TWI796782B - 豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物。重組抗原為PPRSV雙結構蛋白與T細胞表位抗原之嵌合蛋白。單離聚核苷酸則編碼重組抗原之胺基酸序列。上述聚核苷酸可利用真核表現系統表現出重組抗原，有利於量產及純化。含有上述重組抗原之免疫原性組成物更可促進豬肺泡巨噬細胞促發炎M1表型的極化，減少CD163受體的表現量，並活化巨噬細胞介導的輔助型T免疫反應，進而應用於抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物。

Description

豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚 核苷酸及含此之組成物
本發明係有關一種動物病毒之重組抗原及其應用，特別是有關於一種具有豬生殖與呼吸綜合症病毒(PPRSV)雙結構蛋白與T細胞表位抗原之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物。
豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)為正向單股RNA病毒，屬於巢狀病毒目(Nidovirales)、動脈病毒科(Arteriviridae)、豬動脈炎病毒屬(Porartevirus)，PRRSV感染後，會造成母豬繁殖障礙及生長豬隻呼吸系統疾病，在全球養豬業引起危害最嚴重的疾病之一。
PRRSV疫苗早在1990年代中期即開始使用。 目前市售PRRSV疫苗主要有四類，例如活毒減毒(modified live virus，MLV)疫苗、死毒(inactive virus，KIV)疫苗、次單位疫苗(subunit vaccine)及核酸疫苗(DNA疫苗、病毒載體疫苗)。活毒減毒疫苗雖可同時誘發細胞性與體液性免疫反應，但其中和抗體力價偏低、對異源性病毒的保護效力不足，且有排毒與返毒風險。死毒疫苗雖無返毒風險，比較安全，但只能誘發體液性免疫(humoral immunity)反應，需免疫二次才可達到保護效果，且對異源性病毒沒有保護力。換言之，無論死毒疫苗或馴化活毒疫苗，皆無法有效預防或控制PRRS。
至於次單位疫苗及核酸疫苗，雖改善上述缺點，也提高對於異源性病毒的保護力，但目前次單位疫苗及核酸疫苗大多針對ORF5研發，PRRSV在宿主誘發之免疫反應相當複雜，且PRRSV具迴避宿主免疫系統之機制，使得發展此病毒之疫苗具有相當困難性。
因此，本發明之一態樣是提供一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原，其為PPRSV雙結構蛋白與T細胞表位抗原之嵌合蛋白，以促進豬肺泡巨噬細胞的極化，並活化巨噬細胞介導的輔助型T(T helper，Th1)免疫反應。
其次，本發明之另一態樣是提供一種單離聚核苷 酸，其係編碼上述重組抗原之胺基酸序列。
再者，本發明之又一態樣是提供一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原的製造方法，其係將上述聚核苷酸利用真核表現系統表現出重組抗原，有利於量產及純化。
另外，本發明之再一態樣是提供一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之免疫原性組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述單離聚核苷酸。
此外，本發明之又另一態樣是提供一種促進豬肺泡巨噬細胞極化之免疫原性組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述單離聚核苷酸。
又，本發明之又再一態樣是提供一種減少CD163受體的表現量之免疫原性組成物或一種活化巨噬細胞介導的Th1免疫反應之免疫原性組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述聚核苷酸作為有效成分。
又，本發明之更另一態樣是提供一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述聚核苷酸。
根據本發明之上述態樣，提出一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原，其中重組抗原可例如為PPRSV雙結構蛋白與T細胞表位抗原之嵌合蛋白，其係由如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列所組成。
根據本發明之另一態樣，提出一種單離聚核苷酸，其係如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列，以編碼如 SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
