KR20070064666A

KR20070064666A - 돼지의 생식 및 호흡 증후군 바이러스 돌연변이

Info

Publication number: KR20070064666A
Application number: KR1020077010662A
Authority: KR
Inventors: 동완 유; 창희 이; 제이 그레고리 칼버트
Original assignee: 화이자 프로덕츠 인코포레이티드
Priority date: 2004-11-11
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2007-06-21
Also published as: AR051487A1; TW200636067A; US7879337B2; BRPI0517745A; ZA200703762B; CN101056982A; AU2005303510B2; CA2586153A1; US20090004221A1; RU2007117510A; NO20072578L; MX2007005708A; AU2005303510A1; CA2586153C; EP1812573A1; JP2008519594A; IL182976A0; WO2006051396A1

Abstract

본원 발명은 E 단백질의 보존된 시스테인이 결실되거나 시스테인이 아닌 잔사로 변화되도록 개질된 유전적으로 변형된 PRRS 바이러스 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 유전적으로 개질된 바이러스 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

돼지의 생식 및 호흡 증후군 바이러스 돌연변이{MUTANT PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS}

본 발명은 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 유전적으로 개질된 바이러스 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 또한 제공된다.

돼지의 생식 및 호흡 증후군(PRRS)은 어린 돼지의 호흡기 질병 뿐만 아니라 암퇘지의 유산, 사산 및 다른 생식 문제를 특징으로 한다. 원인이 되는 동인(動因)은 아테리비리다에(Arteriviridae)과 니도비랄레스(Nidovirales)목의 일원인 PRRS 바이러스이다. 바이러스의 2가지의 개별적인 유전형이 1980년대 후반에 북아메리카와 유럽에서 거의 동시에 나타났다. PRRS 바이러스는 이제 거의 모든 돼지 생산 국가에서 풍토병이며, 전세계의 돼지 산업에 영향을 미치는 경제적으로 가장 중요한 질병이다.

현재, PRRS에 대한 상업적인 백신은 개질된 생백신 및 사백신(불활성화된 백신)을 포함한다. 사백신은 PRRS 바이러스의 이종 균주에 대해 강건한 면역성을 유 도하는데 실패하였다고 비난받아왔다. 개질된 생백신은 독성이 손실될 때까지 세포 배양액에서 연속 계대 배양함으로써 감독되었다. 변형된 생백신은 사백신에 비해 더 넓은 보호를 이끌어내었지만, 잔여 독성, 백신접종되지 않은 돼지로의 살포 및 독성으로의 유전적 역전을 포함한 여러 안정상의 문제점이 있을 수 있다. 감독 과정동안 수행되는 항원 변화 때문에 이런 백신은 또한 PRRS 바이러스의 독성 야생 균주에 대해 보호할 수 있는 능력을 일부 잃을 수 있다. 따라서 PRRS에 대해 보호하는 새롭고 개선된 개질된 생백신에 대한 필요성이 증가하고 있다.

도 1은 모 cDNA 클론 pCMV-S-P129(상단) 및 돌연변이 cDNA 클론 pCMV-S-P129-E-C54S(하단)를 이용하여 감염시킨 지 4일 후(좌측) 및 5일 후(우측)의 MARC-145 세포에서의 세포변성 효과(CPE)를 나타낸다.

도 2는 모 P129 바이러스(상단) 및 돌연변이 P129-E-C54S(하단)의 플라크 형태를 나타낸다. MARC-145 세포의 단층을 감염시키고, 아가로즈 오버레이로 덮고, 플라크가 명확해질 때까지 배양하고 뉴트럴 레드로 염색하여 플라크를 가시화시켰다. 돌연변이 바이러스 플라크가 더 작고 중심에 더 완성된 CPE를 갖는다.

도 3은 PRRS 바이러스의 북미 및 유럽 단리체에서 나온 E 단백질의 정렬을 나타낸다.

서열의 간단한 설명

서열번호 1: 셔틀 플라스미드 PTB-셔틀-PRRSV-3997 프라이머 셔틀 진행방향

서열번호 2: 셔틀 플라스미드 PTB-셔틀-PRRSV-3997 프라이머 셔틀 역방향

서열번호 3: 돌연변이원성 프라이머 2b-C54s-진행방향

서열번호 4: 돌연변이원성 프라이머 2b-C54s-역방향

서열번호 5: PRRSV P129의 E 단백질

서열번호 6: PRRSV 129 E 단백질의 cDNA

서열번호 7: 돌연변이된 ORF2b

서열번호 8: 돌연변이된 ORF2b 펩타이드

서열번호 9, 11, 15, 19, 23, 27: 다양한 C54s 돌연변이체- 뉴클레오타이드 서열

서열번호 10, 12, 16, 20, 24, 28: 다양한 C54s 돌연변이체- 펩타이드

서열번호 13, 14, 17, 18, 21, 22, 25, 26, 29, 30: C54s 돌연변이체를 위한 진행방향(F) 및 역방향(R) 돌연변이원성 프라이머

발명의 요약

본 발명은 E 단백질의 보존된 시스테인이 결실되거나 시스테인이 아닌 잔기로 변화되도록 개질된, 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 제공한다.

본 발명은 또한 E 단백질의 보존된 시스테인이 결실되거나 시스테인이 아닌 잔기로 변화되도록 개질되되, 단 시스테인이 아닌 잔기가 타이로신이 아닌, 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 언급된 유전적을 개질된 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 언급된 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 언급된 바이러스의 생물학적으로 순수한(즉, 다른 바이러스가 실질적으로 없는) 배양물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 언급된 바와 같은 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 언급된 임의의 전술한 바이러스, 감염성 RNA 분자, 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하기 위한 백신을 제공하고, 상기 백신은, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 면역보호를 생성하기에 효과적인 양의 상기 언급된 바와 같은 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스, 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 암호화하는 상기 언급된 바와 같은 감염성 RNA 분자, 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 암호화하는 (선택적으로 플라스미드 형태의) 상기 언급된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 암호화하는 상기 언급된 바이러스 벡터, 및 수의학적 용도로 허용가능한 담체를 포함한다.

본 발명은 또한 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 면역보호를 생성하기에 효과적인 양의 상기 언급된 백신을 이용하여 동물을 접종함을 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 개시된 바와 같은 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시키는 단계 및 적합한 발현 시스템을 이용하여 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 발현시키는 단계를 포함하는, 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.

야생형 또는 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스는 당 분야에 공지된 적합한 발현 시스템을 이용하여 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 발현될 수 있고, 이러한 발현 시스템의 예는 본원에 참고로 개시되어 있다. 예를 들면 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 하기 더욱 자세히 개시된 바와 같이 적합한 숙주 세포에서 암호화된 바이러스를 발현할 수 있는 플라스미드의 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 이후에 명확해질 것이다.

본 발명은 바이러스의 E(또는 2b) 단백질에서 발견되는 특정 시스테인 잔기를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 독성 PRRS 바이러스를 감독시키는 방법, 상기 감독된 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 상기 면역원성 조성물을 접종함으로써 돼지를 PRRS로부터 보호하는 방법을 개시하고 있다. 본 발명의 방법에 의해 감독된 PRRS 바이러스는 독성 야생성 균주의 항원 특성을 유지해야만 하고, 따라서, 세포 배양 감독된 바이러스에 근거하는 백신에 비해 더욱 강력한 보호를 제공한다.

아테리바이러스는 일시적으로 엔벨로프(E) 단백질로 명명된 작은 소수성 구조 단백질을 암호화한다(스나이더(Snijder, E. J.) 등의 문헌[(1999). Identification of a novel structural protein of arteriviruses. Journal of Virology 73(8), 6335-6345] 참고).

