JP2008113670A - 北米ブタ生殖及び呼吸症候群(PRRS)ウィルスの感染性cDNAクローン及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成るプラスミド、及びそのようなプラスミドを用いてのワクチンに関する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、動物の健康の分野に関し、そして陽性極性(positive
polarity)RNAウィルスの感染性cDNAクローン、及びそのようなcDNAクローンを用いてのワクチン、特にブタワクチンの構成に向けられる。
1451-1460 ; Suarez, P.など., 1996, Virus Research 42 :
159-165) 。前記2種の型は、1980年代、1つは北アメリカ及び他はヨーロッパにおいて、独立してブタ集団に、たぶん、げっ歯動物又は鳥類起原の未知の生物学的病原体保存体から最初に侵入したように思われる。原型“Lelystad, Virus ”により表わされるヨーロッパ型は、1991年オランダにおいて単離され、そして配列決定された(Terpstra, C.など., 1991, Vet. Quart. 13 :
131-136 ; Wensvoort, G. など., 1991, Vet. Quart. 13 :
121-130 ; Wensvoort, G. など., WO92/21375 1992 (PCT/NL
92/00096)、1992 ; Meulenberg, J.J.M. など., 1993, Virol. 192 : 62-72)。
及びトロウィルス(toroviruses)をまた包含するニドビラレス(Nidovirales)目内に分類される。ニドウィルス(nidoviruses)は、一本鎖の陽性極性RNAから成るゲノムを有する封入されたウィルスである。陽性−鎖のRNAウィルスのゲノムRNAは、遺伝子情報の貯蔵及び発現の両者において二重の役割を満たす。DNAはニドウィルスにおける複製又は転写に関与しない。従って、ニドウィルスのゲノムRNAの再生は、ゲノム複製及びmRNA転写の組合された工程である。さらに、いくつかのタンパク質が、ニドウィルスのゲノムRNAから直接的に翻訳される。アルテリビリダエ科の分子生物学が、最近、Snijder and Meulenberg(Snijder, E.J. and
Meulenberg, J.J.M., 1998, Journal of General Virology 79 : 961-979) により総説されている。
。
本発明はさらに、上記の単離されたポリヌクレオチド分子によりコードされる単離された感染性RNA分子、及びそれに対して相同の単離された感染性RNA分子を提供し、ここで前記単離された感染性RNA分子は北米PRRSウィルスをそれぞれコードする。
本発明はさらに、北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して相同の配列であるDNA配列を含んで成るウィルスベクターを提供する。
本発明はさらに、北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して相同の配列であるDNA配列を含んで成る、コードされた北米PRRSウィルスを発現することができるトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、上記のような遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成るウィルスベクターを提供する。
本発明はさらに、上記のような遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成るトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、北米PRRSウィルスによりコードされるペプチドをコードする1又は複数のヌクレオチド配列を含んで成るトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、ここで前記北米PRRSウィルスのゲノム配列は配列番号1又はそれに対して相同の配列である。
本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の範囲内であり、そして中でも、次に記載される組換え技法に従って実施され得る:Maniatis, など., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY ; Ausubel, など., 1989, Current Protocols In
Molecular Biology, Geene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY
; Sambrook, など., 1989, Molecular Cloning : A
Laboratory Manual, 2d, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY ; Innlsなど. (eds), 1995, PCR
Strategles, Academic Press, Inc., San Diego, and Erlich (ed), 1992, PCR
Technology, Oxford University Press, New York;それらのすべては、引用により本明細書に組込まれる。
本発明は、北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明はさらに、遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明のための“感染性RNA分子”とは、適切な宿主細胞における機能的ビリオンへのウィルス複製、転写及び翻訳のための必要な要素をコードするRNA分子であるが、但し、必要なら、RNA分子においていづれかの遺伝子修飾、たとえば配列欠失を補正するペプチド又は複数のペプチドが存在する。
Maryland, USA) of the United States National Institute of Health)。好ましくは、相同ヌクレオチド配列は、少なくとも約75%のヌクレオチド配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約85%のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝子コードは縮重性であるので、相同ヌクレオチド配列は、いづれかの数の“サイレント”塩基変化、すなわち、それにもかかわらず同じアミノ酸をコードするヌクレオチド置換を包含することができる。
