BRPI9905902B1

BRPI9905902B1 - "molécula polinucleotídica isolada, plasmídeo, e método para produzir um vírus prrs norte-americano"

Info

Publication number: BRPI9905902B1
Application number: BRPI9905902-9A
Authority: BR
Inventors: Jay Gregory Calvert; Michael George Sheppard; Siao-Kun Wan Welch
Original assignee: Zoetis P Llc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2015-09-01
Also published as: CY1115010T1; CN1263945A; JP2004081218A; BRPI9905902B8; PT1627919E; ZA997289B; ATE309364T1; AR058249A2; DE69928209T9; AR025146A1; US6500662B1; EP1018557B9; DE69928209T2; AU6173399A; US20020172690A1; BR9905902A; CA2290220A1; NZ513289A; JP4159242B2; CY1105680T1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA POLINUCLEOTÍDICA ISOLADA, PLASMÍDEO, E MÉTODO PARA PRO- DUZIR UM VÍRUS PRRS NORTE-AMERICANO".

Campo da invenção A presente invenção situa-se no campo da saúde animal e é di- rigida a clones de cDNA infecciosos de vírus de RNA de polaridade positiva e à construção de vacinas, em particular, vacinas para suínos, usando-se tais clones de cDNA.

Fundamento da Invenção A síndrome reprodutora e respiratória porcina (PRRS) é uma nova doença dos porcos, descrita pela primeira vez em 1987 na América do Norte e em 1990 na Europa. A doença tem, desde então, espalhado-se pela Ásia e afeta a maior parte dos países produtores de porcos do mundo. Os principais sintomas são pro- blemas reprodutores em porcas adultas e jovens, incluindo os abor- tos no fim do tempo, natimortos e múmias, e ninhadas de leitões pequenos e fracos que nascem virêmicos e muitas vezes não so- brevivem. Ainda, a síndrome manifesta-se como uma doença respi- ratória em porcos jovens que se espalha horizontalmente e provoca febre, letargia, respiração em esforço, perda de apetite, crescimen- to lento, e ocasionalmente morte, muitas vezes em associação com outros patógenos respiratórios. A doença pode ainda ser transmiti- da a porcas adultas e jovens através do sêmen de porcos infecta- dos, naturalmente ou através de inseminação artificial. Por estas e outras razões, PRRS mostrou-se uma doença difícil de controlar e portanto uma das doenças economicamente mais desastrosa para a suinocultura. O agente causador de PRRS é o vírus PRRS, o qual existe co- mo dois tipos genética e serologicamente distintos (Murtaugh, Μ. P. e ou- tros, 1995, Arch-Virol. 140, 1451-1460; Suarez, P. e outros, 1996, Virus Re- search 42:159-165). Pensa-se que os dois tipos tenham entrado indepen- dentemente pela primeira vez nas populações de suínos, um na América do Norte e o outro na Europa, nos anos 80, a partir de reservatórios biológicos desconhecidos, possivelmente originados em roedores ou em aves. O tipo Europeu, representado pelo protótipo "Lelystad Virus", foi isolado e sequen- ciado na Holanda em 1991 (Terpstra, C. e outros, 1991, Vet. Quart. 13:131- 136; Wensvoort, G. e outros, 1991, Vet. Quart. 13:121-130; Wensvoort, G. e outros, WO 92/213751992 (PCT/NL92/00096), 1992; Meulenberg, J. J. M. e outros, 1993, Virol. 192:62-72).

Tanto o vírus PRRS Norte-americano como o vírus PRRS Euro- peu são classificados dentro da família Arteriviridae, a qual também inclui vírus da aretrite eqüina, vírus aumentador da desidrogenase do lactato e vírus da febre hemorrágica símia. Os arterivírus são por sua vez colocados dentro da ordem Nidovirales, a qual também inclui os coronavírus e os toro- vírus. Os nidovírus são vírus com invólucro tendo genomas consistindo num RNA de cadeia simples e polaridade positiva. O RNA genômico de um vírus de RNA de cadeia postiva desempenha o duplo papel de armazenamento e expressão da informação genética. Na replicação ou transcrição dos nidoví- rus não está envolvido DNA. A reprodução do RNA genômico nidoviral é pois um processo combinado de replicação genômica e transcrição de mRNA. Ainda, algumas proteínas são traduzidas diretamente a partir do RNA genômico dos nidovírus. A biologia molecular da família Arteriviridae foi recentemente revista por Snijder e Meulenberg (Snijder, E. J. e Meulenberg, J. J. M., 1998, Journal of General Virology 79:961-979).

As vacinas disponíveis comercialmente contra PRRS são as convencionais de vírus vivo modificado (culturas celulares, atenuado) ou de vírus morto (preparações de culturas celulares de vírus virulento inativadas). Várias destas vacinas foram criticadas com base em preocupações de segu- rança e/ou eficácia. O desenvolvimento de uma segunda geração de vaci- nas PRRS, baseada em adições, deleções e outras modificações específi- cas do genoma de PPRS é portanto muito desejável. No entanto, uma vez que os vírus PPRS não incluem quaisquer intermediários de DNA durante a sua replicação, tais vacinas têm esperado pela construção de clones de cDNA de tamanho completo dos vírus PRRS para manipulação por técnicas de biologia molecular ao nível do DNA. Muito recentemente, foi descrito um clone de cDNA infeccioso de tamanho completo do vírus PPRS Europeu (Meulenberg, J.J.M. e outros, 1998, supra; Meulenberg, J.J.M. e outros, 1988, J. Virol. 72, 380-387).

As publicações referidas, assim como todas as outras referênci- as discutidas a seguir neste pedido, são aqui incluídas como referência na sua totalidade.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica isolada, compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molé- cula de RNA infeccioso codificador de um vírus PRRS Norte-americano, em que a referida seqüência de DNA é SEQ ID NO:1 ou é uma seqüência ho- móloga.

A presente invenção proporciona ainda uma molécula de RNA infeccioso isolada codificada pela referida molécula polinuleotídica citada atrás, e moléculas de RNA infecciosas isoladas homólogas que codificam individualmente um vírus PRRS Norte-americano. A presente invenção proporciona ainda a molécula polinucleotí- dica isolada, atrás referida, codificadora da molécula de RNA infeccioso na forma de um vetor como seja um plasmídeo. A presente invenção proporciona ainda um vetor viral compre- endendo um DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codifica- dor de um vírus PRRS Norte-americano, em que a referida seqüência de DNA é SEQ ID NO:1 ou é uma seqüência de DNA homóloga. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira transfectada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus PRRS Norte- americano, em que a referida seqüência de DNA é SEQ ID NO:1 ou é uma seqüência de DNA homóloga, tal célula hospedeira transfectada é capaz de expressar o vírus PRRS Norte-americano. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus PRRS Norte-americano modificado. Numa realização preferida, o vírus PRRS é geneticamente mo- dificado de forma que, quando infecta um suíno, é: a) incapaz de produzir PRRS no animal e b) capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção de um animal por um vírus PRRS. Numa realização parti- cular, a seqüência de DNA é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, exceto no que respeita a conter uma ou mais mutações que tornam o vírus PRRS codificado geneticamente incapaz de produzir PRRS.

A presente invenção proporciona ainda uma molécula de RNA infeccioso isolada, codificada pela molécula polinucleotídica isolada referida atrás, e moléculas de RNA infecciosas isoladas homólogas, tais moléculas de RNA infeccioas codificam um vírus PRRS Norte-americano genetica- mente modificado, incapaz de produzir PRRS. A presente invenção proporciona ainda um vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificado codificado por uma molécula de RNA infeccioso conforme referido atrás, tal vírus PRRS Norte-americano geneti- camente modificado é incapaz de produzir PRRS no porco quando infecta o animal, sendo no entanto capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção por um vírus PRRS no animal. A presente invenção proporciona ainda um vetor viral compre- endendo uma seqüência de DNA infecciosa codificadora de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus PRRS Norte-americano geneti- camente modificado como referido atrás. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira transfectada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado conforme referido atrás. A presente invenção proporciona ainda uma vacina para prote- ção de um suíno contra a infecção por um vírus PRRS, tal vacina compre- ende vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado; uma molé- cula de RNA infeccioso conforme referida atrás codificadora de vírus PRRS

Norte-americano geneticamente modificado; uma molécula polinucleotídica isolada referida atrás, na forma de um plasmídeo, codificador do vírus PRRS

Norte-americano geneticamente modificado; ou o vetor viral atrás referido codificador do vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado; numa quantidade eficaz para produzir uma resposta imunoprotetora contra a infecção por um vírus PRRS; e um veículo aceitável para usar em veteriná- ria. A presente invenção proporciona ainda um método para prote- ção de um suíno da infecção por um vírus PRRS, o qual se caracteriza pela vacinação do animal com uma quantidade da vacina atrás referida que é eficaz para produzir imunoproteção contra a infecção por vírus PRRS. A presente invenção proporciona ainda qualquer uma das molé- culas polinucleotídicas atrás referidas compreendendo ainda uma sequência nucleotídica codificadora de um epítopo antigênico heterólogo, assim como correspondentes moléculas de RNA infecciosas, vetores, células hospedei- ras transfectadas, vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, vacinas e métodos de administração de tais vacinas a mamíferos e/ou aves.

Tais epítopos antigênicos heterólogos podem ser de qualquer epítopo anti- gênico, presentemente conhecido, ou que possa ser determinado no futuro.

Numa realização não limitante, tal epítopo antigênico é de um patógeno ca- paz de infectar patogenicamente uma ave ou um mamífero para além do porco, por exemplo um humano, e é capaz de induzir uma resposta imuno- protetora eficaz contra o referido patógeno. Numa outra realização não li- mitante, tal epítopo antigênico é de um agente patogênico para o porco dife- rente do vírus PRRS Norte-americano e é capaz de induzir uma resposta imunoprotetora contra o referido patógeno de suínos. Numa outra realização não limitante, tal epítopo antigênico é um epítopo antigênico detectável. A presente invenção proporciona ainda qualquer uma das molé- culas polinucleotídicas atrás referidas, mas sem um ou mais epítopos anti- gênicos detectáveis, assim como as correspondentes moléculas de RNA infeccioso, vetores, células hospedeiras transfectadas, vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificado, vacinas e métodos de administração tais como vacinas para mamíferos e/ou aves. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas que codificam um peptídeo codificado pelo vírus PRRS Norte-americano, em que a seqüência genômica do referido vírus PRRS Norte-americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga. A presente invenção proporciona ainda uma célula hospedeira transfectada compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas que codificam um peptídeo codificado pelo vírus PRRS Norte-americano, em que a seqüência genômica do referido vírus PRRS Norte-americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga. A presente invenção proporciona ainda um vírus Nidovirales ge- neticamente modificado que é capaz de induzir uma resposta imunoproteto- ra num mamífero ou numa ave vacinada com ele, tal vírus Nidovirales gene- ticamente modificado é preparado através da obtenção de uma molécula polinucleotídica isolada, compreendendo uma seqüência de DNA codifica- dor de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales selvagem, mutageneização genética da seqüência de DNA de forma a obter uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codficadora de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales geneticamente modificado que é incapaz de produzir uma infecção patogênica, ainda que seja capaz de induzir uma resposta imuno- protetora eficaz contra a infecção pelo vírus Nidovirales selvagem num ma- mífero ou numa ave, e expressão do vírus Nidovirales geneticamente modi- ficado a partir da molécula polinucleotídica isolada assim obtida. A presente invenção proporciona ainda um método para a pre- paração de um vírus Nidovirales geneticamente modificado, que é capaz de induzir uma resposta imunoprotetora num mamífero ou numa ave vacinada com ele, método esse que se caracteriza pela obtenção de uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales sel- vagem, mutagenização genética do DNA de forma a obter uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA codificadora de um vírus Nidoviraies genetica- mente modificado, tal vírus é incapaz de produzir uma infecção patogênica, ainda que seja capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção pelo vírus Nidoviraies selvagem num mamífero ou numa ave, e expressão do vírus Nidoviraies geneticamente modificado a partir da molé- cula polinucleotídica isolada assim obtida. A presente invenção proporciona ainda uma vacina para prote- ção de um mamífero ou ave da infecção por um vírus Nidoviraies, vacina essa que compreende um vírus Nidoviraies geneticamente modificado como descrito atrás, numa quantidade eficaz para induzir uma resposta imuno- protetora contra o vírus Nidoviraies selvagem num mamífero ou numa ave vacinada com ele e um veículo aceitável para uso veterinário ou farmacêuti- co.

Breve Descrição das Figuras FIGURA 1: Estratégia de clonagem para a construção do clone de cDNA infeccioso de tamanho completo do vírus PRRS Norte-americano, pT7P129A. As setas representam as seqüências do promotor de T7. FIGURA 2: Viremia no soro após infecção com P129A ou com o vírus PRRS recombinante rP129A-1. Determinada por ensaio de placas em células MARC-145. 0 limite inferior de deteção é 5 pfu/ml (ou 0,7 na escala logarítmica). FIGURA 3: Anticorpos séricos anti-vírus PRRS rP129A-1. De- terminado pelo ensaio de ELISA para PRRS HerdChek (IDEXX (Westbrook, Maine, USA)).

Descrição Detalhada da Invenção A produção e manipulação das moléculas polinucleotídicas iso- ladas aqui descritas são convencionais e podem ser realizadas de acordo com técnicas de DNA recombinante descritas, por exemplo em Maniatis, e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, e outros, 1989, Current Protocols in Molecular Bioloav, Greene Publishing Associates & Wiley In- terscience, NY; Sambrook, e outros, 1989. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. 2d Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Innis e outros, 1995, PCR Strateqies. Academic Press, Inc., San Diego; e Erlich (ed), 1992, PCR Technoloav, Oxford University Press, New York, todos eles sendo aqui incluídos como referência.

A. Moléculas polinucleotídicas isoladas e moléculas de RNA codificadoras de um vírus PRRS Norte-americano e moléculas polinucleotí- dicas isoladas e moléculas de RNA codificadoras de vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificados: A presente invenção proporciona moléculas polinucleotídicas isoladas compreendendo sequências de DNA que codificam moléculas de RNA infeccioso que codificam um vírus PRRS Norte-americano. A presente invenção proporciona ainda moléculas polinucleotídicas isoladas compre- endendo sequências de DNA que codificam moléculas de RNA infecciosas que codificam vírus PRRS Norte-americanos geneticamente modificados.

Em particular, a presente invenção proporciona uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma seqüência codificadora de uma molécula de RNA infeccioso que codifica um vírus PRRS Norte- americano, em que a referida seqüência de DNA é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga. Numa realização preferida, a presente invenção pro- porciona uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma se- qüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso que codifi- ca um vírus PRRS Norte-americano, em que a referida seqüência de DNA é a seqüência que começa no nucleótido 1, inclusive, até ao nucleótido 15416, inclusive, de SEQ ID NO:1, exceto o nucleótido correspondente ao nucleótido 12622 de SEQ ID NO:1 ser uma guanina em vez de adenina e o nucleótido correspondente ao nucleótido 1559 de SEQ ID NO:1 ser uma timina em vez de uma citosina. A referida seqüência de DNA codifica uma molécula de RNA infeccioso que é o genoma de RNA do PRRS Norte- americano isolado P129.

Deve-se compreender que os termos aqui referidos como molé- culas de ácido nucléico tais como "molécula polinucleotídica isolada", "seqüência polinucleotídica isolada”, "sequência nucleotídica", "quadro de leitura aberta (ORF)" e similares, a menos que de outra forma seja especifi- cado, incluem moléculas de DNA e RNA e incluem moléculas de cadeia simples e de cadeia dupla. Também, quando se faz referência a uma se- qüência particular da seção "Listagem de seqüências" do presente pedido, pretende-se, a menos que de outra forma seja especificado, referir DNA da "Listagem de seqüências" assim como RNA correspondentes à seqüência de DNA e inclui seqüências complementares das seqüências de DNA e RNA que são idênticas uma à outra, exceto a seqüência de RNA possuir uracila em vez de timina e o esqueleto da molécula de RNA possuir ribose em vez de desoxirribose.

