JP2024069426A - ネオ抗原およびそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ネオ抗原およびそれらの使用の提供。【解決手段】本明細書での開示は、ネオエピトープを含む免疫療法ペプチドを含む免疫療法組成物に関する。免疫療法ペプチドをコードするポリヌクレオチドも本明細書で開示される。ネオエピトープを含む免疫療法ペプチドの合成方法、および処置方法を含む免疫療法組成物の使用も、本明細書で開示される。一態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、上記の態様のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。【選択図】なし

Description

相互参照
本願は、２０１８年６月１９日に出願した米国特許仮出願第６２／６８７，１９１号、２０１８年７月２４日に出願した米国特許仮出願第６２／７０２，５６７号、２０１８年９月４日に出願した米国特許仮出願第６２／７２６，８０４号、２０１９年１月７日に出願した米国特許仮出願第６２／７８９，１６２号、２０１９年２月６日に出願した米国特許仮出願第６２／８０１，９８１号、２０１９年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／８００，７００号、および２０１９年２月４日に出願した米国特許仮出願第６２／８００，７９２号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がん免疫療法は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、がん細胞が、自体の表面に免疫系により検出され得る分子を有することが多いという事実を活用し、これらの分子は、腫瘍抗原として公知であり、タンパク質または他の巨大分子（例えば、炭水化物）であることが多い。能動免疫療法は、腫瘍抗原を標的化することにより腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を方向付ける。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強するものであり、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞を認識して溶解する抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するために共に働く、腫瘍抗原および免疫刺激分子（例えば、アジュバント、サイトカインまたはＴＬＲリガンド）で概して構成されている。根治的かつ腫瘍特異的な免疫療法の開発に対する深刻な障害の１つは、自己免疫を回避するための高特異的な限定された腫瘍抗原の同定および選択である。
悪性細胞内の遺伝子変化（例えば、逆位、転座、欠失、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異など）の結果として生じる腫瘍ネオ抗原は、腫瘍特異性が最も高い抗原クラスの代表であり、患者特異的であることもあり、または共有されることもある。腫瘍ネオ抗原は、突然変異およびその対応するタンパク質がその腫瘍にのみ存在するので、腫瘍細胞に特有である。それらはまた、中枢性寛容を回避し、したがって、免疫原性である可能性がより高い。したがって、腫瘍ネオ抗原は、体液性免疫と細胞免疫の両方によるものを含む免疫認識の優れた標的を提供する。しかし、腫瘍ネオ抗原は、それらの同定、最適化された抗原の選択、およびワクチンまたは免疫原性組成物に使用するためのネオ抗原の産生が技術的に困難であるため、がんワクチンまたは免疫原性組成物にはほとんど使用されていない。したがって、さらなるがん治療薬の開発が依然として必要とされている。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、（ａ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドもしくはその薬学的に許容される塩であって、（ｉ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、（ｉｉ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端配列が、第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端配列とオーバーラップしており、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列：ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、少なくとも１つのポリペプチドもしくはその薬学的に許容される塩、または（ｂ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、医薬組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ペプチド配列は、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸は、配列：ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬ（配列番号３）の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸は、配列：ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号４）の少なくとも１個のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の少なくとも一方は、少なくとも１４個の突然変異型アミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも３つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、第３の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列をさらに含み、第３の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸は、配列番号２の配列の少なくとも１個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、第３のＧＡＴＡ３突然変異型ペプチドは、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、（ａ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、（ｂ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、（ｃ）ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、または（ｄ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、（ａ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合し、または結合すると予測され；（ｂ）第２のＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合し、または結合すると予測され；第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、または結合すると予測される。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の少なくとも一方は、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に５００ｎＭ未満の親和性で結合する。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ペプチド配列の少なくとも一方は、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１時間より長く安定して結合する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、以下の配列：（ａ）ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、（ｂ）ＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、（ｃ）ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ、（ｄ）ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ならびに／あるいは（ｅ）ＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩのうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、以下の配列：（ａ）ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、（ｂ）ＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、（ｃ）ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ、（ｄ）ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ならびに／あるいは（ｅ）ＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩのうちの少なくとも２つを含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、（ａ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｂ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｂ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｃ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｃ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｄ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｅ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｃ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｆ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｇ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｈ）（ｃ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；（ｉ）（ｃ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列；または（ｊ）（ｄ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、表５および／または表６のペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＧＡＴＡ３タンパク質の第１のネオエピトープを含み、第２のペプチド突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、突然変異型ＧＡＴＡタンパク質の第２のネオエピトープを含み、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なり、第１のネオエピトープは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、第２のネオエピトープは、同じ突然変異型アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、［Ｘａａ］Ｆ－［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃまたは［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃ－［Ｘａａ］Ｆの式で表され、式中、各Ｘａａは、アミノ酸であり、［Ｘａａ］Ｎおよび［Ｘａａ］Ｃ各々は、ＧＡＴＡ３遺伝子の異なる部分によりコードされるアミノ酸配列を含み、［Ｘａａ］Ｆは、任意のアミノ酸配列であり、［Ｘａａ］Ｎは、ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、［Ｘａａ］Ｃは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、Ｎは、０～１００の整数であり、Ｃは、１～１００の整数であり、Ｆは、０～１００の整数であり、ＮとＭの和は、少なくとも８である。
一部の実施形態では、［Ｘａａ］Ｆの各Ｘａａは、リシン残基であり、Ｆは、１～１００、１～１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１の整数である。一部の実施形態では、Ｆは、３、４または５である。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、少なくとも５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、表１または表２の配列を含む。一部の実施形態では、組成物は、免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣである。
一態様では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む医薬組成物であって、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤ、およびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨからなる群から選択される配列を含む、医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤである。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨである。
一部の実施形態では、医薬組成物は、０．１ｍＭ～１ｍＭの濃度で存在するｐＨ調整剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１ｍＭ～１０ｍＭの濃度で存在するｐＨ調整剤を含む。
一態様では、ＧＡＴＡ３ペプチドを合成する方法であって、ペプチドが、Ｘａａ－Ｃｙｓ、Ｘａａ－Ｓｅｒ、およびＸａａ－Ｔｈｒ（これらの式中のＸａａは、任意のアミノ酸である）からなる群から選択される少なくとも２個の連続するアミノ酸の配列を含み、（ａ）少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸またはその誘導体とカップリングさせて、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを得るステップであって、ジペプチドまたはその誘導体が、シュードプロリン部分を含む、ステップ、（ｂ）１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンとカップリングさせるステップ、および（ｃ）ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを樹脂から切断するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを脱保護するステップを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体がカップリングされるアミノ酸またはその誘導体は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、およびＶａｌからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンと必要に応じてカップリングされる１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを含む。
一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のＮ末端アミノ酸またはその誘導体は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨからなる群から選択される。
一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、（ａ）Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、（ｂ）Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、（ｃ）Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、（ｄ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、（ｅ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（ｐｓｉ（Ｄｍｐ，Ｈ）ｐｒｏ）－ＯＨである。一部の実施形態では、（ａ）Ｘａａ－Ｓｅｒは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒであり、（ｂ）Ｘａａ－Ｓｅｒは、Ｇｌｕ－Ｓｅｒであり、（ｃ）Ｘａａ－Ｔｈｒは、Ａｌａ－Ｔｈｒであり、（ｄ）Ｘａａ－Ｔｈｒは、Ｌｅｕ－Ｔｈｒであり、または（ｅ）Ｘａａ－Ｃｙｓは、Ｌｅｕ－Ｃｙｓである。
一態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、上記の態様のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一態様では、がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現する者として対象を同定するステップを含み；治療薬が、（ａ）１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸の断片である、少なくとも１つのポリペプチド；または（ｂ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み；１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々またはその一部分が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／もしくはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するものである、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。
一態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、医薬組成物を対象に投与するステップを含み；医薬組成物が、（ａ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、（ｉ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、（ｉｉ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端配列が、第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端配列とオーバーラップしており、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、少なくとも１つのポリペプチド；または（ｂ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み；対象により発現されるＨＬＡアレルが投与の時点で不明である、方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸は、配列：ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、抗エストロゲン療法に対して抵抗性である、ＭＳＩ乳がんである、転移性乳がんである、Ｈｅｒ２陰性乳がんである、Ｈｅｒ２陽性乳がんである、ＥＲ陰性乳がんである、ＥＲ陽性乳がんである、ＰＲ陽性乳がんである、ＰＲ陰性乳がんまたはこれらの任意の組合せである、乳がんを有する。
一部の実施形態では、乳がんは、突然変異を有するエストロゲン受容体を発現する。一部の実施形態では、上記の態様の方法は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法は、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、抗ＣＤ４０剤、レトロゾール、フルベストラント、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、および／またはＣＤＫ４／６阻害剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、セリシクリブ、ジナシクリブ、ミルシクリブ、ロニシクリブ、アツベシクリブ、ブリシクリブ、リビシクリブ、セリシクリブ、トリラシクリブ、ボルシクリブまたはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９）；リボシクリブ（ＬＥＥ ０１１）；ボルシクリブ（Ｐ１４４６Ａ－０５）；ファスカプリシン；アルシリアフラビン；２－ブロモ－１２，１３－ジヒドロ－５Ｈ－インドロ［２，３－ａ］ピロロ［３，４－ｃ］カルバゾール－５，７（６Ｈ）－ジオン；３－アミノチオアクリドン（３－ＡＴＡ）、ｔｒａｎｓ－４－（（６－（エチルアミノ）－２－（（１－（フェニルメチル）－１Ｈ－インドール－５－イル）アミノ）－４－ピリミジニル）アミノ）－シクロヘキサノ（ＣＩＮＫ４）；１，４－ジメトキシアクリジン－９（１０Ｈ）－チオン（ＮＳＣ ６２５９８７）；２－メチル－５－（ｐ－トリルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－４，７－ジオン（リュウビジン）；フラボピリドール（アルボシジブ）；セリシクリブ；ジナシクリブ；ミルシクリブ；ロニシクリブ；アツベシクリブ；ブリシクリブ；リビシクリブ；トリラシクリブ（Ｇ１Ｔ２８）；またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパリリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウムブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７またはＡＥＺＳ－１３６である。
一部の実施形態では、がんは、再発または転移性乳がんである。一部の実施形態では、対象は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせての内分泌療法後に疾患進行を経験したことがある、または対象が、以前に全身療法を受けたことがない。一部の実施形態では、方法は、対象の細胞のエストロゲン受容体遺伝子の突然変異状態を判定するステップを含む。一部の実施形態では、細胞は、単離された細胞であるか、またはエストロゲン受容体の発現が増された細胞である。
態様では、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸の断片である、少なくとも１つのポリペプチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含むか；またはＨＬＡタンパク質との複合体を形成している、少なくとも１つのポリペプチドのネオエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、配列番号１または２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
態様では、２つもしくはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、２つもしくはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、第１のＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端配列が、第２のＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端配列とオーバーラップしている、少なくとも１つのポリペプチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含むか；またはＨＬＡタンパク質との複合体を形成している、少なくとも１つのポリペプチドのネオエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子のフレームシフト突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の断片を含む。一部の実施形態では、少なくとも８個の連続するアミノ酸は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列によりコードされる少なくとも１個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異は、フレームシフト突然変異である。一部の実施形態では、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異は、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異、または遺伝子融合突然変異である。一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の突然変異型アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチドを含み、または少なくとも１つのポリヌクレオチドは、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つもしくは複数のＧＡＴＡ３ペプチド配列の少なくとも１つ、または２つもしくはそれより多くのＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちの少なくとも１つは、ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちの少なくとも２つは、ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちの少なくとも１つは、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちの少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０は、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちのものの各々は、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のうちの少なくとも１つは、配列番号３の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、少なくとも８個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも１個は、配列番号４のアミノ酸である。一部の実施形態では、少なくとも８個の連続するアミノ酸のうちのある連続するアミノ酸は、配列番号４のアミノ酸でない。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、またはＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列と、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される第２のＧＡＴＡ３ペプチド配列とを含み、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、または結合すると予測される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１０μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満の親和性で結合する、少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に２４時間より長く、１２時間より長く、９時間より長く、６時間より長く、５時間より長く、４時間より長く、３時間より長く、２時間より長く、１時間より長く、４５分より長く、３０分より長く、１５分より長く、または１０分より長く安定して結合する、少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡアレルは、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ２４：０２、ＨＬＡ－Ａ０３：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、以下の配列：ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ；および／またはＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ；および／またはＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬおよび／またはＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩのうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、以下の配列：ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ；および／またはＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ；および／またはＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬおよび／またはＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩのうちの少なくとも２つを含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、以下の配列：ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤ、ＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳ、およびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩのうちの少なくとも２つを含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、表５および／または表６の少なくとも２つの配列を含む。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、ＧＡＴＡ３タンパク質の第１のネオエピトープを含み、第２のペプチド突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、突然変異型ＧＡＴＡタンパク質の第２のネオエピトープを含み、第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なり、第１のネオエピトープは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、第２のネオエピトープは、同じ突然変異型アミノ酸を含む。
態様では、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも１つのポリペプチドが、
［Ｘａａ］Ｆ－［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃの式で表され、式中、各Ｘａａは、独立して、任意のアミノ酸であり、［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃは、１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を表し、［Ｘａａ］Ｎおよび［Ｘａａ］Ｃ各々は、ＧＡＴＡ３遺伝子の異なる部分によりコードされる連続するアミノ酸配列を含み、［Ｘａａ］Ｎは、非野生型リーディングフレームにコードされ、［Ｘａａ］Ｃは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、非野生型リーディングフレームにコードされ、Ｎは、０～１００の整数であり、Ｃは、１～１００の整数であり、Ｆは、０～１００の整数であり、ＮとＭの和は、少なくとも８である組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々について、少なくとも８個の連続するアミノ酸は、［Ｘａａ］Ｆ－［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃまたは［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃ－［Ｘａａ］Ｆの式で表され、式中、各Ｘａａは、アミノ酸であり、［Ｘａａ］Ｎおよび［Ｘａａ］Ｃ各々は、ＧＡＴＡ３遺伝子の異なる部分によりコードされるアミノ酸配列を含み、［Ｘａａ］Ｆは、任意のアミノ酸配列であり、［Ｘａａ］Ｎは、ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、［Ｘａａ］Ｃは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、Ｎは、０～１００の整数であり、Ｃは、１～１００の整数であり、Ｆは、０～１００の整数であり、ＮとＭの和は、少なくとも８である。一部の実施形態では、［Ｘａａ］Ｆの各Ｘａａは、リシン残基であり、Ｆは、１～１００、１～１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１の整数である。一部の実施形態では、Ｆは、３、４または５である。
一部の実施形態では、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続する突然変異型アミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、最大でも５０００μｇ／ｍＬ、最大でも２５００μｇ／ｍＬ、最大でも１０００μｇ／ｍＬ、最大でも７５０μｇ／ｍＬ、最大でも５００μｇ／ｍＬ、最大でも４００μｇ／ｍＬ、または最大でも３００μｇ／ｍＬの濃度でのみ存在する。一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々は、１０μｇ／ｍＬ～５０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～４０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～３０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～２０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、または３０００μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
一部の実施形態では、組成物は、免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣである。態様では、本明細書に記載の組成物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、１ｍＭ未満の濃度または１ｍＭより高い濃度で存在するｐＨ調整剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ワクチン組成物である。一部の実施形態では、医薬組成物は、水性である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドのうちの１つまたは複数は、ｐＩ＞５かつＨＹＤＲＯ＞－６、ｐＩ＞８かつＨＹＤＲＯ＞－８、ｐＩ＜５かつＨＹＤＲＯ＞－５、ｐＩ＞９かつＨＹＤＲＯ＜－８、ｐＩ＞７かつＨＹＤＲＯ値＞－５．５、ｐＩ＜４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＜－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつＨＹＤＲＯ≦－４．、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９、５≧ｐＩ≧１２かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９により限定される。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、塩基である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、弱酸のコンジュゲート塩基である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、ジカルボン酸塩またはトリカルボン酸塩である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、クエン酸および／またはクエン酸塩である。一部の実施形態では、クエン酸塩は、クエン酸二ナトリウムおよび／またはクエン酸三ナトリウムである。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、コハク酸および／またはコハク酸塩である。一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウムおよび／またはコハク酸一ナトリウムである。一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウム・六水和物である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、０．１ｍＭ～１０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、０．１ｍＭ～５ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、０．１ｍＭ～１ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、１ｍＭ～１０ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、１ｍＭ～５ｍＭの濃度で存在する。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、液体を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、水を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、糖を含む。一部の実施形態では、糖は、デキストロースまたはマンニトールを含む。一部の実施形態では、デキストロースまたはマンニトールは、１～１０％ ｗ／ｖの濃度で存在する。一部の実施形態では、糖は、トレハロースを含む。一部の実施形態では、糖は、スクロースを含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
一部の実施形態では、ＤＭＳＯは、０．１％～１０％、０．５％～５％、１％～５％、２％～５％、２％～４％、または２％～４％の濃度で存在する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫調節物質またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＡＲＮＡＸ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタナイドＩＭＳ１３１２、モンタナイドＩＳＡ２０６、モンタナイドＩＳＡ５０Ｖ、モンタナイドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）、ベクター系、ＰＬＧＡ微小粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。
一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣを含む。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、２：１～１：１０ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４または１：５ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：３ ｖ：ｖである。
態様では、ＧＡＴＡ３ペプチドを合成する方法であって、ペプチドが、Ｘａａ－Ｃｙｓ、Ｘａａ－Ｓｅｒ、およびＸａａ－Ｔｈｒ（これらの式中のＸａａは、任意のアミノ酸である）からなる群から選択される少なくとも２個の連続するアミノ酸の配列を含み；少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸またはその誘導体とカップリングさせて、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを得るステップであって、ジペプチドまたはその誘導体が、シュードプロリン部分を含む、ステップ；１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンとカップリングさせるステップ；およびＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを樹脂から切断するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、方法は、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを脱保護するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドは、本明細書に記載の組成物のまたは本明細書における医薬組成物の少なくとも１つのポリペプチドのペプチドである。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のＮ末端アミノ酸またはその誘導体は、樹脂に結合されている。一部の実施形態では、樹脂は、Ｗａｎｇ樹脂または２－クロロトリチル樹脂（２－Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂）である。一部の実施形態では、カップリングの出発材料は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ樹脂、Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－２Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｗａｎｇ樹脂、またはＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｗａｎｇ樹脂である。一部の実施形態では、少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体がカップリングされるアミノ酸またはその誘導体は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、およびＶａｌからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンと必要に応じてカップリングされる１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを含む。
一部の実施形態では、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のＮ末端アミノ酸またはその誘導体は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨからなる群から選択される。
一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨである。一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨである。一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨである。一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨである。一部の実施形態では、シュードプロリン部分は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（ｐｓｉ（Ｄｍｐ，Ｈ）ｐｒｏ）－ＯＨである。
一部の実施形態では、Ｘａａ－Ｓｅｒは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒである。一部の実施形態では、Ｘａａ－Ｓｅｒは、Ｇｌｕ－Ｓｅｒである。一部の実施形態では、Ｘａａ－Ｔｈｒは、Ａｌａ－Ｔｈｒである。一部の実施形態では、Ｘａａ－Ｔｈｒは、Ｌｅｕ－Ｔｈｒである。一部の実施形態では、Ｘａａ－Ｃｙｓは、Ｌｅｕ－Ｃｙｓである。
態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
態様では、がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現する者として対象を同定するステップを含み；治療薬が、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸の断片である、少なくとも１つのポリペプチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含むか；またはＨＬＡタンパク質との複合体を形成している、少なくとも１つのポリペプチドのネオエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み；１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々またはその一部分が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するものである、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。
態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、組成物を対象に投与するステップを含み；組成物が、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸の断片である、少なくとも１つのポリペプチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか；少なくとも１つのポリペプチドを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含むか；またはＨＬＡタンパク質との複合体を形成している、少なくとも１つのポリペプチドのネオエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み；突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその一部分が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合し；対象が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルを発現すると同定される、方法が、本明細書で提供される。
態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、組成物を対象に投与するステップを含み、組成物が、２つもしくはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、２つもしくはそれより多くの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、第１のＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端が、第２のＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端とオーバーラップしている、少なくとも１つのポリペプチド；少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド；少なくとも１つのポリペプチドを含む１つもしくは複数のＡＰＣ；またはＨＬＡタンパク質との複合体を形成している、少なくとも１つのポリペプチドのネオエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、対象により発現されるＨＬＡアレルが投与の時点で不明である方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、免疫応答が対象において惹起される。一部の実施形態では、免疫応答は、体液性応答である。一部の実施形態では、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列は、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドが第２のＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後、逐次的に投与される。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、抗エストロゲン療法に対して抵抗性である、ＭＳＩ乳がんである、転移性乳がんである、Ｈｅｒ２陰性乳がんである、Ｈｅｒ２陽性乳がんである、ＥＲ陰性乳がんである、ＥＲ陽性乳がんである、ＰＲ陽性乳がんである、ＰＲ陰性乳がんまたはこれらの任意の組合せである、乳がんを有する。一部の実施形態では、乳がんは、突然変異を有するエストロゲン受容体を発現する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法は、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、抗ＣＤ４０剤、レトロゾール、フルベストラント、および／またはＣＤＫ４／６阻害剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９）；リボシクリブ（ＬＥＥ ０１１）；ボルシクリブ（Ｐ１４４６Ａ－０５）；ファスカプリシン；アルシリアフラビン；２－ブロモ－１２，１３－ジヒドロ－５Ｈ－インドロ［２，３－ａ］ピロロ［３，４－ｃ］カルバゾール－５，７（６Ｈ）－ジオン；３－アミノチオアクリドン（３－ＡＴＡ）、ｔｒａｎｓ－４－（（６－（エチルアミノ）－２－（（１－（フェニルメチル）－１Ｈ－インドール－５－イル）アミノ）－４－ピリミジニル）アミノ）－シクロヘキサノ（ＣＩＮＫ４）；１，４－ジメトキシアクリジン－９（１０Ｈ）－チオン（ＮＳＣ ６２５９８７）；２－メチル－５－（ｐ－トリルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－４，７－ジオン（リュウビジン）；およびフラボピリドール（アルボシジブ）；セリシクリブ；ジナシクリブ；ミルシクリブ；ロニシクリブ；アツベシクリブ；ブリシクリブ；リビシクリブ；トリラシクリブ（Ｇ１Ｔ２８）；およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、追加の治療剤は、突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。一部の実施形態では、投与するステップは、皮下投与または静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、がんは、再発または転移性乳がんである。一部の実施形態では、対象は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせての内分泌療法後に疾患進行を経験したことがある対象である。
ＣＬＬおよびある特定のリンパ腫によく見られる突然変異は、ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）遺伝子の４８１位におけるシステインからセリンへの変化（Ｃ４８１Ｓ）である。突然変異は、アミノ酸配列：
を有する領域内にあり、突然変異したセリンには下線が付けられている。この変化は、様々なＨＬＡ分子に結合する多数の結合ペプチドを生じさせる。
一態様では、Ｃ４８１Ｓ突然変異型ＢＴＫタンパク質からの１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む、ポリペプチドを含む組成物であって、１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列が、突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、ペプチドのアミノ酸配列が、表３４に収載されている、ＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＡＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＥＹＭＡＮＧＳＬ；ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮ；ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＧＳＬＬＮＹＬＲＥＭ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬ；ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＳＬＬＮＹＬＲＥＭＲ；ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬ；ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＹＭＡＮＧＳＬＬ；またはＹＭＡＮＧＳＬＬＮである、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列は、（ａ）ＡＮＧＳＬＬＮＹを含み、ＨＬＡ－Ａ３６：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｂ）ＡＮＧＳＬＬＮＹＬを含み、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２、ＨＬＡ－Ａ０２：０４、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ４４：０２、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１およびＨＬＡ－Ｂ３８：０１からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｃ）ＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲを含み、ＨＬＡ－Ａ７４：０１アレルもしくはＨＬＡ－Ａ３１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｄ）ＥＹＭＡＮＧＳＬを含み、ＨＬＡ－Ｃ１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ１４：０３およびＨＬＡ－Ａ２４：０２からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｅ）ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮを含み、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルもしくはＨＬＡ－Ａ２３：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｆ）ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹを含み、ＨＬＡ－Ａ２９：０２アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｇ）ＧＳＬＬＮＹＬＲを含み、ＨＬＡ－Ａ３１：０１アレルもしくはＨＬＡ－Ａ７４：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｈ）ＧＳＬＬＮＹＬＲＥＭを含み、ＨＬＡ－Ｂ５８：０２アレルもしくはＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｉ）ＩＴＥＹＭＡＮＧＳを含み、ＨＬＡ－Ａ０１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｊ）ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬを含み、ＨＬＡ－Ａ０１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｋ）ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬを含み、ＨＬＡ－Ａ０１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｌ）ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬを含み、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ３５：０３、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４およびＨＬＡ－Ｃ０８：０２からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｍ）ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲを含み、ＨＬＡ－Ａ３３：０３アレルもしくはＨＬＡ－Ａ７４：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｎ）ＮＧＳＬＬＮＹＬを含み、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｏ）ＮＧＳＬＬＮＹＬを含み、ＨＬＡ－Ａ６８：０１、ＨＬＡ－Ａ３３：０３、ＨＬＡ－Ａ３１：０１およびＨＬＡ－Ａ７４：０１からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｐ）ＳＬＬＮＹＬＲＥＭＲを含み、ＨＬＡ－Ａ７４：０１アレルもしくはＨＬＡ－Ａ３１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｑ）ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬを含み、ＨＬＡ－Ｂ４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ４４：０２およびＨＬＡ－Ｂ４０：０２からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｒ）ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹを含み、ＨＬＡ－Ｂ４４：０３アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、（ｓ）ＹＭＡＮＧＳＬＬを含み、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２、ＨＬＡ－Ｃ１４：０３、ＨＬＡ－Ｃ１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２、ＨＬＡ－Ａ０１：０１からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測されるか、または（ｔ）ＹＭＡＮＧＳＬＬＮを含み、ＨＬＡ－Ａ２９：０２アレルもしくはＨＬＡ－Ａ０１：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合する、もしくは結合すると予測される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列は、ＨＬＡタンパク質との複合体を形成しているコグネイトＴ細胞受容体に特異的である。一部の実施形態では、組成物は、２つまたはそれより多くの突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む。
一態様では、Ｃ４８１Ｓ突然変異型ＢＴＫタンパク質からの少なくとも８個の連続するアミノ酸を各々が有する１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列であって、表３４から選択される、１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物であって、突然変異型ＢＴＫペプチド配列のＮ末端またはＣ末端に連結されている、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基をさらに含み、３個またはそれより多くのアミノ酸残基が、細胞内の突然変異型ＢＴＫペプチド配列のプロセシングを増強する、および／または突然変異型ＢＴＫペプチド配列のエピトープの提示を増強する、組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、ＣＭＶ－ｐｐ６５、ＨＩＶ、ＭＡＲＴ－１または非ウイルス性、非ＢＴＫ内在性ペプチドからのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、最大でも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸のみを含む。
一態様では、式（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎ－（ＸａａＢＴＫ）Ｐ－（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃ（式中、Ｐは、７より大きい整数であり；（ＸａａＢＴＫ）Ｐは、Ｃ４８１Ｓ突然変異型アミノ酸を含む突然変異型ＢＴＫタンパク質の配列ＩＦＩＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲＥＭＲＨＲから選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む突然変異型ＢＴＫペプチド配列であり；Ｎは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎは、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；Ｃは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；およびＮとＣの両方が０である）の少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎおよび／または（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、ＣＭＶ－ｐｐ６５、ＨＩＶ、ＭＡＲＴ－１または非ウイルス性、非ＢＴＫ内在性タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ｎおよび／またはＣは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０より大きい整数である。
一部の実施形態では、Ｎおよび／またはＣは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００未満の整数である。一部の実施形態では、Ｎが０である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物。一部の実施形態では、Ｃが０である、８～１０。
一態様では、請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物が、本明細書で提供される。一態様では、組成物は、上記のならびに表３４および３６に記載の突然変異型ＢＴＫペプチドのいずれかについての１つまたは複数のペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０の突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列のうちの少なくとも１つは、突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０は、突然変異ＢＴＫタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列の各々、または２つもしくはそれより多くのＢＴＫペプチド配列の各々は、突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、表３５に収載されているＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１５０ｎＭもしくはそれ未満の親和性および／または２時間もしくはそれより長い半減期で結合するまたは結合すると予測される、少なくとも１つの突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列は、（ａ）表３４から選択される第１の突然変異型ＢＴＫペプチド配列であって、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される第１の突然変異型ＢＴＫペプチド配列と、（ｂ）Ｃ４８１Ｓ突然変異を有する第２のＢＴＫペプチドとを含み、第１の突然変異型ＢＴＫペプチド配列と第２の突然変異型ＢＴＫペプチド配列は、非同一である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１０μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満の親和性で結合する、少なくとも１つの突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に２４時間より長く、１２時間より長く、９時間より長く、６時間より長く、５時間より長く、４時間より長く、３時間より長く、２時間より長く、１時間より長く、４５分より長く、３０分より長く、１５分より長く、または１０分より長く安定して結合する、少なくとも１つの突然変異型ＢＴＫペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎは、ＩＤＩＩＭＫＩＲＮＡ、ＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＩＩＦＦＩＦＦＷＭＣ、ＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＡＡＦＷＦＷ、ＩＦＦＩＦＦＩＩＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＩＩＩＩＩＩＩＷＥＣ、ＦＩＦＦＦＩＩＦＦＦＦＦＩＦＦＦＦＦＩＦＩＩＩＩＩＩＦＷＥＣ、ＴＥＹ、ＷＱＡＧＩＬＡＲ、ＨＳＹＴＴＡＥ、ＰＬＴＥＥＫＩＫ、ＧＡＬＨＦＫＰＧＳＲ、ＲＲＡＮＫＤＡＴＡＥ、ＫＡＦＩＳＨＥＥＫＲ、ＴＤＬＳＳＲＦＳＫＳ、ＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶ、ＣＬＬＬＨＹＳＶＳＫ、またはＭＴＥＹＫＬＶＶＶのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｃ末端Ｘａａ）Ｃは、ＫＫＮＫＫＤＤＩＫＤ、ＡＧＮＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＫＫＤＫＤＤＤＤＤＤ、ＡＧＮＫＫＫＫＫＫＫＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、ＡＧＲＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤ、ＧＫＳＡＬＴＩＱＬ、ＧＫＳＡＬＴＩ、ＱＧＱＮＬＫＹＱ、ＩＬＧＶＬＬＬＩ、ＥＫＥＧＫＩＳＫ、ＡＡＳＤＦＩＦＬＶＴ、ＫＥＬＫＱＶＡＳＰＦ、ＫＫＫＬＩＮＥＫＫＥ、ＫＫＣＤＩＳＬＱＦＦ、ＫＳＴＡＧＤＴＨＬＧ、ＡＴＦＹＶＡＶＴＶＰ、ＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧ、またはＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列のうちの少なくとも１つは、対象のがん細胞のゲノムによりコードされない突然変異型アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列の各々は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列の各々は、最大でも５０００μｇ／ｍＬ、最大でも２５００μｇ／ｍＬ、最大でも１０００μｇ／ｍＬ、最大でも７５０μｇ／ｍＬ、最大でも５００μｇ／ｍＬ、最大でも４００μｇ／ｍＬ、または最大でも３００μｇ／ｍＬの濃度でのみ存在する。一部の実施形態では、突然変異型ＢＴＫペプチド配列の各々は、１０μｇ／ｍＬ～５０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～４０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～３０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～２０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、組成物は、免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣである。
一態様では、（ａ）上記の組成物と（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ調整剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ワクチン組成物である。一部の実施形態では、医薬組成物は、水性である。一部の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）ｐＩ＞５かつＨＹＤＲＯ＞－６、（ｂ）ｐＩ＞８かつＨＹＤＲＯ＞－８、（ｃ）ｐＩ＜５かつＨＹＤＲＯ＞－５、（ｄ）ｐＩ＞９かつＨＹＤＲＯ＜－８、（ｅ）ｐＩ＞７かつＨＹＤＲＯ値＞－５．５、（ｆ）ｐＩ＜４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、（ｇ）ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＜－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、（ｈ）ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつＨＹＤＲＯ≦－４、（ｉ）ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９、（ｊ）５≧ｐＩ≧１２かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９により限定される少なくとも１つのポリペプチドのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、塩基である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、弱酸のコンジュゲート塩基である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、ジカルボン酸塩またはトリカルボン酸塩である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、クエン酸および／またはクエン酸塩である。一部の実施形態では、クエン酸塩は、クエン酸二ナトリウムおよび／またはクエン酸三ナトリウムである。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、コハク酸および／またはコハク酸塩である。一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウムおよび／またはコハク酸一ナトリウムである。一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウム・六水和物である。一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、０．１ｍＭ～１ｍＭの濃度で存在する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、液体を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、水を含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、糖を含む。一部の実施形態では、糖は、デキストロースを含む。一部の実施形態では、デキストロースは、１～１０％ ｗ／ｖの濃度で存在する。一部の実施形態では、糖は、トレハロースを含む。一部の実施形態では、糖は、スクロースを含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態では、ＤＭＳＯは、０．１％～１０％、０．５％～５％、または１％～３％の濃度で存在する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫調節物質またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＡＲＮＡＸ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタナイドＩＭＳ１３１２、モンタナイドＩＳＡ２０６、モンタナイドＩＳＡ５０Ｖ、モンタナイドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）、ベクター系、ＰＬＧＡ微小粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。
一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣを含む。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、２：１～１：１０ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：１、１：２、１：３、１：４または１：５ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：３ ｖ：ｖである。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、上記の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に表３４、３６または３７の左側の列から選択される配列を有するペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、対象が、表中のペプチドに対応する右側の列に収載されているＨＬＡアレルのいずれか１つによりコードされるタンパク質を発現する、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、本発明は、対象のがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、１つもしくは複数の突然変異型ＢＴＫペプチドを含む組成物、または１つもしくは複数の突然変異型ＢＴＫペプチドをコードする１つもしくは複数の核酸を含む組成物を投与するステップを含み、各突然変異型ＢＴＫペプチドが、突然変異Ｃ４８１Ｓを含む突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、１つまたは複数のペプチドのうちの少なくとも１つが、対象により発現される、表３４、３６または３７に収載されているＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合するものである、方法を提供する。一部の実施形態では、ペプチドは、ＨＬＡタンパク質に１５０ｎＭもしくはそれ未満の親和性および／または２時間もしくはそれより長い半減期で結合する。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、第１および第２のペプチド、または第１および第２のペプチドをコードする核酸を投与するステップを含み、第１のペプチドが、表３４、３６または３７から選択されるアミノ酸配列を有し、第２のペプチドが、表３４、３６または３７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する、方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、免疫応答が対象において惹起される。一部の実施形態では、免疫応答は、体液性応答である。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチドは、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。
一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドが第２のＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後、逐次的に投与される。
一部の実施形態では、がんは、ある特定の種類のリンパ腫およびある特定の種類の白血病からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法は、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、または抗ＣＤ４０剤である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、突然変異型ＢＴＫペプチド配列の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、（ａ）対象により発現される第１のタンパク質を同定するステップであって、第１のタンパク質が、対象の第１のＨＬＡアレルによりコードされ、第１のＨＬＡアレルが、表３４、３７または３８のもののいずれか１つで提供されるＨＬＡアレルである、ステップ；（ｂ）（ｉ）表３４、３６もしくは３７のもののいずれか１つに従って提供される第１のＨＬＡアレルに対するペプチドである第１の突然変異型ＢＴＫペプチドまたは（ｉｉ）第１の突然変異型ＢＴＫペプチドをコードするポリ核酸を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一態様では、がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、表３４、３６または３７のうちの１つのＨＬＡによりコードされるタンパク質を発現する対象として対象を同定するステップを含み、治療剤が、突然変異型ＢＴＫペプチド、または突然変異型ＢＴＫペプチドをコードする核酸であり、突然変異型ＢＴＫペプチドが、Ｃ４８１に突然変異を含む突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、ペプチドが、（ｉ）Ｃ４８１Ｓの突然変異を含み、（ｉｉ）表３４、３６または３７のいずれか１つのペプチドの配列を含み、（ｉｉｉ）表３４、３６または３７のいずれか１つのＨＬＡによりコードされる対応するタンパク質に結合するものである、方法が、本明細書で提供される。
一部の態様では、Ｔ７９０Ｍ突然変異型ＥＧＦＲタンパク質からの１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含むポリペプチドを含む組成物であって、１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列が、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭ、ＶＱＬＩＭＱＬＭ、ＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、およびＬＴＳＴＶＱＬＩＭからなる群から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、ＨＬＡタンパク質との複合体を形成しているコグネイトＴ細胞受容体に特異的である。
一部の実施形態では、組成物は、２つまたは３つまたはそれより多くの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列の混合物を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸。
一部の態様では、Ｔ７９０Ｍ突然変異型ＥＧＦＲタンパク質からの１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列であって、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭ、ＶＱＬＩＭＱＬＭ、ＳＴＶＱＬＩＭＱＬおよびＬＴＳＴＶＱＬＩＭからなる群から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物であって、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のＮ末端またはＣ末端に連結されている、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基をさらに含み、３個またはそれより多くのアミノ酸残基が、細胞内の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のプロセシングを増強する、および／または突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のエピトープの提示を増強する、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、ＣＭＶ－ｐｐ６５、ＨＩＶ、ＭＡＲＴ－１または非ウイルス性、非ＥＧＦＲ内在性ペプチドからのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のＮ末端またはＣ末端に連結されている、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種である３個またはそれより多くのアミノ酸残基は、最大でも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸のみを含む。
一部の実施形態では、（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり、ＮとＣの両方が０でない。
一部の実施形態では、（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎおよび／または（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、ＣＭＶ－ｐｐ６５、ＨＩＶ、ＭＡＲＴ－１または非ウイルス性、非ＥＧＦＲ内在性タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を含む。
一部実施形態では、Ｎおよび／またはＣは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０より大きい整数である。
一部の実施形態では、Ｎおよび／またはＣは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００未満の整数である。一部の実施形態では、ｎは、０である。一部の実施形態では、Ｃは、０である。
一態様では、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物が、本明細書で提供される。一実施形態では、組成物は、本明細書で開示される１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む組成物は、表４０Ａ～４０Ｄから選択される１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のうちの少なくとも１つは、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０は、突然変異ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列の各々、または２つもしくはそれより多くのＥＧＦＲペプチド配列の各々は、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の連続するアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、表４１に収載されているＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１５０ｎＭもしくはそれ未満の親和性および／または２時間もしくはそれより長い半減期で結合するまたは結合すると予測される、少なくとも１つの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、ＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＬＴＳＴＶＱＬＩＭ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭ、およびＶＱＬＩＭＱＬＭからなる群から選択される第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列と、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する第２の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列とを含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、（ａ）ＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＬＴＳＴＶＱＬＩＭ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭ、およびＶＱＬＩＭＱＬＭからなる群から選択される第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列であって、ＨＬＡ－Ａ６８：０２、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ａ２５：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０３、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２、ＨＬＡ－Ａ２６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ５２：０１、ＨＬＡ－Ａ３０：０１、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ａ１１：０１、ＨＬＡ－Ａ３２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０４、ＨＬＡ－Ａ６８：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１、ＨＬＡ－Ａ０１：０１、ＨＬＡ－Ｂ４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１、ＨＬＡ－Ａ３６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ３８：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ｂ５８：０２、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ４０：０１、および／またはＨＬＡ－Ｂ３５：０３アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列と、（ｂ）Ｔ７９０Ｍ突然変異を有する第２の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列とを含み、第１および第２のペプチドは、同一でない。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１０μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満の親和性で結合する、少なくとも１つの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に２４時間より長く、１２時間より長く、９時間より長く、６時間より長く、５時間より長く、４時間より長く、３時間より長く、２時間より長く、１時間より長く、４５分より長く、３０分より長く、１５分より長く、または１０分より長く安定して結合する、少なくとも１つの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎは、ＩＤＩＩＭＫＩＲＮＡ、ＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＩＩＦＦＩＦＦＷＭＣ、ＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＡＡＦＷＦＷ、ＩＦＦＩＦＦＩＩＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＦＩＩＩＩＩＩＩＷＥＣ、ＦＩＦＦＦＩＩＦＦＦＦＦＩＦＦＦＦＦＩＦＩＩＩＩＩＩＦＷＥＣ、ＴＥＹ、ＷＱＡＧＩＬＡＲ、ＨＳＹＴＴＡＥ、ＰＬＴＥＥＫＩＫ、ＧＡＬＨＦＫＰＧＳＲ、ＲＲＡＮＫＤＡＴＡＥ、ＫＡＦＩＳＨＥＥＫＲ、ＴＤＬＳＳＲＦＳＫＳ、ＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶ、ＣＬＬＬＨＹＳＶＳＫ、またはＭＴＥＹＫＬＶＶＶのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、（Ｃ末端Ｘａａ）Ｃは、ＫＫＮＫＫＤＤＩＫＤ、ＡＧＮＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＫＫＤＫＤＤＤＤＤＤ、ＡＧＮＫＫＫＫＫＫＫＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、ＡＧＲＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤ、ＧＫＳＡＬＴＩＱＬ、ＧＫＳＡＬＴＩ、ＱＧＱＮＬＫＹＱ、ＩＬＧＶＬＬＬＩ、ＥＫＥＧＫＩＳＫ、ＡＡＳＤＦＩＦＬＶＴ、ＫＥＬＫＱＶＡＳＰＦ、ＫＫＫＬＩＮＥＫＫＥ、ＫＫＣＤＩＳＬＱＦＦ、ＫＳＴＡＧＤＴＨＬＧ、ＡＴＦＹＶＡＶＴＶＰ、ＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧ、またはＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列のうちの少なくとも１つは、対象のがん細胞のゲノムによりコードされない突然変異型アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列の各々は、最大でも５０００μｇ／ｍＬ、最大でも２５００μｇ／ｍＬ、最大でも１０００μｇ／ｍＬ、最大でも７５０μｇ／ｍＬ、最大でも５００μｇ／ｍＬ、最大でも４００μｇ／ｍＬ、または最大でも３００μｇ／ｍＬの濃度でのみ存在する。
