ES2251162T3 - Clon infeccioso con cdna de virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino norteamericano (prrs) y sus usos. - Google Patents

Clon infeccioso con cdna de virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino norteamericano (prrs) y sus usos.

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ES2251162T3 ES99309409T ES99309409T ES2251162T3 ES 2251162 T3 ES2251162 T3 ES 2251162T3 ES 99309409 T ES99309409 T ES 99309409T ES 99309409 T ES99309409 T ES 99309409T ES 2251162 T3 ES2251162 T3 ES 2251162T3
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Abstract

Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido

Description

Clon infeccioso de cDNA de virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino norteamericano (PRRS) y sus usos.
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de la salud animal y está dirigida a clones de cDNA infecciosos de virus de RNA de polaridad positiva y la construcción de vacunas, en particular, vacunas de animales porcinos, usando tales clones de cDNA.
Antecedentes de la invención
El síndrome reproductor y respiratorio de animales porcinos (PRRS) es una nueva enfermedad de animales porcinos descrita por primera vez en 1987 en Norteamérica y en 1990 en Europa. Desde entonces, la enfermedad se ha extendido en Asia y afecta a la mayoría de los países importantes del mundo productores de cerdos. Los síntomas principales son problemas reproductores en cerdas y en marranas parturientas primerizas, entre los que están incluidos abortos a largo plazo, nacimientos de crías muertas y momias y camadas de cerdos pequeños débiles que nacen virémicos y frecuentemente no sobreviven. Además, el síndrome se manifiesta en sí como enfermedad respiratoria en cerdos jóvenes que se extiende horizontalmente y causa fiebre, letargia, respiración dificultosa, pérdida de apetito, crecimiento lento y, ocasionalmente, muerte, con frecuencia asociada con otros patógenos respiratorios. Además, la enfermedad se transmite a cerdas a través del semen de machos infectados, bien naturalmente o bien por inseminación artificial. Por estas y otras razones, el PRRS ha resultado ser una enfermedad difícil de controlar y, por tanto, una de las enfermedades económicamente más dañinas para la industria porcina.
El causante del PRRS es el virus de PRRS, que existe como dos tipos genética y serológicamente distintos (Murtaugh, M.P. y otros, 1995, Arch. Virol. 140, 1451-1460; Suarez P. y otros, 1996, Virus Research 42:159-165). Se cree que los dos tipos han entrado independientemente en las poblaciones porcinas, uno en Norteamérica y el otro en Europa, en la década de 1980, desde depósitos biológicos desconocidos, posiblemente de origen de roedores o aves. El tipo europeo, representado por el prototipo "Lelystad Virus", se aisló y secuenció en Holanda en 1991 (Terpstra, C. y otros, 1991, Vet. Quart. 13:131-136; Wensvoort, G. y otros, 1991, Vet. Quart. 13:121-130; Wensvoort, G. y otros, WO 92/213751992 (PCT/NL92/00096), 1992; Meulenberg, J.J.M. y otros, 1993, Virol. 192:62-72).
Ambos virus, el virus de PRRS norteamericano y el virus de PRRS europeo, se clasifican dentro de la familia Arteviridae, que también incluye el virus arteritis equino, el virus que eleva el lactato de deshidrogenasa y el virus de fiebre hemorrágica de simios. Los artevirus están situados, a su vez, dentro del orden Nidovirales, que también incluye los coronavirus y torovirus. Los nidovirus son virus envueltos que tienen genomas constituidos por una cadena simple de RNA de polaridad positiva. El RNA genómico de un virus de RNA de cadena positiva desempeña el doble papel en el archivo y expresión de información genética. No está implicado DNA en la replicación o transcripción en los nidovirus. La reproducción de RNA genómico nidoviral es así un proceso combinado de replicación de genoma y transcripción de mRNA. Además, algunas proteínas se traducen directamente desde RNA genómico a nidovirus. Snijder y Meuldenberg (Snijder, E.J. y Meulenberg, J.J.M., 1988, Journal of General Virology, 79:961-979) han hecho recientemente una revisión de la biología molecular de la familia Arterividae.
Las vacunas comerciales actualmente disponibles contra el PRRS son virus vivos convencionales modificados (cultivo celular, atenuado) o muertos convencionales (preparaciones de cultivos celulares inactivados de virus virulentos). Varias de estas vacunas han sido objeto de críticas por razones de seguridad y/o eficacia. Por tanto, es muy deseable el desarrollo de una segunda generación de vacunas de PSSR basadas en adiciones, supresiones y otras modificaciones específicas del genoma de PRRS. Sin embargo, puesto que los virus de PSSR no incluyen intermedios de DNA durante su replicación, tales vacunas han esperado durante mucho tiempo la construcción de clones de cDNA de longitud completa de virus de PSSR para manipulación por técnicas de biología molecular al nivel del DNA. Muy recientemente, se ha dado cuenta de un clon infeccioso de cDNA de longitud completa del virus de PSSR europeo (Meulenberg, J.J.M. y otros, 1998, cita anterior; Meulenberg, J.J.M y otros, 1988, J. Virol. 72, 380-387).
Database EMBL (Online) U87392 describe el genoma completo de la cepa VR-2332 del virus de PRSS.
Database EMBL (Online) AF046869 describe el genoma completo de 16244B del virus de PRRS.
WO 96/04010 describe una secuencia parcial de VR-232 del virus de PRRS.
Sumario de la invención
La invención en consideración proporciona una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con un nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1, es una guanina en vez de una adenina, y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina.
La presente invención proporciona, además, una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416 de SEQ ID NO:1, que incluye, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una una adenina y el nucleótido correspondiente al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO: 1 es una timina en vez de una citosina, célula huésped transfectada que es capaz de expresar el virus de PRRS norteamericano codificado.
La presente invención proporciona además un plásmido capaz de transfectar directamente una célula huésped adecuada y expresar un virus de PRRS norteamericano desde la célula huésped adecuada así transfectada, plásmido que comprende: (a) una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano, secuencia de DNA que es SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con, e incluye, el nucleótido 1 al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO: 1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, y (b) un promotor capaz de transcribir la mencionada molécula infecciosa de RNA en la mencionada célula huésped.
La presente invención proporciona además un procedimiento para generar un virus de PRRS norteamericano, procedimiento que comprende transfectar una célula huésped adecuada con un plásmido de la invención que codifica el virus de PRRS norteamericano y obtener el virus de PRRS norteamericano generado por la célula huésped
transfectada.
La presente invención también proporciona una molécula aislada de polinucleótido que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano que se modifica genéticamente de manera que, cuando infecta un animal porcino, es incapaz de producir PRRS en el animal, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más mutaciones que genéticamente incapacitan el virus de PRRS codificado para producir PRRS.
La presente invención proporciona además una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que se modifica genéticamente de manera que, cuando infecta un animal, es incapaz de producir PRRS en el animal, en la que la mencionada secuencia de DNA es SEQ ID NO:1 o la secuencia de comienza en el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más mutaciones que genéticamente incapacitan el virus de PRRS codificado para producir PRRS, célula huésped transfectada que es capaz de expresar el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado codificado.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un animal porcino de una infección por virus de PRRS, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado codificado por una molécula infecciosa de RNA codificada por una molécula de polinucleótido de la invención, o la mencionada molécula infecciosa de RNA, o la mencionada molécula de polinucleótido en forma de un plásmido, o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención que codifica un virus de PRRS norteamericano que es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a la infección por un virus de PRRS, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a una infección por un virus de PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario.
La presente invención también proporciona una molécula aislada de polinucleótido que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano que se modifica genéticamente de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, en la que la mencionada secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más secuencias más de nucleótidos, cada una de las cuales codifica un epitopo antigénico heterólogo, y en la que cada epitopo antigénico heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un patógeno particular en un mamífero o un pájaro.
La presente invención proporciona además una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que se modifica genéticamente de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, en la que la molécula de RNA que codifica el virus de PSSR norteamericano es la SEQ ID NO:1 o la secuencia de comienza en el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que comprende una o más otras secuencias de nucleótidos de las que cada una codifica un epitopo antigénico heterólogo, y en la que cada epitopo antigénico heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un patógeno particular en un mamífero o un pájaro.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un mamífero o un pájaro de una infección por un patógeno, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado codificado por una molécula infecciosa de RNA codificada por una molécula de polipéptido de la invención, o la mencionada molécula infecciosa de RNA, o un plásmido de la invención, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a una infección por el patógeno del que derivan el epitopo o los epitopos heterólogos de él o así codificados; y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un animal porcino de una infección por un virus de PSSR y de la infección por un patógeno porcino que no es el virus de PRRS norteamericano, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente codificado por una molécula infecciosa de RNA codificada por una molécula de polinucleótido de la invención, o la mencionada molécula infecciosa de RNA, o un plásmido de acuerdo con la invención, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a una infección por virus de PRRS y frente a una infección por un patógeno del que derivan el epitopo o los epitopos heterólogos de él o así codificados; y un vehículo aceptable para uso veterinario.
La presente invención también proporciona una molécula aislada de polinucleótido que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano que está genéticamente modificado de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de DNA es la misma que la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más secuencias más de nucleótidos, cada una de las cuales codifica un epitopo antigénico heterólogo.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un animal porcino de una infección por un virus de PSSR, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente codificado por una molécula infecciosa de RNA codificada por una molécula de polinucleótido de la presente invención, que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, tratado o genéticamente más modificado de manera que es incapaz de producir PRRS en un animal porcino pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente al PRRS en el animal porcino; o la mencionada molécula infecciosa de RNA, en el que el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente así codificado comprende uno o más epitopos antigénicos detectables que comprenden una modificación genética más de manera que es incapaz de producir PRRS pero es capaz de producir una respuesta protectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un polinucleótido aislado de la presente invención en forma de plásmido, en el que el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado así codificado comprende uno o más epitopos antigénicos detectables comprende una modificación genética más de manera que es incapaz de producir PRRS pero es capaz de inducir una respuesta protectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, en el que el virus de PRRS norteamericano modificado así codificado comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables que comprenden más modificaciones genéticas, de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una acción inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a una infección por un virus de PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario.
La presente invención también proporciona una molécula aislada de polinucleótido que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano que está genéticamente modificado de manera que carece de un epitopo antigénico detectable, en la que la mencionada secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que carece de una o más secuencias de DNA que codifican un epitopo antigénico detectable.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un animal porcino de una infección por un virus de PSSR, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente codificado por una molécula infecciosa de RNA codificada por una molécula de polinucleótido de la invención, que carece de uno o más epitopos antigénicos heterólogos, tratado o genéticamente más modificado de manera que es incapaz de producir PRRS en un animal porcino pero es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente al PRRS en el animal porcino; o la mencionada molécula infecciosa de RNA, en la que el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente así codificado que carece de uno o más epitopos antigénicos detectables, comprende más modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero es capaz de inducir una respuesta protectora efectiva frente a un virus de PRRS; o una molécula aislada de polinucleótido en forma de plásmido, en la que el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado así codificado, que carece de uno o más epitopos antigénicos detectables comprenden más modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, en el que el virus de PRRS norteamericano modificado así codificado, que por ello carece de uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables, comprende más modificaciones genéticas, de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una acción inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a una infección por un virus de PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario.
La presente invención proporciona además una molécula de polinucleótido aislada que comprende una o más secuencias de nucleótidos de las que cada una codifica un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia genómica del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma que la de una molécula de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina.
La presente invención proporciona además una célula huésped transfectada que comprende una o más secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la secuencia genómica de la secuencia del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma de una molécula de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1 o la secuencia de comienza en el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, célula tranformada que es capaz de expresar el mencionado polipéptido o los mencionados polipéptidos.
La presente invención proporciona además un procedimiento para preparar un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado que es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora en un mamífero o un pájaro vacunado con él, procedimiento que comprende obtener una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que comienza en el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde a 12.622 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1, es una timina en vez de una citosina, mutar genéticamente la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje apropiadamente para obtener una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, virus que permanece capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra una infección por el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje en un mamífero o un pájaro, y expresar el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente así obtenido de la molécula de polinucleótido aislada.
La presente invención proporciona además una vacuna para proteger un mamífero o un pájaro de la infección por un virus de PRRS norteamericano, que comprende un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado de la invención en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje en un mamífero o un pájaro vacunado con el virus mencionado, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Estrategia clónica para la construcción de un clon de cDNA infeccioso de longitud completa del virus de PRRS norteamericano, pT7P129A. Las cabezas de las flechas representan secuencias del promotor T7.
Figura 2. Viremia sérica que sigue a la infección con P129A o virus de PRRS recombinante rP129A-1. Determinada por ensayo de placa sobre células MARC-145. El límite inferior de detección es 5 pfu/ml (o 0,7 sobre la escala log.).
Figura 3. Anticuerpo de suero de virus anti-PRRS que sigue a la infección con P129A o virus de PRRS recombinante rP129A-1. Determinado por ensayo ELISA de PRRS HerdCheck (IDEXX, Westbrook, Maine, USA).
Descripción detallada de la invención
La producción y manipulación de las moléculas de polinucleótidos aislados aquí descritas es cuestión que corresponde al conocimiento de la técnica y se pueden realizar de acuerdo con técnicas recombinantes descritas por, entre otros, Maniatis y otros, 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis y otros (eds.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; y Erich (ed.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York.
A. Moléculas de polinucleótidos aisladas y moléculas de RNA que codifican un virus de PRRS norteamericano, y moléculas de polinucleótidos aisladas y moléculas de RNA que codifican virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente
La invención en consideración proporciona una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO: 1. En una realización preferente, la presente invención proporciona una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la secuencia que comienza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15, 416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.262 de la SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina. La mencionada secuencia de DNA codifica una molécula infecciosa de RNA que es el genoma de RNA del P129 aislado de PRRS norteamericano.
Ha de tenerse en cuenta que los términos que se refieren aquí a moléculas de ácidos nucleicos, tales como "molécula de polinucleótido aislada", "secuencia de nucleótidos", "marco de lectura abierta (ORF)", etc., incluyen, a no ser que se especifique lo contrario, moléculas de DNA y RNA, e incluyen moléculas de cadena simple y doble cadena. También, cuando se hace referencia a una secuencia particular de la sección "Listado de secuencias" de la solicitud en consideración, se considera, a no ser que se indique lo contrario, tanto el DNA del "listado de secuencias" como el RNA que corresponde a la secuencia de DNA, e incluye secuencias complementarias a las secuencias de DNA y RNA. En tales contextos de esta solicitud, "que corresponde" se refiere a secuencias de DNA y RNA que son idénticas entre sí, salvo el hecho de que la secuencia de RNA contiene uracilo en vez de timina y la cadena principal de la molécula de RNA contiene ribosa en vez de desoxirribosa.
