TWI554609B - 抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物 - Google Patents

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Description

抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組 融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物
本發明是有關於一種動物用之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物，特別是有關於一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及其於次單位疫苗組成物之應用。
豬繁殖與呼吸道綜合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome；PRRS)於1987年首度在北美發現，之後數年陸續於全球養豬場爆發，對於養猪產業造成極大損失，因此如何防治PRRS成為全球養豬產業亟待解決之問題。各年齡層豬隻皆可能感染PRRS，除了造成豬隻生殖障礙之外，還會發生呼吸道症狀並死亡。 PRRS由豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus；PRRSV)感染所造成，此病毒隸屬動脈病毒科(Arteriviridae)，含正向(+)單股RNA genome，具有封套，其病毒直徑約為50-70nm。PRRSV之基因組總長為15 kb，共有10個Open reading frames(ORFs)。其中ORF5能夠轉譯出26kDa之糖化蛋白GP5，而ORF6則可轉譯出19kDa之非糖化膜蛋白(unglycosylated membrane protein；M)。
目前市售PRRSV疫苗主要有三類，包括活毒減毒疫苗、死毒疫苗以及由大腸桿菌生產之次單位疫苗。活毒減毒疫苗雖可同時誘發細胞性與體液性免疫反應，但其中和抗體力價偏低，保護效力不足且有排毒與返毒風險。死毒疫苗雖無返毒風險但只能誘發體液性免疫反應，需免疫兩次才可達到保護效果，且對異源性病毒完全失去保護力。此外，目前並無確切數據顯示由大腸桿菌生產之次單位疫苗具備保護效力。
有鑑於PRRSV為RNA病毒，其演化突變速度相當迅速，亟需開發一種安全、不有排毒與返毒風險且具免疫保護力之疫苗，以克服習知疫苗的種種缺點。
因此，本發明之一態樣是在提供一種單離之核酸，其包含如序列辨識編號(SEQ ID NO.)：1所示之重組融合抗原基因，其中此重組融合抗原基因是將豬生殖與呼吸綜 合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus；PRRSV)之截短N’端誘餌抗原決定位(truncated N’-terminal decoy epitope)的醣蛋白GP5、連接序列以及膜蛋白M融合為重組序列並進行密碼子優化。
其次，本發明之另一態樣是在提供一種重組病毒質體，其包含如SEQ ID NO.：1所示之重組融合抗原基因。
再者，本發明之又一態樣是在提供一種重組融合抗原蛋白，其包含如SEQ ID NO.：1所示之核酸片段經重組桿狀病毒表現系統表現之重組融合抗原蛋白，藉此提升其重組融合抗原蛋白的表現量。
本發明之再一態樣是在提供一種抗PRRSV感染之次單位疫苗組成物，其包含如SEQ ID NO.：1所示之核酸片段經重組桿狀病毒表現系統表現之重組融合抗原蛋白及醫藥學上可接受之載劑，以提供較佳的疫苗保護力又不具排毒與返毒風險。
根據本發明之上述態樣，提出一種單離之核酸，其包含如序列辨識編號(SEQ ID NO.)：1所示之重組融合抗原基因。
根據本發明之上述態樣，另提出一種重組病毒質體，其包含如SEQ ID NO.：1所示之重組融合抗原基因。
根據本發明之上述態樣，又提出一種重組融合抗原蛋白，其包含如SEQ ID NO.：1所示之核酸片段經重組桿狀病毒表現系統表現之重組融合抗原蛋白。
根據本發明之上述態樣，再提出一種抗PRRSV感染之次單位疫苗組成物，其包含如SEQ ID NO.：1所示之核酸片段經重組桿狀病毒表現系統表現之重組融合抗原蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