根據本發明之再一態樣，提出一種單離聚核苷酸，其係如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列，以編碼如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
根據本發明之另一態樣，提出一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原的製造方法。在一實施例中，首先，將如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列轉染至真核表現系統。接著，培養轉染後的真核表現系統，以表現重組抗原，其中此重組抗原可例如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。然後，純化真核表現系統之培養上清液，以獲得此重組抗原。
在上述實施例中，前述真核表現系統可例如為巴氏病毒表現系統。
根據本發明之又另一態樣，提出一種促進豬肺泡巨噬細胞極化之免疫原性組成物，其包含上述PRRSV重組抗原及/或如上述單離聚核苷酸作為有效成分。在一例子中，前述肺泡巨噬細胞可例如為促發炎M1表型。
根據本發明之又再一態樣，提出一種活化Th1免疫反應之免疫原性組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述聚核苷酸作為有效成分。在一例子中，前述免疫原性組成物可用於減少CD163受體的表現量。
根據本發明之更另一態樣，提出一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物，其包含上述重組抗原及/或如上述聚核苷酸作為有效成分。
應用本發明豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物，其可利用真核表現系統表現出重組抗原，有利於量產及純化。含有上述重組抗原之免疫原性組成物更可促進豬肺泡巨噬細胞的促發炎M1表型之極化，減少CD163受體的表現量，並活化巨噬細胞介導之Th1免疫反應，進而應用於抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1A]及[圖1B]係分別顯示本發明一實施例利用細胞流式分析法檢測CD14、SLA II、CD80及CD163的細胞比例(圖1A)及平均螢光強度(圖1B)的直條圖。
[圖2A]係繪示根據本發明一實施例之PRRSV重組抗原攻毒之PAMs的M1巨噬細胞及M2巨噬細胞之mRNA表現的直條圖。
[圖2B]係顯示根據本發明一實施例之巨噬細胞之表面蛋白SLA II、CD80及CD163表現的細胞流式分析的直條圖。
[圖3]係繪示根據本發明一實施例之Rap1訊息傳遞路徑參與在TCR訊息傳遞路徑活化的預測結果。
[圖4]係繪示根據本發明另一實施例之Rap1訊息傳遞路徑的預測結果。
[圖5A]至[圖5E]係繪示根據本發明一實施例檢測促發炎基因表現的直條圖。
倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。其次，除非上下文另有定義，單數術語可包括複數，而複數術語亦可包括單數。
如前所述，本發明是提供一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物。前述重組抗原為PPRSV雙結構蛋白與T細胞表位抗原之嵌合蛋白。含有上述重組抗原之免疫原性組成物更可促進豬肺泡巨噬細胞的極化並活化輔助型T(T helper，Th1)免疫反應，進而應用於抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物。
本文所稱之「重組蛋白」、「嵌合蛋白」、「重組抗原」、「蛋白質」、「胜肽」及「多肽」是可互換的，指的是胺基酸的聚合物，通常藉由肽鍵或二硫鍵連接在一起。「胜肽」亦可用於其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸及其聚合物、或者對應於天然存在的胺基酸之類似物或模擬物的胺基酸聚合物。「胜肽」更包括經修 飾的胺基酸聚合物，例如，具有碳水化合物殘基之醣蛋白，或被磷酸化的胜肽。胜肽、多肽及蛋白質可利用液相合成、固相合成或利用基因工程、重組細胞、原核表現系統、真核表現系統產生。
此處所稱之「胺基酸」與「殘基」是可互換的，當與胜肽併用時，指的是天然存在及合成的胺基酸、胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在的胺基酸相似的非天然存在的胺基酸。
此處所稱之「PPRSV」的病毒株不拘，可例如PPRSV-1、PPRSV-2或PPRSV的其他型病毒株。在一實施例中，PPRSV」的病毒株可例如為PPRSV-2。
