BR112020025615A2 - neoantígenos e usos dos mesmos - Google Patents

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BR112020025615A2
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hla
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BR112020025615-3A
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Vikram Juneja
Zhengxin Dong
Robyn Jessica Eisert
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Biontech Us Inc.
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Abstract

A revelação no presente documento se refere a composições imunoterápicas que compreendem peptídeos imunoterápicos que compreendem neoepítopos. Também são revelados no presente documento polinucleotídeos que codificam os peptídeos imunoterápicos. Também são revelados no presente documento métodos de síntese de peptídeos imunoterápicos que compreendem neoepítopos e uso das composições imunoterápicas incluindo métodos de tratamento.

Description

“NEOANTÍGENOS E USOS DOS MESMOS” REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório nº US 62/687.191, depositado em 19 de junho de 2018, Pedido Provisório nº US 62/702.567, depositado em 24 de julho de 2018, Pedido Provisório nº US 62/726.804, depositado em 4 de setembro de 2018, Pedido Provisório nº US 62/789.162, depositado em 7 de janeiro de 2019, Pedido Provisório nº US 62/801.981, depositado em 6 de fevereiro de 2019, Pedido Provisório nº US 62/800.700, depositado em 4 de fevereiro de 2019, e Pedido Provisório nº US 62/800.792, depositado em 4 de fevereiro de 2019, cada um de cujos pedidos é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
ANTECEDENTES
[0002] A imunoterapia de câncer consiste no uso do sistema imunológico para tratar câncer. As imunoterapias exploram o fato de que as células cancerosas têm frequentemente moléculas em sua superfície que podem ser detectadas pelo sistema imunológico, conhecido como antígenos tumorais, que são frequentemente proteínas ou outras macromoléculas (por exemplo, carboidratos). A imunoterapia ativa se refere ao sistema imunológico para atacar células tumorais alvejando- se os antígenos tumorais. As imunoterapias passivas melhoram as respostas antitumorais existentes e incluem o uso de anticorpos monoclonais, linfócitos e citocinas. As vacinas tumorais são tipicamente compostas por antígenos tumorais e moléculas imunoestimuladoras (por exemplo, adjuvantes, citocinas ou ligantes de TLR) que trabalham em conjunto para induzir células T citotóxicas específicas de antígeno (CTLs) que reconhecem e lisam células tumorais. Uma das barreiras críticas para o desenvolvimento da imunoterapia curativa e específica de tumor é a identificação e seleção de antígenos tumorais altamente específicos e restritos para evitar a autoimunidade.
[0003] Os neoantígenos tumorais, que surgem como resultado de mudança genética (por exemplo, inversões, translocações, deleções, mutações missense, mutações no local de splice, etc.) dentro das células malignas, representam a classe de antígenos mais específicos do tumor e podem ser específicos do paciente ou compartilhados. Os neoantígenos tumorais são exclusivos da célula tumoral, visto que a mutação e sua proteína correspondente estão presentes apenas no tumor. Os mesmos também evitam a tolerância central e, portanto, são mais propensos a serem imunogênicos. Portanto, os neoantígenos tumorais fornecem um excelente alvo para o reconhecimento imunológico, incluindo imunidade humoral e celular. No entanto, neoantígenos tumorais raramente foram usados em vacinas contra o câncer ou composições imunogênicas devido a dificuldades técnicas em identificar os mesmos, selecionar antígenos otimizados e produzir neoantígenos para uso em uma vacina ou composição imunogênica. Consequentemente, ainda há a necessidade de desenvolver terapêuticas cancerosas adicionais.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0004] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados no presente documento, por referência, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual tivesse sido especificamente indicado para ser incorporado por referência.
SUMÁRIO
[0005] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende (a) pelo menos um polipeptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo que compreende uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, cada um, compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma sequência de C-terminal da primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se sobrepõe a uma sequência de N-terminal da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes; em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência:
PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLT
GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2) ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo.
[0006] Em algumas modalidades, a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes ou a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos mutantes compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:
2.
[0007] Em algumas modalidades, os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2 compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos da sequência: PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGL (SEQ ID NO: 3).
[0008] Em algumas modalidades, os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência:
EPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCS NH (SEQ ID NO: 4).
[0009] Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 14 aminoácidos mutantes. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos 3 sequências de peptídeos de GATA3 mutantes. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos dois polipeptídeos. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende adicionalmente uma terceira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que a terceira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência SEQ ID NO:
2. Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo mutante GATA3 compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:
2.
[0010] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por: (a) um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-A24:02, (b) um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-B08:01, (c) um alelo HLA-A24:02 e um alelo HLA-B08:01 ou (d) alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02 e um alelo HLA- B08:01. Em algumas modalidades, (a) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA-B08:01; e (b) a segunda sequência de peptídeos de GATA3 se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA-B08:01; em que a primeira sequência de peptídeos GATA3 mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada pelo alelo HLA diferente daquele da segunda sequência de peptídeos GATA3 mutantes.
[0011] Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos GATA 3 mutantes se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma afinidade menor que 500 nM.
[0012] Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos mutantes se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma estabilidade maior que
1 hora.
[0013] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma das seguintes sequências: (a) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 5), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 6), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 7), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 8), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 9), APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 10), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 11), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 12), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 13), e/ou (b) MFLKAESKI (SEQ ID NO: 14) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 15), e/ou (c) VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 16), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 17) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 18), e/ou (d) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 19), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 20), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 21), GPPARVPAV (SEQ ID NO: 22), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 23), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 24) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 25), e/ou (e) IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 26), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 27), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 28), LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 29), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 30), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 31), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 32), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 33) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 34).
[0014] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos duas das seguintes sequências: (a) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 35), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 36), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 37), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 38), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 39), APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 40), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 41), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 42), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 43), e/ou (b) MFLKAESKI (SEQ ID NO: 44) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 45), e/ou (c) VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 46), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 47) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 48), e/ou (d) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 49), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 50), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 51),
GPPARVPAV (SEQ ID NO: 52), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 53), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 54) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 55), e/ou (e) IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 56), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 57), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 58), LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 59), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 60), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 61), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 62), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 63) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 64).
[0015] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem, (a) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b), (b) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c), (c) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d), (d) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e), (e) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c), (f) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d), (g) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e), (h) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d), (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e) ou (j) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e).
[0016] Em algumas modalidades, as primeiras sequências de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos GATA 3 mutantes compreendem um peptídeo da Tabela 5 e/ou Tabela 6. Em algumas modalidades, a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende um primeiro neoepítopo de proteína de GATA3 e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende um segundo neoepítopo de uma proteína GATA mutante, em que a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes é diferente da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, e em que o primeiro neoepítopo compreende pelo menos um aminoácido mutante e o segundo neoepítopo compreende o mesmo aminoácido mutante.
[0017] Em algumas modalidades, cada uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e as segundas sequências de peptídeos de GATA3 mutantes que compreendem os pelo menos oito aminoácidos contíguos são representados por uma fórmula de: [Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C ou [Xaa]N-[Xaa]C- [Xaa]F, em que cada Xaa é um aminoácido, em que [Xaa]N e [Xaa]C, cada um, compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma porção diferente do gene de GATA3, em que [Xaa]F é qualquer sequência de aminoácidos, em que [Xaa]N é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que [Xaa]C compreendem o pelo menos um aminoácido mutante e é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que N é um número inteiro de 0-100, em que C é um número inteiro de 1-100, em que F é um número inteiro de 0-100, em que a soma de N e M é pelo menos 8.
[0018] Em algumas modalidades, cada Xaa de [Xaa]F é um resíduo de lisina e F é um número inteiro de 1-100, 1-10, 9,
8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1. Em algumas modalidades, F é 3, 4 ou 5.
[0019] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes está presente em uma concentração de pelo menos 50 µg/ml-400 µg/ml. Em algumas modalidades, as primeiras sequências de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem uma sequência da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é poliICLC.
[0020] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende: uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 65), KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 66), SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 67), EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 68), LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 69), GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 70) e KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 71).
[0021] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 72). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 73). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 74). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 75). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 76). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 77). Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes consistem em KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 78).
[0022] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um modificador de pH presente em uma concentração de 0,1 mM –1 mM. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um modificador de pH presente em uma concentração de 1 mM – 10 mM.
[0023] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de síntese de um peptídeo de GATA3, em que o peptídeo compreende uma sequência de pelo menos dois aminoácidos contíguos selecionados a partir do grupo que consiste em Xaa-Cys, Xaa-Ser e Xaa-Thr, em que Xaa é qualquer aminoácido, em que o método compreende: (a) acoplar pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo a um aminoácido ou derivado do mesmo de um peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo para obter um peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo, em que o dipeptídeo ou derivado do mesmo compreende uma fração de pseudoprolina, (b) acoplar um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo, e (c) clivar o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo a partir da resina. Em algumas modalidades, o método compreende desproteger o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo.
[0024] Em algumas modalidades, o aminoácido ou derivado do mesmo ao qual pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo é acoplado é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, Tyr, His e Val. Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos opcionalmente acoplados ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo compreendem Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc- Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc- Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc- Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc- Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH e Fmoc-His(Boc)- OH.
[0025] Em algumas modalidades, um aminoácido de N- terminal ou derivado do mesmo do peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc- Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val- OH, Fmoc-His(Trt)-OH e Fmoc-His(Boc)-OH.
[0026] Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é (a) Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH, (b) Fmoc-Ala-
Thr(psi(Me,Me)pro)-OH, (c) Fmoc-Glu(OtBu)- Ser(psi(Me,Me)pro)-OH, (d) Fmoc-Leu- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH, (e) Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH. Em algumas modalidades, (a) Xaa-Ser é Ser-Ser, (b) Xaa-Ser é Glu-Ser, (c) Xaa-Thr é Ala-Thr, (d) Xaa-Thr é Leu-Thr ou (e) Xaa-Cys é Leu-Cys.
[0027] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica de qualquer um os aspectos descritos acima.
[0028] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo com câncer como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende identificar o indivíduo como um que expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA- B08:01, em que a terapêutica compreende (a) pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos um aminoácido mutante e é fragmento de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa; ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes ou uma porção das mesmas se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar a terapêutica ao indivíduo.
[0029] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende: (a) pelo menos um polipeptídeo que compreende uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, cada uma, compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma sequência de C-terminal da primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se sobrepõe a uma sequência de N-terminal da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes; em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência
PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLT
GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2), ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo, em que os alelos HLA expressos pelo indivíduo são desconhecidos no momento da administração.
[0030] Em algumas modalidades, os pelo menos 8 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência:
PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCSMLT
GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2).
[0031] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer ovarino,
câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer do endométrio, e leucemia linfocítica crônica (CLL). Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de mama que é resistente à terapia antiestrogênio, é um câncer de mama de MSI, é um câncer de mama metastático, é um câncer de mama negativo para Her2, é um câncer de mama positivo para Her2, é um câncer de mama negativo para ER, é um câncer de mama positivo para ER, é um câncer de mama positivo para PR, é um câncer de mama negativo para PR ou qualquer combinação dos mesmos.
[0032] Em algumas modalidades, o câncer de mama expressa um receptor de estrogênio com uma mutação. Em algumas modalidades, o método dos aspectos descritos acima compreende adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti-PD-L1, um agente anti-CTLA-4, um agente anti- CD40, letrozol, fulvestrant, um inibidor de PI3 quinase e/ou um inibidor de CDK 4/6. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é palbociclibe, ribociclibe, abemaciclibe, seliciclibe, dinaciclibe, milciclibe, roniciclibe, atuveciclibe, briciclibe, riviciclibe, seliciclibe, trilaciclibe, voruciclibe ou qualquer combinação dos mesmos.
[0033] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é palbociclibe (PD0332991); abemaciclibe (LY2835219); ribociclibe (LEE 011); voruciclibe (P1446A-05); fascaplisina; arciriaflavina; 2-bromo-12,13- di-hidro-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol-5,7(6H)- diona; 3-amino tioacridona (3-ATA), trans-4-((6-(etilamino)- 2-((1-(fenilmetil)-1H-indol-5-il)amino)-4- pirimidinil)amino)-ciclo-hexano (CINK4); 1,4- dimetoxiacridina-9(10H)-tiona (NSC 625987); 2-metil-5-(p- tolilamino)benzo[d]tiazol-4,7-diona (riuvidina); flavopiridol (alvocidibe); seliciclibe; dinaciclibe; milciclibe; roniciclibe; atuveciclibe; briciclibe; riviciclibe; trilaciclibe (G1T28); ou qualquer combinação dos mesmos.
[0034] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-
136.
[0035] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama metastático ou recorrente. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que teve progressão da doença após a terapia endócrina em combinação com um inibidor de CDK 4/6; ou em que o indivíduo não recebeu terapia sistêmica anterior. Em algumas modalidades, o método compreende determinar uma situação de mutação de um gene de receptor de estrogênio de células do indivíduo. Em algumas modalidades, as células são células isoladas ou células enriquecidas para expressão de receptor de estrogênio.
[0036] Em aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos um aminoácido mutante, e é um fragmento de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa; pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo; uma ou mais APCs que compreendem o pelo menos um polipeptídeo; ou um receptor de célula T (TCR) específico para um neoepítopo do pelo menos um polipeptídeo em complexo com uma proteína de HLA.
[0037] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes. Em algumas modalidades, cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou 2.
[0038] Em aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e uma sequência de C- terminal de uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 se sobrepõe a uma sequência de N-terminal de uma segunda sequência de peptídeos de GATA3; pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo uma ou mais APCs que compreendem o pelo menos um polipeptídeo; ou um receptor de célula T (TCR) específico para um neoepítopo do pelo menos um polipeptídeo em complexo com uma proteína de HLA.
[0039] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem um fragmento de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação de deslocamento de quadro de leitura em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa. Em algumas modalidades, os pelo menos 8 aminoácidos contíguos compreendem pelo menos um aminoácido codificado por uma sequência de neoORF de GATA3. Em algumas modalidades, a mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa é uma mutação de deslocamento de quadro de leitura. Em algumas modalidades, a mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa é uma mutação missense, uma mutação de local de emenda ou uma mutação de fusão de gene. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos mutantes.
[0040] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sequências de peptídeos de GATA3 mutantes. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos dois polipeptídeos, ou o pelo menos um polinucleotídeo compreende pelo menos dois polinucleotídeos. Em algumas modalidades, pelo menos uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 ou pelo menos uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 compreendem pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3. Em algumas modalidades, pelo menos duas das sequências de peptídeos de GATA3 compreendem pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3.
[0041] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, cada uma dentre uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, pelo menos uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:
3.
[0042] Em algumas modalidades, pelo menos um dos pelo menos 8 aminoácidos contíguos é um aminoácido da SEQ ID NO:
4. Em algumas modalidades, um aminoácido contíguo dos pelo menos 8 aminoácidos contíguos não é um aminoácido da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA- B08:01. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por: um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-A24:02; um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-B08:01; um alelo HLA- A24:02 e um alelo HLA-B08:01; ou um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02 e um alelo HLA-B08:01.
[0043] Em algumas modalidades, as duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA-B08:01; e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA-B08:01; em que a primeira sequência de peptídeos GATA3 mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada pelo alelo HLA diferente daquele da segunda sequência de peptídeos GATA3 mutantes.
[0044] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma afinidade menor que 10 µM, menor que 1 µM, menor que 500 nM, menor que 400 nM, menor que 300 nM, menor que 250 nM, menor que 200 nM, menor que 150 nM, menor que 100 nM ou menor que 50 nM. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma estabilidade maior que 24 horas, maior que 12 horas, maior que 9 horas, maior que 6 horas, maior que 5 horas, maior que 4 horas, maior que 3 horas, maior que 2 horas, maior que 1 hora, maior que 45 minutos, maior que 30 minutos, maior que 15 minutos ou maior que 10 minutos. Em algumas modalidades, o alelo HLA é selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-A02:01, HLA-A24:02, HLA-A03:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01 e qualquer combinação dos mesmos.
[0045] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma das seguintes sequências: TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 79), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 80), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 81), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 82), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 83), APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 84), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 85), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 86), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 87); e/ou MFLKAESKI (SEQ ID NO: 88) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 89), VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 90), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 91) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 92); e/ou FATLQRSSL (SEQ ID NO: 93), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 94), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 95), GPPARVPAV (SEQ ID NO: 96), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 97), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 98) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 99) e/ou IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 100), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 101), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 102),
LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 103), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 104), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 105), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 106), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 107) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 108).
[0046] Em algumas modalidades, as duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos duas das seguintes sequências: TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 109), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 110), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 111), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 112), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 113), APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 114), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 115), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 116), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 117); e/ou MFLKAESKI (SEQ ID NO: 118) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 119), VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 120), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 121) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 122); e/ou FATLQRSSL (SEQ ID NO: 123), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 124), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 125), GPPARVPAV (SEQ ID NO: 126), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 127), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 128) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 129) e/ou IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 130), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 131), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 132), LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 133), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 134), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 135), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 136), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 137) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 138).
[0047] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos duas das seguintes sequências EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 139), SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 140), GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 141), DLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 142), KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 143), FLKAESKIMFATLQRS (SEQ ID NO: 144) e KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 145).
[0048] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos duas sequências da Tabela 5 e/ou Tabela 6. Em algumas modalidades, uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende um primeiro neoepítopo da proteína de GATA3 e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de peptídeo compreende um segundo neoepítopo de uma proteína GATA mutante, em que a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes é diferente da sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, e em que o primeiro neoepítopo compreende pelo menos um aminoácido mutante e o segundo neoepítopo compreende o mesmo aminoácido mutante.
[0049] Em aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que o pelo menos um polipeptídeo é representado por uma fórmula de
[0050] [Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C, em que cada Xaa é independentemente qualquer aminoácido, em que [Xaa]N-[Xaa]C representa a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que [Xaa]N e [Xaa]C, cada um, compreendem uma sequência de aminoácidos contíguos codificada por uma porção diferente do gene de GATA3, em que [Xaa]N é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem, em que [Xaa]C compreende o pelo menos um aminoácido mutante e é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem, em que N é um número inteiro de 0-100, em que C é um número inteiro de 1-100, em que F é um número inteiro de 0-100, em que a soma de N e M é pelo menos 8.
[0051] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes e os pelo menos oito aminoácidos contíguos são representados por uma fórmula de [Xaa]F- [Xaa]N-[Xaa]C ou [Xaa]N-[Xaa]C-[Xaa]F, em que cada Xaa é um aminoácido, em que [Xaa]N e [Xaa]C, cada um, compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma porção diferente do gene de GATA3, em que [Xaa]F é qualquer sequência de aminoácidos, em que [Xaa]N é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que [Xaa]C compreende o pelo menos um aminoácido mutante e é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que N é um número inteiro de 0-100, em que C é um número inteiro de 1-100, em que F é um número inteiro de 0-100, em que a soma de N e M é pelo menos 8. Em algumas modalidades, cada Xaa de [Xaa]F é um resíduo de lisina e F é um número inteiro de 1-100, 1-10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1. Em algumas modalidades, F é 3, 4 ou 5.
