CN116710126A - 冠状病毒疫苗和使用方法 - Google Patents

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CN116710126A CN202180034574.9A CN202180034574A CN116710126A CN 116710126 A CN116710126 A CN 116710126A CN 202180034574 A CN202180034574 A CN 202180034574A CN 116710126 A CN116710126 A CN 116710126A
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L·斯里尼瓦桑
A·波兰
D·哈里扬托
C·库克辛
D·A·罗滕伯格
J·斯鲁吉
U·沙欣
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Abstract

本发明提供了用于预防和/或治疗病毒感染、特别是冠状病毒科的病毒感染的组合物和方法。

Description

冠状病毒疫苗和使用方法
交叉引用
本申请要求于2020年3月20日提交的美国临时申请62/992,666、2020年5月18日提交的美国临时申请63/026,559、2020年7月31日提交的美国临时申请63/059,582、2020年10月1日提交的美国临时申请63/086,519和2020年12月8日提交的美国临时申请63/122,904的优先权，这些临时申请中的每一者全文以引用方式并入本文。
背景技术
新出现的由新型冠状病毒引起的急性呼吸道病毒感染是重要的公共健康问题。重要的是，在爆发时没有疫苗或特异性抗病毒剂，特别是例如2015年的MERS-CoV或2019 SARSCoV-2感染。2019年12月爆发的2019 SARS CoV-2感染自首次报告病例不到2个月的时间里夺去了2000多人的生命。因此，需要新型且易于扩展的治疗剂来对抗由此类病毒感染引起的疾病。
发明内容
冠状病毒是单正链RNA病毒，其偶尔从人畜共患来源出现以感染人类群体。大多数人类感染引起轻微的呼吸道症状，尽管最近十年中一些冠状病毒感染已导致严重的发病率和死亡率。这些包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和目前正在流行的SARS-CoV-2。感染这些病毒可导致急性呼吸窘迫，从而导致高死亡率。2002年起源的SARS-CoV及其在全球的传播导致8096例病例和774例死亡。2012年在沙特阿拉伯出现了首例MERS-CoV病例，此后共报告了2494例病例和858例相关死亡病例。2019 SARS CoV-2到2020年3月8日，已导致118,096例病例，包括全球4262例死亡。2019SARS-CoV2的迅速传播导致世界卫生组织宣布引起国际关注的全球性流行病。
所有三种冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV和最近出现的SARS CoV-2属于β冠状病毒科。SARS CoV-2具有30千碱基的基因组大小，其编码至少四(4)个结构蛋白(刺突[S]、包膜[E]、膜[M]和核衣壳[N])和至少十五(15)个非结构蛋白(NSP 1-15)。结构蛋白是刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。S蛋白促进病毒进入靶细胞，并且进入依赖于刺突蛋白与SARS-CoV和SARS-CoV-2两者的细胞受体ACE2的结合。这两种病毒在基因组中具有76％的氨基酸同一性，这有助于利用以前对针对SAR-CoV的保护性免疫应答的研究来帮助SARS-CoV-2的疫苗开发。
鉴于这些感染的高发病率和死亡率，已有各种研究对这些感染的免疫应答的报告。先天性免疫应答以及适应性免疫应答都已显示是重要的。在感染SARS-CoV的小鼠中的研究证明，SARS的严重程度与发展病毒特异性免疫应答的能力相关。在另一项研究中，证明了在SARS-CoV感染的小鼠中，I型干扰素和炎性单核细胞巨噬细胞应答的失调导致致死性肺炎。在SARS-CoV的病例中已证明了体液以及细胞免疫应答两者的保护作用。针对S蛋白和N蛋白生成的抗体应答已显示在小鼠中保护免受SARS-CoV感染，并且已在SARS-CoV感染的患者中检测到。然而，这些检测到的针对S蛋白的抗体应答是短寿命的并且在恢复后6年检测不到，表明CD4和CD8应答可能涉及该病毒的控制。
已在SARS-CoV感染的患者中检测到CD4+和CD8+ T细胞应答两者。在恢复的患者中，病毒特异性记忆CD8 T细胞在感染后持续长达11年，并且被证明在老年小鼠中提供针对致死性SARS-CoV感染的保护。此外，在小鼠中的研究已显示病毒特异性效应物CD4+和CD8+ T细胞的过继转移导致快速的病毒清除和临床疾病的改善。这些研究指出T细胞应答在控制疾病严重程度以及提供对SAR-CoV感染的保护性免疫中的重要作用。鉴于SARS-CoV和SARS-CoV-2之间高度的基因组同源性，推断类似的免疫机制可能在提供针对SARS-CoV-2的保护中起关键作用。
本发明的领域涉及免疫治疗肽、编码这些肽的核酸、肽结合剂及其例如在病毒性疾病的免疫治疗中的用途。在一个方面，本发明提供了在病毒感染的细胞中表达的病毒表位，其可单独使用或与其他抗病毒剂或免疫调节剂组合使用以治疗病毒感染。本发明可用于冠状病毒感染的免疫疗法。
本文提供一种组合物，其包含：(i)多肽，其包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列；(ii)编码多肽的多核苷酸，其中该多肽包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列；(iii)T细胞受体(TCR)或包含该TCR的T细胞，其中该TCR结合该多肽的与对应HLA I类或II类分子复合的表位序列；(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或(v)抗体或包含该抗体的B细胞，其中该抗体结合该多肽的表位序列；和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，该多肽包含(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。在一些实施方案中，包含来自ORF1ab的表位序列的序列在包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列的C末端。在一些实施方案中，包含来自ORF1ab的表位序列的序列在包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。在一些实施方案中，包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列在包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。
在一些实施方案中，该多肽包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列
在一些实施方案中，该多肽包含(a)来自ORF1ab的2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个表位序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。
在一些实施方案中，来自ORF1ab的表位序列是来自非结构蛋白的表位序列。在一些实施方案中，该非结构蛋白选自由NSP1、NSP2、NSP3、NSP4以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该多肽包含含有来自NSP1的表位序列的序列、含有来自NSP2的表位序列的序列、含有来自NSP3的表位序列的序列和含有来自NSP4的表位序列的序列。
在一些实施方案中，来自ORF1ab的表位序列选自由YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK以及它们的任何组合组成的组。
在一些实施方案中，来自核衣壳糖蛋白(N)的表位序列是LLLDRLNQL。在一些实施方案中，来自膜磷蛋白(M)的表位序列是VATSRTLSY。在一些实施方案中，该多肽包含来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列和来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
在一些实施方案中，该多肽包含(a)来自ORF1ab的以下表位序列中的每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK；(b)来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列；和(c)来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
在一些实施方案中，包含来自ORF1ab的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：MVTNNTFTLKVPHVGEIPVAYRKVLLKTIQPRVEKYLFDESGEFKLSEVGPEHSLAEYYIFFASFYY；MVTNNTFTLKVPHVGEIPVAYRKVLLKTIQPRVEKYLFDESGEFKLSEVGPEHSLAEY；APKEIIFLEGETLFGDDTVIEVAIILASFSAST；APKEIIFLEGETLFGDDTVIEV；HTTDP SFLGRYMSALFADDLNQLTGYHTDFSSEIIGYQLMCQPILLAEAELAKNVSLILGTVSWNL；TTDPSFLGRYMSALFADDLNQLTGYHTDF S SEIIGYQLMCQPILLAEAELAKNVSLILGTVSWNL；LLSAGIFGAITDVFYKENSYKVPTDNYITTY；以及它们的组合。
在一些实施方案中，包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：ADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLE SELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHS SS SDNIALLVQ；FAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLF；LGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVA；KLLEQWNLVIGF；NRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVY；SELVIGAVILRGHLRIAGHHLGR；VATSRTLSYYKLGASQRV；GLMWLSYF；以及它们的组合。
在一些实施方案中，包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：KDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA；RMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQ；YKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP；SPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDK；以及它们的组合。
在一些实施方案中，该多肽包含一个或多个接头序列。在一些实施方案中，该一个或多个接头序列选自由GGSGGGGSGG、GGSLGGGGSG组成的组。在一些实施方案中，该一个或多个接头序列包含切割序列。在一些实施方案中，该一个或多个切割序列选自由FRAC、KRCF、KKRY、ARMA、RRSG、MRAC、KMCG、ARCA、KKQG、YRSY、SFMN、FKAA、KRNG、YNSF、KKNG、RRRG、KRYS和ARYA组成的组。
在一些实施方案中，该多肽包含跨膜结构域序列。在一些实施方案中，跨膜序列在包含来自ORF1ab的表位序列的序列的C末端，该序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且该序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。在一些实施方案中，该跨膜序列是EQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。
在一些实施方案中，该多肽包含SEC序列。在一些实施方案中，该SEC序列在包含来自ORF1ab的表位序列的序列的N末端，该序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且该序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。在一些实施方案中，该SEC序列是MFVFLVLLPLVSSQCVNLT。
在一些实施方案中，该组合物包含编码该多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，该多核苷酸包含用于在人中表达的密码子优化的序列。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含dEarI-hAg序列。在一些实施方案中，该dEarI-hAg序列是ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTC AGAGAGAACCC，任选地其中每个T是U。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含Kozak序列。在一些实施方案中，该Kozak序列是GCCACC。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含F元件序列。在一些实施方案中，该F元件序列是氨基末端分裂增强子(AES)的3UTR。在一些实施方案中，该F元件序列是CTGGTACTGCATGCACGCAATGCT AGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACC TCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCA CCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC，任选地其中每个T是U。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含I元件序列。在一些实施方案中，该I元件序列是线粒体编码的12S rRNA(mtRNR1)的3′UTR。在一些实施方案中，该I元件序列是CAAGCACGCAGCAATGCAGC TCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGT GATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACT AACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC，任选地其中每个T是U。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含多聚腺苷酸序列。在一些实施方案中，该多聚腺苷酸序列是AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAA，任选地其中每个T是U。
在一些实施方案中，来自ORF1ab、膜糖蛋白和核衣壳磷蛋白的表位序列中的每一者来自2019 SARS-CoV-2。
在一些实施方案中，一个或多个或每个表位引发T细胞应答。
在一些实施方案中，一个或多个或每个表位已通过质谱法观察到由HLA分子呈递。
在一些实施方案中，该组合物包含(i)与选自由RS C1p1full、RS C2p1full、RSC3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RS C5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽；(ii)编码与选自由RS C1p1full、RSC2p1full、RS C3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RSC5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽的多核苷酸；或(iii)与选自由SEQ ID NOs：RS C1n1、RS C2n1、RS C3n1、RS C4n1、RSC5n1、RS C6n1、RS C7n1、RS C8n1、RSC5n2、RS C6n2、RS C7n2、RS C8n2、RS C5n2full、RS C6n2full、RS C7n2full和RS C8n2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多核苷酸。
本文还提供了包含本文所述的组合物中的任一种的药物组合物。
本文还提供了药物组合物，其包含：(i)包含表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B和/或表16的表位序列的多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；(iii)T细胞受体(TCR)或包含该TCR的T细胞，其中该TCR结合与对应HLA I类或II类分子复合的该表位序列；(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或(v)抗体或包含该抗体的B细胞，其中该抗体结合该表位序列；和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，该表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、LLLDRLNQL、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、VATSRTLSY和KTIQPRVEK。在一些实施方案中，该表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV、FGADPIHSL、NYNYLYRLF、KYIKWPWYI、KWPWYIWLGF、LPFNDGVYF、QPTESIVRF、IPFAMQMAY、YLQPRTFLL和RLQSLQTYV。
在一些实施方案中，该表位序列来自orf1ab蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自orf1a蛋白。在一些实施方案中，表位序列来自表面糖蛋白(S)或其移位阅读框。在一些实施方案中，该表位序列来自核衣壳磷蛋白(N)。在一些实施方案中，该表位序列来自oRF3a蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自膜糖蛋白(M)。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF7a蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF8蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自包膜蛋白(E)。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF6蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF7b蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF10蛋白。在一些实施方案中，该表位序列来自ORF9b蛋白。
本文还提供了药物组合物，其包含：具有与表11第2列、表12第2列或表15第3列中描绘的序列中的任一者的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或编码多肽的重组多核苷酸，该多肽具有与表11第2列、表12第2列或表15第3列中描绘的序列中的任一者的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该药物组合物包含与选自由RS C1p1full、RS C2p1full、RSC3plfull、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RSC5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽；或编码与选自由RS C1p1full、RSC2p1full、RS C3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RS C5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含与选自由SEQ ID NO：RS C1n1、RS C2n1、RS C3n1、RS C4n1、RS C5n1、RS C6n1、RS C7n1、RS C8n1、RS C5n2、RS C6n2、RS C7n2、RS C8n2、RS C5n2full、RSC6n2full、RS C7n2full和RS C8n2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，该多核苷酸是mRNA。
在一些实施方案中，该药物组合物还包含一种或多种脂质组分。在一些实施方案中，该一种或多种脂质包含脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，该LNP包封重组多核苷酸构建体。
在一些实施方案中，该多肽是合成的。在一些实施方案中，该多肽是重组的。
在一些实施方案中，该多肽的长度为8-1000个氨基酸。
在一些实施方案中，该表位序列以1000nM或更小的KD结合或预测结合HLA I类或II类分子。在一些实施方案中，该表位序列以500nM或更小的KD结合或预测结合HLA I类或II类分子。
在一些实施方案中，该表位序列包含由受试者的病毒感染细胞表达的病毒蛋白的序列。
本文还提供了治疗或预防病毒感染或治疗与病毒感染相关的呼吸道疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，该病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，该病毒是2019 SARS-CoV 2。在一些实施方案中，由该受试者表达的HLA分子在施用时是未知的。在一些实施方案中，该病毒避免被该受试者的免疫系统识别的逃逸能力与该病毒避免被施用含有来自单一蛋白质的表位或来自比本文所述药物组合物中更少的蛋白质的表位的药物组合物的受试者的免疫系统识别的逃逸能力相比更小。在一些实施方案中，该受试者表达由表1A、表1B、表1C、表2Ai或表2Aii、表2B或表16中的任一者的HLA等位基因编码的HLA分子，并且该表位序列是HLA等位基因匹配的表位序列。
在一些实施方案中，该表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV和FGADPIHSL。
本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的2019SARS-CoV 2感染的方法，其包括向该受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，该药物组合物是作为用于受试者中的2019SARS-CoV 2病毒感染的一种或多种治疗剂的补充施用的。在一些实施方案中，该药物组合物与以下项组合施用：(a)具有2019 SARS-CoV2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽；(b)编码2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的重组多核苷酸；或包含(a)或(b)的2019SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物。在一些实施方案中，2019SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用2019 SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物后1-1 0周施用。在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物后1-6周、1-6个月或1-2年或更晚施用。在一些实施方案中，该药物组合物与2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物的施用在同一天或同时施用。在一些实施方案中，该药物组合物与具有2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽或编码2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的重组多核苷酸共同配制。在一些实施方案中，该药物组合物在施用2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物之前施用，诸如在施用2019 SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物之前2-10周施用。在一些实施方案中，该药物组合物预防性地施用。在一些实施方案中，该药物组合物每1、2、3、4、5、6或更多周施用一次；或每1-7、7-14、14-21、21-28或28-35天施用一次；或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天施用一次。
本文还提供了本文所述的组合物用于制备用于治疗或预防由2019 SARS CoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染的治疗剂的用途。
本文还提供了用作药物的本文所述的组合物或本文所述的药物组合物。
本文还提供了在治疗或预防由2019 SARS CoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染中使用的本文所述的组合物或本文所述的药物组合物。
本文提供了一种包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽。本文还提供了编码包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽的多核苷酸。该抗原性肽和/或多核苷酸可以是重组的。该抗原性肽和/或多核苷酸可以是分离的或纯化的。该抗原性肽可以是合成的或由多核苷酸表达。
本文还提供了抗体或包含抗体的B细胞，该抗体结合包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽。
本文还提供了T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表1A或表1B的与根据表1A或表1B的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。
本文还提供了T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表2Ai或表2Aii的与根据表2Ai或表2Aii的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列。同样地，TCR可结合来自表2Aii左列的与来自表2Aii右列的对应MHCII类分子复合的表位序列。
本文提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽。本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用编码包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽的多核苷酸。
本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用抗体或包含抗体的B细胞，该抗体结合包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B的表位序列的抗原性肽。
本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表1A或表1B的与根据表1A或表1B的对应MHC I类分子复合的表位序列。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第7列(组3)的该对应MHC I类分子。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHCI类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC I类分子。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC II类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC II类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Aii左列的与来自表2Aii同一行中右列的对应MHC II类分子复合的表位序列。
在一个实施方案中，该抗原性肽是病毒抗原。在另一个实施方案中，该抗原性肽是非突变的过表达抗原。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于关于病毒遗传信息的公开披露信息。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于对病毒基因组的分析，以预测T细胞激活的合适表位。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中对病毒基因组序列的分析。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中对病毒序列的分析，该计算机处理器已由机器学习软件训练，其预测由MHC I类或MHC II类抗原结合和呈递表位的可能性。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子是neonmhc2。
在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测算法或MHC-肽呈递预测因子是NetMHCpan或NetMHCIIpan，此外，在MHC-肽呈递预测因子NetMHCpan或NetMHCIIpan中进一步分析用于比较。在一些实施方案中，技术人员可使用隐马尔可夫模型方法用于MHC-肽呈递预测。在一些实施方案中，可利用肽预测模型MARIA。在一些实施方案中，使用的MHC-肽呈递预测算法或MHC-肽呈递预测因子不是NetMHCpan或NetMHCIIpan。在一些实施方案中，在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中分析病毒序列，其中该MHC-肽呈递预测因子是neonmhc1或neonmhc2，其分别指I类和II类结合预测。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子模型是RECON，其基于表达、加工和结合能力提供高质量的MHC-肽呈递预测。
在一个方面，本文提供了一种治疗受试者中由冠状病毒引起的病毒性疾病的方法，其包括：向该受试者施用包含一种或多种病毒肽抗原的组合物，其中该病毒肽抗原预测结合受试者的MHC I类或MHC II类肽，并且预测由抗原呈递细胞呈递给该受试者的T细胞，使得在该受试者中引发抗病毒应答。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中对病毒基因组序列的分析。在一些实施方案中，该病毒抗原来源于在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中对病毒序列的分析，该计算机处理器已由机器学习软件训练，其预测由MHC I类或MHC II类抗原结合和呈递表位的可能性。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子是neonmhc2。在一些实施方案中，该方法还包括在MHC-肽呈递预测模型中分析来源于病毒基因组的核酸序列，该模型包括在已由机器学习软件训练的计算机处理器中实施的算法，其中该MHC-肽呈递预测模型预测由MHC I类或MHC II类抗原结合和呈递由病毒基因组编码的表位的可能性。在一些实施方案中，该方法还包括分析来自受试者的生物样品以鉴定MHC I类和MHC II类库，其中该分析包括通过基因组或全外显子组测序或通过分析由HLA基因编码的蛋白质进行分析。在一些实施方案中，该方法还包括匹配由MHC-肽呈递预测模型预测的对由受试者的HLA基因编码的MHC I类或MHC II类肽具有高亲和力的表位，并选择预测以由MHC-肽呈递预测模型分级的高亲和力结合由受试者的HLA基因编码的MHC肽的一种或多种肽。在一些实施方案中，已预测所选择的一种或多种肽以至少1 000nM的亲和力结合由受试者的HLA基因编码的MHC肽。在一些实施方案中，已预测所选择的一种或多种肽以至少500nM的亲和力结合由受试者的HLA基因编码的MHC I类肽。在一些实施方案中，已预测所选择的一种或多种肽以至少1000nM的亲和力结合由受试者的HLA基因编码的MHC II类肽。
在一些实施方案中，MHC-肽呈递预测模型被编程以提供特定表位或抗原性肽结合HLA等位基因的可能性的降序分级顺序，该HLA等位基因将肽呈递给T细胞受体。在一些实施方案中，选择具有最高结合可能性并由HLA呈递的表位序列用于制备治疗剂。在一些实施方案中，HLA的选择可受到受试者中表达的HLA的限制。在一些实施方案中，HLA的选择可基于群体中等位基因的流行率(例如，较高流行率)。在一些实施方案中，可基于肽(表位)与HLA等位基因(例如目标HLA等位基因)结合并由其呈递的较高可能性来选择用于制备治疗剂的表位。在一些实施方案中，该％等级值可通过评估特定等位基因的查询肽评分与固定的一组参考肽(对于I类和II类具有不同的一组参考肽)相比的百分位数来确定。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前10％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前2％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前5％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前8％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前1％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前0.5％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前0.1％的表位。在一些实施方案中，可选择与HLA等位基因结合可能性最高的前0.01％的表位。在一些实施方案中，截止值的选择可取决于预测模型所确定的预测具有与HLA等位基因结合的高可能性的表位的可用性和数量。
在一些实施方案中，该受试者可被病毒感染。在一些实施方案中，该受试者可能处于被病毒感染的风险中。在一些实施方案中，该病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，该冠状病毒选自SARS病毒、MERS冠状病毒或2019 SARS CoV-2病毒。在一些实施方案中，该一种或多种病毒肽抗原包含含有表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表1 5或表1 6中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。在一些实施方案中，该一种或多种病毒肽抗原包含含有表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16中的序列的至少7个连续氨基酸的肽。在一些实施方案中，该一种或多种病毒肽抗原包含含有表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16中的序列的至少6个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约5至约50个氨基酸。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约15至约35个氨基酸。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约15个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约8至约11个氨基酸。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为9或10个氨基酸。在一个实施方案中，该抗原性肽结合I类主要组织相容性复合体(MHC)。在另一个实施方案中，该抗原性肽以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类。
在一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约30个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约6至约25个氨基酸。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约15至约24个氨基酸。在另一个实施方案中，该抗原性肽的长度为约9至约15个氨基酸。在一个实施方案中，该抗原性肽结合MHC II类。在另一个实施方案中，该抗原性肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC II类。
在一个实施方案中，该抗原性肽还包含侧翼氨基酸。在另一个实施方案中，该侧翼氨基酸不是天然侧翼氨基酸。在一个实施方案中，该抗原性肽与至少第二抗原性肽连接。在另一个实施方案中，这些肽使用聚甘氨酸或聚丝氨酸接头连接。在另一个实施方案中，该第二抗原性肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在另一个实施方案中，该第二抗原性肽以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在另一个实施方案中，两个表位都结合人白细胞抗原(HLA)-A、-B、-C、-DP、-DQ或-DRw。在另一个实施方案中，该抗原性肽结合I类HLA并且该第二抗原性肽结合II类HLA。在另一个实施方案中，该抗原性肽结合II类HLA并且该第二抗原性肽结合I类HLA。
在一个实施方案中，该抗原性肽还包含增加体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递的修饰。在另一个实施方案中，修饰是与载剂蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、聚唾液酸化、羟乙基淀粉化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性物质、添加氨基酸模拟物、或添加非天然氨基酸例如合成氨基酸或f-moc氨基酸、D-氨基酸N-甲基氨基酸。在一个实施方案中，被靶向的细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，使用DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受体或CD1a标志物靶向树突细胞。在另一个实施方案中，使用CD141、DEC205或XCR1标志物靶向树突细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的抗原性肽的体内递送系统。在另一个实施方案中，该递送系统包括细胞穿透肽、纳米颗粒包封、病毒样颗粒或脂质体。在另一个实施方案中，细胞穿透肽是TAT肽、单纯疱疹病毒VP22、转运蛋白或Antp。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的抗原性肽的细胞。在另一个实施方案中，该细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，该细胞是树突细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的抗原性肽的组合物。在另一个实施方案中，该组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种包含表1A的表位的抗原性肽。在另一个实施方案中，该组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种包含表1B的表位的抗原性肽。在另一个实施方案中，该组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种包含表2B的表位的抗原性肽。在另一个实施方案中，该组合物包含2至20种抗原性肽。在另一个实施方案中，该组合物还包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、或至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30种附加的抗原性肽。在另一个实施方案中，该组合物包含约4至约20种附加的抗原性肽。在另一个实施方案中，该附加的抗原性肽对冠状病毒是特异性的。
在一个实施方案中，本文提供了一种编码本文所述的抗原性肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，该多核苷酸是RNA，任选地自扩增RNA。在一些实施方案中，该多核苷酸是DNA。在另一个实施方案中，RNA被修饰以增加稳定性、增加细胞靶向、增加翻译效率、佐剂性、细胞溶质可及性和/或降低细胞毒性。在另一个实施方案中，修饰是与载剂蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、密码子优化、增加GC含量、掺入经修饰的核苷、掺入5′-帽或帽类似物、和/或掺入多聚A序列，例如未掩蔽的多聚A序列或其中连续A序列的两个片段通过接头连接的断裂的多聚A序列。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的多核苷酸的细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，该多核苷酸可操作地连接到启动子。在另一个实施方案中，该载体是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在另一个实施方案中，该载体是腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒或它们的假型
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的多核苷酸的体内递送系统。在另一个实施方案中，该递送系统包括球形核酸、病毒、病毒样颗粒、质粒、细菌质粒或纳米颗粒。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的载体或递送系统的细胞。在另一个实施方案中，该细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，该细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，该细胞是未成熟的树突细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含至少一种本文所述的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，本文提供了一种包含与一种或多种2019 SARS CoV-2疫苗(例如，基于mRNA的疫苗、基于DNA的疫苗、基于AAV的疫苗、基于蛋白质的疫苗)组合的本文所述的一种或多种抗原性肽的组合物。在一些实施方案中，本文提供了一种包含与一种或多种2019SARS CoV-2疫苗(例如，基于mRNA的疫苗、基于DNA的疫苗、基于AAV的疫苗、基于蛋白质的疫苗)组合的一种或多种编码至少一种本文所述的抗原性肽的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，本文提供了一种编码多于一种如本文所述的抗原性肽的单一多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供了一种编码(i)至少一种如本文所述的抗原性肽和(ii)2019 SARSCoV-2蛋白(例如，S蛋白)和/或其免疫原性片段(例如，S蛋白的受体结合结构域(RBD))的单一多核苷酸。在另一个实施方案中，该组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30种多核苷酸。在另一个实施方案中，该组合物包含约2至约20种多核苷酸。在另一个实施方案中，该组合物还包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种编码附加抗原性肽的附加抗原性多核苷酸。在另一个实施方案中，该组合物包含约4至约20种附加的抗原性多核苷酸。在另一个实施方案中，这些多核苷酸与附加的抗原性多核苷酸连接。在另一个实施方案中，这些多核苷酸使用编码聚甘氨酸或聚丝氨酸接头的核酸连接。