Por ejemplo, la SEQ ID NO:1 es una secuencia de DNA que corresponde al genoma de RNA de un virus de PRRS norteamericano. Así, una secuencia de DNA complementaria a la secuencia de DNA presentada en la SEQ ID NO:1 es una plantilla, esto es, es complementaria a o "codifica", el genoma de RNA del virus de PRRS norteamericano (esto es, RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano). Sin embargo, una referencia que aquí se haga a la SEQ ID NO:1 incluye tanto la secuencia de RNA que corresponde a SEQ ID NO:1 como una secuencia de DNA complementaria a la SEQ ID NO:1.
Una "molécula infecciosa de RNA" es, a los fines de la presente invención, una molécula de RNA que codifica los elementos necesarios para una replicación, transcripción y translación viral a un virión funcional en una célula huésped adecuada, proporcionada, si fuera necesario, con un péptido o unos péptidos que compensen cualesquier modificaciones genéticas, por ejemplo, supresiones de secuencias, en la molécula de RNA.
Una "molécula infecciosa de RNA aislada" se refiere a una composición de materia que comprende la antes mencionada molécula infecciosa de RNA puriificada en un grado detectable desde su estado natural, si tal molécula de RNA no se presenta realmente en la naturaleza. Análogamente, una "molécula de polinucleótido aislada" se refiere a una composición de materia que comprende una molécula de polinucleótido de la presente invención puriificada en un grado detectables desde su estado natural, si lo hay.
Ha de entenderse, además, que las moléculas de polinucleótido aisladas y las moléculas de RNA aisladas de la presente invención incluyen tanto moléculas sintéticas como moléculas obtenidas mediante técnicas recombinantes tales como clonación in vitro y transcripción.
Tal como se usa aquí, el término "PRRS" abarca síntomas de enfermedad en animales porcinos causados por una infección con virus de PRRS. Entre los ejemplos de tales síntomas están incluidos, aunque no únicamente, abortos en hembras preñadas, crecimiento lento, dificultades respiratorias, pérdida de apetito y mortalidad en cochinillos. Tal como se usa aquí, un virus de PRRS que es "incapaz de producir PRRS" se refiere a un virus que puede infectar un cerdo, pero que no produce cualesquier síntomas de enfermedad normalmente asociados con una infección de PRRS en el cerdo, o produce tales síntomas pero en grado menor, o produce un número menor de tales síntomas.
Los términos "animal porcino" y "cerdo" se usan aquí de forma intercambiable y se refieren a cualquier animal de la familia Suidae, tal como, por ejemplo, un cochino. El término "mamifero" incluye cualesquier animales vertebrados de la clase Mammalia, incluidos seres humanos.
El término "virus de PRRS", tal como se usa aquí, significa, a no ser que se indique lo contrario, cualquier cepa de virus de PRRS norteamericano o virus de PRRS europeo.
El término "virus de PRRS norteamericano" significa cualquier virus de PRRS que tiene características genéticas asociadas con un aislado de virus de PRRS norteamericano, tal como, aunque no limitativamente, el virus de PRRS aislado primeramente en los EE.UU. al comienzo de la década de 1990 (véase, por ejemplo, Collins y otros, 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126; North American PRRS virus aislate MN-1b, Kwang, J. y otros, 1994, J. Vet. Diagn. Invest., 6:293-296; The Quebec IAF-exp91 strain of PRRS, Mardassi, H. y otros, 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418; y North American PRRS virus aislate VR 2385, Meng, X.J. y otros, 1994, J. Gen. Virol., 75:1795-1801). Características genéticas se refiere a la similitud de la secuencia de nucleótidos genómica y la similitud de la secuencia de aminoácidos compartida por cepas de virus de PRRS norteamericano. A los fines de la presente invención, un virus de PRRS norteamericano es un virus que está codificado por una secuencia de RNA que es la misma que la SEQ ID NO:1.
El término "virus de PRRS europeo" se refiere a cualquier cepa de virus de PRRS que tiene las características genéticas asociadas con el virus de PRRS aislado en Europa en torno a 1991. (véase, por ejemplo, Wensvoort, G. y otros, 1991, Vet. Q, 13:121-130). El término "virus de PRRS europeo" se designa a veces también en la técnica "virus Lelystad".
El término "marco de lectura abierta", o "ORF", tal como se usa aquí, significa la secuencia de nucleótidos mínima requerida para codificar una proteína de virus de PRRS sin un codón de parada que intervenga.
Términos tales como "célula huésped adecuada" y "célula huésped apropiada" se refieren, a no ser que se indique lo contrario, a células en las que se pueden transformar o transfectar moléculas de RNA (o moléculas de polinucleótido aisladas o vectores virales que comprenden secuencias de DNA que codifican tales moléculas de RNA) de la presente invención. Entre las "células huésped adecuadas" para transfección con tales moléculas de RNA, moléculas de pollinucleótido aisladas o vectores virales están incluidas células de mamíferos, en particular animales porcinos, y células de aves, que se describen más detalladamente más adelante.
Un "virión funcional" es una partícula de virus que es capaz de entrar en una célula capaz de alojar un virus de PRRS y expresar genes de su genoma de RNA particular (un genoma no modificado o un genoma genéticamente modificado como se describe aquí) dentro de la célula. Entre las células capaces de alojar un virus de PRRS están incluidas células macrófagas alveolares de porcino y células MARC 145 renales de mono. También pueden actuar como células huésped adecuadas para viriones de PRRS, otras células de mamíferos o aves, especialmente otras células de porcino.
Las moléculas de polinucleótidos aisladas de la presente invención codifican virus de PRRS norteamericano que se pueden usar para preparar vacunas vivas, muertas o atenuadas usando métodos conocidos en la técnica para proteger animales porcinos de la infección por PRRS, como se describe detalladamente más adelante. Estas moléculas de polinucleótidos aisladas son también útiles como vectores para suministrar genes heterólogos a mamíferos, incluidos cerdos, o pájaros, como se describe tambien detalladamente más adelante. Además, estas moléculas de polinuceótidos aisladas son útiles porque pueden mutarse usando técnicas de biología molecular para codificar virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente, útiles, entre otros fines, como vacunas para proteger cerdos frente a la infección de PRRS. Tales virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente así como vacunas que los comprenden se describen detalladamente más adelante.
Consecuentemente, la invención en consideración proporciona además un procedimiento para hacer un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, procedimiento que comprende mutar la secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de DNA que codifica el virus de PRRS norteamericano como se describe más adelante, y expresar el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado usando un sistema de expresión adecuado. Se puede expresar un virus de PRRS norteamericano, de tipo salvaje o genéticamente modificado, a partir de una molécula de polinucleótido aislada usando sistemas de expresión adecuados, generalmente conocidos en la técnica, de los que se describen ejemplos en esta solicitud. Por ejemplo, la molécula de polinucleótido aislada puede estar en forma de un plásmido capaz de expresar el virus codificado en una célula huésped adecuada in vitro, como se describe detalladamente más adelante.
El término "genéticamente modificado", tal como se usa aquí, y a no ser que se indique lo contrario, significa genéticamente mutados, esto es, que tienen uno o más nucleótidos reemplazados, eliminados y/o añadidos. Las moléculas de polinucleótidos se pueden mutar genéticamente usando técnicas recombinantes conocidas por expertos corrientes en la técnica, usando la mutagénesis dirigida al sitio, o por mutagénesis al azar, por ejemplo, mediante exposición a agentes mutagénicos químicos o a radiación, como es conocido en la técnica. En una realización, la modificación genética del virus de PRRS norteamericano de la presente invención hace que el virus sea incapaz de replicar efectivamente, o reducir su capacidad para replicar efectivamente, en un pájaro o un mamífero en el que el virus de tipo salvaje puede replicar efectivamente, de otra manera. En otra realización, el virus de PRRS norteamercano modificado genéticamente de la presente invención permanece capaz de replicar efectivamente en pájaros o mamíferos infectados con él. "Replicación efectiva" significa la capacidad de multiplicar y producir virus de progenie (viriones) en un animal infectado, esto es, la capacidad de "infectar productivamente" un animal.
La invención en consideración proporciona además una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de DNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado que es incapaz de producir PRRS en un animal porcino, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula infecciosa de RNA que codifica el mencionado virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1, excepto que contiene una o más mutaciones que genéticamente incapacitan el virus de PRRS codificado para producir PRRS. "Discapacitado genéticamente" significa que el virus de PRRS es incapaz de producir PRRS en un animal porcino infectado con el virus.
En una realización, el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, incapacitado para causar PRRS, es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra la infección por un virus de PRRS en un animal porcino. Consecuentemente, la invención en consideración también proporciona una molécula aislada de polinucleótido que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está genéticamente modificado de manera que, cuando infecta un animal porcino: (a) es incapaz de producir PRRS en un animal, y (b) es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra un virus de PRRS en el animal, siendo la secuencia de DNA que codifica el mencionado virus de PRRS norteamericano la SEQ ID NO:1, excepto que contiene uno o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS.
El término "respuesta inmune" significa, a los fines de esta invención, la producción de anticuerpos y/o células (tales como linfocitos T) que están dirigidas contra un epitopo antigénico particular o epitopos antigénicos particulares, o coadyuvan a su descomposición o inhibición. Los términos "una respuesta inmunoprotectora efectiva", "inmunoprotección", etc., y otros similares significan, a los fines de la presente invención, una respuesta inmune que está dirigida contra uno o más epitopos antigénicos o un patógeno para proteger contra la infección por el patógeno en un animal vacunado. A los fines de la presente invención, protección frente a la infección por un patógeno incluye, no sólo la prevención absoluta de la invención, sino también cualquier reducción detectable del grado o velocidad de la infección por un patógeno, o cualquier reducción detectable de la severidad de la infección o cualquier síntoma o afección resultante de la infección por el patógeno en el animal vacunado en comparación con un animal infectado no vacunado. Se puede inducir así una respuesta inmunoprotectora efectiva en animales que no han sido infectados previamente con el patógeno y/o no han sido infectados por el patógeno en el momento de la vacunación. Se puede inducir también una respuesta inmunoprotectora efectiva en un animal ya infectado por el patógeno en el momento de la vacunación.
Un "epitopo antigénico" es, a no ser que se indique lo contrario, una molécula que es capaz de producir una respuesta inmune en un animal o una especie particular. Los epitopos antigénicos son moléculas proteináceas, esto es, secuencias de aminoácidos, que opcionalmente comprenden grupos no proteínicos tales como restos de hidratos de carbono y/o restos de lípidos.
El término "que infecta patogénicamente" usado aquí se refiere a la capacidad de un patógeno de infectar un animal y causar una enfermedad en el animal. Como ejemplo, un virus de PRRS es capaz de infectar patogénicamente un animal porcino puesto que puede causar PRRS en un porcino. Sin embargo, aunque un virus de PRRS puede ser capaz de infectar, productivamente o no productivamente, un pájaro o un mamífero, como el hombre, no infecta patogénicamente cualquier animal que no sea un animal porcino, puesto que no causa una enfermedad en animales que no son animales animales porcinos.
Los virus de PRRS norteamericano genéticamente modificados, codificados por las moléculas aisladas de polinucleótido descritas antes, son capaces, en una realización, de producir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a una infección por un virus de PRRS. Preferiblemente, tales virus de PRRS norteamericano genéticamente modificados son capaces de que se manifieste una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a cualquier cepa de virus de PRRS, incluidas cepas norteamericanas y europeas.
En una realización, la mutación o las mutaciones en la molécula de polinucleótido aislada que codifica el virus de PRRS norteamericano genéticamente discapacitado son no silentes y se presentan en uno o más marcos de lectura directa de la secuencia de nucleótidos que codifica el virus de PRRS norteamericano; esto es, la mutación o las mutaciones se presentan en una o más secuencias dentro de la secuencia de nucleótidos que codifica el virus de PRRS norteamericano que son los mismos ORFs 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de la SEQ ID NO:1. En otra realización, la mutación o las mutaciones se presentan en una o más regiones no codificadoras del genoma del virus de PRRS norteamericano, tales como, por ejemplo, en la secuencia líder del genoma del virus de PRRS norteamericano; esto es, la mutación o mutaciones se presentan dentro de la secuencia que es la misma que la secuencia de nucleótidos 1-191 de SEQ ID NO:1. En la misma molécula de polinucleótido aislada se pueden producir mutaciones en regiones no codificadoras y regiones codificadoras.
Tal como se usa aquí, el término "regiones no codificadoras" de la secuencia de nucleótidos que codifica el virus de PRRS norteamericano se refiere, a no ser que se indique lo contrario, a las secuencias de RNA que no se trasladan a una proteína y las secuencias de cDNA que codifican tales secuencias de RNA. Regiones codificadoras se refiere a las secuencias de RNA de las que se expresan las proteínas de virus de PRRS norteamericano, y también se refiere a cDNA que codifica tales secuencias de RNA. Análogamente, "ORFs" se refiere a secuencias de RNA que codifican las proteínas de virus de PRRS norteamericano y a una secuencia de cDNA que codifica tales secuencias de RNA.
La determinación de los puntos adecuados para una mutación o unas mutaciones que codificarán un virus de PRRS norteamericano que sea genéticamente discapacitado de manera que sea incapaz de producir PRRS pero que pueda producir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a una infección por un virus de PRRS, se puede hacer basándose en la SEQ ID NO:1 proporcionada aquí. Un experto corriente en la técnica puede remitirse a la secuencia del clon infeccioso de cDNA del virus de PRRS proporcionado por esta invención, hacer cambios de secuencia que darán por resultado una mutación y ensayar los virus así codificados en cuanto a producir PRRS en un animal porcino e inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a una infección por virus de PRRS. Al actuar así, un experto corriente en la técnica puede usar métodos conocidos en la técnica, descritos también y/o ejemplificados aquí.
Por ejemplo, se puede mutar un ORF de la secuencia que codifica la molécula de RNA infecciosa que codifica el virus de PRRS norteamericano y ensayar el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado resultante en cuanto a su capacidad para causar PRRS. El ORF de un virus de PRRS norteamericano codifica proteínas como sigue: ORF 1a codifica una proteína que comprende función de proteasa; ORF 1b codifica una poliproteína que comprende funciones de replicasa (polimerasa de RNA) y helicasa; los ORFs 2, 3 y 4 codifican pequeñas glicoproteínas de membrana; ORF 5 codifica una glicoproteína importante de envoltura; ORF 6 codifica una proteína de membrana integral no glicosilada; y ORF 7 codifica una proteína de nucleocápsido. En la preparación de los virus de PRRS norteamericano modificados descritos más adelante se pueden usar mutaciones genéticas de una o más de estos ORFs.
