TWI382089B - 編碼有傳染性胃腸炎病毒（ｔｇｅｖ）序列及豬繁殖與呼吸綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）序列以改善ｐｒｒｓｖ序列之表現的核酸（二） - Google Patents

編碼有傳染性胃腸炎病毒（ｔｇｅｖ）序列及豬繁殖與呼吸綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）序列以改善ｐｒｒｓｖ序列之表現的核酸（二） Download PDF

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Description

編碼有傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列及豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)序列以改善PRRSV序列之表現的核酸(二)
本發明係相關於一種核酸，包含一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目。本發明之核酸更編碼PRRSV之ORF5之至少一中和性表位，以及一或多種其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽。使用編碼二種不同PRRSV蛋白之核酸，可提供具有增進之體外穩定度之病毒建構物。本發明更相關於使用這些核酸製備醫藥組成物之用途，用於製備具增進效率之一般性與特異性疫苗。
 發明背景
涉及功能性基因置入細胞中以達到療效之醫療方法，稱之為基因療法，因為是以基因作為藥物。基因療法為一種主要用於矯正對應於疾病發展之基因缺陷之技術。
載劑分子亦稱為載體，係用於傳遞治療性基因至病患標的細胞中。目前最常用之載體為病毒，其已經基因工程改變，可攜帶人類或動物基因。病毒涉及以致病方式包覆與傳送其基因至人類或動物細胞中。因此，科學家利用此能力之優點，操作病毒基因體，移除致病基因，並插入具療效之基因。
這些病毒性載體係用於表現會導致接受該載體之個體免疫反應之異源性基因，因而使該個體免疫。在此情況下，病毒性載體係作為疫苗。
傳染性胃腸炎病毒為冠狀病毒家族成員之一。冠狀病毒為ssRNA(+)病毒，為目前RNA病毒具有最大基因體者，具有25與31kb之長度(請見SIDDELL S.G. 1995,The Coronaviridae)。當冠狀病毒感染一細胞，該基因體RNA(gRNA)會在細胞質中複製，並產生一組具正與負極性之次基因體RNAs(sgRNA)(SETHNAet al .,1989;SAWICKI & SAWICKI,1990;and VAN DER MOST and SPAAN,1995)。
由於冠狀病毒會於細胞質中複製，使用冠狀病毒作為基因治療之載體與疫苗已被報導(ENJUANESet al .,2003)。特別的是，冠狀病毒之缺陷干擾(DI)基因體會被製造出。這些DI基因體為缺失突變株，其需要互補或輔助病毒存在，以複製及/或轉錄(請見CHANGet al .,1994;WO97/34008；西班牙專利申請案P9600620;IZETAet al .,1999;SNCHEZet al .,1999)。
冠狀病毒之完整基因體係以感染性cDNA方式複製出(ALMAZANet al .,2000 and WO01/39797)。完整基因體之複製可允許製備感染性載體，其含有適於於宿主細胞中大量表現之異源性序列。
該複製出之病毒性基因體表現異源性序列之潛力，係回顧於ENJUANESet al .,2003。
使用複製出之病毒，該基因之結構，以及感染用之冠狀病毒性基因之流行程度，便可利用製備缺失突變株而評估。已發現基因3a、3b與7為病毒性核酸複製非必要，且該基因之缺失會降低病毒之致病性(ORTEGOet al .,2002 and 2003;SOLAet al .,2003)。
豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)於1991年首度辨識出，為豬隻新疾病之致病劑(WENSVOORTet al .,1991)。自此，PRRSV便成為全世界豬隻經營損失之主要因素之一，目前公認為豬隻最重要之感染疾病，會導致成熟動物生殖衰竭，以及新生豬隻之嚴重肺炎。PRRSV為Arteriviridae 家族成員之一，屬於Nido 病毒性疾病。已辨識出兩種基因型(美洲型與歐洲型)(MURTAUGHet al .,1995)。PRRSV為一種封包病毒，具有單股正向RNA基因體，為14.5 Kb。三分之二之5’基因體編碼該複製酶多蛋白(pp1a與pp1ab)，其餘的基因體RNA則編碼三個次要膜結合醣蛋白(Gp2、Gp3與Gp4)，以及三個主要結構蛋白(Gp5、M與N)。
豬隻一般會在黏膜表面或呼吸道暴露於病毒下而感染PRRSV。豬隻對PRRSV之抗體反應標記主要為非中和性抗體，會在感染早期偵測到，之後為低度中和性抗體效價，出現於感染後3週。最近幾年之實驗數據已顯示中和性抗體在對抗PRRSV感染上之重要性(LOPEZ and OSORIO,2004,ANSARIet al .,2006)。PRRSV醣蛋白Gp5含有大部分中和病毒表位。PRRSV之蛋白質Gp4與M亦會誘發中和性蛋白，然而，Gp5特異性抗體則會更有效地中和PRRSV，與其他病毒性蛋白之結合相較(OSTROWSKIet al .,2002)。PRRSV感染亦會誘發較弱及延遲之T細胞媒介免疫反應，與其他病毒引起之免疫反應有關。二者反應皆需要完全之病毒清除。
雖然我們較不瞭解PRRSV之免疫反應，但已有某些市售之疫苗。目前對抗PRRSV之疫苗具有數種缺點。PRRSV，不論是野生型或減毒性，皆接會誘發低量之細胞-媒介免疫反應(MEIERet al .,2003)，且中和性抗體(NA)直至感染晚期才會形成(MEIERet al .,2003,VEZINAet al .,1996,YOONet al .,1995)。此外，PRRSV之基因歧異度被認為會影響疫苗效率，在野外條件下(LABRQUEet al .,2004,PESCHet al .,2005)，雖然會存在某些程度之交叉保護(MENGELINGet al .,2003 a,2003b)。經修飾之活疫苗可保護同源性單株體之感染，但一般對於異源性病毒有限制(MENG,2000)。此外，活疫苗對於臨床疾病提供部分保護，但無法預防感染(OSPRIOet al .,1998)，更重要的是，他們可轉變毒性(BOTNERet al .,1997,NIELSENet al .,2001)。另一方面，殺死之PRRSV疫苗已證實對於感染與疾病二者提供之保護較小(OSTROESKIet al .,2002)。
因此，本發明所要解決之問題便是提供一種有效率之疫苗載體，具有良好之安全性，以及對抗PRRSV之免疫增強作用。
 發明概要
依據本發明之第一觀點，係提供一種核酸，包含：(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動該核酸之複製，因此增加該核酸在該細胞中之數目；以及
(b)　一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) ORF5之至少一中和性表位之序列，該序列包括一雙硫鍵形成殘基；以及
(c)　一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽。
依據本發明之第二觀點，係提供一種核酸，包含：
(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動核酸之複製，因此增加該核酸在該細胞中之數目；以及
(b)　編碼PRRSV之一或多個ORF5中和性表位之多聚合體(multimers)，以及至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽之序列。
依據本發明之第三觀點，係提供一種核酸，包含：
(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因此增加該核酸在該細胞中之數目；以及
(b)　一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) ORF5之至少一中和性表位之序列；以及
(c)　一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽，其可穩定(b)之序列之表現，使得大於60%之經此核酸序列感染之細胞，可表現(b)序列之基因產物，至體外病毒分代20代之後。
在一較佳實施例中，該中和性表位係定義為胺基酸序列TYQYIYN(SEQ ID NO: 10)。
在另一較佳實施例中，該核酸包含PRRSV之ORF5與ORF 6，每一者皆在個別之表現調控序列控制下。
在一較佳實施例中，該核酸係由(1) PRRSV之ORF5序列，在基因3a之轉錄調控序列控制下、(2) PRRSV之ORF6序列，在如SEQ ID NO: 19之轉錄調控序列TRS22N 之控制下，以及(3) S基因序列，衍生自TGEV之PTV減毒株，組成。
該複製勝任TGEV序列不一定需要，但可更編碼其他TGEV蛋白。因此，該TGEV序列可編碼一完全感染性TGEV病毒，且該中和性表位多聚合體之序列恰好包含一複製勝任核酸。本發明更相關於一種載體，包含個別之核酸與包含該載體之宿主細胞。該宿主細胞可補足本發明核酸刪除之TGEV基因。因此，宿主細胞可為組裝好之細胞株，或可含有表現TGEV基因輔助病毒，使得TGEV病毒顆粒可形成含有至少一PRRSV中和性表位之序列。由TGEV外殼蛋白與本發明之複製勝任但無感染性之核酸組合而得之病毒顆粒，為本發明之特佳實施例(相對應之病毒顆粒亦稱之為偽-病毒)。
最後，本發明亦相關於該核酸之醫藥用途，該病毒載體與宿主細胞特別使用作為一疫苗，用於治療與保護動物，如豬，對抗感染性疾病。因此，該疫苗可投藥至動物，以降低或解除野生型病毒感染後之症狀。
 較佳實施例之詳細說明
因此，本發明係相關於一種核酸，包含：
(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；以及
(b)　一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之ORF5之至少一中和性表位之序列，該序列包括一雙硫鍵形成殘基；以及
(c)　一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽。
本發明更令人意外地發現表現PRRSV之ORF5之表位之至少一中和性表位或多聚合體，以及至少一其他多胜肽，可增加對抗PRRSV之免疫反應，其中該TGEV載體骨架可產生一有效且相當安全之疫苗對抗PRRSV，具有增進之藥效。
因此，本發明更相關於一種核酸，包含：
(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；
(b)　一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之ORF5之至少一中和性表位之序列；以及
(c)　一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽，其可穩定(b)之序列之表現，使得大於60%之經此核酸序列感染之細胞，可表現(b)序列之基因產物，至體外病毒分代20代之後。
在一實施例中，該核酸可經由至少一其他多胜肽穩定，其可增加對抗PRRSV之免疫反應程度，使得至少65%、70%、75%、80%、85%、90%，或100%之經本發明核酸序列感染之細胞，在病毒體外繁衍20代之後仍可表現PRRSV之ORF5之至少一中和性表位。在一較佳實施例中，至少80%之細胞會在病毒體外繁衍20代之後仍可表現PRRSV之ORF5之至少一中和性表位。
在本申請書中，術語“分代”係指一過程，其中培養皿，如Petri dish，上之單層TGEV敏感細胞(如ST細胞)，係經病毒感染，病毒複製如24小時後，收集該上清液，並轉移至新鮮之單層細胞上。該分代過程可包括複製步驟，如轉染，以獲得由該DNA植株(使用如BHK細胞)，或由病毒溶菌斑純化而得之病毒。
使用含TGEV之載體可允許該表位物傳送至所希望之組織，其具有高度抗原表現量，且該載體可經基因工程操作產生安全之疫苗。
PRRSV感染期間之問題之一為該豬隻僅分泌低量之IFN-γ，在感染之非常晚期。第I型干擾素(IFN-α/β)之誘發為促進抗病毒細胞(PFEFFERet al .,1998)與體液免疫反應(LE BONet al .,2001)所必須。更描述了IFN-α與IL-12涉及T細胞分化為IFN-γ抗原特異性分泌細胞之過程(COUSENSet al .,1999)。然而，已顯示TGEV為一強效之IFN-α誘發物。TGEV誘發IFN，為M蛋白媒介之過程(CHARLEY and LAUDE,1988;LAUDEet al .,1990)。此外，TGEV載體呈現抗原於黏膜位置，引發黏膜性與系統性免疫反應。因此，使用TGEV為PRRSV表位之載體，優點為可增進誘發對抗PRRSV之保護反應。
含TGEV之載體可具有一經修飾之載體-趨性。在本發明之一實施例中，該載體為呼吸道相關載體。此可藉由使用呼吸道病毒之棘蛋白(S)基因而達成。在另一實施例中，該載體為腸道引導載體。此可藉由使用TGEV腸內株之S基因而獲得。該S基因更可為一引導載體至呼吸道與腸道之序列(請見第9圖)。
在一較佳實施例中，係使用經修飾之S基因(SEQ ID No:1)，其提供腸內與呼吸道趨性，且培養豬睪丸(ST)細胞分代時相當穩定。此基因為一嵌合性蛋白質，衍生自TGEV植株C11 之S蛋白(其為劇毒，具有腸內與呼吸道趨性)，並複製PTV。重組S蛋白係經基因工程改造，使用TGEV C11 S基因之前1208 nt，以及PTV病毒嵌合序列之剩餘部分。最終之嵌合蛋白可藉由使用重組病毒攜帶此蛋白至豬隻上，並回收具有嵌合性序列如SEQ ID NO: 1之病毒。此蛋白提供TGEV腸內與呼吸道趨性，且培養豬睪丸(ST)細胞分代時相當穩定，提供高效價(>108 )之TGEV，當培養於ST細胞之組織培養物中時，且不會解除體外之雙重趨性(亦請見第9圖)。
就最廣之觀點而言，本發明之核酸特徵為一編碼複製勝任TGEV序列之核酸，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因此增加該核酸在該細胞中之數目。一旦細胞經本發明核酸感染，該複製酶之基因將可表現，且該核酸將被複製。愈多複製核酸出現於細胞中，便有愈多之表位物會被表現。
術語“轉錄調控序列”，於此使用係指一序列或序列片段，可驅動並轉錄調控序列結合之次基因體病毒性RNAs之合成。此轉錄調控序列為天然轉錄-調節序列(TRS)，與病毒性RNAs結合。在一較佳實施例中，該TRS為基因3a之TRS，在編碼兩抗原之雙順反子(dicistronic)載體中，該第二個TRS為合成TRS，衍生自N基因(TRS22N ;SEQ ID NO: 19)，其可在微基因體與全長cDNA表現系統中，使基因表現最佳化(ALONSOet al .,2002)。