在一个实施方案中，本文提供了一种能够结合至少一种本文所述抗原性肽的T细胞受体(TCR)。在另一个实施方案中，该TCR能够在MHC I类或II类背景下结合抗原性肽。
在一个实施方案中，本文提供了一种嵌合抗原受体，其包含：(i)T细胞激活分子；(ii)跨膜区；和(iii)能够结合本文所述的抗原性肽的抗原识别部分。在另一个实施方案中，CD3-ζ是T细胞激活分子。在另一个实施方案中，该嵌合抗原受体还包含至少一个共刺激信号传导结构域。在另一个实施方案中，该信号传导结构域是CD28、4-1BB、ICOS、OX40、ITAM或FcεRI-γ。在另一个实施方案中，该抗原识别部分能够在MHC I类或II类背景下结合抗原性肽。在另一个实施方案中，该嵌合抗原受体包括CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD4OL、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜区。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞。在一个实施方案中，T细胞是辅助或细胞毒性T细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含与编码本文所述的T细胞受体的多核苷酸可操作地连接的启动子的核酸。在另一个实施方案中，该TCR能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类背景下结合该至少一种抗原性肽。在一个实施方案中，该核酸包含与编码本文所述的嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接的启动子。在另一个实施方案中，该抗原识别部分能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类背景下结合该至少一种抗原性肽。
在一个实施方案中，本文提供了一种能够结合包含表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位的肽的抗体。在一个实施方案中，本文提供了一种能够结合包含表1B的表位的肽的抗体。在一个实施方案中，本文提供了一种能够结合包含表2Ai或表2Aii的表位的肽的抗体。
在一个实施方案中，本文提供了一种用本文所述的核酸转染或转导的经修饰的细胞。在一个实施方案中，经修饰的细胞是T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、NK-T细胞、表达TCR的细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或NK细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体的组合物。在另一个实施方案中，组合物包含含有本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体的自体患者T细胞。在另一个实施方案中，该组合物还包含免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，该组合物还包含至少两种免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，这些免疫检查点抑制剂中的每一种抑制选自由以下项组成的组的检查点蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CLIK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或它们的组合。在另一个实施方案中，这些免疫检查点抑制剂中的每一种与检查点蛋白的配体相互作用，该检查点蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或它们的组合。
在一个实施方案中，该组合物还包含免疫调节剂或佐剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂是共刺激配体、TNF配体、Ig超家族配体、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD4OL、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在另一个实施方案中，该免疫调节剂是至少一种感染细胞提取物。在另一个实施方案中，感染细胞对于需要该组合物的受试者是自体的。在另一个实施方案中，感染细胞已经历裂解或暴露于UV辐射。在另一个实施方案中，该组合物还包含佐剂。在另一个实施方案中，佐剂选自由以下项组成的组：多聚(I：C)、多聚ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870，893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312VG、Montanide ISA 206VG、Montanide ISA 50V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-1 74、OM-1 97-MP-EC、ISA-TLR2激动剂、ONTAK、载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德(resiquimod)、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β--葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐共聚物和QS21刺激素。在另一个实施方案中，当施用于受试者时，佐剂诱导体液免疫。在另一个实施方案中，当施用于受试者时，佐剂诱导1型辅助T细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过向具有被病毒感染的可能性的受试者施用包含一种或多种肽的疫苗组合物来抑制病毒感染的方法，该一种或多种肽包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B中定义的表位的至少8个连续氨基酸，该方法包括使细胞与本发明的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过增强或延长有需要的受试者中的抗病毒应答来治疗病毒感染、特别是冠状病毒感染(例如2019 SARS CoV-2感染)的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞。
在一个实施方案中，该受试者是人。在另一个实施方案中，该受试者患有病毒感染。在一个实施方案中，该受试者被呼吸道病毒感染，该呼吸道病毒诸如急性呼吸道病毒，例如SARS样病毒或MERS或MERS样病毒，或更具体地，2019 SARS CoV-2株的冠状病毒。在一些实施方案中，该受试者感染了2019 SARS CoV-2冠状病毒。在一些实施方案中，该受试者已被可检测地感染了2019 SARS CoV-2冠状病毒。在一些实施方案中，该受试者是无症状的。在一些实施方案中，该受试者是有症状的。在一些实施方案中，未检测到受试者已被2019 SARS CoV-2病毒或相关病毒感染，但受试者非常接近受感染者、在受感染的区域中或处于感染的风险中。
在该方法的一个实施方案中，施用肽。在另一个实施方案中，施用是全身性的。在该方法的另一个实施方案中，施用多核苷酸，任选地RNA。在一个实施方案中，该多核苷酸肠胃外施用。在一个实施方案中，该多核苷酸静脉内施用。在另一个实施方案中，该多核苷酸皮内或肌内或皮下施用。在一个实施方案中，该多核苷酸经肌内施用。在该方法的一个实施方案中，施用细胞。在另一个实施方案中，该细胞是T细胞或树突细胞。在另一个实施方案中，该肽或多核苷酸包含抗原呈递细胞靶向部分。
在一个实施方案中，该肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞在与另一种疗法(诸如另一种抗病毒疗法)同时施用之前施用。在另一个实施方案中，该肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞在另一种抗病毒疗法之前或之后施用。在另一个实施方案中，在整个抗原性肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞疗法中持续施用另一种抗病毒疗法。
在该方法的一个实施方案中，施用附加剂。在另一个实施方案中，该剂是化疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向疗法、放射治疗、抗血管生成剂或降低免疫抑制的剂。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物引发或促进CD4+ T细胞免疫应答。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物引发或促进CD4+ T细胞免疫应答和CD8+ T细胞免疫应答。
在另一个实施方案中，患者在接受抗原性肽或核酸疫苗之前和/或期间接受化疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向疗法或放射治疗。在另一个实施方案中，该自体T细胞获自已接受至少一轮含有抗原的T细胞疗法的患者。在另一个实施方案中，该方法还包括过继性T细胞疗法。在另一个实施方案中，该过继性T细胞疗法包括自体T细胞。在另一个实施方案中，该自体T细胞靶向病毒抗原。在另一个实施方案中，该过继性T细胞疗法还包括同种异体T细胞。在另一个实施方案中，该同种异体T细胞靶向病毒抗原。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于评价治疗功效的方法，该方法包括：(i)测量在施用经修饰的细胞之前从受试者获得的第一样品中靶细胞的数量或浓度，(ii)测量在施用经修饰的细胞之后从受试者获得的第二样品中靶细胞的数量或浓度，以及(iii)确定与第一样品中靶细胞的数量或浓度相比第二样品中靶细胞的数量或浓度的增加或减少。在另一个实施方案中，通过监测以下项来确定治疗功效：临床结果；T细胞抗病毒活性的增加、增强或延长；与治疗前的数量相比抗病毒T细胞或活化T细胞的数量增加；B细胞活性；CD4 T细胞活性；或它们的组合。在另一个实施方案中，通过监测生物标志物来确定治疗功效。在另一个实施方案中，通过T细胞的存在或通过指示T细胞炎症的基因签名的存在或它们的组合来预测治疗效果。
本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：一种或多种具有表11和表12第2列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽；或一种或多种重组多核苷酸构建体，每种重组多核苷酸构建体编码具有表11和表12第2列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，该一种或多种多肽包含至少2、3、4、5、6、7或8种不同的具有表11和表12第2列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽；或者其中该一种或多种重组多核苷酸构建体包含至少2、3、4、5、6、7或8种重组多核苷酸构建体，每种重组多核苷酸构建体编码不同的具有表11和表12第2列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，该药物组合物包含至少8种重组多核苷酸串。在一些实施方案中，编码多种冠状病毒肽抗原的该一种或多种重组多核苷酸串包含选自SEQ ID RS C1n、RS C2n、RSC3n、RSC4n、RS C5n、RS C6n、RS C7n和RS C8n中描述的一组序列的序列，或与上述任一者具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，该重组多核苷酸构建体包含mRNA。在一些实施方案中，该重组多核苷酸构建体是mRNA。在一些实施方案中，该药物组合物还包含一种或多种脂质组分。在一些实施方案中，该一种或多种脂质包含脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，该LNP包封重组多核苷酸构建体。在一些实施方案中，将该药物组合物施用于有需要的受试者。
本文提供了一种治疗有需要的受试者中的COVID的方法，该方法包括向受试者施用上述药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物是作为一种或多种COVID治疗剂的补充施用的。在一些实施方案中，该药物组合物与一种或多种具有2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽或一种或多种编码2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段的重组多核苷酸构建体组合施用。在一些实施方案中，2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用2019 SARSCoV-2刺突蛋白或其片段后2-10周施用。在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段后1-6个月施用。在一些实施方案中，该药物组合物与2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段的施用同时施用。在一些实施方案中，该药物组合物在施用2019 SARS CoV-2刺突蛋白或其片段之前2-10周施用。在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用包含SARS-CoV-2刺突蛋白或编码其的多核苷酸的疫苗后2-10周施用。在一些实施方案中，该药物组合物在第一次施用SARS-CoV-2刺突蛋白或编码其的多核苷酸后1-6个月施用。在一些实施方案中，该药物组合物与SARS-CoV-2刺突蛋白或编码其的多核苷酸的施用同时施用。在一些实施方案中，该药物组合物预防性地施用。在一些实施方案中，该药物组合物每1、2、3、4、5、6或更多周施用一次。
本文提供了本文所述的组合物中的任一者用于制备用于治疗或预防由2019 SARSCoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染的治疗剂的用途。
在本发明的方面或实施方案根据马库什组或其他另选分组进行描述的情况下，本发明不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且涵盖单独的组的每个成员和主组的所有可能的子组，以及缺少一个或多个组成员的主组。本发明还设想在本发明的实施方案中明确排除任何组成员中的一者或多者。
附图说明
图1描绘了鉴定与针对本文所述的病毒表位的CD8+ T细胞应答生成最相关的肽的方法的示例性流程图。
图2描绘了使用在验证数据集中应用于I类肽-MHC等位基因对的T细胞表位预测算法获得的结果以及这些对的计算百分比等级与报告的MHC-结合测定结果的比较的示例性图。在MHC-结合测定中具有二元“阳性”结果的肽-MHC等位基因对的百分比等级显著低于具有“阴性”结果的对。在更细粒度的阳性结果中，更强的测定结果(低<中等<高)与显著更低的百分比等级相关联。
图3描绘了在人T细胞诱导测定中来自201 9 SARS CoV-2的HLA-A02：01预测表位的实验验证。合成预测与HLA-A02：01高度结合的23种肽(参见实施例8的表4)并使用来自三个人供体的PBMC在T细胞诱导中进行测定。如果至少一个供体对肽产生T细胞应答，如通过pMHC多聚体技术确定的，则认为表位是免疫原性的。示出了使用来自实施例8的表4的肽的pMHC染色的代表性流式细胞术图。圈出多聚体阳性群体，其中在每个图的右上角示出了多聚体阳性CD8+ T细胞的频率。
图4A描绘了对于预测为MHC I类表位的指定肽的HLA等位基因的累积USA群体覆盖度(左)和对于预测为MHC II类表位的25mer肽的HLA等位基因的累积USA群体覆盖度(右)的示例性图。
图4B描绘了来自单个2019 SARS-CoV-2蛋白(另选地称为2019-CoV-2蛋白)的少量预测的多等位基因结合表位可实现广泛的群体覆盖度。上图示出了USA、EUR和API群体的累积HLA-I覆盖度分别与所包括的M、N和S蛋白的优先化HLA-I表位的数量的关系。对应于上图的肽序列示于表6中。下图示出了每个群体的累积HLA-II覆盖度分别与所包括的M、N和S蛋白的优先化HLA-II 25mer的数量的关系。对应于下图的肽序列示于表7中。
图5描绘了来自公开可用的蛋白质组学数据集的分析结果，其示出了可被利用以优先化潜在疫苗靶标的相对2019 SARS CoV-2蛋白表达水平。重新分析了检查对2019 SARSCoV-2感染(另选地称为2019 SARS CoV-2感染)的蛋白质组学应答的三个数据集，并通过对蛋白质长度归一化的光谱计数来估计蛋白质丰度。在这些蛋白质组学研究中没有检测到任何未在图中示出的注释ORF。在所有三项研究中，核衣壳蛋白是2019 SARS CoV-2感染期间最丰富的蛋白质。
图6A描绘了也在表9和表11中描述的被描述为第1组的串构建体的图形表示。
图6B提供了图6A中的构建体的详细展开图。
图7A描绘了也在表10和表12中描述的被描述为第2组的串构建体的图形表示。
图7B提供了图7A中的构建体的详细展开图。
图8Ai-图8Aii示出了BNT mRNA疫苗诱导的T细胞在单一表位水平上的表征。所包括的数据示出了在三个不同参与者中针对指定表位的表位应答T细胞。该疫苗包含包封在脂质纳米颗粒中的编码2019SARS COV-2的SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA。
图8B示出了通过流式细胞术分析的多聚体阳性CD8+细胞的细胞表面标志物CCR7、CD45RA、CD3、PD-1、CD38、HLA-DR、CD28和CD27。
图8C示出了包括刺突蛋白S1和S2的多肽疫苗，其具有可结合特异性MHC分子的由沿长度的实心形状指示的指定表位区域，其结合的对应HLA等位基因在下文指示。
图8D示出了用不同剂量(如所示的10、20和30微克)的刺突蛋白mRNA疫苗接种患者后T细胞应答的时程。上图示出了CD4+ T细胞应答，使用ELISPOT测定由IFN-g表达指示。下图示出了CD8+T细胞应答，使用ELISPOT测定由IFN-g表达指示。CEF和CEFT是对照CMV、EBV和流感库。
图8E示出了施用刺突蛋白mRNA疫苗(各10微克)的老年人群体中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞应答的时程。
图9示出了包含ORF-1ab表位的疫苗串的设计，在表位的排序中具体使用了基于MS的HLA-I切割预测因子信息。该设计利用最小数量的接头序列。
图10A示出了用于在动物模型中验证串疫苗组合物的免疫原性的实验设计。
图10B示出了用于在动物模型中验证串疫苗组合物的免疫原性并将疫苗与单独的刺突蛋白mRNA疫苗组合物、单独的串疫苗组合物或如图所示的两者的各种组合进行比较的实验设计。在一些组中，将两种疫苗的共制剂给予小鼠，其中示例性共制剂比率为：刺突蛋白mRNA疫苗：串疫苗(例如，9∶1、3∶1或1∶1)。
图11展示了在各种SARS CoV-2分离株中在刺突蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图12展示了在各种SARS CoV-2分离株中在核衣壳蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图13展示了在各种SARS CoV-2分离株中在膜蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图14展示了在各种SARS CoV-2分离株中在NSP1蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图15展示了在各种SARS CoV-2分离株中在NSP2蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图16展示了在各种SARS CoV-2分离株中在NSP3蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
图17展示了在各种SARS CoV-2分离株中在NSP4蛋白上的序列变体和突变体，以及疫苗表位序列的相应作图。
具体实施方式
本文描述了基于病毒表位的新型治疗剂和疫苗。因此，本文所述的发明提供了可用于例如刺激对病毒抗原的免疫应答、产生用于治疗或预防病毒感染的免疫原性组合物或疫苗的肽、编码该肽的多核苷酸和肽结合剂。
定义
为了便于理解本发明，下面定义了多个术语和短语。
“病毒抗原”是指由病毒编码的抗原。它们包括但不限于冠状病毒的抗原，诸如COVID19。
贯穿本公开，“结合数据”结果可用“IC50”表示。IC50是在结合测定中观察到标记的参考肽的结合的50％抑制的测试肽的浓度。给定进行测定的条件(即，限制HLA蛋白和标记的参考肽浓度)，这些值近似于KD值。用于确定结合的测定是本领域熟知的，并且详细描述于以下文献中：例如，PCT公开WO 94/20127和WO 94/03205，以及其他公开诸如Sidney等人，Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人，J.Immunol.154：247(1995)；以及Sette等人，Mol.Immunol.31：813(1994)。另选地，结合可相对于参考标准肽的结合来表示。例如，可基于其IC50，相对于参考标准肽的IC50。结合还可使用其他测定系统来确定，包括使用以下项的那些：活细胞(例如，Ceppellini等人，Nature 339：392(1989)；Christnick等人，Nature 352：67(1991)；Busch等人，Int.Immunol.2：443(1990)；Hill等人，J.Immunol.147：189(1991)；del Guercio等人，J.Immunol.154：685(1995))，使用去污剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等人，J.Immunol21：2069(1991))，固定的纯化MHC(例如，Hill等人，J.Immunol.152，2890(1994)；Marshall等人，J.Immunol.152：4946(1994))，ELISA系统(例如，Reay等人，EMBO J.11：2829(1992))，表面等离子体共振(例如，Khilko等人，J.Biol.Chem.268：15425(1993))；高通量可溶相测定(Hammer等人，J.Exp.Med.180：2353(1994))，和I类MHC稳定或组装的测量(例如，Ljunggren等人，Nature346：476(1990)；Schumacher等人，Cell 62：563(1990)；Townsend等人，Cell 62：285(1990)；Parker等人，J.Immunol.149：1896(1992))。
当用于讨论表位时，术语“衍生”是“制备”的同义词。衍生的表位可来自天然来源，或者它可根据本领域的标准方案合成。合成表位可包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，诸如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或非天然氨基酸残基诸如环己基丙氨酸。衍生的或制备的表位可以是天然表位的类似物。
“稀释剂”包括无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水也是药物组合物的稀释剂。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可例如在可注射溶液中用作稀释剂。
“表位”是分子的集合特征，诸如一级、二级和三级肽结构和电荷，它们一起形成被例如免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体识别的位点。另选地，表位可以是一组涉及特定免疫球蛋白识别的氨基酸残基，或者在T细胞的背景下，是T细胞受体蛋白、嵌合抗原受体和/或主要组织相容性复合体(MHC)受体识别所必需的那些残基。表位可通过从天然来源分离来制备，或者它们可根据本领域的标准方案来合成。合成表位可包含人工氨基酸残基，“氨基酸模拟物”，诸如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或非天然存在的氨基酸残基诸如环己基丙氨酸。在本公开中，表位在一些情况下可被称为肽或肽表位。
应当理解，包含本文所述的表位或类似物以及附加氨基酸的蛋白质或肽仍在本发明的范围内。在某些实施方案中，肽包含抗原的片段。
在某些实施方案中，对本发明的肽的长度存在限制。当包含本文所述的表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即连续的一系列氨基酸残基)时，出现长度受限的实施方案。为了避免例如在整个天然分子上进行阅读的表位的定义，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度存在限制。因此，对于包含本文所述的表位和与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：小于或等于600个氨基酸残基、小于或等于500个氨基酸残基、小于或等于400个氨基酸残基、小于或等于250个氨基酸残基、小于或等于100个氨基酸残基、小于或等于85个氨基酸残基、小于或等于75个氨基酸残基、小于或等于65个氨基酸残基和小于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”由具有与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽组成，该区域具有小于51个氨基酸残基，以任何增量低至5个氨基酸残基；例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合体(MITC)蛋白(参见例如，Stites等人，IMMUNOLOGY，第8版，Lange Publishing，Los Altos，Calif.(1994))。
如本文所用，“HLA超型或HLA家族”描述基于共有的肽结合特异性分组的HLA分子组。对带有某些氨基酸基序的肽共享一定程度的类似结合亲和力的HLA I类分子被分组为此类HLA超型。术语HLA超家族、HLA超型家族、HLA家族和HLA xx样分子(其中“xx”表示特定的HLA类型)是同义的。
在两个或更多个肽序列或抗原片段的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当在比较窗口上进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过人工比对和视觉检查所测量的。
“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“肽表位”是包含等位基因特异性基序的肽，使得该肽将结合HLA分子并诱导细胞介导的应答或体液应答，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助T淋巴细胞(HTL)和/或B淋巴细胞应答。因此，本文所述的免疫原性肽能够结合适当的HLA分子，然后诱导针对该肽的CTL(细胞毒性)应答或HTL(和体液)应答。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包括免疫球蛋白抗原结合结构域(例如，免疫球蛋白可变结构域)和T细胞受体(TCR)恒定结构域的抗原结合蛋白。如本文所用，TCR多肽的“恒定结构域”包括近膜TCR恒定结构域，并且还可包括TCR跨膜结构域和/或TCR胞质尾。例如，在一些实施方案中，CAR是包括第一多肽和第二多肽的二聚体，该第一多肽包含与TCR-β恒定结构域连接的免疫球蛋白重链可变结构域，该第二多肽包含与TCRα恒定结构域连接的免疫球蛋白轻链可变结构域(例如，1c或2\可变结构域)。在一些实施方案中，CAR是包括第一多肽和第二多肽的二聚体，该第一多肽包含与TCRα恒定结构域连接的免疫球蛋白重链可变结构域，该第二多肽包含与TCRβ恒定结构域连接的免疫球蛋白轻链可变结构域。
短语“分离的”或“生物学上纯的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下发现时通常伴随该物质的组分的物质。因此，本文所述的肽不含有通常与肽在其原位环境中缔合的物质中的一些或全部。“分离的”表位是指不包括衍生该表位的抗原的整个序列的表位。通常，“分离的”表位不具有与其连接的附加氨基酸残基，这些附加氨基酸残基导致在天然序列的全长上具有100％同一性的序列。天然序列可以是诸如病毒抗原的序列，表位衍生自该序列。因此，术语“分离的”意指物质从其原始环境(例如，如果其是天然存在的，则是天然环境)中去除。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但是从天然系统中的一些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分，和/或此类多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括合成产生的此类分子。
“主要组织相容性复合体”或“MHC”是在控制负责生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人体中，MHC复合体也被称为人白细胞抗原(HLA)复合体。关于MHC和HLA复合体的详细描述，参见Paul，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第3版增刊，Raven Press，NewYork(1993)。
“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。此类序列实际上可包括更长的序列。
“T细胞表位”应被理解为意指可以呈递肽的MHC分子或MHC复合体的形式被I类或II类MHC分子结合并且然后以这种形式分别被细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞识别和结合的肽序列。
“受体”应被理解为意指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可用于在细胞、细胞形成物或生物体中传递信息。该受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可由蛋白质分子组成。该受体具有与配体互补的结构，并可作为结合配偶体与配体复合。该信息特别是通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递。在一些实施方案中，受体应被理解为特别是意指能够与配体、特别是合适长度的肽或肽片段形成受体/配体复合体的MHC I类和II类的蛋白质。
“配体”应被理解为意指具有与受体的结构互补的结构且能够与该受体形成复合体的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，使得该肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合体。
在一些实施方案中，“受体/配体复合体”也应被理解为意指“受体/肽复合体”或“受体/肽片段复合体”，包括呈递肽或肽片段的I类或II类MHC分子。
“主要组织相容性复合体(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白”或“HLA蛋白”应被理解为意指能够结合由蛋白抗原的蛋白水解切割产生的肽并代表潜在的淋巴细胞表位(例如T细胞表位和B细胞表位)、将它们转运至细胞表面并在那里将它们呈递至特定细胞特别是细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞的蛋白质。基因组中的主要组织相容性复合体包括遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源和/或外源抗原并因此对于调节免疫过程是重要的。主要组织相容性复合体分为编码不同蛋白质的两个基因组，即MHC I类分子和MHC II类分子。两种MHC类型的细胞生物学和表达模式适应于这些不同的作用。
术语“肽”和“肽表位”在本说明书中与“寡肽”可互换使用，以表示一系列彼此连接的残基，通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接。
“合成肽”是指从非天然来源获得的肽，例如，是人造的。这些肽可使用诸如化学合成或重组DNA技术的方法产生。“合成肽”包括“融合蛋白”。
“PanDR结合”肽、“PanDR结合表位”是结合多于一种HLA II类DR分子的分子家族的成员。
“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理上相容的组合物或组合物的组分。
“药物赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载剂、pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、防腐剂等物质。“药物赋形剂”是药学上可接受的赋形剂。术语“基序”是指被特定HLA分子识别的确定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，对于I类HLA基序，长度小于约15个氨基酸残基、或长度小于约13个氨基酸残基例如约8至约13个氨基酸残基(例如，8、9、10、11、12或13)的肽，以及对于II类HLA基序，约6至约25个氨基酸残基(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)的肽。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序在它们的一级和二级锚定残基的模式上不同。在一些实施方案中，MHC I类基序鉴定长度为9、10或11个氨基酸残基的肽。
“超基序”是由两个或多个HLA等位基因编码的HLA分子共有的肽结合特异性。在一些实施方案中，本文所述的带有超基序的肽被两种或更多种HLA抗原以高或中等亲和力(如本文所定义)识别。
如本文所用，术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可来自天然来源并且在实验室中没有被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
根据本发明，术语“疫苗”涉及药物制备物(药物组合物)或产品，其在施用后诱导识别并攻击病原体或患病细胞(例如感染病毒的细胞)的免疫应答，例如细胞或体液免疫应答。疫苗可用于预防或治疗疾病。
“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”是指对来源于病原性抗原(例如，病毒抗原)的抗原的CTL和/或HTL应答，其以某种方式预防或至少部分阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答还可包括通过刺激辅助T细胞促进的抗体应答。
“抗原加工”或“加工”是指将多肽或抗原降解成加工产物，该加工产物是所述多肽或抗原的片段(例如，将多肽降解成肽)，并且这些片段中的一者或多者(例如，经由结合)与MHC分子缔合，用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递至特异性T细胞。
“抗原呈递细胞”(APC)是在其细胞表面呈递与MHC分子缔合的蛋白抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞。专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或通过受体介导的胞吞作用非常有效地内化抗原，然后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别并与抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合体相互作用。然后抗原呈递细胞产生附加的共刺激信号，从而导致T细胞的激活。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的确定特征。
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞(其具有最广泛的抗原呈递范围并且可能是最重要的抗原呈递细胞)、巨噬细胞、B细胞和某些活化上皮细胞。
树突细胞(DC)是经由MHC II类和I类抗原呈递途径两者将外周组织中捕获的抗原呈递至T细胞的白细胞群体。众所周知，树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的激活是诱导抗病毒免疫的关键步骤。
树突细胞被方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可用作区分两种充分表征的表型的简单方式。然而，这种命名法不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。
未成熟树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，这与Fey受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常在于这些标志物的较低表达，但负责T细胞激活的细胞表面分子诸如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1 BB)的高表达。
术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入肽或蛋白质中的氨基酸残基或氨基酸模拟物残基，或编码氨基酸或氨基酸模拟物的核酸(DNA或RNA)。
用于描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践，其中每个氨基酸残基的氨基基团位于左侧(氨基或N末端)并且羧基基团位于右侧(羧基或C末端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，它们以氨基至羧基方向编号，其中位置一是位于表位的氨基末端的残基，或者是它可以是其一部分的肽或蛋白质。
在代表本发明的所选择的具体实施方案的式中，氨基末端基团和羧基末端基团，尽管没有具体显示，是它们在生理pH值下所呈现的形式，除非另有说明。在氨基酸结构式中，每个残基通常由标准的三字母或单字母命名表示。L-型氨基酸残基由大写单字母或第一字母大写的三字母符号表示，并且具有D-型的那些D-型氨基酸残基由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用三字母符号或全名而没有大写时，它们可指L氨基酸残基。甘氨酸不具有不对称碳原子，并且简称为“Gly”或“G”。本文阐述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号来命名。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，L-缬氨酸；W，色氨酸；和Y，酪氨酸。)
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA，例如mRNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，所施用的多核苷酸是mRNA。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对(如果需要，引入缺口)以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，而不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域熟知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package以及它们的变型。在一些实施方案中，当进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用序列比较算法或通过视觉检查所测量的，本文所述的两种核酸或多肽是基本上相同的，意味着它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约10、至少约20、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或其间的任何整数值2的序列的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于长于60-80个残基诸如至少约80-100个残基的区域上，并且在一些实施方案中，序列在被比较的序列的全长诸如核苷酸序列的编码区上基本上相同。
“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基替换的取代。本领域已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对酪氨酸的取代是保守取代。鉴定不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的。
如本文所用，术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体和包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是在自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已纯化至它们不再处于它们在自然界中所发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。在一个实施方案中，“多核苷酸”包括PCR或定量PCR反应，其包含在PCR或定量PCR反应中扩增的多核苷酸。
如本文所用，术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯、或至少99％纯的物质。
术语-“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿类等，其将是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中关于人类受试者可互换使用。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或障碍的治疗有效量。治疗有效量的药物具有治疗效果并且因此可预防疾病或障碍的发展；减缓疾病或障碍的发展；减缓疾病或障碍的进展；在一定程度上缓解与疾病或障碍相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗(treating或treatment或to treat)”或“缓解(alleviating或toalleviate)”是指1)治愈、减缓、减轻诊断的病理疾病或障碍的症状和/或停止诊断的病理疾病或障碍的进展的治疗性措施和2)预防或减缓靶向病理疾病或障碍的发展的预防性或防止性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有该障碍的那些；易患该障碍的那些；以及需要预防该障碍的那些。
如在本公开和实施方案中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
术语“治疗性”是指用于治疗或预防疾病或病症诸如病毒感染(例如冠状病毒感染)的组合物。例如，治疗剂可以是疫苗。治疗剂可以是药物，例如小分子药物。可向有需要的受试者施用治疗剂，以预防疾病或感染，或减轻或改善与疾病相关的一种或多种症状。治疗剂也可被认为治疗疾病的至少一种症状。
应当理解，诸如“包含(comprises、comprised、comprising)”等术语可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可意指“包括(includes、included、including)”等；并且诸如“基本上由…组成(consisting essentially of和consists essentially of)”的术语具有在美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确列举的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。本文中的任何内容都不旨在作为承诺。
如本文在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
当例如涉及病毒时，术语“2019 SARS-CoV 2”包括但不限于2019SARS-CoV 2病毒及其任何突变体或变体。
在一些实施方案中，测序方法可用于鉴定病毒特异性表位。根据本发明可使用任何合适的测序方法，例如，下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法将来可能替代NGS技术以加速该方法的测序步骤。为了清楚的目的：在本发明的上下文中，术语“下一代测序”或“NGS”是指所有新型高通量测序技术，其与称为Sanger化学的“常规”测序方法相反，通过将整个基因组分成小片而沿整个基因组随机平行地读取核酸模板。此类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间段内，例如在1-2周内，例如在1-7天内或在小于24小时内，递送全基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可商购获得的或文献中提及的多种NGS平台可用于本发明的上下文中，例如WO 2012/159643中详细描述的那些。
