KR20220029561A - 신규한 암 항원 및 방법 - Google Patents

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Abstract

특히, 암, 특히 흑색종, 특히 피부 흑색종 및 포도막 흑색종의 치료, 예방 및 진단에 유용한 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 개시되어 있다.

Description

신규한 암 항원 및 방법
본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 특히 흑색종(melanoma)(예를 들어, 피부 흑색종(cutaneous melanoma) 또는 포도막 흑색종(uveal melanoma))을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 항원성 폴리펩타이드 및 상응하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 특히 상기 핵산 및 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 로딩(loading)되고/거나 이에 의해 자극된 면역 세포, 상기 폴리펩타이드에 특이적인 항체 및 상기 폴리펩타이드를 인식하는 분자로 유전자 조작된 세포(자가 또는 외래)를 포함하는 약제학적 면역원성 조성물에 관한 것이다.
병원성 미생물에 대한 정상적인 면역 감시의 일부로서, 모든 세포는 세포내 단백질을 분해하여 모든 세포의 표면에 발현되는 주요 조직접합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자에 로딩되는 펩타이드를 생성한다. 숙주 세포에서 유래한 이들 펩타이드의 대부분은 자기 자신으로 인식되어 적응 면역계에 노출되지 않은 상태로 남는다. 그러나, 외래(비-자기) 펩타이드는 MHC l-펩타이드 복합체에 단단히 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩(encoding)하는 나이브(naive) CD8+ T 세포의 확장을 자극할 수 있다. 확장된 이러한 T 세포 집단(population)은 외래 항원-태그 세포가 이후에 동물의 생존 기간에 나타날 때 재증폭(re-amplification)될 수 있는 기억 CD8+ T 세포뿐만 아니라, 외래 항원 태그 세포를 제거할 수 있는 효과기 CD8+ T 세포(세포독성 T-림프구-CTL 포함)를 생성할 수 있다.
발현이 일반적으로 수지상 세포(dendritic cell; DC)와 같은 전문 항원 제시 세포(antigen-presenting cell; APC)로 제한되는 MHC 클래스 II 분자는 일반적으로 세포외 환경으로부터 내재화된 펩타이드로 로딩된다. T 세포 부착 분자(CD54, CD48) 및 공자극 분자(CD40, CD80, CD86)를 포함하는 다양한 인자의 존재 하에 MHC ll-펩타이드 복합체에 나이브 CD4+ T 세포로부터의 상보성 TCR의 결합은 CD4+ T 세포의 효과기 세포(예를 들어, TH1, TH2, TH17, TFH, Treg 세포)로의 성숙을 유도한다. 이 효과기 CD4+T 세포는 항체 분비 형질 세포로의 B 세포 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 항원 특이적 CD8+ CTL의 분화를 촉진하여 단기 효과기 기능과 장기 면역학적 기억을 모두 포함하는 외래 항원에 대한 적응 면역 반응의 유도를 지원할 수 있다. DC는 외인성 유래 항원(예를 들어, 병원체 또는 종양 세포로부터 방출된 펩타이드 또는 단백질)을 MHC I 분자에 전달하여 펩타이드 항원의 교차 제시 과정을 수행할 수 있으며, 나이브 CD8+ T 세포의 확장을 자극하는 대체 경로를 제공함으로써 면역학적 기억 생성에 관여한다.
면역학적 기억(특히 항원-특이적 B 세포/항체 및 항원-특이적 CTL)은 미생물 감염을 제어하는데 중요한 역할을 하고, 면역학적 기억은 중요한 병원성 미생물에 의해 야기되는 질병을 예방하는 다수의 백신을 개발하기 위해 이용되어 왔다. 면역학적 기억은 또한 종양 형성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있지만 효과적인 암 백신은 거의 개발되지 않았다.
암은 이환율의 두 번째 주요 원인이며 전 세계적으로 모든 사망의 거의 6분의 1을 차지한다. 2015년 암으로 인한 880만 명의 사망 중 치사율이 가장 높은 암은 폐암종(169만 명), 간암종(788,000명), 대장암종(774,000명), 위암종(754,000명) 및 유방암종(571,000명)이었다. 2010년 암의 경제적 영향은 미화 1조 1600억 달러로 추산되었으며 신규 사례의 수는 향후 20년 동안 약 70% 증가할 것으로 예측된다(세계 보건 기구 암 사실 2017).
피부 흑색종에 대한 현재 치료법은 다양하고 종양의 위치 및 질병의 단계에 크게 좌우된다. 비전이성 흑색종의 주요 치료법은 종양과 주변 조직을 제거하는 수술이다. 후기 단계의 흑색종은 림프절 절개, 방사선 요법 또는 화학 요법을 포함하는 치료가 필요할 수 있다. PD-1/PD-L1 및 CTLA4와 같은 음성 면역 조절제를 표적화하는 항체의 사용을 포함한 면역 체크포인트 차단 전략은 최근 흑색종을 포함한 다양한 악성 종양에 대한 치료법에 혁명을 일으켰다(문헌[Ribas, A., & Wolchok, J. D.(2018) Science, 359:1350-1355.]). 체크포인트 차단 요법의 탁월한 가치, 및 그 자체의 암 항원에 대한 환자의 적응 면역 반응(특히 T 세포 기반 면역 반응)과 임상적 이점의 잘 알려진 연관성은 효과적인 암 백신, 백신 방식 및 암 백신 항원에 대한 검색을 다시 활성화하였다.
인간 내인성 레트로바이러스(HERV)는 외인성 감염성 레트로바이러스의 선대 생식계열 혼입의 결과이다. HERV는 바이러스 게놈에 측접한 긴 말단 반복(LTR)의 존재를 특징으로 하는 내인성 레트로요소 그룹에 속한다. 이 그룹은 또한 포유류의 겉보기 LTR 레트로트랜스포존(Retrotransposon)(MaLR)을 포함하므로 통칭하여 LTR 요소로 공지되어 있다(본 명세서에서는 모든 LTR 요소를 의미하는 ERV로 통칭됨). ERV는 포유동물 게놈의 상당한 비율(8%)을 구성하고 서열 상동성에 기반하여 대략 100개의 패밀리로 그룹화될 수 있다. 많은 ERV 서열은 LTR에 측접하는 gag, pro, pot 및 env 유전자로 구성된 원형 레트로바이러스 게놈 구조를 공유하는 결함 있는 프로바이러스를 인코딩한다. 일부 손상되지 않은 ERV ORF는 HIV-1과 같은 외인성 감염성 레트로바이러스에 의해 인코딩된 단백질과 특징을 공유하는 레트로바이러스 단백질을 생성한다. 이러한 단백질은 강력한 면역 반응을 유도하는 항원 역할을 할 수 있고(문헌[Hurst & Magiorkinis, 2015, J. Gen. Virol 96:1207-1218]), 이는 ERV에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 T 및 B-세포 수용체 선택 과정 및 중추 및 말초 내성을 회피할 수 있음을 시사한다. ERV 산물에 대한 면역 반응성은 감염 또는 암에서 자발적으로 발생할 수 있으며, ERV 산물은 일부 자가면역 질병의 원인과 관련된다(문헌[Kassiotis & Stoye, 2016, Nat. Rev. Immunol. 16:207-219]).
진화 동안 돌연변이 및 재조합 사건의 축적으로 인해, 대부분의 ERV는 유전자의 일부 또는 전부에 대한 기능적 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 상실하여 감염성 바이러스를 생성하는 능력을 상실하였다. 그러나 이러한 ERV 요소는 다른 유전자와 마찬가지로 생식계열 DNA에 유지되며 적어도 일부 유전자에서 단백질을 생성할 가능성이 있다. 실제로, HERV 인코딩 단백질은 다양한 인간 암에서 검출되었다. 예를 들어, HERV-K env 유전자, Rec 및 Np9의 스플라이스(splice) 변이체(variant)는 악성 고환 생식 세포에 배타적으로 발견되며 건강한 세포에서는 발견되지 않는다(문헌[Ruprecht et. al, 2008, Cell Mol Life Sci 65:3366-3382]). HERV 전사체의 증가된 수준은 건강한 조직과 비교하여 전립선 암과 같은 암에서도 관찰되었다(문헌[Wang-Johanning, 2003, Cancer 98:187-197; Andersson et al., 1998, Int. J. Oncol, 12:309-313]). 추가로, HERV-E 및 HERV-H의 과발현은 면역억제성인 것으로 나타났으며, 이는 또한 암 발병에 관여할 수 있다(문헌[Mangeney et al., 2001, J. Gen. Virol. 82:2515-2518]). 그러나, HERV가 암의 발병 또는 병원성에 관여할 수 있는 정확한 기전(들)은 공지되어 있지 않다.
주변 숙주 유전자의 발현을 탈조절하는 것 외에도, ERV 조절 요소의 활성 및 새로운 게놈 부위로의 전위는 신규 전사체의 생성을 초래할 수 있으며, 이들 중 일부는 발암성 특성을 가질 수 있다(문헌[Babaian & Mager, Mob. DNA, 2016, Lock et al., PNAS, 2014, 111:3534-3543]).
광범위한 백신 방식이 공지되어 있다. 널리 기재된 한 가지 접근법은 면역 반응(B 및 T 세포 반응 포함)을 증가시키고 면역 기억을 자극하기 위해 대상체(subject)에 항원성 폴리펩타이드를 직접 전달하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드-인코딩된 면역원성 폴리펩타이드가 생체내에서 발현되도록 벡터(vector)에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터의 사용은 암에 대한 예방적 백신접종 및 치료적 치료 전략 모두에서 항원 전달에 대해 잘 조사되었다(문헌[Wold et al. Current Gene Therapy, 2013, Adenovirus Vector for Gene Therapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy, 13:421-433]). 면역원성 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 환자 유래 항원 제시 세포(APC)를 로딩하는데 사용될 수 있으며, 이는 이어서 치료 또는 예방 면역 반응을 유도하는 백신으로서 대상체에 주입될 수 있다. 이 접근법의 예는 현재 FDA 승인을 받은 유일한 항암 백신인 Provenge이다.
암 항원은 또한 다양한 비-백신 치료 방식을 생성하기 위해 이를 사용함으로써 암의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 이러한 요법은 1) 항원 결합 생물학, 2) 입양 세포 요법의 두 가지 다른 클래스로 나뉜다.
항원 결합 생물학은 일반적으로 항원 부속 암세포를 인식하고 이의 파괴를 촉진하는 다가 조작 폴리펩타이드로 이루어진다. 이러한 생물학적 제제의 항원 결합 성분은 다음에 제한되는 것은 아니나, TCR, 고친화도 TCR 및 다양한 기술(단일클론 항체(monoclonal antibody) 기술 기반 기술 포함)에 의해 생성된 TCR 모방체를 포함하는 TCR 기반 생물학적 제제로 이루어질 수 있다. 이러한 유형의 다가 생물학적 제제의 세포용해 모이어티는 세포독성 화학물질, 생물학적 독소, 면역 세포의 표적화 및 활성화를 촉진하는 표적화 모티프 및/또는 면역 자극 모티프로 이루어질 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 종양 세포의 치료적 파괴를 촉진한다.
입양 세포 요법은 백신 항원 제조물(세포 및 무세포 성분을 포함하는 다른 인자의 존재 또는 부재 하에 T 세포와 함께 배양)를 사용하여 생체외에서 제거되고 자극되는 환자 자신의 T 세포에 기반할 수 있다(문헌[Yossef et al., JCI Insight. 2018 Oct 4;3(19). pii: 122467. doi: 10.1172/jci. insight.122467]). 대안적으로, 입양 세포 요법은 암 항원을 인식하는 항원 결합 폴리펩타이드를 발현하도록 의도적으로 조작된 세포(환자 또는 비환자 유래 세포 포함)를 기반으로 할 수 있다. 이들 항원 결합 폴리펩타이드는 항원 결합 생물학적 제제에 대해 상기 기재된 것과 동일한 부류에 속한다. 따라서, 암 항원 결합 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 림프구(자가 또는 비-자가)는 암을 치료하기 위한 입양 세포 요법으로서 환자에 투여될 수 있다.
암에 대한 효과적인 면역 반응을 증가시키는데 ERV 유래 항원의 사용은 암의 뮤린 모델에서 종양 퇴행 및 더욱 유리한 예후를 촉진하는 유망한 결과를 보여주었다(문헌[Kershaw et al., 2001, Cancer Res. 61:7920- 7924, Slansky et al., 2000, Immunity 13:529-538]). 따라서, 부분적으로 확인된 종양 특이적 ERV 항원의 심각한 제한으로 인해 진행이 제한되었지만, 인간에서 HERV 항원 중심 면역요법 시도가 고려되었다(문헌[Sacha et al., 2012, J. Immunol 189:1467-1479]).
WO 2005/099750은 흑색종에 대한 보호를 부여하고 HERV-K Mel 종양 항원에 대한 교차 반응성 면역 반응을 증가시키는데 공통적인 감염성 병원체에 대한 기존 백신의 고정 서열을 확인한다.
WO 00/06598은 흑색종에서 우선적으로 발현되는 HERV-AVL3-B 종양 연관 유전자의 확인, 및 상기 유전자의 발현을 특징으로 하는 병태를 진단 및 치료하기 위한 방법 및 산물에 관한 것이다.
WO 2006/119527은 흑색종 관련 내인성 레트로바이러스(MERV)로부터 유래된 항원성 폴리펩타이드, 흑색종의 검출 및 진단뿐만 아니라, 질병의 예후를 위한 이의 용도를 제공한다. 항암 백신으로서의 항원성 폴리펩타이드의 용도가 또한 개시되어 있다.
WO 2007/137279는 예를 들어 암 세포 증식을 예방하거나 억제하기 위해 HERV-K+ 결합 항체를 사용하여 HERV-K+ 암을 검출, 예방 및 치료하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다.
WO 2006/103562에는 HERV-K의 env 유전자로부터의 면역억제성 Np9 단백질이 발현되는 암의 치료 또는 예방 방법이 개시되어 있다. 본 발명은 또한 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 핵산 또는 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 상기 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원 또는 백신 조성물에 관한 것이다.
WO 2007/109583은 종양 세포 상의 HERV-E 항원에 반응성인 강화된 면역 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공함으로써 포유동물 대상체에서 신생물성 질병을 예방하거나 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
문헌[Humer J, et al., 2006, Cane. Res., 66:1658-63]은 흑색종 관련 내인성 레트로바이러스로부터 유래된 흑색종 마커를 확인한다.
암, 특히 흑색종, 특히 피부 및 포도막 흑색종의 면역요법에 사용될 수 있는 추가의 HERV-연관 항원 서열을 확인할 필요가 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 피부 흑색종 세포에서 높은 수준으로 존재하지만 정상의 건강한 조직에서는 검출할 수 없거나 매우 낮은 수준으로 존재하는 LTR 요소를 포함하거나 LTR 요소에 인접한 게놈 서열로부터 유래된 특정 RNA 전사체를 발견하였다(실시예 1 참조). 이러한 전사체는 본 명세서에서 암-특이적 LTR-요소 범위 전사체(CLT)로 지칭된다. 또한, 본 발명자들은 이들 CLT 중 하나에 의해 인코딩된 특정의 가능한 폴리펩타이드 서열(즉, 오픈 리딩 프레임(ORF))이 암 세포에서 번역되고, 항원 처리 장치의 구성요소에 의해 처리되고, 클래스 I 및 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II) 및 클래스 I 및 클래스 II 인간 백혈구 항원(HLA 클래스 I, HLA 클래스 II) 분자와 관련하여 종양 조직에 존재하는 세포 표면에 제시된다는 것을 발견하였다(실시예 2 참조). 이러한 발견은 이 폴리펩타이드(본 명세서에서 CLT 항원으로 지칭됨)가 사실상의 항원임을 나타낸다. 따라서, 이 CLT 항원의 암 세포 제시는 CLT 항원에 대한 동족 T 세포 수용체(TCR)를 보유하는 T 세포에 의해 이들 세포가 제거되기 쉽게 할 것으로 예측되고, 이러한 동족 TCR을 보유하는 T 세포를 증폭(amplifying)시키는 CLT 항원 기반 백신화 방법/요법은 암세포(및 이를 포함하는 종양), 특히 흑색종, 특히 피부 흑색종 종양에 대한 면역 반응을 유도할 것으로 예측된다. 흑색종 대상체로부터의 T 세포는 실제로 본 명세서에 개시된 CLT 항원으로부터 유래된 펩타이드에 반응성이다(실시예 3 참조). 본 발명자들은 CLT 항원에 특이적인 T 세포가 중추성 내성에 의해 정상 대상체의 T 세포 목록에서 결실되지 않음을 확인하였다(실시예 4 참조). 마지막으로, qRT-PCR 연구는 CLT가 비-흑색종 세포주와 비교하여 흑색종 세포주로부터 추출된 RNA에서 특이적으로 발현된다는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명자들은 또한 놀랍게도 CLT를 인코딩하는 특정 CLT 항원이 피부 흑색종에서 과발현될 뿐만 아니라, 포도막 흑색종에서도 과발현된다는 것을 발견하였다. 이 CLT에 의해 인코딩된 CLT 항원 폴리펩타이드 서열은 포도막 흑색종 세포 및 이를 포함하는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 것으로 예측된다.
본 발명의 대상인 CLT 및 CLT 항원은 암 게놈 지도에 존재하는 공지된 종양 게놈 서열로부터 용이하게 유래될 수 있는 정규 서열이 아니다. CLT는 ERV 복제기점의 전사 제어 서열에 의해 작동되는 복잡한 전사 및 스플라이싱 사건으로 인한 전사체이다. CLT는 높은 수준으로 발현되고 CLT 항원 폴리펩타이드 서열은 정상 인간 단백질의 서열이 아니기 때문에 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있고 따라서 암 면역요법 환경에서 치료적 사용에 적합할 것으로 예측된다.
본 발명 이전에 인간에서 존재하고 단백질 산물을 생성하는 것으로 공지되지 않은 종양 세포를 특징으로 하는 고도로 발현된 전사체에 존재하는 CLT 항원은 다수의 형식으로 사용될 수 있다. 첫째, 본 발명의 CLT 항원 폴리펩타이드는 종양 세포에 대한 치료 또는 예방적 면역 반응을 유도하는 백신으로서 대상체에게 직접 전달될 수 있다. 둘째, 인코딩된 CLT 항원의 발현을 향상시키기 위해 최적화된 코돈(codon)일 수 있는 본 발명의 핵산은 직접 투여되거나 그렇지 않으면 생체내 전달을 위해 벡터에 삽입되어 대상체에서 종양 세포에 대한 치료 또는 예방적 면역 반응을 유도하는 백신으로서 인코딩된 단백질 산물을 생성할 수 있다. 셋째, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드는 환자 유래 항원 제시 세포(APC)를 로딩하는데 사용될 수 있으며, 이는 이어서 종양 세포에 대한 치료 또는 예방적 면역 반응을 유도하는 백신으로서 대상체에 주입될 수 있다. 넷째, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드는 대상체의 T 세포의 생체외 자극에 사용될 수 있으며, 이는 암 치료를 위한 요법으로서 대상체에게 투여될 수 있는 자극된 T 세포 제조물을 생성한다. 다섯째, MHC I 분자에 복합체화된 CLT 항원을 인식하고 이들이 암 세포를 사멸(또는 사멸 촉진) 할 수 있도록 추가로 변형된 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR 모방체와 같은 생물학적 분자는 암을 치료하기 위한 요법으로서 대상체에 투여될 수 있다. 여섯째, MHC 세포에 복합체화된 CLT 항원을 인식하는 생물학적 분자의 키메라 형태는 T 세포(자가조직의 비자가조직)에 도입될 수 있고, 생성된 세포는 암 치료를 위한 요법으로 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 적용 및 다른 적용은 아래에 더 자세히 설명되어 있다.