La invención en consideración también proporciona una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente tal que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1, y que además comprende una o más secuencias de nucleótidos adicionales, cada una de las cuales codifica un epitopo antigénico heterólogo, y en la que cada epitopo antigénico heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra un patógeno particular en un mamífero o un pájaro.
Un patógeno contra el que se puede inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva por medio del aspecto de la invención indicado antes, es cualquier patógeno, tal como un virus, una bacteria, un hongo o un protozoo, capaz de causar una enfermedad en un mamífero o un pájaro, patógeno que comprende o tiene asociado a él uno o más epitopos antigénicos que se pueden usar para inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra el patógeno en el mamífero o pájaro.
El término "epitopo antigénico heterólogo" significa, a los fines de la presente invención, un epitopo antigénico, según lo definido antes, no encontrado normalmente en un virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje. Se puede insertar una secuencia de nucleótidos que codifica un epitopo antigénico heterólogo en un genoma viral de PRRS norteamericano usando técnicas recombinantes conocidas. Entre los epitopos antigénicos útiles como epitopos antigénicos heterólogos para la presente invención están incluidos epitopos antigénicos adicionales de virus de PRRS norteamericano, epitopos antigénicos de virus de PRRS europeo, epitopos antigénicos de patógenos de animales porcinos que no son virus de PRRS, o epitopos antigénicos de patógenos que infectan patogénicamente pájaros o mamíferos que no son animales porcinos, incluidos seres humanos. Las secuencias que codifican tales epitopos antigénicos son conocidas en la técnica o se proporcionan aquí. Por ejemplo, se puede insertar una segunda proteína de envoltura de virus de PRRS norteamericano, codificada por ORF5 de PRRS norteamericano descrito aquí, en una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA que codifica un virus de PRRS norteamericano de la presente invención para generar un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado que comprende una proteína de envoltura adicional como un epitopo antigénico heterólogo. Tal virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente se puede usar para inducir una respuesta inmunoprotectora más efectiva contra virus de PRRS en un animal porcino vacunado con él.
Los ejemplos de epitopo antigénico de un patógeno de cerdo que no es virus de PRRS incluyen, aunque no únicamente, un epitopo antigénico de un patógeno de cerdo seleccionado entre el grupo constituido por PRRS europeo, parvovirus porcino, circovirus porcino, o rotavirus porcino, gripe de animales porcinos, virus pseudorables, virus de gastroenteritis transmisible, coronavirus respiratorio de porcino, virus de la fiebre clásica de cerdo, virus africano de la fiebre de animales porcinos, virus de encefalomiocarditis, paramixovirus porcino, Actinobacillus pleuropneumoni, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streeptococcus equismilis y Strepcoccus suis. Las secuencias de nucleótidos que codifican epitopos antigénicos de los patógenos de porcino antes mencionados son conocidas en la técnica y se pueden obtener de datos de bases públicas de genes, tales como GenBank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/Web/Genbank/index.html) proporcionados por NCBI.
Si los epitopos antigénicos heterólogos son epitopos antigénicos de uno o más diferentes patógenos animales porcinos, la molécula de polinucleótido aislada puede contener además una o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS. Tales moléculas de polinucleótido aisladas y los virus que codifican son útiles para preparar vacunas para proteger el cerdo frente al patógeno o patógenos de cerdo de los que derivan los epitopos antigénicos heterólogos.
En una realización preferente, el PRRS norteamericano modificado genéticamente es capaz de producir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra una infección por un virus de PRRS en un animal porcino. Tales moléculas de polinucleótido aisladas y los virus que codifican son útiles para preparar vacunas de función dual para proteger el cerdo frente a la infección por virus de PRRS norteamericano y el patógeno o los patógenos de cerdo de los que derivan los epitopos antigénicos heterólogos. En otra realización preferente, el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, útil en una vacuna de función dual, se incapacita genéticamente.
Las moléculas de polinucleótido aisladas de la presente invención que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican epitopos antigénicos heterólogos se pueden preparar como se ha descrito antes basándose en la secuencia que codifica el virus de PRRS norteamericano descrito aquí usando técnicas de biología molecular.
En otra realización preferente más, un epitopo antigénico heterólogo del virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente de la presente invención es un epitopo antigénico detectable. Tales moléculas de polinucleótido aisladas y los virus de PRRS norteamericano que codifican son útiles, entre otras cosas, para estudiar infecciones de PRRS en cerdos, determinar cerdos vacunados con éxito y/o para distinguir cerdos vacunados de cerdos infectados por un virus de PRRS de tipo salvaje. Preferiblemente, tales moléculas aisladas de polinucleótido contienen además una o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS y, más preferiblemente, son capaces de producir una respuesta inmunoprotectora efectiva en un animal porcino contra la infección por un virus de PRRS.
Los epitopos antigénicos heterólogos que son detectables y las secuencias que los codifican son conocidas en la técnica. Los métodos para detectar tales epitopos antigénicos son también conocidos en la técnica y entre ellos están incluidas la detección serológica de anticuerpos específicos para el epitopo antigénico heterólogo mediante, por ejemplo, transferencia Western, ELISA o anticuerpos marcados por fluorescencia capaces de unirse a anticuerpos específicos para el epitopo antigénico heterólogo. Se pueden encontrar métodos para la detección serológica, útiles en la práctica de la presente invención, en textos reconocidos en la técnica, tales como el de Coligan, J.E. y otros (eds.), 1988, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. Alternativamente, el epitopo antigénico heterólogo en sí se puede detectar por ejemplo, poniendo en contacto muestras que potencialmente comprenden el epitopo antigénico con anticuerpos marcados por fluorescencia o marcados radiactivamente que se unen específicamente a los epitopos antigénicos.
La presente invención proporciona además una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente que carece detectablemente de un epitopo antigénico de virus de PRRS norteamericano, en la que la secuencia de DNA que codifica el virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1, excepto que carece de una o más secuencias de nucleótidos que codifican un epitopo antigénico de virus de PRRS norteamericano detectable. Tales moléculas de polinucleótido aisladas son útiles para distinguir entre cerdos infectados con un virus de PRRS norteamericano recombinante de la presente invención y cerdos infectados con un virus de PRRS de tipo salvaje. Por ejemplo, se pueden distinguir animales vacunados con un virus de PRRS norteamericano muerto, vivo o atenuado codificado con tal molécula de polinucleótido aislada, de animales infectados con un virus de PRRS de tipo salvaje basándose en la ausencia de anticuerpos específicos para el epitopo antigénico que falta, o basándose en la ausencia del propio epitopo antigénico: si se detectan en el animal anticuerpos específicos para el epitopo antigénico que falta o el propio epitopo antigénico, el animal se expuso a un virus de PRRS de tipo salvaje y se infectó. Los medios para detectar epitopos antigénicos y anticuerpos específicos para ellos son conocidos en la técnica y se han discutido antes. Preferiblemente, una molécula de polinucleótido aislada de este tipo contiene además una o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS. Más preferiblemente, el virus codificado permanece capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra la infección por un virus de
PRRS.
B. Plásmidos que codifican un virus de PRRS norteamericano o un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente
La presente invención proporciona también cualquiera de las moléculas de polinucleótido antes mencionadas en forma de un plásmido capaz de expresar el virus de PRRS norteamericano codificado por ella.
Los plásmidos de la presente invención pueden expresar el virus de PRRS norteamericano codificado fuera de un organismo vivo para producir virus de PRRS norteamericano de la invención, útiles, entre otros fines, para preparar vacunas. En una realización, un plásmido de la presente invención, capaz de expresar un virus de PRRS norteamericano fuera de un organismo vivo, es un plásmido en el que la transcripción de RNA viral desde él se efectúa in vitro (esto es, extracelularmente); la molécula viral de RNA resultante se transfecta a una célula huésped adecuada usando mecanismos de transfección conocidos, tales como electroporación, lipofección (en algunos casos usando un reactivo asequible comercialmente, tal como Lipofectin^{MC} (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA)), o transfección mediada por dextrano DEAE. Son conocidos en la técnica otros medios de transfección y se pueden emplear en la presente invención. Un ejemplo de tal plásmido para una transcripción in vitro de RNA viral es el plásmido pT7P129A (acceso a ATCC nº. 203488). En tales plásmidos de la invención se puede usar cualquier promotor útil para transcripción in vitro. T7 es uno de estos promotores, pero se pueden usar otros promotores, tales como el promotor SP6 o el promotor T3. Las secuencias de tales promotores se pueden sintetizar artificialmente o clonar de plásmidos asequibles comercialmente. Entre los plásmidos adecuados para preparar tales plásmidos capaces de expresar virus de PRRS norteamericano están incluidos, aunque no únicamente, plásmidos de clonación de vectores para uso general tales como pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), pBR322 y pUC18. Se puede insertar una secuencia de nucleótidos de la presente invención que codifica el virus de PRRS norteamericano en cualquiera de estos plásmidos usando técnicas recombinantes conocidas. Los expertos en la técnica identificarán otros plásmidos en los que se pueden insertar las moléculas de polinucleótido de la presente invención.
Las condiciones adecuadas para la transcripción in vitro de RNA viral de cualquiera de los plásmidos recombinantes antes descritos que comprenden una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano depende del tipo de plásmido, por ejemplo, de su promotor particular, y las puede averiguar un experto corriente en la técnica. Por ejemplo, si el plásmido de la presente invención está basado en un plásmido pCR2.1 que comprende un promotor T7, un ejemplo de condiciones adecuadas para una transcripción in vitro incluye hacer reaccionar el plásmido con RNA-polimerasa T7 y ribonucleótidos en un tampón estándar e incubar la reacción a 37ºC durante aproximadamente 30 min. En algunos casos, hay disponibles kits comerciales para transcribir RNA de un plásmido particular, y en la presente invención se pueden usar tales kits. La mezcla de reacción después de la transcripción se puede transfectar directamente a la célula huésped adecuada sin purificación, o el RNA de virus de PRRS norteamericano transcrito se puede purificar por técnicas conocidas de purificación de RNA, por ejemplo, por extracción orgánica (por ejemplo fenol) y precipitación con un alcohol (por ejemplo etanol o ispropanol), antes de la transfección.
Practicamente cualquier cultivo de células de mamíferos o aves se puede transfectar con el RNA de virus de PRRS norteamericano obtenido como se ha descrito antes con el fin de generar una primera tanda de viriones de PRRS norteamericano. Un ejemplo de células que son particularmente útiles por ser fácilmente asequibles y fáciles de usar son las células BHK (riñón de cría de hamster). Sin embargo, si se desea generar un cultivo de células capaz de una producción sostenida de viriones de PRRS norteamericano, se prefieren las células macrófagas alveolores porcinas o células MARC-145 (Kim, H.D. y otros cita anterior) porque estas células excretan niveles altos de viriones de PRRS de nueva generación después de la infección por virus de PRRS. Para la generación sostenida de viriones de PRRS norteamericano de la presente invención se pueden usar también otras líneas de células derivadas de la línea de células MA-104. Se pueden obtener células macrófagas alveolores porcinas primarias por lavado de la lengua de cerdos, y la línea de células MARC-145 de riñón de mono se puede obtener de los Laboratorios de Servicios Nacionales Veterinarios conocidos como NVSL (Ames, Iowa, USA).
En otra realización, un plásmido capaz de expresar un virus de PRRS norteamericano de la presente invención fuera de un organismo vivo es un plásmido que se transfecta en una célula huésped adecuada, por ejemplo, por electroporación, lipofección o transcripción de la molécula de RNA infecciosa y expresión del virus de PRRS norteamericano que se realiza dentro de la célula huésped transfectada. Por tanto, la célula huésped transfectada genera viriones de PRRS nortemericano. Este procedimiento completamente celular no ha sido descrito ni sugerido nunca hasta el momento para cualquiera de los virus del orden de Nidovirales. A causa de una posible reparación críptica y de secuencias de terminación presentes en el genoma de RNA de virus del orden Nidovirales, se creyó que era improbable un procedimiento completamente celular de expresar un virus Nodovirales. Las secuencias crípticas incluyen las secuencias dadora y aceptora de reparación de RNA, que podrían causar una reparación inapropiada del transcripto de RNA, así como secuencias de poliadenilación, que podrían causar una terminación prematura por la RNA-polimerasa II celular. La presente invención demuestra, sin embargo, que tales secuencias en un plásmido que comprende un clon de cDNA de un Nidovirus no evitan la capacidad del plásmido de expresar el Nidovirus cundo el plásmido se transfecta directamente en una célula huésped adecuada.
Entre los plásmidos adecuados que se pueden usar para preparar plásmidos recombinantes de la presente invención para la expresión completamente celular fuera de un organismo vivo de un virus de Nidovirales, tal como un virus de PRRS, están incluidos virtualmente cualesquier plásmidos útiles para transfección y expresión en células eucariótocas. Un ejemplo de plásmido adecuado para preparar plásmidos recombinantes de la presente invención para expresión completamente celular de un virus Nidovirales es el plásmido pCMVbeta (Clontech, Palo Alto, California, USA). Entre otros plásmidos que son capaces de transfectar y expresar genes en células eucarióticas que se pueden usar para preparar plásmidos de la presente invención están incluidos, aunque no únicamente, pcDNA3.1, pRc/RSV y pZeoSV2 (todos de Invitrogen), y pCMV-Sport3 y pSV-Sport1 (ambos de Life Technologies Inc.). Pero casi cualquier vector eucariótico de expresión funcionará en la presente invención. También se pueden usar las construcciones basadas en cósmidos para expresión completamente celular ex vivo de un virus Nidovirales.
Entre las células huésped adecuadas para el procedimiento completamente celular de la presente invención para expresar virus de PRRS están incluidas células macrófago alveolares de animales porcinos y las células MARC-145 descritas antes. Los procedimientos para transfectar estas células con un plásmido básicamente son los mismos que los procedimientos para transfectar células con RNA viral, descritos antes. Entre tales procedimientos están incluidos, aunque no únicamente, electroporación, lipofección, transfección mediada por DEAE dextrano y coprecipitación con fosfato cálcico.
Una vez que células huésped adecuadas tales como células macrófagas alveolares de porcino o células MARC-145, se han transfectado de acuerdo con la invención en consideración, con RNA viral o con un plásmido de comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un virus, se congelarán las células a aproximadamente -80ºC o una temperatura inferior para almacenarlas durante varios años. Para períodos de tiempo más prolongados, esto es, para décadas, se prefiere el almacenamiento en nitrógeno líquido. Si se prevé un uso relativamente frecuente del virus codificado, las células que alojan el virus se pueden mantener también (no congeladas) en un cultivo usando técnicas conocidas durante períodos de tiempo más cortos. Además, las partículas virales excretadas por tales células se pueden almacenar a aproximadamente -80ºC o menos como fuente de virus. La transfección de tales líneas de células con la molécula de polinucleótido que codifica el virus se puede confirmar, si se desea, por ejemplo, ensayando el medio agotado excretado por la línea de células para un antígeno de virus de PRRS usando un ensayo inmunofluorescente de anticuerpos. Son conocidos en la técnica anticuerpos específicos para antígenos (véase, por ejemplo, Collins, E.J. y otros, WO 93/03760, 4 de marzo de 1993).