在某些实施方案中，本文所述的病毒表位肽分子可包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或更多个氨基酸残基，以及其中可导出的任何范围。在具体的实施方案中，病毒表位肽分子等于或小于100个氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的MHC I类的病毒表位肽的长度为13个残基或更少，并且通常由约8至约11个残基、特别是9或10个残基组成。在一些实施方案中，本文所述的MHC II类的病毒表位肽的长度为9-24个残基。
可以几种方式设计较长的病毒蛋白表位肽。在一些实施方案中，当预测或已知HLA结合肽时，较长的病毒蛋白表位肽可由以下组成：(1)具有朝向每个对应肽的N-和C末端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与各自的延伸序列的串联。在一些实施方案中，假定使用较长的肽允许患者细胞进行内源加工，并且可导致更有效的抗原呈递和T细胞应答的诱导。在一些实施方案中，可使用两种或更多种肽，其中这些肽重叠并平铺在长病毒表位肽上。
在一些实施方案中，病毒表位肽和多肽结合HLA蛋白(例如，HLA I类或HLA II类)。在具体的实施方案中，病毒表位肽或多肽具有至少小于5000nM、至少小于500nM、至少小于100nM、至少小于50nM或更小的IC50。
在一些实施方案中，本文所述的病毒蛋白表位肽可在溶液中，为冻干的，或可以是晶体形式。
在一些实施方案中，本文所述的病毒蛋白表位肽可通过合成、通过重组DNA技术或化学合成制备，或者可来自天然来源诸如天然病毒。表位可单独合成或直接或间接地连接在肽中。尽管本文所述的病毒表位肽将基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白及其片段，但在一些实施方案中，该肽可以合成方式缀合以连接至天然片段或颗粒。
在一些实施方案中，本文所述的病毒蛋白表位肽可以多种方式制备。在一些实施方案中，该肽可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成仪是可商购获得的并且可根据已知方案使用。(参见例如，Stewart&Young，Solid Phase PeptideSynthesis，第2版，Pierce Chemical Co.，1984)。此外，可使用化学连接将各个肽连接以产生仍在本发明的范围内的更大的肽。
另选地，可使用重组DNA技术，其中将编码肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中并在适于表达的条件下培养。这些程序通常是本领域已知的，如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中一般性描述的。因此，包含本文所述的一个或多个表位或由其组成的重组肽可用于呈递适当的T细胞表位。
在一个方面，本文所述的发明还提供了包含一种、至少两种或多于两种病毒表位肽的组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有至少两种不同的肽。在一些实施方案中，该至少两种不同的肽衍生自相同的多肽。不同的多肽是指肽在长度、氨基酸序列或两者上变化。这些肽衍生自已知或已发现含有病毒特异性表位的任何多肽。
病毒表位多核苷酸
编码本文所述的每种肽的多核苷酸也是本发明的一部分。如本领域普通技术人员所理解的，由于遗传密码的冗余性，各种核酸将编码相同的肽。这些核酸中的每一种都落入本发明的范围内。本发明的该实施方案包括DNA和RNA，例如mRNA，并且在某些实施方案中包括DNA和RNA的组合。在一个实施方案中，mRNA是自扩增mRNA。(Brito等人，Adv.Genet.2015；89：179-233)。应当理解，编码本文所述的肽的任何多核苷酸都落入本发明的范围内。
术语“RNA”包括并且在一些实施方案中涉及“mRNA”。术语“mRNA”是指“信使RNA”并涉及通过使用DNA模板生成并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5′-UTR、蛋白质编码区和3′-UTR。mRNA在细胞和体外仅具有有限的半衰期。在一个实施方案中，mRNA是自扩增mRNA。在本发明的上下文中，mRNA可通过体外转录由DNA模板生成。体外转录方法是本领域技术人员已知的。例如，有多种体外转录试剂盒可商购获得。
RNA的稳定性和翻译效率可根据需要进行改变。例如，可通过具有稳定作用和/或增加RNA翻译效率的一种或多种修饰来稳定RNA并增加其翻译。此类修饰描述于例如PCT/EP2006/009448中，其以引用方式并入本文。为了增加根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内对其进行修饰，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，以便增加GC含量以增加mRNA稳定性，并进行密码子优化，并因此增强细胞中的翻译。
在本发明中所用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对所述RNA中不天然存在的RNA的任何修饰。在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未封端的5′-三磷酸。此类未封端的5′-三磷酸的去除可通过用磷酸酶处理RNA来实现。根据本发明的RNA可具有经修饰的核糖核苷酸以便增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，胞苷可被5-甲基胞苷取代；5-甲基胞苷被部分或完全取代，例如，完全取代胞苷。另选地或另外地，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，尿苷可被假尿苷或1-甲基假尿苷取代；假尿苷或1-甲基假尿苷被部分或完全取代，例如，完全取代尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5′-帽或5′-帽类似物的RNA。术语“5′-帽”是指在mRNA分子的5′-末端上发现的帽结构，并且通常由通过不寻常的5′至5′三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规5′-帽”是指天然存在的RNA 5′-帽，即7-甲基鸟苷帽(m G)。在本发明的上下文中，术语“5′-帽”包括类似于RNA帽结构的5′-帽类似物，并且被修饰以具有在体内和/或在细胞中稳定RNA和/或增强RNA(如果附接到其上)的翻译的能力。
在某些实施方案中，向有需要的受试者施用编码病毒表位的mRNA。在一个实施方案中，本发明提供了包含经修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子，包含它们的基因疗法载体，包含它们的基因治疗方法和基因转录沉默方法。在一个实施方案中，待施用的mRNA包含至少一种经修饰的核苷。
编码本文所述的肽的多核苷酸可通过化学技术合成，例如Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981)的磷酸三酯法。编码包含类似物或由类似物组成的肽的多核苷酸可以简单地通过用合适的和期望的核酸碱基取代编码天然表位的那些来制备。
适于产生和施用本文所述的病毒表位肽的大量载体和宿主系统是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。以实例的方式提供了以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX 174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核细胞：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可使用任何其他质粒或载体，只要其在宿主中可复制和存活。
作为适当宿主的代表性实例，可提及：细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙、门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(PseudomonaS)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种菌种；真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇和Sf9；动物细胞，诸如Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7系，和其他能够表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系或Bowes黑素瘤；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的范围内。
因此，本公开还涉及用于产生和施用本文所述的病毒表位肽的载体和表达载体，以及包含此类载体的宿主细胞。
用载体遗传工程化(转导或转化或转染)宿主细胞，这些载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可在常规营养培养基中培养工程化宿主细胞，这些培养基被修饰以适于激活启动子、选择转化体或扩增多核苷酸。培养条件，诸如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员是显而易见的。
为了表达本文所述的病毒表位肽，将提供编码序列，其可操作地连接起始和终止密码子、启动子和终止子区域，并且在一些实施方案中，提供复制系统以提供用于在期望的细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有用于插入期望编码序列的方便的限制性位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列。将得到的表达载体转化到合适的细菌宿主中。
通常，重组表达载体将包括复制起点和允许转化宿主细胞的选择性标志物，例如大肠杆菌和酿酒酵母TRP1基因的氨苄西林抗性基因，以及衍生自高表达基因以指导下游结构序列转录的启动子。此类启动子可衍生自编码糖酵解酶诸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。该异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列组装，并且在一些实施方案中，与能够指导翻译的蛋白质分泌到周质间隙或细胞外介质中的前导序列组装。任选地，该异源序列可编码包括N末端鉴定肽的融合蛋白，该N末端鉴定肽赋予期望的特性，例如表达的重组产物的稳定化或简化的纯化。
也可使用酵母、昆虫或哺乳动物细胞宿主，采用合适的载体和控制序列。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系，和其他能够表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。此类启动子也可衍生自病毒来源，诸如例如人巨细胞病毒(CMV-IE启动子)或单纯疱疹病毒1型(HSV TK启动子)。衍生自SV40剪接的核酸序列以及聚腺苷酸化位点可用于提供非转录遗传元件。
编码本文所述的病毒表位肽的多核苷酸还可包含泛素化信号序列和/或靶向序列，诸如内质网(ER)信号序列，以促进所得肽移动到内质网中。
本文所述的多核苷酸可在人细胞(例如，免疫细胞，包括树突细胞)中施用和表达。人密码子使用表可用于指导每种氨基酸的密码子选择。此类多核苷酸在表位和/或类似物之间包含间隔氨基酸残基，诸如上述那些，或者可包含与表位和/或类似物(和/或CTL、HTL和B细胞表位)相邻的天然存在的侧翼序列。
在一些实施方案中，本文所述的病毒表位肽也可通过病毒或细菌载体施用/表达。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，诸如痘苗或禽痘。作为这种方法的一个实例，痘苗病毒被用作表达编码本文所述的病毒表位肽的核苷酸序列的载体。用于免疫方案的痘苗载体和方法描述于例如美国专利4,722,848中。另一种载体是BCG(卡介苗)。Stover等人，Nature351：456-460(1991)描述了BCG载体。根据本文的描述，用于治疗性施用或免疫本文所述的病毒表位多肽的多种其他载体，例如腺和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、解毒炭疽毒素载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、金丝雀痘载体和禽痘载体等对本领域技术人员是显而易见的。在一些实施方案中，载体是经修饰的安卡拉痘苗病毒(VA)(例如Bayarian Nordic(MVA-BN))。
本领域技术人员熟知的标准调节序列可被包括在载体中以确保在人靶细胞中表达。期望若干载体元件：具有多核苷酸下游克隆位点的启动子，例如小基因插入；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；和大肠杆菌选择性标志物(例如氨苄西林或卡那霉素抗性)。许多启动子可用于该目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其他合适的启动子序列参见例如美国专利5,580,859和5,589,466。在一些实施方案中，启动子是CMV-IE启动子。
本文所述的多核苷酸可在转录区中包含一个或多个合成或天然存在的内含子。还可考虑包含mRNA稳定序列和用于在哺乳动物细胞中复制的序列以增加多核苷酸表达。
此外，本文所述的多核苷酸可包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。这些序列可被包括在载体中，在多核苷酸编码序列之外以增强免疫原性。
病毒表位
冠状病毒是有包膜的正链RNA病毒，其属于冠状病毒科和网巢病毒(Nidovirales)目。冠状病毒经常感染全球的人。存在大量的冠状病毒，其中大多数在包括猪、骆驼、蝙蝠和猫的围养动物中传播。在迄今为止在人类中鉴定的七种冠状病毒中，将冠状病毒229E、NL63分类为第1组抗原性病毒，将OC43和HKU1分类为第2组抗原性病毒。它们通常感染人的上呼吸道，并且可引起急性呼吸综合征并且可以是致命的。冠状病毒可能起源于人畜共患病。SARS-CoV、MERS-CoV和2019 SARS CoV-2具有人类传播和感染能力，并且在本世纪的短期内引起了世界范围内的主要公共健康问题。冠状病毒中遗传多样性的扩展及其在人类中引起疾病的随后能力主要通过感染作为中间宿主的围养动物、培育重组和突变事件来实现。假定将病毒体附着于宿主细胞膜的刺突糖蛋白(S糖蛋白)在宿主范围限制中起主导作用。SARS-CoV和2019 SARS CoV-2利用血管紧张素转化酶2(ACE2)作为受体感染2型肺细胞和纤毛支气管上皮细胞，而MERS-CoV利用跨膜糖蛋白二肽基肽酶4(DPP4)感染2型肺细胞和无纤毛支气管上皮细胞。
冠状病毒首先在呼吸道和肠细胞的上皮细胞中复制。人气道上皮细胞促进2019SARS CoV-2病毒的高生长速率。感染冠状病毒的人可呈现流感样症状并可发展为肺炎。与该疾病相关的症状包括咳嗽、发热、呼吸困难、肌痛或疲乏。一些人类患者呈现出该疾病的轻度临床表现。然而，该疾病在人类群体中的表现可跨越从无症状到致命的广泛范围。在一些情况下，人冠状病毒具有2-4天的潜伏期；2019SARS CoV-2估计为3-6天，SARS-CoV可为4-6天。SARS冠状病毒在2003年被鉴定并可能来源于动物贮库，并且2002年首次感染人类。患者出现呼吸窘迫和腹泻。MERS-CoV在沙特阿拉伯于2012年鉴定。单峰骆驼可能是MERS-CoV的主要贮库。典型的MERS症状包括发热、咳嗽、呼吸短促、肺炎、包括腹泻的胃肠症状。2019SARS CoV-2也被称为SARS CoV-2或简称为CoV-2。
在2003年全球疫情期间，在加拿大多伦多、中国香港特别行政区、中国台北、新加坡和越南河内的病例早期输入之后发生SARS-CoV的人对人传播；至少已报告了四次复苏。据报告MERS在2012年爆发期间已传播到多个国家，至少包括阿尔及利亚、奥地利、巴林、中国、埃及、法国、德国、希腊、伊朗伊斯兰共和国、意大利、约旦、科威特、黎巴嫩、马来西亚、荷兰、阿曼、菲律宾、卡塔尔、大韩民国、沙特阿拉伯王国、泰国、突尼西亚、土耳其、阿拉伯联合酋长国、英国、美国和也门。2019 SARS CoV-2于2019年12月至2020年初在世界范围内传播。
截至2019年3月20日，尚未批准用于这些病毒的疫苗。需要新型抗病毒治疗剂。本公开包括使用受试者自身的免疫细胞激活针对病毒的免疫应答来开发免疫治疗的方法和组合物。
在一个方面，该方法包括以下项中的一者或多者：
-分析病毒基因组序列以获得关于潜在病毒表位的信息。
-分析受试者的MHC I类和MHC II类表达谱。
-在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法中分析病毒序列，其中在计算机处理器中实施的MHC-肽呈递预测算法已通过机器学习训练模块进行训练，该机器学习训练模块整合了与肽和肽MHC相互作用相关的大量特征，以便提供预测与某一MHC分子结合的肽的选择的输出。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子是neonmhc2。在一些实施方案中，为了比较，使用MHC-肽呈递预测因子NetMHCpan或NetMHCpan II进行进一步分析。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子是NetMHCpan。在一些实施方案中，该MHC-肽呈递预测因子是NetMHCpan II。
-鉴定哪些病毒表位能够结合受试者中存在的MHC。
-由机器学习辅助根据结合亲和力对结合受试者的MHC分子的病毒肽进行分级，其中较高的等级意味着较高的结合亲和力和呈递效率。
-从对受试者的一种或多种MHC分子具有高结合亲和力的分级肽中选择至少一种、至少两种、至少三种或至少四种或更多种病毒肽并制备组合物。所选择的病毒肽一起可结合一种或多种I类MHC、或II类MHC、或I类和II类MHC的混合物，其中MHC中的每种由受试者表达。
本文提供了一种包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列的抗原性肽。本文还提供了编码抗原性肽的多核苷酸，该抗原性肽包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列。该抗原性肽和/或多核苷酸可以是重组的。该抗原性肽和/或多核苷酸可以是分离的或纯化的。该抗原性肽可以是合成的或由多核苷酸表达。
本文还提供了结合抗原性肽的抗体或包含抗体的B细胞，该抗原性肽包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列。
本文还提供了T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表1A或表1B的与根据表1A或表1B的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。
本文还提供了T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表2Ai的与根据表2Ai的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列。本文还提供了T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表2Aii的与根据表2Aii的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，TCR可结合来自表2Aii第1列(组1)的与来自表2Aii同一行中第3列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列。
本文提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列的抗原性肽。本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用编码包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列的抗原性肽的多核苷酸。
本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用抗体或包含抗体的B细胞，该抗体结合包含来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列的抗原性肽。
本文还提供了一种治疗或预防有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括向该受试者施用T细胞受体(TCR)或包含TCR的T细胞，该TCR结合来自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的与根据表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的对应MHC I类分子复合的表位序列。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第2列(组1)的与来自表1A同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第4列(组2)的与来自表1A同一行中第5列(组2)的对应MHCI类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1A第6列(组3)的与来自表1A同一行中第7列(组3)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第7列(组3)的该对应MHC I类分子。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第2列(组1)的与来自表1B同一行中第3列(组1)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC I类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表1B第4列(组2)的与来自表1B同一行中第5列(组2)的对应MHC I类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC I类分子。
例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第2列(组1)的与来自表2Ai同一行中第3列(组1)的对应MHC II类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第3列(组1)的该对应MHC II类分子。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列。例如，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Ai第4列(组2)的与来自表2Ai同一行中第5列(组2)的对应MHC II类分子复合的表位序列，该受试者表达来自第5列(组2)的该对应MHC II类分子。同样，该方法可包括向受试者施用TCR或包含TCR的T细胞，该TCR可结合来自表2Aii左列的与来自表2Aii同一行中右列的对应MHC II类分子复合的表位序列。由表2Ai或表2Aii的任何单行中的肽的右边相邻列的对应等位基因编码的蛋白质是结合肽并由APC呈递至T细胞的MHC蛋白质。每行中HLA等位基因的紧邻左列上列出的肽与该行中的HLA匹配。
表1A.肽和等位基因
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病毒基因组包含由跨越单个多核苷酸片段的多个阅读框编码的多个基因。例如，核衣壳蛋白是在2019 S ARS CoV-2病毒中大量表达的蛋白质。短蛋白ORF9b由跨越核衣壳序列区域的另一个阅读框编码。这些高度表达的蛋白质扩大了T细胞免疫的潜在靶标的数目。表1C和表2B分别显示了来自Orf9b的预测的MHC-I结合表位和MHC-II结合表位。
表1C.来自Orf9b的MHC I结合表位
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表1D.(表1A-B等位基因符号说明)
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表2Ai.肽和等位基因
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表2Aii.肽和等位基因
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表2B-来自Orf9b的MHC II结合表位
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表2C(表2Ai和表2Aii等位基因符号说明)
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所选择的肽可合成制造，制备成药物组合物，并且可作为免疫治疗疫苗施用于受试者，其中病毒表位肽抗原在体内刺激T细胞。另外地或另选地，T细胞可来自受试者，并且在体外用所选择的病毒表位肽抗原刺激。在T细胞充分激活后，将活化T细胞作为免疫疗法施用于受试者。另外地或另选地，抗原呈递细胞(APC)可来自受试者，并且APC在体外与包含病毒表位抗原的肽接触。包含病毒表位抗原的肽可以是更长的肽，包含20-100个氨基酸或更多。较长的肽可包含呈现为多联体的多个表位肽。较长的肽被APC摄取，并以有效的方式加工用于抗原呈递。病毒抗原活化的和病毒抗原呈递的APC可作为个体化免疫疗法施用于受试者，以使APC体内激活T淋巴细胞。另外地或另选地，抗原呈递细胞(APC)可来自受试者，并且APC在体外与包含病毒表位抗原的肽接触；此后，将活化APC与来自受试者的T细胞一起温育以在体外激活T细胞。如此体外活化的受试者T细胞可作为个性化免疫疗法施用于受试者。
在一些实施方案中，本文公开的发明还提供了作为信息文库生成的病毒表位肽和HLA对的大选择，其中病毒表位：基于结合亲和力和呈递预测值(PPV)对HLA对进行分级。
在一些实施方案中，本文公开的发明还提供了包含表位的病毒抗原性肽，这些表位已如上述步骤中所述进行了分析和选择，并且是合成制造的，用于搁置和随后用作用于治疗冠状病毒感染的现成免疫治疗试剂或产品。在一些实施方案中，将所制造的包含表位的肽溶解在包含合适赋形剂的合适溶液中，并且可将其冷冻。在一些实施方案中，可将所制造的肽冻干并储存。在一些实施方案中，所制造的包含表位的肽可以干粉形式储存。在确定了进入受试者的HLA所有组成成分后，其中该受试者需要针对冠状病毒的治疗性疫苗，从搁置的产品中回收一种或多种可结合受试者HLA的病毒抗原性肽，混合到药物组合物中并施用于该有需要的受试者。
在一些实施方案中，可分析病毒基因组以鉴定一个或多个B细胞表位。在一些实施方案中，通过分析病毒基因组鉴定的表位可用于在合适的宿主中产生抗体，该宿主诸如哺乳动物宿主，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、山羊、羔羊。在一些实施方案中，通过分析病毒基因组鉴定的表位可用于通过重组技术产生抗体。
在某些实施方案中，本发明提供了能够以高亲和力结合病毒表位肽的结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、或T细胞受体(TCR)、或嵌合抗原受体(CAR)：人白细胞抗原(HLA)复合体。在一些实施方案中，本发明提供了能够以高亲和力结合衍生自蛋白质细胞外结构域的病毒表位肽的CAR。在某些实施方案中，如本文所述的抗原特异性结合蛋白或TCR或CAR包括具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的变体多肽种类，条件是该结合蛋白保留或基本上保留其特异性结合功能。
在某些实施方案中，病毒表位特异性结合蛋白、TCR或CAR能够(a)不依赖于CD8或在其不存在的情况下特异性结合细胞表面上的抗原：HLA复合体。在某些实施方案中，病毒表位特异性结合蛋白是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体或TCR的抗原结合片段，其中任一种可以是嵌合的、人源化的或人的。在另外的实施方案中，该TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)。
在某些实施方案中，提供了一种组合物，其包含根据上述实施方案中任一项的病毒表位特异性结合蛋白或高亲和力重组TCR以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
例如，用于分离和纯化重组产生的可溶性TCR的方法可包括从分泌重组可溶性TCR至培养基中的合适宿主细胞/载体系统获得上清液，然后浓缩该培养基，例如使用可商业获得的过滤器或浓缩器。在浓缩或过滤之后，在一些实施方案中，浓缩物或滤液可例如通过应用于单一合适的纯化基质或应用于一系列合适的基质诸如亲和基质或离子交换树脂来纯化。另选地或另外地，在一些实施方案中，可使用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当将免疫原从其天然环境中分离时，也可使用此类纯化方法。用于大规模生产一种或多种本文所述的分离/重组可溶性TCR的方法包括分批细胞培养，对其进行监测和控制以维持适当的培养条件。可溶性TCR的纯化可根据本文所述和本领域已知的方法进行。
在一个方面，病毒蛋白可以是来自新型冠状病毒株2019SARS-CoV 2(可在NCBI参考序列NC 045512.2处获得)的蛋白质，诸如表3中所列的蛋白质。
表3.病毒蛋白
蛋白质 长度(AA)
orf1ab多蛋白 7096
orf1a多蛋白 4405
表面糖蛋白(S) 1273
核衣壳磷蛋白(N) 419
ORF3a蛋白 275
膜糖蛋白(M) 222
ORF7a蛋白 121
ORF8蛋白 121
包膜蛋白(E) 75
ORF6蛋白 61
ORF7b 43
ORF10蛋白 38
ORF9b蛋白 97
免疫原性和疫苗组合物
在一个实施方案中，本文提供了一种免疫原性组合物，例如，能够产生病毒表位特异性应答(例如，体液或细胞介导的免疫应答)的疫苗组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含对应于本文鉴定的病毒特异性病毒表位的本文所述的病毒表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)。
本领域技术人员将能够通过测试例如T细胞的体外生成及其效率和总体存在、某些T细胞对某些肽的增殖、亲和力和扩增以及T细胞的功能性，例如通过分析IFN-γ的产生或T细胞的细胞杀伤，来选择病毒表位治疗剂。然后可将最有效的肽组合成免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方案中，选择不同的病毒表位肽和/或多肽，使得一种免疫原性组合物包含能够与不同MHC分子诸如不同MHC I类分子缔合的病毒表位肽和/或多肽。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含能够与最频繁出现的MHC I类分子缔合的病毒表位肽和/或多肽。因此，本文所述的免疫原性组合物包含能够与至少2种、至少3种或至少4种MHC I类或II类分子缔合的不同肽。
在一个实施方案中，本文所述的免疫原性组合物能够产生特异性细胞毒性T细胞应答、特异性辅助T细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物还可包含佐剂和/或载剂。有用的佐剂和载剂的实例在下文中给出。该组合物中的多肽和/或多核苷酸可与载剂缔合，该载剂诸如例如蛋白质或抗原呈递细胞，诸如例如能够将肽呈递给T细胞或B细胞的树突细胞(DC)。在另外的实施方案中，DC结合肽用作载剂以将病毒表位肽和编码病毒表位肽的多核苷酸靶向树突细胞(Sioud等人FASEB J 27：3272-3283(201 3))。
在实施方案中，病毒表位多肽或多核苷酸可作为含有此类多肽或多核苷酸的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)提供。在其他实施方案中，此类抗原呈递细胞用于刺激T细胞以用于患者。
在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在相关的实施方案中，该树突细胞是用未突变的蛋白表位肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该病毒表位肽可以是引起适当的T细胞应答的任何合适的肽。在一些实施方案中，该T细胞是CTL。在一些实施方案中，该T细胞是HTL。
因此，本发明的一个实施方案是含有至少一种抗原呈递细胞(例如，树突细胞)的免疫原性组合物，该至少一种抗原呈递细胞被脉冲或负载有本文所述的一种或多种病毒表位多肽或多核苷酸。在实施方案中，此类APC是自体的(例如，自体树突细胞)。另选地，来自患者的外周血单核细胞(PBMC)可离体负载有病毒表位肽或多核苷酸。在相关的实施方案中，将此类APC或PBMC注射回患者体内。
该多核苷酸可以是能够转导树突细胞，从而导致病毒表位肽的呈递和免疫诱导的任何合适的多核苷酸。在一个实施方案中，该多核苷酸可以是通过被动负载被细胞吸收的裸DNA。在另一个实施方案中，该多核苷酸是递送媒介物例如脂质体、病毒样颗粒、质粒或表达载体的一部分。在另一个实施方案中，该多核苷酸通过无载体递送系统(例如，高性能电穿孔和高速细胞变形)递送。在实施方案中，此类抗原呈递细胞(APC)(例如，树突细胞)或外周血单核细胞(PBMC)用于刺激T细胞(例如，自体T细胞)。在相关的实施方案中，该T细胞是CTL。在其他相关实施方案中，该T细胞是HTL。然后将此类T细胞注射到患者体内。在一些实施方案中，将CTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将HTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将CTL和HTL两者注射到患者体内。任一治疗剂的施用可同时进行或以任何顺序依次进行。
本文所述的用于治疗性治疗的药物组合物(例如，免疫原性组合物)旨在用于胃肠外、局部、经鼻、口服或局部施用。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是肠胃外施用的，例如静脉内、皮下、皮内或肌内。在一些实施方案中，本文描述了用于肠胃外施用的组合物，其包含病毒表位肽的溶液，并且免疫原性组合物溶解或悬浮在可接受的载剂例如水性载剂中。可使用各种水性载剂，例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可通过常规的、熟知的灭菌技术灭菌，或者可无菌过滤。所得水溶液可被包装用于原样使用、或冻干，该冻干制备物在施用前与无菌溶液组合。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本文所述的病毒表位肽和多核苷酸在药物制剂中的浓度可广泛变化，即按重量计从小于约0.1％、通常为或至少约2％至多达20％至50％或更多，并且将根据所选的特定施用模式通过流体体积、粘度等来选择。
本文所述的病毒表位肽和多核苷酸也可通过脂质体施用，其将肽靶向特定的细胞组织，诸如淋巴组织。脂质体也可用于增加肽的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。在这些制备物中，待递送的肽作为脂质体的一部分单独掺入，或与结合例如淋巴样细胞中普遍存在的受体的分子(诸如结合DEC205抗原的单克隆抗体)、或与其他治疗性或免疫原性组合物结合掺入。因此，可将填充有本文所述的期望的肽或多核苷酸的脂质体引导至淋巴样细胞的位点，在那里脂质体然后递送所选择的治疗性/免疫原性多肽/多核苷酸组合物。脂质体可由标准的形成囊泡的脂质形成，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇，例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑例如脂质体大小、血流中脂质体的酸不稳定性和稳定性来指导。有多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9；467(1980)、美国专利4,235,871、4,501,728、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述。
为了靶向免疫细胞，将病毒表位多肽或多核苷酸掺入脂质体中用于期望免疫系统细胞的细胞表面决定簇。含有肽的脂质体悬浮液可静脉内、局部、体表等施用，其剂量尤其根据施用方式、被递送的多肽或多核苷酸和被治疗疾病的阶段而变化。
在一些实施方案中，病毒表位多肽和多核苷酸靶向树突细胞。在一个实施方案中，使用标志物DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、TSLP受体或CD1a将病毒表位多肽和多核苷酸靶向树突细胞。
对于固体组合物，可使用常规或纳米颗粒无毒固体载剂，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，通过掺入任何通常使用的赋形剂(诸如先前列出的那些载剂)和通常10％-95％的活性成分(即一种或多种本文所述的病毒表位多肽或多核苷酸)以25％-75％的浓度形成药学上可接受的无毒组合物。
对于气溶胶施用，病毒表位多肽或多核苷酸可以细分散的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。此类剂的代表是含有6-22个碳原子的脂肪酸，诸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸与脂族多元醇的酯或偏酯或其环酐。可使用混合酯，诸如混合或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物重量的0.1％-20％，或0.25％-5％。组合物的余量可以是推进剂。也可根据需要包含载剂，例如用于鼻内递送的卵磷脂。
用于递送本文所述的病毒表位多核苷酸的其他方法也是本领域已知的。例如，核酸可作为“裸DNA”直接递送。例如，在Wolff等人，Science 247：1465-1468(1990)以及美国专利5,580,859和5,589,466中描述了这种方法。核酸也可使用如美国专利5,204,253中所述的弹道递送来施用。可施用仅由DNA组成的颗粒。另选地，DNA可粘附到颗粒，诸如金颗粒。
出于治疗或免疫目的，也可将编码病毒表位肽或肽结合剂的mRNA施用于患者。在一些实施方案中，编码病毒表位肽或肽结合剂的mRNA可以是合成的脂质纳米颗粒制剂的一部分。在一个实施方案中，mRNA是自扩增RNA。在另外的实施方案中，mRNA，诸如自扩增RNA，是合成的脂质纳米颗粒制剂的一部分(Geall等人，Proc Natl Acad Sci U S A.109：14604-14609(2012))。
核酸也可与阳离子化合物诸如阳离子脂质复合递送。在一些实施方案中，核酸可被包封在脂质纳米颗粒(例如，包含阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂和/或固醇)和/或PEG-脂质)中。脂质介导的基因递送方法描述于以下文献中，例如WO 96/18372、WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques 6(7)：682-691(1988)；美国专利5,279，833；WO 9I/06309；和Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7414(1987)。
本文所述的病毒表位肽和多肽也可由减毒病毒诸如痘苗或禽痘表达。该方法包括使用痘苗病毒作为载体来表达编码本文所述的肽的核苷酸序列。在引入急性或慢性感染宿主或引入未感染宿主后，重组痘苗病毒表达免疫原性肽，并因此引发宿主CTL应答。用于免疫方案的痘苗载体和方法描述于例如美国专利4,722,848中。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等人(Nature 351：456-460(1991))中。根据本文的描述，用于治疗性施用或免疫本文所述的肽的多种其他载体对本领域技术人员将是显而易见的。
佐剂是任何这样的物质，其混入免疫原性组合物中增加或以其他方式改变对治疗剂的免疫应答。载剂是病毒表位多肽或多核苷酸能够与其缔合的支架结构，例如多肽或多糖。任选地，佐剂与本文所述的多肽或多核苷酸共价或非共价缀合。
佐剂增加对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减轻。例如，体液免疫的增加可表现为针对抗原产生的抗体滴度的显著增加，并且T细胞活性的增加可表现为细胞增殖、或细胞毒性、或细胞因子分泌的增加。佐剂也可改变免疫应答，例如通过将主要的体液或T辅助细胞2应答改变为主要的细胞或T辅助细胞1应答。
合适的佐剂是本领域已知的(参见，WO 2015/095811)，包括但不限于多聚(I：C)、多聚I和多聚C、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CPG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1 31 2、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、衍生自皂苷的Aquila的QS21刺激素(Aquila Biotech，Worcester，Mass.，USA)、分枝杆菌提取物和合成的细菌细胞壁模拟物、以及其他专有佐剂诸如Ribi′s Detox.Quil或Superfos.佐剂还包括不完全弗氏佐剂或GM-CSF。先前已描述了几种树突细胞特异性免疫佐剂(例如，MF59)及其制备(Dupuis M等人，Cell Immunol.1998；186(1)：18-27；Allison AC；Dev Biol Stand.1998；92：3-11)(Mosca等人Frontiers inBioscience，2007；12：4050-4060)(Gamvrellis等人Immunol&Cell Biol.2004；82：506-516)。此外，可使用细胞因子。几种细胞因子已直接与影响树突细胞向淋巴组织的迁移(例如，TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-lb、IL-4、IL-6和CD4OL)(美国专利5,849,589，其全文以引用方式并入本文)和用作免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人，J ImmunotherEmphasis TumorImmunol.1996(6)：414-418)有关。
还报告了CpG免疫刺激性寡核苷酸在疫苗环境中增强佐剂的作用。不受理论束缚，CpG寡核苷酸通过经由Toll样受体(TLR)、主要是TLR9激活先天(非适应性)免疫系统而起作用。CpG触发的TLR9激活增强了对多种抗原的抗原特异性体液和细胞应答，这些抗原包括肽或蛋白质抗原、活的或灭活的病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖缀合物。重要的是，它增强树突细胞成熟和分化，导致TH1细胞的增强激活和强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成，甚至在缺乏CD4 T细胞辅助的情况下也是如此。由TLR9刺激诱导的TH1偏倚即使在通常促进TH2偏倚的疫苗佐剂诸如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA)的存在下也能维持。当与其他佐剂一起配制或共同施用或者在诸如微粒、纳米颗粒，脂质乳液或类似制剂的制剂中时，CpG寡核苷酸显示出甚至更大的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这对于诱导强应答是特别必要的。在一些实验中，它们也加速免疫应答，并使得抗原剂量减少，与不含CpG的全剂量疫苗的抗体应答相当(Arthur M.Krieg，Nature Reviews，DrugDiscovery，5，June 2006，471484)。美国专利6,406,705 B1描述了CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原的组合使用以诱导抗原特异性免疫应答。可商购获得的CpGTLR9拮抗剂是由Mologen(Berlin，GERMANY)出售的dSLIM(双茎环免疫调节剂)，其是本文所述的药物组合物的组分。也可使用其他TLR结合分子，诸如RNA结合TLR 7、TLR 8和/或TLR 9。
有用的佐剂的其他实例包括但不限于经化学修饰的CpG(例如CpR，Idera)、多聚(I：C)(例如多聚i：Cl2U)、非CpG细菌DNA或RNA、针对TLR8的ssRNA40、以及免疫活性小分子和抗体，诸如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗(bevacizumab)、塞来昔布(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他达那非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉非尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremilimumab)和SC58175，其可在治疗上和/或作为佐剂起作用。在本发明的上下文中有用的佐剂和添加剂的量和浓度可由本领域技术人员容易地确定而无需过度实验。其他佐剂包括集落刺激因子，诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF、沙格司亭)。
