JP2001218591A - 北米ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウィルスの感染性ｃＤＮＡクローン及びその使用 - Google Patents

北米ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウィルスの感染性ｃＤＮＡクローン及びその使用

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）からブ
タを保護するための手段に関する。 【解決手段】 北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染
性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るプラ
スミド、及びそのようなプラスミドを用いてのワクチン
に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物の健康の分野
に関し、そして陽性極性（positive polarity)ＲＮＡウ
ィルスの感染性ｃＤＮＡクローン、及びそのようなｃＤ
ＮＡクローンを用いてのワクチン、特にブタワクチンの
構成に向けられる。
【０００２】
【従来の技術】ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）
は、１９８７年に北米において、及び１９９０年にヨー
ロッパにおいて、最初に記載された、ブタに関する新規
疾病である。この疾病はそれ以来、アジアに広がってお
り、そして世界のほとんどの主要ブタ生産国に影響を及
ぼしている。一次症候群は、雌ブタ及び若い雌ブタにお
ける生殖問題、たとえば後期流産、死産及びミイラ化で
あり、そしてウィルス血症で生まれ、そしてしばしば、
生存し得ない同腹子の弱い子ブタが存在する。さらに、
前記症候は、水平的に広がり、そして発熱、無気力、苦
しい呼吸、食欲不振、遅い成長、及びしばしば、他の呼
吸病原体に関連しての死を引き起こす、若いブタにおけ
る呼吸疾患として現われる。疾病はさらに、天然におい
て又は人工受精により、感染された雄ブタの精液を通し
て雌ブタ及び若い雌ブタに伝達され得る。それらのため
に及び他の理由のために、ＰＲＲＳは制御するのに困難
な疾病であり、そして従って、ブタ産業に対して最とも
経済的な損傷を与える疾病の１つであることがわかって
いる。
【０００３】ＰＲＲＳの原因物質は、２種の遺伝学的及
び血清学的に異なった型として存在するＰＲＲＳウィル
スである（Murtaugh, M.P.など., 1995, Arch-Virol. 1
40,1451-1460 ; Suarez, P.など., 1996, Virus Resear
ch 42 : 159-165) 。前記２種の型は、１９８０年代、
１つは北アメリカ及び他はヨーロッパにおいて、独立し
てブタ集団に、たぶん、げっ歯動物又は鳥類起原の未知
の生物学的病原体保存体から最初に侵入したように思わ
れる。原型“Lelystad, Virus ”により表わされるヨー
ロッパ型は、１９９１年オランダにおいて単離され、そ
して配列決定された（Terpstra, C.など., 1991, Vet.
Quart. 13 : 131-136 ; Wensvoort, G.など., 1991, Ve
t. Quart. 13 : 121-130 ; Wensvoort, G. など., WO92
/213751992 (PCT/NL 92/00096)、1992 ; Meulenberg,
J.J.M. など., 1993, Virol. 192 : 62-72)。
【０００４】北米ＰＲＲＳウィルス及びヨーロピアンＰ
ＲＲＳウィルスの両者は、ウマ動脈炎ウィルス、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ−上昇性ウィルス及びサル出血性発熱ウ
ィルスをまた包含するアルテリビリダエ（Arterivirida
e)科内に分類される。動脈炎ウィルスは、コロナウィル
ス（corronaviruses) 及びトロウィルス（toroviruses)
をまた包含するニドビラレス（Nidovirales)目内に分類
される。ニドウィルス（nidoviruses)は、一本鎖の陽性
極性ＲＮＡから成るゲノムを有する封入されたウィルス
である。陽性−鎖のＲＮＡウィルスのゲノムＲＮＡは、
遺伝子情報の貯蔵及び発現の両者において二重の役割を
満たす。ＤＮＡはニドウィルスにおける複製又は転写に
関与しない。従って、ニドウィルスのゲノムＲＮＡの再
生は、ゲノム複製及びｍＲＮＡ転写の組合された工程で
ある。さらに、いくつかのタンパク質が、ニドウィルス
のゲノムＲＮＡから直接的に翻訳される。アルテリビリ
ダエ科の分子生物学が、最近、Snijder and Meulenberg
（Snijder, E.J. and Meulenberg, J.J.M., 1998, Jour
nal of General Virology 79 : 961-979) により総説さ
れている。
【０００５】最近入手できるＰＲＲＳに対する市販のワ
クチンは、従来の修飾された生存ウィルス（細胞培養
物、弱毒化されている）、又は従来の殺されたウィルス
（ビルレントウィルスの不活性化された細胞培養調製
物）のいづれかである。それらのワクチンのいくつか
は、安全性及び／又は効率に基づいて批評されている。
従って、ＰＲＲＳゲノムに対する特定の付加、欠失及び
他の修飾に基づいての、ＰＲＲＳワクチンの第二世代の
開発が非常に所望される。しかしながら、ＰＲＲＳウィ
ルスはそれらの複製の間、いづれのＤＮＡ中間体も含ま
ないので、そのようなワクチンは、ＤＮＡレベルでの分
子生物学技法による操作のためのＰＲＲＳウィルスの十
分な長さのｃＤＮＡクローンの構成を大切に待ち続けて
来た。つい最近、ヨーロピアンＰＲＲＳウィルスの十分
な長さの感染性ｃＤＮＡクローンが報告されている（Me
ulenberg, J.J.M.など., 1998 、前記；Meulenberg, J.
J.M.など., 1988, J. Virol. 72, 380-387) 。
【０００６】前述の出版物、及び本明細書において続い
て論ぜられるすべての他の引例は、引用により本明細書
に組込まれる。
【０００７】
【発明の要約】本発明は、北米ＰＲＲＳウィルスをコー
ドする感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号１又は
それに対して相同の配列であるＤＮＡ配列を含んで成る
単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明は
さらに、上記の単離されたポリヌクレオチド分子により
コードされる単離された感染性ＲＮＡ分子、及びそれに
対して相同の単離された感染性ＲＮＡ分子を提供し、こ
こで前記単離された感染性ＲＮＡ分子は北米ＰＲＲＳウ
ィルスをそれぞれコードする。
【０００８】本発明はさらに、感染性ＲＮＡ分子をコー
ドする上記の単離されたポリヌクレオチド分子を、ベク
ター、たとえばプラスミドの形で提供する。本発明はさ
らに、北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
分子をコードする、配列番号１又はそれに対して相同の
配列であるＤＮＡ配列を含んで成るウィルスベクターを
提供する。本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルスをコ
ードする感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号１又
はそれに対して相同の配列であるＤＮＡ配列を含んで成
る、コードされた北米ＰＲＲＳウィルスを発現すること
ができるトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００９】本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルスを
コードする感染性ＲＮＡ分子をコードする本発明のＤＮ
Ａ配列を突然変異誘発し、そして前記突然変異誘発に続
いて、それらから、遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳ
ウィルスを発現することを含んで成る、遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳウィルスを製造するための方法を提
供する。
【００１０】本発明はさらに、遺伝子的に修飾された北
米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を提供する。好ましい態様において、ＰＲＲ
Ｓウィルスは、それがブタ動物を感染する場合、それ
が、ａ）その動物においてＰＲＲＳを生成することがで
ないが、しかしｂ）動物において、ＰＲＲＳウィルスに
よる感染に対しての効果的な免疫保護応答を誘発できる
よう遺伝子的に修飾される。特定の態様において、前記
ＤＮＡ配列は、配列番号１又はそれに対して相同の配列
であるが、但しそれはＰＲＲＳを生成するその能力にお
いて、そのコードされたＰＲＲＳウィルスを遺伝子的に
無能にする１又は複数の突然変異を含む。
【００１１】本発明はさらに、上記の単離されたポリヌ
クレオチド分子によりコードされる単離された感染性Ｒ
ＮＡ分子、及びそれに対して相同の単離された感染性Ｒ
ＮＡ分子を提供し、ここで前記単離された感染性ＲＮＡ
分子はＰＲＲＳを生成するその能力を無能にされた、遺
伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをそれぞれコ
ードする。
【００１２】本発明はさらに、上記のような感染性ＲＮ
Ａ分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米Ｐ
ＲＲＳウィルスを提供し、ここで前記遺伝子的に修飾さ
れた北米ＰＲＲＳウィルスは、それがブタ動物を感染す
る場合、動物にＰＲＲＳを生成することができないよう
無能にされているがまだ、動物においてＰＲＲＳウィル
スによる感染に対しての効果的な免疫保護応答を誘発す
ることができる。本発明はさらに、上記のような遺伝子
的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染
性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るウィ
ルスベクターを提供する。本発明はさらに、上記のよう
な遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコード
する感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで
成るトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１３】本発明はさらに、ＰＲＲＳウィルスによる
感染からブタ動物を保護するためのワクチンを提供し、
ここで前記ワクチンは、上記のような遺伝子的に修飾さ
れた北米ＰＲＲＳウィルス；遺伝子的に修飾された北米
ＰＲＲＳウィルスをコードする上記のような感染性ＲＮ
Ａ分子；遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスを
コードする、プラスミドの形での上記単離されたポリヌ
クレオチド分子；又は遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲ
Ｓウィルスをコードする上記ウィルスベクターを、ＰＲ
ＲＳウィルスによる感染に対する免疫保護を生成するの
に有効な量で；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを
含んで成る。
【００１４】本発明はさらに、ＰＲＲＳウィルスによる
感染に対して免疫保護を生成するのに効果的である量の
上記のワクチンによりブタ動物をワクチン接種すること
を含んで成る、ＰＲＲＳウィルスによる感染からブタ動
物を保護するための方法を提供する。
【００１５】本発明はさらに、異種抗原性エピトープを
コードするヌクレオチド配列をさらに含んで成る前記ポ
リヌクレオチド分子、並びに対応する感染性ＲＮＡ分
子、ベクター、トランスフェクトされた宿主細胞、遺伝
子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルス、ワクチン、及
び哺乳類及び／又は鳥にそのようなワクチンを投与する
ための方法を提供する。そのような異種抗原性エピトー
プは、現在、当業界において知られているか、又は未来
において決定されるいづれかの抗原性エピトープからで
あり得る。非制限的態様においては、そのような抗原性
エピトープは、鳥、又はブタ動物以外の哺乳類、たとえ
ばヒトを病理学的に感染せしめることができ、そして前
記病原体に対する効果的な免疫保護応答を誘発すること
ができる病原体からである。もう１つの非制限的態様に
おいては、そのような抗原性エピトープは、北米ＰＲＲ
Ｓウィルス以外のブタ病原体からであり、そして前記ブ
タ病原体に対する効果的な免疫保護応答を誘発すること
ができる。もう１つの非制限的態様においては、そのよ
うな抗原性エピトープは、検出できる抗原性エピトープ
である。
【００１６】本発明はさらに、１又は複数の検出可能抗
原性エピトープを欠いている前記ポリヌクレオチド分子
のいづれか、並びに対応する感染性ＲＮＡ分子、ベクタ
ー、トランスフェクトされた宿主細胞；遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳウィルス、ワクチン、及び哺乳類及
び／又は鳥にそのようなワクチンを投与するための方法
を提供する。
【００１７】本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルスに
よりコードされるペプチドをコードする１又は複数のヌ
クレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチ
ド分子を提供し、ここで前記北米ＰＲＲＳウィルスのゲ
ノム配列は配列番号１又はそれに対して相同の配列であ
る。本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルスによりコー
ドされるペプチドをコードする１又は複数のヌクレオチ
ド配列を含んで成るトランスフェクトされた宿主細胞を
提供し、ここで前記北米ＰＲＲＳウィルスのゲノム配列
は配列番号１又はそれに対して相同の配列である。
【００１８】本発明はさらに、野生型ニドビラレスウィ
ルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を
得、病原性感染を生成できないが、まだ、哺乳類又は鳥
において野生型ニドビラレスウィルスによる感染に対し
て効果的な免疫保護応答を誘発できる遺伝子的に修飾さ
れたニドビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分
子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリ
ヌクレオチド分子を得るために、前記ＤＮＡ配列を遺伝
子的に突然変異誘発し、そしてそのようにして得られ
た、単離されたポリヌクレオチド分子から遺伝子的に修
飾されたニドビラレスウィルスを発現することによって
調製される、遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィル
スによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において免疫
保護応答を誘発することができる遺伝子的に修飾された
ニドビラレスウィルスを提供する。
【００１９】本発明はさらに、遺伝子的に修飾されたニ
ドビラレスウィルスによりワクチン接種された哺乳類又
は鳥において免疫保護応答を誘発できる遺伝子的に修飾
されたニドビラレスウィルスを調製するための方法を提
供し、ここで前記方法は、野生型ニドビラレスウィルス
をコードする感染性ＤＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列
を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得、病
原性感染を生成できないが、まだ、哺乳類又は鳥におい
て野生型ニドビラレスウィルスによる感染に対して効果
的な免疫保護応答を誘発できる遺伝子的に修飾されたニ
ドビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレ
オチド分子を得るために、前記ＤＮＡ配列を遺伝子的に
突然誘発し、そしてそのようにして得られた、単離され
たポリヌクレオチド分子から遺伝子的に修飾されたニド
ビラレスウィルスを発現することを含んで成る。
【００２０】本発明はさらに、上記のような遺伝子的に
修飾されたニドビラレスウィルスを、それらによりワク
チン接種された哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレ
スウィルスに対して効果的な免疫保護応答を誘発するの
に有効な量で、及び医薬又は獣医学的使用のために許容
できるキャリヤーを含んで成る、ニドビラレスウィルス
による感染から哺乳類又は鳥を保護するためのワクチン
を提供する。
【００２１】発明の特定の記載 本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチド分子
の生成及び操作は、当業者の範囲内であり、そして中で
も、次に記載される組換え技法に従って実施され得る：
Maniatis, など., 1989, Molecular Cloning, A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, など., 1989, Cur
rent Protocols In Molecular Biology, Geene Publish
ing Associates & Wiley Interscience, NY ; Sambroo
k, など., 1989, Molecular Cloni ng : A Laboratory M
anual, 2d, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s,Cold Spring Harbor, NY ; Innlsなど. (eds), 1995,
PCR Strategles, Academic Press, Inc., San Diego,
and Erlich (ed), 1992, PCR Technology, OxfordUnive
rsity Press, New York；それらのすべては、引用によ
り本明細書に組込まれる。
【００２２】Ａ．北米ＰＲＲＳウィルスをコードする単
離されたポリヌクレオチド分子及びＲＮＡ分子、並びに
遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードす
る単離されたポリヌクレオチド分子及びＲＮＡ分子：本
発明は、北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮ
Ａ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離された
ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、遺
伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする
感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る
単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２３】特に、本発明は、北米ＰＲＲＳウィルスを
コードする感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号１
又はそれに対して相同の配列であるＤＮＡ配列を含んで
成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ま
しい態様においては、本発明は、北米ＰＲＲＳウィルス
をコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列
を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供
し、ここで前記ＤＮＡ配列は配列番号１のヌクレオチド
１で開始し、そしてそれから、ヌクレオチド１５，４１
６までを含む配列であるが、但し、配列番号１のヌクレ
オチド１２，６２２に対応するヌクレオチドがアデニン
の代わりにグアニンであり、そして配列番号１のヌクレ
オチド１，５５９に対応するヌクレオチドがシトシンの
代わりにチミンである。前記ＤＮＡ配列は、北米ＰＲＲ
Ｓ単離物Ｐ１２９のＲＮＡゲノムである感染性ＲＮＡ分
子をコードする。
【００２４】核酸分子を言及する用語、たとえば“単離
されたポリヌクレオチド分子”、“ヌクレオチド配
列”、“オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）”及
び同様のものは、特にことわらない限り、ＤＮＡ及びＲ
ＮＡの両分子を包含し、そして一本鎖及び二本鎖の両分
子を包含する。また、本出願の“配列表”セクションか
らの特定の配列を言及する場合、特にことわらない限
り、“配列表”のＤＮＡ、及びそのＤＮＡに対応するＲ
ＮＡの両者を言及することが意図され、そしてＤＮＡ及
びＲＮＡ配列に対して相補的な配列を包含する。本出願
におけるそのような場合、“〜に対応する”とは、お互
い同一であるＤＮＡ及びＲＮＡの配列に言及するが、但
し、ＲＮＡ配列はチミンの代わりにウラシルを含み、そ
してＲＮＡ分子の主鎖はデオキシリボースの代わりにリ
ボースを含む事実を除く。
【００２５】たとえば、配列番号１は、北米ＰＲＲＳウ
ィルスのＲＮＡゲノムに対応するＤＮＡ配列である。従
って、配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対して相補的
なＤＮＡ配列は、北米ＰＲＲＳウィルスのＲＮＡゲノム
（すなわち、北米ＰＲＲＳウィルスをコードするＲＮ
Ａ）のための鋳型であり、すなわちそれに対して相補的
であり、又はそれを“コードする”。それにもかかわら
ず、配列番号１に関する言及は、配列番号１に対応する
ＲＮＡ配列及び配列番号１に対して相補的なＤＮＡ配列
の両者を包含する。
【００２６】さらに、配列表における配列に対して相同
の配列に言及する場合、配列表における配列に対応する
配列に対して相同の配列、及び配列表における配列に対
して相補的な配列に対して相同の配列がまた包含される
ことが理解されるべきである。本発明のための“感染性
ＲＮＡ分子”とは、適切な宿主細胞における機能的ビリ
オンへのウィルス複製、転写及び翻訳のための必要な要
素をコードするＲＮＡ分子であるが、但し、必要なら、
ＲＮＡ分子においていづれかの遺伝子修飾、たとえば配
列欠失を補正するペプチド又は複数のペプチドが存在す
る。
【００２７】“単離された感染性ＲＮＡ分子”とは、そ
のようなＲＮＡ分子が天然に実際、存在する場合、その
天然に存在する状態からいづれかの検出できる程度に精
製された前記感染性ＲＮＡ分子を含んで成る物質の組成
物を意味する。同様に、“単離されたポリヌクレオチド
分子”とは、存在するなら、その天然に存在する状態か
らいづれかの検出できる程度に精製された本発明のポリ
ヌクレオチド分子を含んで成る物質の組成物を言及す
る。
【００２８】本発明のためには、第２ポリヌクレオチド
分子（ＲＮＡ又はＤＮＡのいづれか）のヌクレオチド配
列は次の場合には第１ポリヌクレオチド分子のヌクレオ
チド配列に“相同”である。すなわち、前記第２ポリヌ
クレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝子コードの
縮重に基づいて第１ポリヌクレオチド分子のヌクレオチ
ド配列と同一のポリアミノ酸をコードする場合、又はそ
れが本発明の実施において有用であるように第１ポリヌ
クレオチド分子のヌクレオチド配列によりコードされる
ポリアミノ酸に十分に類似するポリアミノ酸をコードす
る場合である。本発明のためには、ポリヌクレオチド分
子は本発明の実施において有用であり、ここでそれは、
感染されたブタの流体又は組織サンプルにおける北米Ｐ
ＲＲＳウィルスの存在を、標準的ハイブリダイゼーショ
ン又は増幅技法により検出するための診断用プローブと
して使用され得る。
【００２９】ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列
によりコードされるポリアミノ酸は一群の複数のポリア
ミノ酸を含んで成ることができることが理解されるべき
である。一般的に、第２ポリヌクレオチド分子のヌクレ
オチド配列は、BLASTNアルゴリズムに基づいて、第１ポ
リヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して少なく
とも約７０％のヌクレオチド配列同一性を有する場合、
第１ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して
相同である（National Center for Biotechnology Info
rmation (NCBI), (Bethesda, Maryland, USA) of the U
nited States National Institute of Health)。好まし
くは、相同ヌクレオチド配列は、少なくとも約７５％の
ヌクレオチド配列同一性、さらにより好ましくは、少な
くとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺
伝子コードは縮重性であるので、相同ヌクレオチド配列
は、いづれかの数の“サイレント”塩基変化、すなわ
ち、それにもかかわらず同じアミノ酸をコードするヌク
レオチド置換を包含することができる。
【００３０】相同ヌクレオチド配列はさらに、その配列
が第１ヌクレオチド配列によりコードされるポリアミノ
酸に対して少なくとも７０％の同一性で存続し、又は他
方では、本発の実施のために有用である限り、非−サイ
レント突然変異、すなわちコードされたポリアミノ酸に
おけるアミノ酸差異をもたらす、塩基置換、欠失又は付
加を含むことができる。相同ヌクレオチド配列は、ヌク
レオチド配列の比較により、たとえば、上記BLASTNを用
いることによって決定され得る。あるいは、相同ヌクレ
オチド配列は、選択された条件下でのハイブリダイゼー
ションにより決定され得る。
【００３１】たとえば、第２ポリヌクレオチド分子のヌ
クレオチド配列は、それが中位の緊縮条件、たとえば
０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、１mMのＥＤＴＡの溶液における６５℃で
のフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及
び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける４２℃での
洗浄条件（Ausubel など.,上記を参照のこと）、又は下
記で定義されるような北米ＰＲＲＳウィルスをコードす
る配列のハイブリダイゼーションをもたらすであろう条
件下で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする場
合、配列番号１に対して相同である。もう１つの態様に
おいて、第２のヌクレオチド配列は、それが、高い緊縮
条件、たとえば０．５ＭのＮａＨＰＯ4 ，７％のＳＤ
Ｓ，１mMのＥＤＴＡの溶液における６５℃でのフィルタ
ー結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける６８℃での洗浄条件
（Ausubelなど.,上記）下で、配列番号１の相補体にハ
イブリダイズする場合、配列番号１に対して相同であ
る。
【００３２】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
及び単離されたＲＮＡ分子は、合成分子、及び組換え技
法、たとえばインビトロクローニング及び転写により得
られる分子の両者を包含することが、さらに理解される
べきである。本明細書において使用される場合、用語
“ＰＲＲＳ”とは、ＰＲＲＳウィルス感染により惹起さ
れるブタにおける疾病症候群を包含する。そのような症
候群の例は、妊娠した雌ブタにおける流産、及び若いブ
タにおける遅い成長、呼吸困難、食欲不振及び死亡を包
含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書
において使用される場合、“ＰＲＲＳを生成することが
できない”ＰＲＲＳウィルスは、ブタを感染することが
できるが、しかしブタにおけるＰＲＲＳ感染と通常関連
するいづれの疾病症候群も生成しないか、又はそのよう
な症候群を生成するが、しかしより低い程度であるか、
又は少数のそのような症候群を生成するか、あるいは両
者であるウィルスを意味する。
【００３３】用語“ブタ”とは、スイダエ（Suidae）科
のメンバーであるいづれかの動物、たとえばブタを意味
する。“哺乳類”とは、ママアリア（Mammalia）綱のい
づれかの温血脊椎動物、たとえばヒトを包含する。用語
“ＰＲＲＳウィルス”とは、本明細書において使用され
る場合、特にことわらない限り、北米又は欧州ＰＲＲＳ
ウィルスのいづれかの株を意味する。
【００３４】用語“北米ＰＲＲＳウィルス”とは、北米
ＰＲＲＳウィルス単離物、たとえば１９９０年代初期、
アメリカ合衆国において最初に単離されたＰＲＲＳウィ
ルス（たとえば、Collins, J.E.,など., 1992, J. Vet.