En otra realización, un plásmido de la presente invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un virus de PRRS norteamericano es adecuado para expresión in vivo del virus de PRRS norteamericano, esto es, expresión en un organismo vivo. Entre los plásmidos que se pueden usar para preparar plásmidos recombinantes para la expresión in vivo de un virus de PRRS norteamericano están incluidos, aunque no únicamente, plásmidos capaces de transfectar las células eucarióticas descritas antes, tales como pCMVbeta.
Los animales que se pueden transfectar con plámidos de la presente invención incluyen mamíferos y pájaros. Si el animal no es un animal porcino, por ejemplo, es un pavo real, el plásmido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un virus de PRRS norteamericano que además comprende epitopos antigénicos de patógenos que son capaces de infectar patogénicamente el animal; en tal caso, el plásmido codificará un virus de PRRS norteamericano que actúa como vector para transportar epitopos al animal. Si el animal es un animal porcino, usualmente el plásmido puede codificar cualquiera de los virus de PRRS norteamericano descritos aquí, incluidos los virus de PRRS norteamericano genéticamente modificados descritos aquí.
C. Vectores virales que codifican un virus de PRRS norteamericano, incluidos vectores virales que codifican virus de PRRS norteamericano genéticamente modificados
La presente invención proporciona también factores virales que comprenden una secuencia de DNA que codifica una molécula infecciosa de RNA que codifica cualquiera de los virus de PRRS norteamericano descritos aquí, incluidos los virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente descritos aquí. Tales vectores virales son útiles para tansfectar células eucarióticas para la producción de virus de PRRS de la presente invención fuera de un organismo vivo, o para transfectar animales porcinos u otros mamíferos, o aves, con la secuencia que codifica el virus de PRRS norteamericano, para expresión in vivo del virus de PRRS norteamericano.
Son algunos ejemplos de virus que se pueden usar para preparar los vectores virales de la presente invención, virus de animales porcinos, tales como, aunque no únicamente, virus de viruela de cerdo, virus pseudorables, o virus africano de la fiebre de cerdos. Tales virus de cerdos se pueden obtener de los Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios (Ames, Iowa, USA) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos; la Colección de Cultivos de Tipo Americano, conocida como ATCC (Manassas, Virginia, USA) y otras fuentes conocidas. Los vectores virales recombinantes basados en virus de cerdo adecuados tales como los virus de cerdo antes mencionados, son útiles para transfectar cerdos con una secuencia de nucleótidos que codifica un virus de PRRS norteamericano de la presente invención.
Los vectores virales que comprenden una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano de la presente invención basado en estos y otros virus, se pueden preparar usando técnicas recombinantes descritas en textos tales como los citados antes en esta solicitud.
D. Células huésped transfectadas que codifican virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente
La presente invención proporciona también células huésped transfectadas que comprenden una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica cualquiera de los virus de PRRS norteamericano descritos aquí, incluidos los virus de PRRS norteamericano genéticamente modificados descritos aquí, células huésped transfectadas que son capaces de expresar el virus de PRRS norteamericano. Tales células huésped transfectadas son útiles para producir virus de PRRS norteamericano de la presente invención. Entre los ejemplos de células huésped transfectadas de la presente invención están células macrófagas alveolores de porcino transfectadas y las células MARC-145 transfectadas descritas antes.
Entre otras células huésped transfectadas de la presente invención están incluidas, aunque no únicamente, células MA-104 transfectadas y otras derivadas de células MA-104 que están transfectadas; células transfectadas de riñón de crías de hamster (BHK); células transfectadas de ovario de hamster chino (CHO), y células de riñon de mono verde africano que no son células MA-104 o células MARC-145, tales como células VERO, que están transfectadas.
E. Virus de PRRS norteamericano, incluidos virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente
La presente invención también proporciona virus de PRRS norteamericano descritos aquí, incluidos los virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente descritos aquí, expresados y/o codificados por cualquiera de las moléculas de polinucleótido antes descritas, moléculas de RNA, plásmidos, vectores virales o células huésped transfectadas.
En algunos casos, por ejemplo, cuando el virus de PRRS norteamericano se ha de usar en una vacuna para cerdos y el virus de PRRS norteamericano no ha sido modificado genéticamente como se ha descrito antes para que sea incapaz de causar PRRS, es deseable tratar el virus de PRRS norteamericano, por ejemplo, inactivándolo o atenuándolo de manera que no sea capaz de causar PRRS en el cerdo al que se haya administrado. Para inactivar un virus de PRRS norteamericano de la presente invención y que sea así incapaz de causar PRRS en un animal, se pueden usar métodos conocidos. Entre los ejemplos de tales métodos están incluidos, aunque no únicamente, tratamiento con formaldehído, BEI (etilenimina binaria) o BPL (beta-propiolactona). Los métodos de atenuación son también conocidos en la técnica y tales métodos se pueden usar para atenuar un virus de PRRS norteamericano de la presente invención. Se puede atenuar un virus de PRRS norteamericano de la presente invención, por ejemplo, por pasos consecutivos en un cultivo de células.
Si un virus de PRRS norteamericano de la presente invención es para usarlo en un animal que no es un animal porcino, o si ha sido modificado genéticamente como se ha descrito aquí de manera que sea incapaz de producir PRRS en un animal porcino, no es necesario tratar el virus como se ha descrito en el párrafo precedente antes de usarlo en una vacuna.
F. Vacunas y sus usos
La presente invención proporciona también vacunas que comprenden virus de PRRS americano, incluidos los virus de PRRS norteamericano incapacitados para producir PRRS en un animal porcino como se ha descrito antes, moléculas infecciosas de RNA y plásmidos que codifican tales virus de PRRS norteamericano descritos, y vectores virales que codifican tales virus de PRRS norteamericano y moléculas de RNA aisladas según se describe aquí. La invención proporciona también métodos para proteger animales de la infección, que comprenden la vacunación con tales vacunas.
En una realización preferente, la invención en consideración proporciona una vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos según lo descrito aquí, una molécula infecciosa de RNA que codifica tal virus de PRRS modificado genéticamente o un plásmido como se describe aquí, que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, en cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunoprotectora frente a una infección por el patógeno o los patógenos del (los) que deriva(n) el (los) epitopo(s), y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
Tales vacunas se pueden usar para proteger de la infección un mamífero o un pájaro capaz de ser infectado patogénicamente por el patógeno o los patógenos de los que deriva(n)el (los) epitopo(s) antigénico(s). Consecuentemente, la invención en consideración proporciona también un procedimiento para proteger un mamífero o un pájaro de la infección por un patógeno, que comprende vacunar el mamífero o el pájaro con una cantidad de la vacuna descrita en el párrafo precedente efectiva para producir una respuesta inmunoprotectora efectiva en el mamífero o el pájaro frente a la infección por el patógeno.
En otra realización preferente más, la vacuna comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, o una molécula de RNA infecciosa o un plásmido que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, que comprende o codifica uno o más epitopos antigénicos heterólogos de un patógeno de cerdo que no es un virus de PRRS norteamericano. Estas vacunas son útiles para proteger cerdos de la infección por el patógeno o los patógenos porcinos de los que derivan los epitopos antigénicos heterólogos. Si tal vacuna comprende el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, la modificación genética del virus de PRRS norteamericano hace, preferiblemente, que el virus sea incapaz de causar PRRS en cerdos. En otra realización preferente, el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado de la vacuna es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora frente a la infección por virus de PRRS, proporcionando así una vacuna dual para cerdos que protege los cerdos de la infección por el patógeno o los patógenos porcinos del (los) que deriva(n) el (los) epitopo(s) antigénico(s) heterólogo(s), así como de la infección por un virus de PRRS. Si la vacuna comprende una molécula de RNA infecciosa o un plásmido que codifica un virus de PRRS modificado genéticamente que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos de otro patógeno porcino, la secuencia que codifica la molécula de RNA infecciosa que codifica el virus de PRRS modificado genéticamente comprende, preferiblemente, una o más mutaciones más que incapacitan genéticamente el virus de PRRS norteamericano, que no causa así PRRS. En otra realización preferente, el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, incapacitado, es capaz de manifestar una respuesta inmunoprotectora frente a una infección de PRRS en un animal porcino, por lo que proporciona una vacuna dual para cerdos, capaz de proteger los cerdos de la infección por un patógeno o patógenos porcino(s) del (los) que deriva(n) el (los) epitopo(s) antigénico(s) heterólogo(s), así como de la infección por un virus de PRRS. Todas estas vacunas comprenden, además, un vehículo aceptable para uso veterinario.
Las vacunas de la presente invención se pueden formular siguiendo prácticas convencionales para incluir vehículos aceptables para animales, incluidas personas (si son aplicables a ellas), tales como tampones estándar, estabilizadores, diluyentes, conservantes y/o agentes solubilizantes, y se pueden usar también para facilitar una liberación sostenida. Entre los diluyentes están incluidos, agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, etc. Entre los aditivos para impartir isotonicidad están incluidos cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Entre los estabilizadores están incluida la albúmina, entre otros. Otros vehículos y aditivos para vacunas, incluidos los que son particularmente útiles para formular vacuna vivas modificadas, son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 18ª edición, 1990, Mack Publishing.
Las vacunas de la presente invención pueden comprender, además, uno o más componentes inmunomoduladores, tales como, por ejemplo, un coadyuvante o citoquinas, entre otros. Entre los ejemplos no limitativos de coadyuvantes que se pueden usar en las vacunas de la presente invención están incluidos el sistema de coadyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, MT), alum, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, coadyuvantes de Freund completos e incompletos, copolímero Block (CytRx, Atlanta, GA), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), SAF-M (Chiron, Emereyville CA), coadyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, lípido A monofosforílico y el coadyuvante lípido-amina Aviridina. Entre los ejemplos no limitativos de emulsiones de aceite en agua útiles en la vacuna de la presente invención están las formulaciones SEAM62 y SEAM ½ modificadas. SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua que contiene 5% (v/v) de escualeno (Sigma), 1% (v/v) del detergente SPAN® (ICI Surfactants), 0,7% (v/v) del detergente TWEEN® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (v/v) de etanol, 200 \mug/ml de Quil A, 100 \mug/ml de colesterol y 0,5% (v/v) de lecitina. MEAM ½ modificado es una emulsión de aceite en agua que comprende 5% (v/v) de escualeno, 1% (v/v) del detergente SPAN®85, 0,7% del detergente TWEEN 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 \mug/ml de Quil A y 50 \mug/ml de colesterol. En la vacuna se pueden incluir otros agentes inmunorreguladores tales como, por ejemplo, una o más interleuquinas, interferones u otras citoquinas conocidas.
Opcionalmente, las vacunas de la presente invenión se pueden formular para una liberación sostenida del virus, una molécula infecciosa de RNA, un plásmido o un vector viral de la presente invención. Entre los ejemplos de tales formulaciones de liberación sostenida están incluidos virus, una molécula infecciosa de RNA, un plásmido o vector viral en combinación con materiales compuestos de polímeros biocompatibles tales como, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno, etc. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos para suministrar fármacos han sido revisados en varias publicaciones, incluida la de A. Domb y otros, 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292, que se incorpora aquí por referencia. En textos conocidos en la técnica se puede encontrar una guía general para seleccionar y usar polímeros en formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, M. Chasin y R. Langer (eds.), "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Sistems" en Drugs and the Pharmaceutical Sciences, vol. 45, M. Dekker, NY. Alternativa, o adicionalmente, el virus, plásmido o vector viral se puede microencapsular para mejorar la administración y eficacia. Los procedimientos para encapsular antígenos son bien conocidos en la técnica y entre ellos están técnicas descritas, por ejemplo, en la patente U.S. nº. 3.137.631, patente U.S. nº. 3.959.457, patente U.S. nº. 4.205.060, patente U.S. nº. 4.606.940, patente U.S. nº. 4.744.933, patente U.S. nº. 5.132.117 y en la publicación de patente internacional WO 95/28277.
Para una liberación sostenida de virus, plásmidos o vectores virales se pueden usar también liposomas. Los detalles concernientes a cómo usar formulaciones de liposomas se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente U.S. nº. 4.016.100, patente U.S. nº. 4.452.747, patente U.S. nº. 4.921.706 patente U.S. nº. 4.927.637, patente U.S. nº. 4.944.948, patente U.S. nº. 5.008.050 y patente U.S. nº. 5.009.956.
Una cantidad efectiva de cualquiera de las vacunas descritas antes se puede determinar por medios convencionales, comenzando con una dosis baja de virus, plásmido o vector viral y aumentando luego la dosis mientras que se controla el resultado. Se puede obtener una cantidad efectiva después de una sola administración de una vacuna o después de múltiples administraciones de una vacuna. Se pueden tomar en consideración factores conocidos cuando se determina una dosis óptima por animal. Entre tales factores están incluidas la especie, tamaño, edad y estado general del animal, la presencia de otros fármacos en el animal, etc. Preferiblemente, la dosis real se escoge después de considerar los resultados de otros estudios en animales.
Un método para detectar si se ha logrado una respuesta inmune adecuada es determinar la seroconversión y el título de anticuerpo en el animal después de haber sido vacunado. Preferiblemente, el momento para la vacunación y el número de inmunizaciones de recuerdo, si las hay, los determinará el médico o veterinario basándose en factores relevantes, algunos de los cuales se han descrito antes.
La cantidad efectiva de la dosis de virus, molécula de RNA infecciosa, plásmido o vector viral de la presente invención se puede determinar usando técnicas conocidas, considerando factores que puede determinarlos un experto corriente en la técnica, tales como el peso del animal a vacunar. La dosis de virus de la presente invención en una vacuna de la presente invención varía, preferiblemente, de aproximadamente 10^{1} a aproximadamente 10^{9} pfu (unidades que forman placa), más preferiblemente de aproximadamente 10^{2} a aproximadamente 10^{8} pfu y, muy preferiblemente, de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{7} pfu. Preferiblemente, la cantidad de dosis de un pásmido de la presente invención en una vacuna de la presente invención varía de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 mg, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 10 mg, aún más preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 1 mg. La cantidad de la dosis de una molécula de RNA infecciosa de la presente invención en una vacuna de la presente invención varía, preferiblemente, de aproximadamente 0,1\mug a aproximadamente 100 mg, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 10 mg, aún ás preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 1 mg. La cantidad de la dosis de un vector viral de la presente invención en una vacuna de la presente invención varía, preferiblemente, de aproximadamente 10 pfu a aproximadamente 10^{9} pfu, más preferiblemente de aproximadamente 10^{2} a aproximadamente 10^{8} pfu, aún ás preferiblemente de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{7} pfu. Un tamaño adecuado de la dosis varía de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 10 ml y más, preferiblemente de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml.
