ES2267719T3 - Virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y metodos de empleo. - Google Patents

Abstract

Un virus aislado, registrado en la ATCC con el número de registro PTA-2194.

Description

Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y métodos de empleo.

Esta solicitud reivindica el beneficio de las siguientes aplicaciones provisionales de U.S., serie nº 60/181.041 registrada el 8 de Febrero de 2000; serie nº 60/193.220 registrada el 30 de Marzo de 2000; serie nº 60/206.624 registrada el 24 de Mayo de 2000; serie nº 60/215.373 registrada el 29 de Junio de 2000; y serie nº 60/260.041 registrada el 5 de Enero de 2001; número de archivo 110.0125 0164 titulada "Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y método de detección".

Antecedentes

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es un miembro de la familia Arteriviridae del orden de Nidovirales (Cavanagh et al., Virol, 176, 306-307 (1990)) que causa el fallo reproductivo en cerdos de granja y problemas respiratorios en cerdos jóvenes (ver Rossow, Vet. Pathol., 35, 1-20 (1998)). El síndrome fue primeramente reconocido como "enfermedad misteriosa del cerdo" en los Estados Unidos en 1987 y se descubrió en Europa en 1990. Una cepa de PRRSV que es predominante en Europa ha sido aislada con el nombre de Lelystad virus (Wensvoort et al., Vet. Q., 13, 121-130(1991)). Ha sido aislado un PRRSV norteamericano al que se ha llamado VR-2332 (Collins et al., J. Vet. Diagn. Investig., 4, 117-126 (1992)). La enfermedad ha sido también llamada síndrome de Wabash, enfermedad misteriosa del cerdo, síndrome reproductivo y respiratorio porcino, plaga del cerdo, síndrome del aborto epidémico y respiratorio del cerdo, enfermedad del aborto azul, enfermedad de la oreja azul, azul de aborto, y "seuchenhafter spatabort der schweine" ("aborto tardío epidémico de los cerdos"). La enfermedad se caracteriza por el fallo reproductivo en las cerdas preñadas y problemas respiratorios en cerdos de todas las edades. La enfermedad tiene un importante impacto negativo en la industria porcina.

El PRRSV es un virus de ARN monocatenario positivo con envoltura. El ARN con un casquete en 5' y poliadenilado en 3' del virus, es policistrónico y contiene (5' a 3') dos grandes marcos de lectura abiertos de replicasa (ORF), 1a y 1b, y varios ORF pequeños. En la célula infectada los arterivirus producen un conjunto alojado de seis a ocho ARNm subgenómicos coterminales principales (ARNsgm) cada uno de los cuales se cree que expresa solamente el terminal ORF 5' relativo. Estos ARNsgm tienen una secuencia líder derivada del extremo 5' del genoma que se une a los sitios de unión del cuerpo del líder específico localizados corriente abajo por un mecanismo de transcripción discontínuo no claro (Lai, Adv. Exp. Med. Biol., 380, 463-471 (1995)). Los ARNsgm del PRRSV codifican cuatro glicoproteínas (GP2 a 5 codificadas por los ARNsgm 2 a 5), una proteína de membrana sin glicosilar (M, codificada por el ARNsgm 6), y una proteína nucleocapsídica (N, codificada por ARNsgm 7). La cepa prototipo europea del PRRSV, Lelystad, contiene todas estas seis proteínas en la partícula del virus, pero solamente las proteínas codificadas por los ORF 5 a 7 se ha demostrado como conclusión que estaban en el virión de los aislados norteamericanos.

Las comparaciones de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los ORF 3' terminales, 2 a 7, han mostrado que existen importantes diferencias entre las cepas de PRRSV nativas de Europa y las encontradas en Norteamérica (Kapur et al., J. Gen. Virol., 77, 1271-1276 (1996), Murtaugh et al., Arch. Virol., 40, 1451-1460 (1995)). Existe también una substancial variación entre los aislados de PRRSV norteamericanos. La comparación genotípica entre las cepas VR-2332 y Lelystad ha revelado que el ORF aa de VR-2332 es muy diferente del de Lelystad tanto en longitud como en la secuencia, mientras que el ORF 1b se ha conservado relativamente igual entre las dos cepas de PRRSV. La secuencia líder 5' del VR-2332 fue 31 bases más corta que la del Lelystad y fue muy diferente en la secuencia de nucleótidos. Las comparaciones entre regiones de la secuencia de amino-ácidos revelaron también que aunque los dominios funcionales reconocidos de las proteínas de ORF 1a, estaban presentes en ambas cepas, las proteínas no estaban bien conservadas iguales entre estos dominios. Así pues, aunque estas dos cepas de PRRSV causen enfermedades similares, son diferentes en los genes que codifican las proteínas estructurales.

El PRRSV continúa causando pérdidas económicas importantes en todo el mundo. Existen vacunas que están disponibles, pero están basadas en una sola cepa de PRRSV, y es evidente que las cepas de PRRSV varían a niveles antigénicos y genéticos. Además desde que el virus fue identificado en Europa y en los Estados Unidos, han continuado emergiendo nuevos fenotipos de la enfermedad.

Resumen de la invención

La presente invención representa la identificación de un nuevo virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Ya se conoce en la técnica que existe una gran cantidad de variaciones de las secuencias de nucleótidos entre el PRRSV europeo asociado con las epidemias europeas de la misteriosa enfermedad porcina (MSD) y el PRRSV norteamericano asociado con las epidemias norteamericanas de MSD. Como se utilizan en el presente escrito, los términos "PRRSV europeo" y "cepa europea" se emplean intercambiablemente y se refieren a las cepas de PRRSV que son predominantes en Europa. Un ejemplo de una "PRRSV europea" que es conocida en la técnica es la cepa prototípica europea, Lelystad, la cual está disponible en la Collection Nationale De Cultures De Microorganisms ("Colección nacional de cultivos de micro-organismos") del Instituto Pasteur de Francia, con el número de registro I-1102 (ver Wensvoort et al., patente U.S. 5.620.691). La secuencia de nucleótidos de la cepa Lelystad está disponible en el Genbank Accession Number ("número de registro de entrada del banco de genes") NC_002533. Como se utilizan en el presente escrito, los términos "PRRSV norteamericano" y "cepa norteamericana" se emplean intercambiablemente y se refieren a las cepas de PRRSV que son predominantes en Norteamérica. Un ejemplo de "PRRSV norteamericano" conocido en la técnica es la prototípica cepa norteamericana VR-2332 la cual está disponible en la ATCC con el número de registro VR-2332. La secuencia de nucleótidos de la cepa VR-2332 está disponible en el número de registro de entrada del banco de genes U87392.

El PRRSV que se describe en la presente no ha sido descrito antes, y se ha asociado con una epidemia norteamericana de MSD, pero inesperadamente y sorprendentemente tiene una secuencia de nucleótidos que es más similar a las cepas de PRRSV europea que a las cepas de PRRSV norteamericana. Como se emplea en el presente escrito, las expresiones "PRRSV similar al europeo" y "cepa similar a la europea", se utilizan intercambiablemente y se refieren al PRRSV de la presente invención. Las características del PRRSV similar al europeo están descritas en la presente.

La presente invención proporciona un virus aislado depositado en ATCC con el número de registro PTA-2194, y una célula aislada que contiene dicho virus. La invención proporciona también un virus aislado que incluye un polinucleótido de ARN que contiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID NO: 1. La invención proporciona un polinucleótido aislado que contiene la secuencia SEQ ID NO: 1. El polinucleótido aislado puede tener por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, en donde el polinucleótido se replica en una célula.

También se proporciona un vector que incluye un polinucleótido que incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, y un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo formado por SEQ ID NO: 2-10. Se piensa que los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente el 95% de identidad con SEQ ID NO: 2, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con SEQ ID NO: 3, por lo menos aproximadamente el 98% de identidad con SEQ ID NO: 4, por lo menos aproximadamente el 94% de identidad con SEQ ID NO: 5, por lo menos aproximadamente el 95% de identidad con SEQ ID NO: 6, por lo menos aproximadamente el 91% de identidad con SEQ ID NO: 7, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con SEQ ID NO: 9, ó por lo menos aproximadamente el 99,5% de identidad con SEQ ID NO: 10, pueden también ser útiles con respecto a la presente invención.

La especificación describe un anticuerpo que se une específicamente al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino similar al europeo (PRRSV), y proporciona un método para preparar dicho anticuerpo. El método incluye la administración a un animal de una partícula del virus que incluye un polinucleótido de ARN que incluye la secuencia de nucleótidos del ARN correspondiente a SEQ ID NO: 1, o un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 2-10, o un polinucleótido que codifica el polipéptido. La partícula, polipéptido o polinucleótido se administra en una cantidad efectiva para ocasionar la producción del anticuerpo específico para la partícula de virus. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, y el método puede además incluir el aislamiento del anticuerpo. También menciona la especificación el anticuerpo producido por el método.

En la especificación se describen métodos para la detección de un PRRSV. Un método in vitro incluye el contacto de una partícula de virus, por ejemplo a partir de una muestra biológica, con un anticuerpo de la presente invención en condiciones para formar un complejo con una partícula del virus, y detectando dicho complejo, de manera que la presencia del complejo indica la presencia de un PRRSV. El método puede también emplearse para detectar el PRRSV en un sujeto porcino. También se describe un kit para emplear en la detección del PRRSV en un sujeto porcino. El kit incluye el anticuerpo de la invención e instrucciones para el empleo del anticuerpo.

Se proporcionan también los métodos para la detección de la presencia de un PRRSV similar al europeo. Los métodos incluyen la puesta en contacto de un polinucleótido vírico con un primer cebador y un segundo cebador en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable. El primer cebador incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1 ó el complemento de los mismos. El método incluye además la detección de un producto de amplificación, en donde la detección indica que el polinucleótido vírico es un PRRSV similar al europeo. Ejemplos de los primeros cebadores que pueden utilizarse incluyen el 5'ATCGGGAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NO: 12), y 5'AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NO: 14). El método puede emplearse también para la detección de la presencia de un PRRSV similar al europeo en un sujeto porcino e incluye la toma de contacto de una muestra biológica de un sujeto porcino con el primer cebador y el segundo cebador. La muestra biológica incluye de preferencia tejido pulmonar.

La invención proporciona también un kit para emplear en la detección del PRRSV en un sujeto porcino. El kit incluye el primero y el segundo cebador de la invención, adecuados para emplear en la amplificación de una porción del PRRSV e instrucciones para emplear el par de cebadores. Otro kit proporcionado por la invención es para emplear en la detección de anticuerpos al PRRSV en un sujeto porcino. El kit incluye el virus de la invención e instrucciones para emplear el virus.

También proporciona la invención una composición inmunogénica. La composición incluye un PRRSV atenuado o inactivado que incluye un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto. La composición inmunogénica puede incluir un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y una combinación de los mismos.

Métodos de tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección por PRRSV ó que muestra síntomas de una infección por PRRSV, se describen también en la especificación. Dichos métodos incluyen la administración al animal de una composición inmunogénica que incluye un PRRSV atenuado o inactivado, el cual incluye un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente un 96% de identidad con un polinucleótido que comprende un ARN que contiene la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con defecto de parámetros. La composición inmunogénica se administra en una cantidad efectiva para causar una respuesta inmunológica al PRRSV. La composición inmunogénica puede incluir un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, un análogo inmunogénico de los mismos, un fragmento inmunogénico de los mismos o una combinación de los mismos. Alternativamente, puede administrarse al sujeto porcino un anticuerpo neutralizante en una cantidad efectiva para tratar el sujeto porcino.

A no ser que se especifique otra cosa, un, uno, una, unos, unas, el, la, los, las, y "por lo menos uno", se emplean intercambiablemente y significan uno o más de uno.

