polynucleotids richtet sich die Erfindung auf das Nachweisen eines Virus der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, bei denen sowohl das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV als auch das europäische PRRSV nachgewiesen werden und sich die Molekulargewichte der amplifizierten Polynucleotide unterscheiden. Das in diesem Aspekt verwendete Primerpaar produziert ein amplifiziertes Polynucleotid, dass die Region der Deletion, d.h. die Nucleotide 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1, und die entsprechenden Nucleotide eines europäischen PRRSV einschließt. Wenn sowohl ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV als auch ein europäisches PRRSV amplifiziert werden und die resultierenden amplifizierten Polynucleotide verglichen werden, wird das amplifizierte Polynucleotid, das von dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV resultiert, ein Molekulargewicht haben, das etwa 51 Nucleotide weniger ist als ein amplifiziertes Polynucleotid eines europäischen PRRSV. Verfahren des Bestimmens des ungefähren Molekulargewichts eines amplifizierten Polynucleotids sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen zum Beispiel das Auflösen des Polynucleotids auf einem Acrylamid- oder Agarosegel ein.
Ein Beispiel eines Primerpaars, das in diesem Verfahren verwendet werden kann, schließt den Vorwärtsprimer Euro1671/5'-GCCTGTCCTAACGCCAAGTAC (SEQ ID NO: 16) und den Rückwärtsprimer Euro3165-rc: 5'-CATGTCCACCCTATCCCACAT (SEQ ID NO: 17) ein, was in einem amplifizierten Polynucleotid in einem europäisch-ähnlichen PRRSV von etwa 1494 Nucleotiden und einem amplifizierten Polynucleotid in einem europäischen PRRSV von etwa 1544 Nucleotiden resultiert. Andere Primerpaare schließen den Vorwärtsprimer Euro20/5'-CAGAAGGGTTCGAGGAAG (SEQ ID NO: 15) und den Rückwärtsprimer/Euro3207 5'-GCTTGGAACTGCGAGG (SEQ ID NO: 19) (erwartete Größe des amplifizierten Polynucleotids von einem dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV: etwa 910 Nucleotide); den Vorwärtsprimer Euro20/5'-CAGAAGGGTTCGAGGAAG (SEQ ID NO: 15) und den Rückwärtsprimer/Euro2714 5'-GCGCATAAGACAGATCCA (SEQ ID NO: 13) (erwartete Größe des amplifizierten Polynucleotids eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV: etwa 616 Nucleotide) ein. Wenn diese Primer verwendet werden, um ein europäisches PRRSV zu amplifizieren, wird erwartet, dass die Größe des amplifizierten Polynucleotids etwa 51 Nucleotide größer ist.
In einem weiteren Aspekt des Nachweisens eines PRRSV durch das Amplifizieren eines Polynucleotids richtet sich die Erfindung auf das Nachweisen eines Virus der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, bei denen ein europäisches PRRSV nachgewiesen wird und dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV nicht nachgewiesen werden. In diesem Aspekt der Erfindung ist mindestens einer der Primer eines Primerpaars komplementär zu einem Teil der Nucleotide 2419 bis 2470 des Prototyps des europäischen PRRSV, Lelystad (Genbank-Zugangsnummer NC 002533) oder dem Komplement davon. Ein Beispiel eines Primerpaars, das in diesem Verfahren verwendet werden kann, schließt den Vorwärtsprimer Euro1/: 5'TGAAGGTGCTCTGGTCT (SEQ ID NO: 20) und den Rückwärtsprimer/Euro2: 5'AAATTCCCGCCTACC (SEQ ID NO: 21) ein, was in einem amplifizierten Polynucleotid von einem europäischen PRRSV von etwa 51 Nucleotiden resultiert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Kit für die Verwendung im Nachweisen eines Virus der vorliegenden Erfindung, wobei der Kit den ersten Primer und einen zweiten Primer von Anspruch 13 oder 14, geeignet für die Verwendung im Amplifizieren eines Teils eines PRRSV, und Anweisungen für die Verwendung umfasst. Die Beschreibung beschreibt einen Kit für das Nachweisen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines immunogenen Analogs oder eines immunogenen Fragments davon. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit für die Verwendung im Nachweisen eines Antikörpers gegen das Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) in einem porcinen Individuum, wobei der Kit das Virus von Anspruch 1 oder 3 und Anweisungen für einen Antikörper, der spezifisch ein Virus der vorliegenden Erfindung bindet, oder ein Primerpaar, wie hierin beschrieben (wenn ein Polynucleotid amplifiziert wird) in einem geeigneten Verpackungsmaterial in einer Menge, die für mindestens einen Test ausreichend ist, umfasst. Vorzugsweise bindet der Antikörper das europäische PRRSV, das als I-1102 bei der Collection Nationale De Cultures De Microorganisms, Institute Pasteur, Frankreich, hinterlegt wurde, oder das nordamerikanische PRRSV, das als VR-2332 bei der ATCC hinterlegt wurde, nicht spezifisch. Wenn ein Antikörper gegen das Virus nachgewiesen wird, schließt der Kit ein Virus der vorliegenden Erfindung ein. Optionell sind andere Reagenzien wie Puffer und Lösungen, die benötigt werden, um die Erfindung auszuführen, auch eingeschlossen. Anweisungen für die Verwendung des verpackten Virus oder Polypeptids oder Primerpaars sind typischerweise auch eingeschlossen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Verpackungsmaterial" eine oder mehrere physikalische Strukturen, die verwendet werden, um die Bestandteile des Kits zu beherbergen. Das Verpackungsmaterial wird durch wohlbekannte Verfahren konstruiert, vorzugsweise um eine sterile, kontaminationsfreie Umgebung zu liefern. Das Verpackungsmaterial hat eine Beschriftung, die darauf hinweist, dass das Polypeptid oder Primerpaar für das Nachweisen eines Virus der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Zusätzlich enthält das Verpackungsmaterial Anweisungen, die darauf hinweisen, wie die Materialien im Kit angewendet werden, um ein Virus der vorliegenden Erfindung nachzuweisen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Verpackung" eine feste Matrix oder ein Material wie Glas, Plastik, Papier, Folie und dergleichen, das zum Halten eines Virus oder eines Primerpaars in festgesetzten Grenzen in der Lage ist. Daher kann zum Beispiel eine Verpackung ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um Milligramm-Mengen eines Primerpaars zu enthalten, oder sie kann eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte sein, in der Mikrogramm-Mengen eines Virus befestigt worden sind.