[0052] Em algumas modalidades, o pelo menos um aminoácido mutante compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos mutantes contíguos. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes está presente em uma concentração pelo menos 1 µg/ml, pelo menos 10 µg/ml, pelo menos 25 µg/ml, pelo menos 50 µg/ml, pelo menos 100 µg/ml, pelo menos 200 µg/ml, pelo menos 250 µg/ml, pelo menos 300 µg/ml ou pelo menos 400 µg/ml. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes está presente em uma concentração no máximo de 5000 µg/ml, no máximo de 2500 µg/ml, no máximo de 1000 µg/ml, no máximo de
750 µg/ml, no máximo de 500 µg/ml, no máximo de 400 µg/ml ou no máximo de 300 µg/ml. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes está presente em uma concentração de 10 µg/ml a 5000 µg/ml, 10 µg/ml a 4000 µg/ml, 10 µg/ml a 3000 µg/ml, 10 µg/ml a 2000 µg/ml, 10 µg/ml a 1000 µg/ml, 25 µg/ml a 500 µg/ml, 50 µg/ml a 500 µg/ml, 100 µg/ml a 500 µg/ml, 200 µg/ml a 500 µg/ml, 200 µg/ml a 400 µg/ml ou 3000 µg/ml a 400 µg/ml.
[0053] Em algumas modalidades, a composição que compreende adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é poliICLC. Em aspectos, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende uma composição descrita no presente documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um modificador de pH presente em uma concentração menor que 1 mM ou maior que 1 mM. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é aquosa.
[0054] Em algumas modalidades, um ou mais dentre o pelo menos um polipeptídeo é ligado por pI>5 e HYDRO >-6, pI>8 e HYDRO >-8, pI<5 e HYDRO >-5, pI>9 e HYDRO <-8, pI >7 e um valor HYDRO de >-5,5, pI < 4,3 e -4≥HYDRO≥-8, pI>0 e HYDRO<- 8, pI>0 e HYDRO >-4 ou pI>4,3 e -4≥HYDRO≥-8, pI>0 e HYDRO>- 4 ou pI>4,3 e HYDRO≤-4., pI>0 e HYDRO>-4 ou pI>4,3 e - 4≥HYDRO≥-9, 5≥pI ≥12 e -4≥HYDRO≥-9.
[0055] Em algumas modalidades, o modificador de pH é uma base. Em algumas modalidades, o modificador de pH é uma base conjugada de um ácido fraco. Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal de dicarboxilato ou tricarboxilato. Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido cítrico e/ou um sal de citrato. Em algumas modalidades, o sal de citrato é citrato dissódico e/ou citrato trissódico. Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido succínico e/ou um sal de succinato. Em algumas modalidades, o sal de succinato é um succinato dissódico e/ou um succinato monossódico. Em algumas modalidades, o sal de succinato é hexa-hidrato de succinato dissódico. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 0,1 mM – 10 mM. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 0,1 mM – 5 mM. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 0,1 mM – 1 mM. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 1 mM – 10 mM. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 1 mM – 5 mM.
[0056] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um líquido. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende água. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um açúcar. Em algumas modalidades, o açúcar compreende dextrose ou manitol. Em algumas modalidades, a dextrose ou o manitol está presente em uma concentração de 1-10 % p/v. Em algumas modalidades, o açúcar compreende tre-halose. Em algumas modalidades, o açúcar compreende sacarose. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende sulfóxido de dimetila (DMSO).
[0057] Em algumas modalidades, o DMSO está presente em uma concentração de 0,1 % a 10 %, 0,5 % a 5 %, 1 % a 5 %, 2 % a 5 %, 2 % a 4 % ou 2 % a 4 %. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável não compreende sulfóxido de dimetila (DMSO). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liofilizável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um imunomodulador ou adjuvante. Em algumas modalidades, o imunomodulador ou adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em poli-ICLC, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, agonistas de STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídeo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, sistema de vetor, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, Virossomas e outras partículas similares ao vírus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys e estímulo QS21 de Aquila.
[0058] Em algumas modalidades, o imunomodulador ou adjuvante compreende poli-ICLC. Em algumas modalidades, uma razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é de 2:1 a 1:10 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:4 ou 1:5 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:3 v:v.
[0059] Em aspectos, é fornecido no presente documento um método de síntese de um peptídeo de GATA3, em que o peptídeo compreende uma sequência de pelo menos dois aminoácidos contíguos selecionados a partir do grupo que consiste em Xaa-Cys, Xaa-Ser e Xaa-Thr, em que Xaa é qualquer aminoácido, em que o método compreende: acoplar pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo a um aminoácido ou derivado do mesmo de um peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo para obter um peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo, em que o dipeptídeo ou derivado do mesmo compreende uma fração de pseudoprolina; acoplar um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo; e clivar o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo a partir da resina.
[0060] Em algumas modalidades, o método compreende desproteger o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo. Em algumas modalidades, o peptídeo de GATA3 é um peptídeo do pelo menos um polipeptídeo de uma composição descrita no presente documento ou da composição farmacêutica no presente documento. Em algumas modalidades, um aminoácido de N-terminal ou derivado do mesmo do peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo é ligado a uma resina. Em algumas modalidades, a resina é uma resina Wang ou uma resina de 2-clorotritila (resina 2-Cl-Trt). Em algumas modalidades, um material de partida para o acoplamento é resina Fmoc- His(Trt)-Wang, resina H-His(Trt)-2Cl-Trt, resina Fmoc- Asp(OtBu)-Wang, resina Fmoc-Ile-Wang, resina Fmoc-Ser(tBu)- Wang ou resina Fmoc-Leu-Wang. Em algumas modalidades, o aminoácido ou derivado do mesmo ao qual pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo é acoplado é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe,
Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, Tyr, His e Val.
[0061] Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos opcionalmente acoplados ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo compreendem Fmoc-Ala- OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc- Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc- Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)- OH e Fmoc-His(Boc)-OH.
[0062] Em algumas modalidades, um aminoácido de N- terminal ou derivado do mesmo do peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc- Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val- OH, Fmoc-His(Trt)-OH e Fmoc-His(Boc)-OH.
[0063] Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH. Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é Fmoc-Ala- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH. Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH. Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é Fmoc-Leu- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH. Em algumas modalidades, a fração de pseudoprolina é Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH.
[0064] Em algumas modalidades, Xaa-Ser é Ser-Ser. Em algumas modalidades, Xaa-Ser é Glu-Ser. Em algumas modalidades, Xaa-Thr é Ala-Thr. Em algumas modalidades, Xaa- Thr é Leu-Thr. Em algumas modalidades, Xaa-Cys é Leu-Cys.
[0065] Em aspectos, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0066] Em aspectos, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo com câncer como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende identificar o indivíduo como aquele que expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA- B08:01, em que a terapêutica compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos um aminoácido mutante e é fragmento de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa; pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo; uma ou mais APCs que compreendem o pelo menos um polipeptídeo; ou um receptor de célula T (TCR) específico para um neoepítopo do pelo menos um polipeptídeo em complexo com uma proteína de HLA; em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes ou uma porção das mesmas se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo
HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar a terapêutica ao indivíduo.
[0067] Em aspectos, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende administrar ao indivíduo uma composição que compreende: pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos um aminoácido mutante e é fragmento de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa; pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo; uma ou mais APCs que compreendem o pelo menos um polipeptídeo; ou um receptor de célula T (TCR) específico para um neoepítopo do pelo menos um polipeptídeo em complexo com uma proteína de HLA; em que o peptídeo de GATA3 mutante ou como porção do mesmo se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01; em que o indivíduo é identificado como expressando um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA- B08:01.
[0068] Em aspectos, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer que compreende administrar ao indivíduo uma composição que compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma das duas ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e uma sequência de C-terminal de uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 se sobrepõe a uma sequência de N-terminal de uma segunda sequência de peptídeos de GATA3; pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo; uma ou mais APCs que compreendem o pelo menos um polipeptídeo; ou um receptor de célula T (TCR) específico para um neoepítopo do pelo menos um polipeptídeo em complexo com uma proteína de HLA; em que os alelos HLA expressos pelo indivíduo são desconhecidos no momento da administração.
[0069] Em algumas modalidades, uma resposta imune é provocada no indivíduo. Em algumas modalidades, a resposta imune é um uma resposta. Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes são administradas simultânea, separada ou sequencialmente. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é sequencialmente administrado após um período de tempo suficiente para o segundo peptídeo ativar as segundas células T. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer ovarino, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer do endométrio, e leucemia linfocítica crônica (CLL). Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de mama que é resistente à terapia antiestrogênio, é um câncer de mama de MSI, é um câncer de mama metastático, é um câncer de mama negativo para Her2, é um câncer de mama positivo para Her2, é um câncer de mama negativo para ER, é um câncer de mama positivo para ER, é um câncer de mama positivo para PR, é um câncer de mama negativo para PR ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o câncer de mama expressa um receptor de estrogênio com uma mutação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade.
[0070] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti-PD-L1, um agente anti-CTLA-4, um agente anti-CD40, letrozol, fulvestrant e/ou um inibidor de CDK 4/6. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em palbociclibe (PD0332991); abemaciclibe (LY2835219); ribociclibe (LEE 011); voruciclibe (P1446A-05); fascaplisina; arciriaflavina; 2-bromo-12,13-di-hidro-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4- c]carbazol-5,7(6H)-diona; 3-amino tioacridona (3-ATA), trans-4-((6-(etilamino)-2-((1-(fenilmetil)-1H-indol-5- il)amino)-4-pirimidinil)amino)-ciclo-hexano (CINK4); 1,4- dimetoxiacridina-9(10H)-tiona (NSC 625987); 2-metil-5-(p- tolilamino)benzo[d]tiazol-4,7-diona (riuvidina); e flavopiridol (alvocidib); seliciclibe; dinaciclibe; milciclibe; roniciclibe; atuveciclibe; briciclibe; riviciclibe; trilaciclibe (G1T28); e qualquer combinação dos mesmos.
[0071] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado antes, simultaneamente ou após administrar as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes. Em algumas modalidades, administrar compreende administrar por via subcutânea ou intravenosa. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama metastático ou recorrente. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que teve progressão da doença após a terapia endócrina em combinação com um inibidor de CDK 4/6.
[0072] Uma mutação comum para CLL e certos linfomas é uma alteração de Cisteína para Serina na posição 481 (C481S) no gene de BTK (Tirosina Quinase de Bruton). A mutação é abrigada em uma região que tem a sequência de aminoácidos: IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR (SEQ ID NO: 146), a Serina mutada está sublinhada. Essa alteração produz vários peptídeos de ligação que se ligam a uma faixa de moléculas de HLA.
[0073] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição que compreende um polipeptídeo, que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes de uma proteína BTK mutante C481S, a uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes que compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos da proteína BTK mutante, em que as sequências de aminoácidos dos peptídeos são: ANGSLLNY (SEQ ID NO: 147); ANGSLLNYL (SEQ ID NO: 148); ANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 149); EYMANGSL (SEQ ID NO: 150); EYMANGSLLN (SEQ ID NO: 151); EYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 152); GSLLNYLR (SEQ ID NO: 153); GSLLNYLREM (SEQ ID NO: 154); ITEYMANGS (SEQ ID NO: 155); ITEYMANGSL (SEQ ID NO: 156); ITEYMANGSLL (SEQ ID NO: 157); MANGSLLNYL (SEQ ID NO: 158); MANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 159); NGSLLNYL (SEQ ID NO: 160); NGSLLNYL (SEQ ID NO: 161);
SLLNYLREMR (SEQ ID NO: 162); TEYMANGSLL (SEQ ID NO: 163); TEYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 164); YMANGSLL (SEQ ID NO: 165); ou YMANGSLLN (SEQ ID NO: 166), listados na Tabela 34.
[0074] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes compreendem: (a) ANGSLLNY (SEQ ID NO: 167) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A36:01, (b) ANGSLLNYL (SEQ ID NO: 168) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-C15:02, HLA-C08:01, HLA-C06:02, HLA-A02:04, HLA-C12:02, HLA-B44:02, HLA-C17:01 e HLA-B38:01, (c) ANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 169) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A74:01 ou um alelo HLA-A31:01, (d) EYMANGSL (SEQ ID NO: 170) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-C14:02, HLA-C14:03 e HLA-A24:02, (e) EYMANGSLLN (SEQ ID NO: 171) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A24:02 ou um alelo HLA- A23:01, (f) EYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 172) e se ligam ou prevê- se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA- A29:02, (g) GSLLNYLR (SEQ ID NO: 173) e se ligam ou prevê- se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA- A31:01 ou um alelo HLA-A74:01, (h) GSLLNYLREM (SEQ ID NO: 174) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-B58:02 ou um alelo HLA-B57:01, (i) ITEYMANGS (SEQ ID NO: 175) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A01:01, (j) ITEYMANGSL (SEQ ID NO: 176) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A01:01,
(k) ITEYMANGSLL (SEQ ID NO: 177) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A01:01, (l) MANGSLLNYL (SEQ ID NO: 178) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-C17:01, HLA-C02:02, HLA-B35:01, HLA-C03:03, HLA-C08:01, HLA-B35:03, HLA-C12:02, HLA-C01:02, HLA-C03:04 e HLA-C08:02, (m) MANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 179) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A33:03 ou um alelo HLA-A74:01, (n) NGSLLNYL (SEQ ID NO: 180) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-B14:02, (o) NGSLLNYL (SEQ ID NO: 181) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-A68:01, HLA-A33:03, HLA-A31:01 e HLA-A74:01, (p) SLLNYLREMR (SEQ ID NO: 182) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A74:01 ou um alelo HLA-A31:01, (q) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: 183) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-B40:01, HLA-B44:03, HLA-B49:01, HLA-B44:02 e HLA- B40:02, (r) TEYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 184) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-B44:03, (s) YMANGSLL (SEQ ID NO: 185) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-B15:09, HLA-C03:04, HLA-C03:03, HLA-C17:01, HLA-C03:02, HLA-C14:03, HLA-C14:02, HLA-C04:01, HLA-C02:02, HLA-A01:01 ou (t) YMANGSLLN (SEQ ID NO: 186) e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A29:02 ou um alelo HLA-A01:01.
[0075] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes é específica para um receptor de célula T cognata em complexo com uma proteína de HLA. Em algumas modalidades, a composição compreende duas ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes.
[0076] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição que compreende: pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes, cada uma tendo pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante C481S, a uma ou mais sequências de peptídeos de BTK mutantes selecionadas a partir da Tabela 34, que compreende adicionalmente três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína BTK mutante, ligados à terminação N ou terminação C de uma sequência de peptídeos BTK mutantes, em que os três ou mais resíduos de aminoácido melhoram o processamento das sequências de peptídeos de BTK mutantes dentro de uma célula e/ou melhoram a apresentação de um epítopo das sequências de peptídeos de BTK mutantes. Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína BTK mutante compreendem uma sequência de aminoácidos de CMV- pp65, HIV, MART-1 ou um peptídeo endógeno não BTK não viral.
[0077] Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína BTK mutante compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos.
[0078] Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína BTK mutante compreendem no máximo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos.
[0079] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição que compreende: pelo menos um polipeptídeo da fórmula (N-terminal Xaa)N-(XaaBTK)P-(Xaa-C terminal)C em que, P é um número inteiro maior que 7; (XaaBTK)P é uma sequência de peptídeos BTK mutantes que compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos selecionados a partir da sequência IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR (SEQ ID NO: 187) de uma proteína BTK mutante que compreende o aminoácido mutante C481S; N é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa de N-terminal)N é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína BTK mutante; C é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa-C terminal)C é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína BTK mutante; e tanto N quanto C são 0.
[0080] Em algumas modalidades, (N-terminal Xaa)N e/ou (Xaa-C terminal)C compreendem uma sequência de aminoácidos de um CMV-pp65, HIV, MART-1 ou um peptídeo ou proteína endógena não BTK não viral.
[0081] Em algumas modalidades, N e/ou C é um número inteiro maior que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40.
[0082] Em algumas modalidades, N e/ou C é um número inteiro menor que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100. Em algumas modalidades, a composição de qualquer uma das reivindicações 8-10, em que N é 0. Em algumas modalidades, 8-10, em que C é 0.
[0083] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo da reivindicação 1. Em um aspecto, a composição compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma ou mais sequências de peptídeos de qualquer um dos peptídeos BTK mutantes descritos acima e nas Tabelas 34 e Tabela 36. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sequências de peptídeos de BTK mutantes. Em algumas modalidades, a pelo menos uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante. Em algumas modalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 das sequências de peptídeos de BTK mutantes compreendem pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes ou cada uma das duas ou mais BTK sequências de peptídeos compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante. Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos BTK mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA listado na Tabela 35 com uma afinidade de 150 nM ou menos e/ou uma meia-vida de 2 horas ou mais. Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos de BTK mutantes compreendem (a) uma primeira sequência de peptídeos BTK mutantes selecionadas a partir da Tabela 34 e se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA; e (b) um segundo peptídeo BTK que tem uma mutação C481S, em que a primeira sequência de peptídeos BTK mutantes e a segunda sequência de peptídeos BTK mutantes não são idênticas.
[0084] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos BTK mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma afinidade menor que 10 µM, menor que 1 µM, menor que 500 nM, menor que 400 nM, menor que 300 nM, menor que 250 nM, menor que 200 nM, menor que 150 nM, menor que 100 nM ou menor que 50 nM.
[0085] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos BTK mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma estabilidade maior que 24 horas, maior que 12 horas, maior que 9 horas, maior que 6 horas, maior que 5 horas, maior que 4 horas, maior que 3 horas, maior que 2 horas, maior que 1 hora, maior que 45 minutos, maior que 30 minutos, maior que 15 minutos ou maior que 10 minutos.
[0086] Em algumas modalidades, (N-terminal Xaa)N compreende uma sequência de aminoácidos de IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 188), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 189), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 190),
IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 191), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 192), TEY, WQAGILAR (SEQ ID NO: 193), HSYTTAE (SEQ ID NO: 194), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 195), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 196), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 197), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 198), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 199), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 200), CLLLHYSVSK (SEQ ID NO: 201) ou MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 202). Em algumas modalidades, (C-terminal Xaa)C compreende uma sequência de aminoácidos de KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 203), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 204), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 205), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 206), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 207), GKSALTI (SEQ ID NO: 208), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 209), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 210), EKEGKISK (SEQ ID NO: 211), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 212), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 213), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 214), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 215), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 216), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 217), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 218) ou TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 219).
[0087] Em algumas modalidades, a pelo menos uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes compreende um aminoácido mutante não codificada pelo genoma de uma célula cancerosa de um indivíduo.
[0088] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes está presente em uma concentração pelo menos 1 µg/ml, pelo menos 10 µg/ml, pelo menos 25 µg/ml, pelo menos 50 µg/ml ou pelo menos 100 µg/ml. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes está presente em uma concentração no máximo de 5000 µg/ml, no máximo de 2500 µg/ml, no máximo de 1000 µg/ml,
no máximo de 750 µg/ml, no máximo de 500 µg/ml, no máximo de 400 µg/ml ou no máximo de 300 µg/ml. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos de BTK mutantes está presente em uma concentração de 10 µg/ml a 5000 µg/ml, 10 µg/ml a 4000 µg/ml, 10 µg/ml a 3000 µg/ml, 10 µg/ml a 2000 µg/ml, 10 µg/ml a 1000 µg/ml, 25 µg/ml a 500 µg/ml ou 50 µg/ml a 300 µg/ml. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é poliICLC.