本明細書において使用される場合、用語“PRRS”とは、PRRSウィルス感染により惹起されるブタにおける疾病症候群を包含する。そのような症候群の例は、妊娠した雌ブタにおける流産、及び若いブタにおける遅い成長、呼吸困難、食欲不振及び死亡を包含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書において使用される場合、“PRRSを生成することができない”PRRSウィルスは、ブタを感染することができるが、しかしブタにおけるPRRS感染と通常関連するいづれの疾病症候群も生成しないか、又はそのような症候群を生成するが、しかしより低い程度であるか、又は少数のそのような症候群を生成するか、あるいは両者であるウィルスを意味する。
用語“PRRSウィルス”とは、本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、北米又は欧州PRRSウィルスのいづれかの株を意味する。
Invest. 4 : 117-126 を参照のこと);北米PRRSウィルス単離物MN−1b(Kwang,
J. など., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6 : 293-296);PRRSのQuebec IAF-exp91株(Mardassi, H.など., 1995, Arch. Virol. 140 : 1405-1418);及び北米PRRSウィルス単離物VR2385(Meng, X.-J. など., 1994, J. Gen. Virol. 75 : 1795-1801) (但し、それらだけには限定されない)に関連する遺伝子特徴を有するいづれかのPRRSウィルスを意味する。
121-130 を参照のこと)。“欧州PRRSウィルス”とはまた、時々、“Lelystadウィルス”として当業界において言及される。
用語“オープンリーディングフレーム”又は“ORF”とは、本明細書において使用される場合、介在性停止コドンを伴わないで、特定のPRRSウィルスタンパク質をコードするために必要とされる最小ヌクレオチド配列を意味する。
本明細書において使用される用語“病原的に感染する”とは、動物を感染し、そして動物に疾病を引き起こす病原体の能力を意味する。例として、PRRSウィルスは、それがブタにおいてPRRSを引き起こすことができるので、ブタ動物を病原的に感染することができる。しかしながら、PRRSウィルスは鳥又は他の哺乳類、たとえばヒトを、生産的に又は非生産的に感染することができるが、それはブタ動物以外の動物においていづれの疾病も引き起こさないので、ブタ動物以外のいづれの動物も病原的に感染しない。
anthraci)、ボルデテラブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、クロストリジウムハエモリチカム(Clotridium haemolyticum)、クロストリジウムペルフリンゲンス(Clostridium
perfringens)、クロストリジウムテタニ(Clostridiumtetani)、エシュリシアコリ(Escherichia coli) 、エリシペロトリクスルシオパチアエ(Erysipelothrix
rhusiopathiae) 、ハエモフィラスパラスイス(Haemophilus parasuis) 、レプトスピラspp.(Leptospira spp.)、マイコプラズマヒオペネウモニアエ(Mycoplasma
hyopneumoniae) 、マイコプラズマヒロリニス(Mycoplasma hyorhinis) 、パステウレラハエモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パステウレラムルトシダ(Pasteurella
multocida)、サルモネラコレラエスイス(Salmonella choleraesuis)、サルモネラチピムリウム(Salmonella typhimurium) 、ストレプトコーカスエクイスミリス(Streptococcus
equismillis)及びストレプトコーカススイス(Streptococcus suis) から成る群から選択されたブタ病原体からの抗原性エピトープ。前記ブタ病原体からの抗原性エピトープをコードするヌクレオチド配列は、当業界において知られており、そして公開された遺伝子データベース、たとえばNCBIにより提供されるGenBank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/Web/Genbank/index.html)
から入手できる。
Protocols in Immunology, John Willey & Sons, Inc., に見出され得る。他方では、異種抗原性エピトープ自体はたとえば、抗原性エピトープを実質的に含んで成るサンプルと、抗原性エピトープを特異的に結合する螢光ラベルされた抗体又は放射性ラベルされた抗体とを接触せしめることによって検出され得る。
本発明はまた、上記単離されたポリヌクレオチド分子のいづれかを、それによりコードされる北米PRRSウィルスを発現することができるプラスミドの形で提供する。
Inc., Rockville, Maryland, USA) を用いる)、又はDEAEデキストラン介在性トランスフェクションを用いて、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされる。
である。インビトロ転写のために有用ないづれかのプロモーターが、本発明のそのようなプラスミドに使用され得る。T7は1つのそのようなプロモーターであるが、しかし他のプロモーター、たとえばSP6プロモーター又はT3プロモーターが使用され得る。そのようなプロモーターの配列は、市販のプラスミドから人工的に合成され、又はクローン化され得る。
USA),pBR322及びpUC18を包含するが、但しそれらだけには限定されない。北米PRRSウィルスをコードする本発明のヌクレオチド配列は、既知の組換え技法を用いて、それらのプラスミドのいづれか中に挿入され得る。本発明のポリヌクレオチド分子が挿入され得る他のプラスミドは、当業者により認識されるであろう。
veterinary Services Laboratories (Ames, Iowa, USA) から得られる。
USA) である。
(すべて、Invitrogenからである);並びにpCMV-Sprot3
及びpSV-Sport1(両者ともLife