依據本發明，“中和性表位”係指一表位，其涉及病毒中和作用。可辨識PRRSV Gp5(由ORF5編碼)之抗體可更有效地中和PRRSV，與特異於其他病毒性蛋白者相較(OSTROWSKIet al .,2002)。應瞭解為，本發明之核酸編碼PRRSV之ORF5之至少一中和性表位，但亦編碼更多之中和性表位，或ORF5之更大部分，例如整個Gp5蛋白。
在一較佳實施例中，該中和性表位係定義為胺基酸序列TYQYIYN(SEQ ID NO: 10)。
在一實施例中，本發明核酸係編碼PRRSV之ORF5之至少一中和性表位，以及一雙硫鍵形成殘基，其可連結另一多胜肽至該中和性表位上。例如，一ORF6之表位，其編碼PRRSV之M蛋白，或完全M蛋白可經由雙硫鍵耦合至ORF5之表位。
在另一實施例中，本發明之核酸會編碼ORF5中和性表位之多聚合體。“多聚合體”包含至少一表位之二複製物。一“多聚合體”可包含Gp5之重複，或其他PRRSV衍生蛋白序列誘發之中和用PRRSV抗體。此定義包括衍生自PRRSV Gp5之合成蛋白區域(或胜肽)，或其他PRRSV蛋白，具有點突變之經修飾序列，可產生免疫原結構，提供更高之保護，由於強化之中和反應或移除誘餌表位所致。
一般而言，編碼多聚合體之核酸包含2至5個重複序列，該序列編碼PRRSV之ORF5之表位。這些多聚合體可與一核酸序列連結，該序列編碼一彈性聯結子(flexible linker)，為2至8個胺基酸，較佳3至6個胺基酸。這些“聯結基殘基”可增進表位之彈性。特佳之聯結基為序列Gly-Gly-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO: 15)。
在另一實施例中，編碼ORF5中和性表位之核酸，其經修飾刪除醣化位置，最近一篇報導描述缺乏該醣化位置可增加誘發中和PRRSV之抗體(ANSARIet al .,2006)。在一較佳實施例中，此醣化位置為Gp5胺基酸46及/或53，得自PRRSV Olot 91株。
Gp5蛋白表位之醣化可影響抗體之誘發，導致免疫反應下降。因此，由本發明核酸編碼之表位可提供增進之免疫反應刺激效應，與天然發生之表位相較。
在本發明之一較佳實施例中，該核酸編碼PRRSV之ORF5與ORF6之至少一中和性表位，但非其他PRRSV多胜肽。因此，在本發明之另一實施例中，該核酸包含PRRSV之ORF5之一中和性表位，以及ORF6之至少一表位。在另一實施例中，該核酸係由PRRSV之ORF5之一中和用表位，以及ORF6之一中和用表位組成。在另一較佳實施例中，該核酸係由PRRSV之ORF5之一中和性表位，以及整段ORF 6組成。
此可產生非常有效對抗PRRSV之疫苗。在另一較佳實施例中，該核酸編碼整段ORF5與ORF6，但無其他PRRSV多胜肽。
在另一較佳實施例中，該核酸編碼ORF5之一中和性表位，以及整段ORF6，但無其他PRRSV多胜肽。在另一較佳實施例中，ORF5之中和性表位係定義為SEQ ID NO: 10。
在另一較佳實施例中，該核酸編碼ORF5之至少一中和性表位、整段ORF6，以及額外地，Gp4之至少一中和性表位。
僅包含PRRSV之Gp5之疫苗，已證實對於保護小豬對抗PRRSV感染非常有效。此由感染PRRSV後，接種疫苗之小豬可防止體重減輕而得知(請見第1圖)，且接種疫苗之小豬亦可預防被PRRSV感染(請見第2圖)。然而，僅包含Gp5之重組病毒已證實為不穩定，在將病毒於組織培養中分代時。如同第3圖所示，Gp5 mRNA無法在組織培養分代5次後(p5)，於感染重組病毒之ST細胞中偵測到，其在分代2次後(p2)仍可於感染重組病毒之ST細胞中偵測到。此現象係由於在病毒分代時會產生缺失所致。
相對地，使用編碼PRRSV之Gp5(ORF5)與M(ORF6)之核酸，已顯示可提供具有實質上增進穩定性之建構物。更特別的是，除了提供保護對抗PRRSV感染外，包含編碼PRRSV之Gp5(ORF5)與M(ORF6)之核酸之雙順反子建構物為更穩定，甚至在組織培養中分代20次之後仍是(請見第5、6與8圖)。該病毒更可由經感染之小豬中取得。該建構物之穩定性可更進一步由RT-PCR分析顯示(請見第7圖)，其顯示轉錄ORF5與ORF6二基因，可由體外分代20次之ST細胞中偵測到病毒植株。此資料清楚地顯示本發明之雙順反子建構物，包含碼PRRSV之Gp5與M之核酸，不僅可提供在細胞培養20次分代後仍維持其能力之病毒，亦可在20次分代後仍表現由該雙順反子建構物編碼之二蛋白。此在細胞培養中增進之穩定性，對於用於疫苗製備之體外重組病毒之繁殖相當重要。此外，由於增進之穩定性，亦可由接種疫苗小豬之肺部與腸組織中回收表現有PRRSV Gp5與M之重組TGEV，可更進一步使用ST細胞進行細胞培養繁殖(請見第9與10圖)。
其他可被表現以誘發保護性免疫反應之PRRSV衍生蛋白為醣蛋白Gp2、Gp3與Gp4。已顯示這些蛋白可加入病毒粒子(virions)中成為多聚合體複合體(WISSINKet al .,2005)，為病毒感染性所必須。因此，在本發明之另一實施例中，該核酸編碼Gp5至少一中和性表位，以及Gp2、Gp3或Gp4之至少一表位。在一較佳實施例中，該核酸編碼Gp5與Gp2之一中和性表位。在另一實施例中，該核酸編碼Gp5與Gp3之一中和性表位，而在另一實施例中，該核酸編碼Gp5與Gp4之一中和性表位。其他實施例則包含Gp5與Gp2及Gp3之組合，Gp5與Gp2及Gp4之組合，或Gp5與Gp3及Gp4之組合。
在本發明之另一實施例中，該核酸包含一核酸，其包含：
(a)　一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；
(b)　SEQ ID NO: 2之殘基118至138，或一具有與這些殘基90%相似度之序列，在一表現調控序列之控制下；以及
(c)　SEQ ID NO: 3，或一具有與SEQ ID NO: 3 90%相似度之序列，在一表現調控序列之控制下；其中
(a)與(b)與(c)之每一序列皆在不同表現調控序列之控制下。
在一實施例中，該核酸之特徵為SEQ ID NO: 2之特定殘基，SEQ ID NO: 3更包含核酸序列SEQ ID NO: 12，其編碼溶酶體貫穿性膜蛋白-II(LIMPII)之溶酶體標靶訊號，或具有與SEQ ID NO: 12相似度90%之序列。LIMP-II會引導融合蛋白至溶酶體(請見第21圖)。引導至溶酶體之抗原係由MHC II呈現，會增進體液免疫反應(RODRIGUEZet al .,2001)。該編碼LIMP-II蛋白之序列較佳係融合至SEQ ID NO: 2，使得該核酸可表現含有PRRSV之ORF5序列與LIMP-II序列之融合蛋白。在本實施例之一觀點中，該核酸可包含編碼ORF5表位多聚合體之序列，如上所述(即具有SEQ ID NO: 2之殘基118至138序列之2至5重複，選擇性地插入2至8個，較佳3至6個胺基酸之連結基)，以及SEQ ID NO: 3，但該核酸不包含任一其他衍生自PRRSV之序列，即，無其他序列具有與PRRSV Olot 91已知序列80%、較佳90或95%之相似度。
使用劇毒或減毒病毒，以及PRRSV之重組抗原，可導致延遲病毒中和性抗體之誘發。在本發明之一實施例中，該核酸編碼多胜肽，其增進抗原之呈現。在一較佳實施例中，該溶酶體貫穿性膜蛋白-II(LIMPII)之溶酶體標靶訊號係使用於此目的。在另一實施例中，係使用該完整之LIMP-II蛋白，而其他實施例則包括含有含溶酶體標靶訊號之LIMP-II之任一片段。在一較佳實施例中，含有LIMPII之溶酶體標靶訊號，以及ORF5及/或ORF6，或至少一中和性表位之融合蛋白，係由本發明核酸所編碼，其中該LIMPII之溶酶體標靶訊號可融合至ORF5或ORF6，在二者，ORF5與ORF6，皆存在之情況下，該LIMPII之溶酶體標靶訊號係融合至其中之一，而ORF5與ORF6，或其中和性表位，則以雙硫鍵聯結。
在另一實施例中，該可增加對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽為介白素。最近報導IL-10與IL-12在肺部防禦機制上扮演一重要角色，在小豬中對抗PRRSV之感染(CHUNG and CHAE,2003)。豬隻應付PRRSV感染之能力可能與感染期間IFN-γ之低含量有關(SURADHATet al .,2003)。IL-12為可誘發性細胞激素，係由二聯結之次單元(p35與p40)組成，其可誘發IFN於T細胞與天然殺手細胞中表現。因此，較佳之介白素為，如IL-2、IL-10或IL-12。在一較佳實施例中，其為介白素12(IL-12)，而在一最佳實施例中，其僅為IL-12之p35次單元。
複製勝任TGEV載體可為感染性或非感染性。含有至少所有核酸複製所需之序列之核酸，可產生一或數種外殼蛋白，且會將外殼蛋白與病毒顆粒組合，對其他細胞產生感染性，稱之為感染性核酸，依據本發明。
在一較佳觀點中，本發明係提供一種病毒顆粒，其包含上述核酸，以及至少一TGEV外殼蛋白。該病毒顆粒可包含大於一種，甚至所有之TGEV外殼蛋白。相對應之病毒顆粒可進入宿主細胞，藉由感染方式。然而，此種病毒顆粒之核酸可為感染性或非感染性，由於其不需要編碼所有製造病毒顆粒所需之TGEV外殼蛋白。若該核酸為非感染性核酸，符合本申請書，該病毒顆粒係利用組裝宿主細胞，或互補於TGEV基因之輔助病毒而製備。使用組裝之宿主細胞或輔助病毒，以獲得含有不完整病毒基因體之病毒顆粒，為技術上已知。此方法具有特定之優點，由於病毒顆粒本身便具感染性(即，可一次感染一細胞)，但該核酸無法產生其他感染性病毒顆粒。換句話說，衍生自TGEV之該序列並不編碼可與核酸組合形成新病毒顆粒之蛋白。因此，這些病毒顆粒非常安全，且會提供高度免疫反應對抗該核酸表現出之表位物。
依據本發明之另一實施例，該TGEV蛋白與該核酸序列組合而成之TGEV感染性病毒顆粒，為減毒病毒顆粒。此具有優點為，使用本發明核酸治療之個體，接種疫苗後可同時對抗TGEV以及PRRSV。
本發明之核酸可包含編碼TGEV所有蛋白之序列。此外，該核酸可包含僅編碼複製勝任TGEV載體所需之TGEV蛋白之序列。因此，該核酸較佳編碼TGEV複製酶。依據一特佳實施例，該核酸編碼一複製勝任，但非感染性之TGEV載體，其包含編碼TGEV複製酶與TGEV N蛋白，並無其他TGEV蛋白之序列。此載體具有特定之優點，TGEV體可在宿主細胞中大量複製，因而製造大量之表位物。同時，此載體相當安全，因為其為非感染性。
術語“核酸編碼TGEV蛋白”使用於此係指一核酸序列，如同PENZESet al .(2001)所揭示者，或與這些序列具有至少60%，較佳至少75%，最佳至少95%相似度之核酸序列。例如，特定之另一序列可用於分辨TGEV疫苗接種動物，與經TGEV感染動物(如同下列詳細敘述)。在本發明示範之TGEV基礎載體中，相對應之核苷酸取代基已使用RT-PCR，分別導入位置6752、18997、20460與21369。特別的是，使用於此之編碼TGEV複製酶，或TGEV之N蛋白、M蛋白、E蛋白或S蛋白之核酸序列，係指如PENZESet al .,2001所揭示之核酸序列(具有或不具上述之修正)。當然，亦可使用其他TGEV株，或包括其他刪除、取代、插入或加入至該核酸序列。因此，依據另一觀點，該TGEV序列不同於PENZESet al .所揭示之序列，但仍具有與這些序列至少60%，較佳至少75%，最佳至少95%相似度。
術語“編碼PRRSV蛋白之核酸”使用於此係指PRRSV野生型核酸序列，或與這些序列具有至少60%，較佳至少75%，最佳至少95%相似度之序列。
用於本申請案之目的，序列相似度係使用ClustalW電腦程式，得自於European Bioinformatics Institute(EBI)，決定，除非另有指出。
感染性TGEV載體不需包含基因3a、3b與7，如同已知為非必需者。由TGEV之基因3a、3b與7編碼之蛋白，可調節對抗TGEV之免疫反應，且希望調節TGEV與宿主之交互作用，這些基因可維持於TGEV載體中。
此外，感染性TGEV載體已經改造，表現PRRSV抗原於TGEV基因體之不同位置，如取代nsp2蛋白，或介於複製酶多蛋白nsp1與nsp2蛋白間，類似者係描述於MHV與HCoV-229E(GRAHAMet al .,2005;HERTZIGet al .,2004)。
此外，由於PRRSV感染後中和性抗體之延遲出現，可歸因於誘餌表位(高抗原性)之出現，或由調控T細胞辨識出之表位之出現，會抑制強免疫反應，其他感染性TGEV載體已改造為表現PRRSV M與Gp5之經修飾版本。在此經改造之Gp5蛋白中，該誘餌表位與T-調控細胞表位已經剔除，維持經突變之Gp5之能力，與M蛋白交互作用，因此，增進重組病毒之穩定性。
本發明具有該核酸之蛋白編碼序列，較佳係聯結至宿主細胞或生物體中控制這些基因表現之序列上。這些編碼表位或其他多胜肽之基因，可，例如，側接轉錄調控序列(TRS)及/或內部核醣體進入位置(IRES)序列，以增加蛋白編碼序列之轉錄及/或轉譯。TRS與IRES序列為技術上已知。較佳該TRS為基因3a之TRS，其中若雙順反子載體編碼二抗原，第二TRS較佳為合成之TRS，衍生自N基因(TRS22N ;SEQ ID NO: 19)。
本發明之核酸可為DNA或RNA形式。在本發明範疇中，係包含特定之重組RNA分子，其由上述核酸之一所編碼。
在一較佳實施例中，該核酸包含PRRSV之ORF5與ORF6序列，每一者皆在個別之表現調控序列控制下。
在一較佳實施例中，該核酸係由(1) PRRSV之ORF5序列，在基因3a之轉錄調控序列之控制下、(2) PRRSV之ORF6序列，在如SEQ ID NO: 19之轉錄調控序列TRS22N 之控制下，以及(3) S基因序列，衍生自TGEV之PTV減毒株，組成。此S蛋白之一範例為SEQ ID NO: 1。
依據本發明之另一觀點，本發明係相關於一種載體，包含任一上述核酸。該載體可為cDNA載體，較佳為BAC衍生載體，如BAC-TGEVFL 。該載體較佳可在特定宿主細胞或數種宿主細胞中複製核酸。
宿主細胞，其包含一載體，含有任一上述核酸，為本發明之另一目的。該細胞可為細菌細胞、酵母菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞或人類細胞。依據一較佳實施例，該細胞為豬睪丸(ST)細胞株，如寄存於ATCC CRL-1746之細胞株。
本發明更相關於一種多胜肽，包含ORF5與ORF6之中和性表位。在一實施例中，此多胜肽係由ORF5與ORF6之中和性表位所組成，並由SEQ ID NO:13所編碼，或由具有與SEQ ID NO:13相似度90%之序列所編碼。在另一實施例中，此多胜肽係由ORF5與ORF6之中和性表位，以及LIMP-II之溶酶體標靶序列所組成。在一較佳實施例中，此多胜肽係由ORF5與ORF6之中和性表位，以及LIMP-II之溶酶體標靶序列所組成，且由SEQ ID NO: 14所編碼，或由具有與SEQ ID NO: 14相似度90%之序列所編碼。
本發明更相關於一種醫藥組成物，包含本發明核酸、病毒性RNAs、多胜肽或載體之任一者，或上述之宿主細胞。該醫藥組成物更可包含一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑，及/或佐劑。
在本發明之一尤佳實施例中，係相關於一種疫苗，可保護動物對抗由感染性病毒引起之疾病，包含本發明之核酸、病毒性RNA、載體、多胜肽或宿主細胞之任一者。該疫苗亦可包含一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑，及/或佐劑。