一部の実施形態では、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列の各々は、１０μｇ／ｍＬ～５０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～４０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～３０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～２０００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
一部の実施形態では、組成物は、免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣである。
一態様では、（ａ）上記の少なくとも１つの突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物と（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ調整剤をさらに含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ワクチン組成物である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、水性である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドのうちの１つまたは複数は、ｐＩ＞５かつＨＹＤＲＯ＞－６、ｐＩ＞８かつＨＹＤＲＯ＞－８、ｐＩ＜５かつＨＹＤＲＯ＞－５、ｐＩ＞９かつＨＹＤＲＯ＜－８、ｐＩ＞７かつＨＹＤＲＯ値＞－５．５、ｐＩ＜４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＜－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－８、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつＨＹＤＲＯ≦－４．、ｐＩ＞０かつＨＹＤＲＯ＞－４、またはｐＩ＞４．３かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９、５≧ｐＩ≧１２かつ－４≧ＨＹＤＲＯ≧－９により限定される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、塩基である、ｐＨ調整剤を含む。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、弱酸のコンジュゲート塩基である。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、薬学的に許容される塩である。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、ジカルボン酸塩またはトリカルボン酸塩である。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、クエン酸および／またはクエン酸塩である。
一部の実施形態では、クエン酸塩は、クエン酸二ナトリウムおよび／またはクエン酸三ナトリウムである。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、コハク酸および／またはコハク酸塩である。
一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウムおよび／またはコハク酸一ナトリウムである。
一部の実施形態では、コハク酸塩は、コハク酸二ナトリウム・六水和物である。
一部の実施形態では、ｐＨ調整剤は、０．１ｍＭ～１ｍＭの濃度で存在する。
一部の実施形態では、医薬組成物は、液体を含む、薬学的に許容される担体を含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、水を含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、糖を含む。
一部の実施形態では、糖は、デキストロースを含む。
一部の実施形態では、デキストロースは、１～１０％ ｗ／ｖの濃度で存在する。
一部の実施形態では、糖は、トレハロースを含む。
一部の実施形態では、糖は、スクロースを含む。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
一部の実施形態では、ＤＭＳＯは、０．１％～１０％、０．５％～５％、または１％～３％の濃度で存在する。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない。
一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥され得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫調節物質またはアジュバントをさらに含む。
一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ＡＲＮＡＸ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタナイドＩＭＳ１３１２、モンタナイドＩＳＡ２０６、モンタナイドＩＳＡ５０Ｖ、モンタナイドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）、ベクター系、ＰＬＧＡ微小粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。
一部の実施形態では、免疫調節物質またはアジュバントは、ポリＩＣＬＣを含む。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、２：１～１：１０ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：１、１：２、１：３、１：４または１：５ ｖ：ｖである。一部の実施形態では、医薬組成物中のポリＩＣＬＣのペプチドに対する比は、約１：３ ｖ：ｖである。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、上記の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、１つもしくは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド、または１つもしくは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチドをコードする１つもしくは複数の核酸を投与するステップを含み；各突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、突然変異Ｔ７９０Ｍを含む突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み；１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、表４０Ａ～４０Ｄで示されるアミノ酸配列を有し；１つまたは複数のペプチドのうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ａ６８：０２、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ａ２５：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０３、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２、ＨＬＡ－Ａ２６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ５２：０１、ＨＬＡ－Ａ３０：０１、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ａ１１：０１、ＨＬＡ－Ａ３２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０４、ＨＬＡ－Ａ６８：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１、ＨＬＡ－Ａ０１：０１、ＨＬＡ－Ｂ４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１、ＨＬＡ－Ａ３６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ３８：０１、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ｂ５８：０２、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ４０：０１、および／またはＨＬＡ－Ｂ３５：０３アレルによりコードされるタンパク質に１５０ｎＭもしくはそれ未満の親和性および／または２時間もしくはそれより長い半減期で結合し、前記アレルによりコードされるタンパク質に結合し、または結合すると予測され；前記アレルが対象により発現される、方法が、本明細書で提供される。
一態様では、がんを有する対象を処置する方法であって、それを必要とする対象に、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列を含むポリペプチド、または突然変異型ＥＧＦＲペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与するステップを含み、（ａ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＬＩＭＱＬＭＰＦを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２アレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｂ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＬＴＳＴＶＱＬＩＭを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１、ＨＬＡ－Ａ３６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３およびＨＬＡ－Ｂ５８：０２からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｃ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＱＬＩＭＱＬＭＰＦを有し、対象が、ＨＬＡ－Ａ２６：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｄ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＳＴＶＱＬＩＭＱＬを有し、対象が、ＨＬＡ－Ａ６８：０２、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２、ＨＬＡ－Ａ２５：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０３、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２、ＨＬＡ－Ａ２６：０１、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ａ３０：０１、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２、ＨＬＡ－Ａ１１：０１、ＨＬＡ－Ａ３２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０４、ＨＬＡ－Ａ６８：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１およびＨＬＡ－Ｂ４０：０１からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｅ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＳＴＶＱＬＩＭＱＬＭを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｆ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｃ１５：０２アレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｇ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＴＶＱＬＩＭＱＬを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質を発現するか、（ｈ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＴＶＱＬＩＭＱＬＭを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｂ３５：０３アレルによりコードされるタンパク質を発現するか、または（ｉ）突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、配列ＶＱＬＩＭＱＬＭを有し、対象が、ＨＬＡ－Ｂ５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２およびＨＬＡ－Ｂ３７：０１からなる群から選択されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質を発現する、方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの突然変異型ＥＧＦＲペプチドを含む第２のポリペプチド組成物を投与するステップをさらに含み、第２の突然変異型ＥＧＦＲペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄから選択される。
一態様では、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象により発現される第１のタンパク質を同定するステップであって、第１のタンパク質が、対象の第１のＨＬＡアレルによりコードされ、第１のＨＬＡアレルが、表４１～４３のもののいずれか１つで提供されるＨＬＡアレルである、ステップ；および（ｂ）（ｉ）表４２Ａｉおよびｉｉ、４２Ｂもしくは４３のいずれか１つに従って提供される第１のＨＬＡアレルに対するペプチドである第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチド、または（ｉｉ）第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチドをコードするポリ核酸を、対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象において発現される１つまたは複数の特異的ＨＬＡサブタイプを同定するステップ；本明細書に記載の１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチドを含む組成物を、１つまたは複数のペプチドが、対象により発現される少なくとも１つのＨＬＡサブタイプに１５０ｎＭもしくはそれ未満の親和性および／または２時間もしくはそれより長い半減期で結合するように、対象に投与するステップを含む、対象のがんを処置する方法。
一態様では、対象のがんを処置する方法であって、（ａ）対象のゲノムのＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現する対象を同定するステップ；（ｂ）配列ＳＴＶＱＬＩＭＱＬＭを有するペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、方法は、（ａ）対象が、対象のゲノムのＨＬＡ－Ａ２６：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現するかどうかを確認するステップ；（ｂ）配列ＱＬＩＭＱＬＭＰＦを有するペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む。
一部の実施形態では、免疫応答が対象において惹起される。一実施形態では、免疫応答は、体液性応答である。
一部の実施形態では、１つまたは複数の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドが第２のＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後、逐次的に投与される。
一部の実施形態では、がんは、神経膠芽腫、肺腺癌、非小細胞肺がん、肺扁平上皮癌、腎臓癌、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、胃がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび食道がんからなる群から選択される。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法は、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、または抗ＣＤ４０剤である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。
一態様では、がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、表４１、４２Ａｉ、４２Ａｉｉ、４２Ｂまたは４３のうちの１つのＨＬＡによりコードされるタンパク質を発現する対象として対象を同定するステップを含み；治療剤が、突然変異型ＥＧＦＲペプチド、または突然変異型ＥＧＦＲペプチドをコードする核酸であり；突然変異型ＥＧＦＲペプチドが、Ｔ７９０に突然変異を含む突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み；ペプチドが、（ｉ）Ｔ７９０Ｍの突然変異を含み、（ｉｉ）表４２Ａｉ、４２Ａｉｉ、４２Ｂ、４３または４４のいずれか１つのペプチドの配列を含み、（ｉｉｉ）表４２Ａｉ、４２Ａｉｉ、４２Ｂ、４３または４４のいずれか１つのＨＬＡによりコードされる対応するタンパク質に結合するものである、方法が、本明細書で提供される。
一態様では、がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、対象がＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現することを判定するステップを含み、治療薬が、アミノ酸配列ＳＴＶＱＬＩＭＱＬＭを有する突然変異型ＥＧＦＲペプチドを含む、方法が、本明細書で提供される。
一態様では、対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、対象がＨＬＡ－Ａ２６：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現することを判定するステップを含み、治療薬が、アミノ酸配列ＱＬＩＭＱＬＭＰＦを有する突然変異型ＥＧＦＲペプチドを含む、方法が、本明細書で提供される。
本開示の特色は、添付の特許請求の範囲に具体的に示されている。本開示の特色および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用されている例証的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
以下を含む医薬組成物：
（ａ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドもしくはその薬学的に許容される塩であって、
（ｉ）前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、かつ
（ｉｉ）前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端配列が、前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端配列とオーバーラップしており、前記配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、前記少なくとも１つのポリペプチドもしくはその薬学的に許容される塩、または
（ｂ）前記少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド。
(項目２)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列または前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、項目１に記載の医薬組成物。
(項目３)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ペプチド配列が、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、項目１～２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目４)
前記配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬ（配列番号３）の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、項目２～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目５)
前記配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号４）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、項目２～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目６)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の少なくとも一方が、少なくとも１４個の突然変異型アミノ酸を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目７)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、少なくとも３つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目８)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、少なくとも２つのポリペプチドを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目９)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、第３の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列をさらに含み、前記第３の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、前記配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列番号２の配列の少なくとも１個のアミノ酸を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１０)
前記第３のＧＡＴＡ３突然変異型ペプチドが、配列番号２の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、項目９に記載の医薬組成物。
(項目１１)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１２)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、
（ａ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、
（ｂ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、
（ｃ）ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、または
（ｄ）ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレルおよびＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル
によりコードされるタンパク質に結合するまたは結合すると予測される少なくとも１つの突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１３)
（ａ）前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合し、または結合すると予測され；
（ｂ）前記第２のＧＡＴＡ３ペプチド配列が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルまたはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合し、または結合すると予測され；前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、または結合すると予測される、項目１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１４)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の少なくとも一方が、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に５００ｎＭ未満の親和性で結合する、項目１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１５)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ペプチド配列の少なくとも一方が、ＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に１時間より長く安定して結合する、項目１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１６)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、以下の配列：
（ａ）ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ；
（ｂ）ＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ
（ｃ）ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ；
（ｄ）ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ならびに／あるいは
（ｅ）ＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ
のうちの少なくとも１つを含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１７)
前記少なくとも１つのポリペプチドが、以下の配列：
（ａ）ＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬ、ＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＡＬＱＰＬＱＰＨＡ、ＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、および／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ；
（ｂ）ＭＦＬＫＡＥＳＫＩおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ；
（ｃ）ＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨ、ＹＭＦＬＫＡＥＳＫおよび／またはＫＩＭＦＡＴＬＱＲ；
（ｄ）ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよび／またはＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ならびに／あるいは
（ｅ）ＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭ、ＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭ、ＥＰＨＬＡＬＱＰＬ、ＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ、ＦＬＫＡＥＳＫＩＭおよび／またはＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ
のうちの少なくとも２つを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目１８)
前記突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、
（ａ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｂ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｂ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｃ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｃ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｄ）（ａ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｅ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｃ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｆ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｇ）（ｂ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｈ）（ｃ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｄ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、
（ｉ）（ｃ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列、または
（ｊ）（ｄ）からの第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および（ｅ）からの第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列
を含む、項目１６または１７に記載の医薬組成物。
(項目１９)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、表５および／または表６のペプチドを含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目２０)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、ＧＡＴＡ３タンパク質の第１のネオエピトープを含み、第２のペプチド突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、突然変異型ＧＡＴＡタンパク質の第２のネオエピトープを含み、前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列とは異なり、前記第１のネオエピトープが、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、前記第２のネオエピトープが、同じ突然変異型アミノ酸を含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。(項目２１)
少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、
［Ｘａａ］Ｆ－［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃまたは［Ｘａａ］Ｎ－［Ｘａａ］Ｃ－［Ｘａａ］Ｆの式で表され、式中、
各Ｘａａは、アミノ酸であり、
［Ｘａａ］Ｎおよび［Ｘａａ］Ｃの各々は、ＧＡＴＡ３遺伝子の異なる部分によりコードされるアミノ酸配列を含み、
［Ｘａａ］Ｆは、任意のアミノ酸配列であり、
［Ｘａａ］Ｎは、前記ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、
［Ｘａａ］Ｃは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、前記ＧＡＴＡ３遺伝子の非野生型リーディングフレームにコードされ、
Ｎは、０～１００の整数であり、
Ｃは、１～１００の整数であり、
Ｆは、０～１００の整数であり、
ＮとＭの和は、少なくとも８である、項目１～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目２２)
［Ｘａａ］Ｆの各Ｘａａが、リシン残基であり、Ｆが、１～１００、１～１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１の整数である、項目２１に記載の医薬組成物。
(項目２３)
Ｆが、３、４または５である、項目２２に記載の医薬組成物。
(項目２４)
前記突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも５０μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬの濃度で存在する、項目１～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目２５)
前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、表１または表２の配列を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目２６)
免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む、項目１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目２７)
前記アジュバントが、ポリＩＣＬＣである、項目２６に記載の医薬組成物。
(項目２８)
１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む医薬組成物であって、
前記１つまたは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列が、ＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ、ＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ、ＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤ、およびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨからなる群から選択される配列を含む、医薬組成物。
(項目２９)
０．１ｍＭ～１ｍＭの濃度で存在するｐＨ調整剤を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目３０)
１ｍＭ～１０ｍＭの濃度で存在するｐＨ調整剤を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
(項目３１)
ＧＡＴＡ３ペプチドを合成する方法であって、
前記ペプチドが、Ｘａａ－Ｃｙｓ、Ｘａａ－Ｓｅｒ、およびＸａａ－Ｔｈｒ（式中、Ｘａａは、任意のアミノ酸である）からなる群から選択される少なくとも２個の連続するアミノ酸の配列を含み、
（ａ）少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸またはその誘導体とカップリングさせて、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有するシュードプロリンを得るステップであって、前記ジペプチドまたはその誘導体が、シュードプロリン部分を含む、ステップ；
（ｂ）１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体を、ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有する前記シュードプロリンとカップリングさせるステップ；および
（ｃ）ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有する前記シュードプロリンを樹脂から切断するステップ、を含む方法。
(項目３２)
ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有する前記シュードプロリンを脱保護するステップを含む、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
少なくとも１つのジペプチドまたはその誘導体がカップリングされる前記アミノ酸またはその誘導体が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、およびＶａｌからなる群から選択される、項目３１～３２のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体を含有する前記シュードプロリンと必要に応じてカップリングされる前記１つまたは複数の選択されたアミノ酸、小ペプチドまたはその誘導体が、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを含む、項目３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
(項目３５)
前記ＧＡＴＡ３ペプチドまたはその誘導体のＮ末端アミノ酸またはその誘導体が、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨからなる群から選択される、項目３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目３６)
前記シュードプロリン部分が、
（ａ）Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ、Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、
（ｂ）Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ、Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、
（ｃ）Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ、Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、
（ｄ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ、Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、
（ｅ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（ｐｓｉ（Ｄｍｐ、Ｈ）ｐｒｏ）－ＯＨ
である、項目３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
（ａ）Ｘａａ－Ｓｅｒが、Ｓｅｒ－Ｓｅｒである、
（ｂ）Ｘａａ－Ｓｅｒが、Ｇｌｕ－Ｓｅｒである、
（ｃ）Ｘａａ－Ｔｈｒが、Ａｌａ－Ｔｈｒである、
（ｄ）Ｘａａ－Ｔｈｒが、Ｌｅｕ－Ｔｈｒである、または
（ｅ）Ｘａａ－Ｃｙｓが、Ｌｅｕ－Ｃｙｓである、
項目３１～３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
がんを有する対象を処置する方法であって、項目１～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
(項目３９)
がんを有する対象を治療薬の候補者として同定する方法であって、
前記対象を、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質を発現する者として同定するステップを含み；
前記治療薬が、
（ａ）１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、前記１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含み、がん細胞のＧＡＴＡ３遺伝子の突然変異から生じる突然変異型ＧＡＴＡ３タンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸の断片である、前記少なくとも１つのポリペプチド、または
（ｂ）前記少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み；
前記１つもしくは複数の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々またはその一部分が、ＨＬＡ－Ａ０２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２アレルおよび／もしくはＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレルによりコードされるタンパク質に結合するものである、方法。
(項目４０)
前記治療薬を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
がんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、
（ａ）第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、
（ｉ）前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列および前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列の各々が、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、かつ
（ｉｉ）前記第１の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＣ末端配列が、前記第２の突然変異型ＧＡＴＡ３ペプチド配列のＮ末端配列とオーバーラップしており、前記配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、前記少なくとも１つのポリペプチド、または
（ｂ）前記少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含み、
対象により発現されるＨＬＡアレルが投与の時点で不明である、方法。
(項目４２)
前記配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸が、配列：
ＰＧＲＰＬＱＴＨＶＬＰＥＰＨＬＡＬＱＰＬＱＰＨＡＤＨＡＨＡＤＡＰＡＩＱＰＶＬＷＴＴＰＰＬＱＨＧＨＲＨＧＬＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（配列番号２）の少なくとも１個のアミノ酸を含む、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
前記がんが、黒色腫、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される、項目４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記対象が、抗エストロゲン療法に対して抵抗性である、ＭＳＩ乳がんである、転移性乳がんである、Ｈｅｒ２陰性乳がんである、Ｈｅｒ２陽性乳がんである、ＥＲ陰性乳がんである、ＥＲ陽性乳がん、ＰＲ陽性乳がん、ＰＲ陰性乳がんまたはこれらの任意の組合せである、乳がんを有する、項目４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目４５)
前記乳がんが、突然変異を有するエストロゲン受容体を発現する、項目４４の方法。
(項目４６)
少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む、項目４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記少なくとも１つの追加の治療剤または治療法が、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、抗ＣＤ４０剤、レトロゾール、フルベストラント、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、および／またはＣＤＫ４／６阻害剤である、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、セリシクリブ、ジナシクリブ、ミルシクリブ、ロニシクリブ、アツベシクリブ、ブリシクリブ、リビシクリブ、セリシクリブ、トリラシクリブ、ボルシクリブまたはこれらの任意の組合せである、項目４７に記載の方法。
(項目５０)
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９）；リボシクリブ（ＬＥＥ ０１１）；ボルシクリブ（Ｐ１４４６Ａ－０５）；ファスカプリシン；アルシリアフラビン；２－ブロモ－１２，１３－ジヒドロ－５Ｈ－インドロ［２，３－ａ］ピロロ［３，４－ｃ］カルバゾール－５，７（６Ｈ）－ジオン；３－アミノチオアクリドン（３－ＡＴＡ）、ｔｒａｎｓ－４－（（６－（エチルアミノ）－２－（（１－（フェニルメチル）－１Ｈ－インドール－５－イル）アミノ）－４－ピリミジニル）アミノ）－シクロヘキサノ（ＣＩＮＫ４）；１，４－ジメトキシアクリジン－９（１０Ｈ）－チオン（ＮＳＣ ６２５９８７）；２－メチル－５－（ｐ－トリルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－４，７－ジオン（リュウビジン）；フラボピリドール（アルボシジブ）；セリシクリブ；ジナシクリブ；ミルシクリブ；ロニシクリブ；アツベシクリブ；ブリシクリブ；リビシクリブ；トリラシクリブ（Ｇ１Ｔ２８）；またはこれらの任意の組合せである、項目４７に記載の方法。
(項目５１)
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウムブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７またはＡＥＺＳ－１３６である、項目４７に記載の方法。
(項目５２)
前記がんが、再発または転移性乳がんである、項目４１～５１のいずれか一項に記載の方法。
(項目５３)
前記対象が、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせての内分泌療法後に疾患進行を経験したことがある、または前記対象が、以前に全身療法を受けたことがない、項目４１～５２のいずれか一項に記載の方法。
(項目５４)
前記対象の細胞のエストロゲン受容体遺伝子の突然変異状態を判定するステップを含む、項目４１～５３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５５)
前記細胞が、単離された細胞であるか、またはエストロゲン受容体の発現が増された細胞である、項目５４に記載の方法。
図１は、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することができるＧＡＴＡ３エピトープの決定のための例示的なワークフローを示す。
図２は、エピトープがプロセシングおよび提示されるか否か（上）ならびにエピトープがＴ細胞により認識されるか否か（下）を決定するための実験の例示的なワークフローを示す。このワークフローにより、ＧＡＴＡ３ネオ抗原がプロセシングおよび提示されたこと（質量分析により検出）、ならびにＨＬＡマルチマーに結合しているＧＡＴＡ３ネオ抗原が、Ｊｕｒｋａｔ細胞系で発現された組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識され得ることが確認された。
図３は、質量分析によるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦエピトープの検出のためのワークフローの例示的な概略図を示す。ペプチドの単離のために、バッチ溶解を実施した。免疫沈降には、ＨＬＡクラスＩ汎抗体（Ｗ６／３２）が使用されている。
図４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＧＡＴＡ３抗原特異的拡大増殖のワークフローの例示的な概略図を示す。
図５は、ＨＬＡ－Ａ０２（左）、ＨＬＡ－Ｂ０７（中央）、およびＨＬＡ－Ｂ０８（右）に対する予測ＧＡＴＡ３エピトープを質量分析により検出することができることを示す実験の要約を示す。
図６は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの説明図である。網掛け領域は、すべての患者により共有されている（共通領域）および一部の患者により共有されている（可変領域）ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列部分の部分を表す。
図７Ａは、可変領域配列（配列番号３）および共通領域配列（配列番号４）を有するＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列（配列番号２）の説明図である。
図７Ｂは、ネオＯＲＦ配列（配列番号２）を有するＧＡＴＡ３配列（配列番号１）示す概略図であり、３つの予測ＨＬＡ－０２：０１エピトープ、２つの予測ＨＬＡ－Ｂ０７：０２エピトープ、および１つの予測ＨＬＡ－Ｂ０８：０１が質量分析により観察されたことを示す。このデータは、エピトープが標的化可能であることを示す。
図７Ｃは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ領域全体にわたるオーバーラップしているペプチド（ＯＬＰ）のペプチド設計スキームの例の説明図である。
図７Ｄは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ（配列番号３）の可変領域の例示的なアミノ酸配列である。
図７Ｅは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ（配列番号４）の共通領域の例示的なアミノ酸配列である。
図８は、治療用クラスＩ ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦエピトープの数対これらのエピトープを含有する患者のパーセントを示すグラフである。ほとんどの患者は４～５つのエピトープを有する。
図９Ａは、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、表記のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す結果の例を示す。
図９Ｂは、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、表記のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す果の例を示す。
図９Ｃは、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、表記のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す結果の例を示す。
図１０Ａは、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、表記のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す結果の例を示す。
図１０Ｂは、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、表記のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す結果の例を示す。
図１１は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドを負荷してまたは負荷せずにＡＰＣで刺激した健康なＨＬＡ－Ａ０２：０１ドナーに由来するＣＤ４＋細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルの抗原特異的誘導のＦＡＣＳ解析を示す図である。
図１２Ａは、表記のペプチドが、表記のペプチド濃度では、５ｍＭまたは０．２５ｍＭコハク酸塩、ＤＭＳＯなし、水中５％デキストロース（５ＤＷ）、およびポリＩＣＬＣなしの医薬組成物中で可溶性であったことを示す。
図１２Ｂは、表記のペプチドが、表記のペプチド濃度では、５ｍＭまたは０．２５ｍＭコハク酸塩、ＤＭＳＯなし、水中５％デキストロース（５ＤＷ）、およびポリＩＣＬＣの医薬組成物中で可溶性であったことを示す。
図１２Ｃは、表記のペプチドが、表記のペプチド濃度では、５ｍＭまたは０．２５ｍＭコハク酸塩、ＤＭＳＯなし、水中５％デキストロース（５ＤＷ）、および表記のペプチド：ポリＩＣＬＣ比のポリＩＣＬＣの医薬組成物中で可溶性であったことを示す。
図１３は、ＧＡＴＡ３フレームシフト突然変異の共通領域のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図１４は、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ乳がんデータセットにおける患者のカプランマイヤー生存曲線を示す。
図１５は、患者当たりの提示エピトープのシミュレートされた数を示す。
図１６は、ＧＡＴＡ３野生型および突然変異ヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
図１７は、ＧＡＴＡ３野生型および突然変異アミノ酸配列のアラインメントを示す。
図１８は、ＧＡＴＡ３突然変異がコードされたプラスミドマップを示す。
図１９は、ＧＡＴＡ３突然変異遺伝子のマルチアラインメントおよびＧＡＴＡ３突然変異プラスミド構築物のＤＮＡ配列決定データを示す。
図２０は、ＡｆｌＩＩによるＧＡＴＡ３突然変異プラスミドの制限酵素消化を示す。
図２１は、ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現を示す。
図２２Ａ～２２Ｄは、ＨＬＡ－Ａ０２．０１、ＨＬＡ－Ｂ０７．０２、およびＨＬＡ－Ｂ０８．０１をトランスフェクトしたＧＡＴＡ３ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨＬＡ－Ａ０２およびＭＨＣ－ＡＢＣの発現プロファイルを示す。
図２２Ａは、トランスフェクトされていないＧＡＴＡ３ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。
図２２Ｂは、ＨＬＡ－Ａ０２．０１をトランスフェクトしたＧＡＴＡ３ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。
図２２Ｃは、ＨＬＡ－Ｂ０７．０２をトランスフェクトしたＧＡＴＡ３ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。
図２２Ｄは、ＨＬＡ－Ｂ０８．０１をトランスフェクトしたＧＡＴＡ３ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。
図２３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において安定的に発現されるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する予測ペプチドエピトープの検出を示す。明灰色および黒色の配列は、それぞれ、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの可変領域および共通領域を示す。
図２４Ａは、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ（下）およびその対応する合成ペプチド（上）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
図２４Ｂは、ＭＳ／ＭＳスペクトル一致の網羅的なプロットを示す。
図２５Ａは、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＭＬＴＧＰＰＡＲＶ（下）およびその対応する合成ペプチド（上）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
図２５Ｂは、スペクトル一致の網羅的なプロットを示す。
図２６Ａは、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦ（下）およびその対応する合成ペプチド（上）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
図２６Ｂは、スペクトル一致の網羅的なプロットを示す。
図２７Ａは、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ（下）およびその対応する合成ペプチド（上）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
図２７Ｂは、スペクトル一致の網羅的なプロットを示す。
図２８Ａは、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＥＳＫＩｍＦＡＴＬ（下）およびその対応する合成ペプチド（上）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
図２８Ｂは、スペクトル一致の網羅的なプロットを示す。
図２９Ａは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチド（ＦＬＴ－ｍＤＣ ＧＡＴＡ３ Ｓｔｉｍ２マルチマー）によるＣＤ８＋応答の代表的な誘導を示す。
図２９Ｂは、ＰＢＭＣおよび樹状細胞においてＣＤ８＋応答の誘導のない陰性対照を示す。
図３０Ａは、ペプチドを用いない抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の誘導を示す。
図３０Ｂは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドを用いた抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の誘導を示す。
図３１Ａ～３１Ｄは、マルチマー染色によるＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
図３１Ａは、健康なドナーＨＤ４７の長期刺激後に、平均１．１６％陽性でＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が観察されたことを示す。
図３１Ｂは、健康なドナーＨＤ５０の長期刺激後に、平均１．２９％陽性でＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が観察されたことを示す。
図３１Ｃは、健康なドナーＨＤ５１の長期刺激後に、平均１．９％陽性でＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が観察されたことを示す。
図３１Ｄは、図３１Ｃとは異なる濃度のペプチドでの健康なドナーＨＤ５１の長期刺激後に、平均４．５％陽性でＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が観察されたことを示す。
図３２は、生標的細胞のカスパーゼ－３陽性割合の比較を示す。４つの異なる、ＧＡＴＡ３により誘導した健康なドナーＰＢＭＣ１～４を、ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧＡＴＡ３Ｔｒｄ）または陰性対照群としての形質導入されていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＮｏＴＲｄ２９３Ｔ）と共に共培養した。
図３３は、ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と形質導入されていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞との間の有意差を示す。
図３４は、ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞または形質導入されていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共に共培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ発現の差を示す。
図３５は、ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、形質導入されていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞との間の、ＧＡＴＡ３により誘導したＴ細胞との共培養条件下におけるＩＦＮ－γ濃度の差を示す。
図３６は、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲクローニングの概要を示す。詳細は実施例２６に記載されている。
図３７は、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔおよびＰＢＭＣを生成するための例示的な方法を示す。詳細は実施例２６に記載されている。
図３８は、ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを用いた機能アッセイの概要を示す。
図３９は、選別のためにマルチマー染色することによるＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
図４０は、レンチウイルス用のＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ構築物を示す。
図４１Ａは、ＧＡＴＡ３ ＴＣＲアルファ配列および野生型ＤＮＡ配列のマルチアラインメントを示す。
図４１Ｂは、ＧＡＴＡ３ ＴＣＲベータ配列および野生型ＤＮＡ配列のマルチアラインメントを示す。
図４２は、ＡｆｌＩＩによるＧＡＴＡ３ ＴＣＲプラスミドの制限酵素消化を示す。
図４３は、ＧＡＴＡ３マルチマーＰＥおよびＧＡＴＡ３マルチマーＢＶ６５０で染色した、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを示す。
図４４は、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲペプチド滴定アッセイを示す。
図４５は、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞およびＧＡＴＡ３突然変異を形質導入した標的細胞のＩＬ－２放出アッセイを示す。
図４６は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、１４個のアミノ酸およびＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬの配列からなる。ペプチドは、Ｃ７０Ｈ１１９Ｎ１９Ｏ２２Ｓの分子式、および１６１０．８９ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図４７は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、１６個のアミノ酸およびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩの配列からなる。ペプチドは、Ｃ８７Ｈ１４３Ｎ２３Ｏ２３Ｓの分子式、および１９１１．３０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図４８は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、１８個のアミノ酸およびＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨの配列からなる。ペプチドは、Ｃ８７Ｈ１３７Ｎ２３Ｏ２３Ｓの分子式、および１９０５．２５ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図４９は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、２１個のアミノ酸およびＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨの配列からなる。ペプチドは、Ｃ１００Ｈ１５６Ｎ２６Ｏ２８Ｓ２の分子式、および２２３４．６２ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図５０は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、２５個のアミノ酸およびＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩの配列からなる。ペプチドは、Ｃ１３４Ｈ２１７Ｎ３７Ｏ３４Ｓ３の分子式、および２９８６．６２ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図５１は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、２６個のアミノ酸およびＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤの配列からなる。ペプチドは、Ｃ１３１Ｈ２０９Ｎ３９Ｏ３３Ｓ２の分子式、および２９２２．４７ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図５２は、例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの立体化学を示す。ペプチドは、３３個のアミノ酸およびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨの配列からなる。ペプチドは、Ｃ１７３Ｈ２７４Ｎ４８Ｏ４６Ｓ４の分子式、および３８９０．６３ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩の形態である。
図５３は、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用した、ＢＴＫ抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
図５４は、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用した、ＥＧＦＲ抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
ＧＡＴＡ３は、乳がんに高度に発現される遺伝子であり、これらのがんにおいて最も高頻度に突然変異される遺伝子の１つである。この遺伝子の突然変異の最もよく見られるクラスは、アミノ酸３９３をコードするヌクレオチドとアミノ酸４４５（天然停止コドン）をコードするヌクレオチドの間の挿入および欠失である。これらが、オープンリーディングフレームを＋１フレームにシフトさせると、それらは、健康な細胞には通常発現されない少なくとも６１個から１１３個までものアミノ酸を導く伸長した新規リーディングフレーム（「ネオＯＲＦ」）に至る。６１個のアミノ酸は、全ての患者間で共有される（保存領域）が、各患者は、０～５２個の追加のアミノ酸（可変領域）を有することになる。したがって、このネオＯＲＦからプロセシングされ、提示されるエピトープは、この同じクラスの突然変異を保有する一部または全ての患者間で共有されるネオ抗原である。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、乳がんにおける有害予後因子であるように見える。ＧＡＴＡ３野生型は、高度に発現される遺伝子であり、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、高度な発現を保持する。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、翻訳され、乳がんのリスク増大と関連付けられる。
一部の実施形態では、ネオＯＲＦ全体に広がるオーバーラップしている長いペプチド（ＯＬＰ）をがんの処置に使用することができる。一部の態様では、本明細書に記載のＯＬＰは、ペプチドの末端にエピトープを含むように設計されており、これは、プロセシングおよび提示のプロセスを単純化する（１つの切断事象のみが必要であるため）。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合する短いペプチド（例えば、９～１１アミノ酸）を対象に投与して、がんを処置することができる。本明細書に記載の手法を使用して、患者を彼らのＨＬＡ組成に基づいて選択する必要なく、多くのネオ抗原を標的とすることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、免疫原性を増大させることができる修飾（例えば、脂質付加）を含むことができる。一部の実施形態では、全ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ポリボディ）が提供される。一部の実施形態では、特定のエピトープを標的とするＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞などの、細胞ベースの治療を使用して、がんを有する対象を処置することができる。
ＧＡＴＡ３タンパク質の共通領域に広がる合成の長いペプチド（ＳＬＰ）が本明細書で開示される。これらのペプチドは、本明細書に記載の製剤に可溶性であり、ｓ．ｃ．注射用のポリＩＣＬＣと適合性である。これらのペプチドの１つまたは複数についての高い純度および合成収率は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）中のシュードプロリンブロックの採用により達成することができる。これらのペプチドの各々についての精製条件も開発された。
個体の腫瘍に固有の突然変異事象から生じるネオ抗原の発見に基づく新規免疫治療剤およびそれらの使用が、本明細書に記載される。したがって、本明細書に記載の本開示は、例えば、腫瘍関連抗原またはネオエピトープに対する免疫応答を刺激するために、疾患の処置に使用するための免疫原性組成物またはがんワクチンを作出するために、使用することができる、ペプチド、ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびペプチド結合剤を提供する。
以下の説明および例によって本開示の実施形態が詳細に例証される。本開示が、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、したがって変わり得ることを理解されたい。本発明の範囲に包含される、本開示の非常に多くの変形形態および修飾形態があることは、当業者には理解されるであろう。
全ての用語は、それらが当業者によって理解されるように理解されることを意図したものである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載の主題を限定すると見なすべきでない。
本開示の様々な特徴が単一の実施形態に関連して記載されることがあるが、特徴が別々にまたは任意の好適な組合せで提供されることもある。逆に、本開示は、明確にするために別々の実施形態に関連して本明細書に記載されることがあるが、本開示が単一の実施形態で実行されることもある。
以下の定義は、当技術分野における定義を補足するものであり、本願を対象とするものであり、いずれの関連または非関連ケースにも、例えば、所有者が共通するいずれの特許または出願にも、帰属しないものとする。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を本開示の試験の実施の際に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することを目的にしたものに過ぎず、限定することを意図したものでない。
定義
本明細書で使用される用語法は、特定のケースを説明することを目的にしたものに過ぎず、限定することを意図したものでない。本願では、単数形の使用は、別段の具体的な記述がない限り複数形を含む。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含むように意図される。
本願では、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／または」を意味する。本明細書で使用される場合の用語「および／または」および「これらの任意の組合せ」およびそれらの文法的等価表現は、同義的に使用され得る。これらの用語は、任意の組合せが特に企図されることを伝えることができる。単に例証を目的として、次の句「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはこれらの任意の組合せ」は、「個別にＡ；個別にＢ；個別にＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、ＢおよびＣ」を意味することがある。用語「または」は、文脈が選言的使用に具体的に言及している場合を除き、連言的に使用されることもあり、または選言的に使用されることもある。
用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって決定されるような特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、この許容される誤差範囲は、値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制約に一部依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野での実務に従って、１以内の標準偏差を意味することもあり、または１より大きい標準偏差を意味することもある。あるいは、「約」は、所与の値の２０％以下、１０％以下、５％以下または１％以下の範囲を意味することもある。あるいは、特に生物システムまたは生物学的プロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することもある。特定の値が本願または特許請求の範囲に記載される場合、別段の記述がない限り、その特定の値の許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を想定すべきである。
本願および特許請求の範囲で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに有すること（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）（ならびに含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という語は、包括的または非限定的であり、追加の、挙げられていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態を本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができること、および逆に、本開示の任意の方法または組成物を本明細書で論じられる任意の実施形態に関して実行することができることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「１つの実施形態」または「他の実施形態」への本明細書での言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態に含まれるとは限らないことを意味する。本開示の理解を助長するために、いくつかの用語および句が下記で定義される。
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答の原因となる細胞相互作用の制御に関与する遺伝子のクラスターである。ヒトの場合、ＭＨＣ複合体は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体としても公知である。ＭＨＣおよびＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Ｐａｕｌ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）を参照されたい。「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質または分子」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＨＬＡタンパク質」は、タンパク質抗原のタンパク質分解切断の結果として得られるペプチドに結合することができ、可能性のあるリンパ球エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープ）を提示することができ、それらを細胞表面に輸送することができ、それらをそこで特定の細胞、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、またはＢ細胞に提示することができる、タンパク質を意味すると理解されたい。ゲノム内の主要組織適合遺伝子複合体は、細胞表面に発現された遺伝子産物が内在性および／または外来抗原に結合し、それらを提示するために、したがって免疫学的プロセスを調節するために重要である、遺伝子領域を含む。主要組織適合遺伝子複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群、すなわち、ＭＨＣクラスＩの分子とＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。２つのＭＨＣクラスの細胞生物学および発現パターンは、これらの異なる役割に適応する。
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ Ｅｄ．， Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， Ｃａｌｉｆ． （１９９４）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合の「ポリペプチド」、「ペプチド」およびそれらの文法的等価表現は、通常は、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により、一方が他方に接続されている、アミノ酸残基、通常はＬ－アミノ酸、のポリマーを指す。ポリペプチドおよびペプチドは、「突然変異型ペプチド」、「ネオ抗原ペプチド」および「ネオ抗原性ペプチド」を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドまたはペプチドは、様々な長さで、それらの中性（非荷電）形態または塩である形態のどちらかであり得、グリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化などの修飾がないこともあり、またはこれらの修飾を、修飾が本明細書に記載されるようなポリペプチドの生物活性を破壊しないことを条件として、含有することもある。「成熟タンパク質」は、全長であり、必要に応じて、グリコシル化または所与の細胞環境におけるタンパク質に典型的な他の修飾を含む、タンパク質である。本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（それらの機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、ｔｒａｎｓ－３－およびｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリセリン、α－ナフチルアラニン、シクロへキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、ならびにα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンを含む。本開示は、操作された細胞における本明細書に記載のポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の１つまたは複数のアミノ酸の翻訳後修飾に付随し得ることを、さらに企図している。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、アシル化（アセチル化およびホルミル化を含む）、グリコシル化（Ｎ連結型およびＯ連結型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、アルキル化（メチル化およびエチル化を含む）、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化およびヨウ素化が挙げられる。
ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの隣接配列を含み得る。本明細書で使用される場合の用語「隣接配列」は、エピトープの一部でないペプチドの断片または領域を指す。
「免疫原性」ペプチドまたは「免疫原性」エピトープまたは「ペプチドエピトープ」は、ペプチドが、ＨＬＡ分子に結合し、細胞媒介応答または体液性応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋））、ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋））および／またはＢリンパ球応答を誘導することになるように、アレル特異的モチーフを含むペプチドである。したがって、本明細書に記載の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合することができ、その後、ペプチドに対するＣＴＬ（細胞傷害性）応答、またはＨＴＬ（および体液性）応答を誘導することができる。
「ネオ抗原」は、タンパク質の腫瘍特異的変化から生じる腫瘍抗原のクラスを意味する。ネオ抗原は、例えば、タンパク質配列の置換、フレームシフト突然変異、融合ポリペプチド、インフレーム欠失、挿入、内在性レトロウイルスポリペプチドの発現、およびポリペプチドの腫瘍特異的過剰発現から生じる、腫瘍抗原を包含するが、これらに限定されない。
用語「残基」は、アミド結合もしくはアミド結合模倣物によってペプチドもしくはタンパク質に組み込まれている、またはアミノ酸もしくはアミノ酸模倣物をコードする核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）に組み込まれている、アミノ酸残基もしくはアミノ酸模倣残基を指す。
「ネオエピトープ」、「腫瘍特異ネオエピトープ」または「腫瘍抗原」は、非罹患細胞、例えば、非がん性細胞または生殖系列細胞などの、参照には存在しないが、罹患細胞、例えばがん細胞には見られる、エピトープまたは抗原決定領域を指す。これは、対応するエピトープが正常な非罹患細胞または生殖系列細胞に見られるが、罹患細胞、例えばがん細胞、における１つまたは複数の突然変異に起因して、そのエピトープの配列が変化してネオエピトープを生じさせる結果となる状況を含む。本明細書で使用される場合の用語「ネオエピトープ」は、ペプチドまたはネオ抗原性ペプチド内の抗原決定領域を指す。ネオエピトープは、少なくとも１個の「アンカー残基」および少なくとも１つの「アンカー残基隣接領域」を含み得る。ネオエピトープは、「分離領域」をさらに含み得る。用語「アンカー残基」は、ＨＬＡとの相互作用の特異性をもたらす、ＨＬＡ上の特定のポケットに結合するアミノ酸残基を指す。一部の場合には、アンカー残基は、標準アンカー位置に存在することがある。他の場合には、アンカー残基は、非標準アンカー位置に存在することもある。ネオエピトープは、ペプチド結合溝のポケットの中に突き出している一次および二次アンカー残基によってＨＬＡ分子に結合することができる。ペプチド結合溝内で、特定のアミノ酸が、提示されたネオエピトープのアンカー残基の対応する側鎖に対応するポケットを構成している。ペプチド結合選好性が、ＨＬＡ Ｉ分子とＨＬＡ ＩＩ分子の両方の異なるアレル間に存在する。ＨＬＡクラスＩ分子は、短いネオエピトープに結合し、そのＮ末端およびＣ末端がネオエピトープ結合溝の末端に位置するポケットに繋留される。ＨＬＡクラスＩ結合ネオエピトープの大多数は、約９アミノ酸のものであるが、より長いネオエピトープは、それらの中央部分の突出部によって調整することができ、その結果、約８～１２アミノ酸の結合ネオエピトープとなる。ＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合するネオエピトープは、サイズの制約がなく、約１６から約２５アミノ酸まで様々であり得る。ＨＬＡクラスＩＩ分子中のネオエピトープ結合溝は、両方の末端が開放されており、このことによって相対的により長い長さを有するペプチドの結合が可能になる。コアの９アミノ酸残基の長いセグメントは、ネオエピトープの認識に一番貢献するが、アンカー残基隣接領域も、ＨＬＡクラスＩＩアレルに対するペプチドの特異性にとって重要である。一部の場合には、アンカー残基隣接領域は、Ｎ末端残基である。別の場合には、アンカー残基隣接領域は、Ｃ末端残基である。さらに別の場合には、アンカー残基隣接領域は、Ｎ末端残基とＣ末端残基の両方である。一部の場合には、アンカー残基隣接領域には少なくとも２個のアンカー残基が隣接している。アンカー残基が隣接しているアンカー残基隣接領域は、「分離領域」である。
「参照」は、腫瘍検体から本開示の方法で得られた結果を相関させるためにおよび比較するために使用され得る。典型的には、「参照」は、患者または１もしくは複数の個体、例えば健康な個体、特に同じ種の個体のいずれからから採取された、１つまたは複数の正常な検体、特に、がん疾患に罹患していない検体に基づいて、得ることができる。「参照」は、十分に多い数の正常な検体を試験することにより、実験によって決定することができる。
「エピトープ」は、認識される部位、例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ分子、またはキメラ抗原受容体により認識される部位を一緒に形成する、分子の集団的特徴、例えば一次、二次および三次ペプチド構造ならびに電荷である。あるいは、エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識にまたはＴ細胞の状況に関与する一連のアミノ酸残基であって、Ｔ細胞受容体タンパク質、キメラ抗原受容体および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要な残基と定義することができる。「Ｔ細胞エピトープ」は、ペプチド提示ＭＨＣ分子またはＭＨＣ複合体の形態のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子により結合され、その後、この形態で、Ｔリンパ球またはヘルパーＴ細胞などのＴ細胞により認識され、結合され得る、ペプチド配列を意味すると理解されたい。エピトープは、天然源からの単離によって調製することができ、または当技術分野における標準的プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、人工アミノ酸残基、「アミノ酸模倣物」、例えば、天然に存在するＬ－アミノ酸残基のＤ異性体、または天然に存在しないアミノ酸残基、例えばシクロへキシルアラニンを含むことができる。本開示を通して、エピトープは、一部の場合にはペプチドまたはペプチドエピトープと呼ばれることもある。本明細書に記載のエピトープまたはアナログはもちろん追加のアミノ酸も含むタンパク質またはペプチドがやはり本開示の範囲内であることを理解されたい。ある特定の実施形態では、ペプチドは、抗原の断片を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドの長さ制限がある。長さが制限される実施形態は、本明細書に記載のエピトープを含むタンパク質またはペプチドが、ネイティブ配列と１００％の同一性を有する領域（すなわち、連続した一連のアミノ酸残基）を含む場合に生じる。例えば天然分子全体に関して、読み取りからのエピトープの定義を避けるために、ネイティブペプチド配列と１００％の同一性を有する任意の領域について長さ制限がある。したがって、本明細書に記載のエピトープと、ネイティブペプチド配列と１００％の同一性を有する領域とを含むペプチドについて、ネイティブ配列と１００％の同一性を有する領域は、一般に、６００未満またはそれに等しいアミノ酸残基、５００未満またはそれに等しいアミノ酸残基、４００未満またはそれに等しいアミノ酸残基、２５０未満またはそれに等しいアミノ酸残基、１００未満またはそれに等しいアミノ酸残基、８５未満またはそれに等しいアミノ酸残基、７５未満またはそれに等しいアミノ酸残基、６５未満またはそれに等しいアミノ酸残基、および５０未満またはそれに等しいアミノ酸残基の長さを有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の「エピトープ」は、下は５アミノ酸残基に至るまで任意の増分で、ネイティブペプチド配列と１００％の同一性を有する５１未満のアミノ酸残基、例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸残基を有する領域を有するペプチドにより構成される。