[0089] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende: (a) a composição descrita acima, e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um modificador de pH. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é aquosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende a uma ou mais do pelo menos um polipeptídeo é ligada por (a) pI>5 e HYDRO >-6, (b) pI>8 e HYDRO >-8, (c) pI<5 e HYDRO >-5, (d) pI>9 e HYDRO <-8, (e) pI >7 e um valor HYDRO de >-5,5, (f) pI < 4,3 e -4≥HYDRO≥-8, (g) pI>0 e HYDRO<-8, pI>0 e HYDRO >-4, ou pI>4,3 e -4≥HYDRO≥-8, (h) pI>0 e HYDRO>-4 ou pI>4,3 e HYDRO≤-4, (i ) pI>0 e HYDRO>-4, ou pI>4,3 e -4≥HYDRO≥-9, (j) 5≥pI ≥12 e -4≥HYDRO≥-9.
[0090] Em algumas modalidades, o modificador de pH é uma base. Em algumas modalidades, o modificador de pH é uma base conjugada de um ácido fraco. Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal de dicarboxilato ou tricarboxilato. Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido cítrico e/ou um sal de citrato. Em algumas modalidades, o sal de citrato é citrato dissódico e/ou citrato trissódico. Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido succínico e/ou um sal de succinato. Em algumas modalidades, o sal de succinato é um succinato dissódico e/ou um succinato monossódico. Em algumas modalidades, em que o sal de succinato é hexa-hidrato de succinato dissódico. Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 0,1 mM – 1 mM. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um líquido. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende água.
[0091] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um açúcar. Em algumas modalidades, o açúcar compreende dextrose. Em algumas modalidades, a dextrose está presente em uma concentração de 1-10 % p/v. Em algumas modalidades, o açúcar compreende tre- halose. Em algumas modalidades, o açúcar compreende sacarose.
[0092] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende sulfóxido de dimetila (DMSO). Em algumas modalidades, DMSO está presente em uma concentração de 0,1 % a 10 %, 0,5 % a 5 % ou 1 % a 3 %. Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável não compreende sulfóxido de dimetila (DMSO). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liofilizável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um imunomodulador ou adjuvante. Em algumas modalidades, em que o imunomodulador ou adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em poli-ICLC,
1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, agonistas de STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídeo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, sistema de vetor, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, Virossomas e outras partículas similares ao vírus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys e estímulo QS21 de Aquila.
[0093] Em algumas modalidades, o imunomodulador ou adjuvante compreende poli-ICLC. Em algumas modalidades, uma razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é de 2:1 a 1:10 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ou 1:5 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:3 v:v.
[0094] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica como descrito acima.
[0095] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, em que o método compreende: administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma composição que compreende um peptídeo que tem uma sequência selecionada a partir da Tabela 34, 36 ou 37 coluna da esquerda; em que o indivíduo expressa uma proteína codificada por qualquer um dos alelos HLA listados na coluna da direita correspondente ao peptídeo dentro da Tabela. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento de câncer em um indivíduo, que compreende: administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo, uma composição que compreende um ou mais peptídeos BTK mutantes, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o um ou mais peptídeos BTK mutantes, em que cada peptídeo BTK mutante compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante que compreende uma mutação C481S, em que pelo menos um dentre o um ou mais peptídeos se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA listado na Tabela 34, 36 ou 37, que é expresso pelo indivíduo. Em algumas modalidades, o peptídeo se liga a proteína de HLA com uma afinidade de 150 nM ou menos e/ou uma meia-vida de 2 horas ou mais.
[0096] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo, um primeiro e um segundo peptídeos ou um ácido nucleico que codifica o primeiro e o segundo peptídeos, em que o primeiro peptídeo tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da: Tabelas 34, 36 ou 37; e o segundo peptídeo tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da qualquer uma das Tabelas 34, 36 ou 37.
[0097] Em algumas modalidades, uma resposta imune é provocada no indivíduo. Em algumas modalidades, a resposta imune é um uma resposta.
[0098] Em algumas modalidades, o um ou mais peptídeos BTK mutantes são administrados simultânea, separada ou sequencialmente.
[0099] Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é sequencialmente administrado após um período de tempo suficiente para o primeiro peptídeo ativar as segundas células T.
[0100] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em certos tipos de linfoma e certos tipos de leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia linfoblástica aguda (ALL), um linfoma de células do manto (MCL), um linfoma linfocítico crônico ou um linfoma não Hodgkin de célula B.
[0101] Em algumas modalidades, compreendendo adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade.
[0102] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos.
[0103] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti- PD-L1, um agente anti-CTLA-4 ou um agente anti-CD40. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado antes, simultaneamente, ou após administrar as sequências de peptídeos de BTK mutantes.
[0104] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, que compreende as etapas de: (a) identificar uma primeira proteína expressa pelo indivíduo, em que a primeira proteína é codificada por um primeiro alelo HLA do indivíduo e em que o primeiro alelo HLA é um alelo HLA fornecido em qualquer um daqueles das Tabelas 34, 37 ou 38, (b) administrar ao indivíduo (i) um primeiro peptídeo BTK mutante, em que o primeiro peptídeo BTK mutante é um peptídeo para o primeiro alelo HLA fornecido de acordo com qualquer um daqueles das Tabelas 34, 36 ou 37; ou (ii) um ácido polinucleico que codifica o primeiro peptídeo BTK mutante.
[0105] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo com câncer como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende identificar o indivíduo como um indivíduo que expressa uma proteína codificada por um HLA dentre um das Tabelas 34, 36 ou 37, em que a terapêutica é um peptídeo BTK mutante ou um ácido nucleico que codifica o peptídeo BTK mutante, em que o peptídeo BTK mutante compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante que compreende uma mutação em C481, em que o peptídeo (i) compreende uma mutação de C481S, (ii) compreende uma sequência de um peptídeo dentre qualquer um das Tabelas 34, 36 ou 37 e (iii) se liga a uma proteína correspondente codificada por HLA dentre qualquer um das Tabelas 34, 36 ou 37.
[0106] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes de uma proteína EGFR mutante T790M, a uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes que compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos selecionados a partir do grupo que consiste em: LIMQLMPF (SEQ ID NO: 220), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 221), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 222), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 223), VQLIMQLM (SEQ ID NO: 224), STVQLIMQL (SEQ ID NO: 225) e LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 226).
[0107] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes são específicas para um receptor de célula T cognata em complexo com uma proteína de HLA.
[0108] Em algumas modalidades, a composição compreende uma mistura de duas ou três ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 sequências de peptídeos EGFR mutantes. Em algumas modalidades pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante.
[0109] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes de uma proteína EGFR mutante T790M, a uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes que compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos selecionados a partir do grupo que consiste em: LIMQLMPF (SEQ ID NO: 227), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 228), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 229), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 230), VQLIMQLM (SEQ ID NO: 231), STVQLIMQL (SEQ ID NO: 232) e LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 233), que compreende adicionalmente três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína EGFR mutante, ligados à terminação N ou terminação C de uma sequência de peptídeos EGFR mutantes, em que os três ou mais resíduos de aminoácido melhoram o processamento das sequências de peptídeos EGFR mutantes dentro de uma célula e/ou melhoram a apresentação de um epítopo das sequências de peptídeos EGFR mutantes.
[0110] Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína EGFR mutante compreendem uma sequência de aminoácidos de CMV-pp65, HIV, MART-1 ou um peptídeo endógeno não EGFR não viral.
[0111] Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína EGFR mutante compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos.
[0112] Em algumas modalidades, os três ou mais resíduos de aminoácido que são heterólogos à proteína EGFR mutante são ligados à terminação N ou terminação C das duas ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes compreendem no máximo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos.
[0113] Em algumas modalidades, (Xaa-C terminal)C é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína EGFR mutante; e, tanto N e C não são 0.
[0114] Em algumas modalidades, (N-terminal Xaa)N e/ou (Xaa-C terminal)C compreendem uma sequência de aminoácidos de um CMV-pp65, HIV, MART-1 ou uma proteína ou peptídeo endógeno não EGFR não viral.
[0115] Em algumas modalidades, N e/ou C é um número inteiro maior que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40.
[0116] Em algumas modalidades, N e/ou C é um número inteiro menor que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100. Em algumas modalidades, N é 0. Em algumas modalidades,
C é 0.
[0117] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição que compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo descrito acima. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes reveladas no presente documento.
[0118] Em algumas modalidades, a composição que compreende uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes compreende adicionalmente um ou mais peptídeos EGRF mutantes selecionados a partir da Tabela 40A-40D.
[0119] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sequências de peptídeos de EGFR mutantes.
[0120] Em algumas modalidades, pelo menos uma das sequências de peptídeos EGFR mutantes compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante. Em algumas modalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 das sequências de peptídeos de EGFR mutantes compreendem pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante. Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos EGFR mutantes ou cada das duas ou mais EGFR sequências de peptídeos compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante.
[0121] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos EGFR mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA listado na Tabela 41 com uma afinidade de 150 nM ou menos e/ou uma meia-vida de 2 horas ou mais.
[0122] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos EGFR mutantes compreendem uma primeira sequência de peptídeos EGFR mutantes que é selecionada a partir do grupo que consiste em STVQLIMQL (SEQ ID NO: 234), LIMQLMPF (SEQ ID NO: 235), LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 236), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 237), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 238), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 239) e VQLIMQLM (SEQ ID NO: 240) e uma segunda sequência de peptídeos EGFR mutantes que tem uma mutação T790M.
[0123] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos EGFR mutantes compreendem: (a) uma primeira sequência de peptídeos EGFR mutantes que é selecionada a partir do grupo que consiste em STVQLIMQL (SEQ ID NO: 241), LIMQLMPF (SEQ ID NO: 242), LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 243), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 244), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 245), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 246) e VQLIMQLM (SEQ ID NO: 247), em que a primeira sequência de peptídeos EGFR mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A68:02, HLA- C15:02, HLA-A25:01, HLA-B57:03, HLA-C12:02, HLA-C03:02, HLA- A26:01, HLA-C12:03, HLA-C06:02, HLA-C03:03, HLA-B52:01, HLA- A30:01, HLA-C02:02, HLA-C12:03, HLA-A11:01, HLA-A32:01, HLA- A02:04, HLA-A68:01, HLA-B15:09, HLA-C17:01, HLA-C03:04, HLA- B08:01, HLA-A01:01, HLA-B42:01, HLA-B57:01, HLA-B15:01, HLA- B14:02, HLA-B37:01, HLA-A36:01, HLA-C15:02, HLA-B15:09, HLA- C12:02, HLA-B38:01, HLA-C03:03, HLA-A02:03, HLA-B58:02, HLA-
C08:01, HLA-B35:01, HLA-B40:01 e/ou HLA-B35:03; e (b) uma segunda sequência de peptídeos EGFR que compreende uma mutação T790M, em que o primeiro e o segundo peptídeos não são idênticos.
[0124] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos EGFR mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma afinidade menor que 10 µM, menor que 1 µM, menor que 500 nM, menor que 400 nM, menor que 300 nM, menor que 250 nM, menor que 200 nM, menor que 150 nM, menor que 100 nM ou menor que 50 nM.
[0125] Em algumas modalidades, o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos EGFR mutantes que se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma estabilidade maior que 24 horas, maior que 12 horas, maior que 9 horas, maior que 6 horas, maior que 5 horas, maior que 4 horas, maior que 3 horas, maior que 2 horas, maior que 1 hora, maior que 45 minutos, maior que 30 minutos, maior que 15 minutos ou maior que 10 minutos.
[0126] Em algumas modalidades, (N-terminal Xaa)N compreende uma sequência de aminoácidos de IDIIMKIRNA (SEQ ID NO: 248), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC (SEQ ID NO: 249), FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW (SEQ ID NO: 250), IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC (SEQ ID NO: 251), FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC (SEQ ID NO: 252), TEY, WQAGILAR (SEQ ID NO: 253), HSYTTAE (SEQ ID NO: 254), PLTEEKIK (SEQ ID NO: 255), GALHFKPGSR (SEQ ID NO: 256), RRANKDATAE (SEQ ID NO: 257), KAFISHEEKR (SEQ ID NO: 258), TDLSSRFSKS (SEQ ID NO: 259), FDLGGGTFDV (SEQ ID NO: 260), CLLLHYSVSK
(SEQ ID NO: 261) ou MTEYKLVVV (SEQ ID NO: 262).
[0127] Em algumas modalidades, (C-terminal Xaa)C compreende uma sequência de aminoácidos de KKNKKDDIKD (SEQ ID NO: 263), AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD (SEQ ID NO: 264), AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 265), AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD (SEQ ID NO: 266), GKSALTIQL (SEQ ID NO: 267), GKSALTI (SEQ ID NO: 268), QGQNLKYQ (SEQ ID NO: 269), ILGVLLLI (SEQ ID NO: 270), EKEGKISK (SEQ ID NO: 271), AASDFIFLVT (SEQ ID NO: 272), KELKQVASPF (SEQ ID NO: 273), KKKLINEKKE (SEQ ID NO: 274), KKCDISLQFF (SEQ ID NO: 275), KSTAGDTHLG (SEQ ID NO: 276), ATFYVAVTVP (SEQ ID NO: 277), LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG (SEQ ID NO: 278) ou TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE (SEQ ID NO: 279).
[0128] Em algumas modalidades, pelo menos uma das sequências de peptídeos EGFR mutantes compreende um aminoácido mutante não codificado pelo genoma de uma célula cancerosa de um indivíduo.
[0129] Em algumas modalidades, as sequências de peptídeos EGFR mutantes estão presentes em uma concentração pelo menos 1 µg/ml, pelo menos 10 µg/ml, pelo menos 25 µg/ml, pelo menos 50 µg/ml ou pelo menos 100 µg/ml.
[0130] Em algumas modalidades, em que cada uma das sequências de peptídeos EGFR mutantes está presente em uma concentração no máximo de 5000 µg/ml, no máximo de 2500 µg/ml, no máximo de 1000 µg/ml, no máximo de 750 µg/ml, no máximo de 500 µg/ml, no máximo de 400 µg/ml ou no máximo de 300 µg/ml.
[0131] Em algumas modalidades, cada uma das sequências de peptídeos EGFR mutantes está presente em uma concentração de 10 µg/ml a 5000 µg/ml, 10 µg/ml a 4000 µg/ml, 10 µg/ml a
3000 µg/ml, 10 µg/ml a 2000 µg/ml, 10 µg/ml a 1000 µg/ml, 25 µg/ml a 500 µg/ml ou 50 µg/ml a 300 µg/ml.
[0132] Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante. Em algumas modalidades, o adjuvante é poliICLC.
[0133] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende: a. a composição que compreende o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos EGFR mutantes como descrito acima, e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0134] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um modificador de pH.
[0135] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina.
[0136] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é aquosa.
[0137] Em algumas modalidades, o um ou mais dentre o pelo menos um polipeptídeo é ligado por pI>5 e HYDRO >-6, pI>8 e HYDRO >-8, pI<5 e HYDRO >-5, pI>9 e HYDRO <-8, pI >7 e um valor HYDRO of >-5,5, pI < 4,3 e -4≥HYDRO≥-8, pI>0 e HYDRO<- 8, pI>0 e HYDRO >-4, ou pI>4,3 e -4≥HYDRO≥-8, pI>0 e HYDRO>- 4, ou pI>4,3 e HYDRO≤-4,, pI>0 e HYDRO>-4, ou pI>4,3 e - 4≥HYDRO≥-9, 5≥pI ≥12 e -4≥HYDRO≥-9.
[0138] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um modificador de pH, que é uma base.
[0139] Em algumas modalidades, o modificador de pH é uma base conjugada de um ácido fraco.
[0140] Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal farmaceuticamente aceitável.
[0141] Em algumas modalidades, o modificador de pH é um sal de dicarboxilato ou tricarboxilato.
[0142] Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido cítrico e/ou um sal de citrato.
[0143] Em algumas modalidades, o sal de citrato é citrato dissódico e/ou citrato trissódico.
[0144] Em algumas modalidades, o modificador de pH é ácido succínico e/ou um sal de succinato.
[0145] Em algumas modalidades, o sal de succinato é um succinato dissódico e/ou um succinato monossódico.
[0146] Em algumas modalidades, o sal de succinato é hexa- hidrato de succinato dissódico.
[0147] Em algumas modalidades, o modificador de pH está presente em uma concentração de 0,1 mM – 1 mM.
[0148] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o carreador farmaceuticamente aceitável que compreende um líquido.
[0149] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende água.
[0150] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende um açúcar.
[0151] Em algumas modalidades, o açúcar compreende dextrose.
[0152] Em algumas modalidades, a dextrose está presente em uma concentração de 1-10 % p/v.
[0153] Em algumas modalidades, o açúcar compreende tre- halose.
[0154] Em algumas modalidades, o açúcar compreende sacarose.
[0155] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável compreende sulfóxido de dimetila (DMSO).
[0156] Em algumas modalidades, DMSO está presente em uma concentração de 0,1 % a 10 %, 0,5 % a 5 % ou 1 % a 3 %.
[0157] Em algumas modalidades, o carreador farmaceuticamente aceitável não compreende sulfóxido de dimetila (DMSO).
[0158] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é liofilizável.
[0159] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um imunomodulador ou adjuvante.
[0160] Em algumas modalidades, o imunomodulador ou adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em poli-ICLC, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, ARNAX, agonistas de STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídeo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, sistema de vetor, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, Virossomas e outras partículas similares ao vírus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys e estímulo QS21 de Aquila.
[0161] Em algumas modalidades, o imunomodulador ou adjuvante compreende poli-ICLC. Em algumas modalidades, uma razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é de 2:1 a 1:10 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ou 1:5 v:v. Em algumas modalidades, a razão entre poli-ICLC e peptídeos na composição farmacêutica é cerca de 1:3 v:v.
[0162] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica descrita acima.
[0163] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo, uma composição que compreende um ou mais peptídeos EGRF mutantes, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam o um ou mais peptídeos EGRF mutantes, em que cada peptídeo EGFR mutante compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante que compreende uma mutação T790M, em que o um ou mais peptídeos EGRF mutantes têm uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 40A-40D; em que pelo menos um dentre o um ou mais peptídeos se liga com uma afinidade de 150 nM ou menor e/ou uma meia-vida de 2 horas ou mais a uma proteína codificada que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA- A68:02, HLA-C15:02, HLA-A25:01, HLA-B57:03, HLA-C12:02, HLA- C03:02, HLA-A26:01, HLA-C12:03, HLA-C06:02, HLA-C03:03, HLA- B52:01, HLA-A30:01, HLA-C02:02, HLA-C12:03, HLA-A11:01, HLA- A32:01, HLA-A02:04, HLA-A68:01, HLA-B15:09, HLA-C17:01, HLA- C03:04, HLA-B08:01, HLA-A01:01, HLA-B42:01, HLA-B57:01, HLA- B15:01, HLA-B14:02, HLA-B37:01, HLA-A36:01, HLA-C15:02, HLA- B15:09, HLA-C12:02, HLA-B38:01, HLA-C03:03, HLA-A02:03, HLA- B58:02, HLA-C08:01, HLA-B35:01, HLA-B40:01 e/ou HLA-B35:03; e, em que o dito alelo é expresso pelo indivíduo.