在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物可包含多于一种不同的佐剂。此外，本发明涵盖包含任何佐剂物质的治疗组合物，该佐剂物质包括任何上述物质或它们的组合。还设想病毒表位治疗剂可引发或促进免疫应答(例如，体液或细胞介导的免疫应答)。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含病毒表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)，并且佐剂可以任何适当的顺序分开施用。
载剂可独立于佐剂存在。载剂的功能可以是例如增加特别是突变体的分子量以便增加它们的活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，载剂可帮助将肽呈递至T细胞。载剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的载剂，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载剂蛋白可以是但不限于匙孔血蓝蛋白、血清蛋白诸如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素诸如胰岛素或棕榈酸。在一个实施方案中，载剂包含人纤连蛋白III型结构域(Koide等人Methods Enzymol.2012；503：135-56)。对于人的免疫，载剂必须是人可接受的和安全的生理上可接受的载剂。然而，在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载剂。另选地，载剂可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
在一些实施方案中，作为将多肽与载剂偶联以增加免疫原性的另选方案，可将多肽合成为多重连接的肽。此类分子也被称为多抗原性肽(MAPS)。
在一个方面，本文提供的方法包括分离和/或表征一种或多种冠状病毒抗原性肽或编码表征一种或多种冠状病毒抗原性肽的核酸，其中预测这些冠状病毒抗原性肽与受试者中表达的一种或多种HLA编码的MHC I类或MHC II类分子结合，其中该受试者需要冠状病毒免疫疗法，诸如其冠状病毒疫苗。在一些实施方案中，该方法包括：(a)使用机器学习HLA肽呈递预测模型处理多个候选肽序列的氨基酸信息以生成多个呈递预测，其中该多个候选肽序列中的每个候选肽序列由冠状病毒的基因组或外显子组编码，其中该多个呈递预测包括用于该多个候选病毒肽序列中的每个候选病毒肽序列的HLA呈递预测，其中每个HLA呈递预测指示由该受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质能够呈递该多个候选病毒肽序列中的给定候选病毒肽序列的可能性，其中该机器学习HLA肽呈递预测模型使用训练数据来训练，该训练数据包括通过质谱法鉴定为由在训练细胞中表达的HLA蛋白呈递的训练肽的序列的序列信息；以及(b)至少基于该多个呈递预测，将该多个肽序列中的病毒肽序列鉴定为由该受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质中的至少一种蛋白质呈递；其中该机器学习HLA肽呈递预测模型具有根据呈递阳性预测值(PPV)确定方法的至少0.07的PPV。
本文提供了一种方法，其包括：(a)使用机器学习HLA肽结合预测模型处理由冠状病毒的基因组或外显子组编码的多个肽序列的氨基酸信息以生成多个结合预测，其中该多个结合预测包括用于该多个候选肽序列中的每个候选肽序列的HLA结合预测，每个结合预测指示由该受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质结合该多个候选肽序列中的给定候选肽序列的可能性，其中该机器学习HLA肽结合预测模型使用训练数据来训练，该训练数据包括被鉴定为结合HLA II类蛋白或HLA II类蛋白类似物的肽的序列的序列信息；以及(b)至少基于该多个结合预测，鉴定该多个肽序列中与该受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的该一种或多种蛋白中的至少一种蛋白质结合的概率大于结合预测概率阈值的肽序列；其中该机器学习HLA肽结合预测模型具有根据结合阳性预测值(PPV)确定方法的至少0.1的PPV。
在一些实施方案中，该机器学习HLA肽呈递预测模型使用训练数据来训练，该训练数据包括通过质谱法鉴定为由在训练细胞中表达的HLA蛋白呈递的训练肽的序列的序列信息。
在一些实施方案中，该方法包括基于呈递预测，对被鉴定为由受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质中的至少一种蛋白质呈递的至少两种肽进行分级。
在一些实施方案中，该方法包括选择该两种或更多种分级肽中的一种或多种肽。
在一些实施方案中，该方法包括选择该多种肽中被鉴定为由受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质中的至少一种蛋白质呈递的一种或多种肽。
在一些实施方案中，该方法包括选择基于呈递预测分级的两种或更多种肽中的一种或多种肽。
在一些实施方案中，当处理多个测试肽序列的氨基酸信息以生成多个测试呈递预测时，该机器学习HLA肽呈递预测模型具有至少0.07的阳性预测值(PPV)，每个测试呈递预测指示由受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质可呈递该多个测试肽序列中的给定测试肽序列的可能性，其中该多个测试肽序列包含至少500个测试肽序列，这些测试肽序列包含(i)至少一个通过质谱法鉴定为由细胞中表达的HLA蛋白呈递的命中肽序列和(ii)至少499个包含在由生物体的基因组编码的蛋白质内的诱饵肽序列，其中该生物体和该受试者是相同物种，其中该多个测试肽序列包含该至少一个命中肽序列与该至少499个诱饵肽序列的1：499的比率，并且通过该机器学习HLA肽呈递预测模型预测最高百分比的该多个测试肽序列将由在细胞中表达的该HLA蛋白呈递。
在一些实施方案中，当处理多个测试肽序列的氨基酸信息以生成多个测试结合预测时，该机器学习HLA肽呈递预测模型具有至少0.1的阳性预测值(PPV)，每个测试结合预测指示由受试者的细胞的II类HLA等位基因编码的一种或多种蛋白质结合该多个测试肽序列中的给定测试肽序列的可能性，其中该多个测试肽序列包含至少20个测试肽序列，这些测试肽序列包含(i)至少一个通过质谱法鉴定为由在细胞中表达的HLA蛋白呈递的命中肽序列和(ii)至少19个包含在蛋白质内的诱饵肽序列，该蛋白质包含通过质谱法鉴定为由在细胞中表达的HLA蛋白呈递的至少一个肽序列，诸如在细胞(例如，单等位基因细胞)中表达的单个HLA蛋白，其中该多个测试肽序列包含该至少一个命中肽序列与该至少19个诱饵肽序列的1：19的比率，并且通过该机器学习HLA肽呈递预测模型预测最高百分比的该多个测试肽序列将结合细胞中表达的该HLA蛋白。
在一些实施方案中，在该至少一个命中肽序列与这些诱饵肽序列之间不存在氨基酸序列重叠。
CTL肽和HTL肽的组合
具有免疫刺激活性的包含本文所述的病毒表位多肽和多核苷酸或其类似物的免疫原性或疫苗组合物可被修饰以提供期望的属性，诸如改善的血清半衰期，或以增强免疫原性。
例如，通过将肽与含有至少一个能够诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接，可增强病毒表位肽诱导CTL活性的能力。在一个实施方案中，CTL表位/HTL表位缀合物通过间隔子分子连接。间隔子通常由在生理条件下基本不带电荷的相对小的中性分子诸如氨基酸或氨基酸模拟物组成。间隔子通常选自例如Ala、Gly、或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔子。应当理解，任选存在的间隔子不必由相同的残基组成，并且因此可以是杂低聚物或同低聚物。当存在时，间隔子将通常为至少一个或两个残基，更通常为三至六个残基。另选地，CTL肽可在没有间隔子的情况下与T辅助肽连接。
尽管CTL肽表位可以直接与T辅助肽表位连接，但CTL表位/HTL表位缀合物可通过间隔子分子连接。间隔子通常由在生理条件下基本不带电荷的相对小的中性分子诸如氨基酸或氨基酸模拟物组成。间隔子通常选自例如A1a、Gly、或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔子。应当理解，任选存在的间隔子不必由相同的残基组成，并且因此可以是杂低聚物或同低聚物。当存在时，间隔子将通常为至少一个或两个残基，更通常为三至六个残基。CTL肽表位可直接或通过CTL肽的氨基或羧基末端的间隔子与T辅助肽表位连接。免疫原性肽或T辅助肽的氨基末端可被酰化。
HTL肽表位也可被修饰以改变其生物特性。例如，包含HTL表位的肽可含有D-氨基酸以增加它们对蛋白酶的抗性，并因此延长它们的血清半衰期。此外，表位肽可与其他分子诸如脂质、蛋白质或糖或任何其他合成化合物缀合，以增加它们的生物活性。例如，T辅助肽可在氨基或羧基末端与一个或多个棕榈酸链缀合。
在某些实施方案中，T辅助肽是被大多数群体中存在的T辅助细胞识别的肽。这可通过选择与许多、大多数或所有HLA II类分子结合的氨基酸序列来实现。这些被称为“松散HLA限制的”或“混杂的”T辅助序列。混杂的氨基酸序列的实例包括来自抗原的序列，诸如在830-843位的破伤风类毒素(QYIKANSKFIGITE)、在378-398位的恶性疟原虫CS蛋白(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)和在116位的链球菌18kD蛋白(GAVDSILGGVATYGAA)。其他实例包括带有DR 1-4-7超基序、或DR3基序之一的肽。
另选地，可使用自然界中未发现的氨基酸序列以松散HLA限制的方式制备能够刺激T辅助淋巴细胞的合成肽(参见例如PCT公开WO95/07707)。这些被称为Pan-DR结合表位的合成化合物(例如PADRE，Epimmune，Inc.，San Diego，CA)被设计成结合大多数HLA-DR(人HLA II类)分子。例如，具有下式的泛DR结合表位肽：aKXVWANTLKAAa，其中“X”是环己基丙氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，并且a是D-丙氨酸或L-丙氨酸，已被发现结合大多数HLA-DR等位基因，并刺激大多数个体的T辅助淋巴细胞的应答，而与其HLA类型无关。泛DR结合表位的另选物包括所有的“L”天然氨基酸，并且可以编码该表位的核酸的形式提供。
在一些实施方案中，可能期望在药物组合物(例如，免疫原性组合物)中的病毒表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)中包括至少一种引发细胞毒性T淋巴细胞的组分。脂质已被鉴定为能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的剂。例如，棕榈酸残基可附接到赖氨酸残基的c-和a-氨基基团，然后例如经由一个或多个连接残基诸如Gly、Gly-Gly-、Ser-Ser等连接到免疫原性病毒表位肽。然后，脂质化的肽可直接以胶束或颗粒形式施用，掺入脂质体中，或在佐剂中乳化。在一个实施方案中，特别有效的免疫原性构建体包含附接到Lys的c-和a-氨基基团的棕榈酸，该Lys经由键例如Ser-Ser连接到免疫原性肽的氨基末端。
作为CTL应答的脂质引发的另一个实例，当与适当的肽共价附接时，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)可用于引发病毒特异性CTL。(参见例如，Deres等人，Nature 342：561，1989)。本文所述的病毒表位肽可与例如P3CSS偶联，并将脂肽施用于个体以特异性地引发针对靶抗原的CTL应答。此外，由于中和抗体的诱导也可用P3CSS-缀合的表位引发，所以可将两种此类组合物组合以更有效地引发对感染的体液和细胞介导的应答。
如本文所述，可将附加的氨基酸添加到病毒表位肽的末端，以便于将肽彼此连接，用于偶联到载剂支持物或更大的肽，用于修饰肽或寡肽的物理或化学特性等。可在肽或寡肽的C-或N末端引入氨基酸诸如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等。然而，应注意在T细胞表位的羧基末端的修饰在一些情况下可改变肽的结合特性。此外，肽或寡肽序列可通过末端-NH2酰化，例如通过烷酰基(C1-C20)或巯基乙酰基乙酰化、末端-羧基酰胺化，例如氨、甲胺等修饰而不同于天然序列。在一些情况下，这些修饰可提供用于连接到支持物或其他分子的位点。
本文所述免疫原性组合物的实施方案包括将带有表位的病毒表位多肽或多核苷酸的混合物离体施用于来自患者血液的PBMC或来自其的DC。可使用促进树突细胞(DC)收获的药物，包括GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-1b和TNFa。在用肽或编码肽的多核苷酸脉冲DC后，并且在再输注到患者体内之前，洗涤DC以去除未结合的肽。在该实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含肽脉冲的DC，其表面上呈递与HLA分子复合的脉冲肽表位。然后将组合物施用于患者。在其他实施方案中，此类脉冲的DC用于刺激适用于T细胞疗法的T细胞。
多表位免疫原性组合物
许多不同的方法是可用的，其允许同时递送多个表位。编码本文所述的病毒表位肽的核酸是本发明特别有用的实施方案。在一个实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，编码包含一个或多个本文所述的表位的病毒表位肽的小基因构建体可用于施用编码本文所述的病毒表位肽的核酸。在一些实施方案中，施用编码包含一个或多个本文所述的表位的病毒表位肽的RNA构建体(例如，mRNA构建体)。
多表位小基因的示例性用途在以下文献中有所描述：An，L.和Whitton，J.L.，J.Virol.71：2292，1997；Thomson，S.A.等人，J.Immunol.157：822，1996；Whitton，J.L.等人，J.Virol67：348，1993；Hanke，R.等人，Vaccine 16：426，1998。例如，可对编码带有超基序和/或基序的抗原性肽、通用辅助T细胞表位(或多种病毒抗原HTL表位)和内质网易位信号序列的多表位DNA质粒进行工程化。
可在转基因小鼠中测试多表位小基因的免疫原性，以评价针对所测试表位诱导的免疫应答的量级。此外，DNA编码的表位在体内的免疫原性可与特异性CTL系针对用DNA质粒转染的靶细胞的体外应答相关。因此，这些实验可显示小基因同时用于：1).生成细胞介导的应答和/或体液应答和2).诱导的免疫细胞识别表达编码的表位的细胞。
例如，为了产生编码用于在人细胞中表达的所选择的病毒表位(小基因)的DNA序列，可反向翻译表位的氨基酸序列。人密码子使用表可用于指导每种氨基酸的密码子选择。这些编码病毒表位的DNA序列可直接邻接，以便在翻译时产生连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，可将附加的元件掺入到小基因设计中。可反向翻译并包括在小基因序列中的氨基酸序列的实例包括：HLA I类表位、HLA II类表位、泛素化信号序列和/或内质网靶向信号。此外，CTL和HTL表位的HLA呈递可通过包括与CTL或HTL表位相邻的合成(例如聚丙氨酸)或天然存在的侧翼序列来改善；这些包含表位的较大肽在本发明的范围内。
小基因序列可通过组装编码小基因的正链和负链的寡核苷酸而转化为DNA。重叠寡核苷酸(30-100个碱基长)可使用熟知的技术在适当的条件下合成、磷酸化、纯化和退火。寡核苷酸的末端可例如使用T4 DNA连接酶连接。然后可将编码表位多肽的这种合成的小基因克隆到期望的表达载体中。
本领域技术人员熟知的标准调节序列可被包括在载体中以确保在靶细胞中表达。例如，具有用于小基因插入的下游克隆位点的启动子；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；和大肠杆菌选择性标志物(例如氨苄西林或卡那霉素抗性)。许多启动子可用于该目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其他合适的启动子序列参见例如美国专利5，580，859和5，589，466。
附加的载体修饰可用于优化小基因表达和免疫原性。在一些情况下，内含子用于有效的基因表达，并且一个或多个合成的或天然存在的内含子可掺入到小基因的转录区中。还可考虑包含mRNA稳定序列和用于在哺乳动物细胞中复制的序列以增加小基因表达。
一旦选择了表达载体，就可将小基因克隆到启动子下游的多接头区域中。将该质粒转化到适当的大肠杆菌株中，并使用标准技术制备DNA。小基因的取向和DNA序列，以及载体中包含的所有其他元件，可使用限制性图谱和DNA序列分析来确认。携带正确质粒的细菌细胞可作为主细胞库和工作细胞库储存。
此外，免疫调节序列似乎在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果需要增强免疫原性，这些序列可被包括在载体中，在小基因编码序列之外。在一个实施方案中，这些序列是免疫刺激性的。在另一个实施方案中，这些序列是ISS或CpG。
在一些实施方案中，可使用双顺反子表达载体，其允许产生小基因编码的表位和第二蛋白质(包括在内以增强或降低免疫原性)两者。如果共表达，可有益地增强免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括细胞因子(例如，IL-2、IL-12、GM-CSF)、细胞因子诱导分子(例如，LeIF)、共刺激分子或泛DR结合蛋白(对于HTL应答)。辅助(HTL)表位可与细胞内靶向信号连接，并与所表达的CTL表位分开表达；这允许HTL表位指向与CTL表位不同的细胞区室。如果需要，这可促进HTL表位更有效地进入HLA II类途径，从而改善HTL诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-(3)而特异性降低免疫应答在某些疾病中可能是有益的。
治疗量的质粒DNA可通过例如在大肠杆菌中发酵，随后纯化来生产。使用来自工作细胞库的等分试样来接种生长培养基，并且根据熟知的技术在摇瓶或生物反应器中生长至饱和。质粒DNA可使用标准的生物分离技术纯化，诸如QIAGEN，Inc.(Valencia，California)提供的固相阴离子交换树脂。如果需要，超螺旋DNA可使用凝胶电泳或其他方法从开放的环状和线性形式获得。
可使用多种制剂制备用于注射的纯化的质粒DNA。其中最简单的方法是在无菌磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中复溶冻干的DNA。这种方法，称为“裸DNA”，目前在临床试验中用于肌内(IM)施用。为了使小基因DNA疫苗的免疫治疗效果最大化，可使用配制纯化的质粒DNA的另选方法。已描述了多种方法，并且新技术可变得可用。阳离子脂质也可用于制剂中(参见例如，如WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques 6(7)：682(1988)；美国专利5,279,833；WO 9I/06309；和Felgner等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 84：7413(1987)中所述。此外，糖脂、融合脂质体、肽和统称为保护性、相互作用性、非缩合化合物(PINC)的化合物也可与纯化的质粒DNA复合，以影响变量诸如稳定性、肌内分散或运输至特定器官或细胞类型。
在另一个实施方案中，通过使用高速细胞变形将核酸引入细胞。在高速变形期间，细胞被挤压，使得细胞膜中发生暂时性破坏，从而允许核酸进入细胞。另选地，蛋白质可由表达载体产生-例如在细菌表达载体中，然后可将蛋白质递送至细胞。
靶细胞致敏可用作小基因编码的CTL表位的表达和HLA I类呈递的功能测定。例如，将质粒DNA引入适合作为标准CTL铬释放测定的靶标的哺乳动物细胞系中。所用的转染方法将取决于最终制剂。电穿孔可用于“裸”DNA，而阳离子脂质允许直接体外转染。可将表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒共转染，以允许使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集转染的细胞。然后将这些细胞用铬-51(51-Cr)标记并用作表位特异性CTL系的靶细胞；通过51Cr释放检测的细胞溶解表明小基因编码的CTL表位的产生和HLA呈递两者。HTL表位的表达可使用评估HTL活性的测定以类似的方式评价。
体内免疫原性是小基因DNA制剂功能测试的第二种方法。用该DNA产物免疫表达适当的人HLA蛋白的转基因小鼠。施用的剂量和途径是制剂依赖性的(例如，对于PBS中的DNA为IM，对于脂质复合的DNA为腹膜内(IP))。示例性方案是免疫后二十一天，收获脾细胞，并在编码所测试的每个表位的肽的存在下再刺激1周。此后，对于CTL效应细胞，使用标准技术对负载肽的51Cr标记的靶细胞进行细胞溶解测定。被负载有对应于小基因编码表位的肽表位的HLA致敏的靶细胞的裂解证明了DNA疫苗在体内诱导CTL的功能。以类似的方式在转基因小鼠中评价HTL表位的免疫原性。
另选地，核酸可使用如例如美国专利5,204,253中所述的弹道递送来施用。使用该技术，施用仅由DNA组成的颗粒。在另一个另选的实施方案中，DNA可粘附到颗粒，诸如金颗粒。
细胞
在一个方面，本发明还提供了表达激活免疫应答细胞的病毒表位识别受体(例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的细胞，以及使用此类细胞治疗需要增强的免疫应答的疾病的方法。
此类细胞包括表达结合本文所述的病毒表位肽之一的抗原识别受体(例如，TCR或CAR)的经遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞、辅助T淋巴细胞(HTL)细胞)，以及使用其治疗其中需要增加抗原特异性免疫应答的瘤形成和其他病理的方法。T细胞激活由靶向抗原的TCR或CAR介导。
本发明提供了表达激活免疫应答细胞的抗原识别受体(例如TCR、CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)的组合的细胞，以及使用此类细胞治疗需要增强的免疫应答的疾病的方法。在一个实施方案中，病毒抗原特异性T细胞、NK细胞、CTL细胞或其他免疫应答细胞用作穿梭剂，用于选择性富集一种或多种共刺激配体以治疗或预防瘤形成。将此类细胞施用于有需要的人类受试者以治疗或预防特定的病毒感染。
在一个实施方案中，可用于本发明方法中的病毒抗原特异性人淋巴细胞包括但不限于经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain，M.等人，2003Nat Rev Cancer 3：35-45)、经遗传修饰以表达包含a和p异二聚体的全长病毒抗原识别T细胞受体复合体的外周供体淋巴细胞(Morgan，R.A.等人2006Science314：126-129)以及采用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突细胞的选择性体外扩增的抗原特异性外周血白细胞(Dupont，J.等人2005Cancer Res 65：5417-5427；Papanicolaou，G.A.等人2003Blood102：2498-2505)。T细胞可以是自体的、同种异体的或体外衍生自工程化祖细胞或干细胞。
共刺激配体
在一个实施方案中，本发明的细胞提供有至少一种共刺激配体，其是对于免疫细胞的完全激活重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)配体、细胞因子(例如IL-2、IL-12、1L-15或IL21)和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。肿瘤坏死因子(TNF)是一种涉及全身性炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用是调节免疫细胞。肿瘤坏死因子(TNF)配体共享多个共同特征。大多数配体被合成为含有短胞质片段和相对长的细胞外区域的II型跨膜蛋白。TNF配体包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD4OL(CD4OL)/CD154、CD137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFa)、CD134L/OX4OL/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD3OL/CD153、肿瘤坏死因子f3(TNF(3)/淋巴毒素-α(LTa)、淋巴毒素-β(ur(3)、CD257/B细胞-激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Ta11-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF-相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是涉及细胞的识别、结合或粘附过程的一大组细胞表面和可溶性蛋白质。这些蛋白质与免疫球蛋白共享结构特征，它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80和CD86，两者都是CD28的配体。
包含本发明的经遗传修饰的免疫应答细胞的组合物可全身或直接提供给受试者用于治疗瘤形成。在一个实施方案中，将本发明的细胞直接注射到目标器官中。另选地，将包含经遗传修饰的免疫应答细胞的组合物间接提供给目标器官，例如通过施用到循环系统中。可在施用细胞之前、期间或之后提供扩增和分化剂，以增加T细胞、NK细胞或CTL细胞在体外或体内的产生。
经修饰的细胞可在任何生理学上可接受的媒介物中施用，通常是在血管内施用，尽管它们也可被引入到骨或其他方便的位点，在那里细胞可找到用于再生和分化的适当位点(例如胸腺)。经修饰的细胞可以是自体的或同种异体的。本发明的经遗传修饰的免疫应答细胞可包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可使用各种熟知的方法诸如荧光激活细胞分选术(FACS)容易地确定群体中经遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。本领域技术人员可容易地调节剂量(例如，纯度的降低可能需要增加剂量)。细胞可通过注射、导管等引入。如果需要，也可包括因子，包括但不限于白介素，例如IL-2、IL-3、IL-6和IL-11，以及其他白介素，集落刺激因子诸如G-、M-和GM-CSF，干扰素，例如干扰素γ，以及促红细胞生成素。
本发明的组合物包括含有经遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物。施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可从一个受试者获得，并施用于相同的受试者或不同的相容的受试者。本发明的外周血来源的免疫应答细胞或它们的后代(例如，体内、离体或体外来源的)可经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有经遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
使用方法和药物组合物
本文所述的病毒表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，诸如治疗或预防病毒感染。在一些实施方案中，该治疗性治疗方法包括免疫疗法。在某些实施方案中，病毒表位肽可用于激活、促进、增加和/或增强免疫应答或将现有的免疫应答重新引导至新的靶标。使用的方法可以是体外、离体或体内方法。
在一些方面，本发明提供了使用本文所述的病毒表位治疗剂激活受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的病毒表位治疗剂促进受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的病毒表位肽增加受试者中的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用病毒表位肽增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性或体液免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL或HTL活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低Treg的抑制活性。在一些实施方案中，免疫应答是抗原刺激的结果。
在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的病毒表位治疗剂激活、促进、增加和/或增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的病毒表位治疗剂，其将病毒表位多肽或多核苷酸递送至细胞。在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被细胞内化的病毒表位，并且该病毒表位肽被细胞加工。在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的病毒表位多肽，该病毒表位多肽被细胞内化，并且抗原性肽被呈递在该细胞的表面上。在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的病毒表位多肽，该病毒表位多肽被细胞内化、被细胞加工，并且抗原性肽被呈递在该细胞的表面上。
在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位多肽或多核苷酸，其将包含至少一种抗原性肽的外源多肽递送至细胞，其中该抗原性肽被呈递在该细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原性肽以与MHC I类分子复合的形式呈递在细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原性肽以与MHC II类分子复合的形式呈递在细胞的表面上。
在一些实施方案中，一种方法包括使细胞与本文所述的病毒表位多肽或多核苷酸接触，其将包含至少一种抗原性肽的外源多肽递送至细胞，其中该抗原性肽被呈递在细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原性肽以与MHC I类分子复合的形式呈递在细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原性肽以与MHC II类分子复合的形式呈递在细胞的表面上。
在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位多肽或多核苷酸，其将包含至少一种抗原性肽的外源多肽递送至细胞，其中该抗原性肽被呈递在细胞的表面上，并且诱导针对该细胞的免疫应答。在一些实施方案中，针对细胞的免疫应答增加。在一些实施方案中，该病毒表位多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原性肽的外源多肽递送至细胞，其中该抗原性肽被呈递在细胞的表面上。
在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位多肽或多核苷酸，其将包含至少一种抗原性肽的外源多肽递送至细胞，其中该抗原性肽被呈递在细胞的表面上，并且诱导针对该细胞的T细胞杀伤。在一些实施方案中，针对细胞的T细胞杀伤增强。在一些实施方案中，针对细胞的T细胞杀伤增加。
在一些实施方案中，一种增加受试者中的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂，其中该剂是特异性结合本文所述的病毒表位的抗体。在一些实施方案中，一种增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体。
本发明提供了诱导或促进或增强对病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，一种诱导或促进或增强对病毒的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂。在一些实施方案中，免疫应答是针对病毒的。在优选的实施方案中，现有的免疫应答是针对冠状病毒的。在优选的实施方案中，现有的免疫应答是针对COVID19的。在一些实施方案中，该病毒选自由以下项组成的组：麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)。在一些实施方案中，该病毒是水痘-带状疱疹病毒。在一些实施方案中，该病毒是巨细胞病毒。在一些实施方案中，该病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，免疫应答是在天然病毒感染后获得的。在一些实施方案中，免疫应答是在针对病毒的接种后获得的。在一些实施方案中，免疫应答是细胞介导的应答。在一些实施方案中，现有的免疫应答包括细胞毒性T细胞(CTL)或HTL。
在一些实施方案中，一种诱导或促进或增强受试者中对病毒的免疫应答的方法包括施用融合蛋白，该融合蛋白包含(i)特异性结合病毒表位的抗体和(ii)至少一种本文所述的病毒表位肽，其中(a)该融合蛋白在结合该病毒抗原后被细胞内化；(b)病毒表位肽被加工并呈递在与MHC I类分子相关的细胞表面上；和(c)病毒表位肽/MHC I类复合体被细胞毒性T细胞识别。在一些实施方案中，该细胞毒性T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，该记忆T细胞是用病毒表位肽接种的结果。
本发明提供了增加病毒免疫原性的方法。在一些实施方案中，一种增加病毒免疫原性的方法包括使感染病毒细胞与有效量的本文所述的病毒表位治疗剂接触。在一些实施方案中，一种增加病毒免疫原性的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂。在某些实施方案中，该受试者是人。
在一些实施方案中，一种方法可包括通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂来治疗或预防有需要的受试者中的癌症。在一些实施方案中，该癌症是液体癌，诸如淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，该癌症是实体瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是选自由以下项组成的组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤、头颈肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中病毒感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂。
在一些实施方案中，一种治疗或预防病毒感染的方法包括将现有的免疫应答重新引导至新的靶标，该方法包括向受试者施用治疗有效量的病毒表位治疗剂，其中该现有的免疫应答是针对由病毒表位肽递送至细胞或用病毒感染的细胞的抗原性肽。
本发明提供了用于治疗或预防病毒感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的病毒表位治疗剂(例如，需要治疗的受试者)。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有冠状病毒感染或处于冠状病毒感染的风险中。
在某些实施方案中，除了施用本文所述的病毒表位治疗剂之外，该方法或治疗还包括施用至少一种附加的治疗剂。附加的治疗剂可在施用该剂之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，该至少一种附加的治疗剂包括1、2、3或更多种附加的治疗剂。
在一些实施方案中，该病毒表位治疗剂可与选自由以下项组成的组的生物分子组合施用：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF TNF-α、VEGF、P1GF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在某些实施方案中，治疗涉及与附加的疗法组合施用本文所述的病毒表位治疗剂。在某些实施方案中，该附加的疗法是针对另一种病毒例如流感的疗法。病毒的示例性疗法包括但不限于奥司他韦(oseltamivir)、磷酸奥司他韦(作为通用形式或以商品名获得)、扎那米韦(zanamivir)(商品名/>)、帕拉米韦(peramivir)(商品名/>)、巴洛沙韦玛波西酯(baloxavir marboxil)(商品名/>)、金刚烷胺(amantadine)、吗啉胍(moroxydine)、金刚乙胺(rimantadine)、乌米诺韦(umifovir)(商品名/>)和扎那米韦(商品名/>)。
用剂治疗可在施用附加的疗法之前、同时或之后进行。此类附加疗法的给药方案可以由熟练的执业医师确定。
组合施用可包括在单一药物制剂中或使用分开的制剂共同施用，或以任一顺序但通常在一段时间内连续施用，使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
应当理解，本文所述的病毒表位治疗剂和至少一种附加的治疗剂的组合可以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将该剂施用于先前已经历用第二治疗剂治疗的患者。在某些其他实施方案中，该病毒表位治疗剂和第二治疗剂将基本上同时或并行施用。例如，受试者可在经历用第二治疗剂(例如，化学疗法)的疗程时被给予剂。在某些实施方案中，病毒表位治疗剂将在用第二治疗剂治疗的1年内施用。还应当理解，两种(或多种)剂或治疗可在数小时或数分钟内(即基本上同时)施用于受试者。
对于疾病的治疗，本文所述的病毒表位治疗剂的适当剂量取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的响应性、是否出于治疗或预防目的施用剂、先前疗法、患者的临床史等，所有这些均由治疗医师判断。该病毒表位治疗剂可施用一次或在持续数天至数月的一系列治疗中施用，或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻。最佳给药方案可从患者体内药物累积的测量值计算，并且将根据单独剂的相对效力而变化。施用医师可确定最佳剂量、给药方法和重复率。
在一些实施方案中，病毒表位治疗剂可以初始较高“负载”剂量施用，随后是一个或多个较低剂量。在一些实施方案中，施用频率也可改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，随后是每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次的附加剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负载剂量，随后是例如初始剂量一半的每周维持剂量。或者，给药方案可包括施用初始负载剂量，随后是例如每隔一周初始剂量一半的维持剂量。或者，给药方案可包括施用3周的三个初始剂量，随后是例如每隔一周相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知的，施用任何治疗剂可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性如此严重以致于妨碍以治疗有效剂量施用特定剂。在一些情况下，必须中断疗法，并且可尝试其他剂。然而，在相同治疗类别中的许多剂显示出类似的副作用和/或毒性，意味着患者必须停止疗法，或者如果可能，遭受与治疗剂相关的令人不快的副作用。
在一些实施方案中，该给药方案可限于特定的施用次数或“周期”。在一些实施方案中，该剂施用3、4、5、6、7、8或更多个周期。例如，在6个周期内每2周施用该剂，在6个周期内每3周施用该剂，在4个周期内每2周施用该剂，在4个周期内每3周施用该剂，等等。给药方案可由本领域技术人员决定并随后修改。
本发明提供了向受试者施用本文所述的病毒表位治疗剂的方法，其包括使用间歇给药策略施用一种或多种剂，该间歇给药策略可减少与施用剂、化疗剂等相关联的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗或预防人类受试者中病毒感染的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的病毒表位治疗剂与治疗有效剂量的另一种治疗剂诸如抗病毒剂的组合，其中这些剂中的一者或两者根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，用于治疗或预防人类受试者中病毒感染的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的病毒表位治疗剂与治疗有效剂量的第二病毒表位治疗剂的组合，其中这些剂中的一者或两者根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的病毒表位治疗剂，以及约每2周一次施用后续剂量的该剂。在一些实施方案中，间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的病毒表位治疗剂，以及约每3周一次施用后续剂量的该剂。在一些实施方案中，间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的病毒表位治疗剂，以及约每4周一次施用后续剂量的该剂。在一些实施方案中，使用间歇给药策略施用该剂并且每周施用该另外的治疗剂。
本发明提供了包含本文所述的病毒表位治疗剂的组合物。本发明还提供了包含本文所述的病毒表位治疗剂和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物用于免疫疗法。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制病毒复制。在一些实施方案中，该药物组合物可用于抑制受试者(例如，人类患者)中的病毒复制。
通过将本发明的抗原治疗剂与药学上可接受的媒介物(例如，载剂或赋形剂)组合来制备用于储存和使用的制剂。本领域技术人员通常认为药学上可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。示例性制剂列于WO 2015/095811中。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物，诸如Zn-蛋白质络合物；和非离子表面活性剂，诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第22版，2012，Pharmaceutical Press，London.)。在一个实施方案中，媒介物是5％右旋糖的水溶液。
本文所述的药物组合物可以用于局部或全身治疗的许多方式施用。施用可以是通过表皮或透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气溶胶的肺部施用，包括通过喷雾器、气管内和鼻内；口服施用；或肠胃外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或心室内)。
该治疗制剂可以是单位剂型。此类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒剂、在水或非水介质中的溶液或悬浮液、或栓剂
本文所述的病毒表位肽也可包埋在微胶囊中。此类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，2012，Pharmaceutical Press，London中所述。
在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本文所述的病毒表位治疗剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物进行反相蒸发来生成。脂质体可通过限定孔径的过滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。
在某些实施方案中，可产生包含本文所述的病毒表位肽的持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有剂的固体疏水性聚合物的半渗透基质，其中该基质是成形制品(例如，膜或微胶囊)的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
串构建体设计和疫苗组合物
在一个方面，本文提供了用于增长、诱导、促进、增强或改善针对2019 SARS CoV-2病毒的免疫应答的组合物和方法。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法被设计为增加、诱导、促进、增强或改善针对2019 SARS CoV-2病毒的免疫记忆。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法被设计为充当对初级疫苗的免疫加强，该初级疫苗诸如针对2019SARS CoV-2病毒的刺突蛋白的疫苗。在一个实施方案中，该组合物包含一种或多种编码一种或多种SARS COV-2表位的多核苷酸构建体(本文中称为“串”)。本文设想了编码链和非编码链两者。在一些实施方案中，该串是指编码串联的多个SARS COV-2表位的多核苷酸链。在一些实施方案中，在一个串中编码约2至约100、约2至约1000或约2至约10,000个表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约2-5000个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约2-4000个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约2-3000个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约2-2000个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约2-1000个SARSCOV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约10-500个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约10-200个SARS COV-2表位。在一些实施方案中，在一个多核苷酸串中编码约20-100个SARS COV-2表位。