ペプチドまたはタンパク質を記載するために使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左側（アミノ末端またはＮ末端）、およびカルボキシル基が右側（カルボキシ末端またはＣ末端）に提示される、従来の慣例に従う。ペプチドエピトープ内のアミノ酸残基位置に言及される場合、それらは、アミノからカルボキシル方向に番号付けされ、エピトープの、またはそれが一部であり得るペプチドもしくはタンパク質の、アミノ末端に位置する残基が１位となる。本開示の選択された特定の実施形態を表す式では、アミノおよびカルボキシル末端基は、具体的に示されていないが、別段の指定がない限りそれらが生理ｐＨ値でとるであろう形態である。アミノ酸構造式では、各残基は、標準的な３文字または１文字表示によって一般に表される。アミノ酸残基のＬ形は、大文字１文字によって、または３文字記号の大文字の先頭文字によって表され、Ｄ形を有するアミノ酸残基についてのＤ形は、小文字１文字によって、または小文字３文字記号によって表される。しかし、３文字記号またはフルネームが大文字なしで使用される場合、それらは、Ｌアミノ酸残基を指すこともある。グリシンは、不斉炭素原子を有さないため単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と呼ばれる。本明細書で示されるペプチドのアミノ酸配列は、標準的な１文字記号を使用して一般に表される。（Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リシン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；およびＹ、チロシン）。
用語「突然変異」は、参照と比較した核酸配列の変化または相違（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を指す。「体細胞突然変異」は、胚細胞（精子および卵子）の除く身体の細胞のいずれかで起こることがあり、したがって、子供に伝えられない。これらの変更は（常にではないが）がんまたは他の疾患の原因となり得る。一部の実施形態では、突然変異は、非同義突然変異である。用語「非同義突然変異」は、翻訳産物におけるアミノ酸置換などのアミノ酸変化をもたらす突然変異、例えば、ヌクレオチド置換を指す。「フレームシフト」は、突然変異が遺伝子のコドン周期性（「リーディングフレーム」としても公知）の正常な位相を破壊した場合に起こり、その結果、ノンネイティブタンパク質配列の翻訳が生じることになる。遺伝子の異なる突然変異が、同じ変更リーディングフレームを獲得することがあり得る。
「保存的」アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、フェニルアラニンでのチロシンの置換は、保存的置換である。ペプチド機能を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である。
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合対の２つのメンバー、例えば、ＨＬＡ結合ペプチドとクラスＩまたはＩＩ ＨＬＡとの間の結合の強度の尺度を指す。ＫＤは、解離定数であり、モル濃度の単位を有する。親和性定数は、解離定数の逆数である。親和性定数は、この化学物質を記載するための一般用語として使用されることもある。それは、結合エネルギーの直接的尺度である。親和性は、例えば、市販のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲユニットを使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、実験に基づいて決定することができる。親和性は、ペプチドの５０％が置換される濃度である阻害濃度５０（ＩＣ５０）として表されることもある。同様に、ｌｎ（ＩＣ５０）は、ＩＣ５０の自然対数を指す。Ｋｏｆｆは、例えば、ＨＬＡ結合ペプチドとクラスＩまたはＩＩ ＨＬＡの解離についての、解離速度定数を指す。本開示を通して、「結合データ」の結果は、「ＩＣ５０」の観点で表され得る。ＩＣ５０は、標識参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される結合アッセイにおける被験ペプチドの濃度である。アッセイが実行される条件（すなわち、ＨＬＡタンパク質および標識参照ペプチド濃度の制限）を考えると、これらの値は、ＫＤ値に近い。結合を判定するためのアッセイは、当技術分野において周知であり、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５、ならびに他の公表文献、例えば、Ｓｉｄｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１ （１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２４７ （１９９５）；およびＳｅｔｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：８１３ （１９９４）に、詳細に記載されている。あるいは、結合は、参照標準ペプチドによる結合と比較して表現されることもある。例えば、参照標準ペプチドのＩＣ５０に対する、そのＩＣ５０に基づくことがある。結合は、他のアッセイ系を使用して決定されることもあり、そのような他のアッセイ系には、生細胞を使用するもの（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９２ （１９８９）；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６７ （１９９１）；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：４４３ （１９９０）；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：１８９ （１９９１）；ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：６８５ （１９９５））、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系を使用するもの（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：２０６９ （１９９１））、固定化精製ＭＨＣを使用するもの（例えば、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２， ２８９０ （１９９４）；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：４９４６ （１９９４））、ＥＬＩＳＡ系を使用するもの（例えば、Ｒｅａｙ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：２８２９ （１９９２））、表面プラズモン共鳴を使用するもの（例えば、Ｋｈｉｌｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１５４２５ （１９９３））；高フラックス可溶性相アッセイを使用するもの（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：２３５３ （１９９４））、およびクラスＩ ＭＨＣ安定化または会合の測定を使用するもの（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６ （１９９０）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６２：５６３ （１９９０）；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６２：２８５ （１９９０）；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１８９６ （１９９２））が含まれる。「交差反応性結合」は、ペプチドが１つより多くのＨＬＡ分子により結合されることを示し、同義語は、縮重結合である。
エピトープを論じるために使用されるときの用語「誘導された／由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ）」およびその文法的等価表現は、「調製された」およびその文法的等価表現と同義語である。誘導エピトープを天然源からの単離することができ、またはそれを当技術分野において標準的なプロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、人工アミノ酸残基、「アミノ酸模倣物」、例えば、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体、または非天然アミノ酸残基、例えばシクロへキシルアラニンを含むことができる。誘導または調製エピトープは、ネイティブエピトープのアナログであることもある。
「ネイティブ」または「野生型」配列は、自然界に見られる配列を指す。そのような配列は、本来、より長い配列を含み得る。
「受容体」は、リガンドに結合することができる生体分子または分子配置を意味すると理解されたい。受容体は、細胞、細胞形成または生物に関する情報を伝達するように機能し得る。受容体は、例えば、各受容体単位がタンパク質分子からなり得る、少なくとも１つの受容体単位を含む。受容体は、リガンドの構造を補完する構造を有し、結合パートナーとしてのリガンドを複合体化することができる。情報は、特に、細胞表面でのリガンドの複合体化後の受容体の立体構造変化により伝達される。一部の実施形態では、受容体は、特に、リガンド、特に好適な長さのペプチドまたはペプチド断片、と受容体／リガンド複合体を形成することができるＭＨＣクラスＩおよびＩＩのタンパク質を意味すると理解されたい。
「リガンド」は、受容体の構造と相補的な構造を有する分子であって、この受容体と複合体を形成することができる分子を意味すると理解されたい。一部の実施形態では、リガンドは、ペプチドまたはペプチド断片がＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのタンパク質と複合体を形成することができるようにそのアミノ酸配列において好適な長さおよび好適な結合モチーフを有する、ペプチドまたはペプチド断片を意味すると理解されたい。
一部の実施形態では、「受容体／リガンド複合体」はまた、クラスＩのまたはクラスＩＩのペプチド提示またはペプチド断片提示ＭＨＣ分子を含む、「受容体／ペプチド複合体」または「受容体／ペプチド断片複合体」を意味すると理解されたい。
「合成ペプチド」は、非天然源から得られるペプチド、例えば、人間が作り出したペプチドを指す。そのようなペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用して生成することができる。「合成ペプチド」は、「融合タンパク質」を含む。
用語「モチーフ」は、被定義長のアミノ酸配列、例えば、長さが約１５アミノ酸残基未満、または長さが約１３アミノ酸残基未満のペプチド、例えば、特定のＨＬＡ分子により認識される、クラスＩ ＨＬＡモチーフについては約８～約１３アミノ酸残基（例えば、８、９、１０、１１、１２または１３）およびクラスＩＩ ＨＬＡモチーフについては約６～約２５アミノ酸残基（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）のペプチドにおける、残基のパターンを指す。モチーフは、通常は、所与のヒトＨＬＡアレルによりコードされるＨＬＡタンパク質ごとに異なる。これらのモチーフは、一次および二次アンカー残基についてのそれらのパターンが異なる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩモチーフは、長さが９、１０または１１アミノ酸残基のペプチドを識別する。
本明細書において使用される場合の用語「天然に存在する」およびその文法的等価表現は、物体を自然界で見出すことができることを指す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、自然界の供給源から単離することができる、ペプチドまたは核酸であって、研究室で人間によって意図的に修飾されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在するものである。
本開示によれば、用語「ワクチン」は、病原体または罹患細胞、例えばがん細胞を認識して攻撃する免疫応答、例えば細胞性または体液性免疫応答を、投与時に誘導する、医薬調製物（医薬組成物）または医薬製品に関する。ワクチンは、疾患の予防に使用されることもあり、または処置に使用されることもある。用語「個々に応じたがんワクチン」または「個別化がんワクチン」は、特定のがん患者に関するものであり、がんワクチンが個々のがん患者の必要または特別な状況に適応することを意味する。
「抗原プロセシング」または「プロセシング」およびその文法的等価表現は、ポリペプチドまたは抗原の、前記ポリペプチドまたは抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えば、ポリペプチドのペプチドへの分解）、および細胞、例えば抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のためのこれらの断片の１つまたは複数とＭＨＣ分子の（例えば結合を介した）会合を指す。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、それらの細胞表面にＭＨＣ分子に関連しているタンパク質抗原のペプチド断片を提示する細胞である。一部のＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。プロフェッショナル抗原提示細胞は、ファゴサイトーシスまたは受容体媒介エンドサイトーシスのどちらかによる抗原の内在化、およびその後のクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原断片のそれらの膜への提示における効率が非常に高い。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原－クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。その結果、追加の共刺激シグナルが、抗原提示細胞により産生され、Ｔ細胞の活性化に至る。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞を決定付ける特徴である。プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、樹状細胞（これらは、最も広い抗原提示範囲を有し、恐らく、最も重要な抗原提示細胞である）、マクロファージ、Ｂ細胞、およびある特定の活性化上皮細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織に捕捉された抗原をＴ細胞へＭＨＣクラスＩＩ抗原提示経路とＭＨＣクラスＩ抗原提示経路の両方によって提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であること、およびこれらの細胞の活性化が抗腫瘍免疫の誘導に必要不可欠なステップであることは、周知である。樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として便宜的に大別され、これは、２つの十分に特徴付けられた表現型を区別する単純な方法として使用され得る。しかし、この命名法を、分化についての全ての可能性のある中間段階を除外するように解釈すべきでない。未熟樹状細胞は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）およびマンノース受容体の高度な発現と相関する高い抗原の取込みおよびプロセシング能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、これらのマーカーのより低度の発現、しかしＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子、例えばクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４－１ＢＢ）の高度な発現を、通常は特徴とする。
本明細書で使用される場合の用語「同一の」およびその文法的等価表現、またはポリペプチドの２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈での「配列同一性」は、指定比較ウィンドウにわたって最大に一致するようにアラインメントされたときに同じである２つの配列中の残基を指す。本明細書で使用される場合の「比較ウィンドウ」は、ある配列を同数の連続する位置の参照配列とそれら２配列の最適なアラインメント後に比較することができる、少なくとも約２０の連続する位置、通常は約５０～約２００、より通常は約１００～約１５０の連続する位置のセグメントを指す。比較のための配列アラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２：４８２
（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３ （１９７０）のアラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検索方法により；これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない）により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ
Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－２４４ （１９８８）およびＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ， ５：１５１－１５３ （１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６：１０８８１－１０８９０ （１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ８：１５５－１６５
（１９９２）；ならびにＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２４：３０７－３３１ （１９９４）によって十分に説明されている。アラインメントは、点検および手動アラインメントにより行われることも多い。実施形態の１つのクラスでは、本明細書におけるポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴＰ（またはＣＬＵＳＴＡＬ、または任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定して、参照ポリペプチドまたはその断片に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。同様に、核酸もまた出発核酸に対して記載されることがあり、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴＮ（またはＣＬＵＳＴＡＬ、または任意の他の利用可能なアラインメントソフトウェア）によって測定して、参照核酸またはその断片に対して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することがある。１つの分子が、より大きい分子とのある特定の配列同一性パーセンテージを有すると言われるとき、それは、これら２分子が最適にアラインメントされたとき、小さいほうの分子中の前記パーセンテージの残基が、大きいほうの分子中でこれら２分子が最適にアラインメントされた順序に従ってマッチ残基と出会うことを意味する。
核酸配列またはアミノ酸配列に適用される場合の用語「実質的に同一の」およびその文法的等価表現は、核酸またはアミノ酸配列が、標準的パラメーターを使用して上記のプログラム、例えばＢＬＡＳＴを使用して、参照配列と比較して少なくとも９０％のもしくはそれより高い配列同一性、または少なくとも９５％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９９２）を参照されたい）。配列同一性パーセンテージは、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、２つ配列の最適なアラインメントのために参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定される。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算される。実施形態では、実質的同一性は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたって、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、一部の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である。実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
本明細書で使用される場合の用語「ベクター」は、宿主細胞において目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達することおよび通常は発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤を伴うＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびリポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
「単離されている」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、自然界では見られない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、それらが自然界で見られる形態ではもはやない程に精製されているものを含む。一部の実施形態では、単離されているポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、実質的に純粋である。一部の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」は、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ反応で増幅されたポリヌクレオチドを含む、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ反応を包含する。
用語「単離された」、「生物学的に純粋な」またはそれらの文法的等価表現は、物質がそのネイティブな状態で見出されたときに物質に通常は伴う成分が実質的にまたは本質的にない物質を指す。したがって、本明細書に記載の単離されたペプチドは、それらの本来の位置の環境にあるペプチドに通常は付随する物質の一部も全ても含有しない。「単離された」エピトープは、エピトープが由来した抗原の全配列を含まないエピトープを指す。通常は、「単離された」エピトープには、ネイティブ配列の全長にわたって１００％の同一性を有する配列をもたらす追加のアミノ酸残基が結合していない。ネイティブ配列は、エピトープが由来する腫瘍関連抗原などの配列であることもある。したがって、用語「単離された」は、物質がその元の環境（例えば、その物質が天然に存在する場合には天然環境）から除去されていることを意味する。「単離された」核酸は、その天然環境から除去された核酸である。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはペプチドは、単離されていないが、天然の系に共存する物質の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部であることもあり、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはペプチドが組成物の一部であることもあるが、それでもやはり、そのようなベクターもしくは組成物がその天然環境の一部でないことから「単離されている」こともある。単離されたＲＮＡ分子は、本明細書に記載のＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写物を含み、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。
本明細書で使用される場合の用語「実質的に精製された」およびその文法的等価表現は、核酸、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物が天然に伴う、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドおよび他の分子が本質的にない、すなわち、その約５０％より多くがない、その約７０％より多くがない、その約９０％より多くがない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指す。
本明細書で使用される場合の用語「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、夾雑物がない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である物質を指す。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ポリ核酸」または「オリゴヌクレオチド」およびそれらの文法的等価表現は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。したがって、これらの用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。それは、例えばメチル化によりおよび／またはキャッピングにより、修飾された形態、ならびに未修飾の形態のポリヌクレオチドも含む。この用語はまた、天然に存在しないまたは合成のヌクレオチドはもちろんヌクレオチドアナログも含む分子を含むように意図される。本明細書で開示または企図される核酸配列およびベクターは、例えばトランスフェクション、形質転換または形質導入により、細胞に導入することができる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログであってもよく、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよび核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して投与されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
本明細書で使用される場合の「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」は、物理的または化学的方法を使用することによる宿主細胞への１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈法（例えば、Ｍｕｒｒａｙ Ｅ． Ｊ． （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ７， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）を参照されたい）；ＤＥＡＥ－デキストラン；電気穿孔；カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子銃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４６： ７７６－７７７ （１９９０））；およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈法（Ｂｒａｓｈ ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７： ２０３１－２０３４ （１９８７））を含む。その多くが市販されている、好適なパッケージング細胞の中で感染粒子を成長させた後に、ファージまたはウイルスベクターを宿主細胞に導入することができる。
核酸および／または核酸配列は、それらが、共通の祖先核酸または核酸配列から天然にまたは人工的に誘導された場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが共通の祖先核酸または核酸配列から天然にまたは人工的に誘導された場合、「相同」である。相同分子は、ホモログと呼ばれる。例えば、本明細書に記載の、任意の天然に存在するタンパク質を、任意の利用可能な突然変異誘発法によって修飾することができる。発現されたとき、この突然変異誘発された核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同であるポリペプチドをコードする。相同性は、２つまたはそれより多くの核酸またはタンパク質（またはそれらの配列）間の配列同一性から一般に推測される。相同性を確立するのに有用である配列間の正確な同一性パーセンテージは、問題の核酸およびタンパク質によって変わるが、相同性を確立するためにわずか２５％ほどの配列同一性のみが通常は使用される。高い配列同一性レベル、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％もしくはそれより高い％を使用して相同性を確立することもできる。配列同一性パーセンテージを決定する方法（例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）は、本明細書に記載され、一般に利用可能である。
用語「対象」は、特定の処置のレシピエントになる、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。概して、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して本明細書では同義的に使用される。
用語「有効量」または「治療有効量」または「治療効果」は、対象または哺乳動物の疾患または障害を「処置する」のに有効な治療薬の量を指す。薬物の治療有効量は、治療効果を有し、したがって、疾患もしくは障害の発症を予防することができ、疾患もしくは障害の発症を遅らせることができ、疾患もしくは障害の進行を遅らせることができ、疾患もしくは障害に関連する症状の１つもしくは複数をある程度軽減することができ、罹患率もしくは死亡率を低下させることができ、生活の質、またはそのような効果の組合せを改善することができる。
用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」もしくは「処置」もしくは「処置すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」または「緩和すること」もしくは「緩和する」は、（１）診断された病的状態もしくは障害を治癒させる、遅らせる、その症状を減少させる、および／またはその進行を停止させる、治療的手段と、（２）標的とする病的状態または障害の発症を予防または緩徐化する発病予防手段または予防手段の、両方を指す。したがって、処置を必要とする者は、障害を既に有している者；障害に罹患しやすい者；および疾患を予防すべき者を含む。
「薬学的に許容される」は、一般に非毒性の、不活性の、および／または生理学的に適合性の組成物または組成物の成分を指す。
「医薬品賦形剤」または「賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調製および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、保存薬などのような物質を含む。「医薬品賦形剤」は、薬学的に許容される賦形剤である。
ネオ抗原およびそれらの使用
根治的かつ腫瘍特異的な免疫療法の開発に対する深刻な障害の１つは、自己免疫を回避するための高特異的な限定された腫瘍抗原の同定および選択である。悪性細胞内の遺伝子変化（例えば、逆位、転座、欠失、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異など）の結果として生じる腫瘍ネオ抗原は、腫瘍特異性が最も高い抗原クラスの代表である。ネオ抗原は、それらの同定、最適化された抗原の選択、およびワクチンまたは免疫原性組成物に使用するためのネオ抗原の産生が技術的に困難であるため、がんワクチンまたは免疫原性組成物にはほとんど使用されていない。これらの問題には、がんを有する対象の高い割合からのマッチする生殖系列試料中ではなく腫瘍中にＤＮＡレベルで存在する新生物／腫瘍の突然変異を同定すること；同定された突然変異を１つたは複数のペプチド－ＭＨＣ結合予測アルゴリズムで解析して、新生物／腫瘍内に発現され、患者ＨＬＡアレルの高い割合に結合する、複数のネオ抗原Ｔ細胞エピトープを生成すること；およびがんを有する対象の高い割合を処置するのに好適ながんワクチンまたは免疫原性組成物において使用するために、全てのネオ抗原ペプチドおよび予測された結合ペプチドのセットから選択された複数のネオ抗原ペプチドを合成することによって、対処することができる。
例えば、治療ワクチンへのペプチド配列決定情報の翻訳は、個体の高い割合についてのＨＬＡ分子に結合することができる突然変異ペプチドの予測を含み得る。免疫源として利用する特定の突然変異を効率的に選択するには、どの突然変異ペプチドが患者のＨＬＡアレルの高い割合に効率的に結合するのかを予測できなければならない。最近、検証された結合および非結合ペプチドを用いる神経回路網に基づく学習手法が、主要ＨＬＡ－Ａおよび－Ｂアレルについての予測アルゴリズムの正確度を向上させた。しかし、ＨＬＡ－ペプチド結合規則をコードするために、向上した神経回路網に基づくアルゴリズムを使用しても、いくつかの要因が、ＨＬＡアレル上に提示されるペプチドの予測力を制限する。
治療ワクチンへのペプチド配列決定情報の翻訳の別の例としては、長いペプチドのマルチエピトープワクチンとしての薬物の製剤化を挙げることができる。実現可能な限り多くの突然変異エピトープを標的化することによって、免疫系の非常に大きな能力が活用され、免疫標的化遺伝子産物の抑制的調節による免疫回避の機会が防止され、エピトープ予測手法の公知正確度が補償される。合成ペプチドは、複数の免疫原を効率的に調製するための、および突然変異型エピトープの同定を有効なワクチンに迅速に翻訳するための、有用な手段を提供する。夾雑細菌物質も夾雑動物物質もない試薬を利用してペプチドを容易に化学合成することおよび簡単に精製することができる。小さいサイズによって、タンパク質の突然変異領域に明確に焦点を合わせることが可能になり、他の成分（非突然変異タンパク質またはウイルスベクター抗原）からの不適切な抗原の競合も低減される。
治療ワクチンへのペプチド配列決定情報の翻訳についてのさらに別の例としては、強いワクチンアジュバントとの組合せを挙げることができる。有効なワクチンは、免疫応答を開始させるために強いアジュバントを必要とし得る。例えば、ＴＬＲ３ならびにＭＤＡ５およびＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインについてのアゴニストであるポリＩＣＬＣは、ワクチンアジュバントに望ましいいくつかの特性を示した。これらの特性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞の局所および全身性活性化の誘導、刺激性ケモカインおよびサイトカインの産生、ならびにＤＣによる抗原提示の刺激を含む。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトにおいて持続的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なこととして、転写経路およびシグナル伝達経路の上方調節の著しい類似性が、ポリＩＣＬＣを用いるワクチン接種を受けた対象、および非常に有効な複製可能な黄熱病ワクチンを受けたボランティアに見られた。さらに、ＮＹＥＳＯ－１ペプチドワクチン（モンタナイドに加えて）と組み合わせてポリＩＣＬＣで免疫された卵巣癌患者の＞９０％は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、ならびに最近の第１相研究でペプチドに対する抗体応答を示した。それに加えて、ポリＩＣＬＣは、今日までに２５を超える臨床試験で広く試験され、比較的無害な毒性プロファイルを示した。
一部の態様では、タンパク質の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含む組成物、第１のペプチドと第２のペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含む組成物、第１のペプチドと第２のペプチドとを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含む組成物、またはＨＬＡタンパク質との複合体中の第１のネオエピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ＨＬＡタンパク質との複合体中の第２のネオエピトープに特異的な第２のＴＣＲとを含む組成物であって、第１のペプチドが、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが、突然変異を含み、第２のネオエピトープが、同じ突然変異を含む、組成物が、本明細書で提供される。
一部の態様では、タンパク質の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のネオエピトープおよび第２のネオエピトープが、同じである領域の少なくとも１個のアミノ酸を含む、組成物、第１のペプチドと第２のペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含む組成物、第１のペプチドと第２のペプチドとを含む１つもしくは複数のＡＰＣを含む組成物、またはＨＬＡタンパク質との複合体中の第１のネオエピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ＨＬＡタンパク質との複合体中の第２のネオエピトープに特異的な第２のＴＣＲとを含む組成物であって、第１のペプチドが、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが、第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープが、第２の突然変異を含む、組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第１の突然変異と第２の突然変異は同じである。一部の実施形態では、第１のペプチドと第２のペプチドは、異なる分子である。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、同じタンパク質の領域の第１のネオエピトープを含み、第２のネオエピトープは、同じタンパク質の領域の第２のネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第１のネオエピトープおよび第２のネオエピトープは、同じである領域の少なくとも１個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、タンパク質の領域は、タンパク質の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００個の連続するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、タンパク質の領域は、タンパク質の最大でも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００個の連続するアミノ酸のみを有する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、第１のペプチドからプロセシングされた第１のネオエピトープペプチドであり、および／または第２のネオエピトープは、第２のペプチドからプロセシングされた第２のネオエピトープペプチドである。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、長さが第１のペプチドより短く、および／または第２のネオエピトープは、長さが第２のペプチドより短い。一部の実施形態では、第１のネオエピトープペプチドは、第１のペプチドを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングされ、および／または第２のネオエピトープペプチドは、第２のペプチドを含むＡＰＣによりプロセシングされる。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、第１または第２のペプチドを含むクラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＰＣは、第１のペプチドを含む第１のＡＰＣ、および第２のペプチドを含む第２のＡＰＣを含む。一部の実施形態では、突然変異は、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のネオエピトープおよび第２のネオエピトープは、表１または２の遺伝子によりコードされる配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、表１または２の遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、突然変異は、表１または２の第２列の突然変異である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＧＡＴＡ３である。一部の実施形態では、第１のネオエピトープおよび第２のネオエピトープは、表３４または表３６の遺伝子によりコードされる配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、表３４または表３６の遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、突然変異は、表３４または表３６の第２列の突然変異である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＢＴＫである。一部の実施形態では、第１のネオエピトープはおよび第２のネオエピトープは、表４０Ａ～４０Ｄの遺伝子によりコードされる配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、表３または３５の遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、突然変異は、表３または３５の第２列の突然変異である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＥＧＦＲである。一部の実施形態では、単一のポリペプチドが、第１のペプチドおよび第２のペプチドを含み、または単一のポリヌクレオチドが、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同じ転写開始部位から転写された配列によりコードされる。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第１の転写開始部位から転写された配列によりコードされ、第２のペプチドは、第２の転写開始部位から転写された配列によりコードされる。一部の実施形態では、単一のポリペプチドは、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第１の対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する第１の配列と、対応する第２の野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する第２の配列とを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対応する第１の野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する少なくとも８または９個の連続するアミノ酸の第１の配列と、対応する第２の野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する少なくとも１６または１７個の連続するアミノ酸の第２の配列とを含む。一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドより長い。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドより長い。一部の実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、第２のペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する少なくとも１７個の連続するアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、第１のネオエピトープより長い。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、少なくとも８アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、８～１２アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、８個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置のものと異なる。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、少なくとも１６アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、１６～２５アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、少なくとも１６個の連続するアミノ酸を含み、１６個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置におけるものと異なる。
一部の実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも１つの付加的突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第１のネオエピトープの突然変異でない。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第１のネオエピトープの突然変異である。一部の実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１つの付加的突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第２のネオエピトープの突然変異でない。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第２のネオエピトープの突然変異である。一部の実施形態では、第１のペプチド、第２のペプチドまたは両方は、少なくとも１つの隣接配列を含み、少なくとも１つの隣接配列は、ネオエピトープの上流または下流にある。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、非野生型配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｎ末端隣接配列である。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｃ末端隣接配列である。一部の実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つの隣接配列は、第２のペプチドの少なくとも１つの隣接配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つの隣接領域は、第２のペプチドの少なくとも１つの隣接領域とは異なる。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接残基は、突然変異を含む。一部の実施形態では、第１のネオエピトープ、第２のネオエピトープまたは両方は、少なくとも１個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、第１のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、標準アンカー位置にある。一部の実施形態では、第１のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、非標準アンカー位置にある。一部の実施形態では、第２のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、標準アンカー位置にある。一部の実施形態では、第２のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、非標準アンカー位置にある。一部の実施形態では、第１のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、第２のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基とは異なる。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、野生型残基である。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、置換物である。一部の実施形態では、第１ネオエピトープおよび／または第２のネオエピトープは、置換のない対応するネオエピトープより大きい親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１ネオエピトープおよび／または第２のネオエピトープは、置換のない対応する野生型配列より大きい親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、突然変異を含まない。一部の実施形態では、第１のネオエピトープ、第２のネオエピトープまたは両方は、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域を含む。一部の実施形態では、ネオエピトープは、少なくとも１個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、少なくとも２個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、少なくとも２個のアンカー残基は、少なくとも１個のアミノ酸を含む分離領域により分離されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域は、分離領域内にない。一部の実施形態では、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域は、（ａ）および（ｂ）両方ともに少なくとも２個のアンカー残基のうちのＣ末端アンカー残基の下流の少なくとも２個のアンカー残基のうちのＮ末端アンカー残基の上流にある。
一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の追加のペプチドを含み、１つまたは複数の追加のペプチドは、第３のネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、対応する野生型配列より大きい親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、対象により発現されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、突然変異は、対象の非がん細胞には存在しない。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、対象のがん細胞の遺伝子または発現遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、組成物は、第１のＴＣＲを含む第１のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、第２のＴＣＲを含む第２のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、第１のＴＣＲは、ノンネイティブ細胞内ドメインを含み、および／または第２のＴＣＲは、ノンネイティブ細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＴＣＲは、可溶性ＴＣＲであり、および／または第２のＴＣＲは、可溶性ＴＣＲである。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞である。一部の実施形態では、第１のＴ細胞は、第１のネオエピトープで刺激、拡大もしくは誘導されたＴ細胞であり、および／または第２のＴ細胞は、第２のネオエピトープで刺激、拡大もしくは誘導されたＴ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、自己Ｔ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、同種異系Ｔ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴ細胞は、細胞系のＴ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の態様では、本明細書に記載の第１および第２のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはこれらの偽型に由来する。一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアである。
一部の態様では、本明細書に記載の組成物または本明細書に記載のベクターと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、複数の細胞は、自己細胞である。一部の実施形態では、複数のＡＰＣ細胞は、自己細胞である。一部の実施形態では、複数のＴ細胞は、自己細胞である。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、免疫調節剤は、サイトカインである。一部の実施形態では、アジュバントは、ポリＩＣＬＣである。一部の実施形態では、アジュバントは、ヒルトノールである。
一部の態様では、がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一部の態様では、がん治療に対する抵抗性を予防する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一部の態様では、免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、免疫応答は、体液性応答である。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドの後に逐次的に投与される。一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチド後に逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドがＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後、逐次的に投与される。一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドがＴ細胞を活性化するのに十分な期間の後、逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドの後にＴ細胞を再刺激するために逐次的に投与される。一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドの後にＴ細胞を再刺激するために逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のペプチドは、Ｔ細胞を刺激するために投与され、第２のペプチドは、第１のペプチドの後にＴ細胞を再刺激するために投与される。一部の実施形態では、第２のペプチドは、Ｔ細胞を刺激するために投与され、第１のペプチドは、第２のペプチドの後にＴ細胞を再刺激するために投与される。
一部の実施形態では、対象は、がんを有し、がんは、黒色腫、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、がんは、抗エストロゲン療法に対して抵抗性である、ＭＳＩ乳がんである、転移性乳がんである、Ｈｅｒ２陰性乳がんである、Ｈｅｒ２陽性乳がんである、ＥＲ陰性乳がんである、ＥＲ陽性乳がんである、ＰＲ陽性乳がんである、ＰＲ陰性乳がんまたはこれらの任意の組合せである、乳がんである。一部の実施形態では、乳がんは、突然変異を有するエストロゲン受容体を発現する。一部の実施形態では、対象は、抗エストロゲン療法に対して抵抗性である乳がんを有する。一部の実施形態では、乳がんは、突然変異を有するエストロゲン受容体を発現する。一部の実施形態では、対象は、イブルチニブ療法に対して抵抗性であるＣＬＬを有する。一部の実施形態では、ＣＬＬは、Ｃ４８１Ｓ突然変異などの突然変異を有するブルトン型チロシンキナーゼを発現する。一部の実施形態では、対象は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性である肺がんを有する。一部の実施形態では、肺がんは、Ｔ７９０Ｍ突然変異などの突然変異を有する上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する。一部の実施形態では、第１のペプチドを含む複数のＡＰＣ細胞、および第２のペプチドを含む複数のＡＰＣ細胞は、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のＴＣＲを含む複数のＴ細胞、および第２のＴＣＲを含む複数のＴ細胞は、同時に、別々にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤または治療法は、外科手術、チェックポイント阻害剤、抗体もしくはその断片、化学療法剤、放射線、ワクチン、小分子、Ｔ細胞、ベクター、およびＡＰＣ、ポリヌクレオチド、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗ＰＤ－１剤および抗ＰＤ－Ｌ１剤、抗ＣＴＬＡ－４剤、または抗ＣＤ４０剤である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、本明細書における記載に従って医薬組成物の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。
ペプチド
態様では、本開示は、表１または２からの腫瘍特異的突然変異を含む単離されたペプチドを提供する。態様では、本開示は、表３４からの腫瘍特異的突然変異を含む単離されたペプチドを提供する。態様では、本開示は、表４０Ａ～４０Ｄからの腫瘍特異的突然変異を含む単離されたペプチドを提供する。これらのペプチドおよびポリペプチドは、本明細書では「ネオ抗原性ペプチド」または「ネオ抗原性ポリペプチド」と呼ばれる。本明細書で使用される場合の「ポリペプチド」、「ペプチド」およびそれらの文法的等価表現は、通常は隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により、一方が他方に接続されている、アミノ酸残基、通常は、Ｌ－アミノ酸、のポリマーを指す。ポリペプチドおよびペプチドは、「突然変異型ペプチド」、「ネオ抗原ペプチド」および「ネオ抗原性ペプチド」を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドおよびペプチドは、様々な長さで、それらの中性（非荷電）形態または塩の形態のどちらかであり得、グリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化などの修飾がないこともあり、またはこれらの修飾を、修飾が本明細書に記載されるようなポリペプチドの生物活性を破壊しないことを条件として、含有することもある。ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの隣接配列を含み得る。本明細書で使用される場合の用語「隣接配列」は、エピトープの一部でないペプチドの断片または領域を指す。
表１はＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドを収載するものである
下記の表２は例示的な選択されたペプチドを収載するものである
１下線付きＡＡは、ノンネイティブＡＡを表す
表３
１下線付きＡＡは、ノンネイティブＡＡを表す
２太字ＡＡは、２つの融合した遺伝子の２番目のものによりコードされるアミノ酸配列のネイティブＡＡを表す
３太字かつ下線付きＡＡは、フレームシフトに起因する、２つの融合した遺伝子の２番目のものによりコードされるアミノ酸配列のノンネイティブＡＡを表す
ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を標的とし、ＣＬＬおよびある特定のリンパ腫に使用される分子である、イブルチニブに非常によく見られる突然変異は、４８１位におけるシステインからセリンへの変化（Ｃ４８１Ｓ）である。この変化は、様々なＨＬＡ分子に結合する多数の結合ペプチドを生じさせる。突然変異は、アミノ酸配列：
を有する領域内にあり、突然変異したセリンには下線が付けられている。
Ｃ４８１Ｓ突然変異に対応する例示的ネオ抗原性ペプチドは、表３４で提示される。この表は、ＨＬＡアレルのリストも提供し、これらのＨＬＡアレルのコードされたタンパク質産物は、ペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、本開示は、がん治療薬のＣ４８１Ｓネオエピトープ、例えば、ＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＡＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＥＹＭＡＮＧＳＬ；ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮ；ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＧＳＬＬＮＹＬＲＥＭ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬ；ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬ；ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲ；ＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＮＧＳＬＬＮＹＬ；ＳＬＬＮＹＬＲＥＭＲ；ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬ；ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹ；ＹＭＡＮＧＳＬＬ；およびＹＭＡＮＧＳＬＬＮを提供する。表３５および３は、他のがん関連遺伝子突然変異に対応する例示的ネオ抗原候補を提供する。図３６は、本願のための選択されたＨＬＡ拘束性ＢＴＫペプチド、および突然変異型ＢＴＫペプチドが結合するまたは結合すると予測されるＨＬＡアレルによりコードされる対応するタンパク質についてのリストを提供する。表３７は、本願の文脈に当てはまるような、選択されたＢＴＫペプチド、およびペプチドが結合するまたは結合すると予測されるＨＬＡアレルによりコードされる対応する好ましいタンパク質についてのリストを提供する。下記の表３４はＣ４８１Ｓ突然変異に対応する例示的ネオ抗原性ペプチドを収載するものである
表３５は他のがん関連遺伝子突然変異に対応する例示的ネオ抗原候補を提供するものである
１下線付きＡＡは、ノンネイティブＡＡを表す
２太字ＡＡは、２つの融合した遺伝子の２番目のものによりコードされるアミノ酸配列のネイティブＡＡを表す
３太字かつ下線付きＡＡは、フレームシフトに起因する、２つの融合した遺伝子の２番目のものによりコードされるアミノ酸配列のノンネイティブＡＡを表す
下記の表３６は、本願のための選択されたＨＬＡ拘束性ＢＴＫペプチド、および突然変異型ＢＴＫペプチドが結合するまたは結合すると予測されるＨＬＡアレルによりコードされる対応するタンパク質についてのリストを提供する。
表３６
表３７は、本願の文脈に当てはまるような、選択されたＢＴＫペプチド、およびペプチドが結合するまたは結合すると予測されるＨＬＡアレルによりコードされる対応する好ましいタンパク質についてのリストを提供する。
表３７
様々な種類のがんに高頻度に見られるＥＧＦＲ遺伝子の例示的突然変異が表４０Ａ～４０Ｄで提示される。この表は、例示的ＥＧＦＲネオ抗原性ペプチドも提供する。がんに高頻度に見られる単一アミノ酸置換を伴う突然変異は、表４０Ａ～４０Ｃに収載される。欠失を伴うまたは欠失および挿入を伴う例示的突然変異は、表４０Ｄで提示される。
表４０Ａ．がんにおける例示的ＥＧＦＲ点突然変異および突然変異型ペプチド
表４０Ｂ．がんにおける例示的ＥＧＦＲ点突然変異および突然変異型ペプチド
表４０Ｃ．がんにおける例示的ＥＧＦＲ点突然変異および突然変異型ペプチド
表４０Ｄ．がんにおける例示的ＥＧＦＲ欠失突然変異、融合突然変異
上記の表において、例示的融合の１つまたは複数について、最初の「：」の前にある配列は、第１の遺伝子によりコードされるポリペプチドのエクソン配列に属し、２番目の「：」の後にある配列は、第２の遺伝子によりコードされるポリペプチドのエクソン配列に属し、「：」記号の間に出現するアミノ酸は、第１の遺伝子によりコードされるポリペプチドのエクソン配列と第２の遺伝子によりコードされるポリペプチドのエクソン配列の間で分割されるコドンによりコードされる。
しかし、一部の実施形態、例えば、ＮＡＢ：ＳＴＡＴ６では、ＮＡＢエクソンは、ＳＴＡＴ６の５’ＵＴＲに連結されており、接合部の後に出現する第１のアミノ酸は、ＳＴＡＴ６の通常の開始コドンである（この部位にフレームは存在しない（それは、通常は翻訳されないため））。
上記の表中のＡＲ－Ｖ７を、一部の実施形態では、全長ＡＲに見られるリガンド結合ドメインを欠いているタンパク質をコードするＡＲ遺伝子のスプライスバリアントと見なすこともできる。
一部の実施形態では、腫瘍特異的突然変異を同定するために配列決定法が使用される。任意の好適な配列決定法、例えば次世代配列決定（ＮＧＳ）技術を、本開示に従って使用することができる。第三世代配列決定法は、方法の配列決定ステップを加速するために、将来、ＮＧＳ技術と置き換わる可能性がある。明確にするために、本開示の文脈での用語「次世代配列決定」または「ＮＧＳ」は、サンガー化学として公知の「従来の」配列決定方法論とは対照的に、全ゲノムを小片に分解することにより核酸鋳型を全ゲノムに沿って並行してランダムに読み取る、全ての新規ハイスループット配列決定技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（大規模並列配列決定技術としても公知）は、非常に短期間で、例えば、１～２週間以内、例えば、１～７日以内または２４時間未満以内に、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムの全ての転写配列）またはメチローム（ゲノムの全てのメチル化配列）の核酸配列情報を供給することができ、原理上は単一細胞配列決定手法を可能にする。市販されているまたは文献で述べられている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えば、ＷＯ２０１２／１５９６４３に詳細に記載されているものを、本開示に関連して使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、これらに限定されないが、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１５０、約２００、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約７，５００、約１０，０００個のアミノ酸またはそれより多くのアミノ酸残基、およびこれらの中から導出可能な任意の範囲を含み得る。特定の実施形態では、ネオ抗原性ペプチド分子は、１００アミノ酸に等しいかまたはそれ未満である。
一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約８から約５０アミノ酸残基まで、または長さが約８から約３０アミノ酸残基まで、約８から約２０アミノ酸残基まで、約８から約１８アミノ酸残基まで、約８から約１５アミノ酸残基まで、または約８から約１２アミノ酸残基までであり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約８から約５００アミノ酸残基まで、または長さが約８から約４５０アミノ酸残基まで、約８から約４００アミノ酸残基まで、約８から約３５０アミノ酸残基まで、約８から約３００アミノ酸残基まで、約８から約２５０アミノ酸残基まで、約８から約２００アミノ酸残基まで、約８から約１５０アミノ酸残基まで、約８から約１００アミノ酸残基まで、約８から約５０アミノ酸残基まで、または約８から約３０アミノ酸残基までであり得る。
一部の実施形態では、ペプチドは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを超えるアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれを超えるアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが最大でも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ未満のアミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが最大でも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ未満のアミノ酸残基であり得る。
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、または少なくとも５００アミノ酸の全長を有する。
一部の実施形態では、ペプチドは、最大でも８、最大でも９、最大でも１０、最大でも１１、最大でも１２、最大でも１３、最大でも１４、最大でも１５、最大でも１６、最大でも１７、最大でも１８、最大でも１９、最大でも２０、最大でも２１、最大でも２２、最大でも２３、最大でも２４、最大でも２５、最大でも２６、最大でも２７、最大でも２８、最大でも２９、最大でも３０、最大でも４０、最大でも５０、最大でも６０、最大でも７０、最大でも８０、最大でも９０、最大でも１００、最大でも１５０、最大でも２００、最大でも２５０、最大でも３００、最大でも３５０、最大でも４００、最大でも４５０、または最大でも５００アミノ酸の全長のみを有する。
より長いペプチドをいくつかの方法で設計することができる。一部の実施形態では、ＨＬＡ結合ペプチドが予測されるまたは分かっている場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮおよびＣ末端の方に２～５アミノ酸の伸長がある個々の結合ペプチド、または（２）各々に伸長配列がある結合ペプチドの一部または全ての連鎖を含む。他の実施形態では、配列決定が、腫瘍に存在する長い（＞１０残基）ネオエピトープ配列を（例えば、新規ペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルーまたはイントロン包含に起因して）示す場合、より長いペプチドは、単一のより長いペプチド、またはいくつかのオーバーラップしているより長いペプチドのどちらかのような、新規腫瘍特異的アミノ酸の全ストレッチからなり得る。一部の実施形態では、より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能にすると推定され、より有効な抗原提示およびＴ細胞応答の導入をもたらすことができる。一部の実施形態では、ペプチドがオーバーラップし、長いネオ抗原性ペプチドにわたってタイリングされている、２つまたはそれより多くのペプチドが使用され得る。
一部の実施形態では、ペプチドは、約０．５～約１２、約２～約１０、または約４～約８のｐＩ値を有することがある。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５のまたはそれより大きいｐＩ値を有することもある。一部の実施形態では、ペプチドは、最大でも４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、またはそれ未満のｐＩ値のみを有することもある。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、溶解していることがあり、凍結乾燥されていることがあり、または結晶形態であることもある。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドを、組換えＤＮＡ技術もしくは化学合成によって合成的に調製することができ、または自然腫瘍もしくは病原生物などの天然源から単離することができる。ネオエピトープを個々に合成することができ、またはペプチド内で直接もしくは間接的に接合させることができる。本明細書に記載のペプチドには他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらの断片が実質的にないことがあるが、一部の実施形態では、ペプチドを、ネイティブ断片または粒子に接合するように合成的にコンジュゲートさせることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドを多種多様な方法で調製することができる。一部の実施形態では、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上でペプチドを合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従ってそれらを使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ．Ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， １９８４を参照されたい。さらに、化学的ライゲーションを使用して個々のペプチドを接合させて、やはり本開示の範囲内にあるより長いペプチドを生成することができる。
あるいは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に好適な条件下で培養される、組換えＤＮＡ技術を利用することができる。これらの手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に一般に記載されているように、当技術分野において一般に公知である。したがって、本明細書に記載の１つまたは複数のネオ抗原性ペプチドを含む組換えペプチドを使用して、適切なＴ細胞エピトープを提示することができる。
一部の実施形態では、ペプチドは、ネイティブペプチドのアミノ酸置換を生じさせる結果となる点突然変異を有する遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、フレームシフト突然変異を生じさせる結果となる点突然変異を有する遺伝子によりコードされる。フレームシフトは、突然変異が遺伝子のコドン周期性（「リーディングフレーム」としても公知）の正常な位相を破壊した場合に起こり、その結果、ノンネイティブタンパク質配列の翻訳が生じることになる。遺伝子の異なる突然変異が、変更された同じリーディングフレームを獲得することがあり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、融合ポリペプチド、インフレーム欠失、挿入、内在性レトロウイルスポリペプチドの発現、およびポリペプチドの腫瘍特異的過剰発現を生じさせる結果となる突然変異を有する遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と第２の遺伝子の融合体によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と第２の遺伝子のインフレーム融合体によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と第１の遺伝子のスプライスバリアントのエクソンとの融合体によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と第１の遺伝子の隠れたエクソンとの融合体によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、第１の遺伝子と第２の遺伝子の融合体によりコードされ、このペプチドは、融合の結果として生じるアウトオブフレーム配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、少なくとも２つのまたは２つより多くのペプチドを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、少なくとも２つの明確に異なるペプチドを含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含有する。一部の実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。少なくとも２つの明確に異なるペプチドは、長さ、アミノ酸配列または両方が異なり得る。ペプチドは、腫瘍特異的突然変異を含有することが分かっているまたは判明した任意のタンパク質に由来し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タンパク質の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、突然変異を含み、第２のネオエピトープは、同じ突然変異を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１の領域は、第２の領域の少なくとも１個のアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープは、第２の突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異と第２の突然変異は同じである。一部の実施形態では、突然変異は、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ペプチドは、置換突然変異、例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｑ６１ＨもしくはＱ６１Ｌ突然変異、またはＮＲＡＳ Ｑ６１ＫもしくはＱ６１Ｒ突然変異、またはＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ突然変異、またはＥＧＦＲ Ｓ４９２ＲもしくはＥＧＦＲ Ｔ４９０Ｍ突然変異を有するタンパク質に由来し得る。置換は、ペプチドの長さに沿ってどこに位置してもよい。例えば、置換は、ペプチドのＮ末端３分の１に位置することもあり、ペプチドの中央３分の１に位置することもあり、またはペプチドのＣ末端３分の１に位置することもある。別の実施形態では、置換残基は、Ｎ末端から２～５残基離れて位置することもあり、またはＣ末端から２～５残基離れて位置することもある。ペプチドは、同様に、腫瘍特異的挿入突然変異に由来することもあり、この場合、ペプチドは、１つもしくは複数のまたは全ての挿入残基を含む。
一部の実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも１つの付加的突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第１のネオエピトープの突然変異でない。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第１のネオエピトープの突然変異である。一部の実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１つの付加的突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第２のネオエピトープの突然変異でない。一部の実施形態では、少なくとも１つの付加的突然変異のうちの１つまたは複数は、第２のネオエピトープの突然変異である。
一部の態様では、本開示は、第１のペプチドと第２のペプチドとを含む単一のポリペプチドを含む組成物、または第１のペプチドと第２のペプチドとをコードする単一のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１つまたは複数の追加のペプチドを含み、１つまたは複数の追加のペプチドは、第３のネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、同じ転写開始部位から転写された配列によりコードされる。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第１の転写開始部位から転写された配列によりコードされ、第２のペプチドは、第２の転写開始部位から転写された配列によりコードされる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する第１の配列と、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する第２の配列とを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する少なくとも８または９個の連続するアミノ酸の第１の配列と、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する少なくとも１６または１７個の連続するアミノ酸の第２の配列とを含む。
一部の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドより長い。一部の実施形態では、第１のペプチドは、第２のペプチドより長い。一部の実施形態では、第１のペプチドは、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第２のペプチドは、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、または１０，０００アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、第２のペプチドは、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する少なくとも１７個の連続するアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、第１のペプチド、第２のペプチドまたは両方は、少なくとも１つの隣接配列を含み、少なくとも１つの隣接配列は、ネオエピトープの上流または下流にある。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、非野生型配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｎ末端隣接配列である。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接配列は、Ｃ末端隣接配列である。一部の実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つの隣接配列は、第２のペプチドの少なくとも１つの隣接配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つの隣接領域は、第２のペプチドの少なくとも１つの隣接領域とは異なる。一部の実施形態では、少なくとも１つの隣接残基は、突然変異を含む。
一部の実施形態では、隣接配列を有するネオ抗原性ペプチドは、式（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎ－（ＸａａＢＴＫ）Ｐ－（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃ（式中、（ＸａａＢＴＫ）Ｐは、突然変異型ＢＴＫタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む突然変異型ＢＴＫペプチド配列であり；Ｐは、７より大きい整数であり；Ｎは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎは、突然変異型タンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；Ｃは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、突然変異型ＢＴＫタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；およびＮとＣの両方が０ではない）により表され得るポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、隣接配列を有するネオ抗原性ペプチドは、式（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎ－（ＸａａＥＧＦＲ）Ｐ－（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃ（式中、（ＸａａＥＧＦＲ）Ｐは、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列であり；Ｐは、７より大きい整数であり；Ｎは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｎ末端Ｘａａ）Ｎは、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；Ｃは、（ｉ）０であるか、または（ｉｉ）２より大きい整数であり；（Ｘａａ－Ｃ末端）Ｃは、突然変異型ＥＧＦＲタンパク質とは異種の任意のアミノ酸配列であり；およびＮとＣの両方が０ではない）により表され得るポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来するネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているネオ抗原性ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているネオ抗原性ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているネオエピトープＢＴＫ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と少なくとも１個の太字のアミノ酸とを含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄ、３２または３Ａ～３Ｄに示されているネオ抗原性ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているネオエピトープＥＧＦＲ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの突然変異型アミノ酸（例えば、表４０Ａ～４０Ｄのいずれか１つにおける下線付きアミノ酸）を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲペプチドは、表４０Ｄに示されているような太字で示されている少なくとも１個の突然変異型アミノ酸を含むネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（例えば、表４０Ｃ中の下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの非突然変異型アミノ酸とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表１または２に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ＢＴＫペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表３４または３６に示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
Ｃ４８１Ｓ突然変異に対応する例示的ネオ抗原性ペプチドは、表３４で提示される。この表は、ＨＬＡアレルのリストも提供し、これらのＨＬＡアレルのコードされたタンパク質産物は、ペプチドに結合することができる。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ突然変異を含むペプチドは、
である。一部の実施形態では、ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＡＮＧＳＬＬＮＹのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＡＮＧＳＬＬＮＹＬのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＥＹＭＡＮＧＳＬのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＧＳＬＬＮＹＬＲのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＧＳＬＬＮＹＬＲＥＭのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＩＴＥＹＭＡＮＧＳのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＩＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬのネオエピトープ配列を含む。ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬ。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＭＡＮＧＳＬＬＮＹＬＲのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＮＧＳＬＬＮＹＬのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＮＧＳＬＬＮＹＬのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＳＬＬＮＹＬＲＥＭＲのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬ；ＴＥＹＭＡＮＧＳＬＬＮＹのネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ突然変異を含むペプチドは、ＹＭＡＮＧＳＬＬのネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄに示されているような少なくとも１個の突然変異型アミノ酸（下線付きアミノ酸）と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の上流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列と、この少なくとも１個の突然変異型アミノ酸の下流に、対応する野生型配列に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む配列とを含むタンパク質に由来する、ネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む突然変異型ＥＧＦＲペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ突然変異を含むペプチドは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲネオペプチドは、表４０Ａ～４０Ｄから選択される。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩにおけるＧの欠失（内部欠失）などの、ＥＧＦＲの欠失突然変異を含むペプチド、