따라서, 본 발명은 특히
(a) 서열번호 1의 서열 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편(immunogenic fragment)
으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드(isolated polypeptide)(이하 "본 발명의 폴리펩타이드"로 지칭됨)를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자(이하 "본 발명의 핵산"으로 지칭됨)를 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명의 핵산뿐만 아니라, 본 발명의 관련 양상은 하기에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이 암 면역요법 및 예방, 특히 면역요법 및 흑색종의 예방에서 다양한 실시양태에서 유용할 것으로 예측된다.
도 1. 환자 Mel-29의 종양 샘플로부터 획득된 서열번호 2의 펩타이드의 스펙트럼. 상단 패널은 환자의 종양 샘플로부터 획득된 펩타이드의 추출된 MS/MS 스펙트럼(할당된 단편 이온)을 보여주고 하단 패널은 단편 이온에 맵핑된 선형 펩타이드 서열의 위치를 나타내는 스펙트럼의 무작위화를 보여준다.
도 2. 환자 Mel-29의 종양 샘플로부터 획득된 서열번호 2의 펩타이드의 스펙트럼. 본 도면은 동일한 서열에 상응하는 합성 펩타이드의 천연 스펙트럼에 대한 환자 종양 샘플로부터 획득된 펩타이드의 천연 MS/MS 스펙트럼의 정렬을 보여준다.
도 3은 CLT 항원 1로부터의 HLA-A*03:01-제한된 펩타이드(서열번호 6)에 대한 정상 혈액 공여체로부터의 CD8 T 세포 반응을 보여준다.
도 4는 CLT 항원 1(서열번호 3)을 인코딩하는 CLT의 전사를 검증하기 위한 qRT-PCR 분석 결과를 보여준다.
서열의 설명
서열번호 1은 CLT 항원 1의 폴리펩타이드 서열이다.
서열번호 2는 CLT 항원 1로부터 유래한 펩타이드 서열이다.
서열번호 3은 CLT 항원 1을 인코딩하는 CLT의 cDNA 서열이다.
서열번호 4는 CLT 항원 1을 인코딩하는 cDNA 서열이다.
서열번호 5는 CLT 항원 1로부터 유래한 펩타이드 서열이다.
서열번호 6은 CLT 항원 1로부터 유래된 펩타이드 서열이다.
폴리펩타이드
용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 명세서에서 상호 혼용되며, 길이, 동시번역 또는 번역후 변형에 관계없이 아미노산의 임의의 펩타이드-연결된 사슬을 지칭한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 중 임의의 하나뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 20개의 L-아미노산 및 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린)이다. "아미노산 유사체"라는 용어는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖고, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카복실기, 아미노기 및 R기를 갖지만, 천연 아미노산과 비교하여 변형된 R기 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖는 화합물을 지칭한다. 예에는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭사이드, 메티오닌 메틸 술포늄 및 노르류신이 포함된다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 구조가 다르지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다. 적합하게는 아미노산은 천연 발생 아미노산 또는 아미노산 유사체, 특히 천연 발생 아미노산, 특히 유전자 코드에 의해 인코딩된 20개의 L-아미노산 중 하나이다.
아미노산은 일반적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에서 권장하는 1문자 기호로 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 뉴클레오타이드도 마찬가지로 일반적으로 인정되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.
따라서, 본 발명은
(a) 서열번호 1의 서열; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한
(a) 초기 메티오닌 잔기가 제외된 서열번호 1의 서열 ; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 서열의 변이체는 그에 대해 고도의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 적합하게는 전체 길이에 걸쳐 관련 참조 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성(예를 들어, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)을 갖는다.
적합하게는 변이체는 면역원성 변이체이다. 예를 들어, 배양 상청액 중 사이토카인(예를 들어, IFN-감마)의 생성, 림프 증식(예를 들어, T 세포 증식)을 통한 세포의 활성화를 측정하는 항원으로서 상기 폴리펩타이드에 의한 PBMC 또는 전혈의 시험관내 재자극 분석(예를 들어, 수시간 내지 최대 1년, 예컨대 최대 6개월, 1일 내지 1개월 또는 1주 내지 2주의 기간 동안의 재자극)(ELISA 등에 의해 측정), 또는 세포내 및 세포외 염색(예를 들어, CD3, CD4, CD8, IL2, TNF-알파, IFNg, 유형 1 IFN, CD40L, CD69 등과 같은 면역 마커에 특이적인 항체 사용)에 의한 T 세포 반응의 특성화 후 유세포 분석기에 의한 분석에서 변이체는 참조 서열(즉, 변이체가 변이된 서열)의 활성의 적어도 20%, 적합하게는 적어도 50% 및 특히 적어도 75%(예컨대 적어도 90%)인 반응을 유도하는 면역원성 변이체로 고려된다.
변이체는 예를 들어 보존적으로 변형된 변이체일 수 있다. "보존적으로 변형된 변이체"는 변이(들)가 기능적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환 또는 변이체의 생물학적 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 잔기의 치환/결실/추가로 인한 것이다. 통상적으로, 변이체의 이러한 생물학적 기능은 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종 암 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것일 것이다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 변이체는 다른 종에 존재하는 폴리펩타이드의 상동체를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 변이체는 참조 서열과 비교하여 다수의 치환, 예를 들어 보존적 치환(예를 들어, 1 내지 25개, 예컨대 1 내지 10개, 특히 1 내지 5개, 특히 1개의 아미노산 잔기(들)가 변이될 수 있음)을 포함할 수 있다. 치환, 예를 들어 보존적 치환의 수는 참조 서열의 잔기 수의 최대 20%, 예를 들어 최대 10%, 예를 들어 최대 5%, 예를 들어 최대 1%일 수 있다. 일반적으로 보존적 치환은 아래에 명시된 아미노산 그룹 중 하나에 속하지만, 일부 상황에서는 항원의 면역원성 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 다른 치환이 가능할 수 있다. 다음 8개 그룹은 각각 일반적으로 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins 1984] 참조).
적합하게는 이러한 치환은 에피토프(epitope)의 면역학적 구조를 변이시키지 않으며(예를 들어, 이는 1차 서열에 맵핑된 에피토프 영역 내에서 발생하지 않음), 따라서 항원의 면역원성 특성에 상당한 영향을 미치지 않는다.
폴리펩타이드 변이체는 또한 참조 서열과 비교하여 추가의 아미노산이 삽입된 것을 포함하고, 예를 들어 이러한 삽입은 1 내지 10개 위치(예를 들어, 1 내지 5개 위치, 적합하게는 1개 또는 2개 위치, 특히 1개 위치)에서 발생할 수 있고, 예를 들어 각 위치에서 50개 이하의 아미노산(예를 들어, 20개 이하, 특히 10개 이하, 특히 5개 이하)의 추가를 포함할 수 있다. 적합하게는 이러한 삽입은 에피토프 영역에서 발생하지 않으므로 항원의 면역원성 특성에 상당한 영향을 미치지 않는다. 삽입의 한 예는 해당 항원의 발현 및/또는 정제를 지원하기 위한 히스티딘 잔기의 짧은 연장(예를 들어, 2 내지 6개 잔기)을 포함한다.
폴리펩타이드 변이체는 아미노산이 참조 서열과 비교하여 결실된 것을 포함하며, 예를 들어 이러한 결실은 1 내지 10개 위치(예를 들어, 1 내지 5개 위치, 적합하게는 1개 또는 2개 위치, 특히 1개 위치)에서 발생할 수 있고, 예를 들어, 각 위치에서 50개 이하의 아미노산(예를 들어, 20개 이하, 특히 10개 이하, 특히 5개 이하)의 결실을 포함할 수 있다. 적합하게는 이러한 결실은 에피토프 영역에서 발생하지 않으므로 항원의 면역원성 특성에 상당한 영향을 미치지 않는다.
당업자는 특정 단백질 변이체가 치환, 결실 및 추가(또는 이의 임의의 조합)를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 치환/결실/추가는 적절한 환자 HLA 분자에 대한 결합을 향상(또는 중성 효과를 가질 수 있음)시켜 잠재적으로 면역원성을 증가시킬 수 있다(또는 면역원성을 변경하지 않은 상태로 유지시킴).
본 발명에 따른 면역원성 단편은 통상적으로 CLT 항원의 길이에 따라 전장 폴리펩타이드 서열로부터 적어도 9개 인접 아미노산(예를 들어, 적어도 9 또는 10), 예컨대 적어도 12개의 인접 아미노산(예를 들어, 적어도 15 또는 적어도 20개의 인접 아미노산), 특히 적어도 50개의 인접 아미노산, 예컨대 적어도 100개의 인접 아미노산(예를 들어, 적어도 200개의 인접 아미노산)을 포함할 것이다. 적합하게는 면역원성 단편은 전장 폴리펩타이드 서열의 길이의 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 70% 또는 적어도 80%일 것이다.
면역원성 단편은 통상적으로 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 에피토프는 B 세포 및 T 세포 에피토프를 포함하고 적합하게는 면역원성 단편은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다.
T 세포 에피토프는 HLA 분자에 결합될 때 T 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)에 의해 인식되는 아미노산의 짧은 인접 가닥이다. T 세포 에피토프의 확인은 당업자에게 널리 공지된 에피토프 맵핑 실험을 통해 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(1993); Beipbarth et al., 2005, Bioinformatics, 21(Suppl. 1): 129-137]).
암에서 T 세포 반응의 결정적인 관여의 결과로서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 서열번호 1의 전장 폴리펩타이드의 단편은 면역원성일 수 있고 면역보호에 관여할 수 있음은 용이하게 명백하다.
인간과 같은 다양한 근친 교배 집단에서 상이한 HLA 유형은 특정 에피토프가 집단의 모든 구성원에 의해 인식되지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 결과적으로, 폴리펩타이드에 대한 인식 수준 및 면역 반응의 규모를 최대화하기 위해, 면역원성 단편이 전장 서열로부터의 복수의 에피토프(적합하게는 CLT 항원 내의 모든 에피토프)를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다.
사용될 수 있는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 특정 단편은 적어도 하나의 CD8+ T 세포 에피토프, 적합하게는 적어도 2개의 CD8+ T 세포 에피토프 및 특히 모든 CD8+ T 세포 에피토프, 특히 복수의 HLA 클래스 I 대립유전자와 관련된 것, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 대립유전자와 관련된 것을 포함하는 것을 포함한다. 사용될 수 있는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 특정 단편은 적어도 하나의 CD8+ T 세포 에피토프, 적합하게는 적어도 2개의 CD8+ T 세포 에피토프 및 특히 모든 CD4+ T 세포 에피토프(특히 복수의 HLA 클래스 II 대립유전자와 관련된 것, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 대립유전자와 관련된 것)을 포함하는 것을 포함한다. 그러나, 백신 설계에 숙련된 자는 외인성 CD4+ T 세포 에피토프를 본 발명의 CD8+ T 세포 에피토프와 조합하여 본 발명의 CD8+ T 세포 에피토프에 대한 적절한 반응을 달성할 수 있다.
전장 폴리펩타이드의 개별 단편이 사용되는 경우, 이러한 단편은 참조 서열(즉, 단편이 단편화된 서열)의 활성, 예를 들어 예를 들어, 배양 상청액 중 사이토카인(예를 들어, IFN-감마)의 생성, 림프 증식(예를 들어, T 세포 증식)을 통한 세포의 활성화를 측정하는 항원으로서 상기 폴리펩타이드에 의한 PBMC 또는 전혈의 시험관내 재자극 분석(예를 들어, 수시간 내지 최대 1년, 예컨대 최대 6개월, 1일 내지 1개월 또는 1주 내지 2주의 기간 동안의 재자극)(ELISA 등에 의해 측정), 또는 세포내 및 세포외 염색(예를 들어, CD3, CD4, CD8, IL2, TNF-알파, IFN-감마, 유형 1 IFN, CD40L, CD69 등과 같은 면역 마커에 특이적인 항체 사용)에 의한 T 세포 반응의 특성화 후 유세포 분석기에 의한 분석에서의 활성의 적어도 20%, 적합하게는 적어도 50% 및 특히 적어도 75%(예컨대 적어도 90%)인 반응을 유도하는 면역원성으로 고려된다.
일부 상황에서, 전장 폴리펩타이드의 복수의 단편(중복되거나 중첩되지 않을 수 있고 전장 서열의 전체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있음)은 전장 서열 자체에 대한 균등한 생물학적 반응을 획득하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 적어도 2개의 면역원성 단편(예를 들어, 3개, 4개 또는 5개)은 조합하여 시험관내 PBMC 또는 전혈의 재자극 분석(예를 들어, T 세포 증식 및/또는 IFN-감마 생성 분석)에서 참조 서열의 적어도 50%, 적합하게는 적어도 75% 및 특히 적어도 90% 활성을 제공한다.
서열번호 1의 폴리펩타이드의 예시적인 면역원성 단편 및 따라서 본 발명의 예시적인 펩타이드는 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 예시적인 펩타이드는 서열번호 5의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 예시적인 펩타이드는 서열번호 6의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 서열번호 2의 서열은 면역펩티도믹 분석에서 HLA 클래스 I 분자에 결합된 것으로 확인되었다(실시예 2 참조). 서열번호 5 및 6의 서열은 NetMHC 소프트웨어에 의해 HLA 클래스 I 분자에 결합되는 것으로 예측되었으며 면역학적 검증 분석에 사용되었다(실시예 4 참조).
핵산
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 핵산(본 발명의 핵산으로 지칭됨)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 서열번호 3 및 4로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 상호 혼용되며 뉴클레오타이드 단량체, 특히 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 단량체로부터 제조된 중합체성 거대분자를 지칭한다. 이 용어는 참조 핵산과 유사한 특성을 갖고 참조 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되도록 의도되거나 시스템에서 연장된 반감기를 갖도록 의도된 천연 발생 및 비-천연 발생의 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다. 적합하게는 용어 "핵산"은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 단량체의 천연 발생 중합체를 지칭한다. 적합하게는 본 발명의 핵산 분자는 재조합체이다. 재조합이란 핵산 분자가 클로닝, 제한 또는 결찰 단계 또는 천연에 존재하는 핵산 분자와 구별되는 핵산 분자(예를 들어, cDNA의 경우)를 생성하는 다른 절차 중 적어도 하나의 산물임을 의미한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 인공 핵산 서열(예를 들어, 비천연 발생 코돈이 사용되는 cDNA 서열 또는 핵산 서열)이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 DNA이다. 대안적으로, 본 발명의 핵산은 RNA이다.
DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)는 각각 데옥시리보실 및 리보실 모이어티인 당 모이어티의 골격을 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 당 모이어티는 4개의 천연 염기(DNA의 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T) 및 RNA의 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 우라실(U))인 염기에 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "상응하는 RNA"는 참조 DNA와 동일한 서열을 갖지만 DNA 내의 티민(T)이 RNA 내의 우라실(U)로 치환된 RNA이다. 당 모이어티는 또한 이노신, 크산토신, 7-메틸구아노신, 디하이드로우리딘 및 5-메틸시티딘과 같은 비천연 염기에 연결될 수 있다. 당(데옥시리보실/리보실) 모이어티 사이의 천연 포스포디에스테르 연결은 선택적으로 포스포로티오에이트 연결로 대체될 수 있다. 적합하게는 본 발명의 핵산은 당 모이어티 사이에 포스포디에스테르 결합을 갖는 데옥시리보실 또는 리보실 당 골격에 부착된 천연 염기로 이루어진다.
일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 DNA이다. 예를 들어, 핵산은 서열번호 3 및 4로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한 서열번호 3 및 4로부터 선택되는 서열의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 핵산이 제공되고 변이체는 동일한 아미노산 서열을 인코딩하지만 유전자 코드의 축퇴성에 기반하여 다른 핵산을 갖는다.
따라서, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 상이하지만 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩타이드를 변이시키지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변이될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵"(때때로 "축퇴형" 또는 "동의형"으로 지칭됨) 변이체를 야기하며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 명세서에 개시된 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 가능하게 한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 UGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내재되어 있고 본 발명의 양상으로서 제공된다.
축퇴 코돈 치환은 또한 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer eti, 1991, Nucleic Acid Res. 19 :5081, Ohtsuka et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2605-2608, Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8:91-98]).
서열번호 3 및 4로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 본 발명의 핵산은 참조 서열과 비교할 때 다수의 침묵 변이(예를 들어, 1 내지 50, 예를 들어 1 내지 25, 특히 1 내지 5, 특히 1개의 코돈(들)이 변이될 수 있음)를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 상기한 바와 같은 이의 변이체 또는 메티오닌에 대한 초기 코돈(즉, ATG 또는 AUG)이 부재하는 서열번호 4로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 RNA이다. 본 명세서에 제공된 DNA 서열에 상응하고 데옥시리보뉴클레오타이드 골격 대신에 리보뉴클레오타이드 골격을 갖고 티민(T) 대신 측쇄 염기 우라실(U)을 갖는 RNA 서열이 제공된다.
따라서, 본 발명의 핵산은 서열번호 3 및 4로부터 선택되는 cDNA 서열의 RNA 균등물을 포함하거나 이로 이루어지고 참조 서열과 비교할 때 다수의 침묵 변이(예를 들어, 1 내지 50, 예컨대 1 내지 25, 특히 1 내지 5, 특히 1개의 코돈(들)이 변이될 수 있음)를 포함할 수 있다. "RNA 균등물"은 참조 cDNA 서열과 동일한 유전 정보를 포함하는 RNA 서열을 의미한다(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 골격 대신 리보뉴클레오타이드 골격을 갖고 티민(T) 대신 측쇄 염기 우라실(U)을 포함하는 동일한 코돈을 포함하고 함).
본 발명은 또한 상기 언급된 cDNA 및 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 인간 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
본 발명의 핵산은 DNA 핵산의 경우 전사되어 본 발명의 폴리펩타이드로 번역될 수 있고, RNA 핵산의 경우 본 발명의 폴리펩타이드로 번역될 수 있다.
폴리펩타이드 및 핵산
적합하게는, 본 발명에서 사용되는 폴리펩타이드 및 핵산은 단리된다. "단리된" 폴리펩타이드 또는 핵산은 원래 환경에서 분리된 것이다. 예를 들어, 천연 발생 폴리펩타이드 또는 핵산은 천연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리되는 경우 단리된다. 예를 들어 핵산이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터에 클로닝되는 경우 핵산은 단리된 것으로 여겨진다.
폴리펩타이드 또는 핵산 서열과 관련하여 사용될 때 "천연 발생"은 합성적으로 변형되지 않고 천연에 존재하는 서열을 의미한다.
폴리펩타이드 또는 핵산 서열과 관련하여 사용될 때 "인공"은 예를 들어 천연 서열의 합성 변형이거나 비천연 서열을 포함하는 천연에 존재하지 않는 서열을 의미한다.
하나의 핵산 또는 폴리펩타이드와 다른 핵산 또는 폴리펩타이드의 관계와 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 2개 이상의 서열이 천연에서 서로에 대한 동일한 관계로 존재하지 않음을 나타낸다. "이종" 서열은 또한 숙주 유기체에 존재하는 천연 발생 핵산 또는 폴리펩타이드 서열로부터 단리되지 않거나, 유래되지 않거나, 이에 기반하지 않는 서열을 의미할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 폴리펩타이드 변이체는 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 관련 참조 서열에 대해 적어도 약 80% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성(예를 들어, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%)을 갖는다.