此處所稱之「豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原(或稱PRRSV重組抗原、重組抗原)」，指的是具有不同功能性序列之嵌合蛋白，例如PPRSV雙結構蛋白與T細胞表位抗原之嵌合蛋白。在一實施例中，前述PPRSV雙結構蛋白係指N端至C端的胺基酸序列是由ORF6部分序列-ORF5完整序列所組成。在一些例示中，前述PRRSV重組抗原可例如由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列所組成，其由N端至C端的胺基酸序列可例如為ORF6部分序列-ORF5完整序列-T細胞表位。在另一實施例中，PRRSV重組抗原由N端至C端的胺基酸序列可例如為GP64訊息胜肽-ORF6部分序列-ORF5完整序列-之T細胞表位(T cell epitopes)抗原。在其他實施例中，重組抗原之各功能性序列之間， 例如GP64訊息胜肽與ORF6部分序列之間、ORF6部分序列與ORF5完整序列之間、ORF5完整序列與T細胞表位抗原之間，可選擇性包含3至10個胺基酸的連接子。另外，為了方便後續純化蛋白，PPRSV重組抗原之C端可選擇性包含His標籤(His tag)。
此處所稱之「ORF5完整序列」指的是醣蛋白GP5，例如191個胺基酸。
此處所稱之「ORF6部分序列」指的是膜蛋白(M protein，M蛋白)，例如為M蛋白第1至175個胺基酸。
前述T細胞表位抗原可具有一或多個重複，其重複數並無特別限制。在一實施例中，前述T細胞表位抗原可具有至少一個重複。
在此說明的是，上述PRRSV重組抗原是經過特定的序列設計並按照特定的順序安排，才能發揮促進豬肺泡巨噬細胞促發炎M1表型的極化、減少CD163受體的表現量、活化Th1免疫反應及/或抗PPRSV的效果。倘若利用SEQ ID NO：1以外的胺基酸序列所得的重組蛋白，例如改變選用的序列範圍或改變安排的順序，則將無法發揮上述效果，即促進豬肺泡巨噬細胞(PAMs)促發炎M1表型的極化、減少CD163受體的表現量、活化Th1免疫反應及/或抗PPRSV等效果。
在一些實施例中，抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之免疫原性組成物可包含上述PRRSV重組抗原。在其他實施例中，抗PRRSV之免疫原性組成物可包含單離聚核苷 酸，其係PRRSV重組抗原A1之重組基因序列，在一些例示中，前述單離聚核苷酸如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列，以編碼如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，上述免疫原性組成物可例如促進豬肺泡巨噬細胞極化之免疫原性組成物、活化Th1免疫反應之免疫原性組成物及/或抗PPRSV之疫苗組成物。
此處所稱之「豬隻肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)極化(polarization)」指的是PPRSV的感染能力。PPRSV感染後，會使巨噬細胞極化偏向M2表型，進而使T細胞不活化。CD163是M2巨噬細胞上的清道夫受體之一，目前被認為是PPRSV的受體，用以介導病毒脫殼(virus uncoating)作用。在一些實施例中，PAMs極化可由促發炎細胞激素(例如TNF-α、IL-6及IL-12)的基因轉錄產物增加程度評估。
此處所稱之「活化Th1免疫反應」指的是活化T細胞的能力，可由T細胞受體訊息傳遞路徑的活化程度及/或減少CD163受體的表現量來評估。
在一些實施例中，以PRRSV重組抗原A1(亦稱為g6Ld10T)以及PRRSV重組抗原A2(亦稱為lipo-M5Nt，由脂肽-ORF6部分序列-ORF5部分序列-及ORF7部分序列組成)分別測試參與在PAMs極化與活化Th1免疫反應的能力。在一些實施例中，利用PRRSV 攻毒(challenge)後，PAMs上CD163的平均表現量顯著增加，但利用PRRSV重組抗原A1攻毒則顯著減少。利用PRRSV重組抗原A1攻毒後，PAMs的促發炎細胞激素(例如TNF-α、IL-6及IL-12)的基因轉錄產物顯著增加。此外，次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)的數據不僅支持上述結果，更顯示利用PRRSV重組抗原A1攻毒後，可提升PAMs之T細胞受體訊息傳遞路徑，但重組抗原A2則無此功效。在T細胞共培養系統中，利用PRRSV重組抗原A1對PAMs攻毒，可誘導巨噬細胞介導之Th1細胞的活化，使IFN-γ與IL-12的分泌量增加，並使PAMs的TNF-α與IL-6的基因表現助推(boosting)上調，但PRRSV重組抗原A2則無此功效。Th1細胞的活化潛在影響後續體液性免疫細胞(抗體分泌)的活化。從先天性免疫力及T細胞介導之免疫力的觀點，PRRSV重組抗原A1有潛力作為免疫原性組成物及/或疫苗組成物的有效成分，藉由將PAMs的極化狀態從免疫抑制表型(即M2)，轉變為促發炎表型(即M1)，進而減少讓病毒進入之CD163受體的表現，以及增加對Th1型的免疫調節反應。在一些實施例中，重組抗原A1可製成次單位疫苗及/或核酸疫苗(DNA疫苗、病毒載體疫苗)。