Por exemplo, SEQ ID NO:1 é uma seqüência de DNA corres- pondente ao RNA genômico de um vírus PRRS Norte-americano. Assim, uma seqüência de DNA complementar da seqüência de DNA descrita em SEQ ID NO:1 é um molde, ou seja é complementar ou "codifica" o RNA ge- nômico do vírus PRRS Norte-americano (isto é, RNA que codifica o vírus PRRS Norte-americano). No entanto, uma referência à SEQ ID NO:1 inclui a seqüência de RNA correspondente à SEQ ID NO:1 e uma seqüência de DNA complementar de SEQ ID NO:1.

Ainda, quando se faz referência a seqüências homólogas de uma seqüência na Listagem de Seqüências, deve-se entender que as se- qüências homólogas de uma seqüência correspondendo à seqüência na Listagem de seqüências estão também incluídas.

Uma "molécula de RNA infeccioso", para fins da presente inven- ção, é uma molécula de RNA que codifica os elementos necessários para a replicação, transcrição e tradução virais para dar um vírion funcional numa célula hospedeira adequada, se necessário com um peptídeo ou peptídeos que compensam as modificações genéticas, p.e., deleções de seqüências, na molécula de RNA.

Uma "molécula de RNA infeccioso isolada" refere-se a uma composição de matéria compreendendo a molécula de RNA infeccioso refe- rida, purificada a partir do seu estado natural, se tal molécula de RNA ocor- rer na natureza. Igualmente, uma "molécula polinucleotídica isolada" refere- se a uma composição de matéria compreendendo uma molécula polinucleo- tídica da presente invenção purificada a partir do seu estado natural se como tal existir.

Para fins da presente invenção, a sequência nucleotídica de uma segunda molécula polinucleotídica (RNA ou DNA) é "homóloga" da se- quência nucleotídica de uma primeira molécula polinucleotídica sempre que a seqüência nucleotídica da segunda molécula polinucleotídica codifique o mesmo polipeptídeo que a seqüência nucleotídica da primeira molécula po- linucleotídica, baseado na degenerescência do código genético, ou quando codificar um polipeptídeo que seja suficientemente semelhante ao polipeptí- deo codificado pela seqüência nucleotídica da primeira molécula polinucle- otídica de forma a ser útil na realização da presente invenção. Para fins da presente invenção, uma molécula polinucleotídica é útil na realização da presente invenção quando pode ser usada como sonda de diagnóstico para detectar a presença do vírus PRRS Norte-americano num fluído ou amostra de tecido de um porco infectado, p.e. por técnicas de hibridação ou de am- plificação convencionais. Deve-se entender que o polipeptídeo, codificado pela seqüência nucleotídica da molécula polinucleotídica, pode compreen- der um grupo de dois ou mais polipeptídeos. De um modo geral, a seqüên- cia nucleotídica de uma segunda molécula polinucleotídica é homóloga da seqüência nucleotídica de uma primeira molécula polinucleotídica se possuir pelo menos cerca de 70% de identidade da seqüência nucleotídica relati- vamente à seqüência nucleotídica da primeira molécula polinucleotídica conforme baseado no algoritmo BLASTN (National Center for Biotechnology Information, também conhecido como NCBI, (Bethesda, Maryland, USA) do United States National Institute of Health). Preferencialmente, uma seqüên- cia nucleotídica homóloga tem pelo menos cerca de 75% de identidade da seqüência de nucleotídeos, mesmo mais preferencialmente pelo menos cer- ca de 85% de identidade da seqüência de nucleotídeos. Uma vez que o có- digo genético é degenerado, uma seqüência nucleotídica homóloga pode incluir uma série de alterações "silenciosas" de bases, isto é substituições que codificam o mesmo aminoácido. Uma sequência nucleotídica homóloga pode ainda conter mutações não-silenciosas, isto é substituições, deleções ou adições de bases resultando em diferenças de aminoácidos no polipeptí- deo codificado, desde que a sequência permaneça pelo menos cerca de 70% idêntica ao polipeptídeo codificado pela primeira sequência nucleotídi- ca ou de outra forma seja útil para a realização da presente invenção. A homologia entre seqüência nucleotídicas pode ser determinada por compa- ração das sequências nucleotídicas, por exemplo usando-se BLASTN, atrás referido. Como alternativa, as seqüências nucleotídicas homólogas podem ser determinadas por hibridação em condições restringentes. Por exemplo, a seqüência nucleotídica de uma segunda molécula polinucleotídica é ho- móloga de SEQ ID NO:1 se hibridar com o complemento de SEQ ID NO:1 em condições moderadamente restringentes, p.e., hibridação com DNA fixa- do a membrana em NaHPC>4, 7% de dodecilsulfato de sódio (SDS), EDTA1 mM a 65°C e lavagem em SSC 0,2X/0,1% SDS a 42°C (ver Ausubel e ou- tros, atrás referido) ou condições que de outra forma resultarão na hibrida- ção de seqüências que codificam um vírus PRRS Norte-americano conforme definido abaixo. Numa outra realização, uma segunda seqüência nucleotídi- ca é homóloga de SEQ ID NO:1 se hibridar com o complemento de SEQ ID NO:1 em condições altamente restringentes, p.e. hibridação com DNA liga- do a filtros em NaHP04, 7% SDS, EDTA a 1 mM a 65°C e lavagem em SSC 0,1X/0,1% SDS a 68°C (Ausubel e outros, referido atrás).

Deve-se ainda entender que as moléculas polinucleotídicas isoladas e as moléculas de RNA isoladas da presente invenção incluem moléculas sintéticas e moléculas obtidas através de técnicas recombinan- tes, tais como clonagem in vitro e transcrição.

Conforme aqui é usado, o termo "PRRS" engloba sintomas de doenças em porcos causados por uma infecção com o vírus PRRS. Exem- plos de tais sintomas incluem, mas não estão limitados a aborto nas fêmeas e crescimento lento, dificuldades respiratórias, perda de apetite e mortalida- de em porcos jovens. Conforme aqui é usado, um vírus PRRS que é "incapaz de produzir PRRS" refere-se a um vírus que pode infectar um por- co, mas que não produz quaisquer sintomas de doença normalmente asso- ciados à infecção do porco por PRRS, ou produz tais sintomas, mas em me- nor grau, ou produz um menor número de tais sintomas, ou ambos.

Os termos "porcino" e suíno são usados indistintamente e refe- rem-se a qualquer animal que seja um membro da família Suidae, como seja, por exemplo, um porco. "Mamíferos" incluem quaisquer animais de sangue quente da classe Mammalia, incluindo humanos. O termo "vírus PRRS", conforme aqui é usado e a menos que de outra forma seja indicado, significa qualquer estirpe do vírus PRRS Norte- americano ou Europeu. O termo "vírus PRRS Norte-americano" significa qualquer isola- do de vírus PRRS Norte-americano, como seja, mas não estando limitado ao vírus PRRS que foi inicialmente isolado nos Estados Unidos por volta de 1990 (ver p.e., Collins, J. E. e outros, 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293- 296); a estirpe Quebec IAF-exp91 de PRRS (Mardassi, H. e outros, 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); e o isolado VR 2385 do vírus PRRS Norte- americano (Meng, X. J. e outros, 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Ca- racterísticas genéticas referem-se a semelhança da seqüência nucleotídica genômica e semelhança da sequência de aminoácidos partilhada pelas es- tirpes de vírus PRRS Norte-americano. Para fins da presente invenção, um vírus PRRS Norte-americano é um vírus que é codificado por uma seqüên- cia de RNA igual ou homóloga de SEQ ID NO:1, em que o termo "homólogo" é como definido anteriormente. Assim, as estirpes de vírus Norte-americano possuem, preferencialmente, pelo menos cerca de 70% de identidade da seqüência nucleotídica genômica com SEQ ID NO:1 e mais preferencial- mente pelo menos cerca de 75% de identidade da seqüência nucleotídica genômica com SEQ ID NO:1, sendo ainda mais preferido pelo menos cerca de 85% de identidade da seqüência nucleotídica genômica com SEQ ID NO:1. O termo "vírus PRRS Europeu" refere-se a qualquer estirpe de virus PRRS tendo as características· genéticas associadas com o vírus PRRS que foi inicialmente isolado na Europa por volta de 1991 (ver, p.e., Wensvoort, G. e outros, 1991, Vet. Q. 13:121-130). "Vírus PRRS Europeu" é também por vezes referido como "vírus Lelystad".

A menos que de outra forma seja indicado, um vírus PRRS

Norte-americano é "útil na realização da presente invenção" se as suas ca- racterísticas estiverem dentro da definição de um vírus PRRS Norte- americano conforme aqui descrito. Por exemlo, um vírus codificado por qualquer uma das moléculas polinucleotídicas isolada da presente invenção é um "vírus PRRS Norte-americano útil na realização da presente invenção" se ele, p.e., possuir as características associadas ao vírus PRRS Norte- americano.

Outros polipeptídeos são "úteis na realização da presente in- venção", p.e., peptídeos codificados por sequências polinucleotídicas ho- mólogas de ORFs do vírus PRRS Norte-americano, se eles puderem com- pensar uma molécula de RNA codificador de um vírus PRRS modificado geneticamente, deficiente num gene essencial para a expressão de vírions PRRS funcionais numa célula hospedeira transfectada, de forma a poderem ser gerados pela célula vírions PPRS funcionais. O termo "quadro de leitura aberta" ou "ORF", conforme aqui é usado, significa a seqüência nucleotídica mínima necessária para codificar ma proteína particular do vírus PRRS sem um códon de paragem interveni- ente.

Os termos tais como "célula hospedeira adequada" e "célula hospedeira apropriada", a menos que de outra forma seja indicado, referem- se a células transfectadas com moléculas de RNA (ou moléculas polinucle- otídicas isoladas ou vetores virais compreendendo seqüências de DNA co- dificador de tais moléculas de RNA) da presente invenção. "Células hospe- deiras adequadas" para transfeção com tais moléculas de RNA, moléculas polinucleotídicas isoladas ou vetores virais, incluem células de mamífero, particularmente células de suíno, e células de aves e estão descritas mais detalhadamente abaixo.

Um "vírion funcional" é uma partícula viral que é capaz de entrar numa célula, passível de servir de hospedeiro a um vírus PRRS, e expres- sar os genes do seu RNA genômico particular (quer um genoma não- modificado que um genoma alterado geneticamente como aqui descrito) dentro da célula. Células passíveis de serem hospedeiras de um vírus PRRS incluem macrófagos alveolares de porco e células de rim de macaco MARC 145. Outras células de mamífero ou de aves, especialmente outras células de suíno, podem também servir como células hospedeiras adequa- das para os vírions PRRS.

As moléculas polinucleotídicas isoladas da presente invenção codificam vírus PRRS Norte-americanos que podem ser usados para prepa- rar vacinas vivas, mortas ou atenuadas usando-se métodos reconhecidos para a proteção de suínos da infecção por um vírus PRRS, como descrito mais detalhadamente abaixo. Estas moléculas polinucleotídicas isoladas são também úteis como vetores para a introdução de genes heterólogos em mamíferos, incluindo porcos, ou aves, como também está descrito detalha- damente abaixo. Ainda, estas moléculas polinucleotídicas isoladas são úteis porque podem ser mutageneizadas, usando técnicas de biologia molecular, para codificarem vírus PRRS Norte-americanos geneticamente modificados úteis, inter alia, como vacinas para a proteção de suínos da infecção PRRS.

Tais vírus PRRS Norte-americanos geneticamente modificados, assim como vacinas contendo-os, estão também descritos mais detalhadamente abaixo.

Assim, a presente invenção proporciona ainda um método para produzir um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, méto- do esse que compreende a mutageneização de uma sequência de DNA co- dificador de uma molécula de RNA infeccioso que codifica o vírus PRRS

Norte-americano conforme descrito atrás e expressão do vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificado usando um sistema de expressão adequado. Um vírus PRRS Norte-americano, selvagem ou geneticamente modificado, pode ser expresso a partir de uma molécula polinucleotídica isolada usando-se sistemas de expressão adequados conhecidos, exemplos dos quais estão descritos neste pedido. Por exemplo, a molécula polinucle- otídica isolada pode ser na forma de um plasmídeo capaz de expressar o vírus codificado numa célula hospedeira adequada in vitro, como descrito mais detalhadamente abaixo. O termo "geneticamente modificado", conforme aqui é usado, e a menos que de outra forma seja especificiado, significa alterado genetica- mente, isto é tendo um ou mais nucleotídeos substituídos, eliminados e/ou adicionados. As moléculas polinucleotídicas podem ser geneticamente alte- radas usando-se técnicas de DNA recombinante conhecidas dos versados na técnica, incluindo mutagênese dirigida, ou por mutagênese randômico como seja por exposição a mutagenes químicos ou a radiação, como é do conhecimento geral. Numa realização, a modificação genética do vírus PRRS Norte-americano da presente invenção torna o vírus incapaz de se replicar eficazmente, ou reduz a sua capacidade para se replicar eficaz- mente, numa ave ou mamífero em que o vírus selvagem possa replicar-se eficazmente. Numa outra realização, o vírus PRRS Norte-americano geneti- camente modificado da presente invenção permanece apto a replicar-se eficazmente em mamíferos ou aves infectadas por ele. "Replicação eficaz" significa capacidade para se multiplicar e produzir pró-gene viral (vírions) num animal infectado, isto é a capacidade para "infectar produtivamente" um animal. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso que codifica um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado que é incapaz de produzir PRRS num suíno, em que a seqüência de DNA codificador da molécula de RNA infeccioso codifi- cador do vírus PRRS Norte-americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, exceto possuir uma ou mais mutações que incapacitam geneti- camente o vírus PRRS codificado de produzir PRRS. "Geneticamente inca- pacitado" significa que o vírus PRRS é incapaz de produzir PRRS num suí- no por ele infectado.

Numa realização, o vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, incapacitado no que respeita a causar PRRS, é capaz de indu- zir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção de um suíno por um vírus PRRS. Assim, a presente invenção também proporciona uma mo- lécula polinucleotídica isolada compreendendo uma sequência de DNA co- dificador de uma molécula de RNA infeccioso, que codifica um vírus PRRS

Norte-americano, que está geneticamente modificado de forma a quando infectar um suíno ele: a) é incapaz de produzir PRRS no animal e b) é capaz de induzir uma resposta imunoprotetora contra a infecção por um vírus PRRS no animal, em que a sequência de DNA codificador do referido vírus PRRS Norte-americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, ex- ceto possuir uma ou mais mutações que o tornam geneticamente incapaz de codificar vírus PRRS causador PRRS. O termo "resposta imune" para fins desta invenção significa a produção de anticorpos e/ou células (tais como linfócitos T) que são dirigi- dos contra, ou facilitam a decomposição ou inibição, de um epítopo antigê- nico particular ou epítopos antigênicos particulares. As frases "uma resposta imunoprotetora eficaz", "imunoproteção" e termos semelhantes, para fins da presente invenção, significam uma resposta imune que é dirigida contra um ou mais epítopos antigênicos de um patógeno de forma a proteger contra a infecção pelo patógeno numa animal vacinado. Para fins da presente inven- ção, a proteção contra a infecção por um patógeno inclui não só a preven- ção absoluta da infecção, mas também qualquer redução no grau ou taxa de infecção por um patógeno, ou qualquer redução detectável da gravidade da doença ou qualquer sintoma ou estado resultante da infecção por um pató- geno, no animal vacinado comparado com um animal infectado não- vacinado. Uma resposta imunoprotetora eficaz pode ser induzida em ani- mais que não foram anteriormente infectados com o patógeno e/ou não es- tão infectados com o patógeno na altura da vacinação. Uma resposta imunoprotetora eficaz pode também ser induzida num animal já infectado com o patógeno na altura da vacinação.

Um "epítopo antigênico" é, a menos que de outra forma indica- do, uma molécula que é capaz de induzir uma resposta imune num animal ou espécie particular. Epítopos antigênicos são moléculas proteicas, isto é seqüências polipeptídicas, facultativamente compreendendo grupos não protéicos tais como grupos de açúcar e /ou grupos lipídicos. 0 termo "infectado patogenicamente" aqui usado refere-se à capacidade de um patógeno para infectar um animal e causar uma doença no animal. Como exemplo, um vírus PRRS é capaz de infectar patogenica- mente um suíno uma vez que pode causar PRRS no suíno. No entanto, se bem que um vírus PRRS possa infectar, de forma produtiva ou não, uma ave ou um outro mamífero, como seja o homem, não infecta patogenicamente qualquer animal que não seja um suíno e não causa doença em outros ani- mais para além do porco.