Finalmente, la presente invención se refiere al empleo de una composición inmunogénica que comprende un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) atenuado o inactivado, que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con un polinucleótido de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección con un PRRSV ó que muestra síntomas de una infección por PRRSV. La presente invención se refiere también al empleo de una composición inmunogénica que comprende un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y una combinación de las mismas para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección con un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) ó que muestra síntomas de una infección por PRRSV.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia de nucleótidos de ADN de una porción de la cadena positiva del genoma de la cepa similar a la europea (SEQ ID NO: 1). La secuencia de ARN que corresponde a la SEQ ID NO: 1 y está presente en una partícula vírica, tiene nucleótidos de uracilo (U) en lugar de radicales de timidina (T). Las filas 1, 2 y 3 debajo de la secuencia de nucleótidos representan los tres diferentes marcos de lectura. Las secuencias de aminoácidos pronosticadas codificadas por la cepa similar a la europea son las representadas por algunos marcos de lectura abiertos pronosticados, que incluyen: SEQ ID NO: 2 (ORF1a), SEQ ID NO: 3 (ORF1b), SEQ ID NO: 4 (ORF2), SEQ ID NO: 5 (ORF3), SEQ ID NO: 6 (ORF4), SEQ ID NO: 7 (ORF5), SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 (ORF6) y SEQ ID NO: 10
(ORF7).

Figura 2. Secuencia de nucleótidos de ADN de una porción de la cadena positiva del genoma de la cepa similar a la europea (nucleótidos 1.830 a 2.618 de la SEQ ID NO: 1), comparada con una porción de la secuencia de nucleótidos de ADN de la cepa prototípica europea Lelystad (SEQ ID NO: 11, la cual corresponde a los nucleótidos 1.981 a 2.820 del número de registro NC_002533 del Banco de Genes). En la SEQ ID NO: 11, los nucleótidos del caso anterior significan nucleótidos no idénticos alineados; los nucleótidos del caso inferior significan nucleótidos no alineados; los guiones significan nucleótidos idénticos alineados, y los puntos significan un gap.

Descripción detallada de la invención Polinucleótidos

La presente invención tiene su base en la identificación de un nuevo virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), un virus de ARN monocatenario positivo con recubrimiento. Por lo tanto, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados. De preferencia, un polinucleótido aislado puede replicarse en una célula. De preferencia, un polinucleótido aislado de la presente invención no es mayor de aproximadamente 15,3 kilobases. Si un polinucleótido aislado puede replicarse en una célula puede determinarse insertando el polinucleótido en un vector de expresión, produciendo un ARN infeccioso, introduciendo el ARN infeccioso en células y evaluando si el ARN infeccioso ocasiona que la célula produzca partículas de virus. Estos métodos están descritos con mayor detalle en la presente. Un ejemplo preferido de un polinucleótido de la presente invención es la SEQ ID NO: 1 (figura 1). Este polipéptido es una porción de un polinucleótido obtenido de un PRRSV similar al europeo. De preferencia, el PRRSV similar al europeo tiene la designación de cepa MND99-35186 y está depositado en la American Type Culture Collection "Colección americana de cultivos tipo"), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, USA, el 7 de Julio de 2000 (ATCC concedido con el número de registro PTA-2194).

El depósito se efectuó de acuerdo con las normas del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes. Se espera que la secuencia completa de nucleótidos del PRRSV descrita en SEQ ID NO: 1 incluirá los nucleótidos adicionales en el extremo 5' del polinucleótido. Específicamente, se espera que aproximadamente de 100 a 200, de preferencia aproximadamente 150 nucleótidos adicionales, puedan estar presentes en el extremo 5' de la SEQ ID NO: 1 cuando se determine la secuencia de nucleótidos del PRRSV completo representada por SEQ ID NO: 1. Debe hacerse notar que mientras SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADN, la presente invención contempla la correspondiente secuencia de ARN y también los complementos de ARN y ADN de los mismos.

Como se utiliza en la presente, una substancia "aislada" es la que ha sido extraída de su medio ambiental natural, producida empleando técnicas recombinantes, o químicamente o enzimaticamente sintetizada. Por ejemplo, puede aislarse un polipéptido, un polinucleótido, o una partícula del virus de esta invención. De preferencia, un polipéptido, polinucleótido o una partícula del virus de esta invención se purifica es decir, se convierte en esencialmente libre de cualquier otro tipo de polipéptido, polinucleótido o partícula de virus y productos celulares asociados u otras impurezas. Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien sean ribonucleótidos o bien sean desoxinucleótidos, e incluye tanto los ADN y ARN de doble cadena como los monocatenarios. A no ser que se diga otra cosa, un polinucleótido incluye el complemento del mismo. La secuencia de nucleótidos del complemento de un polinucleótido puede determinarse fácilmente por una persona experta en la técnica. Un polinucleótido puede incluir secuencias de nucleótidos que tienen diferentes funciones, incluyendo por ejemplo secuencias de codificación y secuencias no codificantes tales como secuencias reguladoras y/o regiones no traducidas. Un polinucleótido puede obtenerse directamente a partir de una fuente natural o puede prepararse con ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas o químicas. Un polinucleótido puede ser de topología lineal o circular. Un polinucleótido puede ser, por ejemplo, una porción de un vector tal como un vector de expresión o clonación o un fragmento.

"Polipéptido" se utiliza en la presente refiriéndose a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica de un polímero de aminoácidos. Así por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, proteína y enzima están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término incluye también modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

Los términos "región de codificación" y "secuencia de codificación" se emplean intercambiablemente y se refieren a la región de un polinucleótido que codifica un polipéptido y que cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, expresa el polipéptido codificado. Los límites de un región codificadora están generalmente determinados por un codón de comienzo de la traducción en su extremo 5' y un codón de interrupción de la traducción en su extremo 3'. Una secuencia reguladora es una secuencia de polinucleótidos que regula la expresión de una región de codificación a la cual está operablemente unida. Ejemplos no limitantes de secuencias reguladoras incluyen promotores, sitios de iniciación de la transcripción, sitios de comienzo de la traducción, sitios de interrupción de la traducción, y terminadores. "operablemente unidos" se refiere a una yuxtaposición, en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera propuesta. Una secuencia reguladora está "operablemente unida" a una región codificadora cuando está unida de tal manera que la expresión de la región de codificación se logra en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

"Complemento" y "complementario" se refieren a la capacidad de dos polinucleótidos monocatenarios de emparejar las bases, a saber, hibridar entre sí, de manera que una adenina de un polinucleótido emparejará base con base con una timina de un segundo polinucleótido y una citosina de un polinucleótido emparejará base con base con una guanina de un segundo polinucleótido. Dos polinucleótidos son complementarios entre sí cuando una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido puede emparejarse base con base con una secuencia de nucleótidos de un segundo nucleótido. Por ejemplo, 5'-ATGC y 5'-GCAT son complementarios. Los términos complemento y complementario comprenden también dos polinucleótidos en donde un polinucleótido contiene por lo menos un nucleótido que no empareja base con base con por lo menos un nucleótido presente en un segundo polinucleótido en las condiciones de hibridación descritas más adelante. Por ejemplo, el tercer nucleótido de cada uno de los dos polinucleótidos 5'-ATTGC y 5'-GCTAT no emparejará base con base con el otro, pero estos dos polinucleótidos son igualmente complementarios como se ha definido en la presente.

La presente invención proporciona también polinucleótidos aislados que corresponden a regiones de codificación presentes en SEQ ID NO: 1. Estas regiones de codificación se muestran en la tabla 1.

TABLA 1 Regiones de codificación de SEQ ID NO: 1

Nucleótidos de SEQ ID NO: 1	Polipéptido codificado por la región	SEQ ID NO del polipéptido
correspondientes a la región	de codificación
de codificación
71 a 7.210	ORF1a	SEQ ID NO: 2
7.207 a 11.583	ORF1b	SEQ ID NO: 3
11.594 a 12.343	ORF2	SEQ ID NO: 4
12.202 a 12.994	ORF3	SEQ ID NO: 5

TABLA 1 (continuación)

Nucleótidos de SEQ ID NO: 1	Polipéptido codificado por la región	SEQ ID NO del polipéptido
correspondientes a la región	de codificación
de codificación
12.744 a 13.295	ORF4	SEQ ID NO: 6
13.292 a 13.897	ORF5	SEQ ID NO: 7
13.449 a 13.775	no aplicable	SEQ ID NO: 8
13.885 a 14.406	ORF6	SEQ ID NO: 9
14.396 a 14.782	ORF7	SEQ ID NO: 10

La presente invención incluye también polinucleótidos que tienen una similitud estructural con SEQ ID NO: 1 ó con una región de codificación presente en SEQ ID NO: 1. La similitud se refiere a un "tanto por ciento de identidad" y se determina alineando los radicales de los dos polinucleótidos (a saber, la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido candidato y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó una región de codificación de SEQ ID NO: 1) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo largo de la longitud de sus secuencias; huecos en cualquiera de las secuencias o en ambas secuencias están permitidos al hacer el alineamiento con el fin de optimizar el número de nucleótidos compartidos, aunque los nucleótidos en cada secuencia deben permanecer sin embargo en su propio orden. Un polinucleótido candidato es el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se está comparando con SEQ ID NO: 1 ó con una región de codificación presente en SEQ ID NO: 1 (p. ej., nucleótidos nº 71 a 7.210 de la SEQ ID NO: 1). Un polinucleótido candidato puede aislarse de un animal, de preferencia un cerdo infectado con PRRSV, ó puede producirse empleando técnicas recombinantes, o sintetizándolo química o enzimaticamente. De preferencia, dos secuencias de nucleótidos se comparan empleando un programa GAP del GCG Wisconsin Package (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versión 10.0 (actualizada en Enero de 1999).

El programa GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)) para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de emparejamientos y minimiza el número de huecos.

De preferencia se utilizan todos los parámetros de búsqueda GAP, incluyendo la matriz de puntuación = ADN del gap nuevo. cmp, peso del gap = 50, peso de la longitud = 3, apareamiento medio = 10, desapareamiento medio = 0. En la comparación de dos secuencias de nucleótidos utilizando el algoritmo de búsqueda GAP, la similitud estructural recibe el nombre de "tanto por ciento de identidad". De preferencia, un polinucleótido incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una similitud estructural con una región de codificación de SEQ ID NO: 1 de por lo menos aproximadamente el 99% de identidad.

Otro polinucleótido aislado descrito en la presente es un polinucleótido de ARN con el cual hibrida un oligonucleótido que tiene la secuencia:

AGAGCGGGAACAGAATCCTTCCCACCTTTAGCGGTACGCTTG

(SEQ ID NO: 18).

De preferencia, el polinucleótido de ARN replica en las células para formar partículas de virus. Dicho ARN recibe el nombre de ARN infeccioso. La producción y el test de los ARN infecciosos se describe con gran detalle más adelante.

De preferencia, las condiciones de hibridación incluyen la desnaturalización de aproximadamente 1 \mug del ARN total con glicosilo, y la electroforesis a través de un gel de agarosa al 2%, transfiriendo a una membrana de nylon (MagnaGraph, MSI, Westboro, MA), y reticulando la membrana mediante luz ultravioleta. De preferencia, el oligonucleótido es radiomarcado en su extremo 3', por ejemplo, con [\alpha^{32}P]dATP (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) y la desoxinucleótido transferasa terminal (TdT) (Promega Corporation, Madison, WI), de preferencia, las condiciones de hibridación incluyen la incubación de la membrana conteniendo el ARN reticulado con el oligonucleótido marcado en una solución de hibridación, por ejemplo QuikHyb (Stratagene, La Jolla, CA) a 68ºC durante 16 horas. La membrana se lava a continuación 3 veces en una solución que contiene cloruro de sodio 0,9 M/citrato de sodio 0,09 M/pH 7,0 (6x SSC) y 0,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS) a 78ºC y a continuación se expone a una película de autorradiografía (NEN Life Science Products, Boston, MA) ó una pantalla de imagen fosforescente (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA). Se espera que con estas condiciones, el oligonucleótido no hibride con el PRRSV europeo Lelystad ni con el PRRSV norteamericano VR-2332.