„Anweisungen für die Verwendung" schließen typischerweise einen handfesten Ausdruck ein, der die Reagenten-Konzentration oder mindestens einen Testverfahrens-Parameter wie die relativen Mengen von Reagenz und Probe, die zusammengemischt werden sollen, Aufrechterhaltungs-Zeiträume für Reagenz/Proben-Gemische, Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen beschreibt.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf eine immunogene Zusammensetzung, die ein abgeschwächtes oder inaktiviertes Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) umfasst, umfassend ein Polynucleotid, das unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standardparametern mindestens etwa 99% Identität mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz aufweist, und auf eine immunogene Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, das von der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination davon besteht. Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, umfassend ein abgeschwächtes oder inaktiviertes Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV), umfassend ein Polynucleotid, das mindestens unter Verwendung eines GAP-Algorithmus mit Standardparametern etwa 99% Identität mit einem RNA-Polynucleotid aufweist, umfassend die RNA-Nucleotidsequenz, die der SEQ ID NO: 1 entspricht, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung für die Behandlung eines porcinen Individuums mit einem Risiko einer Infektion mit einem PRRSV oder das Symptome einer PRRSV-Infektion zeigt, und die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination davon besteht, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zum Behandeln eines porcinen Individuums mit einem Risiko einer Infektion mit einem Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV) oder das Symptome einer PRRSV-Infektion zeigt. Die Behandlung kann prophylaktisch sein oder kann alternativ nach der Entwicklung von MSD in einem porcinen Individuum initiiert werden. Ein Impfstoff kann zum Beispiel eine immunogene Zusammensetzung oder einen neutralisierenden Antikörper einschließen. Der Begriff „Impfstoff" bezeichnet eine Zusammensetzung, die bei der Verabreichung an ein Individuum einen Schutz gegen ein Virus der vorliegenden Erfindung liefern wird. Wenn der Impfstoff eine immunogene Zusammensetzung einschließt, wird die Verabreichung an das Individuum auch eine immunologische Antwort auf ein Polypeptid produzieren und in einer Immunität resultieren.
Eine immunogene Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein abgeschwächtes oder inaktiviertes Virus der vorliegenden Erfindung und/oder ein oder mehrere Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder immunogene Analoge oder immunogene Fragmente davon und/oder ein Polynucleotid einschließen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „immunogene Zusammensetzung" eine Zusammensetzung oder ein Präparat, die/das in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um in einem/einer gewissen therapeutischen Nutzen oder Wirkung zu resultieren, um zu einer Immunantwort zu gelangen, die MSD in einem Individuum inhibiert oder verhindert, oder um in der Produktion von Antikörpern gegen ein PRRSV der vorliegenden Erfindung zu resultieren. Sowohl die lokale als auch die systemische Verabreichung wird in Betracht gezogen. Die systemische Verabreichung wird bevorzugt.
Ein in einem Impfstoff der Erfindung verwendetes Polynucleotid ist vorzugsweise eines, das eine Nucleotidsequenz einschließt, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein immunogenes Analog oder immunogenes Fragment davon codiert. Das Polynucleotid kann eine DNA, RNA oder eine Kombination davon einschließen. Das Polynucleotid kann als Teil eines Vektors oder als ein „nacktes" Polynucleotid bereitgestellt werden. Allgemeine Verfahren für die Konstruktion, Produktion und Verabreichung von Polynucleotid-Impfstoffen sind auf dem Fachgebiet bekannt, z.B. F. Vogel et al., Clin. Microbiol. Rev. 8: 406–410 (1995); WO 93/02556; Felgner et al., US-Patent Nr. 5,580, 859, Pardoll et al., Immunity 3: 165 (1995); Stevenson et al., Immunol. Rev. 145: 211 (1995); Molling, J. Mol. Med. 75: 242 (1997); Donnelly et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 772: 40 (1995); Yang et al., Mol. Med. Today 2: 476 (1996); und Abdallah et al., Biol. Cell 85: 1 (1995)). Ein Nucleinsäuremolekül kann durch Mittel, die auf dem Fachgebiet Standard sind, wie durch rekombinante Techniken oder durch enzymatische oder chemische Synthese hergestellt werden.