Os vírus PRRS Norte-americanos modificados geneticamente e codificados pelas moléculas polinucleotídicas isoladas atrás referidas são, numa realização, capazes de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção pelo vírus PRRS. Tais vírus PRRS Norte-americanos mo- dificados geneticamente são preferencialmente capazes de induzir uma res- posta imunoprotetora eficaz contra qualquer estirpe de vírus PRRS, incluin- do as estirpes Européias e Norte-americanas.

Numa realização, a mutação ou mutações na molécula polinu- cleotídica isolada codificadora do vírus PRRS Norte-americano genetica- mente incapacitado não são silenciosas e ocorrem numa ou mais grelhas de leitura abertas da seqüência nucleotídica codificadora do vírus PRRS Norte- americano, as quais são as ORFs 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de SEQ ID N0:1 ou homólogas. Numa outra realização, a mutação ou mutações ocorrem dentro da seqüência que é a seqüência de nucleotídeos 1-191 de SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga. Na mesma molécula polinucleotídica isolada as mutações podem ocorrer nas regiões codificadora e não codifi- cadora.

Conforme aqui é usado, a menos que de outra forma seja indi- cado, "regiões não codificadoras" da seqüência nucleotídica codificadora do vírus PRRS Norte-americano refere-se às seqüências de RNA que não são traduzidas numa proteína e às seqüências de cDNA que codificam tais se- qüências de RNA. Regiões codificadoras referem-se às seqüências de RNA a partir das quais são expressas proteínas do vírus PRRS Norte-americano e também se referem ao cDNA que codifica tais seqüências de RNA. Igual- mente, "ORFs" referem-se a seqüências de RNA que codificam proteínas do vírus PRRS Norte-americano e a seqüências de cDNA codificadoras de tais seqüências de RNA. A determinação de localizações para uma mutação ou muta- ções, que codificarão um vírus PRRS Norte-americano geneticamente inca- pacitado, de forma a ser incapaz de produzir PRRS, mantendo no entanto a capacidade de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção por um vírus PRRS, pode ser conseguida com base em SEQ ID NO:1 aqui fornecida. Qualquer um versado na técnica, poderá referir-se à seqüência do clone de cDNA infeccioso do vírus PRRS Norte-americano proporciona- do pela presente invenção, fazer alterações da seqüência que resultarão numa mutação e testar os vírus codificados tanto relativamente à sua capa- cidade para produzir PRRS em suínos, como para induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção por um vírus PRRS. Ao fazê-lo, os versados na técnica poderão ter como referência técnicas conhecidas e também as aqui descritas e/ou exemplificadas.

Por exemplo, uma ORF da seqüência codificadora da ORF da molécula de RNA infeccioso codificador do vírus PRRS Norte-americano pode ser mutagenizada e o vírus PRRS Norte-americano resultante testado quanto à sua capacidade para causar PRRS. A ORF de um vírus PRRS

Norte-americano codifica proteínas como segue: ORF 1a codifica uma poli- proteína compreendendo a função de protease; ORF1b codifica uma poli- proteína compreendendo as funções de replicase (RNA-polimerase) e heli- case; ORFs 2, 3 e 4 codificam pequenas glicoproteínas de membrana; ORF 5 codifica uma glicoproteína principal do invólucro; ORF 6 codifica uma proteína de membrana integral não glicosilada; e ORF 7 codifica uma pro- teína da nucleocapsídeo. As mutações genéticas de uma ou mais destas ORFs podem ser usadas na preparação de vírus PRRS Norte-americanos geneticamente modificados descritos infra. A presente invenção também proporciona uma molécula polinu- cleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA, codificadora da molécula de RNA infeccioso, codificador do vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado de forma a compreender um ou mais epítopos antigênicos heterólogos, em que a sequência de DNA codificador da molé- cula de RNA codificador do vírus PRRS Norte-americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, e ainda compreendendo uma ou mais seqüências polinucleotídicas adicionais que codificam epítopos antigênicos heterólogos e em que cada epítopo antigênico heterólogo é capaz de induzir uma res- posta imunoprotecora eficaz contra um patógeno particular num mamífero ou numa ave.

Um patógeno contra o qual pode ser induzida uma resposta imunoprotetora eficaz por meio de um aspecto da presente invenção atrás referida, é qualquer patógeno, como seja um vírus, bactéria, fungo ou proto- zoário, capaz de causar uma doença num mamífero ou ave, patógeno esse que compreende ou está associado a um ou mais epítopos antigênicos que podem ser usados para induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra o patógeno no mamífero ou ave. 0 termo "epítopo antigênico heterólogo" para fins da presente invenção significa um epítopo antigênico, como definido atrás, normalmente não encontrado num vírus PRRS Norte-americano selvagem. Uma seqüên- cia nucleotídica codificadora de um epítopo antigênico heterólogo pode ser inserida num genoma viral PRRS Norte-americano usando-se técnicas re- combinantes conhecidas. Epítopos antigênicos, úteis como epítopos antigê- nicos heterólogos para a presente invenção, incluem epítopos antigênicos adicionais dos vírus Norte-americanos, epítopos antigênicos dos vírus PRRS Europeus, epítopos antigênicos de patógenos de suíno para além dos vírus PRRS ou epítopos antigênicos de patógenos que infectam pato- genicamente aves ou outros animais para além de suínos, incluindo o ho- mem. Sequências codificadoras de tais epítopos antigênicos são conheci- das ou são proporcionadas aqui. Por exemplo, uma segunda proteína do invólucro do vírus PRRS Norte-americano, codificada pela ORF 5 de PRRS

Norte-americano aqui descrita, pode ser inserida numa seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA codificadora de um vírus PRRS Norte- americano da presente invenção para gerar um vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificado compreendendo uma proteína adicio- nal do invólucro como epítopo antigênico heterólogo. Tal vírus PRRS Norte- americano geneticamente modificado pode ser usado para induzir uma re- posta imunoprotetora mais eficaz contra vírus PRRS num suíno vacinado com ele.

Exemplos de um epítopo antigênico de um patógeno de suíno para além do vírus PRRS Norte-americano incluem, mas não estão limitados a um epítopo antigênico de um patógeno de suíno, selecionado do grupo constituído por PRRS Europeu, parvovírus de suíno, circovírus de suíno, rotavírus de suíno, gripe de suíno, pseudo-raiva de suíno, vírus da gastro- enterite transmissível, coronavírus respiratório de suíno, vírus da febre suí- na clássica, vírus da peste suína africana, vírus da encefalomiocardite, pa- ramixovírus de suíno, Actinobacillus pleuropneumoni, Bacillus anthraci, Bor- detella bronchiseptica, Clostridium harmolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escheríchia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophi- lus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella haemolytica, Pateurella multocida, Salmonells choie- raesuis, Salmonella typhímurium, Streptococcus equismilis e Streptococcus suis. Sequências nucleotídicas codificadoras de epítopos antigênicos dos patógenos de suínos atrás referidos são conhecidos e podem ser obtidas de bases de dados públicas tais como o GenBank. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbak/iNdex.html) fornecido pelo NCBI.

Se os epítopos antigênicos heterólogos forem epítopos antigê- nicos de um ou mais patógenos de suíno, então a molécula polinucleotídica isolada poderá conter ainda uma ou mais mutações que incapacitam geneti- camente o vírus PRRS codificado para produzir PRRS. Tais moléculas poli- nucleotídicas isoladas e os vírus que codificam são úteis para a preparação de vacinas para proteção de porcos contra o patógeno ou patógenos de suíno de onde derivam os epítopos antigênicos heterólogos.

Numa realização preferida, PRRS Norte-americano genetica- mente modificado é capaz de induzir uma resposta imune protetora contra a infecção por um vírus PRRS num suíno. Tais moléculas polinucleotídicas isoladas e os vírus que codificam são úteis na preparação de vacinas com dupla função para proteção de suínos contra a infecção por um vírus PRRS

Norte-americano e pelo patógeno ou patógenos de suíno dos quais derivam os epítopos antigênicos heterólogos. Numa outra realização preferida, o vírus PRRS Norte-americano, modificado geneticamente, útil numa vacina de função dupla está geneticamente incapacitado de causar PRRS.

As moléculas polinucleotídicas isoladas da presente invenção, compreendendo seqüências nucleotídicas codificadoras de epítopos antigê- nicos heterólogos, podem ser preparadas como descrito atrás baseado na seqüência codificadora de um vírus PRRS Norte-americano aqui descrito, usando técnicas conhecidas de biologia molecular.

Numa realização preferida, um epítopo antigênico heterólogo do vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado da presente inven- ção é um epítopo antigênico detectável. Tais moléculas polinucleotídicas isoladas e os vírus PRRS Norte-americanos que codificam são úteis, inter alia, para o estudo de infecções PRRS em suínos, determinando o número de suínos vacinados com êxito e/ou para distinguir suínos vacinados de suí- nos infectados por um vírus PRRS selvagem. Preferencialmente, tais molé- culas polinucleotídicas isoladas contêm ainda uma ou mais mutações que incapacitam geneticamente o vírus PRRS codificado no que respeita à sua capacidade para produzir PRRS e mais preferencialmente são capazes de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz num suíno contra a infecção por um vírus PRRS.

Os epítopos antigênicos heterólogos que são detectáveis e as seqüências que os codificam são conhecidos. Técnicas para a deteção de tais epítopos antigênicos são também conhecidas e incluem a deteção se- rológica de anticorpos específicos contra o epítopo antigênico heterólogo, por exemplo por meio de Western, ELISA ou com anticorpos marcados com uma marca fluorescente capazes de se ligarem aos anticorpos específicos do epítopo antigênico heterólogo. Técnicas para a deteção serológica úteis na realização da presente invenção podem ser encontradas em textos co- nhecidos, tais como Coligan, J.E. e outros, (eds), 1998, Current Protocols in Immunoloqy, John Willey & Sons, Inc, que aqui é incluído como referência na sua totalidade. Como alternativa, o próprio epítopo antigênico heterólogo pode ser detectado por exemplo pondo em contacto as amostras que poten- cialmente compreendem o epítopo antigênico com anticorpos marcados com uma marca fluorescente ou anticorpos marcados com uma marca radioacti- va que especificamente se ligam aos epítopos antigênicos. A presente invenção proporciona ainda uma molécula polinucle- otídica isolada compreendendo uma sequência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso que codifica vírus PRRS Norte-americano, ge- neticamente modificado, que não possui de forma detectável um epítopo antigênico do vírus PRRS Norte-americano, em que a seqüência de DNA codificador da molécula de RNA codificadora do vírus PRRS Norte- americano é SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, exceto não possuir uma ou mais seqüências nucleotídicas codificadoras de um epítopo antigê- nico detectável do vírus PRRS Norte-americano. Tais moléculas polinucleo- tídicas isoladas são úteis para distinguir entre porcos infectados com um vírus PRRS Norte-americano reçombinante da presente invenção e porcos infectados com um vírus PRRS selvagem. Por exemplo, animais vacinados com vírus PRRS Norte-americano morto, vivo ou atenuado codificado por tal molécula polinucleotídica isolada podem ser distinguidos de animais infec- tados com PRRS selvagem com base na ausência de anticorpos específicos do epítopo antigênico ausente, ou baseado na ausência do próprio epítopo antigênico. Se anticorpos específicos do epítopo antigênico em falta ou se o próprio epítopo antigênico forem detectados no animal, então o animal foi exposto e infectado pelo vírus PRRS. Conforme discutido atrás, são conhe- cidos meios para a deteção de epítopos antigênicos e anticorpos específi- cos contra os mesmos. Preferencialmente, tal molécula polinucleotídica isolada contém ainda uma ou mais mutações que incapacitam genetica- mente o vírus PRRS no que respeita à sua capacidade para produzir PRRS.

Mais preferencialmente, o vírus codificado permanece capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção por um vírus PRRS. B. Plasmídeos codificadores de um vírus PRRS Norte- americano ou de um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modifica- do: A presente invenção também proporciona qualquer uma das moléculas polinucleotídicas atrás descritas na forma de um plasmídeo capaz de expressar o vírus PRRS Norte-americano por ele codificado.

Os plasmídeos da presente invenção podem expressar o vírus PRRS Norte-americano codificado fora de um organismo vivo, para produzir vírus PRRS Norte-americano da invenção útil, inter alia, para a preparação de vacinas. Numa realização, um plasmídeo da presente invenção capaz de expressar um vírus PRRS Norte-americano foi de um organismo vivo, é um plasmídeo em que a transcrição do RNA viral a partir dele ocorre in vitro (isto é extracelularmente); a molécula de RNA viral resultante é usada para transfectar uma célula hospedeira adequada usando-se mecanismos co- nhecidos de transfeção, tais como eletroporação, lipofeção (em alguns ca- sos usando um reagente obtido comercialmente, como seja Lipofectin® (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA)) ou transfeção mediada por DEAE dextrano. São conhecidos outros métodos de tranfeção que podem ser empregados na presente invenção. Um exemplo de tal plasmídeo para a transcrição in vitro de RNA do vírus PRRS Norte-americano é o plasmídeo pT7P129A (ATCC N° de Acesso 203488). Qualquer promotor útil para a transcrição in vitro pode ser usado em tais plasmídeos desta invenção. T7 é um desses promotores, mas outros promotores podem ser usados, como seja um promotor SP6 ou um promotor T3. As seqüèncias de tais promoto- res podem ser artificialmente sintetizadas ou clonadas a partir de plasmí- deos disponíveis no mercado. Plasmídeos adequados para a preparação de tais plasmídeos capazes de expressar vírus PRRS Norte-americano inclu- em, mas não estão limitados a plasmídeos vetores de clonagem para apli- cações gerais tais como o pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, USA), pBR322 e pUC18. Uma seqüêncía nucleotídica da presente invenção codifi- cadora de vírus PRRS Nort^-americano pode ser inserida em qualquer um destes plasmídeos usandià técnicas recombinantes conhecidas. Outros plasmídeos em que as moléculas polinucleotídicas da presente invenção podem ser inseridas serão reconhecidos pelos versados na técnica.

Condições adequadas para a transcrição in vitro de RNA viral a partir de qualquer um dos plasmídeos recombinantes atrás descritos, com- preendendo uma sequência de DNA codificador de uma molécula de RNA viral infecciosa de um vírus PRRS Norte-americano, depende do tipo de plasmídeo, por exemplo, do seu promotor particular e pode ser otimizado pelos versados na técnica. Por exemplo, se um plasmídeo da presente in- venção for baseado num plasmídeo pCR2.1 compreendendo um promotor T7, então um exemplo de condições adequadas para a transcrição in vitro inclui reactivação do plasmídeo com RNA-polimerase de T7 e ribonucleotí- deos num tampão convencional e incubação da reacção a 37°C durante cerca de 30 minutos. Em alguns casos, existe no mercado estojos para a transcrição de RNA a partir de um plasmídeo particular e tais estojos podem ser usados na presente invenção. Após a transcrição mistura de reacção pode ser usada para transfectar diretamente uma célula hospedeira ade- quada sem purificação ou o RNA transcrito do vírus PRRS Norte-americano pode ser purificado por técnicas de purificação conhecidas, por exemplo por extracção orgânica (p.e. fenol) e precipitação com álcool (p.e. etanol ou iso- propanol), antes da transfeção.