El polinucleótido de la presente invención incluye una supresión cuando se compara con la secuencia de nucleótidos de la cepa europea Lelystad, la cual está disponible en Genbank con el número de registro NC 002533. Cuando la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y el número de registro NC 002533 del GenBank se comparan, los nucleótidos 2.419 a 2.470 del número de registro NC 002533 del GenBank no están presentes en SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1 están inmediatamente 5' (corriente arriba) y 3' (corriente abajo) de esta supresión. Así, los polinucleótidos de la presente invención que incluyen los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1 incluyen esta supresión. La presencia de esta supresión es útil para distinguir entre un polinucleótido de la presente invención y algunos aislados clínicos del PRRSV (descritos en la presente con gran detalle).

Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden obtenerse a partir de una partícula de virus. Como se emplean en la presente, los términos "partícula de virus" y "partícula vírica" se emplean intercambiablemente y se refieren a una partícula de PRRSV. Una partícula de virus incluye un polinucleótido de ARN que se reproducirá en una célula, por ejemplo una célula de un cerdo y/o un macrófago alveolar porcino primario cultivado (es decir recién preparado), en las condiciones apropiadas. Una partícula de virus incluye también una cubierta que rodea el polinucleótido. Una partícula de virus se obtiene típicamente de un cerdo que presenta síntomas de la enfermedad misteriosa porcina (MSD) la cual incluye el aborto, anorexia, fiebre, letargia, neumonía, coloración roja/azul de las orejas, respiración trabajosa (dispnea) y aumento de la velocidad respiratoria (taquipnea). Aunque no se pretende ser limitante, una partícula del virus puede obtenerse de un cerdo mediante su eliminación del tejido, de preferencia tejido pulmonar, seguido por un examen microscópico del tejido para detectar tabiques alveolares gruesos causados por la presencia de macrófagos, células degenerativas y residuos en los espacios alveolares.

Estas características indican la presencia de una infección por PRRSV. El pulmón u otro tejido porcino se homogeniza a continuación con una solución acuosa farmacéuticamente aceptable (tal como una solución salina fisiológica, solución Ringer, solución de Hank equilibrada con sal, medio esencial mínimo, y similares) de forma que el tejido incluya aproximadamente el 10 por ciento en peso/volumen de la cantidad de homogeneizado. El virus puede aislarse mediante centrifugación a baja velocidad como se describe en el ejemplo 1 para formar un homogeneizado. Alternativamente, el virus puede aislarse pasando el homogeneizado a través de filtros con diámetros de poro en el margen de 0,05 a 10 micras, de preferencia a través de una serie de filtros de 0,45, 0,2 y 0,1 micras, para producir un homogeneizado que contiene el PRRSV. Como resultado el homogeneizado contiene partículas virales que tienen un tamaño no mayor de aproximadamente 1,0 micras, de preferencia no mayor de aproximadamente 0,2 a 0,1 micras. Otros tejidos, incluyendo el tejido fetal puede también emplearse para recuperar el virus. Típicamente, esta partícula de virus se hace crecer a continuación in vivo (es decir, dentro del cuerpo de un sujeto) o en un cultivo celular (es decir, in vitro) para producir más partículas de virus. Este proceso de infectar un animal o una célula en cultivo, permitiendo que el virus se reproduzca, y a continuación recogiendo el virus nuevo producido, recibe en la presente el nombre de "passaging" ("siembra y cosecha") del virus. Opcionalmente, el virus se purifica.

El homogeneizado descrito más arriba puede ser sembrado en un cultivo celular mediante la inoculación en una serie de cultivos celulares. Las células cultivadas pueden ser células de órganos de mamíferos tales como el riñón, hígado, corazón y cerebro, pulmón, bazo, testículo, turbinado, células blancas y rojas de la sangre, y células de los ganglios linfáticos, así como preparaciones de insectos y embriones de aves. De preferencia, la célula es un macrófago primario alveolar porcino. De preferencia, los macrófagos alveolares primarios porcinos se aislan de por lo menos dos cerdos, y los macrófagos alveolares primarios porcinos de cada cerdo no se mezclan. Se ha observado que existe alguna variabilidad en la capacidad de los virus de la presente invención para replicar en macrófagos alveolares primarios porcinos, y el empleo de macrófagos alveolares primarios porcinos a partir de más de un cerdo aumenta significativamente la capacidad para el "passaging" de virus en los macrófagos. Los medios de cultivo adecuados para estas preparaciones celulares incluyen aquellos soportes de crecimiento de células de mamíferos tales como p. ej. el suero (por ejemplo, suero fetal de cordero, o suero de cerdo) y el agar, agar de infusión de sangre, caldo y agar de glucosa de infusión de cerebro-corazón, y similares. Después de inocular las células cultivadas con homogeneizado y haciendo crecer el cultivo, pudieron cosecharse flóculos individuales de células cultivadas y reintroducirse en un medio de cultivo estéril con las células. Alternativamente y de preferencia, los sobrenadantes de las células cultivadas se someten
a centrifugación de baja velocidad y se emplean para inocular el medio de cultivo estéril conteniendo las células.

Si una partícula de virus aislada obtenida de esta manera, de preferencia purificada, es capaz de causar la MSD, puede determinarse por inoculación a cerdos de 3 a 4 semanas de edad como se describe en el ejemplo 1, ó por los métodos de Terpstra et al., (Vet. Q., 13, 131-136 (1991)), y Collins et al., (patente U.S. 5.846.805). Estos métodos comprueban experimentalmente si la partícula vírica reproduce en último término el aborto y el fallo reproductivo en cerdas preñadas o signos clínicos y lesiones microscópicas en cerditos gnotobióticos similares a los brotes sobre el terreno. Los cerdos experimentalmente inoculados de esta manera pueden también emplearse para el "passaging" in vivo del virus recogiendo el tejido y procesándolo para el aislamiento del virus como se describe en el ejemplo 1.

Después del aislamiento, y de preferencia después de la purificación de la partícula de virus, el polinucleótido de la partícula puede aislarse mediante, por ejemplo, tratamiento de la partícula para eliminar la cubierta. Métodos para la eliminación de la cubierta son ya conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la solubilización con fenol:cloroformo o guanidinio. Opcionalmente, el polinucleótido se purifica empleando métodos ya conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, la precipitación del polinucleótido.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar presentes en un vector. Un vector es un polinucleótido de replicación tal como un plásmido, un fago, un cósmido o un cromosoma artificial al cual puede unirse otro polinucleótido (p. ej., un polinucleótido de la presente invención) para causar la replicación del polinucleótido unido. Cuando un polinucleótido de la presente invención está en un vector, el polinucleótido es ADN. Cuando está presente en un vector, un polinucleótido de la invención recibe el nombre de "polinucleótido recombinante". La construcción de vectores que contienen un polinucleótido de la invención emplea técnicas de unión estándar ya conocidas en la técnica. Ver p. ej. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual "Clonación molecular: Un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ó Ausubel, R.M., ed. Current Protocols in Molecular Biology ("Protocolos habituales en Biología Molecular") (1994).

Un vector puede proporcionar una posterior clonación (amplificación de un polinucleótido), es decir un vector de clonación, o puede proporcionar la expresión del polipéptido codificado por una región de codificación presente en el polinucleótido, es decir, un vector de expresión. La selección de un vector depende de una variedad de características deseadas en la construcción resultante, tal como un marcador de selección, grado de replicación del vector y similares. Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores de la presente, son células procariotas o eucarióticas, y los vectores adecuados para la clonación y/o expresión en células procariotas y/o células eucariotas son ya conocidos en la técnica. Típicamente, cuando el vector se emplea para clonar un polinucleótido, la célula hospedadora es un procariota. Los procariotas adecuados incluyen las eubacterías como los organismos gram-negativos o gram-positivos. De preferencia se emplea el E. coli. Más adelante se describen células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos de la invención, con más detalle.

El polinucleótido empleado para transformar la célula hospedadora incluye opcionalmente una o más secuencias marcadoras, las cuales codifican típicamente una molécula que inactiva o de otra manera detecta o es detectada por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusión de una secuencia marcadora puede convertir la célula transformada en resistente a un antibiótico, o puede conferir un metabolismo específico del compuesto a la célula transformada. Ejemplos de una secuencia marcadora son las secuencias que confieren resistencia a la canamicina, ampicilina, cloranfenicol. tetraciclina, neomicina y formulaciones de fleomicina D1 incluyendo por ejemplo, la formulación disponible con el nombre registrado de ZEOCIN (Invitrogen).

Un vector de expresión incluye opcionalmente secuencias reguladoras unidas operablemente a la secuencia codificadora. La invención no está limitada por el empleo de ningún promotor en particular y se conoce una amplia variedad de los mismos. Los promotores actúan como señales reguladoras que se unen a la ARN polimerasa en una célula para iniciar la transcripción de una secuencia codificadora en dirección corriente abajo (en la dirección 3'). El promotor empleado en la invención puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. Puede ser, pero no es necesario que lo sea, heterólogo con respecto a la célula hospedadora. Ejemplos de promotores para emplear en vectores presentes en células procarióticas incluyen lac, lacUV5, tac, trc, T7, SP6 y ara.

Las secuencias de promotores son ya conocidas para los eucariotas. La mayor parte de secuencias que codifican los eucariotas tienen una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección corriente arriba a partir del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba a partir del principio de la transcripción de muchos genes, es la región CXCAAT en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de genes eucariotas existe una secuencia AATAAA que puede ser una señal para la adición de la poli cola A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias están adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucariótica.

La transcripción de una secuencia de codificación que codifica un polipéptido de la presente invención en células hospedadoras de mamíferos puede ser controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus de polioma, virus fowlpox, adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma avícola, citomegalovirus, un retrovirus, y el virus de la hepatitis B.

La transcripción de una secuencia de codificación que codifica un polipéptido de la presente invención mediante eucariotas puede aumentarse insertando una secuencia de un potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN cis-activos, habitualmente con aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose encontrado 5' y 3' en secuencias de codificación dentro de un intrón así como también dentro de la misma secuencia de codificación. Se conocen muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Se conocen también potenciadores a partir de virus de células eucarióticas e incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación, el citomegalovirus potenciador temprano del promotor, el potenciador polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en la posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación que codifica un polipéptido de la presente invención, pero de preferencia se localiza en el sitio 5' del promotor.

Un vector de expresión puede opcionalmente incluir un sitio de unión al ribosoma (un sitio Shine Dalgarno para sistemas procarióticos o un sitio Kozak para sistemas eucarióticos), y un sitio de comienzo (p. ej., el codón ATG) para iniciar la traducción del mensaje transcrito para producir la enzima. Puede también incluir una secuencia de terminación para finalizar la traducción. Una secuencia de terminación es típicamente un codón para el cual no existe ningún aminoacetil-ARNt correspondiente, terminando así la síntesis del polipéptido. El polinucleótido empleado para transformar la célula hospedadora puede opcionalmente incluir además una secuencia de terminación de la transcripción. El terminador rrnB, el cual es un tramo de ADN que contiene dos terminadores T1 y T2, es un terminador empleado a menudo que se incorpora en los sistemas bacterianos de expresión. Las secuencias de terminación de la transcripción en vectores para células eucarióticas incluyen típicamente una señal 3' de poliadenilación de la secuencia de codificación.

Células hospedadoras adecuadas para el vector de expresión que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención pueden derivarse de organismos multicelulares. Dichas células hospedadoras son capaces de procesado y de actividades de glicosilación. Pueden emplearse cultivos de vertebrados o invertebrados. Numerosas cepas y variantes de baculovirus y células hospedadoras de insectos permisivos correspondientes a partir de hospedadores como Spodoptera frugiperda, Aedes aegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster, Trichoplusia ni y Bombyx mori, son ya conocidas en la técnica.

Las células de vertebrados pueden también emplearse como hospedadoras. Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (CAS-7, ATCC CRL-1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de bebé de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de Hamster chino/-DHFR (CHO); CHO-K1 (ATCC CCL-61); CHO-D; células de ratón sertoli (TM4); células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W1 38, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI; células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133, 477-483 (1993)), y MA-104 (ATCC CRL-2378).