Technologies Inc.からである)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。しかしながら、ほとんどいづれの真核発現ベクターでも、本発明のために作用するであろう。コスミドに基づく構造体がまた、ニドビラレスウィルスの完全な細胞性エクスビボ発現のために使用され得る。
1993) を参照のこと)。
本発明はまた、本明細書に記載される北米PRRSウィルスのいづれか、たとえば本明細書に記載される遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成るウィルスベクターを提供する。そのようなウィルスベクターは、生存生物の外部で本発明のPRRSウィルスの生成のために真核細胞をトランスフェクトするために、又は本明細書における北米PRRSウィルスのインビボ発現のために、北米PRRSをコードする配列により、ブタ、又は他の哺乳類、又は鳥類をトランスフェクトするために有用である。
the United States Department of Agriculture ; American Type Culture Collection
(ATCC) (Manassas, Virginia, USA) ;及び他の既知の源から得られる。適切なブタウィルス、たとえば前記ブタウィルスに基づく組換えウィルスベクターは、本発明の北米PRRSウィルスをコードするヌクレオチド配列によりブタ動物をトランスフェクトするために有用である。
本発明はまた、本明細書に記載される北米PRRSウィルスのいづれか、たとえば本明細書に記載される遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る、その北米PRRSウィルスを発現することができるトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。そのようなトランスフェクトされた宿主細胞は、本発明の北米PRRSウィルスを生成するために有用である。本発明のトランスフェクトされた宿主細胞の例は、トランスフェクトされたブタ肺胞マクロファージ細胞及びトランスフェクトされたMARC-145細胞を包含する。
本発明はまた、上記単離されたポリヌクレオチド分子、RNA分子、プラスミド、ウィルスベクター又はトランスフェクトされた宿主細胞のいづれかにより発現され、そして/又はコードされる、本明細書に記載されるような遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを包含する、本明細書に記載されるような北米PRRSウィルスを提供する。
本発明はまた、本明細書に記載されるようなブタ動物においてPRRSを生成するそれらの能力において無能にされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを包含する、北米PRRSウィルス;本明細書に記載されるようなそのような北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子及びプラスミド;又は本明細書に記載されるようなそのような北米PRRSウィルス及び単離されたRNA分子をコードするウィルスベクターを含んで成るワクチンを提供する。本発明はまた、そのようなワクチンによるワクチン接種を含んで成る、感染から動物を保護するための方法も提供する。
Publishingを参照のこと。
Inc., Cambridye MA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA) 、AMPHIGEN登録商標アジュバント、サポニン、QuilA 又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質A及びAvridine−脂質−アミンアジュバント。
Technologies 3 : 279-292 に再考されている。
Delivery Systems ”in Drugs and the Pharmaceutical Science, Vol. 45, M.
Dekker, NY に見出され得る。他方では、又はさらに、ウィルス、プラスミド、又はウィルスベクターは、投与及び効能を改良するためにマイクロカプセル封入され得る。抗原をマイクロカプセル封入するための方法は、当業界において知られており、そしてアメリカ特許第 3,137,631号;第 3,959,457号;第 4,205,060号;第 4,606,940号;第 4,744,933号;第 5,132,117号;及び国際特許出願WO95/28227(それらは引用により本明細書中に組込まれる)に記載される技法を包含する。
pfu 、及び最とも好ましくは、約103
〜約107 pfu の範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のプラスミドの用量は、約0.1μg〜約100mg、より好ましくは約1μg〜約10mg、さらにより好ましくは約10μg〜約1mgの範囲である。
pfu 、及びさらにより好ましくは約103 〜約107
pfu の範囲である。適切な投与量サイズは、約0.5μl〜約10ml、及びより好ましくは約1ml〜約5mlの範囲である。
用語“本発明の北米PRRSウィルス”及び同様の用語は、特にことわらない限り、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスのいづれか、及び配列番号1又はそれに対して相同の配列によりコードされる修飾されていない北米PRRSウィルスを包含することが理解されるべきである。
本発明はまた、北米PRRSウィルスによりコードされるペプチドをコードする1又は複数のヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供し、ここで前記北米PRRSウィルスのゲノム配列は、配列番号1に対応するRNA分子と同じであるか又それに対して相同である。本明細書において使用される場合、用語“北米PRRSウィルスペプチド”とは、北米PRRSウィルスにより発現されるペプチドを意味する。そのようなペプチドは、北米PRRSウィルスに対して特異的であるが、しかし必ずしも必要ではない。
本発明はさらに、遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において免疫保護を誘発することができるそれらの遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを提供し、ここで前記遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスは、野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発することができる遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得るために野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を遺伝子的に突然変異誘発し、そしてそのようにして得られた、単離されたポリヌクレオチド分子から前記遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを発現することによって調製される。