Praticamente qualquer cultura de células de mamífero ou de aves pode ser transfectada com o RNA do vírus PRRS Norte-americano, obtido como descrito atrás, de forma a gerar um primeiro ciclo de vírions PRRS Norte-americanos. Um exemplo de células que pode-se pensar como particularmente úteis, devido a poderem ser facilmente obtidas e utilizadas, são as células BHK (rim de hamster bébé). No entanto, caso se pretenda obter uma cultura celular capaz de manter a produção de vírions PRRS

Norte-americanos, então os macrófagos alveolares de porco ou as células MARC-145 (Kim e outros, supra) são preferidas uma vez que estas células secretam níveis elevados de vírions PRRS da nova geração subseqüente à infecção com o vírus PRRS. Outras linhas celulares derivadas da linha ce- lular MA-104 podem igualmente ser usadas para a produção contínua de vírions PRRS Norte-americanos da presente invenção. Os macrófagos alve- olares de porco primários podem ser obtidos através de lavagem pulmonar dos porcos e a linha celular de rim de macaco MARC-145 pode ser obtida do National Veterinary Services laboratories também conhecido como NVSL (Ames, lowa, USA). 5 Numa outra realização, um plasmídeo capaz de expressar um vírus PRRS Norte-americano da presente invenção fora de um organismo vivo é um plasmídeo que é usado para transfectar uma célula hospedeira adequada, por exemplo, por eletroporação ou lipofeção, ocorrendo transcri- ção da molécula de RNA infeccioso e expressão do vírus PRRS Norte- io americano na célula hospedeira transfectada. A célula hospedeira transfec- tada gera assim vírions PRRS Norte-americanos. Tal método totalmente celular nunca foi descrito ou sugerido dentro da ordem de Nidovirales. Devi- do às possíveis sequências críticas de união e terminação presentes no RNA genômico dos vírus da ordem Nidovirales, um método completamente 15 celular de expressão de um vírus Nidovirales era considerado improvável.

As sequências críticas incluem sequências doadoras e aceitadoras de união do RNA, as quais poderíam causar união inadequado do transcrito de RNA, assim como seqüências de poliadenilação, as quais poderão causar termi- nação prematura da RNA-polimerase II. A presente invenção demonstra, no 20 entanto, que a presença de tais seqüências num plasmídeo, compreenden- do um clone de cDNA de um Nidovírus, não inibe a capacidade do plasmí- deo em expressar o Nidovírus quando o plasmídeo é usado diretamente para transfectar uma célula hospedeira adequada.

Assim, a presente invenção também proporciona plasmídeos e 25 um método completamente celular para a expressão de um vírus Nidovira- les, em que o plasmídeo compreende: a) uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador do vírus Nidovirales; e b) um promotor capaz de transcrever a referida seqüência codificadora numa célula, em que o referido promotor está operacionalmente ligado à seqüên- 30 cia de DNA codificador da molécula de RNA infeccioso. O método compre- ende transfeção de uma célula hospedeira adequada com o referido plas- mídeo, sujeição da célula hospedeira transfectada a condições adequadas à expressão das seqüências gênicas transfectadas e colheita dos vírus Nido- virales expressos a partir delas. Um exemplo de um plasmídeo adequado à expressão completamente celular do vírus PRRS norte-americano fora de um organismo vivo é o plasmídeo pCMV-S-P129 (ATCC N° de Acesso 203489). Numa realização preferida, o promotor de tal plasmídeo é um pro- motor de CMV. Numa realização preferida, um plasmídeo da invenção ade- quado a um método completamente celular de expressão de um vírus Nido- virales compreende um promotor eucariótico, como seja um promotor de CMV, imediatamente a montante e adjacente à seqüência nucleotídica codi- ficadora do vírus Nidovirales. Numa realização preferida, a seqüência nu- cleotídica codificadora do vírus Nidovirales codifica um vírus PRRS, Euro- peu ou Norte-americano. Outros exemplos de vírus Nidovirales que podem ser expressos por meio do método completamente celular atrás descrito in- clui outros Arterivírus tais como, vírus da artrite eqüina, vírus aumentadores da desidrogenase de lactato e vírus da febre hemorrágica símia; vírus que são membros do gênero Coronaviridae, tais como, mas não estando limita- dos a vírus da peritonite infecciosa felina, coronavírus entérico felino, coro- navírus canino, coronavírus bovino, coronavírus respiratório de suínos, co- ronavírus do perú, gastroenterite transmissível de suínos, coronavírus hu- mano, vírus da hepatite de murganho e vírus da bronquite infecciosa aviária; e membros do gênero Toroviridae, tais como, mas não estando limitado a vírus de Berne, vírus de Breda e torovírus humano. Assim, os plasmídeos adequados à expressão completamente celular, compreendendo uma se- qüência nucleotídica codificadora de um destes vírus, também estão englo- bados na presente invenção.

Plasmídeos adequados, que podem ser usados para preparar plasmídeos recombinantes da presente invenção, para a expressão com- pletamente celular de um vírus Nidovirales, como seja o vírus PRRS, fora de um organismo vivo incluem virtualmente qualquer plasmídeo útil na transfe- ção e expressão de células eucarióticas. Um exemplo de um plasmídeo adequado para a preparação de plasmídeos recombinantes da presente invenção para a expressão completamente celular de um vírus Nidovirales é o plasmídeo pCMVbeta (Clontech, Paio Alto, Califórnia, USA). Outros plas- mídeos, que são suscetíveis de serem transfectados e expressarem genes em células eucarióticas, que podem ser usados para preparar plasmídeos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a pCDNA3.1, pRc/RSV e pZeoSV2 (todos da Invitrogen); e pCMV-Sport3 e pSV-Sport1 (ambos da Life Technologies Inc.). No entanto, praticamente todos os veto- res de expressão eucarióticos funcionarão na presente invenção. As cons- truções baseadas em cosmídeos podem ser também usadas para a expres- são completamente celular ex vivo de um vírus Nidovirales. Células hospedeiras adequadas, para o método completamente celular da presente invenção para expressão do vírus PRRS, incluem ma- crófagos alveolares de suíno e células MARC-145, descritas atrás. Métodos de transfeção destas células com um plasmídeo são basicamente os mes- mos métodos da transfeção de células com RNA viral descrito atrás. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a eletroporação, lipofeção, transfeção mediada por DEAE dextrano e coprecipitação com fosfato de cálcio.

Uma vez transfectadas, com RNA viral ou com um plasmídeo compreendendo uma sequência nucleotídica codificadora de um vírus, as células hospedeiras, tais como macrófagos alveolares ou células MARC- 145, de acordo com a presente invenção, são depois congeladas a cerca de -80°C ou menos para se guardar durante vários dias. Durante períodos de tempo mais longos, isto é, décadas, prefere-se o armazenamento em azoto líquido. Caso se preveja um uso relativamente frequente do vírus codificado, então as células portadoras do vírus podem ser mantidas (descongeladas) em cultura usando-se técnicas conhecidas, durante períodos de tempo mais curtos. Ainda, as partículas virais excretadas por tais células podem ser guardadas congeladas a cerca de -80°C ou abaixo de uma fonte de vírus. A transfeção de tais linhas celulares com a molécula polinucleotídica codifica- dora do vírus pode ser confirmada caso se pretenda, por exemplo, testando o meio metabolizado pela linha celular relativamente a um antígeno do vírus PRRS usando um teste de anticorpo imunofluorescente. Os anticorpos que são específicos dos antígenos são conhecidos (ver, p.e., Collins, E. J. e ou- tros, WO 93/03760 4 de Março, 1993).

Numa outra realização, um plasmídeo da presente invenção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora do vírus PRRS

Norte-americano é adequado para a expressão in vivo do vírus PRRS Norte- americano, isto é expressão num organismo vivo. Os plasmídeos que po- dem ser usados para a preparação de plasmídeos recombinantes para a expressão in vivo de um vírus PRRS Norte-americano incluem, mas não estão limitados aos plasmídeos capazes de transfectar as células eucarióti- cas descritas atrás, tais como pCMVbeta.

Os animais que podem ser transfectados com plasmídeos da presente invenção incluem mamíferos e aves. Se o animal não for um suíno, por exemplo um pato bravo, então o plasmídeo pode compreender uma se- qüência nucleotídica codificadora de vírus PRRS Norte-americano compre- endendo outros epítopos antigênicos que são capazes de infectar patogeni- camente o animal; neste caso, o plasmídeo codificará um vírus PRRS Norte- americano servindo como vetor para a introdução de epítopos no animal. Se o animal for um suíno, então o plasmídeo poderá codificar quaisquer vírus PRRS Norte-americanos aqui descritos, incluindo os vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados aqui descritos. C. Vetores virais codificadores de um vírus PRRS Norte- americano, incluindo vetores virais codificadores de vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados: A presente invenção também proporciona vetores virais com- preendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de qualquer um dos vírus PRRS Norte-americanos aqui descritos, incluindo os vírus PRRS Norte-americanos geneticamente modificados aqui descritos. Tais vetores virais são úteis para transfeção de células eucarióticas para a produção de vírus PRRS da presente invenção fora de um organismo vivo ou para transfeção de suíno ou outros mamífe- ros, ou aves, com a seqüência codificadora do vírus PRRS Norte- americano, para expressão in vivo do vírus PRRS Norte-americano.

Alguns exemplos dos vírus que podem ser usados como vetores para a preparação de vetores virais da presente invenção incluem, mas não estão limitados a vírus de suíno, tais como vírus pox de suíno, vírus da pseudo-raiva ou vírus da peste suína africana. Tais vírus de suínos podem ser obtidos de The National Veterinary Services Laboratories (Ames, lowa, USA) do United States Department of Agriculture; the American Type Cultu- re Collection, também conhecida como ATCC (Manassas, Virgínia, USA); e outras fontes conhecidas. Os vetores virais recombinantes baseados em vírus de suíno adequados, tais como os vírus de suíno atrás referidos, são úteis para a transfeção de suínos com uma sequência nucleotídica codifica- dora de um vírus PRRS Norte-americano da presente invenção.

Vetores virais compreendendo uma seqüência de DNA, codifi- cadora de uma molécula de RNA infeccioso, codificadora de um vírus PRRS

Norte-americano da presente invenção, baseado nestes e em outros vírus, podem ser preparados usando-se técnicas recombinantes conhecidas des- critas em textos como os anteriormente citados neste pedido. D. Transfeção de células hospedeiras codificadoras de vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado: A presente invenção também proporciona células hospedeiras transfectadas que compreendem uma seqüência de DNA, codificadora de uma molécula de RNA infeccioso, codificadora de qualquer um dos vírus PRRS Norte-americanos aqui descritos, incluindo os vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados aqui descritos, tais células trans- fectadas sendo capazes de expressar o vírus PRRS Norte-americano. Tais células hospedeiras transfectadas são úteis para a produção dos vírus PRRS Norte-americanos da presente invenção. Exemplos de células hos- pedeiras transfectadas da presente invenção incluem os macrófagos alveo- lares de porco transfectados e as células MARC-145 transfectadas atrás descritas.

Outras células hospedeiras transfectadas da invenção incluem, mas não estão limitadas a células MA-104 transfectadas e outros derivados de células MA-104 que são transfectadas; células de rim de hamster bebê (BHK) transfectadas; células de ovários de hamster chinês (CHO) transfec- tadas; e células de rim de macaco verde africano, para além das células MA-104 ou células MARC-145, tais como células Vero; que são transfecta- das. E. Vírus PRRS Norte-americanos, incluindo vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados: A presente invenção também proporciona vírus PRRS Norte- americanos como aqui descrito, incluindo vírus PRRS Norte-americano ge- neticamente modificado como aqui descrito, expresso e/ou codificado por qualquer uma das moléculas polinucleotídicas isoladas atrás descritas, mo- léculas de RNA, plasmídeos, vetores virais ou células hospedeiras trans- fectadas.

Em certas situações, por exemplo quando o vírus PRRS Norte- americano se destina a usar em uma vacina para suínos e o vírus PRRS

Norte-americano não foi geneticamente modificado, como descrito atrás, de forma a não poder causar PRRS, é desejável tratar o vírus PRRS Norte- americano, por exemplo através da sua inativação ou atenuação, de forma que seja incapaz de causar PRRS em suínos quando administrado. Podem ser usados métodos conhecidos para inativar o vírus PRRS Norte- americano da presente invenção, de forma a torná-lo incapaz de causar PRRS num animal. Exemplos de tais métodos incluem, mas não estão limi- tados a tratamento com formaldeído, BEI (etileneimina binária) ou BPL (beta-propiolactona). Os métodos de atenuação são também conhecidos e tais métodos podem ser usados para atenuar um vírus PRRS Norte- americano da presente invenção. Um vírus PRRS Norte-americano da pre- sente invenção pode, por exemplo, ser atenuado por passagem seriada em culturas celulares.

Se um vírus PRRS Norte-americano da presente invenção for usado noutro animal para além de um suíno, ou se for geneticamente modi- ficado como aqui descrito de forma a ser incapaz de produzir PRRS num suíno, então não é necessário tratar o vírus como descrito no parágrafo an- terior antes de o usar numa vacina. F. Vacinas e suas utilizações A presente invenção também proporciona vacinas compreen- dendo vírus PRRS Norte-americanos, incluindo vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados incapazes de produzir PRRS num animal como aqui descrito; moléculas de RNA infeccioso e plasmídeos codi- ficadores de tais vírus PRRS Norte-americanso como aqui descrito; e veto- res virais codificadores de tais vírus PRRS Norte-americanos e moléculas de RNA isoladas como aqui descrito. A invenção também proporciona méto- dos para a proteção de animais da infecção compreendendo vacinação com tais vacinas.

Em uma realização preferida, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo um vírus Norte-americano geneticamente mo- dificado compreendendo um ou mais epítopos antigênicos heterólogos como aqui descrito, uma molécula de RNA infeccioso codificador de tal vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado ou um plasmídeo como aqui descrito, codificador de um vírus PRRS Norte-americano genetica- mente modificado, numa quantidade eficaz para induzir uma resposta imune protetora contra a infecção pelo patógeno ou patógenos dos quais derivam epítopo(s) antigênico(s) heterólogo(s) e um veículo aceitável para uso far- macêutico ou veterinário.

Tais vacinas podem ser usadas para proteger da infecção um mamífero ou uma ave capaz de ser patogenicamente infectada pelo patóge- no ou patógenos dos quais derivam os epítopo(s) antigênico(s) heterólo- go(s). Assim, a presente invenção também proporciona um método, para a proteção de um mamífero ou ave da infecção por um patógeno, que se ca- racteriza pela vacinação de um mamífero ou ave com uma quantidade da vacina, descrita no parágrafo anterior, eficaz na indução de uma resposta imunoprotetora no mamífero ou ave relativamente à infecção pelo patógeno.

Em uma realização preferida, a vacina compreende um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado ou uma molécula de RNA ou plasmídeo infeccioso codificador de tal vírus PRRS Norte-americano ge- neticamente modificado, compreendendo ou codificando um ou mais epíto- pos antigênicos heterólogos de um patógeno de suíno diferente do vírus PRRS Norte-americano. Estas vacinas são úteis para proteger os suínos da infecção por patógenos de suínos, dos quais derivam os epítopos antigêni- cos heterólogos. Se tal vacina compreender o vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, a modificação genética do vírus PRRS Norte- americano preferencialmente torna-o incapaz de causar PRRS em suínos.

Numa outra realização preferida, o vírus PRRS Norte-americano genetica- mente modificado da vacina é capaz de induzir uma resposta imunoproteto- ra contra a infecção por um vírus PRRS, proporcionando assim uma dupla vacina para suínos, protegendo-os da infecção por um ou mais patógenos de suínos dos quais derivam os epítopos antigênicos heterólogos, assim como contra a infecção por um vírus PRRS. Se a vacina compreender uma molécula de RNA infeccioso ou um plasmídeo codificador de um vírus PRRS

Norte-americano, compreendendo um ou mais epítopos antigênicos heteró- logos de um outro patógeno de suínos, então a sequência codificadora da molécula de RNA infeccioso codificador do vírus PRRS geneticamente mo- dificado, preferencialmente compreende uma ou mais mutações que geneti- camente incapacitam o vírus PRRS Norte-americano codificado de causar PRRS. Numa outra realização preferida, o vírus PRRS Norte-americano, geneticamente incapacitado de causar PRRS, é capaz de induzir uma re- posta imunoprotetora contra uma infecção PRRS num suíno, proporcionan- do uma dupla vacina para suínos, capaz de proteger os suínos da infecção por um ou mais patógenos de suínos, de onde derivam os epítopos antigê- nicos heterólogos, assim como da infecção por um vírus PRRS. Todas estas vacinas compreendem ainda um veículo aceitável para uso veterinário. A presente invenção proporciona ainda um método para a pro- teção de um suíno da infecção por um ou mais patógenos de suínos para além do vírus PRRS Norte-americano e, facultativamente, para proteção simultânea do suíno da infecção por um vírus PRRS, o qual se Caracteriza pela vacinação do animal com uma quantidade de uma vacina descrita no parágrafo anterior, eficaz na indução de uma resposta imunoprotetora no suíno quando da infecção por um ou mais patógenos de suínos e, facultati- vamente, por um vírus PRRS.