Un vector de expresión de la presente invención puede emplearse para determinar si un polinucleótido de la presente invención replica en una célula. Un polinucleótido de la invención replica en una célula si el cultivo de la célula muestra signos de efecto citopático (CPE) como se describe en el ejemplo 2, y/o si las partículas de virus pueden aislarse de las células. Los polinucleótidos presentes en el vector de expresión pueden ser transcritos in vitro (es decir libres de células) para producir transcriptos de ARN. Los transcriptos de ARN pueden introducirse en células de cultivo, e incubarse en condiciones adecuadas para la replicación de un PRRSV. Los transcriptos de ARN que replican emplearán la ingeniería celular (incluyendo por ejemplo, ribosomas y los ARNt para replicar. El cultivo puede ensayarse como está descrito en el ejemplo 2 para CPE. La presencia de CPE indica que el virus es capaz de replicar en una célula. Opcionalmente, pueden aislarse las partículas de virus producidas por las células. Este tipo de vector de expresión es considerado a menudo en la técnica como un clon infeccioso de ADNc, y el ARN producido por el vector de expresión se considera como un ARN infeccioso. Métodos para la clonación del PRRSV europeo Lelystad y la inserción del mismo en un vector son ya conocidos en la técnica (Meulenberg et al., J. Virol., 72, 380-387 (1998)) y se espera que los polinucleótidos de la presente invención puedan emplearse de esta manera para producir ARN infeccioso. Además, el método de Meulenberg et al., puede emplearse para obtener partículas virales. En consecuencia, una persona experta en la técnica puede proporcionar un polinucleótido de la presente invención por ejemplo SEQ ID NO: 1, introducir el polinucleótido en un vector de expresión y producir ARN infecciosos que podrían ser introducidos en las células para dar como resultado la producción de partículas de virus. Las células transfectadas con un ARN infeccioso pueden ser por ejemplo células BHK-21, células CL2621, células MA-104, células MARC-145 ó macrófagos alveolares porcinos primarios, de preferencia, los macrófagos alveolares porcinos primarios. Métodos para transfectar las células eficientemente, incluyen el empleo de cloruro de calcio y productos comercialmente adquiribles conocidos con los nombres comerciales de LIPO-FECTIN y LIPOFECTAMINE. Métodos para transfectar eficientemente los macrófagos alveolares porcinos primarios son ya conocidos en la especialidad (Groot BramelVerheige et al., Virol., 278, 380-389 (2000)).

Polipéptidos

La presente invención se refiere también a polipéptidos que tienen por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, en donde el polinucleótido se replica en una célula, de preferencia polipéptidos aisladoscodificados por polinucleótidos de la presente invención. De preferencia, un polipéptido de la presente invención tiene actividad inmunogénica. "Actividad inmunogénica" se refiere a una secuencia de aminoácidos la cual induce una respuesta inmunológica en un sujeto. Una respuesta inmunológica a un polipéptido es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpos al polipéptido. Normalmente una respuesta inmunológica incluye, pero no está limitada a, uno o más de los siguientes efectos: producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras, y/o células T citotóxicas (ver por ejemplo, de Antonio y al., Vet. Immunol. Immunopathol., 61, 265-277 (1998) y Kwang et al., Res. Vet. Sci., 67, 199-201 (1999)) dirigidos específicamente a un epitopo o epitopos del fragmento de polipéptido. Como se emplea en la presente, un anticuerpo que puede "unirse específicamente" ó "es específicamente para" una partícula de virus y/o un polipéptido, es un anticuerpo que interactúa solamente con un epitopo del antígeno que induce la síntesis del anticuerpo, o interactúa con un epitopo estructuralmente relacionado. Un antígeno que "se une específicamente" a un PRRSV similar al europeo, es un anticuerpo que no se une específicamente a un PRRSV europeo, de preferencia un PRRSV europeo que tiene el número de registro I-1102, ó un PRRSV norteamericano, de preferencia un PRRSV norteamericano con un número de registro VR-2332. Como se emplea en la presente, el término "complejo" se refiere a la combinación de un anti-cuerpo y una partícula de virus y/o un polipéptido que resulta cuando un anticuerpo específico se une a una partícula de virus y/o un polipéptido.

Ejemplos preferidos de polipéptidos de la invención son SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 (ver tabla 1). La presente invención menciona también polipéptidos con similitud estructural con los polipéptidos de la presente invención. La similitud estructural se refiere al tanto por ciento de identidad y se determina generalmente mediante la alineación de los radicales de las dos secuencias de aminoácidos (es decir una secuencia candidata de amino-ácidos y la secuencia de aminoácidos de un SEQ ID NO: 2-10) para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de las longitudes de sus secuencias; se permiten los huecos en alguna o ambas secuencias al efectuar el alineamiento con el fin de optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque los aminoácidos de cada secuencia deben permanecer sin embargo en su propio orden. Una secuencia candidata de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos que está siendo comparada con una secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido preferido de la presente invención. De preferencia, dos secuencias de aminoácidos se comparan empleando el programa GAP de GCG Wisconsin Package (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versión 10.0 (actualización Enero de 1999). El programa GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 443-453 (1970) para encontrar el alineamiento de las dos secuencias completas que maximiza el número de apareamientos y minimiza el número de huecos.

De preferencia, se emplean valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda del GAP, incluyendo la matriz de evaluación = BLOSUM62.cmp, peso del hueco = 8, peso de la longitud = 2, apareamiento promedio = 2,912, y desapareamiento promedio = 2,003. En la comparación de dos secuencias de aminoácidos empleando el algoritmo de búsqueda GAP, la similitud estructural recibe el nombre de "tanto por ciento de identidad". La especificación menciona polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tienen una similitud estructural con SEQ ID NO: 2 de por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos aproximadamente el 97%, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad. También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de amino-ácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 3 de por lo menos aproximadamente el 99% de identidad.

También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 4 de por lo menos aproximadamente el 98%, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad. También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de amino-ácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 5 de por lo menos aproximadamente el 94%, por lo menos aproximadamente el 96%, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad.

También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 6 de por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos aproximadamente el 97%, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad. También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 7 de, en orden creciente de preferencia, por lo menos aproximadamente el 91%, por lo menos aproximadamente el 93%, por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos aproximadamente el 97%, por lo menos aproximadamente el 99% de identidad. También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 9 de por lo menos aproximadamente el 99% de identidad.

También se mencionan polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 10 de por lo menos aproximadamente el 99,5% de identidad.

La presente invención menciona además, polipéptidos análogos y fragmentos de polipéptidos, de preferencia análogos de polipéptidos inmunogénicos y fragmentos de polipéptidos inmunogénicos. Un fragmento de polipéptido es por lo menos aproximadamente de 8, por lo menos aproximadamente de 12, por lo menos aproximadamente de 20 aminoácidos de longitud. Análogos inmunogénicos de polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen
substituciones de aminoácidos que no eliminan la capacidad del polipéptido de inducir una respuesta inmunológica.

Substitutos para un aminoácido pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, aspartato y glutamato. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen la arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Ejemplos de substituciones conservativas preferidas incluyen Lys para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu para Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser para Thr de manera que se conserva un -OH libre; y Gla para Asn para conservar un NH_{2} libre.

Análogos inmunogénicos, en la forma en que esta expresión se emplea en la presente, incluyen también polipéptidos modificados. Las modificaciones de polipéptidos de la invención incluyen las derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de cadenas laterales, modificaciones de estructura, y modificaciones en los terminales N- y C-, incluyendo la acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de grupos hidratos de carbono o lípidos, cofactores, y similares. Fragmentos inmunogénicos de un polipéptido incluyen una porción del polipéptido que contiene supresiones o adiciones de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos, de tal forma que el polipéptido resultante es inmunogénico.

Los polipéptidos de la presente invención pueden obtenerse a partir de, por ejemplo, una muestra biológica de un sujeto porcino infectado con un PRRSV similar el europeo que codifica el polipéptido. De preferencia, el PRRSV similar al europeo incluye la SEQ ID NO: 1, con más preferencia es el PRRSV similar al europeo que tiene el ATCC número PTA-2194. El polipéptido puede obtenerse a partir de células cultivadas, de preferencia macrófagos alveolares primarios porcinos, que han sido por ejemplo, infectados con un PRRSV similar al europeo que codifica el polipéptido o contiene un polinucleótido recombinante, de preferencia un polinucleótido de la invención, que codifica un polipéptido de la invención.

Alternativamente, el polipéptido puede obtenerse a partir de una célula procariótica o una célula eucariótica que contiene un vector de expresión que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden también obtenerse mediante síntesis química.

Virus

Las partículas de virus similares al europeo de la presente invención comprenden un polinucleótido de ARN que contiene la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a SEQ ID NO: 1. Un ejemplo preferido de una partícula de virus incluye la SEQ ID NO: 1. La partícula de virus de la presente invención es el virus que tiene el número de registro ATCC PTA-2194. Una partícula de virus de la presente invención incluye una cubierta y, cuando se añade a una célula cultivada, puede replicar para dar como resultado la producción de más partículas víricas.

Como se ha descrito más arriba, una partícula de virus de la presente invención puede obtenerse a partir del cerdo que presenta síntomas de MSD. Una partícula de virus puede hacerse crecer mediante el "passage" in vivo o en cultivo celular. El "passage" in vivo comprende la inoculación de un cerdo, por ejemplo como se describe en el ejemplo 1. El "passage" en cultivo celular incluye la exposición de células cultivadas a la partícula del virus e incubación de las células en condiciones adecuadas para que el virus se reproduzca y produzca más partículas de virus.

De preferencia, las células en cultivo no son líneas celulares inmortalizadas o transformadas (es decir, las células ya no son capaces de dividirse indefinidamente). De preferencia, los macrófagos alveolares primarios porcinos se emplean para el "passage" en cultivo celular. El empleo de macrófagos alveolares primarios porcinos se describe en el ejemplo 2. Una partícula de virus puede también obtenerse a partir de células transfectadas con un ARN infeccioso como se describe en la presente.

Un virus de la presente invención puede ser inactivado, es decir, convertido en incapaz de reproducirse in vivo y/o en cultivo celular. Métodos de inactivación son ya conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo, el tratamiento de un virus de la invención con un agente estándar de inactivación química tal como un reactivo aldehido incluyendo la formalina, acetaldehido y similares; alcoholes reactivos de carácter ácido, incluyendo el cresol, fenol y similares; ácidos como el ácido benzoico, ácido benzosulfónico y similares; lactonas tales como beta propiolactona y caprolactona; y lactamas activadas, carbodiimidas y compuestos de carbonilo diheteroaromáticos tales como el carbonil diimidazol. La irradiación como el ultravioleta y la irradiación gamma pueden también emplearse para inactivar el virus.

También están incluidos en la presente invención los PRRSV similares al europeo atenuados (es decir virus que tienen reducida su capacidad a causa de los síntomas de MSD de los cerdos), y métodos de obtención un PRRSV similar al europeo atenuado. Métodos de producción de un virus atenuado son ya conocidos en la técnica. Típicamente un virus de la presente invención es "passaged", es decir, se emplea para infectar una célula en cultivo, hacer que se reproduzca, y a continuación cosecharlo. Este proceso se repite hasta que la virulencia del virus en los cerdos disminuye. Por ejemplo, el virus puede ser "passaged" 10 veces en cultivo celular y a continuación se mide la virulencia del virus. Si la virulencia no ha disminuido, el virus que no se inyectó en el animal es "passaged" 10 veces más en cultivo celular. El proceso se repite hasta que la virulencia ha disminuido. En general la virulencia se mide mediante inoculación de cerdos con virus y evaluando la presencia de síntomas clínicos y/o LD_{50} (ver por ejemplo, el ejemplo 1, Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8, 11-20 (1996), y Halbur et al., Vet. Pathol., 32, 200-204 (1995), y Park et al., Am. J. Vet. Res., 57, 320-323 (1996)). De preferencia. la virulencia decrece de manera que el virus atenuado no causa la muerte de los animales, y de preferencia no causa síntomas clínicos de la enfermedad.