밀접하게 관련된 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위해, 제1 서열과 제2 서열 사이의 "서열 동일성 %"가 계산될 수 있다. 폴리펩타이드 서열은 전체 길이에 걸쳐 100% 서열 동일성을 공유하는 경우 다른 폴리펩타이드 서열과 동일하거나 균등한 것으로 언급된다. 서열의 잔기는 왼쪽에서 오른쪽으로, 즉 폴리펩타이드의 경우 N-말단에서 C-말단으로 번호가 지정된다. 2개 이상의 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이라는 용어는 비교 범위에서 최대 상응을 위해 비교 및 정렬될 때 동일한 아미노산 잔기의 소정의 백분율을 갖거나(즉, 소정의 영역에 걸쳐 70% 동일성, 선택적으로 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성) 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 적합하게는, 비교는 참조 서열의 전체 길이에 상응하는 범위에 걸쳐 수행된다.
서열 비교를 위해, 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하며 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 기본 프로그램 매개변수를 사용하거나 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본 명세서에 사용된 "비교 범위"는 두 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 서열이 비교될 수 있는 절편을 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, 1981, Adv. Appi Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터 구현(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP은 관계 및 서열 동일성 퍼센트를 표시하기 위해 점진적인 쌍별 정렬을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한 정렬을 생성하는데 사용된 클러스터링 관계를 보여주는 전개도 또는 덴도그램(dendogram)을 표시한다. PILEUP은 문헌[Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360]의 점진적 정렬 방법의 간략화를 사용한다. 사용된 방법은 문헌[Higgins & Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153]에 기재된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 최대 300개 서열, 각각 최대 길이 5,000개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산까지 정렬할 수 있다. 다중 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍별 정렬로 시작하여 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 생성한다. 그런 다음 이 클러스터는 다음으로 가장 관련 있는 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 정렬된다. 2개의 서열 클러스터는 2개의 개별 서열의 쌍별 정렬의 단순 확장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 점진적인 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 이 프로그램은 특정 서열과 서열 비교 영역의 아미노산 좌표를 지정하고 프로그램 매개변수를 지정하여 실행된다. PILEUP을 사용하여 참조 서열을 다른 시험 서열와 비교하여 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치(0.10) 및 가중된 말단 갭 매개변수를 사용하여 서열 동일성 관계 퍼센트를 결정한다. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어 버전 7.0으로부터 획득될 수 있다(문헌[Devereaux et al., 1984, Nuc. Acids Res. 12:387-395]).
서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 또 다른 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌[Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 사용할 수 있다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 문자열과 정렬될 때 일부 양의 값 임계값 점수 T와 일치하거나 이를 충족하는 문의 서열에서 길이 W의 짧은 문자열를 확인하여 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 인접 단어 점수 임계값을 지칭한다(문헌[Altschul et al., supra] 참조). 이러한 최초 인접 문자열 확정은 검색을 개시하여 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 종자 역할을 한다. 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 문자열 확정은 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열의 경우 매개변수 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수, 항상 > 0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 벌점 점수, 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수 책정 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어져있거나 하나 이상의 음의 점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 된 경우; 또는 서열의 말단에 도달한 경우 각 방향의 확정 문자열 확장이 중단된다. 아미노산 서열의 경우 BLASTP 프로그램은 디폴트 값으로 3의 문자열 길이 및 10의 기대치(E)를 사용하고 BLOSUM62 점수 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조)는 50의 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소합 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다.
서열 간의 "차이"는 제1 서열과 비교하여 제2 서열의 위치에서 단일 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 2개의 서열에는 이러한 차이가 하나, 둘 또는 그 이상 포함될 수 있다. 그외에 제1 서열과 동일한(100% 서열 동일성) 제2 서열의 삽입, 결실 또는 치환은 서열 동일성 %를 감소시킨다. 예를 들어, 동일한 서열이 9개 잔기 길이인 경우 제2 서열에서 하나의 치환으로 88.9%의 서열 동일성이 생성된다. 동일한 서열이 17개의 아미노산 잔기 길이인 경우, 제2 서열에서 2개의 치환으로 88.2%의 서열 동일성이 생성된다.
대안적으로, 제1 참조 서열을 제2 비교 서열과 비교할 목적으로 제2 서열을 생성하기 위해, 제1 서열에 이루어진 추가, 치환 및/또는 결실의 수를 확인할 수 있다. 추가는 제1 서열에 하나의 잔기를 추가하는 것이다(제1 서열의 양쪽 말단에서의 추가 포함). 치환은 제1 서열의 하나의 잔기를 하나의 다른 잔기로 치환하는 것이다. 결실은 제1 서열에서 하나의 잔기가 결실되는 것이다(제1 서열의 양쪽 말단에서 결실 포함).
본 발명의 폴리펩타이드의 생성
본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어 문헌[Green and Sambrook 2012 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 개시된 기술을 사용하여 획득 및 조작될 수 있다. 특히, 인공 유전자 합성을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 생성한 후(문헌[Nambiar et al., 1984, Science, 223: 1299-1301, Sakamar 및 Khorana, 1988, Nucl. Acids Res., 14:6361-6372, Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323 및 Grundstrom et al., 1985, Nucl. Acids Res., 13:3305-3316]), 폴리펩타이드를 생성하기 위해 적합한 유기체에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 예를 들어 고체상 DNA 합성에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 전체 유전자는 전구체 주형 DNA 필요 없이 새로 합성될 수 있다. 적절한 올리고뉴클레오타이드를 획득하기 위해 빌딩 블록을 산물의 서열에 필요한 순서대로 성장하는 올리고뉴클레오타이드 사슬에 순차적으로 커플링(coupling)시킨다. 사슬 조립이 완료되면 산물을 고체상으로부터 용액으로 방출하고 탈보호하고 수집한다. 산물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 단리하여 적절한 올리고뉴클레오타이드를 고순도로 획득할 수 있다(문헌[Verma and Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134]). 이러한 비교적 짧은 절편은 다수의 재조합 DNA 기반 발현 시스템에 사용하기에 적합한 더 긴 DNA 분자로의 다양한 유전자 증폭 방법(문헌[Methods Mol Biol., 2012; 834:93-109])을 사용하여 쉽게 조립된다. 본 발명과 관련하여 당업자는 본 발명에 기재된 폴리펩타이드 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 예를 들어 바이러스 벡터를 포함한 다양한 백신 생성 시스템에서 용이하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
미생물학적 숙주(예를 들어, 박테리아 또는 진균)에서 본 발명의 폴리펩타이드의 생성 목적을 위해, 본 발명의 핵산은 적합한 조절 및 제어 서열(프로모터, 종결 신호 등 포함) 및 숙주에서 단백질 생성에 적합한 폴리펩타이드 분비를 촉진하는 서열을 포함할 것이다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 진핵 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 초파리 S2 세포)의 배양을 적합한 조절 및 제어 서열(프로모터, 종결 신호 등 포함) 및 이들 세포에서 단백질 생성에 적합한 폴리펩타이드 분비를 촉진하는 서열과 조합된 본 발명의 핵산으로 형질도입함으로써 생성될 수 있다.
재조합 수단에 의해 생성된 본 발명의 폴리펩타이드의 개선된 단리는 폴리펩타이드의 한쪽 말단을 향한 히스티딘 잔기 가닥(일반적으로 His-태그로 공지됨)의 추가를 통해 선택적으로 촉진될 수 있다.
폴리펩타이드는 또한 합성적으로 생성될 수 있다.
벡터
추가의 실시양태에서, 본 발명의 핵산 중 하나 이상을 포함하는 유전자 작제물을 생체내에서 세포내로 도입하고 본 발명의 폴리펩타이드를 생체내에서 생성하여 면역 반응을 유도한다. 핵산(예를 들어, DNA)은 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 일부 바이러스 발현 시스템을 포함하는 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템 중 임의의 것 내에 존재할 수 있다. 문헌[Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198], 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌에 기재된 것과 같이 다수의 유전자 전달 기술이 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 접근 방식 중 일부는 예시를 위해 아래에 개괄되어 있다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터(본 명세서에서 DNA 발현 작제물' 또는 '작제물'로도 지칭됨)가 제공된다.
적합하게는, 벡터는 인간 숙주 세포에서 번역 활성(translationally active) RNA 분자의 전사를 가능하게 하기에 적합한 조절 요소(예를 들어, 적합한 프로모터 및 종결 신호)를 인코딩하는 핵산을 포함한다. "번역 활성 RNA 분자"는 인간 세포의 번역 장치에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 분자이다.
따라서, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터(이하 "본 발명의 벡터")가 제공된다.
특히, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV)(예를 들어, AAV 유형 5 및 유형 2), 알파바이러스(예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 신드비스(Sindbis) 바이러스(SIN), 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스(SFV), 헤르페스 바이러스, 아레나바이러스(예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)), 홍역 바이러스, 폭스바이러스(예를 들어, 변형 백시니아 앙카라(vaccinia Ankara)(MVA)), 파라믹소바이러스, 렌티바이러스 또는 랍도바이러스(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(VSV)) 벡터일 수 있고, 즉, 벡터는 전술한 바이러스 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
아데노바이러스는 중간 크기의 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양쪽 말단에는 100 내지 200개의 염기쌍 역반복(ITR)이 포함되어 있으며, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소이다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 따라 구분되는 서로 다른 전사 단위를 포함한다. E1 영역(E1 A 및 E1 B)은 바이러스 게놈 및 소수의 세포 유전자의 전사의 조절에 관여하는 단백질을 인코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질 합성을 유발한다. 이 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단에 관여한다(문헌[Renan, 1990]). 대부분의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자의 산물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 생성된 단일 1차 전사체의 유의한 처리 후에만 발현된다. MLP는 감염의 후기 단계에서 특히 효율적이며 이 프로모터로부터 전사된 모든 mRNA는 5'-3문자 리더(TPL) 서열을 가지고 있어 번역에 유리한 mRNA가 된다. 하나 이상의 초기 유전자가 결실된 바이러스 게놈으로부터 생성된 복제-결핍 아데노바이러스는 복제가 제한되고 백신화된 숙주 내 및 백신화된 숙주의 접촉에 대한 병원성 확산 가능성이 적기 때문에 특히 유용하다.
다른 폴리뉴클레오타이드 전달
본 발명의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 작제물은 단순히 네이키드 재조합 DNA 플라스미드로 이루어질 수 있다. 문헌[Ulmer et al., 1993, Science 259:1745-1749]을 참조하고, 문헌[Cohen, 1993, Science 259:1691-1692]에서 검토한다. 작제물의 전달은, 예를 들어, 세포막을 물리적으로 또는 화학적으로 투과시키는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이는 특히 시험관내 전달에 적용 가능하지만 생체내 사용에도 적용될 수 있다. 대상 유전자를 인코딩하는 DNA는 또한 생체내에서 유사한 방식으로 전달되어 유전자 산물을 발현할 수 있다고 생각된다. DNA 분자를 동물 모델과 인간에게 전달하기 위해 다중 전달 시스템이 사용되었다. 이 기술을 기반으로 하는 일부 산물은 동물 사용 허가를 받았고 다른 산물은 인간을 대상으로 임상 2상 및 3상을 진행 중이다.
RNA 전달
본 발명의 다른 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 작제물은 네이키드 재조합 DNA-유도 RNA 분자로 구성될 수 있다(문헌[Ulmer et al., 2012, Vaccine 30:4414-4418]). DNA 기반 발현 작제물의 경우, 시험관내 또는 생체내에서 RNA 분자를 세포내로 도입하기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. RNA 기반 작제물은 도입된 생물학적 분자가 숙주 세포의 번역 기전에 의해 직접 번역되어 이것이 도입된 세포에서 인코딩된 폴리펩타이드를 생성하도록 단순 메신저 RNA(mRNA) 분자를 모방하여 설계될 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 구조 유전자에 혼입함으로써 이들이 도입된 세포내에서 자가 증폭되도록 하는 방식으로 설계될 수 있다. 따라서 자가 증폭 mRNA(SAM™) 분자로 알려진 이러한 유형의 RNA 분자(문헌[Geall et al. 2012, PNAS, 109:14604-14609])는 일부 RNA 기반 바이러스 벡터와 특성을 공유한다. m RNA 기반 또는 SAM™ RNA는 안정성 및 번역을 향상시키기 위해(예를 들어, 이의 서열을 변이시키거나 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여) 추가로 변형될 수 있고(문헌[Schlake et al., RNA Biology, 9: 1319-1330]), 두 가지 유형의 RNA가 제형화됨으로써(예를 들어, 에멀젼(문헌[Brito et al., Molecular Therapy, 2014 22:2118-2129]) 또는 지질 나노입자(문헌[Kranz et al., 2006, Nature, 534:396-401])), 시험관내 또는 생체내에서 안정성 및/또는 세포로의 유입을 촉진할 수 있다. 변형된(및 변형되지 않은) RNA의 다수의 제형이 동물 모델과 인간에서 백신으로 시험되었으며 다수의 RNA 기반 백신이 진행 중인 임상 시험에 사용되고 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 및 벡터는 면역원성 조성물 및 백신 조성물과 같은 약제학적 조성물(이하 모두 "본 발명의 조성물")의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 적합하게 포함한다.
따라서, 일 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 면역원성 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물의 제조는 일반적으로 예를 들어 문헌[Powell & Newman, eds., Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach), 1995]에 기재되어 있다. 본 발명의 조성물은 또한 생물학적으로 활성 또는 불활성일 수 있는 다른 화합물을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물이다.
본 발명의 특정 바람직한 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 하나 이상(예를 들어, 하나)의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 특정 바람직한 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 본 발명의 하나 이상(예를 들어, 하나)의 핵산 또는 본 발명의 하나 이상(예를 들어, 하나)의 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물이 제공된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상(예를 들어, 하나)의 폴리펩타이드 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 조성물은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 벡터 및 하나 이상(예를 들어, 하나)의 폴리펩타이드 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 조성물은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 벡터 및 하나 이상(예를 들어, 하나)의 폴리뉴클레오타이드 성분을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 강화된 면역 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염
본 발명의 조성물은 본 명세서에서 제공되는 핵산 또는 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 염은 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민 및 염기성 아미노산의 염) 및 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 포함한 약제학적으로 허용 가능한 무독성 염기로부터 제조할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체
당업자에게 공지된 많은 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있지만, 사용되는 담체의 최적 유형은 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, 비경구, 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하는 투여, 바람직하게는 비경구, 예를 들어 근육내, 피하 또는 정맥내 투여의 임의의 적절한 방식으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물을 포함하고 pH 조절을 위한 완충액, 안정화제, 예를 들어 계면활성제 및 아미노산 및 긴장성 변형제, 예를 들어 염 및 당을 포함할 수 있다. 본 조성물이 사용 시점에서 희석을 위해 동결건조된 형태로 제공되도록 의도되는 경우, 제형은 동결보호제, 예를 들어 트레할로스와 같은 당을 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 및 탄산마그네슘과 같은 상기 담체 또는 고체 담체 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 완충액(예를 들어, 중성 완충 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란스), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신, 항산화제, 정균제, EDTA와 같은 킬레이트제 또는 글루타티온, 제형을 수용체의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약 고장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물로 제형화될 수 있다.
면역자극제( immunostimulant )
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포 매개)을 향상하거나 강화하는 임의의 물질일 수 있다. 백신 제형과 관련하여 종종 애주번트로 지칭되는 면역자극제의 예는 알루미늄 하이드록사이드 겔(명반) 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염, QS21을 포함하는 사포닌, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 CPG, 수중유 에멀젼(oil-in-water emulsion)(예를 들어, 오일이 스쿠알렌인 경우), 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 지질다당류 또는 이의 유도체, 예를 들어 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D -MPL®) 및 다른 TLR4 리간드, TLR7 리간드, TLR8 리간드, TLR9 리간드, IL-12 및 인터페론을 포함한다. 따라서, 적합하게는 본 발명의 조성물의 하나 이상의 면역자극제는 알루미늄 염, 사포닌, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 수중유 에멀젼, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 지질다당류 및 이의 유도체 및 다른 TLR4 리간드, TLR7 리간드, TLR8 리간드 및 TLR9 리간드로부터 선택된다. 면역자극제는 또한 다른 면역 성분과 특이적으로 상호작용하는 단일클론 항체, 예를 들어 PD-1 및 CTLA4를 포함하는 면역 체크포인트 수용체의 상호작용을 차단하는 단일클론 항체를 포함할 수 있다.
재조합 핵산 전달 방법(예를 들어, DNA, RNA, 바이러스 벡터)의 경우, 단백질 기반 면역자극제를 인코딩하는 유전자는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자와 함께 용이하게 전달될 수 있다.
지속 방출
본 명세서에 기재된 조성물은 투여 후 화합물의 지연/지속 방출에 영향을 미치는 지속 방출 제형(즉, 캡슐, 스펀지, 패치 또는 젤과 같은 제형(예를 들어, 다당류로 구성))의 일부로서 투여될 수 있다.
저장 및 패키징
본 발명의 조성물은 밀봉된 앰플 또는 바이알과 같은 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 바람직하게는 사용할 때까지 제형의 무균성을 보존하기 위해 기밀하게 밀봉된다. 일반적으로 제형은 유성 또는 수성 비히클에 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 사용 직전에 멸균 액체 담체(예를 들어, 물 또는 주사용 식염수)의 첨가만이 필요한 동결-건조 상태로 저장될 수 있다.
투여량
본 발명의 각 조성물에서 제조될 수 있는 핵산, 폴리펩타이드 또는 벡터의 양은 치료 또는 예방 용도에 적합한 투여량이 획득될 수 있는 방식이다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 산물 저장 수명 및 다른 약리학적 고려 사항과 같은 인자는 이러한 조성물을 제조하는 기술 분야의 숙련자에 의해 고려될 것이며, 그 자체로 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
통상적으로, 치료 또는 예방적 유효량을 포함하는 조성물은 투여당 약 0.1 ug 내지 약 1000 ug의 본 발명의 폴리펩타이드, 더욱 통상적으로 투여당 약 2.5 ug 내지 약 100 ug의 폴리펩타이드를 전달한다. 짧은 합성 긴 펩타이드의 형태로 전달되는 경우 투여량은 1 내지 200 ug/펩타이드/투여량 범위일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 조성물과 관련하여, 이는 통상적으로 투여당 약 10 ug 내지 약 20 mg의 본 발명의 핵산, 더욱 통상적으로 투여당 약 0.1 mg 내지 약 10 mg의 본 발명의 핵산을 전달한다.
치료 또는 예방 질병
다른 부분에서 언급된 바와 같이, 서열번호 1은 피부 흑색종에서 과발현되는 CLT 항원에 상응하는 폴리펩타이드 서열이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 약제(medicine)에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 양상은 인간에서 면역 반응을 상승(raising)시키는 방법으로서 인간에게 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간에서 면역 반응을 상승시키는데 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 제공한다.
인간에서 면역 반응을 상승시키는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물의 용도가 또한 제공된다.
적합하게는 면역 반응이 서열번호 1 및 이의 변이체 및 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암성 종양(cancerous tumor)에 대해 상승된다. 이와 관련하여 "상응하는"은 종양이 서열번호 1 또는 이의 변이체 또는 면역원성 단편을 발현하는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물 및 이를 포함하는 약제는 서열번호 1 또는 이의 변이체 또는 면역원성 단편을 기반으로 할 것이다.
적절하게는 면역 반응은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 항체 반응, 특히 CD8+ 세포용해성 T 세포 반응 및 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 포함한다.