Diagn. Invest. 4 : 117-126 を参照のこと）；北米Ｐ
ＲＲＳウィルス単離物ＭＮ−１ｂ（Kwang, J. など.,19
94, J. Vet. Diagn. Invest. 6 : 293-296)；ＰＲＲＳ
のQuebec IAF-exp91株（Mardassi, H.など., 1995, Arc
h. Virol. 140 : 1405-1418)；及び北米ＰＲＲＳウィル
ス単離物VR2385（Meng, X.-J. など., 1994, J. Gen. V
irol. 75 : 1795-1801) （但し、それらだけには限定さ
れない）に関連する遺伝子特徴を有するいづれかのＰＲ
ＲＳウィルスを意味する。
【００３５】遺伝子特徴とは、北米ＰＲＲＳウィルス株
により共有されるゲノムヌクレオチド配列類似性及びア
ミノ酸配列類似性を意味する。本発明のためには、北米
ＰＲＲＳウィルスは、配列番号１と同じか又はそれに対
して相同のＲＮＡ配列によりコードされるウィルスであ
り、ここで用語“相同”とは、前で定義された通りであ
る。従って、北米ＰＲＲＳウィルスの株は好ましくは、
配列番号１と少なくとも約７０％のゲノムヌクレオチド
配列同一性、及びより好ましくは、配列番号１と少なく
とも約７５％のゲノムヌクレオチド配列同一性を有し、
配列番号１との少なくとも約８５％のゲノムヌクレオチ
ド配列同一性がさらにより好ましい。
【００３６】用語“欧州ＰＲＲＳウィルス”とは、１９
９１年でさらにヨーロッパにおいて最初に単離されたＰ
ＲＲＳウィルスに関連する遺伝子特徴を有するＰＲＲＳ
ウィルスのいづれかの株を言及する（たとえば、Wensvo
ort, G.,など., 1991, Vet.Q. 13 : 121-130 を参照の
こと）。“欧州ＰＲＲＳウィルス”とはまた、時々、
“Lelystadウィルス”として当業界において言及され
る。
【００３７】特にことわらない限り、北米ＰＲＲＳウィ
ルスは、その特徴が本明細書に示される北米ＰＲＲＳウ
ィルスの定義内にある場合、“本発明の実施において有
用”である。たとえば、本発明の単離されたポリヌクレ
オチド分子の１つによりコードされるウィルスは、たと
えばそれが、北米ＰＲＲＳウィルスに関連する遺伝子特
徴を有する場合、“本発明の実施において有用な北米Ｐ
ＲＲＳウィルス”である。
【００３８】他のポリアミノ酸、たとえば北米ＰＲＲＳ
ウィルスＯＲＦに対して相同のポリヌクレオチド配列に
よりコードされるペプチドは、それらが、機能的なＰＲ
ＲＳビリオンが細胞により生成されるように、トランス
フェクトされた宿主細胞において機能的なＰＲＲＳビリ
オンを発現するために不可欠な遺伝子が不十分な、遺伝
子的に修飾されたＰＲＲＳウィルスをコードするＲＮＡ
分子を補足することができる場合、“本発明の実施にお
いて有用”である。用語“オープンリーディングフレー
ム”又は“ＯＲＦ”とは、本明細書において使用される
場合、介在性停止コドンを伴わないで、特定のＰＲＲＳ
ウィルスタンパク質をコードするために必要とされる最
小ヌクレオチド配列を意味する。
【００３９】用語“適切な宿主細胞”とは、特にことわ
らない限り、本発明のＲＮＡ分子（又はそのようなＲＮ
Ａ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離された
ポリヌクレオチド分子又はウィルスベクター）が形質転
換され、又はトランスフェクトされ得る細胞を意味す
る。そのようなＲＮＡ分子、単離されたポリヌクレオチ
ド分子、又はウィルスベクターによるトランスフェクト
のための“適切な宿主細胞”は、哺乳類、特にブタ、及
び鳥類細胞を包含し、そして下記にさらに詳細に記載さ
れる。
【００４０】“機能的ビリオン”は、ＰＲＲＳウィルス
を収容することができる細胞に侵入でき、そしてその細
胞内で、その特定のＲＮＡゲノム（本明細書に記載され
るような、修飾されていないゲノム又は遺伝子的に修飾
されたゲノム）の遺伝子を発現することができるウィル
ス粒子である。ＰＲＲＳウィルスを収容することができ
る細胞は、ブタ肺胞マクロファージ細胞及びMARC145 サ
ル腎細胞を包含する。他の哺乳類又は鳥類細胞、特に他
のブタ細胞もまた、ＰＲＲＳビリオンのための適切な宿
主細胞として作用することができる。
【００４１】本発明の単離されたポリヌクレオチド分子
は、下記においてさらに詳細に記載されるように、ＰＲ
ＲＳウィルスによる感染からブタを保護するためのよく
知られている方法を用いて、生ワクチン、殺されたワク
チン又は弱毒化されたワクチンを調製するために使用さ
れ得る北米ＰＲＲＳウィルスをコードする。それらの単
離されたポリヌクレオチド分子はまた、下記において詳
細に記載されるように、ブタ又は鳥を包含する哺乳類中
に異種遺伝子を供給するためのベクターとしても有用で
ある。さらに、それらの単離されたポリヌクレオチド分
子は、それらが中でも、ＰＲＲＳ感染からブタを保護す
るためのワクチンとして有用な、遺伝子的に修飾された
北米ＰＲＲＳウィルスをコードするよう分子生物学的技
法を用いて突然変異誘発され得るので、有用である。そ
のような遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルス、
及びそれらを含んで成るワクチンはまた、下記にさらに
詳細に記載される。
【００４２】従って、本発明はさらに、遺伝子的修飾さ
れた北米ＰＲＲＳウィルスを製造するための方法を提供
し、ここで前記方法は、上記のような北米ＰＲＲＳウィ
ルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
配列を突然変異誘発し、そして適切な発現系を用いて、
前記遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスを発現
することを含んで成る。北米ＰＲＲＳウィルス、すなわ
ち野生型又は遺伝子的に修飾されたいづれかのＰＲＲＳ
ウィルスは、当業界において一般的に知られている適切
な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子か
ら発現され得、ここで前記発現系の例は本明細書に記載
されている。たとえば、単離されたポリヌクレオチド分
子は、下記にさらに詳細に記載されるように、適切な宿
主においてコードされたウィルスを発現することができ
るプラスミドの形で存在することができる。
【００４３】用語“遺伝子的に修飾された”とは、本明
細書において使用される場合、及び特にことわらない限
り、遺伝子的に突然変異誘発されたことを意味し、すな
わち置換され、欠失されそして／又は付加された１又は
複数のヌクレオチドを有することを意味する。ポリヌク
レオチド分子は、当業界者に知られている組換え技法、
たとえば特定部位の突然変異誘発、又はランダム突然変
異誘発、たとえば当業界において知られているような、
化学的な突然変異誘発物質又は放射線への暴露により、
遺伝子的に突然変異誘発され得る。
【００４４】１つの態様においては、本発明の北米ＰＲ
ＲＳウィルスの遺伝子修飾は、野生型ウィルスが効果的
に複製する鳥又は哺乳類において、ウィルスの複製を効
果的に無能にし、又は効果的に複製するその能力を低め
る。もう１つの態様においては、本発明の遺伝子的に修
飾された北米ＰＲＲＳウィルスは、それらにより感染さ
れた鳥又は哺乳類において効果的に複製し続け得る。
“効果的複製”とは、感染された動物において増殖し、
そして子孫ウィルス（ビリオン）を生成する能力、すな
わち動物を“生産的に感染する”能力を意味する。
【００４５】本発明はさらに、ブタ動物においてＰＲＲ
Ｓを生成することができない遺伝子的に修飾された北米
ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を提供し、ここで前記ＤＮＡ配列は配列番号１
又はそれに対して相同の配列であるが、但しそれはＰＲ
ＲＳを生成するその能力において、コードされたＰＲＲ
Ｓウィルスを遺伝子的に無能にする１又は複数の突然変
異を含む。“遺伝子的に無能にされた”とは、ＰＲＲＳ
ウィルスがそれにより感染されたブタ動物においてＰＲ
ＲＳを生成することができないことを意味する。
【００４６】１つの態様において、ＰＲＲＳを引き起こ
すその能力を無能にされた、遺伝子的に修飾された北米
ＰＲＲＳウィルスは、ブタ動物においてＰＲＲＳウィル
スによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発する
ことができる。従って、本発明はまた、ブタ動物を感染
する場合、ａ）動物においてＰＲＲＳを生成することが
できず、そしてｂ）動物においてＰＲＲＳウィルスによ
る感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発できるよう
遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードす
る感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成
る単離されたポリヌクレオチド分子を提供し、ここで前
記北米ＰＲＲＳをコードするＤＮＡ配列は配列番号１又
はそれに対して相同の配列であるが、但しＰＲＲＳを生
成するその能力において、コードされたＰＲＲＳウィル
スを遺伝子的に無能にする１又は複数の突然変異を含
む。
【００４７】用語“免疫応答”とは、特定の抗原性エピ
トープ又は複数の特定の抗原性エピトープに対して向け
られるか又はその分解又は阻害を助ける抗体及び／又は
細胞（たとえばＴリンパ球）の生成を意味する。本発明
に関し、用語“効果的な免疫保護応答”、“免疫保
護”、及び同様の用語は、ワクチン接種された動物にお
いて病原体による感染に対して保護するために病原体の
１又は複数の抗原性エピトープに対して向けられる免疫
応答を意味する。
【００４８】本発明のためには、病原体による感染に対
する保護は、感染の絶対的な阻止のみならず、また病原
体による感染の程度又は速度のいづれかの検出できる低
下、又はワクチン接種されていない感染された動物に比
較して、ワクチン接種された動物における病原体による
感染に起因する疾病、又はいづれかの症状又は状態の重
症度のいづれかの検出できる低下を包含する。効果的な
免疫保護応答は、病原体によりこれまで感染されたこと
がない動物及び／又はワクチン接種の時点で病原体によ
り感染されていない動物において誘発され得る。効果的
な免疫応答はまた、ワクチン接種の時点で病原体により
すでに感染されている動物においても誘発され得る。
【００４９】“抗原性エピトープ”とは、特にことわら
ない限り、特定の動物又は種において免疫応答を誘発で
きる分子である。抗原性エピトープは、タンパク質性分
子、すなわち非タンパク質基、たとえば炭水化物成分及
び／又は脂質成分を任意に含んで成るポリアミノ酸配列
である。本明細書において使用される用語“病原的に感
染する”とは、動物を感染し、そして動物に疾病を引き
起こす病原体の能力を意味する。例として、ＰＲＲＳウ
ィルスは、それがブタにおいてＰＲＲＳを引き起こすこ
とができるので、ブタ動物を病原的に感染することがで
きる。しかしながら、ＰＲＲＳウィルスは鳥又は他の哺
乳類、たとえばヒトを、生産的に又は非生産的に感染す
ることができるが、それはブタ動物以外の動物において
いづれの疾病も引き起こさないので、ブタ動物以外のい
づれの動物も病原的に感染しない。
【００５０】上記単離されたポリヌクレオチド分子によ
りコードされる遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィ
ルスは、１つの態様においてＰＲＲＳウィルスによる感
染に対して効果的な免疫保護応答を誘発することができ
る。そのような遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィ
ルスは好ましくは、欧州株及び北米株の両者を包含する
ＰＲＲＳウィルスのいづれかの株に対して効果的な免疫
保護応答を誘発することができる。
【００５１】１つの態様において、遺伝子的に無能にさ
れた北米ＰＲＲＳウィルスをコードする単離されたポリ
ヌクレオチド分子における突然変異は、非−サイレント
であり、そして北米ＰＲＲＳウィルスをコードするヌク
レオチド配列の１又は複数のオープンリーディングフレ
ームにおいて生じ；すなわち前記突然変異は配列番号１
のＯＲＦ１ａ，１ｂ，２，３，４，５，６、又は７と同
じか又は相同である、北米ＰＲＲＳウィルスをコードす
るヌクレオチド配列内の１又は複数の配列において生じ
る。もう１つの態様においては、突然変異は、北米ＰＲ
ＲＳウィルスゲノムの１又は複数の非コード領域におい
て、たとえば北米ＰＲＲＳウィルスゲノムのリーダー配
列において生じ；すなわち突然変異は配列番号１のヌク
レオチド１〜１９１の配列と同じか又は相同である配列
内に生じる。同じ単離されたポリヌクレオチド分子にお
いては、突然変異はコード及び非コード領域において生
じることができる。
【００５２】本明細書において使用される場合、北米Ｐ
ＲＲＳウィルスをコードするヌクレオチド配列の“非コ
ード領域”は、特にことわらない限り、タンパク質に翻
訳されないそれらのＲＮＡ配列、及びそのようなＲＮＡ
配列をコードするそれらのｃＤＮＡ配列を意味する。コ
ード領域は、北米ＰＲＲＳウィルスタンパク質が発現さ
れるそれらのＲＮＡ配列を意味し、そしてまた、そのよ
うなＲＮＡ配列をコードするｃＤＮＡも意味する。同様
に、“ＯＲＦ”は、北米ＰＲＲＳウィルスタンパク質を
コードするＲＮＡ配列、及びそのようなＲＮＡ配列をコ
ードするｃＤＮＡ配列の両者を言及する。
【００５３】ＰＲＲＳを生成できないが、まだ、ＰＲＲ
Ｓウィルスによる感染に対して効果的な免疫保護応答を
誘発できるよう、遺伝子的に無能につれた北米ＰＲＲＳ
ウィルスをコードするであろう突然変異についての適切
な位置の決定は、本明細書に提供される配列番号１に基
づいて行なわれ得る。当業者は、本発明により提供され
る北米ＰＲＲＳウィルスの感染性ｃＤＮＡクローンの配
列を言及し、突然変異をもたらすであろう配列の変更を
実施し、そしてブタにおいてＰＲＲＳを生成し、そして
ＰＲＲＳウィルスによる感染に対して効果的な免疫保護
応答を誘発するそれらの能力について、それらによりコ
ードされるウィルスを試験することができる。そのよう
にすることで、当業者は、当業界において知られている
技法、及びまた、本明細書に記載され、そして／又は例
示されるそれらの技法を言及することができる。
【００５４】たとえば、北米ＰＲＲＳウィルスをコード
する感染性ＲＮＡ分子をコードする配列のＯＲＦが、突
然変異誘発され得、そしてその得られる遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳウィルスがＰＲＲＳを引き起こすそ
の能力について試験される。北米ＰＲＲＳウィルスのＯ
ＲＦは、次のようなタンパク質をコードする：ＯＲＦ１
ａはプロテアーゼ機能を含んで成るポリタンパク質をコ
ードし；ＯＲＦ１ｂはレプリカーゼ（ＲＮＡポリメラー
ゼ）及びヘリカーゼ機能を含んで成るポリタンパク質を
コードし；ＯＲＦ２，３及び４は小メンバー糖タンパク
質をコードし；ＯＲＦ５は主要エンベロープ糖タンパク
質をコードし；ＯＲＦ６はグリコシル化されていない膜
内在性タンパク質をコードし；そしてＯＲＦ７はヌクレ
オキャプシドタンパク質をコードする。１又は複数のそ
れらのＯＲＦの遺伝子突然変異が、下記に記載される遺
伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスの調製に使用
され得る。
【００５５】本発明はまた、１又は複数の異種抗原性エ
ピトープを含んで成るように遺伝子的に修飾された北米
ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を提供し、ここで前記北米ＰＲＲＳウィルスを
コードするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列は、配列
番号１又はそれに対して相同の配列であり、そしてさら
に、異種抗原性エピトープをそれぞれコードする１又は
複数の追加のヌクレオチド配列を含んで成り、そして前
記個々の異種抗原性エピトープは哺乳類又は鳥において
特定の病原体に対して効果的な免疫保護応答を誘発する
ことができる。
【００５６】効果的な免疫保護応答が本発明の上記観点
の手段により誘発され得る病原体は、哺乳類又は鳥にお
いて疾病を引き起こすことができるいづれかの病原体、
たとえばウィルス、細菌、菌類又は原生動物であり、こ
の病原体は哺乳類又は鳥において病原体に対して効果的
な免疫保護応答を誘発するために使用され得る１又は複
数の抗原性エピトープを含んで成り、又はそれと関連し
ている。
【００５７】本発明のための用語“異種抗原性エピトー
プ”とは、野生型北米ＰＲＲＳウィルスに通常見出され
ない、上記で定義されたような抗原性エピトープを意味
する。異種抗原性エピトープをコードするヌクレオチド
配列は、既知の組換え技法を用いて、北米ＰＲＲＳウィ
ルスゲノム中に挿入され得る。本発明のための異種抗原
性エピトープとして有用な抗原性エピトープは、追加の
北米ＰＲＲＳウィルス抗原性エピトープ、欧州ＰＲＲＳ
ウィルスからの抗原性エピトープ、ＰＲＲＳウィルス以
外のブタ病原体からのエピトープ、又は鳥もしくはブタ
以外の哺乳類、たとえばヒトを病原的に感染する病原体
からの抗原性エピトープを包含する。
【００５８】そのような抗原性エピトープをコードする
配列は、当業界において知られており、又は本明細書に
提供される。たとえば、本明細書に記載される北米ＰＲ
ＲＳＯＲＦ５によりコードされる、第２北米ＰＲＲＳウ
ィルスエンベロープタンパク質は、本発明の北米ＰＲＲ
ＳウィルスをコードするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
配列中に挿入され、異種抗原性エピトープとして追加の
エンベロープタンパク質を含んで成る遺伝子的に修飾さ
れた北米ＰＲＲＳウィルスが生成される。そのような遺
伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスは、それらに
よりワクチン接種されたブタ動物においてＰＲＲＳウィ
ルスに対してより効果的な免疫保護応答を誘発するため
に使用され得る。
【００５９】北米ＰＲＲＳウィルス以外のブタ病原体か
らの抗原性エピトープの例は次のものを包含するが、但
しそれらだけには限定されない：欧州ＰＲＲＳ、ブタパ
ルボウィルス、ブタシルコウィルス（circovirus）、ブ
タロタウィルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウィ
ルス、感染性胃腸炎ウィルス、ブタ呼吸コロナウィル
ス、従来のブタ発熱ウィルス、フフリキャンブタ発熱ウ
ィルス、脳心筋炎ウィルス、ブタパラミクソウィルス、
アクチノバチルスフレウロプネウモニ（Actinobacillus
pleuropneumoni)、バチルスアントラシ（Bacillus ant
hraci)、ボルデテラブロンキセプチカ（Bordetella bro
nchiseptica)、クロストリジウムハエモリチカム（Clot
ridium haemolyticum)、クロストリジウムペルフリンゲ
ンス（Clostridium perfringens)、クロストリジウムテ
タニ（Clostridiumtetani)、エシュリシアコリ（Escher
ichia coli) 、エリシペロトリクスルシオパチアエ（Er
ysipelothrix rhusiopathiae) 、ハエモフィラスパラス
イス（Haemophilus parasuis) 、レプトスピラｓｐｐ．
（Leptospira spp.)、マイコプラズマヒオペネウモニア
エ（Mycoplasma hyopneumoniae) 、マイコプラズマヒロ
リニス（Mycoplasma hyorhinis) 、パステウレラハエモ
リチカ（Pasteurella haemolytica)、パステウレラムル
トシダ（Pasteurella multocida)、サルモネラコレラエ
スイス（Salmonella choleraesuis)、サルモネラチピム
リウム（Salmonella typhimurium) 、ストレプトコーカ
スエクイスミリス（Streptococcus equismillis)及びス
トレプトコーカススイス（Streptococcus suis) から成
る群から選択されたブタ病原体からの抗原性エピトー
プ。前記ブタ病原体からの抗原性エピトープをコードす
るヌクレオチド配列は、当業界において知られており、
そして公開された遺伝子データベース、たとえばＮＣＢ
Ｉにより提供されるGenBank （http://www.ncbi.nim.ni
h.gov/Web/Genbank/index.html) から入手できる。
【００６０】異種抗原性エピトープが１又は複数の他の
ブタ病原体からの抗原性エピトープである場合、単離さ
れたポリヌクレオチド分子はさらに、ＰＲＲＳを生成す
るその能力において、コードされたＰＲＲＳウィルスを
遺伝子的に無能にする１又は複数の突然変異を含むこと
ができる。そのような単離されたポリヌクレオチド分子
及びそれらがコードするウィルスは、異種抗原性エピト
ープが由来するブタ病原体に対してブタを保護するため
のワクチンを調製するために有用である。
【００６１】好ましい態様においては、遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳは、ブタ動物においてＰＲＲＳウィ
ルスによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発す
ることができる。そのような単離されたポリヌクレオチ
ド分子及びそれらがコードするウィルスは、北米ＰＲＲ
Ｓウィルス、及び異種抗原性エピトープが由来するブタ
病原体の両者による感染に対してブタを保護するための
二重機能ワクチンを調製するために有用である。もう１
つの好ましい態様においては、二重機能ワクチンにおい
て有用な、遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルス
が遺伝子的に無能にされる。
【００６２】異種抗原性エピトープをコードするヌクレ
オチド配列を含んで成る本発明の単離されたポリヌクレ
オチド分子は、分子生物学において知られている技法を
用いて、本明細書に記載される北米ＰＲＲＳウィルスを
コードする配列に基づいて、上記のようにして調製され
得る。
【００６３】さらなる好ましい態様においては、本発明
の遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスの異種抗
原性エピトープは、検出できる抗原性エピトープであ
る。そのような単離されたポリヌクレオチド分子及びそ
れらがコードする北米ＰＲＲＳウィルスは中でも、ブタ
におけるＰＲＲＳ感染を研究し、都合良くワクチン接種
されたブタを決定し、そして／又は野生型ＰＲＲＳウィ
ルスにより感染されたブタとワクチン接種されたブタと
を区別するために有用である。好ましくは、そのような
単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、ＰＲＲＳを
生成するその能力において、コードされたＰＲＲＳウィ
ルスを遺伝子的に無能にする１又は複数の突然変異を含
み、そしてより好ましくは、ＰＲＲＳウィルスによる感
染に対してブタ動物において効果的な免疫保護応答を誘
発することができる。
【００６４】検出できる異種抗原性エピトープ、及びそ
れらをコードする配列はまた、当業界において知られて
いる。そのような抗原性エピトープを検出するための技
法はまた、当業界において知られており、そしてたとえ
ばウェスターンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は異種抗原性
エピトープに対して特異的な抗体に結合することができ
る螢光ラベルされた抗体による、異種抗原性エピトープ
に対して特異的な抗体の血清学的検出を包含する。本発
明の実施において有用な血清学的検出のための技法は、
当業界において認識されるテキスト、たとえば引用によ
り本明細書中に組込まれる、Coligan, J.E.,など. (ed
s), 1998, Current Protocols in Immunology, John Wi
lley & Sons, Inc., に見出され得る。他方では、異種
抗原性エピトープ自体はたとえば、抗原性エピトープを
実質的に含んで成るサンプルと、抗原性エピトープを特
異的に結合する螢光ラベルされた抗体又は放射性ラベル
された抗体とを接触せしめることによって検出され得
る。
【００６５】本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルス抗
原性エピトープを検出可能に欠いている遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供し、ここで前記北米ＰＲＲＳ
ウィルスをコードするＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配
列は、配列番号１又はそれに対して相同の配列である
が、但し、それは検出できる北米ＰＲＲＳウィルス抗原
性エピトープをコードする１又は複数のヌクレオチド配
列を欠いている。そのよな単離されたポリヌクレオチド
分子は、本発明の組換え北米ＰＲＲＳウィルスにより感
染されたブタと、野生型ＰＲＲＳウィルスにより感染さ
れたブタとの間を区別するために有用である。
【００６６】たとえば、そのような単離されたポリヌク
レオチド分子によりコードされた、殺された、生存の又
は弱毒化された北米ＰＲＲＳウィルスによりワクチン接
種された動物は、欠けた抗原性エピトープに対して特異
的な抗体の不存在に基づいて、又は抗原性エピトープ自
体の不存在に基づいて、野生型ＰＲＲＳウィルスにより
感染された動物から区別され得る。欠けた抗原エピトー
プに対して特異的な抗体、又は抗原性エピトープ自体が
動物において検出される場合、動物は野生型ＰＲＲＳウ
ィルスに暴露され、又はそれにより感染された。
【００６７】抗原性エピトープ及びそれに対して特異的
な抗体を検出するための手段は、上記で論ぜられたよう
に、当業界において知られている。好ましくは、そのよ
うな単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、ＰＲＲ
Ｓを生成するその能力において、コードされたＰＲＲＳ
ウィルスを遺伝子的に無能にする１又は複数の突然変異
を含む。より好ましくは、そのコードされたウィルス
は、ＰＲＲＳウィルスによる感染に対して効果的な免疫
保護応答を誘発できるまま存続する。
【００６８】Ｂ．北米ＰＲＲＳウィルス又は遺伝子的に
修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードするプラスミ
ド：本発明はまた、上記単離されたポリヌクレオチド分
子のいづれかを、それによりコードされる北米ＰＲＲＳ
ウィルスを発現することができるプラスミドの形で提供
する。
【００６９】本発明のプラスミドは、中でも、ワクチン
を調製するために有用な本発明の北米ＰＲＲＳウィルス
を生成するために、生存生物の外部に、コードされた北
米ＰＲＲＳウィルスを発現することができる。１つの態
様においては、生存生物の外部に北米ＰＲＲＳウィルス
を発現することができる本発明のプラスミドは、それか
らのウィルスＲＮＡの転写がインビトロ（細胞外的に）
で生じるプラスミドであり；その得られるウィルスＲＮ
Ａ分子は、トランスフェクションの既知機構、たとえば
エレクトロポレーション、リポフェクション（多くの場
合、市販の試薬、たとえばLipofectinTM（Life Technol
ogies Inc., Rockville, Maryland, USA) を用いる）、
又はＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション
を用いて、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ
る。
【００７０】他のトランスフェクション方法は、当業界
において知られており、そして本発明において使用され
得る。北米ＰＲＲＳウィルスＲＮＡのインビトロ転写の