Típicamente, un cultivo celular útil para la producción de un virus atenuado de la presente invención incluye células de origen mamífero no porcino. Ejemplos de cultivos de células mamíferas no porcinas incluyen por ejemplo, la línea celular MA-104 (ATCC CRL-2378), la línea celular MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol, 133, 477-483 (1993)), y la línea celular CL-2621 (Baustia et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, 163-165 (1993)). De preferencia, se emplea un cultivo celular mixto para la producción de un virus atenuado de la presente invención. En un cultivo celular mixto hay por lo menos dos tipos de células presentes. De preferencia, un cultivo celular mixto incluye una línea celular inmortalizada o transformada y un cultivo celular primario. Un cultivo celular mixto es particularmente útil cuando un virus se reproduce lentamente o no se reproduce en absoluto, en una línea celular inmortalizada o transformada. Ejemplos preferidos de una línea celular inmortalizada o transformada para emplear en un cultivo celular mixto, incluyen por ejemplo, la línea celular MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133, 477-483 (1993)), y la línea celular MA-104 (ATCC CRL-2378). De preferencia, los cultivos celulares primarios para el empleo en cultivos celulares mixtos son de origen porcino. Un ejemplo preferido de un cultivo de célula primaria para emplear en un cultivo celular mixto son los macrófagos alveolares primarios porcinos.

Métodos de empleo

Las partículas de virus, polinucleótidos, polipéptidos y análogos inmunogénicos y fragmentos inmunogénicos de los mismos de la presente invención pueden emplearse para producir anticuerpos. Los métodos de laboratorio para la producción, caracterización y opcionalmente el aislamiento de los anticuerpos policlonales y monoclonales, son ya conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Harlow E. et al., Antibodies: A laboratory manual ("Anticuerpos: Un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988). Por ejemplo, un virus de la presente invención puede administrarse a un animal, de preferencia un mamífero, en una cantidad efectiva para causar la producción de un anticuerpo específico para el virus administrado. Los polipéptidos de la presente invención y análogos inmunogénicos y fragmentos inmunogénicos de los mismos pueden también administrarse a un animal, de preferencia un mamífero, para producir anticuerpos. Opcionalmente, una partícula de virus o un polipéptido se mezcla con un adyuvante, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund, para estimular la producción de anticuerpos después de la administración. De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

De preferencia, un anticuerpo producido empleando un virus de la presente invención o un polipéptido o un análogo inmunogénico o un fragmento inmunogénico del mismo, es un anticuerpo neutralizante. Un anticuerpo neutralizante es aquel que impide que un virus de la presente invención se reproduzca en un cultivo celular, de preferencia en macrófagos porcinos primarios.

Opcionalmente y de preferencia, el anticuerpo producido empleando una partícula de virus de la presente invención, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención o análogos inmunogénicos y fragmentos inmunogénicos de los mismos, no se unen específicamente con el PRRSV europeo registrado como I-1102 en la Collection Nationale De Cultures De Microorganisms ("Colección nacional de cultivos de microorganismos"), Instituto Pasteur, Francia, o con el PRRSV norteamericano registrado como VR-2332 en la ATCC. Si un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a uno cualquiera o a ambos de estos virus puede determinarse empleando métodos ya conocidos en la técnica.

La especificación de la presente invención describe métodos para la detección de un PRRSV, de preferencia un virus de la presente invención. Estos métodos son útiles, por ejemplo, en la detección de un PRRSV en un animal, en la detección de un PRRSV en un cultivo celular, en el diagnóstico de una enfermedad causada por un PRRSV. De preferencia, estos sistemas de diagnóstico están en forma de un kit. Los kits se describen con gran detalle más adelante. En algunos aspectos de la invención, la detección de un PRRSV incluye la detección de anticuerpos que se unen específicamente a un virus de la presente invención, un polipéptido de la presente invención, y/o un análogo inmunogénico o un fragmento inmunogénico del mismo.

El método incluye la provisión de una muestra biológica, de preferencia un líquido homogeneizado de una muestra de tejido a partir de un sujeto porcino. El sujeto puede estar bajo sospecha de alojar el PRRSV, ó puede ser un miembro de una piara que esta siendo explorada en busca de la presencia del PRRSV. El anticuerpo se añade a la muestra biológica y se incuba en condiciones para formar un complejo con el PRRSV en la muestra biológica. De preferencia el anticuerpo se obtiene empleando una partícula de virus de la presente invención, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, o un análogo inmunogénico o un fragmento inmunogénico del mismo. De preferencia, el anticuerpo no se une específicamente al PRRSV europeo o al PRRSV norteamericano. A continuación se detecta el complejo y la presencia del complejo indica la presencia de un PRRSV en la muestra biológica. La detección de anticuerpos es conocido en la técnica y puede incluir por ejemplo, la inmunofluorescencia y la peroxidasa. Los formatos típicos en los cuales los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse incluyen por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA); un radio-inmunoensayo (RIA), un ensayo de inmunofluorescencia (IFA), un inmunoensayo western.

Como se emplea aquí, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de un tejido o fluido obtenido a partir de un sujeto, incluyendo pero sin limitar a, por ejemplo, el pulmón o el tracto respiratorio. Una "muestra biológica" incluye también muestras de constituyentes de cultivos celulares que incluyen pero sin limitar a las células y medios resultantes del crecimiento celular y tejidos del medio de cultivo. Las células pueden ser infectadas con PRRSV ó pueden contener un vector que incluye un polipéptido de la presente invención, y de preferencia incluyen una región codificadora que codifica un polipéptido de la presente invención.

Otros métodos proporcionados para la detección de un PRRSV similar al europeo, incluyen la amplificación de un polinucleótido, de preferencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En particular la presente invención se refiere a un método in vitro para la detección de la presencia de un virus del síndrome reproductivo y respiratorios porcino similar al europeo, que comprende: la puesta en contacto de un polinucleótido vírico con un primer cebador y un segundo cebador en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable, en donde el primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 1 que contiene los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1 ó el complementario de los mismos; y detección de un producto de amplificación, en donde la detección indica que el polinucleótido vírico es un PRRSV similar al europeo. El polinucleótido puede ser uno que está presente por ejemplo, en una muestra biológica de un sujeto porcino del cual se sospecha que aloja el PRRSV, ó un miembro de una piara la cual está siendo investigada para detectar la presencia del PRRSV. Además, la presente invención se refiere a un método in vitro para la detección de la presencia de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino similar al europeo (PRRSV similar al europeo) en un sujeto porcino, el cual comprende:

toma de contacto de una muestra biológica de un sujeto porcino con un primer cebador y un segundo cebador e incubación en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable, en donde el primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 1 que contiene los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1 ó el complemento del mismo; y

detección de un producto de amplificación, en donde la detección indica que el sujeto porcino tiene un PRRSV similar al europeo.

El polinucleótido puede ser obtenido a partir de una partícula de virus aislada, de preferencia purificada. Cuando el polinucleótido se obtiene de una partícula de virus, el polinucleótido se convierte de un polinucleótido de ARN en un polinucleótido de ADN mediante transcripción inversa (ver por ejemplo el ejemplo 3). En algunos aspectos de la presente invención, los métodos para detectar un PRRSV similar al europeo y distinguirlo del PRRSV europeo y un PRRSV norteamericano, aprovechan la existencia de una supresión presente en el PRRSV similar al europeo. Esta supresión se ha descrito más arriba en la sección titulada "polinucleótidos".

En un aspecto de la detección del PRRSV mediante la amplificación de un polinucleótido, la invención se refiere a la detección de un virus de la presente invención en las condiciones en las cuales el PRRSV europeo y el PRRSV norteamericano no se detectan. El método incluye la puesta en contacto de un polinucleótido vírico que se sospecha es el PRRSV similar al europeo con un par de cebadores e incubando en condiciones para formar un polinucleótido amplificado detectable. Como se emplea en la presente, "un par de cebadores" se refiere a dos polinucleótidos monocatenarios que pueden emplearse juntamente para amplificar una región de un polinucleótido, de preferencia mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El polinucleótido que resulta de la amplificación de una región de un polinucleótido recibe el nombre de "producto de la amplificación" o un "polinucleótido amplificado". La frase "en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable" se refiere a las condiciones de la reacción, que dan como resultado un producto de amplificación. Por ejemplo, en el caso de una PCR, las condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable incluyen las temperaturas, iones y la enzima apropiadas.

Uno de los cebadores del primer par es complementario a una porción del polinucleótido vírico que corresponde a los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1, ó es el complemento del mismo. El empleo de dicho cebador da como resultado la producción de un polinucleótido amplificado cuando hay una supresión. En cambio, el empleo de dicho cebador con un PRRSV europeo no da como resultado la producción de un polinucleótido amplificado porque existen aproximadamente 51 nucleótidos presentes entre los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 2268 y 2269 de SEQ ID NO: 1, ó el complemento de la misma. Por ejemplo, el empleo de dicho par de cebadores no dará como resultado un polinucleótido amplificado cuando el polinucleótido vírico procede del PRRSV Lelystad. Un ejemplo de un par de cebadores que pueden emplearse en este método incluye el cebador delantero 5' ATCGG
GAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NO: 12), el cual corresponde a los nucleótidos 2.255 a 2.276 de SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso Euro2714 5'-GCGCATAAGACAGATCCA (SEQ ID NO: 13), el cual se espera que de como resultado un polinucleótido amplificado de aproximadamente 467 nucleótidos. Otro par de cebadores son el cebador inverso: 5'-AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NO: 14), el cual corresponde al complemento de nucleótidos 2.257 a 2.276 de SEQ ID NO: 1, y el cebador delantero Euro20/ 5'-CAGAAGGGTTCGAGGAAG (SEQ ID NO: 15), el cual se espera que de como resultado un polinucleótido amplificado de aproximadamente 170 nucleótidos.

En otro aspecto de la detección de un PRRSV mediante la amplificación de un polinucleótido, la invención se refiere a la detección de un virus de la presente invención en las condiciones en las que se detectan tanto el PRRSV similar al europeo como el PRRSV europeo, y los pesos moleculares de los polinucleótidos amplificados varían. El par de cebadores empleados en este aspecto produce un polinucleótido amplificado que incluye la región de la supresión, es decir, los nucleótidos 2268 y 2269 de la SEQ ID NO: 1, y los correspondientes nucleótidos de un PRRSV europeo. Cuando se amplifican tanto el PRRSV similar al europeo, como el PRRSV europeo, y se comparan los polinucleótidos amplificados resultantes, el polinucleótido amplificado que resulta del PRRSV similar al europeo tiene un peso molecular que tiene aproximadamente 51 nucleótidos menos que un polinucleótido amplificado de un PRRSV europeo. Métodos para la determinación del peso molecular aproximado de un polinucleótido amplificado son ya co-
nocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, la resolución del polinucleótido sobre un gel de acrilamida o agarosa.

Un ejemplo de un par de cebadores que puede emplearse en este método incluye el cebador delantero Euro1671/5'-GCCTGTCCTAACGCCAAGTAC (SEQ ID NO: 16) y el cebador inverso/Euro3165-rc: 5'-CATGTCCACCCTATCC
CACAT (SEQ ID NO: 17), los cuales dan como resultado un polinucleótido amplificado en un PRRSV similar al europeo de aproximadamente 1.494 nucleótidos, y un polinucleótido amplificado en un PRRSV europeo de aproximadamente 1.544 nucleótidos. Otros pares de cebadores incluyen el cebador delantero euro 20/5'-CAGAAGGGTTC
GAGGAAG (SEQ ID NO: 15) y el cebador inverso euro 3207 5'-GCTTGGAACTGCGAGG (SEQ ID NO: 19) (tamaño esperado del polinucleótido amplificado de un PRRSV similar al europeo: aproximadamente 910 nucleótidos), cebador delantero Euro20/5'-CAGAAGGGTTCGAGGAAG (SEQ ID NO: 15) y cebador inverso/Euro2714 5'-GCG
CATAAGACAGATCCA (SEQ ID NO: 13) (tamaño esperado del polinucleótido amplificado a partir de un PRRSV similar al europeo: aproximadamente 616 nucleótidos). Cuando estos cebadores se emplean para amplificar un PRRSV europeo, el tamaño del polinucleótido amplificado se espera que sea aproximadamente 51 nucleótidos mayor.