依據本發明一實施例，上述之醫藥學上可接受之載劑包含佐劑及/或免疫增效劑。在一個例示中，前述免疫增效劑可例如為CpG增效劑，其序列如SEQ ID NO.：2所示。
應用本發明之抗PRRSV感染之重組融合抗原基因及其重組融合抗原蛋白，其係將PRRSV之截短N’端誘餌抗原決定位的醣蛋白GP5、連接序列以及膜蛋白M融合為重組融合抗原基因並將此序列進行密碼子優化後，再利用重組桿狀病毒表現系統進行體外表現，可提升其重組融合抗原蛋白的產量。所得之重組融合抗原蛋白在應用於次單位疫苗組成物時，可提供較佳的疫苗保護力又不具排毒與返毒風險，從而有效改善習知PRRSV抗原產量低落、免疫保護力不佳、以及具排毒與返毒風險等種種問題。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：圖1A係繪示根據本發明一實施例之重組病毒質體的載體圖譜。
圖1B係顯示根據本發明一實施例之重組質體經限制酶作用後的電泳分析照片。
圖2係顯示根據本發明一實施例之重組病毒質體經PCR反應後的產物之電泳分析照片。
圖3係顯示根據本發明一實施例之Hi-5細胞表現重組融合抗原蛋白的SDS-PAGE分析照片。
圖4係顯示根據本發明一實施例之Hi-5細胞表現重組融合抗原蛋白的西方墨點分析照片。
承前所述，本發明提供一種抗PRRSV感染之重組融合抗原基因及其重組融合抗原蛋白，其係將PRRSV之截短N’端誘餌抗原決定位的醣蛋白GP5、連接序列以及膜蛋白M融合為重組融合抗原基因並將此序列進行密碼子優化後，再利用重組桿狀病毒表現系統進行體外表現，可提升其重組融合抗原蛋白的產量。
本發明此處所稱之「重組融合抗原基因」係指如序列辨識編號(SEQ ID NO.)：1所示之重組融合抗原基因序列。在一實施例中，將PRRSV之醣蛋白GP5之N’端誘餌抗原決定位截短後的基因序列，利用連接(linker)序列與膜蛋白M之基因序列融合為重組序列(或稱為6LdN5)。
申言之，PRRSV之醣蛋白GP5與膜蛋白M為病毒封套(envelope)之主要成分，二者形成以雙硫鍵結合之雙聚體，其含量至少佔總病毒蛋白之1/2。醣蛋白GP5與膜蛋白M均能誘發保護性免疫反應並誘發宿主產生中和抗體，但位於醣蛋白GP5的N-末端處的誘餌抗原決定位 (decoy epitope)約30個胺基酸會減低中和抗體之產生及其反應性，因此本發明之特徵之一就是截去醣蛋白GP5之N’端誘餌抗原決定位第1個胺基酸至第10個胺基酸，形成「截短N’端誘餌抗原決定位」的醣蛋白GP5，利用連接序列與膜蛋白M融合為重組序列，並對此重組序列進行密碼子優化，不僅增加後續於重組桿狀病毒表現系統中的產量，所得之重組融合抗原蛋白經過真核表現系統的後轉譯修飾後，也具有正確的三級結構及折疊。
本發明此處所稱之「連接序列」係用以連接醣蛋白GP5以及膜蛋白M，其長度不拘，可例如為6個鹼基至30個鹼基，然以9個鹼基至24個鹼基為較佳，又以9個鹼基至15個鹼基為更佳。在一個例子中，前述連接序列可為12個鹼基。
本發明此處所稱之「密碼子優化」係指在不改變原胺基酸序列的前提下，根據重組桿狀病毒表現系統對各胺基酸密碼子的喜好，進行密碼子優化，使重組蛋白可以進行正確的後轉譯修飾，發揮免疫保護效果。其理由在於，大腸桿菌雖然是目前最普遍的蛋白質表現系統，具有生長週期快、產量高及成本低等優點，但無法進行正確的醣化作用(glycosylation)等後轉譯修飾，以致形成不溶性的內涵體的機率較高。相較之下，重組桿狀病毒表現系統可產生大量重組蛋白，而且可以進行正確的醣化作用等後轉譯修飾。在一實施例中，由此表現所得之重組融合抗原蛋白具有正確的醣基以及折疊結構。
上述SEQ ID NO.1所示之重組融合抗原基因序列(或稱為6LdN5)，利用市售序列分析軟體(例如DNAStar)，與原始基因(或稱wild-type)比對後，其比對結果如表1所示。
由表1的比對結果可知，SEQ ID NO.1所示之重組融合抗原基因序列(或稱為6LdN5)經密碼子優化後，與原始基因(或稱wild-type)之相似度僅89.5%。