E 단백질의 기능을 공지되어 있지 않지만, 모든 아테리바이러스에서 보존되어 있다. 말 동맥염 바이러스에서의 넉아웃(Knockout) 돌연변이는 E 단백질이 세포 배양에서 바이러스 복제에 필수적임을 보여주었다. 상응하는 독특한 서브게놈 RNA에 의해 각각 암호화되는 PRRS 바이러스의 다른 구조 단백질과는 달리, E 단백질 및 GP2 단백질은 단일 서브게놈 RNA를 공유한다. ORF2b(이는 E를 암호화한다)는 더 큰 ORF2a(이는 GP2를 암호화한다) 내에 완전히 함유되어 있고, 서로 다른 리딩 프레임(reading frame)을 이용한다. 비록 ORF2b의 ATG 개시 코돈이 ORF2a 개시 코돈의 다운스트림에 위치하지만, 이것이 번역 개시에 보다 바람직한 컨텍스트 내에 존재하고, 이 서브게놈 RNA로부터 생성되는 주된 생성물이다(우(Wu, W. H.) 등의 문헌[(2001). A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b. Virology 287(1), 183-191] 참고).

북미의 유전형 PRRS 바이러스는 일반적으로 E 단백질의 아미노산 서열 내의 49 및 54의 위치에서 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 북미 PRRS 단리물 P129의 감염성 cDNA 클론을 이용하여, C49 및 C54는 개별적으로 세린으로 돌연변이되었다. 생성된 C49S 돌연변이체는 생존가능하였다. 유사하게, C54S 돌연변이체 또한 생존가능하였고, 감염성 클론으로부터 자손 바이러스를 높은 생산량으로 생성하였다. P129-E-C49S 및 P129-E-C54S 바이러스는 MARC 세포 상에서 쉽게 계대배양되었고 적정되었다. 그러나, P129-E-C54S 바이러스는 변형된 플라크 형태(작고, 투명한 플라크)과 촉진된 세포변성 효과(CPE)를 나타내었다. 이 돌연변이체가 돼지에서의 감독을 이끌어내야만 한다.

유럽 유전형 PRRS 바이러스는 51 위치에서 하나의 시스테인 잔기를 함유하고, 이는 E 단백질 서열을 정렬하였을 때 북미 PRRS 바이러스의 C54에 정확하게 상응한다. 우리는 유럽 PRRSV E 단백질에서 (결실이나 치환에 의한) C51의 제거가 세포 배양액에서 P129-E-C54S와 유사한 변형된 표현형을 가질 것이고 돼지에서 감독될 것으로 예상하였다. (하기 언급한 바와 같이 북미 PRRS 및 유럽 PRRS E 단백질 둘 모두에 존재하는 시스테인 잔기를 "보존된 시스테인"으로 명명하였다). 이 유형의 바이러스 돌연변이는, 단독으로 또는 다른 감독 돌연변이와 함께, 새로운 PRRS 백신을 디자인하는데 있어 귀중하다.

정의

CPE는 세포변성 효과이다.

본원에서 사용되는 용어 PRRSV "E 단백질" 또는 "ORF2b 단백질"은 PRRS 바이러스의 유럽 및 미국 단리체 둘 모두의 ORF2b에 의해 암호화되는 폴리펩타이드로서 정의된다. 상응하는 독특한 서브게놈 RNA에 의해 각각 암호화되는 PRRS 바이러스의 다른 구조 단백질과는 달리, E 단백질과 GP2 단백질은 단일한 서브게놈 RNA를 공유한다. ORF2b(이는 E를 암호화한다)는 더 큰 ORF2a(이는 GP2를 암호화한다) 내에 완전히 함유되어 있고, 서로 다른 리딩 프레임(reading frame)을 이용한다. 비록 ORF2b의 ATG 개시 코돈이 ORF2a 개시 코돈의 다운스트림에 위치하지만, 이것이 번역 개시에 보다 바람직한 컨텍스트 내에 존재하고, 이 서브게놈 RNA로부터 생성되는 주된 생성물이다(우 등의 2001년도 문헌 참고).

용어 "유럽 PRRS 바이러스"는 1991년경에 유럽에서 처음 단리된 PRRS 바이러스와 연관된 유전적 특징을 갖는 임의의 PRRS 바이러스 균주를 의미한다(예를 들면 웬스부트(Wensvoort, G.) 등의 문헌[1991, Vet. Q. 13:121-130] 참고). "유럽 PRRS 바이러스"는 종종 "렐리스태드(Lelystad) 바이러스"로 당 분야에서 언급된다.

본원에서 사용되는 용어 "유전적으로 개질된"은 달리 지시되지 않는 한, 인간의 개입에 의해 유전적으로 돌연변이됨을 의미한다.

용어 "PRRS 바이러스 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포"는 본 발명의 바이러스 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 감염되거나 형질감염되었을 때 감염성 PRRS를 생성할 수 있는 세포주를 의미한다. 이런 세포는 돼지 폐포 대식세포 및 돼지 폐포 대식세포의 유도체, MA-104 세포 및 MA-104 세포의 유도체, MARC-145 세포 및 MARC-145 세포의 유도체를 포함한다. MARC-145 세포가 본 발명의 작은 플라크 표현형을 입증하기에 특히 바람직하다. 용어 "PRRS 바이러스 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포"는 또한 살아있는 돼지 내의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 목적에서 용어 "면역 반응"은 특정한 항원 에피토프 또는 특정한 항원 에피토프들에 대해 지시되거나 이의 분해 또는 억제를 보조하는 항체 및/또는 세포(예를 들면 T 림프구)의 생성을 의미한다. 문구 "효과적인 면역보호 반응", "면역보호" 등의 용어는 본 발명의 목적에서 접종된 동물에서 병원균에 의한 감염으로부터 보호되도록 병원균의 하나 이상의 항체 에피토프에 대해 지시되는 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적에서, 병원균에 의한 감염에 대한 보호는 감염의 절대적인 예방뿐 아니라, 병원균에 의한 감염 정도 또는 비율의 임의의 검출가능한 감소, 또는 접종되지 않은 감염된 동물과 비교하였을 때 접종된 동물에서 병원균에 의한 감염으로부터 생성된 임의의 증후 또는 상태 또는 질병의 심각성의 임의의 검출가능한 감소를 포함한다. 효과적인 면역보호 반응은 이전에 병원균으로 감염되지 않고/않거나 접종시 병원균으로 감염되지 않은 동물에서 유도될 수 있다. 효과적인 면역보호 반응은 또한 접종 시 병원균으로 이미 감염된 동물에서도 유도될 수 있다.

용어 "돌연변이된"은 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체, 또는 바람직하게는 암호화된 아미노산이 변화되는 방식으로 코딩 뉴클레오타이드의 다른 뉴클레오타이드로의 대체(예를 들면 T 대신 C), 즉, 소위 "치환", 또는 "결실" 또는 "삽입"과 같은 임의의 다른 돌연변이를 의미한다. 돌연변이는 항상 코딩 뉴클레오타이드 서열에서 발생한다.

용어 "북미 PRRS 바이러스"는 북미 PRRS 바이러스 단리체와 연관된 유전적 특징을 갖는 임의의 PRRS 바이러스를 의미하고, 예를 들면 1990년대 초에 미국에서 처음 단리된 PRRS 바이러스(콜린스(Collins, J. E.) 등의 문헌[1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126]); 북미 PRRS 바이러스 단리체 MN-Ib (광(Kwang, J.) 등의 문헌[1994 , J.Vet.Diagn.Invest. 6:293-296)]; PRRS의 퀘벡 IAF-exp91 균주(마르다시(Mardassi, H.)등의 문헌[1995 , Arch.Virol. 140:1405-1418]); 및 북미 PRRS 바이러스 단리체 VR 2385(멩(Meng, X.-J) 등의 문헌[1994 , J.Gen.Virol. 75: 1795-1801)]를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 유전적 특징은 북미 PRRS 바이러스 균주가 공유하는 게놈 뉴클레오타이드 서열 유사성 및 아미노산 서열 유사성을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 개재된 중단 코돈없이 특정한 PRRS 바이러스 단백질을 암호화하는데 필요한 최소한의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

용어 "돼지"는 슈이다에(Suidae)과의 일원인 임의의 동물 예를 들면 돼지를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "PRRS 바이러스" 또는 "PRRSV"는, 달리 지시되지 않으면, 북미 또는 유럽 PRRS 바이러스중 하나의 임의의 균주를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "PRRS"는 PRRS 바이러스 감염에 의해 야기된 돼지의 질병 증후를 포함한다. 이런 증후는 임신한 암퇘지의 유산, 및 어린 돼지의 느린 성장, 호흡 곤란, 식욕 저하 및 사망을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 "PRRS를 생성할 수 없는" PRRS 바이러스는 돼지를 감염시킬 수는 있지만 돼지에서 PRRS 감염과 일반적으로 연관된 임의의 질병 증후를 생성하지 않거나, 또는 이런 증후를 생성하긴 하지만 야생형 독성 감염과 비교하였을 때 더 적은 정도로 생성하거나, 더 적은 수의 이런 증후를 나타내거나 또는 더 적은 수의 증후를 더 적게 생성하는 바이러스를 의미한다.