Vorzugsweise schließt die Verabreichung eines Polynucleotids, das ein Teil eines Impfstoffs ist, das Einbringen eines Expressionsvektors ein, der das Polynucleotid einschließt. Es gibt zahlreiche Plasmide, die Fachleuten bekannt sind und die nützlich für die Produktion von Polynucleotid-Impfstoffplasmiden sind, einschließlich zum Beispiel des Plasmids pVAX1 als der Vektor (InVitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Zusätzlich kann das Vektorkonstrukt immunstimulierende Sequenzen enthalten, die das Immunsystem des Tiers stimulieren. Beispiele von immunstimulierenden Sequenzen schließen zum Beispiel Sequenzen mit CpG-Motiven, zwei 5'-Purinen, einem nicht-methylierten CpG-Dinucleotid oder zwei 3'-Pyrimidinen ein (siehe zum Beispiel Lowie et al., DNA Vaccines Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ (2000)). Andere mögliche Anfügungen an die Polynucleotidimpfstoff-Konstrukte schließen Nucleotidsequenzen ein, die Cytokine wie den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder Interleukin-12 (IL-12) codieren. Die Cytokine können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um die Antwort des Immunsystems des Tieres, einschließlich sowohl die Antikörper- als auch die cytotoxischen T-Lymphocyten-Antworten fein abzustimmen, um den bestimmten Spiegel der Antwort hervorzubringen, der benötigt wird, um eine Immunantwort zu produzieren. Alternativ kann der Impfstoffvektor ein viraler Vektor, einschließlich eines Adenovirus-Vektors und ein Adenovirus-assoziierter Vektors oder ein retroviraler Vektor sein.
Immunogene Träger können verwendet werden, um die Immunogenität eines Impfstoffs, der eine immunogene Zusammensetzung einschließt, zu verstärken. Solche Träger schließen andere Polypeptide, Polysaccharide, Liposomen und bakterielle Zellen und Membranen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Polypeptid-Träger können mit dem abgeschwächten oder inaktivierten Virus der vorliegenden Erfindung und/oder einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem immunogenen Analog oder einem immunogenen Fragment davon verbunden sein, um Fusionspolypeptide durch rekombinante oder synthetische Mittel oder durch chemische Kopplung zu bilden. Nützliche Träger und Mittel zum Koppeln solcher Träger an Polypeptid-Antigene sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Impfstoff schließt vorzugsweise einen pharmazeutischen Träger ein, der kompatibel mit einem porcinen Individuum ist. Der Impfstoff kann oral, parenteral, intranasal oder intravenös verabreicht werden. Faktoren, die einen Einfluß auf die Impfstoffdosis haben, schließen zum Beispiel das Alter, Gewicht und den Spiegel des maternalen Antikörpers des infizierten Schweins ein. Die Impfstoffdosen sollten über etwa 14 bis 28 Tage angewendet werden, um zu versichern, dass das Schwein eine Immunität gegen die MSD-Infektion entwickelt hat.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Dosierungsformen verabreicht werden. Ein wässriges Medium, das den Impfstoff enthält, kann getrocknet und mit pharmazeutisch verträglichen, inerten Excipienten und puffernden Agenzien wie Lactose, Stärke, Calciumcarbonat, Natriumcitrat in Tabletten, Kapseln und dergleichen kombiniert werden. Diese Kombinationen können auch in ein Pulver geformt oder in einer wässrigen Lösung suspendiert werden, so dass diese Pulver und/oder Lösungen zum Tierfutter oder zum Tränkwasser der Tiere zugefügt werden können. Diese Zusammensetzungen können passenderweise gesüßt oder durch verschiedene bekannte Mittel geschmacklich verändert werden, um die orale Aufnahme des Impfstoffs durch das Schwein zu fördern.
Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung kann die Zusammensetzung mit (einem) pharmazeutisch verträglichen Träger(n), der (die) auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist (sind), wie Salzlösung, Wasser, Propylenglycol usw. kombiniert werden. In dieser Form kann der Impfstoff parenteral, intranasal und oral durch wohlbekannte Verfahren, die auf dem veterinärmedizinischen Fachgebiet bekannt sind, angewendet werden. Der Impfstoff kann auch intravenös durch eine Spritze verabreicht werden. In dieser Form wird der Impfstoff mit (einem) pharmazeutisch verträglichen, wässrigen Träger(n) wie einer Salzlösung kombiniert. Die parenteralen und intravenösen Präparate der Zusammensetzung können auch emulgierende und/oder auch suspendierende Agenzien zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel einschließen, um die Abgabe und die Dosismenge der Zusammensetzung zu kontrollieren.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele illustriert.
BEISPIELE
Beispiel 1
Nachweis des Virus in infizierten Schweinen.
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung eines neuen PRRSV von infizierten Schweinen. Dem PRRSV wurde die Bezeichnung MND99-35186 gegeben, und es wird in diesen Beispielen als dem europäischen Stamm ähnlich bezeichnet.
Verfahren
Drei lebende, 3 bis 4 Tage alte Schweine von einer Herde mit einer klinischen Geschichte von Spätaborten und lebensschwach-geborenen Schweinen wurden zum Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory (St. Paul, Minnesota) gebracht. Die Schweine wurden durch eine intravenöse Überdosis von Barbiturat euthanasiert und einer Nekropsie (Autopsie) unterzogen.