[0164] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com câncer, em que o método compreende: administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo, um polipeptídeo que compreende uma sequência de peptídeos EGFR mutantes, ou um polinucleotídeo que codifica o peptídeo EGFR mutante, em que (a) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência LIMQLMPF (SEQ ID NO: 280) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-C03:02, (b) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 281) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-C12:03, HLA-C15:02, HLA-B57:01, HLA-B57:01, HLA- A36:01, HLA-C12:02, HLA-C03:03 e HLA-B58:02, (c) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 282) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA- A26:01, (d) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência STVQLIMQL (SEQ ID NO: 283) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-A68:02, HLA-C15:02, HLA-A25:01, HLA- B57:03, HLA-C12:02, HLA-A26:01, HLA-C12:03, HLA-C06:02, HLA- C03:03, HLA-A30:01, HLA-C02:02, HLA-A11:01, HLA-A32:01, HLA- A02:04, HLA-A68:01, HLA-B15:09, HLA-C03:04, HLA-B38:01, HLA- B57:01, HLA-A02:03, HLA-C08:01, HLA-B35:01 e HLA-B40:01, (e) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 284) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-B57:01, (f) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 285) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-C15:02, (g) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência TVQLIMQL (SEQ ID NO: 286) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-C17:01, HLA-B08:01, HLA-B42:01, HLA-B14:02, HLA-B37:01,
HLA-B15:09, (h) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 287) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-B35:03, ou (i) o peptídeo EGFR mutante tem a sequência VQLIMQLM (SEQ ID NO: 288) e o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA- B52:01, HLA-B14:02 e HLA-B37:01.
[0165] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar uma segunda composição de polipeptídeo que compreende pelo menos um peptídeo EGFR mutante, em que o segundo peptídeo EGFR mutante é selecionado a partir da Tabela 40A-40D.
[0166] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o método compreende as etapas de (a) identificar uma primeira proteína expressa pelo indivíduo, em que a primeira proteína é codificada por um primeiro alelo HLA do indivíduo e em que o primeiro alelo HLA é um alelo HLA fornecido em qualquer um dentre um das Tabelas 41 a 43; e (b) administrar ao indivíduo (i) o peptídeo EGFR mutante, em que o primeiro peptídeo EGFR mutante é um peptídeo para o primeiro alelo HLA fornecido de acordo com qualquer um dentre um das Tabelas 42Ai e ii, 42B ou 43, ou (ii) um ácido polinucleico que codifica o primeiro peptídeo EGFR mutante. Em algumas modalidades, o método de tratamento de um câncer em um indivíduo que compreende as etapas de: identificar uma ou mais subtipos de HLA específicos expressos no indivíduo; administrar ao indivíduo, uma composição que compreende um ou mais peptídeos EGFR mutante descritos no presente documento, de modo que o um ou mais peptídeos se liguem a pelo menos um subtipo de
HLA expresso pelo indivíduo com uma afinidade de 150 nM ou menos e/ou uma meia-vida de 2 horas ou mais.
[0167] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de tratamento de um câncer em um indivíduo, o método compreende as etapas de (a) identificar o indivíduo para expressar uma proteína codificada por um alelo HLA- B57:01 do genoma do indivíduo; (b) administrar ao indivíduo uma composição que compreende um peptídeo que tem uma sequência STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 289). Em uma modalidade, o método compreende as etapas de (a) identificar se o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-A26:01 do genoma do indivíduo; (b) administrar ao indivíduo uma composição que compreende um peptídeo que tem uma sequência QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 290).
[0168] Em algumas modalidades, uma resposta imune é provocada no indivíduo. Em uma modalidade, a resposta imune é uma resposta humoral.
[0169] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de peptídeos EGFR mutantes são administradas simultânea, separada ou sequencialmente. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é sequencialmente administrado após um período de tempo suficiente para o primeiro peptídeo ativar as segundas células T.
[0170] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em glioblastoma, adenocarcinoma pulmonar, câncer de pulmão de célula não pequena, carcinoma de célula escamosa pulmonar, carcinoma de rim, cânceres de cabeça e pescoço, cânceres ovarianos, cânceres cervicais, cânceres de bexiga, cânceres gástricos, cânceres de mama, cânceres colorretais, cânceres do endométrio e cânceres de esôfago.
[0171] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade.
[0172] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti-PD-L1, um agente anti-CTLA-4 ou um agente anti-CD40. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado antes, simultaneamente, ou após administrar as sequências de peptídeos de EGFR mutantes.
[0173] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo com câncer como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende identificar o indivíduo como um indivíduo que expressa uma proteína codificada por um HLA dentre um das Tabelas 41, 42Ai, 42Aii, 42B ou 43, em que a terapêutica é um peptídeo EGFR mutante ou um ácido nucleico que codifica o peptídeo EGFR mutante, em que o peptídeo EGFR mutante compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante que compreende uma mutação em T790, em que o peptídeo (i) compreende uma mutação de T790M, (ii) compreende uma sequência de um peptídeo dentre qualquer um das Tabelas 42Ai, 42Aii, 42B, 43 e 44 e (iii) se liga a uma proteína correspondente codificada por HLA dentre qualquer um das
Tabelas 42Ai, 42Aii, 42B, 43 e 44.
[0174] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-B57:01, em que a terapêutica compreende um peptídeo EGFR mutante que tem a sequência de aminoácidos STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 291).
[0175] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de identificação de um indivíduo como um candidato para uma terapêutica, em que o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por um alelo HLA-A26:01, em que a terapêutica compreende um peptídeo EGFR mutante que tem a sequência de aminoácidos QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 292).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0176] Os recursos da presente revelação são estabelecidos com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento dos recursos e das vantagens da presente revelação serão obtidos com referência à seguinte descrição detalhada que define as modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da revelação são utilizados, e aos desenhos anexos, nos quais:
[0177] A FIG. 1 ilustra um fluxo de trabalho exemplificativo para determinação de epítopos de GATA3 que pode induzir células T CD8+ e/ou CD4+.
[0178] A FIG. 2 ilustra um fluxo de trabalho exemplificativo de experimentos para determinar se os epítopos são processados e apresentados (superior) e se os epítopos são reconhecidos por células T (inferior). Esse fluxo de trabalho confirmou que neoantígenos de GATA3 foram processados e apresentados (detectados por espectrometria de massa) e neoantígenos de GATA3 ligados a um receptor de célula T recombinante HLA poderiam ser reconhecidos por um receptor de célula T recombinante (TCR) expresso em uma linhagem de célula Jurkat.
[0179] A FIG. 3 ilustra uma esquemática exemplificativa de um fluxo de trabalho para detecção de epítopos de neoORF de GATA3 por espectrometria de massa. Para isolamento de peptídeo, a lise em batelada foi realizada e um anticorpo HLA de classe I pan (W6/32) é usado para imunoprecipitação.
[0180] A FIG. 4 ilustra uma esquemática exemplificativa de um fluxo de trabalho para expansão específica de antígeno GATA3 de células T CD8+.
[0181] A FIG. 5 ilustra um sumário de experimentos que mostram epítopos de GATA3 previstos para HLA-A02 (esquerda), HLA-B07 (intermediário) e HLA-B08 (direita) podem ser detectados por espectrometria de massa. A FIG. 5 revela sequências de peptídeos detectados por "HLA-A*02:01" como SEQ ID NOS 3824-3826, as sequências de peptídeos detectadas por "HLA-B*07:02" como SEQ ID NOS 3827-3828, a sequência de peptídeos detectada por "HLA-B*08:01" como SEQ ID NO: 3829 e as sequências de construto como 3830-3832, todas respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0182] FIG. 6 é uma ilustração de neoORF de GATA3. A região sombreada representa a porção da porção de sequência de neoORF de GATA3 compartilhada por todos os pacientes (região comum) e compartilhada por alguns pacientes (região variável).
[0183] A FIG. 7A é uma ilustração da sequência de neoORF de GATA3 (SEQ ID NO: 2) com a sequência de região variável (SEQ ID NO: 3) e sequências de região comum (SEQ ID NO: 4).
[0184] A FIG. 7B descreve uma esquemática que mostra a sequência de GATA3 (SEQ ID NO: 1) com a sequência de neoORF (SEQ ID NO: 2) e que 3 epítopos HLA-02:01 previstos, 2 epítopos HLA-B07:02 previstos e 1 epítopo HLA-B08:01 previstos foram observados por espectrometria de massa. Esses dados mostram que os epítopos são direcionáveis.
[0185] A FIG. 7C é uma ilustração de um exemplo de um esquema de projeto de peptídeo de peptídeos sobrepostos (OLPs) através de toda a região de neoORF de GATA3. A FIG. 7C revela SEQ ID NO: 3853.
[0186] A FIG. 7D é uma sequência de aminoácidos exemplificativa de região variável de neoORF de GATA3 (SEQ ID NO: 3)
[0187] A FIG. 7E é uma sequência de aminoácidos exemplificativa de região comum de neoORF de GATA3 (SEQ ID NO: 4)
[0188] A FIG. 8 é um gráfico que descreve o número de epítopos de neoORF de GATA3 de classe I terapêuticos vs percentual de pacientes que contêm esses epítopos. A maioria dos pacientes terão 4-5 epítopo.
[0189] A FIG. 9A descreve resultados de exemplo que mostram respostas de célula T CD8+ específica de antígeno ao peptídeo indicado (SEQ ID NO: 3834) com uso de uma amostra de PBMC a partir de um doador humano.
[0190] A FIG. 9B descreve resultados de exemplo que mostram respostas de célula T CD8+ específicas de antígeno aos peptídeos indicados (SEQ ID NO: 3835) com uso de amostras de PBMC dos doadores humanos.
[0191] A FIG. 9C descreve resultados de exemplo que mostram respostas de célula T CD8+ específicas de antígeno aos peptídeos indicados com uso de amostras de PBMC de doadores humanos. A FIG. 9C revela as sequências "A02:01" como SEQ ID NOS 3836-3837, a sequência "A03:01" como SEQ ID NO: 3838, a sequência "A11:01" como SEQ ID NO: 3839, as sequências "B07:02" como SEQ ID NOS 3840-3841 e a sequência "B08:01" como SEQ ID NO: 3842, todas respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0192] A FIG. 10A descreve resultados de exemplo que mostram respostas de célula T CD8+ específicas de antígeno aos peptídeos indicados (SEQ ID NOS 3843-3845, respectivamente, em ordem de aparecimento) com uso de amostras de PBMC dos doadores humanos.
[0193] A FIG. 10B descreve resultados de exemplo que mostram respostas de célula T CD8+ específicas de antígeno aos peptídeos indicados (SEQ ID NOS 3846-3848, respectivamente, em ordem de aparecimento) com uso de amostras de PBMC dos doadores humanos.
[0194] A FIG. 11 descreve uma análise de FACS de indução específica de antígeno de níveis de IFNγ e TNFα de células CD4+ de um doador de HLA-A02:01 saudável estimulado com APCs carregado com ou sem um peptídeo neoORF de GATA3.
[0195] A FIG. 12A mostra que os peptídeos indicados eram solúveis nas concentrações de peptídeo indicado nas composições farmacêuticas com um succinato de 5 mM ou 0,25 mM, sem DMSO, 5 % de dextrose em água (5DW) e sem poliICLC.
[0196] A FIG. 12B mostra que os peptídeos indicados eram solúveis nas concentrações de peptídeo indicado nas composições farmacêuticas com um succinato de 5 mM ou 0,25 mM, sem DMSO, 5 % de dextrose em água (5DW) e com poliICLC.
[0197] A FIG. 12C mostra que os peptídeos indicados eram solúveis nas concentrações de peptídeo indicado nas composições farmacêuticas com um succinato de 5 mM ou 0,25 mM, sem DMSO, 5 % de dextrose em água (5DW) e com poliICLC na razão de peptídeo indicado:poliICLC.
[0198] A FIG. 13 mostra a sequência de aminoácidos da região comum de mutações de deslocamento de quadro de leitura de GATA3 (SEQ ID NO: 4).
[0199] A FIG. 14 mostra a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para pacientes no conjunto de dados de câncer de mama MSK-IMPACT.
[0200] A FIG. 15 mostra contagem simulada de epítopo apresentado por paciente.
[0201] A FIG. 16 mostra alinhamento de GATA3 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 3849) e sequências de nucleotídeos de mutação (SEQ ID NO: 3850).
[0202] A FIG. 17 mostra o alinhamento de GATA3 do tipo selvagem e sequências de aminoácidos de mutação. A FIG. 17 revela SEQ ID NOS 3851-3853, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0203] A FIG. 18 mostra mapa de plasmídeo codificado de mutação GATA3.
[0204] A FIG. 19 mostra o alinhamento múltiplo de gene de mutação GATA3 e dados de sequenciamento de DNA de construto de plasmídeo de mutação GATA3. A FIG. 19 revela SEQ ID NOS 3854-3856, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0205] A FIG. 20 mostra a digestão de enzima de restrição de plasmídeo de mutação GATA3 com AflII.
[0206] A FIG. 21 mostra expressão de classe II de MHC e classe I de MHC das células HEK 293T transduzidas por GATA3.
[0207] As FIGs. 22A-22D mostram perfil de expressão de HLA-A02 e MHC-ABC de HLA-A02.01, HLA-B07.02 e células HEH293T de GATA3 transfectadas por HLA-B08.01.
[0208] A FIG. 22A mostra células HEH293T de GATA3 não transfectadas.
[0209] A FIG. 22B mostra células HEH293T de GATA3 transfectadas por HLA-A02.01.
[0210] A FIG. 22C mostra células HEK293T de GATA3 transfectadas por HLA-B07.02.
[0211] A FIG. 22D mostra células HEK293T de GATA3 transfectadas por HLA-B08.01.
[0212] A FIG. 23 mostra a detecção de epítopos de peptídeo previstos derivados da região comum de neoORF de GATA3 estavelmente expresso em células HEK293T. A sequência em cinza claro e preto indicam as regiões comuns e variáveis de neoORF de GATA3, respectivamente. A FIG. 23 revela SEQ ID NO: 3857.
[0213] A FIG. 24A mostra espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado de modo endógeno SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 293) (inferior) e seu peptídeo sintético correspondente (superior).
[0214] A FIG. 24B mostra plotagem de cabeça-aos-pés de correspondência espectral de MS/MS. A FIG. 24B revela "SMLTGPPARV" como SEQ ID NO: 3858.
[0215] A FIG. 25A mostra espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado de modo endógeno MLTGPPARV (SEQ ID NO: 294) (inferior) e seu peptídeo sintético correspondente
(superior).
[0216] A FIG. 25B mostra Plotagem de Cabeça-aos-Pés de correspondência espectral. A FIG. 25B revela "MLTGPPARV" como SEQ ID NO: 3859.
[0217] A FIG. 26A mostra espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado de modo endógeno KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 295) (inferior) e seu peptídeo sintético correspondente (superior).
[0218] A FIG. 26B mostra Plotagem de Cabeça-aos-Pés de correspondência espectral. A FIG. 26B revela "KPKRDGYMF" como SEQ ID NO: 3860.
[0219] A FIG. 27A mostra espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado de modo endógeno KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 296) (inferior) e seu peptídeo sintético correspondente (superior).
[0220] A FIG. 27B mostra Plotagem de Cabeça-aos-Pés de correspondência espectral. A FIG. 27B revela "KPKRDGYMFL" como SEQ ID NO: 3861.
[0221] A FIG. 28A mostra espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado de modo endógeno ESKImFATL (SEQ ID NO: 297) (inferior) e seu peptídeo sintético correspondente (superior).
[0222] A FIG. 28B mostra Plotagem de Cabeça-aos-Pés de correspondência espectral. A FIG. 28B revela "ESKImFATL" como SEQ ID NO: 3862.
[0223] A FIG. 29A mostra indução representativa de respostas de CD8+ com peptídeo específico de neoORF de GATA3 (Multímero FLT-mDC GATA3 Stim2). A FIG. 29A revela "MLTGPPARV" como SEQ ID NO: 3863.
[0224] A FIG. 29 B mostra controle negativo sem indução de respostas de CD8+ em PBMC e células dendríticas. A FIG. 29B revela "MLTGPPARV" como SEQ ID NO: 3864.
[0225] A FIG. 30A mostra a indução de células T CD4 específicas de antígeno com no peptídeo.
[0226] A FIG. 30B mostra a indução de células T CD4 específicas de antígeno com peptídeo específico de neoORF de GATA3.
[0227] As FIGs. 31A-31D mostram células T CD8+ específicas de GATA3 por coloração de multímero.
[0228] A FIG. 31A mostra células T CD8+ específicas de GATA3 que foram observadas em média de 1,16 % positivas após estímulo a longo prazo para doador saudável HD47.
[0229] A FIG. 31B mostra células T CD8+ específicas de GATA3 que foram observadas em média de 1,29 %, positivas após estímulo a longo prazo para doador saudável HD50.
[0230] A FIG. 31C mostra células T CD8+ específicas de GATA3 que foram observadas em média de 1,9 % positivas após estímulo a longo prazo para doador saudável HD51.
[0231] A FIG. 31D mostra células T CD8+ específicas de GATA3 foram observadas em média de 4,5 % positivas após estímulo a longo prazo para doador saudável HD51 em uma concentração diferente de peptídeo que na FIG. 31C.
[0232] A FIG. 32 mostra a comparação de fração positiva para Caspase-3 de células alvo vivas. 4 diferentes doadores saudáveis induzidos por GATA3 PBMC 1 a 4 foram cocultivados com células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 (GATA3Trd) ou células HEK 293T não transduzidas (NoTRd293T) como grupo de controle negativo.
[0233] A FIG. 33 mostra diferença significativa entre células HEK293T transduzidas por GATA3 e células HEK293T não transduzidas.
[0234] A FIG. 34 mostra diferença de expressão de CD107a de cocultura de células T CD8+ com células HEK293T transduzidas por GATA3 ou células HEK293T não transduzidas.
[0235] A FIG. 35 mostra diferença de concentração IFN-γ em condição de cocultura entre células HEK293T transduzidas por GATA3 e células HEK293T não transduzidas com células T induzidas por GATA3.
[0236] A FIG. 36 mostra visão geral de clonagem de TCR específica de GATA3. Os detalhes são descritos no Exemplo
26.
[0237] A FIG. 37 mostra métodos exemplificativos para gerar PBMC e Jurkat transduzido por TCR específico de GATA3 e PBMC. Os detalhes são descritos no Exemplo 26.