용어 "형질감염된 숙주 세포"는 PRRS 바이러스 RNA로 감염되었을 때 제 1회 PRRS 바이러스 비리온을 생성할 수 있는, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,600,662호에 개시된 바와 같은 실질적으로 임의의 숙주 세포를 의미한다. 추가의 생산적 감염이 바람직한 경우, 하기 정의된 바와 같은 "PRRS 바이러스 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포"를 이용할 것이다.

폴리뉴클레오타이드 분자는 당 분야에 공지된 바와 같은 부위 지향적 돌연변이, 또는 화학적 돌연변이원 또는 방사선에 노출시키는 것과 같은 무작위 돌연변이를 포함하여 당 분야의 숙련자들에게 공지된 재조합 기법을 이용하여 유전적으로 돌연변이될 수 있다. 상기 돌연변이는 (예를 들면 멜렌베르그(Meulenberg) 등의 문헌[Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440: 199-206]) 개시된 바와 같은 감염성 카피의 부위 지향적 돌연변이와 같은, 당 분야에 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2(nd) ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.] 참고).

따라서, 본 발명은 또한 유전적으로 개질된 북미 PRRS 바이러스를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 이 방법은 상기 개시된 바와 같은 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시키는 단계 및 적합한 발현 시스템을 이용하여 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스는 당 분야에 일반적으로 공지된 적합한 발현 시스템을 이용하여 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 발현될 수 있고, 이 발현 시스템의 예는 본원에 개시되어 있다. 예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 하기에 추가로 개시된 바와 같이, 생체 외에서 적합한 숙주 세포에서 암호화된 바이러스를 발현할 수 있는 플라스미드의 형태일 수 있다.

현재 알려진 E 단백질의 특정한 아이소타입의 예는 게놈 위치 12,078-12,299에서 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호 U87392(이는 또한 VR2332로 알려져 있다)에서 보고된 서열에 의해 예상되고 젠뱅크 수탁번호 AF494042(이는 또한 P129로 알려져 있다)의 서열에 의해 예상되고 단백질 AAM18560.1로 보고된 바와 같은 미국 PRRS의 73개 아미노산 폴리펩타이드, 및 게놈 위치 11,801-12,013에서 젠뱅크 수탁 번호 M96262(이는 또한 렐리스태드 단리체로서 알려져있다)에 의해 예상되는 바와 같은 70개 잔기 유럽 PRRS E 단백질이다.

북미 PRRSV E 단백질 서열은 매우 보존적이고, 보고된 서열은 서로 약 93%의 동일성을 갖는다. 북미 및 유럽 PRRSV E 단백질은 약 83% 동일성을 갖고, (많은 다른 잔기들 중에서) VR2332 및 P129 E 단백질 단리체의 잔기 54 및 렐리스태드 단리체 E 단백질의 잔기 51에서 보존된 시스테인을 공유한다. 도 3은 "보존된 시스테인", 즉 유럽 PRRS 단리체와 미국 PRRS 단리체 사이에서 보존되는 시스테인으로 지된한 시스테인의 가시화를 가능하게 한다. 상기 언급된 아미노산의 넘버링은 언급된 데이터베이스 단체에 따른 것이다. 서로 다르게 넘버링될 수 있는 모든 다른 PRRS 단리체에서, 관심있는 PRRS 균주의 보존되는 특징적인 아미노산을 확인하고 이를 기준 균주와 함께 정렬함으로써 적절한 시스테인을 쉽게 확인할 수 있다. 본 발명의 목적은 작은 플라크 표현형을 생성하도록, 치환, 결실 또는 삽입중 하나에 의해 보존적 시스테인이 제거되도록 RRRS 바이러스 또는 그의 암호화 핵산을 개질시키는 것이다.

보존된 시스테인을 제거하는 결실 또는 치환은 본 발명의 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 개질에 의해 도입된다. 바람직한 양태에서, 결실 또는 삽입은 보존된 시스테인을 결실시키고, 상기 결실 또는 치환이 생성된 바이러스에서 작은 플라크 표현형을 생성시키게 하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산을 포함한다. 바람직한 양태는 5개 이하의 아미노산의 결실 또는 삽입일 것이다.

아미노산은 물리적 성질 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 당 분야에서 보존적 치환이란 한 종류의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것으로 인식된다. 보존적 치환의 예는 하기의 표 A(이는 1997년 3월 13일자로 공개된 제 WO97/09433호의 제10면(1996년 9월 6일 출원된 PCT/GB96/02197호)에 개시되어 있음)에 개시되어 있다:

다르게는 보존적 아미노산은 하기 표 B에 개시된 바와 같이 레닌저(Lehninger)의 문헌[Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77]에 개시된 바와 같이 분류될 수 있다:

또 다른 대안으로서 예시적인 보존적 치환이 하기 표 C에 개시되어 있다:

유전적으로 개질된 PRRS 바이러스의 제조

재조합 DNA 기법은 DNA 수준에서 핵산을 변형시키는 것을 목적으로 하는 매우 다양하고 강력한 분자 생물학 기법으로 이를 이용하여 분자 수준에서 게놈을 분석하고 개질시키는 것이 가능하다. 이러한 측면에서, PRRS 바이러스와 같은 바이러스는 그 게놈의 크기가 작기 때문에 이런 조작에 특히 적합하다. 그러나, 재조합 DNA 기법은 비-레트로바이러스 RNA 바이러스에는 즉각 적용될 수 없는데, 이는 이들 바이러스가 DNA 중간 단계를 거치지 않고 복제되기 때문이다. 이런 바이러스의 경우, 재조합 DNA 기법을 게놈에 적용하여 개질된 바이러스를 생성하기 전에 감염성 cDNA 클론이 개발되어야만 한다. 감염성 클론은 연구중인 바이러스의 전장(게놈 길이) cDNA(본원에서는 엄격한 의미로서 mRNA의 DNA 카피 뿐 아니라 넓은 의미로서 RNA의 DNA 카피도 사용된다)의 구축을 통해 유래될 수 있고, 이후에 감염성 전사물이 전장 cDNA로 감염된 세포에서 생체 내 합성된다. 감염성 전사물은 또한 전체 바이러스 게놈을 구성하는 전장 또는 결찰된 부분 길이 cDNA 분획의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 모든 경우에서, 전사된 RNA는 cDNA로 도입되는 모든 개질을 갖고, 이렇게 개질된 바이러스를 추가 계대배양하는데 사용될 수 있다.

유럽 PRRS 바이러스 단리체인 렐리스태드 바이러스의 감염성 클론의 제조가 멜렌버그(Meulenberg) 등의 2001년 7월 31일자의 미국 특허 제6,268,199호(이는 본원에 참고로 인용되어 있다)에 개시되어 있다. P129로 명명된 북미 PRRS 바이러스 단리체의 감염성 cDNA 클론의 제조는 캘버트(Calvert) 등의 2002년 12월 31일자의 미국 특허 제6,500,662호(이는 본원에 참고로 인용되어 있다)에 개시되어 있다. P129 cDNA의 서열은 젠뱅크 수탁번호 AF494042 및 캘버트 등의 2002년 12월 31일자의 미국 특허 제6,500,662호에 개시되어 있다. 우리의 하기 작업에서는 플라스미드 내용물이 CMV 즉시 초기 프로모터에 의해 발현되고 pCMV-S-P129로 명명되고 캘버트 등의 2002년 12월 31일자의 미국 특허 제6,500,662호에 또한 개시되어 있는 이런 감염성 클론을 이용하였다. 캘버트 등의 2002년 12월 31일자의 미국 특허 제6,500,662호에 개시된 바와 같이 다른 플라스미드 및 프로모터 또한 적합하다.