Teile der Lunge, Lymphknoten, des Gehirns, der Milz, der Niere, der Tonsille und des Herzens wurden gewonnen und als eine Probe gepoolt. Die Probe wurde für die Isolierung des Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms (PRRSV), des Pseudorabies-Virus (PRV) und des Schweine-Influenzavirus (SIV) behandelt.
Für die Isolierung von PRRSV wurden die Proben auf MARC-145-Zellen und primäre porcine alveoläre Makrophagen beimpft. Vor der Beimpfung wurden die Proben, wie von Rossow et al. (Vet. Pathol., 32, 361–373 (1995)) beschrieben, behandelt. Kurz, balancierte Hank Salzlösung wurde zu der Gewebeprobe oder den Seren zugefügt, um eine ungefähr 10% (Vol/Vol) Suspension herzustellen, und dann homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4133 × g für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt und aufbewahrt. Das pelletierte Material wurde verworfen. Die Bedingungen für das Beimpfen von MARC-145-Zellen und primären porcinen alveolären Makrophagen sind unten beschrieben. Zusätzlich wurde Serum von jedem Schwein zusammen in eine Probe gepoolt und dann verwendet, um MARC-145-Zellen und primäre porcine alveoläre Makrophagen zu beimpfen.
Teile der Lunge, der Lymphknoten, des Magens, des Gehirns, der Leber, der Niere, der Tonsille, des Herzens und des Ileums (ein Abschnitt des Dünndarms) wurden in 10% Formalin, gepuffert mit einem Gemisch von dibasischem Natriumphosphat und monobasischem Natriumphosphat, um pH 7,0 zu ergeben, konserviert. Die Gewebe wurden im Formalin für mindestens 12 Stunden vor der nachfolgenden Verwendung in den Tests inkubiert. Teile von jedem Gewebe wurden in Paraffin eingebettet.
Formalin-fixierte Gewebe wurden durch Hämatoxilin und Eosin (H und E)-Färbung gefärbt.
Formalin-fixierte Gewebe wurden auch für das PRRSV-Testen durch immunhistochemische Technik durch das Verfahren von Christopher-Hennings et al., (Vet. Pathol., 35, 260–267 (1998)) getestet. Kurz, von einer Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Lunge wurden Schnitte von ungefähr 4 Mikron angefertigt, und die Schnitte wurden auf Glas-Objektträger aufgetragen. Die Gewebeschnitte wurde mit dem monoclonalen Antikörper SDOW-17 bedeckt und in einer befeuchteten Kammer inkubiert. SDOW-17 ist ein monoclonaler anti-PRRSV-Antikörper, der ein Epitop erkennt, das auf dem Lelystad-PRRSV und auf dem VR-23332-PRRSV vorhanden ist. Der Antikörper, der an PRRSV in der Lunge bindet, wurde unter Verwendung eines modifizierten Avidin-Biotin-Komplex-Verfahrens (Hsu et al., J. Histochem. Cytochem., 29, 577–580 (1981)) identifiziert.
Die Lungenschnitte wurden schnell in Isopentan bei –30°C eingefroren. Die gefrorenen Schnitte wurden durch eine direkte Fluoreszenz-Antikörpertechnik unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers SDOW-17 auf PRRSV untersucht. Die direkte FA-Untersuchung des Gewebes wurde durch das Verfahren von Rossow et al. (Vet. Pathol., 32, 361–373 (1995)) durchgeführt. Kurz, die Gewebe wurden eingefroren, Schnitte von ungefähr 5 Mikron angefertigt und auf Glas-Objektträger übertragen. Die Gewebeschnitte wurde mit Fluoreszenz-konjugiertem SDOW-17, einem monoclonalen anti-PRRSV-Antikörper (erhalten von E. Nelson, South Dakota State University, South Dakota), bedeckt. Die Gewebeschnitte wurden dann in einer befeuchteten Kammer für etwa 1 Stunde inkubiert und überschüssiger, ungebundener Antikörper wurde durch Waschen in phosphatgepufferter Salzlösung entfernt. Die Anwesenheit des Antikörpers, der an PRRSV in der Lunge bindet, wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.
Gehirn-, Lungen- und Leberproben wurden auf Blutagar-Platten kultiviert, um die Anwesenheit von aeroben Bakterien nachzuweisen.
Gepoolte Gewebe wurden unter Verwendung des Verfahrens von Smith et al. (Cornell Vet., 57, 517–526 (1967)) auch auf Leptospiren untersucht.
Ergebnisse
PRRSV wurde in Lungenschnitten von jedem Schwein durch den immunhistochemischen und direkten fluoreszenten Antikörper identifiziert.
Lichtmikroskopische Gewebeläsionen (H- und E-Objektträger) waren kompatibel mit einer PRRSV-Infektion. Die Histopathologie der Lungen zeigte diffuse Septumverdickungen durch Makrophagen. Manche Alveolen enthielten nekrotische Zelltrümmer. Die Lymphknoten waren durch germinale Zentren, die mit Blasten-Lymphocyten und kleinen Nekrosefoci gefüllt waren, charakterisiert. Die Muskelschicht in einem Magen war durch lymphoplasmacytische Perineuritis und Perivasculitis charakterisiert. Gehirn, Leber, Niere, Tonsille, Herz und Ileum hatten keine Läsionen.