As vacinas da presente invenção podem ser formuladas seguin- do-se convenções aceitas de forma a incluir veículos aceitáveis para ani- mais, incluindo o homem (se aplicável), tais como padrões, estabilizadores, diluentes, conservantes, e/ou solubilizantes convencionais e pode também ser formulada de forma a facilitar a libertação controlada. Os diluentes in- cluem água, soro fisiológico, dextrose, etanol, glicerol e similares. Aditivos para aumentar a isotonicidade incluem cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizadores incluem, entre outros, albumina. São conhecidos, ou serão aparentes para os versados na técnica, outros veículos de vacinas e aditivos adequados, incluindo os que são parti- cularmente úteis na formulação de vacinas vivas modificadas. Ver, p.e., Reminaton's Pharmaceutical Science, 18a ed., 1990, Mack Publishing, que aqui é incluído como referência.

As vacinas da presente invenção podem ainda compreender um ou mais componentes adicionais imunomoduladores, tais como, p.e., um adjuvante ou citocina, entre outros. Exemplos não limitantes de adjuvantes que podem ser usados na vacina da presente invenção incluem o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, MT), alum, géis minerais tais como gel de hidróxido de alumínio, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo tais como, p.e., adjuvantes completo e incompleto de freund, copolíme- ros Block (CytRx, Atlanta GA), QS-21 (Cammbridge Biotech Inc., Cambridge MA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adjuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A ou outra fracção de saponinas, monofosforil-lípido A e adjuvante lípi- do-amina Avridine. Exemplos não limtantes de emulsões de óleo em água, úteis na vacina da invenção incluem formulações modificadas de SEAM62 e SEAM1/2. SEAM62 modificado é uma emulsão de óleo em água contendo 5% (v/v) de esqualeno (Sigma), 1% (v/v) do detergente SPAN®85 (ICI Sur- factants), 0,7% (v/v) do detergente TWEEN®80 (ICI Surfactants), 2,5% (v/v) de etanol, 200 pg/ml de Quil A, 100 pg/ml de colesterol e 0,5% (v/v) de leci- tina. SEAM 1/2 modificado é uma emulsão de óleo em água compreendendo 5% (v/v) de esqualeno, 1% (v/v) do detergente SPAN®85, 0,7% (v/v) do detergente Tween 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 pg/ml de Quil A e 50 μς/ιτιΙ de colesterol. Outros agentes imunomoduladores que podem ser incluídos na vacina incluem p.e., uma ou mais interleucinas, interferons ou outras ci- tocinas conhecidas.

As vacinas da presente invenção podem ser facultativamente formuladas para libertação controlada do vírus, molécula de RNA infeccioso, plasmídeo ou vetor viral em combinação com polímeros biocompatíveis, tais como, p.e., poli(ácido lático), poli(ácido lático-co-glicólico), metilcelulose, ácido hialurônico, colágeno e similares. A estrutura, seleção e utilização de polímeros degradáveis em veículos para libertação de drogas foram revistas em várias publicações, incluindo A. Domb e outros, 1992, Polymers for Ad- vanced Technologies 3:279-292, que aqui é incluído como referência. Ou- tras linhas de orientação na seleção e utilização de polímeros em formula- ções farmacêuticas podem ser encontradas em textos conhecidos, por exemplo M. Chasin e R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delibery Systems" em: Drugs and the Pharmaceutical Sciences.

Vol.45, M. Dekker NY, que aqui é incluído como referência. Como alternati- va, ou adicionalmente, o vírus, plasmídeo ou vetor viral pode ser microen- capsulado para melhorar a administração e eficácia. Os métodos de micro- encapsulação de antígenos são bem conhecidos e incluem técnicas descri- tas, p.e., na Patente U.S. 3,137,631; Patente U.S. 3,959,457; Patente U.S. 4,205,060; Patente U.S. 4,606,940; Patente U.S. 4,744,933; Patente U.S. 5,132,117; e Publicação de Patente Interacional WO 95/28227, todas elas aqui incorporadas como referência.

Os lipossomas podem ser também usados para proporcionar libertação controlada do vírus, plasmídeo ou vetor viral. Detalhes relativos a como preparar e usar as formulações lipossomais podem ser encontrados, entre outros lugares, em Patente U.S. 4,016100; Patente U.S. 4,452,747;

Patente U.S. 4,921,706; Patente U.S. 4,927,637; Patente U.S. 4,944,948;

Patente U.S. 5,008,050; e Patente U.S. 5,009,956, todas elas aqui incluídas como referência.

Uma quantidade eficaz de qualquer uma das vacinas atrás des- critas pode ser determinada por meios convencionais, começando com uma dose baixa do vírus, plasmídeo ou vetor viral e depois aumentando a dosa- gem, controlando ao mesmo tempo os efeitos. Uma quantidade eficaz pode ser obtida após uma única admnistração de uma vacina ou após múltiplas administrações de uma vacina. Fatores conhecidos podem ser tidos em consideração quando da determinação de uma dose ótima por animal. Estes incluem a espécie, tamanho, idade e estado geral do animal, a presença de outras drogas no animal e similares. A dose é preferencialmente escolhida após consideração dos resultados de outros estudos com animais.

Um método para detectar se uma resposta imunológica adequa- da foi ou não conseguida é determinar a seroconversão e o título de anti- corpos no animal após vacinação. O calendário da vacinação e o número de reforços, se houver, serão preferencialmente determinados por um médico ou veterinário com base na análise de todos os fatores relevantes, alguns dos quais estão descritos atrás. A dose eficaz de vírus, molécula de RNA infeccioso, plasmídeo ou vetor viral, da presente invenção pode ser determinada usando-se técni- cas conhecidas, tendo em consideração fatores que podem ser determina- dos pelos versados na técnica, como sejam o peso do animal a ser vacina- do. A dose do vírus da presente invenção numa vacina da presente inven- ção preferencialmente varia entre cerca de 10 e cerca de 10^ pfu (unidades formadoras de placas), mais preferencialmente entre cerca de 10^ e cerca de 10^ pfu, e mesmo mais preferencialmente entre cerca de 10^ e cerca de 107 pfu. A dose de um plasmídeo da presente invenção numa vacina da presente invenção, preferencialmente varia entre cerca de 0,1 pg e cerca de 100 mg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 10 mg, mesmo mais preferencialmente entre cerca de 10 pg e cerca de 1 mg. A dose de uma molécula de RNA infeccioso da presente invenção numa vaci- na da presente invenção preferencialmente varia entre cerca de 0,1 pg e cerca de 100 mg, mais preferencialmente entre cerca de 1 pg e cerca de 10 mg, mesmo mais preferencialmente entre cerca de 100 pg e cerca de 1 mg. A dose de um vetor viral da presente invenção numa vacina da presente invenção, preferencialmente varia entre cerca de 10 pfu e cerca de 10^ pfu, mais preferencialmente entre cerca de 10^ e cerca de 10^ pfu, e mesmo mais preferencialmente entre cerca de 10^ e cerca de 107 pfu. Uma dose adequada varia entre cerca de 0,5 ml e cerca de 10 ml e mais preferencial- mente entre cerca de 1 ml e cerca de 5 ml. A presente invenção proporciona ainda um método para a pre- paração de uma vacina compreendendo um vírus PRRS Norte-americano, molécula de RNA infeccioso, plasmídeo ou vetor viral aqui descritos, método esse que compreende a combinação de uma quantidade eficaz de um dos vírus PRRS Norte-americanos da presente invenção, molécula de RNA in- feccioso, plasmídeo ou vetor viral da presente invenção, com um veículo aceitável para uso farmacêutico ou veterinário.

Deve-se compreender que o termo "vírus PRRS Norte- americanos da presente invenção" e termos semelhantes, a menos que de outra forma seja indicado, incluem qualquer um dos vírus PRRS Norte- americanos geneticamente modificados aqui descritos assim como vírus PRRS Norte-americanos não-modifiçados aqui descritos codificados por SEQ ID NO:1 ou uma sequência homóloga. G. Moléculas polinucleotídicas isoladas e células hospedeiras transfectadas codificadoras de peptídeos de vírus PRRS Norte-americano e métodos para a produção de vírions PRRS Norte-americanos funcionais: A presente invenção também proporciona uma molécula polinu- cleotídica isolada compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas que codificam um peptídeo codificado por um vírus PRRS Norte-americano, em que a sequência genômica do referido vírus Norte-americano é a mesma ou homóloga de uma molécula de RNA correspondendo a SEQ ID NO:1.

Conforme aqui usados os termos "peptídeo do vírus PRRS Norte- americano" significa um peptídeo que é expresso por um vírus PRRS Norte- americano. Tal peptídeo pode ser, mas não o é necessariamente, específico dos vírus PRRS Norte-americanos.

Em uma realização preferida, uma molécula polinucleotídica isolada da presente invenção, codificadora de um peptídeo do vírus PRRS

Norte-americano, compreende uma seqüência ou sequências independen- temente selecionadas entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e uma seqüência homóloga de qualquer uma das referidas seqüências. Tais moléculas polinucleotídicas isoladas são úteis em plasmídeos ou na prepa- ração de vetores virais para transfeção de uma célula hospedeira adequa- da, para criar uma célula "auxiliar" compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas, que codificam peptídeos codificados por um vírus PRRS

Norte-americano, em que a seqüência genômica do referido vírus PRRS

Norte-americano é a mesma ou homóloga de uma seqüência de RNA cor- respondendo a SEQ ID NO:1, tal célula auxiliar é útil na preparação de víri- ons funcionais de vírus PRRS Norte-americanos da presente invenção, ví- rus esses que foram modificados geneticamente, como descrito atrás, de forma a não terem no seu RNA genômico a seqüência codificadora de um ou mais peptídeos codificados pela célula auxiliar.

Assim, a presente invenção inclui plasmídeos e vetores virais compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas codificadoras de um peptídeo codificado por um vírus PRRS Norte-americano, em que a referida seqüência genômica do referido vírus PRRS Norte-americano é a mesma ou homóloga de uma seqüência de RNA correspondendo a SEQ ID NO:1. Tais plasmídeos da invenção podem ser baseados nos plasmídeos descritos atrás, úteis na preparação de plasmídeos, compreendendo uma seqüência nucleotídica codificadora de um vírus PRRS Norte-americano. Tais vetores virais da invenção podem ser baseados, por exemplo, em vetores retrovirais ou vetores de vírus associados a adenovírus. Estes plasmídeos e vetores virais são úteis na preparação de células auxiliares descritas no parágrafo anterior. A presente invenção também proporciona uma célula auxiliar, isto é, uma célula hospedeira transfectada, compreendendo uma ou mais seqüências nucleotídicas que codificam um peptídeo codificado por um ví- rus PRRS Norte-americano, em que a seqüência genômica do referido vírus PRRS Norte-americano é a mesma ou homóloga de uma seqüência de RNA correspondendo a SEQ ID NO:1. Nas realizações preferidas, a célula hos- pedeira transfectada compreende uma ou mais seqüências nucleotídicas, independentemente selecionadas entre SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ

ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e uma seqüência homóloga de qualquer uma das referidas seqüên- cias. Estas células auxiliares são úteis como descrito anteriormente para proporcionar peptídeos para completar moléculas de RNA infecciosas defi- cientes em seqüências codificadoras dos peptídeos codificados pela célula auxiliar, de modo a possam ser produzidos pela célula vírions funcionais de um vírus PRRS Norte-americano. Células adequadas para este aspecto da invenção incluem as células descritas atrás que são adequadas para expressar os vírus PRRS

Norte-americanos, tais como macrófagos alveolares de suíno e células MARC-145. No entanto, pode ser usada praticamente qualquer célula de mamífero ou de ave. Conforme discutido atrás, caso se pretenda obter uma célula hospedeira transfectada capaz de ser reinfectada por vírions PRRS e assim permitir a produção de múltiplas gerações de vírions PRRS Norte- americanos geneticamente modificados, os macrófagos alveolares de suíno e as células MARC-145 são os preferidos. A presente invenção proporciona assim um método para a pro- dução de um vírion funcional de um vírus PRRS Norte-americano genetica- mente modificado, codificado por uma seqüência de RNA correspondendo a SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga, compreendendo uma ou mais mutações que inativam uma ou mais seqüências codificadoras de peptí- deos, método esse que compreende a transfeção de uma célula auxiliar como descrito no parágrafo anterior com uma molécula de RNA infeccioso, plasmídeo ou vetor viral codificador do vírus PRRS Norte-americano geneti- camente modificado, tal célula auxiliar compreende uma ou mais seqüências nucleotídicas codificadoras de um ou mais peptídeos do vírus PRRS Norte- americano de uma ou mais seqüências peptídicas inativadas do vírus PRRS

Norte-americano geneticamente modificado. A presente invenção proporciona assim um método para a gera- ção de um vírion funcional de um vírus PRRS Norte-americano genetica- mente modificado, codificado por uma seqüência de RNA correspondendo a SEQ ID NO:1 ou uma seqüência homóloga compreendendo uma ou mais mutações numa ou mais seqüências codificadoras de peptídeos, método esse que compreende a transfeção de uma célula adequada com uma mo- lécula de RNA infeccioso, plasmídeo ou vetor viral codificador do vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado e um vírus auxiliar que expressa na célula um ou mais peptídeos do vírus PRRS Norte-americano de uma ou mais seqüências codificadoras de peptídeos mutagenizadas do vírus PRRS Norte-americano modificado, e a separação dos vírions PRRS

Norte-americanos geneticamente modificados do vírus auxiliar. São conhe- cidos vários métodos de separação e incluem a utilização de vírus auxiliares letais condicionais que distinguem (matam) o vírus auxiliar em determinadas condições em que o vírus PRRS Norte-americano não é morto. Outros mé- todos de separação conhecidos incluem métodos físicos de separação, sub- seqüentes à expressão de vírions auxiliares e de viriõs PRRS Norte- americanos, por exemplo por centrifugação em gradientes de densidade. Células adequadas para este método da invenção incluem as células sus- cetíveis de serem infectadas por um vírus PRRS, como sejam macrófagos alveolares de porco e células MARC-145. Outras células que podem ser infectadas por um vírus PRRS foram descritas anteriormente neste pedido, por exemplo a linha celular MA-104 ou outras linhas celulares derivadas da linha celular MA-104. Um exemplo de um vírus auxiliar é um vírus PRRS, preferencialmente um isolado do vírus PRRS Norte-americano, como seja P129. Pode ser usado como vírus auxiliar qualquer vírus, selvagem, isolado ou recombinante, que expresse peptídeos de PRRS.

Moléculas de RNA infeccioso, plasmídeos e vetores virais que codificam um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, útil num dos métodos atrás referido para a geração de um vírion funcional de um vírus PRRS Norte-americano geneticamente modificado, são as molé- culas de RNA infeccioso, plasmídeos e vetores virais descritos neste pedi- do. H. Vírus Nidovirales imunoprotetores geneticamente modifica- dos e vacinas que os incluem: A presente invenção proporciona ainda um vírus Nidovirales ge- neticamente modificado, que é capaz de induzir uma resposta imunoproteto- ra num mamífero ou numa ave vacinada com ele, tal vírus Nidovirales gene- ticamente modificado é preparado através da obtenção de uma molécula polinucleotídica isolada, compreendendo uma seqüência de DNA codifica- dor de uma molécula de RNA infeccioso, codificador de um vírus Nidovirales selvagem, mutagenização genética da seqüência de DNA codificador da molécula de RNA infeccioso, codificador do vírus Nidovirales de forma a se obter uma molécula polinucleotídica isolada, compreendendo uma seqüên- cia de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso, codificador de um vírus Nidovirales geneticamente modificado, tal vírus sendo capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção pelo vírus Ni- dovirales selvagem num mamífero ou numa ave e expressão do vírus Nidovi- rales geneticamente modificado a partir da molécula polinucleotídica isolada assim obtida. A presente invenção proporciona ainda um método para a pre- paração de um vírus Nidovirales geneticamente modificado que é capaz de induzir uma resposta imunoprotetora num mamífero ou numa ave vacinada com ele, método esse que compreende a obtenção de uma molécula polinu- cleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales selva- gem, mutagenização genética de uma seqüência de DNA codificador da molécula de RNA infeccioso codificador do vírus Nidovirales de forma a se obter uma molécula polinucleotídica isolada compreendendo uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales geneticamente modificado, tal vírus sendo capaz de induzir uma resposta imunoprotetora eficaz contra a infecção pelo vírus Nidovirales selvagem num mamífero ou numa ave e expressão do vírus Nidovirales ge- neticamente modificado a partir da molécula polinucleotídica isolada assim obtida.