관심있는 임의의 오픈 리딩 프레임의 완전한 서열과 관심있는 아미노산 잔기의 위치가 주어진다면, 당업자가 원하는 특정한 위치에서 변화를 디자인하기 위해서는 코돈 표를 참조하기만 하면 된다는 점은 명확하다:

아미노산과 이를 나타내는 약자, 기호 및 코돈의 표가 하기 표 D에 나타나 있다:

당 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 코돈은 mRNA 및 이의 상응하는 cDNA 분자에서 뉴클레오타이드 트리플릿의 서열로 구성된다. 코돈은 mRNA 분자에 존재하는 경우에는 염기가 우라실(U)이지만, DNA에서 존재하는 경우에는 염기가 티미딘(T)임을 특징으로 한다. 폴리뉴클레오타이드 내에서 동일한 아미노산 잔기에 대한 코돈을 단순히 변화시키는 것은 암호화된 폴리펩타이드의 서열 또는 구조를 변화시키지는 않는다. 특정한 뉴클레오타이드 트리플릿 서열이 임의의 특정한 아미노산을 "암호화"한다고 말하는 경우, 당 분야의 숙련자들은 상기 표가 문제가 되는 특정 뉴클레오타이드를 확인할 수 있는 수단을 제공함을 알 것이다. 예를 들면, 특정 트리플릿 뉴클레오타이드 서열이 시스테인을 암호화하는 경우, 상기 표는 2개의 가능한 트리플릿 서열이 UGC(DNA인 경우는 TGC) 및 UGU(DNA인 경우는 TGT)임을 개시한다. 세린은 AGC, AGU(DNA에서는 AGT), UCA(DNA에서는 TCA) 및 UCC(DNA에서는 TCC), UCG(DNA에서는 TCG) 및 UCU(DNA에서는 TCT)에 의해 암호화된다. 암호화된 단백질에서 시스테인을 세린으로 변화시키기 위해서는 암호화 핵산중에서 TGC 또는 TGT 트리플릿을 AGC, AGT, TCA, TCC, TCG 또는 TCT중 임의의 것으로 대체할 수 있다.

이런 돌연변이 단백질 E 폴리뉴클레오타이드 서열의 구축은 하기에서 예시적인 실시예에 의해 예시된다.

실시예 1: 셔틀 플라스미드 PTB-셔틀-PRRSV-3997의 구축

전장 PRRS 바이러스 게놈 cDNA 클론으로 특정 개질을 도입하는 것을 용이하게 하기 위해서 셔틀 플라스미드를 구축하였다. 바이러스 게놈의 맨끝의 3' 말단(21개 잔사의 폴리아데노신 테일을 포함하는 뉴클레오타이드 위치 11,504 내지 15,416) 및 84bp의 다운스트림 벡터 서열을 나타내는 3,997bp 단편을 PCR 증폭하였다. PCR 반응물은 GeneAmp PCR 시스템 2400(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 이용하고 5ng의 pCMV-S-P-129 플라스미드 DNA(미국 특허 제6,500,662B1호), 300ng의 진행방향 프라이머 P-셔틀-Fwd 서열번호 1(5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3': 위치 11,504 내지 11,530), 300ng의 역방향 프라이머 P-셔틀-Rev 프라이머 서열번호 2(5'- ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3'; 위치 15,500 내지 15,475), 1mM의 각각의 dNTP, 1xPCR 완충액[10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 2 mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100] 및 2.5U의 Pfu DNA 폴리머라제(스트라타진(Stratagene))를 포함한다. 반응물을 95℃에서 5분까지 가열하고, 다음의 조건 하에서 35회 증폭시켰다: 95℃에서 30초동안 변성, 55℃에서 1분동안 프라이머 어닐링 및 72℃에서 3분동안 연장. PCR 생성물을 트루블루 마이크로카트리지(TrueBlue MicroCatridge^TM) PCR 클로닝 키트 XL(뉴욕 버팔로 소재의 게노믹스 원(Genomics One) 제품)을 이용하여 pTrueBlue 벡터로 클로닝하여 pTB-셔틀-PRRSV-3997을 생성하였다.

실시예 2 - 단백질 E(또는 2B)에서 54의 시스테인 잔기를 치환하여 P129-E-C54S 바이러스 생성

ORF 2b에 의해 암호화되는 PRRSV P129의 E 단백질은 49 및 54의 아미노산 위치에 2개의 시스테인 잔기를 함유한다. 하기 서열번호 5를 참고할 수 있다:

서열번호 5의 cDNA는 서열번호 6:

이다.

위치 54의 시스테인 잔기(P129 게놈에서 뉴클레오타이드 위치 12,221-12,223)를 PCR-근거한 부위-지향적 돌연변이에 의해 세린으로 대체하였다. 주형으 로 셔틀 플라스미드 pTB-셔틀-PRRSV-3997을 이용하고, 돌연변이원성 프라이머로 2b-C54S-Fwd 서열번호 3(

: 뉴클레오타이드 위치 12,207 내지 12,238) 및 2b-C54S-Rev 서열번호 4(

: 뉴클레오타이드 위치 12,207 내지 12,238)을 갖는다. 돌연변이된 코돈은 밑줄쳐져 있다. 5ng의 pTB-셔틀-PRRSV-3997 플라스미드 DNA, 300ng의 각각의 진행방향 및 역방향 프라이머; 각각 1mM 농도의 dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP, 1xPCR 완충액[10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 2 mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100] 및 2.5U의 Pfu DNA 폴리머라제(스트라타진)를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 시료를 하기 조건하에서 16회 증폭시켰다: 94℃에서 30초동안 변성, 55℃에서 1분동안 프라이머 어닐링 및 68℃에서 12분 30초동안 프라이머 연장. PCR 사이클링 다음에, PCR 생성물을 10U의 DpnI으로 분해시켜 메틸화된 플라스미드 DNA 주형을 제거하였다. 이. 콜라이 XL1-Blue 세포를 돌연변이된 플라스미드를 함유하는 PCR-DpnI 분해된 반응물 4㎕와 함께 열 쇼크시켜 형질변환시키고, 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 도말하였다. 콜로니를 무작위로 따서 하룻밤동안 배양하였다. QIAprep 스핀 미니프렙 키트(퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 시스테인으로부터 세린으로의 바람직한 돌연변이(C54S)의 존재는 뉴클레오타이드 서열확인에 의해 확인되었고, 생성된 플라스미드를 pTB-셔틀-E-C54S라 명명하였다. 돌연변이된 ORF2b의 서열은 서열번호 7:

에 주어져 있고, 암호화된 펩타이드는 서열번호 8:

에 주어져 있다.

셔틀 플라스미드 pTB-셔틀-E-C54S 및 야생형 전장 게놈 클론 pCMV-S-P129는 둘 모두 독특한 Eco47 III 및 BsrG I 부위(각각 위치 285 및 1,192, 및 위치 11, 785 및 12,692)를 함유한다. 각각의 플라스미드를 Eco47 III 및 BsrG I으로 분해시켰다. 908bp의 Eco47 III - BsrG I 분획을 pTB-셔틀-E-C54S로부터 겔 정제하였고, 17,984bp의 Eco47 III - BsrG I 분획을 pCMV-S-P129로부터 겔 정제하였다. 2개의 분획을 T4 DNA 리가제(ligase)(인비트로겐(Invitrogen) 제품)를 이용하여 결찰시켜 C54S-개질된 전장 게놈 cDNA 클론을 구축하였다. 이.콜라이 균주 DH5-α를 10㎕의 결찰 반응을 이용하여 형질변환시켰다. 박테리아 콜로니를 암피실린을 함유한 LB 플레이트로부터 선택하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. Xma I 소화 패턴에 근거하여 전장 클론을 선택하였다. 선택된 클론을 서열규명하여 전장 게놈 cDNA 클론에서 C54S 개질의 존재를 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pCMV-S-P129-E-C54S라 명명하였다.