適用於經由黏膜路徑投藥基因性疫苗與免疫原之佐劑與載劑，為技術上已知。一般之載劑與佐劑，可回顧於，如KIYONOet al. ,1996。加入趨化素(chemokines)，其可用於調節免疫反應，亦包含於本發明範疇中。個別之化合物與其醫療用途可回顧於TOKAet al .,2004。其優點為可使用顆粒細胞/巨噬體菌落-刺激因子、介白素-2(IL-2)、IL-12、IL-18。IL-12為可誘發之細胞激素，由二聯結之次單元(p35與p40)組成，其可誘發IFN於T細胞與天然殺手細胞中表現。已報導重組單鏈IL-12(IL-12)可作為佐劑，與強化之PRRSV-特異性INF-γ產生細胞之PRRSV疫苗株共投藥(Fosset al. ,2002)。IL-12亦可降低PRRSV在細胞培養物中之效價，並降低經PRRSV-感染之動物之病毒血症，顯示IL-12可強化抗原特異性細胞媒介免疫之發展，並促進IFN-γ在經PRRSV感染動物肺部之產生(CARTER and CURIEL,2005)。IL-12投藥之一限制為p40次單元之過量表現，相對於p35次單元，且顯然，p40雙體會結合至IL-12受體，並作用為IL-12拮抗劑。最近已發現IL-12 p35次單元作為分子佐劑之表現，可增強體液與細胞-媒介之免疫反應，與IL-12 p40無關(OSORIO and GHIASI,2005)。利用數種細胞激素與趨化素之組合療法亦可使用。此外，由於T細胞之記憶性發育所需，涉及關鍵細胞激素如IL-15與IL-23之強化劑，可證實對於記憶池(memory pool)之長期維持是有助益的。
該疫苗較佳適用於治療一動物，例如豬。較佳係接種至母豬。
依據本發明，係提供一種疫苗，其較佳可誘發系統性免疫與黏膜性免疫反應，對抗PRRSV及/或TGEV。
該疫苗更可為多價疫苗，其可提供保護對抗一或多種其他豬隻病原體。因此，多價疫苗更包含衍生自其他病毒性及/或細菌性病原體及/或蛋白之抗原，其可提供免疫性對抗病原體。其他病毒性病原體之抗體範例包含衍生自豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病毒、豬環病毒第1型、豬腺病毒、豬腸病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/或西尼羅病毒、立百(Nipah)病毒之抗原。較佳使用衍生自其他病毒性病原體，選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口蹄疫之一或多者之抗原。
細菌性病原體之抗原範例包括衍生自細菌病原體，選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)、肘黴漿菌(Mycoplasma hyorinis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、格蘭氏陽性產孢菌(Clostridium perfringens)、梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、布氏桿菌(Brucella abortus)，及/或暫定螺旋菌(Candidatus helicobacter suis)。較佳使用一或多種抗原，衍生自細菌病原體，選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)，及/或沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)。
其他病毒性或細菌性抗原可存在於多價疫苗中，作為減毒或去活性病毒或細菌。此外，該多價疫苗可包含一核酸序列，編碼一或數種其他病毒性或細菌性抗原。該序列可位於同一核酸分子中，其亦編碼TGEV與PRRSV序列，或可存在於疫苗中，作為單獨之核酸分子。
多價疫苗可更包含一核酸序列，其編碼對抗豬隻病原之蛋白。個別之核酸序列可編碼一或數種抗體，具有細菌性或病毒性疾病特異性。此外或額外地，該核酸可編碼豬普昂蛋白之序列，且可用於作為對抗由普昂蛋白引起之疾病之疫苗。同樣地，編碼該可提供保護對抗豬隻病原之蛋白之序列，可位於亦編碼TGEV與PRRSV序列之同一核酸分子中，或可存在於疫苗中，作為單獨之核酸分子。
這些疫苗可依據數種技術上常用之方法投藥。特別的是，疫苗可經肌內、靜脈內、鼻內、陰道內、口鼻投藥，或技術上任一其他常用方法投藥。
該疫苗可為經修飾之活疫苗，或去活性(死)疫苗。
經修飾之活疫苗(MLV)可由病毒或細菌中單離出而得。該病毒可經減毒，係指其無法致病，但仍可於宿主細胞中複製，因而可刺激免疫反應(PANLEYet al .,1989;PASTORETet al .,1997)。
去活性(死)疫苗可藉由培養病毒或細菌，之後去活化或殺死生物體，使用加熱或化學物質，而得。在去活性(死)疫苗中，佐劑係加入該死亡生物體之抗原相，以支持免疫系統之刺激，由於死亡之病毒或細菌，在缺乏佐劑之情況下，無法輕易地被免疫系統辨識出。該佐劑更可維持死亡之生物體於注射位置，因此提供足夠之時間給免疫細胞反應(PANLEYet al .,1989;PASTORETet al .,1997)。去活性之疫苗可為死病毒、死細菌(亦稱之為bacterins)，或死毒素(或類毒素)。
在一較佳實施例中，該疫苗為去活性疫苗，以豬環病毒(PCV)第1型-第2型去活性疫苗稀釋(FENAUX et al .,2003,2004)，其已具有硫化脂質-環糊精佐劑。在一較佳實施例中，該去活性疫苗係以豬環病毒(PCV)第1型-第2型去活性疫苗稀釋，其已具有20%之硫化脂質-環糊精佐劑。在另一較佳實施例中，該去活性疫苗係經豬環病毒(PCV)第1型-第2型去活性疫苗以1:3稀釋。
該疫苗較佳含有TGEV/PRRSV核酸，以製造活病毒，效價範圍為約104 至109 ，最佳為約105 至108 。該活病毒之效價係以ST細胞中溶菌斑形成單元決定。
本發明之疫苗可允許此技術領域者，診斷一動物是否經野生型病毒感染，或已被接種疫苗。因此，依據另一觀點，本發明係相關於診斷一動物是否經病毒感染，或已接種本發明疫苗，該方法包含數個步驟，其中該診斷係使用特異於野生型病毒，而非由疫苗株(即3a、3b、7或E)表現之抗體。接種TGEV疫苗之動物與經TGEV感染之動物之差異性，亦可使用RT-PCR決定，序列標記係於位置6752、18997、20460與21369引入重組TGEV基因體，其分別編碼G、C、T與C。
接種疫苗動物與經野生型PRRSV感染之動物之差異，可使用特異於重組病毒中未出現之蛋白之抗體而決定。
棘蛋白(S)基因一般具有缺點，僅提供呼吸道或腸道之一者之趨性。然而，技術上所述之植株則可提供呼吸道與腸道雙重趨性。然而，此S基因並未提供相對應病毒於細胞培養物中或體內高效價之表現，或缺乏雙重趨性，在細胞培養數代後。目前為止，並無S基因描述可提供呼吸道與腸道雙重趨性，在豬睪丸(ST)細胞組織培養中分代相當穩定，並提供TGEV之高效價(>108 )，當培養於ST細胞之組織培養物時，且不會喪失體外雙重趨性。
因此，在本發明之另一觀點係相關於一種核酸，其包含一序列，具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO: 1具有至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織。更佳為，該核酸包含如SEQ ID NO: 1所示之序列。
TGEV感染動物呼吸道與腸道組織之能力，係以範例17所述決定，使用ST細胞上之溶菌斑效價測定試驗，其中培養之ST細胞係經由感染後2天之感染動物體組織所得之病毒感染。在此情況下，由ST細胞獲得之病毒效價，可作為經感染動物體內重組TGEV之活性指標。
在另一實施例中，上述之核酸包含一序列，具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO:1具有至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織，不包含編碼PRRSV之ORF5之序列或編碼其中和性表位之片段。
在本發明之另一觀點中，係相關於一種載體，包含上述核酸，具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織。在一較佳實施例中，這些載體可為cDNA載體，更佳為BAC-TGEV載體。在另一較佳實施例中，該載體可於宿主細胞中複製該核酸。本發明亦相關於一種宿主細胞，包含上述之載體。
本發明之另一觀點為，該棘蛋白係由具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列編碼，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織。
本發明更相關於一種病毒顆粒，包含如上所述之核酸。
此外，一包含上述核酸之醫藥製劑，該核酸具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織、一包含此核酸之載體、一包含此載體之宿主細胞，或由此核酸編碼之棘蛋白，皆為本發明之觀點。
此外，本發明更包含一疫苗，含有具有與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列，其中該與SEQ ID NO: 1至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；以及具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織、一包含此核酸之載體、一包含此載體之宿主細胞，或由此核酸編碼之棘蛋白。
圖示簡要說明：
第1圖顯示小豬在體內接種表現PRRSV Gp5之rTGEVs後，體重測量之結果。小豬係接種表現Gp5之rTGEVs，使用TRS3a (Δ3-TRS3a -ORF5；方形標記)或TRS22N (Δ3-TRS22N -ORF5；三角形標記)。小豬體重係於感染PRRSV後1、2、3與4週測量。接種表現PRRSV Gp5之重組病毒之小豬會有效地增加體重(即正常發育)，其中該接種控制組(“C-”)之小豬則顯示出發育缺陷，僅有些許體重增加。
第2圖顯示ELISA試驗之結果，偵測特異於PRRSV N(ORF7)之抗體。經表現PRRSV Gp5之rTGEVs(不論是Δ3-TRS3a -ORF5或Δ3-TRS22N -ORF5)感染之小豬，或是經未表現ORF5與ORF6之病毒載體感染之小豬(未接種疫苗控制組)之血清樣本，係於PRRSV感染後2、3與4週後收集。無或僅有少量之PRRSV蛋白N可於接種疫苗小豬中偵測到，在小豬經PRRSV感染後，與未接種疫苗控制組相較。因此，當Δ3-TRS3a -ORF5可提供對抗PRRSV之完整保護，Δ3-TRS22N -ORF5則可提供對抗PRRSV之部分保護。相對地，控制組之動物並無法提供對抗PRRSV之保護。
第3圖顯示北方墨漬(Northern-blot)之分析，顯示表現PRRSV Gp5之rTGEVs之穩定度。表現Gp5之重組TGEV病毒(使用不論是TRS3a 或TRS22N )係於組織培養物中分代。ST細胞係以第2代(p2)與第5代(p5)之病毒感染。如圖所示，p2病毒會表現Gp5mRNA，其中p5病毒含有缺失現象，不會表現Gp5 mRNA。
第4圖顯示編碼pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 之cDNA之圖示結構。如圖所示，異源性PRRSV基因ORF5與ORF6係選殖至同一rTGEV病毒性載體上。
第5圖顯示PRRSV之Gp5(ORF5)於ST細胞中之表現，該細胞經表現PRRSV Gp5與M蛋白之TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )感染，以免疫螢光分析評估(係使用特異於TGEV N蛋白之抗體觀察病毒(紅色)，以及使用特異於PRRSV ORF5(Gp5)蛋白之抗體觀察Gp5表現細胞(綠色))。在組織培養20代之後(包括複製步驟)，該病毒係回收，並使用於感染ST細胞。此分析顯示80%之感染細胞會表現Gp5，以及100%之這些細胞為M蛋白陽性(圖上未顯示)。此圖亦顯示該雙順反子建構物具有增進之體外穩定性，並在培養中分代20代之後仍維持穩定。
第6圖顯示第5圖經感染細胞之FACS分析結果。特異於TGEV N蛋白之抗體係用於偵測重組病毒，其中Gp5表現細胞係使用特異於Gp5之多價抗體觀察。此資料清楚顯示80%經表現有PRRSV Gp5與M蛋白之重組TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )感染之細胞，在組織培養分代20代之後(包括複製步驟)，仍會表現PRRSV Gp5。此現象再度顯示表現有PRRSV Gp5與M蛋白之rTGEV之體外穩定性。
第7圖為RT-PCR分析之結果，顯示表現有ORF5與ORF6(M)之重組TGEV之穩定性，在ST細胞中分代後。該重組TGEV係於組織培養物中分代20次。由培養細胞中回收之病毒為溶菌斑植株，且6個植株(c1至c6)表現之mRNA，係以RT-PCR決定。如圖所示，100%之植株皆表現mRNA-ORF5與mRNA-ORF6。此結果顯示表現有ORF5與ORF6之重組TGEV之基因體，可於細胞培養物中分代20次後，仍維持穩定。
第8圖顯示西方墨漬(Western blot)分析結果，偵測PRRSV Gp5蛋白(ORF5；左方墨漬)與M蛋白(ORF6；右方墨漬)於豬睪丸細胞之細胞裂解物中之表現，該細胞經重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) (圖中縮寫為rTGEV-SPTV -ORFs5+6)，或控制組病毒(rTGEV-SPTV -FL)感染。此外，數個控制組係用於西方墨漬(“mock”：無病毒感染之豬睪丸細胞；“PRRSV”：經純化與濃縮之野生型PRRS病毒；“MA104+PRRSV”：非洲綠猿腎細胞株，經野生型PRRS病毒感染)。各蛋白可於裂解物中偵測，得自經重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 感染之細胞、經PRRSV病毒感染之細胞，以及經MA104+PRSSV感染之細胞)，如箭頭所示。
第9圖顯示體內接種後，表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV成長分析。使用於此分析之病毒含有S基因，如SEQ ID NO: 1所示，提供腸道與呼吸道趨性。該圖顯示病毒於取自接種疫苗之小豬之肺部(圓形標記)與腸道(方形標記)之ST細胞中之成長動力學。組織樣本係於接種表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV後1、2、3與4天後收集。