Acad. Sci. USA, 94 (3) : 991-6 に記載される、ウマ動脈炎ウィルスをコードするDNA配列;及びden Boon, J.A., など., 1991, J. Virol. 65 (6)
: 2910-20 に記載される、ウマ動脈炎ウィルスをコードするDNA配列を包含する(前記文献は引用により本明細書中に組込まれる)。本発明の手段により遺伝子的に修飾され得るニドビラレスウィルスは、コードDNA配列が得られるいづれかのニドビラレスウィルスであり得る。ニドビラレスウィルスのいくつかの例は、本明細書の前のセクションに記載されている。
本発明はさらに、ニドビラレスウィルスによる感染から哺乳類又は鳥を保護するためのワクチンを提供し、ここで前記ワクチンは、上記の遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを、それによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィルスに対して効果的な免疫保護応答を誘発するのに効果的な量で、医薬的に又は獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成る。本発明のそれらのワクチンは、上記ワクチンを配合するための技法を用いて配合され得る。
次の例は本発明の観点を例示するに過ぎない。それらは本明細書に記載される本発明を制限するものではない。
PRRSウィルス及びMARC-145細胞の源:
P129と称する北米PRRSウィルス単離物を、Drs. Gregory W. Stevenson, William G. Van Alstine,及びCharles L. Kanitz of Purdne University's Animal Disease Diagnostic
Laboratory in West Lafayette, Indianaから得た。P129ウィルスを、重度のPRRS大発生を経験した南インディアナにおけるブタ集団から1995年、秋に最初に単離した。この農場は、PRRS問題又はPRRSワクチン接種のこれまでの歴史を有さなかった。
Veterinary Servlces Laboratories (NVSL, Ames, Iowa)から得た。それらの細胞は試験され、そしてマイコプラズマ及び通常のブタ異質剤に対して陰性であることが見出されている。MARC-145細胞を、2%のウシ胎児血清及び抗体を含むOpti MEM(Life Technologies Inc.) において37℃で通常通りに増殖する。
プラーク精製されたウィルスP129A を、ブタからの10連続的継代(2つのプラーク精製及び1つの続く継代を包含する)の後、配列決定のために使用した。配列番号1は、P129A RNAゲノムに対応するcDNA配列を示す。ゲノムは、ATGACGTAで開始し、そしてCCGCAATTで終結する、長さ15,395のヌクレオチドである(ポリアデノシン末端を除外する)。55個の残基の典型的なポリアデノシン末端はまた、配列番号1に提供される。
の構造遺伝子(ORF2〜7)のために、種々のPCRプライマーを、公開されたDNA配列データベースGenBank
から入手できる他の北米PRRSウィルス単離物(たとえばPRU00153) のいくつかの部分DNA配列に基づいて選択した。精製されたウィルスRNAを、逆転写酵素及びランダムヘキサマープライマーを用いてcDNA中に逆転写した。次に、このcDNAを、遺伝子−特異的プライマーと共にPCRに使用した。PCR生成物をゲルから切り出し、そしてT/AをプラスミドpCR2.1 (Invitrogen) 中にクローン化した。
また、GenBank データベースにおいては、PRRSウィルスのいくつかの単離物のORF1b 遺伝子の一部を含んで成る一連の短い配列(合計約218個のヌクレオチド)が存在する。それらの1つ(PPSSEQB)を用いて、次のPCRプライマーを企画した:位置9063−9080に対応する前方向5'-ACAGTTTGGTGATCTATG-3'(配列番号10);位置9252−9268に対応する逆方向5'-CAGATTCAGATGTTCAA-3'
(配列番号11)。
”5'-AGGGGGAGCAAAGAAGGGGTCATC-3'(配列番号17)、位置1733−1756)。RACE2 を用いて、cDNA合成をプライムし、そしてRACE3 をPCRに使用した。その得られるPCR生成物をクローン化し、そして配列決定した。2種の最長生成物は、正確に同じ塩基(配列番号1における位置1)で終結した。
(配列番号19)、位置9420−9438)。得られる8078のヌクレオチドRT-PCR生成物をクローン化し、そして配列決定した。
のcDNA 15,450個の塩基のゲノムの配列決定を完結した。
pT7P129Aと称する、P129A
の十分な長さの感染性cDNAクローンを、4種のオーバーラップするクローン化されたRT-PCR生成物からアセンブルした。4種のRT-PCR生成物をまず、プラスミドpCR2.1中にT/Aクローン化し、そしてE.コリ株DH5-α中にトランスフェクトした。細菌コロニーをスクリーンし、そして“T7→M13”配向において予測されるサイズの挿入体を含むそれらを、配列決定及び追加の操作のために選択した。
”を生成した。このプラスミドからの7837bpのBsu361−SpeIフラグメントを、pT7R3A-2からの5482bpのBsu361-SpeI フラグメントに連結した。その得られるプラスミド“pT7RG ”は、T7プロモーターの後ろに、P129A ゲノムの最初の9438個の塩基を含む。
の13,249bpのNdeI−SpeIフラグメントに連結し、P129A ゲノムの最初の12,050個の塩基を含むプラスミド“pT71A1B ”を生成した。
を含む。非サイレント点突然変異及び単一の塩基欠失は、他のクローンからのフラグメントをサブクローニングすることによって修飾された。位置12,622での追加の非サイレント点突然変異(A→G)を、この段階で、非意図的に導入した。