En otro aspecto de la detección de un PRRSV mediante la amplificación de un polinucleótido, la invención se refiere a la detección de un virus de la presente invención en condiciones en donde el PRRSV europeo se detecta y el PRRSV similar al europeo no se detecta. En este aspecto de la invención, por lo menos uno de los cebadores de un par de cebadores es complementario de una porción de los nucleótidos 2.419 a 2.470 del prototipo del PRRSV europeo, Lelystad (número de registro NC002533 del banco de genes), del complemento del mismo. Un ejemplo de un par de cebadores que pueden emplearse en este método incluye el cebador delantero Euro1/: 5' TGAAGGTGCTCTGGTCT (SEQ ID NO: 20) y el cebador inverso/Euro2: 5' AAATTCCCGCCTACC (SEQ ID NO: 21) el cual da como resultado un polinucleótido amplificado de un PRRSV europeo de aproximadamente 51 nucleótidos.

La presente invención proporciona también un kit para emplear en la detección de un virus de la presente invención, el cual kit comprende el primer cebador y un segundo cebador de la reivindicación 13 ó 14, adecuados para emplear en la amplificación de una porción de un PRRSV e instrucciones de empleo. La especificación describe un kit para la detección de un polipéptido de la presente invención o de un análogo inmunogénico o de un fragmento inmunogénico del mismo. La presente invención se refiere también a un kit para emplear en la detección del anticuerpo del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) en un sujeto porcino, comprendiendo dicho kit el virus de la reivindicación 1 ó 3 e instrucciones para un anticuerpo que se une específicamente a un virus de la presente invención o un par de cebadores como se describe en la presente (cuando se amplifica un polinucleótido) en un material de envasado adecuado, en una cantidad suficiente para por lo menos un ensayo. De preferencia, el anticuerpo no se une específicamente al PRRSV europeo registrado como I-1102 en la Collection Nationale De Cultures De Microorganisms ("Colección Nacional de cultivos de micro-organismos"), Instituto Pasteur, Francia, o al PRRSV norteamericano registrado como VR-2332 en el ATCC. Cuando se detecta el anticuerpo del virus, el kit incluye un virus de la presente invención. Opcionalmente, están también incluidos otros reactivos tales como tampones y soluciones necesarios para la práctica de la invención. Instrucciones para el empleo del virus envasado o del polipéptido o del par de cebadores están también típicamente incluidos.

Como se emplea en el presente, el término "material de envasado" se refiere a una o más estructuras físicas empleadas para alojar los contenidos del kit. El material de envasado está preparado mediante métodos bien conocidos, de preferencia para proporcionar un ambiente estéril exento de contaminantes. El material de envasado tiene una etiqueta que indica que el polipéptido o el par de cebadores pueden ser empleados para la detección de un virus de la presente invención. Además, el material de envasado contiene instrucciones indicando como se emplean los materiales del kit para detectar un virus de la presente invención. Como se emplea en le presente, el término "envase" se refiere a una matriz sólida o un material como p. ej., vidrio, plástico, papel, lámina y similar, capaz de contener dentro de unos límites fijados un virus o un par de cebadores. Así por ejemplo, un envase puede ser un vial de vidrio empleado para contener cantidades del orden de miligramos de un par de cebadores, o puede ser un pocillo de una placa de microtitulación al cual se han adherido cantidades del orden de miligramos de un virus.

Las "instrucciones de empleo" incluyen típicamente una expresión tangible describiendo la concentración de reactivo o por lo menos un parámetro del método de ensayo como p. ej., las cantidades relativas de reactivo y de muestra que hay que mezclar, los períodos de tiempo de mantenimiento de las mezclas reactivo previo/muestra, temperatura, condiciones del tampón, y similares.

La presente invención se refiere también a una composición inmunogénica que comprende un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), atenuado o inactivado, que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, y a una composición inmunogénica que comprende un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y una combinación de las mismas. Además, la presente invención se refiere al empleo de una composición inmunogénica que comprende un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), atenuado o inactivado, que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con un polinucleótido de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a SEQ ID NO: 1 empleando el algoritmo GAP con parámetros por defecto, para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección por PRRSV ó que muestra síntomas de infección por PRRSV y el empleo de una composición inmunogénica que comprende un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y una combinación de las mismas para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección con un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), o que muestra síntomas de una infección por PRRSV. El tratamiento puede ser profiláctico o, alternativamente puede ser iniciado después del desarrollo de la MSD en un sujeto porcino. Una vacuna puede incluir por ejemplo, una composición inmunogénica o un anticuerpo neutralizante. El término "vacuna" se refiere a una composición que, después de la administración a un sujeto, proporciona protección contra un virus de la presente invención. Cuando la vacuna incluye una composición inmunogénica, la administración al sujeto produce también una respuesta inmunológica en un polipéptido y da por resultado la inmunidad.

Una composición inmunogénica de la presente invención puede incluir un virus atenuado o inactivado de la presente invención, y/o uno o más polipéptidos de la presente invención o análogos inmunogénicos o fragmentos inmunogénicos de los mismos, y/o un polinucleótido.

Como se emplea en la presente, el término "composición inmunogénica" se refiere a una composición o preparación administrada en una cantidad efectiva para dar como resultado algún beneficio o efecto terapéuticos con el fin de tener una respuesta inmunológica que inhibe o impide la MSD en un sujeto, o para dar como resultado la producción de anticuerpos del PRRSV de la presente invención. Tanto la administración local como la sistémica entran en consideración. La administración sistémica es la preferida.

Un polinucleótido empleado en una vacuna de la invención es de preferencia aquel que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención, o un análogo inmunogénico o un fragmento inmunogénico del mismo. El polinucleótido puede incluir ADN, ARN ó una combinación de los mismos. El polinucleótido puede suministrarse como parte de un vector o como un polinucleótido "desnudo". Métodos generales para la construcción, producción y administración de vacunas de polinucleótido son ya conocidos en la técnica, p. ej., F. Vogel et al., Clin. Microbiol, Rev. 8: 406-410 (1995); WO 93/02556; Felgner et al., patente U.S. nº 5, 580, 589, Pardoll et al., Immunity 3:165 (1995); Stevenson et al., Immunol. Rev. 145:211 (1995); Molling, J. Mol. Med. 75: 242 (1997); Donnelly et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:40 (1995), Yang et al., Mol. Med. Today 2:476 (1996); y Abdallah et al., Biol. Cell 85:1 (1995)). Una molécula de ácido nucleico puede ser generada por medios estándar de la técnica, tales como técnicas recombinantes o por síntesis enzimática o química.

De preferencia, la administración de un polinucleótido que es parte de una vacuna incluye la introducción de un vector de expresión que incluye el polinucleótido. Existen numerosos plásmidos conocidos por los expertos en la técnica, útiles para la producción de plásmidos polinucleótidos de vacuna, incluyendo por ejemplo, el plásmido pVAX1 como el vector (InVitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Además, el vector construido puede contener secuencias inmunoestimulatorias que estimulan el sistema inmunológico del animal. Ejemplos de secuencias inmunoestimulatorias incluyen por ejemplo secuencias con motivos CpG, dos purinas 5', un dinucleótido CpG no metilado, ó dos pirimidinas 3' (ver por ejemplo Lowie et al., Métodos y Protocolos de Vacunas de ADN, Humana Press, Totowa, NJ (2000)). Otras posibles adiciones a las construcciones de polinucleótidos de vacuna incluyen secuencias de nucleótidos que codifican citocinas tales como el factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) ó interleucina-12 (IL-12). Las citocinas pueden emplearse en varias combinaciones para sintonizar con precisión la respuesta del sistema inmunológico del animal, incluyendo tanto el anticuerpo como las respuestas de linfocitos T citotóxicos, para lograr el nivel específico de respuesta necesaria para producir una respuesta inmunológica. Alternativamente, el vector de la vacuna puede ser un vector vírico, incluyendo un vector de adenovirus, un vector asociado de adenovirus, o un vector retroviral.

Los soportes inmunogénicos pueden emplearse para potenciar la inmunogenicidad de una vacuna que incluye una composición inmunogénica. Estos soportes incluyen pero no están limitados a otros polipéptidos, polisacáridos, liposomas y células bacterianas y membranas. Los soportes polipéptido pueden estar unidos al virus atenuado o inactivado de la presente invención, y/o un polipéptido de la presente invención o un análogo inmunogénico o fragmento inmunogénico del mismo para formar polipéptidos de fusión mediante métodos recombinantes o sintéticos o mediante copulación química. Soportes útiles y medios de copulación de dichos soportes a antígenos polipéptidos ya son conocidos en la técnica.

La vacuna incluye de preferencia un soporte farmacéutico que es compatible con un sujeto porcino. La vacuna puede administrarse oralmente, parenteralmente, intranasalmente o intravenosamente. Los factores que determinan la dosificación de la vacuna incluyen por ejemplo, la edad, peso, y nivel de anticuerpo maternal del cerdo infectado. La dosis de vacuna debe ser aplicada durante aproximadamente 14 a 28 días para asegurar que el cerdo ha desarrollado una inmunidad a la infección por MSD.

La vacuna de la presente invención puede administrarse en una variedad de diferentes formas de dosificación. Un medio acuoso que contiene la vacuna puede desecarse y combinarse con excipientes inertes farmacéuticamente aceptables y agentes tampón tales como la lactosa, almidón, carbonato de calcio, citrato de sodio en forma de comprimidos, cápsulas y similares. Estas combinaciones pueden estar también en forma de un polvo o suspendidas en una solución acuosa, de forma que tales polvos y/o soluciones pueden añadirse al pienso del animal o al agua de bebida del animal. Estas composiciones pueden ser endulzadas adecuadamente o saborizadas mediante varios agentes ya conocidos para promover la ingesta de la vacuna oralmente por el cerdo.

Para fines de administración parenteral, la composición puede combinarse con un(os) soporte(s) farmacéuticamente aceptable(s) ya bien conocidos en la técnica tales como una solución salina, agua, propilenglicol, etc. De esta forma, la vacuna puede aplicarse parenteralmente, intranasalmente y oralmente mediante métodos ya bien conocidos en la técnica de la medicina veterinaria. La vacuna puede administrarse también intravenosamente mediante una jeringa. De esta forma, la vacuna se combina con un(os) soporte(s) acuoso(s) farmacéuticamente aceptable(s) tales como una solución salina. Las formulaciones parenterales e intravenosas de la composición pueden también incluir agentes emulsionantes y/o de suspensión también juntamente con un diluyente farmacéuticamente aceptable para controlar el suministro y la cantidad de dosis de la composición.

La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Detección del virus en cerdos infectados

Este ejemplo describe el aislamiento de un nuevo PRRSV a partir de cerdos infectados. Al PRRSV se le dio el nombre de MND99-35186 y se hace referencia al mismo en estos ejemplos como similar al europeo.

Métodos

Tres cerdos vivos de 3 a 4 días de edad de una piara con un historial clínico de abortos de gestación tardía y cerdos nacidos débiles, fueron sometidos al Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory ("Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Minnesota") (St. Paul, Minnesota). Los cerdos fueron eutanizados mediante sobredosis intravenosa de barbiturato y necropsiados (autopsiados).

Porciones de pulmón, ganglios linfáticos, cerebro, bazo, riñón, amígdala y corazón, fueron recogidos y mezclados en una muestra. La muestra fue tratada para el aislamiento del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), pseudorabies virus (PRV) e influenza virus del cerdo (SIV).

Para el aislamiento del PRRSV, se inocularon muestras sobre células MARC-145 y macrófagos alveolares primarios porcinos. Antes de la inoculación se trataron las muestras como se describe en Rossow et al., (Vet. Pathol., 32, 361-373 (1995)). En resumen se añadió solución de sal de Hank equilibrada a la muestra de tejido o sueros para preparar una suspensión aproximadamente del 10% (vol/vol), y a continuación, se homogeneizó. El homogeneizado se centrifugó a 4.133 x g durante 20 minutos, y el sobrenadante se separó y se guardó. El material del sedimento se despreció. Las condiciones para la inoculación de las células MARC-145 y los macrófagos alveolares primarios porcinos se describen más adelante. Además, el suero de cada cerdo se mezcló juntamente en una muestra y a continuación se empleó para inocular las células MARC-145 y los macrófagos alveolares primarios porcinos.