可以理解的是，下述特定的重組蛋白序列、特定的配方、特定的使用劑量、特定的檢測方式、觀點、例示及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在 不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例1 1.1 豬隻及接種
動物倫理聲明：以下實施例相關肺臟收集及豬隻安樂死係經國立屏東科技大學獸醫系實驗動物照顧及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)審查及核准。
此實施例是利用約8週齡至11週齡、體重約9公斤至12公斤的無特定病原(specific pathogen free，SPF)仔豬進行。這些仔豬在台灣國立屏東科技大學(NPUST)實驗動物中心的正壓環境內成長。
1.2 建構重組蛋白抗原
重組蛋白抗原1(A1)的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，由N端至C端是由GP64訊息胜肽(40個胺基酸)、ORF6部分序列(M蛋白，第1個至第175個胺基酸，共175個胺基酸)、ORF5完整序列(醣蛋白GP5，第11個至第201個胺基酸，共191個胺基酸)以及數個重複之T細胞表位(T cell epitopes)所建構而成。重組 蛋白抗原1(A1)的DNA序列則如SEQ ID NO：2所示，可利用巴氏病毒表現系統來表現出重組抗原1。
重組蛋白抗原2(A2)的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，由N端至C端是由脂肽(lipopeptide，40個胺基酸)、ORF6部分序列(M蛋白第2至27個胺基酸)、ORF5部分序列(醣蛋白GP5第31至63個胺基酸)及ORF7部分序列(N蛋白第42至123個胺基酸)所建構而成，並利用大腸桿菌(E.coli)表現系統表現。
關於上述巴氏病毒表現系統及大腸桿菌(E.coli)表現系統，可使用市售的表現系統進行，並無特別限制，相關表現系統誠屬本發明所述技術領域中具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。
1.3 收集豬肺泡巨噬細胞(PAMs)
豬隻經放血後予以安樂死。將氣管縫合，以避免氣胸(肺塌陷)，接著從胸腔取出心臟及肺臟。以無菌方式從新鮮肺臟中收集肺泡巨噬細胞。利用磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)對肺臟進行2至4次的支氣管內沖洗，然後將含有PAMs的沖洗液以300xg的轉速離心10分鐘。收集的PAMs種入24孔細胞培養盤中，於含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Hyclone,Logan,UT，美國)之完全RPMI-1640培養液(Corning,Manassas,VA，美國)中，在37℃及含有5% CO2的加濕空氣中維持。
1.4 細胞激素刺激
PAMs種入24孔細胞培養盤中並分成五組，分別為控制組(未處理)、LPS(10ng/mL，Sigma-Aldrich,Steinheim，德國)處理組、IL-4(20ng/mL，BIOTECH,INC)處理組、抗原A1(5μg/mL)處理組以及抗原A2(5μg/mL)處理組。經48小時處理後，收集細胞，萃取RNA並進行qPCR分析。
1.5 RNA萃取及即時定量PCR
根據製造商提供的方法利用Trizol試劑(Invitrogen,Canada，美國)萃取總RNA。利用iScript cDNA合成套組(Bio-Rad,Hercules,CA，美國)對總RNA(1μg)進行反轉錄反應(reverse transcription，RT)。根據製造商提供的方法，利用KAPA SYBR®快速型qPCR預混液(2X)套組[KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix(2X)Kit,KAPA Biosystem,Wilmington,DE，美國]進行即時定量PCR。利用QIAGEN公司的Rotor Gene Q即時PCR(QIAGEN Rotor Gene Q Real-Time PCR)分析系統，進行即時定量PCR反應。所使用的上游(forward)及下游(reverse)引子序列(5’-3’)如SEQ ID NOs：4至13所示。在95℃進行3分鐘擴增(amplification)步驟，接著進行40個循環的95℃ 3秒的變性反應 (denaturation)以及60℃ 20秒的黏合反應(annealing)。利用標準化mRNA水平之比較法2-△△Ct計算上述數據。
1.6 流式細胞分析法