ためのそのようなプラスミドの例は、プラスミドpT7P12
9A（ATCC受託番号203488) である。インビトロ転写のた
めに有用ないづれかのプロモーターが、本発明のそのよ
うなプラスミドに使用され得る。Ｔ７は１つのそのよう
なプロモーターであるが、しかし他のプロモーター、た
とえばＳＰ６プロモーター又はＴ３プロモーターが使用
され得る。そのようなプロモーターの配列は、市販のプ
ラスミドから人工的に合成され、又はクローン化され得
る。
【００７１】北米ＰＲＲＳウィルスを発現することがで
きるそのようなプラスミドを調製するための適切なプラ
スミドは、一般的な目的のクローニングベクタープラス
ミド、たとえばpCR2.1（Invitrogen, Carlsbad, Califo
rnia, USA)，ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１８を包含する
が、但しそれらだけには限定されない。北米ＰＲＲＳウ
ィルスをコードする本発明のヌクレオチド配列は、既知
の組換え技法を用いて、それらのプラスミドのいづれか
中に挿入され得る。本発明のポリヌクレオチド分子が挿
入され得る他のプラスミドは、当業者により認識される
であろう。
【００７２】北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る上記組
換えプラスミドのいづれかからのウィルスＲＮＡのイン
ビトロ転写のための適切な条件は、プラスミドの型、た
とえばその特定のプロモーターに依存し、そして当業者
により確かめられ得る。たとえば、本発明のプラスミド
がＴ７プロモーターを含んで成るpCR2.1プロモーターに
基づかれている場合、インヒトロ転写のための適切な条
件の例は、プラスミドとＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び
リボヌクレオチドとを、標準の緩衝液において反応せし
め、そしてその反応を３７℃で約３０分間インキュベー
トすることを包含する。
【００７３】多くの場合、市販のキットが特定のプラス
ミドからＲＮＡを転写するために利用でき、そしてその
ようなキットが本発明において使用され得る。転写に続
いて、反応混合物は、精製を伴わないで、適切な宿主細
胞中に直接的にトランスフェクトされ得、又は転写され
た北米ＰＲＲＳウィルスＲＮＡは既知のＲＮＡ精製技
法、たとえば有機物（たとえばフェノール）抽出及びア
ルコール（たとえば、エタノール又はイソプロパノー
ル）沈澱により、トランスフェクションの前、精製され
得る。
【００７４】実質的にいづれかの哺乳類又は鳥細胞培養
物は、第１回目の北米ＰＲＲＳウィルスを生成するため
に、上記のようにして得られた北米ＰＲＲＳウィルスＲ
ＮＡによりトランスフェクトされ得る。それらの容易な
利用性及び容易な使用性のために特に有用であることが
見出されている細胞の例は、ＢＨＫ（子供ハムスター腎
臓）細胞である。しかしながら、北米ＰＲＲＳビリオン
の生成を維持できる細胞培養物を生成することが所望さ
れる場合、ブタ肺胞マクロファージ細胞又はMARC-145細
胞（Kim, H.S.,など.,前記）が、それらの細胞はＰＲＲ
Ｓウィルス感染に続いて、高レベルの新規世代のＰＲＲ
Ｓビリオンを排出するので、好ましい。MA-104細胞系に
由来する他の細胞系はまた、本発明の北米ＰＲＲＳビリ
オンの維持された生成のためにも使用され得る。一次ブ
タ肺胞マクロファージ細胞は、ブタからの肺洗浄により
得られ、そしてMARC-145サル腎細胞系はＮＶＳＬとして
も知られているNational veterinary Services Laborat
ories (Ames, Iowa, USA)から得られる。
【００７５】もう１つの態様においては、生存生物の外
部で本発明の北米ＰＲＲＳウィルスを発現することがで
きるプラスミドは、たとえば、エレクトロポレーション
又はリポフェクション、感染性ＲＮＡ分子の転写、及び
トランスフェクトされた宿主細胞内に生じる、それから
の北米ＰＲＲＳウィルスの発現により、適切な宿主細胞
中にトランスフェクトされるプラスミドである。従っ
て、トランスフェクトされた宿主細胞が北米ＰＲＲＳビ
リオンを生成する。そのような完全な細胞的方法は、ニ
ドビラレス目内のいづれのウィルスについても、これま
で開示されたことも又は提案されたこともない。
【００７６】ニドビラレス目のウィルスのＲＮＡゲノム
に存在する可能性ある隠れたスプライシング及び終結配
列のために、ニドビラレスウィルスを発現する完全な細
胞性方法は見込みのないように思われた。隠れた配列
は、ＲＮＡ転写体の不適切なスプライシングを引き起こ
すＲＮＡスプライスドナー及びスプライス受容体配列、
及び細胞ＲＮＡポリメラーゼIIによる早熟終結を引き起
こすポリアデニル化配列を包含する。しかしながら、本
発明は、ニドウィルスのｃＤＮＡクローンを含んで成る
プラスミドにおけるそのような配列の存在が、プラスミ
ドが適切な宿主細胞中に直接的にトランスフェクトされ
る場合、ニドウィルスを発現するプラスミドの能力を妨
げないことを示す。
【００７７】従って、本発明はまた、ニドビラレスウィ
ルスを発現するためのプラスミド及び完全な細胞的方法
を提供し、ここで前記プラスミドは、ａ）ニドビラレス
ウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤ
ＮＡ配列；及びｂ）細胞において前記コード配列を転写
することができるプロモーターを含んで成り、そして前
記プロモーターは感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ
配列と作用可能に関連して存在する。前記方法は、その
ようなプラスミドにより適切な宿主細胞をトランスフェ
クトし、そのトランスフェクトされた宿主細胞を、そこ
にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現のために適
切な条件にゆだね、そしてそれから、発現されたニドビ
ラレスウィルスを集めることを含んで成る。
【００７８】生存生物の外部での北米ＰＲＲＳウィルス
の完全な細胞性発現のために適切なプラスミドの例は、
プラスミドpCMV-S-P129 （ATCC受託番号203489) であ
る。好ましい態様においては、そのようなプラスミドの
プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。好ましい
態様においては、ニドビラレスウィルスを発現する完全
な細胞性方法のために適切な本発明のプラスミドは、ニ
ドビラレスウィルスをコードするヌクレオチド配列のす
ぐ上流に及びそれに隣接して真核プロモーター、たとえ
ばＣＭＶプロモーターを含んで成る。好ましい態様にお
いては、ニドビラレスウィルスをコードするヌクレオチ
ド配列は、欧州又は北米ＰＲＲＳウィルスをコードす
る。
【００７９】上記完全な細胞性方法により発現され得る
ニドビラレスウィルスの他の例は、他のアルテリビルセ
ス（Arterviruses）、たとえばウマ動脈炎ウィルス、乳
酸デヒドロゲナーゼ−上昇ウィルス及びサル出血性発熱
ウィルス；コロナビリダエ（Coronaviridae)属のメンバ
ーであるウィルス、たとえばネコ感染性ペリチニチスウ
ィルス、ネコ腸コロナウィルス、イヌコロナウィルス、
ウシコロナウィルス、ブタ呼吸コロナウィルス、七面鳥
コロナウィルス、ブタ伝染性胃腸炎ウィルス、ヒトコロ
ナウィルス、ネズミ肝炎ウィルス、及び鳥類感染性気管
支炎ウィルス（但し、それらだけには限定されない）；
及びトロビリダエ（Toroviridae)属のメンバー、たとえ
ばベルン（Berne)ウィルス、ブレダ（Breda)ウィルス及
びヒトトロビウィルス（但し、それらだけには限定され
ない）を包含する。従って、それらのウィルスの１つを
コードするヌクレオチド配列を含んで成る完全な細胞性
発現のために適切なプラスミドがまた、本発明により包
含される。
【００８０】ニドビラレスウィルス、たとえばＰＲＲＳ
ウィルスの生存生物の外部で完全な細胞性発現のための
本発明の組換えプラスミドを調製するために使用され得
る適切なプラスミドは、真核細胞におけるトランスフェ
クション及び発現のために有用ないづれかのプラスミド
を包含する。ニドビラレスウィルスの完全な細胞性発現
のための本発明の組換えプラスミドを調製するために適
切なプラスミドの例は、プラスミドpCMVbeta（Clontec
h, Palo Alto, California, USA) である。
【００８１】本発明のプラスミドを調製するために使用
され得る。真核細胞において遺伝子をトランスフェクト
し、そして発現することができる他のプラスミドは、pc
DNA3.1、pRc/RSV 、及びpZeoSV2 （すべて、Invitrogen
からである）；並びにpCMV-Sprot3 及びpSV-Sport1（両
者ともLife Technologies Inc.からである）を包含する
が、但しそれらだけには限定されない。しかしながら、
ほとんどいづれの真核発現ベクターでも、本発明のため
に作用するであろう。コスミドに基づく構造体がまた、
ニドビラレスウィルスの完全な細胞性エクスビボ発現の
ために使用され得る。
【００８２】ＰＲＲＳを発現するための本発明の完全な
細胞性方法のための適切な宿主細胞は、上記ブタ肺胞マ
クロファージ及びMARC-145細胞を包含する。プラスミド
によりそれらの細胞をトランスフェクトするための方法
は、上記ウィルスＤＮＡにより細胞をトランスフェクト
するためのそれらの方法と基本的に同じである。そのよ
うな方法は、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクショ
ン、及びリン酸カルシウム同時沈澱を包含するが、但し
それらだけには限定されない。
【００８３】宿主細胞、たとえばブタ肺胞マクロファー
ジ細胞又はMARC-145細胞がウィルスＲＮＡにより、又は
ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含んで成るプ
ラスミドにより、本発明に従ってトランスフェクトされ
るとすぐに、それらの細胞は数年間までの貯蔵のために
約−８０℃又はそれ以下で凍結され得る。より長い期
間、すなわち１０年間の貯蔵のためには、液体窒素によ
る貯蔵が好ましい。コードされたウィルスの比較的頻繁
な使用が想定される場合、ウィルスを収容する細胞はま
た、短期間、既知の技法を用いて、培養物において維持
され得る（凍結されないで）。
【００８４】さらに、そのような細胞により排泄される
ウィルス粒子は、ウィルス源として、約−８０℃又はそ
れ以下で凍結貯蔵され得る。ウィルスをコードするポリ
ヌクレオチド分子によるそのような細胞系のトランスフ
ェクションは、所望により、たとえば免疫螢光抗体試験
を用いて、ＰＲＲＳウィルス抗原について前記細胞系に
より排泄される消耗された培地を試験することによって
確かめられ得る。ＰＲＲＳウィルス抗原に対して特異的
である抗体は当業界において知られている（たとえば、
Collins, E.J.,など., WO93/03760 (March 4, 1993) を
参照のこと）。
【００８５】もう１つの態様において、北米ＰＲＲＳウ
ィルスをコードするヌクレオチド配列を含んで成る本発
明のプラスミドは、北米ＰＲＲＳウィルスのインビボ発
現すなわち生存生物における発現のために適切である。
北米ＰＲＲＳウィルスのインビボ発現のための組換えプ
ラスミドを調製するために使用され得るプラスミドは、
上記真核細胞をトランスフェクトすることができるプラ
スミド、たとえばpCMVbetaを包含するが、但しこれだけ
には限定されない。
【００８６】本発明のプラスミドによりトランスフェク
トされ得る動物は、哺乳類及び鳥類を包含する。動物が
ブタ動物以外、たとえばマガモである場合、プラスミド
は動物を病原的に感染することができる病原体からの追
加の抗原性エピトープを含んで成る北米ＰＲＲＳウィル
スをコードするヌクレオチド配列を含んで成り；そのよ
うな場合、プラスミドは、動物中にエピトープを輸送す
るためのベクターとして作用する北米ＰＲＲＳウィルス
をコードするであろう。動物がブタ動物である場合、プ
ラスミドは通常、本明細書に記載される北米ＰＲＲＳウ
ィルスのいづれか、たとえば本明細書に記載される遺伝
子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードするこ
とができる。
【００８７】Ｃ．北米ＰＲＲＳウィルスをコードするウ
ィルスベクター、たとえば遺伝子的に修飾された北米Ｐ
ＲＲＳウィルスをコードするウィルスベクター：本発明
はまた、本明細書に記載される北米ＰＲＲＳウィルスの
いづれか、たとえば本明細書に記載される遺伝子的に修
飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮ
Ａ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るウィルスベ
クターを提供する。そのようなウィルスベクターは、生
存生物の外部で本発明のＰＲＲＳウィルスの生成のため
に真核細胞をトランスフェクトするために、又は本明細
書における北米ＰＲＲＳウィルスのインビボ発現のため
に、北米ＰＲＲＳをコードする配列により、ブタ、又は
他の哺乳類、又は鳥類をトランスフェクトするために有
用である。
【００８８】本発明のウィルスベクターを調製するため
のベクターとして使用され得るウィルスのいくつかのサ
ンプルは、ブタウィルス、たとえばブタポックスウィル
ス、仮性狂犬病ウィルス、又はアフリキャンブタ発熱ウ
ィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されな
い。そのようなブタウィルスは、The National Veterin
ary Services Laboratories (Ames, Iowa, USA) of the
United States Department of Agriculture ; America
n Type Culture Collection (ATCC) (Manassas,Virgini
a, USA) ;及び他の既知の源から得られる。適切なブタ
ウィルス、たとえば前記ブタウィルスに基づく組換えウ
ィルスベクターは、本発明の北米ＰＲＲＳウィルスをコ
ードするヌクレオチド配列によりブタ動物をトランスフ
ェクトするために有用である。
【００８９】それらの及び他のウィルスに基づいての本
発明の北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るウィルスベク
ターは、テキスト、たとえば本明細書において前に引用
された文献に記載される既知の組換え技法を用いて調製
され得る。
【００９０】Ｄ．遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
ィルスをコードするトランスフェクトされた宿主細胞：
本発明はまた、本明細書に記載される北米ＰＲＲＳウィ
ルスのいづれか、たとえば本明細書に記載される遺伝子
的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染
性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る、そ
の北米ＰＲＲＳウィルスを発現することができるトラン
スフェクトされた宿主細胞を提供する。そのようなトラ
ンスフェクトされた宿主細胞は、本発明の北米ＰＲＲＳ
ウィルスを生成するために有用である。本発明のトラン
スフェクトされた宿主細胞の例は、トランスフェクトさ
れたブタ肺胞マクロファージ細胞及びトランスフェクト
されたMARC-145細胞を包含する。
【００９１】本発明の他のトランスフェクトされた細胞
は、次の細胞を包含するが、但しそれらだけには限定さ
れない：トランスフェクトされたMA-104細胞及びトラン
スフェクトされるMA-104細胞の他の誘導体；トランスフ
ェクトされた子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；トラ
ンスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞；及びMA-104細胞又はMARC-145細胞以外のアフ
リキャンミドリザル腎臓細胞、たとえばVERO細胞。
【００９２】Ｅ．遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
ィルスを包含する北米ＰＲＲＳウィルス：本発明はま
た、上記単離されたポリヌクレオチド分子、ＲＮＡ分
子、プラスミド、ウィルスベクター又はトランスフェク
トされた宿主細胞のいづれかにより発現され、そして／
又はコードされる、本明細書に記載されるような遺伝子
的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスを包含する、本明
細書に記載されるような北米ＰＲＲＳウィルスを提供す
る。
【００９３】一定の情況下で、たとえば北米ＰＲＲＳウ
ィルスがブタのためのワクチンに使用され、そして北米
ＰＲＲＳウィルスが、ＰＲＲＳを引き起こすことができ
ないように、上記のようにして遺伝子的に修飾されてい
ない場合、北米ＰＲＲＳウィルスを、たとえば、それが
投与されるブタにおいてＰＲＲＳを引き起こすことがで
きないように、それを不活性化し、又は弱毒化すること
によって処理することが所望される。既知の方法は、動
物においてＰＲＲＳを引き起こさないように、本発明の
北米ＰＲＲＳウィルスを不活性化するために使用され得
る。そのような方法の例は、ホルムアルデヒド、ＢＥＩ
（二元エチレンイシン）又はＢＰＬ（β−プロピオラク
トン）による処理を包含するが、但しそれだけには限定
されない。弱毒化の方法はまた当業界において知られて
おり、そしてそのような方法は本発明の北米ＰＲＲＳウ
ィルスを弱毒化するために使用され得る。たとえば、本
発明の北米ＰＲＲＳウィルスは、細胞培養における一連
の継代により弱毒化され得る。
【００９４】本発明の北米ＰＲＲＳウィルスがブタ動物
以外の動物において使用される場合、又はそれがブタ動
物においてＰＲＲＳを生成できないように、本明細書に
記載されるよう遺伝子的に修飾されている場合、それを
ワクチンに使用する前、前述のようにウィルスを処理す
る必要はない。
【００９５】Ｆ．ワクチン及びその用途：本発明はま
た、本明細書に記載されるようなブタ動物においてＰＲ
ＲＳを生成するそれらの能力において無能にされた遺伝
子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスを包含する、北
米ＰＲＲＳウィルス；本明細書に記載されるようなその
ような北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
分子及びプラスミド；又は本明細書に記載されるような
そのような北米ＰＲＲＳウィルス及び単離されたＲＮＡ
分子をコードするウィルスベクターを含んで成るワクチ
ンを提供する。本発明はまた、そのようなワクチンによ
るワクチン接種を含んで成る、感染から動物を保護する
ための方法も提供する。
【００９６】好ましい態様においては、本発明は、本明
細書に記載されるような１又は複数の異種抗原性エピト
ープを含んで成る遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
ィルス、そのような遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳ
ウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、又はそのよう
な遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコード
する本明細書に記載されるようなプラスミドを、前記異
種抗原性エピトープが由来する病原体による感染に対し
て免疫保護応答を誘発するのに効果的な量で、及び医薬
的又は獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含
んで成るワクチンを提供する。
【００９７】そのようなワクチンは、異種抗原性エピト
ープが由来する病原体により病原的に感染され得る哺乳
類又は鳥類を感染から保護するために使用され得る。従
って、本発明はまた、病原体による感染に対しての哺乳
類又は鳥における免疫保護応答を誘発するのに効果的な
量の前記ワクチンにより哺乳類又は鳥をワクチン接種す
ることを含んで成る、病原体による感染から哺乳類又は
鳥を保護するための方法を提供する。
【００９８】さらに好ましい態様においては、ワクチン
は、遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルス、又は
北米ＰＲＲＳウィルス以外のブタ病原体からの１又は複
数の異種抗原性エピトープを含んで成るか又はそれをコ
ードする、そのような遺伝子的に修飾されたＰＲＲＳウ
ィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子又はプラスミドを
含んで成る。それらのワクチンは、異種抗原性エピトー
プが由来するブタ病原体による感染からブタを保護する
ために有用である。そのようなワクチンが遺伝子的に修
飾された北米ＰＲＲＳウィルスを含んで成る場合、その
北米ＰＲＲＳウィルスの遺伝子修飾がブタにおける前記
ウィルスによるＰＲＲＳの誘発を無能にする。
【００９９】もう１つの好ましい態様においては、ワク
チンにおける遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィル
スはＰＲＲＳウィルスによる感染に対する免疫保護応答
を誘発することができ、従って、ブタに二重−ワクチン
を供給し、異種抗原性エピトープが由来するブタ病原体
による感染から、及びＰＲＲＳウィルスによる感染から
ブタを保護する。ワクチンがもう１つのブタ病原体から
の１又は複数の異種抗原性エピトープを含んで成る遺伝
子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感
染性ＲＮＡ分子又はプラスミドを含んで成る場合、その
遺伝子的に修飾されたＰＲＲＳウィルスをコードする感
染性ＲＮＡ分子をコードする配列は好ましくは、ＰＲＲ
Ｓを引き起こすことができないよう、そのコードされた
北米ＰＲＲＳウィルスを遺伝子的に無能にする１又は複
数の追加の突然変異を含んで成る。
【０１００】もう１つの好ましい態様においては、コー
ドされた遺伝子的に修飾され、無能にされた北米ＰＲＲ
Ｓウィルスは、ブタ動物においてＰＲＲＳ感染に対して
免疫保護応答を誘発することができ、従って、ブタに二
重−ワクチンを供給し、異種抗原性エピトープが由来す
るブタ病原体による感染から、及びＰＲＲＳウィルスに
よる感染からブタを保護することができる。すべてのそ
れらのワクチンはまた、さらに、獣医学的使用のために
許容できるキャリヤーを含んで成る。
【０１０１】本発明はさらに、北米ＰＲＲＳウィルス以
外のブタ病原体による感染からブタ動物を保護し、そし
て任意には、ＰＲＲＳウィルスによる感染からブタ動物
を同時に保護するための方法を提供し、ここで前記方法
は、ブタ病原体及び任意には、ＰＲＲＳウィルスによる
感染に対してブタ動物における免疫保護応答を誘発する
のに有効な量の前記ワクチンにより動物をワクチン接種
することを含んで成る。
【０１０２】本発明のワクチンは、許容される慣例に従
って、動物、たとえばヒト（適用できるなら）のための
許容できるキャリヤー、たとえば標準の緩衝液、安定
剤、希釈剤、保存剤、及び／又は溶解剤を含むよう配合
され得、そしてまた、持効性を促進するよう配合され得
る。希釈剤は、水、塩溶液、デキストロース、エタノー
ル、グリセロール及び同様のものを包含する。等張性の
ための添加剤は、中でも、塩化ナトリウム、デキストロ
ース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを包
含する。溶解剤は中でも、アルブミンを包含する。他の
適切なワクチン用ビークル及び添加剤、たとえば修飾さ
れた生存ワクチンの配合において特に有用であるもの
は、知られており、又は当業者に明らかであろう。たと
えば、引用により本明細書に組込まれる、Rennington's
Pharmacentical Science, 18th ed.,1990, Mack Publi
shingを参照のこと。
【０１０３】本発明のワクチンはさらに、１又は複数の
追加の免疫調節成分、たとえば中でも、アジュバント又
はサイトカインを含むことができる。本発明のワクチン
に使用され得るアジュバントの非制限的例は、次のもの
を包含する：ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ribi In
c., Hamilton, MT)、みょうばん、鉱物ゲル、たとえば
水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルジョン、油中水
エマルジョン、たとえばフロイント完全及び不完全アジ
ュバント、ブロックコポリマー（CytRx, AtlantaGA)，Q
S-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridye MA)、SAF-M
(Chiron, Emeryville CA) 、AMPHIGEN登録商標アジュ
バント、サポニン、QuilA 又は他のサポニン画分、モノ
ホスホリル脂質Ａ及びＡｖｒｉｄｉｎｅ−脂質−アミン
アジュバント。
【０１０４】本発明のワクチンにおいて有用な水中油エ
マルジョンの非制限的な例は、変性されたSEAM62及びSE
AM1/2 配合物を包含する。変性されたSEAM62は、５％
（ｖ／ｖ）のスクアレン（Sigma)，１％（ｖ／ｖ）のSP
AN登録商標８５界面活性剤（ICI Surfactants)，０．７
％（ｖ／ｖ）のTween 登録商標８０界面活性剤（ICI Su
rfactants)，２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００
μｇ／mlのQuilA ，１００μｇ／mlのコレステロール、
及び０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含む水中油エマル
ジョンである。変性されたSEAM12は、５％（ｖ／ｖ）の
スクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ登録商標８５界
面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）のTween80界面活性剤、
２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／mlのQu
ilA 及び５０μｇ／mlのコレステロールを含む水中油エ
マルジョンである。ワクチンに含まれ得る他の免疫調節
剤は、たとえば１又は複数のインターロイキン、インタ
ーフェロン、又は他の既知のサイトカインを包含する。
【０１０５】本発明のワクチンは任意には、本発明のウ
ィルス、感染性ＲＮＡ、プラスミド又はウィルスベクタ
ーの持効性のために配合され得る。そのような持効性配
合物の例は、ウィルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミ
ド、又はウィルスベクター、及び生物適合性ポリマーの
複合材料、たとえば乳酸のポリマー、乳酸−グリコール
酸のコポリマー、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コ
ラーゲン及び同様のものを包含する。薬物供給ビークル
における分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、いく
つかの出版物、たとえば引用により本明細書に組込まれ
る、A. Domb など., 1992, Polymers for Advanced Tec
hnologies 3 : 279-292 に再考されている。
【０１０６】医薬製剤におけるポリマーの選択及び使用
における追加の案内は、当業界において知られているテ
キスト、たとえば引用により本明細書に組込まれる、M.