プラスミドpT7P129Aにおいては、ウィルスゲノムの上流にタンデムに2種のT7プロモーターが存在する。それらの1つは、ウィルスゲノムのすぐ上流に位置し、そして上記のようにしてPCRプライマー中に構築された。他の1つは、pCR2.1クローニングベクターに存在し、そして複数のクローニング部位の外側に位置する(ウィルスゲノムの44塩基上流で転写を開始する)。
を、インビトロ転写のために使用した。約0.6μgのPacI/SwaI消化されたpT7P129Aを含む上記からのDNAペレットを、20μlのT7 Cap-Scribe 緩衝液/T7ポリメラーゼに再懸濁し、そして37℃で30分間インキュベートした。反応の一部を、アガロースゲル電気泳動により分析し、そして15,445bp及び3868bpの予測されるDNAバンドの他に、十分な長さのRNA転写体を含むことを示した。このインビトロ転写反応は、精製しないで、インキュベーションに続いてすぐに新たに使用された。
(血清を含まない)により1度洗浄し、そして500μg/mlのDEAEデキストラン(約500,000 の分子量、Pharmacia Biotech)を含むOptiMEM (血清を含まない)1ml(35mmのウェル当たり)により被覆した。インビトロ転写反応物(15ml)をすぐに添加した。37℃で1時間後、トランスフェクション混合物を除去し、単層細胞をPBSにより1度、洗浄し、そして2%ウシ胎児血清及び抗生物質を含むOptiMEM 中1.25%のSeaPlaque アガロース(FMC Corporation)により被覆した。37℃で5日後、単一のプラークが認識できた。このウィルスを“rP129A-1”として命名し、そしてMARC-145細胞上で拡張し、そして細胞培養物及びブタにおいて特徴づけた。DEAEデキストラン及びエレクトロポレーションの両者を用いての、pT7P129Aからのインビトロ転写されたRNAの続くトランスフェクションは、多くの追加のプラークを生成した。
cDNA−由来の組換えウィルスrP129A-1とその非組換え親P129A との間で、増殖運動学、収率又はプラーク形態学における明らかな差異は存在しない。上記で論ぜられたように、pT7P129Aのコード配列とP129A のコンセンサス配列(配列番号1に示される)との間でヌクレオチド配列における2つの差異が存在する。最初に、位置1559で、pT7P129AはTを含み、そしてP129A はCを含む(これはサイレント突然変異である)。
cDNA−由来のウィルスrP129A-1を、若いブタにおいて臨床学的疾病を引き起こすその能力について、その非組換え親P129A と比較した。PRRS−陰性群からのそれぞれ10匹のブタの3つのグループを、生後4週目で、P129A 又はrP129A-1により感染せしめ、又は細胞培養培地により凝似−感染せしめた。臨床学的徴候、腸温度及び体重をモニターした。血液を、血清ウィルス血症(MARC-145細胞に対するプラークアッセイ、図2)及び血清抗体(IDEXX からのHerdChek PRRS を用いてのELISA による、図3)の決定のために、感染後、0,2,6,10、及び13日で採血した。肺の全体の及び顕微鏡的病変が検死に基づいて観察された。2種のウィルス感染されたグループ間で有意な差異は存在せず、このことは、rP129A-1がブタにおいて複製し、そしてその非組換え親ウィルスに定量的及び定性的に類似する臨床学的疾病を引き起こすことを示す。
ウィルスヌクレオカプシド遺伝子(ORF7)を、本発明のPRRSウィルスの感染性cDNAから部分的に欠失せしめた。その得られる修飾された組換えPRRSウィルスは、ブタにおいて複製−欠失することが予測される。この修飾された組換えPRRSウィルスは、臨床学的疾病、ワクチン接種されていない動物への広がり、又は弱毒化された生存ワクチンに関連する毒性への転換の危険性を伴わないで、他のPRRSウィルスタンパク質に対する免疫応答を誘発するためのワクチンとして使用され得る。
(配列番号29)(MluI部位を導入された、ORF7の5’末端近くの位置14,884−14,914)及び逆方向プライマー5'-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3'(配列番号30)(pCR2.1プラスミドにおけるウィルスゲノムの下流)は、462bpのフラグメントを増幅した。3−手段連結を、上流フランキングPCR生成物の611bpのBstEII−MluIフラグメント、下流フランキングPCR生成物の575bpのMluI−SpeIフラグメント、及びプラスミドp2-7D delta7+7023 からの6653bpのBstEII−SpeIフラグメントを用いて実施した(すべてのフラグメントは、消化に続いて、ゲル精製された)。得られるプラスミドp2-7D delta7+7023 は、ORF7の始めの7個のアミノ酸を欠失され、そして機能的ATG開始コドンを欠く。ウィルスゲノム及びプラスミド主鎖において不在である2つの新規制限部位AflII 及びMluIが、ORF7の5’末端によりこれまで支配されていた空間中への外来性遺伝子の直接的なクローニングを促進するために挿入されている。
の15,214bpのEco47III−SpeIフラグメントとを連結することによって、十分な長さのゲノムクローン中に組込まれた。その得られるプラスミドpCMV-S-p129delta7+7023が、細胞をトランスフェクトするために使用された。
からのORF7遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子の両者を含むプラスミドにより細胞を安定してトランスフェクトすることによって創造され得た。抗生物質G418を用いてネオマイシン耐性について選択した後、単一細胞コロニーを拡張し、そして特徴づけた。免疫螢光及びRT-PCRの両者によるORF7発現のために陽性であるクローンMARC-145−由来の細胞系を、ORF7−欠失P129A ウィルスを生成するために、pT7P129delta7 からのRNAによりトランスフェクトした。
上記例IIにおいては、AflII 及びMluI制限酵素部位が、ORF7の5’末端によりこれまで支配されている領域中に挿入された。それらの部位は、P129A ゲノムにおいて、及びpCR2.1及びpCMVプラスミドにおいて不在であり、そして発現のためにウィルスゲノム中への外来性(異種)遺伝子の直接的なクローニングに使用され得る。位置14,744−14,749(ATAACC)
及び14,858−14,863(TAAACC) でのORF7サブゲノムRNAの転写のための可能性あるリーダー連結部位は、ORF7コード肺胞の欠失により影響されず、そして外来性遺伝子の転写において機能することができる。