[0238] A FIG. 38 mostra visão geral de ensaio funcional com Jurkat transduzido por TCR.
[0239] A FIG. 39 mostra célula T CD8+ específica de GATA3 por coloração de multímero para classificação.
[0240] A FIG. 40 mostra construto de TCR específico de GATA3 para lentivírus.
[0241] A FIG. 41A mostra alinhamento múltiplo de sequência alfa de TCR de GATA3 e sequência de DNA do tipo selvagem. A FIG. 41A revela SEQ ID NOS 3865-3868, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0242] A FIG. 41B mostra alinhamento múltiplo de sequência beta de TCR de GATA3 e sequência de DNA do tipo selvagem. A FIG. 41B revela SEQ ID NOS 3869-3872, respectivamente, em ordem de aparecimento.
[0243] A FIG. 42 mostra digestão de enzima de restrição de plasmídeo de TCR de GATA3 com AflII.
[0244] A FIG. 43 mostra Jurkat transduzido por TCR específico de GATA3 corado com PE de multímero de GATA3 e BV650 de multímero de GATA3.
[0245] A FIG. 44 mostra ensaio de titulação de peptídeo de TCR específico de GATA3.
[0246] A FIG. 45 mostra ensaio de liberação de IL-2 de células de Jurkat transduzido por TCR específico de GATA3 e células alvo transduzidas por mutação de GATA3.
[0247] A FIG. 46 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 14 aminoácidos e sequência de ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 298). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C70H119N19O22S e peso molecular de 1610,89 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0248] A FIG. 47 mostra estereoquímica de peptídeo GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 16 aminoácidos e sequência de KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 299). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C87H143N23O23S e peso molecular de 1911,30 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0249] A FIG. 48 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 18 aminoácidos e sequência de SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 300). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C87H137N23O23S e peso molecular de 1905,25 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0250] A FIG. 49 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 21 aminoácidos e sequência de EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 301). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C100H156N26O28S2 e peso molecular de 2234,62 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0251] A FIG. 50 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 25 aminoácidos e sequência de LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 302). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C134H217N37O34S3 e peso molecular de 2986,62 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0252] A FIG. 51 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 26 aminoácidos e sequência de GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 303). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C131H209N39O33S2 e peso molecular de 2922,47 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0253] A FIG. 52 mostra estereoquímica de peptídeo de GATA3 neo ORF exemplificativo. O peptídeo consiste em 33 aminoácidos e sequência de KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 304). O peptídeo tem uma fórmula molecular de C173H274N48O46S4 e peso molecular de 3890,63 g/mol. O peptídeo está na forma de sal de ácido trifluoroacético (TFA).
[0254] A FIG. 53 mostra BTK respostas de célula T CD8+ específica de peptídeo de antígeno com uso de amostras de PBMC dos doadores humanos.
[0255] A FIG. 54 mostra respostas de célula T CD8+ específica de peptídeo de antígeno de EGFR com uso de amostras de PBMC dos doadores humanos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0256] GATA3 é um gene que é altamente expresso em câncer de mama, e é um dos genes mais frequentemente mutados nesses cânceres. A maioria das classes comuns de mutações nesse gene consiste em inserções ou deleções entre nucleotídeos que codificam aminoácidos 393 e 445 (o códon de parada natural). Quando esses mudam o quadro de leitura aberto para o quadro +1, os mesmos resultam em um novo quadro de leitura estendido ("neoORF") que leva pelo menos 61 e até 113 aminoácidos que não são normalmente expressos em células saudáveis. Os 61 aminoácidos são compartilhados entre todos os pacientes (região conservada), enquanto cada paciente terá 0-52 aminoácidos adicionais (região variável). Os epítopos que são processados e apresentados a partir desse neoORF são, portanto, neoantígenos que são compartilhados entre alguns ou todos os pacientes que apresentam essa mesma classe de mutações. O neoORF de GATA3 aparece como um fator prognóstico adverso em câncer de mama. GATA3 do tipo selvagem é um gene altamente expresso e o neoORF de GATA3 retém alta expressão. O neoORF de GATA3 é traduzido e é associado ao risco aumentado de câncer de mama.
[0257] Em algumas modalidades, os peptídeos longos sobrepostos (OLPs) que cobrem todo o neoORF podem ser usados para o tratamento do câncer. Em alguns aspectos, os OPLs descritos no presente documento foram projetados para incluir epítopos nas extremidades de peptídeos que simplificam o processo de processamento e apresentação (visto que apenas um caso de clivagem é necessário). Em alguns aspectos, peptídeos curtos (por exemplo, 9-11 aminoácidos) podem ser administrados a um indivíduo para tratar câncer que se liga a uma proteína de classe I de MHC. As abordagens descritas no presente documento podem ser usadas para alvejar muitos neoantígenos sem precisar selecionar os pacientes com base em sua composição de HLA.
[0258] Em algumas modalidades, os peptídeos descritos no presente documento podem compreender uma modificação que pode aumentar imunogenicidade (por exemplo, lipidação). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo codificado por todo o neoORF de GATA3 (por exemplo, policorpos) é fornecido. Em algumas modalidades, uma terapia à base de célula, como células T manipuladas que expressam epítopos específicos de alvejamento de TCRs, pode ser usada para tratar um indivíduo com câncer.
[0259] Os peptídeos longos sintéticos (SLPs) que cobrem a região comum de proteína de GATA3 são revelados no presente documento. Esses peptídeos são solúveis nas formulações descritas no presente documento e compatíveis com poliICLC para injeções s.c. Altos teores de pureza e rendimento de síntese de um ou mais desses peptídeos podem ser alcançados adotando-se blocos de construção de pseudoprolina durante a síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS). As condições de purificação de cada um desses peptídeos também foram desenvolvidas.
[0260] São descritos no presente documento agentes imunoterápicos inovadores e usos dos mesmos com base na revelação de neoantígenos provenientes de casos de mutação únicos ao tumor de um indivíduo. Consequentemente, a presente revelação descrita no presente documento fornece peptídeos, polinucleotídeos que codificam os peptídeos e agentes de ligação de peptídeos que podem ser usados, por exemplo, para estimular uma resposta imune a um antígeno associado ao tumor ou neoepítopo, para criar uma composição imunogênica ou vacina contra câncer para uso no tratamento de doenças.
[0261] A descrição e exemplos a seguir ilustram as modalidades da presente revelação em detalhes. Deve ser entendido que essa presente revelação não é limitada às modalidades particulares descritas no presente documento e como tal pode variar. Aquele versado na técnica reconhecerá que há várias variações e modificações dessa presente revelação que são abrangidas no interior de seu escopo.
[0262] Todos os termos são destinados a serem entendidos como seriam entendidos por uma pessoa versada na técnica. A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados daqueles comumente compreendidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence.
[0263] Os títulos de seção usados no presente documento são para propósitos organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitantes da matéria descrita.
[0264] Embora diversos recursos da presente revelação possam ser descritos no contexto de uma única modalidade, os recursos também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer combinação adequada. Por outro lado, embora a presente revelação possa ser descrita no presente documento no contexto das modalidades separadas para clareza, a presente revelação também pode ser implementada em uma única modalidade.
[0265] As seguintes definições complementam aquelas na técnica e são direcionadas para o pedido atual e não devem ser atribuídas a qualquer caso relacionado ou não relacionado, por exemplo, a qualquer pedido ou patente comumente pertencente. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática para testagem da presente revelação, os materiais e métodos preferenciais são descritos no presente documento. Consequentemente, a terminologia usada no presente documento tem a finalidade de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa. Definições
[0266] A terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever casos particulares apenas e não pretende ser limitante. Nesse pedido, o uso do singular inclui o plural, exceto se for especificamente declarado de outro modo. Como usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e "a" pretendem incluir também as formas plurais, salvo se o contexto indicar claramente de outro modo.
[0267] Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou” exceto quando especificado o contrário. Os termos “e/ou” e “qualquer combinação dos mesmos” e seus equivalentes gramaticais como usado no presente documento, podem ser usados de maneira intercambiável. Esses termos podem indicar que qualquer combinação é especificamente contemplada. Somente para propósitos ilustrativos, as seguintes frases “A, B e/ou C” ou “A, B, C ou qualquer combinação dos mesmos” podem significar “A individualmente; B individualmente; C individualmente; A e B; B e C; A e C; e A, B e C”. O termo “ou” pode ser usado conjuntiva ou disjuntivamente, salvo se o contexto especificamente se referir a um uso disjuntivo.
[0268] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” pode significar dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular como determinado por um elemento de habilidade comum na técnica, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, “cerca de” pode significar dentro de 1 ou mais que 1 desvio padrão, pela prática da técnica. Alternativamente, “cerca de” pode significar uma faixa de até 20 %, até 10 %, até 5 % ou até 1 % de um determinado valor. Alternativamente, em particular em relação aos sistemas biológicos ou processos, o termo pode significar dentre de uma ordem de magnitude, em 5 vezes e, com mais preferência, em 2 vezes, de um valor. Onde os valores particulares são descritos no pedido e nas reivindicações, salvo se indicado de outro modo, o termo “cerca de” que significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular deve ser assumido.
[0269] Como usado neste relatório descritivo e na reivindicação (ou reivindicações), as palavras “que compreende” (e qualquer forma de “que compreende”, como “compreende” e “compreender”), “que tem” (e qualquer forma de “que tem”, como “ter” e “tem”), “que inclui” (e qualquer forma de “que inclui”, como “inclui” e “incluir”) ou “que contém” (e qualquer forma de “que contém”, como “contém” e “conter”) são inclusivas ou de interpretação livre e não excluem elementos não recitados adicionais ou etapas de método. Contempla-se que qualquer modalidade discutida neste relatório descritivo pode ser implementada em relação a qualquer método ou composição da presente revelação e vice versa. Além disso, as composições da presente revelação podem ser usadas para alcançar os métodos da presente revelação.
[0270] A referência no relatório descritivo a “algumas modalidades”, “uma (artigo indefinido) modalidade”, “uma (numeral) modalidade” ou “outras modalidades” significa que um recurso, estrutura ou característica particulares descritos em conexão às modalidades é incluída em pelo menos algumas modalidades, mas não necessariamente a todas as modalidades, das presentes revelações. Para facilitar um entendimento da presente revelação, vários termos e frases são definidos abaixo.
[0271] “Complexo Principal de Histocompatibilidade” ou “MHC” é um agrupamento de genes que desempenham uma função no controle das interações celulares responsáveis pelas respostas imunes fisiológicas. Em humanos, o complexo MHC é também conhecido como o complexo de antígeno de leucócito humano (HLA). Para uma descrição detalhada dos complexos MHC e HLA, consulte, Paul, Fundamental Immunology, 3a Ed., Raven Press, Nova York (1993). "Proteínas ou moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC)", "moléculas de MHC", "proteínas de MHC" ou "proteínas HLA" devem ser entendidas como significando proteínas capazes de se ligar a peptídeos resultantes da clivagem proteolítica de antígenos proteicos e representando epítopos de linfócitos potenciais (por exemplo, epítopo de célula T e epítopo de célula B) transportando os mesmos para a superfície de célula e apresentando os mesmos às células específicas, em particular, linfócitos T citotóxicos, células T auxiliares ou células B. O principal complexo de histocompatibilidade no genoma compreende a região genética cujos produtos de gene expressos na superfície celular são importantes para a ligação e apresentação de antígenos endógenos e/ou estranhos e, assim, para a regulação de processos imunológicos. O principal complexo de histocompatibilidade é classificado em dois grupos de genes que codificam proteínas diferentes, a saber, moléculas de MHC de classe I e moléculas de MHC de classe II. A biologia celular e os padrões de expressão das duas classes de MHC são adaptados a essas diferentes funções.
[0272] "Antígeno de Leucócito Humano" ou "HLA" é uma proteína do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe I humana ou classe II (consulte, por exemplo, Stites, et al., Immunology, 8a Ed., Lange Publishing, Los Altos, Calif., EUA (1994).
[0273] “Polipeptídeo”, “peptídeo” e seus equivalentes gramaticais como usado no presente documento se referem a um polímero de resíduos de aminoácido, tipicamente L- aminoácidos, conectados entre si, tipicamente por ligações de peptídeo entre os grupos α-amino e carboxila de aminoácidos adjacentes. Polipeptídeos e peptídeos incluem, porém sem limitação, “peptídeos mutantes”, “peptídeos de neoantígeno” e “peptídeos neoantigênicos”. Polipeptídeos ou peptídeos podem ter uma variedade de comprimentos, em suas formas neutras (não carregadas) ou em formas que são sais, e livres de modificações, como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fosforilação ou que contêm essas modificações, submetidos à condição de que a modificação não destrói a atividade biológica dos polipeptídeos como descrito no presente documento. Uma “proteína madura” é uma proteína que tem comprimento inteiro e que, opcionalmente, inclui glicosilação ou outras modificações típicas para a proteína em um determinado ambiente celular. Polipeptídeos e proteínas revelados no presente documento (que incluem porções funcionais e variantes funcionais das mesmas) podem compreender aminoácidos sintéticos no lugar de um ou mais aminoácidos de ocorrência natural. Tais aminoácidos sintéticos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ácido aminociclo-hexano carboxílico, norleucina, ácido α- amino n-decanoico, homosserina, S-acetilaminometil- cisteína, trans-3- e trans-4-hidroxiprolina, 4- aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4- clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, β-fenilserina, β- hidroxifenilalanina, fenilglicina, α-naftilalanina, ciclo- hexilalanina, ciclo-hexilglicina, ácido indolina-2- carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3- carboxílico, ácido aminomalônico, monoamida de ácido aminomalônico, N’-benzil-N’-metil-lisina, N’,N’-dibenzil- lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido α-aminociclopentano carboxílico, ácido α-aminociclo-hexano carboxílico, ácido α- aminociclo-heptano carboxílico, ácido α-(2-amino-2- norbornano)-carboxílico, ácido α,γ-diaminobutírico, ácido α,β-diaminopropiônico, homofenilalanina e α-terc- butilglicina. A presente revelação contempla adicionalmente que a expressão de polipeptídeos descrita no presente documento em uma célula manipulada pode estar associada a modificações pós-traducionais de uma ou mais aminoácidos dos construtos de polipeptídeo. Os exemplos não limitativos de modificações pós-traducionais incluem fosforilação, acilação que inclui acetilação e formilação, glicosilação (incluindo ligado em N e ligado em O), amidação, hidroxilação, alquilação incluindo metilação e etilação, ubiquitinação, adição de ácido carboxílico de pirrolidona, formação de pontes de dissulfeto, sulfatação, miristoilação, palmitoilação, isoprenilação, farnesilação, geranilação, glipiação lipoilação e iodinação.
[0274] Um peptídeo ou polipeptídeo pode compreender pelo menos uma sequência de flanqueamento. O termo “sequência de flanqueamento” como usado no presente documento se refere a um fragmento ou região de um peptídeo que não faz parte de um epítopo.
[0275] Um peptídeo “imunogênico” ou um epítopo “imunogênico” ou “epítopo de peptídeo” é um peptídeo que compreende um motivo de alelo específico de modo que o peptídeo seja uma molécula de HLA e induz uma resposta humoral ou mediada por célula, por exemplo, linfócito T citotóxico (CTL (por exemplo, CD8+)), linfócito T auxiliar (Th (por exemplo, CD4+)) e/ou resposta de linfócito B. Desse modo, os peptídeos imunogênicos descritos no presente documento são capazes de se ligarem a uma molécula de HLA apropriada e induzindo, posteriormente, uma resposta de CTL (citotóxica) ou uma resposta de HTL (e humoral), ao peptídeo.
[0276] “Neoantigeno” significa uma classe de antígenos tumorais que são provenientes de alterações específicas de tumor em proteínas. Os neoantígenos abrangem, porém sem limitação, antígenos tumorais que são provenientes, por exemplo, da substituição na proteína sequência, mutação de deslocamento de quadro de leitura, polipeptídeo de fusão, deleção em quadro, inserção, expressão de polipeptídeos retrovirais endógenos e superexpressão específica de tumor de polipeptídeos.
[0277] O termo “resíduo” se refere a um resíduo de aminoácido ou resíduo de mimético de aminoácido incorporado em um peptídeo ou proteína por uma ligação de amida ou mimético de ligação de amida ou ácido nucleico (DNA ou RNA) que codifica o aminoácido ou a mimético de aminoácido.
[0278] Um “neoepítopo”, “neoepítopo específico de tumor”
ou “antígeno de tumor” se refere a um epítopo ou região determinante antigênica que não está presente em uma referência, como uma célula não doente, por exemplo, uma célula não cancerosa ou uma célula de linhagem germinativa, mas é encontrado em uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerosa.
Isso inclui situações em que um epítopo correspondente é encontrado em uma célula não doente normal ou uma célula de linhagem germinativa mas, devido a uma ou mais mutações em uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerosa, a sequência do epítopo é alterada de modo a resultar no neoepítopo.
O termo “neoepítopo” como usado no presente documento se refere a uma região determinante antigênica dentro do peptídeo ou peptídeo não antigênico.
Um neoepítopo pode compreender pelo menos um “resíduo âncora” e pelo menos uma “região de flanqueamento de resíduo âncora”. Um neoepítopo pode compreender adicionalmente uma “região de separação”. O termo “resíduo âncora” se refere a um resíduo de aminoácido que se liga a bolsas específicas em HLAs, resultando na especificidade de interações com HLAs.
Em alguns casos, um resíduo âncora pode estar em uma posição âncora canônica.
Em outros casos, um resíduo âncora pode estar em uma posição âncora não canônica.
Os neoepítopos podem se ligar às moléculas de HLA através de resíduos âncora primário e secundário que se projetam em direção aos bolsos nos sulcos de ligação de peptídeo.
Nos sulcos de ligação de peptídeo, aminoácidos específicos compõem bolsos que acomodam as cadeias laterais correspondentes dos resíduos âncora dos neoepítopos apresentados.
As preferências de ligação de peptídeo existem entre diferentes alelos de moléculas tanto de HLA I quanto de HLA II.
As moléculas HLA de classe I se ligam a neoepítopos curtos, cujas extremidades N- e C-terminais são ancoradas nos bolsos localizados nas extremidades do sulco de ligação do neoepítopo. Enquanto a maioria dos neoepítopos de ligação de HLA de classe I é de cerca de 9 aminoácidos, os neoepítopos mais longos podem ser acomodados pela protuberância de sua porção central, resultando em neoepítopos de ligação de cerca de 8 a 12 aminoácidos. Os neoepítopos que se ligam às proteínas HLA de classe II não são limitados em tamanho e podem variar de cerca de 16 a 25 aminoácidos. O sulco de ligação do neoepítopo nas moléculas de HLA de classe II é aberto em ambas as extremidades, o que permite a ligação de peptídeos com comprimento relativamente maior. Embora o segmento longo dos resíduos de aminoácidos do núcleo 9 contribua mais para o reconhecimento do neoepítopo, as regiões de flanqueamento de resíduo âncora também são importantes para a especificidade do peptídeo para o alelo HLA de classe II. Em alguns casos, a região de flanqueamento de resíduo âncora consiste em resíduos de terminação N. Em um outro caso, a região de flanqueamento de resíduo âncora consiste em resíduos de terminação C. Ainda em um outro caso, a região de flanqueamento de resíduo âncora consiste tanto em resíduos de terminação N quanto em resíduos de terminação C. Em alguns casos, a região de flanqueamento de resíduo âncora é flanqueada por pelo menos dois resíduos âncora. Uma região de flanqueamento de resíduo âncora flanqueada por resíduos âncora é uma “região de separação”.