Chasin and R. Langer (eds), 1990,“Biodeyradable
Polymers as Drug DeliverySystems ”in Drugs and th
e Pharmaceutical Science, Vol. 45, M. Dekker, NY
に見出され得る。他方では、又はさらに、ウィルス、プ
ラスミド、又はウィルスベクターは、投与及び効能を改
良するためにマイクロカプセル封入され得る。抗原をマ
イクロカプセル封入するための方法は、当業界において
知られており、そしてアメリカ特許第 3,137,631号；第
3,959,457号；第 4,205,060号；第 4,606,940号；第
4,744,933号；第 5,132,117号；及び国際特許出願WO95/
28227（それらは引用により本明細書中に組込まれる）
に記載される技法を包含する。
【０１０７】リポソームはまた、ウィルス、プラスミド
又はウィルスベクターの持効性を付与するために使用さ
れ得る。リポソーム配合物をいかにして製造し、そして
使用するかに関しての詳細は、中でも、アメリカ特許第
4,016,100号；第 4,452,747号；第 4,921,706号；第
4,927,637号；第 4,944,948号；第 5,008,050号；及び
第 5,009,956号（それらは引用により本明細書中に組込
まれる）に見出され得る。
【０１０８】上記いづれかのワクチンの有効量は、低い
用量のウィルス、プラスミド又はウィルスベクターによ
り開始し、そして次に、効果をモニターしながら、その
用量を高める従来の手段により決定され得る。有効量
は、ワクチンの一回の投与の後、又はワクチンの複数回
の投与の後、得られる。動物当たりの最適な用量を決定
する場合、既知の要因が考慮され得る。それらは、動物
の種、サイズ、年齢及び一般的な状態、動物における他
の薬物の存在、及び同様のものを包含する。実際の投与
量は好ましくは、他の動物研究からの結果の考慮の後、
選択される。
【０１０９】適切な免疫応答が達成されたかどうかを決
定するための１つの方法は、ワクチン接種の後、動物に
おける血清転換及び抗体力価を決定することである。ワ
クチン接種のタイミング及び追加免疫の数は好ましく
は、すべての相当する要因（それらのいくつかは、上記
に記載されている）の分析に基づいて、医者又は獣医に
より決定されるであろう。
【０１１０】本発明のウィルス、感染性ＲＮＡ分子、プ
ラスミド、又はウィルスベクターの効果的用量は、当業
者により決定され得る要因、たとえばワクチン接種され
るべき動物の重量を考慮して、既知の技法を用いて決定
され得る。本発明のワクチンにおける本発明のウィルス
の用量は、好ましくは、約１０1 〜約１０9 pfu （プラ
ーク形成単位）、より好ましくは約１０2 〜約１０8 pf
u 、及び最とも好ましくは、約１０3 〜約１０7 pfu の
範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のプラス
ミドの用量は、約０．１μｇ〜約１００mg、より好まし
くは約１μｇ〜約１０mg、さらにより好ましくは約１０
μｇ〜約１mgの範囲である。
【０１１１】本発明のワクチンにおける本発明の感染性
ＲＮＡ分子の用量は、好ましくは約０．１μｇ〜約１０
０mg、より好ましくは約１μｇ〜約１０mg、さらにより
好ましくは約１０μｇ〜約１mgの範囲である。本発明の
ワクチンにおける本発明のウィルスベクターの用量は、
好ましくは約１０1 〜１０9 pfu 、より好ましくは約１
０2 〜約１０8 pfu 、及びさらにより好ましくは約１０
3 〜約１０7 pfu の範囲である。適切な投与量サイズ
は、約０．５μｌ〜約１０ml、及びより好ましくは約１
ml〜約５mlの範囲である。
【０１１２】本発明はさらに、本明細書に記載される北
米ＰＲＲＳウィルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、
又はウィルスベクターを含んで成るワクチンの調製方法
を提供し、ここで前記方法は、有効量の本発明の北米Ｐ
ＲＲＳウィルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド又はウ
ィルスベクターと、医薬的又は獣医学的使用のために許
容できるキャリヤーとを組合すことを含んで成る。用語
“本発明の北米ＰＲＲＳウィルス”及び同様の用語は、
特にことわらない限り、本明細書に記載される遺伝子的
に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスのいづれか、及び配
列番号１又はそれに対して相同の配列によりコードされ
る修飾されていない北米ＰＲＲＳウィルスを包含するこ
とが理解されるべきである。
【０１１３】Ｇ．北米ＰＲＲＳウィルスペプチドをコー
ドする単離されたポリヌクレオチド分子及びトランスフ
ェクトされた宿主細胞、及び機能的北米ＰＲＲＳビリオ
ンの製造方法：本発明はまた、北米ＰＲＲＳウィルスに
よりコードされるペプチドをコードする１又は複数のヌ
クレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチ
ド分子を提供し、ここで前記北米ＰＲＲＳウィルスのゲ
ノム配列は、配列番号１に対応するＲＮＡ分子と同じで
あるか又それに対して相同である。本明細書において使
用される場合、用語“北米ＰＲＲＳウィルスペプチド”
とは、北米ＰＲＲＳウィルスにより発現されるペプチド
を意味する。そのようなペプチドは、北米ＰＲＲＳウィ
ルスに対して特異的であるが、しかし必ずしも必要では
ない。
【０１１４】好ましい態様においては、北米ＰＲＲＳウ
ィルスペプチドをコードする本発明の単離されたポリヌ
クレオチド分子は、配列番号２，３，４，５，６，７，
８，９、及び前記配列のいづれかに対して相同の配列か
ら独立して選択された配列を含んで成る。そのような単
離されたポリヌクレオチド分子は、プラスミドにおい
て、及び北米ＰＲＲＳウィルスによりコードされるペプ
チドをコードする１又は複数のヌクレオチド配列を含ん
で成る“ヘルパー”細胞を創造するために適切な宿主細
胞をトランスフェクトするためのウィルスベクターを調
製するために有用であり、ここで前記北米ＰＲＲＳウィ
ルスのゲノム配列は配列番号１に対応するＲＮＡ配列と
同じであるか又はそれに対して相同であり、前記ヘルパ
ー細胞は本発明の遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
ィルスの機能的ビリオンの調製において有用であり、前
記ウィルスは、それらがヘルパー細胞によりコードされ
るペプチドをコードする配列をそれらのＲＮＡゲノムか
らミッシングするよう、上記のようにして遺伝子的に修
飾されている。
【０１１５】従って、本発明はまた、北米ＰＲＲＳウィ
ルスによりコードされるペプチドをコードする１又は複
数のヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド及びウィ
ルスベクターを包含し、ここで前記北米ＰＲＲＳウィル
スのゲノム配列は配列番号１に対応するＲＮＡ配列と同
じであるか、又はそれに対して相同である。本発明のそ
のようなプラスミドは、北米ＰＲＲＳウィルスをコード
するヌクレオチド配列を含んで成るプラスミドの調製の
ために有用な上記のそれらのプラスミドに基づかれてい
る。本発明のそのようなウィルスベクターは、たとえば
レトロウィルスベクター又はアデノ−関連ウィルスベク
ターに基づかれ得る。それらのプラスミド及びウィルス
ベクターは、前記ヘルパー細胞の調製のために有用であ
る。
【０１１６】従って、本発明はまた、ヘルパー細胞、す
なわち北米ＰＲＲＳウィルスによりコードされるペプチ
ドをコードする１又は複数のヌクレオチド配列を含んで
成るトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、ここで
前記北米ＰＲＲＳウィルスのゲノム配列は配列番号１に
対応するＲＮＡ配列と同じであるか又はそれに対して相
同である。好ましい態様においては、そのトランスフェ
クトされた宿主細胞は配列番号２，３，４，５，６，
７，８，９、及び前記配列のいづれかに対して相同の配
列から独立して選択されたヌクレオチド配列を含んで成
る。それらのヘルパー細胞は、遺伝子的に修飾された北
米ＰＲＲＳウィルスの機能的ビリオンが細胞により生成
され得るように、ヘルパー細胞によりコードされるペプ
チドをコードする配列に欠失する感染性ＲＮＡ分子を完
全にするためのペプチドを供給するために有用である。
【０１１７】本発明のこの観点のための適切な細胞は、
北米ＰＲＲＳウィルスを発現するために適切である上記
細胞、たとえばブタ肺胞マクロファージ細胞及びＭＡＲ
Ｃ−１４５細胞を包含する。しかしながら、実質的にい
づれの哺乳類又は鳥類細胞でも使用され得る。上記で論
ぜられたように、ＰＲＲＳビリオンによる再感染でき、
そして従って遺伝子的に修飾された機能的北米ＰＲＲＳ
ビリオンの複数世代を生成できるトランスフェクトされ
た宿主細胞を得ることが所望される場合、ブタ肺胞マク
ロファージ細胞及びMARC-145細胞が好ましい。
【０１１８】従って、さらに本発明は、１又は複数のペ
プチドコード配列を無能にする１又は複数の突然変異を
含んで成る、配列番号１又はそれに対して相同の配列に
対応するＲＮＡ配列によりコードされる遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳウィルスの機能的ビリオンを生成す
るための方法を提供し、ここで前記方法は、遺伝子的修
飾された北米ＰＲＲＳウィルスをコードする、感染性分
子、プラスミド又はウィルスベクターにより前記ヘルパ
ー細胞をトランスフェクトすることを含んで成り、ここ
で前記ヘルパー細胞は遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲ
Ｓウィルスの無能化されたペプチドコード配列の北米Ｐ
ＲＲＳウィルスペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含んで成る。
【０１１９】本発明はさらに、１又は複数のペプチドコ
ード配列に１又は複数の突然変異を含んで成る、配列番
号１又はそれに対して相同の配列に対応するＲＮＡ配列
によりコードされる遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳ
ウィルスの機能的ビリオンを生成するための方法を提供
し、ここで前記方法は、遺伝子的に修飾された北米ＰＲ
ＲＳウィルスをコードする、感染性ＲＮＡ分子、プラス
ミド又はウィルスベクター、及び修飾された北米ＰＲＲ
Ｓウィルスの突然変異誘発されたペプチドコード配列の
北米ＰＲＲＳウィルスペプチドを細胞において発現する
ヘルパーウィルスの両者により適切な細胞をトランスフ
ェクトし、そしてヘルパーウィルスから遺伝子的に修飾
された北米ＰＲＲＳビリオンを分離することを含んで成
る。
【０１２０】分離の方法は、当業界において知られてお
り、そして発現された北米ＰＲＲＳウィルスが殺されな
い一定の条件下でヘルパーウィルスを区別する（殺す）
条件的致死ヘルパーウィルスの使用を包含する。他の既
知の分離方法は、ヘルパービリオン及び北米ＰＲＲＳビ
リオンの両者の発現に続いての物理的分離方法、たとえ
ば密度グラジェント遠心分離を包含する。本発明のこの
方法のための適切な細胞は、ＰＲＲＳウィルスにより感
染することができる細胞、たとえばブタ肺胞マクロファ
ージ細胞及びMARC-145細胞を包含する。ＰＲＲＳウィル
スにより感染され得他の細胞は、本明細書において前で
記載されており、たとえばMA-104細胞系、又はそれに由
来する他の細胞系を包含する。ヘルパーウィルスの例
は、ＰＲＲＳウィルス、好ましくは北米ＰＲＲＳウィル
ス単離物、たとえばＰ１２９である。ＰＲＲＳペプチド
を発現する、野生型、単離された又は組換えのいづれか
のウィルスがヘルパーウィルスとして使用され得る。
【０１２１】遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィル
スの機能的ビリオンを生成するための上記方法のいづれ
かにおいて有用な遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
ィルスをコードする、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド及
びウィルスベクターは、本明細書に記載されるそれらの
感染性ＲＮＡ分子、プラスミド及びウィルスベクターで
ある。
【０１２２】Ｈ．遺伝子的に修飾された免疫保護性ニド
ビラレスウィルス及びそれらを含んで成るワクチン：本
発明はさらに、遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィ
ルスによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において免
疫保護を誘発することができるそれらの遺伝子的に修飾
されたニドビラレスウィルスを提供し、ここで前記遺伝
子的に修飾されたニドビラレスウィルスは、野生型ニド
ビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子を得、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレ
スによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発する
ことができる遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィル
スをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配
列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得る
ために野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を遺伝子的に突然変
異誘発し、そしてそのようにして得られた、単離された
ポリヌクレオチド分子から前記遺伝子的に修飾されたニ
ドビラレスウィルスを発現することによって調製され
る。
【０１２３】本発明はさらに、遺伝子的に修飾されたニ
ドビラレスウィルスによりワクチン接種された哺乳類又
は鳥において免疫保護を誘発することができるそれらの
遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを調製する
ための方法を提供し、ここで前記方法は野生型ニドビラ
レスウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードす
るＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド
分子を得、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスに
よる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発すること
ができる遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを
コードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を
含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得るため
に野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮ
Ａ分子をコードするＤＮＡ配列を遺伝子的に突然変異誘
発し、そしてそのようにして得られた、単離されたポリ
ヌクレオチド分子から前記遺伝子的に修飾されたニドビ
ラレスウィルスを発現することを含んで成る。
【０１２４】ニドビラレスウィルスをコードする感染性
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列は、北米ＰＲＲＳウ
ィルスをコードする、本明細書に記載される配列番号１
と同じか又はそれに対して相同であるＤＮＡ配列を包含
する。北米ＰＲＲＳウィルス以外のニドビラレスウィル
スをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配
列は、当業界において知られており、そして既知源、た
とえば上記遺伝子データベースから得られる。
【０１２５】本発明に使用され得るニドビラレスウィル
スをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするいくつか
のＤＮＡ配列の他の例は、Meulenberg, J.J.M., など.,
1993 、前記に記載される、欧州ＰＲＲＳウィルスをコ
ードするＤＮＡ配列；van Dinten, L.D., など., 1997,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (3) : 991-6 に記載
される、ウマ動脈炎ウィルスをコードするＤＮＡ配列；
及びden Boon, J.A.,など., 1991, J. Virol. 65 (6) :
2910-20 に記載される、ウマ動脈炎ウィルスをコード
するＤＮＡ配列を包含する（前記文献は引用により本明
細書中に組込まれる）。本発明の手段により遺伝子的に
修飾され得るニドビラレスウィルスは、コードＤＮＡ配
列が得られるいづれかのニドビラレスウィルスであり得
る。ニドビラレスウィルスのいくつかの例は、本明細書
の前のセクションに記載されている。
【０１２６】ニドビラレスウィルスをコードする感染性
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列が得られると、ニド
ビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオ
チド分子、たとえばプラスミドが、上記組換え技法を用
いて合成され得る。
【０１２７】ニドビラレスウィルスをコードする感染性
ＲＮＡ分子をコードする配列は、遺伝子修飾、たとえば
それらにより感染された動物において疾病を引き起こす
無能性、動物において免疫保護応答を誘発することがで
きる異種抗原性エピトープの包含、検出できる異種抗原
性エピトープの包含、及び検出できる抗原性エピトープ
の欠失を含んで成るニドビラレスを得るために、北米Ｐ
ＲＲＳウィルスについて記載されるようにして遺伝子的
に突然変異誘発され得る。そのような遺伝子修飾は上記
に記載される。遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィ
ルスをコードするための遺伝子突然変異は、ニドビラレ
スウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードする
ＤＮＡ配列のコード及び／又は非コード領域において生
じ得る。１つの態様においては、１又は複数の遺伝子突
然変異が、ニドビラレスウィルスのウィルスペプチドを
コードするＯＲＦにおいて生じる。
【０１２８】“野生型ニドビラレスウィルス”とは、本
明細書において使用される場合、そのゲノムが意図的
に、遺伝子突然変異誘発されていないニドビラレスウィ
ルス、たとえば天然において存在するニドビラレスウィ
ルス及びその単離物を意味する。本発明はさらに、ニド
ビラレスウィルスによる感染から哺乳類又は鳥を保護す
るためのワクチンを提供し、ここで前記ワクチンは、上
記の遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを、そ
れによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において野生
型ニドビラレスウィルスに対して効果的な免疫保護応答
を誘発するのに効果的な量で、医薬的に又は獣医学的使
用のために許容できるキャリヤーを含んで成る。本発明
のそれらのワクチンは、上記ワクチンを配合するための
技法を用いて配合され得る。次の例は本発明の観点を例
示するに過ぎない。それらは本明細書に記載される本発
明を制限するものではない。
【０１２９】
【実施例】例１．北米ＰＲＲＳウィルス単離物の感染性
ｃＤＮＡクローンの調製 ＰＲＲＳウィルス及びMARC-145細胞の源 ：P129と称する
北米ＰＲＲＳウィルス単離物を、Drs. Gregory W. Stev
enson, William G. Van Alstine,及びCharles L. Kanit
z of Purdne University's Animal Disease Diagnostic
Laboratory in West Lafayette, Indianaから得た。P1
29ウィルスを、重度のＰＲＲＳ大発生を経験した南イン
ディアナにおけるブタ集団から１９９５年、秋に最初に
単離した。この農場は、ＰＲＲＳ問題又はＰＲＲＳワク
チン接種のこれまでの歴史を有さなかった。
【０１３０】P129単離物は、それが若いブタにおいてよ
り重度で且つより一貫した呼吸疾患を生成することにお
いて、同じ時期及び地理学的領域からのいくつかの他の
フィールド単離物よりも毒性であった。このウィルスを
最初に、一次ブタ肺胞マクロファージ（天然の宿主細
胞）に基づいて単離し、そして続いて、MARC-145細胞
（Kim, H.S. など., 1993, Arch. Virol. 133 : 477-48
3)に基づいて継代した。P129の構造タンパク質をコード
する遺伝子は、対応する既知の北米ＰＲＲＳ遺伝子配列
に対して相同であることが見出された。
【０１３１】ＰＲＲＳウィルスを増殖するために使用さ
れたMARC-145細胞系は、MA-104 Rhesus Macaqne Monkey
Kidney 細胞系のクローンである。MARC-145細胞をUSDA
のNational Veterinary Servlces Laboratories (NVSL,
Ames, Iowa)から得た。それらの細胞は試験され、そし
てマイコプラズマ及び通常のブタ異質剤に対して陰性で
あることが見出されている。MARC-145細胞を、２％のウ
シ胎児血清及び抗体を含むOpti MEM（Life Technologie
s Inc.) において３７℃で通常通りに増殖する。
【０１３２】５つの生物学的クローンを、P129ウィルス
ストックからプラーク精製し、そしてそれらを P129A〜
P129E と命名した。プラーク精製を、P129ウィルスによ
りMARC-145細胞の単層を感染せしめ、１．２５％のSeaP
laque アガロース（FMC BioProducts)、２％ウシ胎児血
清、及び抗生物質を含むOptiMEM のオーバーレイを添加
することによって実施した。５つの十分に単離されたプ
ラークが取られ、そして新鮮なMARC-145単層上で継代さ
れる場合、７日間のインキュベーション後、透明になっ
た。細胞障害効果（ウィルス誘発された細胞の死）が明
らかになったなら、それらの培養物の個々からの子孫ウ
ィルスをプラーク精製にゆだねた。５つのクローンの個
々からの１つの十分に単離されたプラークを取り、そし
て拡張し、大きなストックを生成した。
【０１３３】５つのクローンを若いブタにおいてビルレ
ンスについて、それぞれ（クローンＡ及びＥ）、又は組
合して（クローンＢ−Ｄ又はクローンＡ−Ｅ）、試験し
た。すべての場合、プラーク精製されたウィルスは、ブ
タにおいて十分に複製し、そして臨床学的疾病を引き起
こした。臨床学的徴候の重症度は、すべての５つのクロ
ーンが一緒に使用される場合でさえ、クローン化されて
いないP129ウィルスにより引き起こされるその重症度よ
りも低かった。P129A を配列決定のために選択し、そし
て続く分子操作に使用した。
【０１３４】P129A のゲノム配列の決定：プラーク精製
されたウィルスP129A を、ブタからの１０連続的継代
（２つのプラーク精製及び１つの続く継代を包含する）
の後、配列決定のために使用した。配列番号１は、P129
A ＲＮＡゲノムに対応するｃＤＮＡ配列を示す。ゲノム
は、ATGACGTAで開始し、そしてCCGCAATTで終結する、長
さ15,395のヌクレオチドである（ポリアデノシン末端を
除外する）。５５個の残基の典型的なポリアデノシン末
端はまた、配列番号１に提供される。
【０１３５】ゲノムの３’側２０％を含んで成る、P129
A の構造遺伝子（ＯＲＦ２〜７）のために、種々のＰＣ
Ｒプライマーを、公開されたＤＮＡ配列データベースGe
nBank から入手できる他の北米ＰＲＲＳウィルス単離物
（たとえばPRU00153) のいくつかの部分ＤＮＡ配列に基
づいて選択した。精製されたウィルスＲＮＡを、逆転写
酵素及びランダムヘキサマープライマーを用いてｃＤＮ
Ａ中に逆転写した。次に、このｃＤＮＡを、遺伝子−特
異的プライマーと共にＰＣＲに使用した。ＰＣＲ生成物
をゲルから切り出し、そしてＴ／ＡをプラスミドpCR2.1
(Invitrogen)中にクローン化した。
【０１３６】個々のプライマー対のために、複数のプラ
スミド（独立したＰＣＲ反応からの）を、ＤＮＡ配列決
定した。配列を、Lasergene パッケージ（DNASTAR, In
c.)からのSeqmanプログラムを用いてアセンブリーし
た。これは、P129A ゲノムの位置11,992〜15,347の配列
の完結を可能にした。また、GenBank データベースにお
いては、ＰＲＲＳウィルスのいくつかの単離物のORF1b
遺伝子の一部を含んで成る一連の短い配列（合計約２１
８個のヌクレオチド）が存在する。それらの１つ（PPSS
EQB)を用いて、次のＰＣＲプライマーを企画した：位置
9063−9080に対応する前方向5'-ACAGTTTGGTGATCTATG-3'
（配列番号１０）；位置9252−9268に対応する逆方向5'
-CAGATTCAGATGTTCAA-3' （配列番号１１）。
【０１３７】それらは、P129A ORF1b 遺伝子からの新規
配列の１７１個のヌクレオチドを含み、位置9081〜9251
に対応する２０６個のヌクレオチドフラグメントを増幅
した。新規前方向プライマーをこの領域内で企画し（5'
-ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3'（配列番号１２）、位置
9201−9224）、そして適合するプライマーをORF2のすぐ
上流のORF1b 内で企画した（5'-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAA
TGA-3'（配列番号１３）、位置12,027−12,050）。それ
らのプライマーを、P129A ゲノムの位置9201−12,050に
対応する、ORF1b の２８５０個のヌクレオチドフラグメ
ントを増幅するためにRT-PCRに使用した。
【０１３８】ＰＲＲＳウィルスのもう１つの北米フィー
ルド単離物のORF5のRT-PCR増幅の間、予測されるサイズ
よりも小さなマイナーなバンドが見られた。これを配列
決定し、そしてLelystadウィルスのORF1a と限定された
相同性（誤ったプライミングに起因する）を有すること
を見出した。この領域内の次の新規プライマーを選択
し、P129A を増幅した（位置1587−1610に対応する前方
向5'-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3'（配列番号１４）；
位置1877−1897に対応する逆方向5'-AGAGCGGCTGGGATGAC
ACTG-3' （配列番号１５）。３１１個のヌクレオチドの
生成物（位置1611−1876に対応するプライマー間の新規
P129A 配列の２６６個のヌクレオチド）の他に、７０１
個のヌクレオチドの大きなマイマーＰＣＲ生成物をクロ
ーン化し、そして配列決定した（位置1611−2264に対応
するプライマー間の新規P129A 配列の６５６個のヌクレ
オチド）。より大きなバンドは、位置2265−2269での逆
方向プライマーの誤ったプライミングに起因する。
【０１３９】P129A のゲノムの最５’末端を、市販のキ
ット（Life Technologies Inc.) を用いて、5'RACE（ｃ
ＤＮＡ末端の急速な増幅）により決定した。次の２種の
逆方向プライマーを、既知のＯＲＦ１の配列内から選択
した：“RACE2 ”5'-CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3'（配列
番号１６）、位置1917−1938；及び“RACE3 ”5'-AGGGG
GAGCAAAGAAGGGGTCATC-3'（配列番号１７）、位置1733−
1756）。RACE2 を用いて、ｃＤＮＡ合成をプライムし、
そしてRACE3 をＰＣＲに使用した。その得られるＰＣＲ
生成物をクローン化し、そして配列決定した。２種の最
長生成物は、正確に同じ塩基（配列番号１における位置
１）で終結した。
【０１４０】ORF1a 及びORF1b における既知の配列間の
大きなギャップは、長いRT-PCRを用いて架橋された。次
の２種の新規プライマーを用いた：前方向5'-AGCACGCTC
TGGTGCAACTG-3'（配列番号１８）、位置1361−1380；逆
方向5'-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3' （配列番号１９）、位
置9420−9438）。得られる8078のヌクレオチドRT-PCR生
成物をクローン化し、そして配列決定した。
【０１４１】P129A のゲノムの最３’末端を、ウィルス
ＲＮＡの３’及び５’末端を一緒に連結し、そして連結
フラグメントを増幅するためにRT-PCRを用いることによ
って決定した。得られる連結フラグメントをクローン化
し、そして配列決定した。手短に言及すると、ペレット
化されたビリオンから抽出されたＲＮＡを、タバコ酸ピ
ロホスファターゼにより処理し（５’キャップ構造体を
除去するために）、次にＴ４ ＲＮＡリガーゼにより自
己連結せしめた（両者ともEpicentre Technologiesから
である）。使用されるプライマーは次のものであった：
5'-CGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3'（配列番号２０）（前方
向、位置15,218−15,239）、及び5'-CGGTAGGTTGGTTAACA
CATGAGTT-3' （配列番号２１）（逆方向、位置６５６−
６８０）又は5'-TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3' （配列番
号２２）（逆方向、位置３３７−３５９）のいづれか。
【０１４２】得られるすべてのクローンをゲノムの５’
末端で切断した（最とも完全なものは、５’ＲＡＣＥに
より示されるように、実際の５’末端の５７個のヌクレ
オチド内に達する）。しかしながら、２種のそれらのク
ローンは、ポリアデノシン末端（長さ４２及び５５のア
デノシン残基）を包含するゲノムの完全な３’末端を含
んだ。これは、配列番号１に示されるように、ポリＡ末
端を包含する、ＰＲＲＳ単離物P129A のｃＤＮＡ 15,4
50個の塩基のゲノムの配列決定を完結した。
【０１４３】P129A の十分な長さの感染性ｃＤＮＡクロ
ーンの創造：pT7P129Aと称する、P129A の十分な長さの
感染性ｃＤＮＡクローンを、４種のオーバーラップする
クローン化されたRT-PCR生成物からアセンブルした。４
種のRT-PCR生成物をまず、プラスミドpCR2.1中にＴ／Ａ
クローン化し、そしてＥ．コリ株DH5-α中にトランスフ
ェクトした。細菌コロニーをスクリーンし、そして“Ｔ
７→Ｍ１３”配向において予測されるサイズの挿入体を
含むそれらを、配列決定及び追加の操作のために選択し
た。
【０１４４】４種すべてのクローン化されたRT-PCR生成
物は、１又は複数の非サイレント突然変異（コードされ
たＯＲＦのアミノ酸配列の変化をもたらす配列番号１の
P129A のためのコンセンサスヌクレオチド配列からの偏
差）を含んだ。それらの非サイレント突然変異（ＯＲＦ
２における位置12,622で１つを除いて）を、他のクロー
ン化されRT-PCR生成物からのフラグメントをサブクロー
ニングすることによって修復した。それらの４種の修復
されたサブゲノムクローンを、段階的に、利用できる制
限部位を用いて、十分な長さのクローン中にアセンブル
した（図１を参照のこと）。pT7P129AにおけるP129A ゲ
ノムに対応するｃＤＮＡの５’及び３’末端を、Ｔ７プ
ロモーター及び適切な制限エンドヌクレアーゼ部位の付
加により修飾した。pT7P129Aの構成は、次に、より詳細
に記載されている。
【０１４５】上記のように5'-RACE により生成され、そ
してpCR2.1中にクローン化されるゲノム（位置１−175
6）の５’末端を、P129A ゲノムに対応するｃＤＮＡの
すぐ上流のＴ７プロモーター、及び後でのクローニング
のためのＰａｃＩ部位を含むよう修飾した。３−手段連
結を、このプラスミドの1216bpのDsuI−BseR1 フラグメ
ント（P129A の塩基２７−1242を含む）、同じプラスミ
ドの4407bpの BseRI−XbaIフラグメント（P129A の塩基
1243−1756、及びXbaI部位までの全プラスミドベクター
を含む）、及び次の合成二本鎖アダプター（配列番号２
３及び２４）を用いて実施した：
【０１４６】
【化１】
【０１４７】Ｔ７プロモーターからの予測される転写体
は、ウィルスゲノムの最初の“Ａ”のすぐ上流のプロモ
ーターからの単一の“Ｇ”残基を含む。位置1230で非サ
イレント突然変異（Ａ→Ｇ）を、906bp の AatII−SacI
I フラグメント（塩基 740−1645）を、もう１つのクロ
ーンの同じフラグメントにより置換することによって修
飾した。このプラスミドを、“pT7R3A-Z”として命名し
た。
【０１４８】上記8078個のヌクレオチドのＰＣＲ生成物
を用いて、P129A ゲノムの塩基1361−9438をカバーし
た。５８bpの欠失（位置2535−2592）、及び７つの非サ
イレント点突然変異を、他のクローン化されたRT-PCR生
成物からのフラグメントをサブクローニングすることに
より訂正し、プラスミド”pGAP10B-4 ”を生成した。こ
のプラスミドからの7837bpのBsu361−SpeIフラグメント
を、pT7R3A-2からの5482bpのBsu361-SpeI フラグメント
に連結した。その得られるプラスミド“pT7RG ”は、Ｔ
７プロモーターの後ろに、P129A ゲノムの最初の9438個
の塩基を含む。
【０１４９】上記ORF1b の2850個のヌクレオチドフラグ
メント（ゲノム位置9201−12,050）を訂正し、非サイレ
ント突然変異を修飾し、そして“p1B3A-2 ”として命名
した。このプラスミドの2682bpのNdeI−SpeIフラグメン
トを、pT7RG の13,249bpのNdeI−SpeIフラグメントに連
結し、P129A ゲノムの最初の12,050個の塩基を含むプラ
スミド“pT71A1B ”を生成した。
【０１５０】P129A ゲノムの第４及び最終フラグメント
は、３’非翻訳領域及びポリＡ末端の一部を含む、ＯＲ
Ｆ２〜７のRT-PCRにより誘導された。前方向プライマー
は、5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3' （配列番号２
５）（位置11,504−11,530)であり、そして逆方向プラ
イマーは、5'-GGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
AATTGCGGCCGCATGGTTCTCG-3' （配列番号２６）であっ
た。逆方向プライマーは、P129A ゲノムの最後の２２個
の塩基（位置15,374−15,395）、２１個の塩基のポリＡ
末端、NsiI部位（ATGCAT) 及びSwaI部位（ATTTAAAT) を
含む。非サイレント点突然変異及び単一の塩基欠失は、
他のクローンからのフラグメントをサブクローニングす
ることによって修飾された。位置12,622での追加の非サ
イレント点突然変異（Ａ→Ｇ）を、この段階で、非意図
的に導入した。
【０１５１】これは、ＯＲＦ２タンパク質のＣ−末端近
くでグルタミンからアルギニンへの変化をもたらす（オ
ーバーラップするＯＲＦ３に影響を及ぼさない、ＯＲＦ
２における２５６個のアミノ酸のアミノ酸残基１８
９）。この突然変異は、細胞培養物において又はブタに
おいて、ウィルス増殖に対して明白な影響を有さず、そ
して修飾されなかった。この突然変異は、ｃＤＮＡクロ
ーンに由来するウィルスと、親P129A 又は他のＰＲＲＳ
ウィルスによる可能性ある汚染とを区別するための遺伝
子マーカーとして作用した。このプラスミドは、“p2-7
D-4 ”として命名された。P129A の構造遺伝子を、pT71
A1B の16,635bpのEco47III−SpeIフラグメントに、p2-7
D-4 の3678bpのEco47III−SpeIフラグメントを連結する
ことによって、ゲノムの残りに付加した。
【０１５２】これは、ユニーク制限酵素部位（PacI及び
SwaI）間のpCR2.1ベクター中にクローン化された、Ｔ７
プロモーターの後のP129A の全ゲノム（しかしながら、
５５個の塩基のポリＡ末端と対照的にわずか２１個の塩
基のポリＡ末端を有する）に対してほとんど同一的に対
応するｃＤＮＡを含んで成る最終構造体“pT7P129A”を
生成する。pT7P129Aの合計の長さは、19,313bpであり、
そしてそれはＥ．コリ株DH5-αにおいて安定する。
【０１５３】pT7P129Aは、グルタミン（配列番号１によ
りコードされるような）よりもむしろＯＲＦ２の位置１
８９でのアルギニンをもたらす位置12,622でのＡ→Ｇ非
サイレント点突然変異、及び位置１５５９でのサイレン
トＣ→Ｔ突然変異を含む。それらの突然変異のいづれ
も、細胞培養物及びブタの両者において試験された条件
下でのウィルス増殖に影響を及ぼさなかった。たとえ
ば、pT7P129Aは、インビトロ転写のために使用され、そ
してその得られるＲＮＡ転写体は、MARC-145細胞中にト
ランスフェクトされる場合、生存北米ＰＲＲＳウィルス
を生成し、従って、この十分な長さのクローンが感染性
であることを示す。
【０１５４】ＲＮＡ転写体のインビトロ転写及びトラン
スフェクション：プラスミドpT7P129Aにおいては、ウィ