收集並利用含有0.5% BSA(Sigma-Aldrich,Steinheim，德國)之PBS潤洗PAMs(1×106cells/mL)一次。上述細胞分別與1μg之FITC標定SLA II+抗體(FITC-SLA II+ Ab，Bio-Rad)、5μg之FITC標定CD14+抗體(FITC-CD14+ Ab，Invitrogen)、0.1μg之抗原呈現細胞(antigen-presentinf cell，APC)-CD80+(APC-CD80+)抗體(Invitrogen)以及藻紅素(phycoerythrin，PE)標定CD163+(PE-CD163+)抗體(稀釋倍率1：10，Invitrogen)，於冰上避光(dark)培養30分鐘。接著，上述細胞利用300×g離心5分鐘潤洗後，將細胞再懸浮(resuspend)於500μL至1mL之冰PBS中。然後，利用流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA，美國)檢測細胞表面蛋白的表現，利用市售分析軟體[BD FACSDivaTM軟體(BD Biosciences)以及FlowJo軟體(Tree Star,Inc.,Ashland,OR，美國)]進行分析。
1.7 次世代定序(Next Generation Sequencing， NGS)分析
根據製造商提供的方法，利用市售mRNA樣本庫製備套組[TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit(Illumina,San Diego,CA，美國)]純化RNA及合成cDNA。利用市售微流體電泳分析系統(Agilent Bioanalyzer 2100 system)及即時PCR系統(Real-Time PCR system)評估cDNA樣本庫。基因體的分析係委託基龍米克斯生物科技股份有限公司(Genomics,BioSci & Tech Company，新北市，台灣)，利用Illumina公司的Novaseq 6000定序系統，以150bp雙末端(paired-end)測序進行NGS。原始測序讀取長度的數據是利用市售軟體Trimmomatic(版本0.36)進行過濾。利用市售軟體Bowtie2(版本2.3.5)對讀取的長度進行序列比對。利用最大期望之RNA測序(RNA-Seq by Expectation-Maximization，RSEM，版本1.3.3)擷取原始基因數(raw gene counts)。利用市售R語言軟體套件之EdgeR v3.16.5分析工具(R package EdgeR v3.16.5 tool)對兩個樣本群進行差異基因表現分析。針對篩選出的差異基因進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析，當p<0.05時，GO術語定義為顯著富集。利用京都基因與基因組百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https：//www.genome.jp/kegg/kegg2.html)對差異表現基因進行基因富集分析。本實施例的數 據資料在2021年5月1日評估，可於線上典藏庫(NCBI Bioproject PRJNA665327：https：//dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA726625)找到。
1.8 整合蛋白質交互作用(protein-protein interaction，PPI)網路
檢索交互作用基因之搜尋工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING；string-db.org)可用於發掘在蛋白質層次上的潛在差異表現基因(differential expression gene，DEG)之交互作用。藉由STRING之DEGs的PPI網路是源自於驗證過的實驗。P<0.05表示具有統計顯著差異性。
1.9 分離豬隻周邊血液單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells；PBMCs)
利用Ficoll-Paque(GE Healthcare BioSciences，Uppsala，瑞典)密度梯度離心法，根據製造商提供的指引，以400×g之轉速離心30分鐘，藉此收集周邊血液單核細胞(PBMCs)。以RPMI 1640培養液(Corning,Manassas,VA，美國)潤洗PBMCs三次後，將細胞再懸浮於含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Hyclone,Lo-gan,UT，美國)之升級(advanced)RPMI 1640培養液中，以進行後續實驗。
1.10 T細胞子群(subsets)的螢光活化細胞分類(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)法
為了取得T細胞子群，利用FACS將PBMCs分類為數個子群，以進行共培養實驗。簡言之，利用0.05μg之抗豬FITC-CD4+抗體(Ab24989,Abcam,Cambridge，英國)以及10μg之抗豬CD25+初級抗體(MCA1736GA,Bio-Rad)對1×106細胞/mL之細胞進行染色，在冰上避光30分鐘，接著利用5μg之抗小鼠R-藻紅素(R-phycoerythrin，R-PE)共軛的IgG1二級抗體(STAR132PE,Bio-Rad)進行染色，在冰上避光30分鐘。之後，在使用BD FACS Aria II細胞分選儀(BD Biosciences，美國)前，利用冰PBS潤洗染色的細胞二次。根據CD4+CD25-(Th1)以及CD4+CD25+(Treg)的表現，將T細胞分成二個子群(分別為Th1及Treg)。