Seqüências de DNA codificador de uma molécula de RNA infec- cioso codificador de um vírus Nidovirales incluem as seqüências de DNA que são iguais ou homólogas de SEQ ID NO:1 aqui descrita, as quais codi- ficam um vírus PRRS Norte-americano. Seqüências de DNA codificador de moléculas de RNA infecciosas codificadoras de vírus Nidovirales diferente do vírus PRRS Norte-americano são conhecidas e podem ser obtidas a par- tir de fontes conhecidas, por exemplo nas bases de dados genéticas referi- das atrás. Outros exemplos de algumas seqüências de DNA.codificador de moléculas de RNA infecciosas, codificadoras de vírus Nidovirales que po- dem ser usadas na presente invenção, incluem a seqüência de DNA codifi- cador do vírus PRRS Europeu descrito em Meulenberg, J.J.M., e outros, 1993, supra', a seqüência de DNA codificador do vírus da artrite eqüina des- crito em van Dinten, L.D., e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(3):991-6; e a seqüência de DNA codificador de vírus da artrite eqüina descrito em den Boon, J.A. e outros, 1991, J. Virol. 65(6):2910-20, todas estas referências são assim incluídas na sua totalidade no presente pedido.

Os vírus Nidovirales, que podem ser geneticamente modificados por meio da presente invenção, podem ser quaisquer vírus Nidovirales para os quais seja obtida uma seqüência de DNA codificador. Alguns exemplos de vírus Nidovirales estão descritos em seções anteriores do presente pedido.

Uma vez obtida uma seqüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales, moléculas polinucleotídicas isoladas, por exemplo plasmídeos, compreendendo a se- qüência de DNA codificador de uma molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales pode ser sintetizada usando técnicas recombinantes descritas atrás.

As seqüências codificadoras da molécula de RNA infeccioso codificador de um vírus Nidovirales podem ser geneticamente mutageniza- das, como descrito atrás para o vírus PRRS Norte-americano, de forma a se obter vírus Nidovirales compreendendo modificações genéticas, tais como uma incapacidade para causar doença num animal infectado, inclusão de epítopos antigênicos heterólogos que são capazes de induzir uma resposta imunoprotetora num animal, inclusão de epítopos antigênicos heterólogos que sejam detectáveis e deleção de epítopos antigênicos detectáveis. Tais modificações genéticas estão descritas atrás. As mutações genéticas, de forma a codificarem vírus Nidovirales geneticamente modificados, podem ocorrer em regiões codificadoras e/ou não-codificadoras da seqüência de DNA codificador da molécula de RNA infeccioso codificador do vírus Nidovi- rales. Numa realização, uma ou mais mutações genéticas ocorrem numa ORF codificadora de um peptídeo viral do vírus Nidovirales. "Vírus Nidovirales do tipo selvagem" como aqui é usado significa um vírus Nidovirales cujo genoma não foi deliberadamente mutagenizado geneticamente, como seja um vírus Nidovirales que ocorra na natureza e seus isolados. A presente invenção proporciona ainda uma vacina para a pro- teção de um mamífero ou de uma ave da infecção por um vírus Nidovirales, a qual compreende um vírus Nidovirales, geneticamente modificado como descrito atrás, numa quantidade eficaz para induzir uma resposta imuno- protetora contra o vírus Nidovirales selvagem num mamífero ou numa ave vacinada com ele e um veículo aceitável para uso farmacêutico ou veteriná- rio. Estas vacinas da presente invenção podem ser formuladas usando as técnicas para formulação de vacinas descritas atrás.

Os exemplos que se seguem são apresentados apenas para ilustrar aspectos da presente invenção. Eles não pretendem limitar a inven- ção, nem foram concebidos para tal, estabelecido nas reivindicações apen- sas e descrito mais detalhadamente aqui.

Exemplos Exemplo I. Preparação de um clone de cDNA infeccioso de um isolado do vírus PRRS Norte-americano.

Fonte de vírus PRRS e células MARC-145: Um isolado do vírus PRRS Norte-americano, designado P129, foi obtido dos Drs. Gregory W.

Stevenson, William G. e Van Alstine e Charles L. Kanitz do Laboratório de Diagnóstico de Doenças Animais da Purdue University em West Lafayette, Indiana. O vírus P129 foi originalmente isolado no Outono de 1995, numa exploração de porcos no sul de Indiana, a qual sofreu um surto grave de PRRS. Esta quinta não tinha histórico anterior de problemas com PRRS ou de vacinação contra PRRS. O isolado P129 era mais virulento do que outros isolados de campo da mesma época e área geográfica, pelo fato de produzir doença respiratória mais grave e mais consistente em porcos jovens. O ví- rus foi inicialmente isolado em macrófagos alveolares de porco (a célula hospedeira natural) e subsequentemente passado em células MARC-145 (Kim, H.S. e outros, 1993, Arch. Virol. 133:477-483). Os genes codificadores de proteínas estruturais de P129 são homólogos das correspondentes se- qüências de genes conhecidas do vírus PRRS Norte-americano. A linha celular MARC-145 que foi usada para propagar os vírus PRRS é um clone da linha celular de Rim de Macaco Rhesus MA-104. As células MARC-145 foram adquiridas ao National Veterinary Sevices Labo- ratories (NVSL, Ames, lowa) da USDA. Estas células foram testadas e en- controu-se serem negativas para micoplasmas e para agentes infectantes comuns de suínos. As células MARC-145 são de rotina crescidas a 37°C em OtimEM (Life Technologies Inc.) com 2% de soro fetal bovino e antibióticos.

Cinco clones biológicos foram purificados de placas do lote de vírus P129 e estes foram designados P129A a P129E. A purificação de pla- cas foi realizada infectando monocamadas de células MARC-145 com vírus P129, adição de uma camada de OtimEM contendo 1,25% de agarose Sea- Plaque (FMC BioProducts), 2% de soro fetal bovino e antibióticos. As placas eram claramente visíveis após 7 dias de incubação, quando 5 placas bem isoladas foram repicadas e passadas para monocamadas de novas MARC- 145. Quando o efeito citopático (morte celular induzida pelo vírus) tornou-se aparente a pró-gene viral de cada uma destas culturas foi sujeita a um outro ciclo de purificação de placas. Uma placa bem isolada de cada um dos cin- co clones foi picada e expandida para produzir grandes lotes. Os 5 clones foram testados relativamente à virulência em porcos jovens, individualmente (clones A e E) ou em combinação (clones B-D, ou clones A-E). Em todos os casos, o vírus purificado de placas replicou-se bem em porcos e causou doença clínica. A gravidade dos sintomas clínicos foi inferior à causada pelo vírus P129 não-clonado, mesmo quando os cinco clones foram usados em conjunto. P129A foi escolhido para sequenciação e foi usado em manipula- ções moleculares subsequentes.

Determinação da seqüência qenòmica de P129A: O vírus purifi- cado de placas P129A foi usado para a determinação da seqüência após dez passagens seriadas em porco (incluindo duas purificações de placas e uma passagem subseqüente). SEQ ID NO:1 mostra a seqüência de cDNA correspondendo ao RNA genômico de P129A. O genoma tem 15395 nucle- otídeos de comprimento (excluindo a cauda de poliadenosinas), começa com ATGACGTA e termina com CCGCAATT. Uma cauda típica de poliade- nosinas de 55 resíduos também está incluída em SEQ ID NO:1.

Para os genes estruturais de P129A (ORFs 2 a 7), que compre- endem 20% de 3' do genoma, foram escolhidas vários "primers" de PCR com base nas seqüências de cDNA parciais de outros isolados do vírus PRRS Norte-americano disponíveis na base de dados pública de seqüên- cias de DNA GenBank (por exemplo PRU00153). RNA viral purificado foi sujeito a transcrição reversa para se obter cDNA, usando transcriptase re- versa e "primers" hexaméricos randômicos. Este cDNA foi então usado em PCR com "primers" específicos de genes. Os produtos de PCR foram remo- vidos dos géis e clonados pelo sistema T/A no plasmídeo pCR2.1 (Invitrogen). Para cada par de "primers", foram sequenciados múltiplos plasmídeos (derivados de reacções de PCR independentes). As seqüências foram montadas usando o programa Seqman do pacote Lasergene (DNASTAR; Inc). Isto permitiu completar a seqüência das posições 11992 a 15347 do genoma de P129A.

Também na base de dados GenBank existe uma série de pe- quenas seqüências (aproximadamente um total de 218 nucleotídeos) que compreendem um segmento do gene ORF 1b de vários isolados de vírus PRRS. Um destes (PPSSEQB) foi usado para projetar "primers" de PCR (direto 5'-ACAGTTTGGTGATCTATG-3' (SEQ ID N0:10), correspondendo às posições 9063-9080; reverso 5'-CAGATTCAGATGTTCAA-3' (SEQ ID NO: 11), correspondendo às posições 9252-9268). Estas amplificaram frag- mentos de 206 nucleotídeos, os quais incluem 171 nucleotídeos da nova seqüência do gene ORF 1b de P129A, correspondendo às posições 9081 a 9251. Um novo "primer" direto foi projetado dentro desta região (5'- ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3' (SEQ ID NO: 12), posições 9201- 9224) e um "primer" foi projetado dentro da ORF1b imediatamente a mon- tante da ORF2 (5'-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAATG-3' (SEQ ID NO: 13), posições 12027-12050). Estos "primers" foram usadas em RT-PCR para amplificar um fragmento de 2850 nucleotídeos da ORF1b, correspondendo às posições 9201-12050 do genoma P129A.

Durante a amplificação por RT-PCR da ORF5 de um outro iso- lado de campo Norte-americano do vírus PRRS, observou-se uma banda fraca com um tamanho inferior ao esperado. Esta foi seqüenciada e encon- trou-se ter homologia com a ORF1a do vírus Lelystad (resultante de uma iniciação inespecífica). Escolheram-se novos "primers" para esta região para amplificar P129A (direto 5'-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3' (SEQ ID NO: 14), correspondendo às posições 1587-1610; reverso 5'- AGAGCGGCTGGGATGACACTG-3' (SEQ ID NO: 15), correspondendo às posições 1877-1897). Para além do produto de 311 nucleotídeos (266 nu- cleotídeos da nova seqüência P129A entre os "primers", correspondendo às posições 1611-1876), um produto de PCR menos abundante e com um ta- manho superior foi clonado e sequenciado (656 nucleotídeos da nova se- qüência P129A entre os "primers" correspondendo às posições 1611-2264). A banda maior resulta de uma iniciação falsa do "primer" reversa nas posi- ções 2265-2269.

O extremo 5' do genoma de P129A foi determinado por 5' RACE (amplificação rápida de extremos de cDNA) usando um estojo comercial (Life Technologies Inc.). Escolheram-se dois "primers" reversos sucessivos dentro da seqüências conhecida da ORF1a ("RACE2" 5'- CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3' (SEQ ID NO: 16), posições 1917-1938; e "RACE3" 5'-AGGGGGAGCAAAGAAGGGGTCATC-3' (SEQ ID NO: 17), posições 1733-1756). RACE2 foi usado para iniciar a síntese de cDNA, en- quanto que RACE3 foi usado em PCR. Os produtos de PCR resultantes fo- ram clonados e sequenciados. Os dois produtos mais longos terminaram precisamente na mesma base (posição 1 em SEQ ID N0:1). 0 intervalo grande entre a sequência conhecida na ORF1a e na 0RF1 b foi preenchido usando RT-PCR longo. Usou-se dois "primers" novos (direto 5'-AGCACGCTCTGGTGCAACTG-3' (SEQ ID NO: 18), posições 1361-1380; reverso 5'-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3' (SEQ ID NO: 19), posições 9420-9438). O produto de RT-PCR resultante de 8078 nucleotí- deos foi clonado e sequenciado. O extremo 3' do genoma de P129A foi determinado ligando os extremos 3' e 5' do RNA viral e usando RT-PCR para amplificar o fragmento da junção. Os fragmentos de junção resultantes foram clonados e sequenci- ados. Resumidamente, RNA extraído dos vírions sedimentados foi tratado com pirofosfatase ácida de tabaco (para remover as estruturas em chapéu ("cap") 5'), depois autoligado com RNA-ligase de T4 (ambos da Epicentre Technologies). Os "primers" usadas foram 5OGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3' (SEQ ID NO:20) (direto, posições 15218-15239) e 5'-CGGTAGGTTGGTTAACACATGAGTT-3' (SEQ ID NO:21) (reverso, posições 656-680) ou 5'- TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3' (SEQ ID NO:22) (reverso, posições 337-359). Todos os clones resultantes eram truncados no extremo 5' do ge- noma (o mais completo iniciado a 57 nucleotídeos do extremo 5', conforme revelado por RACE), no entanto dois destes clones continham o extremo 3' completo do genoma incluindo a cauda de poliadenosinas (42 e 55 resíduos de adenosina de comprimento). Isto completou a sequenciação do cDNA de 15450 bases do genoma do isolado PRRS P129A, incluindo a cauda poliA, como se mostra em SEQ ID NO:1.

Criação de um clone de cDNA de tamanho .completo infeccioso de P129A: Um clone de cDNA de tamanho completo infeccioso de P129A, designado pT7P129A, foi montado a partir de quatro produtos de RT-PCR sobreponíveis clonados. Os quatro produtos de RT-PCR foram primeiro clo- nados em T/A no plasmídeo pCR2.1 (Invitrogen) e usados para transfectar Escherichia coli estirpe DH5-alfa. Fez-se o rastreio das colônias bacterianas e as que continham insertos com os tamanhos esperados na orientação "T7 para M13" foram escolhidos para sequenciação e posterior manipulação. Os quatro produtos de RT-PCR clonados continham uma ou mais mutações não-silenciosas (desvios da seqüência nucleotídica de consenso para P129A de SEQ ID NO:1, as quais resultariam na alteração da seqüência de aminoácidos das ORFs codificadas). Estas mutações não-silenciosas (exceto uma na posição 12622 na ORF2) foram reparadas por subclonagem dos fragmentos a partir de outros produtos de RT-PCR clonados. Os quatro clones subgenômicos reparados foram montados num clone de tamanho completo, passo a passo, usando sítios de restrição disponíveis (ver Figura 1). Os extremos 5' e 3' do cDNA correspondendo ao genoma P129A em pT7P129A foram modificados pela adição de um promotor de T7 e sítios de endonucleases de restrição adequadas. A construção de pT7P129A está descrita mais detalhadamente nos parágrafos que se seguem.

O extremo 5' do genoma (posições 1-1756), gerado por 5'-RACE e clonado em pCR2.1, como descrito atrás, foi modificado para incluir um promotor de T7 imediatamente a montante do cDNA correspondente ao ge- noma de P129A e um sítio Pacl para futuras clonagens. Realizou-se uma ligação de três elementos usando o fragmento Dsal-SseRI de 1216 pares de bases deste plasmídeo (contendo as bases 27-1242 de P129A), o frag- mento Ssel-Xbal de 4407 pb do mesmo plasmídeo (contendo as bases 1243-1756 de P129A e todo o vetor plasmídico até ao sítio XbaI) e o adap- tador sintético que se segue (SEQ ID NOS: 23 e 24): 5'- CTAGATTAATTAATACGACTCACTATAGGGATGACGTATAGGTGTTGGCT CTATGC-3' 31 T AATT AATTAT G CT G AGT G AT ATCCCTACT G C AT AT C C AC AAC CG AG AT A CGGTGC-5' Xba\_______promotor T7 ______Dsal Pacl genoma de P129A O transcrito previsto a partir do promotor T7 inclui um único re- síduo "G" a partir do promotor imediatamente a montante do primeiro "A" do genoma viral. Uma mutação não-silenciosa na posição 1230 (A a G) foi re- parada substituindo o fragmento Aafll-Sacll de 906 pb (bases 740-1645) dentro do mesmo fragmento de um outro clone. Este plasmídeo foi designa- do "pT7R3A-2". O produto de PCR de 8078 nucleotídeos atrás descrito foi usado para cobrir as bases 1361-9438 do genoma de P129A. Uma deleção de 58 pb (posições 2535-2592) e 7 mutações pontuais não-silenciosas foram cor- rigidas por subclonagem dos fragmentos a partir de outros produtos de RT- PCR clonados, dando o plasmídeo "pGAP10B-4". O fragmento BsuZ6\-Spe\ de 7837 pb deste plasmídeo foi ligado ao fragmento BsuZ6\-Spe\ de 5482 pb do pT7R3A-2. O plasmídeo resultante "pT7RG" contém as primeiras 9438 bases do genoma de P129A atrás do promotor T7.