ルスゲノムの上流にタンデムに２種のＴ７プロモーター
が存在する。それらの１つは、ウィルスゲノムのすぐ上
流に位置し、そして上記のようにしてＰＣＲプライマー
中に構築された。他の１つは、ｐＣＲ２．１クローニン
グベクターに存在し、そして複数のクローニング部位の
外側に位置する（ウィルスゲノムの４４塩基上流で転写
を開始する）。
【０１５５】インビトロ転写の前、ＰａｃＩを用いて、
それらのＴ７プロモーター間を切断し、真のウィルスＲ
ＮＡにより接近した転写体を生成した（遠位Ｔ７プロモ
ーターからの４４個の特別な塩基に対立するものとし
て、ウィルスゲノムのすぐ上流の単一の特別な塩基）。
さらに、pT7P129Aを、インビトロ転写の前、ＳｗａＩに
より切断した。その得られる転写体は、２１個の塩基の
長さのポリＡ末端及び９個の非−ＰＲＲＳヌクレオチ
ド、たとえばNsiI部位（その部位はまた、ウィルスゲノ
ムにおいて１度、生じているので、プラスミドを線状化
するために使用されなかった）を包含する。消化された
プラスミドを、使用の前、フェノール抽出及びエタノー
ル沈殿により精製した。
【０１５６】市販のキット（T7 Cap-Scribe, Boehringe
r Mannheim) を、インビトロ転写のために使用した。約
０．６μｇのPacI／SwaI消化されたpT7P129Aを含む上記
からのＤＮＡペレットを、２０μｌのT7 Cap-Scribe 緩
衝液／Ｔ７ポリメラーゼに再懸濁し、そして３７℃で３
０分間インキュベートした。反応の一部を、アガロース
ゲル電気泳動により分析し、そして15,445bp及び3868bp
の予測されるＤＮＡバンドの他に、十分な長さのＲＮＡ
転写体を含むことを示した。このインビトロ転写反応
は、精製しないで、インキュベーションに続いてすぐに
新たに使用された。
【０１５７】MARC-145細胞の集密的単層をOptiMEM （血
清を含まない）により１度洗浄し、そして５００μｇ／
mlのＤＥＡＥデキストラン（約500,000 の分子量、Phar
macia Biotech)を含むOptiMEM （血清を含まない）１ml
（３５mmのウェル当たり）により被覆した。インビトロ
転写反応物（１５ml）をすぐに添加した。３７℃で１時
間後、トランスフェクション混合物を除去し、単層細胞
をＰＢＳにより１度、洗浄し、そして２％ウシ胎児血清
及び抗生物質を含むOptiMEM 中１．２５％のSeaPlaque
アガロース（FMC Corporation)により被覆した。３７℃
で５日後、単一のプラークが認識できた。このウィルス
を“rP129A-1”として命名し、そしてMARC-145細胞上で
拡張し、そして細胞培養物及びブタにおいて特徴づけ
た。ＤＥＡＥデキストラン及びエレクトロポレーション
の両者を用いての、pT7P129Aからのインビトロ転写され
たＲＮＡの続くトランスフェクションは、多くの追加の
プラークを生成した。
【０１５８】組換えウィルスrP129A-1の特性決定：ｃＤ
ＮＡ−由来の組換えウィルスrP129A-1とその非組換え親
P129A との間で、増殖運動学、収率又はプラーク形態学
における明らかな差異は存在しない。上記で論ぜられた
ように、pT7P129Aのコード配列とP129A のコンセンサス
配列（配列番号１に示される）との間でヌクレオチド配
列における２つの差異が存在する。最初に、位置1559
で、pT7P129AはＴを含み、そしてP129A はＣを含む（こ
れはサイレント突然変異である）。
【０１５９】第２に、位置12,622で、pT7P129AはＧを含
み、そしてP129A はＡを含む（これは、上記ＯＲＦ２に
おけるグルタミンからアルギニンへの変化である）。rP
129A-1が実際、非組換えＰＲＲＳウィルス汚染物である
可能性を除外するために、RT-PCR及び配列決定を、それ
らの２つの差異を取り囲む領域に対して実施した。両遺
伝子マーカーの場合、rP129A-1は、プラスミドpT7P129A
と同一であり、そして親ウィルスP129A とは異なってお
り、従って、rP129A-1が感染性ｃＤＮＡクローンに由来
することを確かめた。
【０１６０】ブタにおける組換えウィルスrP129A-1の特
性決定：ｃＤＮＡ−由来のウィルスrP129A-1を、若いブ
タにおいて臨床学的疾病を引き起こすその能力につい
て、その非組換え親P129A と比較した。ＰＲＲＳ−陰性
群からのそれぞれ１０匹のブタの３つのグループを、生
後４週目で、P129A 又はrP129A-1により感染せしめ、又
は細胞培養培地により凝似−感染せしめた。臨床学的徴
候、腸温度及び体重をモニターした。血液を、血清ウィ
ルス血症（MARC-145細胞に対するプラークアッセイ、図
２）及び血清抗体（IDEXX からのHerdChek PRRS を用い
てのELISA による、図３）の決定のために、感染後、
０，２，６，１０、及び１３日で採血した。肺の全体の
及び顕微鏡的病変が検死に基づいて観察された。２種の
ウィルス感染されたグループ間で有意な差異は存在せ
ず、このことは、rP129A-1がブタにおいて複製し、そし
てその非組換え親ウィルスに定量的及び定性的に類似す
る臨床学的疾病を引き起こすことを示す。
【０１６１】例II．北米ＰＲＲＳウィルスからのORF7
（ヌクレオカプシド遺伝子）の欠失；負に標識された複
製−欠失ワクチンのそれによる調製 ウィルスヌクレオカプシド遺伝子（ORF7）を、本発明の
ＰＲＲＳウィルスの感染性ｃＤＮＡから部分的に欠失せ
しめた。その得られる修飾された組換えPRRSウィルス
は、ブタにおいて複製−欠失することが予測される。こ
の修飾された組換えＰＲＲＳウィルスは、臨床学的疾
病、ワクチン接種されていない動物への広がり、又は弱
毒化された生存ワクチンに関連する毒性への転換の危険
性を伴わないで、他のＰＲＲＳウィルスタンパク質に対
する免疫応答を誘発するためのワクチンとして使用され
得る。
【０１６２】非常に安全である他に、そのようなワクチ
ンウィルスはまた、ワクチンウィルスに対する抗体の存
在においてさえ、ＰＲＲＳウィルスのフィールド単離物
への暴露の血清学的決定を可能にする点において、“負
に標識される”。ORF7タンパク質に対する抗体は通常、
ＰＲＲＳウィルス感染されたブタの血清に見出される
が、ところがORF7−欠失されたPRRSV によりワクチン接
種されたブタはORF7タンパク質に対する抗体を欠いてい
る。
【０１６３】感染性クローンからのORF7の欠失は、次の
ようにして達成された：プラスミドp2-7D-4 （図１を参
照のこと）を、ORF7の上流及び下流の５’及び３’フラ
ンキング領域を増幅するためにＰＣＲにおいて鋳型とし
て使用した。前記上流フランキング前方向プライマー
（5'-ATTAGATCTTGCCACCATGGTGGGGAAATGCTTGAC-3'（配列
番号２７）（ORF5の開始近くのゲノム位置13,776−13,7
91に結合し、そして現クローニングに無関係である追加
の反応部位を含む）、及び上流フランキング逆方向プラ
イマー5'-CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGG
TTTAC-3'（配列番号２８）（ORF6及び７の連結部でゲノ
ム位置14,857−14,902に結合する）は、1147bpのフラグ
メントを増幅した。逆方向プライマーは、MluI及びAflI
I 部位及び位置14,874での単一の塩基変化を導入し、こ
の変化は、オーバーラップするＯＲＦ６にコードされる
チロシンを変更しないでORF7のためのＡＴＧ開始コドン
を破壊する。
【０１６４】下流フランキングに関しては、前方向プラ
イマー5'-CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3' （配列
番号２９）（MluI部位を導入された、ORF7の５’末端近
くの位置14,884−14,914）及び逆方向プライマー5'-GCG
CGTTGGCCGATTCATTA-3'（配列番号３０）（pCR2.1プラス
ミドにおけるウィルスゲノムの下流）は、４６２bpのフ
ラグメントを増幅した。３−手段連結を、上流フランキ
ングＰＣＲ生成物の６１１bpのBstEII−MluIフラグメン
ト、下流フランキングＰＣＲ生成物の５７５bpのMluI−
SpeIフラグメント、及びプラスミドp2-7D delta7+7023
からの6653bpのBstEII−SpeIフラグメントを用いて実施
した（すべてのフラグメントは、消化に続いて、ゲル精
製された）。得られるプラスミドp2-7D delta7+7023
は、ORF7の始めの７個のアミノ酸を欠失され、そして機
能的ＡＴＧ開始コドンを欠く。ウィルスゲノム及びプラ
スミド主鎖において不在である２つの新規制限部位AflI
I 及びMluIが、ORF7の５’末端によりこれまで支配され
ていた空間中への外来性遺伝子の直接的なクローニング
を促進するために挿入されている。
【０１６５】p2-7D デルタ7+7023において行なわれる変
化が、p2-7D delta7+7023 の3683bpのEco47III−SpeIフ
ラグメントとpCMV-S-p129 の15,214bpのEco47III−SpeI
フラグメントとを連結することによって、十分な長さの
ゲノムクローン中に組込まれた。その得られるプラスミ
ドpCMV-S-p129delta7+7023が、細胞をトランスフェクト
するために使用された。
【０１６６】ヌクレオカプシドはウィルス増殖のために
必須であるので、ORF7−欠失ＰＲＲＳウィルスの生成及
び複製を可能にするために、このタンパク質を供給する
ことが必要である。これは、たとえばヘルパーウィルス
又は相補的細胞系を用いて達成され得る。ORF7−発現MA
RC-145細胞系は、P129A からのORF7遺伝子及びネオマイ
シン耐性遺伝子の両者を含むプラスミドにより細胞を安
定してトランスフェクトすることによって創造され得
た。抗生物質G418を用いてネオマイシン耐性について選
択した後、単一細胞コロニーを拡張し、そして特徴づけ
た。免疫螢光及びRT-PCRの両者によるORF7発現のために
陽性であるクローンMARC-145−由来の細胞系を、ORF7−
欠失P129A ウィルスを生成するために、pT7P129delta7
からのＲＮＡによりトランスフェクトした。
【０１６７】類似する手段を用いて、他の構造遺伝子
（ORF ２，３，４，５又は６）を欠いているか、又は非
構造遺伝子１ａ及び１ｂのすべて又は一部を欠いている
ＰＲＲＳウィルスを生成することができる。さらに、複
数の欠失を単一のＰＲＲＳウィルス中に構築し、そして
それらを、すべての必要な機能を提供する相補的細胞に
おいて増殖することができる。そのような遺伝子−欠失
ＰＲＲＳウィルスはたぶん、ブタにおいて、部分的に又
は完全に弱毒化され、ＰＲＲＳに対するワクチンとして
それを有用にする。それらはまた、上記で論ぜられたよ
うに、及び／又は他のブタ病原体のエピトープにより動
物にワクチン接種するためのワクチンとして、ワクチン
接種された動物と野生型ＰＲＲＳウィルスにより感染さ
れた動物とを区別するために使用され得る（下記例III
を参照のこと）。
【０１６８】例III ．北米ＰＲＲＳウィルスゲノム中へ
の異種遺伝子の挿入；ベクターとしてのＰＲＲＳウィル
スの使用、及び正しく標識された北米ＰＲＲＳウィルス 上記例IIにおいては、AflII 及びMluI制限酵素部位が、
ORF7の５’末端によりこれまで支配されている領域中に
挿入された。それらの部位は、P129A ゲノムにおいて、
及びpCR2.1及びpCMVプラスミドにおいて不在であり、そ
して発現のためにウィルスゲノム中への外来性（異種）
遺伝子の直接的なクローニングに使用され得る。位置1
4,744−14,749（ATAACC) 及び14,858−14,863（TAAACC)
でのORF7サブゲノムＲＮＡの転写のための可能性ある
リーダー連結部位は、ORF7コード肺胞の欠失により影響
されず、そして外来性遺伝子の転写において機能するこ
とができる。
【０１６９】外来性（異種）遺伝子は、他のＰＲＲＳウ
ィルス単離物又は遺伝子型からの遺伝子、及び／又は他
の非ＰＲＲＳ病原体、すなわちブタを感染する病原体又
はブタ以外の哺乳類又は鳥を感染する病原体のいづれか
からの遺伝子を含むことができる。さらに、それらの外
来性遺伝子（又はその一部）は、ブタにおいて通常、見
出されない抗原性エピトープを供給することができる。
そのようなエピトープは、ワクチンを“陽性標識する”
ために使用され得、その結果、好結果のワクチン接種
が、ＰＲＲＳウィルスのフィールド又は従来のワクチン
株に対する抗体の存在下でさえ、血清学的にモニターさ
れ得る。正のマーカーは、別の発現カセットを必要とし
ない。抗原性エピトープは、ＰＲＲＳウィルスの構造遺
伝子に融合され得る。たとえば、上記例Ｉに記載される
上流フランキング逆方向プライマーは、ＯＲＦ６膜タン
パク質への非ＰＲＲＳウィルス抗原エピトープのカルボ
キシル−末端融合を付加するような手段で拡張され得
る。ブタにおいてのこのエピトープに対する抗体の存在
は、好結果のワクチン接種を示す。
【０１７０】例IV．細胞中へのｃＤＮＡの直接的トラン
スフェクションによるＰＲＲＳウィルスの細胞性発現 真核発現ベクターpCMV-MC1（配列番号３１）は、NotI,
EcoRV, AvrII, BglII,ClaI, KpnI, PacI, NheI, SwaI,
SmaI, SpeI 及びNotI部位を含むリンカーにより、２つ
のNotI部位間のLacZコード配列を置換することによっ
て、市販のプラスミドpCMVbeta (Clontech) から誘導さ
れた。ヒトＣＭＶ即時初期プロモーターの修飾を、SacI
とpCMV-MC1の第２NotI部位との間の配列を合成リンカー
（下記に示される）により置換することによって達成し
た。
【０１７１】前記リンカーは、PacI, SpeIに続いて、Sa
cIのための半分の部位、及びＮｏｔＩのための半分の部
位を含む。２本の一本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリ
ングの後、リンカーを、SacIとNotI部位との間のpCMV-M
C1中にクローン化し、そして選択されたクローンをpCMV
-S1 として命名した。pCMV-S1 のSpeI部位は、たぶん、
オリゴ配列における誤りのために、切断されなかった。
従って、pCMV-S1 におけるPacIとHindIII との間のフラ
グメントを、pCMV-MC1からのPacI（位置８７７での）−
HindIII （位置1162での）フラグメントにより置換し
た。従って、SpeI部位が再び得られた。この最終構造体
（pCMV-S) を用いて、十分な長さのP129ゲノムをクロー
ン化した。
【０１７２】
【化２】
【０１７３】P129ゲノムの５’末端のすぐ上流の配列を
修飾し、適切なスペーシング及び便利な制限酵素部位
（PacI）を含むようにした。これは、pT7P129 からの増
幅のための適切なＰＣＲプライマー（配列番号３４及び
３５）を消化することによって行なわれた。PacI及びAa
tII による消化の後、このＰＣＲフラグメントを、pT7R
G のPacI及びAatII 部位中にサブクローン化した（図
１）。得られるプラスミドをpT7RG-deltaT7 と命名し
た。
【０１７４】最終構成は、PacI及びNdeI部位でpT7RG-de
ltaT7 からのウィルス配列をpT7P129 中にサブクローニ
ングし、pT7P129-deltaT7 を創造することによって完結
した。十分な長さのP129ゲノムをPacI及びSpeIでpT7P12
9-deltaT7 から消化し、そしてPacI及びSpeI部位で、pC
MV-S中にトランスファーした。この構造体を、pCMV-S-P
129 と命名した。pCMV-S-P129 におけるＣＭＶプロモー
ターTATAボックスとP129配列の５’末端との間の修飾の
領域の配列は、配列番号３６で示され、そして下記に図
的に示される：
【０１７５】
【化３】
【０１７６】細胞におけるＰＲＲＳウィルス感染を開始
するためのＣＭＶプロモーターの使用を試験するため
に、pCMV-S-P129 プラスミドＤＮＡ（０．５又は１．０
μｇ）を、 LipofectamineTM（Life Technologies In
c.) を用いて、リポフェクションによりMARC-145細胞中
にトランスフェクトした。ＰＲＲＳウィルス特異的細胞
障害効果を、トランスフェクションの後に観察し、そし
てＰＲＲＳウィルス抗原の存在を免疫螢光抗体試験によ
り決定した。
【０１７７】ＰＲＲＳウィルスをpCMV-S-P129 から効果
的に生成し、そしてその子孫ウィルスを、MARC-145細胞
上で継代した。これは、ＰＲＲＳウィルス感染が、イン
ビトロ転写段階を伴わないで、ＰＲＲＳウィルスをコー
ドするプラスミドｃＤＮＡから直接的に開始され得るこ
とを示す。さらに、pCMV-S-P129 は、pCMVプロモーター
の３’末端が北米ＰＲＲＳウィルスをコードする配列の
開始の直前に存在しないプラスミドに比較して、多量の
子孫ウィルスを生成した。
【０１７８】例Ｖ．北米ＰＲＲＳウィルスからのORF4の
欠失；それによる複製−欠失ワクチンの調製 膜糖タンパク質をコードする、ORF4のための遺伝子の一
部を、本発明のＰＲＲＳウィルスの感染性ｃＤＮＡクロ
ーンから欠失せしめた。その得られる修飾された組換え
ＰＲＲＳウィルスは、ブタにおいて複製−欠失性であ
り、そして臨床学的疾病、ワクチン接種されていない動
物への広がり、又は弱毒化された生存ワクチンに関連す
る毒性への転換の危険性を伴わないで、他のＰＲＲＳウ
ィルスタンパク質に対する免疫応答を誘発することが予
測される。
【０１７９】感染性クローンからのORF4の欠失は、次の
ようにして達成された：プラスミドp2-7D-4 （図１を参
照のこと）を、ORF4の上流及び下流の５’及び３’フラ
ンキング領域を増幅するためにＰＣＲにおいて鋳型とし
て使用した。前記上流フランキング前方向プライマー
は、AGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCCTT
CT-3' （配列番号３７）であった。このプライマーは、
ORF4の開始近くの位置 13194−13241 でゲノムに結合
し、そしてORF3のオーバーラップするアミノ酸配列を変
更しないで、ORF4のＡＴＧ開始コドンを破壊する突然変
異を位置13225 で導入する。
【０１８０】前記上流フランキング逆方向プライマー
は、5'-TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-3'（配列番号
３８）であった。このプライマーは、ORF3の下流のORF4
コード領域内の位置 13455−13477 でゲノムに結合し、
そしてAflII 部位を導入する。下流フランキング領域に
関しては、前方向プライマーは、5'-CTTCTTAAGTCCACGCG
TTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCT-3'（配列番号３９）であ
った。このプライマーは、ORF4の中間において位置 135
20−13545 でゲノムに結合し、そして外来性遺伝子の直
接的なクローニングのためのAflII 及びMluI部位を導入
する。逆方向プライマーは、5'-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT3'
（配列番号４０）であった。このプライマーは、ＯＲＦ
７コード配列において位置 14981−14999 でゲノムに結
合する。
【０１８１】３−手段連結を、上流フランキングＰＣＲ
生成物のSalI−AflII フラグメント、下流フランキング
ＰＣＲ生成物の AflII−BstEIIフラグメント、及びプラ
スミドp2-7D-4 からのSalI−BstEIIフラグメントを用い
て実施した。その得られるp2-7D-4delta4Nは、欠失され
たORF4の中央部分の４２個の塩基を有し、そして１５個
の人工的クローニング部位により置換した。前記クロー
ニング部位は、ウィルスゲノム及びプラスミド主鎖の両
者を欠いている２つの制限部位（AflII 及びMluI）を含
む。それらは、ORF4によりこれまで支配されていた空間
中への外来性遺伝子の直接的なクローニングを促進する
ために使用され得る。クローニング部位はまた、ORF4と
オープンリーディングフレームを整合して存在し、そし
て機能的ORF4タンパク質が生成されないことを確実にす
る停止コドン（TAA)を含む。
【０１８２】ORF4コード配列のより広範な欠失が、下流
のORF5エンベロープ遺伝子の発現を妨げないで行なわれ
得ることが見出された。この場合、より短い下流のフラ
ンキング領域が、同じ鋳型及び逆方向プライマー、及び
逆方向プライマー5'-GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3'
（配列番号４１）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。こ
のプライマーは、ORF4の３’末端近くの位置 13654−13
669 でゲノムに結合し、そしてAflII 部位を含む。下流
フランキングＰＣＲ生成物の AflII−BstEIIフラグメン
トとプラスミドp2-7D-4delta4Nからの AflII−BstEIIフ
ラグメントとの間の２−手段連結は、新規プラスミドp2
-7D-4delta4NS を生成した。このプラスミドは、欠失さ
れ、そして１５個の塩基のクローニング部位により置換
されたORF4クローニング配列の１７６個の塩基を有す
る。
【０１８３】p2-7D-4delta4N及びp2-7D delta4NSにおい
て行なわれた変化は、p2-7D-4delta4N及びp2-7D-4delta
4NS からの修飾された BsrGI−SpeIフラグメントによ
り、pCMV-S-P129 からの BsrGI−SpeIフラグメントを置
換することによって、十分な長さのゲノムクローン中に
組込まれた。その得られるプラスミドpCMV-S-P129delta
4N及びpCMV-S-P129delta4NS は、細胞をトランスフェク
トするために使用された。
【０１８４】pCMV-S-P129 に比較して、プラスミドpCMV
-S-P129delta4N又はpCMV-S-P129delta4NS によるMARC-1
45細胞の感染はウィルスプラーク又は螢光集中をもたら
さなかった。個々のトランスフェクトされた細胞は、OR
F7ヌクレオカプシドタンパク質を生成することが見出さ
れており、このことは、ORF4生成物がウィルス遺伝子の
ＲＮＡ複製又は発現のために必要とされないが、しかし
感染性子孫ウィルスの開放のためには必須であることを
示唆する。ORF4の欠失はウィルス複製に対して致死的で
あるので、このタンパク質を供給する必要はない。これ
は、相補的細胞系を用いることによって達成され得る。
【０１８５】本発明者は、ORF4及びネオマイシン耐性遺
伝子の両者を含むプラスミドにより細胞を安定してトラ
ンスフェクトすることによって、ORF4−発現MARC-145細
胞系を創造した。抗生物質G418を用いてのネオマイシン
耐性に対する選択の後、単一の細胞コロニーを拡張し、
そして特徴づけた。pCMV-S-P129delta4NS による感染の
後、３種のORF4−発現細胞クローンは、それらの細胞に
おいて増殖するが、しかしMARC-145細胞においては増殖
しない生存ウィルスを生成した。それらの１つであるMA
RC400E9 をさらに特徴づけた。プラスミドpCMV-S-P129d
elta4NS によりトランスフェクトされたMARC400E9 細胞
におけるウィルスヌクレオカプシドについての免疫螢光
染色は、陽性であった。
【０１８６】例VI．外来性遺伝子の発現のためのベクタ
ーとしての遺伝子−欠失されたＰＲＲＳウィルスの使用 異種遺伝子が遺伝子−欠失されたＰＲＲＳウィルスから
発現され得るかどうかを決定するために、本発明者は、
プラスミドpCMV-S-P129delta4NにおけるORF4欠失の部位
中に緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）のコピーを挿入し
た。ＧＦＰ遺伝子を、前記遺伝子の５’末端でAflII 部
位及び前記遺伝子の３’末端でMluI部位を導入されたＰ
ＣＲプライマーを用いて、市販のプラスミドから増幅し
た。得られるプラスミドpCMV-S-P129delta4N-GFPを用い
て、MARC-145及びMARC400E9 細胞をトランスフェクトし
た。
【０１８７】予測されるように、MARC-145細胞はORF4−
欠失ウィルスの複製を支持しなかった。一次トランスフ
ェクションに起因する単一緑色細胞をＵＶ範囲下で観察
し、ＧＦＰが発現されたが、しかしウィルスは隣接する
細胞には広がらず、そしてＣＰＥは観察されなかったこ
とが示された。対照的に、高い緑色集中が、トランスフ
ェクトされたMARC400E9 細胞に観察された。単層細胞を
破壊する目に見えるプラークが形成し、そして出現し
た。それらの結果は、外来性遺伝子がORF4−欠失ＰＲＲ
Ｓウィルスから発現され、そして６９２個の塩基（４．
５％）によるウィルスゲノムのサイズの上昇が感染性粒
子中へのウィルスＲＮＡのパッケージングを妨げないこ
とを示す。
【０１８８】例VII ．外来性遺伝子の発現のためのベク
ターとしての遺伝子−コンピテントＰＲＲＳウィルスの
使用 異種遺伝子が複製−コンピテントＰＲＲＳウィルスから
発現され得るかどうかを決定するために、本発明者は、
ORF1b とORF2との間の領域中にＧＦＰのコピーを挿入し
た。ORF2のためのリーダー／連結（Ｌ／Ｊ）配列はORF1
b 内に存在するので、このＬ／Ｊ配列を用いて、ＧＦＰ
遺伝子の発現を駆動し、そしてORF6 L/J配列のコピー
を、ORF2の発現を駆動するためにＧＦＰから下流に挿入
した。
【０１８９】プラスミドp2-7D-4 （図１を参照のこと）
を、挿入部位の上流及び下流の５’及び３’フランキン
グ領域を増幅するためにＰＣＲにおいて鋳型として使用
した。上流のフランキング前方向プライマーは、5'-AAC
AGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3' （配列番号４２）であった。
このプライマーは、ORF1b において位置 11699−11721
でゲノムに結合する。上流のフランキング逆方向プライ
マーは、5'-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAA
AGTTGGTTCA-3' （配列番号４３）であった。このプライ
マーは、ORF1b において位置 12031−12055 でゲノムに
結合し、そしてORF1b とORF2との間に、外来性遺伝子の
直接的なクローニングのためのAflII 及びMluI部位を付
加する。
【０１９０】下流のフランキング前方向プライマーは、
5'-GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA
CAATGAAATGGGGTCTATACAAAGCCTCTTCGACA-3'（配列番号４
４）であった。このプライマーは、ORF2において位置 1
2056−12089 でゲノムに結合し、そしてMluI部位、続い
て、ORF6の開始の先に存在する４０個の塩基（ORF6 L/J
配列を含む）を含む。下流のフランキング逆方向プライ
マーは、5'-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3'（配列番号
４５）であった。このプライマーは、ＯＲＦ５における
位置 13819−13844 でのゲノムに結合する。
【０１９１】３−手段連結を、上流のフランキングＰＣ
Ｒ生成物のEco47III−MluIフラグメント、下流のフラン
キングＰＣＲ生成物からのMluI−BsrGI フラグメント、
及びpCMV-S-P129 からのEco47III−BsrGI フラグメント
を用いて実施した。その得られるプラスミドpCMV-S-P12
9-1bMCS2は、クローニング部位、及びORF1b とORF2との
間の追加のＬ／Ｊ部位と共に完全なP129ゲノムを含む。
このプラスミドは、MARC-145細胞中にトランスフェクト
される場合、機能的に正常なウィルスを生成する。
【０１９２】市販のプラスミドからのＧＦＰ遺伝子を、
前記遺伝子の５’末端にAflII 部位を、３’末端にMluI
部位を付加するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。Af
lII及びMluIによるＰＣＲフラグメント及びPCMV-SP129-
1bMCS2 の消化の後、その挿入体をベクター中に連結
し、プラスミドpCMV-SP129-1bMCS2 を生成した。このプ
ラスミドは、MARC-145細胞中にトランスフェクトされる
場合、緑色プラークを生成した。得られるウィルスをMA
RC-145細胞上で継代し、そしてＵＶ範囲下で観察される
場合、緑色プラークを生成し続けた。従って、外来性遺
伝子は、複製−コンピテントＰＲＲＳウィルスベクター
から発現され得る。P129-1bGFP2 ウィルスは、そのP129
親のゲノムよりも７７４塩基（５％）長いが、まだ通常
通りパッケージされるゲノムを含む。
【０１９３】生物学的材料の寄託 次の生物学的材料が、１９９８年１１月１９日、10801
University Blvd., Manassas, Virginia, 20110−2209
にあるAmerican Type Culture Collection (ATCC) に寄
託され、そして次の受託番号が割り当てられた：プラスミド 受託番号 プラスミドpT7P129A 203488 プラスミドpCMV-S-P129 203489 上記に引用されたすべての特許、特許出願及び出版物
は、引用により本明細書中に組込まれる。本発明は、本
発明の個々の観点の単一の例示として意図される、本明
細書に記載される特定の態様により発明の範囲を限定さ
れず、そして機能的に同等の方法及び成分は、本発明の
範囲内にある。実際、本明細書に示され、そして記載さ
れている修飾の他に、本発明の種々の修飾は当業者に明
らかである。そのような修飾は、本発明の範囲内にあ
る。
【０１９４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc. <120> AN INFECTIOUS cDNA CLONE OF NORTH AMERICAN PROCINE REPRODUCTIVE AN D RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) VIRUS AND USES THEREOF <130> PC10278A <140> N/A <141> 1998-12-22 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 2.0
【０１９５】 <210> 1 <211> 15450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA corresponding to North Am erican Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome (PRRS) Virus Genome . <400> 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60 ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120 gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180 cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240 ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300 tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360 tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420 ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480 gaatggtgcg ggttgcagct gagatttaca gagccggcca actcacccct gcagttttga 540 aggctctaca agtttatgaa cggggttgtc gctggtaccc cattgtcgga cctgtccctg 600 gagtggccgt tcacgccaac tccctacatg tgagtgacaa acctttcccg ggagcaactc 660 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ctgcatttcc gccattacca accggatggt gaattccaaa tttgaaacca 1560 ctcttcccga gagagtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggat cttgtgaata 1620 ccatccaaat cctcaggctc cccgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gctggcgcca 1680 agtacgtgct caagctggaa ggtgagcact ggaccgtctc tgtgacccct gggatgaccc 1740 cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gttgttgtga gcataagagc ggtcttggtt 1800 tcccagacgt ggtcgaagtt tccggatttg accctgcctg tcttgaccga cttgctgaga 1860 taatgcactt acctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgagatgtcc gacgacttca 1920 atcgtctggc ttccccggcc gccactgtgt ggactgtttc gcaattcttt gcccgccaca 1980 gaggaggaga gcatcctgac caggtgtgct tagggaaaat tatcaacctt tgtcaggtga 2040 ttgaggaatg ctgctgttcc cggaacaaag ccaaccgggc taccccggaa gaggttgcgg 2100 caaaagttga ccagtacctc cgtggtgcag caagccttgg agaatgcttg gccaagcttg 2160 agagggctcg cccgccgagc gcgatggaca cctcctttga ttggaatgtt gtgcttcctg 2220 gggttgagac ggcggatcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280 ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca gagactcggt ccctctgacc gccttctcgc 2340 tgtccaattg ctactaccct gcacaaggtg acgaggtccg tcaccgtgag aggctaaact 2400 ccgtgctctc taagttggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactggac 2460 ctggcccgcg acccgcactg ccgaacgggc tcgacgagct taaagaccag atggaggagg 2520 atctgctgaa attagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580 aggttgatct aaaagcttgg gtcaaaaatt acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 2640 caagagttca gcctcgaaaa acgaagtctg tcaagagctt gctagagaac aagcctgtcc 2700 ctgctccgcg caggaaggtc agatctgatt atggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760 ttcctaacgg ttgggaagat tcgactgttg gtggtcccct tgacctttcg gcaccatccg 2820 agccgatgac acctctgagt gagcctgtac ttatttccag gccagtgaca tctttgagtg 2880 tgccggcccc agttcctgca ccgcgtagag ctgtgtctcg accgatgacg ccctcgagtg 2940 agccaatttt tgtgtctgca ctgcgacaca aatttcagca ggtggaaaaa gcaaatctgg 3000 cggcagcagc gccgatgtac caggacgaac ccttagattt gtctgcatcc tcacagactg 3060 aatatggggc ttctccccta acaccaccgc agaacgtggg cattctggag gtaagggggc 3120 aagaagctga ggaagttctg agtgaaatct cggatattct gaatgatacc aaccctgcac 3180 ctgtgtcatc aagcagctcc ctgtcaagtg ttaggatcac acgcccaaaa tactcagctc 3240 aagccattat cgacttgggc gggccctgca gtgggcacct ccaaagggaa aaagaagcat 3300 gcctccgcat catgcgtgag gcttgtgatg cggccaagct tagtgaccct gccacgcagg 3360 aatggctttc tcgcatgtgg gatagggtgg acatgctgac ttggcgcaac acgtctgctt 3420 accaggcgtt