在一些实施方案中，由串构建体编码的SARS COV-2表位包括由HLA结合和呈递预测软件预测为很可能由HLA编码的蛋白质呈递至T细胞以引发免疫应答的表位。在一些实施方案中，预测具有由HLA编码的蛋白质呈递的高可能性的由串构建体编码的SARS COV-2表位选自表1-表12、表14A、表14B和表15中描述的蛋白质或肽中的任一者。在一些实施方案中，由串构建体编码的SARS CoV-2表位包含预测具有由HLA编码的蛋白质呈递的高可能性的表位，并且该表位选自表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B和/或表15中描述的蛋白质中的任一者。在一些实施方案中，串构建体中的表位包含核衣壳表位。
在一些实施方案中，串构建体中的表位包含刺突(S)表位。在一些实施方案中，串构建体中的表位包含膜蛋白表位。在一些实施方案中，串构建体中的表位包含NSP 1、NSP2、NSP3或NSP 4表位。在一些实施方案中，该串构建体包含来自病毒中2、3、4或更多种蛋白的大量表位。在一些实施方案中，该串构建体包括表9-表12和表15中描述的特征。在一些实施方案中，该串构建体包含如SEQ ID RSCln、RS C2n、RS C3n、RS C4n、SEQ ID RS C5n、RSC6n、RS C7n、RS C8n中描绘的序列或与SEQ ID RS C1n、RS C2n、RS C3n、RS C4n、SEQ ID RSC5n、RS C6n、RS C7n、RS C8n中描绘的序列中的任一者具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，该串构建体包含附加的序列，诸如接头，和编码肽自切割序列的序列，例如T2A或P2A序列。在一些实施方案中，串构建体包含两个或更多个重叠表位序列。在一些实施方案中，串构建体包含与序列SEQ ID RS C1n、RS C2n、RS C3n、RS C4n、SEQ ID RS C5n、RS C6n、RS C7n、RS C8n中的任一者具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，表位被排列在串上以使串的免疫原性最大化，例如通过使受试者的HLA等位基因所有组成成分的识别最大化。在一些实施方案中，相同的串编码可结合或预测结合不同HLA等位基因的表位。例如，如序列表(例如，至少在表9、表10、表11、表12、表14A和表14B以及表1 5)中充分例示的，串可编码包含以下的表位：(a)结合或预测结合由第一HLA等位基因编码的第一MHC肽的第一表位；(b)结合或预测结合由第二HLA等位基因编码的第二MHC肽的第二表位；(c)结合或预测结合由第三HLA等位基因编码的第三MHC肽的第三表位，并且可添加更多此类表位，如例如在RS-C1或RS-C2等的串序列中；其中该第一表位、该第二表位和该第三表位是来自相同病毒蛋白或来自不同病毒蛋白的表位。以这种方式，由单个串编码的表位分布被最大化用于命中对T细胞的不同的基于MHC的呈递，从而使从给定群体中更宽范围的患者生成抗病毒应答的可能性和每个患者应答的稳健性最大化。在一些实施方案中，表位是基于通过可靠的预测算法或系统诸如RECON预测算法对与HLA结合的高评分预测来选择的。在一些实施方案中，本公开提供了这样的见解：通过基于高度可靠和有效的预测算法，在由串编码的表位的布局中，在具有或不具有非表位序列或表位侧翼序列的情况下选择表位，可提供特别成功的串，并且使得该串的免疫原性在离体细胞培养模型中或在动物模型中得以验证，特别是在用串构建体或由串构建体编码的多肽接种后显示T细胞诱导并发现表位特异性T细胞应答。在一些实施方案中，该验证可来自在人类患者中使用，并且发现从接种后的患者获得的T细胞显示出表位特异性的有效且持久的T细胞应答。在一个实施方案中，作为疫苗的串的效率受其设计的影响，其部分取决于在设计的周密执行中使用的生物信息学信息的强度、MHC呈递预测模型的可靠性、当串疫苗在细胞中表达时表位处理的效率等。
在一些实施方案中，串构建体中的表位编码序列侧翼是一个或多个被选择用于更高的免疫原性、肽向MHC呈递的更好可切割性、更好的表达和/或在受试者的细胞中改善的翻译的序列。侧翼序列可包含具有特异性可切割序列的接头。在一些实施方案中，串构建体中的表位编码序列侧翼是分泌蛋白序列。在一些实施方案中，串序列编码表位，该表位可包含或以其他方式连接至分泌序列诸如MFVFLVLL PLVSSQCVNLT，或至少相对于其具有1、2、3、4或至多5个氨基酸差异的序列。在一些实施方案中，串序列编码可在N末端处通过序列MFVFLVLLPLVSSQCVNLT或相对于其具有1、2、3、4或至多5个氨基酸差异的序列连接的表位。该连接的序列可包含具有特异性可切割序列的接头。在一些实施方案中，该串构建体与跨膜结构域(TM)连接。在一些实施方案中，串序列编码可在C末端序列处通过T M结构域序列EQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCS CLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT或相对于其具有1、2、3、4或至多5个氨基酸差异的序列连接的表位。在一些实施方案中，一个或多个接头序列可包含切割序列。在一些实施方案中，接头可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的长度。在一些实施方案中，使用不超过约30、25、20、15、10个或更少氨基酸的接头。通常，任何氨基酸可作为接头序列存在。在一些实施方案中，接头或切割序列含有赖氨酸(K)。在一些实施方案中，接头或切割序列含有精氨酸(R)。在一些实施方案中，接头或切割序列含有甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，接头或切割序列含有酪氨酸(Y)。在一些实施方案中，接头被设计为包含基于切割预测因子的氨基酸以生成高度可切割序列肽序列，并且是在T细胞疫苗环境中递送免疫原性T细胞表位的新型且有效的方式。在一些实施方案中，如此设计在串构建体中编码的表位分布及其并置，以促进由表位的氨基酸序列和/或侧翼或连接残基贡献的切割序列，并由此使用最少的接头序列。一些示例性切割序列可以是FRAC、KRCF、KKRY、ARMA、RRSG、MRAC、KMCG、ARCA、KKQG、YRSY、SFMN、FKAA、KRNG、YNSF、KKNG、RRRG、KRYS和ARYA中的一种或多种。其中，本文包括的MS数据证明，高度预测结合的表位最终被呈递给T细胞，并且是免疫原性的。
在一些实施方案中，串构建体可以是mRNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含一个或多个mRNA串构建体，每个串构建体包含编码多个SARS CoV-2表位的序列。在一些实施方案中，该一种或多种mRNA可包含来自SARS-CoV2纤突蛋白的多个表位，其中该多个表位中的每一者通过HLA结合和呈递预测算法预测为很可能被HLA编码的蛋白质呈递至T细胞以引发免疫应答。在一些实施方案中，该一种或多种mRNA可包含来自SARS-CoV2核衣壳蛋白的多个表位，其中该多个表位中的每一者通过HLA结合和呈递预测算法预测为很可能被HLA编码的蛋白质呈递至T细胞以引发免疫应答。在一些实施方案中，该一种或多种mRNA可包含来自SARS-CoV2刺突蛋白、或核衣壳蛋白、或膜蛋白或任何其他蛋白质的多个表位，其中该多个表位的每一者通过HLA结合和呈递预测算法预测为很可能被HLA编码的蛋白质呈递至T细胞以引发免疫应答。在一些实施方案中，该多个表位可包含来自单个2019 SARS CoV-2蛋白的表位。在一些实施方案中，该多个表位可包含来自多个2019 SARS CoV-2蛋白的表位。在一些实施方案中，该多个表位可包含来自2019 SARS CoV-2核衣壳蛋白的表位。在一些实施方案中，mRNA可包含5′UTR和3′UTR。在一些实施方案中，UTR可包含多聚腺苷酸序列。多聚腺苷酸序列的长度可在50-200个核苷酸之间。在一些实施方案中，2019 SARS CoV-2病毒表位的侧翼可以是信号肽序列，例如SP1序列，以增强表位加工和呈递。在一些实施方案中，2019SARS CoV-2病毒表位的侧翼是MITD序列，以增强表位加工和呈递。在一些实施方案中，该多核苷酸包含dEarI-hAg序列。在一些实施方案中，多聚腺苷酸尾包含特定数量的腺苷，诸如约50或更多、约60或更多、约70或更多、约80或更多、约90或更多、约100或更多、约120、或约150或约200。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含200个或更少的A残基。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含约200个A残基。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含180个或更少的A残基。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含约180个A残基。在一些实施方案中，多聚腺苷酸尾可包含150个或更少的残基。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含约150个A残基。在一些实施方案中，多聚腺苷酸尾可包含120个或更少的残基。在一些实施方案中，串构建体的多聚腺苷酸尾可包含约120个A残基。
在一些实施方案中，编码多个表位的串构建体的核苷酸序列可以是密码子优化的。密码子优化的序列的实例可以是针对在真核生物例如人中的表达(即针对在人中的表达进行优化)或针对另一种真核生物、动物或哺乳动物进行优化的序列。已知对人以外的宿主物种进行密码子优化，或对特定器官进行密码子优化。在一些实施方案中，编码蛋白质的编码序列可以是针对在真核细胞诸如人细胞中的表达而进行密码子优化的。密码子优化是指通过用在目标宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，约或多于约1、2、3、4、5、10、1 5、20、25、50或更多个密码子)同时维持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以增强在该宿主细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，这进而被认为尤其取决于被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中所选择的tRNA占优势通常可能是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。密码子使用表可容易地获得，例如可在www.kazusa.orjp/codon/处获得的“密码子使用数据库”并且这些表可以多种方式进行修改。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，诸如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，PA)也是可用的。
在一些实施方案中，RNA的稳定性和翻译效率可结合一个或多个被建立以有助于RNA的稳定性和/或翻译效率的元件；例如，在以引用方式并入本文的PCT/EP2006/009448中描述了示例性的这种元件。为了增加根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内对其进行修饰，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，以便增加GC含量以增加mRNA稳定性，并进行密码子优化，并因此增强细胞中的翻译。
在一些实施方案中，串构建体可包含F元件。在一些实施方案中，该F元件序列是氨基末端分裂增强子(AES)的3UTR。
在一些实施方案中，如上所述的串mRNA构建体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个表位。在一些实施方案中，该药物组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个串。在一些实施方案中，该药物组合物包含6个串。在一些实施方案中，该药物组合物包含7个串。在一些实施方案中，该药物组合物包含8个串。在一些实施方案中，该药物组合物包含9个串。在一些实施方案中，该药物组合物包含10个串。
在一些实施方案中，串构建体可以是多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。
在一些实施方案中，包含一种或多种如上所述的串mRNA构建体的药物组合物可被包封在脂质纳米颗粒中。脂质纳米颗粒(LNP)的直径可以是100-250nm。在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒可具有小于200nm、小于150nm、小于100nm、小于80nm、小于75nm或更低的平均粒度。在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒可具有至少30nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm或更大的平均粒度。上述范围的组合也是可能的。在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒可具有30nm至200nm、或30nm至100nm或50nm至80nm、或50nm至小于80nm的平均粒度。在一些实施方案中，LNP可包含阳离子脂质。LNP可包含非阳离子脂质。LNP可包含PEG修饰的脂质。LNP可包含固醇或甾体脂质。在一些实施方案中，包含一种或多种如上所述的串mRNA构建体的药物组合物可与另一种2019 SARSCOV-2疫苗一起施用，在一些实施方案中，其可以是例如基于蛋白质的疫苗、基于RNA的疫苗、基于DNA的疫苗、基于病毒载体的疫苗，并且可在之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，包含一种或多种如上所述的串mRNA构建体的药物组合物可施用于有需要的受试者，使得受试者接受本文所述的药物组合物和另一种2019SARS CoV-2疫苗(例如，诱导产生针对SARS CoV-2蛋白诸如S蛋白或其免疫原性片段的抗体的疫苗)的组合。例如，在一些实施方案中，包含一种或多种如上所述的串mRNA构建体的药物组合物可施用于正在接受或已接受另一种2019 SARS CoV-2疫苗(例如，诱导产生针对2019 SARS CoV-2蛋白诸如S蛋白或其免疫原性片段的抗体的疫苗)的受试者。
在一些实施方案中，包含一种或多种如上所述的串mRNA构建体的药物组合物可与针对SARS COV-2刺突蛋白的疫苗共同施用。在一些实施方案中，该疫苗包含2019 SARSCOV-2的SARS-CoV-2刺突蛋白或编码其的核酸序列，例如其可具有以下说明中的任一种：
编码SARS-CoV-2刺突蛋白的示例性构建体
结构 m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的 SARS CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋
抗原 白，序列变体)
编码SARS-CoV-2刺突蛋白的示例性核苷酸序列
核苷酸序列用如以粗体字母指示的单个序列元件示出。此外，翻译的蛋白质的序列在编码核苷酸序列的下方以斜体字母示出(*＝终止密码子)。
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编码SARS-CoV-2刺突蛋白的示例性构建体
结构m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的 SARS CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋
抗原 白，序列变体)
编码SARS-CoV-2刺突蛋白的示例性核苷酸序列
核苷酸序列用如以粗体字母指示的单个序列元件示出。此外，翻译的蛋白质的序列在编码核苷酸序列的下方以斜体字母示出(*＝终止密码子)。
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在一些实施方案中，包含一种或多种编码由串构建体编码的多肽的多核苷酸的药物组合物可与另一种用于治疗病毒性疾病例如COVID的疫苗共同施用。在一些实施方案中，包含串构建体的药物组合物可与例如抗体共同施用，该抗体诸如可结合SARS COV-2蛋白例如orf1ab多蛋白、orf1a多蛋白、表面糖蛋白(S)、核衣壳磷蛋白(N)、ORF3a蛋白、膜糖蛋白(M)、ORF7a蛋白、ORF8蛋白、包膜蛋白(E)、ORF6蛋白、ORF7b蛋白或ORF10蛋白的中和抗体。在一些实施方案中，药物组合物可与针对SARS刺突蛋白的抗体共同施用。在一些实施方案中，包含一种或多种编码由串构建体编码的多肽的多核苷酸的药物组合物可在包含上述另一种疫苗的治疗方案之前、之后或同时施用。
在一些方面，由串构建体编码的多肽，尤其是包含SARS COV-2核衣壳蛋白表位的多肽，被设计为增强针对病毒的免疫原性和免疫记忆。目前某些试验中的疫苗包括针对病毒刺突蛋白的疫苗，其可能赋予免疫原性应答，但似乎不引发或促进T细胞应答。在一些实施方案中，包含本文所述的串构建体或由串构建体编码的多肽的疫苗可引发或促进T细胞应答和/或引发或促进持久的免疫记忆。在一些实施方案中，针对SARS CoV-2的疫苗可伴随有一种或多种本文所述的串疫苗组合物，例如作为施用方案的一部分，诸如用于初免后的加强。在一些实施方案中，针对SARS CoV-2的疫苗可以是基于mRNA的、基于病毒载体的(例如，复制和/或非复制)、基于DNA的、基于蛋白质的(例如，蛋白质亚基和/或病毒样颗粒)和/或基于灭活/减毒病毒的。在一些实施方案中，此类疫苗针对刺突蛋白或其免疫原性片段。在一些实施方案中，此类SARS CoV-2疫苗可以是或包括针对SAR-CoV-2的基于mRNA的疫苗，例如，在一些实施方案中，由Moderna开发的编码融合前稳定形式的SARS CoV-2刺突蛋白的基于mRNA的疫苗(mRNA-1273)。在一些实施方案中，此类SARS CoV-2疫苗可以是或包括针对SARS-CoV-2的基于病毒载体的疫苗，例如，在一些实施方案中，由AstraZeneca开发的基于腺病毒疫苗载体的疫苗(AZD1222)，其由病毒(例如，ChAdOx1)制备并且编码SARS CoV-2刺突蛋白，该病毒是腺病毒的弱化形式。
包含串构建体或由串构建体编码的多肽的药物组合物
在一个方面，包含串疫苗的药物组合物可单独或与其他药物或疫苗组合施用于患者。
在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在初次施用另一种用于SARSCoV-2病毒感染的疫苗或药物之前、同时或之后施用。
在一些实施方案中，在施用另一种用于SARS CoV-2病毒感染的疫苗或药物之前，可施用包含串疫苗的药物组合物7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、14周、16周、18周或20周或更长时间。包含串疫苗的药物组合物可预防性地施用，或作为预防性疫苗施用，类似于例如在每年流感季节开始时的流感疫苗。
在一些实施方案中，在施用用于2019 SARS CoV-2病毒感染的疫苗或药物后7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、14周、16周、18周或20周或更长时间施用包含串疫苗的药物组合物。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种2019 SARS-CoV2疫苗疗法后3个月施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种2019 SARS-CoV2疫苗疗法后6个月施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种2019 SARS-CoV2疫苗疗法后8个月施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种2019 SARS-CoV2疫苗疗法后9个月施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种SARS-CoV2疫苗疗法后10个月施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在另一种2019 SARS-CoV2疫苗疗法后12个月施用。
在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可每2天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周或更长时间施用一次。在一些实施方案中，包含串疫苗(例如，如本文所述)的药物组合物可每20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长时间施用一次。在一些实施方案中，包含串疫苗(例如，如本文所述)的药物组合物可每3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间施用一次。在一些实施方案中，可向受试者施用至少两个剂量的包含串疫苗(例如，如本文所述)的药物组合物，并且该至少两个剂量的包含串疫苗的药物组合物可以20天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以21天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以22天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以23天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以24天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以25天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以26天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以27天的间隔施用。在一些实施方案中，两个此类剂量可以28天的间隔施用。在一些实施方案中，包含串疫苗的药物组合物可在包括更频繁给药的初免剂量的初始阶段之后每6个月一次、或每8个月一次或每12个月一次作为加强(或维持)施用。在一些实施方案中，初免剂量可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量。
在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-1000微克的剂量使用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-600微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-500微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-400微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-300微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂1-200微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂10-300微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂10-200微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂10-100微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂10微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂20微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂30微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂40微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂50微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂60微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂70微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂80微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂90微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂100微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂120微克的剂量施用。在一些实施方案中，该串疫苗组合物可以每人每剂150微克的剂量施用。
在一些实施方案中，其中串疫苗组合物(例如，如本文所述)与BNT RNA疫苗组合物(例如，包含编码病毒刺突蛋白(例如，SARS CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(例如，RBD))的RNA(例如，mRNA)的组合物)组合施用，该BNT RNA疫苗组合物在一些实施方案中可被包封在脂质纳米颗粒中，此类BNT RNA疫苗组合物可以0.1微克至100微克、1至60微克、3至50微克、3-30微克或10-30微克的剂量施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30微克或更多的剂量施用。在一些实施方案中，BNT RNA疫苗包含编码SARS CoV-2S蛋白的RNA(例如，mRNA)构建体，其可具有表示为m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70的结构。
在一些实施方案中，待与串疫苗组合物(例如，如本文所述)组合施用的BNT RNA疫苗组合物(例如，如本文所述)可包含初始剂量，例如初免剂量；和后续剂量，例如加强剂量。在一些实施方案中，初免剂量和加强剂量以20天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNTRNA疫苗组合物剂量可以21天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以22天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以23天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物可以24天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以25天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以26天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以27天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物剂量可以28天的间隔施用。在一些实施方案中，此类BNT RNA疫苗组合物可以长于28天的间隔施用，例如包括例如每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间施用。
在一些实施方案中，与串疫苗组合物(例如，如本文所述)组合施用的BNT RNA疫苗组合物(例如，如本文所述)可包含编码病毒刺突蛋白(例如，SARS CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(例如，RBD))的经修饰的RNA，其中一个或多个尿苷核苷酸残基被经修饰的尿苷核苷酸(例如，1-甲基尿苷)替换。在一些实施方案中，该结构的至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％的U核苷酸被经修饰的尿苷核苷酸(例如1-甲基尿苷)替换。在一些实施方案中，该结构的100％的U核苷酸被经修饰的尿苷核苷酸(例如1-甲基尿苷)替换。
在一些实施方案中，包含编码刺突蛋白的核苷酸序列的疫苗可与包含串构建体的RNA疫苗共同施用。在一些实施方案中，施用包含编码刺突蛋白疫苗的核苷酸序列的疫苗作为初始剂量，随后施用包含含有编码来自2种或更多种病毒蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个表位的序列的串构建体的RNA疫苗作为后续剂量、维持剂量、第二剂量、第三剂量或作为一个或多个加强剂量。在一些实施方案中，施用包含编码刺突蛋白的核苷酸序列的疫苗作为初始剂量，随后施用包含含有编码来自2种或更多种病毒蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个表位的序列的串构建体的RNA疫苗作为后续剂量、维持剂量、第二剂量、第三剂量或作为一个或多个加强剂量。在一些实施方案中，向受试者施用包含含有编码来自2种或更多种病毒蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个表位的序列的串构建体的RNA疫苗作为初始剂量，随后施用包含编码刺突蛋白的核苷酸序列的疫苗作为后续剂量、维持剂量、第二剂量、第三剂量或作为一个或多个加强剂量。
在一些实施方案中，包含串构建体的药物组合物可包括共配制疫苗。在一些实施方案中，该共配制疫苗组合物可包含第一浓度的第一串疫苗和第二浓度的第二串疫苗以及第三浓度的第三串疫苗等。在一些实施方案中，第一串疫苗可包含含有编码刺突蛋白的核苷酸序列的疫苗。
在一些实施方案中，该共配制组合物可包含第一多核苷酸组合物，其包含编码刺突蛋白或其片段的核苷酸疫苗。在一些实施方案中，该共配制物可包含具有结构m2 73’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70的第一核苷酸序列，如上所述。在一些实施方案中，该共配制物可包含第二组合物，该第二组合物包含RS C5、RS C6、RS C7和RS C8或它们的组合。在一些实施方案中，该共配制物可包含第二组合物，该第二组合物包含RS C1、RSC2、RS C3和RSC4或它们的组合。在一些实施方案中，具有结构m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70的第一核苷酸序列和具有RSC1、RS C2、RS C3、RS C4、RS C5、RSC6、RS C7或RS C8的第二核苷酸序列可以20∶1、19∶1、18∶1、17∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、12∶1、11∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1的比率存在。在一些实施方案中，该共配制物可包含第二组合物，该第二组合物包含RS C1、RS C2、RS C3和RS C4或它们的组合。在一些实施方案中，具有结构m2 7，3′-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70的第一核苷酸序列和具有RS C1、RS C2、RS C3、RS C4、RS C5、RS C6、RS C7或RS C8的第二核苷酸序列可以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19或1∶20的比率存在。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸(例如，编码病毒刺突蛋白的多核苷酸和/或编码肽的多核苷酸(例如，包含如本文所述的表位序列)可被包封在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，此类脂质纳米颗粒可包含一种或多种阳离子或可电离的脂质。在一些实施方案中，此类脂质纳米颗粒可任选地包含中性脂质(例如，磷脂和/或固醇，诸如例如胆固醇)和/或聚合物缀合的脂质，诸如聚乙二醇化脂质。
在一些实施方案中，可离体生成包含受试者特异性T细胞的药物组合物，其中该受试者特异性T细胞群体可对表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16中的表位中的至少一者或说明书中公开的对应于病毒抗原的任何抗原有应答。在一个实施方案中，可(例如，从白细胞单采样品)分离来自受试者的PBMC，并将其在表(表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16)中的任一者中公开的一个或多个表位的存在下温育。在一些实施方案中，该抗原可基于受试者中存在的MHC肽进行选择，使得基于表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16中公开的肽：MHC对，抗原性肽与MHC组合具有高亲和力和呈递预测评分。
在一些实施方案中，药物组合物包含：(i)包含选自以下的表位序列的肽：NYNYLYRLF、KWPWYIWLGF、QYIKWPWYI、LPFNDGVYF、QPTESIVRF、IPFAMQMAY、YLQPRTFLL和/或RLQSLQTYV；(ii)编码该肽的多核苷酸；(iii)T细胞受体(TCR)或包含该TCR的T细胞，其中该TCR结合与对应MHC I类或II类分子复合的该表位序列；(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或(v)抗体或包含该抗体的B细胞，其中该抗体结合该表位序列。
在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含NYNYLYRLF或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*2402编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可生成产生包含受试者特异性T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含KYIKWPWYI或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*2402编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可离体生成包含受试者特异性T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含KWPWYIWLGF或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*2402编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可离体生成包含受试者特异性T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含QYIKWPWYI或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*2402编码的MHC蛋白。
在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含LPFNDGVYF或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-B*3501编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含QPTESIVRF或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-B*3501编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含IPFAMQMAY或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-B*3501编码的MHC蛋白。
在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含YLQPRTFLL或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*0201编码的MHC蛋白。在一些实施方案中，可离体生成包含T细胞的药物组合物，其中该T细胞可对包含RLQSLQTYV或由其组成的表位序列有应答，其中在一些实施方案中，该受试者表达由HLA-A*0201编码的MHC蛋白。
在一些实施方案中，可配制串疫苗以在水溶液中通过注射全身递送至受试者。该串疫苗可包含一种或多种多核苷酸，诸如RNA，诸如mRNA。在一些实施方案中，mRNA可与一种或多种脂质缔合。在一些实施方案中，该串疫苗可被共配制为包含一个或多个串、一个或多个刺突mRNA疫苗以及一个或多个包含覆盖一种或多种其他病毒蛋白、ORF1ab、核衣壳、膜蛋白或它们的组合中的一种或多种的表位序列的串。在一些实施方案中，该疫苗被配制用于全身注射，诸如肌内、皮下、静脉内、眼内。
在一些实施方案中，使串mRNA与包含抗原呈递细胞和T细胞的细胞群体接触。在一些实施方案中，串mRNA在细胞诸如APC中电穿孔。在一些实施方案中，如本申请中其他地方所述生成T细胞，将其用表达一个或多个串的APC初免。
在一些实施方案中，根据年龄、健康状况、性别、病史、与疾病倾向和结果相关的种族等，可将包含刺突mRNA疫苗或串疫苗或串疫苗与其他治疗剂组合的任何疫苗组合物施用于所选择的患者组。在一些实施方案中，可基于年龄、健康状况、性别、病史、与疾病倾向和结果有关的种族等将患者群体分类为高风险。只有当患者群体已被分类为高风险时，才可向该患者群体施用包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂。相反地，只有当患者群体已被分类为低风险时，才可向该患者群体施用包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于19-55岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于12-65岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于12-35岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于19-35岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于35-55岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于40-65岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于65-85岁的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于12岁或更小的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于10岁或更小的患者。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于青少年群体(例如，约12至约17岁的个体)。在一些实施方案中，疫苗组合物可单独或组合地用于儿科人群。在各种实施方案中，该儿科群体包括或由18岁以下例如5至小于18岁、12至小于18岁、16至小于18岁、12至小于16岁或5至小于12岁的受试者组成。在各种实施方案中，该儿科群体包括或由5岁以下例如2至小于5岁、12至小于24月龄、7至小于12月龄、或小于6月龄的受试者组成。
在一些实施方案中，包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂可施用于患有一种或多种共病诸如慢性疾病例如癌症、糖尿病、肾病或CFTR的患者。在一些实施方案中，包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂可不施用于患有一种或多种共病诸如慢性疾病的患者。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于其职业和/或环境暴露可显著增加其发生SARS CoV-2感染的风险的受试者(包括例如但不限于公共运输、囚犯、杂货店工作者、长期护理设施中的居民、屠宰者或其他肉类加工工作者、健康护理工作者和/或第一响应者，例如紧急响应者)。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于健康护理工作者和/或第一响应者，例如紧急响应者。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于具有吸烟或吸电子烟历史(例如，在6个月、12个月或更长时间内，包括长期吸烟或吸电子烟历史)的那些。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于已确定对SARS CoV-2感染更敏感的某些种族。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于具有可能已确定对SARS CoV-2感染更敏感的血液类型的某些群体。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于免疫受损受试者(例如，患有HIV/AIDS的那些；正在服用某些免疫抑制药物的癌症和移植患者；自身免疫疾病或预期需要免疫抑制治疗的其他生理状况(例如，在3个月内、在6个月内或更长时间)；以及患有影响免疫系统的遗传性疾病(例如，先天性无丙种球蛋白血症、先天性IgA缺陷)的那些)。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于患有感染性疾病的那些。例如，在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于感染人免疫缺陷病毒(HIV)和/或肝炎病毒(例如，HBV、HCV)的那些。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于具有潜在医学病症的那些。此类潜在医学病症的实例可包括但不限于高血压、心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸道疾病(例如慢性肺病、哮喘等)、癌症和其他慢性疾病诸如例如狼疮、类风湿性关节炎、慢性肝病、慢性肾病(例如，3期或更差，诸如在一些实施方案中以肾小球滤过率(GFR)小于60mL/min/1.73m2为特征)。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于超重或肥胖受试者，例如具体包括体重指数(BMI)高于约30kg/m2的那些。在一些实施方案中，可将包含串疫苗或串疫苗与第二治疗剂的组合的治疗剂施用于具有例如基于血清学或鼻拭子的COVID-19的先前诊断或当前或先前SARS CoV-2感染证据的受试者。
在一些实施方案中，本文所述的串疫苗可赋予对其他SARS病毒或对与2019 SARS-Cov 2具有相似性的多种病毒株的抗性、交叉保护并生成免疫原性。
试剂盒
本文所述的病毒表位治疗剂可以试剂盒形式与施用说明书一起提供。典型地，该试剂盒将包括在容器中的单位剂型形式的期望抗原治疗剂和施用说明书。该试剂盒中还可包括其他治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。也可期望的其他试剂盒组分包括例如无菌注射器、加强剂量和其他期望的赋形剂。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例是为了说明的目的，而不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可改变或修改以产生根据本发明的另选实施方案的各种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均全文以引用方式并入本文。
实施方案
具体实施方案是：
1.本公开的一个实施方案是一种组合物，其包含：
(i)多肽，所述多肽包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列，和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列；
(ii)编码所述多肽的多核苷酸；
(iii)T细胞受体(TCR)或包含所述TCR的T细胞，其中所述TCR结合所述多肽的与对应HLA I类或II类分子复合的表位序列；