第10圖顯示表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )之穩定性分析結果，在體內投以回收自豬隻之病毒後。抗體係使用於免疫螢光試驗中，以偵測PRRSV Gp5(上圖之綠色部分)、PRRSV M(下圖之綠色部分)，及TGEV N(紅色部分)陽性ST細胞，經回收自接種疫苗小豬之肺部之病毒感染。結果顯示表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV相當穩定，甚至在體內接種並自接種疫苗動物體內回收後仍是。該資料顯示80%之經感染細胞會表現Gp5蛋白，且100%之經感染細胞亦會表現M蛋白。
第11圖為流程圖，顯示使用重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，組成二疫苗配方。
第12圖為一表格，顯示重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，在經由鼻內路徑接種2×107 pfu/ml之兩天大小豬之目標組織中(肺)之複製與繁殖之評估。此結果由病毒效價測定與組織學決定。
第13圖為免疫組織化學圖，分別得自第1組與第2組豬隻之肺部組織切片，顯示冠狀病毒感染之間質性肺炎。該切片特徵為肺泡壁增厚，由於淋巴球與巨噬體滲入，且肺泡空間被單核球滲入物填滿(淋巴球與巨噬體)，有時是多形核嗜中性白血球。
第14圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗-gp5抗體，於接種經修飾活疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相較。D0 PV之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗-gp5抗體存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試：p值<0.05)。
第15圖顯示特異性免疫過氧化酶單層試驗(IPMA)之結果，用於偵測豬肺泡肺噬菌體中之PRRSV，該豬隻經得自接種疫苗與控制組豬隻之血清樣本感染。
第16圖顯示抗-TGEV(圖A)與抗-PRSSV抗體(圖B)之偵測結果，藉由間接ELISA，以有色受資之吸收波長展現。“Vacc.”代表由接種疫苗動物獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清，“CP”與“CN”分別代表陽性與陰性控制組。由接種疫苗與控制組動物獲得之血清係稀釋60-倍。
第17圖反映對於TGEV與PRSSV有陽性免疫反應之動物百分比，使用1:60之稀釋倍數。圖A為一摘錄結果之表格，其中該圖顯示陽性動物之百分比，以圖示形式(圖B為抗-TGEV，圖C為抗-PRRSV)。“Vacc.”代表由接種疫苗動物獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清。
第18圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗-gp5抗體，於接種去活性疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相較。D0 PV之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗-gp5抗體存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試：p值<0.05)。第19圖顯示定量即時RT-PCR(qRT-PCR)之結果，用於定量血清樣本中之PRRSV效價，該樣本或得自接種疫苗或未接種疫苗之動物中。
第20圖顯示編碼ORF5-LIMP-II融合蛋白之cDNA，以及其對於感染細胞抗原呈現之作用。第21圖顯示編碼Ub-ORF5融合蛋白之cDNA，以及其對於感染細胞抗原呈現之作用。第22圖顯示重組TGEV與嵌合性S蛋白之建構。該圖顯示S基因與原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV與TGEV-PUR46-C11，其5’序列區域之差異性(請見左圖上方)。圖中標示出之核苷酸反映了該二序列之不同，而右圖垂直部分則代表三個核苷酸被刪除。核苷酸之位置係由圖最上方數字指出。該圖更顯示數個S基因突變物之序列，與原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV相較。每一重組病毒之體內效價，在經感染新生小豬之腸道與肺部，亦於圖中指出。
第23圖顯示原始TGEV與重組TGEV-PUR46-S7.1之成長動力學。新生三天小豬接種3×108 pfu每隻小豬劑量後，係測量這些病毒之成長。動物係於指定天數下犧牲，每克組織之病毒效價，係以ST細胞上之溶菌斑效價測定數決定。(■)，肺部之病毒；(●)，腸道之病毒。所指出之數值係對應於三獨立實驗之中間值。下列範例係說明本發明核酸之建構與使用。
範例1真核細胞生長
TGEV的生長、效價測定與純化係於ST(豬睪丸)細胞內進行，其為豬隻胎兒睪丸表皮細胞株(McCLURRIN與NORMAN，1966)。ST細胞得自L. KEMENY(National Animal Disease Centre，Ames，Iowa，USA)。質體轉染作用分析於幼體倉鼠腎臟細胞(BHK-21)內進行，係穩定表達豬胺胜肽酶N(aminopeptidase N)(BHK-pAPN)的基因(LAUDE等人，1990)。ST細胞培養於DMEM(杜氏培養液)，其添加10%胎牛血清(FCS)(GIBCO-BRL)、50 mg/mL慶大黴素、2 mM麩醯胺酸與1%非必需胺基酸。
將豬胺胜肽酶N譯碼基因穩定轉染於BHK-21(BHK-pAPN)並培養於DMEM(杜氏培養液)，其添加10%胎牛血清(FCS)(GIBCO-BRL)、50 mg/mL慶大黴素、2 mM麩醯胺酸與1%非必需胺基酸，並以Geneticine(G418)(1.5 mg/ml)為篩選試劑。
範例2利用質體電穿孔法進行細菌轉形作用
菌種： 以大腸桿菌DH10B(Gibco/BRL)(HANAHAN 等人，1991)作為所有欲建構質體之宿主。本菌種之基因型為：F- mcr AΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlac ZΔM15 Δlac X74deo Rrec A1end A1ara D139(ara ,leu ) 7697gal Ugal K λ- rsp Lnup G。
製備電穿孔法勝任細菌： 欲增量與生產電穿孔法勝任E. coli DH10B細菌，將細菌培養於SOB培養基。將新鮮培養皿中挑出之菌落培殖於10 mL SOB培養基中(20 g/L胰化蛋白、5 g/L酵母菌萃取物、0.5 g/L NaCl)，並於37℃下搖晃培養12 h。取2 mL培養液加入1 L SOB培養基中繼續培養，並於37℃下培養至600 nm光學密度值介於0.8與0.9吸光單位之間。隨後培養基於冰上冷卻20分鐘，且細菌於4℃下以Sorvall GSA轉子進行4.000×g離心15分鐘。將細菌再懸浮於1 L冷的10%甘油中。細菌懸浮液再次離心，並再懸浮於500 mL冷的10%甘油中。細菌經沈降並再懸浮於250 mL冷的10%甘油中。最後，細菌經離心並再懸浮於3 mL 10%甘油。最終懸浮液以50 μL及100 μL體積分裝，並保存於-70℃直到電穿孔法進行。細菌轉形作用效率之計算係利用電穿孔法並以一已知濃度之pBluescript質體做為參考，發現其效率為每微克DNA約109 菌落且具再現性。
以質體電穿孔法進行細菌轉形作用： 以50 μL轉形作用勝任細菌混合1 μL的各反應混合物，或將10 ng之經純化質體加入細菌中，並於冰上培養1 分鐘。隨後，將混合物移至0.2 cm電穿孔匣(Bio-Rad)中，並於“基因脈衝”電穿孔儀(Bio-Rad)上，以2.5 kV電脈衝、25 μF與200 Ω進行轉形反應。在加入1 mL冷的LB培養基之後，細菌於37℃下搖晃培養1 h。以50至100 μL之間的經轉形細菌懸浮液種植於LB(Luria-Bertani培養基)固體培養皿(15 g/L瓊脂)，其添加胺芐青黴素(ampicillin)(100 μg/mL)或氯黴素(chloramphenicol)(34 μg/mL)。細菌於37℃下生長16 h(BULLOCK等人，1987)。在質體的產生與純化方面，細菌以質體進行轉形作用，具備胺芐青黴素或氯黴素抵抗力者可於培養皿上形成單獨菌落，並於液體LB培養基中繼續培養，其添加100 μg/mL胺芐青黴素或34 μg/mL氯黴素。範例3PCR產物之選殖質體以pGEM-T(Promega)質體選殖PCR產物。此質體含有T7與SP6細菌病毒驅動子並被LacZ基因隔開，且在多重選殖序列內存在兩個突出的T序列。此質體以胺芐青黴素抵抗基因進行篩選。範例4DNA操作
選殖與限制酶： 在DNA操作與選殖方面，限制酶Bam HI、Bbs I、Blp I、Eco RI、Mlu I、Swa I、Xcm I、Xho I係購自Roche或New England Biolabs。DNA末端去磷酸化之進行係利用蝦鹼性磷酸酶(SAP)(USB)。DNA接合酶使用如T4病毒DNA接合酶(New England Biolabs)。所有限制酶、去磷酸化反應與DNA接合作用的進行係採用標準程序，如前人所述(SAMBROOK等人，1989)。
聚合酶連鎖反應(PCR)： 欲由模板或常見之質體進行DNA增量，以50-100 ng質體DNA混合相應之寡核苷酸(10 μM)、0.25 mM脫氧核苷三磷酸(ATP、GTP、TTP與CTP)、1.25 mM MgCl2 、PCR緩衝液(10 mM Tris-HCl，pH 8.3、50 mM KCl)與2.5 U Taq Gold DNA聚合酶(水生棲熱菌)(Roche)使最終體積為50 μL。反應以GeneAmp PCR System 9600熱循環機(Perkin Elmer)進行。
以瓊膠電泳分離DNA： 欲分離DNA片段，使用1%瓊膠與溴化乙錠(1 μg/mL)並溶於1X TAE緩衝溶液(40 mM Tris-乙酸鹽、1mM EDTA)。
DNA純化： 以抗生素篩選生長之細菌質體，其純化係利用“Qiaprep Spin Miniprep kit”(Qiagen)製備小量質體DNA，或“Qiafilter Midi-Plasmid Kit”系統(Qiagen)製備大量質體DNA。由瓊膠上取得的DNA，其純化係利用“QiaEx II Gel Extraction Kit”系統(Qiagen)。PCR產物之純化，係利用“QIA quick PCR Purification Kit”(Qiagen)進行。所有過程均依操作說明進行。
範例5RNA分析以TGEV殖株PUR46-MAD感染所產生的RNA分析方面，以60 mm直徑培養皿(NUNC)培養，並鋪滿單層ST(豬睪丸)細胞，並以MOI[感染增殖率]=1之病毒接種數進行感染。細胞於16 hpi[感染後時數]進行溶解，係利用“RNeasy Mini Kit”(Qiagen)並依操作說明進行(Qiagen)。RNA經純化並且再懸浮於40 μL經DEPC[焦碳酸二乙酯]與20 U RNAse抑制劑(Roche)處理之水中。
範例6感染性TGEV之cDNA殖株轉染作用與回收BHK-pAPN細胞(DELMAS，1994)於杜氏培養液(DMEM)中生長，其添加2%胎牛血清(FCS)並以Geneticin(G418)(1.5 mg/ml)作為篩選試劑。BHK-pAPN細胞於直徑35-mm培養皿內長至60%滿，並以15 μl或12 μl lipofectin(GIBCO Life Technologies)或lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染10μg或4μg pBAC-TGEVFL -SPTV-TRS3a-ORF5-TRS22N-ORF6(C306T)質體，係依據操作說明進行。細胞培養於37℃、5% CO2 達6 h後，以新鮮並含有5%(vol/vol)FCS的DMEM更換轉染培養基。兩天後(意指第0代)，收集細胞上清液，並分代(passaged)新鮮的ST單層細胞四次，以增加rTGEV效價(titer)。病毒效價之決定係利用溶菌斑效價測定(plaque titration)。
或者，ST細胞培養於25 cm2 培養角瓶並於含10% FCS之DMEM(杜氏培養液)中長至90%滿，每個細胞以MOI[感染增殖率]=1之溶菌斑形成單位[pfu]進行感染。上清液於48小時後回收，並以溶菌斑限制稀釋法進行效價測定。
溶菌斑效價測定： 病毒之效價測定係利用溶菌斑限制稀釋分析法，以定量ST細胞的感染顆粒數。ST細胞培養於24孔培養皿中達90%滿。重組TGEV病毒依序稀釋10倍(10E-1、10E-2、10E-3、10E-4、10E-5、10E-6等)。將不同的病毒稀釋液加入24孔培養皿的每孔內，並於37℃、5% CO2 條件下培養1小時。之後，移除含病毒ST單層細胞之上清液，並迅速將瓊膠覆蓋於單層細胞上。覆蓋瓊膠之製備係使用1部分2X DMEM(杜氏培養液)與1部分1%經純化之瓊膠並溶於ddH2 O。細胞覆蓋後，多孔培養皿於室溫下靜置15分鐘以固化凝膠，隨後放入37℃、5% CO2 之經控管培養箱中48小時。欲計數病毒溶菌斑，以10%福馬林固定經感染的ST單層細胞，再以0.1%結晶紫染色30分鐘。計算溶菌斑數之前，每孔以去離子水清洗並於室溫下乾燥，並決定病毒效價。TGEV與PRRSV蛋白表達之分析係利用標準免疫螢光分析法。
範例7rTGEV之產生豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬於Purdue株族群，1946年取自美國印第安那(DOYLE與HUTCHINGS，1946)。病毒已適應於細胞培養(HAELTERMAN與PENSAERT，1967)並由E.H.BOHL提供(Ohio State University，Wooster Ohio)。本發明TGEV分離株已於ST細胞中分代115次，並經Luis Enjuanes博士實驗室連續選殖五次(Centro Nacional de Biotecnologia，Madrid，Spain)。所篩選之殖株稱為PUR46-CC120-MAD，簡稱PUR46-MAD。其為減毒病毒，並可於細胞培養中生長良好，且效價介於108 與109 PFU/mL之間。
rTGEV病毒產自pBAC-TGEV建構物，其含有TGEV有毒種PUR-C11(SC11 )之S基因，如所述(ALAMAZAN等人，2000；GONZALEZ等人，2002)。減毒品系PTV(SPTV )之S基因病毒(譯碼TGEV棘蛋白)係源自相應之pBAC-TGEV載體，其所攜帶之SC11 基因經呼吸道種之SPTV 基因置換。範例8表達PRRSV Gp5與M蛋白之重組TGEV載體之建構欲增加TGEV單基因體之選殖能力，係剔除全長cDNA殖株中的非必需基因ORF3a與ORF3b，產生一經刪除之TGEV基因體。將編碼PRRSV蛋白Gp5與M之異種ORF5與ORF6基因插入cDNA建構物中，取代經刪除之TGEV ORFs 3a與3b。