tcgcacctta gatggcaggt ttgggtttct cccaaagatg atactcgaga 3480 cgccgccgcc ctacccgtgt gggtttgtga tgttgcctca cacccctgca ccttccgtga 3540 gtgcagagag cgaccttacc atcggttcag tcgccactga agatattcca cgcatcctcg 3600 ggaaaataga aaataccggt gagatgatca accagggacc cttggcatcc tctgaggaag 3660 aaccggtata caaccaacct gccaaagact cccggatatc gtcgcggggg tctgacgaga 3720 gcacagcagc tccgtccgca ggtacaggtg gcgccggctt atttactgat ttgccacctt 3780 cagacggcgt agatgcggac ggtggggggc cgttgcagac ggtaagaaag aaagctgaaa 3840 ggctcttcga ccaattgagc cgtcaggttt ttaacctcgt ctcccatctc cctgttttct 3900 tctcacacct cttcaaatct gacagtggtt attctccggg tgattggggt tttgcagctt 3960 ttactctatt ttgcctcttt ttgtgttaca gctacccatt cttcggtttc gttcccctct 4020 tgggtgtatt ttctgggtct tctcggcgtg tgcgcatggg ggtttttggc tgctggctgg 4080 cttttgctgt tggcctgttc aagcctgtgt ccgacccagt cggcactgct tgtgagtttg 4140 actcgccaga gtgtaggaac gtccttcatt cttttgagct tctcaaacct tgggaccctg 4200 ttcgcagcct tgttgtgggc cccgtcggtc tcggtcttgc cattcttggc aggttactgg 4260 gcggggcacg ctacatctgg cattttttgc ttaggcttgg cattgttgca gattgtatct 4320 tggctggagc ttatgtgctt tctcaaggta ggtgtaaaaa gtgctgggga tcttgtataa 4380 gaactgctcc taatgaaatc gccttcaacg tgttcccttt tacacgtgcg accaggtcgt 4440 cactcatcga cctgtgcgat cggttttgtg cgccaaaagg catggacccc attttcctcg 4500 ccactgggtg gcgtgggtgc tggaccggcc gaagtcccat tgagcaaccc tctgaaaaac 4560 ccatcgcgtt cgcccagttg gatgaaaaga ggattacggc tagaactgtg gtcgctcagc 4620 cttatgatcc taatcaagcc gtaaagtgct tgcgggtgtt acaggcgggt ggggcgatgg 4680 tggccgaggc agtcccaaaa gtggtcaaag tttctgctat tccattccga gccccctttt 4740 ttcccaccgg agtgaaagtt gatcccgagt gcaggatcgt ggtcgacccc gatactttta 4800 ctacagccct ccggtctggt tactctacca caaacctcgt ccttggtgtg ggggactttg 4860 cccagctgaa tggactaaag atcaggcaaa tttccaagcc ttcgggagga ggcccacacc 4920 tcattgctgc cctgcatgtt gcctgctcga tggcgttgca catgcttgct ggggtttatg 4980 taacttcagt ggggtcttgc ggtgccggca ccaacgatcc atggtgcact aatccgtttg 5040 ccgttcctgg ctacggacca ggctctctct gcacgtccag attgtgcatc tcccaacatg 5100 gccttaccct gcccttgaca gcacttgtgg cgggattcgg tcttcaggaa atcgccttgg 5160 tcgttttgat tttcgtttcc atcggaggca tggctcatag gttgagttgt aaggctgata 5220 tgctgtgcat cttacttgca atcgccagct atgtttgggt accccttacc tggttgcttt 5280 gtgtgtttcc ttgttggttg cgctggttct ctttgcaccc cctcaccatc ctatggttgg 5340 tgtttttctt gatttctgta aatatgcctt cgggaatctt ggccgtggtg ttattggttt 5400 ctctttggct tttgggacgt tatactaaca ttgctggtct tgtcaccccc tatgatattc 5460 atcattacac cagtggcccc cgcggtgttg ccgccttagc taccgcacca gatggaacct 5520 acttggctgc cgtccgccgc gctgcgttga ctggtcgcac catgctgttc accccgtctc 5580 agcttgggtc ccttcttgag ggcgctttca gaactcgaaa gccctcactg aacaccgtca 5640 atgtggttgg gtcctccatg ggctctggtg gagtgttcac catcgacggg aaaattaggt 5700 gcgtgactgc cgcacatgtc cttacgggta attcggctag ggtttccgga gtcggcttca 5760 atcaaatgct tgactttgat gtgaaagggg acttcgccat agctgattgc ccgaattggc 5820 aaggagctgc tcccaagacc caattctgcg aggatggatg ggctggccgt gcctattggc 5880 tgacatcctc tggcgtcgaa cccggtgtta ttgggaatgg attcgccttc tgcttcaccg 5940 cgtgcggcga ttccgggtcc ccagtgatca ccgaagctgg tgagcttgtc ggcgttcaca 6000 caggatcaaa taaacaagga ggtggcatcg tcacgcgccc ttcaggccag ttttgtaacg 6060 tggcacccat caagctgagc gaattaagtg aattctttgc tggacccaag gtcccgctcg 6120 gtgatgtgaa ggttggcagc cacataatta aagatacgtg cgaagtacct tcagatcttt 6180 gcgccttgct tgctgccaaa cctgaactgg agggaggcct ctccaccgtc caacttctgt 6240 gtgtgttttt cctactgtgg agaatgatgg gacatgcctg gacgcccttg gttgctgtgg 6300 ggtttttcat tctgaatgag gttctcccag ctgtcctggt tcggagtgtt ttctcctttg 6360 ggatgtttgt gctatcttgg ctcacaccat ggtctgcgca agttctgatg atcaggcttc 6420 taacagcagc tcttaacagg aacagatggt cacttgcctt ttacagcctt ggtgcggtga 6480 ccggttttgt cgcagatctt gcggcaactc aagggcaccc gttgcaggca gtaatgaatt 6540 tgagcaccta tgccttcctg cctcggatga tggttgtgac ctcaccagtc ccagtgattg 6600 cgtgtggtgt tgtgcaccta cttgccatca ttttgtactt gttcaagtac cgcggcctgc 6660 acaatgttct tgttggtgat ggagcgtttt ctgcagcttt cttcttgcga tactttgccg 6720 agggaaagtt gagggaaggg gtgtcgcaat cctgcggaat gaatcatgag tcattaactg 6780 gtgccctcgc tatgagactc aatgacgagg acttggactt ccttacgaaa tggactgatt 6840 ttaagtgctt tgtttctgcg tccaacatga ggaatgcagc aggccaattc atcgaggctg 6900 cctatgcaaa agcacttaga attgaacttg cccagttggt gcaggttgat aaggttcgag 6960 gtactttggc caagcttgag gcttttgctg ataccgtggc accccaactc tcgcccggtg 7020 acattgttgt tgctcttggc catacgcctg ttggcagcat cttcgaccta aaggttggtg 7080 gtaccaagca tactctccaa gtcattgaga ccagagtcct tgccgggtcc aaaatgaccg 7140 tggcgcgcgt cgttgaccca acccccacgc ccccacccgc acccgtgccc atccccctcc 7200 caccgaaagt tctagagaat ggtcccaacg cctgggggga tggggaccgt ttgaataaga 7260 agaagaggcg taggatggaa accgtcggca tctttgtcat gggtgggaag aagtaccaga 7320 aattttggga caagaattcc ggtgatgtgt tttacgagga ggtccatgac aacacagatg 7380 cgtgggagtg cctcagagtt ggtgaccctg ccgactttga ccctgagaag ggaactctgt 7440 gtgggcatac tactattgaa gataaggatt acaaagtcta cgcctcccca tctggcaaga 7500 agttcctggt ccccgtcaac tcagagagcg gaagagccca atgggaagct gcaaagcttt 7560 ccgtggagca ggcccttggc atgatgaatg tcgacggtga actgacggcc aaagaagtgg 7620 agaaactgaa aagaataatt gacaaacttc agggcctgac taaggagcag tgtttaaact 7680 gctagccgcc agcggcttga cccgctgtgg tcgcggcggc ttggttgtta ctgagacagc 7740 ggtaaaaata gtcaaatttc acaaccggac tttcacccta gggcctgtga atttaaaagt 7800 ggccagtgag gttgagctga aagacgcggt cgagcacaac caacacccgg ttgcaagacc 7860 ggttgacggt ggtgttgtgc tcctgcgttc cgcagttcct tcgcttatag atgtcctgat 7920 ctccggtgct gacgcatctc ctaagttact cgctcgtcac gggccgggga acactgggat 7980 cgatggcacg ctttgggact ttgaggccga ggccaccaaa gaggaaattg cactcagtgc 8040 gcaaataata caggcttgtg acattaggcg cggcgacgca cctgaaattg gtctccctta 8100 caagctgtac cctgttaggg gcaaccctga gcgggtaaaa ggagttttac agaatacaag 8160 gtttggagac ataccttaca aaacccccag tgacactgga agcccagtgc acgcggctgc 8220 ctgcctcacg cccaatgcca ctccggtgac tgatgggcgc tctgtcttgg ctactaccat 8280 gccctccggt tttgaattgt atgtaccgac cattccagcg tctgtccttg attatcttga 8340 ctctaggcct gactgcccca aacagttgac agagcacggc tgtgaggatg ccgcattgag 8400 agacctctcc aagtatgact tgtccaccca aggctttgtt ttacctgggg ttcttcgcct 8460 tgtgcgtaag tacctgtttg cccatgtggg taagtgcccg cccgttcatc ggccttccac 8520 ttaccctgcc aagaattcta tggctggaat aaatgggaac aggtttccaa ccaaggacat 8580 tcagagcgtc cctgaaatcg acgttctgtg cgcacaggcc gtgcgagaaa actggcaaac 8640 tgttacccct tgtaccctca agaaacagta ttgtgggaag aagaagacta ggacaatact 8700 cggcaccaat aatttcattg cgttggccca ccgggcagcg ttgagtggtg tcacccaggg 8760 cttcatgaaa aaggcgttta actcgcccat cgccctcggg aaaaacaaat ttaaggagct 8820 acagactccg gtcttaggca ggtgccttga agctgatctt gcatcctgtg atcgatccac 8880 acctgcaatt gtccgctggt ttgccgccaa tcttctttat gaacttgcct gtgctgaaga 8940 gcacctaccg tcgtacgtgc tgaactgctg ccatgaccta ttggtcacgc agtccggcgc 9000 agtgactaag aggggtggcc tatcgtctgg cgacccgatc acttctgtgt ctaacaccat 9060 ttacagcttg gtgatatatg cacagcacat ggtgcttagt tactttaaaa gtggtcaccc 9120 tcatggcctt ctgttcctac aagaccagct gaagttcgag gacatgctca aagtccaacc 9180 cctgatcgtc tattcggacg acctcgtgct gtatgccgaa tctcccacca tgccgaacta 9240 ccactggtgg gtcgaacatc tgaatttgat gctgggtttt cagacggacc caaagaagac 9300 agccataacg gactcgccat catttctagg ctgtaggata ataaatggac gccagctagt 9360 ccccaaccgt gacaggatcc tcgcggccct cgcttaccat atgaaggcaa gcaatgtttc 9420 tgaatactac gccgcggcgg ctgcaatact catggacagc tgtgcttgtt tagagtatga 9480 tcctgaatgg tttgaagagc ttgtggttgg gatagcgcag tgcgcccgca aggacggcta 9540 cagctttccc ggcccgccgt tcttcttgtc catgtgggaa aaactcagat ccaatcatga 9600 ggggaagaag tccagaatgt gcgggtattg cggggccccg gctccgtacg ccactgcctg 9660 tggcctcgac gtctgtattt accacaccca cttccaccag cattgtccag tcataatctg 9720 gtgtggccac ccggctggtt ctggttcttg tagtgagtgc aaaccccccc tagggaaagg 9780 cacaagccct ctagatgagg tgttagaaca agtcccgtat aagcctccac ggactgtaat 9840 catgcatgtg gagcagggtc tcacccctct tgacccaggc agataccaga ctcgccgcgg 9900 attagtctcc gttaggcgtg gcatcagagg aaacgaagtt gacctaccag acggtgatta 9960 tgctagcacc gccctactcc ccacttgtaa agagatcaac atggtcgctg 10010 tcgcctctaa tgtgttgcgc agcaggttca tcatcggtcc gcccggtgct 10060 gggaaaacat actggctcct tcagcaggtc caggatggtg atgtcattta 10110 cacaccgact caccagacca tgctcgacat gattagggct ttggggacgt 10160 gccggttcaa cgtcccagca ggtacaacgc tgcaattccc tgccccctcc 10210 cgtaccggcc cgtgggttcg catcctggcc ggcggttggt gtcctggtaa 10260 gaattccttc ctggatgaag cagcgtattg taatcacctt gatgtcttga 10310 ggctccttag caaaaccacc cttacctgtc tgggagactt caaacaactc 10360 cacccagtgg gttttgattc tcattgctat gtttttgaca tcatgcctca 10410 gacccagttg aagaccatct ggagattcgg acagaacatc tgtgatgcca 10460 tccaaccaga ttacagggac aaacttgtgt ccatggtcaa cacaacccgt 10510 gtaacctaca tggaaaaacc tgtcaagtat gggcaagtcc tcacccctta 10560 ccacagggac cgagaggacg gcgccatcac aattgactcc agtcaaggcg 10610 ccacatttga tgtggttaca ctgcatttgc ccactaaaga ttcactcaac 10660 aggcaaagag cccttgttgc tatcaccagg gcaagacatg ctatctttgt 10710 gtatgaccca cacaggcaat tgcagagcat gtttgatctt cctgcgaagg 10760 gcacacccgt caacctcgca gtgcaccgtg atgagcagct gatcgtactg 10810 gatagaaata ataaagaatg cacagttgct caggctatag gcaacggaga 10860 taaattcagg gccaccgaca agcgcgttgt agattctctc cgcgccattt 10910 gtgctgatct ggaagggtcg agctccccgc tccccaaggt cgcacacaac 10960 ttgggatttt atttctcacc tgatttgaca cagtttgcta aactcccggt 11010 agaccttgca ccccactggc ccgtggtgac aacccagaac aatgaaaagt 11060 ggccggatcg gctggttgcc agccttcgcc ctgtccataa gtatagccgt 11110 gcgtgcattg gtgccggcta tatggtgggc ccctcggtgt ttctaggcac 11160 ccctggggtc gtgtcatact acctcacaaa atttgtcaag ggcgaggctc 11210 aagtgcttcc ggagacagtc ttcagcaccg gccgaattga ggtggattgc 11260 cgggagtatc ttgatgacag ggagcgagaa gttgctgagt ccctcccaca 11310 tgccttcatt ggcgacgtca aaggcaccac cgttggggga tgtcatcatg 11360 tcacctccaa ataccttccg cgcttccttc ccaaggaatc agtcgcggta 11410 gtcggggttt cgagccccgg gaaagccgca aaagcagtgt gcacattgac 11460 ggatgtgtac ctcccagacc ttgaggccta cctccaccca gagactcagt 11510 ctaagtgctg gaaagttatg ttggacttca aggaagttcg actgatggtc 11560 tggaaagaca agacggccta tttccaactt gaaggccgct atttcacctg 11610 gtatcagctt gcaagctacg cctcgtacat ccgtgttcct gtcaactcca 11660 cggtgtatct ggacccctgc atgggccctg ccctttgcaa cagaagagtt 11710 gtcgggtcca cccattgggg agctgacctc gcagtcaccc cttatgatta 11760 cggtgctaaa atcatcttgt ctagcgctta ccatggtgaa atgcctcctg 11810 gatacaagat tctggcgtgc gcggagttct cgctcgacga cccagtcaag 11860 tacaaacaca cctggggttt tgaatcggat acagcgtatc tgtatgagtt 11910 caccggaaac ggtgaggact gggaggatta caatgatgcg tttcgtgcgc 11960 gccagaaagg gaaaatttat aaggccactg ctaccagcat gaagttttat 12010 tttcccccgg gccccgtcat tgaaccaact ttaggcctga attgaaatga 12060 aatggggtct atacaaagcc tcttcgacaa aattggccag ctttttgtgg 12110 atgctttcac ggaatttttg gtgtccattg ttgatatcat catatttttg 12160 gccattttgt ttggcttcac catcgccggt tggctggtgg tcttttgcat 12210 cagattggtt tgctccgcgg tattccgtgc gcgccctgcc attcaccctg 12260 agcaattaca gaagatccta tgaggccttt ctttctcagt gccgggtgga 12310 cattcccacc tggggggtaa aacacccttt ggggatgttt tggcaccata 12360 aggtgtcaac cctgattgat gaaatggtgt cgcgtcgaat gtaccgcatc 12410 atggaaaaag cagggcaagc tgcctggaaa caggtggtga gcgaggctac 12460 gctgtctcgc attagtagtt tggatgtggt ggctcatttt caacatcttg 12510 ccgccattga agccgagacc tgtaaatatt tggcttctcg actgcccatg 12560 ctacacaacc tgcgcatgac agggtcaaat gtaaccatag tgtataatag 12610 cactttaaat caggtgtttg ctatttttcc aacccctggt tcccggccaa 12660 agcttcatga ttttcagcaa tggctaatag ctgtacattc ctccatattt 12710 tcctctgttg cagcttcttg tactcttttt gttgtgctgt ggttgcgggt 12760 tccaatgcta cgtactgttt ttggtttccg ctggttaggg gcaatttttc 12810 tttcgaactc atggtgaatt acacggtgtg tccaccttgc ctcacccgac 12860 aagcagccgc tgaggtcctt gaacccggta ggtctctttg gtgcaggata 12910 gggcatgacc gatgtgggga ggacgatcac gacgaactag ggttcatggt 12960 tccgcctggc ctctccagcg aaagccactt gaccagtgtt tacgcctggt 13010 tggcgttcct gtccttcagc tacacggccc agttccatcc cgagatattt 13060 gggataggga acgtgagtga agtttatgtt gacatcaagc accaattcat 13110 ctgcgccgtt catgacgggc agaacaccac cttgcctcgc catgacaata 13160 tttcagccgt atttcagacc tactatcaac atcaggtcga cggcggcaat 13210 tggtttcacc tagaatggct gcgtcccttc ttttcctctt ggttggtttt 13260 aaatgtttcg tggtttctca ggcgttcgcc tgcaagccat gtttcagttc 13310 gagtctttca gacatcaaaa ccaacactac cgcagcatca ggctttgttg 13360 tcctccagga catcagctgc cttaggcatg gcgactcgtc ctttccgacg 13410 attcgcaaaa gctctcaatg ccgcacggcg atagggacac ccgtgtatat 13460 caccatcaca gccaatgtga cagatgagaa ttacttacat tcttctgatc 13510 tcctcatgct ttcttcttgc cttttctatg cttctgagat gagtgaaaag 13560 ggattcaagg tggtgtttgg caatgtgtca ggcatcgtgg ctgtgtgtgt 13610 caactttacc agctacgtcc aacatgtcaa agagtttacc caacgctcct 13660 tggtggtcga tcatgtgcgg ctgcttcatt tcatgacacc tgagaccatg 13710 aggtgggcaa ccgttttagc ctgtcttttt gccatcctac tggcaatttg 13760 aatgttcaag tatgttgggg aaatgcttga ccgcgggctg ttgctcgcga 13810 ttgctttctt tgtggtgtat cgtgccgttc tgttttgctg tgctcggcag 13860 cgccaacagc agcagcagct ctcattttca gttgatttat aacttgacgc 13910 tatgtgagct gaatggcaca gattggctgg cagaaaaatt tgattgggca 13960 gtggagactt ttgtcatctt tcccgtgttg actcacattg 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gaaaagcctc gtgttgggtg gcagaaaagc tgttaaacag ggagtggtaa 14860 accttgtcaa atatgccaaa taacaacggc aagcagcaaa agaaaaagaa 14910 ggggaatggc cagccagtca atcagctgtg ccagatgctg ggtaaaatca 14960 tcgcccagca aaaccagtcc agaggcaagg gaccgggcaa gaaaagtaag 15010 aagaaaaacc cggagaagcc ccattttcct ctagcgaccg aagatgacgt 15060 caggcatcac ttcacccctg gtgagcggca attgtgtctg tcgtcgatcc 15110 agactgcctt taaccagggc gctggaactt gtaccctgtc agattcaggg 15160 aggataagtt acactgtgga gtttagtttg ccgacgcatc atactgtgcg 15210 cctgatccgc gtcacagcat caccctcagc atgatgggct ggcattcttt 15260 aggcacctca gtgtcagaat tggaagaatg tgtggtggat ggcactgatt 15310 gacattgtgc ctctaagtca cctattcaat tagggcgacc gtgtgggggt 15360 aaaatttaat tggcgagaac catgcggccg caattaaaaa aaaaaaaaaa 15410 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15450
【０１９６】 <210> 2 <211> 7494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 1a of North American PRRS Virus Genome. <400> 2 atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgc acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag 60 ggccaagtct actgcacacg atgtctcagt gcacggtctc tccttcctct gaatctccaa 120 gttcctgagc ttggggtgct gggcctattt tataggcccg aagagccact ccggtggacg 180 ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gggcctgctg gctttctgcg 240 atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aacctgaact ttcaacaaag aatggtgcgg 300 gttgcagctg agatttacag agccggccaa ctcacccctg cagttttgaa ggctctacaa 360 gtttatgaac ggggttgtcg ctggtacccc attgtcggac ctgtccctgg agtggccgtt 420 cacgccaact ccctacatgt gagtgacaaa cctttcccgg gagcaactca tgtgttaacc 480 aacctaccgc tcccgcagag gcccaagcct gaagactttt gcccttttga gtgtgctatg 540 gctgacgtct atgacattag ccatgacgcc gtcatgtatg tggccagagg gaaagtctcc 600 tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa tttgaaaccg tccccgaaga gttgaagttg 660 attgcgaacc gactccacat ctccttcccg ccccaccacg cagtggacat gtctgagttt 720 gccttcatag cccctgggag tggtgtctcc ttgcgggtcg agcaccaaca cggttgcctt 780 cccgctgata ctgtccctga agggaactgc tggtggtgct tgtttgactt gctcccaccg 840 gaagttcaga ataaagaaat tcgccgtgct aaccaatttg gctatcaaac caagcatggt 900 gtccctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gtctccgagc agtgactgat 960 acagatggac ctattgtcgt acagtacttc tctgttaggg agagttggat ccgccacttc 1020 agactggcgg aagaacctag cctccctggg tttgaagacc tcctcagaat aagggtagag 1080 cctaatacgt cgccattggg tggcaagggt gaaaaaatct tccggtttgg cagtcacaag 1140 tggtacggtg ctggaaagag agcaaggaga gcacgctctg gtgcaactgc cacggtcgct 1200 cactgcgctt tgcccgctcg cgaagcccag caggccaaga agctcgaggt tgccagcgcc 1260 aacagggctg agcatctcaa gtactattcc ccgcctgccg acgggaactg tggttggcac 1320 tgcatttccg ccattaccaa ccggatggtg aattccaaat ttgaaaccac tcttcccgag 1380 agagtgagac cttcagatga ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatac catccaaatc 1440 ctcaggctcc ccgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg ctggcgccaa gtacgtgctc 1500 aagctggaag gtgagcactg gaccgtctct gtgacccctg ggatgacccc ttctttgctc 1560 ccccttgaat gtgttcaggg ttgttgtgag cataagagcg gtcttggttt cccagacgtg 1620 gtcgaagttt ccggatttga ccctgcctgt cttgaccgac ttgctgagat aatgcactta 1680 cctagcagtg tcatcccagc tgctctggcc gagatgtccg acgacttcaa tcgtctggct 1740 tccccggccg ccactgtgtg gactgtttcg caattctttg cccgccacag aggaggagag 1800 catcctgacc aggtgtgctt agggaaaatt atcaaccttt gtcaggtgat tgaggaatgc 1860 tgctgttccc ggaacaaagc caaccgggct accccggaag aggttgcggc aaaagttgac 1920 cagtacctcc gtggtgcagc aagccttgga gaatgcttgg ccaagcttga gagggctcgc 1980 ccgccgagcg cgatggacac ctcctttgat tggaatgttg tgcttcctgg ggttgagacg 2040 gcggatcaga caaccaaaca gctccatgtc aaccagtgcc gcgctctggt tcctgtcgtg 2100 actcaagagc ctttggacag agactcggtc cctctgaccg ccttctcgct gtccaattgc 2160 tactaccctg cacaaggtga cgaggtccgt caccgtgaga ggctaaactc cgtgctctct 2220 aagttggagg gggttgttcg tgaggaatat gggctcacgc caactggacc tggcccgcga 2280 cccgcactgc cgaacgggct cgacgagctt aaagaccaga tggaggagga tctgctgaaa 2340 ttagtcaacg cccaggcaac ttcagaaatg atggcctggg cagccgagca ggttgatcta 2400 aaagcttggg tcaaaaatta cccacggtgg acaccgccac cccctccacc aagagttcag 2460 cctcgaaaaa cgaagtctgt caagagcttg ctagagaaca agcctgtccc tgctccgcgc 2520 aggaaggtca gatctgatta tggcagcccg attttgatgg gcgacaatgt tcctaacggt 2580 tgggaagatt cgactgttgg tggtcccctt gacctttcgg caccatccga gccgatgaca 2640 cctctgagtg agcctgtact tatttccagg ccagtgacat ctttgagtgt gccggcccca 2700 gttcctgcac cgcgtagagc tgtgtctcga ccgatgacgc cctcgagtga gccaattttt 2760 gtgtctgcac tgcgacacaa atttcagcag gtggaaaaag caaatctggc ggcagcagcg 