Tests auf PRV und SIV waren negativ, und keine bakteriellen Pathogene wurden in den Geweben der infizierten Schweine identifiziert.
PRRSV wurde vom gepoolten Gewebehomogenat und den gepoolten Seren, die in den alveolären Makrophagen kultiviert wurden, isoliert. Er waren jedoch wenige Zellen mit PRRSV infiziert. PRRSV wurde von keiner Probe, die in MARC-145-Zellen kultiviert wurde, isoliert.
Da dieses PRRSV in den alveolären Makrophagen schwach wuchs, wurden 3 bis 4 Wochen-alte Schweine von einem dokumentierten, PRRSV-freien Hof mit ungefähr 1 ml des Virus, das vom Überstand der infizierten alveolären Makrophagen erhalten wurde, geimpft (intramuskulär und intranasal). Das Virus wurde durch Zugabe von etwa 9 ml balancierter Hank-Salzlösung zu etwa 1 ml Virus-enthaltendem Überstand verdünnt. Klinisch zeigten die experimentell infizierten Schweine dieselben Symptome von milden, transienten Zeichen von Lethargie innerhalb von etwa 1–2 Tagen, die auch nach einer Infektion eines Schweins mit dem Lelystad-Virus oder VR-2332 gesehen werden. Jedes infizierte Schwein serokonvertierte zu der PRRSV-Infektion. Die Serokonversion wurde durch den IDEXX-EIisa-Test (HerdCheck-PRRSV, IDEXX Laboratories Inc. Westbrook, ME) gemessen. Die Serokonversion wurde auch durch indirekten fluoreszenten Antikörper-Test unter Verwendung von Lelystad-infizierten Zellen und dem Verfahren von Yoon et al. (J. Vet. Diagn. Invest., 4, 144–147 (1992)) gemessen. Das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV wurde von den infizierten Schweine-Geweben und dem Serum, das in porcinen alveolären Makrophagen kultiviert wurde, re-isoliert und in den Geweben durch Immunhistochemie identifiziert.
Beispiel 2
Infektion von porcinen alveolären Makrophagen mit PRRSV
Porcine alveoläre Makrophagen wurden durch Gewinnen von PRRSV-negativen Schweinen, die weniger als 6 Wochen alt waren, isoliert. Die Schweine wurde euthanasiert und Trachea und Lungen wurden entfernt und die Luftwege mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung gespült. Die phosphatgepufferte Salzlösung wurde durch Kombinieren von 8,5 Gramm NaCl, 1,1 Gramm Dinatriumphosphat und 0,32 Gramm Natriummonophosphat in 10 Liter destilliertem Wasser hergestellt. Die porcinen alveolären Makrophagen wurden durch Zentrifugation konzentriert, durch Isolierung und Untersuchen unter Verwendung eines direkten fluoreszenten Antikörpers, wie in Beispiel 1 beschrieben, als negativ für PRRSV bestätigt und sofort verwendet oder in flüssigem Stickstoff in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml gelagert. Gefrorene alveoläre Makrophagen sollten innerhalb von 6 Monaten verwendet werden.
Frisch geerntete porcine alveoläre Makrophagen (etwa 10⁷) oder gefrorene Zellen (10⁶ Zellen) wurden auf einer Platte mit 48 Vertiefungen oder einer 1 × 75 cm-Flasche plattiert und man ließ sie für 4 Stunden bis über Nacht in etwa 10 bis 25 ml komplettem RPMI-1640-Medium anhaften. Man kann die Zellen nicht für mehr als einen Tag inkubieren lassen, bevor das Virus zugefügt wird. Das komplette RPMI-1640-Medium wird durch Kombinieren von 500 ml RPMI-1640-Medium, enthaltend 300 mg/Liter L-Glutamin, 25 mM HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)] (Katalog # 10-041-CV, Mediatech Inc., Herndon, Virginia), 40 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Kat. # 12133-78P; JRH Bioscience, Inc., Lenexa, Kansas), 1 Gramm Neomycinsulfat (Gibco Life Technologies, Rockville, Maryland), 40 ml balancierte Hank Salzlösung (HBSS) (Gibco Life Technologies, # 14180053, Rockville, Maryland), enthaltend Neomycinsulfat in einer Endkonzentration von 150 μg/ml Medium), 66 ml HBSS, enthaltend Penicillin G-Kaliumsalz (Sigma # P7794, ST. Louis, Missouri), Streptomycinsulfat (Sigma # S9137) und gelöstes Amphotericin B (Sigma A-9528) in einer Endkonzentration von 2500 E Penicillin G, 0,45 mg Streptomycinsulfat/ml Medium und 120 μg/ml Amphotericin B/ml Medium hergestellt.
Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden einmal in HBSS gewaschen, und die Zellen wurden mit 1 ml Virus in 1 ml inkomplettem RPMI-Medium (dasselbe wie das komplette RPMI, aber ohne zugefügtes FRS) infiziert. Der Virustiter kann variieren und ist, wenn das Virus von einem Gewebe ist, das von einem PRRSV-infizierten Schwein isoliert wurde, unbekannt. HBSS war 500 ml HBSS, ergänzt mit 5 ml 100 × Neomycin (10 mg/ml) und 5 ml 100 × Penicillin (10 000 E/ml), Streptomycin (10 mg/ml) und Fungizon (25 μg/ml).