MARC-145 세포를 37℃에서 5% CO₂와 함께 8% 소의 태아 혈청(FBS; 깁 코(Gibco) BRL), 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(50㎍/ml)이 보충된 둘베코 개질된 이글 배지(DMED)에서 성장시켰다. 세포를 35mm 직경의 디쉬에 시딩하고 70% 컨플루언시까지 성장시켰다. 세포를 리포펙틴(Lipofectin; 인비트로겐 제품)을 이용하여 24시간동안 2㎍의 pCMV-S-P129-E-C54S 또는 모 pCMV-S-P129 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 8% FBS가 보충된 DMEM에서 5일동안 37℃에서 배양하였다. PRRSV-특이적 세포변성 효과(CPE)를 형질감염한지 3일 후에 관찰하고, 이웃한 세포로의 추가 확장은 형질감염된지 5일후에 보였다. CPE의 특이성은 비구조 단백질인 nsp2 및 nsp3에 대한 토끼의 항혈청 및 N-특이적 MAb SDOW17을 이용한 면역형광 세포 염색에 의해 확인되었다. 형질감염된 세포로부터의 배양 상층액을 형질감염시킨지 5일후에 수확하여 'P129-E-C54S 계대배양 1'(P1)이라 명명하였다. 계대배양 1 바이러스를 이용하여 신선한 MARC-145 세포에 접종시키고, 5일 수확물을 '계대배양-2'(P2)라 명명하였다. '계대배양-3' 바이러스를 P2와 동일한 방식으로 제조하였다. 각각의 바이러스 계대배양을 사용할 때까지 -80℃에서 1ml 분획중에 저장하였다. P129-E-C54S 바이러스의 각각의 계대배양을 플라크 분석법에 의해 적정하고, 역가는 계대배양 1, 2 및 3에 대해 각각 1.5x10⁴, 5x10⁵ 및 1x10⁴pfu/ml로 결정되었다. 야생형 P129 바이러스는 pCMV-S-P129로부터 생성되었고, 동일하게 적정되어 계대배양 1, 2 및 3에 대해 각각 1x10³, 1x10⁴ 및 5x10⁵pfu/ml의 역가를 생성하였다.

P129-E-C54S 바이러스는 P129 모 바이러스에 비해 CPE 출현 개시가 느리고 작은 플라크 표현형을 나타내는 세포변형 효과(CPE)의 명확한 전개를 유도한다. 모 cDNA 클론 PCMV-S-P129 또는 돌연변이 cDNA 클론 pCMV-S-P129-E-C54S중 하나를 이용한 MARC-145 세포의 형질감염은 감염된 세포의 가시 초점을 생성하고, P129-E-C54S 바이러스에 의해 매개되는 CPE는 크기가 매우 작지만 P129 모 바이러스에 비해 약 형질감염 4일 후 정도로 출현이 더 느리다. 그러나, 돌연변이 바이러스는 그 후(형질감염된지 약 5일후 정도) 초점 이내에 죽거나 탈착된 세포 영역이 있는 신속하고 광범위한 CPE를 야기하고, 이와는 달리, 모 바이러스는 동일한 기간동안 단지 초점의 크기만 온화하게 증가함을 보였다. CPE의 차이는 도 1에 도시되어 있다. 바이러스 역가는 CPE의 이러한 차이에 상응하고, 돌연변이가 처음 2회 바이러스 계대배양동안에는 모 바이러스보다 더 많은 자손을 생성하였다(그러나 3번째 계대배양시는 더 적은 자손을 생성하였다). 플라크 형태의 차이는 도 2에 도시되어 있다. P129-E-C54S 바이러스는 모 P129 플라크에 비해 직경이 더 작고 형태가 다른 플라크를 생성한다. P129-E-C454S 플라크는 플라크의 중심에 있는 세포가 P129 플라크보다 더 빠르고 더 완전하게 죽고 탈착되기 때문에 더욱 투명하다. 비록 작은 플라크 표현형에 대해 다수의 생물학적 설명이 있을 수 있지만, 작은 플라크의 관찰은 P129-E-C54S 바이러스가 모 바이러스에 비해 보다 더 느리게 세포에서 세포로 번진다는 사실의 직접적인 증거이다. 이 특징을 본 발명에서 이용하여 독성 모 바이러스로부터 감독된(독성이 더 적은) 생백신을 생성할 수 있다.

작은 플라크 표현형을 나타내고, 그 자체가 천연 숙주에서 감독된 다수의 바 이러스 예가 정말 존재한다(매튜(Mathew et al.) 등의 문헌[The extracellular domain of vaccinia virus protein B5R affects plaque phenotype, extracellular enveloped virus release, and intracellular actin tail formation. Journal of Virology. 72(3):2429-38, (1998); 엥겔스태드(Engelstad) 등의 문헌[The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. Virology. 194(2):627-37, (1993)]; 루이스(Lewis) 등의 문헌[An African swine fever virus ERVl-ALR homologue, 9GL, affects virion maturation and viral growth in macrophages and viral virulence in swine. Journal of Virology. 74(3): 1275-85, (2000)]; 리(Lee) 등의 문헌[Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis and West Nile viruses. Journal of Virology. 78(15):8271-80 (2004)]; 프램프톤(Frampton) 등의 문헌[Contribution of gene products encoded within the unique short segment of equine herpesvirus 1 to virulence in a murine model. Virus Research. 90(l-2):287-301, (2002)]; 리(Lee) 등의 문헌[Mechanism of virulence attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis virus and Murray Valley encephalitis virus. Journal of Virology. 76(10):4901-l 1, (2002)]; 부트라펫(Butrapet) 등의 문헌[Attenuation markers of a candidate dengue type 2 vaccine virus, strain 16681 (PDK-53), are defined by mutations in the 5' noncoding region and nonstructural proteins 1 and 3. Journal of Virology. 74(7):3011-9, (2000)]). 미국 특허 공개 공보 제2002/0012670호에서 유래된 하기 예는 2개의 서로 다른 PRRS 바이러스 균주의 독성 특성을 비교하기 위한 명확한 지침을 제공한다.

실시예 3: 시스테인 잔기 54의 복귀-내성 돌연변이

실시예 2에 개시된 C54S 돌연변이는 단일 코돈에서 하나의 뉴클레오타이드를 변화시킴, 즉 TGC(시스테인)에서 AGC(세린)으로 변화시킴으로써 만들어진다. 비록 돌연변이의 표현형을 측정하기에 적절하지만, 생성된 바이러스가 무작위 돌연변이 및 자연 선택으로 인해 비교적 높은 빈도로 모 서열(및 모 표현형)로 복귀할 수 있음을 예측할 수 있을 것이다. 특히 백신 목적으로, 본 발명의 바람직한 양태는 위치 54의 잔기가 시스테인으로 복귀할 가능성을 최소화하고, 다른 이웃한 잔기(특히 잔기 51 내지 57)가 시스테인으로 돌연변이되는 가능성을 최소화시키기 위해 고안된 여러 개의 뉴클레오타이드 치환 및/또는 결실을 가질 것이다. 유전자 코드를 살펴보면 시스테인이 단지 2개의 코돈(TGT 및 TGC)으로만 암호화됨을 알 수 있다. 시스테인 코돈이 되기 위해서는 2 또는 3개의 분리된 뉴클레오타이드 돌연변이 사건을 필요로 하는 코돈을 이용하는 것이 단지 하나의 돌연변이 사건만을 필요로 하는 코돈보다 바람직하다. 이런 "복귀 내성" 돌연변이의 예가 표 F에 개시되어 있고, 이는 단지 예일뿐 제한하고자 하는 것은 아니다. 복귀 내성 돌연변이의 많은 다른 예들이 당 분야의 숙련자들에 의해 예상될 것이다.