2820 ccgatgtacc aggacgaacc cttagatttg tctgcatcct cacagactga atatggggct 2880 tctcccctaa caccaccgca gaacgtgggc attctggagg taagggggca agaagctgag 2940 gaagttctga gtgaaatctc ggatattctg aatgatacca accctgcacc tgtgtcatca 3000 agcagctccc tgtcaagtgt taggatcaca cgcccaaaat actcagctca agccattatc 3060 gacttgggcg ggccctgcag tgggcacctc caaagggaaa aagaagcatg cctccgcatc 3120 atgcgtgagg cttgtgatgc ggccaagctt agtgaccctg ccacgcagga atggctttct 3180 cgcatgtggg atagggtgga catgctgact tggcgcaaca cgtctgctta ccaggcgttt 3240 cgcaccttag atggcaggtt tgggtttctc ccaaagatga tactcgagac gccgccgccc 3300 tacccgtgtg ggtttgtgat gttgcctcac acccctgcac cttccgtgag tgcagagagc 3360 gaccttacca tcggttcagt cgccactgaa gatattccac gcatcctcgg gaaaatagaa 3420 aataccggtg agatgatcaa ccagggaccc ttggcatcct ctgaggaaga accggtatac 3480 aaccaacctg ccaaagactc ccggatatcg tcgcgggggt ctgacgagag cacagcagct 3540 ccgtccgcag gtacaggtgg cgccggctta tttactgatt tgccaccttc agacggcgta 3600 gatgcggacg gtggggggcc gttgcagacg gtaagaaaga aagctgaaag gctcttcgac 3660 caattgagcc gtcaggtttt taacctcgtc tcccatctcc ctgttttctt ctcacacctc 3720 ttcaaatctg acagtggtta ttctccgggt gattggggtt ttgcagcttt tactctattt 3780 tgcctctttt tgtgttacag ctacccattc ttcggtttcg ttcccctctt gggtgtattt 3840 tctgggtctt ctcggcgtgt gcgcatgggg gtttttggct gctggctggc ttttgctgtt 3900 ggcctgttca agcctgtgtc cgacccagtc ggcactgctt gtgagtttga ctcgccagag 3960 tgtaggaacg tccttcattc ttttgagctt ctcaaacctt gggaccctgt tcgcagcctt 4020 gttgtgggcc ccgtcggtct cggtcttgcc attcttggca ggttactggg cggggcacgc 4080 tacatctggc attttttgct taggcttggc attgttgcag attgtatctt ggctggagct 4140 tatgtgcttt ctcaaggtag gtgtaaaaag tgctggggat cttgtataag aactgctcct 4200 aatgaaatcg ccttcaacgt gttccctttt acacgtgcga ccaggtcgtc actcatcgac 4260 ctgtgcgatc ggttttgtgc gccaaaaggc atggacccca ttttcctcgc cactgggtgg 4320 cgtgggtgct ggaccggccg aagtcccatt gagcaaccct ctgaaaaacc catcgcgttc 4380 gcccagttgg atgaaaagag gattacggct agaactgtgg tcgctcagcc ttatgatcct 4440 aatcaagccg taaagtgctt gcgggtgtta caggcgggtg gggcgatggt ggccgaggca 4500 gtcccaaaag tggtcaaagt ttctgctatt ccattccgag cccccttttt tcccaccgga 4560 gtgaaagttg atcccgagtg caggatcgtg gtcgaccccg atacttttac tacagccctc 4620 cggtctggtt actctaccac aaacctcgtc cttggtgtgg gggactttgc ccagctgaat 4680 ggactaaaga tcaggcaaat ttccaagcct tcgggaggag gcccacacct cattgctgcc 4740 ctgcatgttg cctgctcgat ggcgttgcac atgcttgctg gggtttatgt aacttcagtg 4800 gggtcttgcg gtgccggcac caacgatcca tggtgcacta atccgtttgc cgttcctggc 4860 tacggaccag gctctctctg cacgtccaga ttgtgcatct cccaacatgg ccttaccctg 4920 cccttgacag cacttgtggc gggattcggt cttcaggaaa tcgccttggt cgttttgatt 4980 ttcgtttcca tcggaggcat ggctcatagg ttgagttgta aggctgatat gctgtgcatc 5040 ttacttgcaa tcgccagcta tgtttgggta ccccttacct ggttgctttg tgtgtttcct 5100 tgttggttgc gctggttctc tttgcacccc ctcaccatcc tatggttggt gtttttcttg 5160 atttctgtaa atatgccttc gggaatcttg gccgtggtgt tattggtttc tctttggctt 5220 ttgggacgtt atactaacat tgctggtctt gtcaccccct atgatattca tcattacacc 5280 agtggccccc gcggtgttgc cgccttagct accgcaccag atggaaccta cttggctgcc 5340 gtccgccgcg ctgcgttgac tggtcgcacc atgctgttca ccccgtctca gcttgggtcc 5400 cttcttgagg gcgctttcag aactcgaaag ccctcactga acaccgtcaa tgtggttggg 5460 tcctccatgg gctctggtgg agtgttcacc atcgacggga aaattaggtg cgtgactgcc 5520 gcacatgtcc ttacgggtaa ttcggctagg gtttccggag tcggcttcaa tcaaatgctt 5580 gactttgatg tgaaagggga cttcgccata gctgattgcc cgaattggca aggagctgct 5640 cccaagaccc aattctgcga ggatggatgg gctggccgtg cctattggct gacatcctct 5700 ggcgtcgaac ccggtgttat tgggaatgga ttcgccttct gcttcaccgc gtgcggcgat 5760 tccgggtccc cagtgatcac cgaagctggt gagcttgtcg gcgttcacac aggatcaaat 5820 aaacaaggag gtggcatcgt cacgcgccct tcaggccagt tttgtaacgt ggcacccatc 5880 aagctgagcg aattaagtga attctttgct ggacccaagg tcccgctcgg tgatgtgaag 5940 gttggcagcc acataattaa agatacgtgc gaagtacctt cagatctttg cgccttgctt 6000 gctgccaaac ctgaactgga gggaggcctc tccaccgtcc aacttctgtg tgtgtttttc 6060 ctactgtgga gaatgatggg acatgcctgg acgcccttgg ttgctgtggg gtttttcatt 6120 ctgaatgagg ttctcccagc tgtcctggtt cggagtgttt tctcctttgg gatgtttgtg 6180 ctatcttggc tcacaccatg gtctgcgcaa gttctgatga tcaggcttct aacagcagct 6240 cttaacagga acagatggtc acttgccttt tacagccttg gtgcggtgac cggttttgtc 6300 gcagatcttg cggcaactca agggcacccg ttgcaggcag taatgaattt gagcacctat 6360 gccttcctgc ctcggatgat ggttgtgacc tcaccagtcc cagtgattgc gtgtggtgtt 6420 gtgcacctac ttgccatcat tttgtacttg ttcaagtacc gcggcctgca caatgttctt 6480 gttggtgatg gagcgttttc tgcagctttc ttcttgcgat actttgccga gggaaagttg 6540 agggaagggg tgtcgcaatc ctgcggaatg aatcatgagt cattaactgg tgccctcgct 6600 atgagactca atgacgagga cttggacttc cttacgaaat ggactgattt taagtgcttt 6660 gtttctgcgt ccaacatgag gaatgcagca ggccaattca tcgaggctgc ctatgcaaaa 6720 gcacttagaa ttgaacttgc ccagttggtg caggttgata aggttcgagg tactttggcc 6780 aagcttgagg cttttgctga taccgtggca ccccaactct cgcccggtga cattgttgtt 6840 gctcttggcc atacgcctgt tggcagcatc ttcgacctaa aggttggtgg taccaagcat 6900 actctccaag tcattgagac cagagtcctt gccgggtcca aaatgaccgt ggcgcgcgtc 6960 gttgacccaa cccccacgcc cccacccgca cccgtgccca tccccctccc accgaaagtt 7020 ctagagaatg gtcccaacgc ctggggggat ggggaccgtt tgaataagaa gaagaggcgt 7080 aggatggaaa ccgtcggcat ctttgtcatg ggtgggaaga agtaccagaa attttgggac 7140 aagaattccg gtgatgtgtt ttacgaggag gtccatgaca acacagatgc gtgggagtgc 7200 ctcagagttg gtgaccctgc cgactttgac cctgagaagg gaactctgtg tgggcatact 7260 actattgaag ataaggatta caaagtctac gcctccccat ctggcaagaa gttcctggtc 7320 cccgtcaact cagagagcgg aagagcccaa tgggaagctg caaagctttc cgtggagcag 7380 gcccttggca tgatgaatgt cgacggtgaa ctgacggcca aagaagtgga gaaactgaaa 7440 agaataattg acaaacttca gggcctgact aaggagcagt gtttaaactg ctag 7494
【０１９７】 <210> 3 <211> 4392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 1b of North American PRRS Virus Genome. <400> 3 ggagcagtgt ttaaactgct agccgccagc ggcttgaccc gctgtggtcg cggcggcttg 60 gttgttactg agacagcggt aaaaatagtc aaatttcaca accggacttt caccctaggg 120 cctgtgaatt taaaagtggc cagtgaggtt gagctgaaag acgcggtcga gcacaaccaa 180 cacccggttg caagaccggt tgacggtggt gttgtgctcc tgcgttccgc agttccttcg 240 cttatagatg tcctgatctc cggtgctgac gcatctccta agttactcgc tcgtcacggg 300 ccggggaaca ctgggatcga tggcacgctt tgggactttg aggccgaggc caccaaagag 360 gaaattgcac tcagtgcgca aataatacag gcttgtgaca ttaggcgcgg cgacgcacct 420 gaaattggtc tcccttacaa gctgtaccct gttaggggca accctgagcg ggtaaaagga 480 gttttacaga atacaaggtt tggagacata ccttacaaaa cccccagtga cactggaagc 540 ccagtgcacg cggctgcctg cctcacgccc aatgccactc cggtgactga tgggcgctct 600 gtcttggcta ctaccatgcc ctccggtttt gaattgtatg taccgaccat tccagcgtct 660 gtccttgatt atcttgactc taggcctgac tgccccaaac agttgacaga gcacggctgt 720 gaggatgccg cattgagaga cctctccaag tatgacttgt ccacccaagg ctttgtttta 780 cctggggttc ttcgccttgt gcgtaagtac ctgtttgccc atgtgggtaa gtgcccgccc 840 gttcatcggc cttccactta ccctgccaag aattctatgg ctggaataaa tgggaacagg 900 tttccaacca aggacattca gagcgtccct gaaatcgacg ttctgtgcgc acaggccgtg 960 cgagaaaact ggcaaactgt taccccttgt accctcaaga aacagtattg tgggaagaag 1020 aagactagga caatactcgg caccaataat ttcattgcgt tggcccaccg ggcagcgttg 1080 agtggtgtca cccagggctt catgaaaaag gcgtttaact cgcccatcgc cctcgggaaa 1140 aacaaattta aggagctaca gactccggtc ttaggcaggt gccttgaagc tgatcttgca 1200 tcctgtgatc gatccacacc tgcaattgtc cgctggtttg ccgccaatct tctttatgaa 1260 cttgcctgtg ctgaagagca cctaccgtcg tacgtgctga actgctgcca tgacctattg 1320 gtcacgcagt ccggcgcagt gactaagagg ggtggcctat cgtctggcga cccgatcact 1380 tctgtgtcta acaccattta cagcttggtg atatatgcac agcacatggt gcttagttac 1440 tttaaaagtg gtcaccctca tggccttctg ttcctacaag accagctgaa gttcgaggac 1500 atgctcaaag tccaacccct gatcgtctat tcggacgacc tcgtgctgta tgccgaatct 1560 cccaccatgc cgaactacca ctggtgggtc gaacatctga atttgatgct gggttttcag 1620 acggacccaa agaagacagc cataacggac tcgccatcat ttctaggctg taggataata 1680 aatggacgcc agctagtccc caaccgtgac aggatcctcg cggccctcgc ttaccatatg 1740 aaggcaagca atgtttctga atactacgcc gcggcggctg caatactcat ggacagctgt 1800 gcttgtttag agtatgatcc tgaatggttt gaagagcttg tggttgggat agcgcagtgc 1860 gcccgcaagg acggctacag ctttcccggc ccgccgttct tcttgtccat gtgggaaaaa 1920 ctcagatcca atcatgaggg gaagaagtcc agaatgtgcg ggtattgcgg ggccccggct 1980 ccgtacgcca ctgcctgtgg cctcgacgtc tgtatttacc acacccactt ccaccagcat 2040 tgtccagtca taatctggtg tggccacccg gctggttctg gttcttgtag tgagtgcaaa 2100 ccccccctag ggaaaggcac aagccctcta gatgaggtgt tagaacaagt cccgtataag 2160 cctccacgga ctgtaatcat gcatgtggag cagggtctca cccctcttga cccaggcaga 2220 taccagactc gccgcggatt agtctccgtt aggcgtggca tcagaggaaa cgaagttgac 2280 ctaccagacg gtgattatgc tagcaccgcc ctactcccca cttgtaaaga gatcaacatg 2340 gtcgctgtcg cctctaatgt gttgcgcagc aggttcatca tcggtccgcc cggtgctggg 2400 aaaacatact ggctccttca gcaggtccag gatggtgatg tcatttacac accgactcac 2460 cagaccatgc tcgacatgat tagggctttg gggacgtgcc ggttcaacgt cccagcaggt 2520 acaacgctgc aattccctgc cccctcccgt accggcccgt gggttcgcat cctggccggc 2580 ggttggtgtc ctggtaagaa ttccttcctg gatgaagcag cgtattgtaa tcaccttgat 2640 gtcttgaggc tccttagcaa aaccaccctt acctgtctgg gagacttcaa acaactccac 2700 ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcagac ccagttgaag 2760 accatctgga gattcggaca gaacatctgt gatgccatcc aaccagatta cagggacaaa 2820 cttgtgtcca tggtcaacac aacccgtgta acctacatgg aaaaacctgt caagtatggg 2880 caagtcctca ccccttacca cagggaccga gaggacggcg ccatcacaat tgactccagt 2940 caaggcgcca catttgatgt ggttacactg catttgccca ctaaagattc actcaacagg 3000 caaagagccc ttgttgctat caccagggca agacatgcta tctttgtgta tgacccacac 3060 aggcaattgc agagcatgtt tgatcttcct gcgaagggca cacccgtcaa cctcgcagtg 3120 caccgtgatg agcagctgat cgtactggat agaaataata aagaatgcac agttgctcag 3180 gctataggca acggagataa attcagggcc accgacaagc gcgttgtaga ttctctccgc 3240 gccatttgtg ctgatctgga agggtcgagc tccccgctcc ccaaggtcgc acacaacttg 3300 ggattttatt tctcacctga tttgacacag tttgctaaac tcccggtaga ccttgcaccc 3360 cactggcccg tggtgacaac ccagaacaat gaaaagtggc cggatcggct ggttgccagc 3420 cttcgccctg tccataagta tagccgtgcg tgcattggtg ccggctatat ggtgggcccc 3480 tcggtgtttc taggcacccc tggggtcgtg tcatactacc tcacaaaatt tgtcaagggc 3540 gaggctcaag tgcttccgga gacagtcttc agcaccggcc gaattgaggt ggattgccgg 3600 gagtatcttg atgacaggga gcgagaagtt gctgagtccc tcccacatgc cttcattggc 3660 gacgtcaaag gcaccaccgt tgggggatgt catcatgtca cctccaaata ccttccgcgc 3720 ttccttccca aggaatcagt cgcggtagtc ggggtttcga gccccgggaa agccgcaaaa 3780 gcagtgtgca cattgacgga tgtgtacctc ccagaccttg aggcctacct ccacccagag 3840 actcagtcta agtgctggaa agttatgttg gacttcaagg aagttcgact gatggtctgg 3900 aaagacaaga cggcctattt ccaacttgaa ggccgctatt tcacctggta tcagcttgca 3960 agctacgcct cgtacatccg tgttcctgtc aactccacgg tgtatctgga cccctgcatg 4020 ggccctgccc tttgcaacag aagagttgtc gggtccaccc attggggagc tgacctcgca 4080 gtcacccctt atgattacgg tgctaaaatc atcttgtcta gcgcttacca tggtgaaatg 4140 cctcctggat acaagattct ggcgtgcgcg gagttctcgc tcgacgaccc agtcaagtac 4200 aaacacacct ggggttttga atcggataca gcgtatctgt atgagttcac cggaaacggt 4260 gaggactggg aggattacaa tgatgcgttt cgtgcgcgcc agaaagggaa aatttataag 4320 gccactgcta ccagcatgaa gttttatttt cccccgggcc ccgtcattga accaacttta 4380 ggcctgaatt ga 4392
【０１９８】 <210> 4 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 2 of North American PRRS Virus Genome. <400> 4 atgaaatggg gtctatacaa agcctcttcg acaaaattgg ccagcttttt gtggatgctt 60 tcacggaatt tttggtgtcc attgttgata tcatcatatt tttggccatt ttgtttggct 120 tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcggtattcc 180 gtgcgcgccc tgccattcac cctgagcaat tacagaagat cctatgaggc ctttctttct 240 cagtgccggg tggacattcc cacctggggg gtaaaacacc ctttggggat gttttggcac 300 cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360 aaagcagggc aagctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt 420 agtttggatg tggtggctca ttttcaacat cttgccgcca ttgaagccga gacctgtaaa 480 tatttggctt ctcgactgcc catgctacac aacctgcgca tgacagggtc aaatgtaacc 540 atagtgtata atagcacttt aaatcaggtg tttgctattt ttccaacccc tggttcccgg 600 ccaaagcttc atgattttca gcaatggcta atagctgtac attcctccat attttcctct 660 gttgcagctt cttgtactct ttttgttgtg ctgtggttgc gggttccaat gctacgtact 720 gtttttggtt tccgctggtt aggggcaatt tttctttcga actcatggtg a 771
【０１９９】 <210> 5 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 3 of North American PRRS Virus Genome. <400> 5 atggctaata gctgtacatt cctccatatt ttcctctgtt gcagcttctt gtactctttt 60 tgttgtgctg tggttgcggg ttccaatgct acgtactgtt tttggtttcc gctggttagg 120 ggcaattttt ctttcgaact catggtgaat tacacggtgt gtccaccttg cctcacccga 180 caagcagccg ctgaggtcct tgaacccggt aggtctcttt ggtgcaggat agggcatgac 240 cgatgtgggg aggacgatca cgacgaacta gggttcatgg ttccgcctgg cctctccagc 300 gaaagccact tgaccagtgt ttacgcctgg ttggcgttcc tgtccttcag ctacacggcc 360 cagttccatc ccgagatatt tgggataggg aacgtgagtg aagtttatgt tgacatcaag 420 caccaattca tctgcgccgt tcatgacggg cagaacacca ccttgcctcg ccatgacaat 480 atttcagccg tatttcagac ctactatcaa catcaggtcg acggcggcaa ttggtttcac 540 ctagaatggc tgcgtccctt cttttcctct tggttggttt taaatgtttc gtggtttctc 600 aggcgttcgc ctgcaagcca tgtttcagtt cgagtctttc agacatcaaa accaacacta 660 ccgcagcatc aggctttgtt gtcctccagg acatcagctg ccttaggcat ggcgactcgt 720 cctttccgac gattcgcaaa agctctcaat gccgcacggc gatag 765
【０２００】 <210> 6 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 4 of North American PRRS Virus Genome. <400> 6 atggctgcgt cccttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtttcgtggt ttctcaggcg 60 ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcagaca tcaaaaccaa cactaccgca 120 gcatcaggct ttgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga ctcgtccttt 180 ccgacgattc gcaaaagctc tcaatgccgc acggcgatag ggacacccgt gtatatcacc 240 atcacagcca atgtgacaga tgagaattac ttacattctt ctgatctcct catgctttct 300 tcttgccttt tctatgcttc tgagatgagt gaaaagggat tcaaggtggt gtttggcaat 360 gtgtcaggca tcgtggctgt gtgtgtcaac tttaccagct acgtccaaca tgtcaaagag 420 tttacccaac gctccttggt ggtcgatcat gtgcggctgc ttcatttcat gacacctgag 480 accatgaggt gggcaaccgt tttagcctgt ctttttgcca tcctactggc aatttga 537
【０２０１】 <210> 7 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 5 o f North American PRRS Virus Genome. <400> 7 atgttgggga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcgat tgctttcttt gtggtgtatc 60 gtgccgttct gttttgctgt gctcggcagc gccaacagca gcagcagctc tcattttcag 120 ttgatttata acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctggc agaaaaattt 180 gattgggcag tggagacttt tgtcatcttt cccgtgttga ctcacattgt ttcctatggt 240 gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctgg ttactgtgtc caccgccggg 300 ttttatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atctacgcgg tctgtgctct ggctgcgttg 360 atttgcttcg ttattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct ggcgctactc ttgtaccaga 420 tataccaact tccttctgga cactaagggc agactctatc gttggcggtc gcccgttatc 480 atagaaaaag ggggtaaggt tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa aagagttgtg 540 cttgatggtt ccgtggcaac ccctttaacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtctc 600 tag 603
【０２０２】 <210> 8 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 6 o f North American PRRS Virus Genome. <400> 8 atggggtcgt ctctagacga cttttgccat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgcttttg 60 gcgttttcca ttacctacac gccagtaatg atatatgctc taaaggtaag tcgcggccga 120 ctactagggc ttctgcacct tttgatcttt ctgaattgtg cttttacctt cgggtacatg 180 acattcgagc actttcagag cacaaatagg gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240 cttctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300 ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga aagtgccgcg 360 ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420 actacggtta acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480 gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataa 525
【０２０３】 <210> 9 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA of Open Reading Frame 7 o f North American PRRS Virus Genome. <400> 9 atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca gccagtcaat 60 cagctgtgcc agatgctggg taaaatcatc gcccagcaaa accagtccag aggcaaggga 120 ccgggcaaga aaagtaagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgaccgaa 180 gatgacgtca ggcatcactt cacccctggt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcgatccag 240 actgccttta accagggcgc tggaacttgt accctgtcag attcagggag gataagttac 300 actgtggagt ttagtttgcc gacgcatcat actgtgcgcc tgatccgcgt cacagcatca 360 ccctcagcat ga 372
【０２０４】 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 10 acagtttggt gatctatg 18
【０２０５】 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 11 cagattcaga tgttcaa 17
【０２０６】 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used for determining cD NA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 12 acctcgtgct gtatgccgaa tctc 24
【０２０７】 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, used for determining c DNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 13 tcaggcctaa agttggttca atga 24
【０２０８】 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 14 gatgactggg ctactgacga ggat 24
【０２０９】 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 15 agagcggctg ggatgacact g 21
【０２１０】 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, used for determining c DNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 16 ccggggaagc cagacgattg aa 22
【０２１１】 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, usedfor determining cD NA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 17 agggggagca aagaaggggt catc 24