La presente invención proporciona además un procedimiento para preparar una vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano, una molécula de RNA infecciosa, un plásmido o un vector viral descritos aquí, procedimiento que comprende combinar una cantidad efectiva de un ingrediente entre un virus de PRRS norteamericano, una molécula de RNA infecciosa, un plásmido o un vector viral de la presente invención, con un vehículo aceptable para uso farmacéutico veterinario.
Ha de tenerse en cuenta que el término "virus de PRRS norteamericano de la presente invención" y términos similares, incluyen, a no ser que se indique lo contrario, cualquiera de los virus de PRRS norteamericano modificados genéticamente descritos aquí, así como el virus de PRRS norteamericano descrito aquí codificado por la SEQ ID ID NO:1.
G. Moléculas de polinucleótido aisladas y células huésped transfectadas que codifican péptidos de virus de PRRS norteamericano, y procedimientos para hacer viriones funcionales de PRRS norteamericano
La presente invención proporciona también una molécula de polinucleótido aislada que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la secuencia del genoma del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma de la molécula de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1. Tal como se usan aquí, los términos tales como "péptido de virus de PRRS norteamericano" significan un péptido que expresa un virus de PRRS norteamericano. Tal péptido puede ser, pero no necesariamente, específico para los virus de PRRS norteamericano.
En una realización preferente, una molécula de polinucleátido aislada de la presente invención que codifica un péptido de virus de PRRS norteamericano comprende una secuencia o unas secuencias seleccionadas independientemente entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. Tales moléculas de polinucleótido aisladas son útiles en plásmidos o para preparar vectores virales para transfectar una célula huésped adecuada para crear una célula "cooperadora" que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, siendo la secuencia de genoma del mencionado virus de PRRS norteamericano la misma secuencia de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1, célula cooperadora que es útil en la preparación de viriones funcionales de virus de PRRS norteamericano de la presente invención, virus que han sido modificados genéticamente como se ha descrito antes de manera que carecen en su genoma de RNA de la(s) secuencia(s) que codifica(n) el péptido o los péptidos codificados por la célula cooperadora.
Consecuentemente, la invención en consideración incluye también plásmidos y factores virales que comprenden una o más secuencias de nucleótidos que codifican un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, siendo la secuencia del genoma del mencionado virus de PRRS norteamericano la misma secuencia de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1. Tales plásmidos de la invención pueden estar basados en los plásmidos descritos antes, útiles para preparar plásmidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un virus de PRRS norteamericano. Tales vectores virales de la invención pueden estar basados, por ejemplo, en vectores de retrovirus o vectores virales adeno-asociados. Estos plásmidos y vectores virales son útiles para preparar las células cooperadoras descritas en el párrafo precedente.
La presente invención proporciona también una célula cooperadora, esto es, una célula huésped transfectada que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la secuencia genómica del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma secuencia de RNA que corresponde a SEQ ID NO:1. En realizaciones preferentes, la célula huésped transfectada comprende una secuencia o unas secuencias de nucleótidos seleccionadas entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. Estas células cooperadoras son útiles como se ha descrito antes para proporcionar péptidos para complementar moléculas de RNA infecciosas dedicientes en secuencias que codifican el (los) péptido(s) codificado(s) por la célula cooperadora, de manera que la célula puede generar viriones funcionales de un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado.
Las células adecuadas para este aspecto de la invención incluyen las células descritas antes que son adecuadas para expresar virus de PRRS norteamericano, tales como células macrófago alveolares de animales porcinos y células MARC-145. Pero prácticamente se puede usar cualquier célula de mamífero o ave. Como se ha discutido antes, si se desea obtener una célula huésped transfectada capaz de ser reinfectada por viriones de PRRS y ser así capaz de generar in situ múltiples generaciones de viriones funcionales de PRRS norteamericano modificados genéticamente, se prefieren células macrófagas alvelolares de animal porcino y células MARC-145.
La invención en consideración proporciona además un procedimiento para generar un virión funcional de un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, codificado por una secuencia de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1 que comprende una o más mutaciones que incapacitan una o más secuencias que codifican péptidos, procedimiento que comprende transfectar una célula cooperadora huésped según se ha descrito en el párrafo precedente con una molécula de RNA infecciosa, un plásmido o un vector viral que codifica el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, célula cooperadora que comprende una secuencia o unas secuencias de nucleótidos que codifican el péptido o los péptidos de virus de PRRS norteamericano de la(s) secuencia(s) incapacitadas que codifican el péptido del virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado.
Son moléculas de RNA infecciosas, plásmidos y vectores virales que codifican un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, útiles en los métodos anteriores para generar un virión funcional de un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, las moléculas de RNA infecciosas, los plásmidos y los factores virales descritos en esta solicitud.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un clon de cDNA infeccioso de un aislado de virus de PRRS norteamericano Fuente de virus de PRRS y células MARC-145
Se obtuvo un aislado de virus de PRRS norteamericano, designado P129, de los doctores Gregory W. Stevenson, William G. Van Alstine y Charles L. Kanitz, del Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades de Animales de la Purdue University, en West Lafayette, Indiana. El virus P129 se aisló originalmente en otoño de 1995 de una piara de cerdos que había tenido una severa epidemia de PRRS. La granja no tenía historia anterior de problemas de PRRS o de vacunación contra PRRS. El aislado P129 era más virulento que otros aislados del mismo tiempo y misma zona geográfica en cuanto a que producía en lechones una enfermedad respiratoria más severa y duradera. Inicialmente, el virus se aisló en macrófagos alvelolares de animal porcino (la célula huésped natural) y posteriormente se pasó a células MARC-145 (Kim, H.S. y otros, 1993, Arch. Virol. 133:477-483). Se encontró que los genes que codifican proteínas estructurales de P129 eran homólogos a las correspondientes secuencias de genes de PRRS norteamericano conocidas.
La línea de células MARC-145 que se usó para propagar los virus de PRRS es un clon de la línea de células de riñon de mono macaco MA-104 Rhesus. Las células MARC-145 se obtuvieron de los National Veterinary Services Laboratories (NVSL, Ames, Iowa) de la USDA. El ensayo de estas células dió resultados negativos para micoplasmas y para agentes porcinos comunes extraños. Las células MARC-145 se hicieron crecer rutinariamente a 37ºC en OptiMEM (Life Technologies InC.) con 2% de suero fetal bovino y antibióticos.
Se purificaron en placas cinco clones biológicos de la provisión de virus P129, y se designaron 129A a 129E. La purificación en placas se realizó infectando monocapas de células MARC-145 con virus P129, añadiendo una capa de cobertura de OptiMEM que contenía 1,25% de SeaPlaque agarosa (FMC BioProducts), 2% de suero fetal bovino y antibióticos. Las placas eran claramente visibles después de incubar durante 7 días, y al cabo de ese tiempo se escogieron 5 placas bien aisladas y se pasaron sobre monocapas frescas de MARC-145. Cuando se puso de manifiesto el efecto citopático (muerte celular inducida por el virus), el virus de progenie de cada uno de estos cultivos se sometió a otra tanda de purificación en placas. Se eligió una capa bien aislada de cada uno de los cinco clones y se expandió para producir grandes provisiones. Se ensayaron los cinco clones en cuanto a su virulencia en lechones, bien individualmente (clones A y E) o en combinación (clones B-D o clones A-E). En todos los casos, el virus purificado en placa replicó bien en cerdos y causó enfermedad clínica. La severidad de los síntomas clínicos era menor que la causada por el virus P129 no clonado, incluso cuando se usaron juntos los cinco clones. Se escogió el P120A para secuenciar y se usó en posteriores manipulaciones moleculares.
Determinación de la secuencia de genoma de P129A
Se usó el virus P129A purificado en placa para la determinación de la secuencia después de 10 pasadas seriales desde el cerdo (incluidas dos purificaciones en placa y una pasada posterior). La SEQ ID NO:1 revela la secuencia de cDNA que corresponde al genoma de RNA de P129A. El genoma tiene una longitud de 15.395 nucleótidos (excluida la cola de poliadenosina), comienza con ATGACGTA y acaba con CCGCAATT. En SEQ ID NO:1 se proporciona también una típica cola de poliadenosina de 55 restos.
Para los genes estructurales de P129A (ORFs 2 a 7), que comprenden el 20% de 3' del genoma, se escogieron varios cebadores sobre la base de varias secuencias parciales de cDNA de otros aislados de virus de PRRS norteamericano obtenibles de la base de datos pública GenBank de secuencias de DNA (por ejemplo, PRU00153). Se transcribió inversamente en cDNA RNA viral purificado usando transcriptasa inversa y cebadores hexámeros al azar. Este cDNA se usó luego en PCR con cebadores específicos para genes. Los productos de PCR se separaron de los geles y se clonaron T/C en el plásmido pCR2.1 (Invitrigen). Para cada par de cebadores se secuenció DNA de múltiples plásmidos (de reacciones independientes de PCR). Se conjuntaron las secuencias usando el programa Seqman del paquete Lasergene (DNASTAR, Inc). Esto permitió completar la secuencia de las posiciones 11.922 a 15.347 del genoma de
P129A.
También en la base de datos GenBank hay una serie de secuencias cortas (aproximadamente 218 nucleótidos en total) que comprenden una parte del gen de ORF1b de varios aislados de virus de PRRS. Se usó uno de éstos (PPSSEQB) para designar cebadores para PCR (adelante 5'-ACAGTTTGGTGATCTATG-3' (SEQ ID NO:10) que corresponde a las posiciones 9063-9080; inverso 5'-CAGATTCAGATGTTCAA-3' (SEQ ID NO: 11) que corresponde a las posiciones 9252-9268). Estos amplificaban un fragmento de 206 nucleótidos que incluye 171 nucleótidos de secuencia nueva del gen P129A ORF1b que corresponde a las posiciones 9081 a 9251. Se designó un nuevo cebador de cabecera dentro de la región (5'-ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3' (SEQ IDNO:12), POSICIONES 9201-9224) y se designó dentro de ORF 1b un cebador de acoplamiento corriente arriba de ORF2 (5'-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAATGA-3' (SEQ ID NO:13), posiciones 12.027-12050). Estos cebadores se usaron en PT-PCR para amplificar un fragmento de 2850 nucleótidos de ORF1b, que corresponde a las posiciones 9201-12.050 del genoma de P129A.
Durante la amplificación por RT-PCR de ORF5 de otro aislado de campo norteamericano del virus de PRRS, se vio una banda menor que era menor que el tamaño esperado. Esta se secuenció y se encontró que tenía una homología limitada con ORF 1a del virus de Lelystad (resultante del cebador falso). Se seleccionaron nuevos cebadores dentro de esta región para amplificar P129A (adelante 5'-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3' (SEQ ID NO:14) que corresponde a las posiciones 1587-1610; inverso 5'-AGAGCGGCTGGGATGACACTG-3' (SEQ ID NO:15) que corresponde a las posiciones 1877-1897). Además del producto de 311 nucleótidos (266 nucleótidos de la nueva secuencia de P129A entre los cebadores que corresponden a las posiciones 1611-1876), se clonó un producto minoritario de PCR más grande de 701 nucleótidos y se secuenció (656 nucleótidos de la nueva secuencia de P129A entre los cebadores correspondientes a las posiciones 1611-2264). La banda mayor es resultado del cebado falso del cebador inverso en las posiciones 2265-2269.
Se determinó por 5'-RACE (determinación rápida de extremos de cDNA) el terminal extremo 5' del genoma de P129A usando un kit disponible en el comercio (Life Technologies Inc). Se eligieron dos cebadores inversos anidados de dentro de la secuencia de ORF1 conocida ("RACE2" 5'-CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3' (SEQ ID NO: 16), posiciones 1917-1938, y "RACE3" 5'-AGGGGGAGCAAAGAAGGGGTCATC-3' (SEQ ID NO: 17), posiciones 1733-1756). Se usó RACE 2 para cebar la síntesis de cDNA, mientras que se usó RACE3 en PCR. Los productos de PCR resultantes se clonaron y secuenciaron. Los dos productos más largos terminaban precisamente en la misma base (posición 1 en la SEQ ID NO:1).
El gran resquicio entre secuencias conocidas en ORF1a y ORF1b se puenteó usando RT-PCR larga. Se usaron dos nuevos cebadores (adelante 5'-AGCACGCTCTGGTGCAACTG-3' (SEQ ID NO: 18), posiciones 1361-1380; inverso 5'-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3' (SEQ ID NO: 19), posiciones 9420-9438). El producto de RT-PCR de 8078 nucleótidos se clonó y secuenció.
El terminal extremo 3' del genoma de P129A se determinó ligando juntos los terminales 3' y 5' del RNA viral y usando RT-PCR para amplificar el fragmento de unión. Los fragmentos de unión resultantes se clonaron y secuenciaron. En resumen, RNA extraído de viriones peletizados se trató con pirofosfatasa ácida de tabaco (para eliminar las estructuras de cabeza 5') luego se autoligó con T4 RNA ligasa (ambas de Epicentre Tachnologies). Los cebadores usados eran 5'-CGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3' (SEQ ID NO:20) (adelante, posiciones 15.218-15.239) y 5'-CGGTAGGTTGGTTAACACATGAGTT-3' (SEQ ID NO:21), inversa, posiciones 656-680) o 5'-TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3' (SEQ ID NO: 22) (inverso, posiciones 337-359). Todos los clones resultantes se truncaron en el extremo 5' del genoma (el más completo quedó dentro de 57 nucleótidos del extremo real 5', como se reveló por 5' RACE), pero dos de estos clones contenían el extremo 3' completo del genoma, incluida la cola de adenosina (restos 42 y 55 de adenosina de longitud). Esto completó la secuenciación del genoma de cDNA 15.450 de base del P129A aislado de PRRS, incluida la cola PoliA, como se ve en la SEQ ID NO:1.