本發明此處所稱之「重組桿狀病毒表現系統」係指桿狀病毒表現載體(baculovirus expression vector；BEV)及其宿主昆蟲細胞所構成的基因表現系統。桿狀病毒是一種感染無脊椎動物的大型DNA病毒，主要寄主為昆蟲及部分節肢動物。由於人類及其他脊椎動物都不是桿狀病毒的寄主，因此由桿狀病毒所開發出的桿狀病毒表現載體系統(baculovirus expression vector system；BEVS)非常安全。所謂桿狀病毒表現載體係指載有外源基因之重組桿狀病毒(recombinant baculovirus)。一旦桿狀病毒表現載體感染宿主昆蟲細胞，即可利用桿狀病毒表現載體中的強勢啟動子控制外源基因的表現，並生產出大量的重 組蛋白。由桿狀病毒表現載體系統所得的重組蛋白的轉譯後修飾(post-translational modifications)，例如，與在哺乳動物細胞中所生產者相類似，因此利用桿狀病毒表現載體系統所生產的重組蛋白，不論在抗原性、免疫原性以及生物活性上，大體上與原來蛋白質相似甚至幾乎一致。
在一個例子中，前述重組融合抗原基因序列在構築於桿狀病毒載體後，重組融合抗原基因序列的5'端更可選擇性與桿狀病毒膜醣蛋白(membrane glycoprotein)gp64的訊號胜肽(signal peptide)之基因序列連接。由此表現具有gp64的訊號胜肽的重組融合抗原蛋白，在細胞內的遞送過程中，gp64的訊號胜肽可能會被切除。
在應用時，可將本發明之重組融合抗原蛋白與醫藥學上可接受的載體，製成次單位疫苗組成物，接種於豬隻。在一實施例中，前述醫藥學上可接受之載劑包含佐劑及/或免疫增效劑，其中前述佐劑之種類不拘，其具體例子可包括但不限於鋁膠佐劑、或油質佐劑(例如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等)或上述之任意組合。前述之免疫增效劑可例如具有CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸(或稱CpG增效劑)等。在一例示中，前述CpG增效劑可例如SEQ ID NO.：2所示之序列。在一實施例中，經上述含有CpG增效劑之次單位疫苗組成物免疫之豬隻，其對抗PRRSV感染的保護力可達100%。
由於本發明的重組融合抗原蛋白是將PRRSV之醣蛋白GP5之N-端誘餌抗原決定位(decoy epitope)截短並與膜蛋白M基因融合，中間加入連接(linker)序列，再 將此重組融合抗原基因序列進行密碼子優化，可強化其於昆蟲細胞之表現。其次，當帶有此重組融合抗原基因之重組病毒質體轉染至重組桿狀病毒表現系統進行表現時，可有效提高重組融合抗原蛋白的產量。
其次，本發明利用重組桿狀病毒表現系統進行生產，可以進行懸浮培養，不僅操作簡單、產率高、生產規模容易放大，而且宿主昆蟲細胞具有與哺乳動物細胞相似之轉譯後修飾作用，可生產保有原來生物功能之抗原蛋白。本發明經後續動物免疫實驗證實，以此製得之次單位疫苗組成物的保護效力高達100%，可提供受免疫動物較佳的疫苗保護力又不具排毒與返毒風險，故此技術可望應用在新劑型之PRRSV疫苗組成物，以防治豬繁殖與呼吸道綜合症。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例一：建立pBacF-gp-6LdN5之重組病毒質體
在此實施例中，依據NCBI Genbank所公開含有PRRSV ORF5(醣蛋白GP5)及ORF6(M蛋白)之序列AF035409，設計6LdN5重組融合抗原基因。
請參閱SEQ ID No.：1之序列，首先，將ORF6(第145個鹼基至第681個鹼基)設計於ORF5(第694個鹼基至第1266個鹼基)之前端，中間加入連接序列(第682個鹼基 至第693個鹼基)，並於ORF5及6基因兩端設計帶有Sal I(第121個鹼基至第126個鹼基)、多重限制酶切位序列(第127個鹼基至第144個鹼基)、及Not I(第1288個鹼基至第1295個鹼基)之限制酶切割位。在上述Sal I限制酶切割位之5’端，可進一步連接至後續由pBacF-gp轉移載體(transfer vector)提供之gp64訊號胜肽的基因序列(第1個鹼基至第120個鹼基)，使PRRSV ORF6之N’端序列與gp64訊號序列融合。在ORF5(第694個鹼基至第1266個鹼基)之後另連接His tag(第1267個鹼基至第1284個鹼基)以及終止密碼子(第1285個鹼基至第1287個鹼基)，並以市售基因設計軟體(例如Genomics BioSci & Tech,Ltd.提供的Codon Optimization Services或其他市售可得之軟體，如EnCor Biotechnology Inc.提供的Codon Optimization Calculator，DNA2.0,Inc.提供的GeneGPS® Expression Optimization Technology，ProteinCT Biotech提供的Codon Optimization and Verification Services等)進行密碼子優化後，合成重組基因並命名為6LdN5，其大小為1295bp。