돌연변이 C54S-2(표 F 참고)는 C54S 돌연변이와 동일한 아미노산 변화를 생성하지만, 세린 코돈의 선택은 AGC에서 TCG로 변화된다. 따라서 시스테인 코돈을 생성하기 위해서는 2개의 독립적인 뉴클레오타이드 돌연변이가 필요하고 표현형의 복귀 가능성이 C54S에 비해 감소된다. 돌연변이 C54S-3은 위치 54에 동일한 세린 코돈을 혼입시키지만 류신 52(TTG에서 CTG로), 발린 53(GTT에서 GTA로) 및 세린 55(TCC에서 TCG로)의 코돈 또한 변화된다. 그 결과, 이들 3가지 코돈은 시스테인 코돈으로 더 적게 돌연변이될 것이고, 따라서, 위치 54에서 시스테인 잔기의 부재를 기능적으로 보충할 가능성이 더 적다. CS54-55AA 돌연변이에서, C54 및 S55는 둘 모두 알라닌 잔기를 암호화하도록 돌연변이되었다. 세린처럼, 알라닌은 작고 비하전된 측쇄를 갖지만, 다이설파이드 결합을 형성하거나 금속 이온과 상호작용하는 시스테인의 능력은 없다. 4가지의 가능한 알라닌 코돈중에서 2가지(GCG 및 GCA)가 시스테인 코돈과 충분히 상이하여 시스테인 코돈을 생성하기 위해서는 3가지 뉴클레오타이드 모두 돌연변이되어야만 한다. 따라서, 알라닌 치환은 표현형 복귀 가능성을 추가로 감소시키는 바람직한 방법이다. 최종적으로 CS54-55delA 돌연변이에서 위치 54의 코돈이 결실되었다. 또한, 세린 55는 알라닌으로 변화되었고, 류신 52 및 발린 53의 코돈이 변화되었다. 이런 돌연변이 바이러스의 표현형 복귀는 매우 드물 것으로 예상된다.

복귀 내성 돌연변이를 고안할 때, 종종 제한 효소 인식 부위가 생성되거나 파괴되도록 대체 코돈이 선택된다. 이들 차이는 돌연변이된 플라스미드 및 바이러스를 돌연변이되지 않은 플라스미드 및 바이러스로부터 식별하기 위한 편리한 표식으로 작용할 수 있다. 돌연변이 C54S-3, CS54-55AA 및 CS54-55delA(표 F)의 경우, S55 코돈 TCC의 TCG(세린) 또는 GCG (알라닌)으로의 돌연변이는 자연 발생 SacII 제한효소 부위(CCGCGG)를 파괴시킨다.

ORF2b가 ORF2a(이는 다른 리딩 플레임으로 GP2를 암호화한다)와 중첩되기 때문에, ORF2b에서의 코돈을 개질시키는 과정에서 ORF2a에 종결 코돈을 도입하지 않도록 주의해야만 한다. 일부 경우, ORF2b로의 코돈 변화는 ORF2a에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. GP2 단백질 기능에 미치는 이런 변화의 효과는 예측하기 힘들고 실험에 의해 가장 잘 측정된다.

실시예 4: 감독의 확립

1개 군당 10마리 이상의 암퇘지가 각 시험에 포함되었고, 이들은 PRRSV가 없는 농장에서 유래되었다.

동물들을 PRRS 바이러스 특이적 혈청 항체가 없는지 시험하였고, 이들은 PRRSV에 대해 음성이었다. 시험에 포함되는 모든 동물은 동일한 공급원 및 품종이 다. 동물을 각 군으로 무작위 할당하였다.

임신 90일째에 각 콧구멍당 10⁵ TCID₅₀을 갖는 1ml PRRSV를 비강내 적용함으로서 감염시켰다. 각 실험 구성에 3가지 이상의 군이 있다: P129 감염에 대한 1군; 가능하게 감독된 바이러스를 이용한 감염에 1개 시험군; 및 1개의 엄격한 대조군.

연구의 시간 경과 동안 엄격한 대조군이 PRRSV-음성을 유지하고, 엄격한 대조군에 비해 P129 감염된 군에서 태어난 건강한 새끼 돼지가 25% 이상 적은 경우, 연구가 유효한 것으로 간주된다.

감독, 달리 말하자면 덜 독성이라는 것은 생식 성능을 측정하는 하나 이상의 변수의 통계적으로 유의한 변화로서 정의된다:

P129 감염된 군에 비해 시험 군(가능하게 감독된 바이러스)에 대한 하나 이상의 하기 변수가 상당히 감소된 것이 바람직하다:

a) 사산 빈도

b) 임신 112일 이전의 유전

c) 바짝 마른 새끼 돼지의 수

d) 덜 생기있고 약한 새끼 돼지의 수

e) 젖떼기 전의 사망.

또한 P129 감염된 군에 비해 시험 군에서 하기 변수중 하나가 상당히 증가한 것이 바람직하다:

f) 암퇘지당 젖을 뗀 새끼 돼지의 수

g) 암퇘지당 태어난 살아있는 건강한 새끼 돼지의 수

백신

감독된 균주는 백신 제제에 귀중하다. 본 발명의 백신은 돼지를 PRRS 바이러스 감염으로부터 보호하는 경우 유효하다. 백신을 한 마리 이상의 감염되지 않은 돼지에 투여한 후 후속적으로 생물학적으로 순수한 바이러스 단리물(예를 들면 VR 2385, VR 2386, P129 등)로 감염시켰을 때, 보호되지 않은 유사한 돼지(즉, 적절한 대조군에 대해)에서 단리물에 의해 전형적으로 야기되는 변화나 증후에 비해 임의의 전반적인 또는 병리학적 변화(예를 들면 폐의 부종) 및/또는 질병의 증후의 심각성이 더 적어지는 경우, 백신이 PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 백신은 필요한 한 마리 이상의 적절한 돼지에게 백신을 투여한 후, 적절한 기간(예를 들면 4주 후) 후에 생물학적으로 순수한 PRRSV 단리체의 큰 시료(10^(3-7)TCID₍₅₀₎)로 감염시킴으로써 효과적인 것으로 보일 수 있다. 그런 다음 약 1주 후에 감염된 돼지로부터 혈액 시료를 뽑고, 그런 다음, 혈액 시료로부터 바이러스를 단리하고자 한다(예를 들면 하기 실험 VIII에 예시된 바이러스 단리 과정을 참고할 수 있다). (백신접종되지 않은 감염된 대조군 돼지와 유사한) 높은 수준의 바이러스의 단리는 백신이 효과적이지 않음을 나타낸다. 바이러스를 단리하는데 실패하거나, 더 적은 양의 바이러스가 단리되는 것이 백신이 효과적일 수 있음을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 백신의 효율은 정성적으로(즉, 적절한 대조군에 비해 튼튼한 폐 조직의 비율의 감소) 또는 정량적으로(예를 들면 혈액으로부터 PRRSV의 단리, 면역분석 방법에 의한 폐, 편도선 또는 림프절 조직에서 PRRSV 항원의 검출) 평가될 수 있다. 돼지의 생식 및 호흡기 질병의 증후는 정성적으로(예를 들면 온도/열), 반-정량적으로(예를 들면 (하기 설명되는 바와 같은) 호흡 장애의 심각성) 또는 정량적으로(예를 들면 치아노제, 폐렴, 심장 및/또는 뇌 부종 등과 같은 하나 이상의 증후의 존재 또는 부재 또는 이러한 증후의 심각성의 감소) 평가될 수 있다.

감염되지 않은 돼지는 돼지의 생식 및 호흡 질병 감염원에 노출되지 않은 돼지이거나, 또는 돼지의 생식 및 호흡 질병 감염원에 노출되었지만, 질병의 증후를 보이지 않는 돼지이다. 감염된 돼지는 PRRS의 증후를 보이거나 PRRSV가 단리된 돼지이다.