は、
のネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、配列：
で示される突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、配列：
で示される突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、配列：
で示される突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、配列：
で示される突然変異を含むペプチドは、のネオエピトープ配列を含む。
ペプチド修飾
一部の実施形態では、本開示は、修飾ペプチドを含む。修飾は、抗原性ペプチド自体の一次アミノ酸配列を変更しない共有結合性化学的修飾を含み得る。修飾は、所望の特性、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長、安定性の増大、クリアランスの低減、免疫原性もしくはアレルギー誘発性の変更、特定の抗体の産生の可能化、細胞標的化、抗原取込み、抗原プロセシング、ＨＬＡ親和性、ＨＬＡ安定性または抗原提示、を有するペプチドを生じさせることができる。一部の実施形態では、ペプチドは、例えば免疫応答を生じさせるために、ＡＰＣによるエピトープのプロセシングおよび提示を増強する１つまたは複数の配列を含み得る。
一部の実施形態では、ペプチドを、所望の特質が得られるように修飾することができる。例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、ヘルパーＴ細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。一部の実施形態では、免疫原性ペプチド／ヘルパーＴコンジュゲートをスペーサー分子により連結させることができる。一部の実施形態では、スペーサーは、生理条件下で実質的に非荷電である比較的小さい中性分子、例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物を含む。スペーサーは、例えば、Ａｌａスペーサー、Ｇｌｙスペーサー、または非極性もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択することができる。必要に応じて存在するスペーサーが、同じ残基から構成される必要がなく、したがって、ヘテロオリゴマーであってもまたはホモオリゴマーであってもよいことは、理解されるであろう。ネオ抗原性ペプチドをペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかで直接またはスペーサーを介してヘルパーＴペプチドに連結させることができる。ネオ抗原性ペプチドまたはヘルパーＴペプチドどちらかのアミノ末端をアシル化することができる。ヘルパーＴペプチドの例としては、破傷風トキソイド残基８３０～８４３、インフルエンザ残基３０７～３１９、ならびにマラリアスポロゾイト周囲残基３８２～３９８および残基３７８～３８９が挙げられる。
本開示のペプチド配列を、ＤＮＡレベルでの変化によって、詳細には、ペプチドをコードするＤＮＡの予め選択された塩基を、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように突然変異させることにより、必要に応じて変更することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、結果として得られるペプチドの物理的特性（例えば、安定性または溶解度）を修飾するような置換を含有することができる。例えば、ペプチドをα－アミノ酪酸（「Ｂ」）でのシステイン（Ｃ）の置換により修飾することができる。その化学的性質のため、システインには、ジスルフィド結合を形成し、ペプチドを、構造的に結合能を低下させるのに十分に変更する傾向がある。α－アミノ酪酸でのＣの置換は、この問題を緩和するばかりでなく、ある特定の事例では結合および架橋結合能を実際に向上させもする。α－アミノ酪酸でのシステインの置換は、ネオ抗原性ペプチドの任意の残基で、例えば、ペプチド内のエピトープもしくはアナログのアンカーもしくは非アンカー位置のどちらかで、またはペプチドの他の位置で行うことができる。
化合物のアミノ酸配列を、例えばアミノ酸の付加または欠失により、伸長または減少させることによって、ペプチドを修飾することもできる。ある特定の残基の順序または組成を変更することにより、ペプチドまたはアナログを修飾することもできる。生物活性に不可欠なある特定のアミノ酸残基、例えば、必要不可欠な接触部位におけるものまたは保存残基は、一般に、変更すると生物活性に対して有害効果を伴う可能性があることが当業者に理解されるであろう。必要不可欠でないアミノ鎖は、Ｌ－α－アミノ酸などのタンパク質中に天然に存在するものに必ずしも限定されず、Ｄ－異性体、β－γ－δ－アミノ酸などの非天然アミノ酸も、Ｌ－α－アミノ酸の多くの誘導体も含み得る。
一部の実施形態では、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用してペプチドを修飾して、ＨＬＡ結合に対する帯電、疎水性などの効果を判定することができる。例えば、一連の正荷電（例えば、ＬｙｓもしくはＡｒｇ）または負荷電（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換を、様々なＨＬＡ分子およびＴ細胞受容体に対して異なる感受性パターンを示すペプチドの長さに沿って行うことができる。加えて、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏまたは類似の残基などの、小さい、相対的に中性の分子を使用する複数の置換を利用することができる。置換物は、ホモオリゴマーであってもまたはヘテロオリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数およびタイプは、不可欠な接触点間に必要な間隔、および求められるある特定の機能的特質（例えば、疎水性対親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較して、ＨＬＡ分子またはＴ細胞受容体に対する結合親和性の増大も、そのような置換によって達成することができる。いずれにせよ、そのような置換は、例えば、結合を妨げる可能性がある立体および電荷障害を回避するように選択された、アミノ酸残基または他の分子断片を利用するべきである。アミノ酸置換は、通常は、単一残基の置換である。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組合せを組み合わせて最終ペプチドに到達することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、アミノ酸模倣物または非天然アミノ酸残基、例えば、Ｄ－またはＬ－ナフチルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ－またはＬ－フェニルグリシン；Ｄ－またはＬ－２－チエンイルアラニン；Ｄ－またはＬ－１、－２、３－、または４－ピレンイルアラニン；Ｄ－またはＬ－３チエンイルアラニン；Ｄ－またはＬ－（２－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（３－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（２－ピラジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（４－イソプロピル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロ－メチル）－フェニルアラニン；Ｄ－ρ－フルオロフェニルアラニン；Ｄ－またはＬ－ρ－ビフェニル－フェニルアラニン；Ｄ－またはＬ－ρ－メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ－またはＬ－２－インドール（アリル）アラニン；およびＤ－またはＬ－アルキルアラニン（この場合のアルキル基は、置換もしくは非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－イソチル（ｓｅｃ－ｉｓｏｔｙｌ）、イソペンチル、または非酸性アミノ酸残基であり得る）を含み得る。非天然アミノ酸の芳香族環は、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香族環を含む。様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸残基を有する修飾ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性増大を有し得る。そのようなペプチドは、改善された有効期間または製造特性も有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドを、末端ＮＨ２アシル化により、例えば、アルカノイル（Ｃ１～Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアラニンなどにより、修飾することができる。一部の実施形態では、これらの修飾は、支持体または他の分子への連結のための部位を提供することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、修飾、例えば、これらに限定されないが、グリコシル化、側鎖酸化、ビオチン化、リン酸化、表面活性物質、例えば脂質、の付加を含むことができ、または本明細書に記載のペプチドを化学的に修飾すること、例えばアセチル化など、ができる。さらに、ペプチド中の結合は、ペプチド結合以外、例えば、共有結合、エステルまたはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合などであってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、当技術分野において周知のものなどの担体、例えば、サイログロブリン、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸残基、例えばポリＬ－リシンおよびポリＬ－グルタミン酸、インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含むことができる。
通常はタンパク質の一部でない追加の化学的部分を含有するようにペプチドをさらに修飾することができる。これらの誘導体化部分は、溶解度、生物学的半減期、タンパク質の吸収、または結合親和性を改善することができる。これらの部分は、ペプチドの任意の望ましい副作用などを低減または消失させることもできる。これらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （２０００）において見つけることができる。例えば、所望の活性を有するネオ抗原性ペプチドを、所望のＨＬＡ分子に結合するおよび適切なＴ細胞を活性化する未修飾ペプチドの生物活性の実質的に全てを増大させるまたは少なくとも保持する上に、ある特定の所望の特質、例えば、改善された薬理学的特性を提供するように、必要に応じて修飾することができる。例えば、ペプチドは、保存的置換または非保存的置換どちらかの置換などの様々な変化の対象になり得、そのような変化は、それらを使用する上でのある特定の利点、例えば、改善されたＨＬＡ結合をもたらす可能性がある。そのような保存的置換は、アミノ酸残基を、生物学的におよび／または化学的に類似している別のアミノ酸残基で置き換えること、例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、またはある極性残基を別の極性残基に置き換えることを包含し得る。単一アミノ酸置換の効果を、Ｄ－アミノ酸を使用して探索することもできる。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７ （１９８６）， Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ． （Ｎ．Ｙ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １－２８４ （１９７９）；およびＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩＩ．， Ｐｉｅｒｃｅ）， ２ｄ Ｅｄ． （１９８４）に記載されているような、周知のペプチド合成手順を使用して行うことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドを、大きい、緩徐に代謝される巨大分子、例えばタンパク質；多糖類、例えば、セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ；高分子アミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリシン；アミノ酸コポリマー；不活化ウイルス粒子；不活化細菌毒素、例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子からの毒素；不活化細菌；および樹状細胞に、コンジュゲートさせることができる。
担体タンパク質へのコンジュゲーション、リガンドへのコンジュゲーション、抗体へのコンジュゲーション、ＰＥＧ化、ポリシアル化、ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ模倣物、Ｆｃ融合、アルブミン融合、ナノ粒子結合、ナノ粒子封入、コレステロール融合、鉄融合、アシル化、アミド化、グリコシル化、側鎖酸化、リン酸化、ビオチン化、表面活性物質の付加、アミノ酸模倣物の付加、または非天然アミノ酸の付加を、これらに限定されないが含み得る、ペプチドに対する変化。
グリコシル化は、タンパク質の物理的特性に影響を与えることができ、タンパク質安定性、分泌、および細胞内局在の点でも重要であり得る。適切なグリコシル化は、生物活性にとって重要であり得る。実際、真核生物からの一部の遺伝子は、タンパク質をグリコシル化するための細胞内プロセスを欠いている細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現されたとき、それらのグリコシル化欠如のため活性がほとんどまたは全くないタンパク質を生じさせ、これらのタンパク質が回収される。グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することにより果たすことができる。ペプチドまたはタンパク質に対する変更は、例えば、１もしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基（Ｏ連結型グリコシル化部位について）もしくはアスパラギン残基（Ｎ連結型グリコシル化部位について）の付加によって、またはこれらの残基による置換によって、行うことができる。Ｎ連結型もしくはＯ連結型オリゴ糖の構造および各タイプに見られる糖残基の構造は、異なり得る。両方に見られることが多い糖の１つのタイプは、Ｎ－アセチルノイラミン酸（本明細書では以降、シアル酸と呼ぶ）である。シアル酸は、通常、Ｎ連結型およびＯ連結型オリゴ糖両方の末端残基であり、その負電荷のため、糖タンパク質に酸性の特性を付与することができる。本開示の実施形態は、Ｎ－グリコシル化バリアントの生成および使用を含む。炭水化物の除去は、化学的にもしくは酵素的に果たすこともでき、またはグリコシル化されているアミノ酸残基をコードするコドンの置換により果たすこともできる。化学的脱グリコシル化技術は、公知であり、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
コンジュゲーションのための追加の好適な成分および分子としては、例えば、リンパ系に標的化するための分子、サイログロブリン；アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリアミノ酸、例えば、ポリ（Ｄ－リシン：Ｄ－グルタミン酸）；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルス赤血球凝集素、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ならびにＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原；または前述のものの任意の組合せが挙げられる。
別のタイプの修飾は、ポリペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端での、１つまたは複数の追加の成分または分子、例えば、別のタンパク質（例えば、対象タンパク質とは異種のアミノ酸配列を有するタンパク質）、または担体分子の、コンジュゲート（例えば、連結）である。したがって、例示的なポリペプチド配列は、別の成分または分子とのコンジュゲートとして提供され得る。一部の実施形態では、本開示のペプチドまたはタンパク質へのアルブミンの融合は、例えば、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはその断片が、１つまたは複数のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに接合されるように遺伝子操作することによって、達成することができる。その後、融合ポリペプチドを発現するように、例えば好適なプラスミドの形態の、融合ヌクレオチド配列で、好適な宿主を形質転換すること、またはそのような融合ヌクレオチド配列を宿主にトランスフェクトすることができる。発現を、例えば原核もしくは真核細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで果たすことができ、または例えばトランスジェニック生物から、ｉｎ ｖｉｖｏで果たすことができる。本開示の一部の実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞系、例えばＣＨＯ細胞系で行われる。さらに、アルブミン自体を、その循環半減期を延長するように修飾することができる。１つまたは複数のポリペプチドへの修飾アルブミンの融合は、上記の遺伝子操作技術により、または化学的コンジュゲーションにより成し遂げることができ、結果として得られる融合分子は、非修飾アルブミンとの融合体の半減期を超える半減期を有する（例えば、ＷＯ２０１１／０５１４８９を参照されたい）。コンジュゲートした脂肪酸鎖（アシル化）によるアルブミン結合を含む、いくつかのアルブミン結合戦略が、直接融合の代替法として開発されている。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるので、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドを低分子タンパク質治療薬の半減期延長に使用されている。
コンジュゲーションのための追加の候補成分および分子は、単離または精製に好適なものを含む。非限定的な例としては、結合分子、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体を構成する分子が挙げられ、固体支持体は、例えば、プラスチックまたはポリスチレンビーズ、プレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験紙、および膜を含む。コンジュゲートをそれらの様々な分子量に有効に分離するカチオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法を使用して、電荷の差によりコンジュゲートを分離することができる。カチオン交換クロマトグラフィーにより得られた画分の内容を、従来の方法、例えば、質量分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、または分子量により分子実体を分離するための他の公知の方法を使用して、分子量により同定することができる。
一部の実施形態では、本開示のペプチドまたはタンパク質配列のアミノまたはカルボキシル末端を免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合させて、融合コンジュゲート（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合コンジュゲートは、バイオ医薬品の全身半減期を増加させることが示されており、したがって、バイオ医薬製品は、あまり頻繁な投与を必要としない可能性がある。Ｆｃは、血管の内側を覆っている内皮細胞中の新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合すると、Ｆｃ融合分子は、分解から保護され循環へ再放出され、その結果、分子はより長く循環中に保持される。このＦｃ結合は、内在性ＩｇＧがその長い血漿半減期を保持する機序であると考えられる。ごく最近のＦｃ融合技術は、抗体のＦｃ領域にバイオ医薬品の単一のコピーを連結させて、旧来のＦｃ融合コンジュゲートと比較してバイオ医薬品の薬物動態特性および薬力学的特性を最適化する。
本開示は、１つまたは複数の特性を改善するための、ペプチドの現在公知のまたは将来開発される他の修飾の使用を企図している。本開示のペプチドの循環半減期を延長する、安定性を増大させる、クリアランスを低減させる、または免疫原性もしくはアレルギー誘発性を変更するための１つのそのような方法は、分子の特性を修飾するために他の分子に連結されたヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用する、ＨＥＳ化によるペプチド配列の修飾を含む。ＨＥＳ化の様々な態様は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１３４１９７号および同第２００６／０２５８６０７号に記載されている。
ペプチド安定性を多数の方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼならびに様々な生体媒質、例えばヒト血漿および血清が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ １１：２９１ （１９８６）を参照されたい。本明細書に記載のペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して便利には決定される。このプロトコールは、次の通りである：プールされたヒト血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を使用前に遠心分離により粉砕する。次いで、血清をＲＰＭＩ－１６４０または別の好適な組織培養培地で２５％に希釈する。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を除去し、６％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液またはエタノールのどちらかに添加する。この濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、回転させて、沈殿した血清タンパク質をペレット化する。次いで、安定性に特化したクロマトグラフィー条件を使用して逆相ＨＰＬＣによりペプチドの存在を判定する。
短い血漿半減期またはプロテアーゼ分解に対する脆弱性に関連する問題は、ペプチドまたはタンパク質配列を様々な非タンパク質性ポリマーのいずれか、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンにコンジュゲートまたは連結させること（例えば、タンパク質と非タンパク質性ポリマー、例えばＰＥＧ、の両方に共有結合している連結部分を通常は介して）を含む、様々な修飾により、克服することができる。そのようなＰＥＧコンジュゲート型生体分子は、より良好な物理的および熱安定性、酵素分解に対する脆弱性からの保護、溶解度向上、より長いｉｎ
ｖｉｖｏ循環半減期およびクリアランス減少、免疫原性および抗原性低下、ならびに毒性低下を含む、臨床的に有用な特性を有することが示されている。
ポリペプチドまたはタンパク質配列へのコンジュゲーションに好適なＰＥＧは、一般に、室温で水溶性であり、一般式Ｒ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－Ｒ（式中、Ｒは、水素であるか、またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは、１～１０００の整数である）を有する。Ｒが保護器である場合、それは、一般に、１～８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされるＰＥＧは、直鎖状であってもまたは分岐していてもよい。分岐型ＰＥＧ誘導体、「星型ＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧが本開示により企図される。本開示は、ＰＥＧが異なるｎ値を有し、したがって、様々な異なるＰＥＧが特定の比率で存在する、コンジュゲートの組成物も企図している。例えば、一部の組成物は、ｎ＝１、２、３および４であるコンジュゲートの混合物を含む。一部の組成物は、ｎ＝１であるコンジュゲートのパーセンテージが、１８～２５％であり、ｎ＝２であるコンジュゲートのパーセンテージが、５０～６６％であり、ｎ＝３であるコンジュゲートのパーセンテージが、１２～１６％であり、ｎ＝４であるコンジュゲートのパーセンテージが、５％以下である。そのような組成物を、当技術分野において公知の反応条件および精製方法により生成することができる。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを使用してコンジュゲートを分離することができ、次いで、例えば、所望の数のＰＥＧが結合しているコンジュゲートを含有する画分であって、精製され、未修飾タンパク質配列がなく、かつ他の数のＰＥＧが結合しているコンジュゲートがない、画分が、同定される。
ＰＥＧを本開示のペプチドまたはタンパク質に末端反応基（「スペーサー」）を介して結合させることができる。スペーサーは、例えば、ポリペプチド配列の１つまたは複数についての遊離アミノまたはカルボキシル基とＰＥＧとの結合を媒介する末端反応基である。遊離アミノ基に結合され得る、スペーサーを有するＰＥＧは、Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミドでＰＥＧのコハク酸エステルを活性化することにより調製され得る、Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミドＰＥＧを含む。遊離アミノ基に結合され得る別の活性化ＰＥＧは、ＰＥＧモノメチルエーテルをシアヌル酸クロリドと反応させることにより調製され得る、２，４－ビス（Ｏ－メトキシポリエチレングリコール）－６－クロロ－ｓ－トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合される活性化ＰＥＧは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
スペーサーを有するＰＥＧへの本開示のペプチドまたはタンパク質配列のうちの１つまたは複数のコンジュゲーションは、様々な従来の方法により行うことができる。例えば、コンジュゲーション反応は、４：１～３０：１の試薬のペプチド／タンパク質に対するモル比を利用して、溶液中で、５～１０のｐＨで、４℃～室温の温度で、３０分～２０時間、行うことができる。反応条件は、所望の置換度を主として生じさせるように反応を方向付けるように選択することができる。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を減少させる傾向があり、これに対して、高温、中～高ｐＨ（例えば、ｐＨ＞７）、およびより長い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当技術分野において公知の様々な手段を使用して反応を終結させることができる。一部の実施形態では、反応混合物を酸性化し、例えば－２０℃で、凍結させることにより、反応が終結される。
本開示は、ＰＥＧ模倣物の使用も企図している。ＰＥＧの特質（例えば、血清半減期の向上）を保持し、その上、いくつかの追加の有利な特性を付与する、組換えＰＥＧ模倣物が、開発されている。例として、ＰＥＧに類似した伸長立体構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含む）であって、目的のペプチドまたはタンパク質薬に組換えにより既に融合されているポリペプチド鎖を生成することができる（例えば、ＡｍｕｎｉｘのＸＴＥＮ技術；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。これは、製造プロセス中の追加のコンジュゲーションステップの必要性をなくす。さらに、確立された分子生物学技術によってポリペプチド鎖の側鎖組成を制御することができ、その結果、免疫原性および製造特性の最適化が可能になる。
ネオエピトープ
ネオエピトープは、免疫系により認識される、ネオ抗原性ペプチドまたはネオ抗原性ポリペプチドのネオ抗原決定部分を含む。ネオエピトープは、非罹患細胞、例えば、非がん性細胞または生殖系列細胞などの、参照には存在しないが、罹患細胞、例えばがん細胞には見られる、エピトープを指す。これは、対応するエピトープが正常な非罹患細胞または生殖系列細胞に見られるが、罹患細胞、例えばがん細胞、における１つまたは複数の突然変異に起因して、そのエピトープの配列が変化してネオエピトープを生じさせる結果となる状況を含む。用語「ネオエピトープ」は、通常は隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合により、互いに接続されている一連の残基、通常はＬ－アミノ酸、を示すために、本明細書では「腫瘍特異的ネオエピトープ」と同義的に使用される。ネオエピトープは、様々な長さで、それらの中性（非荷電）形態または塩である形態のどちらかであり得、グリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化などの修飾がないこともあり、またはこれらの修飾を、修飾が本明細書で記載されるようなポリペプチドの生物活性を破壊しないことを条件として、含有することもある。本開示は、表１または２からの腫瘍特異的突然変異を含む単離されたネオエピトープを提供する。本開示は、表３４からの腫瘍特異的突然変異を含む例示的な単離されたネオエピトープも提供した。本開示は、表４０Ａ～４０Ｄおよび表３Ａ～３Ｄからの腫瘍特異的突然変異を含む例示的な単離されたネオエピトープも提供する。
一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩについて本明細書に記載されるネオエピトープは、長さが１３残基またはそれ未満であり、通常は、約８～約１２の間の残基、特に、９または１０残基からなる。一部の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩについて本明細書に記載されるネオエピトープは、長さが２５残基またはそれ未満であり、通常は、約１６～約２５の間の残基からなる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タンパク質の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、突然変異を含み、第２のネオエピトープは、同じ突然変異を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１の領域は、第２の領域の少なくとも１個のアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープは、第２の突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異と第２の突然変異は同じである。一部の実施形態では、突然変異は、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードアウト突然変異、遺伝子融合突然変異およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ
ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ネオ抗原性Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫペプチドを含む組成物は、第１のＢＴＫネオエピトープおよび第２のＢＴＫネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第１のＢＴＫネオエピトープは、表３４から選択されるネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第２のＢＴＫネオエピトープは、表３４から選択されるネオエピトープを含む。
一部の実施形態では、表３４から選択される第１の突然変異型ＢＴＫペプチド配列は、それぞれのペプチドに対応する（右側に対する左側の列）、表３４に収載されているＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する、または結合すると予測される。
一部の実施形態では、ネオ抗原性ＥＧＦＲペプチドを含む組成物は、第１のＥＧＦＲネオエピトープおよび第２のＥＧＦＲネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第１のＥＧＦＲネオエピトープは、表４０Ａ～４０Ｄから選択されるネオエピトープを含む。一部の実施形態では、第２のＥＧＦＲネオエピトープは、表４０Ａ～４０Ｄから選択されるネオエピトープを含む。
一部の実施形態では、第１の突然変異型ＥＧＦＲネオエピトープは、ＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＬＴＳＴＶＱＬＩＭ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭおよびＶＱＬＩＭＱＬＭからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＬＩＭＱＬＭＰＦ、ＬＴＳＴＶＱＬＩＭ、ＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＳＴＶＱＬＩＭＱＬ、ＴＶＱＬＩＭＱＬＭおよびＶＱＬＩＭＱＬＭからなる群から選択される第１の突然変異型ＥＧＦＲペプチド配列は、ＨＬＡ－Ａ６８：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ２５：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ５７：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２アレル、およびＨＬＡ－Ａ２６：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３、ＨＬＡ－Ｂ５２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ３０：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３アレル、ＨＬＡ－Ａ１１：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ３２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ０２：０４アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９アレル、ＨＬＡ－Ｃ１７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０４アレル、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ０１：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ４２：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ３６：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ３８：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０３アレル、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ０２：０３アレル、ＨＬＡ－Ｂ５８：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ０８：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０：０１アレル、および／またはＨＬＡ－Ｂ３５：０３アレルによりコードされるタンパク質に結合する、または結合すると予測される。
表４１は、ＥＧＦＲネオ抗原性ペプチドに結合することができるまたは結合すると予測されるＨＬＡタンパク質をコードする例示的なＨＬＡアレルについてのリストを提供する。
表４２Ａｉ、４２Ａｉｉおよび４２Ｂは、ＥＧＦＲネオエピトープを予測されるＨＬＡサブタイプ特異性とともに示す。
表５Ａｉ、５Ａｉｉおよび５Ｂは、ＥＧＦＲネオエピトープを予測されるＨＬＡサブタイプ特異性とともに示す。
表４２Ａｉ
表４２Ａｉｉ
表４２Ｂ
一部の実施形態では、第１のネオエピトープと第２のネオエピトープは、異なるエピトープである。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、第１のネオエピトープより長い。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、少なくとも８アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、８～１２アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、少なくとも８個の連続するアミノ酸の配列を含み、８個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも１個は、野生型配列の対応する位置におけるものと異なる。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、少なくとも８個の連続するアミノ酸の配列を含み、８個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置におけるものと異なる。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、少なくとも１６アミノ酸の長を有する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、１６～２５アミノ酸の長を有する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、少なくとも１６個の連続するアミノ酸の配列を含み、１６個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも１個は、野生型配列の対応する位置におけるものと異なる。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、少なくとも１６個の連続するアミノ酸の配列を含み、１６個の連続するアミノ酸のうちの少なくとも２個は、野生型配列の対応する位置におけるものと異なる。
一部の実施形態では、ネオエピトープは、少なくとも１個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、第１のネオエピトープ、第２のネオエピトープまたは両方は、少なくとも１個のアンカー残基を含む。一実施形態では、第１のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、標準アンカー位置または非標準アンカー位置にある。別の実施形態では、第２のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、標準アンカー位置または非標準アンカー位置にある。さらに別の実施形態では、第１のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基は、第２のネオエピトープの少なくとも１個のアンカー残基とは異なる。
一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、野生型残基である。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、置換物である。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、突然変異を含まない。
一部の実施形態では、第１もしくは第２のネオエピトープまたは両方は、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域を含む。一部の実施形態では、ネオエピトープは、少なくとも１個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のアンカー残基は、少なくとも２個のアンカー残基を含む。一部の実施形態では、少なくとも２個のアンカー残基は、少なくとも１個のアミノ酸を含む分離領域により分離されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域は、分離領域内にない。一部の実施形態では、少なくとも１つのアンカー残基隣接領域は、（ａ）少なくとも２個のアンカー残基のうちのＮ末端アンカー残基の上流、（ｂ）少なくとも２個のアンカー残基のうちのＣ末端アンカー残基の下流、または（ａ）と（ｂ）の両方にある。一部の実施形態では、第２のネオペプチドは、表３４から選択される。
一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、突然変異Ｔ７９０Ｍを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオペプチドは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
のネオエピトープ配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む第２のネオエピトープは、
の配列を含む。
一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ突然変異を含む第２のネオエピトープ。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｓ４９２Ｒ突然変異を含むペプチドは、
のネオエピトープ配列を含む。
一部の実施形態では、ネオエピトープ配列が、
である、ＥＧＦＲｖＩＩＩにおけるＧの欠失（内部欠失）などの、ＥＧＦＲの欠失突然変異を含む、第２のＥＧＦＲネオエピトープ。
一部の実施形態では、ネオエピトープ配列が、
である、配列：
で示される突然変異を含む第２のネオエピトープ。一部の実施形態では、第２のネオエピトープ配列は、
である。一部の実施形態では、第２のネオエピトープ配列は、
である。一部の実施形態では、第２のネオエピトープ配列は、
である。
一部の実施形態では、第２のネオペプチドは、表３５または表３Ａ～表３Ｄから選択される。
一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ）に結合する。一部の実施形態では、ネオエピトープは、対応する野生型ペプチドより大きい親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ネオエピトープは、５，０００ｎＭ未満、１，０００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、またはそれ未満のＩＣ５０を有する。
一部の実施形態では、ネオエピトープは、約１ｐＭ～約１ｍＭ、約１００ｐＭ～約５００μＭ、約５００ｐＭ～約１０μＭ、約１ｎＭ～約１μＭ、または約１０ｎＭ～約１μＭの間のＨＬＡ結合親和性を有することがある。一部の実施形態では、ネオエピトープは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００もしくは１，０００ｎＭまたはそれより大きいＨＬＡ結合親和性を有することもある。一部の実施形態では、ネオエピトープは、最大でも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００または１，０００ｎＭのＨＬＡ結合親和性のみを有することもある。
一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、対応する野生型ネオエピトープより大きい親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩタンパク質に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、２，０００ｎＭ、１，５００ｎＭ、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０でＨＬＡクラスＩＩタンパク質に結合する。
ある態様では、第１および／または第２のネオエピトープは、対象により発現されるＨＬＡアレルによりコードされるタンパク質に結合する。別の態様では、突然変異は、対象の非がん細胞には存在しない。さらに別の実施形態では、第１および／または第２のネオエピトープは、対象のがん細胞の遺伝子または発現される遺伝子によりコードされる。
一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、表１または２の第２列に示されているような突然変異を含む。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、表１または２の第２列に示されているような突然変異を含む。一部の実施形態では、ある特定の抗原性ペプチドは、特定のアレルと対になっている。
置換は、ネオエピトープの長さに沿ってどこに位置してもよい。例えば、置換は、ペプチドのＮ末端３分の１に位置することもあり、ペプチドの中央３分の１に位置することもあり、またはペプチドのＣ末端３分の１に位置することもある。別の実施形態では、置換残基は、Ｎ末端から２～５残基離れて位置することもあり、またはＣ末端から２～５残基離れて位置することもある。ペプチドは、同様に、腫瘍特異的挿入突然変異に由来することもあり、この場合、ペプチドは、挿入残基の１つもしくは複数または全てを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、細菌性または動物性夾雑物質がない試薬を利用して容易に化学合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ＲＢ： Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｉ． Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４， １９６３）。一部の実施形態では、ペプチドは、（１）均一な合成および切断条件を使用するマルチチャネル機器での並列固相合成；（２）ＲＰ－ＨＰＬＣカラムでのカラムストリッピングによる精製；およびペプチド間で再洗浄、但し交換なし；続いて（３）最も情報価値の高いアッセイの限られたセットによる分析により、調製される。適正製造基準（ＧＭＰ）のフットプリントを、個々の患者のペプチドのセットについて定義することができ、したがって、スイート切り替え手順が必要となるのは、異なる患者のペプチド合成間のみである。
ポリヌクレオチド
あるいは、本開示のペプチドをコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を使用して、ネオ抗原性ペプチドをインビトロで産生することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖および／もしくは二本鎖、またはネイティブもしくは安定化形態のいずれかのポリヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）骨格を有するポリヌクレオチドなど、あるいはこれらの組み合わせであり得、ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードする限り、イントロンを含んでもまたは含まなくてもよい。一部の実施形態では、ペプチドを産生するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳が使用される。
本開示に記載のネオ抗原性ペプチドの各々をコードするネオ抗原性ポリヌクレオチドが、本明細書で提供される。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、または「核酸」は、本開示では、「突然変異型ポリヌクレオチド」、「突然変異型ヌクレオチド」、「突然変異型核酸」、「ネオ抗原性ポリヌクレオチド」、「ネオ抗原性ヌクレオチド」または「ネオ抗原性突然変異型核酸」と同義的に使用される。様々な核酸配列は、遺伝コードの冗長性のため同じペプチドをコードすることがある。これらの核酸の各々が、本開示の範囲に含まれる。ペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであっても、またはＤＮＡとＲＮＡの組合せであってもよい。一部の実施形態では、ペプチドをコードする核酸配列は、自己複製ｍＲＮＡである（Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０１５； ８９：１７９－２３３）。本明細書に記載のペプチドをコードする任意の好適なポリヌクレオチドが、本開示の範囲に含まれる。
用語「ＲＮＡ」は、「ｍＲＮＡ」を含み、一部の実施形態では、「ｍＲＮＡ」に関する。用語「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することにより生成され、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、「転写物」に関する。通常は、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびｉｎ ｖｉｔｒｏで限られた半減期のみを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、自己増幅ｍＲＮＡである。本開示に関して、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写方法論は、当業者に公知である。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットがある。
ＲＮＡの安定性および転写効率を必要に応じて修飾することができる。例えば、ＲＮＡの安定化効果を有するおよび／または翻訳効率を上昇させる１つまたは複数の修飾により、ＲＮＡを安定化することおよびその翻訳を増加させることができる。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本開示に従って使用されるＲＮＡの発現を増加させるために、そのＲＮＡをコード領域内で、すなわち、発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列を、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変更することなく、修飾して、ＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡ安定性を増大させること、およびコドン最適化を行い、かくて細胞内での翻訳を増強させることができる。
本開示で使用されるＲＮＡの文脈での用語「修飾」は、ＲＮＡの、当該ＲＮＡに天然に存在しない、あらゆる修飾を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、キャッピングされていない５’－三リン酸を有さない。そのようなキャッピングされていない５’－三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することにより達成することができる。他の実施形態では、ＲＮＡは、その安定性を増大させるためにおよび／または細胞傷害性を低下させるために修飾リボヌクレオチドを有し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ中の、例えばシチジンを、５－メチルシチジンで部分的にまたは完全に置換することができる。あるいは、例えばウリジンが、シュードウリジンで部分的にまたは完全に置換される。
一部の実施形態では、用語「修飾」は、ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップアナログを設けることに関する。用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造を指し、一般に、異常な５’－５’三リン酸連結によってｍＲＮＡに接続されているグアノシンヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、このグアノシンは、７位がメチル化されている。用語「従来の５’キャップ」は、７－メチルグアノシンキャップ（ｍ Ｇ）に対して、天然に存在するＲＮＡ ５’キャップを指す。本開示に関して、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ている５’キャップアナログであって、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／または細胞内で、ＲＮＡに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力および／またはＲＮＡの翻訳を増強させる能力を有するように修飾されている、５’キャップアナログを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のネオ抗原性ペプチドをコードするｍＲＮＡは、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、本開示は、修飾ヌクレオシドを含むＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子治療ベクター、それらを含む遺伝子治療方法および遺伝子転写サイレンシング方法を提供する。一部の実施形態では、投与されることになるｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０３：３１８５ （１９８１）のホスホトリエステル法により、合成することができる。アナログを含むまたはアナログからなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ネイティブエピトープをコードするものを適切な所望される核酸塩基で単に置換することにより、作製することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンを転写領域に含み得る。ｍＲＮＡ安定化配列、および哺乳動物細胞における複製のための配列を含めることも、ポリヌクレオチド発現を増加させるために検討され得る。加えて、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）を含み得る。これらの配列をベクター内のポリヌクレオチドコード配列の外側に含めて、免疫原性を増強することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内の、例えば、宿主細胞からのペプチドまたはタンパク質の発現および／または分泌を助けるポリヌクレオチドに融合した、ペプチドまたはタンパク質のコード配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、成熟形態のポリペプチドを形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内の、例えば、コードされたペプチドの精製を可能にするマーカー配列に融合した、ペプチドまたはタンパク質のコード配列を含むことができ、次いでそれを個別化疾患ワクチンまたは免疫原性組成物に組み込むことができる。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合はマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を行うためにｐＱＥ－９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであることもあり、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）が使用される場合にはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来する赤血球凝集素（ＨＡ）タグであることもある。さらなるタグとしては、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ
３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｓｐｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアープロテイン（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のネオ抗原性ペプチドを産生することができる単一のコンカテマー化ネオ抗原性ペプチド構築物を作出するために、同じリーディングフレーム内に融合した１つまたは複数の本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質のコード配列を含むこともある。
一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、組換え技術を使用して、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することにより構築される。必要に応じて、部位特異的突然変異誘発により配列の突然変異を誘発して、その機能的アナログを得ることができる。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５６６２－５０６６ （１９８４）および米国特許第４，５８８，５８５号を参照されたい。別の実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学合成により構築されることになる。所望のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、および目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利であるコドンを選択して、そのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。標準的な方法を応用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全アミノ酸配列を使用して、逆翻訳遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、そしてその後、ライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、相補的会合のために５’または３’オーバーハングを通常は含有する。
会合すると（例えば、合成、部位指定突然変異誘発、または別の方法によって）、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に必要に応じて作動的に連結される。適切な会合は、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および好適な宿主における生物活性ポリペプチドの発現により、確認することができる。当技術分野において周知であるように、宿主におけるトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子を、選択された発現宿主において機能する転写および翻訳発現制御配列に作動的に連結させることができる。
したがって、本開示はまた、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドおよびネオエピトープの産生および投与に有用なベクターおよび発現ベクターに、ならびにそのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
ベクター
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質を発現することができる発現ベクターも調製することができる。種々の細胞型のための発現ベクターが当技術分野において周知であり、過度の実験なしにそれらを選択することができる。一般に、ＤＮＡは、プラスミドなどの発現ベクターに、発現のための適切な配向でおよび正しいリーディングフレーム内に挿入される。必要に応じて、所望の宿主（例えば、細菌）により認識される適切な転写および翻訳調節対照ヌクレオチド配列にＤＮＡを連結させることができるが、そのような対照は、一般に、発現ベクターで入手可能である。次いで、ベクターは、標準的技術を使用してクローニングのために宿主細菌に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドの産生および投与に好適な多数のベクターおよび宿主系が当業者に公知であり、市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。真核生物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐ７５．６（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）；ｐＣＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＣＥＩ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターを、それが宿主において複製可能かつ実行可能であるのであれば、使用することができる。
本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドの発現のために、コード配列は、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供するために開始および停止コドンと、プロモーターおよび終結領域と、一部の実施形態では、加えて複製系とを作動可能に連結した状態で、提供されることになる。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入に便利な制限部位を含有するプラスミド内に備えられる。結果として得られる発現ベクターが好適な細菌宿主に形質転換で導入される。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含むことになる。そのようなプロモーターは、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥプロモーター）または単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ ＴＫプロモーター）などの、ウイルス源に由来することもある。ＳＶ４０スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来する核酸配列を使用して、必要非転写遺伝子エレメントを得ることができる。
組換え発現ベクターを使用して、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを増幅することおよび発現させることができる。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する好適な転写または翻訳調節エレメントに作動的に連結されたペプチドまたは生物学的同等アナログをコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する、複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は、本明細書で詳細に記載されるような、（１）遺伝子発現において調節的役割を果たす遺伝子エレメント（単数または複数）、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造配列またはコード配列と、（３）適切な転写および翻訳開始および終結配列との会合体を一般に含む。そのような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含み得る。複製起点と形質転換体の認識を助長するための選択遺伝子とによって通常は付与される、宿主における複製能力を、さらに組み込むことができる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、作動的に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体としてそれが発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動的に連結されており、プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動的に連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように配置されている場合、コード配列に作動的に連結されている。一般に、作動的に連結した／された／されているは、連続していることを意味し、分泌リーダーの場合は、連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。酵母発現系における使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、それは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。その後、この残基を発現された組換えタンパク質から必要に応じて切断して最終産物を得ることができる。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子と、下流の構造配列の転写を指令するための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターとを含むことになる。そのようなプロモーターは、数ある中でも特に３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの、糖分解酵素をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、ならびに一部の実施形態では、細胞膜周辺腔または細胞外培地への翻訳タンパク質の分泌を指令することができるリーダー配列と、適切な期に会合される。必要に応じて、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の単純化をもたらす、Ｎ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ユビキチン化シグナル配列、および／または標的化配列、例えば、結果して生じるペプチドの小胞体への移動を助長するための小胞体（ＥＲ）シグナル配列も、含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドを、ウイルスまたは細菌ベクターによって投与することおよび／または発現させることができる。発現ベクターの例としては、ワクシニアまたは鶏痘などの、弱毒化ウイルス宿主が挙げられる。この手法の例として、ワクシニアウイルスは、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして使用される。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０ （１９９１）によって記載されている。
本明細書に記載のネオ抗原性ポリペプチドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍベクター、無毒化炭疽毒素ベクター、センダイウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、カナリア痘ベクター、ならびに鶏痘ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかになる。一部の実施形態では、ベクターは、改変ワクシニア・アンカラ（ＶＡ）（例えば、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｉｄｉｃ（ＭＶＡ－ＢＮ））である。
本開示の実施の際に使用することができるベクターの中で、レトロウイルス遺伝子移入法を用いて細胞の宿主ゲノムへの組込みが可能であり、これは、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じさせる結果となることが多い。一部の実施形態では、レトロウイルスは、レンチウイルスである。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込み、標的タンパク質の潜在的標的集団を拡大することによって、変更することができる。ある特定の細胞型のみがレンチウイルスに感染するような、挿入された導入遺伝子の条件的発現を可能にするように、レトロウイルスを操作することもできる。細胞型特異的プロモーターを使用して、特異的細胞型における発現を標的化することができる。レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである（およびしたがって、レンチウイルスベクターとレトロウイルスベクターの両方を本開示の実施の際に使用することができる）。さらに、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入することまたは非分裂細胞を感染させることができ、通常は、高いウイルス力価を生じさせることができる。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能があるシス作用性の長い末端反復配列から構成される。最小シス作用性ＬＴＲは、所望の核酸を標的細胞に組み込んで永続的発現をもたらすために後に使用されるベクターの複製およびパッケージングに十分なものである。本開示の実施の際に使用することができる、広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ
ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１－２７３９；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５－１６４０；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８－５９；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
最小非霊長類レンチウイルスベクター、例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくレンチウイルスベクターも、本開示の実施の際に有用である。これらのベクターは、標的遺伝子の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し得る。したがって、本開示は、本開示の実施の際に有用なベクターの中でも、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターを企図している。
アデノウイルスベクターも、本開示の実施の際に有用である。１つの利点は、移入された核酸の高度な発現をもたらす様々な哺乳動物細胞および組織に組換え遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで効率的に移入し、そこで発現させる組換えアデノウイルスの能力である。さらに、静止細胞を生産的に感染させる能力は、組換えアデノウイルスベクターの有用性を拡大する。加えて、高い発現レベルは、免疫応答を生じさせるのに十分なレベルに核酸の産物が発現されることになることを保証する（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，８４８号を参照されたい）。
本開示の実施の際に有用なアデノウイルスベクターについては、米国特許第６，９５５，８０８号に言及される。使用されるアデノウイルスベクターは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６およびＣ７ベクターからなる群から選択することができる。アデノウイルス５（「Ａｄ５」）ゲノムの配列は、公開されている。（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ， Ｊ．，
Ｂｉｅｂｅｒ， Ｆ．， ａｎｄ Ｊａｃｒｏｔ， Ｂ． （１９９２） Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ
Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６， ２８０－２８５；この内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｄ３５ベクターは、米国特許第６，９７４，６９５号、同第６，９１３，９２２号および同第６，８６９，７９４号に記載されている。Ａｄ１１ベクターは、米国特許第６，９１３，９２２号に記載されている。Ｃ６アデノウイルスベクターは、米国特許第６，７８０，４０７号、同第６，５３７，５９４号、同第６，３０９，６４７号、同第６，２６５，１８９号、同第６，１５６，５６７号、同第６，０９０，３９３号、同第５，９４２，２３５号および同第５，８３３，９７５号に記載されている。Ｃ７ベクターは、米国特許第６，２７７，５５８号に記載されている。Ｅ１欠損もしくは欠失型、Ｅ３欠損もしくは欠失型、および／またはＥ４欠損もしくは欠失型であるアデノウイルスベクターも、使用することができる。Ｅ１領域に突然変異を有する、ある特定のアデノウイルスは、Ｅ１欠損アデノウイルス突然変異体が非許容細胞では複製することができないかまたは少なくとも高度に弱毒化されているので、改善された安全マージンを有する。Ｅ３領域の突然変異を有するアデノウイルスは、アデノウイルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方調節する機序を破壊することにより増強された免疫原性を有し得る。Ｅ４突然変異を有するアデノウイルスは、後期遺伝子発現の抑制のため、低下したアデノウイルスベクター免疫原性を有し得る。そのようなベクターは、同ベクターを利用する反復再ワクチン接種が所望される場合に特に有用であり得る。Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４；Ｅ１とＥ３；およびＥ１とＥ４が欠失または突然変異しているアデノウイルスベクターを本開示に従って使用することができる。
さらに、全てのウイルス遺伝子が欠失している「ガットレス」アデノウイルスベクターも、本開示に従って使用することができる。そのようなベクターは、それらの複製のためにヘルパーウイルスを必要とし、自然環境には存在しない条件である、Ｅ１ａとＣｒｅの両方を発現する特殊なヒト２９３細胞系を必要とする。そのような「ガットレス」ベクターは、非免疫原性であり、したがって、これらのベクターを再ワクチン接種のために複数回接種することができる。「ガットレス」アデノウイルスベクターを、異種インサート／遺伝子、例えば、本開示の導入遺伝子の挿入に使用することができ、多数の異種インサート／遺伝子の同時送達にも使用することができる。
一部の実施形態では、送達は、単回追加免疫用量であることもある、アデノウイルスによる送達である。一部の実施形態では、アデノウイルスは、複数用量によって送達される。ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関して、ＡＡＶは、毒性が低いこと、およびそれが宿主ゲノムに組み込まれないので挿入突然変異を引き起こす確率が低いことから、他のウイルスベクターより有利である。ＡＡＶは、４．５または４．７５Ｋｂのパッケージング限界を有する。４．５または４．７５Ｋｂより大きい構築物は、ウイルス産生を有意に低減させる結果となる。核酸分子発現を駆動するために使用することができる多くのプロモーターがある。ＡＡＶ ＩＴＲは、プロモーターとしての機能を果たすことができ、追加のプロモーターエレメントの必要をなくすのに有利である。
普遍的発現には、以下のプロモーターを使用することができる：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖など。脳での発現には、以下のプロモーターを使用することができる：全てのニューロンのためにシナプシンＩ、興奮性ニューロンのためにＣａＭＫ ＩＩアルファ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのためにＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなど。ＲＮＡ合成を駆動するために使用されるプロモーターとしては、Ｕ６またはＨ１などの、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを挙げることができる。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターおよびイントロンカセットの使用は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するために使用され得る。本開示の実施の際に有用なＡＡＶベクターに関しては、米国特許第５６５８７８５号、同第７１１５３９１号、同第７１７２８９３号、同第６９５３６９０号、同第６９３６４６６号、同第６９２４１２８号、同第６８９３８６５号、同第６７９３９２６号、同第６５３７５４０号、同第６４７５７６９号および同第６２５８５９５号、ならびにこれらに引用されている文献に言及される。ＡＡＶについては、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはこれらの任意の組合せであり得る。標的とされ得る細胞に関してＡＡＶを選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的化するためにＡＡＶ血清型１、２、５もしくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはこれらの任意の組合せを選択することができ、心組織を標的化するためにＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。一部の実施形態では、送達は、ＡＡＶによる送達である。投薬量を、あらゆる副作用に対する治療利益のバランスを取るように調整することができる。
一部の実施形態では、ポックスウイルスは、本明細書に記載の組成物に使用される。これらには、オルソポックスウイルス、トリポックス、ワクシニア、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ、鶏痘、ＴＲＯＶＡＣなどが含まれる（例えば、Ｖｅｒａｒｄｉｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｖａｃｃｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：９６１－７０；およびＭｏｓｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ． ２０１３； ３１（３９）： ４２２０－４２２２を参照されたい）。ポックスウイルス発現ベクターは、１９８２年に記載され、あっという間に、ワクチン開発はもちろん非常に多くの分野での研究にも広く使用されるようになった。このベクターの利点としては、単純な構築、大量の外来ＤＮＡに適応する能力、および高い発現レベルが挙げられる。本開示の実施の際に使用することができるポックスウイルス、例えば、なかんずく、Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅサブファミリーのポックスウイルス（脊椎動物のポックスウイルス）、例えば、オルソポックスウイルスおよびトリポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（例えば、Ｗｙｅｔｈ株、ＷＲ株（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－１３５４）、コペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、ＭＶＡ、ＭＶＡ－ＢＮ）、カナリア痘ウイルス（例えば、Ｗｈｅａｔｌｅｙ Ｃ９３株、ＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウイルス（例えば、ＦＰ９株、Ｗｅｂｓｔｅｒ株、ＴＲＯＶＡＣ）、ハト痘（ｄｏｖｅｐｏｘ）、ハト痘（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘ）、ウズラ痘、およびアライグマポックス、とりわけ、これらの合成組換え体または天然に存在しない組換え体、それらの使用、ならびにそのような組換え体を作製および使用するための方法に関する情報は、科学文献および特許文献において見つけることができる。
一部の実施形態では、ワクシニアウイルスは、抗原を発現させるために疾患ワクチンまたは免疫原性組成物において使用される。（Ｒｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｏｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：５１７－５２４， １９９７）。組換えワクシニアウイルスは、感染した宿主細胞の細胞質内で複製することができ、したがって、目的のポリペプチドが、免疫応答を誘導することができる。さらに、ポックスウイルスは、免疫細胞、特に、抗原提示細胞を直接感染させることによって、コードされている抗原を、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ経路によるプロセシングの標的にするそれらの能力のため、しかしまた自己アジュバントに対するそれらの能力に起因して、ワクチンまたは免疫原性組成物ベクターとして広く使用されている。
一部の実施形態では、ＡＬＶＡＣは、疾患ワクチンまたは免疫原性組成物においてベクターとして使用されている。ＡＬＶＡＣは、外来導入遺伝子を発現するように改変することができるカナリア痘ウイルスであり、原核生物抗原と真核生物抗原の両方に対するワクチン接種のための方法として使用されている（Ｈｏｒｉｇ Ｈ， Ｌｅｅ ＤＳ， Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ
ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ （ＡＬＶＡＣ）
ｖａｃｃｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂ７．１ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０００；４９：５０４－１４；ｖｏｎ Ｍｅｈｒｅｎ Ｍ， Ａｒｌｅｎ Ｐ， Ｔｓａｎｇ
ＫＹ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｌｏｔ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｄｕａｌ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｖｉｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｔｈ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ） ａｎｄ Ｂ７．１ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＣＥＡ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ． ２０００； ６：２２１９－２８；Ｍｕｓｅｙ Ｌ， Ｄｉｎｇ
Ｙ， Ｅｌｉｚａｇａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＨＩＶ－１ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｂｏｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ＨＩＶ－１－ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３；１７１：１０９４－１０１；Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｅ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ Ｓ Ａ １９９６；９３：１１３４９－５３；米国特許第７，２５５，８６２号）。第Ｉ相臨床試験で、腫瘍抗原ＣＥＡを発現するＡＬＶＡＣウイルスは、選択された患者において卓越した安全性プロファイルを示し、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答の増加をもたらしたが、客観的臨床応答は観察されなかった（Ｍａｒｓｈａｌｌ ＪＬ， Ｈａｗｋｉｎｓ
ＭＪ， Ｔｓａｎｇ ＫＹ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ａｖｉｐｏｘ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９；１７：３３２－７）。
一部の実施形態では、改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを抗原ワクチンまたは免疫原性組成物のためのウイルスベクターとして使用することができる。ＭＶＡは、オルソポックスウイルス科のメンバーであり、ワクシニアウイルスのアンカラ株のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＶＡ）での約５７０回の連続継代によって生成された（例えば、Ｍａｙｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３， ６－１４， １９７５を参照されたい）。これらの継代の結果として、得られるＭＶＡウイルスは、ＣＶＡと比較して３１キロ塩基少ないゲノム情報を含有し、高度に宿主細胞拘束性である（Ｍｅｙｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， １０３１－１０３８， １９９１）。ＭＶＡは、その極度の弱毒化、すなわち、毒性または感染能力の低下を特徴とするが、卓越した免疫原性をなお保持する。様々な動物モデルで試験されたとき、ＭＶＡは、免疫抑制個体においても無毒であることが証明された。さらに、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）－ＨＥＲ２は、ＨＥＲ－２陽性乳がんの処置のために設計された候補免疫療法であり、現在、臨床試験中である。（Ｍａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｊａｎ ２０１２； ６１（１）： １９－２９）。組換えＭＶＡを作製および使用する方法は、記載されている（例えば、これによりその全体が組み込まれる米国特許第８，３０９，０９８号および同第５，１８５，１４６号を参照されたい）。
ポリペプチドの発現のための好適な宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞を含む。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは桿菌を含む。高等真核細胞は、哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。無細胞翻訳系を利用することもできるだろう。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、当技術分野において周知である（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８５を参照されたい）。
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために有利に利用される。哺乳動物細胞において組換えタンパク質の発現を行うことができる。なぜなら、そのようなタンパク質が、一般に、正しくフォールディングされ、適切に修飾され、完全に機能性であるからである。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）により記載されたサル腎臓細胞のＣＯＳ－７系、ならびに例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を含む、適切なベクターを発現することができる他の細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現されることになる遺伝子に連結されている好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’隣接非転写配列、ならびに５’または３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、および転写終結配列を含むことができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７ （１９８８）により概説されている。
宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る、ベクターで遺伝子操作される（形質導入または形質転換またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはポリヌクレオチドの増幅のために必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に関して以前に使用されたものであり、当業者には明らかであるだろう。
適切な宿主の代表例として、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の中の様々な種；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエおよびＳｆ９、；動物細胞、例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）により記載された、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７細胞系、ならびに適合性ベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系またはＢｏｗｅｓ黒色腫、植物細胞などを挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から当業者の範囲内であると思われる。