さらに、それらの外来性遺伝子(又はその一部)は、ブタにおいて通常、見出されない抗原性エピトープを供給することができる。そのようなエピトープは、ワクチンを“陽性標識する”ために使用され得、その結果、好結果のワクチン接種が、PRRSウィルスのフィールド又は従来のワクチン株に対する抗体の存在下でさえ、血清学的にモニターされ得る。正のマーカーは、別の発現カセットを必要としない。抗原性エピトープは、PRRSウィルスの構造遺伝子に融合され得る。たとえば、上記例Iに記載される上流フランキング逆方向プライマーは、ORF6膜タンパク質への非PRRSウィルス抗原エピトープのカルボキシル−末端融合を付加するような手段で拡張され得る。ブタにおいてのこのエピトープに対する抗体の存在は、好結果のワクチン接種を示す。
真核発現ベクターpCMV-MC1(配列番号31)は、NotI, EcoRV, AvrII, BglII, ClaI, KpnI, PacI, NheI, SwaI, SmaI, SpeI 及びNotI部位を含むリンカーにより、2つのNotI部位間のLacZコード配列を置換することによって、市販のプラスミドpCMVbeta
(Clontech) から誘導された。ヒトCMV即時初期プロモーターの修飾を、SacIとpCMV-MC1の第2NotI部位との間の配列を合成リンカー(下記に示される)により置換することによって達成した。
におけるPacIとHindIII との間のフラグメントを、pCMV-MC1からのPacI(位置877での)−HindIII (位置1162での)フラグメントにより置換した。従って、SpeI部位が再び得られた。この最終構造体(pCMV-S) を用いて、十分な長さのP129ゲノムをクローン化した。
から消化し、そしてPacI及びSpeI部位で、pCMV-S中にトランスファーした。この構造体を、pCMV-S-P129 と命名した。
pCMV-S-P129 におけるCMVプロモーターTATAボックスとP129配列の5’末端との間の修飾の領域の配列は、配列番号36で示され、そして下記に図的に示される:
Technologies Inc.) を用いて、リポフェクションによりMARC-145細胞中にトランスフェクトした。PRRSウィルス特異的細胞障害効果を、トランスフェクションの後に観察し、そしてPRRSウィルス抗原の存在を免疫螢光抗体試験により決定した。
膜糖タンパク質をコードする、ORF4のための遺伝子の一部を、本発明のPRRSウィルスの感染性cDNAクローンから欠失せしめた。その得られる修飾された組換えPRRSウィルスは、ブタにおいて複製−欠失性であり、そして臨床学的疾病、ワクチン接種されていない動物への広がり、又は弱毒化された生存ワクチンに関連する毒性への転換の危険性を伴わないで、他のPRRSウィルスタンパク質に対する免疫応答を誘発することが予測される。
でゲノムに結合し、そしてORF3のオーバーラップするアミノ酸配列を変更しないで、ORF4のATG開始コドンを破壊する突然変異を位置13225 で導入する。
でゲノムに結合し、そして外来性遺伝子の直接的なクローニングのためのAflII 及びMluI部位を導入する。逆方向プライマーは、5'-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT3'(配列番号40)であった。このプライマーは、ORF7コード配列において位置 14981−14999 でゲノムに結合する。
を生成した。このプラスミドは、欠失され、そして15個の塩基のクローニング部位により置換されたORF4クローニング配列の176個の塩基を有する。
delta4NSにおいて行なわれた変化は、p2-7D-4delta4N及びp2-7D-4delta4NS からの修飾された BsrGI−SpeIフラグメントにより、pCMV-S-P129 からの BsrGI−SpeIフラグメントを置換することによって、十分な長さのゲノムクローン中に組込まれた。その得られるプラスミドpCMV-S-P129delta4N及びpCMV-S-P129delta4NS は、細胞をトランスフェクトするために使用された。
をさらに特徴づけた。プラスミドpCMV-S-P129delta4NS によりトランスフェクトされたMARC400E9 細胞におけるウィルスヌクレオカプシドについての免疫螢光染色は、陽性であった。
異種遺伝子が遺伝子−欠失されたPRRSウィルスから発現され得るかどうかを決定するために、本発明者は、プラスミドpCMV-S-P129delta4NにおけるORF4欠失の部位中に緑色螢光タンパク質(GFP)のコピーを挿入した。GFP遺伝子を、前記遺伝子の5’末端でAflII 部位及び前記遺伝子の3’末端でMluI部位を導入されたPCRプライマーを用いて、市販のプラスミドから増幅した。得られるプラスミドpCMV-S-P129delta4N-GFPを用いて、MARC-145及びMARC400E9 細胞をトランスフェクトした。
異種遺伝子が複製−コンピテントPRRSウィルスから発現され得るかどうかを決定するために、本発明者は、ORF1b とORF2との間の領域中にGFPのコピーを挿入した。ORF2のためのリーダー/連結(L/J)配列はORF1b 内に存在するので、このL/J配列を用いて、GFP遺伝子の発現を駆動し、そしてORF6 L/J配列のコピーを、ORF2の発現を駆動するためにGFPから下流に挿入した。
でゲノムに結合する。上流のフランキング逆方向プライマーは、5'-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTCA-3'
(配列番号43)であった。このプライマーは、ORF1b において位置 12031−12055 でゲノムに結合し、そしてORF1b とORF2との間に、外来性遺伝子の直接的なクローニングのためのAflII 及びMluI部位を付加する。
でゲノムに結合し、そしてMluI部位、続いて、ORF6の開始の先に存在する40個の塩基(ORF6 L/J配列を含む)を含む。下流のフランキング逆方向プライマーは、5'-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3'(配列番号45)であった。このプライマーは、ORF5における位置 13819−13844 でのゲノムに結合する。
次の生物学的材料が、1998年11月19日、10801 University
Blvd., Manassas, Virginia, 20110−2209にあるAmerican Type Culture Collection
(ATCC) に寄託され、そして次の受託番号が割り当てられた:
プラスミド 受託番号
プラスミドpT7P129A 203488
プラスミドpCMV-S-P129 203489
上記に引用されたすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書中に組込まれる。