Um fragmento de 2850 nucleotídeos da ORF1b descrito atrás (posições do genoma 9201-12050) foi corrigido para reparar mutações não- silenciosas e designado "p1B3A-2". O fragmento Nde\-Spe\ de 2682 pb deste plasmídeo foi ligado ao fragmento Nde\-Spe\ de 13249 pb do pT7RG para dar o plasmídeo "pT71A1B", o qual contem as 12050 primeiras bases do genoma de P129A. O quarto e último fragmento do genoma de P129A foi obtido por RT-PCR das ORFs 2 a 7, incluindo a região não-traduzida 3' e uma fracção da cauda poliA. O "primer" direta foi 5'- ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3' (SEQ ID NO:25) (posições 11504-11530) e o "primer" reversa foi 5'- GGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTGCGGCCGCAT GGTTCTCG-3' (SEQ ID NO:26). O "primer" reverso contém as 22 últimas bases do genoma P129A (posições 15374-15395), uma cauda poliA de 21 bases, um sítio NsiI (ATGCAT) e um sítio Swal (ATTTAAAT). As mutações pontuais não-silenciosas e uma deleção de uma base foram reparadas por subclonagem dos fragmentos a partir de outros clones. Uma mutação pon- tual não-silenciosa adicional na posição 12622 (A a G) foi inadvertidamente introduzida nesta fase. isto resulta numa mudança de uma glutamina para arginina perto do extremo C da proteína da ORF2 (resíduo de aminoácido 189 dos 256 aminoácidos da ORF2, o qual não afeta a ORF3 sobreposta).

Esta mutação aparentemente não teve influência no crescimento viral, nas culturas celulares ou nos porcos, e não foi reparada. Esta mutação serviu como marca genética para distinguir vírus derivado do clone de cDNA de possível contaminação com P129A parental ou outros vírus PRRS. O plas- mídeo foi designado "p2_7D-4". Os genes estruturais de P129A foram adici- onados ao resto do genoma através da ligação do fragmento Eco47lll-Spel de 3678 pb do p2_7D-4 ao fragmento Eco47lll-Spel de 15635 pb do PT71A1B.

Isto dá a construção final "pT7P129A", o qual compreende cDNA correspondendo quase de forma idêntica à totalidade do genoma de P129A (no entanto, com uma cauda poliA de apenas 21 bases, em oposição à cauda de 55 bases) a seguir ao promotor T7, clonado no vetor pCR2.1 entre sítios de restrição únicos (Pacl e Swal). O comprimento total de pTP7129A é 19313 pb e é estável em E. coli estirpe DH5-alfa. pT7P129A contém uma mutação pontual não-silenciosa de A para G na posição 12622 que resulta numa arginina na posição 189 da ORF2 em vez de uma gluta- mina (conforme codificado por SEQ ID NO:1) e uma mutação silenciosa de C para T na posição 1559. Nenhuma destas mutações afetou o crescimento viral nas condições analisadas, tanto em culturas celulares como em porcos.

Por exemplo, pT7P129A foi usado para transcrição in vitro e os transcritos de RNA resultantes produziram vírus PRRS Norte-americano vivo quando transfectado para células MARC-145, demonstrando assim que o clone de tamanho completo é infeccioso.

Transcrição in vitro e transfeção dos transcritos de RNA, No plasmídeo pT7P129A existem dois promotores T7 em tandem a montante do genoma viral. Um destes está posicionado imediatamente a montante do genoma viral e foi inserido no "primer" de PCR como descrito atrás. O outro está presente no vetor de clonagem pCR2.1 e está situado fora do sítio de clonagem múltipla (iniciação da transcrição 44 bases a montante do genoma viral). Pacl foi usado para cortar entre estes promotores T7, antes da trans- crição in vitro, para gerar um transcrito que está mais perto do RNA viral autêntico (um único G extra imediatamente a montante do genoma viral, em oposição às 44 bases extra relativamente ao promotor T7 distai). Ainda, pT7P129A foi cortado com Swal antes da transcrição in vitro. Os transcritos ininterruptos resultantes incluem uma cauda poliA de 21 bases de compri- mento e nove nucleotídeos não existentes em PRRS, incluindo um sítio Nsi\ (o qual não foi usado para linearizar o plasmídeo, uma vez que o sítio tam- bém ocorre no genoma viral). O plasmídeo digerido foi purificado por extrac- ção com fenol e precipitação com etanol antes de ser usado.

Um estojo comercial (T7 Cap-Scribe, Boehringer Mannheim) foi usado para a transcrição in vitro. O sedimento de DNA atrás referido, con- tendo cerca de 0,6 pg de pT7P129A digerido com Pac\lSwa\, foi ressuspen- so em 20 μΙ de tampão T7 Cap-Scribe/polimerase T7 e incubado a 37°C durante 30 minutos. Um fragmento da reacção foi analisado por eletroforese em gel de agarose e mostrou conter transcriptos de RNA de tamanho com- pleto para além das bandas de DNA esperadas de 15445 pb e 3868 pb. A reacção de transcrição in vitro foi usada de fresco, imediatamente após in- cubação, sem purificação. Monocamadas de células MARC-145 que atingi- ram a confluência há pouco tempo foram lavadas uma vez com OtimEM(sem soro) e cobertas com 1 ml de OtimEM (sem soro) por cavidade de 35 mm contendo 500 pg/ml de DEAE dextrano (peso molecular de aproximada- mente 500000, Pharmacia Biotech. A reacção de transcrição in vitro (15 μΙ) foi adicionada imediatamente. Após 1 hora a 37°C a mistura de transfeção foi removida, as monocamadas foram lavadas uma vez com PBS e cobertas com 1,25% de agarose SeaPlaque (FMC Corporation) em OtimEM com 2% de soro fetal bovino e antibóticos. Após 5 dias a 37°C, viu-se apenas uma única placa. Este vírus, designado ΎΡ129Α-1", foi expandido em células MARC-145 e caracterizado em culturas celulares e em porcos. Subseqüen- tes transfeções de RNA transcrito in vitro a partir de pT7P129A, usando tanto DEAE dextrano como eletroporação, deram muitas placas adicionais.

Caracterização de vírus recombinante rP129A-1: Não existem diferenças aparentes nas cinéticas de crescimento, produção ou morfologia das placas entre vírus recombinantes derivado de cDNA e ΓΡ129Α-1 e o ví- rus parental não-recombinante P129A. Conforme discutido atrás, existem duas diferenças na sequência de nucleotídeos entre a seqüència codifica- dora de pT7P129A e a sequência de consenso de P129A (apresentada em SEQ ID NO:1). Em primeiro lugar, na posição 1559 de pT7P129A existe um T, enquanto que em P129A existe um C (esta é uma mutação silenciosa).

Em segundo lugar, na posição 12622 pT7P129A contém um G, enquanto que P129A contém um A (esta é uma mudança de glutamina para arginina na ORF2 descrita atrás). Para excluir a possibilidade de rP129A-1 ser de fato um vírus PRRS não-recombinante contaminante, realizou-se RT-PCR e sequenciação nas regiões à volta destas duas diferenças. No caso de am- bas as marcas genéticas, rP129A-1 era idêntico ao plasmídeo pT7P129A e diferente do vírus parental P129A, confirmando assim que rP129A-1 deriva do clone de cDNA infeccioso.

Caracterização do vírus recombinante rP129A-1 em porcos: O vírus rP129A-1 derivado do cDNA recombinante foi comparado com o seu vírus parental não-recombinante P129A relativamente à sua capacidade para infectar e causar doença clínica em porcos jovens. Três grupos de 10 porcos cada, derivados de uma exploração negativa para PRRS, foram in- fectados com 4 semanas de idade com P129A, rP129A-1 ou infectados com meio de cultura. Controlaram-se os sinais clínicos, temperaturas rectais e peso do corpo. Colheu-se sangue nos dias 0, 2, 6, 10 e 13 após infecção para determinação da virémia no soro (por ensaio de placas em células MARC-145, Figura 2) e anticorpos séricos (por ELISA usando HerdChek PRRS da IDEXX, Figura 3). Observou-se a existência de lesões macroscó- picas e microscópicas do pulmão quando da necrópsia. Não houve diferen- ças significativas entre os dois grupos infectados com vírus, indicando que rP129A-1 replica-se em porcos e provoca doença clínica que é quantitativa e qualitativamente semelhante ao seu vírus parental não-recombinante.

Exemplo II. Deleção da ORF7 (gene da nucleocápside) do vírus PRRS

Norte-americano; Preparação de um vírus vacinai defectivo para a replica- ção e marcado negativamente. 0 gene da nucleocápside viral (ORF7) foi parcialmente elimina- do de um clone de cDNA infeccioso do vírus PRRS da presente invenção.

Esperava-se que o vírus PRRS recombinante modificado resultante fosse defectivo para a replicação em porcos. Este vírus PRRS recombinante mo- dificado podería ser usado como vacina para induzir uma resposta imune contra outras proteínas do vírus PRRS sem os riscos de doença clínica, dis- seminação a animais não-vacinados ou reversão da virulência associada a vacinas vivas atenuadas. Para além de ser muito seguro, tal vírus vacinai seria também "marcado negativamente", no sentido de permitir que a expo- sição a isolados de campo do vírus PRRS pudesse ser determinada serolo- gicamente, mesmo na presença de anticorpos contra o vírus vacinai. Os anticorpos contra a proteína ORF7 são normalmente encontrados nos soros de porcos infectados com vírus PRRS, enquanto que os porcos vacinados com um PRRSV sem a ORF7 não produziría anticorpos contra a proteína da ORF7. A deleção da ORF7 do clone infeccioso foi conseguida como se segue: 0 plasmídeo p2_7D-4 (ver Figura 1) foi usado como molde no PCR para amplificar as regiões flanqueantes 5' e 3' a montante e a jusante da ORF7. O "primer" direto a montante 5'- ATT AG AT CTT GCCACCATGGTGGGG AAAT GCTT GAC-3' (SEQ ID NO:27) (que se liga às posições no genoma 13776-13791 perto do início da ORF5 e contém sítios de restrição adicionais que são irrelevantes para a presente clonagem) e o "primer" reverso a montante 5'- CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGGTTTAC-3' (SEQ ID NO:28) (que se liga às posições no genoma 14857-14902 na jun- ção das ORFs 6 e 7) amplificaram um fragmento de 1147 pb. O "primer" re- verso introduziu sítios Mlu\ e AflU e uma única alteração de bases na posi- ção 14874, destruindo o códon de iniciação ATG da ORF7 sem alteração da tirosina codificada plea ORF6 sobreposta. Para a região flanqueante a ju- sante, o "primer" direto foi 5'- CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3' (SEQ ID NO:29) (posições 14884-14914 perto do extremo 5' da ORF7, introduziu um sítio Mlul) e o "primer" reversa 5'-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3' (SEQ ID NO:30) (a jusante do genoma viral no plasmídeo pCR2.1) amplificou um fragmento de 462 pb. Realizou-se uma via de 3 ligações, usando o frag- mento BstEII-MIuil de 611 pb do produto de PCR da seqüência flanqueante a montantes, o fragmento Mlu\-Spe\ de 575 pb do produto de PCR da região flanqueante a jusante e o fragmento SsfEII-Spel de 6653 pb do plasmídeo p2_7D-4 (todos os fragmentos foram purificados em gel após digestão). O plasmídeo resultante p2_7Ddelta tinha eliminados os sete primeiros amino- ácidos da ORF7 e não possui um códon de iniciação ATG funcional. Dois outros sítios de restrição novos, que estão ausentes no genoma viral e na estrutura do plasmídeo, AflW e Mlu\, foram inseridos para facilitar a clona- gem direcionada de genes estranhos no espaço previamente ocupado pelo extremo 5' da ORF7.

As alterações feitas em p2_7Ddelta7+7023 foram incluídas num clone genômico de tamanho completo através da ligação do fragmento Eco47lll-Spel de 3683 pb de p2_7Ddelta7+7023 com o fragmento Eco47lll- Spel de 15214 pb do pCMV-S-p129. O plasmídeo resultante pCMV-S- p129delta7+7023 foi usado para transfectar células.

Uma vez que o nucleocapsídeo é essencial para o crescimento viral, é necessário fornecer esta proteína de forma a permitir a obtenção de replicação de um vírus PRRS deficiente na ORF7. Isto pode ser conseguido, por exemplo, usando um vírus auxiliar ou uma linha celular que o comple- mente. Podem ser criadas linhas celulares MARC-145 que expressem a ORF7 através da transfeção estável das células com um plasmídeo conten- do o gene da ORF7 de P129A e o gene de resistência à neomicina. Após seleção da resistência à neomicina usando o antibiótico G418, as colônias isoladas podem ser então expandidas e caracterizadas. As linhas celulares clonais derivadas de MARC-145 que são positivas para a expressão da ORF7, tanto por imunofluorescência como por RT-PCR, puderam ser trans- fectadas com RNA derivado de pT7P129delta7 de forma a produzir vírus P129A defectivo na ORF7.

Estratégias semelhantes podem ser usadas para gerar vírus PRRS deficientes noutros genes estruturais (ORFs 2, 3, 4, 5 ou) ou defici- entes noutras regiões dos genes não-estruturais 1a e 1b. Ainda, podem ser produzidas múltiplas deleções num único vírus PRRS e este pode ser cres- cido em células de complementação que proporcionam todas as funções necessárias. Tais vírus PRRS defectivos para vários genes são provavel- mente parcial ou totalmente atenuados em porcos, tornando-os úteis como vacinas contra PRRS. Eles podem também ser usados para distinguir ani- mais vacinados de animais infectados com um vírus PRRS selvagem, con- forme discutido atrás, e/ou como vetores para a vacinação de animais com epítopos de outros patógenos de suíno (ver Exemplo III, abaixo).

Exemplo III. Inserção de genes heterólogos no genoma do vírus PRRS

Norte-americano; utilização do vírus PRRS como vetor e como vírus PRRS

Norte-americano marcado positivamente No Exemplo II, atrás, foram inseridos sítios de restrição AflU e Mlu\ na região inicialmente ocupada pelo extremo 5' da ORF7. Estes sítios estão ausentes no genoma de P129A e nos plasmídeos pCR2.1 e pCMV e podem ser usados na clonagem direcionada de genes estranhos (heterólogos) no genoma viral para expressão. Potenciais sítios de junção de seqüências líderes para transcrição do RNA subgenômico da ORF7 nas posições 14744-14749 (ATAACC) e 14858-14863 (TAAACC) não foram afetados pela deleção da seqüência codificadora da ORF7 e podem funcio- nar na transcrição de um gene estranho. Genes estranhos (heterólogos) podem incluir genes de outros isolados ou genótipos do vírus PRRS, e/ou genes para outros patógenos não PRRS, quer patógenos que infectam suí- nos quer patógenos que infectam mamíferos não suínos, ou aves.

Ainda, estes genes estranhos (ou seus fragmentos) podem pro- porcionar epítopos antigênicos que não são normalmente encontrados nos suínos. Tais epítopos podem ser usados para "marcar positivamente" uma vacina, de forma a que o sucesso da vacinação seja controlado serologica- mente, mesmo na presença dos anticorpos contra estirpes do campos ou estirpes vacinais convencionais do vírus PRRS. Uma marca positiva não necessita de uma cassete de expressão separada. Um epítopo antigênico pode ser fundido com um gene estrutural do vírus PRRS. Por exemplo, o "primer" reverso da seqüência flanqueante a montante, descrita atrás no Exemplo I, pode ser prolongado de forma a adicionar uma fusão, no extremo de carboxila, de um epítopo antigênico, que não seja do vírus PRRS, à pro- teína de membrana da ORF6. A presença do anticorpo contra este epítopo no suíno indica uma vacinação bem sucedida.