적합하게는 면역 반응이 종양, 특히 서열번호 1 및 이의 변이체 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 서열을 발현하는 것에 대해 상승된다.
바람직한 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양, 예를 들어 피부 흑색종 종양이다.
종양은 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간 환자를 치료하거나, 암이 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 제공한다.
서열번호 3에 상응하는 전사체는 또한 포도막 흑색종에서 과발현되었다. 결과적으로, 대안적인 실시양태에서, 종양은 포도막 흑색종 종양이고/거나 종양이 서열번호 1의 서열을 발현한다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 방법 또는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 제공하며, 상기 폴리펩타이드는
(a) 서열번호 1의 서열; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함하고,
예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
암은 포도막 흑색종이다.
"방지" 및 "예방"이라는 단어는 본 명세서에서 상호 혼용된다.
치료 및 백신화 요법
치료 요법은(i) 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터와(ii) 하나 이상의 추가의 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터 및/또는(iii) 선택적으로 애주번트와 동시에 투여되는 항원 단백질과 같은 다양한 다른 치료적으로 유용한 화합물 또는 분자와 같은 추가 성분의 동시(예를 들어, 공동 투여) 또는 순차적(예를 들어, 프라임-부스트(prime-boost)) 전달을 포함할 수 있다. 공동 투여의 예에는 동측 공동 투여 및 대측 공동 투여가 포함된다. "동시" 투여는 적절하게는 동일한 라운드의 치료 동안 전달되는 모든 성분을 지칭한다. 적절하게는 모든 성분이 동시에 투여되지만(예를 들어, DNA와 단백질 동시 투여), 하나의 성분은 몇 분 이내에(예를 들어, 동일한 진료 예약 또는 의사 방문 시) 또는 몇 시간 내에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터의 "프라이밍(priming)" 또는 제1 투여 후, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터의 하나 이상의 "부스팅(boosting)" 또는 후속 투여("프라임 앤 부스트" 방식)가 수행된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터는 프라임-부스트 백신화 요법에서 사용된다. 일 실시양태에서 프라임 및 부스트는 모두 본 발명의 폴리펩타이드로 이루어지고, 각각의 경우에 본 발명의 동일한 폴리펩타이드이다. 일 실시양태에서 프라임 및 부스트 모두는 본 발명의 핵산 또는 벡터로 이루어지고, 각각의 경우에 본 발명의 동일한 핵산 또는 벡터이다. 대안적으로, 프라임은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 사용하여 수행될 수 있고 부스트는 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 수행될 수 있거나, 프라임은 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 수행될 수 있고 부스트는 본 발명의 핵산 또는 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로 제1 또는 "프라이밍" 투여 및 제2 또는 "부스팅" 투여는 약 1 내지 12주 후에, 또는 최대 4 내지 6개월 후에 제공된다. 후속 "부스터" 투여는 매 1 내지 6주마다의 빈도로 제공될 수 있거나 훨씬 더 후(최대 몇 년 후) 제공될 수 있다.
항원 조합
본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터는 본 발명의 하나 이상의 다른 폴리펩타이드 또는 핵산 또는 벡터 및/또는 흑색종 예를 들어, 피부 또는 포도막 흑색종에 대해 상승된 면역 반응을 야기하는 다른 항원성 폴리펩타이드(또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터)와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 다른 항원성 폴리펩타이드는 다양한 공급원으로부터 유래할 수 있으며, GPR143, PRAME, MAGE-A3 또는 pMel(gp100)과 같이 널리 기재된 흑색종 관련 항원을 포함할 수 있다. 대안적으로 이는 환자-특이적 신생항원을 포함하는 다른 유형의 흑색종 항원(문헌[Lauss et al.(2017). Nature Communications, 8(1), 1738). http://doi.org/10.1038/s41467-017-01460-0]), 잔류 인트론 신생항원(문헌[Smart et al.(2018). Nature Biotechnology http://doi.org/10.1038/nbt.4239]), 스플라이싱된 변이체 신생항원(문헌[Hoyos et al., Cancer Cell, 34(2), 181-183. http://doi.Org/10.1016/i.cceiL2Q18.07.008; Kahles et al.(2018). Cancer Cell, 34(2), 211-224.e6. http://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.07.001]), 손상된 펩타이드 처리와 관련된 T 세포 에피토프를 인코딩하는 항원으로 알려진 범주에 맞는 흑색종 항원(TIEPP; 문헌[Gigoux, M., & Wolchok, J(2018). JEM, 215 2233, Marijt et al.(2018). JEM 215 2325]), 또는 발견될 신생항원(CLT 항원 포함)을 포함할 수 있다. 또한, 이들 다양한 공급원으로부터의 항원성 펩타이드는 또한 예를 들어,(i) 비특이적 면역자극제/애주번트 종 및/또는(ii) 공동-투여된 항원에 의해 유도된 항흑색종 특이적 반응을 증폭시키기 위해 강력한 CD4 헬퍼 T 세포(폴리펩타이드, 또는 이들 CD4 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 전달됨)를 유도하는 것으로 공지된 범용 CD4 헬퍼 에피토프(universal CD4 helper epitope)를 포함하는 항원과 조합될 수 있다.
상이한 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터는 동일한 제형으로 또는 별개의 제형으로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드가 제2의 또는 추가의 폴리펩타이드에 융합된 융합 단백질로서 제공될 수 있다(하기 참조).
전술한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 제공될 수 있다.
더욱 일반적으로, 2개 이상의 성분이 조합되어 사용될 때 성분은 예를 들어
(1) 2개 이상의 개별 항원성 폴리펩타이드 성분;
(2)(또는 추가의) 폴리펩타이드 성분 둘 모두를 포함하는 융합 단백질;
(3) 하나 이상의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 성분;
(4) 2개 이상의 개별 폴리뉴클레오타이드 성분;
(5) 2개 이상의 개별 폴리펩타이드 성분을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드; 또는
(6) 두(또는 추가의) 폴리펩타이드 성분을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드로서
제시될 수 있다.
편의상, 다수의 성분이 존재할 때 단일 융합 단백질 또는 단일 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 내에 포함되는 것이 종종 바람직하다(하기 참조). 본 발명의 일 실시양태에서 모든 성분은 폴리펩타이드로서 제공된다(예를 들어, 단일 융합 단백질). 본 발명의 다른 실시양태에서 모든 성분은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 단일 융합 단백질을 인코딩하는 것과 같은 단일 폴리뉴클레오타이드)로서 제공된다.
융합 단백질
항원 조합에 대한 상기 논의의 실시양태로서, 본 발명은 또한 개별 항원을 인코딩하는 서열을 함께 융합하는 핵산 작제물을 생성함으로써, 본 발명의 제2의 또는 추가의 폴리펩타이드에 융합된 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드(이하 "본 발명의 조합 폴리펩타이드")를 제공한다. 본 발명의 조합 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 본 명세서에 기재된 유용성을 가질 것으로 예측되며, 우수한 면역원성 또는 백신 활성 또는 예방 또는 치료 효과의 이점(반응의 폭 및 깊이 증가 포함)을 가질 수 있으며, 특히 근친 교배 집단에서 가치가 있을 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 융합은 또한 백신 항원 및/또는 벡터화 백신(핵산 백신 포함)의 작제 및 제조 효율을 증가시키는 이점을 제공할 수 있다.
항원 조합 섹션에서 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명의 조합 폴리펩타이드는 또한
(a) 흑색종 관련 항원이고 따라서 백신에서 면역원성 서열로서 잠재적으로 유용한 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 상기에서 언급된 GPR143, PRAME, MAGE-A3 및 pMel(gp100)); 및
(b) 면역 반응을 향상시킬 수 있는 폴리펩타이드 서열(즉, 면역자극제 서열).
(c) 예를 들어 강력한 CD4+ 지원을 제공하여 CLT 항원 에피토프에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증가시킬 수 있는 범용 CD4 헬퍼 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 서열
중 하나 이상을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드가 아닌 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 준용하여 본 발명의 다른 양상(벡터, 조성물, 세포 등)을 제공한다.
CLT 항원-결합 폴리펩타이드
종양-발현된 항원에 대해 면역특이적인 항원-결합 폴리펩타이드(본 발명의 폴리펩타이드)는 세포용해 세포를 항원-부속 종양 세포로 집합시켜 그의 파괴를 매개하도록 설계될 수 있다. 항원 결합 폴리펩타이드에 의한 세포용해 세포 집합의 이러한 메커니즘 중 하나는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 면역특이적인 항원 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 단일클론 항체 및 이의 단편, 예를 들어 도메인 항체, Fab 단편, Fv 단편 및 VHH 단편과 같은 항체를 포함하는 항원 결합 폴리펩타이드는 비인간 동물 종(예를 들어, 설치류 또는 낙타류)에서 생성되어 인간화될 수 있거나 비인간 종(예를 들어, 인간 면역계를 갖도록 유전자 변형된 설치류)에서 생성될 수 있다.
항원-결합 폴리펩타이드는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 특이적 항체 생성 B 세포를 조직 배양에서 성장하는 능력 및 항체 사슬 합성의 부재에 대해 선택된 골수종(B 세포 암) 세포와 융합하여 하이브리도마 기술을 사용하여 생성할 수 있다(문헌[Kohler 및 Milstein, 1975, Nature 256(5517): 495-497 및 Nelson et al., 2000(Jun), Mol Pathol. 53(3): 111-7], 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨).
결정된 항원에 대한 단일클론 항체는 예를 들어
a) 결정된 항원, 불멸 세포, 바람직하게는 골수종 세포에 의해 사전에 면역/노출된 동물(인간 포함)의 말초 혈액으로부터 획득된 림프구를 불멸화하여 하이브리도마를 형성하는 단계,
b) 형성된 불멸화 세포(하이브리도마)를 배양하고, 적절한 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포를 회수하는 단계
에 의해 획득할 수 있다.
단일클론 항체는 a) 벡터, 특히 파지 및 더욱 특히 사상 박테리오파지에, 동물의 림프구, 특히 말초혈 림프구로부터 획득된 DNA 또는 cDNA 서열(적절하게는 결정된 항원에 의해 사전 면역화됨)을 클로닝하는 단계,
b) 항체의 생성을 가능하게 하는 조건에서 상기 벡터로 원핵 세포를 형질전환시키는 단계,
c) 항체를 항원-친화도 선택에 적용하여 항체를 선택하는 단계,
d) 적절한 특이성을 갖는 항체를 회수하는 단계
e) 항원에 노출된 환자 또는 항원으로 실험적으로 면역화된 동물의 B 세포로부터 획득된 항체-인코딩 핵산 분자를 발현시키는 단계
를 포함하는 공정에 의해 획득할 수 있다.
선택된 항체는 통상적인 재조합 단백질 생성 기술(예를 들어, 유전자 조작된 CHO 세포)을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 면역특이적인 단리된 항원 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 적합하게는, 항원 결합 폴리펩타이드는 단일클론 항체 또는 이의 단편이다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 폴리펩타이드는 세포독성 모이어티에 커플링된다. 예시적인 세포독성 모이어티는 ADCC를 촉진하는 Fc 수용체-보유 세포를 집합시킬 항체의 Fc 도메인을 포함한다. 대안적으로, 항원-결합 폴리펩타이드는 생물학적 독소, 또는 세포독성 화학물질에 연결될 수 있다.
항원-결합 폴리펩타이드의 또 다른 중요한 클래스는 본 발명의 항원의 HLA-디스플레이 단편에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)-유도된 분자를 포함한다. 이 실시양태에서, 종양 세포의 표면에서 CLT 항원(또는 이의 유도체)을 인식하는 TCR 기반 생물학적 제제(환자로부터 직접 유도된 TCR, 또는 특이적으로 조작된 고친화도 TCR 포함)는 또한 이러한 면역 세포를 종양으로 유인하는 T 세포(또는 다른 클래스의 면역 세포) 상의 성분을 인식하는 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며 치료 효과를 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 또한 재유도된 면역 세포의 유리한 활성(세포용해 활성 포함)을 자극할 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드이거나 그의 일부인 HLA-결합(HLA-bound) 폴리펩타이드에 대해 면역특이적이다. 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드는 T 세포 수용체이다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드는 본 발명은 대상체에서 세포독성 세포 또는 다른 면역 성분과 결합할 수 있는 또 다른 폴리펩타이드에 커플링될 수 있다.
일 실시양태에서, 항원-결합 폴리펩타이드는 약제에 사용하기 위한 것이다.
일 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물일 수 있다. 예를 들어, 위의 약제학적 조성물의 개시내용을 참조한다.
본 발명은 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 발명의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 상기 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 세포독성 모이어티에 커플링될 수 있는 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 상기 항원-결합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다.
적합하게는 임의의 상기 실시양태에서, 암은 흑색종 특히 피부 흑색종이다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 방법 또는 항원 결합 폴리펩타이드 또는 조성물이 제공되며,
폴리펩타이드는
(a) 서열번호 1의 서열; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 암은 포도막 흑색종이다.
항원-결합 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)은 예를 들어 5 내지 1000 mg, 예를 들어 25 내지 500 mg, 예를 들어 100 내지 300 mg, 예를 들어 약 200 mg의 투여량으로 투여될 수 있다.
생체내 항원 제시를 촉진하기 위한 세포 요법
다양한 세포 전달 비히클 중 임의의 것이 약제학적 조성물 내에서 이용되어 항원-특이적 면역 반응의 생성을 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드로 생체외 로딩(ex vivo loading)에 의해 변형되거나 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 단리된 항원 제시 세포(이하 "본 발명의 APC"로 지칭됨)인 세포를 제공한다. 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 효율적인 APC가 되도록 조작될 수 있는 다른 세포와 같은 항원 제시 세포(APC). 이러한 세포는 반드시 그러한 것은 아니나, 항원 제시 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 개선하고/거나 수용체와 면역학적으로 공존할 수 있도록(즉, 일치된 HLA 일배체형) 유전자 변형될 수 있다. APC는 일반적으로 임의의 다양한 생물학적 유체 및 기관으로부터 단리될 수 있고 자가, 동종이계, 동계 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 실시양태는 APC로서 수지상 세포 또는 그의 전구 세포를 사용한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 APC는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC이며(문헌[Banchereau & Steinman, 1998, Nature, 392:245-251]), 예방 또는 치료 면역을 유도하기 위한 생리학적 애주번트로서 효과적인 것으로 나타났다(문헌[Timmerman & Levy, 1999, Ann. Rev. Med. 50:507-529]). 일반적으로 수지상 세포는 통상적인 모양(시험관내에서 관찰되는 세포질 과정(수지돌기)이 표지된 원위치 성상), 고효율로 항원을 흡수, 처리 및 제시하는 능력 및 나이브 T 세포 반응을 활성화하는 능력을 기반으로 확인할 수 있다. 물론, 수지상 세포는 생체내 또는 생체외 수지상 세포에서 일반적으로 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 조작될 수 있으며, 이러한 변형된 수지상 세포는 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포에 대한 대안으로서, 항원-로딩된 분비 소포(엑소좀(exosome)이라고 함)가 면역원성 조성물 내에서 사용될 수 있다(문헌[Zitvogel et al., 1998, Nature Med. 4:594-600] 참조). 따라서, 일 실시양태에서 본 발명의 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀이 제공된다.
수지상 세포 및 전구 세포는 말초 혈액, 골수, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 임의의 다른 적합한 조직 또는 유체로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토카인의 조합을 말초 혈액으로부터 채취한 단핵구의 배양에 첨가함으로써 생체외에서 분화될 수 있다. 대안적으로, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 수확된 CD34-양성 세포는 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 다른 화합물(들)의 조합을 배양 배지에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화될 수 있다.
수지상 세포는 간편하게는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되며, 이는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법을 가능하게 한다. 그러나, 이 명명법은 분화의 가능한 모든 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리 능력이 높은 APC로 특징지어지며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있다. 성숙한 표현형은 통상적으로 이들 마커의 낮은 발현을 특징으로 하지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)과 같은 T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 분자의 높은 발현을 특징으로 한다.
APC는 또한 예를 들어 단백질(또는 이의 일부 또는 다른 변이체)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염되어 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 일어날 수 있고, 그런 다음 이러한 형질감염된 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, 수지상 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클이 환자에게 투여되어 형질감염이 생체내에서 발생할 수 있게 할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 WO 97/24447에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 문헌[Mahvi et al., 1997, Immunology and Cell Biology 75:456-460]에 기재된 유전자 총 접근법을 사용하여 수행될 수 있다. 수지상 세포의 항원 로딩은 수지상 세포 또는 전구 세포를 폴리펩타이드, DNA(예를 들어, 플라스미드 벡터) 또는 RNA; 또는 항원-발현 재조합 박테리아 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV)(예를 들어, AAV 유형 5 및 유형 2), 알파바이러스(예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV), 신드비스 바이러스(SIN)), 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 헤르페스 바이러스, 아레나바이러스(예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)), 홍역 바이러스, 폭스바이러스(예를 들어, 변형 백시니아 앙카라(MVA) 또는 계두), 파라믹소바이러스, 렌티바이러스 또는 랍도바이러스(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(VSV))와 함께 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 폴리펩타이드 로딩 전에, 폴리펩타이드는 T 세포 지원을 제공하는 면역학적 대상(예를 들어, 담체 분자)에 공유 결합에 의해 접합될 수 있다. 대안적으로 수지상 세포는 별도로 또는 폴리펩타이드 또는 벡터의 존재 하에 비접합 면역학적 대상으로 펄싱(pulsing)될 수 있다.
본 발명은 특이적으로 설계된 짧은 화학적으로 합성된 폴리펩타이드 항원의 에피토프-인코딩된 단편을 항원 제시 세포로 전달하는 것을 제공한다. 당업자는 합성된 긴 펩타이드(SLP)로도 알려진 이러한 유형의 분자가 시험관내에서 세포를 자극(또는 로딩)하기 위해 본 발명의 항원성 폴리펩타이드를 사용하기 위한 치료 플랫폼(문헌[Gornati et al., 2018, Front.Imm, 9: 1484]), 또는 생체내에서 폴리펩타이드 항원을 항원 제시 세포에 도입하는 방법(문헌[Melief & van der Burg, 2008, Nat Rev Cancer, 8:351-60])을 제공한다는 것을 인식할 것이다.
일 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합하게는 수지상 세포인 본 발명의 항원 제시 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물일 수 있다. 예를 들어, 위의 약제학적 조성물의 개시내용을 참조한다.
일 실시양태에서, 약제에 사용하기 위한, 적합하게는 수지상 세포인, 본 발명의 항원-제시 세포가 제공된다.
또한 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 상기 인간에 적합하게는 수지상 세포인 본 발명의 상기 항원 제시 세포 또는 본 발명의 상기 항원 제시 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것으로 적합하게는 수지상 세포인 본 발명의 항원 제시 세포, 또는 본 발명의 상기 항원 제시 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물일 수 있다. 예를 들어, 위의 약제학적 조성물의 개시내용을 참조한다.
조성물은 선택적으로 면역자극제를 포함할 수 있다 - 상기 면역자극제의 개시내용을 참조한다.
일 실시양태에서, 약제에 사용하기 위한 본 발명의 엑소좀이 제공된다.
암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 발명의 경우 상기 엑소좀 또는 본 발명의 상기 엑소좀을 포함하는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 엑소좀 또는 본 발명의 상기 엑소좀을 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 실시양태 중 임의의 하나에서, 적합하게는 암은 흑색종, 특히 피부 흑색종이다.