上述6LdN5重組融合抗原基因的核酸片段經純化後，與pBacPAK8-gp轉移載體(transfer vector)(即桿狀病毒載體，具有gp64訊號胜肽之基因序列)進行接合作用，以構築重組病毒質體。
前述之pBacPAK8轉移載體的全長大小為約5.5kb，包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus；AcMNPV)基因，可提供與轉移的DNA進行重組之序列。pBacPAK8轉移載體另含有高度表現的多角體啟動子(polyhedrin promoter；PPH)、抗氨苄西林(ampicillin；Amp)的選擇性標誌(selective marker)基因及SV40聚腺苷酸化訊息(polyadenylation signal)。前述的6LdN5之重組基因與pBacPAK8-gp病毒載體(帶有gp64訊號胜肽之基因序列)接合後，即為重組病毒質體(或稱pBacPAK8-gp-6LdN5)，其全長大小為約6.7kb，如圖1A所示。
上述所得之重組病毒質體(或稱pBacPAK8-gp-6LdN5)再轉型至大腸桿菌(Escherichia coli XL-1 Blue；Invitrogen,California,USA)勝任細胞，以抗生素篩選目標基因確實插入表現載體之菌株，再利用限制酶Xba I(在pBacPAK8-gp病毒載體上，緊鄰gp34基因序列5’端的上游)以及Not I切割出目標基因並經DNA電泳分析，其結果如圖1B所示。
請參閱圖1B，其係顯示根據本發明一實施例之重組病毒質體經限制酶切割後的產物之電泳分析照片，其中第M道為DNA標記，第1道為pBacPAK8-gp病毒載體利用限制酶Xba I以及Not I切割後的DNA片段，第2道為重組病毒質體(pBacPAK8-gp-6LdN5)利用限制酶Xba I(切割位在病毒載體上)以及Not I切割後的DNA片段，而第2道在 1295bp處即為6LdN5之重組基因以及部份載體序列的DNA片段。
另外，上述所得之轉型株，再利用PCR反應並經DNA電泳分析，其結果如圖2所示。上述PCR反應可利用5μL之2x PCR Mastermix(0.5U SuperTherm DNA polymerase mix,200μM dNTPs,1.5mM MgCl2,1x buffer)(Bertec,Taiwan)、1μL之2.5mM 6L5(SalI)forward primer、1μL之2.5mM 5his(NotI)reverse primer以及3μL之二次去離子水配製成反應物後，先在94℃反應5分鐘，然後依序在94℃進行1分鐘的DNA變性步驟、在56℃進行90秒之DNA與引子黏合步驟以及在72℃進行1分鐘之DNA增幅步驟等三個步驟，進行30次的循環，循環結束後，在72℃進行7分鐘之DNA增幅步驟。反應結束後，取4μL PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢視結果。前述6L5(SalI)forward primer之序列如SEQ ID NO：3所示，而5his(NotI)reverse primer之序列則如SEQ ID NO：4所示。以上述6L5(SalI)與5his(NotI)之引子對增幅出的DNA序列，包含截短N’端誘餌抗原決定位的醣蛋白GP5的基因序列、連接序列與膜蛋白M之基因序列，但不含gp64訊號胜肽之基因序列。
請參閱圖2，其係顯示根據本發明一實施例之重組病毒質體經聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)反應後的產物之電泳分析照片，其中第M道為DNA標記，第1道為重組病毒質體 (pBacPAK8-gp-6LdN5)經PCR反應及1%瓊膠電泳分析後，確認所得的DNA片段為1151bp。