1.11 Th1細胞激素分析
首先，將2×106細胞/mL之PAMs種入間接式(indirect)穿透小室(transwell)共培養系統的下腔室底部，培養至隔夜。然後，利用PRRSV重組抗原A1或PRRSV重組抗原A2刺激下腔室的細胞，同時將T細胞子群(CD4+CD25-或CD4+CD25+)種入穿透隔膜的 上腔室。接著，將上述穿透小室共培養系統以標準條件(5% CO2、37℃)培養48小時。之後，收集上述的條件培養基(conditioned medium)，進行Th1細胞激素分析。
簡言之，利用市售ELISA套組IFN-γ(Thermo Fisher Scientific,Vienna，奧地利)及IL-12(R&D System，美國)，根據製造商提供的方法，建立細胞激素IFN-γ及IL-12濃度之標準曲線。接著，利用市售微量盤讀取儀(EZ Read 400 Microplate Reader，Biochrom,Cambridge，英國)判斷每個孔在波長450nm的光學密度(OD450nm)。另外，利用即時定量PCR檢測促發炎基因TNF-α、IL-6及Arg-1的表現。
1.12 數值分析
以下所述的數值以平均值±標準誤差(SEM)表示。利用t-檢驗(t-test)、95%信賴區間、單因子變異數分析(One-way ANOVA)以及杜凱氏檢驗(Tukey’s test)進行多重比較的數值分析。數值分析利用市售軟體Prism 7.0(GraphPad Software Inc.，美國)進行分析。以P<0.05判斷具有統計顯著差異。
實施例2：評估PRRSV抗原1促使巨噬細胞朝向M1巨噬細胞極化，並使CD163的表現下調的效果
請參閱圖1A及圖1B，其係顯示本發明一實施例 由PRRSV感染動物取得的肺泡巨噬細胞之表面標記表現。利用專一性單株抗體、FITC-共軛之抗小鼠抗體及利用細胞流式分析法檢測CD14、SLA II、CD80及CD163的細胞比例(圖1A)及平均螢光強度(MFI，圖1B)的直條圖。未感染動物的表現程度則做為控制組。
PAMs代表豬隻體內PRRSV的目標細胞，此實施例首先要確定與這些細胞相關的特定標記。在這些標記中，CD14是較早被研究做為骨髓單核表型的標記。其次，已知PAMs可表現SLA II與CD163的受體。從健康豬隻體內分離出的PAMs中，91.3%、97.5%及95.2%之PAMs的CD14、SLA II、CD163表現為陽性。反之，從PRRSV感染豬隻體內分離出的PAMs中，僅少部分(23.8%及23.1%)之PAMs的CD14及CD163表現為陽性。健康豬隻與PRRSV感染豬隻體內分離出的PAMs中，SLA II表現陽性的細胞雖然不具有顯著差異，但是PRRSV感染豬隻體內SLA II表現陽性的細胞(85.8%)有下降的趨勢，如圖1A所示。不過，PRRSV感染豬隻體內分離出的PAMs中，CD163的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)顯著較高，代表受PRRSV感染之PAMs趨於M2表型的極化，在此細胞系中CD163的受體平均表達量上調，扮演罹受PRRSV病毒感染之重要角色。
請參閱圖2A及圖2B，其係繪示根據本發明一實施例之PRRSV重組抗原1(A1)驅使M1巨噬細胞極化， 使PAMs上之CD163表現量顯著減少。圖2A係繪示根據本發明一實施例之PRRSV重組抗原攻毒之PAMs的M1巨噬細胞及M2巨噬細胞之mRNA表現的直條圖，其係利用定量PCR(qPCR)檢測。圖2A的結果顯示抗原1(A1)可促進促發炎基因的mRNA量表現上調，但使抗發炎基因的表現下調。圖2B係顯示根據本發明一實施例之巨噬細胞之表面蛋白SLA II、CD80及CD163表現的細胞流式分析的直條圖。重組抗原1(A1)可減少PAMs表現CD163的細胞比例與平均螢光強度。PAMs利用LPS、IL-4、重組抗原1(A1)或重組抗原2(A2)處理48小時。未處理的PAMs做為控制組。圖號*代表相較於控制組的p<0.05；圖號α代表相較於LPS組的p<0.05；圖號ψ代表相較於IL-4組，p<0.05；圖號#代表相較於A1組的p<0.05；圖號φ代表相較於A2組的p<0.05。數值由三頭豬(每頭豬二重複)得出，以平均值±標準誤差(SEM)表示。
為了驗證抗原對巨噬細胞極化的效果，此實施例利用PRRSV重組抗原(A1及A2)對PAMs攻毒。結果顯示，利用重組抗原A1攻毒的PAMs，可提升促發炎基因(例如TNF-α、IL-6及IL-12)的表現上調，代表重組抗原A1可促使M1巨噬細胞極化，不過利用重組抗原A2攻毒的PAMs則無此現象。反之，利用重組抗原A2攻毒的PAMs可促使Arg-1的表現上調，Arg-1是抗發炎基因之一，代表的是M2巨噬細胞(圖2A)。利用重組抗原 A1及重組抗原A2誘導，SLA II表面蛋白標記的表現量並無顯著差異。反之，在以重組抗原A1處理後，表現CD163的細胞數與平均表現量顯著減少(圖2B)。上述結果顯示，重組抗原A1能調控巨噬細胞極化，亦可作為抑制PRRSV感染的候選物。