자극된 T 세포 요법
본 발명의 폴리펩타이드에 대해 면역특이적인 T 세포의 생체내 또는 생체외 APC-매개 생성에 더하여, 자가 또는 비-자가 T 세포는 대상체, 예를 들어 말초혈액, 제대혈로부터 및/또는 성분채집에 의해 단리될 수 있고, 이를 APC 세포의 MHC 분자(신호 1)에 로딩된 종양 연관 항원의 존재 하에 자극하여 이 항원에 대해 TCR 면역특이적인 T 세포의 증식을 유도할 수 있다.
성공적인 T 세포 활성화에는 항원 제시 세포 및 T 세포 각각에 대한 공자극 표면 분자 B7 및 CD28의 결합이 필요하다(신호 2). 최적의 T 세포 활성화를 달성하려면 신호 1과 2가 모두 필요하다. 이와 달리, 동시자극(신호 2) 부재 하의 항원성 펩타이드 자극(신호 1)은 완전한 T 세포 활성화를 유도할 수 없으며 T 세포내성을 유도할 수 있다. 공자극 분자 외에도 또한 T 세포 활성화를 방지하기 위한 신호를 유도하는 CTLA-4 및 PD-1과 같은 억제 분자가 있다.
따라서 자가 또는 비-자가 T 세포는 본 발명의 폴리펩타이드의 존재 하에 자극될 수 있고, 확장되어 암 세포가 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드를 발현하는 암의 위험이 있거나 암에 걸린 환자에게 다시 전달될 수 있고, 단, 항원 특이적 TCR은 환자의 MHC에 의해 제시되는 항원을 인식할 것이고, 이는 상기 상응하는 폴리펩타이드를 발현하는 상기 암의 세포를 표적화하여 사멸을 유도할 것이다.
일 실시양태에서, 상기 인간에서 상기 암의 치료를 위해 상기 인간으로 자극 및/또는 증폭된 상기 T 세포의 후속 재도입을 위해 암에 걸린 인간으로부터 유래된 T 세포의 생체외 자극 및/또는 증폭에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물이 제공된다.
본 발명은 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암의 치료 방법으로서, 선택적으로 항원 제시 세포와 함께 적어도 T 세포를 포함하는 백혈구 세포의 집단을 상기 인간으로부터 채취하는 단계, 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물의 존재 하에 상기 T 세포를 자극 및/또는 증폭하는 단계 및 적어도 자극 및/또는 증폭된 T 세포 T 세포를 포함하는 상기 백혈구 세포의 일부 또는 전부를 인간에게 재도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 하나에서, 적합하게는 암은 흑색종, 특히 피부 흑색종이다.
일 실시양태에서, 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성인 T 세포 집단을 제조하는 공정으로서,(a) 암 환자로부터 T 세포 및 항원-제시 세포를 획득하는 단계,(ii) 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 사용하여 생체외에서 T 세포 집단을 자극 및 증폭하는 단계를 포함하는 공정이 제공된다.
이와 관련하여 "상응하는"은 암세포가 서열번호 1 또는 이의 변이체 또는 면역원성 단편을 발현하는 경우 그 후 T 세포 집단은 서열번호 1 또는 이의 변이체 또는 면역원성 단편에 의해 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터, 또는 전술한 것 중 하나를 포함하는 조성물의 형태로 자극 및 증폭되는 것을 의미한다.
예를 들어, 이러한 과정에서 배양 및 확장은 수지상 세포의 존재하에 수행된다. 수지상 세포는 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터로 형질감염될 수 있고 본 발명의 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
본 발명은 임의의 전술한 공정에 의해 획득 가능한 T 세포 집단(이하, 본 발명의 T 세포 집단)을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물로 자극된 T 세포인 세포(이하, 본 발명의 T 세포)가 제공된다.
일 실시양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 T 세포 집단 또는 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 예를 들어 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물일 수 있다.
일 실시양태에서, 약제에 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 집단 또는 T 세포가 제공된다.
또한 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 발명의 상기 T 세포 집단 또는 T 세포 또는 본 발명의 상기 T 세포 집단 또는 T 세포를 포함하는 조성물을 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 집단, 본 발명의 T 세포 또는 본 발명의 상기 T 세포 집단 또는 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 실시양태 중 임의의 하나에서, 적합하게는 암은 흑색종, 특히 피부 흑색종이다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 공정, 방법 또는 T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀 또는 조성물이 제공되고, 본 폴리펩타이드는
(a) 서열번호 1의 서열; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 암은 포도막 흑색종이다.
조작된 면역 세포 요법
인간 HLA 분자에 복합체화된 CLT 항원-유래 펩타이드를 인식하는 TCR 또는 TCR 모방체(문헌[Dubrovsky et al., 2016, Oncoimmunology] 참조)를 포함하여 상기 기재된 모든 유형의 CLT 항원 결합 폴리펩타이드의 유도체는 T 세포(자가 또는 비-자가)의 표면에서 발현될 수 있으며, 이는 암 치료를 위한 입양 T 세포 요법으로 투여될 수 있다.
이들 유도체는 "키메라 항원 수용체(CAR)"의 범주내에 속하고, 이는 본 명세서에 사용된 바와 같이 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있으며, 예를 들어 인공 특이성을 특정 면역 효과기 세포에 이식하는 조작된 수용체를 포함한다.
CAR은 단일클론 항체의 특이성을 T 세포에 부여함으로써, 예를 들어 입양 세포 요법에 사용하기 위해 다수의 특이적 T 세포가 생성되도록 할 수 있다. CAR은 세포의 특이성을 종양 연관 항원인 본 발명의 폴리펩타이드에 유도할 수 있으며, 본 폴리펩타이드는 HLA-결합된다.
환자에서 암을 치료하기 위한 또 다른 접근법은 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 통해 종양 세포 상에 발현된 항원을 표적화하도록 T 세포를 유전자 변형시키는 것이다. 이 기술은 문헌[Wendell & June, 2017, Cell, 168: 724-740](상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함됨)에서 검토되었다.
이러한 CAR T 세포는 대상체로부터, 예를 들어, 말초 혈액, 제대혈로부터 및/또는 성분채집에 의해 세포 샘플을 획득하고, 상기 세포를 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 면역특이적인 키메라 T 세포 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 방법에 의해 생성될 수 있으며, 상기 샘플은 T 세포 또는 T 세포 전구체를 포함하며, 폴리펩타이드는 HLA에 결합된다. 이러한 핵산은 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 대한 T 세포 반응을 제공하기 위한 유효량으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 세포 샘플을 수집할 수 있다.
상기 CAR-발현 T 세포를 생성하기 위해 사용된 세포는 자가 또는 비-자가일 수 있는 것으로 이해된다.
트랜스제닉 CAR-발현 T 세포는 불활성화된 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 세포는 내인성 알파/베타 T 세포 수용체(TCR)의 발현이 제거되도록 조작될 수 있다.
세포의 형질감염 방법은 당업계에 잘 공지되어 있지만, 전기천공과 같은 고효율 형질감염 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, CAR 작제물을 발현하는 본 발명의 핵산 또는 벡터는 뉴클레오펙션 장치를 사용하여 세포내로 도입될 수 있다.
CAR-발현 T 세포에 대한 세포 집단은 세포의 형질감염 후에 농축될 수 있다. 예를 들어, CAR을 발현하는 세포는 CAR 또는 CAR-결합 항체에 의해 결합된 항원을 사용함으로써(예를 들어, FACS를 통해) CAR을 발현하지 않는 세포로부터 분류될 수 있다. 대안적으로, 농축 단계는 비-T 세포의 고갈 또는 CAR 발현이 부재하는 세포의 고갈을 포함한다. 예를 들어, CD56+ 세포는 배양 집단에서 고갈될 수 있다.
트랜스제닉 CAR-발현 세포의 집단은 CAR-발현 T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배지에서 생체외에서 배양될 수 있다. 따라서, CAR-발현 T 세포는 생체외에서 확장될 수 있다.
CAR 세포의 샘플은 보존(또는 배양에서 유지)될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 추후 확장 또는 분석을 위해 동결보존될 수 있다.
CAR-발현 T 세포는 다른 치료제, 예를 들어 PD-L1 길항제를 포함하는 체크포인트 억제제와 조합하여 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 표면 상에 임의의 상기 항원-결합 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세포독성 세포가 제공된다. 적합하게는, 세포독성 세포는 T 세포이다.
일 실시양태에서, 약제에 사용하기 위한, 그의 표면 상에 임의의 상기 항원-결합 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된, 적합하게는 T 세포인 세포독성 세포가 제공된다.
본 발명은 적합하게는 T 세포인 본 발명의 세포독성 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간 환자를 치료하거나, 암이 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법이 제공되며, 본 방법은 적합하게는 T 세포인 본 발명의 세포독성 세포를 상기 인간에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 적합하게는 T 세포인 본 발명의 세포독성 세포는 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
조합 요법
본 발명에 따른 암의 치료 방법은 다른 요법, 특히 체크포인트 억제제 및 인터페론과 조합하여 수행될 수 있다.
폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 항원 결합 폴리펩타이드 및 입양 세포 요법(APC 및 T 세포 기반)은 면역원성을 향상시키고, 예를 들어 유도된 면역 반응의 규모 및/또는 폭을 개선하거나, 다른 활성(예를 들어, 선천성 또는 적응 면역 반응의 다른 양상의 활성화, 또는 종양 세포의 파괴)을 제공하도록 설계된 다른 성분과 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 약제학적으로 허용 가능한 담체; 및(i) 하나 이상의 추가 면역원성 또는 면역자극성 폴리펩타이드(예를 들어, 인터페론, IL-12, 체크포인트 차단 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터),(ii) 소분자(예를 들어, HDAC 억제제 또는 암 세포의 후성 유전학적 프로파일을 변형시키는 다른 약물) 또는 본 발명의 대상인 폴리펩타이드 산물의 번역 및/또는 제시를 향상시킬 생물학적 제제(이를 인코딩하는 폴리펩타이드 또는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터로 전달됨)와 함께 포함하는 본 발명의 조성물(즉, 면역원성, 백신 또는 약제학적 조성물) 또는 이러한 다수의 조성물의 키트를 제공한다.
이러한 억제제가 면역계 공격에 대한 암의 주요 방어 중 하나를 극복하기 위해 조사되고 있으므로, 암 세포의 정상 단백질 또는 이에 반응하는 T 세포의 단백질을 차단하는 체크포인트 억제제는 CLT-항원 기반 요법과 조합하는 약물의 특히 중요한 부류일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 항원-결합 폴리펩타이드, 조성물, T 세포, T 세포 집단, 또는 항원 제시 세포를 체크포인트 억제제와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 체크 포인트 억제제의 예는 PD-1 억제제, 예컨대 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(Keytruda) 및 니볼루맙(nivolumab)(Opdivo), PD-L1 억제제, 예컨대 아테졸리주맙(atezolizumab)(Tecentriq), 아벨루맙(avelumab)(Bavencio) 및 더발루맙(durvalumab)(Imfinzi) 및 CTLA-4 억제제, 예컨대 이필리무맙(ipilimumab)(Yervoy)으로부터 선택된다.
인터페론(예를 들어, 알파, 베타 및 감마)은 신체가 매우 소량으로 만드는 단백질 패밀리이다. 인터페론은 암세포의 분열을 지연시키거나 중단시키고, 암세포가 면역계로부터 스스로를 보호하는 능력을 감소시키고/거나, 적응 면역계의 다수의 양상을 향상시킬 수 있다. 인터페론은 일반적으로 예를 들어 대퇴부 또는 복부에 피하 주사로 투여된다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 항원 결합 폴리펩타이드 또는 조성물을 인터페론, 예를 들어 인터페론 알파와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상이한 방식이 또한 조합될 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 및 벡터는 본 발명의 APC, T 세포 또는 T 세포 집단과 조합될 수 있다(아래에서 논의됨).
본 발명의 하나 이상의 방식은 또한 통상적인 항암 화학요법 및/또는 방사선과 조합될 수 있다.
진단
또 다른 양상에서, 본 발명은 암, 특히 흑색종, 예를 들어, 피부 흑색종을 진단하기 위해 또는 또는 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 항원 결합 폴리펩타이드, 입양 세포 요법 또는 조성물에 의한 치료에 적합한 인간 대상체를 진단하기 위해 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 중 하나 이상을 사용하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 암에 걸린 인간을 진단하는 방법으로서, 상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체(예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 5 또는 서열번호 6 중 어느 하나의 서열)로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열; 또는 상기 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 3 및 4의 서열로부터 선택됨)을 인코딩하는 핵산을 발현하는지를 결정하는 단계, 및 상기 폴리펩타이드 또는 상응하는 핵산이 상기 암 세포에서 과발현되는 경우 상기 인간을 암에 걸린 것으로 진단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 암 세포에서 "과발현된"은 암 세포에서의 발현 수준이 정상 세포에서보다 더 높다는 것을 의미한다.
본 발명은 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종인 암에 걸린 인간을 진단하는 방법으로서 상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열; 또는 상기 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산을 발현하는지를 결정하는 단계, 및 상기 폴리펩타이드 또는 상응하는 핵산이 상기 암 세포에서 과발현되는 경우, 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종인 암에 걸린 것으로서 상기 인간을 진단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
과발현은 암이 없는 것으로 확인된 대조군 인간 대상체에서 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드의 수준을 기준으로 결정될 수 있다. 따라서 과발현은 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드가 대조군 대상체에서보다 시험 대상체에서 상당히 더 높은 수준(예를 들어, 30%, 50%, 100% 또는 500% 더 높은 수준)에서 검출된다는 것을 나타낸다. 대조군 인간 대상체의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드의 수준이 검출 불가능한 경우, 진단은 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드를 검출함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 암에 걸린 인간을 치료하는 방법으로서,
(a) 상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체(예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열)로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 서열번호 3 및 4의 서열로부터 선택됨)을 발현하는지를 결정하는 단계; 및 이러한 경우
(b) 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 조성물, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 항원 결합 폴리펩타이드 또는 세포독성 세포를 상기 인간에 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 인간이 본 발명의 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 조성물, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 세포독성 세포를 포함하는 백신에 의한 치료에 적합한지를 결정하기 위한 바이오마커(biomarker)로서,
(a) 서열번호 1의 서열; 또는
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c) 암에 걸린 인간의 종양으로부터 단리된(a)의 서열의 면역원성 단편으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 용도, 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 용도가 제공된다.
적합하게는, 암은 흑색종, 특히 피부 흑색종이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법 또는 용도를 제공하고, 본 폴리펩타이드는
(a) 서열번호 1의 서열; 및
(b)(a)의 서열의 변이체; 및
(c)(a)의 서열의 면역원성 단편
으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
암은 포도막 흑색종이다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 이의 단편, 예컨대 이의 면역원성 단편(예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열)로부터 선택되는 서열을 갖는다.
적합하게는 본 발명의 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 갖거나 포함한다.
핵산의 존재를 검출하기 위한 키트는 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 적어도 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트는 특이적 핵산의 검출 및 반정량화를 가능하게 하기 위해 실시간 PCR(RT-PCR) 반응 내에서 사용될 수 있다. 이러한 키트를 사용하면 포스터 공명 에너지 전이(Forster Resonance Energy Transfer, FRET)(예를 들어, TaqMan® 키트)의 결과로 또는 이중 가닥 DNA(예를 들어, SYBR® Green 키트)의 결합 시 형광 신호를 생성하여 PCR 산물을 검출할 수 있다. 일부 키트(예를 들어, 표적 DNA의 엑손 범위의 TaqMan® 프로브를 포함하는 키트)는 mRNA, 예를 들어 본 발명의 전사체 인코딩 핵산의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 특정 키트를 사용한 분석은 반응 내에서 동시에 다수의 핵산을 검출하기 위해 다중 형식으로 설정될 수 있다. 활성 DNA(즉, 발현을 나타내는 특정 후성 유전학적 특징을 지닌 DNA)의 검출을 위한 키트가 또한 사용될 수 있다. 이러한 키트 내에 존재할 수 있는 추가 성분에는 본 발명의 핵산의 검출을 용이하게 하는 진단 시약 또는 리포터가 포함된다.
본 발명의 핵산은 또한 환자의 혈액 샘플을 사용하여 액체 생검을 통해 검출될 수 있다. 이러한 절차는 외과적 생검에 대한 비침습적 대안을 제공한다. 이러한 혈액 샘플로부터의 혈장은 본 발명의 핵산의 존재에 대해 단리 및 분석될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 환자 종양 샘플의 균질화된 제조물에서 본 발명의 폴리펩타이드를 검출하기 위한 ELISA 유형 분석에서 항원-특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 적절하게 표지된 항체 제조물을 사용하여 염색된 환자 종양 샘플의 절편을 검사하기 위해 광학 현미경을 사용하여 폴리펩타이드 항원의 존재를 확인하는 면역조직화학적 분석에 의해 검출될 수 있다. 추가 대안으로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 적절하게 표지된 항체 제조물을 사용하여 염색된 환자 종양 샘플의 절편을 검사하기 위해 광학 현미경을 사용함으로써 폴리펩타이드 항원의 존재를 확인하는 면역조직화학적 분석에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 이들이 상기 폴리펩타이드에 대해 생성된 T 세포를 자극할 수 있는지를 결정함으로써 검출될 수 있다.
인간의 암, 특히 흑색종 피부 흑색종의 치료 방법은(i) 본 발명에 따른 핵산 또는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계 및(ii) 대상체에게 본 발명의 핵산, 폴리펩타이드, 벡터, 세포, T 세포 또는 T 세포 집단 또는 조성물을 투여하는 단계(및 바람직하게는 검출된 동일한 핵산 또는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 투여하는 단계)를 포함한다.
인간의 암, 특히 흑색종, 예를 들어 피부 흑색종의 치료 방법은 또한 본 발명에 따른 핵산, 폴리펩타이드, 벡터, 세포, T 세포 또는 T 세포 집단 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 대상체에서(바람직하게는 동일한) 본 발명에 따른 핵산 또는 폴리펩타이드가 검출되었다.
특히, 진단되고 적절한 경우 치료되는 암은 흑색종, 예를 들어, 피부 흑색종이다.
서열번호 1 또는 이의 단편의 본 발명의 폴리펩타이드가 검출되면 그 후 암은 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종일 수 있다.
특정 실시양태
일 실시양태에서, CLT 항원 폴리펩타이드는 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어진다. 예시적인 단편은 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열번호 3 또는 4를 포함하거나 이로 이루어진다. 상기에 기재된 바와 같이, 상응하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), T 세포, T 세포 집단, 세포독성 세포, 항원-결합 폴리펩타이드, 항원 제시 세포 및 엑소좀이 제공된다. 상기 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), T 세포, T 세포 집단, 세포독성 세포, 항원-결합 폴리펩타이드, 항원 제시 세포 및 엑소좀은 암 특히 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종의 치료에 사용될 수 있다. 관련 진단 방법이 또한 제공된다.
실시예
실시예 1 - CLT 확인
이는 LTR 요소로 전체 또는 부분적으로 이루어진 암 특이적 전사체를 확인하기 위한 것이었다.