Porciones del pulmón, ganglios linfáticos, estómago, cerebro, hígado, riñón, amígdalas, corazón e íleo (una sección del intestino delgado), se conservaron en formalina al 10% tamponada con una mezcla de fosfato de sodio dibásico y fosfato de sodio monobásico para dar un pH de 7,0. Los tejidos se incubaron en formalina durante por lo menos 12 horas antes de emplear a continuación en los ensayos. Porciones de cada tejido fueron incrustadas en parafina.

Los tejidos fijados en formalina se tiñeron con tintura de hematoxilina y eosina (H y E).

Los tejidos fijados en formalina fueron también ensayados con el test de PRRSV mediante la técnica inmunohistoquímica mediante el método de Christopher-Hennings et al., (Vet. Pathol., 35, 260-267 (1998)). En resumen, el pulmón fijado con formalina, incrustado en parafina, se seccionó a aproximadamente 4 micras y las secciones se aplicaron a portaobjetos de vidrio. Las secciones del tejido se cubrieron con el anticuerpo monoclonal SDOW-17 y se incubaron en una cámara de humidificación. El SDOW-17 es un anticuerpo monoclonal anti PRRSV, que reconoce un epitopo presente en el PRRSV Lelystad y en el VR-23332 PRRSV. El anticuerpo que se une al PRRSV en el pulmón se identificó empleando un método modificado del complejo avidina biotina (Hsu et al., J. Histochem. Cytochem, 29, 577-580 (1981)).

Secciones de pulmón se congelaron rápidamente en isopentano a -30ºC. Las secciones congeladas se examinaron para detectar el PRRSV mediante la técnica directa del anticuerpo fluorescente empleando el anticuerpo monoclonal SDOW-17. El examen FA directo del tejido se realizó mediante el método de Rossow et al., (Vet. Pathol., 32, 361-373 (1995)). En resumen los tejidos se congelaron, se seccionaron a aproximadamente 5 micras y se transfirieron a portaobjetos de vidrio. Las secciones de tejido se cubrieron con SDOW-17 conjugado con fluoresceno, un anticuerpo monoclonal anti-PRRSV (obtenido en E. Nelson, Universidad del Estado de Dakota del Sur, Dakota del Sur). Las secciones del tejido se incubaron a continuación en una cámara de humidificación durante aproximadamente 1 hora y el exceso de anticuerpo sin unir se eliminó lavando con solución salina tamponada con fosfato. La presencia de anticuerpo unido al PRRSV en el pulmón se visualizó con un microscopio de fluorescencia.

Se cultivaron muestras de cerebro, pulmón e hígado en placas de agar de sangre para detectar la presencia de bacterias aerobias.

La mezcla de tejidos se examinó también para detectar la presencia de leptospira empleando el método de Smith et al., (Cornell Vet., 57, 517-526 (1967)).

Resultados

El PRRSV se identificó en las secciones de pulmón de cada cerdo mediante un anticuerpo inmunohistoquímico y un anticuerpo fluorescente directo.

Ligeras lesiones microscópicas (portaobjetos H y E) del tejido eran compatibles con la infección por PRRSV. La histopatología de los pulmones mostró un engrosamiento séptico difuso en los macrófagos. Algunos alveolos contenían residuos celulares necróticos. Los ganglios linfáticos se caracterizaron por los centros germinales llenos con blastlinfocitos y pequeños focos de necrosis. La capa muscular en un estómago se caracterizó por una perineuritis y perivasculitis linfoplasmacíticas. El cerebro, hígado, riñón, amigdalas, corazón e íleo no presentaron lesiones.

Los ensayos para la detección del PRV y SIV fueron negativos y no se identificó ningún patógeno bacteriano en los tejidos de los cerdos infectados.

El PRRSV se aisló a partir del homogeneizado de la mezcla de tejidos y de la mezcla de sueros cultivados en los macrófagos alveolares. Sin embargo, pocas células se infectaron con PRRSV. No se aisló ningún PRRSV de ninguna muestra cultivada en las células MARC-145.

Debido a que este PRRSV creció pobremente en los macrófagos alveolares, se inocularon (intramuscularmente e intranasalmente) cerdos de 3 a 4 semanas de edad de una granja documentada libre de PRRSV, con aproximadamente 1 ml del virus obtenido a partir del sobrenadante de macrófagos alveolares infectados. El virus se diluyó añadiendo 9 mls de solución de sal de Hank equilibrada hasta aproximadamente 1 ml de sobrenadante conteniendo el virus. Clínicamente, los cerdos infectados experimentalmente, presentaron los mismos síntomas de signos suaves, pasajeros de letargia dentro de aproximadamente 1-2 días que fueron vistos también después de la infección de un cerdo con virus Lelystad ó VR-2332. Cada cerdo infectado se seroconvirtió con la infección con PRRSV. La seroconversión se midió mediante el test de Elisa IDEXX (HerdChek-PRRSV, IDEXX Laboratories Inc. Westbrook, ME). La seroconversión se midió también mediante el test indirecto del anticuerpo fluorescente empleando células infectadas con el Lelystad y el método de Yoon et al. (J. Vet. Diagn. Invest.,4, 144-147 (1992)). El PRRSV similar al europeo se aisló de nuevo a partir de tejidos y suero de cerdos infectados, se cultivó en macrófagos alveolares porcinos, y se identificó en los tejidos mediante inmunohistoquímica.

Ejemplo 2 Infección de macrófagos alveolares porcinos con PRRSV

Se aislaron macrofagos alveolares porcinos a partir de cerdos PRRSV-negativos de menos de 6 semanas de edad. Los cerdos fueron eutanizados, se extirparon la tráquea y los pulmones, y se lavaron con solución salina estéril tamponada con fosfato. La solución salina tamponada con fosfato se preparó mezclando 8,5 gramos de NaCl, 1,1 gramos de fosfato disódico y 0,32 gramos de monofosfato de sodio en 10 litros de agua destilada. Los macrófagos alveolares porcinos se concentraron por centrifugación, se confirmaron negativos respecto al PRRSV mediante aislamiento y examen empleando anticuerpos fluorescentes directos como se ha descrito en el ejemplo 1, y se emplearon inmediatamente o se guardaron en nitrógeno líquido a una concentración de 10^{6} células/ml. Los macrófagos alveolares congelados pudieron emplearse durante 6 meses.

Macrófagos alveolares porcinos recién obtenidos (aproximadamente 10^{7}) ó células congeladas (10^{6} células) se plaquearon en placas de 1 x 48 pocillos ó un frasco de 1 x 75 cm y se dejaron adherir durante 4 horas a toda la noche en aproximadamente 10 a 25 ml de medio RPMI-1640 completo. Las células no pueden dejarse incubar durante más de un día antes de añadir el virus. El medio RPMI-1640 completo se prepara combinando 500 ml de medio RPMI-1640 conteniendo 300 mg/litro de L-glutamina, 25 mM de HEPES [N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etansulfónico)] (catálogo # 10-041-CV, Mediatech Inc., Herndon, Virginia), 40 ml de suero fetal bovino inactivado por el calor (Cat # 12133-78P; JRH Bioscience, Inc., Lenexa, Kansas), 1 gramo de sulfato de neomicina (Gibco Life Technologies, Rockville, Maryland), 40 ml de solución de sal de Hank equilibrada (HBSS) (Gibco Life Technologies, # 14180053, Rockville, Maryland) conteniendo sulfato de neomicina a una concentración final de 150 [\mug/ml de medio), 66 ml de HBSS conteniendo sal potásica de penicilina G (Sigma #P7794, St. Louis, Missouri), sulfato de estreptomicina (Sigma #S9137), y anfotericina B solubilizada (Sigma A-9528) a una concentración final de 2500 U de penicilina G, 0,45 mg de sulfato de estreptomicina/ml de medio, y 120 [\mug/ml de anfotericina B/ml de medio.

El medio se eliminó y las células se lavaron una vez en HBSS, y se infectaron con 1 ml de virus en 1 ml de medio RPMI incompleto (igual que el RPMI completo pero sin añadir FBS). El título del virus puede variar, y cuando el virus se aisla del tejido de un cerdo infectado con PRRSV, es desconocido. El HBSS consistió en 500 mls de HBSS suplementado con 5 mls de 100x de neomicina (10 mg/ml) y 5 mls de 100x de penicilina (10.000 U ml), estreptomicina (10 mg/ml), y fungizona (25 \mug/ml).

La placa se agitó suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron nueve mls de medio RPMI completo, y las células infectadas se incubaron a 37ºC. Las células se observaron diariamente hasta que se observó el 60-80% de efecto citopático (CPE) (2-3 días). El CPE se manifestó en forma de células fragmentadas, vacuoladas, deformadas, contraídas.

El virus se aisló eliminando el medio y centrifugando aproximadamente a 4.000 x g durante 10 minutos para eliminar los residuos celulares, y dejar el virus en el sobrenadante.

La presencia de PRRSV en los macrófagos alveolares primarios porcinos, se confirmó manchando con el anticuerpo monoclonal SDOW-17 como está descrito por Nelson et al. (J. Clin. Microbiol., 34, 3184-3189 (1993)).

Ejemplo 3 Análisis de la secuencia del virus 1. Extracción del ARN del PRRSV

Se extrajo el ARN vírico de los sobrenadantes del cultivo de macrófagos empleando el kit QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAgen, Inc., Valencia, California). En resumen, 280 \mul del fluido del cultivo celular se añadieron a 1120 \mul de tampón AVL/soporte ARN, se trató en el Vortex durante 15 segundos, se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugó brevemente. Después de este paso, se añadieron 1120 \mul de etanol 100% a la reacción, se trató en el Vortex durante 15 segundos y se centrifugó brevemente. La reacción se aplicó a continuación a una columna QIAamp giratoria (en un tubo de recogida de 2 ml) en alícuotas de 630 \mul (4X) y se centrifugó a 6000 x g (800 rpm) durante 1 minuto, despreciando cada vez la pérdida. Cuando toda la muestra se aplicó al filtro, la columna QIAamp giratoria se colocó en un tubo limpio de recogida de 2 ml, y se centrifugó de nuevo. Se añadió tampón AWI (500 \mul) al filtro conteniendo el ARN vírico y esta reacción se centrifugó a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto. Se añadió tampón AW2 (500 \mul) a la columna giratoria y la columna se centrifugó a toda velocidad (20.000 x g; 14.000 rpm) durante 3 minutos. El tubo de recogida se despreció, y la columna QIAamp giratoria se colocó en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Se añadió tampón AVE (60 \mul) a la columna giratoria, se incubó la columna a temperatura ambiente durante 1 minuto y a continuación se centrifugó a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto.

2. RT-PCR

Se emplearon dos métodos para la transcripción inversa del ARN vírico para obtener el ADN para emplear en el análisis de la secuencia de ADN. En general, los cebadores se seleccionaron para hibridar a una porción apropiada de SEQ ID NO: 1 y amplificar un segmento de ADN que a continuación se empleó en las reacciones de secuenciado del ADN.

a. RT-PCR Qiagen de un paso

Se añadieron cinco microlitros de ARN extraido, a una mezcla de reacción conteniendo tampón 1X Qiagen RT-PCR; 400 nM de cada uno de los dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 0,08 unidades/inhibidor de la reacción con RNasa (20 U/\mul, Perkin Elmer, Boston Massachusetts); 1/25 volumen de mezcla de enzima Qiagen; 300 nM de cada uno del cebador delantero y cebador inverso; para completar un volumen total de reacción de 25 ml. Las condiciones del termociclado consistieron en: 1 ciclo de 50ºC durante 30 minutos; 1 ciclo de 95ºC durante 15 minutos; 35 ciclos de 57ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos, 94ºC durante 45 segundos; 1 ciclo de 57ºC durante 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos y guardado a 4ºC.

b. RT y PCR-reacción de 2 pasos

b1. Transcripción inversa: El ADNc cebado aleatoriamente, se generó de la siguiente manera: 2 \mul de 50 \muM de hexámeros aleatorios, se añadieron a 6 \mul de extracto de ARN. Este se calentó a 70ºC durante 5 minutos y se enfrió rápidamente sobre hielo. A continuación se añadieron 32 \mul de una mezcla madre que contenía 5 mM de MgCl_{2} (Perkin Elmer), 1X tampón II Perkin Elmer (50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl,(pH 8,3 a temperatura ambiente)), 1 mM de los dNTP (Perkin Elmer), 1 U/\mul de inhibidor de RNasa (20 U/\mul, Perkin Elmer) y 25 U/\mul MuLV RT (transcriptasa inversa del virus de la leucemia del ratón; Perkin Elmer).