(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或
(v)抗体或包含所述抗体的B细胞，其中所述抗体结合所述多肽的表位序列；和
药学上可接受的赋形剂。
2.在一个实施方案中，所述组合物包含(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。
3.如实施方案所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列在所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列的C末端。
4.如实施方案所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列在所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。
5.如实施方案所述的组合物，其中所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列在所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。
6.如实施方案所述的组合物，其中所述组合物包含(a)来自ORF1ab的2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个表位序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。
7.如以上实施方案所述的组合物，其中所述来自ORF1ab的表位序列是来自非结构蛋白的表位序列。
8.如以上实施方案所述的组合物，其中所述非结构蛋白选自由NSP1、NSP2、NSP3、NSP4以及它们的组合组成的组。
9.如以上实施方案所述的组合物，其中所述多肽包含含有来自NSP1的表位序列的序列、含有来自NSP2的表位序列的序列、含有来自NSP3的表位序列的序列和含有来自NSP4的表位序列的序列。
10.如以上实施方案所述的组合物，其中所述来自ORF1ab的表位序列选自由YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK以及它们的任何组合组成的组。
11.如以上实施方案所述的组合物，其中所述来自核衣壳糖蛋白(N)的表位序列是LLLDRLNQL。
12.如以上实施方案所述的组合物，其中所述来自膜磷蛋白(M)的表位序列是VATSRTLSY。
13.如以上实施方案所述的组合物，其中所述多肽包含来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列和来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
14.如以上实施方案所述的组合物，其中所述多肽包含(a)来自ORF1ab的以下表位序列中的每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK；(b)来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列；和(c)来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
15.如以上实施方案所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：MVTNNTFTLKVPHVGEIPVAYRKVLLKTIQPRVEKYLFDESGEFKLSEVGPEHSLAEYYIFFASFYY；
MVTNNTFTLKVPHVGEIPVAYRKVLLKTIQPRVEKYLFDESGEFKLSEVGPEHSLAEY；
APKEIIFLEGETLFGDDTVIEVAIILASFSAST；
APKEIIFLEGETLFGDDTVIEV；
HTTDPSFLGRYMSALFADDLNQLTGYHTDFSSEIIGYQLMCQPILLAEAELAKNVSLILGTVSWNL；
TTDPSFLGRYMSALFADDLNQLTGYHTDFSSEIIGYQLMCQPILLAEAELAKNVSLILGTVSWNL；
LLSAGIFGAITDVFYKENSYKVPTDNYITTY；以及它们的组合。
16.如以上实施方案所述的组合物，其中所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：ADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ；
FAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLF；
LGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVA；
KLLEQWNLVIGF；
NRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVY；
SELVIGAVILRGHLRIAGHHLGR；
VATSRTLSYYKLGASQRV；
GLMWLSYF；以及它们的组合。
17.如以上实施方案所述的组合物，其中所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：
KDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA；
RMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQ；
YKHWPQIAQFAP SASAFFGMSRIGMEVTP SGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP；
SPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDK以及它们的组合。
18.如以上实施方案所述的组合物，其中所述多肽还包含信号肽序列。
1 9.如以上实施方案所述的组合物，其中所述信号肽序列是MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS。
20.如实施方案1所述的组合物，其中所述多肽还包含MITD序列。
21.如以上实施方案所述的组合物，其中所述MITD序列是IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSD SAQGSDVSLTA。
22.如实施方案1所述的组合物，其中所述多肽包含一个或多个接头序列。
23.如以上实施方案所述的组合物，其中所述一个或多个接头序列选自由GGSGGGGSGG、GGSLGGGGSG组成的组。
24.如实施方案22所述的组合物，其中所述一个或多个接头序列包含切割序列。
25.如以上实施方案所述的组合物，其中所述一个或多个切割序列选自由FRAC、KRCF、KKRY、ARMA、RRSG、MRAC、KMCG、ARCA、KKQG、YRSY、SFMN、FKAA、KRNG、YNSF、KKNG、RRRG、KRYS和ARYA组成的组。
26.如实施方案1所述的组合物，其中所述多肽包含跨膜结构域序列。
27.如实施方案26所述的组合物，其中所述跨膜序列在所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列的C末端，所述序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且所述序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。
28.如实施方案26所述的组合物，其中所述跨膜序列是EQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。
29.如实施方案1所述的组合物，其中所述多肽包含SEC序列。
30.如实施方案29所述的组合物，其中所述SEC序列在所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列的N末端，所述序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且所述序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。
31.如实施方案29所述的组合物，其中所述SEC序列是MFVFLVLLPLVSSQCVNLT。
32.如实施方案1所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述多肽的所述多核苷酸。
33.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
34.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含用于在人中表达的密码子优化的序列。
35.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含dEarI-hAg序列。
36.如实施方案35所述的组合物，其中所述dEarI-hAg序列是ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC，任选地其中每个T是U。
37.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含Kozak序列。
38.如实施方案37所述的组合物，其中所述Kozak序列是GCCACC。
39.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含F元件序列。
40.如实施方案39所述的组合物，其中所述F元件序列是氨基末端分裂增强子(AES)的3UTR。
41.如实施方案39所述的组合物，其中所述F元件序列是CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC，任选地其中每个T是U。
42.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含I元件序列。
43.如实施方案42所述的组合物，其中所述I元件序列是线粒体编码的12S rRNA(mtRNR1)的3′UTR。
44.如实施方案42所述的组合物，其中所述I元件序列是CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC，任选地其中每个T是U。
45.如实施方案32所述的组合物，其中所述多核苷酸包含多聚腺苷酸序列。
46.如实施方案45所述的组合物，其中所述多聚腺苷酸序列是AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，任选地其中每个T是U。
47.如实施方案1所述的组合物，其中来自所述ORF1ab、所述膜糖蛋白和所述核衣壳磷蛋白的所述表位序列中的每一者来自2019SARS-CoV-2。
48.如实施方案1所述的组合物，其中一个或多个或每个表位引发T细胞应答。
49.如实施方案1所述的组合物，其中一个或多个或每个表位已通过质谱法观察到由HLA分子呈递。
50.如实施方案1所述的组合物，其中所述多肽包含选自由RSC1n、RSC2n、RSC3n、RSC4n、RSC5n、RSC6n、RSC7n和RSC8n组成的组的序列。
51.一种药物组合物，其包含如以上实施方案中任一项所述的组合物。
52.一种药物组合物，其包含：
(i)包含表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B和/或表16的表位序列的多肽；
(ii)编码所述多肽的多核苷酸；
(iii)T细胞受体(TCR)或包含所述TCR的T细胞，其中所述TCR结合与对应HLAI类或II类分子复合的所述表位序列；
(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或
(v)抗体或包含所述抗体的B细胞，其中所述抗体结合所述表位序列；和
药学上可接受的赋形剂。
53.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、LLLDRLNQL、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、VATSRTLSY和KTIQPRVEK。
54.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV、FGADPIHSL、NYNYLYRLF、KYIKWPWYI、KWPWYIWLGF、LPFNDGVYF、QPTESIVRF、IPFAMQMAY、YLQPRTFLL和RLQSLQTYV。
55.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自orf1ab蛋白。
56.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自orf1a蛋白
57.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自表面糖蛋白(S)或其移位阅读框。
58.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自核衣壳磷蛋白(N)。
59.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF3a蛋白。
60.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自膜糖蛋白(M)。
61.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF7a蛋白。
62.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF8蛋白。
63.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自包膜蛋白(E)。
64.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF6蛋白。
65.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF7b蛋白。
66.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF1 0蛋白。
67.如实施方案52所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF9b蛋白。
68.一种药物组合物，其包含：一种或多种具有表11和表12第2列以及表15第3列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽；或一种或多种重组多核苷酸构建体，每种重组多核苷酸构建体编码具有表11和表12第2列以及表15第3列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽。
69.如实施方案68所述的药物组合物，其中所述一种或多种多肽包含至少2、3、4、5、6、7或8种不同的具有表11和表12第2列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列和表15第3列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的多肽；或其中所述一种或多种重组多核苷酸构建体包含至少2、3、4、5、6、7或8种重组多核苷酸构建体，每种重组多核苷酸构建体编码具有表11和表12第2列以及表15第3列中描绘的序列中的任一者的氨基酸序列的不同多肽。
70.如实施方案68所述的药物组合物，其中所述一种或多种重组多核苷酸构建体包含与选自由SEQ ID ：R SC1n、RS C2n、RS C3n、RSC4n、RS C5n、RS C6n、RS C7n和RS C8n组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的序列。
71.如实施方案68所述的药物组合物，其中所述重组多核苷酸构建体是mRNA。
72.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或多种脂质组分。
73.如实施方案72所述的药物组合物，其中所述一种或多种脂质包括脂质纳米颗粒(LNP)。
74.如实施方案73所述的药物组合物，其中所述LNP包封所述重组多核苷酸构建体。
75.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽是合成的。
76.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽是重组的。
77.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽的长度为8-1000个氨基酸。
78.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列以1000nM或更小的KD结合或预测结合HLAI类或II类分子。
79.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列以500nM或更小的KD结合或预测结合HLAI类或II类分子。
80.如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列包含由受试者的病毒感染的细胞表达的病毒蛋白的序列。
81.如实施方案80所述的药物组合物，其中所述病毒是2019SARS-CoV2。
82.一种治疗或预防病毒感染或治疗与病毒感染相关的呼吸道疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物。
83.如实施方案82所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
84.如实施方案82所述的方法，其中所述病毒是2019 SARS-CoV2。
85.如实施方案82所述的方法，其中由所述受试者表达的HLA分子在施用时是未知的。
86.如实施方案82所述的方法，其中所述病毒或其突变形式避免被所述受试者的免疫系统识别的逃逸能力与所述病毒或其突变形式避免被施用含有来自单一蛋白质的表位或来自比如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物中更少的蛋白质的表位的药物组合物的受试者的免疫系统识别的逃逸能力相比更小。
87.如实施方案82所述的方法，其中所述受试者表达由表1A、表1B、表1C、表2Ai或表2Aii、表2B或表16中的任一者的HLA等位基因编码的HLA分子，并且所述表位序列是HLA等位基因匹配的表位序列。
88.如实施方案82所述的方法，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV和FGADPIHSL。
89.一种治疗或预防有需要的受试者中的2019 SARS-CoV2感染的方法，其包括向所述受试者施用如实施方案51、52或68中任一项所述的药物组合物。
90.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物是作为用于所述受试者中的所述2019 SARS-CoV2病毒感染的一种或多种治疗剂的补充施用的。
91.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物与以下项组合施用：(a)具有2019 SARS-CoV2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽；(b)编码2019 SARS-CoV2刺突蛋白或其片段的重组多核苷酸；或包含(a)或(b)的2019 SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物。
92.如实施方案89所述的方法，其中所述2019 SARS-CoV2刺突蛋白或其片段是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
93.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物在第一次施用所述2019SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物后1-10周施用。
94.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物在第一次施用所述2019SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物后1-6周、1-6个月或1-2年或更晚施用。
95.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物与所述2019SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物的施用在同一天或同时施用。
96.如实施方案95所述的方法，其中所述药物组合物与具有2019SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的所述多肽或编码2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的所述重组多核苷酸共同配制。
97.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物之前施用，诸如在施用所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物之前2-10周施用。
98.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物预防性地施用。
99.如实施方案89所述的方法，其中所述药物组合物每1、2、3、4、5、6或更多周施用一次；或每1-7、7-14、14-21、21-28或28-35天施用一次；或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天施用一次。
100.如实施方案1-50中任一项所述的组合物用于制备用于治疗或预防由2019SARS CoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染的治疗剂的用途。
101.一种治疗或预防病毒感染或治疗与病毒感染相关的呼吸道疾病或病症的方法，其包括：向有需要的受试者施用如实施方案1所述的药物组合物。
102.如实施方案101所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
103.如实施方案101所述的方法，其中所述病毒是2019SARS-CoV 2。
104.如实施方案101所述的方法，其中所述受试者表达由表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii或表2B或表16中的任一者的HLA等位基因编码的MHC分子，并且所述表位序列是HLA等位基因匹配的表位序列。
105.如实施方案101所述的方法，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV和FGADPIHSL。
实施例
实施例1：用于诱导对SARS-COV-2的T细胞应答的疫苗靶标的基于序列的预测
冠状病毒是正义单链RNA病毒，其偶尔从人畜共患来源出现以感染人类群体。大多数冠状病毒感染引起轻微的呼吸道症状。然而，一些近期的冠状病毒感染已导致严重的发病率和死亡率，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)和2019 SARS-CoV-2，其是造成当前世界范围的大流行病COVID-19的原因。这三种病毒属于β冠状病毒科属。SARS-CoV于2002年被鉴定，并且其在全球的传播导致8,096例病例和774例死亡。2012年在沙特阿拉伯出现了首例MERS-CoV病例，此后共报告了2,494例病例和858例相关死亡病例。与这些其他冠状病毒感染的更有限范围相反，SARS-CoV-2已导致4,077,355例病例，包括截至2020年5月9日全球279,043例死亡病例。SARS CoV-2的迅速传播已导致世界卫生组织宣布全球性流行病。因此，迫切需要针对SARS CoV-2的有效疫苗和抗病毒治疗以减少这种高度传染性病原体的传播。
SARS CoV-2的基因组长度跨越30千碱基，编码13个开放阅读框(ORF)，包括四个结构蛋白。这些结构蛋白是刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。此外，有超过20种非结构蛋白构成了涉及病毒转录和复制的所有蛋白。该病毒的所有编码蛋白都是开发诱导强T细胞免疫的疫苗的潜在候选物。
SARS-CoV和SARS CoV-2在基因组中共享76％的氨基酸同一性。这种高度的序列相似性允许我们利用以前对SARS-CoV的保护性免疫应答的研究来帮助SARS-CoV-2的疫苗开发。已显示体液和细胞免疫应答两者在宿主对SARS-CoV的应答中是重要的。针对S蛋白和N蛋白生成的抗体应答已显示在小鼠中保护免受SARS-CoV感染，并且已在SARS-CoV感染的患者中检测到。然而，在恢复后六年的患者中检测不到针对S蛋白的抗体应答。此外，在病毒感染的更严重临床病例中发现了更高滴度的抗体，这表明单独的强抗体应答可能不足以控制SARS-CoV和SARS-CoV-2感染。
与B细胞免疫一起，T细胞应答在SARS-CoV的免疫应答控制中似乎是重要的，并且对于SARS-CoV-2的控制最可能是重要的。在小鼠中，研究表明SARS-CoV特异性记忆CD8+ T细胞的过继转移在老年小鼠中提供了抗致死性SARS-CoV感染的保护，并且将效应CD4+和CD8+ T细胞过继转移到免疫缺陷或年轻小鼠中加快了病毒清除并改善了临床结果。也已在SARS-CoV和SARS-CoV-2感染的患者中检测到CD4+和CD8+ T细胞应答。另外，已经发现SARS-CoV特异性记忆CD8+ T细胞在感染后在从SARS恢复的患者中持续长达11年。这些病毒特异性CD8+ T细胞可以是细胞毒性的，并可杀伤病毒感染细胞以降低疾病严重程度。除了具有效应子功能之外，CD4+ T细胞可通过激活T依赖性B细胞促进病毒特异性抗体的产生。鉴于来自SARS-CoV的大量数据、SARS CoV-2与SARS-CoV之间的同源性以及来自SARS-CoV-2的新出现的数据，T细胞免疫可能在提供针对SARS-CoV-2的保护中起关键作用。
这里，我们利用基于质谱(MS)的HLA-I和HLA-II表位结合预测工具来鉴定由CD4+和CD8+ T细胞识别的SARS CoV-2表位。这些结合预测因子是在经由MS生成的高质量单等位基因HLA免疫表位数据上训练的。使用MS鉴定MHC肽配体组产生大量且相对无偏倚的体内天然加工和呈递的MHC结合肽群体。与依赖于化学合成和待测定的肽和配体的先验知识的传统结合测定不同，MS使用在细胞内经受内源加工和呈递途径的天然肽-MHC复合体。另外，使用工程化的单等位基因细胞系避免了对计算机模拟解卷积技术的依赖，并且允许等位基因覆盖度以靶向方式扩增。
用这种方法，我们生成了74个HLA-I和83个HLA-II等位基因的结合预测因子。将选择用于数据采集的等位基因优先化以最大化群体覆盖度。该MS数据使得我们能够训练基于等位基因特异性神经网络的结合预测因子，其对于HLA-I和HLA-II两者优于主要的基于亲和力的预测因子。此外，我们在Abelin等人，2019中证明，通过在针对不同集合的病原体和变应原的免疫应答数据集上验证该方法，这种改进的结合预测导致改进的免疫原性预测。在此，我们利用已从病毒病原体资源(ViPR)数据库中测定了T细胞反应性或MHC结合的冠状病毒科肽，特异性地验证了这些结合预测因子。ViPR数据库整合了来自内部管护数据、研究者提交的病毒病原体数据和来自各种外部来源的数据。与具有类似目的但依赖于较小的验证数据集和较少的覆盖等位基因从而导致更加有限的生物信息预测SARS CoV-2表位集合的最近研究相比，我们的方法在预测的广度和它们的有效性方面提供了显著的改进。
我们使用我们的基于MS的HLA-I和HLA-II结合预测因子来预测来自整个SARSCoV-2基因组的肽序列对广泛的一组HLA-I和HLA-II等位基因的结合潜力，覆盖了绝大多数的美国、欧洲和亚洲群体。我们还证实了这些表位的子集可在使用供体PBMC的T细胞诱导测定中引起特异性CD8+ T细胞应答。此外，我们探究了公开可用的蛋白质组学数据，并证明多种SARS CoV-2蛋白在病毒感染细胞中的相对表达显著不同，从而指示在疫苗设计中应考虑以诱导细胞免疫的另一个参数。预测具有结合多个HLA-I和HLA-II等位基因的高可能性并在感染的人细胞中表现出高表达的表位是引发针对SARS-CoV-2的T细胞应答的有前途的疫苗候选物。
方法
来自ViPR的冠状病毒科T细胞表位的分析
从ViPR数据库(viprbrc.org/；2020年3月5日访问)中检索用于人类宿主的冠状病毒科的实验确定的表位。为了建立验证数据集，获得了阳性和阴性两者的T细胞测定和MHC结合测定。仅包括与以至少四位数分辨率鉴定并得到我们的预测因子支持的等位基因相关的测定用于该分析。
阳性调用被优先化-即，如果给定的肽-等位基因对通过特定的测定类型被测定多次并且在任何单一的测定中被确定为阳性，则该肽-等位基因对被分类为阳性。具体地，优先级按以下顺序给出：阳性-高＞阳性-中等＞阳性-低＞阳性＞阴性(例如，具有结果阳性-高、阳性和阴性的三次测定的肽等位基因配对被指定阳性-高结果)。值得注意的是，另选的方法，诸如优先化阴性测定结果或在多个结果的情况下随机选择，产生非常类似的结果(数据未示出)。
对于ViPR冠状病毒科T细胞表位的结合预测
使用我们的HLA-I结合预测因子(一种在单等位基因MS数据上训练的神经网络)对ViPR验证数据集中的肽-HLA-I等位基因对进行评分。类似地，使用我们的HLA-II结合预测因子(一种最近公开的也在单等位基因MS数据上训练的基于卷积神经网络的模型)对ViPR验证数据集中的肽-HLA-II等位基因对进行评分。我们用HLA-II结合预测因子对给定测定肽中包含的所有12-20mer进行评分，并将最大评分作为该测定肽的代表性结合评分。代表绝大多数ViPR数据集的体外MHC结合测定不需要内源加工和呈递以获得阳性结合结果。由于我们的结合预测因子(其是在经由MS观察到的天然加工和呈递的配体上训练的)也隐含地学习了这些内源加工规则，所以我们对所测定的肽内的所有潜在配体(而不是仅全长测定肽本身)进行评分以说明这种区别。
2019 SARS Co V-2序列的检索
本研究使用2019 SARS CoV-2的GenBank参考序列(登录号：NC_045512.2)。所有十二个注释的开放阅读框(ORF1a、ORF1b、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N和ORF10)被认为是潜在表位的来源。此外，由于其在最近公开的蛋白质组学数据集中的高表达水平，如UniProt(P0DTD2)所注释的ORF9b也用于表位预测。
HLA-I表位的鉴定和按群体覆盖度的优先化
为了鉴定候选HLA-I表位，我们用我们的74个等位基因(包括21个HLA-A等位基因、35个HLA-B等位基因和18个HLA-C等位基因)的HLA-I结合预测因子对来自2019 SARS CoV-2的所有可能的8-12mer肽序列进行了全面评分。通过将肽-等位基因对的结合评分与用于相同的相应等位基因的1,000,000个参考肽(选自尚未用于模型训练的人蛋白质组的部分)进行比较，为肽-等位基因对指定百分比等级。在这些参考肽的评分的前1％中评分的肽-等位基因对被认为是强的潜在结合物。
由于疫苗应理想地有益于大部分群体，因此考虑到每种肽预期结合的所有等位基因(即，肽评分在前1％的所有等位基因)，然后基于预期的群体覆盖度对这些等级最高的肽进行优先化。每种肽的群体覆盖度的估计值计算为
覆盖度＝1-Π基因座(1-∑基因座等位基因f等位基因，平均值)2
其中f等位基因，平均值是跨美国、欧洲和亚太岛民(API)群体的(未加权)平均等位基因频率并且
跨三个HLA-I基因座：HLA-A、HLA-B和HLA-C取累积乘积。该累积乘积本身代表群体中个体不表达所含等位基因中的任一者的机会；因此，补语描述了存在至少一个的概率。
美国群体等位基因频率计算为以下几个亚群的加权平均值：0.623*EUR+0.133*AFA+0.068*API+0.176*HIS，其中EUR＝欧洲人，AFA＝非裔美国人，API＝亚太岛民，HIS＝西班牙裔群体。对于AFA、HIS或API群体频率不可用的等位基因，将USA群体等位基因频率值设定为与EUR匹配。对于我们的分析，缺失的API等位基因频率值保守地估算为0。
然后我们按覆盖度构建了两种类型的HLA-I表位的分级列表。首先将所有SARSCoV-2表位按它们的绝对覆盖度进行分级，使得预测结合类似等位基因集合的肽将被类似地分级。该方法提供了按每种肽的预期覆盖度分类的预测的I类表位的完整列表，其中充分假设每个结合预测都是正确的。
第二种类型的列表，称为“不相交”列表，以迭代方式构建，其中首先选择具有最大覆盖度的肽，然后更新剩余表位的覆盖度，以消除来自已选择的任何等位基因的贡献(表6)。单独生成M、N和S蛋白(最高表达的结构蛋白)的不相交列表，而不是跨越整个2019 SARSCoV-2基因组，以提供蛋白质水平优先化。这种方法产生了肽的精简列表，其旨在以最少的选择次数使累积群体覆盖度最大化并且用于生成图4A(左图)和图4B(上图)。
HLA-II表位的鉴定和按群体覆盖度的优先化
为了鉴定HLA-II表位，我们使用我们的基于MS的HLA-II结合预测子来对SARSCoV-2蛋白质组中的所有12-20mer序列进行评分，以预测结合潜力和每个12-20mer中可能的结合核心。对所有支持的HLA-II等位基因进行评分，包括46个HLA-DR等位基因、17个HLA-DP等位基因和20个HLA-DQ等位基因。
通过将肽-等位基因对的结合评分与100,000个参考肽(如前所述，从训练中排除的人类蛋白质组的部分中取样)的结合评分进行比较，为肽-等位基因对指定百分比等级。评分在前1％中的配对被认为可能结合。另外，我们将12-20mer的“表位”定义为序列内的预测结合核心。因此，对于给定等位基因具有相同预测结合核心的重叠12-20mer将构成单个表位。表5示出了这些表位的计数。
此外，考虑到需要设计在全球群体中广泛有效的疫苗，我们按群体覆盖度对SARSCoV-2中预测的HLA-II结合25mer进行优先化。为此，我们将每个25mer与可能是结合物的所有子序列相关联，并计算对应HLA-II等位基因的群体覆盖度。给定等位基因的集合，我们如前一节中所述计算覆盖度，唯一的差异是取跨以下四个HLA-II基因座的累积乘积：HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5、HLA-DP和HLA-DQ。HLA-II等位基因频率获自等位基因频率网络数据库。
与HLA-I一样，生成两种类型的预测结合序列的分类列表。第一类型按由组成子序列预期结合的HLA-II等位基因提供的绝对覆盖度对每个预测的SARS CoV-225mer进行分级。使用不相交的覆盖度，再次对M、N和S蛋白中的预测结合物单独进行第二类型的分级，以用肽的精简列表(表7)最大化累积群体覆盖度。这用于生成图4A(右图)和图4B(下图)。
预测表位与人蛋白质组的比较
使用具有人基因组及其蛋白质编码转录物的hg19注释(63,691个条目)的UCSC基因组浏览器基因，将来自SARS CoV-2的8-12mer序列(对应于预测的HLA-I表位)、9mer序列(对应于预测的HLA-II结合核心)和25mer序列(对应于预测的结合多个等位基因的HLA-II序列)与来自人蛋白质组的相同长度的所有子序列进行比较。鉴定了精确匹配并将其从不相交覆盖度分级分析中省略，以避免对可能无意中诱导自身免疫应答的肽进行优先化。对于预测的HLA-II结合核心或25mer序列没有发现精确匹配。
T细胞诱导和肽-MHC阳性T细胞应答的评估
使用Ficoll分离法从单采材料(AllCells，USA)分离来自HLA-A02：01阳性人供体的人PBMC。按类似的结合潜力将二十三个预测与HLA-A02：01强结合的SARS CoV-2表位合并，每个库中至多6个肽。所选择的肽代表预测结合来自S、N、M、E和ORF1ab蛋白的HLA-A02：01的高等级肽，从而避免了也被Grifino等人进行优先化的序列。23种肽序列中的五种也在SARS-CoV中发现并且先前在ViPR中作为HLA-A02：01结合物进行了测定和确认。将PBMC与肽库一起温育，成熟，并在IL-7和IL-15(CellGenix GmbH，Germany)的存在下培养以促进T细胞生长。然后收获细胞，使用pMHC多聚体的组合编码测定肽-MHC(pMHC)特异性CD8+ T细胞的频率。pMHC多聚体如申请人在其他地方所述制备。简而言之，在UV光下，用SARS CoV-2预测肽交换负载有UV可切割肽的生物素化HLA-A02：01单体。将链霉亲和素标记的荧光团PE、APC、BV421(Biolegend，Inc.，USA)、BV650和BUV395(BD Biosciences，USA)添加到UV交换的单体中，以产生荧光标记的多聚体试剂。然后将收获的细胞用用于633或635nm激发的LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒(Life Technologies Corporation，USA)、抗CD4FITC、抗CD14 FITC、抗CD16 FITC和抗CD19 FITC(BD Biosciences，USA)和抗CD8 AF700(Biolegend Inc.，USA)染色。只有相关pMHC多聚体的两种荧光染料染色的活CD8+ T细胞被认为是阳性的。在FACS LSR Fortessa 18 X20细胞计数器(BD Biosciences)上分析样品，并使用FlowJo(TreeStar)分析数据。用于测定的相应肽显示在表4中。
表4.病毒表位和T细胞诱导
公开可用的SARS CoV-2蛋白质组学数据集的分析
从PRIDE储存库下载2019 SARS CoV-2蛋白质组学数据集(Bojkova等人：PXD017710；Bezstarosti等人：PXD018760；Davidson等人：PXD018241)。在这些研究中，用2019 SARS-CoV-2感染Caco-2人结直肠腺癌细胞(Bojkova)或Vero E6非洲绿猴肾上皮细胞(Bezstarosti和Davidson)。使用Spectrum Mill MS Proteomics软件包7.0预发布版(Agilent Technologies)对用数据依赖性采集(DDA)获得的串联质谱(MS/MS)进行解释。选择半胱氨酸脲甲基化作为固定的修饰。选择甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺、蛋白质N末端乙酰化、肽N末端谷氨酰胺变为焦谷氨酸和肽N末端半胱氨酸焦脲甲基化作为可变修饰。对于采用同量异序质量标签的Bojkova数据集，添加TMT11作为肽N末端和赖氨酸的固定修饰，添加13C6-15N2-TMT1l-赖氨酸和13C6-15N4-精氨酸作为可变修饰。针对与包含智人蛋白质组(Bojkova，UCSC基因组浏览器hg19注释，63691个条目)或绿长尾猴(Chlorocebus sabaeus)蛋白质组(Bezstarosti和Davidson，UniProtKB，9229个条目)的数据库级联的2019 SARSCoV-2蛋白质组(UniProtKB，2020年4月28日，14个条目)搜索所有数据集。前体和碎片质量容差如每份手稿中所述设定，或当未指定时设定为20ppm。将数据库搜索结果导出为具有1％的基于靶诱饵的错误发现率(FDR)估计值的肽谱匹配(PSM)的列表。将来自每个研究的各个级分合并成单个列表。为了进行光谱计数，对指定给单个2019 SARS CoV-2蛋白的PSM进行计数，其中ORF1a和ORF1ab作为单个蛋白组处理。丢弃与宿主和SARS CoV-2蛋白两者匹配的肽。将光谱计数归一化为每种蛋白质的长度，并且将每个数据集内的最大值设定为100％。
结果
使用ViPR的病毒表位的生物信息学预测因子验证
我们首先试图验证我们的预测因子从冠状病毒科基因组中鉴定表位的能力。由于最近才出现SARS CoV-2，因此关于SARS CoV-2肽MHC结合和免疫原性表位的特异性数据目前是有限的。然而，已对来自冠状病毒科的其他病毒，特别是MERS-CoV和SARS-CoV进行了彻底的研究。后者与2019 SARS-CoV-2具有显著的序列同源性。因此，我们试图利用先前测试的来自冠状病毒科的表位来验证我们对病毒肽的预测，特别目标是与新型2019 SARS CoV-2病毒的蛋白质序列精确匹配的肽序列。为此，我们使用ViPR数据库，其列出了对于病毒病原体表位的HLA-I和HLA-II等位基因两者的T细胞免疫原性和MHC肽结合测定的结果。我们使用来自ViPR的人类宿主对冠状病毒药病毒的所有测定作为我们的验证数据集。不具有相关的四位HLA等位基因或与我们的模型不支持的等位基因相关的测定被省略。
对于HLA-I，在验证数据集中，存在总共4,445个独特的肽-HLA等位基因对，使用以下变化测定MHC-结合：1)细胞MHC或纯化的MHC；2)直接或竞争性测定；和3)通过荧光或放射性测量。通过X射线晶体学证实了两个附加的肽-MHC等位基因对。根据收集数据的研究，肽-MHC等位基因对在ViPR中被简单地定义为结合的“阴性”和“阳性”，或具有更多的阳性粒度等级：低、中等和高。我们指定了具有多重测量的肽-MHC等位基因对，其中在重复中检测到最高的MHC结合(参见“方法”)。
然后我们将我们的HLA-I结合预测因子应用于验证数据集中的肽-MHC等位基因对，并将这些对的计算的HLA-I百分比等级与报告的MHC-结合测定结果进行比较。低百分比等级值对应于结合的高可能性(例如，具有1％评分的百分比等级的肽在随机肽的参考组中的前1％中)。在MHC-结合测定中具有二元“阳性”结果的肽-MHC等位基因对的百分比等级显著低于具有“阴性”结果的对。此外，在更细粒度的阳性结果中，更强的测定结果(低＜中等＜高)与越来越低的百分比等级相关(图2，左上)。此外，通过X射线晶体学证实的两个肽-MHC等位基因被预测为非常可能的结合物，具有0.07％和0.30％的低百分比等级评分。尽管我们的HLA-I结合预测因子最初是为了支持癌症中新抗原预测的目的而建立的，但是该分析显示其可成功地应用于冠状病毒蛋白质组。我们通过执行精确率-召回率分析评价了我们的预测因子，证明了阳性结合物的准确调用与检测到的真实结合物的分数之间的折衷(图2，左下)。
与MHC结合测定相比，T细胞反应性的测定(例如，干扰素-γELISpot、四聚体)，其为对表位的T细胞免疫原性的更严格的量度，以显著更低的数量进行。对于HLA-I，我们预测的肽-MHC等位基因对(支持的等位基因)和具有报告的T细胞测定的对之间的重叠仅由32对组成，其中23对具有阳性结果。我们没有检测到阳性与阴性组之间的百分比等级差异，但样品量极小(数据未示出)。此外，对于HLA-I表位，验证数据集仅包含在结合测定中具有阳性结果的肽-MHC等位基因对的T细胞测定结果，表明选择用于测试的表位的高度偏倚库，这也反映在高比率的阳性T细胞测定结果中。实际上，与完全随机选择的肽所预期的相比，高比率的阳性MHC结合测定也意味着基于预测或先前数据预期结合的肽被优先化用于测试(或阴性结果报告不足)。在该验证数据集上评价结合预测因子性能时，要牢记所测定的肽中的这种潜在偏倚很重要。如果选择随机肽用于测试，则可预期阳性与阴性的评分之间甚至更显著的差异。
除了鉴定CD8+ T细胞的靶标之外，我们最近证明了预测HLA-II结合物的能力，从而允许我们靶向CD4+ T细胞应答，其可用于2019SARS CoV-2疫苗。这些CD4+应答可潜在地同时支持T细胞免疫并增强体液免疫。
以类似于HLA-I分析的方式，我们使用我们的HLA-II结合预测因子对ViPR中具有所支持的HLA-II等位基因的所有冠状病毒科肽-MHC等位基因对进行评分。在HLA-II的ViPR验证数据集中存在通过MHC结合测定所测定的259个独特的肽-MHC等位基因对。如前所述，我们将它们的百分比等级与其报告的“最佳”(在多次测量的情况下)MHC-结合测定结果进行比较。由于HLA-II的验证数据集中只有一个阴性结果，因此无法将“阴性”对作为独立组进行比较。低阴性计数可能是由于阴性测定结果的报告不足或待测定的肽的偏倚选择。因此，我们将“阴性”和“阳性-低”组合并为一组，并将它们的百分比等级与“阳性-中等”或“阳性-高”组进行比较(图2，右上)。该分析揭示了与用HLA-I预测观察到的趋势类似的趋势，指示更强的MHC结合测定结果与更低的HLA-II结合物的预测百分比等级相关，如我们对稳健预测因子所预期的。我们还通过进行精确率-召回率分析评价了我们的HLA-II结合预测因子(图2，右下)。精确率-召回率曲线下面积(AUC)指示我们的预测因子与随机猜测相比仅有很小的优势，这通过对具有阳性HLA-II结合测定结果的肽的严重偏倚来解释。与HLA-I T细胞测定类似，在我们的验证数据集中记录的HLA-II T细胞测定过少，无法确定测试阳性和阴性的肽-HLA II等位基因对之间的百分比等级差异。总之，这些发现进一步确证了我们的表位预测因子的有效性，因为我们的HLA-I和HLA-II MHC-结合预测因子两者在结合测定中具有阳性结果的肽-MHC等位基因对一致地具有较低的百分比等级(较好的评分)。
SARS-CoV-2的表位预测
我们利用我们基于MS的HLA结合预测能力来鉴定与SARS CoV-2T细胞应答的生成最相关的肽。我们首先进行HLA-I肽结合的分析，并计算来自13个SARS CoV-2ORF的长度为8-12个氨基酸的每种肽与我们数据库中的任何HLA-I等位基因结合的可能性。然后，我们通过将每个肽-MHC等位基因对的结合评分与一组参考肽的结合评分进行比较来计算它们的百分比等级；推定的结合物被鉴定为预测以1％或更低的百分比等级结合给定等位基因的序列(图1)。
通过这种度量，我们检测到总共11,897个独特的SARS CoV-2肽，其被预测结合至少一个HLA-I等位基因。这些肽中的16种肽与人蛋白质组的子序列重叠，并出于潜在自身免疫的考虑而被标记。