請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例之Rap1訊息傳遞路徑參與在TCR訊息傳遞路徑活化的預測結果，藉此促進增殖、存活及基因活化。利用重組抗原A1，可促進T細胞受體(T cell receptors，TCRs)訊息傳遞路徑的基因表現上調與富集。C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)訊息傳遞路徑亦可發現被富集的類似結果。CLRs可促進各種訊息傳遞路徑與活化轉錄因子NF-kB的潛能，導致特定的細胞激素表現，而決定T細胞分化狀態，是研發疫苗的重要設計之一。為方便了解調控免疫反應時，差異表現基因(differentially expressed genes，DEG)之潛在蛋白質層次的交互作用，此實施例使用檢索交互作用基因之搜尋工具(STRING)，以分析預測蛋白質與蛋白質之交互作用(PPI)。由圖3結果顯示，利用重組抗原A1攻毒的PAMs可分泌部分的蛋白[例如凋亡蛋白酶1(caspase 1)、IL-18、PIK3CB以及IKKB]，與發炎及免疫反應相關。
請參閱圖4，其係繪示根據本發明另一實施例之Rap1訊息傳遞路徑的預測結果，可參與在TCR訊息傳 遞路徑的活化。在圖4以KEGG製圖工具(mapping tool)的分析結果顯示，抗發炎基因表現的下調與抑制雌激素訊息傳遞路徑具有關聯性，雌激素在皮膚修復過程中可刺激M2巨噬細胞的極化。另外，這些基因亦可刺激調控T細胞活化的蛋白，例如ISG15、CYLD以及DAPK1(圖未繪示)。
分離出的PAMs利用抗原攻毒後，與CD4+CD25+調節型T細胞(Tregs)或CD4+CD25-Th1輔助型(Th1)細胞共培養48小時。利用ELISA檢測細胞激素蛋白濃度，由三頭豬隻(每頭豬隻為二重複)計算出平均值±標準誤差(SEM)，其結果如圖5A至圖5E所示，其中圖號*代表相較於PAMs組的p<0.05。
請參閱圖5A至圖5E，其係繪示根據本發明一實施例檢測促發炎基因表現的直條圖。如圖5A至圖5E的即時定量RT-PCR分析結果顯示，利用重組抗原A1攻毒的PAMs與Th1細胞共培養，可增加IFN-γ(圖5A)與IL-12(圖5B)的分泌量。另外，重組抗原A1攻毒的PAMs在與Th1細胞共培養後亦推助(boosting)巨噬細胞的TNF-α(圖5C)與IL-6(圖5D)的mRNA表現量，但Arg-1表現量則無顯著差異(圖5E)。
綜言之，本發明以特定的胺基酸序列、特定的製造方法、特定的組成、特定的分析模式或特定的評估方法 僅用於例示說明豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的胺基酸序列、其他的製造方法、其他的組成、其他的分析模式或其他的評估方法亦可用於豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物，並不限於上述。舉例而言，可使用其他方法製得之重組抗原，以優化製程及量產。
根據上述實施例，本發明的豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物，其優點在於可利用真核表現系統表現出重組抗原，有利於量產及純化。由此所製得之含有上述重組抗原的組成物可有效促進豬肺泡巨噬細胞的促發炎M1亞型之極化，減少CD163受體的表現量，並活化巨噬細胞介導的Th1免疫反應，未來可應用於抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。
<110> 國立屏東科技大學
<120> 豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原及其製造方法、單離聚核苷酸及含此之組成物
<130> 無
<160> 13
<210> 1
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV重組抗原A1(gp6Ld10T)
<400> 1
Figure 110133470-A0305-02-0027-1
Figure 110133470-A0305-02-0028-3
<210> 2
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV重組抗原A1之重組基因序列
<400> 2
Figure 110133470-A0305-02-0028-5
Figure 110133470-A0305-02-0029-6
<210> 3
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV重組抗原A2(lipo-M5Nt)