Las condiciones del termociclado fueron las siguientes: 1 ciclo de 22ºC durante 10 minutos; 1 ciclo de 42ºC durante 15 minutos; 1 ciclo de 95ºC durante 10 minutos, 1 ciclo de 5ºC durante 5 minutos y guardado a 4ºC.

b2. PCR: El tubo de reacción conteniendo 40 \mul de 5 mM de MgCl_{2} (Perkin Elmer), 1X de tampón II de Perkin Elmer, 300 nM del cebador delantero, 300 nM del cebador inverso, y 0,25 U/\mul de polimerasa Amplitaq (Perkin Elemer), se añadió a 10 \mul de ADNc obtenido de la transcripción inversa (parágrafo b1, más arriba). Alternativamente, para amplificar la sección más larga del ADNc cebado aleatoriamente, se empleó el kit Expand Long Template PCR (de Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana). Las condiciones del termociclado fueron las siguientes: 1 ciclo de 93ºC durante 4 minutos; 35 ciclos de 57ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 45 segundos, 93ºC durante 45 segundos; 1 ciclo de 57ºC durante 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos y guardado a 4ºC (la temperatura de reasociación variaría de acuerdo con el par de cebadores utilizados para la amplificación del ADNc).

3. Los resultados de cada PCR fueron evaluados y preparados para el secuenciado del ADN. El análisis de secuenciado fue efectuado por el Advanced Genetic Análisis Center ("Centro avanzado de análisis genético") (AGAC) (Universidad de Minnesota, Minneapolis, Minnesota), empleando un secuenciador de ADN marca ABI modelo 377.

1. Evaluación de las reacciones PCR sobre un gel de agarosa

Se añadió un gramo de agarosa a 100 ml de tampón TAE 1X. Se trató con el microondas durante 2 minutos, y se añadieron 4 \mul de 10 mg/ml de EtBr a cada 100 ml de agarosa. El gel se vació y se dejó solidificar durante aproximadamente 15-30 minutos. Cuatro \mul del producto PCR se mezclaron con 1 \mul de colorante de carga, y se añadió al gel, el cual se trató a 140 voltios durante 1 hora ó 75 voltios durante 2 horas.

II. Purificación del producto PCR con el kit de purificación de PCR Qiagen Qiaquick

Para cada muestra a purificar, se colocó una columna en un tubo de recogida. Cien \mul de tampón PB se añadieron a los 20 \mul de reacción PCR dejados en el tubo PCR, y se mezclaron a fondo. Toda la mezcla de producto PCR/tampón PB se añadió a la columna, y la columna se centrifugó durante 1 minuto a toda velocidad en una microcentrífuga Eppendorf. Se despreció la pérdida de flujo del tubo de recogida, y la columna se colocó de nuevo en el tubo. Se añadieron setecientos cincuenta \mul de tampón PE, y la columna se centrifugó durante otro minuto a toda velocidad. Después de despreciar la pérdida de flujo del tubo de recogida, la columna se centrifugó durante otro minuto a toda velocidad para eliminar cualquier tampón PE residual de la columna. La columna se transfirió a un tubo de microcentrífuga limpio, se añadieron 30 \mul de H_{2}O a la columna y se incubó por lo menos un minuto a temperatura ambiente. La columna se centrifugó durante un minuto a toda velocidad. El producto PCR/eluato acuoso en el tubo de la microcentrífuga, estaba preparado para ser añadido a la reacción de secuenciación.

Ejemplo 4 Detección del PRRSV similar al europeo

En este ejemplo, se amplificaron ADN víricos, empleando cebadores que amplifican el PRRSV similar al europeo, el PRRSV europeo y el PRRSV norteamericano. La región amplificada incluye la supresión que está presente en el PRRSV similar al europeo.

Se obtuvo el ARN vírico de Lelystad a partir del sobrenadante de células MA-104 infectadas, el ARN vírico del VR-2332 se obtuvo a partir de los sobrenadantes de las células MA-104 infectadas, y el ARN vírico a partir del PRRSV similar al europeo se obtuvo a partir de los sobrenadantes de los macrófagos alveolares primarios porcinos infectados. El ADNc del ARN vírico se preparó como se ha descrito más arriba en el ejemplo 3.

Los ADNc víricos se ampliaron empleando los cebadores Euro1671/: 5'-GCCTGTCCTAACGCCAAGTAC (SEQ ID NO: 16) y Euro3165-rc: 5'-CATGTCCACCCTATCCCACAT (SEQ ID NO: 17). Las condiciones de la amplificación figuran listadas en la tabla 2.

TABLA 2 Condiciones generales de la PCR (para 50 \mul de reacción)

Componente	Concentración del stock	Concentración final
MgCl_{2}		25 mM		5 mM
Tampón II^{1}		10X		1X
Cebador delantero		15 \muM		0,3 \muM
Cebador inverso		15 \muM		0,3 \muM
Taq polimerasa		5 U/\mul		0,25 U/ml
^{1} Tampón II, fabricado por Perkin Elmer.

Resultados

La amplificación del ADN vírico a partir del Lelystad, VR 2332, y la del similar al europeo, dio como resultado productos de amplificación que migraron a los pesos moleculares previstos. Como era esperado, el producto de la amplificación del ADN similar al europeo migró a aproximadamente 1,5 kilobases, aproximadamente 51 pares de bases menos que el Lelystad.

Todos los encabezados están puestos con idea de ayudar al lector y no deben utilizarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, a no ser que se especifique expresamente.

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Texto libre para listado de las secuencias

SEQ ID NO: 1 Porción de secuencia de nucleótidos de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

SEQ ID NOs: 2-10 Polipéptidos previstos a partir de los marcos de lectura abiertos de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 11 Nucleótidos 1.918 a 2.820 del virus Lelystad

SEQ ID NOs: 12-17 Cebador

SEQ ID NO: 18 oligonucleótido

SEQ ID NOs: 19-21 Cebador

<110> MIEMBROS DE LA JUNTA DE GOBIERNO DE LA UNIVERSIDAD DE MINNESOTA

\hskip1cm

COLLINS, James E.

\hskip1cm

FAABERG, Kay S.

\hskip1cm

ROSSOW, Kurt D.

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<120> VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO Y METODOS DE EMPLEO

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 110.01250201

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US01/04351

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-02-08

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/181.041

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-02-08

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/193,220

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-30

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/206,624

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-05-24

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/215,373

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-06-29

\vskip0.400000\baselineskip

<150> UNASSIGNED

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<151> 2001-01-05

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14896

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<212> DNA

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

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<400> 1

1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 2402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

7

8

9

10

11

12

13

14

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 1458

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<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

15

16

17

18

19

20

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<210> 4

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<211> 249

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<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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21

22

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<210> 5

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<211> 265

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<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo porcino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

23

24

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<210> 6

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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26

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<210> 7

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<211> 201

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<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 840

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<212> DNA

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<213> Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

33

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<210> 12

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgggaatg ctcagtcccc tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcataaga cagatcca

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaggggactg agcattcccg

\hfill

20

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<210> 15

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagaagggtt cgaggaag

\hfill

18

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<210> 16

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<211> 21

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<212> DNA

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctgtccta acgccaagta c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

catgtccacc ctatcccaca t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagcgggaa cagaatcctt cccaccttta gcggtacgct tg

\hfill

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcttggaact gcgagg

\hfill

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223>Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaaggtgct ctggtct

\hfill

17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 15

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebadar

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<400> 21

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaattcccgc ctacc

\hfill

15

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Claims (22)

1. Un virus aislado, registrado en la ATCC con el número de registro PTA-2194.

2. Una célula aislada que contiene un virus, registrado en la ATCC con el número de registro PTA-2914.

3. Un virus aislado que comprende un polinucleótido de ARN que contiene la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a la SEQ ID NO: 1.

4. Un polinucleótido aislado que contiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

5. Un polinucleótido aislado en donde la secuencia es SEQ ID NO: 1.

6. Un polinucleótido aislado que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, el cual polinucleótido se replica en una célula.

7. Un vector que comprende un polinucleótido que contiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1.

8. Un polipéptido que contiene una secuencia de amino-ácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 2-10.

9. Un método para la obtención de un anticuerpo, comprendiendo dicho método la administración a un animal no humano de una partícula de virus que contiene un polinucleótido de ARN que contiene la secuencia de nucleótidos de ARN correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en una cantidad efectiva para causar la producción de un anticuerpo específico para la partícula de virus.

10. Un método para la obtención de un anticuerpo, comprendiendo dicho método la administración a un animal no humano de un polipéptido que contiene una secuencia de amino-ácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 2-10, ó un polinucleótido que codifica el polipéptido en una cantidad efectiva para causar la producción de un anticuerpo específico para el polipéptido.

11. El método de la reivindicación 9 ó 10, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo formado por un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal.

12. El método de la reivindicación 9 ó 10, que comprende además, el aislamiento del anticuerpo.

13. Un método in vitro para la detección de la presencia de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) similar al europeo, que comprende:

la puesta en contacto de un polinucleótido vírico con un primer cebador y un segundo cebador en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable, en donde el primer cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la SEQ ID NO: 1 que contiene los nucleótidos 2268 y 2269 de la SEQ ID NO: 1 ó el complemento de los mismos; y

la detección de un producto de amplificación, en donde la detección indica que el polinucleótido vírico es un PRRSV similar al europeo.

14. Un método in vitro para la detección de la presencia de un PRRSV similar al europeo en un sujeto porcino, el cual comprende:

la puesta en contacto de una muestra biológica de un sujeto porcino con un primer cebador y un segundo cebador e incubando en condiciones adecuadas para formar un producto de amplificación detectable, en donde el primer cebador contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la SEQ ID NO: 1 la cual contiene los nucleótidos 2268 y 2269 de la SEQ ID NO: 1 ó el complemento de los mismos; y detectando un producto de amplificación en donde la detección indica que el sujeto porcino tiene un PRRSV similar al europeo.

15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en donde el primer cebador contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por:

5'ATCGGGAATGCTCAGTCCCCTT (SEQ ID NO: 12), y 5'-AAGGGGACTGAGCATTCCCG (SEQ ID NO: 14).

16. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra biológica comprende un tejido de pulmón.

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17. Un kit para emplear en la detección del PRRSV en un sujeto porcino, conteniendo este kit el primero y segundo cebadores de la reivindicación 13 ó 14 adecuados para emplear en la amplificación de una porción de un PRRSV e instrucciones para el empleo del par de cebadores.

18. Un kit para emplear en la detección de un anti-cuerpo al PRRSV en un sujeto porcino, conteniendo este kit el virus de la reivindicación 1 ó 3 e instrucciones para el empleo del virus.

19. Una composición inmunogénica que contiene un PRRSV atenuado o inactivado, que contiene un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente el 99% de identidad con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto.

20. Una composición inmunogénica que contiene un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y una combinación de las mismas.

21. Una composición inmunogénica que contiene un PRRSV atenuado o inactivado que contiene un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente un 99% de identidad con un polinucleótido de ARN que contiene la secuencia de nucleótidos de ARN que corresponden a la SEQ ID NO: 1, empleando un algoritmo GAP con parámetros por defecto, para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección por PRRSV ó mostrando síntomas de una infección por PRRSV.

22. Empleo de una composición inmunogénica que contiene un polipéptido seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, y una combinación de las mismas para la preparación de una composición inmunogénica para el tratamiento de un sujeto porcino con riesgo de infección por PRRSV ó mostrando síntomas de una infección por PRRSV.