Creación de un clon de cDNA infeccioso de longitud completa de P129A
Se formó un clon infeccioso de cDNA de P129A, designado pT7P129A con cuatro productos clonados de RT-PCR que se solapaban. Primeramente, los cuatro productos de RT-PCR se clonaron T/A en plásmido pCR2.1 (Invitrogen) y se transfectaron en DH5-alfa de cepa Eschirichia coli. Se exploraron colonias bacterianas y se escogieron para secuenciación y posterior manipulación las que contenían insertos de los tamaños esperados en la orientación "T7 a M13". Los cuatro productos de RT-PCR clonados contenían una o más mutaciones no silentes (desviaciones de la secuencia de nucleótidos consensuada para P129A de SEQ ID NO:1 que darían por resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos de los ORFs codificados). Estas mutaciones no silentes (salvo una en la posición 12.622 de ORF2) se repararon subclonando fragmentos de otros productos de RT-PCR clonados. Los cuatro clones subgenómicos reparados se reunieron de manera escalonada en un clon de longitud completa usando sitios de restricción (véase Fig 1). Los extremos 5' y 3' del cDNA que corresponde al genoma de P129A en pT7P129A se modificaron añadiendo un promotor T7 y sitios apropiados de endonucleasa de restricción. La construcción de pT7P129A se describe más detalladamente en los párafos siguientes:
Se modificó el terminal 5' del genoma (posiciones 1-1756), generado por 5'-RACE y clonado en pCR2.1 como se ha descrito antes, para incluir un promotor T7 inmediatamente corriente arriba del cDNA que corresponde al genoma de P129A y un sitio PacI para posterior clonación. Se realizó una clonación de 3 vías usando el fragmento Dsai-BseRI de 1216 bp de este plásmido (que contenía las bases 27-1242 de P129A), el fragmento BseRI-XbaI de 4407 bp del mismo plásmido (que contenía las bases 1243-1756 de P129A y el vector de plásmido entero hasta el sitio XbaI) y el siguiente adaptador sintético de doble cadena (SEQ ID NOS: 23 y 24):
30
El transcripto predicho del promotor T7 incluye un resto "G" individual del promotor inmediatamente corriente arriba del primer "A" del genoma viral. Se reparó una mutación no silente en la posición 1230 (A a G) reemplazando el fragmento AafII-SacII de 906 bp (bases 740-1645) con el mismo fragmento de otro clon. Este plásmido se designó "pT7R3A-2".
El producto de PCR de 8078 nucleótidos descrito antes se usó para cubrir las bases 1361-9438 del genoma de P129A. Se corrigieron una supresión de 58 bp (posiciones 2535-2592) y 7 mutaciones no silentes subclonando fragmentos de otros productos de RT-PCR, resultando el plásmido "pGAP10B-4". El fragmento Bsu36l-SpeI de 7837 bp del plásmido se ligó al fragmento Bsu36l-SpeI de 5482 de pT7R3A-2. El plásmido "pT7RG" resultante contiene las primeras 9438 bases del genoma de P129A detrás del promotor T7.
Se corrigió el fragmento de 2850 nucleótidos de PORF1b descrito antes (posiciones del genoma 9201-12.050) para reparar mutaciones no silentes designadas "p1B3A-2". El fragmento NdeI-SpeI de 2682 bp de este plásmido se ligó al fragmento NdeI-SpeI de 13.249 bp de pT7RG para que resultara el plásmido "pT71A1B" que contiene las primeras 12.050 bases del genoma de P129A.
El cuarto y final fragmento del genoma de P129A se derivo por RT-PCR de los ORFs 2 a 7, incluida la región 3'-no traducida y una porción de la cola de poliA. El cebador de cabecera era 5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3' (SQ ID NO:25) (posiciones 11.504-11.530) y el cebador inverso era GGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTGCGGCCGCATGGTTCTCG-3' (SEQ ID NO:26). El cebador inverso contiene las 22 últimas bases del genoma de P129A (posiciones 15.374-15.395), una cola de poliA de 21 bases, un sitio NsiI (ATGCAT) y un sitio SwaI ATTTAAAT). Se repararon mutaciones puntuales no silentes y una supresión de base individual subclonando fragmentos de otros clones. En esta etapa se introdujo inadvertidamente una mutación puntual no silente adicional en la posición 12.622 (A a G). Esto dio por resultado un cambio de glutamina a arginina cerca del término C de la proteína de ORF2 (resto aminoácido 189 de los 256 aminoácidos de ORF2 que no afecta a ORF3 que se solapa). Esta mutación no tenía aparentemente influencia sobre el crecimiento de virus en cultivos de células o en cerdos, y no se reparó. Esta mutación actuaba como marcador genético para distinguir virus derivados del clon de cDNA de una posible contaminación con P129A parenteral u otros virus de PRRS. El plásmido se designó "p2_7D-4". Se añadieron restos estructurales de P129A al resto del genoma ligando el fragmento Eco47III-SpeI de 3678 bp de p2_7D-4 al fragmento Eco47III-SpeI de 15.635 bp de pT71A1B.
Así se obtuvo la construcción final "pT7P129A", que comprende cDNA que corresponde casi idénticamente al genoma entero de P129A (pero con sólo una cola de poliA de 21 bases, en oposición a la cola de poliA de 55 bases) detrás de un promotor T7, clonado en el vector pCR2.1 entre sitios de enzimas singulares de restricción (PacI y SwaI). La longitud completa de pTPT129A es de 19.319 bp, y es estable en DH5-alfa de cepa de E. coli. PT7P129A contiene una mutación puntual no silente A a G en la posición 12.622 que da por resultado una arginina en la posición 189 de ORF2, y no una glutamina (como es codificada por la SEQ ID NO:1), y una mutación silente C a T en la posición 1559. Ninguna de estas mutaciones afectaba al crecimiento viral en las condiciones examinadas, tanto en cultivo de células como en cerdos. Por ejemplo, se usó pT7P129A para transcripción in vitro y los transcriptos de RNA resultantes produjeron virus vivo de PRRS norteamericano cuando se transfectaron a células MARC-145, lo que demostró que este clon de longitud completa era infeccioso.
Transcripción in vitro y transfección de transcriptos de RNA
En el plásmido pT7P129A hay dos promotores T7 en serie corriente arriba del genoma viral. Uno de éstos está situado inmediatamente corriente arriba del genoma viral y se construyó en el cebador de PCR como se ha descrito antes. El otro está presente en el vector de clonación pCR2.1 y está situado fuera del sítio de clonación múltiple (iniciando la transcripción 44 bases corriente arriba del genoma viral). Se usó PacI para cortar entre estos promotores T7 antes de la transcripción in vitro para generar un transcripto que estaba más próximo al RNA viral auténtico (un G extra individual inmediatamente corriente arriba del genoma viral, en oposición a las 44 bases extra del promotor distal T7). Además, el pT7P129A se cortó con SwaI antes de la transcripción in vitro. Los transcriptos de salida resultantes incluyen una cola de poliA de una longitud de 21 bases y nueve nucleótidos que no son de PRRS, incluido un sitio NsiI (que no se usó para linearizar el plásmido, puesto que el sitio se presenta también una vez en el genoma viral). El plásmido digerido se purificó por extracción con fenol y precipitación con etanol antes de usarlo.
Para la transcripción in vitro se usó un kit comercial (T7 Cap-Scribe, Boheringer Mannheim). El pelet anterior de DNA, que contenía aproximadamente 0,6 \mug de pT7P129A digerido con PacI/Swai, se puso en suspensión en 20 \mul de tampón Cap-Scribe T7/T7 polimerasa y se incubó a 37ºC durante 30 min. Una porción de la mezcla de reacción se analizó por electroforesis en gel de agarosa y reveló que tenía transcriptos de RNA de longitud completa además de las bandas de DNA esperadas de 15.445 bp y 3868 bp. La mezcla de reacción de transcripción in vitro se usó fresca, seguidamente a la incubación, sin purificarla. Las monocapas recientemente confluentes de células MARC-145 se lavaron una vez en OptiMEM (sin suero) y se cubrieron con 1 ml por pocillo de 35 mm de OptiMEM (sin suero) que contenía 500 \mug/ml de dextrano de DEAE (peso molecular, aproxim. 500.000, Pharmacia Biotech.). Se añadió inmediatamente la mezcla reacción de transcripción in vitro (15 \mul). Después de 1 h a 37ºC, se eliminó la mezcla de transcripción, se lavaron las monocapas una vez con PBS y se cubrió a 1,25% de agarosa SeaPlaque (FMC Corporation) en OptimEM con 2% de suero fetal bovino y antibióticos. Después de 5 días a 37ºC era visible una capa individual. Este virus se designó "rP129A-1", se expandió sobre células MARC-145 y se caracterizó en cultivo de células y cerdos. Posteriores transfecciones de RNA de pT7P129A transcriptas in vitro, usando tanto dextrano de DEAE como electroporación, han dado muchas placas adicionales.
Caracterización del virus rP129A-1 recombinante
No hay diferencias aparentes en la cinética de crecimiento, el rendimiento o la morfología de la placa entre el virus recombinante rP129A-1 derivado de cDNA y su matriz no recombinante P129A. Como se ha discutido antes, hay dos diferencias en la secuencia de nucleótidos entre la secuencia de codificación de pT7P129A y la secuencia de consenso de P129A (representada en la SEQ ID NO:1). Primeramente, en la posición 1559, pT7P129A contiene un T, mientras que P129A contiene un C (una mutación silente). Segundo, en la posición 12.622, pT7P129A contiene un G, mientras que P129A contiene un A (es el cambio de la glutamina a arginina en ORF2 descrito antes). Con el fin de excluir la posibilidad de que rP129A-1 sea realmente un virus contaminante de PRRS, se realizó la RT-PCR y la secuenciación en las regiones en torno a estas dos diferencias. En el caso de ambos marcadores genéticos, rP129A-1 era idéntico al plásmido pT7P129A y diferente del virus parenteral P129A, lo que confirma que rP129A-1 deriva del clon infeccioso de cDNA.
Caracterización del virus recombinante rP129A-1 en cerdos
Se comparó el virus rP129A-1 derivado de cDNA con su matriz P129A no recombinante en cuanto a su capacidad para infectar lechones y causar una enfermedad clínica en ellos. Se infectaron con P129A, rP129A-1 o simuladamente con medio de cultivo, tres grupos de 10 cerdos cada uno de 4 semanas de edad, de una manada negativa a PRRS. Se controlaron las señales clínicas, las temperaturas rectales y los pesos corporales. Se extrajo sangre los días 0, 2, 6, 10 y 13 después de infectar para determinar la viremia sérica (por ensayo en placa en células MARC-145, Fig. 2) y anticuerpos séricos (por ELISA, usando PRRS HerdCheck de IDEXX, Fig. 3). Después de necropsia se examinaron las lesiones importantes y microsópicas. No había diferencias significativas entre los dos grupos infectados, lo que indica que rP129A-1 replica en cerdos y causa una enfermedad clínica que cuantitativa y cualitativamente es similar a la causada por su virus matriz no recombinante.
Ejemplo II Supresión de ORF7 (gen de nucleocápsido) de virus de PRRS norteamericano; preparación de una vacuna con defecto de replicación, negativamente marcada
El gen de nucleocápsido viral (ORF7) se eliminó parcialmente de un clon infeccioso de cDNA del virus de PRRS de la presente invención. Era de esperar que el virus de PRRS recombinante modificado resultante no tendría replicación. Este virus de PRRS recombinante modificado se podría usar como una vacuna para inducir una respuesta inmune a proteínas de otros virus de PRRS sin los riesgos de enfermedad clínica, extensión a animales no vacunados o reversión a virulencia con vacunas vivas atenuadas. Además de ser muy segura, la vacuna con tal virus estaría también "negativamente marcada" en el sentido de que permitiría una exposición a aislados de campo de virus de PRRS a determinar serológicamente, incluso en presencia de anticuerpos para el virus de la vacuna. Los anticuerpos para proteína de ORF7 se encuentran comúnmente en el suero de cerdos infectados con virus de PRRS, mientras que los cerdos vacunados con un PRRSV del que se eliminó ORF7 no tendrían anticuerpos para la proteína de ORF7.
La eliminación de ORF7 de un clon infeccioso se hizo como sigue: Se usó el plásmido p2_7D-4 (véase Fig. 1) como molde en PCR para amplificar las regiones que flanquean 5' y 3' corriente arriba y corriente abajo de ORF7. El cebador de adelante del flanco corriente arriba 5'-ATTAGATCTTGCCACCATGGTGGGGAAATGCTTGAAC-3' (SEQ ID NO:27) (que se une a las posiciones genómicas 13.776-13.791 cerca del comienzo de ORF5 y contiene sitios de restricción adicionales que son irrelevantes para la clonación corriente) y el cebador inverso corriente arriba 5'-CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGGTTTAC-3' (SEQ ID NO:28) (que se une a las posiciones del genoma 14.857-14.902 en la unión de los ORG 6 y 7) amplificaron un fragmento de 1147 bp. El cebador inverso introdujo sitios MluI y AflI y un cambio de una base individual en la posición 14.874, destruyendo el codón de partida ATG para ORF7 sin alterar la tirosina codificada en ORF6 que solapa. Para el flanco corriente abajo, el cebador delantero 5'-CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3' (SEQ ID NO:29) (posiciones 14.884-14.941 cerca del extremo 5' de ORF7, introdujo un sitio MLuI) y el cebador inverso 5'-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3' (SEQ ID NO:30) (aguas abajo del genoma viral en el plásmido pCR2.1) amplificó un fragmento de 462 bp. Se realizó una ligación de 3 vías usando el fragmento BsEII-MluI de 611 bp del producto de PCR del flanco corriente arriba, el fragmento MluI-SpeI de 575 bp del producto de PCR del flanco corriente abajo y el fragmento BsEII-SpeI de 6653 bp del plásmido p2_7D-4 (todos los plásmidos se purificaron en gel después de digestión). El plásmido p2_7Ddelta7+7023 resultante se eliminó en los primeros siete aminoácidos de ORF7 y carece de un codón de partida ATG funcional. Para facilitar la clonación direccional de genes foráneos en el espacio previamente ocupado por el extremo 5' de ORF7, se han insertado dos nuevos sitios de restricción que están ausentes en el genoma viral y en el espinazo del plásmido, AfIII y MluI.
Los cambios hechos en p2_7Ddelta7+7023 se incorporaron en el clon genómico de longitud completa ligando el fragmento Eco47III-SpeI de 3683 bp de p2_7Ddelta7+7023 con el fragmento Eco47III-SpeI de 15.214 bp de pCMV-S-p129. El plásmido pCMV-S-p129delta7+7023 resultante se uso para transfectar células.