제1 단계로, 본 발명자들은 포괄적인 범암 전사체를 새로 조립하였다. 이를 달성하기 위해 다양한 암 유형(32개 암 유형(원발성 흑색종 31개 및 전이성 흑색종 1개)으로부터의 성별 균형 샘플 24개), 표 S1)을 나타내는 암 게놈 지도(TCGA) 컨소시엄에서 획득된 768명의 환자 샘플로부터의 RNA 시퀀싱 판독을 게놈 유도 조립에 사용하였다. 성별 균형 샘플(성별 특이적 조직 제외)은 적응용이고, cutadapt(v1.13)(문헌[Marcel M., 2011, EMBnet J., 17:3])를 사용하여 품질(Q20) 트리밍되고 길이 필터링되고(쌍의 두 판독 모두 35개 이상의 뉴클레오타이드), khmer(v2.0)(문헌[Crusoe et al., 2015, F1OOORes., 4:900])를 사용하여 kmer 정규화(k=20)하였고, 최대 및 최소 깊이는 각각 200 및 3이었다. 내장된 인 실리코 깊이 정규화가 비활성화된 게놈 유도 조립의 경우 판독을 TCGA 범위에서 사용된 것과 동일한 설정으로 STAR(2.5.2b)를 사용하여 GRCh38에 맵핑하고 Trinity(v2.2.0)(문헌[Trinity, Grabherr, M.G., et al., 2011, Nat. Biotechnol., 29:644-52])로 전달하였다. 대부분의 조립 공정을 32코어 HPC 노드의 256GB RAM 내에서 완료하였으며, 실패한 공정은 1.5TB RAM 노드를 사용하여 재실행하였다.
생성된 콘티그(contig)를 폴리(A) 트리밍(SeqClean v110222 내의 트림폴리(trimpoly)) 및 엔트로피 필터링(0.7 이상)하여 저품질 및 인공 콘티그(BBMap v36.2 내의 bbduk)를 제거하였다. 암 유형별로 원래의 24개 샘플을 연어(v0.8.2 또는 v0.9.2)(문헌[Patro, R., et al., 2017, Nat. Methods, 14:417-419])를 사용하여 세척된 조립에 준 맵핑하였으며, 백만분의 전사체(transcripts per million)(TPM)가 0.1 미만인 것으로 나타난 콘티그를 제거하였다. 나머지를 GMAP(v161107)(문헌[Wu et al., 2005, Bioinf., 21 : 1859-1875])을 사용하여 GRCh38에 맵핑하였으며, 길이의 85% 이상에 걸쳐 85% 이상의 동일성을 갖도록 정렬되지 않은 콘티그는 조립으로부터 제거하였다. 마지막으로, 모든 암 유형에 대한 조립을 균일화하고 gffread(Cufflinks v2.2.1)(문헌[Trapnell et al., 2010, Nat. Biotech., 28:511-515])를 사용하여 가장 긴 인접 전사체로 병합하였다. 이 조립 공정은 반복 요소를 평가할 수 있도록 특별히 설계되었기 때문에 모노엑손 전사체는 유지되었지만 플래그가 형성되었다. 전사체 조립 완성도 및 품질을 GENCODE v24basic 및 MiTranscriptome1(문헌[Iyer et al. 2015, Nat. Genet., 47: 199-208])에 의해 비교하여 평가하였다. 본 발명자들은 GENCODE 내에 표시되는 고유한 스플라이스 부위 목록을 컴파일하고 스플라이스 부위가 2-뉴클레오타이드 유예 창 내의 전사체 조립 내에 존재하는지 시험하였다. 이 공정을 통해 1,001,931개의 전사체가 확인되었으며, 이 중 771,006개는 스플라이싱되었고 230,925개는 모노엑손이었다.
별도로, LTR 요소를 포함하는 전사체를 확인하기 위해 조립된 콘티그를 게놈 반복 서열 주석으로 오버레잉(overlaying)하였다. LTR 및 비 LTR 요소를 이전에 기재된 대로 주석을 붙였다(문헌[Attig et al., 2017, Front. In Microbiol., 8:2489]). 간단히 말해서, 확인된 인간 반복 패밀리(Dfam 2.0 라이브러리 v150923)를 나타내는 숨겨진 Markov 모델(HMM)을 사용하여 RepeatMasker Open-3.0(문헌[Smit, A., R. Hubley and P. Green, http://www.repeatmasker.org, 1996-2010])을 사용하여 GRCh38의 주석을 붙였으며, 이는 nhmmer(문헌[Wheeler et al., 2013, Bioinform., 29:2487-2489])로 구성되었다. HMM 기반 스캐닝은 BLAST 기반 방법과 비교하여 주석의 정확도를 증가시킨다(문헌[Hubley et al., 2016, Nuc. Acid. Res., 44:81-89]). RepeatMasker는 LTR과 내부 영역에 개별적으로 주석을 붙였기 때문에 동일한 요소에 대한 인접한 주석을 병합하기 위해 표 형식 출력을 분석하였다. 이 공정은 하나 이상의 완전한 또는 부분적인 LTR 요소를 포함하는 181,967개의 전사체를 산출하였다.
연어를 사용하여 모든 전사체에 대해 백만분의 전사체(TPM)를 추정하고, 각 암 유형 내의 발현을 811개의 건강한 조직 샘플과 비교하였다(가능한 경우, TCGA 및 개별적으로 GTEx로부터 모든 암 유형에 대한 건강한 조직 일치 대조군)(문헌[The Genotype-Tissue Expression Consortium, 2015, Science, 348:648-60]). 전사체는 임의의 샘플에서 1 TPM 초과에서 검출된 경우 암에서 발현된 것으로 간주하고 다음 기준이 충족되는 경우 암 특이적으로 간주하였다: i, 각 암 유형의 24개 샘플 중 6개 이상에서 발현 ii, 모든 건강한 조직 샘플의 90% 이상에서 10 미만 TPM으로 발현 iii, 임의의 대조군 조직 유형에서 중앙값 발현 3x 이상의 대상 암 유형에서 발현; 및 iv, 가능한 경우, 각 건강한 조직의 90 퍼센트 3x 이상의 대상 암 유형에서 발현.
그런 다음 암 특이적 전사체 목록을 전체 또는 부분 LTR 요소를 포함하는 전사체 목록과 교차하여 모든 기준을 충족하는 5,923개의 전사체 목록을 생성하였다(암 특이적 LTR 요소 범위 전사체에 대한 CLT로 지칭됨).
잠재적으로 잘못 조립된 콘티그 및 세포 유전자의 조립에 상응하는 것을 배제하기 위해 흑색종에서 특이적으로 발현된 403개의 CLT에 대해 추가 큐레이션을 수행하였다. 스플라이싱 패턴이 원래 RNA 시퀀싱 판독에 의해 뒷받침되었는지 확인하기 위해 추가 수동 평가를 수행하였다. CLT를 추가로 분류하여 임의의 GTEx 정상 조직에서 중앙값 발현이 1 TPM을 초과하는 CLT를 제외하였다.
피부 흑색종에 대한 403개의 CLT 내에서, 97개의 CLT가 이 필터를 통과하였다.
실시예 2 - 면역펩티도믹 분석
질량 분석(MS) 기반 면역펩티도믹 분석은 HLA 분자(HLAp)와 연관되고 세포 표면에 제시되는 특이적 펩타이드의 직접 검출을 가능하게 하는 강력한 기술이다. 이 기술은 항-HLA 항체 포획에 의한 세포 또는 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 HLAp의 친화도 정제로 구성된다. 그런 다음 단리된 HLA 분자와 결합된 펩타이드를 서로 분리하고 용리된 펩타이드를 질량 분석법에 결합된 나노 초고성능 액체 크로마토그래피(nUPLC-MS)로 분석한다(문헌[Freudenmann et al., 2018, Immunology 154(3):331-345]). 질량 분석기에서 규정된 전하 대 질량 비율(m/z)의 특이적 펩타이드를 선택하고, 단리하고, 단편화한 다음 두 번째 질량 분석(MS/MS) 라운드에 적용하여 생성된 단편 이온의 m/z를 확인한다. 그런 다음 단편화 스펙트럼(MS/MS)을 조사하여 검출된 단편 이온을 발생시킨 선택된 펩타이드의 아미노산 서열을 정확하게 확인할 수 있다.
MS/MS 스펙트럼 해석 및 후속 펩타이드 서열 확인은 참조 데이터베이스에 포함된 펩타이드 서열로부터 생성된 이론적 스펙트럼과 실험 데이터 간의 일치에 좌우된다. 확인된 전사체 또는 전체 게놈에서 유래된 모든 오픈 리딩 프레임(ORF)에 상응하는 소정의 목록을 사용하여 MS 데이터 검색이 가능하지만(문헌[Nesvizhskii et al., 2014, Nat. Methods 11: 1114-1125]), 이러한 매우 큰 서열 데이터베이스를 조사하면 제시된 펩타이드의 확인을 제한하는 매우 높은 거짓 발견률(FDR)이 발생한다. 추가 기술 문제(예를 들어, 류신의 질량 = 이소류신의 질량) 및 이론적 문제(예를 들어, 펩타이드 스플라이싱(문헌[Liepe, et al., 2016, Science 354(6310): 354-358]))는 확인된 전사체 또는 전체 게놈에서 생성된 것과 같은 매우 큰 데이터베이스의 사용과 관련된 제한을 증가시킨다. 따라서, 실제로, 가능한 폴리펩타이드 서열의 잘 규정된 세트를 참조하지 않고 신규한 항원을 확인하기 위해 정확한 면역펩티도믹 분석을 수행하는 것은 예외적으로 어렵다(문헌[Li, et al., 2016, BMC Genomics 17(Suppl 13): 1031]).
따라서 본 발명자들은 실시예 1의 97개의 피부 흑색종 CLT로부터의 10개 이상의 잔기의 모든 예측된 폴리펩타이드 서열(ORF)의 데이터베이스를 작제하였다. 이는 10 내지 207개 아미노산 길이 범위의 2,269개의 ORF를 산출하였다.
문헌[Bassani-Sternberg et al.(Bassani-Sternberg et al., 2016, Nature Commun., 7: 13404]; 데이터베이스 링크: https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD004894)는 전체 인간 프로테옴에 대해 보고된 폴리펩타이드 서열에 대해 25명의 피부 흑색종 환자로부터 유래된 HLA 결합 펩타이드 샘플로부터 수집된 MS/MS 데이터를 조사하였다. 이러한 분석을 통해 확인된 인간 단백질과 일치하는 수만 개의 펩타이드가 발견되었다. 예측대로 이러한 펩타이드에는 PRAME, MAGEA3 및 TRPM1(멜라스타틴)을 포함한 다수의 종양 연관 항원(TAA) 내에 존재하는 펩타이드가 포함되었다.
면역펩티도믹 평가에 대한 상세한 지식을 적용함으로써, 본 발명자들은 PEAKS™ 소프트웨어(v8.5 및 vX, Bioinformatics Solutions Inc)를 사용하여 인간 프로테옴(UniProt)에 존재하는 모든 폴리펩타이드 서열과 함께 PXD004894 HLA 클래스 I 데이터세트로부터 스펙트럼을 조사하였다. 세포에 존재하는 클래스 I HLA 결합 펩타이드의 대부분은 항시적으로 발현되는 단백질에서 유래하기 때문에 UniProt 프로테옴을 사용하여 이러한 데이터베이스를 동시에 조사하면 MS/MS 스펙트럼에 대한 본 발명자들의 CLT ORF 서열의 할당이 정확한지 확인하는데 도움이 된다. 다른 MS/MS 조사 소프트웨어와 마찬가지로 PEAKS 소프트웨어는 할당을 정량화하기 위해 스펙트럼의 각 할당에 확률 값(-1OlgP, 표 1 참조)을 할당한다.
이들 연구의 결과는 Bassani-Sternberg 등에 의해 조사된 25명의 환자로부터의 종양 샘플로부터 면역침전된 HLA 클래스 I 분자와 연관된 50개 초과의 개별 펩타이드를 확인하였으며, 이는 CLT 유래 ORF의 아미노산 서열에 상응
하고, 확인된 인간 프로테옴(UniProt) 내에 존재하는 폴리펩타이드 서열에 상응하지 않는다.
PEAKS 소프트웨어에 의해 할당된 펩타이드 스펙트럼의 추가 수동 검토를 사용하여 CLT 유래 ORF에 맵핑되어 CLT 항원으로 규정된 펩타이드에 대한 스펙트럼 할당을 확인하였다. 45-코돈 ORF에 맵핑된 Bassani-Sternberg의 MS/MS 데이터세트에서 반복적으로 관찰된 하나의 펩타이드를 CLT 항원 1로 규정하였다(표 1, 서열번호 1).
HLA 클래스 I 분자와 연관된 이들 펩타이드의 반복된 검출은 CLT 항원 1(서열번호 1)이 흑색종 조직에서 번역되고, HLA 클래스 I 경로를 통해 처리되고, 최종적으로 HLA 클래스 I 분자와의 복합체로 면역계에 제시됨을 나타낸다. 표 1은 이 CLT 항원에 맵핑된 3명의 환자에서 검출된 펩타이드의 특성을 보여준다. 도 1은 표 1에 표시된 펩타이드를 포함하는 환자 샘플 중 하나의 대표적인 MS/MS 스펙트럼을 보여준다. 도 1의 상단 패널은 표준 MS/MS 주석(b: N-말단 단편 이온, y: C-말단 단편 이온, -H2O: 수분 손실, -NH3: 암모니아 손실, [2+]: 2가 하전된 펩타이드 이온, pre: 단편화되지 않은 전구체 펩타이드 이온, an-n: 내부 단편 이온)을 나타낸다. 위 패널의 도 1은 PEAKS 소프트웨어에 의해 할당되고 PRIDE 데이터베이스(문헌[Bassani-Sternberg et al., 2016, Nature Commun., 7: 13404]; 데이터베이스 링크: https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD004894)로부터 획득된 가장 다존재하는 단편 이온 피크의 추출을 보여준다. 도 1의 하단 패널은 단편 이온에 맵핑된 선형 펩타이드 서열의 위치를 나타내는 스펙트럼의 렌더링(rendering)을 보여준다.
표 1의 펩타이드에 할당된 고-10lgP 점수와 일치하게, 이 스펙트럼은 본 발명자들이 이러한 분석에서 발견한 펩타이드의 서열(서열번호 2)과 정확하게 일치하는 다수의 단편을 포함한다.
표 1에서 HLA 클래스 I 분자와 관련하여 검출된 펩타이드는 NetMHCpan 4.0 예측 소프트웨어(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetHCpan/)를 사용하여 평가하여 환자의 HLA 클래스 I 유형 A 및 B 유형에 대한 예측된 결합 강도를 결정하였다. 이러한 예측 연구의 결과는 해당 펩타이드가 두 유형의 환자에 존재하는 HLA 클래스 I B07:02 대립유전자에 대한 강한 결합을 나타냄을 보여준다(표 2 참조). CLT 항원 유래 펩타이드가 각 유형의 환자에 존재하는 HLA 대립유전자 중 하나에 결합할 것으로 예측되었다는 사실은 이의 검출과 일치한다.
본 발명자들이 발견한 펩타이드 서열에 대한 종양 조직 유래 MS 스펙트럼의 할당에 대한 추가 확실성을 제공하기 위해, 발견된 이러한 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고 원 연구(문헌[Bassani-Sternberg et al., 2016, Nature Commun., 7: 13404])에서 종양 샘플에 적용된 동일한 조건을 사용하여 nUPLC-MS2에 적용하였다. 이 합성 펩타이드와 선택된 내인성 펩타이드에 대한 스펙트럼의 비교는 도 2에 나와 있다. 이 도면에서 상단 스펙트럼은 종양 샘플에 상응하고(PRIDE 데이터베이스(문헌[Bassani-Sternberg et al., 2016, Nature Commun., 7: 13404]; 데이터베이스 링크: https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/proiects/PXD004894) 하단 스펙트럼은 합성적으로 생성된 동일한 서열의 펩타이드에 상응한다. 검출된 이온 단편의 선택된 m/z 값은 이러한 MS/MS 스펙트럼에서 각 단편 피크 위/아래에 표시된다. 이 도면은 단편의 정확한 정렬(종양 및 합성 펩타이드 유래 단편 이온 사이의 실험적으로 결정된 m/z 값의 작은 차이는 허용 가능한 단편 허용 오차 0.05 미만 달톤 이내임)을 보여주며, 이는 종양 조직 유래 스펙트럼에서 CLT 인코딩 펩타이드 스펙트럼까지의 할당의 정확성을 확인시킨다.
종합하면, 표 1 및 표 2 및 도 1 및 도 2에 나타낸 데이터는 흑색종 환자에서 상응하는 CLT 항원의 번역, 처리 및 제시에 대해 예외적으로 강력한 뒷받침을 제공한다.
CLT의 암 특이성을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 37개의 정상 조직 샘플(10개의 정상 피부, 9개의 정상 폐 및 18개의 정상 유방 조직)을 처리하고 면역펩티도믹 분석을 위해 준비하였다. 본 발명자들은 CLT 항원 1의 폴리펩타이드 서열로부터 유래된 모든 가능한 펩타이드 서열을 검색하여 이들 정상 조직 샘플로부터 HLA-클래스 I 데이터세트의 스펙트럼을 조사하였다. CLT 항원 1로부터 유래된 펩타이드는 정상 조직 샘플 세트에서 검출되지 않았으며(표 3), 이는 CLT가 암 특이적 발현을 나타낸다는 추가 확인을 제공한다.
요약하면 예측된 이러한 ORF로부터 유래된 면역펩티도믹 펩타이드의 반복된 확인은 이 CLT(서열번호 3)가 종양 조직에서 폴리펩타이드(서열번호 1; CLT 항원 1로 지칭됨)로 번역됨을 시사한다. 따라서 이 항원은 세포의 면역 감시 장치에 의해 처리되고 성분 펩타이드(예를 들어, 서열번호 2)가 HLA 클래스 I 분자에 로딩되어 생성된 펩타이드/HLA 클래스 I 복합체를 인식하는 T 세포에 의해 세포가 세포용해의 표적이 될 수 있다. 따라서 CLT 항원 1 및 이의 단편이 종양이 이들 항원을 발현하는 환자의 흑색종의 치료를 위한 다양한 치료 방식에 유용할 것으로 예측된다.
SKCM 종양 샘플의 면역펩티도믹 분석에 의해 확인된 펩타이드 목록, CLT 항원 명칭 및 서열번호에 대한 상호 참조.
펩타이드 서열1 펩타이드 서열번호 CLT Ant. NO. CLT Ant. 서열번호 환자 #2 펩타이드 질량3 펩타이드 길이 -10lgP4 스펙트럼 #5 Ppm6
LPRTPRPDLIL 서열번호 2 1 서열번호 1 Mel8 1289.7819 11 22.53 2 2.3
LPRTPRPDLIL 서열번호 2 1 서열번호 1 Mel16 1289.7819 11 28.23 5 7
LPRTPRPDLIL 서열번호 2 1 서열번호 1 Mel29 1289.7819 11 28.79 1 -1.4
1　질량 분석에 의해 확인된 1개의 HLA 클래스 I 펩타이드.
2　문헌[Bassani-Sternberg et al, 2016, Nature Comm., 7: 13404]
3　계산된 펩타이드 질량.
4 PEAKS™ 프로그램-10lgP 값은 하나 초과의 스펙트럼 검출이 획득된 펩타이드/환자에 대한 가장 높은 일치에 대한 펩타이드에 대해 표시된다.
5 펩타이드가 검출된 스펙트럼의 수.
6　관찰된 질량과 계산된 질량 사이의 편차; 하나 초과의 스펙트럼이 획득된 펩타이드에 대해 선택된 ppm 값이 표시된다.
환자 HLA 유형에 대한 질량 분석법으로 확인된 펩타이드의 예측된 NetMHCpan4.0 결합.