[0279] Uma “referência” pode ser usada para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da presente revelação a partir de um espécime de tumor. Tipicamente, a
“referência” pode ser obtida com base em um ou mais espécimes normais, em particular, espécimes que não são afetados por uma doença de câncer, obtidos de um paciente ou um ou mais indivíduos diferentes, por exemplo, indivíduos saudáveis, em particular, indivíduos da mesma espécie. Uma “referência” pode ser determinada empiricamente testando-se um número suficientemente grande de espécimes normais.
[0280] Um “epítopo” são as características coletivas de uma molécula, como a estrutura do peptídeo primário, secundário e terciário e a carga, que juntas formam um sítio reconhecido por, por exemplo, uma imunoglobulina, receptores de célula T, molécula de HLA ou receptor de antígeno quimérico. Alternativamente, um epítopo pode ser definido como um conjunto de resíduos de aminoácidos que está envolvido no reconhecimento por uma imunoglobulina específica ou no contexto de células T, aqueles resíduos necessários para reconhecimento por proteínas receptoras de células T, receptores de antígeno quimérico e/ou receptores do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC). Um “epítopo de célula T” deve ser entendido como significando uma sequência de peptídeos que pode ser ligada por moléculas de MHC de classe I ou II na forma de uma molécula de MHC de apresentação de peptídeo ou complexo MHC e, assim, nessa forma, ser reconhecida e ligada por células T, como linfócitos T ou células auxiliares T. Os epítopos podem ser preparados por isolamento a partir de uma fonte natural, ou podem ser sintetizados de acordo com os protocolos padrão na técnica. Os epítopos sintéticos podem compreender resíduos de aminoácido artificial, “miméticos de aminoácido”, como isômeros D de resíduos de aminoácido L de ocorrência ou resíduos de aminoácido não natural, como ciclo-hexilalanina.
Ao longo desta revelação, os epítopos podem ser referidos em alguns casos como peptídeos ou epítopos de peptídeo.
Deve ser apreciado que as proteínas ou peptídeos que compreendem um epítopo ou um análogo descrito no presente documento bem como aminoácido (ou aminoácidos) adicional ainda estão dentro das ligações da presente revelação.
Em certas modalidades, o peptídeo compreende um fragmento de um antígeno.
Em certas modalidades, há uma limitação no comprimento de um peptídeo da presente revelação.
A modalidade que é limitada pelo comprimento ocorre quando a proteína ou peptídeo que compreende um epítopo descrito no presente documento compreende uma região (isto é, uma série contígua de resíduos de aminoácidos) tendo 100 % de identidade com uma sequência nativa.
A fim de evitar a definição do epítopo da leitura, por exemplo, em moléculas naturais inteiras, há uma limitação no comprimento de qualquer região que tenha 100 % de identidade com uma sequência de peptídeo nativo.
Desse modo, para um peptídeo que compreende um epítopo descrito no presente documento e uma região com 100 % de identidade com uma sequência nativa de peptídeos, a região com 100 % de identidade para uma sequência nativa tem geralmente um comprimento de: menor ou igual a 600 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 500 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 400 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 250 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 100 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 85 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 75 resíduos de aminoácido, menor ou igual a 65 resíduos de aminoácido e menor ou igual a 50 resíduos de aminoácido.
Em certas modalidades, um “epítopo” descrito no presente documento é compreendido por um peptídeo que tem uma região com menos que 51 resíduos de aminoácido que tem 100 % de identidade para uma sequência nativa de peptídeos, em qualquer incremento até 5 resíduos de aminoácido; Por exemplo, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido.
[0281] A nomenclatura usada para descrever peptídeos ou proteínas segue a prática ou proteínas que o grupo amino é apresentado para a esquerda (a terminação amino ou N) e o grupo carboxila para a direita (a terminação carbóxi ou C) de cada resíduo de aminoácido. Quando as posições de resíduo de aminoácido são referidas em um epítopo de peptídeo, as mesmas são numeradas em uma direção amino para carboxila com posição sendo que uma é o resíduo localizado na extremidade amino terminal do epítopo, ou o peptídeo ou a proteína da qual podem fazer parte. Na fórmula que representa modalidades específicas selecionadas da presente revelação, os grupos amino- e carboxil-terminal, embora não especificamente mostrados, estão na forma que assumiriam em valores de pH fisiológico, a menos que especificado o contrário. Na fórmula de estrutura de aminoácido, cada resíduo é geralmente representado por designações padrão de três letras ou única letra. A forma L de um resíduo de aminoácido é representada por uma letra única maiúscula ou uma primeira letra maiúscula de um símbolo de três letras, e a forma D para aqueles resíduos de aminoácido que têm formas D é representada por uma letra única minúscula ou um símbolo de três letras minúsculas. No entanto, quando símbolos de três letras ou nomes completos são usados sem letras maiúsculas, os mesmos podem se referir a resíduos de aminoácidos L. A glicina não tem átomo de carbono assimétrico e é simplesmente referida como "Gly" ou "G". As sequências de aminoácido de peptídeos apresentadas no presente documento são geralmente designadas usando o símbolo de letra única padrão. (A, alanina; C, Cisteína; D, Ácido aspártico; E, Ácido Glutâmico; F, Fenilalanina; G, Glicina; H, Histidina; I, Isoleucina; K, Lisina; L, Leucina; M, Metionina; N, Asparagina; P, Prolina; Q, Glutamina; R, Arginina; S, Serina; T, Treonina; V, Valina; W, Triptofano; e Y, Tirosina.)
[0282] O termo "mutação" refere-se a uma mudança ou diferença na sequência de ácido nucleico (substituição, adição ou deleção de nucleotídeos) em comparação a uma referência. Uma “mutação somática” pode ocorrer em qualquer uma das células do corpo, exceto nas células germinativas (espermatozoide e óvulo) e, portanto, não são transmitidas às crianças. Essas alterações podem (mas nem sempre) causar câncer ou outras doenças. Em algumas modalidades, uma mutação é uma mutação não sinônima. O termo "mutação não sinônima" refere-se a uma mutação, por exemplo, uma substituição de nucleotídeo, que resulta em uma alteração de aminoácido, como uma substituição de aminoácido no produto de tradução. Um “deslocamento de quadro de leitura” ocorre quando uma mutação interrompe a fase normal da periodicidade do códon de um gene (também conhecido como "quadro de leitura"), resultando na tradução de uma sequência de proteína não nativa. É possível que diferentes mutações em um gene alcancem o mesmo quadro de leitura alterado.
[0283] Uma substituição de aminoácido "conservadora" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina para uma tirosina é uma substituição conservadora. Os métodos de identificação de substituições conservativas de nucleotídeos e aminoácidos que não eliminam a função do peptídeo são bem conhecidos na técnica.
[0284] Como usado no presente documento, o termo "afinidade" se refere a uma medição da força de ligação entre dois membros de um par de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação de HLA e um HLA de classe I ou II. KD é a constante de dissociação e tem unidades de molaridade. A constante de afinidade é o inverso da constante de dissociação. Uma constante de afinidade é algumas vezes usada como um termo genérico para descrever essa entidade química. É uma medição direta da energia de ligação. A afinidade pode ser determinada experimentalmente, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície (SPR) usando unidades Biacore SPR comercialmente disponíveis.
A afinidade também pode ser expressa como a concentração inibitória 50 (IC50), concentração à qual 50 % do peptídeo são deslocados.
Da mesma forma, ln(IC50) se refere ao log natural IC50. Koff se refere à constante de taxa de dissociação, por exemplo, para dissociação de um peptídeo de ligação de HLA e um HLA de classe I ou II.
Ao longo desta revelação, os resultados de “dados de ligação” podem ser expressos em termos de “IC50”. IC50 é a concentração do peptídeo testado em um ensaio de ligação em que 50 % de inibição de ligação de um peptídeo de referência marcado são observados.
Dadas as condições em que os ensaios são executados (isto é, proteínas de HLA limitantes e concentrações de peptídeo de referência marcado), esses valores se aproximam dos valores KD.
Os ensaios para determinar a ligação são bem conhecidos na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, nas publicações PCT WO 94/20127 e WO 94/03205 e outras publicações, como Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, Austrália, et al., J.
Immunol. 154:247 (1995); e Sette, et al., Mol.
Immunol. 31:813 (1994). Alternativamente, a ligação pode ser expressa em relação à ligação por um peptídeo padrão de referência.
Por exemplo, pode ter como base seu IC50, em relação a IC50 de um peptídeo padrão de referência.
A ligação também pode ser determinada com uso de outros sistemas de ensaio incluindo aqueles com uso: células vivas (por exemplo, Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989); Christnick et al., Nature 352:67 (1991); Busch et al., Int.
Immunol. 2:443 (1990); Hill et al., J.
Immunol. 147:189 (1991); del Guercio et al., J. Immunol. 154:685 (1995)), sistemas livres de célula com uso de lisados detergentes (por exemplo, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069 (1991)), MHC purificado imobilizado (por exemplo, Hill et al., J. Immunol. 152, 2890 (1994); Marshall et al., J. Immunol. 152:4946 (1994)), sistemas ELISA (por exemplo, Reay et al., EMBO J. 11:2829 (1992)), ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)); ensaios de fase solúvel de alto fluxo (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994)), e medição de estabilização de MHC de classe I ou montagem (por exemplo, Ljunggren et al., Nature 346:476 (1990); Schumacher et al., Cell 62:563 (1990); Townsend et al., Cell 62:285 (1990); Parker et al., J. Immunol. 149:1896 (1992)). “Ligação de reatividade cruzada” indica que um peptídeo é ligado por mais de uma molécula de HLA; um sinônimo é ligação degenerada.
[0285] O termo “derivado” e seus equivalentes gramaticais quando usados para discutir um epítopo é um sinônimo para “preparado” e seus equivalentes gramaticais. Um epítopo derivado pode ser isolado de uma fonte natural, ou pode ser sintetizado de acordo com protocolos padrão na técnica. Os epítopos sintéticos podem compreender “miméticos de aminoácido” de resíduos de aminoácido artificial, como isômeros D de resíduos de aminoácido L de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido não natural, como ciclo- hexilalanina. Um epítopo derivado ou preparado pode ser um análogo de um epítopo nativo.
[0286] Uma sequência “nativa” ou uma sequência “do tipo selvagem” se refere a uma sequência encontrada na natureza. Tal sequência pode compreender uma maior sequência na natureza.
[0287] Um “receptor” deve ser entendido como significando uma molécula biológica ou um agrupamento de molécula capaz de ligar um ligante. Um receptor pode servir, para transmitir informações em uma célula, uma formação de célula ou um organismo. O receptor compreende pelo menos uma unidade receptora, por exemplo, em que cada unidade receptora pode consistir em uma molécula de proteína. O receptor tem uma estrutura que complementa aquela de um ligante e pode complexar o ligante como um parceiro de ligação. As informações são transmitidas em particular por alterações conformacionais do receptor após complexação do ligando na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, um receptor deve ser entendido como significando, em particular, proteínas de MHC de classes I e II capazes de formar um complexo de receptor/ligante com um ligante, em particular, um peptídeo ou fragmento de peptídeo de comprimento adequado.
[0288] Um “ligante” deve ser entendido como significando uma molécula que tem uma estrutura complementar àquela de um receptor e é capaz de formar um complexo com esse receptor. Em algumas modalidades, um ligante deve ser entendido como significando um peptídeo ou fragmento de peptídeo que tem um comprimento adequado e motivos de ligação adequados em sua sequência de aminoácidos, de modo que o peptídeo ou fragmento de peptídeo seja capaz de formar um complexo com proteínas de MHC de classe I ou MHC de classe II.
[0289] Em algumas modalidades, um “complexo de receptor/ligante” também deve ser entendido como significando um “complexo de receptor/peptídeo” ou “complexo de receptor/fragmento de peptídeo”, incluindo uma molécula de MHC que apresenta peptídeo ou fragmento de peptídeo de classe I ou de classe II.
[0290] “Peptídeo sintético” se refere a um peptídeo que é obtido a partir de uma fonte não natural, por exemplo, é artificial. Tais peptídeos podem ser produzidos com uso de tais métodos como síntese química ou tecnologia de DNA recombinante. “Peptídeos sintéticos” incluem “proteínas de fusão”.
[0291] O termo “motivo” se refere a um padrão de resíduos em uma sequência de aminoácidos de comprimento definido, por exemplo, um peptídeo menor que cerca de 15 resíduos de aminoácido de comprimento, ou menor que cerca de 13 resíduos de aminoácido de comprimento, por exemplo, de cerca de 8 a cerca de 13 resíduos de aminoácido (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, ou 13) para um motivo de HLA de classe I e de cerca de 6 a cerca de 25 resíduos de aminoácido (por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25) para um motivo de HLA de classe II, que é reconhecido por uma molécula de HLA particular. Os motivos são tipicamente diferentes para cada proteína de HLA codificada por um determinado alelo HLA humano. Esses motivos diferem em seu padrão dos resíduos âncora primário e secundário. Em algumas modalidades, um motivo de MHC de classe I identifica um peptídeo de 9, 10 ou 11 resíduos de aminoácido de comprimento.
[0292] O termo “de ocorrência natural” e seus equivalentes gramaticais como usado no presente documento se referem ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
[0293] De acordo com a presente revelação, o termo “vacina” se refere a uma preparação farmacêutica (composição farmacêutica) ou produto que sob administração induz uma resposta imune, por exemplo, uma resposta imune humoral ou celular, que reconhece e ataca um patógeno ou uma célula doente como uma célula cancerosa. Uma vacina pode ser usada para prevenção ou tratamento de uma doença. O termo “vacina individualizada contra câncer” ou “vacina personalizada contra câncer” se refere a um paciente com câncer particular e significa que uma vacina contra câncer é adaptada às necessidades ou circunstâncias especiais de um paciente com câncer individual.
[0294] “Processamento de antígeno” ou “processamento” e seus equivalentes gramaticais se refere à degradação de um polipeptídeo ou antígeno em produtos de processão, que são fragmentos do dito polipeptídeo ou antígeno (por exemplo, a degradação de um polipeptídeo em peptídeos) e a associação de um ou mais desses fragmentos (por exemplo, através de ligação) com moléculas de MHC para apresentação por células, por exemplo, células que apresentam antígeno, às células T específicas.
[0295] “Células que apresentam antígeno” (APC) são células que apresentam fragmentos de peptídeo de antígenos de proteína em associação com moléculas de MHC em sua superfície celular. Algumas APCs podem ativar células T específicas de antígeno. As células que apresentam antígeno profissionais são muito eficazes na internalização de antígenos, seja por fagocitose ou por endocitose mediada por receptor e, então, exibem um fragmento do antígeno, ligado a uma molécula de MHC de classe II, em sua membrana.
A célula T reconhece e interage com o complexo de molécula de MHC de classe II de antígeno na membrana da célula que apresenta antígeno.
Um sinal coestimulador adicional é, então, produzido pela célula que apresenta antígeno, levando à ativação da célula T.
A expressão de moléculas coestimuladoras é um recurso de definição de células que apresentam antígeno profissionais.
Os principais tipos de células que apresentam antígeno profissionais são células dendríticas, que têm a faixa mais ampla de apresentação de antígeno e são provavelmente as células que apresentam antígeno mais importantes, macrófagos, células B e certas células epiteliais ativadas.
Células dendríticas (DCs) são populações de leucócitos que apresentam antígenos capturados em tecidos periféricos para células T através de ambas as vias de apresentação de antígeno de MHC de classe II e I.
Sabe-se bem que as células dendríticas são potentes indutores de respostas imunes e a ativação dessas células é uma etapa crítica para a indução da imunidade antitumoral.
As células dendríticas são convenientemente categorizadas como células "imaturas" e "maduras", o que pode ser usado como uma maneira simples de discriminação entre dois fenótipos bem caracterizados.
No entanto, essa nomenclatura não deve ser interpretada para excluir todos os estágios intermediários possíveis de diferenciação.
As células dendríticas imaturas são caracterizadas como células que apresentam antígenos com alta capacidade de absorção e processamento de antígenos, o que se correlaciona com a alta expressão do receptor Fc (FcR)
e do receptor de manose. O fenótipo maduro é tipicamente caracterizado por uma expressão mais baixa desses marcadores, mas uma alta expressão de moléculas de superfície celular responsáveis pela ativação de células T, como MHC de classe I e classe II, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CD11) e moléculas coestimuladoras (por exemplo, CD40, CD80, CD86 e 4-1 BB).
[0296] Os termos "idênticos" e seus equivalentes gramaticais, como usado no presente documento ou "identidade de sequência" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou sequências de aminoácidos de polipeptídeos, se referem aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Uma "janela de comparação", como usado no presente documento, se refere a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem alinhadas de forma otimizada. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981); pelo algoritmo de alinhamento de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970); pela pesquisa para método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 85:2444 (1988); por implementações computadorizadas desses algoritmos (incluindo, porém sem limitação, CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligentics,
Mountain View Calif., EUA, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., EUA); o programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) e Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); e Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994). Alinhamento também é frequentemente realizado por alinhamento manual e inspeção.
Em uma classe de modalidades, os polipeptídeos no presente documento têm pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um polipeptídeo de referência, ou um fragmento do mesmo, por exemplo, como medido por BLASTP (ou CLUSTAL, ou qualquer outro software de alinhamento disponível) com uso de parâmetros padrão.
De modo similar, os ácidos nucleicos também podem ser descritos com referência a um ácido nucleico de partida, por exemplo, os mesmos podem ter 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um ácido nucleico de referência ou um fragmento do mesmo, por exemplo, como medido por BLASTN (ou CLUSTAL, ou qualquer outro software de alinhamento disponível) com uso de parâmetros padrão.
Quando se diz que uma molécula tem certa porcentagem de identidade de sequência com uma molécula maior, isso significa que quando as duas moléculas estão alinhadas de forma otimizada, a dita porcentagem de resíduos na molécula menor encontra um resíduo correspondente na molécula maior de acordo com a ordem em que as duas moléculas estão alinhadas de maneira ideal.
[0297] O termo "substancialmente idêntico" e seus equivalentes gramaticais quando aplicado a sequências de ácido nucleico ou aminoácidos significa que uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência de aminoácidos compreende uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência ou mais, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % e pelo menos 99 %, em comparação com uma sequência de referência usando os programas descritos acima, por exemplo, BLAST, usando parâmetros padrão. Por exemplo, o programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 10915 (1992)). A porcentagem de identidade de sequência é determinada comparando-se duas sequências alinhadas de forma otimizada em uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Em modalidades, a identidade substancial existe sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos e em modalidades, as sequências são substancialmente idênticas em pelo menos cerca de 150 resíduos. Em modalidades, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das regiões de codificação.