好適なベクターおよび制御配列を利用して、酵母、昆虫または哺乳動物細胞宿主を使用することもできる。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）により記載された、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７系、ならびに適合性ベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドを、ヒト細胞（例えば、樹状細胞を含む、免疫細胞）に投与することおよび発現させることができる。ヒトコドン使用頻度表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導くことができる。そのようなポリヌクレオチドは、上記のものなどの、エピトープおよび／もしくはアナログ間にスペーサーアミノ酸残基を含み、またはエピトープおよび／もしくはアナログ（ならびに／またはＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋）、Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋）およびＢ細胞エピトープ）に隣接する天然に存在する隣接配列を含むことができる。
当業者に周知の標準的調節配列を、ヒト標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含めることができる。いくつかのベクターエレメントが望ましい：ポリヌクレオチド、例えばミニ遺伝子挿入、のための下流クローニング部位を伴うプロモーター；効率的転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；Ｅ．ｃｏｌｉ選択可能マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。非常に多くのプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを、このために使用することができる。例えば、他の好適なプロモーター配列については米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照されたい。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ－ＩＥプロモーターである。
真核生物宿主、特に、哺乳動物またはヒトに有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからのプラスミド、より広い宿主範囲プラスミド、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
ベクターをいくつかの異なる方法により動物組織に導入することができる。２つの最も評判のよい手法は、標準的な皮下針を使用する、食塩水中のＤＮＡの注射、および遺伝子銃送達である。ＤＮＡワクチンプラスミドの構築およびこれら２つの方法による宿主へのその後のその送達についての概要の要旨は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ （Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２８１ （１）： ３４－４１）で説明されている。食塩水での注射は、通常は、骨格筋内への筋肉内注射で（ＩＭ）、または皮内注射で（ＩＤ）行われ、ＤＮＡが細胞外空間に送達される。これを、電気穿孔により、ブピバカインなどの筋毒素で筋肉繊維を一時的に損傷させることにより、または食塩水もしくはスクロースの高張性溶液を使用することにより、支援することができる（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）．
Ａｄｖ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４２： ３４３－４１０）。この送達方法に対する免疫応答は、針の種類、針の配列、注射速度、注射体積、筋肉の種類、注射される動物の年齢、性別および生理的状態を含む多くの要因による影響を受け得る（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）．
Ａｄｖ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４２： ３４３－４１０）。
他の一般に使用されている送達方法である遺伝子銃送達は、促進剤として圧縮ヘリウムを使用して、標的細胞への金またはタングステン微粒子に吸着されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を弾道的に加速させる（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）． Ａｄｖ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
４２： ３４３－４１０；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） ５４： １２９－８８）。
代替送達方法としては、鼻または肺粘膜などの粘膜表面に対するネイキッドＤＮＡのエアロゾル滴下（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） ５４： １２９－８８）および眼および膣粘膜へのｐＤＮＡの局所投与（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） ５４： １２９－８８）を挙げることができる。粘膜表面送達はまた、カチオン性リポソーム－ＤＮＡ調製物、生体内分解性マイクロスフェア、腸管粘膜への経口投与のための弱毒化ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａベクター、および組換えアデノウイルスベクターを使用して達成されている。細胞膜を軽度に機械的に破壊して細胞を一時的に透過性にした後、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達することもできる。膜のそのような軽度の機械的破壊は、小さい開口部を通して細胞を穏やかに押し出すことによって果たすことができる（Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ， ＰＬＯＳ ＯＮＥ （２０１５））。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系が挙げられ、脂質に基づく系は、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。「リポソーム」は、密閉脂質二重層または凝集体の生成により形成される様々な単一および多層脂質ビヒクルを包含する一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを伴う小胞構造を有することを特徴とし得る。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、自己再構成を経た後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を封入する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５： ５０５－１０ （１９９１））。しかし、正常な小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることもあり、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもある。リポフェクタミン－核酸複合体も考えられる。
宿主細胞への核酸の（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの）導入のために脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は、脂質を伴うこともある。脂質を伴う核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていることもあり、リポソームの脂質二重層内に散在していることもあり、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に付随する連結分子を介してリポソームに結合していることもあり、リポソームに封入されていることもあり、リポソームと複合体化していることもあり、脂質を含有する溶液に分散さていることもあり、脂質と混合されていることもあり、脂質と化合していることもあり、脂質中に懸濁液として含有されることもあり、ミセルとともに含有されるもしくはミセルと複合体化していることもあり、または脂質を別様に伴うこともある。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中でいずれの特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造内に、ミセルとして、または「つぶれた」構造で存在することがある。それらは、溶液中に単に散在していることもあり、したがって、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、天然に存在する脂質であることもまたは合成脂質であることもある、脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質中に天然に存在する脂肪液滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどの、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から入手することができるだろう。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の保存液を、約－２０℃で保管することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するので、単なる溶媒として使用される。
一部の実施形態では、ベクターは、第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとをコードする、ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。少なくとも２つの明確に異なるペプチドは、長さ、アミノ酸配列または両方が異なり得る。ペプチドは、腫瘍特異的突然変異を含有することが分かっているまたは判明した任意のタンパク質に由来する。一部の実施形態では、ベクターは、タンパク質の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、突然変異を含み、第２のネオエピトープは、同じ突然変異を含む。一部の実施形態では、ベクターは、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドと、同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドとを含み、第１の領域は、第２の領域の少なくとも１個のアミノ酸を含み、第１のペプチドは、第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは、第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープは、第２の突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異と第２の突然変異は同じである。一部の実施形態では、突然変異は、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはこれらの偽型に由来する。一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアである。
Ｔ細胞受容体
一態様では、本開示は、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を活性化するネオ抗原認識受容体を発現する細胞、および免疫応答の増強を必要とする疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を提供する。そのような細胞としては、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドの１つを結合する抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋））細胞、ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋））細胞）が挙げられる。したがって、抗原特異的免疫応答の増加が望まれる新生物および他の病理の処置のための使用方法。Ｔ細胞活性化は、抗原を標的とするＴＣＲまたはＣＡＲにより媒介される。
本開示は、免疫応答性細胞（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）を活性化する抗原認識受容体とキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）との組合せを発現する細胞、および免疫応答の増強を必要とする疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞、または他の免疫応答性細胞は、新生物の処置または予防のための１つまたは複数の共刺激リガンドの選択的富化のための運搬体として使用される。そのような細胞は、特定のがんの処置または予防のために、それを必要とするヒト対象に投与される。
一部の実施形態では、本開示の方法において使用することができる腫瘍抗原特異的ヒトリンパ球としては、限定ではないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：３５－４５）、ａおよびｐヘテロダイマーを含む全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１２６－１２９）、腫瘍生検の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物（Ｐａｎｅｌｌｉ， Ｍ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４９５－５０４； Ｐａｎｅｌｌｉ， Ｍ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４３８２－４３９２）、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を用いて選択的にｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大増殖された抗原特異的末梢血白血球（Ｄｕｐｏｎｔ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ６５：５４１７－５４２７； Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ， Ｇ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２：２４９８－２５０５）が挙げられる。Ｔ細胞は、自己由来、同種異系、または操作された前駆もしくは幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで導出してもよい。
一部の実施形態では、免疫療法薬は、操作された受容体である。一部の実施形態では、操作された受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）、またはそれらの誘導体である。他の態様では、操作された受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の態様では、ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲである。他の態様では、ＣＡＲは、第２世代ＣＡＲである。さらに他の態様では、ＣＡＲは、第３世代ＣＡＲである。一部の態様では、ＣＡＲは、細胞外部分、膜貫通部分、および細胞内部分を含む。一部の態様では、細胞内部分は、少なくとも１つのＴ細胞共刺激ドメインを含む。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＴＮＦＲＳ９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＩＴＧＢ２（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＫＬＲＣ２（ＮＫＧ２Ｃ）、ＴＮＦＲＳ１８（ＧＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ）、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の態様では、操作された受容体は、標的を結合する。一部の態様では、結合は、疾患または状態に罹患している１つまたは複数の対象に特異的なペプチドに対して特異的である。
一部の態様では、免疫療法薬は、本明細書に詳細に記載されているような細胞である。一部の態様では、免疫療法薬は、本明細書に記載のペプチドまたはネオエピトープを特異的に結合する受容体を含む細胞である。一部の態様では、免疫療法薬は、本開示のペプチド／核酸と組み合わせて使用される細胞である。一部の実施形態では、細胞は、患者細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍浸潤性リンパ球である。
一部の態様では、状態または疾患を有する対象は、対象のＴ細胞受容体レパートリーに基づいて処置される。一部の実施形態では、ペプチドまたはネオエピトープは、対象のＴ細胞受容体レパートリーに基づいて選択される。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載のようなペプチドまたはネオエピトープに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞で処置される。一部の実施形態では、対象は、ＴＣＲ、例えば対象特異的ＴＣＲに特異的なペプチドまたはネオエピトープで処置される。一部の実施形態では、対象は、ＴＣＲ、例えば対象特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞に特異的なペプチドまたはネオエピトープで処置される。一部の実施形態では、対象は、対象特異的ＴＣＲに特異的なペプチドまたはネオエピトープで処置される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のような組成物は、１つまたは複数の対象で同定されたＴＣＲに基づいて選択される。一部の実施形態では、Ｔ細胞レパートリーの同定および機能アッセイでの試験を使用して、状態または疾患を有する１つまたは複数の対象に投与されることになる組成物を決定する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のような１つまたは複数のペプチドまたはタンパク質を含む抗原ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、対象特異的なネオ抗原性ペプチドを含む。一部の実施形態では、ワクチンに含まれることになるペプチドは、ネオエピトープに結合する対象特異的ＴＣＲの定量化に基づいて選択される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＴＣＲに対するペプチドの結合親和性に基づいて選択される。一部の実施形態では、選択は、量および結合親和性の両方の組合せに基づく。例えば、機能アッセイではネオエピトープに強力に結合するが、ＴＣＲレパートリーではあまり目立たないＴＣＲが、抗原ワクチンの良好な候補であり得、それは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が有利に増幅され得るからである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の対象に投与するためのペプチドまたはタンパク質は、ＴＣＲに対する結合に基づいて選択される。一部の実施形態では、疾患または状態を有する対象に由来するＴ細胞などのＴ細胞を拡大増殖することができる。ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープに特異的なＴＣＲを発現する拡大増殖されたＴ細胞を、対象に投与して戻すことができる。一部の実施形態では、好適な細胞、例えばＰＢＭＣに、ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープに特異的なＴＣＲの発現のためのポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクトし、対象に投与する。ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を拡大増殖し、対象に投与して戻すことができる。一部の実施形態では、自己疾患組織と共にインキュベートすると細胞溶解活性をもたらす、ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を拡大増殖し、対象に投与することができる。一部の実施形態では、機能アッセイで使用し、ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープへの結合をもたらしたＴ細胞を拡大増殖し、対象に投与することができる。一部の実施形態では、対象特異的ネオ抗原性ペプチドまたはネオエピトープに結合することが決定されているＴＣＲをＴ細胞で発現させ、対象に投与することができる。
実施形態では、本開示は、第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含む組成物であって、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが突然変異を含み、第２のネオエピトープが同じ突然変異を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、第１のネオエピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む第１のＴ細胞、および第２のネオエピトープに特異的な第２のＴＣＲを含む第２のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。
別の実施形態では、本開示は、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含む組成物であって、第１の領域が第２の領域の少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープが第２の突然変異を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、第１のネオエピトープに特異的な第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む第１のＴ細胞、および第２のネオエピトープに特異的な第２のＴＣＲを含む第２のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異および第２の突然変異は同じである。
一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、クラスＩ ＨＬＡタンパク質に結合して、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体を形成する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第１のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、第２のネオエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ
ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲは、クラスＩ ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。
一部の実施形態では、第１のＴＣＲは、第１のネオエピトープに特異的な第１のキメラ抗原受容体であり、第２のＴＣＲは、第２のネオエピトープに特異的な第２のキメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、第１のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。一部の実施形態では、第１のＴ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。一部の実施形態では、第２のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０で、ＨＬＡ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０で、ＨＬＡクラスＩ－ペプチド複合体に結合する。一部の実施形態では、第１および／または第２のＴＣＲは、２，０００、１，５００、１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、または１０ｎＭ未満のＫＤまたはＩＣ５０で、ＨＬＡクラスＩＩ－ペプチド複合体に結合する。
抗原提示細胞
ネオ抗原性ペプチドまたはタンパク質は、本明細書に記載のようなペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドを含有する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）として提供することができる。他の実施形態では、そのような抗原提示細胞は、患者に使用するためのＴ細胞を刺激するために使用される。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数のネオ抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドでパルスまたは負荷された少なくとも１つの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含有する組成物である。一部の実施形態では、そのようなＡＰＣは、自己由来である（例えば、自己樹状細胞）。あるいは、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に、ネオ抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドをｅｘ ｖｉｖｏで負荷してもよい。関連する実施形態では、そのようなＡＰＣまたはＰＢＭＣは、注射して患者に戻される。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。関連する実施形態では、樹状細胞は、ネオ抗原性ペプチドまたは核酸でパルスされた自己樹状細胞である。ネオ抗原性ペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせる任意の好適なペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原に由来するペプチドでパルスされた自己樹状細胞を使用するＴ細胞療法は、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９， ３７１－３８０およびＴｊｕａ ｅｔ ａｌ．
（１９９７） Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３２， ２７２－２７８に開示されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８＋）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ（例えば、ＣＤ４＋））である。
一部の実施形態では、本開示は、対象に投与することもできる細胞に基づく免疫原性医薬組成物を含む組成物を提供する。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に基づく免疫原性医薬組成物は、当技術分野において適切であり理解されている周知の技法、担体、および賦形剤のいずれかを使用して製剤化することができる。ＡＰＣとしては、単球、単球由来細胞、マクロファージ、および樹状細胞が挙げられる。ある場合には、ＡＰＣに基づく免疫原性医薬組成物は、樹状細胞に基づく免疫原性医薬組成物であってもよい。
樹状細胞に基づく免疫原性医薬組成物は、当技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。一部の場合では、樹状細胞に基づく免疫原性医薬組成物は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法により調製することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ法は、患者への投与の前に本明細書に記載のポリペプチドを用いてｅｘ ｖｉｖｏでパルスしてＤＣを活性化または負荷した自己ＤＣの使用を含んでいてもよい。ｉｎ ｖｉｖｏ法は、本明細書に記載のポリペプチドとカップリングされている抗体を使用して、特異的ＤＣ受容体を標的とすることを含んでいてもよい。ＤＣに基づく免疫原性医薬組成物は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ－７～８、およびＣＤ４０アゴニストなどのＤＣ活性化因子をさらに含んでいてもよい。ＤＣに基づく免疫原性医薬組成物は、アジュバントおよび薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ヒトおよび非ヒト霊長類、他の哺乳動物、ならびに脊椎動物を含む、様々な供給源から調製することができる。ある特定の実施形態では、ＡＰＣは、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の血液から調製することができる。ＡＰＣは、白血球の富化集団から分離することもできる。白血球の集団は、当業者に公知の方法により調製することができる。そのような方法としては、典型的には、ヘパリン添加血液の収集、アフェレーシスまたは白血球フェレーシス、バフィーコートの調製、ロゼット形成、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、フィコール、コロイド状シリカ粒子、およびスクロースを使用して）、非白血球細胞の差次的溶解、および濾過が挙げられる。白血球集団は、対象から血液を収集し、除細動（ｄｅｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｎｇ）して血小板を除去し、赤血球細胞を溶解することによっても調製することができる。白血球集団は、必要に応じて、単球性樹状細胞前駆体を富化してもよい。
血液細胞集団は、白血球の富化集団の所望の使用に応じて、様々な対象から得ることができる。対象は、健康な対象であってもよい。あるいは、血液細胞は、例えば、がん患者または免疫刺激が有益となる他の患者など、免疫刺激を必要とする対象から得ることができる。同様に、血液細胞は、例えば、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、糖尿病、狼瘡、および多発性硬化症など）を有する患者など、免疫抑制を必要とする対象から得ることができる。白血球の集団は、ＨＬＡ一致の健康な個体から得ることもできる。
ＡＰＣの供給源として血液を使用する場合、血液白血球は、それらの生存能力を維持する従来法を使用して得ることができる。本開示の一態様によると、血液は、ヘパリンまたは他の適切な抗凝固剤を含有してもしなくてもよい媒体に希釈してもよい。血液の媒体に対する体積は約１対１であり得る。細胞は、媒体中の血液の４℃での約１，０００ｒｐｍ（１５０ｇ）での遠心分離により濃縮することができる。血小板および赤血球細胞は、赤血球を溶解する当技術分野で公知の任意の数の溶液、例えば塩化アンモニウムに細胞を再懸濁することにより枯渇させることができる。例えば、混合物は、体積で約１：１の媒体および塩化アンモニウムであってもよい。血小板および赤血球細胞を実質的に含まない白血球の集団が得られるまで、細胞を遠心分離により濃縮し、所望の溶液で洗浄することができる。組織培養において一般的に使用される任意の等張溶液を、血小板および赤血球細胞から血液白血球を分離するための媒体として使用することができる。そのような等張溶液の例は、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩類溶液、および完全増殖培地であってもよい。ＡＰＣおよび／またはＡＰＣ前駆細胞は、水簸により精製することもできる。
一実施形態では、ＡＰＣは、炎症または別様の活性化状態下では非ノミナルＡＰＣ（ｎｏｎ－ｎｏｍｉｎａｌ ＡＰＣ）であってもよい。例えば、非ノミナルＡＰＣとしては、インターフェロン－ガンマで刺激された上皮細胞、ＡＰＣ活性を誘導する因子または条件により活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および／または単球を挙げることができる。そのような非ノミナルＡＰＣは、当技術分野で公知の方法により調製することができる。
ＡＰＣは、ＡＰＣのタイプに応じて、所望の場合、培養、拡大増殖、分化、および／または成熟させてもよい。ＡＰＣは、例えば、培養プレート、フラスコ、培養バッグ、およびバイオリアクターなどの任意の適切な培養容器で培養することができる。
ある特定の実施形態では、調製物中のＡＰＣの数を維持および／または拡大増殖させるために、ＡＰＣを、好適な培養または増殖培地中で培養することができる。培養培地は、単離されたＡＰＣのタイプに応じて選択することができる。例えば、成熟樹状細胞などの成熟ＡＰＣを、それらの維持および拡大増殖に好適な増殖培地中で培養することができる。培養培地には、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および二価カチオンなどを補充することができる。加えて、サイトカイン、増殖因子、および／またはホルモンが、増殖培地に含まれていてもよい。例えば、成熟樹状細胞の維持および／または拡大増殖のために、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および／またはインターロイキン４（ＩＬ－４）などのサイトカインを添加することができる。他の実施形態では、未成熟ＡＰＣを、培養および／または拡大増殖してもよい。未成熟樹状細胞は、標的ｍＲＮＡを取り込み、新しい抗原をプロセシングする能力を保持することができる。一部の実施形態では、未成熟樹状細胞は、それらの維持および培養に好適な培地で培養することができる。培養培地には、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および二価カチオンなどを補充することができる。加えて、サイトカイン、増殖因子、および／またはホルモンが、増殖培地に含まれていてもよい。
他の未成熟ＡＰＣも同様に培養または拡大増殖させることができる。未成熟ＡＰＣの調製物を成熟させて成熟ＡＰＣを形成することができる。ＡＰＣの成熟は、ネオ抗原性ペプチドへの曝露中または曝露後に生じてもよい。ある特定の実施形態では、未成熟樹状細胞の調製物を成熟させてもよい。好適な成熟因子としては、例えば、サイトカインＴＮＦ－αおよび細菌産物（例えば、ＢＣＧ）などが挙げられる。別の態様では、単離されたＡＰＣ前駆体を使用して、未成熟ＡＰＣの調製物を調製することができる。ＡＰＣ前駆体を、培養、分化、および／または成熟させることができる。ある特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体を、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、および／または二価カチオンを補充した好適な培養培地の存在下で培養して、単球性樹状細胞前駆体の未成熟樹状細胞への分化を促進させることができる。一部の実施形態では、ＡＰＣ前駆体は、ＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、ドナー、例えばヒトドナーから得ることができ、新鮮なまま使用しても、または将来の使用のために凍結してもよい。一部の実施形態では、ＡＰＣは、１つまたは複数のＡＰＣ調製物から調製される。一部の実施形態では、ＡＰＣは、第１および第２のネオエピトープを含む第１および第２のネオ抗原性ペプチド、または第１および第２のネオエピトープを含む第１および第２のネオ抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドで負荷したＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、自己ＡＰＣ、同種異系ＡＰＣ、または人工ＡＰＣである。
実施形態では、本開示は、第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含むＡＰＣを含む組成物であって、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが突然変異を含み、第２のネオエピトープが同じ突然変異を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、第１および第２のペプチドは、同じタンパク質に由来する。別の実施形態では、本開示は、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含むＡＰＣを含む組成物であって、第１の領域が第２の領域の少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドが第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープが第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープが第２の突然変異を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、第１の突然変異および第２の突然変異は同じである。
アジュバント
アジュバントを使用して、本明細書で提供されるような組成物を受けている患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強することができる。ある場合には、アジュバントは、Ｔｈ１型応答を誘発することができる。他の場合では、アジュバントは、Ｔｈ２型応答を誘発することができる。Ｔｈ１型応答は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１０などのサイトカインの産生により特徴付けることができるＴｈ２型応答とは対照的に、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの産生により特徴付けることができる。
一部の態様では、ＭＰＬＡおよびＭＤＰなどの脂質に基づくアジュバントを、本明細書で開示される免疫原性医薬組成物と共に使用することができる。例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、特定のＴリンパ球に対するリポソーム抗原提示の増加を引き起こすアジュバントである。加えて、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）も、本明細書に記載の免疫原性医薬製剤と併せて好適なアジュバントとして使用することができる。
好適なアジュバントは当技術分野で公知であり（ＷＯ２０１５／０９５８１１を参照）、これらに限定されないが、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣＬＣ、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）．ベクター系、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、サポニン、マイコバクテリア抽出物、および合成細菌細胞壁模倣物に由来するＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州、米国）、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなど他の有標アジュバントが挙げられる。アジュバントとしては、不完全フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦも挙げられる。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）およびそれらの調製は、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８； １８６（１）：１８－２７； Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ； Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． １９９８； ９２：３－１１）（Ｍｏｓｃａ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７； １２：４０５０－４０６０）（Ｇａｍｖｒｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００４； ８２： ５０６－５１６）。サイトカインも使用することができる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織への樹状細胞遊走に影響を及ぼすこと（例えば、ＴＮＦ－アルファ）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速させること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＩＬ－１、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、およびＣＤ４０Ｌ）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，５８９号）、および免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）に直接的に関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６ （６）：４１４－４１８）。
また、アジュバントは、サイトカインなどの刺激性分子を含むことができる。サイトカインの非限定的な例としては：ＣＣＬ２０、ａ－インターフェロン（ＩＦＮ－ａ）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ（リンホトキシンアルファ（ＬＴα））、ＧＭ－ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－１－、ＩＬ－８、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８の突然変異型形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性型ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、およびＴＡＰ２が挙げられる。
追加のアジュバントとしては：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＰ－ｌｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の突然変異型形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性型ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能性断片が挙げられる。
一部の態様では、アジュバントは、トール様受容体のモジュレーターであってもよい。トール様受容体のモジュレーターの例としては、ＴＬＲ－９アゴニストが挙げられ、イミキモドなどのトール様受容体の小分子モジュレーターに限定されない。本明細書に記載の免疫原性医薬組成物と組み合わせて使用されるアジュバントの他の例としては、これらに限定されないが、サポニンおよびＣｐＧ ＯＤＮなどを挙げることができる。ある場合には、アジュバントは、細菌トキソイド、ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンブロックポリマー、アルミニウム塩、リポソーム、ＣｐＧポリマー、水中油型エマルジョン、またはそれらの組合せから選択される。ある場合には、アジュバントは、水中油型エマルジョンである。水中油型エマルジョンは、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含んでいてもよく、油および界面活性剤は、生分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、直径が５μｍ未満であってもよく、サブミクロンの直径を有する場合さえあり、これらの小さなサイズは、安定エマルジョンを提供するためにマイクロフルイダイザーを用いて達成される。サイズが２２０ｎｍ未満の液滴は、フィルター滅菌に供することができる。
処置方法および医薬組成物
本明細書に記載のネオ抗原治療薬（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有するＡＰＣまたは樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体など）は、これらに限定されないが、がんの処置など、治療的処置方法を含む様々な応用に有用である。一部の実施形態では、治療的処置方法は、免疫療法を含む。ある特定の実施形態では、ネオ抗原性ペプチドは、免疫応答を活性化、促進、増加、および／もしくは増強する、既存の免疫応答を新しい標的に方向付け直す、腫瘍の免疫原性を増加させる、腫瘍成長を阻害する、腫瘍体積を低減させる、腫瘍細胞アポトーシスを増加させる、ならびに／または腫瘍の腫瘍形成性を低減させるために有用である。使用方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドまたはタンパク質を使用して対象の免疫応答を活性化するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドを使用して対象の免疫応答を促進するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドを使用して対象の免疫応答を増加させるための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ネオ抗原性ペプチドを使用して免疫応答を増強するための方法を提供する。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、細胞媒介性免疫を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性または体液性免疫を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＴＬまたはＴｈ活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させることおよびＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＴＬ活性を増加させることおよびＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の抑制活性を阻害または減少させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原刺激の結果である。一部の実施形態では、抗原刺激は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、抗原刺激は、がんである。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドを使用して、免疫応答を活性化、促進、増加、および／または増強する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、ネオ抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを腫瘍細胞へと送達する治療有効量のネオ抗原性ペプチドを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、腫瘍細胞により内部移行される治療有効量のネオ抗原性ペプチドを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、腫瘍細胞により内部移行される治療有効量のネオ抗原性ペプチドを投与するステップを含み、ネオ抗原性ペプチドは細胞によりプロセシングされる。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、腫瘍細胞により内部移行される治療有効量のネオ抗原性ポリペプチドを投与するステップを含み、ネオエピトープが腫瘍細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、腫瘍細胞により内部移行され、細胞によりプロセシングされる治療有効量のネオ抗原性ポリペプチドを投与するステップを含み、抗原性ペプチドが腫瘍細胞の表面に提示される。
一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞へと送達する本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを投与するステップを含み、ネオ抗原性ペプチドに由来する少なくとも１つのネオエピトープが、腫瘍細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して腫瘍細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して腫瘍細胞の表面に提示される。
一部の実施形態では、方法は、腫瘍細胞を、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞へと送達する本明細書に記載のネオ抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドに由来する少なくとも１つのネオエピトープが、腫瘍細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して腫瘍細胞の表面に提示される。一部の実施形態では、ネオエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して腫瘍細胞の表面に提示される。
一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つの抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞へと送達する本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与するステップを含み、ネオエピトープが腫瘍細胞の表面に提示され、腫瘍細胞に対する免疫応答が誘導される。一部の実施形態では、腫瘍細胞に対する免疫応答が増加される。一部の実施形態では、ネオ抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞へと送達し、ネオエピトープが腫瘍細胞の表面に提示され、腫瘍成長が阻害される。
一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドを含む外因性ポリペプチドを腫瘍細胞へと送達する本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与するステップを含み、少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドに由来するネオエピトープが、腫瘍細胞の表面に提示され、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅が誘導される。一部の実施形態では、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅が増強される。一部の実施形態では、腫瘍細胞に対して方向付けられるＴ細胞死滅が増加される。
一部の実施形態では、対象の免疫応答を増加させる方法は、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原性治療薬を対象に投与するステップを含み、作用剤は、本明細書に記載のネオ抗原を特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、対象の免疫応答を増加させる方法は、治療有効量の抗体を対象に投与するステップを含む。
本開示は、既存の免疫応答を腫瘍に方向付け直す方法を提供する。一部の実施形態では、既存の免疫応答を腫瘍に方向付け直す方法は、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、既存の免疫応答は、ウイルスに対してである。一部の実施形態では、ウイルスは、麻疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ；チキンポックスウイルス）、インフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、サイトメガロウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、麻疹ウイルスである。一部の実施形態では、既存の免疫応答は、自然ウイルス感染後に獲得されている。一部の実施形態では、既存の免疫応答は、ウイルスに対するワクチン接種後に獲得されている。一部の実施形態では、既存の免疫応答は、細胞媒介性応答である。一部の実施形態では、既存の免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＴｈ細胞を含む。
一部の実施形態では、既存の免疫応答を対象の腫瘍に方向付け直す方法は、（ｉ）ネオ抗原を特異的に結合する抗体および（ｉｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのネオ抗原性ペプチドを含む融合タンパク質を投与するステップを含み、（ａ）融合タンパク質は、腫瘍関連抗原またはネオエピトープに結合した後、腫瘍細胞により内部移行され、（ｂ）ネオ抗原性ペプチドは、プロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子に付随して腫瘍細胞の表面に提示され、（ｃ）ネオ抗原性ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞により認識される。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ネオ抗原性ペプチドによるワクチン接種の結果である。
本開示は、腫瘍の免疫原性を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍の免疫原性を増加させる方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、本明細書に記載の有効量のネオ抗原治療薬と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、腫瘍の免疫原性を増加させる方法は、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含む。
また、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を使用して腫瘍の成長を阻害するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍の成長を阻害する方法は、細胞混合物をネオ抗原治療薬とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させるステップを含む。例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）と混合された不死化細胞系またはがん細胞系を、ネオ抗原性ペプチドが添加されている培地中で培養する。一部の実施形態では、腫瘍細胞を、患者試料、例えば、組織生検、胸水、または血液試料から単離し、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）と混合し、ネオ抗原治療薬が添加されている培地中で培養する。一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、免疫細胞の活性を増加、促進、および／または増強する。一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、腫瘍細胞成長を阻害する。一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、腫瘍細胞の死滅を活性化する。
ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は腫瘍を有するか、または対象は少なくとも部分的に除去された腫瘍を有していた。
一部の実施形態では、腫瘍の成長を阻害する方法は、治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与することを含む、既存の免疫応答を新しい標的に方向付け直すステップを含み、既存の免疫応答は、ネオ抗原性ペプチドにより腫瘍細胞に送達された抗原性ペプチドに対してである。一部の実施形態では、処置方法は、ペプチドを投与する前に、ペプチドが、対象により特異的に発現される少なくとも１つまたは複数のＨＬＡサブタイプに結合するように、対象において発現される１つまたは複数のＨＬＡサブタイプを同定するステップを含む。一部の実施形態では、表３４から選択される１つまたは複数の突然変異型ＢＴＫペプチドを対象に投与する場合、投与されたペプチドが、対象により特異的に発現される少なくとも１つまたは複数のＨＬＡサブタイプに結合するように、表３４のペプチドに対応するＨＬＡサブタイプの発現の事前決定が、対象において実施される。一部の実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ｃ１４：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ１４：０３アレル、ＨＬＡ－Ａ３３：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ０４：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９アレル、またはＨＬＡ－Ｂ３８：０２アレルによりコードされるタンパク質を対象が発現することを決定するステップを含み、治療薬は、アミノ酸配列ＥＹＭＡＮＧＳＬＬを有する突然変異型ＢＴＫペプチドを含む。一部の実施形態では、方法が、ＨＬＡ－Ｃ０２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ５３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ１２：０２アレル、ＨＬＡ－Ｃ１２：０３アレル、ＨＬＡ－Ａ３６：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２６：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２５：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ５７：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ４６：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０３アレル、ＨＬＡ－Ａ３３：０３アレル、ＨＬＡ－Ｂ３５：０３アレル、またはＨＬＡ－Ａ１１：０１アレルのいずれか１つによりコードされるタンパク質を対象が発現することを決定するステップを含む場合、治療薬は、アミノ酸配列ＭＡＮＧＳＬＬＮＹを有する突然変異型ＢＴＫペプチドを含む。一部の実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ａ０２：０４アレル、ＨＬＡ－Ａ０２：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ０３：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ０３：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ３２：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ０２：０７アレル、ＨＬＡ－Ｃ１４：０３アレル、ＨＬＡ－Ｃ１４：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ３１：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ３０：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ７４：０１アレル、ＨＬＡ－Ｃ０６：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０３アレル、ＨＬＡ－Ｂ４６：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１３：０２アレル、ＨＬＡ－Ａ２５：０１アレル、ＨＬＡ－Ａ２９：０２アレル、またはＨＬＡ－Ｃ０１：０２アレルのいずれか１つによりコードされるタンパク質を対象が発現することを決定するステップを含み、治療薬は、アミノ酸配列ＳＬＬＮＹＬＲＥＭを有する突然変異型ＢＴＫペプチドを含む。
一部の実施形態では、方法は、ＨＬＡ－Ｂ１４：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ４９：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ４４：０３アレル、ＨＬＡ－Ｂ４４：０２アレル、ＨＬＡ－Ｂ３７：０１アレル、ＨＬＡ－Ｂ１５：０９アレル、ＨＬＡ－Ｂ４１：０１、またはＨＬＡ－Ｂ５０：０１アレルのいずれか１つによりコードされるタンパク質を対象が発現することを決定するステップを含み、治療薬は、アミノ酸配列ＴＥＹＭＡＮＧＳＬを有する突然変異型ＢＴＫペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、がん幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度は、ネオ抗原治療薬の投与により低減される。一部の実施形態では、対象の腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減する方法であって、治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
加えて、一部の態様では、本開示は、対象の腫瘍の腫瘍形成性を低減させる方法であって、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、がん幹細胞を含む。一部の実施形態では、腫瘍の腫瘍形成性は、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度を低減させることにより低減される。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を使用するステップを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍におけるがん幹細胞の頻度は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬の投与により低減される。
一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、胃腸管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、卵巣腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、乳房腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、肺腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、膵臓腫瘍である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、黒色腫腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。
本開示は、対象のがんを処置するための方法であって、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
一部の実施形態では、がんを処置する方法は、既存の免疫応答を新しい標的に方向付け直すステップを含み、治療有効量のネオ抗原治療薬を対象に投与するステップを含み、既存の免疫応答は、ネオ抗原性ペプチドによりがん細胞に送達された抗原性ペプチドに対してである。
本開示は、がんを処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量のネオ抗原治療薬を対象（例えば、処置を必要とする対象）に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、がん性腫瘍を有する。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を少なくとも部分的に除去したことがある。
対象は、例えば、哺乳動物、ヒト、妊婦、高齢者、成人、青年、前青年、子供、幼児、乳児、新出生児、または新生児であってもよい。対象は、患者であってもよい。一部の場合では、対象はヒトであってもよい。一部の場合では、対象は、子供（すなわち、思春期年齢未満の若年ヒト）であってもよい。一部の場合では、対象は乳児であってもよい。一部の場合では、対象は、人工栄養乳児であってもよい。一部の場合では、対象は、臨床研究に登録されている個人であってもよい。一部の場合では、対象は、実験動物、例えば、哺乳動物またはげっ歯動物であってもよい。一部の場合では、対象は、マウスであってもよい。一部の場合では、対象は、肥満または太りすぎの対象であってもよい。
一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数の異なるがん治療法で以前に処置されたことがある。一部の実施形態では、対象は、放射線療法、化学療法、または免疫療法の１つまたは複数で以前に処置されたことがある。一部の実施形態では、対象は、１、２、３、４、または５つの以前の療法で処置されたことがある。一部の実施形態では、以前の療法は、細胞傷害性療法である。
ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸管がん、黒色腫、子宮頸部がん、神経内分泌がん、膀胱がん、神経膠芽腫、および頭頸部がんからなる群から選択されるがんである。ある特定の実施形態では、がんは、膵臓がんである。ある特定の実施形態では、がんは、卵巣がんである。ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。ある特定の実施形態では、がんは、乳がんである。ある特定の実施形態では、がんは、前立腺がんである。ある特定の実施形態では、がんは、肺がんである。ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、がんは、固形がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍を含む。
一部の実施形態では、がんは、血液学的がんである。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、併用療法として投与される。２つまたはそれよりも多くの治療剤との併用療法は、必須ではないが、異なる作用機序により作用する作用剤を使用する。異なる作用機序を有する作用剤を使用する併用療法は、相加または相乗効果をもたらすことができる。併用療法は、各作用剤の用量を単剤療法で使用されるよりも低くすることを可能にし、それにより、作用剤の毒性副作用を低減することおよび／または治療指数を増加させることができる。併用療法は、抵抗性がん細胞が発生する可能性を減少させることができる。一部の実施形態では、併用療法は、免疫応答に影響を及ぼす（例えば、応答を増強または活性化する）治療剤、および腫瘍／がん細胞に影響を及ぼす（例えば、阻害または死滅させる）治療剤を含む。
一部の場合では、免疫原性医薬組成物は、追加の作用剤と共に投与することができる。一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、免疫療法と共に投与することができる。免疫療法は、例えば、免疫チェックポイントを標的とする抗体であってもよい。一部の実施形態では、抗体は、二特異性抗体である。追加の作用剤の選択は、少なくとも部分的に、処置される状態に依存し得る。追加の作用剤としては、例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＤ４０、または抗ＴＩＭ３作用剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＤ４０、または抗ＴＩＭ３抗体）などのチェックポイント阻害性作用剤；または例えば、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、またはアスピリンなどの、炎症状態を処置するために使用される薬物を含む、病原体感染（例えば、ウイルス感染）に対して治療効果を有する任意の作用剤を挙げることができる。例えば、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１ １０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）からなる群から選択されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストであってもよい。別の例として、製剤は、ビタミンＣ、Ｅまたは他の抗酸化剤などの１つまたは複数のサプリメントをさらに含有することができる。
本開示の方法は、当技術分野で公知の任意のタイプのがんを処置するために使用することができる。本開示の方法により処置されるがんの非限定的な例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の新生物悪性腫瘍を挙げることができる。
加えて、本明細書で提供される疾患または状態は、本開示の処置方法を使用してその成長を阻害することができる難治性または再発性の悪性腫瘍を含む。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、子宮内膜がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸部がん、卵管がん、原発性腹膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、肛門性器領域扁平上皮癌、黒色腫、腎細胞癌、肺がん、非小細胞肺がん、肺扁平上皮癌、胃がん、膀胱がん、胆嚢がん、肝臟がん、甲状腺がん、喉頭がん、唾液腺がん、食道がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部扁平上皮癌、前立腺がん、膵臓がん、中皮腫、肉腫、血液学的がん、白血病、リンパ腫、神経腫、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんとしては、例えば、癌腫、扁平上皮癌（例えば、子宮頸管、眼瞼、結膜、膣、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、および食道）、および腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、子宮頸管、大腸、肺、膵臓、食道、直腸、子宮、胃、乳腺、および卵巣）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんとしては、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、黒色腫、およびリンパ腫がさらに挙げられる。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんは、乳がんである。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、卵巣がんである。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、結腸直腸がんである。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物で処置される患者または患者の集団は、固形腫瘍を有する。一部の実施形態では、固形腫瘍は、黒色腫、腎細胞癌、肺がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、胆嚢がん、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺がん、胃がん、唾液腺がん、前立腺がん、膵臓がん、またはメルケル細胞癌である。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物で処置される患者または患者の集団は、血液学的がんを有する。一部の実施形態では、患者は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（「ＤＬＢＣＬ」）、ホジキンリンパ腫（「ＨＬ」）、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）、濾胞性リンパ腫（「ＦＬ」）、急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）、または多発性骨髄腫（「ＭＭ」）などの血液学的がんを有する。一部の実施形態では、処置される患者または患者の集団は、卵巣がん、肺がん、および黒色腫からなる群から選択されるがんを有する。
本開示に準じて予防および／または処置することができるがんの具体的な例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：腎がん、腎臓がん、多形神経膠芽腫、転移性乳がん；乳癌；乳房肉腫；神経線維腫；神経線維腫症；小児腫瘍；神経芽細胞腫；悪性黒色腫；表皮癌；白血病、例えば、これらに限定されないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病、および骨髄異形成症候群（ｍｙｃｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの急性骨髄性白血病、これらに限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病；真性赤血球増加症；これらに限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；これらに限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；重鎖病；これらに限定されないが、骨の肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫誘発性骨肉腫、骨パジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫などの骨がんおよび結合組織肉腫；これらに限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；これらに限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄質乳がん、粘液性乳がん、管状乳がん、乳頭状乳がん、パジェット病（若年性パジェット病を含む）、および炎症性乳がんを含む乳がん；これらに限定されないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌などの副腎がん；これらに限定されないが、乳頭状または濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がん、および未分化甲状腺がんなどの甲状腺がん；これらに限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島細胞腫瘍などの膵臓がん；これらに限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｉｕｓ）などの下垂体がん；これらに限定されないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼黒色腫、ならびに網膜芽細胞腫などの眼のがん；扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫などの膣がん；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰がん；これらに限定されないが、扁平上皮癌および腺癌などの子宮頸部がん；これらに限定されないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮がん；これらに限定されないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍などの卵巣がん；子宮頸部癌；これらに限定されないが、扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｃｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌、および燕麦細胞（小細胞）癌などの食道がん；これらに限定されないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在性拡大型、びまん性拡大型の悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃がん；結腸がん；結腸直腸がん、ＫＲＡＳ変異型結腸直腸がん；結腸癌；直腸がん；これらに限定されないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓がん、腺癌などの胆嚢がん；これらに限定されないが、乳頭状、結節性、およびびまん性などの胆管癌；ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、および小細胞肺がんなどの肺がん；肺癌；これらに限定されないが、胚性腫瘍、セミノーマ、未分化、古典的（典型的）、精母細胞性、非セミノーマ性、胚性癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）などの精巣がん、これらに限定されないが、アンドロゲン非依存性前立腺がん、アンドロゲン依存性前立腺がん、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺がん；ペナルがん（ｐｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；これに限定されないが、扁平上皮癌などの口腔がん；基底がん（ｂａｓａｌ ｃａｎｃｅｒ）；これらに限定されないが、腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺がん；これらに限定されないが、扁平上皮がんおよびいぼ状などの咽頭がん；これらに限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌、および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫などの皮膚がん；これらに限定されないが、腎細胞がん、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮がん（腎盂および／またはウテレル（ｕｔｅｒｅｒ））などの腎臓がん；腎癌；ウィルムス腫瘍；これらに限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮がん、腺癌、癌肉腫などの膀胱がん。加えて、がんとしては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、および乳頭状腺癌が挙げられる。
がんとしては、これらに限定されないが、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病などの重鎖病、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症、および免疫細胞性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性、ホルモン不応性前立腺がん）、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸部がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、肝臟がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液学的組織のがんなどが挙げられる。本開示により包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例としては、ヒト肉腫および癌種、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、肝臓がん、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病性）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病が挙げられる。一部の実施形態では、その表現型が本開示の方法により決定されるがんは、これらに限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、婦人科がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、または皮膚がんなどの上皮がんである。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、または結腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸部癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮がんは、これらに限定されないが、漿液性、類内膜性、粘液性、明細胞性、ブレンナー性、または未分化を含む他の様々な様式で特徴付けることができる。一部の実施形態では、本開示は、これに限定されないがマントル細胞リンパ腫を含むリンパ腫またはそのサブタイプの処置、診断、および／または予後に使用される。リンパ増殖性障害も、増殖性疾患とみなされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の作用剤と少なくとも１つの追加の治療剤との組合せは、相加的または相乗的な結果をもたらす。一部の実施形態では、併用療法は、作用剤の治療指数の増加をもたらす。一部の実施形態では、併用療法は、追加の治療剤の治療指数の増加をもたらす。一部の実施形態では、併用療法は、作用剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。一部の実施形態では、併用療法は、追加の治療剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。
ある特定の実施形態では、方法または処置は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を投与するステップに加えて、少なくとも１つの追加の治療剤を投与するステップをさらに含む。追加の治療剤は、作用剤の投与の前、同時、および／または後に投与することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くの追加の治療剤を含む。
本明細書に記載のネオ抗原治療薬と組み合わせて投与することができる治療剤としては、化学療法剤が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、方法または処置は、化学療法剤と組み合わせた、または化学療法剤のカクテルと組み合わせた本明細書に記載の作用剤の投与を含む。作用剤による処置は、化学治療薬の投与の前、同時、または後に行ってもよい。併用投与は、単一の医薬製剤でもしくは別々の製剤を使用してのいずれかでの同時投与、またはいずれの順序でもよいが、一般にすべての活性作用剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮することができるような期間内での連続投与を含むことができる。そのような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の使用説明書に従って、または熟練の開業医により経験的に決定されるように使用することができる。そのような化学療法薬の調製および投薬スケジュールは、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｏｏｋ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００８， Ｍ． Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡにも記載されている。
化学療法剤の有用な種類としては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）、および三核白金錯体、およびカルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、またはビンカアルカロイドなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。
本開示に有用な化学療法剤としては、これらに限定されないが、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチルロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、化学療法剤としては、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）を含む、抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、シスプラチンである。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、カルボプラチンである。
ある特定の実施形態では、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ）の作用を妨げる化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、ドキソルビシンＨＣｌ、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンＨＣｌ、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣｌ、テニポシド（ＶＭ－２６）、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、追加の治療剤は、イリノテカンである。
ある特定の実施形態では、化学療法剤は、代謝拮抗薬である。代謝拮抗薬は、正常な生化学反応に必要な代謝物に類似する構造を有するが、細胞分裂などの細胞の１つまたは複数の正常機能を妨げるのに十分な程度に異なる化学物質である。代謝拮抗薬としては、これらに限定されないが、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラリトレキセド（ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、５－アザシチジン、６メルカプトプリン、アザチオプリン、６－チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、ゲムシタビンである。
ある特定の実施形態では、化学療法剤は、これらに限定されないが、チューブリンを結合する作用剤を含む、抗有糸分裂剤である。一部の実施形態では、作用剤は、タキサンである。ある特定の実施形態では、作用剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体である。ある特定の実施形態では、作用剤は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、ＤＨＡ－パクリタキセル、またはＰＧ－パクリタキセルである。ある特定の代替的実施形態では、抗有糸分裂剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシンなどのビンカアルカロイド、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、抗有糸分裂剤は、キネシンＥｇ５の阻害剤、またはオーロラＡまたはＰｌｋ１などの有糸分裂キナーゼの阻害剤である。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、パクリタキセルである。一部の実施形態では、追加の治療剤は、アルブミン結合パクリタキセルである。
一部の実施形態では、追加の治療剤は、小分子などの作用剤を含む。例えば、処置は、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、および／またはＶＥＧＦを含む腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する小分子との、本開示の作用剤の併用投与を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本開示の作用剤は、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ラパタニブ、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８、ＣＩ－１０３３、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）、およびパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ）からなる群から選択されるプロテインキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む。別の実施形態では、追加の治療剤は、Ｔｒｅｇ細胞の数を低減させる化学療法薬または他の阻害剤である。ある特定の実施形態では、治療剤は、シクロホスファミドまたは抗ＣＴＬＡ４抗体である。別の実施形態では、追加の治療薬は、骨髄由来サプレッサー細胞の存在を低減させる。さらなる実施形態では、追加の治療薬は、カルボタキソール（ｃａｒｂｏｔａｘｏｌ）である。別の実施形態では、追加の治療剤は、細胞をＴヘルパー１応答へとシフトさせる。さらなる実施形態では、追加の治療剤は、イブルチニブである。