將ORF5(606nt)(SEQ ID NO: 2)選殖至cDNA建構物，以置換TGEV基因3a與3b。基因以PCR進行增量，使用寡核苷酸PpuMI-ORF5 VS(5’-AACAGGTCCTACCATGAGATGTTCTCACAAATTGGGG-3’)(SEQ ID NO: 4)與Blp-ORF5 RS mut(5’-CCGCTAAGCCTAGGCTTCCCATTGCTCAGCCGAAGTCC-3’)(SEQ ID NO: 5)。PCR產物以Ppu MI與Blp I切割並選殖至質體pSL-TGEV-AvrII之相同限制酶位置，其包含TGEV 3a與3b刪除之基因體nt 22965至25865，並產生質體pSL-AvrII-Δ3-PpuMI-ORF5。欲取得具感染性cDNAs，質體以Avr II切割，並將含有ORF5之插入子選殖至pBAC-SC11 或pBAC-SPTV (PacI/MluI)之相同限制酶位置，以分別取得具備腸道內與呼吸道內趨性(tropism)之載體。pBAC質體與具感染性TGEV cDNA殖株之基因序列如先前所揭示(WO01/39797)。
PRRSV Olot91種之ORF6(SEQ ID NO: 3)係以重疊法PCR進行增量，由於選殖上的限制，故導入一啞突變(silent mutation)以剔除Avr II限制酶位置，並考慮Sus scrofa 密碼子的使用。在初步PCR部分，使用寡核苷酸BlpIORF6 VS(5’-CGGCTGAGCAATGGGAAGCCTAGAAAATTATTACATATGGTATAACTAAACAAA ATGGGAAGCCTAGACGATTTTTG-3’)(SEQ ID NO:6)，劃底線序列為TRS22N 及ORF6-C306T-RS(5’-GCCGGCCTAGA CAACACAATC-3’)(SEQ ID NO: 7)。利用類似步驟，在二次PCR中，使用寡核苷酸ORF6-C306T-VS(5’-GATTGTGTTGT CTAGGCCGGC-3’)(SEQ ID NO: 8)及BlpIORF6rs new(5’-GCTAAGCTTACCGGCCATACTTGACGAGG-3’)(SEQ ID NO:9)。利用這些PCR產物及寡核苷酸BlpIORF6 VS與BlpIORF6rs new，以獲得最終產物(574 nt)。此PCR產物以Blp I切割並選殖至pSL-AvrII-Δ3-PpuMI-ORF5之相同限制酶位置，產生質體pSL-TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 。欲獲得具感染性cDNA pBAC-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，質體pSL-TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 係以Avr II切割，並將含ORF5與ORF6之插入子選殖至pBAC-SPTV (PacI/MluI)之相同限制酶位置(第4圖)。利用相同選殖步驟，以獲得編碼腸道內趨性TGEV之cDNA(適應於細胞培養)，可表達PRRSV Gp5與M。
具呼吸道內趨性之重組病毒，rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，係經回收並進行三次溶菌斑選殖。ORF5與ORF6之mRNAs表現以RT-PCR確認。篩選具表達能力之殖株，經細胞培養兩代後，分別偵測ORF5與ORF6之mRNA表現，確認病毒穩定存在。儘管如此，欲改善表現量，將重組病毒適應於ST細胞，再進行兩次溶菌斑選殖步驟。病毒殖株Gp5表達之評估係利用免疫螢光分析(請見第5圖)，並定量表達Gp5之經感染細胞。經篩選之病毒(rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )可於80%之經感染豬睪丸(ST)細胞中大量表達Gp5，係以螢光激發細胞分選法(FACS)進行評估。
範例9體外研究以確認TGEV病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 欲確認重組TGEV病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，進行免疫螢光分析與西方墨點分析，以偵測病毒載體所產生不同PRRSV蛋白gp5與M之表達。
免疫螢光分析 ST細胞於8或12孔培養皿中長至30%滿。以MOI=5 pfu/細胞進行感染，細胞於37℃之MEME(最小需求培養基)中生長，內含2%胚胎殖株III血清(購自Hyclone)。感染8小時後，移除接種體(inoculum)，細胞以PBS清洗並於室溫下加入4%三聚甲醛固定30分鐘。在雙標定方面，其中一級抗體源自小鼠與兔子，一級抗體於含PBS-SFB 20%/0.2%之皂苷稀釋劑中混合。抗體於室溫下吸附90分鐘，隨後細胞以PBS清洗三次。其後，細胞於室溫下培養於1:1000稀釋之抗-兔子與抗-小鼠二級抗體中達30分鐘，其連接羅丹明(rhodamine)與螢光素(flouresceine)。培養皿以PBS清洗五次，固定後進行螢光顯微鏡分析。
西方墨點分析 ST細胞於12.5 cm2 組織培養角瓶內長至100%滿。以MOI=5 pfu/細胞進行感染8小時，細胞於37℃之MEME(最小需求培養基)中生長，內含2%胚胎殖株III血清(Hyclone)。細胞以1X上樣緩衝液破壞。細胞裂解液以12.5%梯度之十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。經分離之蛋白以0.02% SDS轉移至PDVF薄膜(100 V；Amp限值0.30；時間1:30小時)。轉移至PDVF薄膜後，室溫下以PBS：牛奶5%進行阻斷(blocking) 2小時，隨後4℃隔夜培養於1:100稀釋之Gp5 PRRSV蛋白(8676)多株抗體或1:50稀釋之M PRRSV蛋白(7718)多株抗體。反應後，PDVF薄膜以PBS：牛奶5%:0.05 Tween-20清洗三次。PDVF薄膜隨後培養於山羊-抗-兔子抗體1小時，其連接過氧化酶，之後以PBS：牛奶5%:0.05 Tween-20清洗五次。經結合抗體以Inmobilon Western Chemiluminescent HRP受質(Millipore)偵測。結果顯示於第8圖。PRRSV gp5與M蛋白可於經重組病毒感染之ST細胞或經PRRS野生病毒感染之MA104細胞裂解液中測出。MA104細胞亦可作為控制組，此系統較類似細胞感染培養模式，亦即，經rTGEV-ORF5-ORF6病毒感染之ST細胞。重組TGEV病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，於組織培養分代20次後仍維持穩定，即使自感染小豬中回收亦是如此(請見第5與6圖)。在組織培養分代20次以後，病毒仍表現PRRSV ORF5與ORF6基因(請見第7圖)。
範例10經修飾活疫苗(MLV)之產生反應始於rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6之主要種子(Master Seed)病毒，此經修飾活疫苗含有豬睪丸(ST)細胞上清液，係經重組rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6感染並表達重組PRRSV蛋白gp5與M，其產生如下(亦請見第11圖)：rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6病毒係取自十個100 cm2 培養皿之感染ST細胞，其主要種子病毒具備MOI=1[感染增殖率]之高感染力。上清液經移除、離心並冷凍於-80℃(±10℃)。重組病毒以效價測定方式取得。所得上清液重組病毒以1:10 DMEM培養基稀釋產生最終劑型~1×107 PFU/ml。此疫苗配方所組成MLV進一步以活體內實驗評估(請見範例12與13)。
範例11去活性(死)疫苗之產生含有裂解之豬睪丸(ST)細胞萃取物之去活性疫苗，該豬隻經表現重組PRRSV蛋白gp5與M之重組rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6感染，其產生如下(亦請見第11圖)：該rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6抗原係得自以高MOI[感染增殖率]3之主要種子病毒，感染10盤100 cm2 培養皿之ST細胞。細胞經回收，以磷酸鈉緩衝溶液(PBS)清洗，並沈澱。細胞沈澱物係凍於-80℃(±10℃)。考慮到約70%之經感染ST細胞會產生gp5與M重組蛋白，該沈澱物係懸浮於pH 8.3之碳酸氫鈉水溶液中，濃度為3.9×106 經感染生產細胞/mL。細胞經裂解，細胞萃取物於4℃，以15000×g離心30分鐘。上清液以雙乙亞胺(BEI)去活性，最終濃度為5%，期間為72 h，於37℃連續攪拌。去活性抗原係以1:3比例，經豬隻環狀病毒(PCV)第1型-第2型去活性疫苗稀釋(FENAUX等人，2003；FENAUX等人，2004)，其已具有20%之硫化脂質-環糊精佐劑(SLCD；得自Fort Dodge，Iowa，USA)，如下：32 mL ST-rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6去活性抗原，具3.7×106 經感染生產細胞/mL，與64 mL之PCV Type1-Type2疫苗混合。該混合物係於室溫下攪拌3.25 h。此疫苗配方(去活性)已經體內實驗(請見範例14)評估。
範例12表現二異源性PRRSV蛋白之重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6之小豬體內疾病評估此評估係進行，以評估rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6在標的組織(腸與肺臟)之體內複製與繁殖，藉由病毒效價測定，及免疫組織化學分析，以及異源性PRRSV蛋白(Gp5與M)之表現，且這些組織之TGEV基因體，係以免疫組織化學分析評估。該評估更進一步確認，rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6會於兩天大小豬之肺部複製，該小豬經由鼻內路徑接種2×107 pfu/ml之病毒。係評估肺部與組織病理學切片之病毒效價。
17隻兩天大小豬，為Large White x Belgian Land race混種，不含對抗TGEV與PRRSV之抗體，係經挑選並分為三組。第1組之豬隻(7動物)係接種2×107 pfu/ml之控制組病毒rTGEV-SPTV -FL，第2組豬隻(7動物)係接種2×107 pfu/ml之重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6，而第3組豬隻(3動物)代表控制組。自接種後0天起，每一組之動物係犧牲並切片，如表1所示。
於接種後第1、2、3與4天，第1組與第2組之豬隻係犧牲，而第3組豬隻則於接種後第4天犧牲。在肺臟切片後，係以巨觀方式檢驗。該肺臟切片之形狀與內容係描述，並依據描述於HANNAN 等人，1982之評分系統評估。一般稱之為肺臟切片之肺部積分，係如第12圖所示。
由這些動物獲得之肺臟組織樣本，係以PBS均質化，以決定標的組織(肺臟)之重組病毒效價。回收自肺臟組織之病毒係於ST細胞單層細胞上，以溶菌斑形成單位(pfu/ml)進行效價測定。
組織樣本亦置於甲醛(10%經緩衝-福馬林)，用於組織病理學研究。2-3 mm之組織樣本係分配於塑膠盒中，於一系列分級酒精中脫水，並以石蠟包埋，使用自動組織處理器系統(Cytadel)。組織塊係製備，並由這些組織塊中切下4-5 μm切片，使用自動化切片機(Finesse)。這些切片係以蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin)染色，使用自動化染色機(Linistain GLX)。
其他之石蠟包埋切片係置於矽化載玻片中，並製備用於免疫組織化學分析(IHC)技術，以偵測重組病毒表現之TGEV與PRRSV抗原。該切片係加熱至60℃，10分鐘，直至石蠟融化。之後該樣本係浸入對二甲苯10分鐘二次，以及絕對乙醇10分鐘二次。在將樣本於黑暗中浸入內生性過氧化酶抑制溶液(甲醇+3%(v/v)過氧化氫(H2 O2 )) 30分鐘後，樣本以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次，之後將樣本浸入檸檬酸鈉溶液中15分鐘，該溶液預先以微波加熱，之後以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次。之後，該樣本係浸入TBS(0.05 M)-BSA溶液中10分鐘，以阻斷非特異性結合。在加入一級抗體之前，係加入2滴Avidin Solution(Vector Laboratories，Blocking Kit)至樣本中，之後靜置15分鐘，之後加入2滴Biotin Solution(Vector Laboratories，Blocking Kit)，並靜置15分鐘。該樣本之後浸入一級抗體溶液3BB3單株抗體，對抗TGEV M蛋白(1/100稀釋)，並於4℃培養至隔日。該樣本以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次，之後浸入二級抗體溶液抗小鼠IgG(Vector Laboratories，Vectastain ABC Kit)(1/100稀釋)中1小時。以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次後，將其浸入Avidin-Biotin-過氧化酶溶液(Vector Laboratories，Vectastain ABC Kit)中1小時，再以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次。將樣本浸入DAB(3,3’-二胺基聯苯胺，SIGMA)溶液中7分鐘，以Tris-Saline緩衝溶液(TBS)(0.05 M)清洗三次，將其浸入蒸餾水10分鐘。該樣本之後以Hematoxylin染色1-2分鐘，浸入蒸餾水中10分鐘，浸入96%乙醇中5分鐘，浸入100%乙醇中5分鐘，最後浸入xylol中5分鐘。在以光學顯微鏡評估該樣本之前，該樣本係以疏水性置放介質(mounting medium)製備，並覆蓋上玻璃。
TGEV載體S蛋白之偵測，該樣本得自第1組與第2組豬隻，係以免疫組織化學分析確認，顯示該重組病毒於豬隻肺臟中複製，在經由鼻內路徑接種疫苗後(請見第12圖)。肺臟樣本與組織病理學切片中偵測之病毒效價，發現於組織切片中，確認了這些結果。由組織病理學檢查偵測出之間質性肺炎，可與病毒感染相關，且為冠狀病毒感染之特徵切片(第1組與第2組豬隻之一之組織切片免疫組織化學分析範例，顯示第13圖)。
免疫組織化學分析TGEV抗原之同步偵測，以及病毒效價測定重組病毒之高效價，確認了肺臟重組病毒之複製。此外，由於增進之穩定性，重組TGEV病毒可自接種疫苗小豬之肺臟與腸組織回收。由這些組織收回之病毒可繼續繁殖於ST細胞培養(請見第9圖)，該經回收病毒感染之ST細胞會表現Gp5(約80%經感染細胞)與M(約100%經感染細胞；請見第10圖)。