[0298] O termo "vetor", como usado no presente documento, significa um construto que é capaz de entregar e geralmente expressar um ou mais genes (ou gene) ou sequências (ou sequências) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, porém sem limitação, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nu, vetores de expressão de plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensação catiônicos e vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomos.
[0299] Um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que é "isolado" é um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que está em uma forma não encontrada na natureza. Os polipeptídeos, anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células ou composições isolados incluem aqueles que foram purificados até um grau em que não estão mais na forma em que são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que é isolada é substancialmente pura. Em algumas modalidades, um "polinucleotídeo isolado" abrange uma PCR ou reação de PCR quantitativa que compreende o polinucleotídeo amplificado na PCR ou reação de PCR quantitativa.
[0300] O termo "isolado", "biologicamente puro" ou seus equivalentes gramaticais se refere ao material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material visto que é encontrado em seu estado nativo. Assim, os peptídeos isolados descritos no presente documento não contêm alguns ou todos os materiais normalmente associados aos peptídeos em seu ambiente in situ. Um epítopo "isolado" se refere a um epítopo que não inclui toda a sequência do antígeno a partir do qual o epítopo foi derivado. Tipicamente, o epítopo "isolado" não possui resíduos de aminoácidos adicionais que resultam em uma sequência que tem 100 % de identidade ao longo de todo o comprimento de uma sequência nativa. A sequência nativa pode ser uma sequência tal como um antígeno associado a tumor a partir do qual o epítopo é derivado. Assim, o termo "isolado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ocorrer naturalmente). Um ácido nucleico "isolado" é um ácido nucleico removido de seu ambiente natural. Por exemplo, um polinucleotídeo ou peptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou peptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tal polinucleotídeo pode ser parte de um vetor e/ou tal polinucleotídeo ou peptídeo pode ser parte de uma composição e ainda ser "isolado" de modo que tal vetor ou composição não faça parte de seu ambiente natural. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de
RNA in vivo ou in vitro das moléculas de DNA descritas no presente documento e incluem adicionalmente tais moléculas produzidas sinteticamente.
[0301] O termo "substancialmente purificado" e seus equivalentes gramaticais, como usado no presente documento, se refere a uma sequência de ácidos nucleicos, polipeptídeo, proteína ou outro composto que é essencialmente livre, ou seja, é mais que cerca de 50 % livre de, mais que cerca de 70 % livre de, mais de cerca de 90 % livre dos polinucleotídeos, proteínas, polipeptídeos e outras moléculas com as quais o ácido nucleico, polipeptídeo, proteína ou outro composto está naturalmente associado.
[0302] O termo "substancialmente puro", como usado no presente documento, se refere ao material que é pelo menos 50 % puro (ou seja, livre de contaminantes), pelo menos 90 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 98 % puro ou pelo menos 99 % puro.
[0303] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "ácido nucleico", "ácido polinucleico" ou "oligonucleotídeo" e seus equivalentes gramaticais são usados no presente documento indistintamente e se referem a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA, por exemplo, mRNA. Assim, esses termos incluem DNA de fita simples e dupla, DNA triplex, bem como RNA de fita simples e dupla. Também inclui formas modificadas, por exemplo, por metilação e/ou cobertura, e formas não modificadas do polinucleotídeo. O termo também pretende incluir moléculas que incluem nucleotídeos de ocorrência não natural ou sintéticos, bem como análogos de nucleotídeos. As sequências de ácidos nucleicos e vetores revelados ou contemplados no presente documento podem ser introduzidos em uma célula, por exemplo, por transfecção, transformação ou transdução. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados e ou seus análogos ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo e ácido nucleico podem ser mRNA transcrito in vitro. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que é administrado com uso dos métodos da presente revelação é mRNA.
[0304] “Transfecção”, “transformação” ou “transdução” como usado no presente documento se refere à introdução de uma ou mais polinucleotídeos exógenos em uma célula hospedeira através do uso de métodos físicos e químicos. Muitas técnicas de transfecção são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, coprecipitação de DNA de fosfato de cálcio (consulte, por exemplo, Murray EJ (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextran; electroporation; cationic liposome-mediated transfection; tungsten particle-facilitated microparticle bombardment (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e strontium phosphate DNA co-precipitation (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Os vetores de fago ou virais podem ser introduzidos nas células hospedeiras, após o crescimento de partículas infecciosas em células de empacotamento adequadas, muitas das quais estão disponíveis comercialmente.
[0305] Os ácidos nucleicos e/ou sequências de ácidos nucleicos são "homólogos" quando são derivados, natural ou artificialmente, de um ácido nucleico ancestral comum ou sequência de ácido nucleico. Proteínas e/ou sequências de proteínas são "homólogas" quando seus DNAs de codificação são derivados, natural ou artificialmente, de um ácido nucleico ancestral comum ou sequência de ácido nucleico. As moléculas homólogas podem ser denominadas homólogas. Por exemplo, quaisquer proteínas de ocorrência natural, como descrito no presente documento, podem ser modificadas por qualquer método de mutagênese disponível. Quando expresso, esse ácido nucleico mutagenizado codifica um polipeptídeo que é homólogo à proteína codificada pelo ácido nucleico original. A homologia é geralmente inferida da identidade de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos ou proteínas (ou suas sequências). A porcentagem precisa de identidade entre sequências que é útil no estabelecimento de homologia varia com o ácido nucleico e a proteína em questão, mas tão pouco quanto 25 % de identidade de sequência é rotineiramente usada para estabelecer homologia. Níveis mais elevados de identidade de sequência, por exemplo, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % ou mais também podem ser usados para estabelecer homologia. Métodos para determinar as porcentagens de identidade de sequência (por exemplo, BLASTP e BLASTN usando parâmetros padrão) são descritos no presente documento e estão geralmente disponíveis.
[0306] O termo "indivíduo" se refere a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, porém sem limitação, humanos, primatas não humanos, caninos, felinos, roedores e similares, que deve ser o destinatário de um tratamento específico. Normalmente, os termos "indivíduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável no presente documento em referência a um indivíduo humano.
[0307] Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "efeito terapêutico" se referem a uma quantidade de uma terapêutica eficaz para "tratar" uma doença ou transtorno em um indivíduo ou mamífero. A quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco tem um efeito terapêutico e, como tal, pode prevenir o desenvolvimento de uma doença ou transtorno; retardar o desenvolvimento de uma doença ou transtorno; retardar a progressão de uma doença ou transtorno; aliviar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados a uma doença ou transtorno; reduzir a morbidade e mortalidade; melhorar a qualidade de vida; ou uma combinação de tais efeitos.
[0308] Os ambos termos “que trata” ou “tratamento” ou “para tratar” ou “que alivia” ou “para aliviar” se referem a (1) medidas terapêuticas que curam, retardam, diminuem os sintomas de e/ou interrompem a progressão de um transtorno ou condição patológica diagnosticada; e (2) medidas profiláticas ou preventivas que previnem ou retardam o desenvolvimento de uma condição ou transtorno patológico direcionado. Assim, aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm o transtorno; aqueles propensos a ter o transtorno; e aqueles nos quais o transtorno deve ser prevenido.
[0309] "Farmaceuticamente aceitável" se refere a uma composição ou componente geralmente não tóxico, inerte e/ou fisiologicamente compatível de uma composição.
[0310] Um "excipiente farmacêutico" ou "excipiente" compreende um material, como um adjuvante, um carreador, agentes de ajuste de pH e tampão, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, conservantes e similares. Um "excipiente farmacêutico" é um excipiente que é farmaceuticamente aceitável. Neoantígenos e Usos dos Mesmos
[0311] Uma das barreiras críticas para o desenvolvimento da imunoterapia curativa e específica de tumor é a identificação e seleção de antígenos tumorais altamente específicos e restritos para evitar a autoimunidade. Os neoantígenos tumorais, que surgem como resultado de mudança genética (por exemplo, inversões, translocações, deleções, mutações missense, mutações no sítio de splice, etc.) dentro das células malignas, representam a classe de antígenos mais específica do tumor. Os neoantígenos foram raramente usados em vacinas contra o câncer ou composições imunogênicas devido a dificuldades técnicas em identificá-los, selecionar antígenos otimizados e produzir neoantígenos para uso em uma vacina ou composição imunogênica. Esses problemas podem ser resolvidos por: identificar mutações em neoplasias/tumores que estão presentes no nível do DNA no tumor, mas não em amostras de linha germinativa correspondentes de uma alta proporção de indivíduos com câncer; analisar as mutações identificadas com um ou mais algoritmos de previsão de ligação de peptídeo-MHC para gerar uma pluralidade de epítopos de célula T de neoantígeno que são expressos dentro da neoplasia/tumor e que se ligam a uma alta proporção de alelos HLA do paciente; e sintetizar a pluralidade de peptídeos neoantigênicos selecionados a partir dos conjuntos de todos os peptídeos neoantigênicos e peptídeos de ligação previstos para uso em uma vacina contra o câncer ou composição imunogênica adequada para o tratamento de uma alta proporção de indivíduos com câncer.
[0312] Por exemplo, a tradução da informação de sequenciamento de peptídeos em uma vacina terapêutica pode incluir a previsão de peptídeos mutados que podem se ligar a moléculas HLA de uma alta proporção de indivíduos. A escolha de modo eficaz de quais mutações particulares utilizar como imunógeno requer a capacidade de prever quais peptídeos mutados se ligariam de forma eficaz a uma alta proporção de alelos HLA do paciente. Recentemente, as abordagens de aprendizagem à base de rede neural com peptídeos de ligação e não-ligação validados aumentaram a precisão dos algoritmos de predição para os principais alelos HLA-A e -B. No entanto, mesmo usando algoritmos avançados à base de rede neural para codificar regras de ligação de peptídeo HLA, vários fatores limitam a possibilidade de prever os peptídeos apresentados em alelos HLA.
[0313] Outro exemplo de tradução das informações de sequenciamento de peptídeos em uma vacina terapêutica pode incluir a formulação do fármaco como uma vacina de múltiplos epítopos de peptídeos longos. Direcionar o maior número possível de epítopos mutados tira vantagem praticamente da enorme capacidade do sistema imunológico, evita a oportunidade de escape imunológico por modulação descendente de um produto de gene imunologicamente alvejado e compensa a imprecisão conhecida das abordagens de predição de epítopos. Os peptídeos sintéticos proporcionam um meio útil para preparar múltiplos imunógenos de forma eficaz e para traduzir rapidamente a identificação de epítopos mutantes em uma vacina eficaz. Os peptídeos podem ser prontamente sintetizados quimicamente e purificados facilmente utilizando reagentes livres de bactérias ou substâncias animais contaminantes. O tamanho pequeno permite um foco claro na região mutada da proteína e também reduz a competição antigênica irrelevante de outros componentes (proteína não mutada ou antígenos de vetor viral).
[0314] Ainda outro exemplo de tradução de informações de sequenciamento de peptídeo em uma vacina terapêutica pode incluir uma combinação com um adjuvante de vacina forte. Vacinas eficazes podem exigir um adjuvante forte para iniciar uma resposta imune. Por exemplo, poli-ICLC, um agonista de TLR3 e os domínios de helicase de RNA de MDA5 e RIG3, mostrou várias propriedades desejáveis para um adjuvante de vacina. Essas propriedades incluem a indução da ativação local e sistêmica de células imunes in vivo, a produção de quimiocinas e citocinas estimuladoras e o estímulo da apresentação de antígenos por DCs. Além disso, o poli-ICLC pode induzir respostas duráveis de CD4+ e CD8+ em humanos. É importante notar que similaridades marcantes na regulação ascendente das vias de transcrição e transdução de sinal foram observadas em indivíduos vacinados com poli-ICLC e em voluntários que receberam a vacina contra febre amarela altamente eficaz e competente para replicação. Além disso, >90 % dos pacientes com carcinoma de ovário imunizados com poli-ICLC em combinação com uma vacina de peptídeo NYESO-1 (além de Montanida) mostraram indução de células T CD4+ e CD8+, bem como respostas de anticorpos ao peptídeo em um estudo de fase recente 1. Ao mesmo tempo, o poli-ICLC foi amplamente testado em mais de 25 ensaios clínicos até o momento e exibiu um perfil de toxicidade relativamente benigno.
[0315] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende: um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da mesma proteína, um polinucleotídeo que codifica o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, uma ou mais APCs que compreendem o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, ou um primeiro receptor de célula T (TCR) específico para o primeiro neoepítopo em complexo com uma proteína de HLA e uma segunda TCR específica para o segundo neoepítopo em complexo com uma proteína de HLA; em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação.
[0316] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende: um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da região da mesma proteína, em que o primeiro neoepítopo e o segundo neoepítopo compreendem pelo menos um aminoácido da região que é a mesma, um polinucleotídeo que codifica o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, uma ou mais APCs que compreendem o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, ou um primeiro receptor de célula T (TCR) específico para o primeiro neoepítopo em complexo com uma proteína de HLA e uma segunda TCR específica para o segundo neoepítopo em complexo com uma proteína de HLA; em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação.
[0317] Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo são moléculas diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo compreende um primeiro neoepítopo de uma região da mesma proteína, em que o segundo neoepítopo compreende um segundo neoepítopo da região da mesma proteína. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e o segundo neoepítopo compreendem pelo menos um aminoácido da região que é a mesma. Em algumas modalidades, a região da proteína compreende pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 aminoácidos contíguos da proteína. Em algumas modalidades, a região da proteína compreende no máximo de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou
1.000 aminoácidos contíguos da proteína. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo é um primeiro peptídeo de neoepítopo processado a partir do primeiro peptídeo e/ou o segundo neoepítopo é um segundo peptídeo de neoepítopo processado a partir do segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo tem comprimento menor que o primeiro peptídeo e/ou o segundo neoepítopo tem comprimento menor que o segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo de neoepítopo é processado por uma célula que apresenta antígeno (APC) que compreende o primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo de neoepítopo é processado por uma APC que compreende o segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD8+ T.
Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD4+ T.
Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD8+ T.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD4+ T.
Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II que compreende o primeiro ou o segundo peptídeos.
Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I que compreende o primeiro ou o segundo peptídeos.
Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I que compreende o primeiro ou o segundo peptídeos.
Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II que compreende o primeiro ou o segundo peptídeos.
Em algumas modalidades, a uma ou mais APCs compreendem uma primeira APC que compreende o primeiro peptídeo e uma segunda APC que compreende o segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma mutação de sítio de splice, uma mutação de deslocamento de quadro de leitura, uma mutação de leitura direta, uma mutação de fusão de gene e qualquer combinação das mesmas.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e o segundo neoepítopo compreendem uma sequência codificada por um gene da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, a proteína é codificada por um gene da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação da coluna 2 da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, a proteína é GATA3. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e o segundo neoepítopo compreendem uma sequência codificada por um gene da Tabela 34 ou Tabela 36. Em algumas modalidades, a proteína é codificada por um gene da Tabela 34 ou Tabela 36. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação da coluna 2 da Tabela 34 ou Tabela 36. Em algumas modalidades, a proteína é BTK.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e o segundo neoepítopo compreendem uma sequência codificada por um gene da Tabela 40A-40D.
Em algumas modalidades, a proteína é codificada por um gene da Tabela 3 ou 35. Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação da coluna 2 da Tabela 3 ou 35. Em algumas modalidades, a proteína é EGFR.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo único compreende o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, ou um polinucleotídeo único codifica o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo são codificados por uma sequência tarnscrita a partir de um mesmo sítio de início de transcrição.
Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é codificado por uma sequência transcrita a partir de um primeiro sítio de início de transcrição e o segundo peptídeo é codificado por uma sequência transcrita a partir de um segundo sítio de início de transcrição. Em algumas modalidades, o polipeptídeo único tem um comprimento de pelo menos 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1.000; 1.500; 2.000;
2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 7.500; ou 10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma primeira sequência com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um primeiro correspondente da sequência do tipo selvagem; e uma segunda sequência com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um segundo correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma primeira sequência de pelo menos 8 ou 9 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um primeiro correspondente da sequência do tipo selvagem; e uma segunda sequência de pelo menos 16 ou 17 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %,
76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um segundo correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é maior que o primeiro peptídeo, em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é maior que o segundo peptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo tem um comprimento de pelo menos 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900;
1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 7.500; ou
10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo tem um comprimento de pelo menos 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000;
7.500; ou 10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo compreende uma sequência de pelo menos 9 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade para um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo compreende uma sequência de pelo menos 17 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade para um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo é maior que o primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo tem um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo tem um comprimento de 8 a 12 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 8 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 2 dos 8 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo tem um comprimento de pelo menos 16 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo tem um comprimento de 16 a 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 16 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 2 dos 16 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem.
[0318] Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo compreende pelo menos uma mutação adicional. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional não é uma mutação no primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional é uma mutação no primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo compreende pelo menos uma mutação adicional. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional não é uma mutação no segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional é uma mutação no segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo, o segundo peptídeo ou ambos compreendem pelo menos uma sequência de flanqueamento, em que a pelo menos uma sequência de flanqueamento é a montante ou a jusante do neoepítopo.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento tem pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento compreende uma sequência do tipo não selvagem.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento é uma sequência de flanqueamento de terminação N.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento é uma sequência de flanqueamento de terminação C.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento do primeiro peptídeo tem pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a pelo menos uma sequência de flanqueamento do segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma região de flanqueamento do primeiro peptídeo é diferente da a pelo menos uma região de flanqueamento do segundo peptídeo.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de flanqueamento compreende a mutação.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo, o segundo neoepítopo ou ambos compreendem pelo menos um resíduo âncora.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora do primeiro neoepítopo está em uma posição âncora canônica.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora do primeiro neoepítopo está em uma posição âncora não canônica.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora do segundo neoepítopo está em uma posição âncora canônica.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora do segundo neoepítopo está em uma posição âncora não canônica.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora do primeiro neoepítopo é diferente do pelo menos um resíduo âncora do segundo neoepítopo.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora é um do tipo selvagem resíduo.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora é uma substituição.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e/ou o segundo neoepítopo se ligam a uma proteína de HLA com uma afinidade maior que um neoepítopo correspondente sem a substituição.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo e/ou o segundo neoepítopo se ligam a uma proteína de HLA com uma afinidade maior que uma correspondente dA sequência do tipo selvagem sem a substituição.
Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo âncora não compreende a mutação.
Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo, o segundo neoepítopo ou ambos compreendem pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora.
Em algumas modalidades, o neoepítopo compreende pelo menos um resíduo âncora.
Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora compreendem pelo menos dois resíduos âncora.
Em algumas modalidades, os pelo menos dois resíduos âncora são separados por uma região de separação que compreende pelo menos 1 aminoácido.
Em algumas modalidades,
a pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora não está dentro da região de separação. Em algumas modalidades, a pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora está a montante de um resíduo âncora de N- terminal dos pelo menos dois resíduos âncora a jusante de um resíduo âncora de C-terminal dos pelo menos dois resíduo âncora tanto (a) quanto (b).