本発明は、本発明の個々の観点の単一の例示として意図される、本明細書に記載される特定の態様により発明の範囲を限定されず、そして機能的に同等の方法及び成分は、本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、そして記載されている修飾の他に、本発明の種々の修飾は当業者に明らかである。そのような修飾は、本発明の範囲内にある。
Claims (13)
- ブタ動物に感染した場合に、その動物においてPRRSを生成することができないように遺伝子的に修飾されている北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するが、但しPRRSを生成するその能力において前記コードされたPRRSウィルスを遺伝子的に無能にする1又は複数の突然変異を含むDNA配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド分子。
- ブタ動物に感染した場合に、その動物においてPRRSを生成することができないように遺伝子的に修飾されている北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するが、但しPRRSを生成するその能力において前記コードされたPRRSウィルスを遺伝子的に無能にする1又は複数の突然変異を含むDNA配列を含んで成る、前記コードされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを発現することができるトランスフェクトされた宿主細胞。
- PRRSウィルスによる感染からブタ動物を保護するためのワクチンであって、請求項1記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルス、又は前記感染性RNA分子、又はプラスミドの形での前記ポリヌクレオチド分子、又はPRRSウィルスによる感染に対する効果的な免疫保護応答を誘発することができる北米PRRSウィルスをコードする請求項1記載のヌクレオチド配列を含んで成るウィルスベクターを、PRRSウィルスによる感染に対して免疫保護を生成するのに効果的な量で、及び獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
- 哺乳類又は鳥における特定の病原体に対しての効果的な免疫保護応答を誘発できる1又は複数の異種抗原性エピトープを含むように遺伝子的に修飾されている北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するが、但し異種抗原性エピトープをそれぞれコードする1又は複数の追加のヌクレオチド配列を含んで成るDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列が、ブタ動物においてPRRSを生成するその能力において前記コードされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを無能にする1又は複数の突然変異を含んで成る、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
- プラスミドの形での請求項4記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
- 哺乳類又は鳥における特定の病原体に対しての効果的な免疫保護応答を誘発できる1又は複数の異種抗原性エピトープを含むように遺伝子的に修飾されている北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するが、但し異種抗原性エピトープをそれぞれコードする1又は複数の追加のヌクレオチド配列を含んで成るDNA配列を含んで成るトランスフェクトされた宿主細胞において、前記遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列が、ブタ動物においてPRRSを生成するその能力において前記コードされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを無能にする1又は複数の突然変異を含んで成る、ことを特徴とする宿主細胞。
- 病原体による感染から哺乳類又は鳥を保護するためのワクチンであって、請求項4記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルス、又は前記感染性RNA分子、又は請求項5記載のプラスミドを、1又は複数の異種抗原性エピトープを提供するか又はそれらによりコードされる病原体による感染に対して免疫保護を生成するのに効果的な量で;及び医薬又は獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
- PRRSウィルスによる感染からブタ動物を保護するためのワクチンであって、ブタ動物においてPRRSを生成することができないが、まだそのブタ動物においてPRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう処理されているか又は遺伝子的に修飾されている、1又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含んで成る、請求項1記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルス;又は前記感染性RNA分子(ここで1又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含んで成る、前記感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスが、PRRSを生成することができないが、まだ、PRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る);又はプラスミドの形での請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド分子(1又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含んで成る、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスが、PRRSを生成することがでないが、なおPRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る);又はPRRSを生成することができないが、まだPRRSウィルスに対して効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る、1又は複数の検出できる異種抗原性エピトープを含んで成る遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするヌクレオチド配列をコードするウィルスベクターを、PRRSウィルスによる感染に対して免疫保護を生成するのに効果的な量で;並びに獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