본 발명의 백신은 허용되는 관행에 따라 인간(적용가능한 경우)을 포함하는 동물에 허용가능한 담체, 예를 들면 표준 완충액, 안정화제, 희석제, 방부제 및/또는 용해제를 포함하도록 배합될 수 있고, 또한 지속성 방출이 용이하도록 배합될 수도 있다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함한다. 등장성을 위한 첨가제는, 다른 것들 중에서도, 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소비톨 및 락토즈를 포함한다. 안정화제는 다른 것들 중에서 알부민을 포함한다. 개질된 생백신을 배합하는데 특히 유용한 것들을 포함하는 다른 적합한 백신 비히클 및 첨가제는 당 분야에 공지되어 있거나, 또는 당 분야의 숙련자에게 명확하다. 예를 들면 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing]을 참고할 수 있다.

본 발명의 백신은 다른 것들 중에서도 예를 들면 아쥬방트 또는 사이토카인과 같은 하나 이상의 추가의 면역조절 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 아쥬방트의 비-한정적인 예는 RIBI 아쥬방트 시스템(몬태나주 해밀톤 소재의 리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 명반, 미네랄 겔, 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드 겔, 수중유 유화액, 유중수 유화액, 예를 들면 프룬드 완전 및 불완전 아쥬방트, 블록 공중합체(조지아주 아틀란타 소재의 사이트렉스(CytRx)), QS-21(매사추세츠주 캠브릿지 소재의 캠브릿지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.)), SAF-M(캘리포니아주 에머리빌 소재의 시론(Chiron)), AMPHIGEN(등록상표) 아쥬방트, 사포닌, Quil A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 리피드 A 및 아브리딘 리피드-아민 아쥬방트를 포함한다. 본 발명의 백신에 유용한 수중유 유화액의 비한정적인 예는 개질된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제제를 포함한다. 개질된 SEAM62는 5%(v/v) 스쿠알렌(시그마(Sigma)), 1%(v/v) SPAN(등록상표) 85 세제(ICI 서펙탄츠(Surfactants), 0.7% (v/v) TWEEN(등록상표) 80 세제(ICI 서펙탄츠), 2.5%(v/v) 에탄올, 200pg/ml Quil A, 100㎍/ml 콜레스테롤 및 0.5%(v/v) 레시틴을 함유하는 수중유 유화액이다. 개질된 SEAM 1/2는 5%(v/v) 스쿠알렌, 1%(v/v) SPAN(등록상표) 85 세제, 0.7% (v/v) TWEEN(등록상표) 80 세제, 2.5%(v/v) 에탄올, 100㎍/ml Quil A 및 50㎍/ml 콜레스테롤을 함유하는 수중유 유화액이다. 백신에 포함될 수 있는 다른 면역조절제는 예를 들면 하나 이상의 인터 류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인을 포함한다.

본 발명의 백신은 선택적으로 본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속성 방출을 위해 배합될 수 있다. 이런 지속성 방출 제제의 예는 생물학적 상용성 중합체, 예를 들면 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 메틸셀룰로즈, 히알루로닉산, 콜라겐 등의 복합체와 조합된 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 약물 전달 비히클중의 분해가능한 중합체의 구조, 선택 및 용도는, 본원에 참고로 인용된 돔(A. Domb) 등의 문헌[1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292]을 포함하는 여러 문헌에 개론되어 있다. 약학 제제에서 중합체를 선택하고 이용하는데 있어 추가의 안내는 당 분야에 공지된 문헌, 예를 들면 본원에 참고로 인용된 채신(M. Chasin) 및 랭거(R. Langer)가 편집한 문헌[1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N. Y.]에서 발견할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 미세캡슐화되어 투여 및 효능을 개선할 수 있다. 항원의 마이크로캡슐화 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 미국 특허 제3,137,631호; 미국 특허 제3,959,457호; 미국 특허 제4,205,060호; 미국 특허 제4,606,940호; 미국 특허 제4,744,933호; 미국 특허 제5,132,117호; 및 국제 특허 공개 공보 제WO 95/28227호(이들은 본원에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 기법을 포함한다.

또한 리포좀을 이용하여 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속성 방출을 제공할 수 있다. 리포좀 제제를 제조하고 이용하는 방법에 대한 상세한 내용은 다른 것들 중에서도 미국 특허 제4,016,100호; 미국 특허 제4,452,747호; 미국 특허 제4,921,706호; 미국 특허 제4,927,637호; 미국 특허 제4,944,948호; 미국 특허 제5,008,050호; 및 미국 특허 제5,009,956호(이들 모두 본원에 참고로 인용되어 있다)에서 발견할 수 있다.

상기 개시된 임의의 백신의 효과량은 낮은 투여량의 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 백신으로 시작하여 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시켜서 결정될 수 있다. 백신을 단일 투여하거나 백신을 여러번 투여한 후 효과량을 수득할 수 있다. 동물당 최적 투여량을 결정할 때, 공지된 인자들을 고려할 수 있다. 여기에는 동물의 종, 크기, 연령 및 일반적인 상태, 동물중의 다른 약물의 존재 등이 포함된다. 실제 투여량은 바람직하게는 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택된다.

적절한 면역 반응이 달성되었는지 여부를 검출하는 한가지 방법은 접종후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 측정하는 것이다. 접종 시기 및, 필요한 경우, 부스터 횟수는 관련된 모든 인자의 분석에 근거하여 의사나 수의학자에 의해 결정될 것이고, 이중 일부는 상기 개시되어 있다.

본 발명의 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 효과적인 투여량은 접종되는 동물의 체중과 같은 당 분야의 숙련자들에 의해 결정될 수 있는 인자를 고려하여 공지된 기법을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 백 신중에서 본 발명의 바이러스의 투여량은 바람직하게는 약 10¹ 내지 약 10⁹pfu(플라크 형성 단위), 보다 바람직하게는 약 10² 내지 약 10⁸pfu, 가장 바람직하게는 약 10³ 내지 약 10⁷pfu의 범위이다. 본 발명의 백신중의 본 발명의 플라스미드의 투여량은 바람직하게는 약 0.1㎍ 내지 약 100mg, 보다 바람직하게는 약 1㎍ 내지 약 10mg, 보다 더 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 1mg이다. 본 발명의 백신중의 감염성 RNA 분자의 투여량은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100mg, 보다 바람직하게는 약 1㎍ 내지 약 10mg, 보다 더 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 1mg의 범위이다. 본 발명의 백신중의 본 발명의 바이러스 벡터의 투여량은 바람직하게는 약 10¹pfu 내지 약 10⁹pfu, 보다 바람직하게는 약 10²pfu 내지 약 10⁸pfu, 보다 더 바람직하게는 약 10³ 내지 약 10⁷pfu의 범위이다. 적합한 투여 크기는 약 0.5ml 내지 약 10ml, 보다 바람직하게는 약 1ml 내지 약 5ml이다.