Die Platte wurde für 1 Stunde bei Zimmertemperatur sanft rotiert. Neun ml komplettes RPMI-Medium wurden zugefügt, und die infizierten Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurde täglich betrachtet, bis ein 60–80% cytopathischer Effekt (CPE) gesehen wurde (2–3 Tage). Der CPE erscheint als fragmentierte, vakuolisierte, missgebildete, geschrumpfte Zellen.
Das Virus wurde durch Entfernen des Mediums und Zentrifugieren bei etwa 4000 × g für 10 Minuten, um die zellulären Trümmer zu entfernen und das Virus im Überstand zu lassen, isoliert.
Das Vorliegen von PRRSV in den primären porcinen alveolären Makrophagen wurde durch Färben mit dem monoclonalen SDOW-17-Antikörper bestätigt, wie von Nelson et al. (J. Clin. Microbiol., 34, 3184–3189 (1993)) beschrieben.
Beispiel 3
Sequenzanalyse des Virus
1. PRRSV-RNA-Extraktion:
Die virale RNA wurde von den Makrophagen-Kulturüberständen unter Verwendung des QIAamp Viral RNA Mini Spin Kit (QIAgen, Inc., Valencia, Kalifornien) extrahiert. Kurz, 280 μl Zellkulturflüssigkeit wurden zu 1120 μl Puffer AVL/Träger-RNA zugefügt, für 15 Sekunden puls-gevortext, bei Zimmertemperatur für 10 Minuten inkubiert und kurz zentrifugiert. Nach diesem Schritt wurde 1120 μl 100% Ethanol zu der Reaktion zugefügt, für 15 Sekunden puls-verwirbelt und kurz zentrifugiert. Der Reaktionsansatz wurde dann auf eine QIAamp-Spin-Säule (in einem 2 ml-Sammelröhrchen) in 630 μl-Aliquots (4×) aufgetragen und bei 6000 × g (800 UpM) für 1 Minute zentrifugiert, wobei jedes Mal der Durchfluss verworfen wurde. Wenn die ganze Probe auf den Filter aufgetragen war, wurde die QIAamp-Spin-Säule in ein sauberes 2 ml-Sammelröhrchen platziert und wieder zentrifugiert. Der Puffer AW1 (500 μl) wurde zu dem Filter, enthaltend virale RNA, zugefügt, und dieser Reaktionsansatz wurde bei 6000 × g (8000 UpM) für 1 Minute zentrifugiert. Der Puffer AW2 (500 μl) wurde zu der Spin-Säule zugefügt, und die Säule wurde bei höchster Geschwindigkeit (20000 × g; 14000 UpM) für 3 Minuten zentrifugiert. Das Sammelröhrchen wurde verworfen, und die QIAamp-Spin-Säule wurde in ein sauberes 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen platziert. Puffer AVE (60 μl) wurde zu der Spin-Säule zugefügt, die Säule bei Zimmertemperatur für 1 Minute inkubiert und dann bei 6000 × g (8000 UpM) für 1 Minute zentrifugiert.
2. RT-PCR:
Zwei Verfahren wurden verwendet, um die virale RNA revers zu transkribieren und DNA für die Verwendung in der DNA-Sequenzanalyse zu erhalten. Im Allgemeinen wurden die Primer ausgewählt, um an einen geeigneten Teil der SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren und ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das dann in den DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendet wurde.
a. Qiagen-OneStep-RT-PCR:
Fünf Microliter extrahierte RNA wurde zu einem Reaktionsgemisch zugefügt, das 1 × Qiagen-RT-PCR-Puffer; je 400 nM dATP, dCTP, dGTP und dTTP; 0,08 Einheiten/Reaktion RNase-Inhibitor (20 E/μl, Perkin Elmer, Boston Massachusetts); 1/25 Volumen Qiagen-Enzym-Gemisch; je 300 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer; enthielt, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 ml auszumachen. Die Thermocycler-Bedingungen bestanden aus: 1 Zyklus 50°C für 30 Minuten; 1 Zyklus 95°C für 15 Minuten; 35 Zyklen 57°C für 30 Sekunden, 72°C für 45 Sekunden, 94°C für 45 Sekunden; 1 Zyklus 57°C für 30 Sekunden; 1 Zyklus 72°C für 10 Minuten und Halten bei 4°C.
b. RT- und RCR-2-Schrittreaktion

b1. Reverse Transkription: Zufällig geprimte cDNA wurde auf folgende Weise hergestellt: 2 μl 50 μM zufällige Hexamere wurde zu 6 μl RNA-Extrakt zugefügt. Dies wurde auf 70°C für 5 Minuten erhitzt und schnell auf Eis abgekühlt. Dann 32 μl eines Mastermix, enthaltend 5 mM MgCl₂ (Perkin Elmer), 1 × Perkin Elmer-Puffer II (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, (pH 8,3 bei Zimmertemperatur)), 1 mM dNTPs (Perkin Elmer), 1 E/μl RNase-Inhibitor (20 E/μl, Perkin Elmer) und 25 E/μl MuLV-RT (murine, reverse Leukämievirus-Transkriptase; Perkin Elmer). Die Thermocycler-Bedingungen bestanden aus: 1 Zyklus 22°C für 10 Minuten; 1 Zyklus 42°C für 15 Minuten; 1 Zyklus 95°C für 10 Minuten, 1 Zyklus 5°C für 5 Minuten und Halten bei 4°C.