範例13rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6經修飾活疫苗於豬隻中對抗牧場單離PRRSV株Olot/91感染之效用評估進行此評量，以評估rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6之功效，其表達不同異源性PRRSV蛋白之經修飾活疫苗(MLV)，以預防一週大小豬之生殖與呼吸道病變，係以鼻內途徑投藥後進行牧場單離PRRSV株Olot/91感染。疫苗之功效係評估血清中所產生抗體(以ELISA、IPMA與血清中和反應分析)。
將39隻血清反應陰性或低TGEV與PRRSV抗體效價之一週大小豬分成三組。第1組豬隻(17隻動物)接種控制組病毒rTGEV-SPTV -FL，第2組豬隻(17隻動物)接種重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6，而第3組豬隻(5隻動物)則代表控制組。豬隻接種疫苗之進行係依據表2之實驗設計，其中“D0 ”代表一週大豬隻之第一接種日。
豬隻每個鼻孔接種0.5 ml病毒懸浮液，兩次鼻內途徑接種之體積共1 ml/小豬，第一次接種於一週大時進行，且第二次接種(再接種)於四週大時進行。選擇鼻內途徑可增加重組病毒於受感染豬隻標的組織(肺臟)的複製與繁殖。豬隻係隨機分組。所有豬隻均於首次接種後十週進行感染，感染時豬隻年齡為11週大。豬隻係經鼻內途徑感染PRRSV西班牙種(Olot/91)且104.7 -104.8 TCID50 /豬隻。感染係以站姿進行而非鎮靜狀態，並使用10 mL注射針。將接種物分成兩等分，每個鼻孔各一。採取鼻內途徑，因其被視為一般的感染途徑。
在接種與感染後，每日觀察豬隻臨床表徵以確認疫苗之安全性。一旦發現任何異常，即進行完整的臨床檢查。在感染後D0、D21與D28 PI進行血液樣本採集並取得血清，以決定血清效價並研究抗TGEV與PRRSV之免疫反應。
PRRSV感染之效用評估係利用競爭性ELISA INGEZIM PRRS gp5 Compac(INGENASA)測定特定抗gp5抗體之表現。利用一呈色受質(chromogenic substrate)，可偵測D0 PV(接種後)、D0 PI、D14 PI與D28 PI之經接種與控制組動物血清中特定抗gp5抗體之存在(第14圖)。利用D0 PV(其中未出現競爭現象)之吸光值計算每一血清樣本中的結合百分比，公式如下：
血清檢測樣品中，愈低之結合百分比代表愈高表現量之抗gp5抗體。如第14圖所示，感染14天後，相較於未接種控制組動物，經接種動物具備較高的抗gp5效價與較快速的抗體反應。
進行特定免疫過氧化酶單層細胞分析(IPMA)，其如WENSVOORT 等人(1986)所述，以偵測經感染豬隻肺泡巨噬細胞之PRRSV，其中血清樣本係取自本範例中之不同豬隻。WENSVOORT 等人(1986)所描述方法之唯一差別在於使用蛋白-A結合辣根(horseradish)過氧化酶作為二級抗體，而非綿羊抗豬之免疫球蛋白結合辣根過氧化酶。所得結果顯示於第14圖。
如第15圖所示，大多數豬隻在D28 PI時對於PRRSV呈現血清反應陽性。然而，在MLV接種動物組中，D14 PI時，16隻動物中有5隻(相符於31%)對於PRRSV呈現血清反應陽性，然而經rTGEV-SPTV -FL接種之控制組動物，D14 PI時未發現有血清反應陽性，顯示經接種動物對於PRRSV產生較快速的抗體反應。
範例14rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6死疫苗於豬隻中對抗牧場單離PRRSV株Olot/91感染之效用評估進行此評量，以評估rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6去活性次單元疫苗(死疫苗)之功效，其表達不同異種PRRSV之蛋白。使用去活性疫苗以預防豬隻生殖與呼吸道症候群(PRRS)，係以肌內(IM)途徑給予次單元疫苗後進行牧場單離PRRSV株Olot/91感染。疫苗之功效係評估預防情形或間質性肺炎(interstitial pneumonia)、病毒血症(viremia)以及血清中抗體誘發能力(以ELISA、血清中和分析(SN)等評估)。
在本效用分析中，表達PRRSV gp5與M蛋白之rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6去活性次單元疫苗，其產生係如範例11所述。
接種
將27隻六至七週大的豬隻分成兩組。第1組豬隻(14隻動物)接種PRRSV去活性-PCV疫苗(3ml，以IM途徑進行)兩次(分別為6-7週大時與3週後)，而第2組豬隻(13隻動物)係未接種疫苗之控制組豬隻。
接種後，每日觀察豬隻臨床表徵以確認疫苗之安全性。一旦發現任何異常，即進行完整的臨床檢查。在血清學研究方面，接種後(PV) D0、D21與D49進行血液樣本採集並取得血清，進行PRRSV、TGEV與PCV2之血清學檢查(請見以下所示)。由rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6疫苗所誘發之體液反應(humoral response)係利用間接式PRRSV ELISA分析，係利用PRRSV偵測抗gp5與抗M抗體，並以超高速離心濃縮作為塗佈抗原(第16圖B與第17圖C)。
PRRSV稀釋抗原於5±3℃隔夜陪養。清洗後，每孔表面以PBS、5% BSA Fraction V進行阻斷反應，並於37±1℃下陪養1 h。在D0、D21與D42 PV時，經接種與控制組動物以及PRRSV陽性與陰性控制組之血清以PBS、Tween-20 0.05%稀釋，並於37±1℃下培養1 h。清洗後，加入經PB5、Tween-200.05%(1:1000)稀釋之過氧化酶-結合蛋白A，並於37±1℃下培養1 h。最終清洗後，每孔加入呈色受質(鄰苯二胺(OPD))。反應因加入3NH2 SO4 而停止。培養皿利用ELISA微讀盤儀於450-nm濾鏡下判讀。
由rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6疫苗所誘發之體液反應係以上述之相同方法分析，並進行間接式PRRSV ELISA，其利用超高速離心濃縮TGEV作為塗佈抗原，而非PRRSV(第16圖A與第17圖B)。
欲評估rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6去活性疫苗中豬隻環狀病毒(PCV)第1型-第2型疫苗產生之體液反應，利用IPMA分析D0 PV、D49 PV與D0 PI(D63 PV)時之抗PCV2 ORF2抗體表現(請見上述)。此免疫學技術可定量經重組BAC-ORF2 PCV2桿狀病毒感染Sf9細胞中抗PCV2棘蛋白(ORF2產物)抗體之表現。
以感染增殖率=1(MOI)之重組桿狀病毒Bac-ORF2 PCV2感染Sf9細胞。經感染細胞於27±0.5℃下生長4天後固定。經接種與控制組動物之血清經PBS、Tween-80 0.05%稀釋並於37±1℃下培養1 h。清洗後，過氧化酶-結合蛋白A經PBS、Tween-20 0.05%(1:1000)稀釋並於37±1℃下培養1 h。最終清洗後，每孔加入呈色受質(3-胺-9-乙基咔唑)。反應因PBS清洗兩次而終止。當經感染細胞之細胞質呈現紅色時，表示反應為陽性。抗體效價與最高稀釋濃度倒數相符時即顯示為陽性反應。
在D0 PV時，大多數動物的抗PCV2抗體表現呈陰性(經接種動物為58%且控制組動物為92%)。在第二次免疫注射後(D49 PV與D63 PV)，控制組未經接種動物仍維持血清PCV2陰性反應，而經接種動物血清則轉換為PCV2(請見表3)。
感染 第二次接種六週後，兩組之所有豬隻均利用鼻內(IN)途徑感染牧場單離PRRSV株Olot/91(104.7 -104.8 TCID50 /豬隻)。在第0、7、12、20與27 PI天採血取血清以決定血清效價，並研究抗PRRSV之免疫反應(利用ELISA測定抗gp5與N蛋白抗體，以及SN檢測)。血清亦用於測量PRRSV之病毒血症，係利用定量式RT-PCR。
血清學研究 血清中和性抗體(NAb)係取自經接種與控制組動物D0 PV、D0 PI、D12 PI與 D27 PI之血液，並以血清中和分析法進行分析(SN；請見表4)。於感染前(D0 PV與D0 PI)，任何組別均偵測不到Nab。在D12 PI時，某些動物產生NAb(第1組(經接種動物)有21.4%，且第2組(未經接種動物)有23%)，然而，感染後27天可觀察到更高的Nab效價及更高數目的陽性動物(第1組有75%陽性，第2組有46%陽性)。
特定抗gp5抗體之表現係以競爭式ELISA INGEZIM PRRS gp5 Compac(INGENASA)分析，並依據操作說明進行。本方法係測量豬隻血清與經抗gp5-過氧化酶標定單株抗體(MAb)之間競爭結合重組gp5蛋白之能力，其事先塗佈於欲測試培養皿表面上。利用一呈色受質，偵測經接種與控制組動物之D0 PV、D0 PI、D14 PI、D21 PI與D28 PI血清中特定抗gp5抗體之表現(請見第18圖)。利用D0 PV(其中未出現競爭現象)之吸光值計算每一血清樣本中的結合百分比，公式如下：
較低結合百分比代表受測血清中含有較高量的抗gp5抗體。如第18圖所示，相較於未經接種控制組動物，感染後14天，經接種動物具備較高的抗gp5效價與較快的抗體反應。
欲定量血清(病毒血症)與肺部灌洗液中的PRRSV，於D0、D3、D7、D14、D20與D28 PI採血及分離血清，並保存於-80±10℃供分析之用。另外，於D27 PI時所有豬隻均犧牲並檢驗屍體。評估肺臟整體損害並進行肺部灌洗。欲取得肺灌洗液，找出肺臟並以100 mL PBS經由氣管導入肺臟，隨後溫和地按摩並將PBS吸至無菌試管中。肺臟灌洗液經分裝並保存於-80±10℃。由血清與肺臟灌洗液中純化RNA，係利用Nucleospin 96 RNA(Macherey-Nagel)套組，並依據操作說明進行。RNA樣本保存於-80±10℃。
欲定量PRRSV，進行即時RT-PCR技術(qRT-PCR)。首先，特定引子(順向引子(Olot91F): 5’ TTCCCTCTGCTTGCAATCG 3’(SEQ ID NO: 16)與逆向引子(Olot91R): 5’ GGATGAAAGCGACGCAGTTC 3’(SEQ ID NO: 17))，及探針(探針(Olot91S): 5’6-FAM-ACGGCTTTTAATCAAGGC-MGB 3’(SEQ ID NO:18))其5’端含有6-FAM作為報導染劑且3’端含有一MGB(次要溝部結合物)片段作為非螢光性中止劑，以上設計均使用Applied Biosystems’ Primer Express program進行PRRSV Olot/91基因體之67 bp片段增量反應。其次，純化PRRSV感染株之RNA，以獲得標準RNA，並將其調整至104 PRRSV TCID50 /μl RNA。將RNA分裝並保存於-80±10℃。試劑濃度與反應條件之最佳化係使用套組RNA UltraSenseTM One-Step qRT-PCR System(Invitrogen)。以純化之病毒RNA作為模板，於50℃下進行逆向轉錄反應30分鐘，並於95℃下進行本質改變反應5分鐘。PCR條件包含95℃、20秒的40個循環之去活性反應(denaturation)，及56℃、40秒之黏合反應(annealing)。qRT-PCR於7500 Real-Time PCR System熱循環儀內進行。所得結果以SDS 1.2軟體(Applied Biosystems)分析(請見第19圖)。
如第19圖所示，接種後，經接種動物於D14 PI時可觀察到血清PRRSV效價明顯下降(由911 PRRSV TCID50 /ml降至144 PRRSV TCID50 /ml)。於D20與D28 PI A時可觀察到更明顯的下降情形。
豬肺泡巨噬細胞取自經接種豬隻之肺臟灌流液，其所含病毒(9606.74 PRRSV TCID50 /ml灌流液)遠低於控制組豬隻(71518.33 PRRSV TCID50 /ml灌流液)。值得注意的是，經接種豬隻肺臟切片中PRRSV的含量(25%)低於控制組豬隻(66.6%)，顯示去活性疫苗降低PRRSV於標的組織中複製的能力。
在D27 PI時犧牲動物以取出肺臟，進行肺損傷之顯微鏡檢，並依據HANNAN等人(1982)所述之方法進行評分。表5係肺部評分之平均值，顯示控制組與經接種動物之間具有統計上差異。相較於經接種豬隻，控制組動物具備較高平均之肺部評分。
範例15表達ORF5-LIMP-II融合蛋白之載體該重組載體係經改造，使用如上所述之相同選殖步驟。融合蛋白之表現係由TRS-3a引導，該載體係設計為具腸道內趨性。該載體pBAC-SC11-TRS3a-ORF5-LIMPII(請見第20圖)係由選殖PRRSV ORF5，融合至豬隻LIMP-II(GeneBank取得號AAS55916)之末20 aa(SEQ ID NO: 11)，其含有此蛋白之溶酶體標靶序列，而得。穩定之重組病毒係回收自pBAC-SC11-TRS3a-ORF5-LIMPII cDNA。
Gp5-LIMPII之表現係以西方墨漬與免疫螢光分析偵測，使用溶酶體pH之特異性抑制劑(亦即，氯喹(chloroquine)、NH4 Cl)。可觀察到高量與穩定之抗原表現。此特異性融合蛋白亦由表現Gp5-LIMPII與M蛋白之TGEV載體表現。此會對雙順反子載體之穩定性產生更進一步之增進。
範例16具S基因突變之重組TGEV殖株之建構係建構重組TGEVs之群聚物，僅於5’S基因不同，但其餘皆具有相同之序列。所有重組病毒皆產生自具感染性之相同TGEV cDNA殖株，具有如ALMAZ N 等人(2000)描述之序列，除了S蛋白係衍生自TGEV-PUR46-PTV單離物，具呼吸道內趨性(PENZES 等人，2001)。該重組TGEVs係如前所述建構(ALMAZ N 等人，2000)，使用具感染性cDNA，作為細菌人造染色體(BAC)。
二原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV(其感染呼吸道)與TGEV-PUR46-C11(其感染腸道與呼吸道)，在S基因之5’不同，如同第22圖(請見左圖上方)。標示出之核苷酸反映了該二序列間之不同，而右方垂直部分代表三個核苷酸缺失。此外，某些殖株亦具有6個核苷酸缺失，已存在於TGEV-PUR46-PTV之S基因之S蛋白中(PENZES 等人，2001)。起始自病毒rTGEV-SPTV ，重組病毒之聚集物係以連續引入存在於TGEV-PUR46-C11之S基因之序列而產生，而非將PTV引入rTGEV-SPTV 之S基因之序列(請見第22圖之序列)。深色框中之核苷酸代表該核苷酸已經修正。該重組病毒係經ST細胞上之溶菌斑純化三次，並於這些細胞上進行二次額外的分代細胞。由此獲得之病毒儲存液係使用作為Working Stocks[WS分代0，acronym WS(P0)]。在病毒於ST細胞上繁殖後，回收單離物之序列係決定，並如第22圖所示。
該病毒係供應至3天大之新生小豬。係顯示每一重組病毒在感染2-3天後，於肺臟或腸中之介質病毒效價。該殖株稱之為“R7殖株1”(或S7.1 )，顯示在小豬感染2-3天後，於肺臟或腸中呈現最高活性。