一部の実施形態では、追加の治療剤は、抗体などの生物学的分子を含む。例えば、処置は、これらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、および／またはＶＥＧＦを結合する抗体を含む腫瘍関連抗原に対する抗体との、本開示の作用剤の併用投与を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、がん幹細胞マーカーに特異的な抗体である。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、血管新生阻害剤である抗体（例えば、抗ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体抗体）である。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、ニモツズマブ、ザルツムマブ、またはセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。
本明細書で提供される作用剤および組成物は、単独で、または外科手術、放射線照射、化学療法、および／もしくは骨髄移植（自己、同系、同種異系、または無関係）など、従来の治療レジメンと組み合わせて使用することができる。一組の腫瘍抗原が、例えば、がん患者の大部分で有用であり得る。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンを含む組成物に加えて、少なくとも１つまたは複数の化学療法剤を投与してもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法剤は、異なる種類の化学療法剤に属していてもよい。
化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、ナイトロジェンマスタードなどのアルキル化剤（例えば、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、クロラムブシル、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、およびメルファラン）；ニトロソウレア（例えば、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、およびセムスチン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；テトラジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ミトゾロミドおよびテモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）））；アジリジン（例えば、チオテパ、ミトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）、およびジアジコン）；ならびに白金薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン）；プロカルバジンおよびアルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）などの非古典的アルキル化剤；５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ａｒａ－Ｃ（登録商標））、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ネララビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、ペントスタチン、チオグアニン、ビダーザなどの代謝拮抗剤；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニン）などの抗微小管剤；タキサン（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）））；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；エポチロン（例えば、イクサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標）））；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））；アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、エピルビシン、イダルビシン）などの抗腫瘍抗生物質；アクチノマイシン－Ｄ；ならびにブレオマイシン；トポテカンおよびイリノテカン（ＣＰＴ－１１）などのトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、ミトキサントロン、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プレドニゾン、メチルプレドニゾロン（Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標））およびデキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））などのコルチコステロイド；Ｌ－アスパラギナーゼ；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、サリドマイド、レナリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、ＢＣＧ、インターロイキン２、インターフェロン－アルファ、およびＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）などのがんワクチンなどの免疫療法剤；フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））、タモキシフェン、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ（登録商標））、エストロゲン、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（登録商標））、ロイプロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））、およびゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））などのホルモン治療剤；レチノイド、トレチノイン（ＡＴＲＡまたはＡｔｒａｌｉｎ（登録商標））、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））、および三酸化ヒ素（Ａｒｓｅｎｏｘ（登録商標））などの分化誘導剤；ならびにイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））などの標的化治療剤が挙げられる。一部の実施形態では、化学療法薬は、カクテル療法薬である。カクテル療法薬の例としては、これらに限定されないが、ＣＨＯＰ／Ｒ－ＣＨＯＰ（リツキサン、シクロホスファミド、ヒドロキシドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ヒドロキシドキソルビシン）、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ヒドロキシドキソルビシン、デキサメタゾン）、ＦＯＬＦＯＸ（フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ロイコボリン、オキサリプラチン）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）、ＤＨＡＰ（高用量のシタラビン［ａｒａ－Ｃ］、デキサメタゾン、シスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、シタラビン［ａｒａ－Ｃ］、シスプラチン）、およびＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセート、フルオウラシル（ｆｌｕｏｕｒａｃｉｌ））が挙げられる。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３Ｋ）の阻害剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、免疫原性ワクチンは、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、ＡＥＺＳ－１３６、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用してもよい。
一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の、ヒト処置のために用いられる用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約３０ｍｇ／ｋｇ）であってもよい。所望の用量は、便利には、単回用量で、または例えば１日当たり２、３、４つ、もしくはそれよりも多くの分割用量として適切な間隔で投与される複数回用量として投与してもよい。
一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の投薬量は、約１ｎｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の投薬量は、これらに限定されないが、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇを含む任意の投薬量であってもよい。
免疫原性ワクチンおよびＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の投与様式は、同時であっても逐次的であってもよく、免疫原性ワクチンおよび少なくとも１つの追加の薬学的に活性な作用剤は、逐次的に（または別々に）投与される。例えば、免疫原性ワクチンおよびＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６は、一緒に摂取するための単一の単位剤形で、または同時にもしくはある特定の時間差で投与するための別々の実体（例えば、別々の容器中の）として提供されてもよい。この時間差は、１時間～１か月の間、例えば１日～１週間、例えば４８時間～３日間の間であってもよい。加えて、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６とは異なる別の投与方式で投与することが可能である。例えば、免疫原性ワクチンまたはＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６のいずれかを静脈内に、他方を全身性または経口で投与することが有利であり得る。例えば、免疫原性ワクチンは静脈内にまたは皮下に、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６は経口で投与される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の時間的に前に投与される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤が投与される１～２４時間、２～２４時間、３～２４時間、４～２４時間、５～２４時間、６～２４時間、７～２４時間、８～２４時間、９～２４時間、１０～２４時間、１１～２４時間、１２～２４時間、１～３０日、２～３０日、３～３０日、４～３０日、５～３０日、６～３０日、７～３０日、８～３０日、９～３０日、１０～３０日、１１～３０日、１２～３０日、１３～３０日、１４～３０日、１５～３０日、１６～３０日、１７～３０日、１８～３０日、１９～３０日、２０～３０日、２１～３０日、２２～３０日、２３～３０日、２４～３０日、２５～３０日、２６～３０日、２７～３０日、２８～３０日、２９～３０日、１～４週、２～４週、３～４週、１～１２か月、２～１２か月、３～１２か月、４～１２か月、５～１２か月、６～１２か月、７～１２か月、８～１２か月、９～１２か月、１０～１２か月、１１～１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤が投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６が投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤が投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６が投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤が投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６が投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、少なくとも１つの追加の薬学的に活性な作用剤として時間的に同時に投与される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６の時間的に後で投与される。一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される１～２４時間、２～２４時間、３～２４時間、４～２４時間、５～２４時間、６～２４時間、７～２４時間、８～２４時間、９～２４時間、１０～２４時間、１１～２４時間、１２～２４時間、１～３０日、２～３０日、３～３０日、４～３０日、５～３０日、６～３０日、７～３０日、８～３０日、９～３０日、１０～３０日、１１～３０日、１２～３０日、１３～３０日、１４～３０日、１５～３０日、１６～３０日、１７～３０日、１８～３０日、１９～３０日、２０～３０日、２１～３０日、２２～３０日、２３～３０日、２４～３０日、２５～３０日、２６～３０日、２７～３０日、２８～３０日、２９～３０日、１～４週、２～４週、３～４週、１～１２か月、２～１２か月、３～１２か月、４～１２か月、５～１２か月、６～１２か月、７～１２か月、８～１２か月、９～１２か月、１０～１２か月、１１～１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６は、免疫原性ワクチンが投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６は、免疫原性ワクチンが投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、ＰＩ３キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６は、免疫原性ワクチンが投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のＰＩ３キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。例えば、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６と組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日サイクルで、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間連続して、１日１回、２回、または３回投与し、続いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間休薬し（例えば、免疫原性ワクチンの投与無し／処置の中断）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤（例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６）を、１日またはそれよりも多くの日において（例えば、サイクル１の１日目に）免疫原性ワクチンの投与の前、同時、または後に投与する。一部の実施形態では、併用療法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１３サイクルで投与される。一部の実施形態では、併用療法は、２８日間の１～１２または１３サイクル（例えば、約１２か月間）で投与される。
一部の実施形態では、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のＰＩ３キナーゼ阻害剤、例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６、およびチェックポイント阻害剤などの二次的活性作用剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日サイクルで、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間連続して、１日１回、２回、または３回投与し、続いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間休薬し（例えば、免疫原性ワクチンの投与無し／処置の中断）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤（例えば、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ＬＹ２９４００２、ヒビスコンＣ、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、タセリシブ、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）、ウンブラリシブ、（ＴＧＲ１２０２）、コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）、ＰＸ－８６６、ダクトリシブ、ＣＵＤＣ－９０７、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、ＣＵＤＣ－９０７、ＭＥ－４０１、ＩＰＩ－５４９、ＳＦ１１２６、ＲＰ６５３０、ＩＮＫ１１１７、ピクチリシブ（ＧＤＣ－０９４１）、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、またはＡＥＺＳ－１３６）を、１日またはそれよりも多くの日において（例えば、サイクル１の１日目に）免疫原性ワクチンの投与の前、同時、または後に投与し、二次的作用剤を毎日、毎週、または毎月投与する。一部の実施形態では、併用療法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１３サイクルで投与される。一部の実施形態では、併用療法は、２８日間の１～１２または１３サイクル（例えば、約１２か月間）で投与される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、例えば、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６の阻害剤と組み合わせて使用することができる。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、パルボシクリブ（ＩＢＲＡＮＣＥ）である（例えば、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．； ２０１５， ２１（１３）； ２９０５－１０を参照）。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、リボシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、アベマシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、セリシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、ジナシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、ミルシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、ロニシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、アツベシクリブ（ａｔｕｖｅｃｉｃｌｉｂ）である。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、ブリシクリブ（ｂｒｉｃｉｃｌｉｂ）である。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、リビシクリブ（ｒｉｖｉｃｉｃｌｉｂ）である。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、セリシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、トリラシクリブである。本免疫原性ワクチンと組み合わせて使用することができるそのような阻害剤の例は、ボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）である。一部の例では、本開示の免疫原性ワクチンは、ＣＤＫ４および／もしくはＣＤＫ６の阻害剤と、ＣＤＫ４／６阻害剤の細胞分裂抑制活性を強化する作用剤と、ならびに／または可逆的な細胞分裂抑制を不可逆的な成長停止もしくは細胞死に変換する作用剤と組み合わせて使用することができる。例示的ながんサブタイプとしては、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、脂肪肉腫、およびマントル細胞リンパ腫が挙げられる。
一部の実施形態では、ヒト処置に用いられる、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい（例えば、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約３０ｍｇ／ｋｇ）。所望の用量は、便利には、単回用量で、または例えば１日当たり２、３、４、もしくはそれよりも多くの分割用量として適切な間隔で投与される複数回用量として投与してもよい。
一部の実施形態では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの投薬量は、約１ｎｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの投薬量は、これらに限定されないが、約１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇを含む任意の投薬量であってもよい。
免疫原性ワクチンおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの投与様式は、同時であっても逐次的であってもよく、免疫原性ワクチンおよび少なくとも１つの追加の薬学的に活性な作用剤は、逐次的に（または別々に）投与される。例えば、免疫原性ワクチンおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブは、一緒に摂取するための単一の単位剤形で、または同時にもしくはある特定の時間差で投与するための別々の実体（例えば、別々の容器中の）として提供されてもよい。この時間差は、１時間～１か月の間、例えば１日～１週間、例えば４８時間～３日間の間であってもよい。加えて、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブとは異なる別の投与方式で投与することが可能である。例えば、免疫原性ワクチンまたはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、もしくはパルボシクリブのいずれかを静脈内に、他を全身性にまたは経口で投与することが有利であり得る。例えば、免疫原性ワクチンは静脈内または皮下に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブは経口で投与される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの時間的に前に投与される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤が投与される１～２４時間、２～２４時間、３～２４時間、４～２４時間、５～２４時間、６～２４時間、７～２４時間、８～２４時間、９～２４時間、１０～２４時間、１１～２４時間、１２～２４時間、１～３０日、２～３０日、３～３０日、４～３０日、５～３０日、６～３０日、７～３０日、８～３０日、９～３０日、１０～３０日、１１～３０日、１２～３０日、１３～３０日、１４～３０日、１５～３０日、１６～３０日、１７～３０日、１８～３０日、１９～３０日、２０～３０日、２１～３０日、２２～３０日、２３～３０日、２４～３０日、２５～３０日、２６～３０日、２７～３０日、２８～３０日、２９～３０日、１～４週、２～４週、３～４週、１～１２か月、２～１２か月、３～１２か月、４～１２か月、５～１２か月、６～１２か月、７～１２か月、８～１２か月、９～１２か月、１０～１２か月、１１～１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤が投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブが投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤が投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブが投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤が投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、免疫原性ワクチンは、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブが投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、少なくとも１つの追加の薬学的に活性な作用剤と時間的に同時に投与される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブの時間的に後で投与される。一部の実施形態では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される１～２４時間、２～２４時間、３～２４時間、４～２４時間、５～２４時間、６～２４時間、７～２４時間、８～２４時間、９～２４時間、１０～２４時間、１１～２４時間、１２～２４時間、１～３０日、２～３０日、３～３０日、４～３０日、５～３０日、６～３０日、７～３０日、８～３０日、９～３０日、１０～３０日、１１～３０日、１２～３０日、１３～３０日、１４～３０日、１５～３０日、１６～３０日、１７～３０日、１８～３０日、１９～３０日、２０～３０日、２１～３０日、２２～３０日、２３～３０日、２４～３０日、２５～３０日、２６～３０日、２７～３０日、２８～３０日、２９～３０日、１～４週、２～４週、３～４週、１～１２か月、２～１２か月、３～１２か月、４～１２か月、５～１２か月、６～１２か月、７～１２か月、８～１２か月、９～１２か月、１０～１２か月、１１～１２か月、またはそれらに任意の組合せの前に投与される。一部の実施形態では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブは、免疫原性ワクチンが投与される少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブは、免疫原性ワクチンが投与される最大でも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、免疫原性ワクチンが投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与される。例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブは、免疫原性ワクチンが投与される約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれらの任意の組合せの前に投与してもよい。
一部の実施形態では、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。例えば、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のセリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブと組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、免疫原性ワクチンを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日サイクルで、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間連続して、１日１回、２回、または３回投与し、続いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間休薬し（例えば、免疫原性ワクチンの投与無し／処置の中断）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブ）を、１日またはそれよりも多くの日において（例えば、サイクル１の１日目に）免疫原性ワクチンの投与の前、同時、または後に投与する。一部の実施形態では、併用療法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１３サイクルで投与される。一部の実施形態では、併用療法は、２８日間の１～１２または１３サイクル（例えば、約１２か月間）で投与される。
一部の実施形態では、状態または疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の免疫原性ワクチンを、治療有効量のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えばセリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブ、およびチェックポイント阻害剤などの二次的活性作用剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日サイクルで、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間連続して、１日１回、２回、または３回投与し、続いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間休薬し（例えば、免疫原性ワクチンの投与無し／処置の中断）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば、セリシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、またはパルボシクリブ）を、１日またはそれよりも多くの日において（例えば、サイクル１の１日目に）免疫原性ワクチンの投与の前、同時、または後に投与し、二次的作用剤を毎日、毎週、または毎月投与する。一部の実施形態では、併用療法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１３サイクルで投与される。一部の実施形態では、併用療法は、２８日間の１～１２または１３サイクル（例えば、約１２か月間）で投与される。
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、第２の免疫療法剤を含む。一部の実施形態では、追加の免疫療法剤としては、これらに限定されないが、コロニー刺激因子、インターロイキン、免疫抑制機能を阻止する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体）、免疫細胞機能を増強する抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ－４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、または抗４－１ＢＢ抗体）、トール様受容体（例えば、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、可溶性リガンド（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬ－Ｆｃ、ＯＸ－４０Ｌ、ＯＸ－４０Ｌ－Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ、４－１ＢＢリガンド、または４－１ＢＢリガンド－Ｆｃ）、またはＢ７ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）が挙げられる。一部の実施形態では、追加の免疫療法剤は、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＯＸ－４０、ＣＤ－４０、または４－１ＢＢを標的とする。
一部の実施形態では、追加の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗４－１ＢＢ抗体、または抗ＯＸ－４０抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピジルズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ－Ａ３１７、およびＰＤＲ００１からなる群から選択される抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ－１１０５）、アテキソリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）からなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）およびトレメリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ－４抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＢＭＳ－９８６０１６およびＬＡＧ５２５からなる群から選択される抗ＬＡＧ－３抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、およびＭＯＸＲ０９１６からなる群から選択される抗ＯＸ－４０抗体である。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ＰＦ－０５０８２５６６からなる群から選択される抗４－１ＢＢ抗体である。
一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ガンマ－ＩＦＮ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される生物分子と組み合わせて投与することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のネオ抗原治療薬による処置には、腫瘍の外科的除去、がん細胞の除去、または処置する医師が必要であるとみなす任意の他の外科的療法が伴ってもよい。
ある特定の実施形態では、処置は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を、放射線療法と組み合わせて投与することを含む。作用剤による処置は、放射線療法の投与の前、同時、または後に行ってもよい。そのような放射線療法の投与スケジュールは、熟練の開業医により決定することができる。
併用投与は、単一の医薬製剤でもしくは別々の製剤を使用してのいずれかでの同時投与、またはいずれの順序でもよいが、一般にすべての活性作用剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮することができるような期間内での連続投与を含むことができる。
本明細書に記載のネオ抗原治療薬と少なくとも１つの追加の治療剤との組合せは、任意の順序でまたは同時発生的に投与することができることが理解されるだろう。一部の実施形態では、作用剤は、第２の治療剤による処置を以前に受けたことがある患者に投与される。ある特定の他の実施形態では、ネオ抗原治療薬および第２の治療剤は、実質的に同時にまたは同時発生的に投与される。例えば、対象は、第２の治療剤（例えば、化学療法）による一連の処置を受けている間に作用剤を与えてもよい。ある特定の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、第２の治療剤による処置の１年以内に投与される。２つ（またはそれよりも多く）の作用剤または処置は、わずか数時間または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与することができることがさらに理解される。
疾患の処置の場合、本明細書に記載のネオ抗原治療薬の適切な投薬量は、すべて処置する医師の裁量で、処置しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、作用剤が治療的または予防目的で投与されるのか、以前の療法、および患者の病歴など、に依存する。ネオ抗原治療薬は、１度に、もしくは数日～数か月間続く一連の処置にわたって、または治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの低減）が達成されるまで投与してもよい。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができ、個々の作用剤の相対的効力に応じて様々である。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法論、および反復率を決定することができる。
一部の実施形態では、ネオ抗原治療薬は、初期にはより高い「負荷」用量で、続いて１つまたは複数のより低い用量で投与してもよい。一部の実施形態では、投与の頻度を変化させることもできる。一部の実施形態では、投薬レジメンは、初期用量を投与し、続いて追加の用量（または「維持」用量）を週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、または毎月１回投与することを含んでいてもよい。例えば、投薬レジメンは、初期負荷用量を投与し、続いて、例えば初期用量の半分の毎週の維持用量を投与することを含んでいてもよい。または、投薬レジメンは、初期負荷用量を投与し、続いて、例えば初期用量の半分の維持用量を隔週で投与することを含んでいてもよい。または、投薬レジメンは、３つの初期用量を３週間投与し、続いて、例えば同じ量の維持用量を隔週で投与することを含んでいてもよい。
当業者に公知であるように、いかなる治療剤の投与も、副作用および／または毒性をもたらし得る。一部の場合では、治療有効用量での特定の作用剤の投与が妨げられるほど副作用および／または毒性が深刻である。一部の場合では、療法を中断しなければならず、他の作用剤を試みてもよい。しかしながら、同じ治療用クラスの多くの作用剤は、同様の副作用および／または毒性を示し、これは、患者が、療法を中止するか、または可能であれば、治療剤に関連する不快な副作用に苦しまなければならないかのいずれかであることを意味する。
一部の実施形態では、投薬スケジュールは、具体的な数の投与または「サイクル」に限定される場合がある。一部の実施形態では、作用剤は、３、４、５、６、７、８、またはそれよりも多くのサイクルで投与される。例えば、作用剤は２週間毎に６サイクルで投与される、作用剤は３週間毎に６サイクルで投与される、作用剤は２週間毎に４サイクルで投与される、作用剤は３週間毎に４サイクルで投与されるなどである。投薬スケジュールは、当業者により決定され、その後修正されてもよい。
本開示は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を対象に投与する方法であって、作用剤、化学療法剤などの投与に関連する副作用および／または毒性を低減することができる、１つまたは複数の作用剤を投与するための間欠投薬戦略を使用するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ヒト対象のがんを処置するための方法は、対象に、治療有効用量のネオ抗原治療薬を、治療有効用量の化学療法剤と組み合わせて投与するステップを含み、作用剤の一方または両方は、間欠投薬戦略に従って投与される。一部の実施形態では、ヒト対象のがんを処置するための方法は、対象に、治療有効用量のネオ抗原治療薬を、治療有効用量の第２の治療剤と組み合わせて投与するステップを含み、作用剤の一方または両方は、間欠投薬戦略に従って投与される。一部の実施形態では、間欠投薬戦略は、初期用量のネオ抗原治療薬を対象に投与すること、および後続用量の作用剤を２週間毎に約１回投与することを含む。一部の実施形態では、間欠投薬戦略は、初期用量のネオ抗原治療薬を対象に投与すること、および後続用量の作用剤を３週間毎に約１回投与することを含む。一部の実施形態では、間欠投薬戦略は、初期用量のネオ抗原治療薬を対象に投与すること、および後続用量の作用剤を４週間毎に約１回投与することを含む。一部の実施形態では、作用剤は、間欠投薬戦略を使用して投与され、追加の治療剤は、毎週投与される。
本開示は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬を含む組成物を提供する。また、本開示は、本明細書に記載のネオ抗原治療薬および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫療法において使用が見出される。一部の実施形態では、組成物は、腫瘍成長を阻害することにおいて使用が見出される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）の腫瘍成長を阻害することにおいて使用が見出される。一部の実施形態では、組成物は、がんを処置することにおいて使用が見出される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）のがんを処置することにおいて使用が見出される。
製剤は、本開示のネオ抗原治療薬を薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体または賦形剤）と組み合わせることにより、保管および使用のために調製される。当業者は、一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または安定剤を、製剤または医薬組成物の不活性成分であるとみなす。例示的な製剤は、ＷＯ２０１５／０９５８１１に列挙されている。
好適な薬学的に許容されるビヒクルとしては、これらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの非毒性緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールなどの保存剤；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０アミノ酸残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；Ｚｎ－タンパク質錯体などの金属錯体；ならびにＴＷＥＥＮ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０１２， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ．）。一部の実施形態では、ビヒクルは、水中５％デキストロースである。
本明細書に記載の医薬組成物は、局所または全身処置のいずれかのために、任意の数の方式で投与することができる。投与は、表皮もしくは経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および散剤による局部的；ネブライザーによることを含む散剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくは吹送による肺内、気管内、および鼻腔内；経口；または、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内（例えば、注射または点滴）、もしくは頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）を含む非経口であってもよい。
治療用製剤は、単位剤形であってもよい。そのような製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の溶液剤もしくは懸濁剤、または坐剤が挙げられる。
また、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドは、マイクロカプセルに封入されていてもよい。そのようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０１２， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載のように、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、もしくはマクロエマルジョンでは、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルにより調製される。
ある特定の実施形態では、医薬製剤は、リポソームと複合体化された本明細書に記載のネオ抗原治療薬を含む。リポソームを産生するための方法は、当業者に公知である。例えば、一部のリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物との逆相蒸発により生成することができる。リポソームを規定の孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径を有するリポソームを得ることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のネオ抗原性ペプチドを含む徐放性調製物を産生することができる。徐放性調製物の好適な例としては、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である、作用剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）などのヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸および７エチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
本開示は、免疫原性ワクチンを含む処置方法を提供する。疾患（がんまたはウイルス感染など）を処置する方法が提供される。方法は、対象に、免疫原性抗原を含む有効量の組成物を投与するステップを含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原を含む。
調製することができるワクチンの非限定的な例としては、ペプチドに基づくワクチン、核酸に基づくワクチン、抗体に基づくワクチン、Ｔ細胞に基づくワクチン、および抗原提示細胞に基づくワクチンが挙げられる。
ワクチン組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性作用剤のプロセシングを容易にする賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する場合がある。周知の技法、担体、および賦形剤はいずれも、好適におよび当技術分野で理解されているように使用することができる。
一部の場合では、ワクチン組成物は、ペプチドに基づくワクチン、核酸に基づくワクチン、抗体に基づくワクチン、または細胞に基づくワクチンとして製剤化される。例えば、ワクチン組成物としては、カチオン性脂質製剤中のネイキッドｃＤＮＡ；リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１， １９９５）、例えば、ポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロスフェアに封入されているネイキッドｃＤＮＡまたはペプチド（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：２８７－２９４， １９９１：Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９－３０６， １９９４；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５－６８１， １９９５を参照）；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含有されているペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３－８７５， １９９０；Ｈｕ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１３：２３５－２４３， １９９８）；または複数の抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ， Ｊ． Ｐ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：５４０９－５４１３， １９８８；Ｔａｒｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７－３２， １９９６を参照）を挙げることができる。ある場合には、ワクチンは、ペプチドに基づくワクチン、または核酸がポリペプチドをコードする核酸に基づくワクチンとして製剤化される。ある場合には、ワクチンは、抗体に基づくワクチンとして製剤化される。ある場合には、ワクチンは、細胞に基づくワクチンとして製剤化される。
同定された疾患特異的免疫原性ネオ抗原ペプチドのアミノ酸配列を使用して、薬学的に許容される組成物を開発することができる。抗原の供給源は、これらに限定されないが、糖タンパク質、ペプチド、およびスーパー抗原を含む天然または合成タンパク質；抗体／抗原複合体；リポタンパク質；ＲＮＡまたはその翻訳産物；ならびにＤＮＡまたはＤＮＡによりコードされるポリペプチドであってもよい。また、抗原の供給源は、形質転換されていない、形質転換された、トランスフェクトされた、または形質導入された細胞または細胞系を含んでいてもよい。細胞は、組換え抗原を発現するために用いることができる当業者に公知の様々な発現ベクターまたはレトロウイルスベクターのいずれかを使用して、形質転換、トランスフェクト、または形質導入することができる。また、発現は、組換え抗原をコードするＤＮＡ分子を含有する発現またはレトロウイルスベクターを形質転換、トランスフェクト、または形質導入した任意の適切な宿主細胞にて達成することができる。当業者に公知の任意の数のトランスフェクション、形質転換、および形質導入プロトコールを使用することができる。組換えワクシニアベクターおよびワクシニアベクターに感染させた細胞を、抗原の供給源として使用することができる。
組成物は、合成疾患特異的免疫原性ネオ抗原ペプチドを含んでいてもよい。組成物は、２つまたはそれよりも多くの疾患特異的免疫原性ネオ抗原ペプチドを含んでいてもよい。組成物は、疾患特異的免疫原性ペプチド（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡなど）の前駆体を含んでいてもよい。疾患特異的免疫原性ペプチドに対する前駆体は、同定された疾患特異的免疫原性ネオ抗原ペプチドに対して生じても生じさせもよい。一部の実施形態では、治療用組成物は、免疫原性ペプチドの前駆体を含む。疾患特異的免疫原性ペプチドに対する前駆体は、プロドラッグであってもよい。一部の実施形態では、疾患特異的免疫原性ネオ抗原ペプチドを含む組成物は、アジュバントをさらに含んでいてもよい。例えば、ネオ抗原ペプチドを、ワクチンとして利用することができる。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、薬学的に許容される免疫原性ネオ抗原ペプチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、免疫原性ワクチンは、免疫原性ネオ抗原ペプチドに対する薬学的に許容される前駆体（タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡなど）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、処置方法は、対象に、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量の抗体を投与するステップを含む。一部の実施形態では、処置方法は、対象に、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量の可溶性ＴＣＲまたはＴＣＲアナログを投与するステップを含む。
本明細書に記載の方法は、免疫原性ネオ抗原ペプチドを使用して同じ個体のための治療薬（ワクチンまたは治療用抗体など）が開発される個別化医療の状況において特に有用である。したがって、対象の疾患を処置する方法は、本明細書に記載の方法に従って対象の免疫原性ネオ抗原ペプチドを同定するステップ；およびペプチド（またはその前駆体）を合成するステップ；およびペプチドまたはペプチドを特異的に認識する抗体を対象に投与するステップを含んでいてもよい。一部の実施形態では、免疫原性ネオ抗原の発現パターンは、患者特異的ワクチンの生成のための本質的基盤としての役目を果たすことができる。一部の実施形態では、免疫原性ネオ抗原の発現パターンは、特定の疾患を有する患者群のためのワクチンの生成のための本質的基盤としての役目を果たすことができる。したがって、患者群の特定の疾患、例えば特定のタイプの腫瘍を選択的に処置することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、大規模患者群において自己抗疾患Ｔ細胞により認識され得る構造的に通常の抗原である。一部の実施形態では、疾患が構造的に通常のネオ抗原を発現する罹患対象群の抗原発現パターンが決定される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、タンパク質の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含み、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは突然変異を含み、第２のネオエピトープは同じ突然変異を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、タンパク質の第１の領域の第１のネオエピトープを含む第１のペプチドおよび同じタンパク質の第２の領域の第２のネオエピトープを含む第２のペプチドを含み、第１の領域は第２の領域の少なくとも１つのアミノ酸を含み、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なり、第１のネオエピトープは第１の突然変異を含み、第２のネオエピトープは第２の突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異および第２の突然変異は同じである。一部の実施形態では、突然変異は、点突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、リードスルー突然変異、遺伝子融合突然変異、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
免疫原性ネオ抗原を産生するための様々な方式が存在する。タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法により作製することができる。一般に、そのような疾患特異的ネオ抗原は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで産生することができる。免疫原性ネオ抗原は、ペプチドまたはポリペプチドとしてｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができ、次いで、それらを、個別化ワクチンまたは免疫原性組成物へと製剤化し、対象に投与することができる。免疫原性ネオ抗原のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、ペプチド合成、または様々な細菌、真核生物、もしくはウイルス組換え発現系のいずれかにおけるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子からのペプチド／ポリペプチドの発現、続く発現されたペプチド／ポリペプチドの精製を含んでいてもよい。あるいは、免疫原性ネオ抗原は、免疫原性ネオ抗原をコードする分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびウイルス発現系）を対象に導入し、その際にコードされた免疫原性ネオ抗原が発現されることによりｉｎ ｖｉｖｏで産生することができる。一部の実施形態では、免疫原性ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、ネオ抗原ペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、免疫原性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖および／もしくは二本鎖、ネイティブもしくは安定化形態のポリヌクレオチド、またはそれらの組合せであってもよい。免疫原性ネオ抗原ペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列がペプチドをコードする限り、イントロンを含有していてもいなくてもよい。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を使用してペプチドを産生する。
ネオ抗原をコードする配列を含む発現ベクターならびに発現ベクターを含有する宿主細胞も企図される。本開示での使用に好適な発現ベクターは、核酸配列に操作的に連結されている少なくとも１つの発現制御エレメントを含んでいてもよい。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される。発現制御エレメントの例は、当技術分野で周知であり、例えば、ｌａｃ系、ラムダファージのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、およびポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、またはＳＶ４０に由来するプロモーターが挙げられる。追加のオペレーター的なエレメントとしては、これらに限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主系における核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳に必要なまたは好ましい任意の他の配列が挙げられる。当業者であれば、発現制御エレメントの正しい組合せは、選択した宿主系に依存することを理解するだろう。発現ベクターは、核酸配列を含有する発現ベクターの宿主系への移入およびその後の複製に必要な追加のエレメントを含有するべきであることがさらに理解されるだろう。そのようなエレメントの例としては、これらに限定されないが、複製起点および選択可能なマーカーが挙げられる。
ネオ抗原ペプチドは、所望のネオ抗原ペプチドをコードするＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子の形態で提供することができる。本開示の１つまたは複数のネオ抗原ペプチドは、単一の発現ベクターによりコードされていてもよい。一般に、ＤＮＡを、発現のために適切な方向性および正しいリーディングフレームでプラスミドなどの発現ベクターに挿入し、必要に応じて、ＤＮＡを、所望の宿主（例えば、細菌）により認識される適切な転写および翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結させてもよいが、そのような制御は、発現ベクターにおいて一般に利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を使用してクローニング用の宿主細菌に導入する。真核生物宿主、特に哺乳動物またはヒトのために有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３などの広宿主域プラスミド、ならびに繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用して化学合成により構築することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利であるコドンを選択して設計することができる。標準的な方法を適用して、単離された目的のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。
ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある原核、酵母、昆虫、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはｂａｃｉｌｌｉが挙げられる。高等真核細胞としては、哺乳動物由来の確立された細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系も用いることができる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主との使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、当技術分野で周知である。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることができる。例示的な哺乳動物宿主細胞系としては、これらに限定されないが、ＣＯＳ－７、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結されている適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’隣接非転写配列などの非転写エレメント、ならびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに転写終結配列などの５’または３’非翻訳配列を含んでいてもよい。
形質転換された宿主により産生されたタンパク質は、任意の好適な方法に従って精製することができる。そのような標準的な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィーなど）、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技法によるものが挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどの親和性タグをタンパク質に付着させて、適切な親和性カラムを通過させることによる容易な精製を可能にすることができる。また、単離されたタンパク質を、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびＸ線結晶解析法などの技法を使用して物理的に特徴付けることができる。
ワクチンは、本明細書に記載のポリペプチド配列を結合する実体を含んでいてもよい。実体は、抗体であってもよい。抗体に基づくワクチンは、周知の技法、担体、および賦形剤のいずれかを、好適におよび当技術分野で理解されているように使用して、製剤化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチドを、抗体治療薬などのネオ抗原特異的治療薬を作製するために使用することができる。例えば、ネオ抗原は、ネオ抗原を特異的に認識する抗体を生じさせるおよび／または同定するために使用することができる。これらの抗体は、治療薬として使用することができる。抗体は、天然抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体であってもよく、または抗体断片であってもよい。抗体は、本明細書に記載のポリペプチドの１つまたは複数を認識することができる。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のポリペプチドと最大で４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを認識することができる。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のポリペプチドと少なくとも４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを認識することができる。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のポリペプチドの長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるポリペプチド配列を認識することができる。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のポリペプチドの長さの最大で３０％、４０％、５０％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるポリペプチド配列を認識することができる。
また、本開示は、ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態で、それを必要とする対象に送達するためのビヒクルとしての核酸分子の使用を企図する。
一部の実施形態では、ワクチンは、核酸ワクチンである。一部の実施形態では、ネオ抗原は、プラスミドの使用により対象に投与することができる。プラスミドは、いくつかの異なる方法、例えば、鼻および肺粘膜などの粘膜表面へのネイキッドＤＮＡの注射またはエアロゾル滴注により動物組織へと導入することができる。一部の実施形態では、「遺伝子銃」などを用いた物理的送達を使用することができる。発現ベクターの正確な選択は、発現させようとするペプチド／ポリペプチドに依存する場合があり、十分当業者の技術の範囲内にある。
一部の実施形態では、核酸は、免疫原性ペプチドまたはペプチド前駆体をコードする。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、免疫原性ペプチドまたはペプチド前駆体をコードする配列に隣接する配列を含む。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、１つよりも多くの免疫原性エピトープを含む。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、ＤＮＡに基づくワクチンである。一部の実施形態では、核酸ワクチンは、ＲＮＡに基づくワクチンである。一部の実施形態では、ＲＮＡに基づくワクチンは、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡに基づくワクチンは、ネイキッドｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡに基づくワクチンは、修飾ｍＲＮＡを含む（例えば、プロタミンを使用して分解から保護されているｍＲＮＡ、修飾５’ＣＡＰ構造を含有するｍＲＮＡ、または修飾ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡ）。一部の実施形態では、ＲＮＡに基づくワクチンは、一本鎖ｍＲＮＡを含む。
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であっても、好適なベクターまたは送達系に含有されていてもよい。好適なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または１つよりも多くのウイルスのエレメントを含有するハイブリッドに基づく系などのウイルスが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマー（例えば、カチオン性リポソーム）が挙げられる。
１つまたは複数のネオ抗原ペプチドを、ウイルスに基づく系を使用してｉｎ ｖｉｖｏでコードおよび発現させることができる。ウイルスの感染力を破壊することなく新しい遺伝子が導入されるようにウイルスゲノムの部分が欠失されているウイルスベクターを、本開示における組換えベクターとして使用してもよい。本開示のウイルスベクターは、非病原性ウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳動物の特定の細胞タイプに対して向性を有する。別の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、樹状細胞およびマクロファージなどのプロフェッショナル抗原提示細胞に感染することができる。本開示のさらに別の実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳動物の任意の細胞に感染することができる。ウイルスベクターは、腫瘍細胞にも感染することができる。本開示で使用されるウイルスベクターとしては、これらに限定されないが、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、鶏痘ウイルス、および高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（ＡｎｋａｒａまたはＭＶＡ）などのポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルスなどが挙げられる。
ワクチンは、様々な経路を介して送達することができる。送達経路としては、経口（頬側および舌下を含む）、直腸、鼻、局部、経皮パッチ、肺、膣、坐剤、もしくは非経口（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮内、腹腔内、皮下、および静脈内を含む）投与、またはエアロゾル化、吸入、もしくは吹送による投与に好適な形態のものを挙げることができる。薬物送達系に関する基本情報は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ． （１９９９）に見出すことができる。本明細書に記載のワクチンは、筋肉に投与してもよく、または皮内注射もしくは皮下注射により、またはイオントフォレーシスなどにより経皮的に投与してもよい。ワクチンの表皮投与を用いてもよい。
一部の場合では、ワクチンは、鼻道を介する投与のために製剤化することもできる。担体が固体である場合、経鼻投与に好適な製剤としては、嗅ぎタバコを吸うように、すなわち鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻道を介する急速な吸入により投与される、例えば、約１０～約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗散剤を挙げることができる。製剤は、鼻腔スプレー、点鼻薬であっても、ネブライザーによるエアロゾル投与によるものであってもよい。製剤は、ワクチンの水性または油性溶液を含んでいてもよい。
ワクチンは、懸濁液剤、シロップ剤、またはエリキシル剤などの液体調製物であってもよい。また、ワクチンは、無菌懸濁液剤またはエマルジョン剤など、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射剤投与）のための調製物であってもよい。
ワクチンは、単回免疫化のための材料を含んでいてもよく、または複数回免疫化のための材料を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。複数用量の配合には、保存剤を含めることが好ましい。複数用量組成物に保存剤を含めることの代わりとして（またはそれに加えて）、組成物は、材料の取り出しのための無菌アダプターを有する容器に含有されていてもよい。
ワクチンは、約０．５ｍＬの投薬体積で投与することができるが、子供には半分の用量（すなわち、約０．２５ｍＬ）を投与することができる。ある場合には、ワクチンは、より高い用量、例えば、約１ｍｌで投与することができる。
ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くの用量コースレジメン（ｄｏｓｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）として投与することができる。ある場合には、ワクチンは、１、２、３、または４用量コースレジメンとして投与される。ある場合には、ワクチンは、１用量コースレジメンとして投与される。ある場合には、ワクチンは、２用量コースレジメンとして投与される。
最初の用量および２回目の用量の投与は、約０日、１日、２日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、２か月、４か月、６か月、９か月、１年、１．５年、２年、３年、４年、またはそれよりも長く、隔てられていてもよい。
本明細書に記載のワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも長い年毎に投与してもよい。ある場合には、本明細書に記載のワクチンは、２、３、４、５、６、７またはそれよりも長い年毎に投与される。ある場合には、本明細書に記載のワクチンは、４、５、６、７またはそれよりも長い年毎に投与される。ある場合には、本明細書に記載のワクチンは、一度投与される。
投薬量の例は、限定ではなく、本明細書に記載のワクチンを投与するための特定の投薬レジメンを例示するために使用されているに過ぎない。ヒトに使用するための有効量は、動物モデルから決定することができる。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であることが見出されている循環、肝臓、局所、および／または胃腸管中濃度を達成するように製剤化することができる。当業者であれば、動物データおよび他のタイプの類似データに基づき、ヒトに適切なワクチン組成物の有効量を決定することができる。
作用剤または作用剤の組合せを参照する場合の有効量は、一般に、医学もしくは医薬品分野の種々の規制もしくは諮問機関（ＦＤＡ、ＡＭＡなど）のいずれかにより、または製造業者もしくは供給業者により、推奨または承認されている用量範囲、投与様式、製剤などを意味する。
一部の態様では、本明細書に記載のワクチンおよびキットは、２℃～８℃の間で保管することができる。一部の場合では、ワクチンは、凍結保管されない。一部の場合では、ワクチンは、－２０℃または－８０℃などの温度で保管される。一部の場合では、ワクチンは、日光を避けて保管される。
キット
本明細書に記載のネオ抗原治療薬は、投与の説明書と共にキット形態で提供することができる。典型的には、キットは、容器内の単位剤形の所望のネオ抗原治療薬および投与の説明書を含み得る。また、追加の治療薬、例えば、サイトカイン、リンホカイン、チェックポイント阻害剤、抗体がキットに含まれていてもよい。望ましい場合もあり得る他のキット構成物としては、例えば、無菌注射器、ブースター投薬物、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
また、キットおよび製造品は、本明細書に記載の１つまたは複数の方法で使用するために本明細書で提供される。キットは、１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のネオ抗原性ポリペプチドを含有してもよい。また、キットは、本明細書に記載のペプチドもしくはタンパク質の１つもしくは複数をコードする核酸、本明細書に記載のペプチドの１つもしくは複数を認識する抗体、または本明細書に記載のペプチドの１つもしくは複数で活性化されるＡＰＣに基づく細胞を含有してもよい。キットは、ワクチンの構成および送達に必要なアジュバント、試薬、および緩衝剤をさらに含有してもよい。
また、キットは、バイアルおよびチューブなどの１つまたは複数の容器を受け入れるように区画化されているキャリア、包装、または容器を含んでいてもよく、容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用されるペプチドおよびアジュバントなどの別々の要素の１つを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料で形成されていてもよい。
本明細書で提供される製造品は、包装材料を含有する。医薬品包装材料の例としては、これらに限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択された製剤および意図されている投与様式および処置に好適な任意の包装材料が挙げられる。キットは、典型的には、内容物および／または使用説明が列挙されている標識、ならびに使用説明が記載された添付文書を含む。典型的には、一組の説明書も含まれる。
本開示は、具体的な例によって、より詳細に記載される。以下の実施例は、説明の目的で提供されており、いかなる点においても本開示を限定することを意図するものではない。当業者であれば、変更または改変して、本開示による代替的実施形態を得ることができる様々な非クリティカルパラメーターを容易に認識するだろう。本明細書に列挙されている特許、特許出願、および印刷刊行物はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
これらの実施例は、例示の目的のみで提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞誘導を使用して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞を拡大増殖させる。これらのアッセイのために、成熟プロフェッショナルＡＰＣを以下の方式で調製する。ビーズに基づくキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、単球を健康なヒトドナーＰＢＭＣから富化する。富化した細胞を、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４に播種して、未成熟ＤＣを誘導する。５日後、未成熟ＤＣを、ペプチドのプールと共に３７℃で１時間インキュベートしてから、サイトカイン成熟カクテル（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＰＧＥ１β）を添加する。ペプチドのプールは、複数の突然変異を含んでいてもよく、それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を拡大増殖させるためのショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）およびロングマー（ｌｏｎｇｍｅｒ）を両方とも有する。細胞を３７℃でインキュベートしてＤＣを成熟させる。
ＤＣの成熟後、ＰＢＭＣ（バルクまたはＴ細胞が富化されているかのいずれか）を、増殖サイトカインと共に成熟樹状細胞に添加する。機能アッセイおよび／またはテトラマー染色の組合せを使用して、培養物を、ペプチド特異的Ｔ細胞についてモニターする。修飾ペプチドおよび親ペプチドを用いて並行した免疫原性アッセイにより、ペプチドがペプチド特異的Ｔ細胞を拡大増殖させる相対効率の比較が可能になった。
（実施例２）
テトラマー染色アッセイ
ＭＨＣテトラマーを購入するかオンサイトで製造し、免疫原性アッセイにてペプチド特異的Ｔ細胞の拡大増殖を測定するために使用する。評価のために、テトラマーを、製造業者の説明書に従って、１％ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中の１×１０５細胞に添加する。細胞を室温で２０分間暗所にてインキュベートする。次いで、ＣＤ８などのＴ細胞マーカーに特異的な抗体を、製造業者が示唆する最終濃度になるように添加し、細胞を４℃で２０分間暗所にてインキュベートする。細胞を冷却ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有する緩衝液に再懸濁する。細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）機器で取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の使用により分析する。テトラマー陽性細胞の分析には、前方および側方散乱プロットからリンパ球ゲートを採取する。データは、ＣＤ８＋／テトラマー＋であった細胞のパーセンテージとして報告する。
（実施例３）
細胞内サイトカイン染色アッセイ
抗原特異的Ｔ細胞集団を同定するための十分に確立されたテトラマー染色の非存在下で、抗原特異性は、十分に確立されたフローサイトメトリーアッセイを使用するサイトカイン産生の評価を使用して推定することができる。手短に言えば、Ｔ細胞を、目的のペプチドで刺激し、対照と比較する。刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）を、細胞内染色により評価する。これらのサイトカイン、特にＩＦＮγを使用して、刺激された細胞を同定することができる。図１１は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドで負荷してまたは負荷せずにＡＰＣで刺激した健康なＨＬＡ－Ａ０２：０１ドナーに由来するＣＤ４＋細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルの抗原特異的誘導のＦＡＣＳ解析を示す。
（実施例４）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を単一細胞に基づいて測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ペプチド特異的Ｔ細胞を機能的に数え上げる。標的細胞（Ｔ２またはＨＬＡ－Ａ０２０１をトランスフェクトしたＣ１Ｒ）に、１０μＭペプチドを３７℃で１時間パルスし、３回洗浄した。１×１０５個のペプチドでパルスした標的を、免疫原性培養物から採取した様々な濃度のＴ細胞（５×１０２～２×１０３個）と共に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートウェルで共培養する。プレートを、製造業者のプロトコールに従って発色させ、付属のソフトウェアを用いてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析する。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットを、播種したＴ細胞の数当たりの絶対スポット数として報告する。修飾ペプチドで拡大増殖したＴ細胞を、修飾ペプチドでパルスした標的を認識する能力だけでなく、親ペプチドでパルスした標的を認識する能力についても試験する。図３５は、ＩＦＮγの抗原特異的誘導を示すグラフである。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドをコードするレンチウイルス発現ベクターを疑似形質導入または形質導入した２つの試料のＩＦＮγレベルが示されている。
（実施例５）
ＣＤ１０７染色アッセイ
ＣＤ１０７ａおよびｂは、同族ペプチドによる活性化後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上に発現される。Ｔ細胞の溶解顆粒は、分子ＣＤ１０７ａおよびｂを含むリソソーム関連膜糖タンパク質（「ＬＡＭＰ」）を含有する脂質二重層を有する。細胞傷害性Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して活性化されると、これらの溶解顆粒の膜が動員され、Ｔ細胞の原形質膜と融合する。顆粒内容物が放出され、これが標的細胞の死に結び付く。Ｃ１０７ａおよびｂは、顆粒膜が原形質膜と融合すると細胞表面に露出するため、それらは脱顆粒のマーカーである。ＣＤ１０７ａおよびｂ染色により測定される脱顆粒は、単一細胞に基づいて報告されるため、アッセイは、ペプチド特異的Ｔ細胞を機能的に数え上げるために使用する。アッセイを実施するため、ペプチドを、最終濃度が２０μＭになるようにＨＬＡ－Ａ０２：０１をトランスフェクトした細胞Ｃ１Ｒに添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄した。１×１０５個のペプチドでパルスしたＣ１Ｒ細胞をチューブにアリコートし、ＣＤ１０７ａおよびｂに特異的な抗体を、製造業者（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が示唆する最終濃度になるように添加する。アッセイの経過中一過性に表面に出現する際にＣＤ１０７分子を「捕捉」するために、Ｔ細胞の添加の前に抗体を添加する。次に、免疫原性培養物に由来する１×１０５個のＴ細胞を添加し、試料を３７℃で４時間インキュベートした。Ｔ細胞を、ＣＤ８などの追加の細胞表面分子についてさらに染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得する。付属のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してデータを分析し、結果を、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａおよびｂ＋細胞のパーセンテージとして報告する。図３４は、細胞傷害性マーカーＣＤ１０７ａの抗原特異的誘導を示すグラフである。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドをコードするレンチウイルス発現ベクターを疑似形質導入または形質導入した２つの試料の総ＣＤ８＋細胞中のＣＤ１０７ａ＋細胞パーセントが示されている。
（実施例６）
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害活性を、方法１または方法２を使用して測定する。方法１は、クロム放出アッセイを伴う。標的Ｔ２細胞を３７℃にて１時間Ｎａ５１Ｃｒで標識し、洗浄する。次いで、５×１０３個の標的Ｔ２細胞を、免疫原性培養物に由来する様々な数のＴ細胞に添加する。３７℃での４時間のインキュベーションの後で回収した上清中のクロム放出を測定する。特異的溶解のパーセンテージを、以下のように算出する。
方程式１０． 実験放出－自然放出／放出合計－自然放出×１００
方法２では、フローサイトメトリーによる標的細胞内の切断されたカスパーゼ３の検出により、細胞傷害活性を測定する。標的がん細胞を、操作して、適切なＭＨＣ－Ｉアレルと共に、突然変異型ペプチドを発現させる。疑似形質導入した標的細胞（すなわち、突然変異型ペプチドを発現していない）を、陰性対照として使用する。細胞をＣＦＳＥで標識して、エフェクター細胞として使用される刺激ＰＢＭＣと区別する。標的およびエフェクター細胞を６時間共培養してから、回収する。細胞内染色を実施して、ＣＦＳＥ陽性標的がん細胞内のカスパーゼ３の切断型を検出する。特異的溶解のパーセンテージを、以下のように算出する。
方程式１１． カスパーゼ３の実験切断／カスパーゼ３の自然切断（突然変異型ペプチド発現の非存在下で測定される）×１００
方法２の細胞傷害性アッセイは、本明細書の実施例２５の材料および方法セクションに提供されている。
（実施例７）
ロングマーおよびショートマーを逐次的に使用したｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強
ロングマーペプチドでのワクチン接種は、ペプチドのプロセシングおよび提示に応じて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導することができる。最小ショートマーエピトープによるワクチン接種は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することに集中するが、抗原提示前のペプチドプロセシングを必要としない。そのため、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）だけでなく、任意の細胞がエピトープを容易に提示することができる。これは、末梢性寛容の一部として、抗原を提示する健康な細胞に接触するＴ細胞の寛容に結び付く場合がある。これを回避するために、ロングマーよる初期免疫化は、ペプチドをプロセシングおよび提示することができるＡＰＣによってのみ、ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを可能にする。その後の免疫化は、初期ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をブーストする。
ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性アッセイ
１９匹の８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、到着時にランダムに、かつ前向きに処置群に割り当てた。動物を、研究開始前に３日間順化させた。動物は、ＬａｂＤｉｅｔ（商標）５０５３滅菌げっ歯動物餌で維持し、滅菌水を自由に提供した。群１の動物は、ワクチン接種アジュバントのみの対照として役目を果たし、０、７、および１４日目に皮下注射（ｓ．ｃ．）により０．１ｍＬの体積で１００μｇのポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）単独を投与した。群２の動物には、６つのロングマーペプチド（下に記載）の各々５０μｇを、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、０、７、および１４日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与した。群３の動物には、６つのロングマーペプチド（下に記載）の各々５０μｇを、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、０日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与し、モル一致当量の対応するショートマーペプチド（下に記載）を、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、７および１４日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与した。動物を、毎日計量し、全体的な健康をモニターした。研究終了２１日目に、動物が０日目の体重と比較してその体重の＞３０％を喪失した場合、または動物が瀕死であると見出された場合、動物をＣＯ２過剰投与により安楽死させた。屠殺時に、脾臓を回収し、標準的プロトコールを使用して単一細胞懸濁液へと加工した。手短に言えば、脾臓を７０μＭフィルターに通して機械的に分解し、ペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶解してから、細胞培養培地に再懸濁した。
ペプチド
６つの以前に同定されたマウスネオ抗原を、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するそれらの実証されている能力に基づいて使用した。各ネオ抗原について、最小エピトープに対応するショートマー（８～１１個のアミノ酸）が画定されている。突然変異周囲の２０～２７個のアミノ酸に対応するロングマーを使用した。
ＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴ分析（マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｓｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ；ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、キットプロトコールに従って実施した。手短に言えば、分析日の前日に、９６ウェルフィルタープレート（０．４５μｍの孔径の疎水性ＰＶＤＦ膜；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を活性化し（３５％ＥｔＯＨ）、洗浄し（ＰＢＳ）、捕捉抗体でコーティングした（１：２５０；４℃ Ｏ／Ｎ）。分析日に、ウェルを洗浄し、ブロッキングした（培地；３７℃で２時間）。１００μＬ中およそ２×１０５個の細胞を、１００μＬの１０ｍＭ試験ペプチドプール（ショートマー）、またはＰＭＡ／イオノマイシン陽性対照抗原、またはビヒクルと共にウェルに添加した。細胞を、抗原と共に３７℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートした。翌日、細胞懸濁液を廃棄し、ウェルをＰＢＳで１回および脱イオン水で２回洗浄した。アッセイの残りのすべての洗浄ステップでは、ウェルが各洗浄ステップで３分間浸漬されることを可能にした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で３回洗浄し、検出抗体（１：２５０）をすべてのウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。検出抗体溶液を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。アビジン－ＨＲＰ（１：２５０）をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。コンジュゲート溶液を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で３回、次いでＰＢＳで１回洗浄した。基質（３－アミノ－９－エチル－カルバゾール、０．１Ｍ酢酸緩衝液、Ｈ２Ｏ２）をすべてのウェルに添加し、スポット発色をモニターした（およそ１０分間）。ウェルを水で洗浄することにより基質反応を停止させ、プレートを一晩空気乾燥させた。プレートを、付属のソフトウェアを用いてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析した。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットを、播種したＴ細胞の１個当たりの絶対スポット数として報告する。
（実施例８）
質量分析によるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの検出
２９３Ｔ細胞に、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦによりコードされるペプチドの種々の領域をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列によりコードされるペプチドを発現する５０００万～７億個の形質導入した細胞を培養し、酸洗浄を使用してペプチドをＨＬＡ－ペプチド複合体から溶出させた。次いで、溶出したペプチドをＭＳ／ＭＳで分析した。ＨＬＡ－Ａ０２：０１タンパク質を発現する２９３Ｔ細胞の場合、ペプチドＶＬＰＥＰＨＬＡＬ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、およびＭＬＴＧＰＰＡＲＶが質量分析により検出された（図５）。ＨＬＡ－Ｂ０７：０２タンパク質を発現する２９３Ｔ細胞の場合、ペプチドＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬが質量分析により検出された（図５）。ＨＬＡ－Ｂ０８：０１タンパク質を発現する２９３Ｔ細胞の場合、ペプチドＥＳＫＩＭＦＡＴＬが質量分析により検出された（図５）。
（実施例９）
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、複数のアレルに強力なエピトープを産生する。
下記の表４のネオエピトープを含有する複数のペプチドを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現させるかまたは負荷した。次いで、質量分析を実施し、表記のＨＬＡアレルに対するネオエピトープの親和性、およびＨＬＡアレルとのネオエピトープの安定性を決定した。
表４は、複数のアレルでの例示的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ産生エピトープを列挙している
（実施例１０）
複数のネオエピトープがＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する
ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の誘導を実施した。Ｔ細胞製造後にＣＤ８＋Ｔ細胞誘導を分析した。分析のために様々な時点で細胞試料を採取することができる。ｐＭＨＣマルチマーを使用して、誘導培養における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をモニターした。図９Ａ～９Ｃおよび１０Ａ～１０Ｂは、それぞれ、ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶおよびＭＬＴＧＰＰＡＲＶで誘導した抗原特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の割合を示す例示的な結果を示す。図９Ａは、刺激または誘導後にフローサイトメトリーにより分析したＭＬＴＧＰＰＡＲＶペプチドに応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す、６人の異なる健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイの例示的な結果を示す。抗原特異的Ｔ細胞の割合の増加が観察された。図９Ｂは、刺激または誘導後にフローサイトメトリーにより分析したＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶペプチドに応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す、健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイの例示的な結果を示す。抗原特異的Ｔ細胞の割合の増加が観察された。試験した５人の健康なドナーのうち、４人は、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶペプチドに応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加を示した。３人の異なる健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイは、３人のドナーのうち１人において、刺激または誘導後にフローサイトメトリーにより分析したＶＬＰＥＰＨＬＡＬペプチドに応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加を示した。図９Ｃは、刺激または誘導後にフローサイトメトリーにより分析したＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＫＩＭＦＡＴＬＱＲ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ＫＰＫＲＤＧＹＭＦ、またはＥＳＫＩＭＦＡＴＬペプチドに応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０３：０１、ＨＬＡ－Ａ１１：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、およびＨＬＡ－Ｂ０８：０１の健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイの例示的な結果を示す。図１０Ａは、刺激ペプチドＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ（最小エピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬを分析）に応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２の健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイの例示的な結果を示す。図１０Ｂは、刺激ペプチドＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ（最小エピトープＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶおよびＭＬＴＧＰＰＡＲＶを分析）に応答した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す、ＨＬＡ－Ａ０２：０１の健康なドナーに由来するＰＢＭＣを使用したＴ細胞応答アッセイの例示的な結果を示す。
（実施例１１）
誘導されたＴ細胞の細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイを使用して、誘導されたＴ細胞培養物が抗原発現腫瘍系を死滅させることができるか否かを評価した。この実施例では、生および死腫瘍細胞での活性カスパーゼ３での発現を測定して、早期細胞死および死腫瘍細胞を定量化した。図３３では、誘導されたＣＤ８＋応答は、抗原発現腫瘍標的を死滅させることが可能であった。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドをコードするレンチウイルス発現ベクターを疑似形質導入または形質導入した２つの試料の生カスパーゼ－Ａ陽性標的細胞のパーセントが示されている。
（実施例１２）
ペプチド合成
下記の表５のペプチドが合成され、精製された。予測されたおよび決定された分子量が示されている。表記のペプチドの粗純度および最終純度も示されている。
表５
（実施例１３）
合成ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドの溶解度試験
下記の表６の各ペプチドの溶解度を、種々の表記の溶液で試験した。ＳＳ＝コハク酸ナトリウム。試験した製剤Ａは、Ｄ５Ｗ中に４％ＤＭＳＯ、５ｍＭコハク酸ナトリウム（ＳＳ）を含んでいた。試験した製剤Ｂは、ＤＭＳＯを含まず、Ｄ５Ｗ中に５ｍＭ ＳＳを含んでいた。試験した製剤Ｃは、ＤＭＳＯを含まず、Ｄ５Ｗ中に０．２５ｍＭ ＳＳを含んでいた。２つのシステインを含有する３３量体Ｌ１５の合成は、配列中のＥＳ、ＡＴ、ＳＳの側鎖のコンジュゲーションにより、シュードプロリン構造単位を作出することにより使用して実施した。これにより、Ｌ１５を９５％の純度に精製し、固相ペプチド合成中の凝集を防止することが可能になった。
下記の表６はペプチド溶解度を列挙している
（実施例１４）
対象への投与のための合成ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドのプールの設計
表記のＧＡＴＡ３ペプチドの種々のプールを、下記の表７に従って設計した。例えば、「設計１」は、３つのペプチドプールを含有し、プール１は３つのペプチド（すなわち、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１４）を含有し、プール２は２つのペプチド（すなわち、Ｌ９およびＬ１０ｃ）を含有し、プール３は２つのペプチド（すなわち、Ｌ１５およびＬ１１ｆ）を含有する。例えば、「設計６」は、２つのペプチドプールを含有し、プール１は４つのペプチド（すなわち、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１４）を含有し、プール２は２つのペプチド（すなわち、Ｌ１５およびＬ１１ｆ）を含有する。例えば、「設計１０」は、４つのペプチドプールを含有し、プール１は５つのペプチド（すなわち、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、およびＬ１４）を含有し、プール２は１つのペプチド（すなわち、Ｌ１５）を含有し、プール３は１つのペプチド（すなわち、Ｌ１１ｆ）を含有し、プール４は１つのペプチド（すなわち、Ｌ１１ｉ）を含有する。プール内の各ペプチドの濃度は、ペプチド製剤を調製する当業者に従って変更することができる。下記の表７には、ＧＡＴＡ３プールの設計の説明が列挙されている。
表７
（実施例１５）
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチド合成
７００ｍｇの粗材料を標的として従来の合成を実施する。適切な側鎖保護を有する以下のＦｍｏｃ－アミノ酸を、Ｌ７ペプチド（ＥＰＣＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ）の構築に使用した：Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、およびＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ。Ｃ末端ヒスチジンを、Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－２Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂またはＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ樹脂のいずれかを使用することによって樹脂に事前負荷することにより配列に組み込んた。アスパルタミド（ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）形成を最小限に抑えるために「ＤＧ」の配列組合せを用いるなど、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨを使用して、合成の向上を支援することができる。
ペプチド配列をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で膨潤させ、２回排液した。合成は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して、混合のために窒素を分注しながらＮ－α－ＦＭＯＣ保護基の脱保護から開始した。廃液後、樹脂をＤＭＦで洗浄した。次に、０．４Ｍアミノ酸溶液を、０．４Ｍ ＨＣＴＵおよび０．８Ｍ ＤＩＥＡと共に添加した。混合のために窒素を分注しながらカップリング反応を実行し、続いて反応容器（ＲＶ）を排液した。アミノ酸、ＨＣＴＵ、およびＤＩＥＡの添加を、最初のカップリングステップと同じ混合および排液パラメーターを用いてダブルカップリングサイクルで繰り返した。次いで、樹脂をＤＭＦで再び洗浄した。このサイクルを、すべてのアミノ酸残基に対して繰り返した。最終脱保護法により、Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２０％のピペリジンにより除去し、樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。樹脂は、取り出すまで窒素下で機器に入れたままにした。
マイクロ波合成の場合、同じＦｍｏｃ－アミノ酸出発材料を使用し、（Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－２Ｃｌ Ｔｒｔ樹脂ではなく）Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ樹脂のみを利用してＣ末端ヒスチジンを組み込んだ。
マイクロ波合成機にて、樹脂をＤＭＦで膨潤させてから、ＨＴラインを介してマイクロ波反応容器（ＲＶ）に移した。ＲＶにある間、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ負荷樹脂をＤＭＦ中２５％ピロリジンで処理して、８５℃／９０Ｗ、続いて１００℃／２０Ｗ下でＮ－α－ＦＭＯＣを除去した。次に、ＲＶを排液し、ＤＭＦで洗浄し、再び排液した。プログラムされたＦｍｏｃ－アミノ酸を、４Ｍ ＤＩＣおよび０．２５Ｍ Ｏｘｙｍａｐｕｒｅと共にＲＶに添加した（ＤＭＦ中０．５Ｍ）。このカップリング反応後に、１０５℃／２８８Ｗ加熱、続いて１０５℃／７３Ｗ加熱を行った。この最初の脱保護では、まずＤＭＦで希釈したが、ＲＶにはカップリング反応に由来するＤＭＦがすでに含有されていたため、このステップは、いかなるその後の脱保護でも必要ではなかった。ペプチドが合成されるまで、脱保護、洗浄、およびカップリングのサイクルを各残基に対して繰り返した。アルギニン残基の場合、ダブルカップリングステップを実施し、その場合、シングルカップリングを実施した後に、溶液を排液し、カップリングステップを繰り返してから脱保護に進んだ。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の最終脱保護は、排液し、ＤＭＦで２回洗浄してから、ＤＭＦにより元のＨＴ樹脂位置に移し戻すことを除いて、上記と同様に実施した。
合成後、ＤＭＦを使用して樹脂をフリット注射器に移し、ＭｅＯＨですすぎ、真空マニホールドを使用して乾燥させた。次いで、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％水、５％チオアニソール、５％フェノール、および２．５％エタンジチオール）を使用し、往復振とう機上の直立ホルダーを使用して、樹脂を室温で３時間切断した。
次いで、切断カクテルを、濾過注射器フリットを介して冷却ジエチルエーテルまたは冷却メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に分注した。次いで、各注射器を、撹拌により９５：５トリフルオロ酢酸：水の溶液ですすいだ。次いで、すすぎ液を、カクテル／エーテル混合物の残りに添加した。次いで、混合物を遠心分離した。エーテルをデカントした後、別の冷却エーテル洗浄液を添加した。容器をボルテックスし、再び遠心分離した。これを繰り返してペレットをよくすすいだ。最終洗浄液をデカントし、ペレットを真空デシケーターにより乾燥させた。ペレットの試料を溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、水、またはアセトニトリル）に溶解し、ＵＰＬＣ－ＭＳにより同一性、粗純度、および滞留時間を分析した。他のペプチド、例えば、Ｌ１４（ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨ）、Ｌ８（ＧＰＰＡＲＶＰＡＶＰＦＤＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤ）、Ｌ１０ｃ（ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ）、Ｌ１１ｈ（ＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲ）、およびＬ１１ｉ（ＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬ）を、それらの配列に特異的なアミノ酸および事前負荷樹脂を使用して同様の形式で作製した。
（実施例１６）
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチド合成
以下のＦｍｏｃ－アミノ酸を、ペプチドＬ１５（ＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩＭＦＡＴＬＱＲＳＳＬＷＣＬＣＳＮＨ）を合成するのに使用した：Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、およびＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ。Ｃ末端ヒスチジンを、Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－２Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂またはＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ樹脂のいずれかを使用することによって樹脂に事前負荷することにより配列に組み込んだ。アスパルタミド形成を最小限に抑えるために「ＤＧ」の配列組合せを用いるなど、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの代わりにＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨを使用して、合成の向上を支援することができる。セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）およびスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）残基が存在する場合、「ＳＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、「ＡＴ」の代わりにＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、および「ＥＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨなどのアミノ酸ジペプチド（シュードプロリン）を組み込んで合成収率を向上させた。Ｌ１５の一部の合成では、３つのシュードプロリンすべて（すなわち、「ＳＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、「ＡＴ」の代わりにＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ、および「ＥＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ）の組合せを使用した。Ｌ１５の他の合成では、それぞれ、以下のペスドプロリン（ｐｅｓｕｄｏｐｒｏｌｉｎｅ）およびシュードプロリンの組合せを使用した：「ＡＴ」の代わりにＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨおよび「ＥＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ；「ＳＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨおよび「ＥＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ；「ＳＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨおよび「ＡＴ」の代わりにＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ；「ＡＴ」の代わりにＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｔｈｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ；「ＥＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ）；ならびに「ＳＳ」の代わりにＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）－ＯＨ。
ペプチド配列をＤＭＦで膨潤させ、２回排液した。合成は、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して、混合のために窒素を分注しながらＮ－α－Ｆｍｏｃ基の脱保護から開始した。廃液後、樹脂をＤＭＦで洗浄した。次に、０．４Ｍアミノ酸溶液を、０．４Ｍ ＨＣＴＵおよび０．８Ｍ ＤＩＥＡと共に添加した。混合のために窒素を分注しながらカップリング反応を実施し、続いて反応容器（ＲＶ）を排液した。アミノ酸、ＨＣＴＵ、およびＤＩＥＡの添加を、最初のカップリングステップと同じ混合および排液パラメーターを用いてダブルカップリングサイクルで繰り返した。次いで、樹脂をＤＭＦで再び洗浄した。このサイクルを、すべてのアミノ酸残基に対して繰り返した。最終脱保護法により、Ｎ末端ＦｍｏｃをＤＭＦ中２０％ピペリジンにより除去し、樹脂をＤＭＦで洗浄し、続いてＭｅＯＨで洗浄した。樹脂は、取り出すまで窒素のカバー下で機器に入れたままにした。
マイクロ波合成の場合、同じアミノ酸出発材料を使用し、（Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－２Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂ではなく）Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ樹脂のみを利用してＣ末端ヒスチジンを組み込んだ。
マイクロ波合成機にて、樹脂をＤＭＦで膨潤させてから、ＨＴラインを介してマイクロ波反応容器（ＲＶ）に移した。ＲＶにある間、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）負荷樹脂をＤＭＦ中２５％ピロリジンで処理して、８５℃／９０Ｗ、続いて１００℃／２０Ｗ下でＮ－α－Ｆｍｏｃを除去した。この最初の脱保護では、まずＤＭＦで希釈したが、ＲＶにはカップリング反応に由来するＤＭＦがすでに含有されていたため、このステップは、いかなるその後の脱保護でも必要ではなかった。次に、ＲＶを排液し、ＤＭＦで洗浄し、再び排液した。次いで、プログラムされたＦｍｏｃ－アミノ酸を、４Ｍ ＤＩＣおよび０．２５Ｍ Ｏｘｙｍａｐｕｒｅと共にＲＶに添加した（ＤＭＦ中０．５Ｍ）。このカップリング反応後に、１０５℃／２８８Ｗ加熱、続いて１０５℃／７３Ｗ加熱を行った。ペプチドが合成されるまで、脱保護、洗浄、およびカップリングのサイクルを各残基に対して繰り返した。アルギニン残基の場合、ダブルカップリングステップが存在し、その場合、シングルカップリングを実施した後に、溶液を排液し、カップリングステップを繰り返してから脱保護に進んだ。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の最終脱保護は、排液し、ＤＭＦで２回洗浄してから、ＤＭＦにより元のＨＴ樹脂位置に移し戻すことを除いて、すべての他の脱保護ステップと同じく実施した。
合成後、ＤＭＦを使用して樹脂をフリット注射器に移し、ＭｅＯＨですすぎ、真空マニホールドを使用して乾燥させた。次いで、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％水、５％チオアニソール、５％フェノール、および２．５％エタンジチオール）を使用し、往復振とう機上の直立ホルダーを使用して、樹脂を室温で切断した。
次いで、切断カクテルを、濾過注射器フリットを介して冷却ジエチルエーテルまたは（または冷却ＭＴＢＥ）に分注した。次いで、各注射器を、撹拌により９５：５トリフルオロ酢酸：水の溶液ですすいだ。次いで、すすぎ液を、カクテル／エーテル混合物の残りに添加した。次いで、混合物を遠心分離した。エーテルをデカントした後、別の冷却エーテル洗浄液を添加した。容器をボルテックスし、再び遠心分離した。これを繰り返してペレットをよくすすいだ。最終洗浄液をデカントし、ペレットを真空デシケーターにより乾燥させた。ペレットの試料を溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、水、またはアセトニトリル）に溶解し、ＵＰＬＣ－ＭＳにより同一性、粗純度、および滞留時間を分析した。
他のペプチド、例えば、Ｌ９（ＬＨＦＣＲＳＳＩＭＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬＫＡＥＳＫＩ）を、それらの配列に特異的なアミノ酸および事前負荷樹脂、ならびにセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）またはスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）残基が存在するシュードプロリン誘導体および上記のようなＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）－ＯＨを使用して、類似の形式で作製した。
（実施例１７）
溶解度研究
ネオエピトープを有するいくつかのＧＡＴＡ３ペプチドを、まず、４％ＤＭＳＯ有りのＤ５Ｗ中５ｍＭコハク酸ナトリウム（ＳＳ）を使用して溶解度について試験した。初期の結果に基づきコハク酸ナトリウム（ＳＳ）濃度およびＤＭＳＯ量を調整することにより製剤戦略を向上させた。それにより７つのペプチドの選択に至った。これらのペプチドのプール化戦略を、溶解度およびポリＩＣＬＣとの適合性について決定した。これらの結果に基づき、３つのプールを選択した。Ｄ５Ｗ中０．２５ｍＭ ＳＳにペプチドが各々１つしかない２つのプール、およびＤ５Ｗ中５ｍＭ ＳＳに５つのペプチドを有する第３のプール。ポリＩＣＬＣと組み合わせた後のプールのｐＨはすべてｐＨ５．０～６．０であり、濾過中の喪失は最小限であった。
以下の研究のためにスクリーニングしたペプチドはすべて表８に列挙されている。
表８
緩衝液はすべての毎日調製した。Ｄ５Ｗは、デキストロースを秤量し、デキストロースにｍｉｌｌｉＱ水を添加して、適切な体積に到達させることにより調製した。例えば、１２．５ｇのデキストロースに水を添加して総体積を２５０ｍＬに到達させた。秤量することによって５０ｍＬのＤ５Ｗ中５ｍＭ ＳＳを調製するために、６７．５４ｍｇのＳＳを秤量し、Ｄ５Ｗに添加して総体積を５０ｍＬに到達させた。Ｄ５Ｗ中０．２５ｍＭ ＳＳを調製するために、２．５ｍＬのＤ５Ｗ中５ｍＭ ＳＳを、４７．５ｍＬのＤ５Ｗで希釈した。
各ペプチドのペプチド含有量％を以下のように決定した：総ＴＦＡ理論値は、正電荷（Ｎ末端、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓ）の数の合計に等しい。その数を以下の方程式に代入した。式中、ＭＷはペプチドの分子量である。
方程式１． ＴＦＡ％＝１００＊（（ＴＦＡ％＊１１４．０２）／（（ＴＦＡ％＊１１４．０２）＋ＭＷ））
次いで、含水量理論値として６．４５％を使用してペプチド含有量パーセントを算出するためにこの値を使用した。
方程式２． ペプチド％＝１００－ＴＦＡ％－６．４５％
これらの実験の標的総重量は、以下の方程式を使用して算出した。
方程式３． 標的総重量＝（１３．２＊１００００）／（ペプチド含有量％＊純度％）
ペプチドを、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＸＰ１０５ Ｄｅｌｔａ Ｍａｓｓ分析天びんを使用して１５ｍＬまたは５０ｍＬコニカルチューブに秤量し、実際の総重量を記録し、５０ｍｇ／ｍＬを得るためのＤＭＳＯの量を決定するために使用した。計算を下記に示す。
方程式４． ＤＭＳＯ（μＬ）＝（実際の総重量（ｍｇ）＊２６４μｌ）／（標的総重量（ｍｇ））
次いで、ストックを、適切な製剤緩衝液中で２ｍｇ／ｍＬＬに希釈した（１部のＤＭＳＯストック、２４部の緩衝液）。
ペプチド重量および含有量パーセントを上記のように算出し、適切な緩衝液をペプチドに直接添加した。方程式３を使用して標的総重量を算出し、２ｍｇ／ｍＬペプチドを得るために使用される緩衝液の体積を方程式５を使用して算出した。
方程式５． 緩衝液（ｍｌ）＝（実際の総重量（ｍｇ）＊６．６ｍＬ）／（標的総重量（ｍｇ））
ペプチドを緩衝液で１：４にさらに希釈して０．４ｍｇ／ｍＬを得るか、または表記されている場合のみ、緩衝液を乾燥ペプチドに直接添加して０．４ｍｇ／ｍＬを得た。後者の場合、方程式６を使用して添加する適切な体積を決定した。
方程式６． 緩衝液（ｍｌ）＝（実際の総重量（ｍｇ）＊３３ｍＬ）／（標的総重量（ｍｇ））
ペプチドは、それらを超音波処理またはボルテックスすることによってではなく、コニカルチューブを逆さまにすることにより溶解させた。
５つのペプチドをプールするために、各２ｍｇ／ｍＬストックの等体積を組み合わせて、０．４ｍｇ／ｍＬの各ペプチドを得た。５つ未満のペプチドを有するプールの場合、等体積のペプチドを組み合わせ、次いで溶液を適切な緩衝液で希釈して、０．４ｍｇ／ｍＬの各ペプチドを得た。プールを３～５回逆さまにして混合した。製剤化されたペプチドをガラスバイアルに移して、溶解度を視覚化した。２時間毎に写真を撮影して、あらゆる外観の変化を記録した。
ポリＩＣＬＣは商業的に入手した。プールは、３：１のペプチドのポリＩＣＬＣに対する比で、１５０μＬのポリＩＣＬＣを使用して４５０μＬのペプチドプールと２ｍＬガラスバイアルにて組み合わせた。溶液を３～５回逆さまにして混合し、６時間、２時間毎に写真を撮影して、あらゆる外観の変化を記録した。ｐＨ測定はすべて、使用前に毎日較正したＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ｉｎＬａｂ Ｍｉｃｒｏ ｐＨメーターを使用して行った。分析している試料の１００μＬを取り出し、マイクロ遠心分離チューブに添加してｐＨを測定した。次いで、試料を廃棄した。ＵＰＬＣ－ＭＳ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＱＤａ質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ）により試料を分析した。各サンプルの２μＬ注射を、１０：９０溶媒Ａ：Ｂから５０：５０溶媒Ａ：Ｂ（Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ：０．１％ＴＦＡ：アセトニトリル）までの８分間勾配を使用して二連で分析した。標準製剤中のペプチドの初期溶解度を、０．４ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬの各ペプチドについて決定した。写真を撮影したが、ゲルは透明であることが多かった、またはペプチドは溶解すると小さなガラス状粒子であったため、写真は、必ずしも明確に溶解度を示すとは限らなかった。４％ＤＭＳＯ有りの５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗにおけるペプチド溶解度を表９に示す。下記の表９は、４％ＤＭＳＯ有りの５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗでのペプチド溶解度および観察を列挙している
５ｍＭ ＳＳに不溶性であったペプチドを、４％ＤＭＳＯ有りのＤ５Ｗ中０．２５ｍＭ
ＳＳを使用して試験した。結果は、表１０に要約されている。５ｍＭ ＳＳに不溶性であったペプチドの多くは、６時間後に、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で４％ＤＭＳＯ有りの０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗに可溶性であり、さらなる研究ではこのより低いＳＳ濃度を使用して試験した。
表１０は、４％ＤＭＳＯ有りの０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗでのペプチド溶解度および観察を列挙している
これらの結果に基づき、ペプチドＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１４、Ｌ１０ｃ、Ｌ１１ｄ、Ｌ１１ｆ、およびＬ１５を、製剤研究のために選択した。ＤＭＳＯ無しの製剤を、製剤化されたペプチドの安定性を向上させ、システイン含有ペプチドの二量体化を遅延させるための方式として試験した。濃度が０．２５ｍＭ ＳＳ中０．４ｍｇ／ｍＬの試験したペプチド（Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１４、Ｌ１０ｃ、Ｌ１１ｄ、Ｌ１１ｆ、およびＬ１５）はすべて、ＤＭＳＯ無しで６時間後に可溶性であった。ペプチドＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、Ｌ１２ｄ、およびＬ１４を、５ｍＭ ＳＳ中で試験し、同様に６時間後にＤＭＳＯ無しで可溶性であった。０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗおよび５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中のペプチド製剤のｐＨ値は、表１１に列挙されている。
下記の表１１は、０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗおよび５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中の０．４ｍｇ／ｍＬペプチド製剤のｐＨを示す
表１１に報告されているペプチドはすべて、０．２５ｍＭ ＳＳに可溶性であったため、より低いＳＳ濃度を使用して初期プール設計を研究した。プールは、個々の溶解度も念頭に置いて設計した。Ｌ１５およびＬ１１ｆは、低ＳＳに可溶性であったため、それら２つのペプチドを一緒にプールした。最初の３つのプール設計を表１２に示す。
下記の表１２は、０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中の初期ペプチドプールを示す
ペプチドはすべて、プールした後も可溶性のままであった。ポリＩＣＬＣを添加したまたは添加しないペプチドプールのｐＨ値を表１３に示す。
下記の表１３は、ポリＩＣＬＣを添加したまたは添加しない表１２のペプチドプールのｐＨを列挙している
次いで、各設計のプールをポリＩＣＬＣと混合して、アジュバントとの適合性を試験した。プール３およびペプチドＬ１０ｃを含有するすべてのプールは、ポリＩＣＬＣと組み合わせると沈殿した。加えて、３つのペプチドを有するプールは、ポリＩＣＬＣと組み合わせると５．０未満のｐＨを有し、これは、プールが２つよりも多くのペプチドを含有する場合、緩衝能力をより高くするべきであることを示唆する。
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、およびＬ１４はすべて、５ｍＭ ＳＳに可溶性であるため、それらを高ＳＳ濃度を有するプールで試験した。これらの５つのペプチドを用いて３つのプールを試験した。１つのプールはＬ１０ｃを有しておらず、１つはＬ１０ｃ単独を有し、３つ目は５つのペプチドすべてを有していた。Ｌ１１ｆおよびＬ１５は、このより高い濃度では可溶性でなかったため、０．２５ｍＭ ＳＳで製剤化した。しかしながら、沈殿が観察されたため、単一プールではなく、別々に０．４ｍｇ／ｍＬに製剤化した。ペプチドの各々は、それぞれの製剤に可溶性であった。これらのプールは、視覚化に基づきポリＩＣＬＣとも適合性であり、プールをポリＩＣＬＣと組み合わせた後のｐＨ値はすべて５．０～６．３の間であり（表１４）、これは、皮下注射に適切である。
表１４は、ポリＩＣＬＣ無しのペプチドプールのｐＨ対ポリＩＣＬＣ有りのペプチドプールのｐＨを列挙している
ペプチドＬ１１ｉを、ＤＭＳＯ無しの種々のコハク酸塩濃度を有するＤ５Ｗ中で試験した。ペプチドは、０．４ｍｇ／ｍＬではすべてのＳＳ濃度で可溶性であると考えられた。より高いＳＳ濃度では、２ｍｇ／ｍＬでいくらかの沈殿が観察された。試料はすべて、ポリＩＣＬＣと組み合わせても同じであるように見えた。ポリＩＣＬＣ無しの０．２５ｍＭ
ＳＳ、０．５ｍＭ ＳＳ、または５ｍＭ ＳＳ中の２ｍｇ／ｍＬまたは０．４ｍｇ／ｍＬペプチドＬ１１ｉ、およびポリＩＣＬＣ有りの０．２５ｍＭ ＳＳ、０．５ｍＭ ＳＳ、または５ｍＭ ＳＳ中の０．４ｍｇ／ｍＬペプチドＬ１１ｉの製剤のｐＨ値を表１５に示す。
表１５は、ポリＩＣＬＣ無しの０．２５ｍＭ ＳＳ、０．５ｍＭ ＳＳ、および５ｍＭ ＳＳ中の２ｍｇ／ｍＬまたは０．４ｍｇ／ｍＬ Ｌ１１ｉペプチド、ならびにポリＩＣＬＣ有りの０．２５ｍＭ ＳＳ、０．５ｍＭ ＳＳ、および５ｍＭ ＳＳ中の０．４ｍｇ／ｍＬのｐＨを列挙している
結果に基づいて最終的に決定されたプールには、プール１（５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中のＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、およびＬ１４）、プール２（０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中のＬ１１ｉまたはＬ１１ｆのいずれか）、およびプール３（０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中のＬ１５）が含まれていた。これらのプールの各々を、Ｐａｌｌ製０．２μｍフィルター（ＨＰ１００２）での保持について試験した。事前に濾過した試料ならびに２回濾過の各々の後の試料を、ＵＰＬＣ－ＭＳにより分析した。Ｌ１１ｆおよびＬ１１ｉの３％未満が最初の濾過ステップ後に失われ、２回目の濾過ステップ後には追加のペプチドは失われなかった。わずか４．９％のＬ１５が最初の濾過後に失われ、次いで、１．３％が２回目の濾過後に失われた。プール１の各ペプチドの合計３％未満が、２回の濾過ステップ後に失われた。
結論
一連の有望なＧＡＴＡ３ペプチドを、４％ＤＭＳＯ有りの５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗを含有する製剤緩衝液中での溶解度について試験した。５ｍＭ ＳＳに不溶性のペプチドも、より低いＳＳ濃度で試験した。これらの結果に基づき７つのペプチドを選択し、そのうちの５つは、５ｍＭ ＳＳに可溶性であり（Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、およびＬ１４）、他のものは、より低い濃度で可溶性であった（Ｌ１１ｆ、Ｌ１１ｉ、およびＬ１５）。ＤＭＳＯの除去も試験した。ＤＭＳＯの除去は、溶解度を向上させ、ＵＰＬＣ分析をより困難にする場合があるジスルフィド形成を遅延させることができる。選択したペプチドの各々は、ＤＭＳＯ無しで可溶性であった。
溶解度の結果に基づき、０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗを使用して３つのプール設計を生成した。プールは可溶性であったが、一部は、ポリＩＣＬＣと適合性ではなかった。一部の場合では、Ｌ１０ｃを含有するプールをポリＩＣＬＣと混合すると沈殿が観察された。Ｌ１１ｆおよびＬ１５の両方を含有するプールをポリＩＣＬＣと組み合わせた場合でも、同じ観察がなされた。これらの結果に基づき、第４のセットのプールを設計した。第１のプールは、５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗ中にＬ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０ｃ、およびＬ１４を含有し、ポリＩＣＬＣと適合性であった。ペプチドＬ１５およびＬ１１ｆまたはＬ１１ｉを、０．２５ｍＭ ＳＳ／Ｄ５Ｗを用いて直接溶解して０．４ｍｇ／ｍＬにすることにより調製される個々のペプチドとして維持した。これらのプールはすべて、ポリＩＣＬＣと混合した場合ｐＨ５．０よりも高く、これは、皮下注射に許容される。
（実施例１８）
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異の出現率
この実施例では、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異の出現率および翻訳の証拠を特徴付ける。ワクチンは、この遺伝子のある特定のフレームシフト突然変異を内包する細胞にのみ存在するＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）の新規オープンリーディングフレームにわたる長鎖ペプチドのプールで構成されている。フレームシフト突然変異の開始位置に応じて、得られるオープンリーディングフレームは長さが様々であり得るが、それらはすべて、共通翻訳領域「ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ」を共有する。図１３は、共通翻訳領域の例示的なアミノ酸配列を提供する。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ翻訳配列をもたらすあらゆる遺伝子フレームシフト突然変異が、「ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異」である。公的に入手可能なゲノムおよびプロテオミクスデータセットを、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異の出現率およびＧＡＴＡ３ネオＯＲＦについての翻訳の証拠について調査した。
材料および方法
データセット
ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ乳がんデータセット：ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ乳がんデータセット（Ｒａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）は、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｓｔｕｄｙ？ｉｄ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｓｋ＿２０１８）で利用可能な公開データセットである。このデータセットは、ハイブリダイゼーション捕捉に基づく次世代配列決定アッセイであるＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴを使用した配列決定データを含有し、合計で１９１８個の乳房腫瘍検体および１７５６人の患者に由来する患者一致正常検体（ｐａｔｉｅｎｔ－ｍａｔｃｈｅｄ ｎｏｒｍａｌ）に由来する、３４１～４６８個の間のがん関連遺伝子のすべてのタンパク質コードエクソンを分析する。この研究のため、公的に入手可能な突然変異データ、ならびにＥＲステータス、ＨＥＲ２ステータス、および全生存期間を含む臨床データをダウンロードした。
ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセット：ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセット（ＮＣＩ ＣＰＴＡＣ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）は、ＣＰＴＡＣデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｐｔａｃ－ｄａｔａ－ｐｏｒｔａｌ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｃｐｔａｃ／ｓ／Ｓ０１５）で利用可能な公的データセットである。このデータセットは、ｉＴＲＡＱタンパク質定量法を使用した１０５人のＴＣＧＡ乳がん患者に由来するグローバルプロテオームのタンデム質量分析データを含有する。この研究のために、公的に入手可能な生データをダウンロードした。
突然変異出現率分析
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ同定：ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ乳がんデータセットのＧＡＴＡ３遺伝子の各突然変異事象を、ヒトゲノム由来のＧＡＴＡ３転写物ＥＮＳＴ０００００３４６２０８．３（ｈｇ１９、ＧＲＣｈ３７ゲノムリファレンスコンソーシアムヒューマンリファレンス（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）３７）にマッピングし、次いでｉｎ ｓｉｌｉｃｏで全長タンパク質に翻訳した。全長タンパク質がＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列を含有する場合、この突然変異事象を含有する試料を、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性と標識する。
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ出現率：コホート内のすべての対象について、対象が、ＧＡＴＡ３ ネオＯＲＦ陽性であると同定された少なくとも１つの配列決定された腫瘍試料を有する場合、対象をＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性とみなす。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ出現率を、コホートにおけるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性対象のパーセンテージであると規定する。
プロテオミクスデータからのペプチド同定
タンパク質配列データベース：タンパク質配列データベースは、ＵＣＳＣタンパク質配列データベース（２００９年２月のヒト参照配列、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）からの６３，６９１個のタンパク質配列、およびＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列を含有する１つの全長タンパク質を含有する。
ペプチド同定：ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセットの生データを、タンデム質量スペクトルの解釈のためのオープンソースソフトウェアパッケージであるＣｏｍｅｔ検索エンジン（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｅｔ－ｍｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）で分析した。Ｃｏｍｅｔ（バージョン２０１７．０１レビジョン２）を使用して、ＵＣＳＣタンパク質配列データベースに対してＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセットからのすべてのＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。＋６までの前駆体イオンを有するＭＳ／ＭＳスペクトルの検索を可能にした。前駆体イオンの質量誤差許容範囲は±１０百万分率（ｐｐｍ）であり、０．０２のｍ／ｚビン幅を断片イオンに使用した。検索はすべて、トリプシンにより制限され、その結果、実験スペクトルに一致する各ペプチドは、酵素の切断特異性、つまりリシンまたはアルギニンのＣ末端側と一致しなければならなかった。最大で２つの切断ミスを許容した。ｉＴＲＡＱ標識化から予想される＋１４４．１０２１Ｄａの固定修飾を、ペプチドのＮ末端およびすべてのリシン残基に適用した。可変修飾は、１ペプチド当たり最大で２つの酸化メチオニン残基を含んでいた。カルバミドメチル化システインの場合、＋５７．０２１４６４Ｄａの固定修飾を、すべてのシステインに適用した。標的－デコイ偽発見率を評価するため、検索中に、Ｃｏｍｅｔ検索エンジンの一部としてデコイペプチドが自動的に生成された。検索結果をＰｅｒｃｏｌａｔｏｒ（バージョン３．０２．０）により処理して、タンデム質量分析データを使用して、ペプチド同定の偽発見率を評価するための従来基準であるペプチドレベルｑ値を算出した。標準閾値（ｑ値＜０．０１）を使用して、偽発見の可能性が高いものが許容ペプチドの１％未満になるように、データセットから同定されたペプチドを許容した。
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの翻訳の証拠：ＵＣＳＣタンパク質配列データベース中の任意の他のタンパク質からではなく、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを含有するタンパク質配列から特異的に導出されるペプチドを、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドと呼んだ。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドの同定を、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの翻訳の証拠とみなした。
結果
乳がんにおけるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異出現率
１，７５６人の患者のＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ乳がんデータセットから、突然変異出現率分析を実施し（上記の材料および方法のセクション１）、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性であった９１人の患者を同定した。これらの９１人の患者のうち、７７人の患者が、ＨＲ＋Ｈｅｒ２（－）であると報告され、６２人の患者が診断時に転移性であると報告された。各サブグループにおけるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性患者の出現率は、下記の表１６に報告されている。ＨＲ＋Ｈｅｒ２（－）患者の中で、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ陽性患者は、全ＨＲ＋Ｈｅｒ２（－）患者と比較して全生存期間に統計的差異を有さない（それらのＧＡＴＡ３ネオＯＲＦステータスに関わらず）（ｐ値＝０．２４６）（図１４）。
下記の表１６は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの出現率を列挙している
下記の表１７は、ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセットから同定された基準ＧＡＴＡ３に対してマッピングされたＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドおよび他のペプチドを列挙している
乳がんゲノムデータセットの調査により、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦが、それらの転移ステータスに応じて、ＨＲ＋Ｈｅｒ２（－）乳がん患者の６～７％に広く存在していることが示された。基準ＧＡＴＡ３にマッピングされた複数のＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドが、他のペプチドと共に同定され、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの翻訳が示された。まとめると、これらの結果は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異が、ＨＲ＋Ｈｅｒ２（－）乳がんに広く存在しており、存在する場合、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは翻訳されて、タンパク質産物をもたらし得ることを示した。
（実施例１９）
ＨＬＡ型にわたるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦエピトープ数
この実施例は、多様なＨＬＡ型を有する患者集団にわたるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦから予想され得る典型的なエピトープの数の推定を提供する。
材料および方法
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域（実施例１８で規定されているような）内のペプチド（長さ８～１１）はすべて、遺伝子発現、ＨＬＡ結合能、およびプロテアソームプロセシング能が併せて考慮されるｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測アルゴリズムを使用して、提示確率を評価した。アルゴリズムでは、３つの変数を、単一アレル質量分析ＨＬＡ－Ｉプロファイリングデータに対するロジスティック回帰フィッティングによる全体的提示予測に組み合わせる。３つの入力変数を規定するために、以下の仮定およびツールを使用した。
発現
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）ＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づくと、乳がん試料は、１００万個当たり約７００個の転写物（ＴＰＭ）のＧＡＴＡ３発現中央値を有する。変異型アレルおよび野生型アレルがＧＡＴＡ３発現全体に等しく寄与すると仮定すると、ネオＯＲＦ転写物は、３５０個のＴＰＭで発現されると推定される。
ＨＬＡ結合能
米国でのアレル頻度を、民族特異的頻度に基づき、米国集団が６２．３％欧州人、１３．３％アフリカ系アメリカ人、６．８％アジア太平洋島民、および１７．６％ヒスパニックであると仮定して帰属させた（表１８）。２１個の最も一般的なＨＬＡ－Ａアレルおよび４９個の最も一般的なＨＬＡ－Ｂアレルの場合、ペプチド結合予測は、ツールＮｅｔＭＨＣｐａｎ－３．０を使用して実行した（２１個および４９個のアレルは、それぞれ、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂに９５％の集団網羅範囲を提供する）。
プロセシング能
プロセシング能の予測因子を、例えば、Ａｂｅｌｉｎ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２０１７、Ｂａｓｓａｎｉ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１５に記載のような、各ペプチドの上流および下流配列内容に基づいてプロセシング能を決定するニューラルネットワーク構成である、公的に入手可能な質量分析に基づくＨＬＡ－Ｉプロファイリングデータを使用してトレーニングした。
１患者当たりのエピトープ数をシミュレートするため、それらの全体的米国頻度に従って、２つのＨＬＡ－Ａアレルおよび２つのＨＬＡ－Ｂアレルをランダムに抜き出す（ホモ接合性を可能にするため、置き換え有り）ことにより、模擬ＨＬＡ遺伝子型を作出した（表１８）。ほとんどの模擬患者は、４つの個別のアレルを有していたが、ホモ接合性が可能にされていたため、一部の模擬患者は、２つまたは３つの個別のアレルしか有していなかった。模擬患者の各ペプチド－アレル対に対して、帰属された提示確率（上記のモデルから導出された）によりパラメーター化されたベルヌーイコイントスを実施した。陽性結果を、所与のペプチドが所与のアレルに提示され得ることを示すと解釈した。各模擬患者に対して、固有の陽性ペプチドの総数を合計して、反応性エピトープの総数を決定した（シミュレーションにおいて複数のアレルに提示されたペプチドは、１回だけ計数したことを意味する）。入れ子構造のエピトープ（例えば、陽性１０量体内に完全に含有される陽性９量体）を単一エピトープとして計数することにより、結果をさらに選抜した。統計プログラミング言語Ｒを使用し、この様式で１万人の患者をシミュレートした。
下記の表１８は、シミュレーションで使用されたアレル頻度を列挙している
結果
方法セクションに記載されている分析は、患者の９５％が、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来する≧２つのＨＬＡ－Ｉエピトープを提示し得ることを示した（図１５）。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、上に提示されている詳細に基づくと、患者のＨＬＡ遺伝子型に関わらず、複数の提示可能なＨＬＡ－Ｉエピトープを内包することができる。これは、これらの予測ネオ抗原に対するＴ細胞応答を誘導する療法の有効性を示す。予測エピトープのサブセットを、以下の実施例２０、２１、２２、２３に詳述されているフォローアップ研究での検証のために選択した。
（実施例２０）
エピトープの生化学的測定
以下の実施例は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来するエピトープの親和性の生化学的検証を提供する。多数のエピトープが、多くのＨＬＡアレルに結合することができる（実施例１９に記載のように）。この実施例では、エピトープを、いくつかの一般的なＨＬＡアレル、つまりＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、およびＨＬＡ－Ｂ０８：０１に結合する能力について評価した。エピトープとそれらの予測ＨＬＡとの間の結合の親和性および安定性の両方を評価した。
親和性は、ＨＬＡに対するエピトープの結合の強さの尺度である。強力な結合（一般に＜５００ｎＭと規定される）は、Ｔ細胞により標的とされ得るネオ抗原の重要な特徴である。これは、ネオ抗原が腫瘍細胞の表面に提示されなければならず、したがって、一度に１つのペプチドしか個々のＨＬＡ分子に結合することができないため、ＨＬＡ分子の１つの結合ポケットのために、腫瘍細胞により産生される他の抗原に打ち勝たなければならないからである。さらに、免疫原性エピトープは、それらの特異的ＨＬＡに対して強力な親和性を有する傾向があることが示されている。
安定性は、所与のエピトープが、どれだけの間、同族ＨＬＡに結合したままでいるかの尺度である。安定的な結合（一般に＞１時間と規定される）も、Ｔ細胞により標的とされ得るネオ抗原の重要な特徴である。エピトープは、Ｔ細胞により認識されるために、細胞表面上にて腫瘍細胞に結合したままでなければならない。さらに、親和性と同様に、免疫原性エピトープは、それらの特異的ＨＬＡに安定的に結合する傾向があることが以前に示されている。
同族ＨＬＡ分子に対するエピトープの安定性および親和性を評価するため、ペプチドを、＞７０％の純度（ＵＶ分析の面積％による）で合成し、２０ｍＭまたはそれより低く希釈し、それらの親和性および安定性を測定した。
この実施例では、１４個のエピトープと同族ＨＬＡ分子との間の結合の親和性および安定性が報告される。４つのエピトープをＨＬＡ－Ａ０２：０１で研究し、５つのエピトープをＨＬＡ－Ｂ０７：０２で研究し、８つのエピトープをＨＬＡ－Ｂ０８：０１で研究した（３つのエピトープを、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２およびＨＬＡ－Ｂ０８：０１の両方で研究した）。ペプチドはすべて、９．５ｎＭ～２４２．８ｎＭの範囲の親和性により強力な結合を示した。安定性は、０時間～２１．７時間の範囲であり、各アレルに対する少なくとも１つのエピトープは、１時間を超えていた。これらの結果は、１アレル当たり少なくとも１つのＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来する強力なエピトープが存在することを示す。
材料および方法
生化学的測定のためのエピトープの選択
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来する複数のエピトープを、具体的な一般的ＨＬＡアレル、つまりＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、またはＨＬＡ－Ｂ０８：０１への結合に対する能力の確認のために選択した。これらのエピトープは、弱い～強い結合物質の範囲にあると予測された。
固相ペプチド合成
Ｉｎｔａｖｉｓペプチド合成機での固相ペプチド合成を使用して、ペプチドを５μｍｏｌ規模で作製した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用してＦｍｏｃ脱保護を実施し、ニートＤＭＦですすいだ。アミノ酸はすべて、６０μＬの０．５Ｍアミノ酸（６当量）、５５μＬの０．５Ｍ ＨＣＴＵ（５．５当量）、５μＬのＮＭＰ（０．５当量）、および１４μＬの４Ｍ ＮＭＭ（１１．２当量）を使用して、１５分間の持続期間で室温にてダブルカップリングした。各ダブルカップリングサイクル後、１００μＬのＤＩＥＡ溶液（まずＮＭＰ中２Ｍの溶液として作製し、次いでＤＭＦを使用して１２．５％に希釈した）およびＤＭＦ中６．２５％無水酢酸を１５分間添加することによりアセチルキャッピングを実施してから、真空排液し、ＤＭＦですすいだ。脱保護、洗浄、ダブルカップリング、アセチルキャッピング、洗浄サイクルを、配列の各アミノ酸に対して繰り返した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンで最終脱保護を、ＤＭＦ、ＥｔＯＨ、およびＤＣＭで最終洗浄を実施した。機器での５分間の最終廃液乾燥が完了した後、プレート底部をＤＣＭですすいだ。
ペプチドの切断
９２．５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％ＥＤＴの溶液を使用してペプチドを切断した。１時間後、プレートを、１．２ｍＬ Ｍｉｃｒｏｎｉｃラックへと真空排液した。次いで、合計で３時間後、ペプチドを、冷却ジエチルエーテルを用いて遠心分離により沈殿させた。
ペプチドのＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析
粗ペプチドを乾燥させ、０．１％ＴＦＡを含有する１：１ＡＣＮ：Ｈ２Ｏに再懸濁し、完全に凍結するまで－８０℃で維持した。次いで、ペプチドを凍結乾燥して、ペプチドを粉末形態で単離した。ペプチド粉末を、まずニートＤＭＳＯに溶解し、次いでＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析のためにＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏで３：１に希釈した。ＵＶモニタリングを、２１４ｎｍの波長で、２００～１２５０Ｄａにわたる質量検出器範囲にて実施した。長さが９アミノ酸未満のペプチドに使用されるＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳ法は、２．１×５０ｍｍ １．７μＭ ＢＥＨ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣカラムでの、５分間にわたる０～１００％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ、対応する移動相Ａは、水中０．１％ＴＦＡ）の勾配を含み、９アミノ酸よりも大きなペプチドのための方法は、２．１×１００ｍｍ １．７μＭ ＢＥＨ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣカラムでの、８分間にわたる１０～８０％移動相Ｂの勾配を含んでいた。
Ａ２１４法によるペプチド濃度の決定
Ａ２１４法による評価のために、粗ペプチドを２～５ｍｇ／ｍＬの濃度でニートＤＭＳＯに溶解した。ＵＰＬＣ－ＵＶクロマトグラムのペプチドピーク面積は、分析のために注入したペプチドの量、および検出波長でのペプチドの吸光係数に比例する。したがって、ペプチド試料の濃度は、そのＵＶピーク面積を公知の濃度の参照ペプチドのＵＶピーク面積と比較し、それぞれの吸光係数を考慮することにより決定することができる。以下の方程式を使用して、ペプチド濃度を算出する。
方程式７． Ｃ＝Ｃｒｅｆ＊（Ａｓａｍ＊Ｅｒｅｆ＊Ｖｒｅｆ）／（Ａｒｅｆ＊Ｅｓａｍ＊Ｖｓａｍ）
式中、Ｃは、ｍＭでのペプチド試料濃度であり、Ｃｒｅｆは、ｍＭでの参照ペプチド濃度であり、Ａｓａｍは、ペプチド試料のＵＶピーク面積であり、Ａｒｅｆは、参照ペプチドのＵＶピーク面積であり、Ｅｒｅｆは、Ｍ－１ｃｍ－１での参照ペプチドの吸光係数であり、Ｅｓａｍは、Ｍ－１ｃｍ－１でのペプチド試料の吸光係数であり、Ｖｓａｍは、試料の注入体積であり、Ｖｒｅｆは、参照ペプチドの注入体積である。
２１４ｎｍにおけるペプチドの吸光係数は、個々のアミノ酸およびペプチド結合の吸光係数を組み合わせることにより予測される。ＲＡＫＦＫＱＬＬ（ペプチドＩＤ ＬＳ－１８）の配列を有する０．２ｍｇ／ｍＬの参照ペプチドを、粗ペプチド試料と順にＵＰＬＣ－ＵＶ－ＭＳに流す。次いで、ＵＶピーク面積および吸光係数計算値を使用して、ｍＭでのペプチド濃度を算出する。
親和性測定
ＨＬＡ分子の結合ポケットのために規定の放射性標識ペプチドに打ち勝つ能力を評価することにより、ペプチドのＨＬＡ分子に対する結合親和性を測定した。これは、ＨＬＡ分子を精製し、それらを複数濃度の目的のペプチドおよび放射性標識されている高親和性結合ペプチドとインキュベートすることにより行った。２日間のインキュベーション後、未結合放射性標識ペプチドを、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離し、放射性標識ペプチドを有するＨＬＡ分子の割合を測定した。アッセイの終了時に結合していた放射性標識ペプチドのパーセンテージが低いペプチドは、ＨＬＡに対して強い親和性を有する。放射性標識ペプチドの結合を５０％阻害するために必要な目的のペプチドの濃度は、複数濃度にわたる阻害の回帰分析により定量的に決定することができる。このＩＣ５０測定を、真の結合親和性の近似として使用した。
分析したペプチドの第１のウェーブ（ｗａｖｅ）では、ペプチドの実際の濃度は、Ａ２１４測定に基づき公知であり、濃度に基づいてあらゆる必要な補正を行った。分析したペプチドの第２のウェーブでは、ペプチドの濃度はすべて２０ｍＭであると推定し、その推定に基づいて初期ＩＣ５０を算出し、後に実際の濃度を考慮して調整を実施した。実際の濃度が２０ｍＭ未満のペプチドの場合、測定したＩＣ５０に、Ａ２１４法で決定した実際の濃度をかけ、２０ｍＭで割ることにより補正した。
安定性測定
クラスＩ ＭＨＣに対するペプチドの結合安定性を測定するため、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉ重鎖および軽鎖をコードする合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、標準的な方法を使用して封入体から精製する。軽鎖（β２ｍ）を、ヨウ素（１２５Ｉ）で放射性標識し、１８℃にて精製ＭＨＣ－Ｉ重鎖および目的のペプチドと組み合わせて、ｐＭＨＣ－Ｉ複合体形成を開始させた。これらの反応を、ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロプレートで実施して、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉ重鎖を表面に結合させ、放射性標識軽鎖の測定を可能にして、複合体形成をモニターした。より高い濃度の未標識軽鎖の添加、および３７℃でのインキュベーションにより、解離を開始させた。安定性は、シンチレーション計数により測定して、複合体の半分が解離するのにかかる時間単位の時間の長さと規定した。二連測定を実施した。２回の測定値の平均を安定性として採用した。
結果
親和性測定
下記の表１９は、エピトープ親和性測定値を列挙している
＊ここに報告されている実際のペプチド濃度およびＩＣ５０測定値は、生データから丸められているが、ＩＣ５０補正値は、丸められてない生データを使用して算出したことに留意されたい。
安定性測定
下記の表２０は、安定性測定値を列挙している
実施例２０では、複数の一般的ＨＬＡ分子（ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ０８：０１）に対するＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ由来の予測エピトープを評価した。すべてのエピトープは、強力な親和性（＜５００ｎＭ）を有すると決定された。これらのエピトープのサブセットも安定的結合物質（＞１時間）であり、評価したＨＬＡアレルの各々に対して少なくとも１つの強力な結合物質があった。これらのデータは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦエピトープが、複数のＨＬＡアレルにわたって存在することを示す。
（実施例２１）
ＧＡＴＡ３突然変異およびＨＬＡアレルを有する細胞系の生成
この実施例には、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）新規オープンリーディングフレーム（ネオＯＲＦ）突然変異ならびに高出現率ＨＬＡアレルＨＬＡ－Ａ０２：０１およびＨＬＡ－Ｂ０７：０２を有する細胞系の調製を記載した。この細胞系は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を含有する腫瘍細胞のｉｎｖｉｔｒｏ代用物として使用することができる。注目した特異的ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを天然に内包する細胞系は、容易に入手することができず、それを、一般的に使用される細胞系ＨＥＫ２９３Ｔの安定的レンチウイルス形質導入により調製した。この細胞系を選択したのは、一般的なＨＬＡアレルの２つ、ＨＬＡ－Ａ０２：０１およびＨＬＡ－Ｂ０７：０２を天然で発現するからである。この改変細胞系を、Ｔ細胞による機能アッセイに使用した（実施例２５および実施例２６）。加えて、この細胞系を、複数のＨＬＡアレルに対するＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来するネオ抗原プロセシング／提示の検証に使用した（実施例２２）。これらの研究では、ＨＬＡアレルを改変細胞系に一過性にトランスフェクトした。
材料および方法
ＧＡＴＡ３突然変異細胞系の生成の概要
ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成は、（ａ）ＧＡＴＡ３突然変異がコードされたプラスミド設計、レンチウイルスの産生、ＧＡＴＡ３突然変異のＨＥＫ２９３Ｔ細胞株への形質導入、および形質導入された細胞の選択を伴った。ＧＡＴＡ３突然変異細胞系の生成のためのこれらのステップが下に記載されている。
細胞系および培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、メリーランド州、米国）から購入し、ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ培地で維持した。
ＧＡＴＡ３突然変異がコードされたプラスミドの設計
ＧＡＴＡ３突然変異遺伝子
ＧＡＴＡ３突然変異遺伝子プラスミド構築物の効率的な発現のために、１４７３～２０７４の６００ｂｐ ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）野生型配列（５５８～１８９２のコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）配列を含有する）を、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１００２２９５．０１から得た。さらに、ＧＡＴＡ３突然変異配列を、参照配列から１７３４および１７３５における２つのヌクレオチドを欠失させることにより生成した（図１６）。そのため、ＧＡＴＡ３突然変異配列は、野生型配列からのアミノ酸配列の８７位におけるフレームシフトを翻訳する（図１７）。このＤＮＡ構築物は、野生型ＧＡＴＡ３アミノ酸配列の８７個の残基、および欠失により引き起こされるフレームシフトしたＧＡＴＡ３ネオＯＲＦアミノ酸配列の１１４を網羅することができる。
ＧＡＴＡ３突然変異プラスミドの設計
ＧＡＴＡ３突然変異配列をコドン最適化し、合成し、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－Ｐｕｒｏベクター（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングした（図１８）。
レンチウイルス産生
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を完全培養培地（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ）で培養し、ＧＡＴＡ３突然変異がコードされたレンチウイルスプラスミドをトランスフェクトして、ＧＡＴＡ３突然変異遺伝子のレンチウイルスを産生した。トランスフェクションの前日に、１ウェル当たり８×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。トランスフェクション当日に培養培地を置き換えた。４μｇのレンチウイルス構築物プラスミドおよび４．６μＬのレンチウイルスパッケージングプラスミドミックス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で混合した。混合物を１０μＬのＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、細胞に直接添加した。２４時間後に、培地を新鮮な完全培養培地に置き換えた。レンチウイルスを含有していた上清を、トランスフェクションの７２時間後に回収した。
ＧＡＴＡ３突然変異の形質導入
５×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、６μｇ／ｍＬポリブレンおよび１０％ＦＢＳを含有していた１２ウェルプレートの２ｍＬ ＤＭＥＭ培地に播種した。ＧＡＴＡ３レンチウイルスを含有する１３０μＬの上清を、細胞に直接添加した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。２４時間時に、培地を、１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭ培地に置き換えた。
ピューロマイシン選択
１μｇ／ｍＬ濃度のピューロマイシン処理を、ＧＡＴＡ３突然変異レンチウイルスの形質導入の２日後に開始した。細胞を、回収するまで、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、および１μｇ／ｍＬピューロマイシンを有するＤＭＥＭ培地で培養および拡大増殖した。
ＨＬＡをコードする構築物によるトランスフェクション
１．５×１０７個のＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔ１７５フラスコに接種した。１５μｇのＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、またはＨＬＡ－Ｂ０８．０１がコードされたプラスミド（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を、７０μＬのＦｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。各ＨＬＡ型プラスミドとＦｕｇｅｎｅ ＨＤとの混合物を、トランスフェクションのために、Ｔ１７５フラスコ内のＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。３つの異なるＨＬＡをトランスフェクトした、およびＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４８時間培養してから回収した。
ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入した、およびＨＬＡをトランスフェクトした細胞の回収
細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。３７℃での３分間のインキュベーション後、細胞を、１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＤＭＥＭ培地に再懸濁し回収した。１，５００ｒｐｍでの５分間の遠心分離、続くＰＢＳ緩衝液での懸濁を含む洗浄ステップを３回実施した。細胞ペレットを、７０％エタノール中のドライアイスで急速凍結した。凍結した細胞ペレットを、プロテオミクス分析のために－８０℃の冷凍庫で保管した。
結果
ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔを、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ機能アッセイを評価するための標的細胞として、および質量分析によりＨＬＡ－Ａ０２．０１に対するＧＡＴＡ突然変異提示を評価するための材料として使用した（実施例２２）。下には、ＧＡＴＡ３突然変異を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成を実証する結果が概説されている。
ＧＡＴＡ３突然変異プラスミド構築物
ＧＡＴＡ３突然変異がコードされたプラスミド構築物を生成し、ＧＥＮＥＷＩＺでのＤＮＡ配列決定により評価した。最終的なＧＡＴＡ３突然変異がコードされたプラスミドのＤＮＡ配列決定データは、設計したＧＡＴＡ３突然変異遺伝子配列と１００％一致する（図１９）。制限酵素ＡｆｌＩＩ消化後、ゲル電気泳動アッセイのレーン２に、５０００ｂｐ～３０００ｂｐの間に２つのＤＮＡバンドが観察された。これらのバンドは、それぞれ４２４３ｂｐおよび３４２４ｂｐの予想サイズと相関する（図２０）。
ＧＡＴＡ３突然変異形質導入および回収
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＧＡＴＡ３突然変異形質導入に使用した。形質導入された細胞を、総細胞数が２００×１０６個の細胞に達するまで培養した。回収当日に、１×１０６個の細胞を、ＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－クラスＩＩの発現についてフローサイトメーターにより使用した（図２１）。９９．５％の細胞がＨＬＡ－クラスＩ陽性であった。プロテオミクス分析のために１９３×１０６個の細胞を凍結した。
ＨＬＡトランスフェクション
ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＢＡＰタグ付きＨＬＡ－Ａ０２．０１、ＢＡＰタグ付きＨＬＡ－Ｂ０７．０２、およびＢＡＰタグ付きＨＬＡ－Ｂ０８．０１がコードされた発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を４８時間培養し、回収した。回収当日に、１×１０６個の細胞を、ＨＬＡ－Ａ０２．０１およびＨＬＡ－クラスＩ発現についてフローサイトメトリーにより使用した（図２２）。トランスフェクトされていない（図２２Ａ）、ＨＬＡ－Ａ０２．０１をトランスフェクトした（図２２Ｂ）、ＨＬＡ－Ｂ０７．０２をトランスフェクトした（図２２Ｃ）、およびＨＬＡ－Ｂ０８．０１をトランスフェクトした（図２２Ｃ）ＧＡＴＡ３
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞。トランスフェクトされた細胞はすべて、ＨＬＡ－Ａ０２．０１およびＨＬＡ－クラスＩを高度に発現した。
突然変異ＧＡＴＡ３遺伝子を含有するレンチウイルスのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への安定的な形質導入により、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを発現する改変細胞系を生成した。ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現した。その後、この細胞系を、ＧＡＴＡ３ネオ抗原に特異的なＴ細胞を用いた機能アッセイの標的として使用した（実施例２５および実施例２６）。さらに、いくつかの一般的ＨＬＡアレルのトランスフェクション後、これらの細胞系は、より広い分布のＨＬＡ－クラスＩおよびＨＬＡ－Ａ：０２発現レベルを示し、これらのアレルに対する複数のネオ抗原のプロセシングおよび提示の評価のために使用した（実施例２２）。
（実施例２２）
質量分析によるＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドエピトープの検証
この実施例は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、およびＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１ヘテロダイマーに結合するためのＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）新規オープンリーディングフレーム（ネオＯＲＦ）の共通領域に由来する予測ペプチドエピトープの内因性プロセシングおよび提示の、質量分析による検証を提供する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを安定的に発現するように操作し、目的のビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）タグ付きＨＬＡアレルを発現するように一過性にトランスフェクトした。アレル特異的ペプチドエピトープの予測およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成は、それぞれ実施例１９および実施例２１に記載されている。ＨＬＡ－ペプチド複合体を、各ＨＬＡクラスＩヘテロダイマーのアルファ鎖に発現されたビオチン化ＢＡＰタグの親和性プルダウンにより細胞溶解物から単離した。酸での処理によりペプチドリガンドをＨＬＡ－ペプチド複合体から放出させ、逆相液体クロマトグラフィーにより脱塩した。ＨＬＡ－ペプチドリガンドを、高分解能タンデム質量分析計にカップリングされたナノ液体クロマトグラフィー（ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりさらに分離した。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来する予測ペプチドエピトープを、標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供し、各ペプチドエピトープの前駆体質量の先験的知識を使用して、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）による断片化およびその後のペプチド配列決定のために、各ペプチドエピトープの理論的モノアイソトピック質量を選択した。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドエピトープは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを含有するデータベースに対するデータベースマッチングアルゴリズムにより、およびそれらの合成ペプチド対応物に対応する前駆体質量（ＭＳ）とＭＳ／ＭＳスペクトルとのスペクトル比較により、得られたタンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）と一致した。
３つの異なるＨＬＡヘテロダイマーに結合した、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する合計で５つのペプチドエピトープが、操作したＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出された。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の場合、４つの標的化ペプチドエピトープのうち以下の２つが検出された：ＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶおよびＭＬＴＧＰＰＡＲＶ。ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２の場合、５つの標的化ペプチドエピトープのうち以下の２つが検出された：ＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ。ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１の場合、８つの標的化ペプチドエピトープのうちの以下の１つが検出された：ＥＳＫＩＭＦＡＴＬ。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを発現する細胞からのこれらのペプチドエピトープの、ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる検出および同定により、それらが内因的にプロセシングされ、その後ＨＬＡヘテロダイマーにより結合したことが実証された。
材料および方法
ペプチド：ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドエピトープに対応する１２Ｃ１４Ｎ合成ペプチドを合成した。
下記の表２１は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ予測ペプチドエピトープに対応する合成ペプチドのリストを提供する
細胞培養
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを安定的に発現する操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生成、および各親和性タグ付き（ＢＡＰタグ付き）アレルの一過性トランスフェクションは、実施例２１に記載されている。表２２は、標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳに使用した試料および細胞数を列挙している。
下記の表２２は、標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳのための試料の要約を提供する
親和性タグ付き（ＢＡＰタグ付き）ＨＬＡ－ペプチド複合体のプルダウン
ＢＡＰタグ付きＨＬＡ分子を含有する凍結細胞ペレットを氷上で２０分間解凍し、次いで、５０×１０６個の細胞当たり１．２ｍＬ溶解緩衝液の比の冷却溶解緩衝液［２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、６０ｍＭオクチルＢ－Ｄ－グルコピラノシド、０．２ｍＭ ２－ヨードアセトアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテル］中で手作業にてピペットすることにより穏やかに溶解した。溶解物を、５０×１０６個の細胞当たり≧２５０単位のベンゾナーゼの比のベンゾナーゼヌクレアーゼと共に、回転させて４℃で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ／ＲＮＡを分解し、次いで１５，０００×ｇにて２０分間４℃で遠心分離して細胞残渣および不溶性材料を除去した。清澄化した上清を新しいチューブに移し、ＢＡＰタグ付きＨＬＡ分子を、０．５６μＭビオチン、１ｍＭ ＡＴＰ／１ｍＭ酢酸マグネシウム、および３μＭ ＢｉｒＡを有する１．５ｍＬチューブにて１０分間回転させて室温でインキュベートすることによりビオチン化した。上清を、５０×１０６個の細胞当たり２００μＬのＰｉｅｒｃｅ ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎビーズ状アガロース樹脂スラリーに対応する体積で、回転させて４℃で３０分間インキュベートして、ビオチン化ＨＬＡ－ペプチド複合体を親和性富化した。最後に、ＨＬＡ結合樹脂を１ｍＬ冷却洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭオクチルＢ－Ｄ－グルコピラノシド、０．２ｍＭ ２－ヨードアセトアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８）で４回洗浄し、次いで１ｍＬの冷却１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８で４回洗浄した。洗浄の間では、ＨＬＡ結合樹脂を手作業で穏やかに混合し、次いで１，５００×ｇで１分間４℃での遠心分離によりペレット化した。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎビーズ状アガロース樹脂は、使用前に１ｍＬ冷却ＰＢＳで３回洗浄した。ＨＬＡペプチドの溶出前の１週間未満の間、洗浄したＨＬＡ結合樹脂を－８０℃で保管した。
ＨＬＡ－ペプチドの脱塩、還元、およびアルキル化