b2. PCR: Das Reaktionsgefäß, enthaltend 40 μl 5 mM MgCl₂ (Perkin Elmer), 1 × Perkin Elmer-Puffer II, 300 nM Vorwärtsprimer, 300 nM Rückwärtsprimer und 0,25 E/μl Amplitaq Polymerase (Perkin Elmer), wurde zu 10 μl cDNA zugefügt, die von der reversen Transkription erhalten wurde (Absatz b1, oben). Alternativ, um längere Abschnitte von zufällig geprimter cDNA zu amplifizieren, wurde der Expand Long Template PCR Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) verwendet. Die Thermocycler-Bedingungen bestanden aus: 1 Zyklus 93°C für 4 Minuten; 35 Zyklen 57°C für 30 Sekunden, 72°C für 45 Sekunden, 93°C für 45 Sekunden; 1 Zyklus 57°C für 30 Sekunden; 1 Zyklus 72°C für 10 Minuten und Halten bei 4°C. (Die Anlagerungstemperatur würde gemäß dem Primerpaar, das angewendet wurde, um die cDNA zu amplifizieren, variieren).

3. Die Ergebnisse von jeder PCR wurden bewertet und für die DNA-Sequenzierung vorbereitet. Die Sequenzanalyse wurde durch das Advanced Genetic Analysis Center (AGAC) (University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota) unter Verwendung eines ABI Modell 377-DNA-Sequenziergeräts durchgeführt.
I. Bewertung der PCR-Reaktionen auf einem Agarosegel.
Ein Gramm Agarose wurde zu 100 ml 1 × TAE-Puffer zugefügt. Dies wurde für 2 Minuten in der Mikrowelle erhitzt, und 4 μl von 10 mg/ml EtBr wurden zu 100 ml Agarose zugefügt. Das Gel wurde gegossen und man ließ es über etwa 15–30 Minuten, fest werden. 4 μl des PCR-Produkts wurden mit 1 μl Ladefarbstoff gemischt und zu dem Gel zugefügt, das bei 140 Volt für 1 Stunde oder bei 75 Volt für 2 Stunden laufen gelassen wurde.
II. Aufreinigung des PCR-Produkts mit dem Qiagen-Qiaquick-PCR-Aufreinigungskit
Für jede Probe, die aufgereinigt werden soll, wurde eine Säule in ein Sammelröhrchen platziert. 100 μl PB-Puffer wurden zu der 20 μl-PCR-Reaktion, die im PCR-Röhrchen verblieben ist, zugefügt und gründlich gemischt. Das gesamte PCR-Produkt/PB-Puffer-Gemisch wurde zu der Säule zugefügt, und die Säule wurde für 1 Minute bei höchster Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Mikrofuge zentrifugiert. Der Durchfluss des Sammelröhrchens wurde verworfen, und die Säule wurde zurück in das Röhrchen platziert. 750 μl PE-Puffer wurden zugefügt, und die Säule wurde für eine weitere Minute bei höchster Geschwindigkeit zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Durchflusses vom Sammelröhrchen wurde die Säule für eine weitere Minute bei höchster Geschwindigkeit zentrifugiert, um jeglichen Rest-PE-Puffer aus der Säule zu entfernen. Die Säule wurde in ein sauberes Mikrofugen-Röhrchen übertragen, und 30 μl H₂O wurden zu der Säule zugefügt und für mindestens eine Minute bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Säule wurde für eine Minute bei höchster Geschwindigkeit zentrifugiert. Das PCR-Produkt/H₂O eluiert in das Mikrofugen-Röhrchen und war bereit, zu der Sequenzierungsreaktion zugefügt zu werden.
Beispiel 4
Nachweis des dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV.
In diesem Beispiel wurden virale DNAs unter Verwendung von Primern amplifiziert, die das dem europäischen Stamm ähnliche PRRSV, das europäische PRRSV und das nordamerikanische PRRSV amplifizieren. Die amplifizierte Region schloss die Deletion ein, die im dem europäischem Stamm-ähnlichen PRRSV vorhanden ist.
Die virale RNA von Lelystad wurde von Überständen von infizierten MA-104-Zellen erhalten, die virale RNA von VR-2332 wurde von Überständen von infizierten MA-104 Zellen erhalten, und die virale RNA von dem europäischen Stamm ähnlichem PRRSV wurde von Überständen von infizierten primären porcinen alveolären Makrophagen erhalten. Die cDNA der viralen RNA wurde, wie oben in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt.
Die viralen cDNAs wurde unter Verwendung der Primer Euro1671/: 5'-GCCTGTCCTAACGCCAAGTAC (SEQ ID NO: 16) und/Euro3165-rc: 5'-CATGTCCACCCTATCCCACAT (SEQ ID NO: 17) amplifiziert. Die Amplifizierungsbedingungen sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2. Allgemeine PCR-Bedingungen (für eine 50 μl-Reaktion)
Ergebnisse

Die Amplifizierung der viralen DNA von Lelystad, VR-2332 und des dem europäischen Stamm ähnlichen PRSV resultierte in Amplifizierungsprodukten, die bei den vorhergesagten Molekulargewichten wanderten. Wie erwartet, wanderte das Produkt des Amplifizierens der dem europäischen Stamm ähnlichen DNA bei etwa 1,5 Kilobasen, ungefähr 51 Basenpaare weniger als Lelystad. Sequenzprotokoll freier Text

SEQ ID NO: 1	Teil der Nucleotidsequenz eines Virus des porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndroms
SEQ ID NO: 2–10	Polypeptide, die von den offenen Leserahmen von SEQ ID NO: 1 vorhergesagt wurden.