펩타이드 환자 1 A1 대립유전자 1 순위 점수 2 A2 대립유전자 순위 점수 2 B1 대립유전자 순위 점수 2 B2 대립유전자 순위 점수 2
LPRTPRPDLIL Mel8 A01:01 25.34 A03:01 45.75 B07:02 0.18 B08:01 4.50
LPRTPRPDLIL Mel16 A01:01 25.34 A24:01 23.32 B07:02 0.18 B08:01 4.50
LPRTPRPDLIL Mel29 NA - NA - NA - NA -
1 문헌[Bassani-Sternberg et al, 2016, Nature Comm., 7: 13404]; NA = 정보 없음
2 NetMHCpan 4.0의 예측 순위 점수(%); 0.5% 이하의 점수는 강한 결합을 예측한다.
정상 조직 샘플 세트에서 CLT 항원 1 내지 8로부터 유래된 펩타이드의 수.
항원 피부 폐 유방
CLT 항원 1 0/10 0/9 0/18
실시예 1 및 2에 제공된 결과는 전체적으로 또는 부분적으로 암 게놈 지도(TCGA) 연구 네트워크에 의해 생성된 데이터를 기반으로 한다(http://cancergenome.nih.gov/); 유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트(미국 국립보건원 국장실 및 NCI, NHGRI, NHLBI, NIDA, NIMH, 및 NINDS의 공동 기금에 의해 지원됨).
실시예 3 - 흑색종 환자에서 CLT 항원에 대한 T 세포 특이성을 입증하기 위한 분석
(a) CLT 항원 펩타이드 5량체에 의한 반응성 T 세포 염색
흑색종 환자에서 CLT 항원에 특이적인 순환 CD8 T 세포의 존재 및 활성은 HLA 클래스 I/펩타이드-5량체("5량체") 염색 및/또는 시험관내 사멸 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 따라서, 실시예 1 및 2(표 1 내지 표 3, 도 1 및 도 2)에서 설명된 방법을 사용하여 발견된 CLT 항원에 대한 이러한 방법론의 적용은 암 환자에서 CLT 항원에 대한 치료적으로 관련된 T 세포 반응의 존재를 입증하는데 사용될 수 있다.
이러한 연구를 위해, 환자 혈액으로부터 단리된 CD8 T 세포를 다양한 배양 방법, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 현미경 비드 플러스 인터루킨-2를 사용하여 확장시킨다. 그런 다음 확장된 세포를 HLA 분자의 펩타이드 결합 홈에 있는 관련 CLT 항원 펩타이드에 결합된 HLA 클래스 I 분자의 5량체로 구성된 CLT 펩타이드 5량체를 사용하여 T 세포 수용체의 특이적 CLT 항원 반응성에 대해 염색할 수 있다. 결합을 5량체 구조의 코일형 코일 다량체화 도메인에 특이적인 피코에리트린(phycoerythrin) 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin) 결합 항체 단편으로 검출하여 측정한다. 5량체 염색 외에도 기억 마커 CD45RO 및 리소좀 방출 마커 CD107a와 같은 추가 표면 마커를 조사할 수 있다.
특이적 표면 마커와 5량체 양성의 연관은 5량체-반응성 T 세포 집단의 수 및 상태(기억 대 나이브/줄기) 둘 모두를 추론하는데 사용될 수 있다.
5량체 염색된 세포를 또한 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용하여 분류 및 정제할 수 있다. 그런 다음 분류된 세포를 시험관내 사멸 분석에서 표적 세포를 사멸시키는 능력에 대해 추가로 시험할 수 있다. 이러한 분석은 CD8 T 세포 집단과 형광 표지된 표적 세포 집단을 포함한다. 이 경우, CD8 집단은 CLT 항원 특이적이거나 CD8 T 세포 5량체로 분류되고 Mart-1과 같은 강력한 사멸 반응을 유도하는 것으로 공지된 양성 대조군 항원에 특이적이다. 이 연구의 표적 세포에는 HLA-A*02를 발현하는 펩타이드 펄싱 T2 세포, HLA-A*02,03 또는 B*07로 형질감염된 펩타이드 펄싱 C1R 세포 또는 이전에 CLT/CLT 항원을 발현하는 것으로 나타난 흑색종 세포주 또는 환자 종양 세포가 포함될 수 있다. T2 또는 C1R 세포를 펄싱하는데 사용되는 펩타이드는 CLT 항원 펩타이드 또는 양성 대조군 펩타이드를 포함한다. 표적 세포를 건강한 세포의 핵으로 흡수되는 적색 핵 염료 nuclight rapid red와 같은 필수 염료로 이중으로 표지할 수 있다. 특이적 T 세포에 의한 표적 세포 공격의 추가 증거는 카스파제 3/7 매개 아폽토시스를 나타내는 녹색 카스파제 3/7 활성 지표에 의해 입증될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 세포가 사멸됨에 따라 CD8 T 세포에 의해 매개되는 아폽토시스에 의해 아폽토시스 고유의 카스파제 3/7 활성으로 인해 적색 형광을 손실하고 녹색 형광을 획득한다. 따라서, 5량체-분류된 CLT 항원-특이적 CD8 T 세포에 대한 이러한 사멸 분석의 적용을 흑색종 환자 T 세포의 생체외 배양에서 CLT-항원-특이적 T 세포의 세포독성 활성을 열거하는데 사용할 수 있다.
(b) 흑색종 환자에서 T 세포 특이성의 HERVfest 분석
특이적 T 세포(fest) 기술은 체크포인트 차단 요법에 반응한 환자의 종양 세포에 존재하는 "돌연변이 관련 신생항원"(MANA) 목록에 존재하는 특이적 종양 유래 에피토프를 확인하는데 사용되었다(문헌[Anagnostou et al., Cancer Discovery 2017 ; Lee et al., Science 2017]). 실시예 1 및 2(표 1 및 표 2, 도 1 및 도 2)에서 설명된 방법을 사용하여 발견된 CLT 항원에 이 기술을 적용하면 암 환자에서 CLT 항원에 대한 치료적으로 관련된 T 세포 반응의 존재를 확인할 수 있다.
면역 노출이 진행된 대상체에서 에피토프 특이적 T 세포를 확인하기 위한 다른 분석(예를 들어, ELISPOT)과 마찬가지로, "fest" 기술은 항원 제시 세포 및 적합한 항원성 펩타이드를 포함하는 생체외 배양에서 동족 T 세포를 확장함으로써 특이성을 유도한다. 이 기술은 증폭된 배양에 존재하는 T 세포 수용체(TCR) mRNA의 차세대 시퀀싱(구체적으로는 TCRVβ CDR3 영역을 표적화하는 TCRseq)을 활용하여 표적 펩타이드(표준 HLA 결합 알고리즘을 사용하여 환자의 HLA 유형과 일치하도록 사전 선택됨)와 배양된 세포에서 확장된 특이적 TCR을 검출한다는 점에서 다른 면역학적 분석과 다르다. 성공적인 체크포인트 차단 요법 후 채취한 동일한 환자의 종양 조직에 TCRseq를 적용하면 생체외 펩타이드 자극 배양에서 검출된 TCR/T 세포가 암의 면역 억제 부위에도 존재하는지 결정하는데 사용할 수 있다. MANAfest의 경우, 이 방법을 사용하여 각 환자의 종양에서 진행되고, 또한 환자 종양의 T 세포에서 검출되는 MHC 제시 신생항원 펩타이드를 인식하는 특이적 TCR을 확인하고, 각 환자로부터의 정상 및 종양 조직의 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 발견된 수천 개의 가능한 돌연변이 펩타이드 중에서 기능적으로 관련된 신생항원 펩타이드를 확인할 수 있다(문헌[Le et al., Science 2017]).
CLT 항원에 대한 MANAfest(문헌[Anagnostou et al., 2017 Cancer Discovery]) 기술의 적용을 다음과 같이 수행한다. 단계 1: 선택된 HLA 수퍼유형에 효율적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 것으로 예측되는 펩타이드를 CLT 항원에서 확인한다. 단계 2: 적절한 환자로부터의 PBMC를 선택하고 HLA 유형에 따라 단계 1에서 선택한 펩타이드 라이브러리와 일치시킨다. 단계 4: 이러한 환로부터H의 PBMC를 T 세포 및 비-T 세포 분획으로 분리한다. 비-T 세포에 방사선 조사하고(증식을 방지하기 위함) 환자의 T 세포에 다시 추가한 다음 20 내지 50개의 샘플로 나누고 T 세포 성장 인자 및 개별 CLT 특이적 합성 펩타이드(1단계에서 선택)에서 10 내지 14일 동안 배양한다. 단계 4: TCRseq(에피토프 특이적 TCRVβ CDR3 서열의 시퀀싱)를 시험 펩타이드의 존재 하에 증폭된 동족 T 세포/TCR을 확인하기 위해 모든 웰에서 수행하고; 이러한 TCR의 특이성을 TCRseq를 사용하여 비증폭/증식된 T 세포에서 검출된 TCR과 비교하여 결정한다. 이 단계로부터 획득된 데이터에 의해 어떤 펩타이드가 환자에서 면역 반응을 유도했는지 확인할 수 있다. 단계 5: 체크포인트 차단 요법에 반응한 환자의 종양에 해당하는 특이적으로 증폭된 TCR을 결정하기 위해 종양 샘플에서 TCRseq를 수행하여, 이 TCR을 보유하는 T 세포가 체크포인트 차단 요법의 효과에 관여할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 4 - CLT 항원에 특이적인 고친화도 T 세포가 정상 대상체의 T 세포 목록으로부터 결실되지 않았음을 입증하기 위한 분석.
CLT 항원-특이적 CD8 T 세포가 건강한 개체의 정상 T 세포 목록에 존재하고, 따라서 이러한 환자의 나이브 및 흉선 조직에서 암-특이적 CLT 항원의 발현으로 인한 중추성 내성에 의해 결실되지 않았음을 나타내기 위해 ELISPOT 분석을 사용할 수 있다. 이러한 유형의 ELISPOT 분석은 다수의 단계를 포함한다. 단계 1: CD8 T 세포와 CD14 단핵구를 정상 혈액 공여체의 말초 혈액으로부터 단리할 수 있고, 검사되는 특이적 CLT 항원과 일치하도록 이 세포의 HLA 유형을 지정한다. CD8 T 세포를 기억 마커 CD45RO에 대한 자기 표지된 항체를 사용하여 나이브 및 기억 하위 유형으로 추가로 세분화할 수 있다. 단계 2: CD14 단핵구를 3시간 동안 풀링된 CLT 항원 펩타이드 또는 각각의 CLT 항원 펩타이드로 펄싱한 후 14일 동안 CD8 T 세포와 공동-배양한다. 단계 3: 확장된 CD8 T 세포를 이러한 배양으로부터 단리하고 펩타이드로 펄싱된 새로운 단핵구로 밤새 재자극한다. 이러한 펩타이드에는 개별 CLT 항원 펩타이드, 관련 없는 대조군 펩타이드 또는 감염성(예를 들어, CMV, EBV, Flu, HCV) 또는 자가(예를 들어, MART-1) 항원에 대한 강력한 반응을 유도하는 것으로 공지된 펩타이드가 포함될 수 있다. 재자극은 항인터페론 감마(IFNγ) 항체 코팅 플레이트에서 수행한다. 항체는 펩타이드 자극 T 세포에 의해 분비되는 임의의 IFNγ를 포획한다. 밤새 활성화시킨 후, 세포를 플레이트로부터 세척하고 플레이트 상에 포획된 IFNγ를 추가의 항-IFNγ 항체 및 표준 비색 염료로 검출한다. IFNγ를 생성하는 세포가 원래 플레이트에 있던 부분에 어두운 반점이 남는다. 이러한 분석에서 유래된 데이터에는 반점 수, 중간 반점 크기 및 중간 반점 강도가 포함된다. 이는 IFNγ를 생성하는 T 세포의 빈도와 세포당 IFNγ의 양을 측정한 것이다. 추가로, 반점 수 또는 중앙 반점 크기로 측정된 특이적 반응을 특이적 펩타이드가 없는 단핵구에 대한 배경 반응으로 나눈 것인 자극 지수(SI)로부터 CLT 항원에 대한 반응의 크기의 척도를 유도할 수 있다. 반점 수에 대한 자극 지수에 반점 강도에 대한 자극 지수를 곱하여 자극 강도의 측정치를 유도한다. 이러한 방식으로, CLT 항원 및 대조군 항원에 대한 반응의 비교를 사용하여 나이브 대상체가 CLT 항원 기반 면역원성 제형에 의한 백신화에 의해 확장될 수 있는 강력한 CLT 항원 반응성 T 세포 목록을 포함한다는 것을 입증할 수 있다. 표 4는 HLA 일치 정상 혈액 공여체로부터 유의한 CD8 T 세포 반응을 유도한 CLT 항원 유래 펩타이드의 목록을 제공한다. 대표적인 결과는 도 3에 나와 있다. 가로 막대는 데이터의 평균을 나타낸다. M+t는 펩타이드 부재 하의 음성 대조군(단핵구 및 T 세포)을 나타낸다. CEF는 양성 대조군(23개의 CMV, EBV 및 인플루엔자 펩타이드의 혼합물)을 나타낸다. 통계적 유의도를 Dunns 보정으로 반복 측정에 대한 보정에 의해 Kruskall Wallis 테스트 일원 Anova로 측정하였다. 도 3은 CLT 항원 1로부터의 HLA-A*03:01-제한된 펩타이드(서열번호 6; 도 3의 RPDLILLQL CLT001)에 대한 정상 혈액 공여체로부터의 유의한 CD8 T 세포 반응의 예를 제공한다.
HLA 일치 정상 혈액 공여체로부터 유의한 CD8 T 세포 반응을 유도한 CLT 항원 유래 펩타이드
참조CLT 항원 서열번호 펩타이드 서열 펩타이드의 HLA 유형(NetMHC에 의해 예측)
5 서열번호 5 TPRPDLILL HLA-A*03:01
5 서열번호 6 RPDLILLQL HLA-B*07:02
실시예 5 - 흑색종 세포에서 CLT 발현을 검증하기 위한 분석
a) 흑색종 세포주에서 CLT 발현의 qRT-PCR 검증
정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)은 소정의 생물학적 샘플로부터 추출된 RNA에 존재하는 특정 전사체의 양을 결정하기 위한 광범위한 기술이다. 특이적 핵산 프라이머 서열을 대상 전사체에 대해 설계하고, 프라이머 사이의 영역을 일련의 써모사이클(thermocyle) 반응을 통해 후속하여 증폭시키고 삽입 염료(SYBR Green)를 사용하여 형광 정량화한다. 프라이머 쌍을 CLT에 대해 설계하고 흑색종 세포주로부터 추출된 RNA에 대해 분석하였다. 비 흑색종 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다. 구체적으로, 흑색종 세포주 COLO 829(ATCC 참조번호 CRL-1974), MeWo(ATCC 참조번호 HTB-65), SH-4(ATCC 참조번호 CRL-7724) 및 대조군 세포주 HepG2(간세포 암종, ATCC 참조번호 HB-8065), Jurkat(T세포 백혈병, ATCC 참조번호 TIB152) 및 MCF7(선암종, ATCC 참조번호 HTB-22)을 시험관내에서 확장시키고 RNA를 1x106개의 급속-동결 세포로부터 추출하고 cDNA로 역전사시켰다. 표준 기술에 따른 SYBR Green 검출을 사용한 qRT-PCR 분석을 각 CLT의 두 영역에 대해 설계된 프라이머와 참조 유전자를 사용하여 수행하였다. 상대 정량화(RQ)를 다음과 같이 계산하였다:
RQ = 2[Ct(참조)-Ct(표적)].
이들 실험의 결과는 도 4에 제시되어 있으며, 이는 3개의 흑색종 세포주 및 3개의 비흑색종 세포주로부터 추출된 RNA의 CLT 항원 1(서열번호 3)을 인코딩하는 CLT를 표적화하는 프라이머 세트(88+89)를 사용한 qRT-PCR 분석 결과를 보여준다. 이러한 결과는 비흑색종 세포와 비교하여 흑색종 세포주로부터 추출한 RNA에서 CLT의 특이적 발현을 확인하였다. CLT는 시험된 흑색종 세포주의 2/3에서 검출되었다.
b) 흑색종 세포에서 CLT 발현의 인시튜 (in situ) RNAScope 검증
전사체 발현 분석의 인시튜 혼성화(ISH) 방법은 소정의 전사체의 존재 및 발현 수준이 표본의 조직병리학과 관련하여 시각화되도록 한다. 통상적인 RNA ISH 분석은 항체 또는 효소 기반 비색 반응의 조합에 의해 생성된 신호를 통해 시각화되는 적절한 RNA 서열의 짧은 가닥에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 인시튜 고유 RNA 분자의 인식을 포함한다. RNAScope는 생성된 신호의 특이성을 보장하고 표적 전사체의 감응성 단일 분자 시각화를 가능하게 하는 더욱 진보된 프로브 화학을 사용하여 최근에 개발된 인시튜 혼성화 기반 기술이다(문헌[Wang et al 2012 J Mol Diagn. 14(1): 22-29]). 전사체 분자에 대한 양성 염색은 소정의 세포에서 작은 적색 점으로 나타나며 다수의 개의 전사체가 존재함을 나타내는 여러 개의 점이 있다.
RNAScope 프로브를 CLT에 대해 설계하고 12개의 포르말린 고정 파라핀 포매 피부 흑색종 종양 중심부의 절편에서 분석하였다. 발현 신호의 점수 책정을 다음과 같이 각 중심부의 대표적인 이미지에 대해 수행하였다:
· CLT 프로브에 대해 양성 염색된 추정 세포 %, 가장 근사한 10으로 반올림
· 소정의 절편에 걸친 세포당 발현의 추정 수준은 다음과 같다:
· 0 = 염색 없음
· 1 = 세포당 1 내지 2개의 점
· 2 = 세포당 2 내지 6개의 점
· 3 = 세포당 6 내지 10개의 점
· 4 = 세포당 10개 초과의 점
종양 유래 RNAseq 데이터로부터의 발견을 독립적으로 검증하고 특정 샘플에 걸쳐 종양 조직 내 발현의 상대적 균질성을 확인하고 또한 다수의 환자에 걸쳐 존재를 강조함으로써 다수의 상이한 환자 종양 중심부에 걸쳐 각각의 CLT의 발현을 검출하였다(표 5).
흑색종 환자 조직 중심부에서 RNAScope의 점수 책정
CLT 항원 1
(서열번호 3)
조직 중심부 (+)ve 세포 % 점수
흑색종 61 30 2
흑색종 62 20 1
흑색종 63 10 1
흑색종 64 70 2
흑색종 65 10 1
흑색종 66 80 3
흑색종 67 100 4
흑색종 68 30 2
흑색종 69 10 1
흑색종 70 10 1
흑색종 71 50 3
흑색종 72 90 3
명세서 및 하기의 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 '~를 포함하다' 및 '~들을 포함하다' 및 '~를 포함하는'과 같은 변용례는 명시된 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹를 포함하지만 임의의 다른 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
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본 발명은 바람직한 그룹 및 더욱 바람직한 그룹 및 적합한 그룹 및 더욱 적합한 그룹 및 상기 열거된 그룹의 실시양태의 모든 조합을 포함한다.