본 발명은 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 이 방법은 효과량의 본 발명의 PRRS 바이러스, 감염성 RNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터중 하나를 약학적 또는 수의학적 용도에 허용가능한 담체와 조합하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명의 감독된 생백신은 공지된 재조합 기법을 이용하여 PRRS 바이러스 게놈에 삽입되는 이종 항원 에피토프를 암호화하기 위해, 미국 특허 제 6,500,662호에 개시된 바와 같이 개질될 수 있다. 본 발명을 위한 이종 항원 에피토프로서 유용한 항원 에피토프는 PRRS 바이러스가 아닌 돼지 병원균으로부터 나온 항원 에피토프를 포함하고, 이는 돼지 파르보바이러스, 돼지 시르코바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 인플루엔자, 슈도라비스 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 돼지 호흡기 코로나바이러스, 전형적인 돼지 열 바이러스, 아프리카 돼지 열 바이러스, 뇌척수심근염 바이러스, 돼지 파라믹소바이러스, 악티노바실러스 플레로뉴모니(Actinobacillus pleuropneumoni), 바실러스 안트라시(Bacillus anthraci), 보데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 클로스트리디움 하에몰리티쿰(Clostridium haemolyticum), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 에리시펠로쓰딕스 루시오파티아에(Erysipelothdix rhusiopathiae), 하에모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라스마 하이오르히니스(Mycoplasma hyorhinis), 파스퇴렐라 하에몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스(Streptococcus equismilis) 및 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 전술된 돼지 병원균으로부터 나온 항원 에피토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당 분야에 공지되어 있고, NCBI에 의해 제공되는 젠뱅 크(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)와 같은 공개된 유전자 데이터베이스로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 추가의 특징 및 변종은 상세한 설명을 포함하는 본 출원의 전체로부터 당분야의 숙련자들에게 자명할 것이고, 모든 이런 특징은 본 발명의 양태로 간주된다. 유사하게, 본원에 개시된 본 발명의 특징은 본 발명의 양태로서 의도된 추가의 양태로 재조합될 수 있고, 이는 특징의 조합이 본 발명의 양태로서 상기 구체적으로 언급되었는지의 여부와는 무관하다. 또한, 본 발명에 결정적인 것으로 본원에 개시된 제한만이 결정적인 간주되어야 하고, 중요하게 제한되는 것으로 본원에 개시되지 않은 본 발명의 변형은 본 발명의 양태들로 의도되어야 한다. 전술된 상세한 설명 및 실시예에 구체적으로 개시된 것 이외에도 본 발명이 실시될 수 있음은 명확하다.

상기 개시 내용에 비추어 본 발명의 다양한 개질 및 변형이 가능하고, 따라서, 이들은 본 발명의 범위 이내이다.

본원에 언급된 모든 공개 문헌의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 혼입된다.

SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc. YOO, Dongwan LEE, Changhee CALVERT, Jay Gregory <120> Mutant Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus <130> PC32633A <150> 60/626767 <151> 2004-11-11 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 actcagtcta agtgctggaa agttatg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2 atcttatcat gtctggatcc ccgcggc 27 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 3 gcatcagatt ggttagctcc gcggtattcc g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 cggaataccg cggagctaac caatctgatg c 31 <210> 5 <211> 73 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 5 Met Gly Ser Ile Gln Ser Leu Phe Asp Lys Ile Gly Gln Leu Phe Val 1 5 10 15 Asp Ala Phe Thr Glu Phe Leu Val Ser Ile Val Asp Ile Ile Ile Phe 20 25 30 Leu Ala Ile Leu Phe Gly Phe Thr Ile Ala Gly Trp Leu Val Val Phe 35 40 45 Cys Ile Arg Leu Val Cys Ser Ala Val Phe Arg Ala Arg Pro Ala Ile 50 55 60 His Pro Glu Gln Leu Gln Lys Ile Leu 65 70 <210> 6 <211> 222 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 6 atggggtcta tacaaagcct cttcgacaaa attggccagc tttttgtgga tgctttcacg 60 gaatttttgg tgtccattgt tgatatcatc atatttttgg ccattttgtt tggcttcacc 120 atcgccggtt ggctggtggt cttttgcatc agattggttt gctccgcggt attccgtgcg 180 cgccctgcca ttcaccctga gcaattacag aagatcctat ga 222 <210> 7 <211> 222 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 7 atggggtcta tacaaagcct cttcgacaaa attggccagc tttttgtgga tgctttcacg 60 gaatttttgg tgtccattgt tgatatcatc atatttttgg ccattttgtt tggcttcacc 120 atcgccggtt ggctggtggt cttttgcatc agattggtta gctccgcggt attccgtgcg 180 cgccctgcca ttcaccctga gcaattacag aagatcctat ga 222 <210> 8 <211> 73 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 8 Met Gly Ser Ile Gln Ser Leu Phe Asp Lys Ile Gly Gln Leu Phe Val 1 5 10 15 Asp Ala Phe Thr Glu Phe Leu Val Ser Ile Val Asp Ile Ile Ile Phe 20 25 30 Leu Ala Ile Leu Phe Gly Phe Thr Ile Ala Gly Trp Leu Val Val Phe 35 40 45 Cys Ile Arg Leu Val Ser Ser Ala Val Phe Arg Ala Arg Pro Ala Ile 50 55 60 His Pro Glu Gln Leu Gln Lys Ile Leu 65 70 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 9 agattggttt gctccgcggt a 21 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 10 Arg Leu Val Cys Ser Ala Val 1 5 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 agattggtta gctccgcggt a 21 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 12 Arg Leu Val Ser Ser Ala Val 1 5 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 13 gcatgagatt ggttagctcc gcggtattcc g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 14 cggaataccg cggagctaac caatctcatg c 31 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 15 agattggttt cgtccgcggt a 21 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 16 Arg Leu Val Ser Ser Ala Val 1 5 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 17 gcatgagatt ggtttcgtcc gcggtattcc g 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 18 cggaataccg cggacgaaac caatctcatg c 31 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 19 agactggtat cgtcggcggt a 21 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 20 Arg Leu Val Ser Ser Ala Val 1 5 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 21 ttttgcatga gactggtatc gtcggcggta ttccgtgcg 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 22 cgcacggaat accgccgacg ataccagtct catgcaaaa 39 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 23 agactggtgg cggcggcggt a 21 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 24 Arg Leu Val Ala Ala Ala Val 1 5 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 25 ttttgcatga gactggtggc ggcggcggta ttccgtgcg 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 26 cgcacggaat accgccgccg ccaccagtct catgcaaaa 39 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 27 agactggtgg cggcggta 18 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 28 Arg Leu Val Ala Ala Val 1 5 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 29 ttttgcatga gactggtggc ggcggtattc cgtgcg 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 30 cgcacggaat accgccgcca ccagtctcat gcaaaa 36

Claims

a) E 단백질에서 보존된 시스테인 잔기가 돌연변이되도록 개질된 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스;

b) a)의 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자;

c) b)의 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자

중 하나 이상을 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

보존된 시스테인이 결실되거나, 시스테인이 아닌 잔기로 대체되는 조성물.
제 2 항에 있어서,

시스테인이 시스테인이 아닌 다른 잔기로 대체되고, 단 상기 잔기가 타이로신이 아닌 조성물.
제 1 항에 있어서,

보존된 시스테인이 세린 또는 세린의 보존성 치환체로 대체되는 조성물.
제 1 항에 있어서,

보존된 시스테인이 세린, 트레오닌, 메티오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 대체되는 조성물.
제 1 항에 있어서,

보존된 시스테인이 세린, 트레오닌 및 메티오닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 대체되는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

보존된 시스테인 돌연변이가 위치 54에서의 잔기가 시스테인으로 복귀할 가능성을 최소화하도록 복귀 내성이 된 조성물.
제 1 항에 있어서,

PRRS 바이러스가 북미 PRRS 바이러스 또는 유럽 PRRS 바이러스인 조성물.
제 1 항에 있어서,

개질로 인해 작은 플라크 표현형 바이러스가 생성되는 조성물.
PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 면역보호를 생성하기에 효과적인 양의 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항의 조성물 및 수의학적 용도에 허용가능한 담체를 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하기 위한 백신.
PRRS 바이러스에 의한 감염에 대해 면역보호를 생성하는데 효과적인 양의 제 10 항의 백신을 동물에게 접종함을 포함하는, PRRS 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 형질감염된 숙주 세포.
a) PRRS 바이러스를 암호화하는 감염성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시켜 E 단백질의 보존된 시스테인이 시스테인이 아닌 잔기로 변화된 유전적으로 개질된 PRRS 바이러스를 생성시키는 단계; 및

b) 유전적으로 개질된 북미 PRRS 바이러스를 PRRS 바이러스 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포로 도입시키는 단계를 포함하는,

유전적으로 개질된 북미 PRRS 바이러스를 제조하는 방법.
제 13 항에 있어서,

PRRS 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포가 MARC-145 세포인 방법.
제 13 항에 있어서,

PRRS 복제를 지속시킬 수 있는 숙주 세포가 살아있는 돼지 내부에 포함된 방법.