SEQ ID NO: 11	Nucleotide 1981 bis 2820 des Lelystad-Virus
SEQ ID NO: 12–17	Primer
SEQ ID NO: 18	Oligonucleotid
SEQ ID NO: 19–21	Primer

Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Virus, das unter der ATCC-Zugangsnummer PTA-2194 hinterlegt wurde.
Isolierte Zelle, die ein Virus umfasst, das unter der ATCC-Zugangsnummer PT-2914 hinterlegt wurde.
Isoliertes Virus, das ein RNA-Polynucleotid umfasst, umfassend die RNA-Nucleotidsequenz, die der SEQ ID NO: 1 entspricht.
Isoliertes Polynucleotid, umfassend die Sequenz der SEQ ID NO: 1.
Isoliertes Polynucleotid, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Isoliertes Polynucleotid, das mindestens etwa 99% Identität mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz aufweist, wobei ein GAP-Algorithmus mit Standardparametern verwendet wird, und wobei das Polynucleotid in einer Zelle repliziert.
Vektor, umfassend ein Polynucleotid, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz umfasst.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 bis 10.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen eines Viruspartikels an ein nicht-menschliches Tier, wobei das Viruspartikel ein RNA-Polynucleotid umfasst, das die SEQ ID NO: 1 entsprechende RNA-Nucleotidsequenz umfasst, in einer Menge, die wirksam ist, die Produktion eines für das Viruspartikel spezifischen Antikörpers zu verursachen.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen eines Polypeptids an ein nicht-menschliches Tier, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 bis 10, oder eines Polynucleotids, dass das Polypeptid codiert, in einer Menge, die wirksam ist, die Produktion eines für das Polypeptid spezifischen Antikörpers zu verursachen.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem polyclonalen Antikörper und einem monoclonalen Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, des weiteren umfassend das Isolieren des Antikörpers.
In vitro-Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines dem europäischen Stamm ähnlichen porcinen reproduktives und respiratorisches Syndrom-Virus (PRRSV), umfassend: Inkontaktbringen eines viralen Polynucleotids mit einem ersten Primer und einem zweiten Primer unter Bedingungen, die geeignet sind, ein nachweisbares Amplifikationsprodukt zu bilden, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil von SEQ ID NO: 1 ist, der die Nucleotide 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1 oder das Komplement hiervon umfasst; und Nachweis eines Amplifikationsprodukts, wobei der Nachweis anzeigt, dass das virale Polynucleotid ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV ist.
In vitro-Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines dem europäischen Stamm ähnlichen PRRSV in einem Schwein, umfassend: Inkontaktbringen einer biologischen Probe des Schweins mit einem ersten Primer und einem zweiten Primer und Inkubieren unter Bedingungen, die geeignet sind, ein nachweisbares Amplifikationsprodukt zu bilden, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die komplementär zu einem Teil von SEQ ID NO: 1 ist, der die Nucleotide 2268 und 2269 von SEQ ID NO: 1 oder das Komplement hiervon umfasst; und Nachweis eines Amplifikationsprodukts, wobei der Nachweis anzeigt, dass das Schwein ein dem europäischen Stamm ähnliches PRRSV hat.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei der erste Primer eine Nucleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 5'-ATCGGGAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NR: 12), und 5'-AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NR: 14).
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die biologische Probe Lungengewebe umfasst.
Kit zur Verwendung zum Nachweis von PRRSV in einem Schwein, wobei der Kit den ersten Primer und einen zweiten Primer nach Anspruch 13 oder 14 umfasst, die geeignet sind zur Verwendung zur Amplifikation eines Teils eines PRRSV, sowie Anweisungen für das Verwenden des Primer-Paares.
Kit zur Verwendung zum Nachweis eines gegen PRRSV gerichteten Antikörpers in einem Schwein, wobei der Kit das Virus nach Anspruch 1 oder 3 und Instruktionen für die Verwendung des Virus umfasst.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein attenuiertes oder inaktiviertes PRRSV, umfassend ein Polynucleotid, das mindestens etwa 99% Identität mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz aufweist, wobei ein GAP-Algorithmus mit Standardparametern verwendet wird.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination hiervon.
Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung umfassend ein attenuiertes oder inaktiviertes PRRSV, das ein Polynucleotid mit mindestens etwa 99% Identität mit einem RNA-Polynucleotid aufweist, umfassend die RNA-Nucleotidsequenz entsprechend SEQ ID NO: 1, wobei ein GAP-Algorithmus mit Standardparametern verwendet wird, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Behandlung eines Schweins, das dem Risiko ausgesetzt ist, mit einem PRRSV infiziert zu werden, oder Symptome einer PRRSV-Infektion zeigt.
Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 und einer Kombination hiervon für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Behandlung eines Schweins, das dem Risiko ausgesetzt ist, mit PRRSV infiziert zu werden, oder Symptome einer PRRSV-Infektion zeigt.