<400> 3
Figure 110133470-A0305-02-0029-7
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬IL-6基因的上游引子
<400> 4
Figure 110133470-A0305-02-0030-8
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬IL-6基因的下游引子
<400> 5
Figure 110133470-A0305-02-0030-9
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬TNF-α基因的上游引子
<400> 6
Figure 110133470-A0305-02-0030-10
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬TNF-α基因的下游引子
<400> 7
Figure 110133470-A0305-02-0030-11
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬Arg-1基因的上游引子
<400> 8
Figure 110133470-A0305-02-0031-15
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬Arg-1基因的下游引子
<400> 9
Figure 110133470-A0305-02-0031-17
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬IL-12基因的上游引子
<400> 10
Figure 110133470-A0305-02-0031-18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬IL-12基因的下游引子
<400> 11
Figure 110133470-A0305-02-0031-19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬β-actin基因的上游引子
<400> 12
Figure 110133470-A0305-02-0032-12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 豬β-actin基因的下游引子
<400> 13
Figure 110133470-A0305-02-0032-14

Claims (10)

  1. 一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原，其係由如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列所組成。
  2. 一種單離聚核苷酸，其係如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列，以編碼如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
  3. 一種豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原的製造方法，包含：將如SEQ ID NO：2所示之聚核苷酸序列轉染至一真核表現系統；培養轉染後的該真核表現系統，以表現該重組抗原，其中該重組抗原為如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列；以及純化該真核表現系統之一培養上清液，以獲得該重組抗原。
  4. 如請求項3所述之豬生殖與呼吸綜合症病毒之重組抗原的製造方法，其中該真核表現系統為一巴氏病毒表現系統。
  5. 一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之免疫原性 組成物，其包含如請求項1所述之PRRSV重組抗原及/或如請求項2所述之單離聚核苷酸作為一有效成分。
  6. 一種促進豬肺泡巨噬細胞極化之免疫原性組成物，其包含如請求項1所述之重組抗原及/或如請求項2所述之聚核苷酸作為一有效成分。
  7. 如請求項6所述之促進豬肺泡巨噬細胞極化之免疫原性組成物，其中該肺泡巨噬細胞為促發炎M1亞型。
  8. 一種減少CD163受體的表現量之免疫原性組成物，其包含如請求項1所述之重組抗原及/或如請求項2所述之聚核苷酸作為一有效成分。
  9. 一種活化巨噬細胞介導的Th1免疫反應之免疫原性組成物，其包含如請求項1所述之重組抗原及/或如請求項2所述之聚核苷酸作為一有效成分。
  10. 一種抗豬生殖與呼吸綜合症病毒之疫苗組成物，其係以如請求項1所述之重組抗原及/或如請求項2所述之單離聚核苷酸做為一有效成分。
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