与具有封闭的结合槽(这将结合的肽的长度限制为约8-12个氨基酸)的HLA-I不同，结合HLA-II的肽具有较宽的长度分布(高达30个氨基酸或甚至更长)，因为HLA-II结合槽在两端都是开放的。肽与占据HLA-II结合槽的9个氨基酸子序列(称为结合核心)结合，其中任何侧翼序列悬于分子边缘。我们考虑一组在侧翼区中不同但共享共同结合核心作为单一表位的肽。使用HLA-II预测因子，我们鉴定了3，372个独特的结合核心，其被预测以1％或更低的百分比等级评分结合至少一个HLA-II等位基因(表5)。大多数预测的肽-MHC等位基因对来自ORF1a和ORF1ab，主要由这些oRF的长度驱动。此外，ORF1a和oRFlab具有非常类似的序列，预测两个ORF具有超过18，000个相同的结合肽-HLA-I等位基因对。因此，我们选择排除冗余预测，并且仅报告唯一对(参见表5中的*)。类似地，来自ORF1a的所有HLA-II预测表位被ORF1ab报告的那些所覆盖。
为了测试SARS CoV-2预测肽-HLA对的有效性，我们在ViPR数据库的冠状病毒科部分中寻找与SARS CoV-2肽序列精确匹配的肽序列(图2D)。根据我们的预测因子，来自SARSCoV-2的总共374个HLA-I肽-MHC等位基因对都具有低于1％的百分比等级，并且在HLA-IMHC-结合验证数据集中发现。引人注目的是，在这些HLA-I肽-MHC等位基因对中，333对(89％)具有阳性测定结果。作为比较，我们还测试了预测具有低MHC结合可能性(50％或更高的百分比等级)的表位与验证数据集之间的重叠。37个肽-MHC等位基因对在这些组之间重叠，其中36个(97.2％)具有如预测的阴性测定结果。此外，我们试图确定我们高度预测的2019 SARS CoV-2肽-HLA-I等位基因对(百分比等级低于1％)是否将通过报告的T细胞测定结果来验证。尽管在验证数据集中测试了T细胞反应性的肽-MHC等位基因对的数量显著较少，但通过我们的HLA-I结合预测因子也高度预测了10个测定对。这10个预测对中的九个预测对(90％)对T细胞测定具有阳性结果。在验证数据集中没有报告低评分对(50％或以上的百分比等级)。这些发现证明了我们对SARS CoV-2表位的肽-HLA-I等位基因对的预测的有效性。值得注意的是，虽然我们的算法没有在T细胞反应性数据上训练，并且是针对肽-MHC结合的，但是对于ViPR中报告了T细胞反应性测定结果的少数实例，我们能够显示我们的高评分肽-MHC等位基因对在大多数情况下确实是免疫原性的。
对于HLA-II肽-MHC等位基因对，只有单个HLA-II肽-MHC等位基因对都具有低于1％的百分比等级，并在验证数据集中报告；该单对(来自包膜蛋白)具有“阳性-高”测定结果。
表5
*orf1a独有的肽(在orf1ab中未发现)。
**在UniProt中注释。
HLA-A02：01-预测的2019 SARS Co V-2表位的免疫原性
所用的基于MS的结合预测算法预测表位被特定HLA等位基因呈递的可能性，但不直接预测T细胞受体识别MHC分子呈递的表位的能力。由于中枢耐受过程删除了可与来自自身抗原的肽交叉反应的T细胞，不是每个作为强MHC结合物的表位都将引发T细胞应答。因此，需要在T细胞测定中进一步验证高亲和力MHC结合肽(图1)。为了解决高度预测的MHC结合肽的子集的免疫原性，我们合成了来自以下SARS CoV-2蛋白中的每一种的23个高度预测的HLA-A02：01结合表位：S、M、N、E和ORF1ab。在这些高度预测的SARS CoV-2表位中，五个序列在ViPR中对于与HLA-A02：01相关的MHC结合或T细胞反应性呈阳性。将这些肽的库与来自三个人供体的PBMC一起培养，并且如果预测的表位在三个供体的至少一个个供体中引起T细胞应答，如通过与HLA-A02：01的pMHC多聚体结合所检测的，则认为它们是免疫原性的。
如图3所示，对于23个高度预测的表位中的11个表位，在至少一个供体中验证了CD8+ T细胞应答(表7和图3)。在ViPR中先前报告的作为免疫原性或强结合物的五个表位中，证实了三个表位引发CD8+ T细胞应答，从而证实我们的结合预测因子可鉴定免疫原性的表位。此外，我们能够鉴定先前未在ViPR中报告的八个新表位，其被供体PBMC中的特异性CD8+ T细胞识别。应答通常是强有力的，在我们的测定中阳性的11个表位中的九个表位在至少两个供体中被特异性CD8+ T细胞应答识别(表7)，令人鼓舞的是，来自2019 SARS CoV-2的每个ORF被测定具有至少一个导致T细胞应答的肽(表7)。总之，这些数据显示，许多由MHC-I结合预测因子预测为强结合物的新型2019 SARS CoV-2表位被发现是免疫原性的。
预测结合多个HLA-I和HLA-II等位基因的肽的群体覆盖度
验证数据集与本文提供的高度预测的肽-MHC等位基因对之间的一致性指示HLA结合预测因子显著扩展了来自2019 SARS-CoV-2的ORF的预测MHC结合肽的列表。接下来，对来自M、N和S蛋白的肽进行优先化，基于MHC等位基因在美国、欧洲(EU)和亚太岛民(API)群体中的流行率，预测这些肽提供了对这些群体的广泛覆盖度。发现预测肽的子集结合广泛的一组HLA-I或HLA-II等位基因。对于每种蛋白质，确定少量的肽序列分别提供了对美国、欧洲和亚太岛民群体的饱和覆盖度，对于HLA-I，用所选择的8-12mer表位实现了＞99％的群体覆盖度，对于HLA-II，用所选择的25mer序列实现了＞95％的群体覆盖度(图4B)。即使没有完全支持对所有肽-MHC等位基因对的充分假设，其中前1％中的给定肽评分确实是免疫原性的，这一发现也可促进设计一种诱导广泛的T细胞免疫的精简、广泛有效的疫苗。
表6示出了来自三种SARS CoV-2蛋白：刺突、核衣壳和膜中的每一种的具有最宽累积等位基因覆盖度的最高HLA-I预测结合物。该表提供了肽序列、其等级、其来源的2019SARS CoV-2蛋白、该肽预测结合的等位基因、以及达到该等级的所有肽对美国、欧洲(EUR)和亚太岛民(API)群体的累积HLA-I覆盖度。
表7示出了来自三种2019 SARS CoV-2蛋白：刺突、核衣壳和膜中的每一种的最高HLA-II预测结合物。对于每个25mer，该表提供了等级、肽序列、其来源的2019 SARS CoV-2蛋白、由达到该等级的所有25mer覆盖的累积等位基因、以及相关的美国、欧洲(EUR)和亚太岛民(API)群体覆盖度。注意，这些25mer中的任一种或它们的结合子序列都不是作为人蛋白质组中的子序列发现的。
表6
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表索引：P，病毒蛋白；S，表面糖蛋白；M，膜糖蛋白；NP，核衣壳磷蛋白。
表7
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表索引：S1，选择；P，病毒蛋白；S，表面糖蛋白；M，膜糖蛋白；NP，核衣壳磷蛋白。
利用蛋白质组学数据推断相对病毒蛋白丰度
除了肽-MHC结合之外，在设计潜在的SARS CoV-2疫苗中的另一个重要考虑是在感染的宿主细胞中病毒蛋白表达的程度。为了确定SARS CoV-2蛋白的相对丰度，我们分析了三个公开可用的蛋白质组学数据集，其在SARS-CoV-2感染的宿主细胞的胰蛋白酶消化上获得了无偏倚LC-MS/MS。通过光谱计数，一种半定量方法，由此对肽-光谱匹配进行计数，并比较蛋白质的总数，来估计病毒蛋白的相对丰度(表8)。表8示出了来自公开的SARS CoV-2蛋白质组学数据集的光谱计数。将指定给来自SARS CoV-2蛋白的肽的MS/MS光谱在数据集之间进行统计，除以蛋白长度，并在每个数据集内归一化以生成图5。该分析证明了SARS CoV-2蛋白的表达水平的显著宽范围。具体地，证实了N蛋白是SARS CoV-2感染后所有三个数据集中最丰富的病毒蛋白(图5)。这一发现由在来自COVID-19患者的漱口液样品中检测到的N-衍生肽的报告确证。此外，N蛋白已被用作诊断感染了SARS-CoV病毒的患者的生物标志物。另一方面，仅基于基因组信息，ORF10可能被认为是疫苗开发的潜在靶标。然而，几乎没有蛋白质组学和转录组学证据表明ORF10实际上在SARS CoV-2感染的细胞中表达。这些发现强调了在疫苗设计策略中除了HLA结合预测和这些表位的免疫原性之外还考虑SARSCoV-2蛋白表达水平的价值。
表8
表索引：Boj，Bojkoya等人：PXD017710；Bez，Bezstarosti等人：PXD018760；Dav，Davidson等人：PXD018241。
讨论
在这项工作中，证明了所用的HLA-I和HLA-II结合预测算法对冠状病毒科病毒家族并且特别是SARS-CoV-2的实用性和有效性。预测的强度是双重的：首先，我们具有基于MS的对于HLA-I和HLA-II结合物两者的验证预测因子，其潜在地可用于诱导针对病毒的长期CD4+和CD8+ T细胞免疫。具体地，我们的HLA-II预测因子，其也已在一大组单等位基因MS数据上进行了训练，已显示出显著优于先前公开的工具，并且在此用于鉴定可能对细胞和体液免疫均有贡献的高质量CD4+表位。其次，我们支持的HLA-I和HLA-II等位基因的扩展数据库为我们提供了不仅鉴定许多肽-MHC等位基因对，而且生成具有许多可由整个美国、欧洲和亚太岛民群体呈递的潜在HLA配对的肽的窄列表的能力。通过将这些算法应用于在ViPR中先前测定的肽-MHC等位基因对，我们能够证明对于HLA-I和HLA-II表位两者我们的结合预测与结合测定结果之间的极好一致性。我们利用冠状病毒科内的同源性来证明，确实证实了我们的可获得验证的高等级SARS CoV-2肽-MHC等位基因对中的极高部分(～90％)结合预测的MHC等位基因。我们还证实了我们的结合预测因子可鉴定免疫原性的表位，并且可导致对供体PBMC中的多种SARS CoV-2蛋白的CD8+ T细胞应答。有理由认为，我们的大部分实验证实的表位(在所有高度预测、测试的表位中)只是对总体免疫原性的低估，因为在该初始实验中仅使用来自三个供体的PBMC。尽管我们没有进行T细胞测定来评价HLA-II预测表位的免疫原性，但这种分析是有价值的，特别是考虑到CD4+ T细胞在细胞和体液抗病毒应答中的重要性。因此，我们提出B细胞和T细胞表位的组合可提供对SARS CoV-2的长期免疫或当保护是部分的时减轻疾病的严重程度。
因此，我们得出结论，使用基于MS的HLA结合预测因子从SARS CoV-2的ORF预测T细胞表位提供了用于该病毒的一组显著扩展的、新型的高质量T细胞疫苗靶标。当将该研究与Grifoni等人的最新出版物进行比较时，情况尤其如此。我们在更多的HLA等位基因中提供了十倍多的高度预测表位，这使我们更好地优先化候选疫苗物。此外，我们不仅提供了对ViPR中先前报告的来自冠状病毒科的其他病毒的更大组表位的生物信息学验证，而且提供了实验验证的新型2019SARS CoV-2T细胞表位。
靶序列的选择可进一步由蛋白质表达、预测提供对大部分群体的覆盖的表位和保守的2019 SARS CoV-2表位来指导。首先，设计针对预测表位的治疗剂仅在含有那些表位的蛋白质以足够高的水平表达以发生有效的抗原加工和呈递时才有效。因此，在选择治疗靶标时考虑蛋白质表达是关键的。其次，预测结合多个等位基因的表位的优先化可提供对群体的显著部分的覆盖，同时在疫苗中包括很少的表位。最后，在病毒通过群体传播和扩增期间，获得基因组修饰，从而在2019 SARS CoV-2群体中生成序列多样性。这种多样性可允许逃避免疫压力，因此重要的是优先化在2019 SARS CoV-2群体中保守的表位。
虽然将表位选择限制于高度表达的蛋白质、预测结合多个高频率HLA等位基因的表位和保守的病毒表位限制了潜在表位的数量，但我们提供的列表的广度增加了鉴定许多高质量、高度表达的表位的可能性。此处表征的表位，结合对2019 SARS CoV-2蛋白表达的认识以及确认免疫原性的进一步努力，可提供表位的临床前验证，这些表位可以是诱导强细胞免疫的疫苗候选物。
结论
总之，该工作提供了最广泛的一组CD4+和CD8+ T细胞表位，它们跨越整个2019SARS CoV-2基因组并结合广泛的一组HLA-I和HLA-II等位基因。将该表位列表与蛋白质表达水平、群体覆盖度和病毒序列保守性组合将导致生成在大多数群体中可能具有免疫原性的疫苗表位候选物的简短列表。我们预测的CD4+和CD8+ T细胞表位的列表将补充B细胞表位，并作为科学界生成有效的2019 SARS CoV-2疫苗表位和生成持久的T细胞免疫的资源。
实施例2：HLA I类和II类结合测定
以下肽与HLA分子结合的实施例证明了HLA I类和II类肽的结合亲和力的定量。可用带有基序或不带有基序的肽进行结合测定。制备2019 SARS CoV-2感染的细胞系。根据公开的方案制备细胞裂解物并纯化HLA分子(Sidney等人，Current Protocols inImmunology18.3.1(1998)；Sidney等人，J.Immunol.154：247(1995)；Sette等人，Mol.Immunol.31：813(1994))。通过亲和色谱法从裂解物中纯化HLA分子。使裂解物通过与适当抗体偶联的Sepharose CL-4B珠柱。然后用在1％NP-40中的10mM Tris-HCL(pH 8.0)、PBS和含有0.4％正辛基葡糖苷的PBS洗涤抗HLA柱，并用在0.15M NaCl中的50mM二乙胺(含有0.4％正辛基葡糖苷，pH 11.5)洗脱HLA分子。将1/25体积的2.0M Tris(pH 6.8)添加到洗脱液中以降低pH。然后将洗脱液在Centriprep 30浓缩器(Amicon，Beverly，MA)中离心浓缩。通过BCA蛋白质测定(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)评价蛋白质含量并通过SDS-PAGE确认。
已公开了用于测量肽与I类和II类MHC结合的方案的详细描述(Sette等人，Mol.Immunol.31：813，1994；Sidney等人，Current Protocols in Immunology，Margulies编辑，John Wiley&Sons，New York，第18.3节，1998)。简而言之，在蛋白酶抑制剂混合物存在下，将纯化的MHC分子(5至500nM)与各种未标记的肽抑制剂和1-10nM1251-放射性标记的探针肽在含有0.05％Nonidet P40(NP40)(或20％w/v毛地黄皂苷，用于H-2IA测定)的PBS中温育48小时。除了在pH 4.5下进行的DRB1*0301以及在pH 5.0下进行的DRB1*1601(DR2w21131)和DRB4*0101(DRw53)以外，所有测定均在pH 7.0下进行。
温育后，通过在7.8mm x 15em TSK200柱(TosoHaas 16215，Montgomeryville，PA)上的凝胶过滤从游离肽中分离MHC-肽复合体。因为用于DRB1*1501(DR2w2(31)测定的放射性标记肽的大尺寸使得在这些条件下分离结合的和未结合的峰更困难，所以使用以0.6mL/min洗脱的7.8mm x 30em TSK2000柱进行所有DRB1*1501(DR2w2(31)测定。使来自TSK柱的洗脱液通过Beckman 170放射性同位素检测器，并绘制放射性并使用Hewlett-Packard3396A积分仪积分，并测定结合肽的分数。
放射性标记肽使用氯胺-T方法碘化。通常，在初步实验中，在固定量的放射性标记肽的存在下滴定每种MHC制备物以确定结合总放射性的10％-20％所需的HLA分子的浓度。使用这些HLA浓度进行所有随后的抑制和直接结合测定。
由于在这些条件下[标记]＜[HLA]并且IC50＞[HLA]，因此所测量的IC50值是真实KD值的合理近似值。肽抑制剂通常以120μg/ml至1.2ng/ml范围内的浓度进行测试，并且在两至四个完全独立的实验中测试。为了比较在不同实验中获得的数据，通过将抑制的阳性对照的IC50除以每种测试肽(通常是放射性标记的探针肽的未标记形式)的IC50来计算每种肽的相对结合图。出于数据库目的和实验间的比较，对相对结合值进行编译。这些值随后可通过将抑制的阳性对照的IC5onM除以目标肽的相对结合而转化回IC50nM值。这种数据编译方法已被证明对于比较在不同天或用不同批次的纯化MHC进行测试的肽是最准确和一致的。
因为用于HLA-DR纯化的抗体(LB3.1)是a-链特异性的，所以131分子不与133(和/或134和(35)分子分离。结合测定的131特异性在DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)和DRB1*0803(DR8w3)的情况下是明显的，其中不表达133。还对DRB1*0301(DR3)和DRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302(DR6w19)和DRB1*0701(DR7)进行了展示。通过使用成纤维细胞避免了DRB1*1501(DR2w2(31)、DRB5*0101(DR2w2(32)、DRB1*1601(DR2w21131)、DRB5*0201(DR51Dw21)和DRB4*0101(DRw53)测定的13链特异性的问题。先前已描述了关于DRP分子特异性的测定的开发和验证(参见例如，Southwood等人，J.Immunol.160：3363-3373，1998)。
也可使用基于活细胞/流式细胞术的测定。这是一种利用TAP-缺陷型杂交瘤细胞系T2(美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号CRL-1992)，Manassas，Va.)的充分建立的测定。该细胞系中的TAP缺乏导致ER中MHCI的低效负载和过量的空MHCI。Salter和Cresswell，EMBO J.5：94349(1986)；Salter，Immunogenetics 21：235-46(1985)。空MHCI是高度不稳定的，因此寿命短。当将T2细胞在降低的温度下培养时，空MHCI短暂地出现在细胞表面上，在那里它们可通过外源添加MHCI结合肽而稳定。为了进行这种结合测定，通过在单独的无血清AIM-V培养基中或在含有递增浓度(0.1-100μM)肽的培养基中，在26℃下过夜培养107个T2细胞的等分试样，来诱导肽-接受性MHCI。然后将细胞用PBS洗涤两次，随后与荧光标记的HLA-A02：01特异性单克隆抗体BB7.2温育，以定量细胞表面表达。在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得样品，并使用附带的Cellquest软件测定平均荧光强度(MFI)。
实施例3：免疫原性的确认
在用于确认免疫原性的示例性方法中，使用体外培养(IVE)测定来测试每种测试肽扩增CD8+ T细胞的能力。以下列方式制备成熟的专职APC用于这些测定。将来自健康人供体的80-90x106个PBMC铺板在含有2％人AB血清的20ml RPMI培养基中，并在37℃下温育2小时以允许单核细胞的塑性粘附。去除非贴壁细胞，并将贴壁细胞在RPMI、2％人AB血清、800IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4中培养。6天后，添加TNF-α至终浓度为10ng/ml。在第7天，通过添加12.5mg/ml多聚I：C或0.3μg/ml CD4OL使树突细胞(DC)成熟。在第8天收获成熟树突细胞(mDC)，洗涤，并且直接使用或冷冻保存以备将来使用。
对于CD8+ T细胞的IVE，用每种肽以100微摩尔的终浓度脉冲2x105个mDC的等分试样，在37℃下温育4小时，然后辐照(2500rad)。将肽脉冲的mDC在含有2％人AB血清的RPMI中洗涤两次。将2x105个mDC和2x106个自体CD8+细胞铺板在24孔板的每孔2ml含有2％人AB、20ng/ml IL-7和100pg/ml IL-12的RPMI中，并温育12天。然后用肽脉冲的、辐照的mDC再刺激CD8+ T细胞。两至三天后，添加20IU/ml IL-2和20ng/IL7。每8-10天再刺激扩增的CD8+ T细胞，并将其维持在含有IL-2和IL-7的培养基中。使用功能测定和/或四聚体染色的组合监测培养物的肽特异性T细胞。用经修饰的肽和亲本肽进行平行IVES允许比较肽扩增肽特异性T细胞的相对效率。
CD8+和CD4+ T细胞的定量和功能评估
四聚体染色
MHC四聚体是购买的或现场制造的，并且用于在IVE测定中测量肽特异性T细胞扩增。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体添加到含有1％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中的lx105个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。然后添加对T细胞标志物诸如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的终浓度，并将细胞在黑暗中在4℃下温育20分钟。将细胞用冷的FACS缓冲液洗涤并重悬于含有1％甲醛的缓冲液中。在FACSCalibur(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用Cellquest软件(BectonDickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，淋巴细胞门取自正向和侧向散点图。数据报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比。
可使用离体诱导方案测试针对肽抗原的CD4+ T细胞应答。在本实施例中，通过以抗原特异性方式监测IFNγ和/或TNFα产生来鉴定CD4+ T细胞应答。
抗原呈递的评价：对于预测抗原的子集，确定病毒表位对指定HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。已公开了用于测量肽与I类MHC的结合亲和力的方案的示例性详细描述(Sette等人，Mol.Immunol.31(11)：813-22，1994)。简而言之，制备MHCI复合体并与放射性标记的参考肽结合。将肽以不同浓度与这些复合体一起温育2天，并使用尺寸排阻凝胶过滤测量与MHCI结合的剩余放射性标记肽的量。置换参考放射性标记肽所需的测试肽的浓度越低，证明测试肽对MHCI的亲和力越强。对MHCI的亲和力<50nM的肽通常被认为是强结合物，而亲和力＜150nM的肽被认为是中等结合物，而亲和力＜500nM的肽被认为是弱结合物(Fritsch等人，2014)。
已公开了用于测量肽与I类MHC的结合稳定性的方案的示例性详细描述(Hamdahl等人J Immunol Methods.374：5-12，2011)。简而言之，在大肠杆菌中表达编码生物素化MHC-I重链和轻链的合成基因并使用标准方法将其从包涵体中纯化。将轻链(β2m)用碘(125I)放射性标记，并在18℃下与纯化的MHC-I重链和目标肽结合以引发pMHC-I复合体形成。这些反应在链霉亲和素包被的微孔板中进行，以使生物素化的MHC-I重链结合到表面，并允许测量放射性标记的轻链以监测复合体的形成。通过添加较高浓度的未标记轻链并在37℃下温育来引发解离。稳定性被定义为如通过闪烁计数测量的一半复合体解离所花费的以小时计的时间长度。按照与测量MHCI-肽结合亲和力相同的一般程序测量MHC-II与肽的结合亲和力。本文描述了用于预测MHCII等位基因与给定肽结合的预测算法。此外，NetMHCIIpan可用于预测结合。
为了评估抗原是否可从较大的多肽背景中加工和呈递，通过串联质谱法(MS/MS)分析从表达目标基因的细胞中分离的HLA(I类或II类)分子中洗脱的肽。
ELISPOT
使用ELISPOT测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定以单细胞为基础测量T细胞的IFNγ释放。将靶细胞(T2或HLA-A0201转染的C1R)用10uM肽在37℃下脉冲1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的靶细胞在ELISPOT板孔中与取自IVE培养物的不同浓度的T细胞(5x102至2x103)共培养。根据制造商的方案对这些板进行显影，并在ELISPOT读数器(Cellular Technology Ltd.)上用附带的软件进行分析。对应于产生IFNγ的T细胞数量的斑点报告为每铺板的T细胞数量的斑点的绝对数量。测试用经修饰的肽扩增的T细胞识别用经修饰的肽脉冲的靶标的能力，以及识别用亲本肽脉冲的靶标的能力。
CD107染色
CD107a和b在用同源肽激活后在CD8+ T细胞的细胞表面上表达。T细胞的裂解性颗粒具有脂质双层，该脂双层含有溶酶体相关膜糖蛋白(“LAMP”)，其包括分子CD107a和b。当细胞毒性T细胞通过T细胞受体激活时，这些裂解性颗粒的膜动员并与T细胞的质膜融合。释放颗粒内容物，这导致靶细胞的死亡。由于颗粒膜与质膜融合，C107a和b暴露于细胞表面，因此是脱粒的标志。因为如通过CD107a和b染色测量的脱粒是在单细胞基础上报告的，所以该测定用于功能性地计数肽特异性T细胞。为了进行该测定，将肽添加到HLA-A0201转染的细胞C1R中至终浓度为20μM，将细胞在37℃下温育1小时，并洗涤三次。将1x105个肽脉冲的C1R细胞等分到管中，并添加CD107a和b特异性抗体至制造商(Becton Dickinson)建议的终浓度。在添加T细胞之前添加抗体，以便在测定过程中当CD107分子瞬时出现在表面上时“捕获”它们。接着添加来自培养物的1x105个T细胞，并将样品在37℃下温育4小时。对T细胞的附加细胞表面分子诸如CD8进一步染色，并在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得。使用附带的Cellquest软件分析数据，结果报告为CD8+CD107 a和b+细胞的百分比。
CTL裂解
细胞毒性活性使用铬释放测定来测量。将靶T2细胞在37℃下用Na51Cr标记1小时，然后将洗涤的5x103个靶T2细胞添加到来自IVE培养物的不同数量的T细胞中。在37℃下温育4小时后收集的上清液中测量铬释放。特异性裂解的百分比计算为：
实验释放-自发释放/总释放-自发释放x100
实施例4：用于预防或治疗用途的肽组合物
本发明的免疫原性或疫苗组合物用于抑制病毒复制。例如，将含有多个CTL和HTL表位的多表位组合物(或包含该组合物的核酸)施用于具有病毒感染的个体。该组合物作为包含多个表位的单个脂质化多肽提供。该组合物在由明矾组成的水性载剂中施用。对于70kg的患者，用于初次免疫的肽剂量为约1至约50,000lig，通常为100-5,000ps。初始施用之后是4周的加强剂量，然后通过确定PBMC样品中表位特异性CTL群体存在的技术评价患者中免疫应答的量级。根据需要施用附加的加强剂量。发现该组合物对于抑制病毒复制既安全又有效。
另选地，根据本领域已知的和本文公开的方法，该多表位组合物可作为核酸例如RNA施用。
病毒表位结合剂，诸如TCR或CAR，可以根据本领域已知的和本文公开的方法施用。结合剂可作为编码结合剂的多肽或多核苷酸(例如RNA)施用，或通过施用表达结合剂的细胞作为细胞疗法施用。
病毒表位肽、多核苷酸、结合剂或表达这些分子的细胞可通过本领域已知的多种方法递送至同一患者，并且可进一步与其他疗法(例如，抗病毒疗法)组合。
实施例5.使用树突细胞施用组合物
包含本发明表位的疫苗可使用树突细胞施用。在本实施例中，可将肽脉冲的树突细胞施用于患者以在体内刺激CTL应答。在该方法中，树突细胞被分离、扩增，并用包含本发明的肽CTL和HTL表位的疫苗进行脉冲。将树突细胞输注回患者体内以引发体内CTL和HTL应答。然后，诱导的CTL和HTL破坏(CTL)或促进破坏(HTL)带有疫苗中表位所来源的蛋白质的特异性靶细胞。
另选地，可通过将患者的或遗传相容的CTL或HTL前体细胞与抗原呈递细胞来源诸如树突细胞和适当的免疫原性肽一起在组织培养物中温育来诱导对特定病毒抗原的离体CTL或HTL应答。
在适当的温育时间(通常约7-28天)后，其中前体细胞被激活并扩增为效应细胞，将细胞输注回患者体内，在那里它们将破坏(CTL)或促进破坏(HTL)其特异性靶细胞，即展示病毒表位的细胞。
实施例6：具有免疫原性潜力的突变体序列的鉴定
对于每个表位，衍生病毒表位的全长氨基酸序列。使用可用算法对任何组分9-mer或10-mer蛋白序列在六种常见HLA等位基因(HLA-A01：01、HLA-A02：01、HLA-A03：01、HLA-A24：02、HLA-B07：02和HLA-B08：01)上的结合潜力进行评分。提名任何评分优于1000nM的肽。
对于每个表位，衍生病毒表位的全长氨基酸序列。对在种系蛋白序列中未发现的任何组分9mer或10mer进行标记，并使用可用算法对其在六种常见HLA等位基因(HLA-A01：01、HLA-A02：01、HLA-A03：01、HLA-A24：02、HLA-B07：02和HLA-B08：01)上的结合潜力进行评分。
实施例7：SARS COV-2(2019 SARS-Cov 2)肽串设计
本文提供了用于治疗应用的多个2019 SARS COV-2核衣壳表位的特殊构建体“串”。这些串被设计成含有2019 SARS COV-2核衣壳的特异性表位，其中每个表位在本申请的先前实施例中单独公开，并且通过如上所述的MHC-结合算法预测。这些串被设计用于治疗COVID 19的治疗用途，并且可作为核酸串构建体例如包封在脂质纳米颗粒中的mRNA施用。
这些串被设计成包括5’UTR和3’UTR。表位通过由相应的核酸序列编码的肽接头相互连接。一些接头具有特异性切割位点。表11和表12示出了氨基酸的完整序列和编码它们的核苷酸序列。进一步对核苷酸序列进行密码子优化以在人体内有效翻译。表9和表10提供了构建体图谱，分别详述了对应于表11和表12中的每个串的片段和序列。图6A和图6B以图形方式例示了第1组RS C1-C4的序列的串的设计。图6B展示了图6A的更详细布局。图7A和图7B以图形方式例示了第2组RS C5-C8的序列的串的设计。图7B展示了图7A的更详细布局。在一些情况下，串也被鉴定为RS C1n、RS-C2n等。
命名为“RS_C1 GSS接头”(缩写为RS C1)的串编码具有1266个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为3798个核苷酸长。整个串为4107个核苷酸长，并且编码1369个氨基酸长的肽串。表11例示了氨基酸和核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS C1 GSS接头”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“反向RS C2 GSS接头”(缩写为RS C2)的串编码具有1266个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为3798个核苷酸长。整个串为4107个核苷酸长，并且编码1369个氨基酸长的肽串。表11例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“反向RS C2 GSS接头”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“RS_C3 2A接头”(缩写为RS C3)的串编码具有1326个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为3978个核苷酸长。整个串为4287个核苷酸长，并且编码1429个氨基酸长的肽串。表11例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS_C3 2A接头”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“作为接头的RS C4 ORF1ab”(缩写为RS C4)的串编码具有1234个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为3702个核苷酸长。整个串为4011个核苷酸长，并且编码1 337个氨基酸长的肽串。表11例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“作为接头的RS C4 ORF1ab”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“RS C52300”(缩写为RS C5)的串编码具有756个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为2268个核苷酸长。整个串为2577个核苷酸长，并且编码859个氨基酸长的肽串。表12例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS C52300”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“RS C6 1200”(缩写为RS C6)的串编码具有404个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为1212个核苷酸长。整个串为1521个核苷酸长，并且编码507个氨基酸长的肽串。表12例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS C6 1200”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“RS C71500M组块”(缩写为RS C7)的串编码具有492个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为1476个核苷酸长。整个串为1785个核苷酸长，并且编码595个氨基酸长的肽串。表12例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS C71500M组块”的串的示例性密码子优化序列是：
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命名为“RS C81500M表位”(缩写为RS C8)的串编码具有485个氨基酸的氨基酸长度的ORF，并且编码该ORF的核苷酸序列为1455个核苷酸长。整个串为1764个核苷酸长，并且编码588个氨基酸长的肽串。表12例示了氨基酸序列和编码其的核酸序列(未密码子优化)。对于命名为“RS C81500M表位”的串的示例性密码子优化序列是：
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排列的序列是DNA序列，并且可互换地用于解释RNA(或mRNA)序列，如本领域技术人员所熟知的。
实施例8：所设计的SARS COV-2(2019 SARS-Coy 2)核衣壳肽串的药物组合物
将如实施例8中例示的所设计的串制备成脂质纳米颗粒(LNP)包封的mRNA的药物组合物，该mRNA具有SEQ ID RS C1n、或SEQ ID RS C2n、或SEQ ID RS C3n、或SEQ ID RSC4n、或SEQ ID RS C5n、或SEQ ID RS C6n、或SEQ ID RS C7n、或SEQ ID RS C8n、或它们的任何组合中描绘的序列，或编码表11和表12中所述的对应氨基酸、具有表11和12中每行序列组RSC1-RSC8的第2列中公开的氨基酸序列的序列。LNP至少包含阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质。将LNP包封的mRNA制剂冻干并在低于(-)20℃的温度下储存，优选地在液氮下冷冻以长期储存。可将LNP-mRNA组合物在水溶液中解冻和复溶以供使用。
所设计的串的LNP-mRNA组合物单独施用或与用于2019 SARS CoV-2感染的BNTSpike疫苗共同施用。
实施例9：用于生成串构建体的方法
本文描述了通过生物信息学和分子生物学技术的整合生成串构建体的示例性方法。这些串被设计成包含来自2019 SARS CoV-2蛋白的表位。这些表位是基于在基于计算机的程序中的HLA结合和预测算法中的分级以及来自实验数据的支持来选择的。在选择蛋白质片段时，考虑基于群体HLA频率的预测群体覆盖度，以便使群体覆盖度最大化。
简而言之，构建体被设计成从5′-3′掺入各种病毒蛋白的最高预测和免疫原性表位和区域，包括SARS CoV-2蛋白的核衣壳、膜、ORF3a、ORF9b和ORF1ab。
通过级联来自2019 SARS-CoV-2的不同开放阅读框(ORF)的序列来设计RNA串。ORF衍生序列可以是完整的ORF；ORF的区段(长度范围为99至954bp-基于预测和观察的表位密度优先化)；或构成或含有CD8+表位的区域，其被组装以优化MHC I类可切割性。对所有串变体的ORF1ab采用最后的方法；这也用一个串变体(RS C8)的膜ORF进行。使用在MHC I类质谱数据上训练的神经网络预测因子对MHC I类可切割性进行评分，该预测因子以候选肽序列及其应被切割的背景(任一侧30个AA)作为输入。考虑到给定的串变体中的相邻序列，当另外不可能有效切割时，在表位之间和在组装表位的每个区域的侧翼上添加四种AA--长可切割性接头(通过测试氨基酸的所有潜在组合并采用我们的预测因子的最佳评分来选择)。表位的排序通过选择允许最有效切割的构型同时添加尽可能少的可切割性接头来确定。两个串变体推定使用非免疫原性GSS接头来从不同的ORF分离序列。一个串变体使用2A自切割肽序列作为接头以从不同的ORF分离序列。剩余的变体使用所设计的MHC I类可切割区作为“接头”。串内ORF的排序由蛋白质组学丰度和免疫原性数据驱动。一个串变体具有反向的ORF顺序作为对照，以便评价作为沿串的距离的函数的翻译效率。
实施例10：mRNA疫苗的表位特异性
在本实施例中说明了一个示例性研究，证明在施用针对SARS CoV-2的BNT mRNA疫苗后的体内T细胞特异性。研究参与者在第1天接受BNT162b2的初免免疫，并且在第22±2天接受加强免疫。在第1天(初免前)、第8±1天(初免后)、第22±2天(加强前)、第29±3天、第43±4天、第50±4天和第85±7天(加强后)获得血清。在第1天(初免前)和第29±3天(加强后)获得PBMC。
在本研究中，CD8+ T细胞应答在三个接种BNT mRNA的参与者中的表位水平上表征。将在第1天(初免前)和第29天(加强后7天)获得的三个接种的参与者(剂量队列10μg，n＝1；30μg，n＝2)的PBMC用单独的pMHC I类多聚体混合物染色，并通过流式细胞术分析T细胞表位特异性(图8Ao和图8Aii)和表型(图8B；来自参与者3的实例；YLQPRTFLL)。在图8Ai-图8C中，点图上方的肽序列指示pMHC I类多聚体表位特异性，点图上方的数字指示对应于S蛋白中的表位的氨基酸。图8C示出了S蛋白中鉴定的MHC I类限制性表位的定位。将接种前和接种后PBMC用个体化肽/MHC多聚体染色混合物染色以用于流式细胞术分析。对于参与者1、2和3，分别使用二十三(对于HLA-B*0702为4，对于HLA-A*2402为19)、14(HLA-B*3501)和23(对于HLA-B*4401为7，对于HLA-A*0201为16)个不同的肽/MHC等位基因对，从而探查一组选定的潜在反应性，而不是全面捕获多表位T细胞应答。对于每个参与者，鉴定了从头诱导的针对多个表位的CD8+ T细胞反应性，总计有八个不同的表位/MHC对遍布S的全长(图8Ai-图8Aii、图8C)。表位特异性T细胞应答的量级范围在外周CD8+ T细胞的0.01％-3.09％之间，并且对于HLA-A*0201 YLQPRTFLL(CD8+的3.09％多聚体+)、HLA-A*2402QYIKWPWYI(CD8+的1.27％多聚体+)和HLA-B*3501 QPTESIVRF(CD8+的0.17％多聚体+)，观察到最显著的扩增。与通过ELISpot和ICS确定的这些个体中针对完整S的大量IFNγ+CD8+ T细胞应答的比较表明，pMHC技术可能更适用于评估细胞免疫应答的真实程度。鉴定的pMHC多聚体+S抗原经历的CD8+ T细胞特异性的表型分析揭示了早期分化的效应记忆表型，其特征在于CCR7和CD45RA的低表达和共刺激分子CD28和CD27的高表达。CD8+ T细胞也表达与同源激活相关的标志物，诸如CD38、HLA-DR和PD-1(图8B)。本文提供的数据首次证明了被COVID-19疫苗诱导的T细胞识别的表位。
在人类受试者中，跟踪疫苗施用后检测活化T细胞的时程。在图8D描绘的研究中，向受试者施用10、20或30微克编码刺突蛋白的mRNA疫苗。以至多200天的时间间隔分离活化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，并通过ELISPOT检测IFNγ从细胞的释放。通过剂量依赖方式的IFNg释放测定，受试者表现出活化CD4+和CD8+ T细胞两者的更长持久性。这些图还指示，这些细胞对受试者所暴露的大多数表位有应答，例如在上图左图中在200天时10微克组中的8个受试者中的7个受试者。在老年队列中的相同研究也显示出在200天的过程中更持久的接种表位应答活化T细胞(图8E)。顺便提及，不相关的病毒库表位对照(CEFT或CEF)显示对CD4+ T细胞的较低应答。受试者中的相应表位、匹配HLA和应答如下所列：
实施例11.肽/MHC多聚体染色
为了选择MHC-I类表位用于多聚体分析，将基于质谱的结合和呈递预测因子(例如，如Abelin等人，Immunity 46，315-326(2017)和Poran等人，Genome Med.12，70(2020)中所述)应用于8-12个氨基酸长的肽序列，该肽序列来自来源于SARS CoV-2的GenBank参考序列(登录号：NC_045512.2，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512)的刺突糖蛋白并与欧洲人群体中频率＞5％的18个MHC-I类等位基因配对。通过对结合百分比等级(≤±1％)和呈递评分(≥±10-2.2)设定阈值来鉴定排名靠前的预测表位，并考虑合成纯度＞90％的肽。用easYmer技术(试剂盒，ImmuneAware Aps)重折叠pMH C复合体，并根据制造商的说明书在基于珠粒的流式细胞术测定中验证复合体形成。使用组合标记，利用五种不同荧光标记的双色组合，分析T细胞的抗原特异性，以能够检测每个样品多达十种不同的T细胞群体。对于四聚化，添加链霉亲和素(SA)-荧光染料缀合物：SA BV421、SA BV711、SA PE-Cy7、SA APC(均来自BD Bioscience s)。对于三个接种BNT162b2的参与者，个体化pMHC多聚体染色混合物包含多达十种pMHC复合体，其中每种pMHC复合体由独特的双色组合编码。将PBMC(2x106)在室温下用每种pMHC多聚体混合物以4nM的终浓度在Brilliant Staining Buffer Plus(B SB Plus[BD HorizonTM])中离体染色20分钟。在补充有BSB Plus的流动缓冲液(D PBS[Gibco]，具有2％FBS[Biochrom]、2mM EDTA[Sigma-Aldrich])中在4℃下进行表面和活力染色30分钟(CD3 BUV395，1：50；C D45RA BUV563，1：200；CD27 BUV737，1：200；CD8 BV480，1：200；CD279 BV650，1：20；CD197 BV786，1：15；CD4BB515，1：50；CD28 BB700，1：100；CD38 PE-CF594，1：600；HLA-DR APC-R700，1：150；均来自BD BiosCiences；DUMP通道：CD14 APC-eFl uor780，1：100；CD16 APC-eFluor780，1：100；CD19 APC-eFluor780，1：100；可固定活力染料eFluor780， ：1，667；均来自ThermoFishe rScientific)。将细胞在4℃下在1x稳定化固定剂(BD)中固定15分钟，在FACSymphonyTM A3流式细胞仪(BD BioSciences)上获得并用1 0.6.2版FlowJo软件(FlowJo LLC，BDBiosciences)分析。当观察到仅用两种pMHC多聚体颜色标记的成簇群体时，CD8+ T细胞反应性被认为是阳性的。
实施例12.T细胞制造
本发明提供了一种T细胞疗法，其中将针对对病毒表位具有特异性的抗原性肽进行初免和有应答的T细胞施用于受试者。该治疗可包括通过用表达病毒T细胞表位的APC初免T细胞并扩增活化T细胞以获得病毒表位特异性CD8+和CD4+(包括表现出记忆表型的这些细胞的群体)来离体生成病毒表位特异性T细胞(参见例如，WO2019094642，其全文以引用方式并入)。离体生成靶病毒抗原应答T细胞，并使用体外抗原特异性T细胞测定验证免疫原性。质谱可用于验证表达目标抗原的细胞可加工肽并将其呈递在相关HLA分子上。另外，使用细胞毒性测定来证实这些T细胞杀伤呈递肽的细胞的能力。
靶肿瘤细胞抗原应答T细胞的离体生成
材料：
AIM V培养基(Invitrogen)人FLT3L，临床前CellGenix#1415-050储液50ng/μL；TNF-α，临床前CellGenix#1406-050储液10ng/μL；IL-1p，临床前CellGenix#1411-050储液10ng/μL；PGE1或前列地尔(Alprostadil)-来自Czech republic的Cayman，储液0.5μg/μL；R10培养基-RPMI 1640glutamax+10％人血清+1％PenStrep；20/80培养基-18％AIM V+72％RPMI 1640glutamax+10％人血清+1％PenStrep；IL7储液5ng/μL；IL15储液5ng/μL。
程序：
步骤1：用在2mL AIM V培养基中的FLT3L在24孔板的每个孔中铺板5百万个PBMC(或目标细胞)
步骤2：AIMV中的肽负载和成熟
1.将目标肽库(除了没有肽的情况)与PBMC(或目标细胞)在相应的孔中混合。
2.温育1小时。
3.温育后，将成熟混合物(包括TNF-α、IL-1β、PGE1和IL-7)混合到每个孔中。
步骤3：将人血清以10体积％的终浓度添加到每个孔中并混合。
步骤4：用补充有IL7+IL15的新鲜RPMI+10％HS培养基替换培养基。
步骤5：在温育期间每1-6天用补充有IL7+IL15的新鲜20/80培养基替换培养基。
步骤6：用在2ml AIM V培养基中的FLT3L在新的6孔板的每个孔中铺板5百万个PBMC(或目标细胞)
步骤7：用于再刺激的肽负载和成熟-(新板)
1.将目标肽库(除了没有肽的情况)与PBMC(或目标细胞)在相应的孔中混合
2.温育1小时。
3.温育后将成熟混合物混合到每个孔中
步骤8：再刺激：
1.计数第一刺激FLT3L培养物，并向新的再刺激板中添加5百万个培养的细胞。
2.将培养物体积调至5mL(AIM V)，并添加500μL人血清(10体积％)