Exemplo IV. Expressão celular de um vírus PRRS por transfeção das células diretamente com cDNA. O vetor de expressão eucariótico pCMV-MC1 (SEQ ID NO:31) deriva do plasmídeo comercial pCMVbeta (Clontech) substituindo a seqüên- cia codificadora de LacZ entre os dois sítios Notl com um adaptador conten- do Not\, EcoRV, Avrll, Sg/ll, C/al, Kpn\, Pacl, NheI, Swal, Smal, Spel e Not\. A modificação do promotor precoce imediato de CMV foi conseguida subs- tituindo a seqüência entre o sítio Sad e o segundo sítio Notl de pCMV-MC1 com um adapatador sintético (apresentado abaixo). O adaptador contém um meio sítio Sad seguido de Pacl, Spel e um meio sítio Notl. Após empare- Ihamento dos dois oligonucleotídeos de cadeia simples, o adaptador foi clo- nado em pCMV-MC1 entre os sítios Sad e Notl e um clone selecionado foi designado pCMV-S1. O sítio Spel de pCMV-S1 não foi cortado, possivel- mente devido a um erro na seqüência oligonucleotídica. Assim, o fragmento entre Pacl e Hindlll em pCMV-S1 foi substituído com um fragmento Pacl (na posição S77)-Hind\\\ (na posição 1162) do pCMV-MC1. Assim, um sítio Spel foi recuperado. Esta construção final (pCMV-S) foi usada para clonar o ge- noma de tamanho completo de P129.

Seqüência do adaptador (SEQ ID NO:32 e 33): 5' CGTTAATTAAACCGACTAGTGC 3' 3' TCGAGCAATTAATTTGGCTGATCACGCCGG 5' -------Pacl Spel------- Saci Notl A seqüência imediatamente a montante do extremo 5' do geno- ma P129 foi modificada para obter espaçamento correto e um sítio para en- zima de restrição adequado (Pacl). Isto foi conseguido projetando "primers" adequados para PCR (SEQ ID NOS:34 e 35) para amplificação a partir de pT7P129. Após digestão com Pacl e AatU, este fragmento de PCR foi sub- clonado nos sítios Pacl e AatW de pT7RG (Fig. 1). O plasmídeo resultante foi designado pT7RG-deltaT7. A construção final foi completada por subclonagem das seqüên- cias virais a partir de pT7RG-deltaT7 nos sítios Pacl e NdeI em pT7P129, criando pT7P129-deltaT7. O genoma P129 de tamanho completo foi digeri- do a partir de pT7P129-deltaT7 em Pacl e Spel e transferido para pCMV-S nos sítios Pacl e Spel. Esta construção foi designada pCMV-S-P129. A seqüência da região de modificação entre a caixa TATA do promotor CMV e o extremo 5' da seqüência P129 em pCMV-S-P129 está apresentado em SEQ ID NO:36 e esquematicamente mostrada abaixo: TATATAAGCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTCATGACGTATAGGTGTTGGC 5'caixa TATA Saci Pacl Início de P129 3' Para testar a utilização do promotor CMV para iniciar a infecção pelo vírus PRRS em células, o plasmídeo pCMV-S-P129 (0,5 ou 1,0 μg) foi usado para transfectar células MARC-145 por lipofeção usando Lipofecta- mine (Life Technologies Inc.). Efeito citopático específico do vírus PRRS foi observado após transfeção e a presença do antígeno do vírus PRRS foi determinada por um teste com anticorpos imunofluorescentes. O vírus PRRS foi produzido eficazmente a partir de pCMV-S- P129 e a pró-gene viral foi passada em células MARC-145. isto demonstra que uma infecção pelo vírus PRRS pode ser iniciada diretamente a partir de um plasmídeo com cDNA codificador de um vírus PRRS, sem uma etapa de transcrição in vitro. Ainda, pCMV-S-P129 gerou uma maior quantidade de pró-gene viral comparada com os plasmídeos em que o extremo 3' do pro- motor de pCMV não estava imediatamente antes da seqüência codificadora do vírus PRRS Norte-americano.

Exemplo V. Deleção da ORF4 do vírus PRRS Norte-americano; Preparação de um vírus vacinai defectivo na replicação.

Um segmento do gene da ORF4, que codifica uma glicoproteína de membrana, foi eliminado de um clone de cDNA do vírus PRRS da pre- sente invenção. Espera-se que o vírus PRRS recombinante modificado re- sultante seja defectivo relativamente à replicação em porcos e que induza uma resposta imunológica contra outras proteínas do vírus PRRS sem os riscos de doença clínica, disseminação para animais não-vacinados ou re- versão da virulência associada a vacinas vivas atenuadas. A deleção da ORF4 a partir de um clone infeccioso foi conse- guida como se segue. O plasmídeo p2_7D-4 (ver Figura 1) foi usado como molde em PCR para amplificar as regiões flanqueantes 5' e 3' a montante a jusante da ORF4. O "primer" direto para a região flanqueante a montante foi 5'- AGGTCGACGGCGGC/4A7TGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCCTTCT- 3' (SEQ ID NO:37). Este "primer" liga-se às posições do genoma 13194- 13241, perto do começo da ORF4, e introduz uma mutação na posição 13225 que destrói o códon de iniciação ATG da ORF4 sem alteração da sequência de aminoácidos sobreposta da ORF3 O "primer" reverso da se- qüência flanqueante a montante foi 5’- TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-31 (SEQ ID N0:38). Este "primer" liga-se às posições do genoma 13455-13477 dentro da região codi- ficadora de ORF4, a jusante da ORF3 e introduz um sítio AflW. Para a região flanqueante a jusante, o "primer" direto foi 5'- CTTCTTAAGTCCACGCGTTTTCncnGCCTTTTCTATGCTTCT-3' (SEQ ID NO:39). Este "primer" liga-se às posições do genoma 13520-13545 no meio da ORF4 e introduz sítios AflW e Mlu\ para a clonagem direcionada de genes estranhos. O "primer" reverso foi 5'-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT3' (SEQ ID NO:40). este "primer" liga-se às posições do genoma 14981-14999 na seqüência codificadora da ORF7. Realizou-se uma ligação de três ele- mentos usando o fragmento Sal\-Afl\ do produto de PCR da região flanque- ante a montante, o fragmento Affll-SsfEII do produto de PCR da região flan- queante a jusante e o fragmento Sa/l-BsfEII do plasmídeo p2_7D-4. Todos os fragmentos foram purificados em gel após digestão. O plasmídeo resul- tante p2_7D-4delta4N não possui 42 bases da região central da ORF4 que foram substituídas por um sítio de clonagem artifical de 15 bases. O sítio de clonagem contém dois sítios de restrição (Afl\ e Mlu\) que estão ausentes do genoma viral e da estrutura do plasmídeo. Estes podem ser usados para facilitar a clonagem direcionada de genes estranhos no espaço previamente ocupado pela ORF4. O sítio de clonagem também contém um códon de pa- ragem (TAA) que está na mesma quadro de leitura da ORF4 e assim asse- gura que a proteína funcional da ORF4 não seja produzida.

Encontrou-se que uma deleção mais extensa da seqüência co- dificadora da ORF4 poderá ser feita sem interferir com a expressão do gene do invólucro da ORF5 a jusante. Neste caso uma região flanqueante a ju- sante mais curta foi amplificada por PCR usando o mesmo molde e o "primer" reverso e usando o "primer" direta 5'- GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3' (SEQ ID NO:41). Este "primer" liga-se às posições do genoma 13654-13669 perto do extremo 3' da ORF4 e contém um sítio Aflll. Procedeu-se a uma ligação de dois elementos entre o fragmento Affll-físfEII do produto de PCR da região flanqueante a jusante e o fragmento Af/ll-SsfEII do plasmídeo p2_7D-4-delta4N deu o novo plasmí- deo p2_7D-4delta4NS. Este plasmídeo tem 176 bases da ORF4 codificado- ra da seqüência eliminada e substituída com um sítio de clonagem de 15 bases.

As alterações feitas em p2_7D-4delta e p2_7Ddelta4NS foram incluídas no clone genômico de tamanho completo substituindo o fragmento BsrGI-Spel de pCMV-S-P129 com os fragmentos BsrGI-Spel modificados de p2_7D-4delta4N e p2_7D-4delta4NS. Os plasmídeos resultantes pCMV-S- P129delta4N e pCMV-S-P129delta4NS foram usados para células trans- fectadas.

Ao contrário depCMV-S-P129, a transfeção das células MARC- 145 com os plasmídeos pCMV-S-P129delta4N ou pCMV-S-P129delta4NS não resultou em placas virais ou focos fluorescentes. Pode-se observar que células individuais transfectadas produzem a proteína da nucleocápside da ORF7, sugerindo que o produto do gene da ORF4 não é necessário para a replicação ou expressão de genes virais, mas é essencial para a libertação de pró-gene viral infecciosa. Uma vez que a deleção da ORF4 é letal para a replicação do vírus, é necessário fornecer esta proteína. Isto pode ser con- seguido usando uma linha celular de complementação. Foram criadas linhas celulares MARC145, que expressam a ORF4, transfectando as células de forma estável com um plasmídeo contendo a ORF4 e o gene de resistência à neomicina. Após seleção da resistência à neomicina usando o antibiótico G418, colônias de células isoladas foram expandidas e caracterizadas.

Após transfeção com pCMV-S-P129delta4NS, três clones celulares expres- sando a ORF4 produziram vírus vivo que pode ser propagado nestas célu- las mas não nas células MARC-5. Um destes, MARC400E9 foi posterior- mente caracterizado. A coloração por imunofluorescência da nucleocápside viral em células MARC400E9 transfectadas com o plasmídeo pCMV-S- P129delta4NS foi positiva.

Exemplo VI. Utilização de vírus PRRS com genes deletados como vetor para a expressão de genes heterólogos Para determinar se os genes heterólogos podem ser expressos a partir de vírus PRR com genes deletados, inserimos uma cópia da proteí- na fluorescente verde (GFP) no sítio de deleção da ORF4 no plasmídeo pCMV-S-P129delta4N. O gene GFP foi amplificado a partir de um vetor plasmídico comercial usando "primers" de PCR que introduziram um sítio AflW no extremo 5' do gene e um sítio Mlu\ no extremo 3' do gene. O plasmí- deo resultante pCMV-S-P129delta4N-GFP foi usado para transfectar células MARC-145 e MARC400E9. Conforme esperado, as células MARC-145 não sustentaram a replicação do vírus com a ORF4 eliminada. Células verdes isoladas resultantes da transfeção primária foram observadas sob luz UV, indicando que GFP estava a ser expressa, mas o vírus não passou para as células vizinhas e não foi observado efeito citopático. Pelo contrário, obser- vou-se grandes focos verdes nas células MARC400E9. Formaram-se e sur- giram placas visíveis que destruiram a monocamada. Estes resultados indi- cam que genes estranhos podem ser expressos em vírus PRRS, cuja ORF4 foi eliminada, e que o aumento do tamanho do genoma viral em 692 bases (4,5%) não interferiu com a encapsidação do RNA viral nas partículas infec- ciosas.

Exemplo VII. Utilização de vírus PRRS competente para a replicação como vetor de expressão de genes heterólogos.

Para determinar se os genes heterólogos podem ser expressos a partir de um vírus PRRS competente para a replicação, foi inserida uma cópia de GFP na região entre a ORF1b e a ORF2. Uma vez que a seqüên- cia líder/junção (L/J) para a ORF2 situa-se dentro da ORF1b, esta seqüên- cia L/J foi usada para dirigir a expressão do gene GFP e uma cópia dase- qüência ORF6 L/J foi inserida a jusante de GFP para dirigir a expressão da 0RF2. O plasmídeo p2_7D-4 (ver Figura 1) foi usado como molde em PCR para amplificar as regiões flanqueantes 5' e 3' a montante e a jusante do sítio de inserção. O "primer" direta para da região flanqueante a mon- tante foi 5'-AACAGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3' (SEQ ID NO:42). Este "primer" liga-se às posições do genoma 11699-11721 na ORF1b. O "primer" reversa da região flanqueante a montante foi 5'- GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTCA- 3' (SEQ ID NO:43). Este "primer" liga-se às posições do genoma 12031- 12055 na ORF1b e adiciona sítios AflU e Mlu\ para a clonagem direcionada de genes estranhos entre a ORF1b e a ORF2. O "primer" direta da região flanqueante a jusante foi 5'- GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAAC AATGAAATGGGGTCTATACAAAGCCTCTTCGACA-3' (SEQ ID NO:44).

Este "primer" liga-se às posições do genoma 12056-12089 na ORF2 e con- tem um sítio Mlul seguido de 40 bases que precedem a iniciação da ORF6 (contendo a seqüência L/J da ORF6). O "primer" reversa da região flanque- ante a jusante foi 5'-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3' (SEQ ID NO:45). Este "primer" liga-se às posições do genoma 13819-13844 na ORF5. Procedeu-se a uma ligação de très elementos usando o fragmento Eco47lll-/W/ull do produto de PCR da região flanqueante a montante, o fragmento Mlu\-BsrG\ do produto de PCR da região flanqueante a jusante e o fragmento Eco47lll-BsrGI do pCMV-S-P129. O plasmídeo resultante, pCMV-S-P129-1bMCS2, contem todo o genoma de P129 com um sítio de clonagem e um sítio L/J adicional entre a ORF1b e a ORF2. O plasmídeo produz vírus funcionalmente normal quando usado para transfectar células MARC-145. O gene GFP de um plasmídeo comercial foi amplificado por PCR usando "primers" que adicionam um sítio AflW ao extremo 5' e um sítio Mlu\ ao extremo 3' do gene. Após digestão do fragmento de PCR e de PCMV-SP129-1bMCS2 com AflW e Mlu\, o inserto foi ligado ao vetor para dar o plasmídeo pCMV-S-P129-1bGFP2. Este plasmídeo produziu placas verdes quando usado para transfectar células MARC-145. O vírus resultante foi passado em células MARC-145 e continuou a produzir placas verdes quando observado sob luz UV. Assim, genes estranhos podem ser expres- sos a partir de vetores do vírus PRRS competente para a replicação. O vírus P129-1 bGFP2 contem um genoma que é 774 bases maior (5%) do que o do vírus parental P129, se bem que seja encapsado normalmente.

DEPÓSITO DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Depositou-se o material biológico que se segue na American Type Culture Collection (ATCC) em 10801 University Blvd Manassas, Virgí- nia, 20110-2209, USA, em 19 de Novembro, 1998 e a que foram dados os seguintes números de acesso: Plasmídeo N° de Acesso plasmídeo pT7P129A 203488 plasmídeo pCMV-S-P129 203489 Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações citadas são aqui incluídas como referência na sua totalidade. A presente invenção não está limitada pelas realizações especí- ficas descritas, as quais destinam-se a ser simples ilustrações dos aspectos da invenção, e métodos funcionalmente equivalentes estão dentro do âm- bito da invenção. De fato, várias modificações da invenção, para além das apresentadas serão aparentes para os versados na técnica a partir da des- crição anterior e dos desenhos juntos. Tais modificações devem ser incluí- das no âmbito das reivindicações apensas.

Claims

1. Molécula polinucleotídica isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA codificando uma molécula de RNA infeccioso, a qual codifica um vírus PRRS Norte-americano, em que a referi- da sequência de DNA corresponde à SEQ ID NO.: 1.

2. Molécula polinucleotídica isolada de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que está na forma de um plasmídeo.

3. Plasmídeo capaz de transfectar diretamente uma célula hos- pedeira adequada e expressar um vírus PRRS Norte-americano a partir da célula hospedeira adequada assim transfectada, caracterizado pelo fato de que compreende a) uma sequência de DNA codificando uma molécula de RNA infeccioso codificando o vírus PRRS Norte-americano, a referida se- quência de DNA sendo correspondente à SEQ ID NO.: 1 e b) um promotor capaz de transcrever a referida molécula de RNA infeccioso codificada, na referida célula hospedeira adequada.

4. Método para produzir um vírus PRRS Norte-americano, carac- terizado pelo fato de que compreende a transfeção de uma célula hospedei- ra adequada com o plasmídeo como definido na reivindicação 3 e a obten- ção do vírus produzido pela célula hospedeira transfectada.