Puesto que el nucleocápsido es esencial para el crecimiento viral, es necesario proporcionar esta proteína para poder generar y replicar un virus de PRRS deficiente en ORF7. Esto se puede realizar usando un virus cooperador o una línea de células complementaria, por ejemplo. Se podrían crear líneas de células MARC-145 que expresan ORF7 transfectando establemente células con un plásmido que contiene el gen ORF7 de P129A y el gen de resistencia a la neomicina. Después de hacer la selección en cuanto a la resistencia a la neomicina usando el G418 antibiótico, se podrían expandir y caracterizar colonias de células individuales. Para generar virus P129 deficientes en ORF7 se podrían transfectar con RNA de pT7P129delta7 líneas de células clónicas derivadas de MARC-145 que fueran positivas para expresión de ORF7 por inmunofluoresecencia y RT-PCR.
Se podrían usar estrategias similares para generar virus de PRRS deficientes en otros genes estructurales (ORFs 2, 3, 4, 5 o 6) o deficientes en todos o en partes de genes no estructurales 1a y 1b. Además, se pueden realizar múltiples supresiones en un virus individual de PRRS y éstos se pueden hacer crecer complementando células que proporcionan todas las funciones necesarias. Tales virus de PRRS deficientes en genes probablemente están total o parcialmente atenuados en cerdos, siendo así útiles como vacunas contra el PRRS. También pueden usarse para distinguir animales vacunados de animales infectados con un virus de PRRS de tipo salvaje, como se ha discutido antes, y/o como vectores para vacunar animales con epitopos de otros patógenos porcinos (véase el Ejemplo III siguiente).
Ejemplo III Inserción de genes heterólogos en el genoma de virus de PRRS norteamericano; uso de virus de PRRS como vector, y un virus de PRRS norteamericano marcado positivamente
En el anterior Ejemplo II, se insertaron sitios de restricción de enzimas SfIII y MluI en la región primeramente ocupada por el extremo 5' de ORF7. Estos sitios no estaban presentes en el genoma de P129A ni en los plásmidos pCR2.1 y pCMV, y se pueden usar en la clonación direccional de genes foráneos (heterólogos) en el genoma viral para expresión. Los sitios potenciales de unión líder para transcripción del RNA subgenómico de ORF7 en las posiciones 14.744-14.749 (ATAACC) y 14.858-14.863 (TAAACC) no están afectados por la supresión de la secuencia que codifica ORF7 y pueden funcionar en la transcripción de un gen foráneo. Los genes foráneos (heterólogos) pueden incluir genes de otros aislados de virus de PRRS o genotipos y/o genes de otros patógenos que no son de PRRS, bien patógenos que infectan cerdos o bien patógenos que infectan mamíferos que no son porcinos, o aves.
Además, estos genes foráneos (o porciones de ellos) pueden proporcionar epitopos antigénicos que normalmente no se encuentran en cerdos. Tales epitopos se pueden usar para "marcar positivamente" una vacuna, de manera que se pueda controlar serológicamente una vacunación exitosa incluso en presencia de un anticuerpo a suministrar, o cepas de vacunas convencionales de virus de PRRS. No es necesario que un marcador positivo sea una casete de expresión. Un epitopo antigénico se puede fusionar a genes estructurales de virus de PRRS. Por ejemplo, el cebador inverso del flanco corriente arriba descrito en el anterior Ejemplo I se puede extender de manera que se añada una fusión terminal carboxilo de un epitopo antigénico de virus no de PRRS a la proteína de membrana de ORF6. La presencia de un anticuerpo para este epitopo indica que la vacunación ha tenido éxito.
Ejemplo IV Expresión celular de un virus de PRRS por transfección directa de cDNA en células
El vector de expresión eucariótica pCMV-MC1 (SEQ ID NO:31) se derivó del plásmido pCMVbeta disponible comercialmente (Clontech) reemplazando la secuencia codificadora LacZ entre dos sitios NotI con un conector que contiene los sitios Not I, EcoRV, Avr II, Bg II, Cla I, Kpn I, Pac I, Nhe I, Swa I, Sma I, Spe I y Not I. La modificación del promotor temprano inmediato CMV humano se realizó sustituyendo la secuencia entre los sitios Sac I y el segundo Not I de pCMV-MC1 con un conector sintético (que se representa más adelante). El conector contiene un semisitio medio para Sac I seguido de Pac I, Spe I y un semisitio para Not I. Después de anillar los dos oligonucleótidos de cadena simple, el conector se clonó en pCMV-MC1 entre los sitios Sac I y Not I y se designó pCMV-S1 un clon seleccionado. El sitio Spe I-S1 de pCMV no se pudo cortar, posiblemente debido a un error en la oligosecuencia. Por tanto, el fragmento entre Pac I y Hind III en pCMV-S1 se reemplazó con el fragmento Pac I (en la posición 877) - Hind III (en la posición 1162) de pCMV-MC1. Así se recuperó un sitio Spe I. La construcción final (pCMV-S) se usó para clonar el genoma de P129 de longitud completa.
Secuencia del conector (SEQ ID NOS: 32 y 33):
31
Se modificó la secuencia inmediatamente corriente arriba del extremo 5' del genoma de P129 para que contuviera un espaciado apropiado y un sitio de restricción de enzima conveniente (Pac I). Esto se hizo diseñando cebadores por PCR (SEQ ID NOS: 34 y 35) para amplificación de pT7129. Después de digestión con Pac I y Aat II, este fragmento de PCR se subclonó en los sitios Pac I y Aat II de pT7RG (Fig. 1). El plásmido resultante se designó pT7RG-deltaT7.
La construcción final se completó subclonando las secuencias virales de pT7RG-deltaT7 en los sitios Pac I y Nde I en pT7P129, creando pT7P129-deltaT7. El genoma de P129 de longitud completa se digerió de pT7P129-deltaT7 en Pac I y Spe I y se transfirió a pCMV-S en los sitios Pac I y Spe I. Esta construcción se denominó pCMV-S-P129.
La secuencia de la región de modificación entre la caja de TATA del promotor de CMV y el extremo 5' de la secuencia P129 de pCMV-S-P129 se presenta en la SEQ ID NO:36 y se reproduce esquemáticamente como sigue:
32
Con el fin de comprobar el uso del promotor de CMV para iniciar la infección con virus de PRRS en células, el
DNA del plásmido pCMV-S-P129 (0,5 o 1,0 \mug) se transfectó en células MARC-145 por lipofección usando Lipofec-
tamina^{MC} (Life Technologies Inc). Se observó un efecto citopático específico del virus de PRRS después de la transfección y se determinó la presencia de antígeno del virus de PRRS por el ensayo inmunofluorescente de anticuerpos.
Se generó eficientemente virus de PRRS a partir de pCMV-S-P129 y el virus de progenie se pudo pasar a células de MARC-145. Esto demuestra que se puede iniciar una infección por virus de PRRS directamente desde un cDNA de plásmido que codifica un virus de PRRS, sin una etapa de transcripción in vitro. Además, el pCMV-S-P129 generó una mayor cantidad de virus de progenie en comparación con plásmidos en los que el extremo 3' del promotor de pCMV no estaba inmediatamente al frente del inicio de la secuencia que codifica el virus de PRRS norteamericano.
Ejemplo V Supresión de ORF4 del virus de PRRS norteamericano, preparación con él de una vacuna con defecto de replicación
Se suprimió una porción del gen para ORF4, que codifica una glicoproteína de membrana, de un clon infeccioso de cDNA del virus de PRRS de la presente invención. Se espera que el virus de PRRS modificado recombinante de la presente infección tenga defecto de replicación en cerdos y sea capaz de inducir una respuesta inmune a otras proteínas de virus de PRRS sin los riesgos de enfermedad clínica, extensión a animales no vacunados o reversión a virulencia asociada a vacunas vivas atenuadas.
La supresión de ORF4 de un clon infeccioso se realizó como sigue. Se usó el plásmido p2_7D-4 véase la Fig. 1) como molde en PCRpara amplificar las regiones del flanco 5' y 3' corriente arriba y corriente abajo de ORF4. El cebador delantero del flanco corriente arriba era 5'-AGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCC
TTCT-3' (SEQ ID NO:37). Este cebador se une a las posiciones 13194-13241, cerca del inicio de ORF4, e introduce una mutación en la posición 13225 que destruye el codón de partida ATG de ORF4 sin alterar la secuencia de aminoácidos que se solapa de ORF3. El cebador inverso del flanco corriente arriba era 5'-TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-3' (SEQ ID NO:38). Este cebador se une a las posiciones 13455-13477 del genoma dentro de la región que codifica de ORF4, corriente abajo de ORF3, e introduce un sitio Afl II. Para la región del flanco corriente abajo, el cebador delantero era 5'-CTTCTTAAGTCCACGCGTTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCT-3' (SEQ ID NO: 39). Este cebador se une a las posiciones 13520-13545 del genoma a la mitad de ORF4 e introduce los sitios All II y Mlu I para la clonación direccional de genes foráneos. El cebador inverso era 5'-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT3' (SEQ ID NO: 40). Este cebador se une a las posiciones 14981-14999 de la secuencia de codificación de ORF7. Se realizó una ligación de tres vías usando el fragmento Sal I-Afl II del producto de PCR del flanco corriente arriba, el fragmento Afl II-BstE II del producto de PCR del flanco corriente abajo y el fragmento Saf I-BstE II del plásmido p2_7D-4. Todos los plásmidos se purificaron después de digestión. El plásmido p2_7D-4delta4N resultante tiene suprimidas 42 bases de la porción central de ORF4 y reemplazadas con un sitio artificial de 15 bases. El sitio de clonación contiene dos sitios de restricción (Afl II y Mlu I) que están ausentes del genoma viral y el espinazo del plásmido. Estos se pueden usar para facilitar la clonación direccional de genes foráneos en el espacio previamente ocupado por ORF4. El sitio de clonación también contiene un codón de parada (TAA) que está en el marco con ORF4 y asegura además que no se produzca proteína funcional de ORF4.
Se encontró que se podría hacer una supresión más extensa de la secuencia de codificación de ORF4 sin interferir con la expresión del gen de envoltura de ORF5 corriente abajo. En este caso, se amplificó por PCR una región más corta que flanquea corriente abajo usando el mismo molde y cebador inverso, y usando el cebador delantero 5'-GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3' (SEQ ID NO:41). Este cebador se une a las posiciones 13654-13669 del genoma cerca del extremo 3' de ORF4, y contiene un sitio AFL II. La ligación de dos vías entre el fragmento Afl II-BstE II del producto de PCR del flanco corriente abajo y el fragmento Afl II-BstE II del plásmido p2_7D-4delta4N dio el nuevo plásmido p2_7D-4delta4NS. Este plásmido tiene 176 bases de la secuencia que codifica ORF4 suprimidas y reemplazadas con el sitio de clonacion de 15 bases.
Los cambios hechos en p2_7D-4delta4N y p2_7Ddelta 4NS se incorporaron en el clon genómico de longitud completa reemplazando el fragmento BsrGI-Spe I de pCMV-S-P129 con los fragmentos BsRGI-SpeI modificados de p2_7D-4delta4N y p2_7Ddelta-4NS. Los plásmidos pCMV-S-P129delta4N y pCMBV-S-P129delta4NS resultantes se usaron para transfectar células.
A diferencia con pCMV-S-P129, la transfección de células MARC-145 con los plásmidos pCMV-S-P129delta4N o pCMV-S-P129delta4NS no dió por resultado placas virales o focos fluorescentes. Podía verse que células individuales transfectadas producían la proteína de nucleocápsido de ORF7, lo que sugería no se requiere el producto de gen de ORF4 para replicación de RNA o expresión de genes virales, pero que es esencial para liberar virus de progenie infecciosa. Puesto que la supresión de ORF4 es letal para la replicación de virus, es necesario proporcionar esta proteína. Esto se puede realizar usando una línea complementaria de células. Se crearon líneas de células MARC-145 que expresan ORF-4 transfectando células establemente con un plásmido que contenía ORF4 y los genes de resistencia a la neomicina. Después de seleccionar en cuanto a la resistencia a la neomicina usando el G418 antibiótico, se expandieron y caracterizaron colonias de células individuales. Después de transfección con pCMV-S-P129delta4NS, tres clones de células que expresan ORF4 dieron virus que se podían propagar en estas células pero no en células MARC-145. Se caracterizó más una de éstas, MARC400E9. La tinción inmunofluorescente para nucleópsido viral en células MARC400E9 transfectadas con el plásmido pCMV-S-P129delta4NS fue positiva.
Ejemplo VI Uso de PRRS con genes suprimidos como vector para expresión de genes foráneos
Con el fin de determinar si se pueden expresar genes heterólogos de un virus de PRRS con genes suprimidos, se insertó una copia de proteína fluorescente verde (GFP) en el sitio de supresión de ORF4 en el plásmido pCMV-S-P129delta4N. El gen GFP se amplificó desde un vector de plásmido adquirible comercialmente usando cebadores de PCR que introducían un sitio Afl II en el extremo 5' del gen y un sitio Mlu I en el extremo 3' del gen. El plásmido resultante pCMV-S-P129delta4N-GFP se usó para transfectar células MARC-145 y MARC400E9. Como se anticipó, las células MARC-145 no apoyaron la replicación del virus con ORF4 suprimido. Se vieron bajo lupa de UV células verde individuales resultantes de la transfección primaria lo que indicaba que se estaba expresando GFP, pero el virus no se extendía a células vecinas y no se observó CPE. A diferencia, se observaron focos verdes grandes en células MARC400E9 transfectadas. Se formaban y unían placas visibles, destruyendo la monocapa. Estos resultados indican que los genes foráneos pueden expresar desde virus de PRRS con ORF4 suprimido y que el aumento del tamaño del genoma viral en 692 bases (4,5%) no interfiere con el empaquetamiento de RNA viral en partículas infecciosas.
Ejemplo VII Uso de virus de PRRS competentes en replicación como vector para expresión de genes foráneos
Con el fin de determinar si se pueden expresar genes heterólogos de un virus de PRRS competente en replicación, se insertó una copia de GFP en la región entre ORF1b y ORF2. Puesto que la secuencia líder/de unión (L/J) para ORF2 está dentro de ORF1b, se usó esta secuencia L/J para guiar la expresión del gen del gen GFP y se insertó una copia de la secuencia L/J de ORF6 corriente abajo de GFP para guiar la expresión de ORF2.