範例17經挑選具S基因突變之重組TGEV殖株之生長動力學重組TGEV病毒rTGEV-PUR46-PTV，rTGEV-PUR46-C11與TGEV-PUR46-S7.1之生長，係以ST細胞進行體外評估，並以小豬進行體內評估。
就體外研究而言，係評估TGEV-PUR46-C11(TGEV C11)與TGEV-PUR46-S7.1(TGEV7.1)感染ST細胞之效價。該ST細胞係接種來自Working Stock之病毒(於0代；請見上述範例16)，或於ST細胞上額外分代6次之病毒。病毒效價係經效價測定，使用ST細胞上之溶菌斑試驗。結果顯示於表6，代表三次單獨實驗之中間值。
如表6所示，TGEV-PUR46-C11與TGEV-PUR46-S7.1二者皆於ST細胞之細胞培養物上成長為高效價，即使在6代後仍無明顯活性喪失。就體內研究而言，3天大新生小豬係接種3×108 pfu TGEV-PUR46-C11(TGEV C11)與TGEV-PUR46-S7.1(TGEV7.1)於每隻小豬。小豬係以來自Working Stock之病毒(P0)，或於ST細胞上額外分代6次之病毒感染胞。動物係於接種後第2天犧牲，每克動物組織(腸或肺臟)之病毒效價係經效價測定，使用溶菌斑於ST細胞上。結果顯示於表7，代表三次單獨實驗之中間值。
顯示於表7之結果說明，二病毒在肺臟與腸中皆生長得很好，當動物經得自Working Stock(P0)之病毒感染後。此外，該病毒在感染前係於ST細胞上分代六次，生長為在二器官中具高效價。然而，在二器官中，S7.1 提供明顯較SC11 高之效價。
在另一實驗中，三天大新生小豬係接種3×108 pfu之rTGEV-PUR46-PTV、TGEV-PUR46-C11與TGEV-PUR46-S7.1，每隻小豬。動物係分別於接種後第1、2、3與4天犧牲，每克組織之病毒效價係以ST細胞上之溶菌斑進行效價測定(請見第23圖)。
如第23圖所示，rTGEV-PUR46-PTV僅具呼吸道趨性。此外，該病毒效價在體內四天並不穩定，而是逐漸降低(請見第22圖左圖)。TGEV-PUR46-C11與TGEV-PUR46-S7.1二者皆具雙重趨性，並可於呼吸道(肺臟)與腸道(腸)成長(請見第23圖)。然而，二器官中之TGEV-PUR46-C11效價於小豬體內四天內明顯降低，而TGEV-PUR46-S7.1之效價卻可維持幾乎穩定(在肺臟)，或僅降低些許，與TGEV-PUR46-C11(腸)相較。在任一情況下，由TGEV-PUR46-S7.1所得之病毒效價在二器官中較高，與得自TGEV-PUR46-C11者相較，亦即，該包含S基因S71 之重組TGEV，較TGEV-PUR46-C11具有更高之體外與體內穩定性。
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<223>　衍生自N基因之人造序列
<400>　19
第1圖顯示小豬在體內接種表現PRRSV Gp5之rTGEVs後，體重測量之結果。小豬係接種表現Gp5之rTGEVs，使用TRS3a (Δ3-TRS3a -ORF5；方形標記)或TRS22N (Δ3-TRS22N -ORF5；三角形標記)。小豬體重係於感染PRRSV後1、2、3與4週測量。接種表現PRRSV Gp5之重組病毒之小豬會有效地增加體重(即正常發育)，其中該接種控制組(“C-”)之小豬則顯示出發育缺陷，僅有些許體重增加。
第2圖顯示ELISA試驗之結果，偵測特異於PRRSV N(ORF7)之抗體。經表現PRRSV Gp5之rTGEVs(不論是Δ3-TRS3a -ORF5或Δ3-TRS22N -ORF5)感染之小豬，或是經未表現ORF5與ORF6之病毒載體感染之小豬(未接種疫苗控制組)之血清樣本，係於PRRSV感染後2、3與4週後收集。無或僅有少量之PRRSV蛋白N可於接種疫苗小豬中偵測到，在小豬經PRRSV感染後，與未接種疫苗控制組相較。因此，當Δ3-TRS3a -ORF5可提供對抗PRRSV之完整保護，Δ3-TRS22N -ORF5則可提供對抗PRRSV之部分保護。相對地，控制組之動物並無法提供對抗PRRSV之保護。
第3圖顯示北方墨漬(Northern-blot)之分析，顯示表現PRRSV Gp5之rTGEVs之穩定度。表現Gp5之重組TGEV病毒(使用不論是TRS3a 或TRS22N )係於組織培養物中分代。ST細胞係以第2代(p2)與第5代(p5)之病毒感染。如圖所示，p2病毒會表現Gp5mRNA，其中p5病毒含有缺失現象，不會表現Gp5 mRNA。
第4圖顯示編碼pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 之cDNA之圖示結構。如圖所示，異源性PRRSV基因ORF5與ORF6係選殖至同一rTGEV病毒性載體上。
第5圖顯示PRRSV之Gp5(ORF5)於ST細胞中之表現，該細胞經表現PRRSV Gp5與M蛋白之TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )感染，以免疫螢光分析評估(係使用特異於TGEV N蛋白之抗體觀察病毒(紅色)，以及使用特異於PRRSV ORF5(Gp5)蛋白之抗體觀察Gp5表現細胞(綠色))。在組織培養20代之後(包括複製步驟)，該病毒係回收，並使用於感染ST細胞。此分析顯示80%之感染細胞會表現Gp5，以及100%之這些細胞為M蛋白陽性(圖上未顯示)。此圖亦顯示該雙順反子建構物具有增進之體外穩定性，並在培養中分代20代之後仍維持穩定。
第6圖顯示第5圖經感染細胞之FACS分析結果。特異於TGEV N蛋白之抗體係用於偵測重組病毒，其中Gp5表現細胞係使用特異於Gp5之多價抗體觀察。此資料清楚顯示80%經表現有PRRSV Gp5與M蛋白之重組TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )感染之細胞，在組織培養分代20代之後(包括複製步驟)，仍會表現PRRSV Gp5。此現象再度顯示表現有PRRSV Gp5與M蛋白之rTGEV之體外穩定性。
第7圖為RT-PCR分析之結果，顯示表現有ORF5與ORF6(M)之重組TGEV之穩定性，在ST細胞中分代後。該重組TGEV係於組織培養物中分代20次。由培養細胞中回收之病毒為溶菌斑植株，且6個植株(c1至c6)表現之mRNA，係以RT-PCR決定。如圖所示，100%之植株皆表現mRNA-ORF5與mRNA-ORF6。此結果顯示表現有ORF5與ORF6之重組TGEV之基因體，可於細胞培養物中分代20次後，仍維持穩定。
第8圖顯示西方墨漬(Western blot)分析結果，偵測PRRSV Gp5蛋白(ORF5；左方墨漬)與M蛋白(ORF6；右方墨漬)於豬睪丸細胞之細胞裂解物中之表現，該細胞經重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) (圖中縮寫為rTGEV-SPTV -ORFs5+6)，或控制組病毒(rTGEV-SPTV -FL)感染。此外，數個控制組係用於西方墨漬(“mock”：無病毒感染之豬睪丸細胞；“PRRSV”：經純化與濃縮之野生型PRRS病毒；“MA104+PRRSV”：非洲綠猿腎細胞株，經野生型PRRS病毒感染)。各蛋白可於裂解物中偵測，得自經重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) 感染之細胞、經PRRSV病毒感染之細胞，以及經MA104+PRSSV感染之細胞)，如箭頭所示。
第9圖顯示體內接種後，表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV成長分析。使用於此分析之病毒含有S基因，如SEQ ID NO: 1所示，提供腸道與呼吸道趨性。該圖顯示病毒於取自接種疫苗之小豬之肺部(圓形標記)與腸道(方形標記)之ST細胞中之成長動力學。組織樣本係於接種表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV後1、2、3與4天後收集。
第10圖顯示表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV(pBAC-TGEVFL -SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) )之穩定性分析結果，在體內投以回收自豬隻之病毒後。抗體係使用於免疫螢光試驗中，以偵測PRRSV Gp5(上圖之綠色部分)、PRRSV M(下圖之綠色部分)，及TGEV N(紅色部分)陽性ST細胞，經回收自接種疫苗小豬之肺部之病毒感染。結果顯示表現PRRSV Gp5與M之重組TGEV相當穩定，甚至在體內接種並自接種疫苗動物體內回收後仍是。該資料顯示80%之經感染細胞會表現Gp5蛋白，且100%之經感染細胞亦會表現M蛋白。
第11圖為流程圖，顯示使用重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，組成二疫苗配方。
第12圖為一表格，顯示重組病毒rTGEV-SPTV -TRS3a -ORF5-TRS22N -ORF6(C306T) ，在經由鼻內路徑接種2×107 pfu/ml之兩天大小豬之目標組織中(肺)之複製與繁殖之評估。此結果由病毒效價測定與組織學決定。
第13圖為免疫組織化學圖，分別得自第1組與第2組豬隻之肺部組織切片，顯示冠狀病毒感染之間質性肺炎。該切片特徵為肺泡壁增厚，由於淋巴球與巨噬體滲入，且肺泡空間被單核球滲入物填滿(淋巴球與巨噬體)，有時是多形核嗜中性白血球。
第14圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗-gp5抗體，於接種經修飾活疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相較。D0 PV之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗-gp5抗體存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試：p值<0.05)。
第15圖顯示特異性免疫過氧化酶單層試驗(IPMA)之結果，用於偵測豬肺泡肺噬菌體中之PRRSV，該豬隻經得自接種疫苗與控制組豬隻之血清樣本感染。
第16圖顯示抗-TGEV(圖A)與抗-PRSSV抗體(圖B)之偵測結果，藉由間接ELISA，以有色受質之吸收波長展現。“Vacc.”代表由接種疫苗動物獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清，“CP”與“CN”分別代表陽性與陰性控制組。由接種疫苗與控制組動物獲得之血清係稀釋60-倍。
第17圖反映對於TGEV與PRSSV有陽性免疫反應之動物百分比，使用1:60之稀釋倍數。圖A為一摘錄結果之表格，其中該圖顯示陽性動物之百分比，以圖示形式(圖B為抗-TGEV，圖C為抗-PRRSV)。“Vacc.”代表由接種疫苗動物獲得之血清，“Ctrl.”代表由未接種疫苗動物獲得之血清。
第18圖顯示競爭性ELISA之結果，使用抗-gp5抗體，於接種去活性疫苗之動物中偵測，與未接種疫苗之動物相較。D0 PV之吸收係用於計算每一血清中之結合百分比，使用特定計算。較低之結合百分比代表較高量抗-gp5抗體存在於測試血清中。接種疫苗組與未接種疫苗組之動物間之吸收值差異與結合百分比，符合統計相關性(t測試：p值<0.05)。
第19圖顯示定量即時RT-PCR(qRT-PCR)之結果，用於定量血清樣本中之PRRSV效價，該樣本或得自接種疫苗或未接種疫苗之動物中。
第20圖顯示編碼ORF5-LIMP-II融合蛋白之cDNA，以及其對於感染細胞抗原呈現之作用。
第21圖顯示編碼Ub-ORF5融合蛋白之cDNA，以及其對於感染細胞抗原呈現之作用。
第22圖顯示重組TGEV與嵌合性S蛋白之建構。該圖顯示S基因與原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV與TGEV-PUR46-C11，其5’序列區域之差異性(請見左圖上方)。圖中標示出之核苷酸反映了該二序列之不同，而右圖垂直部分則代表三個核苷酸被刪除。核苷酸之位置係由圖最上方數字指出。該圖更顯示數個S基因突變物之序列，與原始TGEV單離物TGEV-PUR46-PTV相較。每一重組病毒之體內效價，在經感染新生小豬之腸道與肺部，亦於圖中指出。
第23圖顯示原始TGEV與重組TGEV-PUR46-S7.1之成長動力學。新生三天小豬接種3×108 pfu每隻小豬劑量後，係測量這些病毒之成長。動物係於指定天數下犧牲，每克組織之病毒效價，係以ST細胞上之溶菌斑效價測定數決定。(■)，肺部之病毒；(●)，腸道之病毒。所指出之數值係對應於三獨立實驗之中間值。

Claims (73)

  1. 一種經單離的核酸，包含：(a)一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；以及(b)一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之ORF5之至少一中和性表位之序列，該序列包括一形成雙硫鍵的殘基；以及(c)一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽。
  2. 一種經單離的核酸，包含：(a)一複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)序列，該序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；以及(b)編碼PRRSV之一或多個ORF5中和性表位之多聚合體(multimers)，以及至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽之序列。
  3. 一種經單離的核酸，包含：(a)複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之序列，該等序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，使得該複製酶於含該核酸之細胞中之表現可啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目； (b)一編碼豬繁殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之ORF5之至少一中和性表位之序列；以及(c)一序列，該序列係編碼至少一其他可增進對抗PRRSV之免疫反應之多胜肽，其可穩定(b)之序列之表現，使得該病毒在體外分代20代之後，大於60%之經此核酸序列感染之細胞，可表現(b)序列之基因產物。
  4. 一種經單離的核酸，包含：(a)複製勝任傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之序列，該等序列編碼一TGEV複製酶，在表現調控序列之控制下，其中該複製酶係於宿主細胞中表現，並會啟動該核酸之複製，因而增加該核酸在該細胞中之數目；(b)SEQ ID NO：2之殘基118至138，或一具有與該等殘基90%相似度之序列，在一表現調控序列之控制下；以及(c)SEQ ID NO：3，或一具有與SEQ ID NO：3 90%相似度之序列，在一表現調控序列之控制下；其中(a)與(b)與(c)之每一序列皆在不同表現調控序列之控制下。