上述初步確定之轉型株另委託台北源資國際生物科技股份有限公司以核酸序列自動定序儀(ABI 3730,CD Genomics,USA)進行核酸定序後，確認插入的序列正確無誤。前述之構築轉型質體、細胞轉型、篩選目標菌株、質體DNA萃取、限制酶反應、PCR反應、DNA電泳分析、DNA定序等，應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，此處不再贅述。
實施例二：建立重組桿狀病毒表現系統 1.昆蟲細胞培養
此實施例係以秋行軍蟲蛹Sf9細胞株(Spodoptera frugiperda)(BCRC 60011；ATCC CRL-1711)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)卵High Five(以下簡稱Hi-5)細胞株(BTI-TN-5B1-4)(例如Invitrogen Co.)建立重組桿狀病毒表現系統。
取9mL之Sf-9細胞培養基或Hi-5細胞培養基，加入10cm培養皿中。將Sf9細胞株或Hi-5細胞株的冷凍小管，快速至37℃水浴槽中解凍後，將細胞液均勻地分散於Sf-9細胞培養基或Hi-5細胞培養基中。之後，將培養皿置於28℃培養箱中培養，並以貼附方式生長，此時細胞型態為光滑圓潤形狀。
上述Sf-9細胞培養基為Grace’s Insect cell culture medium，每1000mL含0.35g NaHCO3、3g Lactalbumin hydrolysate、20mL yeastolate以及10%FBS，另添加10,000unit/mL Penicillin/Streptomycin。上述Hi-5細胞培養基可使用例如Sf-900II TM SFM(Invitrogen/GIBCO，USA)。
2.Sf-9細胞之轉染作用
取3×105/mL Sf9細胞培養至12孔(well)組織培養皿中，靜置於室溫下至少1小時，待細胞貼附，再各別將重組病毒質體DNA取1μg與2μL flashBAC DNA與6μL Cellfectin® Reagent(Invitrogen®)以unsupplemented Grace’s Medium(Gibco®)混合均勻，室溫下靜置45分鐘，將12孔(well)組織培養皿中之細胞上清液移除。之後，以Sf-900 II SFM清洗2次後，移除培養基，並將上述混合物1mL加入含細胞之12孔組織培養皿中，於27℃靜置培養5小時後，移除上清液，再加入1mL growth medium(TNM-FH；Sigma-Aldrich Co.LLC.,USA)，靜置於27℃培養箱5天以上或直到觀察到細胞出現感染徵狀。
3.重組桿狀病毒之分離與病毒力價增輻
上述轉染後的Sf9細胞經3至5天的培養，若觀察細胞出現受到病毒感染的細胞病變型態(cytopathic effect；CPE)時，即可進行回收重組桿狀病毒。
首先，將上清液移入1.5mL離心管以1,000xg，離心5分鐘，再將含有零代(P0)重組桿狀病毒的種毒庫存液(virus stock)，分裝移入新的棕色1.5mL離心管，避光儲存於-80℃備用。
取3×105/mL的Sf9細胞均勻回種至12孔組織培養皿中，室溫下靜置至待細胞貼附，再取15μL之零代(P0)重組桿狀病毒液加入培養基中，靜置於27℃培養箱5天後，即可進行分離初代(P1)重組桿狀病毒。分離時，將細胞上清液移入離心管，以1,000xg之轉速離心5分鐘後，再將含有初代(P1)重組桿狀病毒之種毒庫存液，分裝移入新的棕色離心小管中，避光儲存於-80℃備用。
重複上述步驟，放大第二代(P2)之重組桿狀病毒的產量後，回收病毒液並將第二代(P2)重組桿狀病毒之種毒庫存液儲存於-80℃備用。
實施例三：評估重組桿狀病毒表現系統之重組融合抗原蛋白的表現 1.分離重組融合抗原蛋白
取25mL之1×106/mL Hi-5細胞回種於125mL三角搖瓶中，加入重組桿狀病毒後於27℃培養3~5天後收取細胞，於4℃ 10,000 xg，離心10分鐘後去除上清液，而細胞部份則以超音波破碎機將細胞打破，定量蛋白後即完成重組融合抗原蛋白(或稱BV-gp6LdN5)之萃取，並以SDS-PAGE與西方墨點法分析。
2.SDS-PAGE分析
將換算定量過之樣品蛋白，加入4x Sample Buffer混合均勻，並於沸水煮沸5分鐘，利用SDS使蛋白質變性並且均勻帶負電。將製作膠體(gel)之玻璃平板裝置妥當，並補滿純水測試裝備是否安裝妥當。於小燒杯依序加入表2所示之試劑，製作分離膠體(separating gel)。