ＨＬＡ－ペプチドを、親和性タグ付き（ＢＡＰタグ付き）ＨＬＡ複合体から溶出させ、同時にＳｅｐ－Ｐａｋ固相抽出システムを使用して脱塩した。手短に言えば、Ｓｅｐ－Ｐａｋカートリッジを、２４ポジション固相抽出マニホールドに取り付け、２００μＬのメタノール、続いて１００μＬの５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で２回活性化し、次いで５００μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸で４回洗浄した。親和性タグ付き（ＢＡＰタグ付き）ＨＬＡ分子からＨＬＡ－ペプチドを解離させ、ｔＣ１８固相へのペプチド結合を促進するために、４００μＬの３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５％（ｖ／ｖ）ギ酸を、ＨＬＡ結合ビーズ状アガロース樹脂を含有するチューブに添加した。スラリーをピペットすることにより混合し、次いでＳｅｐ－Ｐａｋカートリッジに移した。チューブおよびピペットチップを１％（ｖ／ｖ）のギ酸（２×２００μＬ）ですすぎ、すすぎ液をカートリッジに移した。１００フェムトモルのＰｉｅｒｃｅペプチド滞留時間較正混合物を、負荷対照としてカートリッジに添加した。ビーズ状アガロース樹脂を、２００μＬの１０％（ｖ／ｖ）酢酸と共に５分間、２回インキュベートして、ＨＬＡ－ペプチドを親和性タグ付き（ＢＡＰタグ付き）ＨＬＡ分子からさらに解離させ、次いで５００μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸で４回洗浄した。２５０μＬの１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１％（ｖ／ｖ）ギ酸、続いて２５０μＬの３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１％（ｖ／ｖ）ギ酸による段階的分画により、ＨＬＡ－ペプチドを、ｔＣ１８から新しい１．５ｍＬマイクロチューブへと溶出させた。活性化、試料負荷、洗浄、および溶出に使用した溶液は重力で流したが、カートリッジから残りの溶出液を取り出すためには真空（≧－２．５ＰＳＩ）を使用した。ＨＬＡ－ペプチドを含有する溶出液を凍結し、真空遠心分離により乾燥させ、－８０℃で保管した後、還元、アルキル化、および第２の脱塩ワークフローに供した。
システイン含有ＨＬＡ－ペプチドの還元およびアルキル化を、１．５ｍＬマイクロチューブにて以下のように実施した。乾燥したペプチドを、２００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８に可溶化し、次いでＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにて１，０００ｒｐｍで振とうしながら、５ｍＭのジチオスレイトールと共に６０℃で３０分間インキュベートすることにより還元した。還元されたチオールを、１５ｍＭ ２－ヨードアセトアミドと共に室温にて３０分間、暗所でインキュベートすることによりアルキル化した。あらゆる未反応２－ヨードアセトアミドを、５ｍＭのジチオスレイトールと共に室温にて１５分間、暗所でインキュベートすることによりクエンチした。還元およびアルキル化の直後、試料を脱塩した。
ＨＬＡ－ペプチド試料の二次脱塩は、Ｅｍｐｏｒｅ Ｃ１８固相抽出ディスクの２つの１６ゲージパンチを使用して充填した自家製ＳｔａｇｅＴｉｐを用いて実施した。ＳｔａｇｅＴｉｐを１００μＬのメタノール、続いて５０μＬの９９．９％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で２回活性化し、次いで１００μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸で３回洗浄した。ペプチド溶液を、２００μＬの３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５％（ｖ／ｖ）を添加することにより酸性化し、次いでＳｔａｇｅＴｉｐに負荷した。チューブおよびピペットチップを、２００μＬの３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５％（ｖ／ｖ）、続いて１％（ｖ／ｖ）ギ酸（２×１００μＬ）ですすぎ、リンス体積をＳｔａｇｅＴｉｐに移した。ＳｔａｇｅＴｉｐを、１００μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸で５回洗浄した。２０μＬの１５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１％（ｖ／ｖ）ギ酸、続いて２つの２０μＬ分の３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／１％（ｖ／ｖ）ギ酸による段階的勾配を使用して、ペプチドを１．５ｍＬマイクロチューブへと溶出させた。試料負荷、洗浄、および溶出は、卓上遠心分離機で最高速度を１，８００～３，５００×ｇにして室温にて実施した。溶出液を凍結し、真空遠心分離で乾燥させ、－８０℃で保管した。
ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＨＬＡ－ペプチド配列決定
すべてのｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で、下に記載のものと同じ液体クロマトグラフィー分離条件を用いた。ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ １２０Å Ｃ１８－ＡＱ １．９μｍ充填材料を約１，０００ｐｓｉのヘリウム圧力で約３５ｃｍまで充填し、分離中は６０℃に加熱した内径７５μｍのＰｉｃｏＦｒｉｔおよび１０μｍエミッターナノスプレーカラムを装着したＥＡＳＹ－ｎＬＣ１２００システムを使用してペプチドをクロマトグラフィーで分離した。カラムを、１０×ベッド体積の溶媒Ａ［３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸］で平衡化し、試料を４μＬの３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５％（ｖ／ｖ）ギ酸で負荷し、ペプチドを、８４分間にわたる６～４０％の溶媒Ｂ［８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸］、９分間にわたる４０～６０％の溶媒Ｂの線形勾配で溶出させ、次いで９０％溶媒Ｂで５分間、および５０％溶媒Ｂで９分間保持して、カラムを洗浄した。線形勾配は、２００ｎＬ／分の速度で実行した。
ペプチドを、２．５ｋＶにて、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘイオン源を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計へと溶出させた。４×１０５の自動ゲイン制御（ＡＧＣ）標的および５０ミリ秒の最大注入時間を用いて３００から１，８００ｍ／ｚまで１５，０００の分解能で、フルスキャンＭＳを取得した。各ＭＳスキャンは、標的化ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドエピトープのイオン質量計算値（ｍ／ｚ）およびそれらの予測電荷ステータス（ｚ）を含むインクルージョン質量リスト（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｍａｓｓ ｌｉｓｔ）（表２３）に従ってＭＳ／ＭＳスキャン後に行った。以下の基準を満たしたペプチドの追加のイオン質量計算値が含まれていた：ｉ）配列中の１つもしくは複数の塩基性残基の存在により複数の電荷ステータスが予想されること、ならびに／またはｉｉ）システイン、メチオニン、およびＮ末端グルタミンなど、試料プロセシング中に改変されることが予想されるアミノ酸を含有するペプチド。最大注入時間を１００ミリ秒～１２０ミリ秒の間で変化させて、クロマトグラフィーピークの幅を２～２．８秒のサイクル時間に維持した。ＭＳ／ＭＳスキャンは、１ｍ／ｚの単離幅、３４の正規化ＨＣＤ衝突エネルギー、および１×１０５のＡＧＣ標的を使用して、１１０から１，３００～１，５００ｍ／ｚまで、１５，０００の分解能で取得した。
表２３は、各ＨＬＡアレルのＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドエピトープのインクルージョン質量リストを列挙している
データベース検索
質量スペクトルを、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌソフトウェアパッケージを使用して解釈した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、６００～２，０００Ｄａの範囲の前駆体ＭＨ＋を有してなかった、＞５の前駆体電荷を有していた、または４つ未満の検出ピークを有していた場合、検索から除外した。同じクロマトグラフィーピークで取得された同じ前駆体ｍ／ｚとの類似スペクトルのマージを無効にした。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、全長ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ配列および１５０個の一般的夾雑物と組み合わせて、ゲノムのｈｇ１９注釈を有するすべてのＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ遺伝子およびそのタンパク質をコードする転写物を含有していたデータベース（６３，６９１個のエントリー）に対して検索した。データベース検索の前に、すべてのＭＳ／ＭＳは、配列タグ長が＞２である（つまり、最低で３質量がアミノ酸の鎖内質量により分離される）スペクトル品質フィルターに合格しなければならなかった。最小骨格切断スコアを５に設定し、「ＥＳＩ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ ＨＬＡ ｖ２」スコアリングスキームを使用した。スペクトルはすべて、酵素特異性がないこと、システインカルバミドメチル化（Ｃａｍｃ）の固定修飾、ならびに以下の可変修飾：酸化メチオニン（ｍ）、ピログルタミン酸、およびシステイニル化（Ｃｃｙｓ）を使用して検索した。前駆体および産物の質量許容値を、それぞれ０．１Ｄａおよび１０ｐｐｍに設定し、最小一致ピーク強度を３０％に設定した。個々のスペクトルのペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ自動検証モジュールを使用してＰＳＭランクでの標的－デコイに基づくＦＤＲ推定を適用し、スコアリング閾値基準を設定することにより確実に割り当てられるように自動的に指定した。最小配列長７、自動可変範囲前駆体質量フィルタリング、ならびにスコアおよびデルタランク１－ランク２スコア閾値を使用する自動閾値戦略を、ＨＬＡアレルのすべてのｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行にわたって最適化し、各前駆体電荷ステータスについて＜１％のＰＳＭ ＦＤＲ推定値を得た。
方程式
各ペプチドエピトープの実験的モノアイソトピック分子量（ＭＷ）を、以下の方程式に従って算出した。式中、ｍ／ｚは、質量分析計により検出されたペプチドエピトープの質量電荷比であり、ｚは、ペプチドエピトープの電荷であり、１．００７２７６は、プロトンのモノアイソトピック分子量である。
方程式８． 実験的ＭＷ＝（（ｍ／ｚ）×（ｚ））－（（ｚ）×（１．００７２７６））
結果
標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、およびＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１に結合することが予測されたＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来するペプチドエピトープの内因性プロセシングを検証した。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する５つのペプチドエピトープが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にて３つのアレルにわたって検出された（図２３）。
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ヘテロダイマーの場合、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する４つのペプチドを、ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより標的とした。共通領域に由来する２つのペプチドＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶおよびＭＬＴＧＰＰＡＲＶを、データベース検索により、およびそれらの合成ペプチド対応物とのスペクトル一致により同定することに成功した。各ペプチドエピトープの理論的および実験的モノアイソトピック分子量が、関連する質量誤差と共に表２４に示されている。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌデータベース検索ワークフローにより報告された骨格切断スコアおよびスコア化ピーク強度が表２５に列挙されている。骨格切断スコアは、ＨＣＤにより生成された断片特異的イオンの数を示し、スコア化ピーク強度は、検索解釈により説明されるＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるイオン電流のパーセンテージを示す。
下記の表２４は、分子量理論値および分子量実験値を質量誤差と共に列挙している
＊小文字のｍは、メチオニンの酸化を示す。
表２５は、データベース検索の解釈基準を示す
＊小文字のｍは、メチオニンの酸化を示す。
内因的にプロセシングされたペプチドエピトープに対して取得された各ＭＳ／ＭＳスペクトルは、対応する合成ペプチドを使用して生成されたＭＳ／ＭＳスペクトルと一致した。図２４は、内因的にプロセシングされたペプチドエピトープＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶのＭＳ／ＭＳスペクトル（図２４Ａ下）と、その対応する合成ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（図２４Ａ上）とのスペクトル比較を示す。図２４Ｂは、同一のスペクトル一致の代替的表現を示す。これらの網羅的なプロットは、それぞれ９量体および１０量体ペプチドエピトープの上位４５または５０位の最も豊富なイオンを使用して生成した（ｈｔｔｐ：／／ｏｒｇｍａｓｓｓｐｅｃ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／）。
図２５は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の内因的にプロセシングされたペプチドＭＬＴＧＰＰＡＲＶのＭＳ／ＭＳスペクトル比較を示す。
ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２の場合、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する５つのペプチドエピトープを、ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより標的とした。共通領域に由来する２つのペプチドエピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬを、データベース検索により、およびそれらの対応する合成ペプチドとのスペクトル一致により同定することに成功した。各ペプチドエピトープの理論的および実験的分子量が、関連する質量誤差と共に表２４に示されている。検索エンジンにより報告された骨格切断スコアおよびスコア化ピーク強度が表２５に列挙されている。
図２６および図２７は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２のペプチドエピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬのスペクトル比較をそれぞれ示す。
ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１の場合、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する８つのペプチドエピトープを、ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより標的とした。共通領域に由来する１つのペプチドエピトープＥＳＫＩＭＦＡＴＬを、データベース検索により、および対応する合成ペプチドとのスペクトル一致により同定することに成功した。このペプチドは、側鎖への酸素の付加を示す１５．９９９Ｄａの質量シフトをもたらした、メチオニンのスルホキシド形態で検出された。メチオニンのスルホキシド形態への酸化（小文字のｍで示されている）は、試料プロセシングの一般的な結果である。ＥＳＫＩｍＦＡＴＬの理論的および実験的分子量が、関連する質量誤差と共に表２４に示されている。検索エンジンにより報告された骨格切断スコアおよびスコア化ピーク強度が表２５に列挙されている。
図２８は、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１ペプチドエピトープＥＳＫＩｍＦＡＴＬのスペクトル比較を示す。
標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、およびＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１ヘテロダイマーに結合すると予測された、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に由来する５つのペプチドエピトープのプロセシングおよび提示を検証した。各クラスＩ ＨＬＡヘテロダイマーのアルファ鎖に遺伝子発現された親和性タグを使用してＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、クラスＩ ＨＬＡヘテロダイマーを精製した。各親和性タグ付きヘテロダイマー（ＢＡＰタグ付きＨＬＡアレル）を、ＲＰ１９－００５に記載のように、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。各標的化ペプチドエピトープの正しい線形配列を、ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチド配列決定により確認した。すべてのＭＳ／ＭＳスペクトルは、実験的ＭＳ／ＭＳスペクトルを、全長ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを含む＞６３，０００個のエントリーで構成されるデータベースからのペプチドに対して照合したＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌデータベース検索ワークフローで解釈した。観察された各ペプチドエピトープの分子量は、その分子量理論値の＋／－０．０１Ｄａ以内で算出された。実験的ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈は、ＭＳ／ＭＳスペクトルのイオン電流の≧７２％が、配列特異的断片イオンにより説明できることを示した。内因的にプロセシングされたペプチドエピトープ配列の追加の確認は、同一の断片イオン質量および骨格切断パターンを示した対応する合成ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルとスペクトルを照合することにより実施した。併せて、標的化ｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペプチドエピトープＳＭＬＴＧＰＰＡＲＶおよびＭＬＴＧＰＰＡＲＶ、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２ペプチドエピトープＫＰＫＲＤＧＹＭＦおよびＫＰＫＲＤＧＹＭＦＬ、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１ペプチドエピトープＥＳＫＩＭＦＡＴＬが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で内因的にプロセシングされ、その後ＨＬＡヘテロダイマーにより結合したことが確認された。
（実施例２３）
ＭＨＣ Ｉに対する免疫原性
この実施例では、種々の高出現率ＨＬＡアレルに対するＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの免疫原性を評価する。ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦは、少なくとも６１個の新規アミノ酸によるタンパク質の伸長をもたらす、天然終止コドンの前に生じるフレームシフト突然変異である。免疫原性を、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、Ａ０３：０１、Ａ２４：０２、Ｂ０７：０２、またはＢ０８：０１に特異的な予測最小エピトープに対する健康なドナー（ＨＤ）ＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導により評価した。
材料および方法
表２６は、アレル制限に基づいて調製されたペプチドプールを列挙している
表２７は、健康なドナーの情報を列挙している
Ｎ／Ａ＝ドナーは特定のアレルがホモ接合性である。エピトープ標的化アレルは、太字である。
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を使用してＤＣを刺激する誘導
ＦＬＴ３Ｌ刺激を、以下の方法で実施した。ＰＢＭＣを解凍し、５×１０＾７細胞／ｍＬでＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ７０７４６）を２５～２９Ｕ／μＬで添加し、３７℃で３０分間～１時間インキュベートした。製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ １３０－０５０－２０１、１３０－０９２－９８３）に従ってＣＤ１４／ＣＤ２５枯渇を実施して、単球（ＣＤ１４）およびＴ制御性細胞（ＣＤ２５）を除去した。２×１０＾６細胞／ｍＬの細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１５－０５０）を有するＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェル当たり２ｍＬで一晩播種した。ＡＩＭ－Ｖで希釈したペプチドを、２ｕＭの最終濃度で添加し、ウェルを穏やかに混合した。細胞を、ペプチドと共に３７℃で１時間インキュベートした。
腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－ａ）（１０００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０６－０５０）、ＩＬ－１ｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１１－０５０）、プロスタグランジン－Ｅ１（ＰＧＥ－１）（０．５μｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－７（０．５ｎｇ／ｍＬ）を有する成熟カクテルを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。成熟カクテルでの一晩のインキュベーション後、ＦＢＳを、１０体積％の最終濃度で各ウェルに添加し、混合した。５日目から開始して２～３日毎に、ウェル中の最終濃度が５ｎｇ／ｍＬになるような十分なＩＬ－７およびＩＬ－１５を有する新鮮なＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ）＋１０％ＦＢＳで、培地の７５％を注意深く置き換えることにより、共培養に栄養供給した。最初の栄養供給後の栄養供給の場合、ウェル中の最終濃度が５ｎｇ／ｍＬになるような十分なＩＬ－７およびＩＬ－１５を有する新鮮な２０／８０＋１０％ＦＢＳで培地を置き換えた。ｍＤＣ生成を、４日目に開始した。
成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の生成
ＰＢＭＣを解凍し、５×１０＾７細胞／ｍＬで樹状細胞（ＤＣ）培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ２０８０１－０５００）に再懸濁した。ベンゾナーゼ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ ７０７４６）を２５～２９Ｕ／ｕＬで添加し、３７℃で３０分間～１時間インキュベートした。
汎単球単離を、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ １３０－０９６－５３７）に従って実施した。細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（８００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１２－０５０）およびＩＬ－４（４００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０３－０５０）を有する６ウェルプレートの２ｍＬ ＤＣ培地に３×１０＾６細胞／ウェルで播種し、３７℃で５日間インキュベートした。
ペプチド負荷および成熟を、以下の様式で実施した。ｉｍｍＤＣを、ピペットすることによりウェルから収集し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離することによりペレット化した。細胞を、１ｍＬでＤＣ培地に再懸濁した。細胞を、各プールについて１ウェル当たり０．２×１０＾６（または０．５×１０＾６）細胞を有するプールに分割し、１．６ｕＭのペプチド（０．４ｕＭ最終濃度）と共に３７Ｃで１時間インキュベートした。１ウェル当たり８００ｕＬ（または２ｍＬ）のＤＣ培地を、ペプチド負荷ｉｍｍＤＣに添加し、以下のサイトカインを有する６ウェルプレートに播種し、３７℃で２日間インキュベートした：ＩＬ－４（４００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０３－０５０）、ＧＭ－ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１２－０５０）、ＴＮＦ－ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０６－０５０）、ＩＬ－１ｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１１－０５０）、ＰＧＥ－１（０．５μｇ／ｍＬ）（チェコ共和国のＣａｙｍａｎ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １００４－５０）。
成熟樹状細胞媒介性長期刺激（ｍＤＣ ＬＴＳ）
１２日目に、ＦＬＴ３Ｌで刺激したＴ細胞を添加した。ＤＣを、１ｍＬの２０／８０に再懸濁した。共培養ウェルを回収および計数し、細胞を、５×１０＾６／ｍＬで２０／８０に再懸濁した。１ｍＬのナイーブＴ細胞を、サイトカインＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ） ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）と共に１０：１（Ｔ細胞：ｍＤＣ）の比でｍＤＣに添加した。最終体積が１ウェル当たり５ｍＬになるように培地を添加した。共培養物を３７℃でインキュベートした。共培養物には、１５日目から開始して２～３日毎に栄養供給した。必要に応じて、細胞をより大きい体積のフラスコに拡大増殖させた。
方程式９． 添加する培地（ｍＬ）＝（現在の体積（ｍＬ）×（１８０－グルコース））／６０
２３日目に、培養物を新しいｍＤＣで再刺激した。ＤＣを、１ｍＬの２０／８０に再懸濁した。共培養ウェルを回収し、細胞を、２ｅ６／ｍＬ（または５ｅ６／ｍＬ）で２０／８０に再懸濁した。１ｍＬのナイーブＴ細胞を、サイトカインＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）
ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）と共に１０：１（Ｔ細胞：ｍＤＣ）の比でｍＤＣに添加した。最終体積が１ウェル当たり５ｍＬになるように培地を添加した。共培養物を３７℃でインキュベートした。共培養物には、２～３日毎に栄養供給した。必要に応じて、細胞をより大きい体積のフラスコに拡大増殖させた。
方程式９． 添加する培地（ｍＬ）＝（現在の体積（ｍＬ）×（１８０－グルコース））／６０
３１日目に、細胞を、１ｍＬ凍結培地（９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）で凍結した。細胞を、－８０℃にて一晩、ＣｏｏｌＣｅｌｌ Ｆｒｅｅｚｅ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＶＷＲ ７５７７９－８１６）で維持してから、長期保管のために液体窒素に移した。
マルチマー生成および分析
ペプチド交換モノマー
ＵＶ切断可能なペプチドを負荷したＨＬＡ ＭＨＣクラスＩモノマーを内部的に生成した。モノマーを、１００ｕｇ／ｍＬで濾過ＰＢＳに再懸濁し、アッセイペプチドを、１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに再懸濁し、ＵＶ切断可能なペプチドを、ＵＶ光下で１時間４℃にて個々のアッセイペプチドと１ｕＬペプチド：５０ｕＬモノマーの比で交換した。交換したモノマーを、３６００ＲＰＭで遠心沈降させ、上清を収集した。
蛍光色素コンジュゲーション
５０ｕＬのｐＭＨＣを、以下の蛍光色素のコンジュゲーション比（ＣＲ）の各々に従って、暗所の氷上で３０分間ストレプトアビジン標識蛍光色素と組み合わせた：ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２０３）（ＣＲ：２）；ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２０７）（ＣＲ：３）；ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２２６）（ＣＲ：２）；ＱＤ６０５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｑ１０１０１ ＭＰ）（ＣＲ：２）；ＱＤ７０５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｑ１０１６１ ＭＰ）（ＣＲ：２）；ＢＵＶ３９５（ＢＤ ５６４１７６）（ＣＲ：２）；ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３８５５）（ＣＲ：２）。各ｐＭＨＣを分割し、２つの個々の蛍光色素にコンジュゲートさせた。ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ ＢＩＯ２００）＋０．５％アジドを１：２０の比で添加し、マルチマーを４℃で１～３日間、暗所にて保管した。１１日目、２２日目、および凍結後に、フローサイトメトリー読出しを得た。約２×１０＾６細胞を、ポリプロピレンＶ底９６ウェルプレートの２５～２９Ｕ／ｕＬのベンゾナーゼ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ
７０７４６）を有する培地に収集し、３７℃で３０分間～１時間インキュベートした。
細胞を、５０ｕＬの濾過リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、誘導されたペプチドが負荷された以下のすべての蛍光色素コンジュゲートマルチマーを用いて、１５分間３７℃で暗所にて染色した。ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２０３）１ｕＬ； ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２０７）３ｕＬ；ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４０５２２６）１ｕＬ；ＱＤ６０５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｑ１０１０１ ＭＰ）４．５ｕＬ；ＱＤ７０５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｑ１０１６１ ＭＰ）４．５ｕＬ；ＢＵＶ３９５（ＢＤ ５６４１７６）３．５ｕＬ；ＢＶ６５０（ＢＤ ５６３８５５）２．５ｕＬ。試料を、暗所の氷上にて３０分間、以下の表面抗体で染色した。分化クラスター（ＣＤ）８（＋）／ＣＤ４（－）／ＣＤ１４（－）／ＣＤ１６（－）／ＣＤ１９（－）／Ｄｅａｄ（－）／マルチマー＿１（＋）／マルチマー＿２（＋）／無関連マルチマー（－）：ＣＤ８－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７０４）２ｕＬ、ＣＤ４－ＡＦ７００（ＢＤ ５５７９２２）１ｕＬ、ＣＤ１４－ＡＦ７００（ＢＤ ５５７９２３）１ｕＬ、ＣＤ１９－ＡＦＦ７００（ＢＤ ５５７９２１）１ｕＬ、ＣＤ１６－ＡＦ７００（ＢＤ ５５７９２０）１ｕＬ、Ｌｉｖｅ ｄｅａｄ染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐｒｏｂｅｓ Ｌ－２３１０１）０．１ｕＬをＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
結果
各試料を、ドナーがそれに対して誘導されたすべてのペプチド毎に、蛍光色素組合せが固有である２つのマルチマーで染色した。陽性誘導は、少なくとも１０個の事象が、少なくとも１つの特定の蛍光色素組合せに対して陽性であり、無関連蛍光色素組合せに対して陰性であることにより決定した。データを各刺激後に収集し、２つの刺激にわたって結果が陽性であったものを陽性誘導とみなした。図２９Ａおよび図２９Ｂは、ＧＡＴＡ３ネオ抗原ＣＤ８＋応答の代表的な誘導を示す。
表２８は、陽性ＧＡＴＡ３ネオ抗原ＣＤ８＋応答のパーセンテージを示す
表２８は、２つの独立した刺激にわたって確認されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞誘導をもたらした複製物のパーセンテージを報告している。
これらの結果は、５つのアッセイしたＨＬＡのうちの４つに対してＣＤ８＋特異的誘導をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる少なくとも１つの最小エピトープがＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ内に存在することを示す。結果により、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦのすべてのＨＬＡにわたる広範な免疫原性が示され、高出現率のＨＬＡに特異的な免疫原性最小ネオ抗原エピトープが同定される。
（実施例２４）
ＭＨＣ ＩＩに対する免疫原性
この実施例では、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに特異的なロングマーペプチド（＞１５個のアミノ酸）のＣＤ４免疫原性を評価する。ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＤ４免疫原性を予測するため、最小ＨＬＡ－クラスＩＩオーバーラップを有する５人の異なる健康なドナーに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導アッセイを使用した。
材料および方法
下記の表２９は、誘導ペプチドを列挙している
下記の表３０は、健康なドナーの情報を提供した
成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の生成
単球単離
ＰＢＭＣを解凍し、５×１０＾７細胞／ｍＬで樹状細胞（ＤＣ）培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ２０８０１－０５００）に再懸濁した。ベンゾナーゼ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ ７０７４６）を２５～２９Ｕ／ｕＬで添加し、３７℃で３０分間～１時間インキュベートした。汎単球単離を、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ １３０－０９６－５３７）に従って実施した。細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ－４（４００Ｕ／ｍＬ）を有する６ウェルプレートの２ｍＬ ＤＣ培地に３×１０＾６細胞／ウェルで播種し、３７℃で５日間インキュベートした。
ペプチド負荷および成熟
ｉｍｍＤＣを、ピペットすることによりウェルから収集し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離することによりペレット化した。細胞を、１ｍＬでＤＣ培地に再懸濁した。細胞を、各プールについて１ウェル当たり０．２×１０＾６（または０．５×１０＾６）細胞のプールに分割し、１．６ｕＭのペプチド（０．４ｕＭ最終濃度）と共に３７℃で１時間インキュベートした。１ウェル当たり８００ｕＬ（または２ｍＬ）のＤＣ培地を、ペプチド負荷ｉｍｍＤＣに添加し、以下のサイトカインを有する２４（または６）ウェルプレートに播種し、３７℃で２日間インキュベートした：ＩＬ－４（４００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０３－０５０）、ＧＭ－ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１２－０５０）、ＴＮＦ－ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４０６－０５０）、ＩＬ－１ｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １４１１－０５０）、ＰＧＥ－１（０．５μｇ／ｍＬ）（チェコ共和国のＣａｙｍａｎ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ １００４－５０）。
長期刺激（ＬＴＳ）
ナイーブＴ細胞を添加した。ＰＢＭＣを解凍し、５×１０＾７細胞／ｍＬでＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ２０８０１－０５００）に再懸濁した。ベンゾナーゼ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ ７０７４６）を２５～２９Ｕ／ｕＬで添加し、３７℃で３０分間～１時間インキュベートした。
ＣＤ１４／ＣＤ２５枯渇を、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ １３０－０５０－２０１、１３０－０９２－９８３）に従って実施して、単球（ＣＤ１４）およびＴ制御性細胞（ＣＤ２５）を除去した。１ｍＬのナイーブＴ細胞を、サイトカインＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ） ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ；ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）と共に１０：１（Ｔ細胞：ｍＤＣ）の比でｍＤＣに添加した。共培養物を３７℃でインキュベートした。ｍＤＣは、２０／８０に再懸濁したか、またはサイトカインと共にＤＣ培地で維持したかのいずれかであった。
共培養物には、５日目から開始して２～３日毎に、下記の方法１または方法２（２．３．２．１．１または２．３．２．１．２）のいずれかに従って栄養供給した。必要に応じて、細胞をより大きい体積のフラスコに拡大増殖させた。
方法１の場合、添加する培地を、（ｍＬ）＝（現在の体積（ｍＬ）×（１８０－グルコース））／６０のように算出した。方法２の場合、グルコース計を使用して培地が黄色か否かを調べた。グルコースが高いままである場合（＞９０ｍｇ／ｄＬ）、１００ｕＬの２０×ＩＬ－７およびＩＬ－１５をウェルに添加した。グルコースが低い場合（＜９０ｍｇ／ｄＬ）、細胞を６ウェルプレートに拡大増殖し（４ｍＬ／ウェル）、１×ＩＬ－１５およびＩＬ－７で補完した。グルコースが非常に低い場合（＜６０ｍｇ／ｄＬ）、６ウェルプレートで６ｍＬ／ウェルに拡大増殖した。６および１３または１４日目に、新しいｍＤＣが生成された。
１３および２１または２２日目に、新しいｍＤＣの培養物を再刺激した。共培養ウェルを回収し、計数し、細胞を２×１０＾６／ｍＬ（または５×１０＾６／ｍＬ）で２０／８０に再懸濁した。１ｍＬのナイーブＴ細胞を、サイトカインＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ） ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）と共に１０：１（Ｔ細胞：ｍＤＣ）の比でｍＤＣに添加した。共培養物を３７℃でインキュベートした。ｍＤＣは、２０／８０に再懸濁したか、またはサイトカインと共にＤＣ培地で維持したかのいずれかであった。２８または２９日目に、細胞を、１ｍＬ凍結培地（９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）で凍結した。細胞を、－８０℃にて一晩、ＣｏｏｌＣｅｌｌ Ｆｒｅｅｚｅ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＶＷＲ ７５７７９－８１６）で維持してから、長期保管のために液体窒素に移した。
ＣＤ４リコールアッセイ
新しいｍＤＣを生成したか、または同じ誘導ドナーに由来する新鮮なＰＢＭＣを解凍したかのいずれかであった。細胞を、０．２６／ウェルのＰＢＭＣおよび０．０２×１０＾６個／ウェルのｍＤＣで、０．８ｕＭの最終濃度ペプチドまたはＤＭＳＯ有りの９６ウェルｕ底プレートに播種する。誘導試料を、１：１の誘導：ＰＢＭＣまたは１０：１の誘導：ｍＤＣの比でウェルに添加し、３２℃で２０～２４時間インキュベートした。
フローサイトメトリー読出し
Ｇｏｌｇｉ ｓｔｏｐ（ＢＤ ５５４７２４）および ｇｏｌｇｉ ｐｌｕｇ（ＢＤ ５５５０２９）を、製造業者のプロトコールに従って培養物に添加し、４時間インキュベートした。細胞をＣＤ４－ＢＶ７８６（ＢＤ ５６３８７７）、ＣＤ８－ＡＦ７００（ＢＤ ５６１４５３）、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＢＤ ３４０６８２）、ＣＤ１６－ＦＩＴＣ（ＢＤ ３４０７０４）、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ（ＢＤ ３４０８６４）、Ｌｉｖｅ ｄｅａｄ染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ Ｌ－２３１０１）で２０分間染色した。試料を、製造業者のプロトコールに従って固定／透過化キット（ＢＤ ５５４７１４）を使用して固定した。細胞を、ＩＦＮ－ｙ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５０２５０８）で２０分間染色した。分析は、ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａで、ＣＤ４（＋）／ＣＤ８（－）／ＣＤ１４（－）／ＣＤ１６（－）／ＣＤ１９（－）、Ｄｅａｄ（－）／ＩＦＮｙ（＋）について行った。
結果
フローサイトメトリーを使用して、抗原特異的なＣＤ４ Ｔ細胞を同定した（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。試験したすべての健康なドナーにおいて、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ペプチドに対する少なくとも１つの誘導が同定された。
誘導された細胞を個々のペプチドに対してリコールし、ペプチド無しでのリコールと比較することにより、特異的な反応性ペプチドを同定した。各誘導試料を、まず誘導プールに対して分析し、その後陽性試料を、個々のペプチドに対してリコールした。すべての試料を二連プレートで分析し、ペプチドを有する誘導試料の平均ＣＤ４＋／ＩＦＮｙ＋パーセンテージが、ペプチドを有しない同じ試料と比較して２％よりも大きかった場合、試料をヒットとみなした。
表３１は、ＧＡＴＡ３ネオ抗原ＣＤ４応答のパーセンテージを示す
太字の配列は、すべての患者に共通するＧＡＴＡ３ネオＯｒｆの領域にある
試験したすべての健康なドナーにおいて、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦの共通領域に対して少なくとも１つのＣＤ４特異的応答が観察された。これらのドナーは、幅広い範囲のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡアレルを有しており、これは、ＣＤ４ ＧＡＴＡ３応答を生成する能力が、アレルに依存しないことを示す。
（実施例２５）
誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞による機能アッセイ
この実施例は、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）新規オープンリーディングフレーム（ネオＯＲＦ）に由来するネオ抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の、適切なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を内包する細胞を死滅させる能力を示す。ネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、実施例２３において以前に記載されており、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を内包する細胞系の生成は、実施例２１に記載されている。
この実施例では、ＨＬＡ－Ａ０２：０１に提示されたＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来する単一エピトープ（ペプチド配列ＭＬＴＧＰＰＡＲＶにより網羅される）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、この詳細な分析のために選択した。手短に言えば、誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを形質導入したかまたは陰性対照として未操作であったかのいずれかの標的細胞と共に共培養した。共培養の後、誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞傷害性の尺度として、細胞死のマーカーであるカスパーゼ３の発現について標的細胞を評価した。未操作細胞と比較して、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを発現する標的細胞でのカスパーゼ３の増加は、同族エピトープが標的細胞の表面上に提示されていることに起因する特異的な死滅であることを表す。加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原特異的Ｔ細胞活性化を測定するために、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ１０７ａの発現について評価した。ＧＡＴＡ３により誘導したＰＢＭＣの抗原特異的認識をさらに評価するため、抗原認識時にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞により産生されるサイトカインであるＩＦＮ－γも上清で測定した。
合計で、ＨＬＡ－Ａ０２：０１に対するＧＡＴＡ３ ネオＯＲＦエピトープに特異的な４つの異なるＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、突然変異を内包する標的細胞を死滅させる能力について試験した。４つの場合すべてにおいて、突然変異を有しない標的細胞と比較して、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦを内包する標的細胞にてカスパーゼ３の増加が観察された。カスパーゼ３の増加は、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来するエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を内包する細胞を死滅させる能力を示す。
材料および方法
細胞傷害性アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、メリーランド州、米国）から購入し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ培地で維持した。ＧＡＴＡ３遺伝子がコードされたレンチウイルスを生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入した。ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全培地中の１μｇ／ｍＬピューロマイシン下で２週間よりも長く維持した。さらなる詳細は、実施例２１に記載されている。
１ｍＬ中１×１０７個の標的細胞を、１μＬのＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に添加し、続いて５％ＣＯ２インキュベーターで２０分間インキュベートし、１０％ＦＢＳで５ｍＬの培養培地を２回洗浄し、細胞を１×１０６細胞で培養培地に再懸濁した。
誘導されたＰＢＭＣのバイアルを、３７℃の水浴に入れることにより解凍した。次いで、１ｍＬのＦＢＳを各バイアルに添加した。細胞を、ＡＩＭ－Ｖ、１０％ＦＢＳ、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ培地の１５ｍｌ培養培地を含有する５０ｍＬコニカルチューブに移した。細胞を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍＬの培養培地に再懸濁した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターに３７℃にて１時間３０分静置してから、５μＬのベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を添加し、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間３７℃にてさらにインキュベートした。インキュベートした細胞を再び遠心分離し、上清を除去した後、５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。Ｖｉ－ＣＥＬＬ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞数を計数した。
細胞を遠心分離し、１×１０７個の標的細胞当たり４０μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ８＋陽性細胞を、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従って陰性富化した。ＣＤ８＋細胞を、２．５×１０６個の細胞で１ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。１ウェル当たり５×１０４個の標的細胞を、９６ウェル平底プレートの５０μＬの培養培地に接種し、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩３７℃にて培養した。ＧＡＴＡ３により誘導したおよびＣＤ８＋富化した細胞を、１００μＬ ＡＩＭ－Ｖ培地中の１ウェル当たり２．５×１０５細胞で標的細胞に接種した。共培養細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間３７℃にてインキュベートした。
共培養物の培養上清を回収し、製造業者のプロトコール（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に従ってＶ－ＰＬＥＸヒトＩＦＮ－γアッセイによりＩＦＮ－γ濃度を評価した。
懸濁細胞を、新しい染色プレートに移し、１ウェル当たり５０μＬのトリプシンを添加し、３７℃でインキュベートし、ＡＩＭ Ｖ培地に再懸濁した後で付着細胞を移した。細胞を合わせ、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。５０μＬの抗体混合物（抗ＣＤ３－ＢＵＶ８０５２、抗ＣＤ４－ＢＶ７１１、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ７８６、抗ＣＤ８＋－ＰＥ－ｃｙ５、およびＩＲ色素Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ；ＢＤ）を各試料に添加し、続いて氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。カスパーゼ－３細胞内染色を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ）の製造マニュアルに従って２μＬのカスパーゼ－３抗体を用いて実施した。染色された細胞を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩ（ＢＤ）で分析した。
結果
ＧＡＴＡ３により誘導したＰＢＭＣによる細胞傷害性アッセイ
３つの異なる健康なドナーのＰＢＭＣ（ＨＤ４７、ＨＤ５０、およびＨＤ５１）を、長期刺激法により、ＧＡＴＡ３ ＨＬＡ－Ａ：０２ネオ抗原ペプチドＭＬＴＧＰＰＡＲＶで誘導した。このエピトープ：アレルの組合せは、アレル頻度および細胞計数を考慮すると、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに関係する他のエピトープ：アレルと比較して細胞傷害性アッセイで試験するために最適であると決定した。図３１Ａ～３１Ｄは、マルチマー染色によるＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。これらのＴ細胞を、細胞傷害性アッセイのためのエフェクター細胞として選択した。
ＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を標的細胞として使用した（実施例２１）。また、形質導入されていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を陰性対照に使用した。エフェクター細胞および標的細胞の６時間の共培養後、形質導入されていない標的細胞での４回の実験では、平均で３．３％、３．７％、２．５％、および２．８％のカスパーゼ－３陽性細胞が見出され、ＧＡＴＡ３を形質導入した細胞では、それぞれ平均で４．４％、５．２％、６．３％、および６．９％のカスパーゼ－３陽性細胞が見られた（図３２）。ＨＤ５１に由来するＧＡＴＡ３により誘導したＰＢＭＣとの共培養では、顕著により高いカスパーゼ－３陽性標的細胞が観察された（図３３）。ＣＤ１０７ａ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い頻度が、ＧＡＴＡにより誘導した健康なドナーのＰＢＭＣの２つ（試料１および試料２）とのＧＡＴＡ３を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞共培養条件で観察された（図３４）。より高いレベルのＩＦＮ－γが、ＧＡＴＡにより誘導した健康なドナーのＰＢＭＣの２つ（試料１および試料２）との同じ条件の共培養で検出された（図３５）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを利用して、ＧＡＴＡ３フレームシフト突然変異を内包する細胞を認識および死滅させる、ＧＡＴＡ３ ネオＯＲＦに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を評価した。ＧＡＴＡ３フレームシフトペプチドＭＬＴＧＰＰＡＲＶで刺激した健康なドナーに由来するＨＬＡ－Ａ０２：０１に対するＧＡＴＡ３フレームシフトネオ抗原に特異的なＴ細胞を含むＰＢＭＣを、ＧＡＴＡ３フレームシフトワクチンから誘導され得るＴ細胞のタイプの代表として試験した。これらのＴ細胞は、標的細胞死マーカーであるカスパーゼ－３の存在をアッセイすることにより確認したところ、腫瘍細胞死に結び付いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ１０７ａおよびサイトカインＩＦＮ－γアッセイからの結果は、これらのペプチド誘導性Ｔ細胞が、ＧＡＴＡ３フレームシフトネオ抗原を天然でプロセシングおよび提示する細胞を認識および死滅させることができることをさらに示唆する。
（実施例２６）
ＴＣＲクローニングおよび機能アッセイ
実施例は、ＨＬＡ－Ａ０２：０１に対するＧＡＴＡ３ネオＯＲＦに由来するネオ抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローニングおよび機能アッセイを示す。ネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、実施例２３に記載されている。特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して単離し、ＴＣＲ配列を、１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓおよびＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して同定した。次いで、ＴＣＲの機能的特徴付けならびにＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を内包する細胞の表面でのネオ抗原のプロセシングおよび提示の評価の両方のために、選択したＴＣＲをＴ細胞系で組換え的に発現させた。その生成は実施例２１に記載されている。
ＴＣＲは、４０ｎＭ未満の結合力を有すると特徴付けられた。これにより、ＧＡＴＡ３ネオ抗原に対するＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することが可能であることが実証される。さらに、ＴＣＲは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を内包するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面にプロセシングおよび提示されたネオ抗原を認識することができ、これは、実施例２２の結果を支持しており、突然変異を内包する細胞の表面でのＧＡＴＡ３ネオ抗原のプロセシングおよび提示を実証する。
材料および方法
図３６～３８は、ＴＣＲクローニングおよび機能アッセイの概要を示す。マルチマーによるＧＡＴＡ３ ＣＤ８＋Ｔ細胞選別
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的Ｔ細胞を誘導し、拡大増殖した（実施例２３）。誘導された細胞を、ＧＡＴＡ３ ９量体ペプチドマルチマーおよび表面抗体（ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、および近ＩＲ蛍光反応性色素）で染色した。ＧＡＴＡ３マルチマーであり、ＣＤ８陽性であったＧＡＴＡ３特異的Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ融合（ＢＤ）により選別し、ＰＢＳ中２％ＦＢＳを含有する１．５ｍＬチューブに収集した。
１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓおよびＭｉＳｅｑによる単一Ｔ細胞ＴＣＲ配列決定
選別後、収集した細胞を単一細胞バーコード化のために直ちにプロセシングし、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊ試薬キット（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてｃＤＮＡを生成した。ＴＣＲ配列富化およびライブラリー構築を、製造業者のプロトコールに従って実施した。配列決定を、ＭｉＳｅｑ３００サイクル試薬キットおよびＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて１０ｐＭ規模で実施した。ＴＣＲ配列およびクローン性の分析を、Ｃｅｌｌ ｒａｎｇｅｒソフトウェアおよびＬｏｕｐｅ ＶＤＪブラウザー（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて行った。
ＴＣＲ遺伝子合成およびクローニング
選択したＴＣＲ配列を、哺乳動物系のためにコドン最適化した。ＴＣＲ ＤＮＡ配列は、ＧＥＮＥＷＩＺ（ニュージャージー州、米国）により合成し、レンチウイルスベクター（ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－Ｐｕｒｏ、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。レンチウイルスベクターは、ＥＦ１αプロモーター、続いてＴＣＲベータ、フューリン切断部位、Ｆ２Ａ、ＴＣＲアルファ、Ｔ２Ａ、およびピューロマイシン耐性部位を含有していた（図４０）。
レンチウイルス産生
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ ＴＣＲ遺伝子がコードされたレンチウイルスを生成するために、レンチウイルスベクター、パッケージングプラスミド、および新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、トランスフェクション法により使用した。トランスフェクションおよび回収の詳細は、実施例２１に記載されている。
Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＰＢＭＣへの形質導入
ＴＣＲベータを欠如する改変Ｊｕｒｋａｔ（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５、ＡＴＣＣ）細胞を、ＣＤ８＋アルファ遺伝子をコードするレンチウイルスによりＣＤ８＋アルファ鎖を発現するように改変した。改変Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＧＡＴＡ３ ＴＣＲレンチウイルスの形質導入に使用した。１．８×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を、２４ウェルプレートの１０％ＦＢＳおよび６μｇ／ｍＬのポリブレンを有する１．２ｍＬ ＲＰＭＩ－１６４０培地に接種した。０．６ｍＬのＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲレンチウイルスを細胞に添加した後、プレートを、２，４００ｒｐｍで４５分間３２℃にて遠心分離した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ－１６４０培地で１０日間維持した。
ペプチド滴定によるＩＬ－２放出アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ細胞にクローニングしたＴＣＲの感度を評価するために、ペプチド滴定アッセイを実施した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＴＣＲシグナル伝達に応答して特異的にＩＬ－２を分泌する。このアッセイで用いられるＪｕｒｋａｔ細胞は内因性ＴＣＲベータを欠如するため、これらの細胞の表面上のＴＣＲは、明らかに、クローニングしたＴＣＲである。広範囲の濃度にわたって、ペプチドを、関連ＨＬＡ（ＨＬＡ－Ａ０２：０１）を有するがＧＡＴＡ３突然変異を有していないＨＥＫ２９３Ｔ標的細胞に添加して、最大ＩＬ－２分泌を評価し、この最大分泌の５０％を放出するのに必要なペプチドの濃度（ＥＣ５０）を推定した。このＥＣ５０を、ＴＣＲの結合力とした。ＨＬＡ：Ａ０２．０１を内因的に発現する２０，０００個の未改変ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中の１００μＬ ＧＡＴＡ３ペプチドまたは２０μＭ～２ｐＭ濃度範囲の無関連ペプチドを添加した９６ウェルプレートに接種した。３７℃での一晩のインキュベーション後、２００，０００個のＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、１０：１のＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞のペプチド負荷ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する比で各ウェルに添加した。共培養物を、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間３７℃でインキュベートした。各ウェルから５０μｌの上清を回収し、ヒトＩＬ－２の濃度を、製造業者のプロトコールに従ってＭｅｓｏ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙキットにより測定した。
ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入した標的細胞によるＩＬ－２放出アッセイ
真にプロセシングおよび提示されたネオ抗原を認識するＴＣＲの能力を評価するため、ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ標的細胞の共培養。しかしがら、この系では、ペプチドを外因的に添加しなかった。代わりに、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦまたは無関連遺伝子のいずれかを形質導入した細胞系を標的として利用した。このように、ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞がその標的を認識するためには、ＧＡＴＡ３ネオ抗原がプロセシングされ、標的細胞の表面に提示されなければならない。
ＧＡＴＡ３突然変異または無関連遺伝子を形質導入した２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに接種した。一晩のインキュベーション後、２００，０００個のＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を各ウェルに添加した。共培養物を、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間３７℃でインキュベートした。各ウェルから５０μｌの上清を回収し、ヒトＩＬ－２の濃度を、製造業者のプロトコール（Ｍｅｓｏ ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に従ってＭｅｓｏ ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙキットにより測定した。
結果
ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞選別
ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦペプチドＭＬＴＧＰＰＡＲＶによる長期刺激後、健康なドナー４２のウェル番号５では、ＧＡＴＡ３ ＨＬＡ－Ａ０２マルチマーにより２．１％のＧＡＴＡ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。マルチマー二重陽性の５，４０２個の細胞を、ＦＡＣＳＡＲＩＡにより選別した（図３９）。選別された細胞は、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖ（Ｄ）Ｊキットでバーコード化された単一細胞であった。ＴＣＲアルファおよびベータ対配列を、Ｌｏｕｐｅ Ｖ（Ｄ）Ｊブラウザーで分析した。優性クロノタイプ（クロノタイプ１）は、それぞれ、ＣＤＲ３ ＴＣＲのアルファおよびベータアミノ酸配列の配列ＣＡＬＤＩＹＧＮＮＲＬＡＦおよびＣＡＳＳＬＤＦＶＬＡＧＳＹＳＹＥＱＦＦを有する。クロノタイプ２は、ＴＣＲアルファの配列を有していないクロノタイプ１と同じＴＣＲベータ配列を有する。クロノタイプ４は、ＴＣＲベータの配列を有していないクロノタイプ１と同じＴＣＲアルファ配列を有する。クロノタイプ１、２、および４の合計割合は、全ＴＣＲクロノタイプの８２．５％であり、他のクロノタイプは１％未満であった（表３２）。
下記の表３２は、例示的なＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲクロノタイプ分析を示す
ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ ＤＮＡ合成およびクローニング
クロノタイプ１ ＴＣＲアルファおよびベータ配列を、ヒト細胞系およびＰＢＭＣでの最大発現のために、ヒトコドン使用頻度に従ってコドン最適化した（表３２）。ＴＣＲ遺伝子がコードされたレンチウイルスプラスミド（図４０）を、ＤＮＡ配列決定および制限酵素消化により評価した。最終的なＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ＴＣＲがコードされたプラスミドのＤＮＡ配列データは、ＴＣＲアルファおよびベータコドン最適化配列と１００％一致する（図４１の太字）。制限酵素ＡｆｌＩＩでの消化後、２つのＤＮＡバンドが観察された。一方のバンドは６０００ｂｐ～５０００ｂｐの間、他方のバンドは４０００ｂｐ～３０００ｂｐの間。これらのバンドは、それぞれ５５９０ｂｐおよび３４２４ｂｐの予想サイズと相関する（図４２）。
下記の表３３は、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲアルファおよびベータＤＮＡ配列およびコドン最適化配列を示す
ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ発現
ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを発現させたＪｕｒｋａｔ細胞の場合、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ構築物でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のトランスフェクション後、レンチウイルス系を使用し、レンチウイルスをＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。形質導入し、ピューロマイシンで選択したＪｕｒｋａｔ細胞を、ＧＡＴＡ３マルチマー－ＰＥおよびＧＡＴＡ３マルチマー－ＢＶ６５０で染色し、形質導入されていないＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲ発現を検証した。７３．１％の細胞が、ＧＡＴＡ３マルチマー－ＰＥおよびＧＡＴＡ３マルチマー－ＢＶ６５０の両方に陽性であり、これは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ特異的ＴＣＲの発現を示す（図４３）。
ペプチド滴定試験
組換えＴＣＲが機能性であることを検証するため、２０μＭ～０．２ｐＭのペプチド濃度を、ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞で試験した。Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ－２分泌レベルは、ＧＡＴＡ３ペプチド濃度と非線形相関性を示し、ＥＣ５０＝３７．８５ｎＭが観察された（図４４）。
ＧＡＴＡ３特異的ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔのＩＬ－２放出アッセイ
ＧＡＴＡ３突然変異特異的ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔによる内因性ＧＡＴＡ３突然変異抗原の認識を検証するため、突然変異を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を標的細胞として使用し、ＧＡＴＡ３ ＴＣＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞と共に共培養した。ＩＬ－２レベルは、図４５では、ＧＡＴＡ３突然変異ペプチド負荷ＨＥＫ２９３Ｔ細胞群（円形）の方が、無関連ペプチド負荷細胞群（三角形）よりも高かった。また、ＩＬ－２レベルは、図４５では、ＧＡＴＡ３突然変異を形質導入した標的細胞群（四角形）の方が、無関連遺伝子を形質導入した標的細胞群（逆三角形）よりも高かった。
この研究では、ＨＬＡ－Ａ０２：０１に提示されたＧＡＴＡ３ネオ抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞からＴＣＲをクローニングした。ＴＣＲの結合力は、ペプチド滴定により４０ｎＭ未満（ＥＣ５０）であると画定され、ＴＣＲは、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ発現細胞系を認識することができた。これらのデータにより、ＧＡＴＡ３ネオＯＲＦ突然変異を有する細胞を認識することができる強力なＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の生成が確認される。
下に記載の実施例２７～実施例４１は、突然変異型ＢＴＫおよび突然変異型ＥＧＦＲペプチドに関する
（実施例２７）
細胞内サイトカイン染色アッセイ
ＢＴＫネオ抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導ならびにテトラマー染色アッセイを、実施例１および実施例２に記載のように実施する。ＥＧＦＲネオ抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導ならびにテトラマー染色アッセイを、実施例１および実施例２に記載のように実施する。抗原特異的Ｔ細胞集団を同定するための十分に確立されたテトラマー染色の非存在下では、抗原特異性は、十分に確立されたフローサイトメトリーアッセイを使用したサイトカイン産生の評価を使用して推定することができる。手短に言えば、Ｔ細胞を、目的のペプチドで刺激し、対照と比較する。刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）を、細胞内染色により評価する。これらのサイトカイン、特にＩＦＮγを、刺激された細胞を同定するために使用することができる。突然変異型ＢＴＫを負荷したまたは負荷しないＡＰＣで刺激された健康なドナーに由来するＣＤ４＋細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルの抗原特異的誘導のＦＡＣＳ解析を実施する。突然変異型ＥＧＦＲペプチドで負荷したまたは負荷しないＡＰＣで刺激された健康なドナーに由来するＣＤ４＋細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルの抗原特異的誘導のＦＡＣＳ解析を実施する。
（実施例２８）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ペプチド特異的Ｔ細胞を機能的に数える。このアッセイでは、Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を単一細胞に基づいて測定する。標的細胞（Ｔ２またはＨＬＡ－Ａ０２０１をトランスフェクトしたＣ１Ｒ）に、１０μＭペプチドで３７℃で１時間パルスし、３回洗浄した。１×１０５個のペプチドパルス標的を、免疫原性培養物から採取した様々な濃度のＴ細胞（５×１０２～２×１０３個）と共に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートウェルで共培養する。プレートを、製造業者のプロトコールに従って発色させ、付属のソフトウェアを用いてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析する。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットを、播種したＴ細胞の１個当たりの絶対スポット数として報告する。改変ペプチドで拡大増殖したＴ細胞を、改変ペプチドでパルスした標的を認識する能力だけでなく、親ペプチドでパルスした標的を認識する能力についても試験する。突然変異型ＢＴＫペプチドまたは突然変異型ＥＧＦＲペプチドをコードするレンチウイルス発現ベクターを疑似形質導入または形質導入した試料のＩＦＮγレベルを決定する。
（実施例２９）
ＣＤ１０７染色アッセイ
ＣＤ１０７ａおよびｂは、同族ペプチドによる活性化後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に発現される。Ｔ細胞の溶解性顆粒は、分子ＣＤ１０７ａおよびｂを含むリソソーム関連膜糖タンパク質（「ＬＡＭＰ」）を含有する脂質二重層を有する。細胞傷害性Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して活性化されると、これらの溶解性顆粒の膜が動員され、Ｔ細胞の原形質膜と融合する。顆粒内容物が放出され、これが標的細胞の死に結び付く。顆粒膜が原形質膜と融合すると、Ｃ１０７ａおよびｂは、細胞表面に露出するため、脱顆粒のマーカーである。ＣＤ１０７ａおよびｂ染色により測定される脱顆粒は、単一細胞に基づいて報告されるため、アッセイは、ペプチド特異的Ｔ細胞を機能的に数えるために使用される。アッセイを実施するために、ペプチドを、最終濃度が２０μＭになるようにＨＬＡ－Ａ０２：０１をトランスフェクトした細胞Ｃ１Ｒに添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄する。１×１０５個のペプチドパルスＣ１Ｒ細胞をチューブにアリコートし、ＣＤ１０７ａおよびｂに特異的な抗体を、製造業者（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が示唆する最終濃度になるように添加する。ＣＤ１０７分子がアッセイの経過中に一過性で表面に出現する際にＣＤ１０７分子を「捕捉」するために、Ｔ細胞の添加の前に抗体を添加する。次に、免疫原性培養物に由来する１×１０５個のＴ細胞を添加し、試料を３７℃で４時間インキュベートする。Ｔ細胞を、ＣＤ８などの追加の細胞表面分子についてさらに染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得する。付属のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してデータを分析し、結果を、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａおよびｂ＋細胞のパーセンテージとして報告する。
（実施例３０）
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害活性を、方法１または方法２を使用して測定する。方法１は、クロム放出アッセイを伴う。標的Ｔ２細胞を３７℃で１時間Ｎａ５１Ｃｒで標識し、洗浄する。次いで、５×１０３個の標的Ｔ２細胞を、免疫原性培養物に由来する様々な数のＴ細胞に添加する。３７℃での４時間のインキュベーション後に回収した上清中のクロム放出を測定する。特異的溶解パーセンテージを、以下のように算出する。
方程式１０． 実験放出－自然放出／放出合計－自然放出×１００
方法２では、フローサイトメトリーによる標的細胞中の切断されたカスパーゼ３の検出により、細胞傷害活性を測定する。標的がん細胞を、操作して、適切なＭＨＣ－Ｉアレルと共に突然変異型ペプチドを発現させる。疑似形質導入した標的細胞（すなわち、突然変異型ペプチドを発現しない）を、陰性対照として使用する。細胞をＣＦＳＥで標識して、エフェクター細胞として使用される刺激ＰＢＭＣと区別する。標的およびエフェクター細胞を、６時間共培養してから、回収する。細胞内染色を実施して、ＣＦＳＥ陽性標的がん細胞中のカスパーゼ３の切断型を検出する。特異的溶解パーセンテージを、以下のように算出する。
方程式１１． カスパーゼ３の実験切断／カスパーゼ３の自然切断（突然変異型ペプチド発現の非存在下で測定）×１００
方法２の細胞傷害性アッセイは、本明細書の実施例２５の材料および方法セクションに提供されている。
（実施例３１）
ロングマーおよびショートマーを逐次的に使用したｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強
ロングマーペプチドでのワクチン接種は、ペプチドのプロセシングおよび提示に応じて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導することができる。最小ショートマーエピトープによるワクチン接種は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成することに集中するが、抗原提示前のペプチドプロセシングを必要としない。そのため、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）だけでなく、任意の細胞がエピトープを容易に提示することができる。これは、末梢性寛容の一部として、抗原を提示する健康な細胞に接触するＴ細胞の寛容に結び付く場合がある。これを回避するために、ロングマーよる初期免疫化は、ペプチドをプロセシングおよび提示することができるＡＰＣによってのみ、ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを可能にする。その後の免疫化は、初期ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をブーストする。
ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性アッセイ
１９匹の８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、到着時にランダムに、かつ前向きに処置群に割り当てた。動物を、研究開始前に３日間順化させた。動物は、ＬａｂＤｉｅｔ（商標）５０５３滅菌げっ歯動物餌で維持し、滅菌水を自由に提供する。群１の動物は、ワクチン接種アジュバントのみの対照として役目を果たし、０、７、および１４日目に皮下注射（ｓ．ｃ．）により０．１ｍＬの体積で１００μｇのポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）単独を、投与する。群２の動物には、６つのロングマーペプチド（下に記載）の各々５０μｇを、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、０、７、および１４日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与する。群３の動物には、６つのロングマーペプチド（下に記載）の各々５０μｇを、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、０日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与し、モル一致当量の対応するショートマーペプチド（下に記載）を、１００μｇのポリＩ：Ｃと共に、７および１４日目に０．１ｍＬの体積でｓ．ｃ．投与する。動物を、毎日計量し、全体的な健康をモニターした。研究終了２１日目に、動物が０日目の体重と比較してその体重の＞３０％を喪失した場合、または動物が瀕死であると見出された場合、動物をＣＯ２過剰投与により安楽死させる。屠殺時に、脾臓を回収し、標準的プロトコールを使用して単一細胞懸濁液へと加工する。手短に言えば、脾臓を７０μＭフィルターに通して機械的に分解し、ペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶解してから、細胞培養培地に再懸濁する。
ペプチド
６つの以前に同定されたマウスネオ抗原を、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するそれらの実証されている能力に基づいて使用する。各ネオ抗原について、最小エピトープに対応するショートマー（８～１１個のアミノ酸）が画定されている。突然変異周囲の２０～２７個のアミノ酸に対応するロングマーを使用する。
ＥＬＩＳＰＯＴ
ＥＬＩＳＰＯＴ分析（マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｓｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ；ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、キットプロトコールに従って実施する。手短に言えば、分析日の前日に、９６ウェルフィルタープレート（０．４５μｍの孔径の疎水性ＰＶＤＦ膜；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を活性化し（３５％ＥｔＯＨ）、洗浄し（ＰＢＳ）、捕捉抗体でコーティングする（１：２５０；４℃ Ｏ／Ｎ）。分析日に、ウェルを洗浄し、ブロッキングする（培地；３７℃で２時間）。１００μＬ中およそ２×１０５個の細胞を、１００μＬの１０ｍＭ試験ペプチドプール（ショートマー）、またはＰＭＡ／イオノマイシン陽性対照抗原、またはビヒクルと共にウェルに添加する。細胞を、抗原と共に３７℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートする。翌日、細胞懸濁液を廃棄し、ウェルをＰＢＳで１回および脱イオン水で２回洗浄する。アッセイの残りのすべての洗浄ステップでは、各洗浄ステップにてウェルが３分間浸漬されることを可能にする。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で３回洗浄し、検出抗体（１：２５０）をすべてのウェルに添加する。プレートを室温で２時間インキュベートする。検出抗体溶液を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄する。アビジン－ＨＲＰ（１：２５０）をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。コンジュゲート溶液を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で３回、次いでＰＢＳで１回洗浄する。基質（３－アミノ－９－エチル－カルバゾール、０．１Ｍ酢酸緩衝液、Ｈ２Ｏ２）をすべてのウェルに添加し、スポット発色をモニターする（およそ１０分間）。ウェルを水で洗浄することにより基質反応を停止させ、プレートを一晩空気乾燥させる。プレートを、付属のソフトウェアを用いてＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析する。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットを、播種したＴ細胞の１個当たりの絶対スポット数として報告する。
（実施例３２）
質量分析による突然変異型ＢＴＫペプチドの検出
２９３Ｔ細胞に、突然変異型ＢＴＫペプチドの種々の領域をコードするレンチウイルスベクターを形質導入する。突然変異型ＢＴＫペプチドによりコードされるペプチドを発現する５０００万～１億個の形質導入した細胞を培養し、酸洗浄を使用してペプチドをＨＬＡ－ペプチド複合体から溶出させる。次いで、溶出したペプチドをＭＳ／ＭＳで分析した。
（実施例３３）
突然変異型ＢＴＫペプチドは、複数のアレルに対して強力なエピトープを産生する。
ネオエピトープを含有する複数のペプチドを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現または負荷する。次いで、質量分析を実施し、表記のＨＬＡアレルに対するネオエピトープの親和性、およびネオエピトープとＨＬＡアレルとの安定性を決定する。
（実施例３４）
複数のＢＴＫネオエピトープがＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する
ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、抗原特異的Ｔ細胞誘導を実施することができる。Ｔ細胞製造後にＣＤ８＋Ｔ細胞誘導を分析する。分析のために様々な時点で細胞試料を採取することができる。ｐＭＨＣマルチマーを使用して、誘導培養における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をモニターする。
（実施例３５）
突然変異型ＢＴＫネオペプチドの予測ＨＬＡ特異性
特異的ＢＴＫネオペプチドを、有標ＲＥＣＯＮアルゴリズムにかけて、ＨＬＡ特異性を予測した。ネオペプチドを、予測結合親和性に基づいてランク付けした。表３８は、高い～低い親和性に基づいてさらにランク付けされたアレル特異性を示す。ランク値が低いほど、親和性が強いことを示す。表３８は、本明細書で同定および特徴付けられた突然変異型ＢＴＫネオペプチドが、複数のアレルとの強力なエピトープを有することをさらに実証する。
表３８は、高い～低い親和性に基づいてさらにランク付けされたアレル特異性を示す
（実施例３６）
突然変異型ＢＴＫネオペプチドの親和性および安定性
下記の表のネオエピトープを含有する複数のペプチドを、抗原提示細胞に発現させたかまたは負荷したかのいずれかを行った。次いで、質量分析を実施し、表記のＨＬＡアレルに対するネオエピトープの親和性を決定し、ネオエピトープとＨＬＡアレルとの安定性を決定した。
表３９は、突然変異型ＢＴＫペプチドの親和性および安定性をそれぞれ示す
（実施例３７）
質量分析による突然変異型ＥＧＦＲペプチドの検出
２９３Ｔ細胞に、突然変異型ＥＧＦＲペプチドの種々の領域をコードするレンチウイルスベクターを形質導入する。突然変異型ＥＧＦＲペプチドによりコードされるペプチドを発現する５０００万～１億個の形質導入した細胞を培養し、酸洗浄を使用してペプチドをＨＬＡ－ペプチド複合体から溶出させる。次いで、溶出したペプチドをＭＳ／ＭＳで分析した。
（実施例３８）
突然変異型ＥＧＦＲペプチドは、複数のアレルに対して強力なエピトープを産生する
ネオエピトープを含有する複数のペプチドを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現または負荷する。次いで、質量分析を実施し、表記のＨＬＡアレルに対するネオエピトープの親和性、およびネオエピトープとＨＬＡアレルとの安定性を決定した。
（実施例３９）
複数のＥＧＦＲネオエピトープがＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する
ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、抗原特異的Ｔ細胞誘導を実施することができる。Ｔ細胞製造後にＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を分析する。分析のために様々な時点で細胞試料を採取することができる。ｐＭＨＣマルチマーを使用して、誘導培養における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をモニターする。
（実施例４０）
ＥＧＦＲネオペプチドの予測ＨＬＡ特異性
特異的ネオペプチドを、有標ＲＥＣＯＮアルゴリズムにかけて、ＨＬＡ特異性を予測した。ネオペプチドを、予測結合親和性に基づいてランク付けした。表４３は、高い～低い親和性に基づいてさらにランク付けされたアレル特異性を示す。ランク値が低いほど、親和性が高いことを示す。表４３は、本明細書で同定および特徴付けられた突然変異型ＥＧＦＲネオペプチドが、複数のアレルとの強力なエピトープを有することも実証する。
表４３
（実施例４１）
突然変異型ＥＧＦＲネオペプチドの親和性および安定性
下記の表のネオエピトープを含有する複数のペプチドを、抗原提示細胞に発現させたかまたは負荷したかのいずれかを行った。次いで、質量分析を実施し、表記のＨＬＡアレルに対するネオエピトープの親和性を決定し、ネオエピトープとＨＬＡアレルとの安定性を決定した。表４４は、突然変異型ＥＧＦＲペプチドのそれぞれの親和性および安定性を示す。
表４４

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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