Se usó el plásmido p2_7D-4 (véase la Fig. 1) como molde en PCR para amplificar las regiones que flanquean 5' y 3' corriente arriba y corriente abajo del sitio de inserción. El cebador delantero del flanco corriente arriba era 5'-AACAGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3' (SEQ ID NO:42). Este cebador se une a las posiciones 11699-11721 del genoma en ORF1b. El cebador inverso del flanco corriente arriba era 5'-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATT CAGGCCTAAAGTTGGTTCA-3' (SEQ ID NO:43). Este cebador se une a las posiciones 12031-12055 del genoma en ORF1b y añade los sitios AflII y MluI para clonación direccional de genes foráneos entre ORF1b y ORF2. El cebador delantero del flanco corriente abajo era GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGAAATGGGGTCTATACAAAGCCTCTTCGACA-3' (SEQ ID NO:44). Este cebador se une a las posiciones 12056-12089 del genoma en ORF2 y contiene un sitio MluI seguido por las 40 bases que preceden al inicio de ORF6 (que contienen la secuencia L/J de ORF6). El cebador inverso del flanco corriente abajo era 5'-AACAGAACGGCACGATACACCAAA-3' (SEQ ID NO: 45). Este cebador se une a las posiciones 13819-13844 en ORF5. Se realizó una ligación de tres vías usando el fragmento Eco47 III-Mlu I del producto de PCR del flanco corriente arriba y el fragmento Eco47III-BsrG I de pCMV-S-P129. El plásmido pCMV-S-P129-1bMCS2 resultante contiene el genoma de P129 entero con un sitio de clonación y un sitio adicional L/J entre ORF1b y ORF2. El plásmido produce virus funcionalmente normal cuando se transfecta en células MARC-145.
El gen de GFP de un plásmido accesible comercialmente se amplificó por PCR usando cebadores que añaden un sitio AflII al extremo 5' y un sitio MluI al extremo 3' del gen. Después de digestión del fragmento de PCR y PCMV-SP129-1bMCS2 con AflI y MluI, el inserto se ligó al vector, obteniéndose el plásmido pCMV-S-P129-1bGFP2. Este plásmido produjo placas verdes cuando se transfectó a células MARC-145. El virus resultante se pudo pasar sobre células MARC-145 y continuó produciendo placas verdes cuando se observó con la lupa de UV. Así, se pueden expresar genes foráneos de vectores de virus de PRRS capaces de replicación. El virus P129-1bGFP2 contiene un genoma que es 774 bases (5%) más largo que el de su matriz P129, aunque está empaquetado normalmente.
Depósito de materiales biológicos
Se depositaron los materiales biológicos siguientes en la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC), en 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, USA, el 19 de noviembre de 1998, se asignaron a ellos los siguientes números de acceso:
Plásmido Número de acceso
Plásmido pT7P129A 203488
Plásmido pCMV-S-P129 203489
<110> Pfizer Products Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> UN CLON INFECCIOSO DE cDNA DE VIRUS DEL SÍNDROME REPRODUCTOR Y RESPIRATORIO PORCINO NORTEAMERICANO (PRRS) Y SUS USOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC10278A
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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<160> 45
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<170> PatentIn ver. 2.0
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15450
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA correspondiente al Genoma del Virus del Síndrome Reproductor y Respiratorio Porcino Norteamericano (PRRS).
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<400> 1
1
2
3
4
5
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7494
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 1a del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
7
8
9 
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<210> 3
<211 4392
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 1b del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
10
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 771
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 2 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
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<400> 4
12
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 765
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 3 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
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<400> 5
14 
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<210> 6
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<211> 537
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 4 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
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<400> 6
15 
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<210> 7
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<211> 603
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 5 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
\newpage
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<400> 7
16 
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<210> 8
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<211> 525
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 6 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
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<400> 8
17 
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<210> 9
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<211> 372
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cDNA de la Fase de Lectura Abierta 7 del Genoma del Virus PRRS Norteamericano.
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<400> 9
18 
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<210> 10
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagtttggt gatctatg 
\hfill
18 
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<210> 11
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<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagattcaga tgttcaa 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acctcgtgct gtatgccgaa tctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaggcctaa agttggttca atga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgactggg ctactgacga ggat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagcggctg ggatgacact g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggggaagc cagacgattg aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agggggagca aagaaggggt catc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcacgctct ggtgcaactg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgcggcgt agtattcag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgtcacag catcaccctc ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtaggttg gttaacacat gagtt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para determinar cDNA correspondiente al genoma del virus PRRS Norteamericano.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggctcttcg ggcctataaa ata 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cadena de adaptador de cadena doble sintético usado en pT7P129A.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagattaat taatacgact cactataggg atgacgtata ggtgttggct ctatgc 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cadena de adaptador de cadena doble sintético usado en pT7P129A.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taattaatta tgctgagtga tatccctact gcatatccac aaccgagata cggtgc 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para preparar pT7P129A.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actcagtcta agtgctggaa agttatg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para preparar pT7P129A.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggatttaaa tatgcatttt tttttttttt tttttttaat tgcggccgca tggttctcg 
\hfill
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para sintetizar región flanqueante de ORF7 del virus PRRS Norteamericano cadena arriba.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attagatctt gccaccatgg tggggaaatg cttgac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para sintetizar región flanqueante de ORF7 del virus PRRS Norteamericano cadena arriba.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttacgcgt ttgcttaagt tatttggcgt atttgacaag gtttac 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena directa, usado para sintetizar región flanqueante de ORF7 del virus PRRS Norteamericano cadena abajo.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacacgcgt cagcaaaaga aaaagaaggg g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, cadena reversa, usado para sintetizar región flanqueante de ORF7 del virus PRRS Norteamericano cadena abajo.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgcgttggc cgattcatta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador superior usado en preparar pCMV-S-P129.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgttaatt aaaccgtcat gacgtatagg tgttggc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Plásmido: pCMV-MC1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
19
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cadena de ligando sintético usado en la preparación de pCMV-S-P129.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgttaattaa accgactagt gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cadena de ligando sintético usado en la preparación de pCMV-S-P129.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagcaatt aatttggctg atcacgccgg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inferior usado en preparar pCMV-S-P129.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggggacggt ttcaaatttc actt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: parte de plásmido pCMV-S-P129, en dirección 5'-3', inmediatamente antes del genoma de P129.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatataagca gagctcgtta attaaaccgt catgacgtat aggtgttggc 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, directo, usado para sintetizar región flanqueante a ORF4 cadena arriba.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggtcgacgg cggcaattgg tttcacctag agtggctgcg tcccttct 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, reverso, usado para sintetizar región flanqueante a ORF4 cadena arriba.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcttaagcat tggctgtgat ggtgatatac 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, directo, usado para sintetizar región flanqueante a ORF4 cadena abajo.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttcttaagt ccacgcgttt tcttcttgcc ttttctatgc ttct 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, reverso, usado para sintetizar región flanqueante a ORF4 cadena abajo.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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tgcccggtcc cttgcctct 
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19 
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<210> 41
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, directo, usado para sintetizar región flanqueante a ORF4 cadena abajo.
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<400> 41
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gtttacgcgt cgctccttgg tggtcg 
\hfill
26 
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<210> 42
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, directo, usado para sintetizar región flanqueante a sitio de inserción entre ORF1b y ORF2 cadena arriba.
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<400> 42
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aacagaagag ttgtcgggtc cac 
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23 
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<210> 43
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, reverso, usado para sintetizar región flanqueante a sitio de inserción entre ORF1b y ORF2 cadena arriba.
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<400> 43
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gctttgacgc gtccccactt aagttcaatt caggcctaaa gttggttca 
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49 
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<210> 44
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<211> 82
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, directo, usado para sintetizar región flanqueante a sitio de inserción entre ORF1b y ORF2 cadena abajo.
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<400> 44
21 
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<210> 45
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador, reverso, usado para sintetizar región flanqueante a sitio de inserción entre ORF1b y ORF2 cadena abajo.
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<400> 45
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aacagaacgg cacgatacac cacaaa 
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26

Claims (24)

1. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina.
2. Una molécula de RNA aislada infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1, molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano.
3. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 en forma de un plásmido.
4. Una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano, en la que la mencionada secuencia es SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, célula huésped transfectada que es capaz de expresar el virus de PRRS norteamericano codificado.
5. Un plásmido capaz de transfectar directamente una célula huésped adecuada y expresar un virus de PRRS norteamericano desde la célula huésped adecuada así transfectada, plásmido que comprende (a) una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica el virus de PRRS norteamericano, y en el que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, y (b) un promotor capaz de transcribir la mencionada molécula de RNA infecciosa en la mencionada célula huésped adecuada.
6. Un procedimiento para generar un virus de PRRS norteamericano, procedimiento que comprende transfectar una célula huésped adecuada con un plásmido de acuerdo con la reivindicación 5 que codifica el virus de PRRS norteamericano y obtener el virus de PRRS norteamericano generado por la célula huésped transfectada.
7. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que, cuando infecta un animal porcino, es incapaz de producir PRRS en el animal, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS.
8. Una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codiifca una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que, cuando infecta un animal porcino, es incapaz de producir PRRS en el animal, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que contiene una o más mutaciones que incapacitan genéticamente el virus de PRRS codificado para producir PRRS, célula huésped transfectada que es capaz de expresar el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente.
9. Una vacuna para proteger un animal porcino frente a la infección por un virus de PRRS, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente codificado por una molécula de RNA infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7, o la mencionada molécula de RNA infecciosa, o la mencionada molécula de polinucleótido en forma de un plásmido, o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la reivindicación 7 que codifica un virus de PRRS norteamericano que es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra una infección por un virus de PRRS, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección contra una infección por un virus de PRRS, y un vehículo aceptable para uso veterinario.
10. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que comprende una o más secuencias de nucleótidos más, cada una de las cuales codifica un epitopo antigénico heterólogo, y en la que cada epitopo antigénico heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra un patógeno particular en un mamífero o un pájaro.
11. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 10 en forma de un plásmido.
12. Una célula huésped transfectada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA que codifica el virus de PRRS norteamericano es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que comprende uno o más secuencias de nucleótidos más, de las que cada una codifica un epitopo antigénico heterólogo, y en la que cada epitopo antigénico heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra un patógeno particular en un mamífero o un pájaro.
13. Una vacuna para proteger un mamífero o pájaro de la infección por un patógeno, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente codificado por una molécula de RNA infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido de la reivindicación 10, o la mencionada molécula de RNA infecciosa, o un plásmido de acuerdo con la reivindicación 11, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a la infección por el patógeno del que derivan el epitopo o los epitopos antigénicos heterólogos o codificados por él; y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
14. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA infecciosa que codifica el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente comprende una o más mutaciones más que incapacitan el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado para producir PRRS en un animal porcino.
15. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 14 en forma de un plásmido.
16. Una vacuna para proteger un animal porcino de la infección por un virus de PRRS y de la infección por un patógeno porcino que no es un virus de PRRS norteamericano, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente codificado por una molécula de RNA infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14, o la mencionada molécula de RNA infecciosa, o un plásmido de acuerdo con la reivindicación 15, en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a la infección por un virus de PRRS y frente a la infección por el patógeno del que derivan el epitopo o los epitopos antigénicos heterólogos o codificados por él; y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
17. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables, en la que la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA infecciosa es la SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que comprende una o más secuencias de nucleótidos más, cada una de las cuales codifica un epitopo antigénico heterólogo detectable.
18. Una vacuna para proteger un animal porcino de la infección por un virus de PRRS, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente codificado por una molécula de RNA infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables, tratado o más modificado genéticamente de manera que es incapaz de producir PRRS en un animal porcino pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS en un animal porcino; o la mencionada molécula de RNA infecciosa, en la que el virus de PRRS norteamericano codificado por ella que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables comprende además modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 17, en forma de un plásmido, en la que el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente codificado de ese modo, que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables comprende además modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, en el que el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, codificado de ese modo, que comprende uno o más epitopos antigénicos detectables comprende más modificaciones genéticas de manera que incapaz de producir PRRS, pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunoprotectora frente a una infección por un virus de PRRS, y un vehículo aceptable para uso veterinario.
19. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano que está modificado genéticamente de manera que carece de un epitopo antigénico detectable, en la que la secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1, o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, excepto que carece de una o más secuencias de DNA que codifican un epitopo antigénico detectable.
20. Una vacuna para proteger un animal porcino frente un la infección por un virus de PRRS, vacuna que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, codificado por una molécula de RNA infecciosa codificada por una molécula de polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 19, que carece de uno o más epitopos antigénicos detectables, tratado o modificado genéticamente más de manera que es incapaz de producir PRRS en un animal porcino pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS en un animal porcino; o la mencionada molécula de RNA infecciosa, en la que el virus de PRRS norteamericano, codificado de es manera, que comprende uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables comprende más modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; o una molécula de polinucleótido aislada en forma de un plásmido, en la que el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, codificado igualmente de esa manera, que carece de uno o más epitopos antigénicos heterólogos detectables comprende además modificaciones genéticas de manera que es incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; o un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula infecciosa de DNA que codifica tal virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado, en el que el virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado codificado de esa manera, que carece de uno o más epitopos antigénicos detectables, comprende más modificaciones genéticas de manera que incapaz de producir PRRS pero capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva frente a un virus de PRRS; en una cantidad efectiva para producir inmunoprotección frente a la infección por un virus de PRRS; y un vehículo aceptable para uso veterinario.
21. Una molécula de polincleótido aislada que comprende una o más secuencias de nucleótidos, de las que cada una codifica un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la escuencia genómica del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma de una molécula de RNA que corresponde a la SEQ ID NO:1, o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina.
22. Una célula huésped transfectada que comprende una o más secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica un péptido codificado por un virus de PRRS norteamericano, en la que la secuencia del genoma del mencionado virus de PRRS norteamericano es la misma de una molécula de RNA que corresponde al la secuencia SEQ ID NO:1 o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de la SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, célula transformada que es capaz de expresar el mencionado o los mencionados péptidos.
23. Un procedimiento para preparar un virus de PRRS norteamericano genéticamente modificado que es capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora en un mamífero o un pájaro vacunado con él, procedimiento que comprende obtener una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje, en la que la mencionada secuencia de DNA es la SEQ ID NO:1, o la secuencia que empieza con el nucleótido 1, que incluye, al nucleótido 15.416, que incluye, de la SEQ ID NO:1, excepto que el el nucleótido que corresponde al nucleótido 12.622 de SEQ ID NO:1 es una guanina en vez de una adenina y el nucleótido que corresponde al nucleótido 1.559 de SEQ ID NO:1 es una timina en vez de una citosina, mutar genéticamente la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA infecciosa que codifica el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje de manera que se obtiene una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de DNA que codifica una molécula de RNA infecciosa que codifica un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente, virus que permanece capaz de inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra la infección por el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje en un mamífero o un pájaro, y expresar el virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente de la molécula de polinucleótido aislada así obtenida.
24. Una vacuna para proteger un mamífero o un pájaro de una infección por un virus de PRRS norteamericano, que comprende un virus de PRRS norteamericano modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 23 en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunoprotectora efectiva contra el virus de PRRS norteamericano de tipo salvaje en un mamífero o un pájaro vacunada con él, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico o veterinario.
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