備妥上述分離膠體之後，將分離膠體緩慢注入玻璃平板內，並在分離膠體之界面上緩緩加上ddH2O，待25分鐘後分離膠體凝結聚合，以濾紙將殘餘的ddH2O吸乾。再依序加入表3所示之試劑，製作疊層膠體(stacking gel)。
約15分鐘後，疊層凝膠聚合完成，即可注入樣品。將玻璃平板於垂直電泳槽上裝置妥當，加入1x Running buffer。將樣品置入膠體中，樣品於疊層膠體時設60V，等跑到分離膠體改以120V分離蛋白質。約3小時後，可完成電泳程序，其結果如圖3所示。
請參閱圖3，其係顯示根據本發明一實施例之Hi-5細胞表現重組融合抗原蛋白的SDS-PAGE分析照片，其中1μg、2μg、4μg、8μg之BSA的色帶係用來建立標準曲線，第M道為蛋白質標記，第1道為Hi-5細胞蛋白的色帶，第2道為由Hi-5細胞表現重組融合抗原蛋白的色帶。由圖3之第2道色帶的結果可知，Hi-5細胞所表現之重組融合抗原蛋白的大小為41kDa。
3.西方墨點法分析
上述SDS-PAGE蛋白質電泳完成後，拆下玻璃片切除疊層膠體，將分離膠體浸泡於轉印緩衝液(Transfer buffer)中10分鐘。另準備轉漬夾，於轉漬夾鋪上一層以轉印緩衝液浸泡過之Whatman 3M濾紙(Advantec,Japan)。剪下適當大小之PVDF轉印膜(Immobilon TM-P Transfer Membrane,Millipore,Ireland)浸泡於100% Methanol時間約為5分鐘左右，再以轉印緩衝液浸泡至表面，放置於濾紙上。將浸泡於轉印緩衝液之膠片放置於 PVDF膜上，最後鋪上一張濾紙，將夾好膠與膜的轉漬夾放入轉漬槽中。有PDVF膜需放置於朝向正極，而膠片朝向負極，以250mA條件下，進行轉漬75分鐘。
取下PVDF膜以1x PBST清洗5分鐘，加入Blocking buffer，於4℃震盪1小時。加入一級抗體(Mouse anti-His Monoclonal Antibody，Rural Technologies,Inc.；稀釋倍數：1：2,000)，置於4℃震盪18小時。去除一級抗體後，以1xPBST清洗PVDF膜數次後，再加入二級抗體(Goat Anti-mouse IgG-HRP，Chemicon,USA；稀釋倍數：1：15,000)，置於4℃震盪60分鐘。去除二級抗體後，以1x PBST清洗PVDF膜數次。接著，去除PBST緩衝液，加入ECL Plus顯色劑(ECL Plus Western Blotting Detection Reagents，GE Healthcare,UK)，反應1分鐘。之後，將PVDF膜置於冷光儀照相系統(SYNGENE G，博克科技，Taiwan)之平台正中間，以市售影像分析軟體進行分析後，可計算出目標蛋白之分子量，其結果如圖4所示。
請參閱圖4，其係顯示根據本發明一實施例之Hi-5細胞表現重組融合抗原蛋白利用抗His單株抗體的西方墨點分析照片，其中第M道為蛋白質標記，第C道為Hi-5細胞蛋白的色帶，第1道為Hi-5細胞表現第2天之重組融合抗原蛋白的色帶，第2道為Hi-5細胞表現第3天之重組融合抗原蛋白的色帶，第3道為Hi-5細胞表現第4天之重組融合抗原蛋白的色帶，第4道為Hi-5細胞表現第5天之重組融合抗原蛋白的色帶。由圖4之第1~4道色帶的結果可知，重組 融合抗原蛋白的產量隨著表現天數的增加而依次遞增，在第5天時重組融合抗原蛋白的產量為533μg/mL。
4.毒力試驗
選取3-4周齡的剛斷奶仔豬，PRRSV和豬瘟(classical swine fever；CSF)抗原及抗體皆陰性的豬8頭。在進行攻毒前3天，將所有試驗豬測量體溫3天，體溫均正常者才進行攻毒。進行攻毒時，以105.0TCID50/mL之PRRSV病毒力價，於每頭頸部肌肉注射3mL。攻毒後，每天測量體溫並觀察14天。觀察期結束後，進行剖檢觀察臨床症狀及病理變化，同時採血進行PCR檢測。
5.免疫攻毒試驗
選取3-4周齡的剛斷奶仔豬，PRRSV和CSF抗原、抗體均陰性的豬15頭，隨機分三組，第一組：免疫前述萃取之重組融合抗原蛋白與市售油質佐劑(例如弗氏不完全佐劑等)5頭，每頭頸部肌肉注射2mL之次單位疫苗組成物(含有50μg抗原蛋白以及1.2mL油質佐劑)。第二組：前述萃取之重組融合抗原蛋白、市售油質佐劑(例如弗氏不完全佐劑等)與CpG增效劑(如SEQ ID NO.：2所示之序列)，每頭頸部肌肉注射2mL之次單位疫苗組成物(50μg抗原蛋白、1.2mL油質佐劑以及50μg CpG增效劑)。剩餘未接種的豬作為陰性對照(或第三組)，僅接種High 5細胞液與油質佐劑(含有125μL細胞萃取液以及1.2mL油質佐劑)，隔離飼養。免疫28天後將所有試驗豬進行PRRSV病毒液攻毒，頸部肌肉注射105.0TCID50/mL，每頭注射3mL。觀察21天。待觀察 期結束後進行剖檢，根據臨床症狀、病理變化和抗原、抗體檢測進行判定。