【０２１２】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer forward strand, used fo r determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 18 agcacgctct ggtgcaactg 20
【０２１３】 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 19 gccgcggcgt agtattcag 19
【０２１４】 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 20 cgcgtcacag catcaccctc ag 22
【０２１５】 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 21 cggtaggttg gttaacacat gagtt 25
【０２１６】 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or determining cDNA corresponding to North American PRRS virus genome. <400> 22 tggctcttcg ggcctataaa ata 23
【０２１７】 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Strand of synthetic doublestra nded adapter used in pT7P129A. <400> 23 ctagattaat taatacgact cactataggg atgacgtata ggtgttggct ctatgc 56
【０２１８】 <210> 24 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Strand of synthetic double-str anded adapter used in pT7P129A. <400> 24 taattaatta tgctgagtga tatccctact gcatatccac aaccgagata cggtgc 56
【０２１９】 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward strand, used i n preparing pT7P129A. <400> 25 actcagtcta agtgctggaa agttatg 27
【０２２０】 <210> 26 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used i n preparing pT7P129A. <400> 26 gggatttaaa tatgcatttt tttttttttt tttttttaat tgcggccgca tggttctcg 59
【０２２１】 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward strand, used f or synthesizing region flanking North American PRRS virus ORF7 upstream. <400> 27 attagatctt gccaccatgg tggggaaatg cttgac 36
【０２２２】 <210> 28 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or synthesizing region flanking North American PRRS virus ORF7 upstream. <400> 28 ctttacgcgt ttgcttaagt tatttggcgt atttgacaag gtttac 46
【０２２３】 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer,forward strand, used fo r synthesizing region flanking North American PRRS virus ORF7 downstream . <400> 29 caacacgcgt cagcaaaaga aaaagaaggg g 31
【０２２４】 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse strand, used f or synthesizing region flanking North American PRRS virus ORF7 downstrea m. <400> 30 gcgcgttggc cgattcatta 20
【０２２５】 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Upper primer used in preparing pCMV-S-P129. <400> 31 ctcgttaatt aaaccgtcat gacgtatagg tgttggc 37
【０２２６】 <210> 32 <211> 3796 <212> DNA <213> Plasmid <220> <223> Description of Plasmid: pCMV-MC1 <400> 32 gaattcgagc ttgcatgcct gcaggtcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 60 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 120 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 180 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 240 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 300 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 360 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 420 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 480 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 540 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 600 cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatccggtac tcgaggaact gaaaaaccag 660 aaagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg 720 gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctaggc ctgtacggaa 780 gtgttacttc tgctctaaaa gctgcggaat tgtacccgcg gccgcaagat atcgccctag 840 gaagatctcg atcgattggt accaatccgc gaccccttaa ttaacagcta gcggatttaa 900 atcagggccc gggatactag tgagcggccg cggggatcca gacatgataa gatacattga 960 tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 1020 tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 1080 ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt cggatcctct 1140 agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 1200 aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 1260 ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 1320 ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 1380 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 1440 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 1500 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 1560 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 1620 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 1680 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 1740 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 1800 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 1860 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 1920 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 1980 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 2040 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 2100 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 2160 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 2220 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 2280 aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 2340 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 2400 agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 2460 cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 2520 ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 2580 gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 2640 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 2700 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 2760 ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 2820 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 2880 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 2940 ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 3000 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 3060 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 3120 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 3180 acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 3240 ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 3300 tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac 3360 attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga 3420 cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 3480 tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg 3540 gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 3600 accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg 3660 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 3720 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 3780 taaaacgacg gccagt 3796
【０２２７】 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Strand from synthetic linker u sed in the preparation of pCMV-S-P129. <400> 33 cgttaattaa accgactagt gc 22
【０２２８】 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Strand from synthetic linker u sed in the preparation of pCMV-S-P129. <400> 34 tcgagcaatt aatttggctg atcacgccgg 30
【０２２９】 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Lower primer used in preparing pCMV-S-P129. <400> 35 cggggacggt ttcaaatttc actt 24
【０２３０】 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Portion of plasmid pCMV-S-P129 , in 5'to 3' direction, immediately prior to P129 genome. <400> 36 tatataagca gagctcgtta attaaaccgt catgacgtat aggtgttggc 50
【０２３１】 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward, used for synt hesizing upstream flanking region to ORF4 <400> 37 aggtcgacgg cggcaattgg tttcacctag agtggctgcg tcccttct 48
【０２３２】 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse, used for synt hesizing upstream flanking region to ORF4 <400> 38 tcttaagcat tggctgtgat ggtgatatac 30
【０２３３】 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, froward, used for synt hesizing downstream flanking region to ORF4 <400> 39 cttcttaagt ccacgcgttt tcttcttgcc ttttctatgc ttct 44
【０２３４】 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse, used for synt hesizing downstream flanking region to ORF4 <400> 40 tgcccggtcc cttgcctct 19
【０２３５】 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward, used for synt hesizing downstream flanking region to ORF4 <400> 41 gtttacgcgt cgctccttgg tggtcg 26
【０２３６】 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward, used for synt hesizing upstream flanking region to insertion site between ORF1b and OR F2 <400> 42 aacagaagag ttgtcgggtc cac 23
【０２３７】 <210> 43 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse, used for synt hesizing upstream flanking region to insertion site between ORF1b and O RF2 <400> 43 gctttgacgc gtccccactt aagttcaatt caggcctaaa gttggttca 49
【０２３８】 <210> 44 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, forward, used for synt hesizing downstream flanking region to insertion site between ORF1b and ORF2 <400> 44 gcgacgcgtg ttccgtggca acccctttaa ccagagtttc agcggaacaa tgaaatgggg 60 tctatacaaa gcctcttcga ca 82
【０２３９】 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer, reverse, used for synt hesizing downstream flanking region to insertion site between ORF1b and ORF2 <400> 45 aacagaacgg cacgatacac cacaaa 26
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、北米ＰＲＲＳウィルスの十分な長さの
感染性ｃＤＮＡクローン、pT7P129Aの構成のためのクロ
ーニング手段を示す。矢じりはＴ７プロモーター配列を
示す。
【図２】これは、P129A 、又は組換えＰＲＲＳウィルス
rP129A-1による感染に続く血清性ウィルス血症を示す。
MARC-145細胞に対するプラークアッセイにより決定され
た。検出の下限は、５ pfu／ml（又は対数尺度に基づい
て０．７）である。
【図３】これは、P129A 、又は組換えＰＲＲＳウィルス
のP129A-1 による感染に続いての抗−ＰＲＲＳウィルス
血清抗体を示す。これは、HerdChek PRRS ELISA アッセ
イ（IDEXX (Westbrook, Maine, USA))により決定され
た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 7/04 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 7/04 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/569 Ｈ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/569 (Ｃ１２Ｎ 7/00 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マイケル ジョージ シェパード アメリカ合衆国，コネチカット 06359, ノース ストニングトン，キングスウッド ドライブ 29 (72)発明者 シャオ−クン ワン ウエルシュ アメリカ合衆国，コネチカット 06359, ノース ストニングトン，サリー レイン ４

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ブタ動物に感染した場合に、その動物に
    おいてＰＲＲＳを生成することができないように遺伝子
    的に修飾されている北米ＰＲＲＳウィルスをコードする
    感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号１又はそれに
    対して相同であるが、但しＰＲＲＳを生成するその能力
    において前記コードされたＰＲＲＳウィルスを遺伝子的
    に無能にする１又は複数の突然変異を含むＤＮＡ配列を
    含んで成る、単離されたポリヌクレオチド分子。
  2. 【請求項２】 ブタ動物に感染した場合に、その動物に
    おいてＰＲＲＳを生成することができないように遺伝子
    的に修飾されている北米ＰＲＲＳウィルスをコードする
    感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号１又はそれに
    対して相同であるが、但しＰＲＲＳを生成するその能力
    において前記コードされたＰＲＲＳウィルスを遺伝子的
    に無能にする１又は複数の突然変異を含むＤＮＡ配列を
    含んで成る、前記コードされた遺伝子的に修飾された北
    米ＰＲＲＳウィルスを発現することができるトランスフ
    ェクトされた宿主細胞。
  3. 【請求項３】 ＰＲＲＳウィルスによる感染からブタ動
    物を保護するためのワクチンであって、請求項１記載の
    ポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性ＲＮＡ
    分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米ＰＲ
    ＲＳウィルス、又は前記感染性ＲＮＡ分子、又はプラス
    ミドの形での前記ポリヌクレオチド分子、又はＰＲＲＳ
    ウィルスによる感染に対する効果的な免疫保護応答を誘
    発することができる北米ＰＲＲＳウィルスをコードする
    請求項１記載のヌクレオチド配列を含んで成るウィルス
    ベクターを、ＰＲＲＳウィルスによる感染に対して免疫
    保護を生成するのに効果的な量で、及び獣医学的使用の
    ために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
  4. 【請求項４】 哺乳類又は鳥における特定の病原体に対
    しての効果的な免疫保護応答を誘発できる１又は複数の
    異種抗原性エピトープを含むように遺伝子的に修飾され
    ている北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
    分子をコードする、配列番号１又はそれに対して相同の
    配列であるが、但し異種抗原性エピトープをそれぞれコ
    ードする１又は複数の追加のヌクレオチド配列を含んで
    成るＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチ
    ド分子。
  5. 【請求項５】 プラスミドの形での請求項４記載の単離
    されたポリヌクレオチド分子。
  6. 【請求項６】 哺乳類又は鳥における特定の病原体に対
    しての効果的な免疫保護応答を誘発できる１又は複数の
    異種抗原性エピトープを含むように遺伝子的に修飾され
    ている北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ
    分子をコードする、配列番号１又はそれに対して相同の
    配列であるが、但し異種抗原性エピトープをそれぞれコ
    ードする１又は複数の追加のヌクレオチド配列を含んで
    成るＤＮＡ配列を含んで成るトランスフェクトされた宿
    主細胞。
  7. 【請求項７】 病原体による感染から哺乳類又は鳥を保
    護するためのワクチンであって、請求項４記載のポリヌ
    クレオチド分子によりコードされる感染性ＲＮＡ分子に
    よりコードされる遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウ
    ィルス、又は前記感染性ＲＮＡ分子、又は請求項５記載
    のプラスミドを、１又は複数の異種抗原性エピトープを
    提供するか又はそれらによりコードされる病原体による
    感染に対して免疫保護を生成するのに効果的な量で；及
    び医薬又は獣医学的使用のために許容できるキャリヤー
    を含んで成るワクチン。
  8. 【請求項８】 前記遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳ
    ウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤ
    ＮＡ配列が、ブタ動物においてＰＲＲＳを生成するその
    能力において前記コードされた遺伝子的に修飾された北
    米ＰＲＲＳウィルスを無能にする１又は複数の追加の突
    然変異を含んで成る請求項４記載の単離されたポリヌク
    レオチド分子。
  9. 【請求項９】 プラスミドの形での請求項８記載の単離
    されたポリヌクレオチド分子。
  10. 【請求項１０】 ＰＲＲＳウィルスによる感染から、及
    び北米ＰＲＲＳウィルス以外のブタ病原体による感染か
    らブタ動物を保護するためのワクチンであって、請求項
    ８記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染
    性ＲＮＡ分子によりコードされる遺伝子的に修飾された
    北米ＰＲＲＳウィルス、又は前記感染性ＲＮＡ分子、又
    は請求項９記載のプラスミドを、ＰＲＲＳウィルスによ
    る感染に対して、及び異種抗原性エピトープ、又はそれ
    らのもしくはそれらによりコードされるエピトープが由
    来する病原体による感染に対して免疫保護を生成するの
    に効果的な量で；並びに獣医学的使用のために許容でき
    るキャリヤーを含んで成るワクチン。
  11. 【請求項１１】 １又は複数の検出できる異種抗原性エ
    ピトープを含むよう遺伝子的に修飾されている北米ＰＲ
    ＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードす
    る、配列番号１の配列に対して同じかもしくは相同であ
    り、又はそれに対して相同であるが、但し検出できる異
    種抗原性エピトープをそれぞれコードする１又は複数の
    追加のヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ配列を含ん
    で成る単離されたポリヌクレオチド分子。
  12. 【請求項１２】 ＰＲＲＳウィルスによる感染からブタ
    動物を保護するためのワクチンであって、ブタ動物にお
    いてＰＲＲＳを生成することができないが、まだそのブ
    タ動物においてＰＲＲＳウィルスに対する効果的な免疫
    保護応答を誘発することができるよう処理されているか
    又は遺伝子的に修飾されている、１又は複数の検出でき
    る異種抗原性エピトープを含んで成る、請求項１１記載
    のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性ＲＮ
    Ａ分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米Ｐ
    ＲＲＳウィルス；又は前記感染性ＲＮＡ分子（ここで１
    又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含んで成
    る、前記感染性ＲＮＡ分子によりコードされる遺伝子的
    に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスが、ＰＲＲＳを生成
    することができないが、まだ、ＰＲＲＳウィルスに対す
    る効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追
    加の遺伝子修飾を含んで成る）；又はプラスミドの形で
    の請求項１１記載の単離されたポリヌクレオチド分子
    （１又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含ん
    で成る、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる
    遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲＳウィルスが、ＰＲＲ
    Ｓを生成することがでないが、なおＰＲＲＳウィルスに
    対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよ
    う追加の遺伝子修飾を含んで成る）；又はＰＲＲＳを生
    成することができないが、まだＰＲＲＳウィルスに対し
    て効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追
    加の遺伝子修飾を含んで成る、１又は複数の検出できる
    異種抗原性エピトープを含んで成る遺伝子的に修飾され
    た北米ＰＲＲＳウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子
    をコードするヌクレオチド配列をコードするウィルスベ
    クターを、ＰＲＲＳウィルスによる感染に対して免疫保
    護を生成するのに効果的な量で；並びに獣医学的使用の
    ために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
  13. 【請求項１３】 検出できる抗原性エピトープを欠失す
    るよう遺伝子的に修飾されている北米ＰＲＲＳウィルス
    をコードする感染性ＲＮＡ分子をコードする、配列番号
    １又はそれに対して相同の配列であるが、但し検出でき
    る抗原性エピトープをコードする１又は複数のＤＮＡ配
    列を欠いているＤＮＡ配列を含んで成る、単離されたポ
    リヌクレオチド分子。
  14. 【請求項１４】 ＰＲＲＳウィルスによる感染からブタ
    動物を保護するためのワクチンであって、ブタ動物にお
    いてＰＲＲＳを生成することができないが、まだそのブ
    タ動物においてＰＲＲＳウィルスに対する効果的な免疫
    保護応答を誘発することができるよう処理されているか
    又は遺伝子的に修飾されている、１又は複数の検出可能
    な抗原性エピトープを欠いている、請求項１３記載のポ
    リヌクレオチド分子によりコードされる感染性ＲＮＡ分
    子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲ
    Ｓウィルス；又は前記感染性ＲＮＡ分子（１又は複数の
    検出できる抗原性エピトープを欠いている、前記感染性
    ＲＮＡ分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北
    米ＰＲＲＳウィルスが、ＰＲＲＳを生成することができ
    ないが、まだ、ＰＲＲＳウィルスに対する効果的な免疫
    保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾
    を含んで成る）；又はプラスミドの形での請求項１３記
    載の単離されたポリヌクレオチド分子（１又は複数の検
    出できる抗原性エピトープを欠いている、前記ポリヌク
    レオチド分子によりコードされる遺伝子的に修飾された
    北米ＰＲＲＳウィルスが、ＰＲＲＳを生成することがで
    ないが、まだ、ＰＲＲＳウィルスに対する効果的な免疫
    保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾
    を含んで成る）；又はＰＲＲＳを生成することができな
    いが、まだＰＲＲＳウィルスに対して効果的な免疫保護
    応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含
    んで成る、１又は複数の検出できる抗原性エピトープを
    欠いているそのような遺伝子的に修飾された北米ＰＲＲ
    Ｓウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードする
    ヌクレオチド配列をコードするウィルスベクターを、Ｐ
    ＲＲＳウィルスによる感染に対して免疫保護を生成する
    のに効果的な量で；並びに獣医学的使用のために許容で
    きるキャリヤーを含んで成るワクチン。
  15. 【請求項１５】 野生型ニドビラレスウィルスをコード
    する感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで
    成る単離されたポリヌクレオチド分子を得ることによ
    り、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィルス
    による感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発できる
    まま存続する遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィル
    スをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配
    列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得る
    ために、前記野生型ニドビラレスウィルスをコードする
    感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を遺伝子的に
    突然変異誘発し、そしてそのようにして得られた、単離
    されたポリヌクレオチド分子から遺伝子的に修飾された
    ニドビラレスウィルスを発現することによって調製され
    る、遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスにより
    ワクチン接種された哺乳類又は鳥において免疫保護応答
    を誘発することができる遺伝子的に修飾されたニドビラ
    レスウィルス。
  16. 【請求項１６】 遺伝子的に修飾されたニドビラレスウ
    ィルスによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において
    免疫保護応答を誘発できる遺伝子的に修飾されたニドビ
    ラレスウィルスを調製するための方法であって、野生型
    ニドビラレスウィルスをコードする感染性ＤＮＡ分子を
    コードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌク
    レオチド分子を得ることにより、哺乳類又は鳥において
    野生型ニドビラレスウィルスによる感染に対して効果的
    な免疫保護応答を誘発できるまま存続する遺伝子的に修
    飾されたニドビラレスウィルスをコードする感染性ＲＮ
    Ａ分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離された
    ポリヌクレオチド分子を得るために、野生型ニドビラレ
    スウィルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードする
    ＤＮＡ配列を遺伝子的に突然誘発し、そしてそのように
    して得られた、単離されたポリヌクレオチド分子から遺
    伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを発現する、
    ことを含んで成る方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１５記載の遺伝子的に修飾され
    たニドビラレスウィルスを、それらによりワクチン接種
    された哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィル
    スに対して効果的な免疫保護応答を誘発するのに有効な
    量で、及び医薬又は獣医学的使用のために許容できるキ
    ャリヤーを含んで成る、ニドビラレスウィルスによる感
    染から哺乳類又は鳥を保護するためのワクチン。
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