- 検出できる抗原性エピトープを欠失するよう遺伝子的に修飾されている北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードする、配列番号1又はそれに対して少なくとも85%の同一性を有するが、但し検出できる抗原性エピトープをコードする1又は複数のDNA配列を欠いているDNA配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド分子。
- PRRSウィルスによる感染からブタ動物を保護するためのワクチンであって、ブタ動物においてPRRSを生成することができないが、まだそのブタ動物においてPRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう処理されているか又は遺伝子的に修飾されている、1又は複数の検出可能な抗原性エピトープを欠いている、請求項9記載のポリヌクレオチド分子によりコードされる感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルス;又は前記感染性RNA分子(1又は複数の検出できる抗原性エピトープを欠いている、前記感染性RNA分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスが、PRRSを生成することができないが、まだ、PRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る);又はプラスミドの形での請求項9記載の単離されたポリヌクレオチド分子(1又は複数の検出できる抗原性エピトープを欠いている、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスが、PRRSを生成することがでないが、まだ、PRRSウィルスに対する効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る);又はPRRSを生成することができないが、まだPRRSウィルスに対して効果的な免疫保護応答を誘発することができるよう追加の遺伝子修飾を含んで成る、1又は複数の検出できる抗原性エピトープを欠いているそのような遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするヌクレオチド配列をコードするウィルスベクターを、PRRSウィルスによる感染に対して免疫保護を生成するのに効果的な量で;並びに獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
- 野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得ることにより、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィルスによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発できるまま存続する遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得るために、前記野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を遺伝子的に突然変異誘発し、そしてそのようにして得られた、単離されたポリヌクレオチド分子から遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを発現することによって調製される、遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において免疫保護応答を誘発することができる遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスにおいて、前記遺伝子的に修飾されたDNA配列が、ブタ動物においてPRRSを生成するその能力において前記コードされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを無能にする1又は複数の突然変異を含んで成る、ことを特徴とするニドビラレスウイルス。
- 遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において免疫保護応答を誘発できる遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを調製するための方法であって、野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性DNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得ることにより、哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィルスによる感染に対して効果的な免疫保護応答を誘発できるまま存続する遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を得るために、野生型ニドビラレスウィルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を遺伝子的に突然誘発し、そしてそのようにして得られた、単離されたポリヌクレオチド分子から遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを発現する、ことを含んで成る方法において、前記遺伝子的に修飾されたDNA配列が、ブタ動物においてPRRSを生成するその能力において前記コードされた遺伝子的に修飾された北米PRRSウィルスを無能にする1又は複数の突然変異を含んで成る、ことを特徴とする方法。
- 請求項11記載の遺伝子的に修飾されたニドビラレスウィルスを、それらによりワクチン接種された哺乳類又は鳥において野生型ニドビラレスウィルスに対して効果的な免疫保護応答を誘発するのに有効な量で、及び医薬又は獣医学的使用のために許容できるキャリヤーを含んで成る、ニドビラレスウィルスによる感染から哺乳類又は鳥を保護するためのワクチン。
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