經上述免疫攻毒試驗後，第一組的豬隻的保護效力高達75%，第二組的豬隻的保護效力更高達100%，而第三組的豬隻的保護效力為0%。由此確實證明以此製得之次單位疫苗組成物確實可提供充份的保護效力，而且次單位疫苗組成物中添加免疫增效劑，保護效力更佳，可望應用在新劑型之PRRSV次單位疫苗組成物，以防治豬繁殖與呼吸道綜合症。
需補充的是，本發明雖以特定的重組質體、表現系統、分離方法、培養方法、分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明的抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物亦可使用其他重組質體、其他的真核表現系統、其他分離方法、其他培養方法、其他分析方法或其他儀器進行。
由上述本發明實施例可知，本發明的抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原基因、重組融合抗原蛋白及含彼之次單位疫苗組成物，其優點在於將PRRSV之截短N’端誘餌抗原決定位的醣蛋白GP5、連接序列以及膜蛋白M融合為重組融合抗原基因並將此序列進行密碼子優 化後，再利用重組桿狀病毒表現系統進行體外表現，可提升其重組融合抗原蛋白的產量。所得之重組融合抗原蛋白在應用於次單位疫苗組成物時，可提供較佳的疫苗保護力又不具排毒與返毒風險，從而有效改善習知PRRSV抗原產量低落、免疫保護力不佳、以及具排毒與返毒風險等種種問題。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立屏東科技大學
<120> 抗豬生殖與呼吸綜合症病毒感染之重組融合抗原蛋白及含彼之疫苗組成物
<130> 無
<160> 4
<210> 1
<211> 1295
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV重組融合抗原基因
<400> 1
<210> 2
<211> 230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG增效劑
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6L5(SalI)forward primer
<400> 3
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5his(NotI)reverse primer
<400> 4

Claims (7)

  1. 一種單離之核酸，其包含如序列辨識編號(SEQ ID NO.)：1所示之一重組融合抗原基因。
  2. 一種重組病毒質體，其包含如SEQ ID NO.：1所示之一重組融合抗原基因。
  3. 一種重組融合抗原蛋白，其包含如SEQ ID NO.：1所示之一核酸片段經一重組桿狀病毒表現系統表現之一重組融合抗原蛋白。
  4. 一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus；PRRSV)感染之次單位疫苗組成物，其包含如SEQ IDNO.：1所示之一核酸片段經一重組桿狀病毒表現系統表現之一重組融合抗原蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  5. 根據申請專利範圍第4項所述之抗PRRSV感染之次單位疫苗組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含一佐劑/或一免疫增效劑。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述之抗PRRSV感染之次單位疫苗組成物，其中該免疫增效劑包含一CpG增效劑。
  7. 根據申請專利範圍第6項所述之抗PRRSV感染之次單位疫苗組成物，其中該CpG增效劑為如SEQ ID NO.：2所示之序列。
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