步骤9：去除3ml培养基并添加6ml补充有IL7+IL15的RPMI+10％HS培养基。
步骤10：用补充有IL7+IL15的新鲜20/80培养基替换75％的培养基。
步骤11：如果需要，重复再刺激。
抗原特异性诱导分析
MHC四聚体是购买的或根据普通技术人员已知的方法现场制造的，并且用于在免疫原性测定中测量肽特异性T细胞扩增。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体添加到含有1％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中的1x105个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。然后添加对T细胞标志物诸如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的终浓度，并将细胞在黑暗中在4℃下温育20分钟。将细胞用冷的FACS缓冲液洗涤并重悬于含有1％甲醛的缓冲液中。在LSR Fortessa(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用FlowJo软件(Becton Dickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，淋巴细胞门取自正向和侧向散点图。数据报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比。
病毒抗原呈递的评价
可确定病毒表位对HLA等位基因的亲和力和病毒表位与HLA等位基因的稳定性。已公开了用于测量肽与I类MHC的结合亲和力的方案的示例性详细描述(Sette等人，Mol.Immunol.31(11)：813-22，1994)。简而言之，制备MHCI复合体并与放射性标记的参考肽结合。将肽以不同浓度与这些复合体一起温育2天，并使用尺寸排阻凝胶过滤测量与MHCI结合的剩余放射性标记肽的量。置换参考放射性标记肽所需的测试肽的浓度越低，证明测试肽对MHCI的亲和力越强。对MHCI的亲和力＜50nM的肽通常被认为是强结合物，而亲和力＜150nM的肽被认为是中等结合物，而亲和力＜500nM的肽被认为是弱结合物(Fritsch等人，2014)。
已公开了用于测量肽与I类MHC的结合稳定性的方案的示例性详细描述(Hamdahl等人J Immunol Methods.374：5-12，2011)。简而言之，在大肠存菌中表达编码生物素化MHC-I重链和轻链的合成基因并使用标准方法将其从包涵体中纯化。将轻链(β2m)用碘(125I)放射性标记，并在18℃下与纯化的MHC-I重链和目标肽结合以引发pMHC-I复合体形成。这些反应在链霉亲和素包被的微孔板中进行，以使生物素化的MHC-I重链结合到表面，并允许测量放射性标记的轻链以监测复合体的形成。通过添加较高浓度的未标记轻链并在37℃下温育来引发解离。稳定性被定义为如通过闪烁计数测量的一半复合体解离所花费的以小时计的时间长度。
为了评估抗原是否可从较大的多肽背景中加工和呈递，通过串联质谱法(MS/MS)分析从表达目标基因的细胞中分离的HLA分子中洗脱的肽。
为了分析病毒抗原的呈递，使用已被病毒感染或被慢病毒转导以表达病毒抗原的细胞系。基于细胞系的天然表达分离HLA分子，或者将细胞系慢病毒转导或瞬时转染以表达目标HLA。用编码病毒多肽的不同区域的慢病毒载体转导293T细胞。培养超过5千万个表达由病毒多肽编码的肽的细胞，并使用酸洗液从HLA-肽复合体中洗脱肽。然后通过具有平行反应监测(PRM)的靶向MS/MS分析洗脱的肽。
HLAI类结合和稳定性
用于亲和力测量的肽的子集也用于使用所述测定的稳定性测量。小于50nM可被本领域认为是强结合物，50-150nM可被认为是中等结合物，150-500nM可被认为是弱结合物，并且大于500nM可被认为是非常弱的结合物。
免疫原性测定用于测试每种测试肽扩增T细胞的能力。以下列方式制备成熟的专职APC用于这些测定。使用基于珠粒的试剂盒(Miltenyi)从健康人供体PBMC中富集单核细胞。将富集的细胞铺板在GM-CSF和IL-4中以诱导未成熟的DC。5天后，将未成熟DC与每种肽在37℃下温育1小时，然后添加细胞因子成熟混合物(GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6、TNFα、PGE1β)。将细胞在37℃下温育以使DC成熟。
抗原特异性T细胞的体外细胞毒性能力的评估
细胞毒性活性可通过流式细胞术检测靶细胞中切割的胱天蛋白酶3来测量。靶癌细胞被工程化以表达病毒肽以及适当的MHC-I等位基因。将模拟转导的靶细胞(即不表达病毒肽)用作阴性对照。用CFSE标记细胞以将它们与用作效应细胞的刺激的PBMC区分开。在收获前将靶细胞和效应细胞共培养6小时。进行细胞内染色以检测CFSE阳性靶细胞中胱天蛋白酶3的切割形式。特异性裂解的百分比计算如下：实验性胱天蛋白酶3的切割/胱天蛋白酶3的自发切割(在不存在突变肽表达的情况下测量)x100。
在一些实施例中，通过将诱导的T细胞与具有表达对应HLA的靶细胞的病毒抗原特异性T细胞群体共培养，并通过测定靶细胞的相对生长，以及特异性地测量靶细胞中的凋亡标志物膜联蛋白V，来评估细胞毒性活性。靶细胞被工程化以表达病毒肽，或者病毒肽是外源负载的。将模拟转导的靶细胞(即不表达病毒肽)、负载病毒肽的靶细胞或未负载肽的靶细胞用作阴性对照。细胞也被转导以稳定表达GFP，从而允许跟踪靶细胞生长。用IncuCyteS3装置随时间测量GFP信号或膜联蛋白-V信号。通过尺寸排阻过滤出源自效应细胞的膜联蛋白V信号。靶细胞生长和死亡分别表示为随时间变化的GFP和膜联蛋白-V面积(mm2)。
靶抗原活化T细胞的富集
可进一步富集病毒抗原应答T细胞。在本实施例中，探究了富集抗原应答T细胞的多种途径。在病毒抗原特异性T细胞的初始刺激之后，可在进一步扩增这些细胞之前使用富集程序。作为实例，刺激培养物并在第13天用与用于初始刺激相同的病毒肽脉冲，并且使用磁辅助细胞分离(MACS；Miltenyi)富集上调4-1BB的细胞。然后这些细胞可进一步扩增，例如，使用抗-CD3和抗-CD28微珠和低剂量IL-2。
用于所选择的肽的免疫原性测定
DC成熟后，将PBMC(大量或富集T细胞)添加到具有增殖细胞因子的成熟树突细胞中。使用功能测定和/或四聚体染色的组合监测培养物的病毒肽特异性T细胞。用病毒肽进行的平行免疫原性测定允许比较肽扩增肽特异性T细胞的相对效率。在一些实施方案中，肽在T细胞培养物中引发免疫应答包括检测T细胞培养物中FAS配体、粒酶、穿孔素、IFN、TNF或它们的组合的表达。
免疫原性可通过四聚体测定来测量。MHC四聚体是购买的或现场制造的，并且用于在免疫原性测定中测量肽特异性T细胞扩增。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体添加到含有1％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中的1x10^5个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。然后添加对T细胞标志物诸如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的终浓度，并将细胞在黑暗中在4摄氏度下温育20分钟。将细胞用冷的FACS缓冲液洗涤并重悬于含有1％甲醛的缓冲液中。在FACS Calibur(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用Cellquest软件(Becton Dickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，淋巴细胞门取自正向和侧向散点图。数据报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比。
免疫原性可通过细胞内细胞因子染色来测量。在不存在用于鉴定病毒抗原特异性T细胞群体的充分建立的四聚体染色的情况下，可使用充分建立的流式细胞术测定，使用细胞因子产生的评估来估计抗原特异性。简而言之，用目标病毒肽刺激T细胞并与对照进行比较。刺激后，通过细胞内染色评估CD4+ T细胞产生的细胞因子(例如，IFNγ和TNFα)。这些细胞因子，尤其是IFNγ，用于鉴定受刺激的细胞。
在一些实施方案中，通过使用ELISpot测定测量由T细胞表达的蛋白质或肽来测量免疫原性。使用ELISpot测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定以单细胞为基础测量T细胞的IFNγ释放。将靶细胞用10μM病毒肽在37℃下脉冲一小时，并洗涤三次。将1x10^5个肽脉冲的靶细胞在ELISPOT板孔中与取自免疫原性培养物的不同浓度的T细胞(5x10^2至2x10^3)共培养。根据制造商的方案对这些板进行显影，并在ELISPOT读数器(Cellular Technology Ltd.)上用附带的软件进行分析。对应于产生IFNγ的T细胞数量的斑点报告为每铺板的T细胞数量的斑点的绝对数量。测试用经修饰的肽扩增的T细胞识别用经修饰的肽脉冲的靶标的能力，以及识别用亲本肽脉冲的靶标的能力。
CD107a和CD107b在用病毒肽激活后在CD8+ T细胞的细胞表面上表达。T细胞的裂解性颗粒具有脂质双层，该脂双层含有溶酶体相关膜糖蛋白(“LAMP”)，其包括分子CD107a和b。当细胞毒性T细胞通过T细胞受体激活时，这些裂解性颗粒的膜动员并与T细胞的质膜融合。释放颗粒内容物，这导致靶细胞的死亡。由于颗粒膜与质膜融合，C107a和b暴露于细胞表面，因此是脱粒的标志。因为如通过CD107a和b染色测量的脱粒是在单细胞基础上报告的，所以该测定用于功能性地计数病毒肽特异性T细胞。为了进行该测定，将肽添加到HLA转染的细胞中至终浓度为20μM，将细胞在37℃下温育1小时，并洗涤三次。将1x10^5个肽脉冲的细胞等分到管中，并且将对CD107a和b特异性的抗体添加至制造商(Becton Dickinson)建议的终浓度。在添加T细胞之前添加抗体，以便在测定过程中当CD107分子瞬时出现在表面上时“捕获”它们。接着添加来自免疫原性培养物的1x10^5个T细胞，并将样品在37℃下温育4小时。对T细胞的附加细胞表面分子诸如CD8进一步染色，并在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得。使用附带的Cellquest软件分析数据，结果报告为CD8+CD107a和b+细胞的百分比。
细胞毒性活性使用铬释放测定来测量。将靶T2细胞在37℃下用Na51Cr标记1小时，然后将洗涤的5x10^3个靶细胞添加到来自免疫原性培养物的不同数量的T细胞中。在37℃下温育4小时后收集的上清液中测量铬释放。特异性裂解的百分比计算如下：实验释放-自发释放/总释放-自发释放x 100
进行免疫原性试验以评估每种肽是否可通过病毒抗原特异性扩增引发T细胞应答。阳性结果证明肽可诱导T细胞应答。如所述用多聚体读数测试了几种病毒肽引发CD8+ T细胞应答的能力。用第二多聚体制备物测量每个阳性结果以避免任何制备偏倚。在示例性测定中，将T细胞与负载病毒表位的单核细胞衍生的树突细胞共培养10天。使用多聚体(初始：BV421和PE；验证：APC和BUV396)分析CD8+ T细胞对病毒表位的病毒抗原特异性。
虽然抗原特异性CD8+ T细胞应答易于使用充分建立的HLA I类多聚体技术进行评估，但CD4+ T细胞应答需要单独的测定来评估，因为HLA II类多聚体技术未充分建立。为了评估CD4+ T细胞应答，用目标病毒肽再刺激T细胞。刺激后，通过细胞内染色评估CD4+ T细胞产生的细胞因子(例如，IFNγ和TNFα)。这些细胞因子，尤其是IFNγ，用于鉴定受刺激的细胞。
细胞扩增和制备
为了制备APC，采用以下方法：(a)从患者的外周血中获得自体免疫细胞；富集培养物中的单核细胞和树突细胞；负载病毒肽并使DC成熟。
T细胞诱导(方案1)
第一诱导：(a)从单采袋中获得自体T细胞；(b)耗尽CD25+细胞和CD14+细胞，或者仅耗尽CD25+细胞；(c)洗涤负载的肽并使DC细胞成熟，重悬于T细胞培养基中；(d)将T细胞与成熟的DC一起温育。第二诱导：(a)洗涤T细胞，并重悬于T细胞培养基中，并任选地评价来自细胞培养物的小等分试样以确定细胞生长、T细胞亚型的比较生长和诱导以及抗原特异性，并监测细胞群体的损失；(b)将T细胞与成熟DC一起温育。
第三诱导：(a)洗涤T细胞，并重悬于T细胞培养基中，并任选地评价来自细胞培养物的小等分试样以确定细胞生长、T细胞亚型的比较生长和诱导以及病毒抗原特异性，并监测细胞群体的损失；(b)将T细胞与成熟DC一起温育。
为了收获肽活化T细胞并冷冻保存T细胞，可采用以下方法：(a)洗涤并重悬包含活化T细胞的最终制剂，该活化T细胞处于构成药物物质(DS)的期望特征的细胞类型的最佳细胞数量和比例。释放标准测试尤其包括无菌性、内毒素、细胞表型、TNC计数、活力、细胞浓度、效力；(b)将药物物质填充到合适的封闭式输注袋中；(c)保存至使用时间。
CD4+和CD8+病毒抗原特异性T细胞的功能表征方法。
开发了T细胞生产工艺以通过多轮离体T细胞刺激提高对病毒抗原的记忆和从头CD4+和CD8+ T细胞应答，从而生成用于过继性细胞疗法的病毒抗原反应性T细胞产物。受刺激的T细胞产物的详细表征可用于测试这些方法利用的许多潜在变量。为了探测T细胞的功能性和/或特异性，开发了同时检测病毒抗原特异性T细胞应答并表征其量级和功能的测定。该测定采用以下步骤。首先，使用T细胞-APC共培养物引发病毒抗原特异性T细胞中的反应性。任选地，采用使用荧光细胞条形码的样品多重化。为了鉴定病毒抗原特异性CD8+ T细胞和检查T细胞功能性，使用FACS分析同时探测肽-MHC多聚体的染色和多参数细胞内和/或细胞表面细胞标志物染色。这种简化测定的结果证明了其在研究由健康供体诱导的T细胞应答中的应用。在供体中鉴定了针对肽诱导的病毒抗原特异性T细胞应答。还比较了诱导的T细胞应答的量级、特异性和功能性。简而言之，用不同浓度的不同荧光染料对不同的T细胞样品进行条形码标记(参见例如，实施例19)。每个样品接受不同浓度的荧光染料或不同浓度的多种染料的组合。将样品重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后添加溶于DMSO(通常以1∶50稀释)中的荧光团至5μM的最大终浓度。在37℃下标记5分钟后，通过添加含蛋白质的培养基(例如含有10％合并的人AB型血清的RPMI培养基)淬灭过量的荧光染料。用如上所述的用病毒抗原性肽脉冲的自体APC攻击独特条形码标记的T细胞培养物。
将差异标记的样品合并到一个FACS管或孔中，如果所得体积大于100μL，则再次沉淀。用包括荧光染料缀合的肽-MHC多聚体的表面标记抗体对合并的条形码标记的样品(通常为100μL)进行染色。在固定和透化后，用靶向TNF-α和IFN-γ的抗体对样品进行细胞内染色。
然后在流式细胞仪上通过流式细胞术同时分析合并的条形码标记的T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色。与分别分析T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的其他方法不同，本实施例中描述的对T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析提供了关于既是病毒抗原特异性的又具有增加的细胞标志物染色的T细胞百分比的信息。分析T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的其他方法单独确定样品中病毒抗原特异性T细胞的百分比，并单独确定具有增加的细胞标志物染色的T细胞的百分比，从而仅允许这些频率相关联。
本实施例中描述的对T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析不依赖于病毒抗原特异性T细胞的频率和具有增加的细胞标志物染色的T细胞的频率的相关性；相反，它提供了既是病毒抗原特异性的又具有增加的细胞标志物染色的T细胞的频率。本实施例中描述的对T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析允许在单个细胞水平上测定那些既是病毒抗原特异性的又具有增加的细胞标志物染色的细胞。
为了评价给定诱导过程的成功，可使用召回率应答测定，随后进行多重多参数流式细胞术面板分析。用独特的双色荧光细胞条形码标记取自诱导培养物的样品。将标记的细胞在负载病毒抗原的DC或未负载的DC上温育过夜，以刺激病毒抗原特异性细胞中的功能性应答。第二天，在抗体和多聚体染色之前将独特标记的细胞合并。用于T细胞培养的示例性材料提供如下：
材料：AIM V培养基(Invitrogen)人FLT3L；临床前CellGenix#1415-050储液50ng/μL TNFα；临床前CellGenix#1406-050储液10ng/μL；IL-1β，临床前CellGenix#1411-050储液10ng/μL；PGE1或前列地尔-来自Czech republic的Cayman，储液0.5μg/μL；R10培养基-RPMI 1640glutamax+10％人血清+1％PenStrep；20/80培养基-18％AIM V+72％RPMI1640glutamax+10％人血清+1％PenStrep；IL7储液5ng/μL；IL15储液5ng/μL；DC培养基(Cellgenix)；CD14微珠，人，Miltenyi#130-050-201，细胞因子和/或生长因子，T细胞培养基(AIM V+RPMI 1640glutamax+血清+PenStrep)，肽储液-1mM/肽病毒肽)。
实施例13.设计Orf1ab最小表位的接头
本实施例显示，使用基于MS的HLA-I切割预测因子设计这些串以优化Orf1ab表位或含有最少表位的延伸序列的排序，从而添加尽可能少的接头同时保持有效的表位切割(图9)。除了RS-C6中两个序列被去除之外，每个串变体中都包括相同的18个Orf1ab序列。然而，序列组和所设计的切割接头的排序根据侧翼背景而不同。串RS C8被特别设计为使得最小Orf1ab最小表位序列彼此紧密接近，在表位的任一侧利用基于MS的切割预测因子并且需要最小接头序列。
表13-针对切割优化的示例性Orf1ab表位
实施例14.动物模型中的免疫原性研究
本实施例展示了基于免疫原性选择链的方法，并且一个或多个结构域可用于开发。在图10A中描述了用于测试mRNA串疫苗的模型研究；或者比较由靶向病毒分泌结构域(SEC结构域)或胞质尾TM结构域的疫苗提供的免疫原性来验证免疫原性应答。在示例性测定中，向每组6-8周龄雌性BALB/c小鼠和HLA-A2转基因小鼠肌内注射施用四种mRNA串构建体中的一种(5微克/小鼠)，并在注射后7、14、21和28天收集血样。在第14天和第28天对动物实施安乐死并收获器官。
在如图10B所例示的更精细的研究设计中，比较了不同的疫苗策略：单一疫苗：(a)单独的刺突mRNA疫苗，或(b)单独的串疫苗，以及组合，(c)首先是刺突疫苗，随后是串疫苗；(d)首先是串疫苗，随后是刺突疫苗；(e)刺突疫苗和串疫苗以第一比率(例如，9∶1)的共制剂；(f)刺突疫苗和串疫苗以第二比率(例如，3∶1)的共制剂；(g)刺突疫苗和串疫苗以第三比率(例如，1∶1)的共制剂。在一项研究中，在第14天处死每组的约一半小鼠，并且在第28天处死其余小鼠。分析样品的细胞因子和趋化因子生成，用在第14和21天收集的样品进行ELISPOT，通过流式细胞术测试T细胞亚群的抗病毒细胞因子应答、表面标志物表达、谱系标志物。还在体外测量T细胞的抗原特异性应答。还测试了组织样品中脾、引流淋巴结和血液中刺突抗体、T细胞应答和T细胞亚群的存在。
实施例15.RECON预测与来自独立研究的验证的相关性
从T细胞免疫原性研究和质谱研究导出的大量数据目前在世界范围内是可获得的，这些数据与本研究中首次报告并在表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B、表9、表10、表11、表12、表14A、表14B、表15或表16的表位序列中提供的表位预测强烈相关并验证了该表位预测。在世界范围内进行的研究中的这种验证和强相关性使得预测算法的可靠性具有高置信度。表14A和表14B例示了MS观察到的表位验证。
表14A-BNT-刺突疫苗构建体的示例性表位
表14B-示例性多蛋白表位串构建体
上述数据代表19项研究，涵盖1180个I类表位，包括881个I类独特表位序列。多达756(86％)具有与RECON预测的精确匹配。872(98％)个序列在RECON预测中具有超串或子串。这些研究表明通过RECON预测表位与实际T细胞免疫原性观察数据的高度相关性。
实施例16.SARS CoV-2的序列可变性
在本实施例中，根据串疫苗可提供的保护，示出了SARS CoV-2的序列变异性。图11-图17展示了沿SARS CoV-2基因组的变体或突变氨基酸位置的检测/鉴定。这继而用于评估串疫苗对变体的敏感性。这些图突出了由串覆盖的表位覆盖的区域。如至少在这些图中所示，并且还与本文其他地方提供的串序列的信息相结合，来自多种不同病毒蛋白的多个表位被包括在每个串中。即，如果一个表位覆盖突变序列，则至少保留其他表位以提供针对病毒株的免疫应答。这种设计确保不仅更宽和更强的免疫原性应答可由疫苗触发，而且重要的是注意到病毒的不同变体和突变体被串疫苗所覆盖。由此可见，构建体的设计提供了避免病毒逃逸变体的良好机制，如图11-图17中的分析所证明的。这提供了对串疫苗可赋予非变体依赖性的保护性免疫的支持。
实施例17.使用HLA-肽呈递预测算法的预测
在机器学习HLA-肽呈递预测算法RECON中的更新运行预测了以高评分(即，代表表位肽实际上将由HLA等位基因呈递的高可能性的评分)预测的较新表位。这些表位-HLA对列于下表16中。对于每一对，预测左列(第1列或第3列)中的表位肽序列由同一行中紧邻其右列(分别为第2列或第4列)的HLA呈递。
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Claims (98)

1.一种组合物，其包含：
(i)多肽，所述多肽包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列，和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列；
(ii)编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含以下中的至少两种：(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列，和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列；
(iii)T细胞受体(TCR)或包含所述TCR的T细胞，其中所述TCR结合所述多肽的与对应HLAI类或II类分子复合的表位序列；
(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或
(v)抗体或包含所述抗体的B细胞，其中所述抗体结合所述多肽的表位序列；和
药学上可接受的赋形剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含(a)包含来自ORF1ab的表位序列的序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列在所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列的C末端。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列在所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列在所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列的N末端。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含(a)来自ORF1ab的2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个表位序列，(b)包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列和(c)包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述来自ORF1ab的表位序列是来自非结构蛋白(NSP)的表位序列。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述非结构蛋白(NSP)选自由NSP1、NSP2、NSP3、NSP4以及它们的组合组成的组。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含含有来自NSP1的表位序列的序列、含有来自NSP2的表位序列的序列、含有来自NSP3的表位序列的序列和含有来自NSP4的表位序列的序列。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述来自ORF1ab的表位序列选自由YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK以及它们的任何组合组成的组。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述来自核衣壳糖蛋白(N)的表位序列是LLLDRLNQL。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述来自膜磷蛋白(M)的表位序列是VATSRTLSY。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列和来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含(a)来自ORF1ab的以下表位序列中的每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、KTIQPRVEK；(b)来自核衣壳糖蛋白(N)的为LLLDRLNQL的表位序列；和(c)来自膜磷蛋白(M)的为VATSRTLSY的表位序列。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：MVTNNTFTLKVPHVGEIPVAYRKVLLKTIQPRVEKYLFDESGEFKLSEVGPEHSLAEYYIFFASFYY；
LLSAGIFGAITDVFYKENSYKVPTDNYITTY；以及它们的组合。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：ADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ；
GLMWLSYF；以及它们的组合。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列的序列选自由以下序列或其片段组成的组：
SPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDK以及它们的组合。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含一个或多个接头序列。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述一个或多个接头序列选自由GGSGGGGSGG、GGSLGGGGSG组成的组。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述一个或多个接头序列包含切割序列。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述一个或多个切割序列选自由FRAC、KRCF、KKRY、ARMA、RRSG、MRAC、KMCG、ARCA、KKQG、YRSY、SFMN、FKAA、KRNG、YNSF、KKNG、RRRG、KRYS和ARYA组成的组。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含跨膜结构域序列。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述跨膜结构域序列在所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列的C末端，所述序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且所述序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。
24.如权利要求22所述的组合物，其中所述跨膜结构域序列是
25.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含SEC序列。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述SEC序列在所述包含来自ORF1ab的表位序列的序列的N末端，所述序列包含来自膜糖蛋白(M)的表位序列并且所述序列包含来自核衣壳磷蛋白(N)的表位序列。
27.如权利要求25所述的组合物，其中所述SEC序列是MFVFLVLLPLVSSQCVNLT。
28.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含编码所述多肽的所述多核苷酸。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含用于在人中表达的密码子优化的序列。
31.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含dEarI-hAg序列。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述dEarI-hAg序列是ATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC，任选地其中每个T是U。
33.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含Kozak序列。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述Kozak序列是GCCACC。
35.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含F元件序列。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述F元件序列是氨基末端分裂增强子(AES)的3UTR。
37.如权利要求35所述的组合物，其中所述F元件序列是CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC，任选地其中每个T是U。
38.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含I元件序列。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述I元件序列是线粒体编码的12S rRNA(mtRNR1)的3′UTR。
40.如权利要求38所述的组合物，其中所述I元件序列是CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACC，任选地其中每个T是U。
41.如权利要求28所述的组合物，其中所述多核苷酸包含多聚腺苷酸序列。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述多聚腺苷酸序列是AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，任选地其中每个T是U。
43.如权利要求1所述的组合物，其中来自所述ORF1ab、所述膜糖蛋白和所述核衣壳磷蛋白的所述表位序列中的每一者来自2019SARS-CoV-2。
44.如权利要求1所述的组合物，其中一个或多个或每个表位引发T细胞应答。
45.如权利要求1所述的组合物，其中一个或多个或每个表位已通过质谱法观察到由HLA分子呈递。
46.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含(i)与选自由RS C1p1full、RSC2p1full、RS C3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RS C5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽；(ii)编码与选自由RSC1p1full、RS C2p1full、RS C3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RS C5p2full、RSC6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RSC8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽的多核苷酸；或(iii)与选自由SEQ ID NO：RS C1n1、RS C2n1、RS C3n1、RS C4n1、RS C5n1、RS C6n1、RS C7n1、RS C8n1、RS C5n2、RS C6n2、RS C7n2、RS C8n2、RS C5n2full、RS C6n2full、RSC7n2full和RS C8n2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多核苷酸。
47.一种药物组合物，其包含如权利要求1-46中任一项所述的组合物。
48.一种药物组合物，其包含：
(i)包含表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B和/或表16的表位序列的多肽；
(ii)编码包含表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B和/或表16的表位序列的所述多肽的多核苷酸；
(iii)T细胞受体(TCR)或包含所述TCR的T细胞，其中所述TCR结合与对应HLA I类或II类分子复合的所述表位序列；
(iv)包含(i)或(ii)的抗原呈递细胞；或
(v)抗体或包含所述抗体的B细胞，其中所述抗体结合所述表位序列；和
药学上可接受的赋形剂。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：YLFDESGEFKL、YLFDESGEF、FGDDTVIEV、LLLDRLNQL、QLMCQPILL、TTDPSFLGRY、PTDNYITTY、PSFLGRY、AEAELAKNV、VATSRTLSY和KTIQPRVEK。
50.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV、FGADPIHSL、NYNYLYRLF、KYIKWPWYI、KWPWYIWLGF、LPFNDGVYF、QPTESIVRF、IPFAMQMAY、YLQPRTFLL和RLQSLQTYV。
51.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自orf1ab蛋白。
52.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自orf1a蛋白。
53.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自表面糖蛋白(S)或其移位阅读框。
54.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自核衣壳磷蛋白(N)。
55.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF3a蛋白。
56.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自膜糖蛋白(M)。
57.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF7a蛋白。
58.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF8蛋白。
59.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自包膜蛋白(E)。
60.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF6蛋白。
61.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF7b蛋白。
62.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF10蛋白。
63.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述表位序列来自ORF9b蛋白。
64.一种药物组合物，其包含：具有与表11第2列、表12第2列或表15第3列中描绘的序列中的任一者的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；或编码多肽的重组多核苷酸，所述多肽具有与表11第2列、表12第2列或表15第3列中描绘的序列中的任一者的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的氨基酸序列。
65.如权利要求64所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：与选自由RSC1p1full、RS C2p1full、RS C3p1full、RS C4plfull、RS C5p1、RS C5p2、RS C5p2full、RSC6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7p1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RS C8p2和RSC8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽；或编码与选自由RS C1p1full、RS C2p1full、RS C3p1full、RS C4p1full、RS C5p1、RS C5p2、RSC5p2full、RS C6p1、RS C6p2、RS C6p2full、RS C7β1、RS C7p2、RS C7p2full、RS C8p1、RSC8p2和RS C8p2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多肽的多核苷酸。
66.如权利要求64所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含与选自由SEQ ID NO：RS C1nl、RS C2nl、RS C3n1、RS C4n1、RS C5n1、RS C6n1、RS C7n1、RS C8n1、RS C5n2、RSC6n2、RS C7n2、RS C8n2、RS C5n2full、RS C6n2full、RS C7n2full和RS C8n2full组成的组的序列具有至少70％、80％、90％或100％序列同一性的多核苷酸。
67.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
68.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或多种脂质组分。
69.如权利要求68所述的药物组合物，其中所述一种或多种脂质包括脂质纳米颗粒(LNP)。
70.如权利要求69所述的药物组合物，其中所述LNP包封所述重组多核苷酸构建体。
71.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽是合成的。
72.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽是重组的。
73.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽的长度为8-1000个氨基酸。
74.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列以1000nM或更小的KD结合或预测结合HLA I类或II类分子。
75.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列以500nM或更小的KD结合或预测结合HLA I类或II类分子。
76.如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物，其中所述表位序列包含由受试者的病毒感染的细胞表达的病毒蛋白的序列。
77.如权利要求76所述的药物组合物，其中所述病毒是2019SARS-CoV 2。
78.一种治疗或预防病毒感染或治疗与病毒感染相关的呼吸道疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述病毒是2019 SARS-CoV 2。
81.如权利要求78所述的方法，其中由所述受试者表达的HLA分子在施用时是未知的。
82.如权利要求78所述的方法，其中所述病毒避免被所述受试者的免疫系统识别的逃逸能力与所述病毒避免被施用含有来自单一蛋白质的表位或来自比如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物中更少的蛋白质的表位的药物组合物的受试者的免疫系统识别的逃逸能力相比更小。
83.如权利要求78所述的方法，其中所述受试者表达由表1A、表1B、表1C、表2Ai、表2Aii、表2B和表16中的任一者的HLA等位基因编码的HLA分子，并且所述表位序列是HLA等位基因匹配的表位序列。
84.如权利要求78所述的方法，其中所述表位序列包含以下中的一者或多者或每一者：SAPPAQYEL、AVASKILGL、EYADVFHLY、DEFTPFDVV、VRIQPGQTF、SFRLFARTR、KFLPFQQF、VVQEGVLTA、RLDKVEAEV和FGADPIHSL。
85.一种治疗或预防有需要的受试者中的2019 SARS-CoV 2感染的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求47、48或64中任一项所述的药物组合物。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物是作为用于所述受试者中的所述2019 SARS-CoV 2病毒感染的一种或多种治疗剂的补充施用的。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物与以下项组合施用：(a)具有2019SARS-CoV 2剌突蛋白或其片段的氨基酸序列的多肽；(b)编码2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的重组多核苷酸；或包含(a)或(b)的2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段是SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物在第一次施用所述2019 SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物后1-10周施用。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物在第一次施用所述2019 SARS-CoV2刺突蛋白药物组合物后1-6周、1-6个月或1-2年或更晚施用。
91.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物与所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物的施用在同一天或同时施用。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述药物组合物与具有2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的氨基酸序列的所述多肽或编码2019 SARS-CoV 2刺突蛋白或其片段的所述重组多核苷酸共同配制。
93.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物在施用所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物之前施用，诸如在施用所述2019 SARS-CoV 2刺突蛋白药物组合物之前2-10周施用。
94.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物预防性地施用。
95.如权利要求85所述的方法，其中所述药物组合物每1、2、3、4、5、6或更多周施用一次；或每1-7、7-14、14-21、21-28或28-35天施用一次；或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天施用一次。
96.如权利要求1-46中任一项所述的组合物用于制备用于治疗或预防由2019 SARSCoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染的治疗剂的用途。
97.根据权利要求1-46中任一项所述的组合物或根据权利要求47、48和64中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
98.根据权利要求1-46中任一项所述的组合物或根据权利要求47、48和64中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防由2019 SARS CoV-2病毒引起的呼吸道病毒感染。
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