  5. 一種重組RNA，由如申請專利範圍第1至4項任一項之核酸所編碼。
  6. 一種載體，包含如申請專利範圍第1至4項任一項之核酸。
  7. 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第6項之載體。
  8. 一種病毒顆粒，包含如申請專利範圍第1至4項任一項之 核酸，以及至少一TGEV外殼蛋白。
  9. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第1至4項任一項之核酸。
  10. 一種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請專利範圍第1至4項任一項之核酸。
  11. 如申請專利範圍第10項之疫苗，其中該疫苗為多價疫苗，可提供保護對抗PRRSV之外之一或多種豬病原體。
  12. 一種經單離的核酸，包含具有與SEQ ID NO：1序列至少95%相似度之一序列，其中該與SEQ ID NO：1序列具有至少95%相似度之序列所編碼之蛋白為棘蛋白，該棘蛋白，當以TGEV病毒之一部分存在時，可誘發豬隻呼吸道與腸道中之TGEV感染，其中該感染之特徵為：具有至少1×107 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物呼吸道組織；具有至少1×106 PFU之病毒效價於經TGEV感染之ST細胞中，該病毒衍生自感染後2天之動物之1克動物腸道組織。
  13. 一種經單離的核酸，包含SEQ ID NO：1所示之序列。
  14. 如申請專利範圍第12或13項之經單離的核酸，其中該核酸不包含編碼PRRSV之ORF5之序列或其編碼中和性表位之片段。
  15. 一種載體，包含如申請專利範圍第12至14項任一項之核酸。
  16. 如申請專利範圍第15項之載體，其中該載體為cDNA載體。
  17. 如申請專利範圍第16項之載體，其中該載體為BAC-TGEV載體。
  18. 如申請專利範圍第15至17項任一項之載體，其中該載體可於宿主細胞中複製該核酸。
  19. 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第15至18項任一項之載體。
  20. 一種蛋白，由如申請專利範圍第12至14項任一項之核酸所編碼。
  21. 一種病毒顆粒，包含如申請專利範圍第12至14項任一項之核酸。
  22. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第12至14項任一項之核酸。
  23. 一種疫苗，包含如申請專利範圍第12至14項任一項之核酸。
  24. 一種多胜肽，由SEQ ID NO：13所編碼，或由具有與SEQ ID NO：13相似度90%之序列所編碼。
  25. 一種多胜肽，由SEQ ID NO：14所編碼，或由具有與SEQ ID NO：14相似度90%之序列所編碼。
  26. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第24或25項之多胜肽。
  27. 如申請專利範圍第26項之藥學組成物，更包含一藥學上可接受之載劑、賦形劑，及/或佐劑。
  28. 一種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請專利範圍第24或25項之多胜肽。
  29. 如申請專利範圍第28項之疫苗，其中該疫苗為多價疫苗，可提供保護對抗PRRSV之外之一或多種豬病原體。
  30. 如申請專利範圍第29項之疫苗，更包含衍生自其他病毒及/或細菌病原體之抗原，及/或可提供對抗病原體之免疫性的蛋白。
  31. 如申請專利範圍第29項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自其他病毒性病原體，該等病毒性病原體係選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病毒、豬環病毒第1型、豬腺病毒、豬腸病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/或西尼羅(West Nile)病毒、立百(Nipah)病毒。
  32. 如申請專利範圍第31項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自其他病毒性病原體，該等病毒性病原體係選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口蹄疫。
  33. 如申請專利範圍第32項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自細菌性病原體，該等細菌性病原體係選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿 菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)、肘黴漿菌(Mycoplasma hyorinis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、格蘭氏陽性產孢菌(Clostridium perfringens)、梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、布氏桿菌(Brucella abortus)，及/或暫定螺旋菌(Candidatus helicobacter suis)。
  34. 如申請專利範圍第32項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自細菌性病原體，該等細菌性病原體係選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌 毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)，及/或沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)。
  35. 如申請專利範圍第33或34項之疫苗，其中該其他病毒性或細菌性抗原係以減毒性或去活性病毒或細菌，或以編碼一或多種該其他病毒性或細菌性抗原之核酸序列，存在於該多價疫苗中。
  36. 如申請專利範圍第35項之疫苗，其中該疫苗適用於接種疫苗於豬隻，較佳為母豬。
  37. 如申請專利範圍第36項之疫苗，其中該疫苗可誘發對抗感染性病毒試劑之系統性免疫反應與黏膜性免疫反應兩者。
  38. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第6項之載體。
  39. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第7項之宿主細胞。
  40. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第8項之病毒顆粒。
  41. 一種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請專利範圍第6項之載體。
  42. 一種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請專利範圍第7項之宿主細胞。
  43. 一種疫苗，可保護動物對抗PRRSV，該疫苗包含如申請專利範圍第8項之病毒顆粒。
  44. 如申請專利範圍第41項之可保護動物對抗PRRSV之疫苗，其中該疫苗為多價疫苗，可提供保護對抗PRRSV之外之一或多種豬病原體。
  45. 如申請專利範圍第42項之可保護動物對抗PRRSV之疫苗，其中該疫苗為多價疫苗，可提供保護對抗PRRSV之外之一或多種豬病原體。
  46. 如申請專利範圍第43項之可保護動物對抗PRRSV之疫苗，其中該疫苗為多價疫苗，可提供保護對抗PRRSV之外之一或多種豬病原體。
  47. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第15至18項任一項之載體。
  48. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第19項之宿主細胞。
  49. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第20項之蛋白。
  50. 一種藥學組成物，包含如申請專利範圍第21項之病毒顆粒。
  51. 一種疫苗，包含如申請專利範圍第15至18項任一項之載體。
  52. 一種疫苗，包含如申請專利範圍第19項之宿主細胞。
  53. 一種疫苗，包含如申請專利範圍第20項之蛋白。
  54. 一種疫苗，包含如申請專利範圍第21項之病毒顆粒。
  55. 如申請專利範圍第2項之經單離的核酸，其中編碼該ORF5之中和性表位之序列已經修飾，以剔除(knock out)會干擾抗體誘發之醣化位置。
  56. 如申請專利範圍第55項之經單離的核酸，其中該核酸編碼一TGEV複製酶，以及一編碼TGEV N蛋白之序列。
  57. 如申請專利範圍第56項之經單離的核酸，其中該複製勝任TGEV載體為非感染性。
  58. 如申請專利範圍第56項之經單離的核酸，其中該複製勝任TGEV載體為感染性。
  59. 如申請專利範圍第58項之經單離的核酸，其中該核酸更包含下列TGEV基因之一或多者：S、E、M及/或N，或是具有與此等序列至少60%相似度之序列。
  60. 如申請專利範圍第58或59項之經單離的核酸，其中可得自結合TGEV蛋白與該核酸序列之TGEV感染性病毒顆粒為減毒性病毒顆粒。
  61. 如申請專利範圍第3項之經單離的核酸，其中編碼該ORF5之中和性表位之序列已經修飾，以剔除(knock out)會干擾抗體誘發之醣化位置。
  62. 如申請專利範圍第61項之經單離的核酸，其中該核酸編碼一TGEV複製酶，以及一編碼TGEV N蛋白之序列。
  63. 如申請專利範圍第62項之經單離的核酸，其中該複製勝任TGEV載體為非感染性。
  64. 如申請專利範圍第62項之經單離的核酸，其中該複製勝任TGEV載體為感染性。
  65. 如申請專利範圍第64項之經單離的核酸，其中該核酸更包含下列TGEV基因之一或多者：S、E、M及/或N，或是具有與此等序列至少60%相似度之序列。
  66. 如申請專利範圍第64或65項之經單離的核酸，其中可得自結合TGEV蛋白與該核酸序列之TGEV感染性病毒顆粒為減毒性病毒顆粒。
  67. 如申請專利範圍第30項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自其他病毒性病原體，該等病毒性病原體係選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟、口蹄疫、偽狂犬病毒、豬環病毒第1型、豬腺病毒、豬腸病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬輪狀病毒、腦心肌炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、藍眼症病毒、E型肝炎病毒，及/或西尼羅(West Nile)病毒、立百(Nipah)病毒。
  68. 如申請專利範圍第67項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自其他病毒性病原體，該等病毒性病原體係選自於豬流感病毒、豬細小病毒、豬環病毒第2型、典型豬瘟、非洲豬瘟，及/或口蹄疫。
  69. 如申請專利範圍第68項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自細菌性病原體，該等細菌性病原體係選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、 豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)、肘黴漿菌(Mycoplasma hyorinis)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、格蘭氏陽性產孢菌(Clostridium perfringens)、梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、布氏桿菌(Brucella abortus)，及/或暫定螺旋菌(Candidatus helicobacter suis)。
  70. 如申請專利範圍第69項之疫苗，更包含一或多種抗原，該等抗原係衍生自細菌性病原體，該等細菌性病原體係選自於豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、溶血性毒素豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、A型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type A)(毒素)、D型巴斯德桿菌(Pasteurella multocida type D)(毒素)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、豬等孢球蟲(Isospora suis)、豬痢疾蛇形螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriae)、結腸菌毛樣短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)、胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)、紅斑丹毒絲狀菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)，及/或沙門氏腸炎桿菌(Salmonella enterica)。
  71. 如申請專利範圍第69或70項之疫苗，其中該其他病毒性或細菌性抗原係以減毒性或去活性病毒或細菌，或以編碼一或多種該其他病毒性或細菌性抗原之核酸序列，存在於該多價疫苗中。
  72. 如申請專利範圍第71項之疫苗，其中該疫苗適用於接種疫苗於豬隻，較佳為母豬。
  73. 如申請專利範圍第72項之疫苗，其中該疫苗可誘發對抗感染性病毒試劑之系統性免疫反應與黏膜性免疫反應兩者。
TW100107364A 2005-12-01 2006-11-30 編碼有傳染性胃腸炎病毒（ｔｇｅｖ）序列及豬繁殖與呼吸綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）序列以改善ｐｒｒｓｖ序列之表現的核酸（二） TWI382089B (zh)

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