서열목록
서열번호 1(CLT 항원 1의 폴리펩타이드 서열)
MLPRTPRPDLILLQLLPAGLRQLLQTSGPDNEQPIEQDLICNVC
서열번호 2(CLT 항원 1로부터 유래된 펩타이드 서열)
LPRTPRPDLIL
서열번호 3(CLT 항원 1을 인코딩하는 CLT의 cDNA 서열)
CTTTCATCTTTAATTTGACCAAAATGGAAACCAGGATCATGAGAATTCCTCGGGGCTGGTGTTGAAAGGAATTTCCCCTGCTCTTGCCAGAGTCTCGAGGGGTGGCCTCCTTCCACGGGTGAGTAACCACAAGTCCATGTGACCGAACAAACAGCATATTCTTTTGTTCAAAAGAGAAAAACAACATTGAAGGAAATCAGCTGAAGAAAATTGAGATGAAAGCCAGTCCACGCCTCAGCATCCTGAGGAAATGTTCTTCCTTGATGCTCTGAGCTCTCTAAGAAGTTACCACAAAACCAAACCCATCAGAAGTTTGCAGGACGTCCTTGTTTAGAGCTGGGAAATAAACCACGAAACAGCGCAAAGGAGAGTCCAGGCCTGCCAATGCTTCCGCGAACTCCTCGCCCCGACCTCATCCTTCTCCAGCTCCTACCTGCAGGCCTCAGACAACTTTTGCAGACCTCTGGTCCGGACAATGAACAACCCATAGAACAAGATCTGATTTGTAATGTTTGCTGATCTCCAAAGTGTAAATACTCCCACCATGACCAATTGGAAGCCACTGACAAGTCCTCACTAAATGCAGAATTGAGAAGAAACACGAATAGCACATCATTGTATGGTATTTCCACTCTACCAATGGATGTGAATAACCTCAAGAACACATAATGTTGAGATGTGGAAAAATCATCAGGAAGCCTCTCCCCTTCACCCTGCAGTGTCTCTGCAATGCTGGTAGAGTGGGCTGGCACAGCCCCCGCCTCTGGCCTGGTCCGGGTCCAACCTGCCTGCCTCCTGGGGCAGCAGCTCCCTGAACGAAGAGCCGCGGAGACCGAAGAACTCAGTGAATCAGCAGTTCTCCCAGATGAAACGCTGGCCTGAAAGCAGCCTCAAGAGCTTTGGCCCGTCACCTTGCCTTGCCTTCTCTTCCTTCCTCGTCCTCTGTTTGTTCATCTTTCCTGAAAAAATTAAGTCAGCTGTTCCCCTTAACCAATTTCCCTGGCATTCTGAAGGGTAGGCCACATGGCCCACCTGCCAGCTACTCCCACCTGCCAAGCCTTCCTGACTATATTTACCCTGGTACTCCCATGTCCCGGGGCTGCTTCAGCAGAGCCAAGGACACACCCAGGTGTTTGTTTTCTAGGTCAGATTTCCTCAGCCATGGGTGTATCTGTGCTTGTCCCTCAAAATCCTCATAGCTCCTTTCCCCACCCCAACTTCCAGGCCAGACGGGGTTCAGGGGTGTCTCAGCTAAGGTTCCCCTGAAGCAGACACAAATTAGTACAAAAGGGACTTATTAGGAGGTGATCCTTAAAAATTTGGGCAGGAGAATGGAAAGGGTGGACACAGACAAAAAGGATGCCAAGTGAGAATGTGATGATTACTGCTGCAGTTTTCTACAGCTGCCTGTCAAACTATCCCAACACAGTGGCATTGACCAGCAGCCATTTTCGCTATGCCCACAGCTTCTGTGGGTCAGGCGTTTGGACAGGGCAATGGGAACAGCTTGTTTCTGTTCCATAGTGTGTGAGGGAGGCCTCAACTGGAAAACTCAAAGACCGGGGTGGCTTGATGACTGGAGGCTGGAACCATCCGGAAGCTTCTTGAAGCTGGGTTGACTTACATGTGGTCTTGCATGTGAGTTGGGCTTTTCACATCATGGCTGTTGGGTTCCAAGAGGCAGTGTCTGGGGAACAAGAGTTCCAAGACACCAAGGCAGAAGCTGCTAGACCTTTTTTGACCTCGCTTCGGATGTCAGCAATGAAGTTCTGTGGATTCAACTGCATTCTATTGGTTACCAGCAGTCGCTTGAATCTGATTAGCTCCAAAACTGAGTGAGCCTCTGGCAAGAGTGCATTGCAGAAGGGCACATCCAATGAGAGGCGCTGCTGTAGTAACAGGGACCTCTCCAATGGCCTGTTTGAGTGCTCTCAGAATATGGCACCTGGGTTCCTCCAGAGCAAGTGATCTGAGAGAGAGCAAGGAGAAGGCCACTCTGCCTTTCATGACTCATCTCAGAAGTCACACACTATCACAGGTTCTGTTCTGTTCATTGGAAGTGAGTCATGAAGTCCGGCCCACACTCAAGAGAAAGGAAATTATGCTCCTTCTTTTGAAATGAGTGTAAGAAAGTAAAACTTTGTCAAATGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTG
서열번호 4(CLT 항원 1을 인코딩하는 cDNA 서열)
ATGCTTCCGCGAACTCCTCGCCCCGACCTCATCCTTCTCCAGCTCCTACCTGCAGGCCTCAGACAACTTTTGCAGACCTCTGGTCCGGACAATGAACAACCCATAGAACAAGATCTGATTTGTAATGTTTGCTGA
서열번호 5(CLT 항원 1로부터 유래된 펩타이드 서열)
TPRPDLILL
서열번호 6(CLT 항원 1로부터 유래된 펩타이드 서열)
RPDLILLQL
SEQUENCE LISTING <110> The Francis Crick Institute Limited Enara Bio Limited <120> NOVEL CANCER ANTIGENS AND METHODS <130> ENA-P2206PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Pro Arg Thr Pro Arg Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ala Gly Leu Arg Gln Leu Leu Gln Thr Ser Gly Pro Asp Asn Glu 20 25 30 Gln Pro Ile Glu Gln Asp Leu Ile Cys Asn Val Cys 35 40 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Pro Arg Thr Pro Arg Pro Asp Leu Ile Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 2172 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctttcatctt taatttgacc aaaatggaaa ccaggatcat gagaattcct cggggctggt 60 gttgaaagga atttcccctg ctcttgccag agtctcgagg ggtggcctcc ttccacgggt 120 gagtaaccac aagtccatgt gaccgaacaa acagcatatt cttttgttca aaagagaaaa 180 acaacattga aggaaatcag ctgaagaaaa ttgagatgaa agccagtcca cgcctcagca 240 tcctgaggaa atgttcttcc ttgatgctct gagctctcta agaagttacc acaaaaccaa 300 acccatcaga agtttgcagg acgtccttgt ttagagctgg gaaataaacc acgaaacagc 360 gcaaaggaga gtccaggcct gccaatgctt ccgcgaactc ctcgccccga cctcatcctt 420 ctccagctcc tacctgcagg cctcagacaa cttttgcaga cctctggtcc ggacaatgaa 480 caacccatag aacaagatct gatttgtaat gtttgctgat ctccaaagtg taaatactcc 540 caccatgacc aattggaagc cactgacaag tcctcactaa atgcagaatt gagaagaaac 600 acgaatagca catcattgta tggtatttcc actctaccaa tggatgtgaa taacctcaag 660 aacacataat gttgagatgt ggaaaaatca tcaggaagcc tctccccttc accctgcagt 720 gtctctgcaa tgctggtaga gtgggctggc acagcccccg cctctggcct ggtccgggtc 780 caacctgcct gcctcctggg gcagcagctc cctgaacgaa gagccgcgga gaccgaagaa 840 ctcagtgaat cagcagttct cccagatgaa acgctggcct gaaagcagcc tcaagagctt 900 tggcccgtca ccttgccttg ccttctcttc cttcctcgtc ctctgtttgt tcatctttcc 960 tgaaaaaatt aagtcagctg ttccccttaa ccaatttccc tggcattctg aagggtaggc 1020 cacatggccc acctgccagc tactcccacc tgccaagcct tcctgactat atttaccctg 1080 gtactcccat gtcccggggc tgcttcagca gagccaagga cacacccagg tgtttgtttt 1140 ctaggtcaga tttcctcagc catgggtgta tctgtgcttg tccctcaaaa tcctcatagc 1200 tcctttcccc accccaactt ccaggccaga cggggttcag gggtgtctca gctaaggttc 1260 ccctgaagca gacacaaatt agtacaaaag ggacttatta ggaggtgatc cttaaaaatt 1320 tgggcaggag aatggaaagg gtggacacag acaaaaagga tgccaagtga gaatgtgatg 1380 attactgctg cagttttcta cagctgcctg tcaaactatc ccaacacagt ggcattgacc 1440 agcagccatt ttcgctatgc ccacagcttc tgtgggtcag gcgtttggac agggcaatgg 1500 gaacagcttg tttctgttcc atagtgtgtg agggaggcct caactggaaa actcaaagac 1560 cggggtggct tgatgactgg aggctggaac catccggaag cttcttgaag ctgggttgac 1620 ttacatgtgg tcttgcatgt gagttgggct tttcacatca tggctgttgg gttccaagag 1680 gcagtgtctg gggaacaaga gttccaagac accaaggcag aagctgctag accttttttg 1740 acctcgcttc ggatgtcagc aatgaagttc tgtggattca actgcattct attggttacc 1800 agcagtcgct tgaatctgat tagctccaaa actgagtgag cctctggcaa gagtgcattg 1860 cagaagggca catccaatga gaggcgctgc tgtagtaaca gggacctctc caatggcctg 1920 tttgagtgct ctcagaatat ggcacctggg ttcctccaga gcaagtgatc tgagagagag 1980 caaggagaag gccactctgc ctttcatgac tcatctcaga agtcacacac tatcacaggt 2040 tctgttctgt tcattggaag tgagtcatga agtccggccc acactcaaga gaaaggaaat 2100 tatgctcctt cttttgaaat gagtgtaaga aagtaaaact ttgtcaaatg tgtatgtgtg 2160 tgtgtgtgtg tg 2172 <210> 4 <211> 135 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcttccgc gaactcctcg ccccgacctc atccttctcc agctcctacc tgcaggcctc 60 agacaacttt tgcagacctc tggtccggac aatgaacaac ccatagaaca agatctgatt 120 tgtaatgttt gctga 135 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Pro Arg Pro Asp Leu Ile Leu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Leu 1 5

Claims (65)

  1. (a) 서열번호 1의 서열; 및
    (b)(a)의 서열의 변이체(variant); 및
    (c)(a)의 서열의 면역원성 단편(immunogenic fragment)
    으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드(isolated polypeptide).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 단리된 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,(i) 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 다른 폴리펩타이드(ii) 흑색종(melanoma) 관련 항원인 다른 폴리펩타이드(iii) 면역 반응을 향상시킬 수 있는 폴리펩타이드 서열(즉, 면역자극제(immunostimulant) 서열) 및(iv) 예를 들어 강력한 CD4+ 지원을 제공하여 항원 에피토프(epitope)에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증가시킬 수 있는 범용 CD4 헬퍼 에피토프(universal CD4 helper epitope)를 포함하는 폴리펩타이드 서열로부터 선택되는 제2의 또는 추가의 폴리펩타이드에 융합된, 단리된 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩(encoding)하는 단리된 핵산.
  5. 제4항에 있어서, DNA인, 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 인간 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈(codon)인, 핵산.
  8. 제4항에 있어서, RNA인, 핵산.
  9. 제4항, 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 서열인, 핵산.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터(vector).
  11. 제10항에 있어서, 인간 숙주 세포에서 번역 활성(translationally active) RNA 분자의 전사를 가능하게 하기에 적합한 조절 요소를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 바이러스 벡터인, 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV), 알파바이러스(alphavirus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 아레나 바이러스(arena virus), 홍역 바이러스, 폭스바이러스(poxvirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 렌티바이러스(lentivirus) 및 랍도바이러스(rhabdovirus) 벡터인, 벡터.
  14. 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 면역원성 약제학적 조성물.
  15. 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터를 포함하는 백신 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 하나 이상의 면역자극제를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 면역자극제는 알루미늄 염, 사포닌, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 수중유 에멀젼(oil-in-water emulsion), 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 지질다당류 및 이의 유도체 및 다른 TLR4 리간드, TLR7 리간드, TLR8 리간드, TLR9 리간드, IL-12 및 인터페론으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 투여에 적합한 멸균 조성물인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약제(medicine)에 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  20. 인간에서 면역 반응을 상승(raising)시키는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 서열번호 1 및 이의 변이체 및 면역원성 단편으로부터 선택되는 서열을 발현하는 암성 종양(cancerous tumor)에 대해 면역 반응이 상승되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 면역 반응을 상승시키는데 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암성 종양에 대해 면역 반응이 상승되는, 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  24. 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간 환자를 치료하거나, 암이 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 방법은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 암에 걸린 인간으로부터 유래된 T 세포의 생체외 자극 및/또는 증폭(amplification)에 사용하기 위한 것으로, 상기 인간에서 상기 암의 치료를 위해 상기 인간에 상기 자극 및/또는 증폭된 T 세포의 후속 재도입을 위한, 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  27. 인간에서 암을 치료하는 방법으로서, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하고, 선택적으로 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)와 함께 적어도 T 세포를 포함하는 백혈구 세포의 집단(population)을 상기 인간으로부터 채취하는 단계, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물의 존재 하에 상기 T 세포를 자극 및/또는 증폭시키는 단계, 및 상기 백혈구 세포, 적어도 자극 및/또는 증폭된 T 세포 T 세포의 일부 또는 전부를 인간에 재도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제21항 및 23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종(cutaneous melanoma)인, 방법 또는 사용하기 위한 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  29. 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성인 T 세포 집단을 제조하는 공정으로서,(a) 암 환자로부터 선택적으로 항원 제시 세포와 함께 T 세포를 획득하는 단계 및(ii) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물로 생체외에서 T 세포 집단을 자극 및 증폭하는 단계를 포함하는 공정.
  30. 제29항의 공정에 의해 획득 가능한 T 세포 집단.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물로 자극된 T 세포.
  32. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물을 생체외에서 로딩(ex vivo loading)함으로써 변형되거나 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 항원 제시 세포.
  33. 제32항에 있어서, 수지상 세포(dendritic cell)인, 항원 제시 세포.
  34. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물이 로딩되거나 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 세포로부터 제조된 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀(exosome).
  35. 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포 또는 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 약제에 사용하기 위한, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포 또는 엑소좀.
  37. 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀 또는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀 또는 조성물.
  39. 제29항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종인, 공정, 방법 또는 사용하기 위한 T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀 또는 조성물.
  40. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드에 대해 면역특이적인, 단리된 항원-결합 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 단일클론 항체(monoclonal antibody) 또는 이의 단편인, 항원-결합 폴리펩타이드.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 세포독성 모이어티에 커플링(coupling)된, 항원-결합 폴리펩타이드.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 약제에 사용하기 위한, 항원-결합 폴리펩타이드.
  44. 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  45. 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간을 치료하거나, 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 제40항 내지 제42항 및 제44항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물을 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제40항 내지 제42항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 암은 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종인, 방법, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물.
  48. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드이거나 이의 일부인 HLA 결합(HLA-bound) 폴리펩타이드에 대해 면역 특이적인 단리된 항원-결합 폴리펩타이드.
  49. 제48항에 있어서, T 세포 수용체 또는 이의 단편인, 항원-결합 폴리펩타이드.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 대상체(subject)에서 세포독성 세포 또는 다른 면역 성분과 결합할 수 있는 또 다른 폴리펩타이드에 커플링된, 항원-결합 폴리펩타이드.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 폴리펩타이드를 세포의 표면에 발현하도록 조작된 세포독성 세포.
  52. 제51항에 있어서, T 세포인, 세포독성 세포.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 약제에 사용하기 위한, 세포독성 세포.
  54. 제51항 또는 제52항에 따른 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  55. 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현하는 암에 걸린 인간 환자를 치료하거나, 암이 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 및 변이체로부터 선택되는 서열을 발현할 암에 걸릴 경우로부터 인간을 예방하는 방법으로서, 본 방법은 제51항 또는 제52항에 따른 세포를 상기 인간에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  56. 제51항 또는 제52항에 있어서, 인간에서 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 상응하는 서열을 발현하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 세포독성 세포.
  57. 인간을 암에 걸린 것으로 진단하는 방법으로서,
    상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열, 또는 상기 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산을 발현하는지를 결정하는 단계, 및 상기 폴리펩타이드 또는 상응하는 핵산이 상기 암 세포에서 과발현되는 경우 상기 인간을 암에 걸린 것으로 진단하는 단계
    를 포함하는 방법.
  58. 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종(uveal melanoma)인 암에 걸린 인간을 진단하는 방법으로서, 상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열; 또는 상기 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산을 발현하는지를 결정하는 단계, 및 상기 폴리펩타이드 또는 상응하는 핵산이 상기 암 세포에서 과발현되는 경우, 상기 인간을 피부 흑색종 또는 포도막 흑색종인 암에 걸린 것으로서 진단하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 암에 걸린 인간을 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 암의 세포가 서열번호 1 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 서열번호 3 및 4의 서열로부터 선택됨)을 발현하는지를 결정하는 단계; 및 이러한 경우
    (b) 제1항 내지 제18항, 제30항 내지 제35항, 제40항 내지 제42항, 제44항, 제50항, 제51항 및 제53항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 조성물, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 세포독성 세포를 상기 인간에 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. 인간이 제1항 내지 제18항, 제30항 내지 제35항, 제40항 내지 제42항, 제44항, 제51항, 제52항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 상응하는 폴리펩타이드, 핵산, 벡터, 조성물, T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀, 항원-결합 폴리펩타이드 또는 세포독성 세포를 포함하는 백신에 의한 치료에 적합한지를 결정하기 위한 바이오마커(biomarker)로서,
    (a) 서열번호 1의 서열; 또는
    (b)(a)의 서열의 변이체; 및
    (c) 암에 걸린 인간의 종양으로부터 단리된(a)의 서열의 면역원성 단편
    으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 용도 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 용도.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 암은 흑색종 예를 들어, 피부 흑색종인, 방법 또는 용도.
  62. 제21항 및 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는
    (a) 서열번호 1의 서열; 및
    (b)(a)의 서열의 변이체; 및
    (c)(a)의 서열의 면역원성 단편
    으로부터 선택되는 서열을 포함하고;
    예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    암은 포도막 흑색종인, 방법 또는 사용하기 위한 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 또는 조성물.
  63. 제45항 또는 제46항에 있어서, 폴리펩타이드는
    (a) 서열번호 1의 서열; 및
    (b)(a)의 서열의 변이체; 및
    (c)(a)의 서열의 면역원성 단편
    으로부터 선택되는 서열을 포함하고;
    예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    암은 포도막 흑색종인, 방법 또는 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩타이드 또는 조성물.
  64. 제29항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는
    (a) 서열번호 1의 서열; 및
    (b)(a)의 서열의 변이체; 및
    (c)(a)의 서열의 면역원성 단편
    으로부터 선택되는 서열을 포함하고;
    예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    암은 포도막 흑색종인, 공정, 방법 또는 사용하기 위한 T 세포 집단, T 세포, 항원 제시 세포, 엑소좀 또는 조성물.
  65. 제59항 또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩타이드는
    (a) 서열번호 1의 서열; 및
    (b)(a)의 서열의 변이체; 및
    (c)(a)의 서열의 면역원성 단편
    으로부터 선택되는 서열을 포함하고;
    예를 들어 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 예를 들어 핵산은 서열번호 3 및 4 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    암은 포도막 흑색종인, 방법 또는 용도.





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