[0319] Em algumas modalidades, a composição compreende um adjuvante. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais peptídeos adicionais, em que o um ou mais peptídeos adicionais compreendem um terceiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA com uma afinidade maior que uma correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA com um KD ou um IC50 menor que 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA De classe I com um KD ou um IC50 menor que 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA de classe II com um KD ou um IC50 menor que 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína codificada por um alelo HLA expresso por um indivíduo. Em algumas modalidades, a mutação não está presente em células não cancerosas de um indivíduo. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos são codificados por um gene ou um gene expresso de células cancerosas de um indivíduo.
Em algumas modalidades, a composição compreende uma primeira célula T que compreende o primeiro TCR.
Em algumas modalidades, a composição compreende uma segunda célula T que compreende o segundo TCR.
Em algumas modalidades, o primeiro TCR compreende um domínio intracelular não nativo e/ou o segundo TCR compreende um domínio intracelular não nativo.
Em algumas modalidades, o primeiro TCR é um TCR solúvel e/ou o segundo TCR é um TCR solúvel.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T citotóxica.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T gama delta.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T auxiliar.
Em algumas modalidades, a primeiro célula T é uma célula T estimulada, expandida ou induzida com o primeiro neoepítopo e/ou a segunda célula T é uma célula T estimulada, expandida ou induzida com o segundo neoepítopo.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T autóloga.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T alogênica.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T manipulada.
Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda células T são uma célula T de uma linhagem celular.
Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo TCRs se ligam a um complexo de HLA-peptídeo com um KD ou um IC50 menor que 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM.
Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um primeiro e um segundo peptídeos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, o vetor é um replicon, plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion de RNA de autoamplificação. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é derivado de um retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adenosassociado, vírus herpes, poxvírus, vírus alfa, vírus vaccinia, vírus da hepatite B, papilomavírus humano ou um pseudótipo dos mesmos. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é uma nanopartícula, um lipídio catiônico, um polímero catiônico, um nanopolímero metálico, um nanorod, um lipossomo, uma micela, uma microbolha, um peptídeo de penetração celular ou uma liposfera.
[0320] Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende: uma composição descrita no presente documento, ou um vetor descrito no presente documento; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0321] Em algumas modalidades, a pluralidade de células consiste em células autólogas. Em algumas modalidades, a pluralidade de células APC consiste em células autólogas. Em algumas modalidades, a pluralidade de células T consiste em células autólogas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é uma citocina. Em algumas modalidades, o adjuvante é poliICLC. Em algumas modalidades,
o adjuvante é Hiltonol.
[0322] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método de tratamento de câncer, em que o método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0323] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método de prevenção da resistência a uma terapia de câncer, em que o método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0324] Em alguns aspectos, é fornecido no presente documento um método de indução de uma resposta imune, em que o método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma composição farmacêutica descrita no presente documento.
[0325] Em algumas modalidades, a resposta imune é um uma resposta. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo são administrados simultânea, separada ou sequencialmente. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é sequencialmente administrado após o segundo peptídeo. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é sequencialmente administrado após o primeiro peptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é sequencialmente administrado após um período de tempo suficiente para o segundo peptídeo ativar as células T. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é sequencialmente administrado após um período de tempo suficiente para o primeiro peptídeo ativar as células T. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é sequencialmente administrado após o segundo peptídeo reestimular as células T. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é sequencialmente administrado após o primeiro peptídeo reestimular as células T. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é administrado para estimular as células T e o segundo peptídeo é administrado após o primeiro peptídeo reestimular as células T. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é administrado para estimular as células T e o primeiro peptídeo é administrado após o segundo peptídeo reestimular as células T.
[0326] Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer ovarino, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer do endométrio e leucemia linfocítica crônica (CLL). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama que é resistente à terapia antiestrogênio, é um câncer de mama de MSI, é um câncer de mama metastático, é um câncer de mama negativo para Her2, é um câncer de mama positivo para Her2, é um câncer de mama negativo para ER, é um câncer de mama positivo para ER, é um câncer de mama positivo para PR, é um câncer de mama negativo para PR ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o câncer de mama expressa um receptor de estrogênio com uma mutação. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de mama que é resistente à terapia antiestrogênio. Em algumas modalidades, o câncer de mama expressa um receptor de estrogênio com uma mutação. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma CLL que é resistente à terapia de ibrutinibe. Em algumas modalidades, a CLL expressa uma tirosina quinase de Bruton com uma mutação, como uma mutação C481S. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer de pulmão que é resistente à um inibidor de tirosina quinase. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão expressa um receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) com uma mutação, como uma mutação T790M. Em algumas modalidades, a pluralidade de células APC que compreende o primeiro peptídeo e a pluralidade de células APC que compreende o segundo peptídeo são administradas simultânea, separada ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a pluralidade de células T que compreende o primeiro TCR e a pluralidade de células T que compreende o segundo TCR são administradas simultânea, separada ou sequencialmente. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti-PD-L1, um agente anti-CTLA-4 ou um agente anti-CD40. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado antes, simultaneamente ou após administrar uma composição farmacêutica de acordo com o que está descrito no presente documento. Peptídeos
[0327] Em aspectos, a presente revelação fornece peptídeos isolados que compreendem uma mutação de tumor específico da Tabela 1 ou 2. Em aspectos, a presente revelação fornece peptídeos isolados que compreendem uma mutação de tumor específico da Tabela 34. Em aspectos, a presente revelação fornece peptídeos isolados que compreendem uma mutação de tumor específico da Tabela 40A- 40D.
Esses peptídeos e polipeptídeos são referidos no presente documento como “peptídeos neoantigênicos” ou “polipeptídeos neoantigênicos”. “Polipeptídeo”, “peptídeo” e seus equivalentes gramaticais como usado no presente documento se referem a um polímero de resíduos de aminoácido, tipicamente L-aminoácidos, conectados entre si, tipicamente por ligações de peptídeo entre os grupos α-amino e carboxila de aminoácidos adjacentes.
Polipeptídeos e peptídeos incluem, porém sem limitação, “peptídeos mutantes”, “peptídeos de neoantígeno” e “peptídeos neoantigênicos”. Polipeptídeos ou peptídeos podem ser uma variedade de comprimentos, em suas formas neutras (não carregadas) ou em formas que são sais e livres de modificações, como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fosforilação ou contendo essas modificações, submetidos à condição de que a modificação não destrói a atividade biológica dos polipeptídeos como descrito no presente documento.
Um peptídeo ou polipeptídeo pode compreender pelo menos uma sequência de flanqueamento.
O termo “sequência de flanqueamento” como usado no presente documento se refere a um fragmento ou região de um peptídeo que não faz parte de um epítopo.
A Tabela 1 lista peptídeos de neoORF de GATA3
Tipo Sequências 8mers EPCSMLTG (SEQ ID NO: 305), PCSMLTGP (SEQ ID NO: 306), CSMLTGPP (SEQ ID NO: 307), SMLTGPPA (SEQ ID NO: 308), MLTGPPAR (SEQ ID NO: 309), LTGPPARV (SEQ ID NO: 310), TGPPARVP (SEQ ID NO: 311), GPPARVPA (SEQ ID NO: 312), PPARVPAV (SEQ ID NO: 313), PARVPAVP (SEQ ID NO: 314), ARVPAVPF (SEQ ID NO: 315), RVPAVPFD (SEQ ID NO: 316), VPAVPFDL (SEQ ID NO: 317), PAVPFDLH (SEQ ID NO: 318), AVPFDLHF (SEQ ID NO: 319), VPFDLHFC (SEQ ID NO: 320), PFDLHFCR (SEQ ID NO: 321), FDLHFCRS (SEQ ID NO: 322), DLHFCRSS (SEQ ID NO: 323), LHFCRSSI (SEQ ID NO: 324), HFCRSSIM (SEQ ID NO: 325), FCRSSIMK (SEQ ID NO: 326), CRSSIMKP (SEQ ID NO: 327), RSSIMKPK (SEQ ID NO: 328), SSIMKPKR (SEQ ID NO: 329), SIMKPKRD (SEQ ID NO: 330), IMKPKRDG (SEQ ID NO: 331), MKPKRDGY (SEQ ID NO: 332), KPKRDGYM (SEQ ID NO: 333), PKRDGYMF (SEQ ID NO: 334), KRDGYMFL (SEQ ID NO: 335), RDGYMFLK (SEQ ID NO: 336), DGYMFLKA (SEQ ID NO: 337), GYMFLKAE (SEQ ID NO: 338), YMFLKAES (SEQ ID NO: 339), MFLKAESK (SEQ ID NO: 340), FLKAESKI (SEQ ID NO: 341), LKAESKIM (SEQ ID NO: 342), KAESKIMF (SEQ ID NO: 343), AESKIMFA (SEQ ID NO: 344), ESKIMFAT (SEQ ID NO: 345), SKIMFATL (SEQ ID NO: 346), KIMFATLQ (SEQ ID NO: 347), IMFATLQR (SEQ ID NO: 348), MFATLQRS (SEQ ID NO: 349), FATLQRSS (SEQ ID NO: 350), ATLQRSSL (SEQ ID NO: 351), TLQRSSLW (SEQ ID NO: 352), LQRSSLWC (SEQ ID NO: 353), QRSSLWCL (SEQ ID NO: 354), RSSLWCLC (SEQ ID NO: 355), SSLWCLCS (SEQ ID NO: 356), SLWCLCSN
Tipo Sequências (SEQ ID NO: 357)
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Tipo Sequências KIMFATLQR (SEQ ID NO: 400), IMFATLQRS (SEQ ID NO: 401), MFATLQRSS (SEQ ID NO: 402), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 403), ATLQRSSLW (SEQ ID NO: 404), TLQRSSLWC (SEQ ID NO: 405), LQRSSLWCL (SEQ ID NO: 406), QRSSLWCLC (SEQ ID NO: 407), RSSLWCLCS (SEQ ID NO: 408), SSLWCLCSN (SEQ ID NO: 409), SLWCLCSNH (SEQ ID NO: 410) 10mers EPCSMLTGPP (SEQ ID NO: 411), PCSMLTGPPA (SEQ ID NO: 412), CSMLTGPPAR (SEQ ID NO: 413), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 414), MLTGPPARVP (SEQ ID NO: 415), LTGPPARVPA (SEQ ID NO: 416), TGPPARVPAV (SEQ ID NO: 417), GPPARVPAVP (SEQ ID NO: 418), PPARVPAVPF (SEQ ID NO: 419), PARVPAVPFD (SEQ ID NO: 420), ARVPAVPFDL (SEQ ID NO: 421), RVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 422), VPAVPFDLHF (SEQ ID NO: 423), PAVPFDLHFC (SEQ ID NO: 424), AVPFDLHFCR (SEQ ID NO: 425), VPFDLHFCRS (SEQ ID NO: 426), PFDLHFCRSS (SEQ ID NO: 427), FDLHFCRSSI (SEQ ID NO: 428), DLHFCRSSIM (SEQ ID NO: 429), LHFCRSSIMK (SEQ ID NO: 430), HFCRSSIMKP (SEQ ID NO: 431), FCRSSIMKPK (SEQ ID NO: 432), CRSSIMKPKR (SEQ ID NO: 433), RSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 434), SSIMKPKRDG (SEQ ID NO: 435), SIMKPKRDGY (SEQ ID NO: 436), IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 437), MKPKRDGYMF (SEQ ID NO: 438), KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 439), PKRDGYMFLK (SEQ ID NO: 440), KRDGYMFLKA (SEQ ID NO: 441), RDGYMFLKAE (SEQ ID NO: 442), DGYMFLKAES (SEQ ID NO: 443), GYMFLKAESK (SEQ ID NO: 444), YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 445), MFLKAESKIM (SEQ ID NO: 446), FLKAESKIMF (SEQ ID
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A Tabela 2 abaixo lista Peptídeos Selecionados Exemplificativos
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela 2 DESLOCAMENTOS DE
QUADRO DE LEITURA 1 GATA3 L328fs AQAKAVCSQESRDVL CLQCLWALL (A02.01) (SEQ ID Câncer de Mama N334fs CELSDHHNHTLEEEC NO: 1561) QWGPCLQCLWALLQA CQWGPCLQCL (A02.01) (SEQ ID SQY* (SEQ ID NO: NO: 1562) 1559) QWGPCLQCL (A24.02) (SEQ ID NO: 1563) QWGPCLQCLW (A24.02) (SEQ ID NO: 1564) GATA3 H400fs PGRPLQTHVLPEPHL AIQPVLWTT (A02.01) (SEQ ID Câncer de Mama S408fs ALQPLQPHADHAHAD NO: 1565) S408fs APAIQPVLWTTPPLQ ALQPLQPHA (A02.01) (SEQ ID S430fs HGHRHGLEPCSMLTG NO: 1566) H434fs PPARVPAVPFDLHFC DLHFCRSSIM (B08.01) (SEQ ID H435fs RSSIMKPKRDGYMFL NO: 1567) KAESKIMFATLQRSS EPHLALQPL (B07.02, B08.01) LWCLCSNH* (SEQ (SEQ ID NO: 1568) ID NO: 1560) ESKIMFATL (B08.01) (SEQ ID NO: 1569) FATLQRSSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1570) FLKAESKIM (B08.01) (SEQ ID NO: 1571) FLKAESKIMF (B08.01) (SEQ ID NO: 1572) GPPARVPAV (B07.02) (SEQ ID NO: 1573) IMKPKRDGYM (B08.01) (SEQ ID NO: 1574) KIMFATLQR (A03.01) (SEQ ID NO: 1575) KPKRDGYMF (B07.02) (SEQ ID NO: 1576) KPKRDGYMFL (B07.02) (SEQ ID NO: 1577) LHFCRSSIM (B08.01) (SEQ ID NO: 1578) LQHGHRHGL (B08.01) (SEQ ID NO: 1579) MFATLQRSSL (B07.02, B08.01)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela 2 DESLOCAMENTOS DE
QUADRO DE LEITURA 1 (SEQ ID NO: 1580) MFLKAESKI (A24.02) (SEQ ID NO: 1581) MLTGPPARV (A02.01) (SEQ ID NO: 1582) QPVLWTTPPL (B07.02) (SEQ ID NO: 1583) SMLTGPPARV (A02.01) (SEQ ID NO: 1584) TLQRSSLWCL (A02.01) (SEQ ID NO: 1585) VLPEPHLAL (A02.01) (SEQ ID NO: 1586) VPAVPFDLHF (B07.02) (SEQ ID NO: 1587) YMFLKAESK (A03.01) (SEQ ID NO: 1588) YMFLKAESKI (A02.01, A03.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1589) 1AAs sublinhados representam Aas não nativos Tabela 3 Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A AKT1 E17K MSDVAIVKEGWLHKRGKY KYIKTWRPRY (A24.02) (SEQ BRCA, CESC, HNSC, IKTWRPRYFLLKNDGTFI ID NO: 1632) LUSC, PRAD, SKCM, GYKERPQDVDQREAPLNN WLHKRGKYI (A02.01, B07.02, THCA FSVAQCQLMKTER (SEQ B08.01) (SEQ ID NO: 1633) ID NO: 1590) WLHKRGKYIK (A03.01) (SEQ ID NO: 1634) ANAPC1 T537A TMLVLEGSGNLVLYTGVV APKPLSKLL (B07.02) (SEQ ID GBM, LUSC, PAAD, RVGKVFIPGLPAPSLTMS NO: 1635) PRAD, SKCM NTMPRPSTPLDGVSAPKP GVSAPKPLSK (A03.01) (SEQ LSKLLGSLDEVVLLSPVP ID NO: 1636)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A ELRDSSKLHDSLYNEDCT VSAPKPLSK (A03.01) (SEQ ID FQQLGTYIHSI (SEQ NO: 1637) ID NO: 1591) FGFR3 S249C HRIGGIKLRHQQWSLVME CPHRPILQA (B07.02) (SEQ ID BLCA, HNSC, KIRP, SVVPSDRGNYTCVVENKF NO: 1638) LUSC
GSIRQTYTLDVLERCPHR PILQAGLPANQTAVLGSD
VEFHCKVYSDAQPHIQWL KHVEVNGSKVG (SEQ ID NO: 1592) FRG1B I10T MREPIYMHSTMVFLPWEL KLSDSRTAL (A02.01, B07.02, KIRP, PRAD, SKCM HTKKGPSPPEQFMAVKLS B08.01) (SEQ ID NO: 1639) DSRTALKSGYGKYLGINS KLSDSRTALK (A03.01) (SEQ DELVGHSDAIGPREQWEP ID NO: 1640) VFQNGKMALLASNSCFIR LSDSRTALK (A01.01, A03.01) (SEQ ID NO: 1593) (SEQ ID NO: 1641) RTALKSGYGK (A03.01) (SEQ ID NO: 1642) TALKSGYGK (A03.01) (SEQ ID NO: 1643) FRG1B L52S AVKLSDSRIALKSGYGKY ALSASNSCF (A02.01, A24.02, GBM, KIRP, PRAD, LGINSDELVGHSDAIGPR B07.02) (SEQ ID NO: 1644) SKCM EQWEPVFQNGKMALSASN ALSASNSCFI (A02.01) (SEQ SCFIRCNEAGDIEAKSKT ID NO: 1645) AGEEEMIKIRSCAEKETK FQNGKMALSA (A02.01, KKDDIPEEDKG (SEQ B08.01) (SEQ ID NO: 1646) ID NO: 1594) HER2 L755S AMPNQAQMRILKETELRK KVSRENTSPK (A03.01) (SEQ BRCA (Resistência) VKVLGSGAFGTVYKGIWI ID NO: 1647)
PDGENVKIPVAIKVSREN TSPKANKEILDEAYVMAG
VGSPYVSRLLGICLTSTV QLVTQLMPYGC (SEQ ID NO: 1595) IDH1 R132G RVEEFKLKQMWKSPNGTI KPIIIGGHAY (B07.02) (SEQ BLCA, BRCA, CRC, RNILGGTVFREAIICKNI ID NO: 1648) GBM, HNSC, LUAD, PRLVSGWVKPIIIGGHAY PAAD, PRAD, UCEC
GDQYRATDFVVPGPGKVE ITYTPSDGTQKVTYLVHN
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A FEEGGGVAMGM (SEQ ID NO: 1596) KRAS G12C MTEYKLVVVGACGVGKSA KLVVVGACGV (A02.01) (SEQ BRCA, CESC, CRC, LTIQLIQNHFVDEYDPTI ID NO: 1649) HNSC, LUAD, PAAD, EDSYRKQVVIDGETCLLD LVVVGACGV (A02.01) (SEQ ID UCEC ILDTAGQE (SEQ ID NO: 1650) NO: 1597) VVGACGVGK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 1651) VVVGACGVGK (A03.01) (SEQ ID NO: 1652) KRAS G12D MTEYKLVVVGADGVGKSA VVGADGVGK (A11.01) (SEQ ID BLCA, BRCA, CESC, LTIQLIQNHFVDEYDPTI NO: 1653) CRC, GBM, HNSC, EDSYRKQVVIDGETCLLD VVVGADGVGK (A11.01) (SEQ KIRP, LIHC, LUAD, ILDTAGQE (SEQ ID ID NO: 1654) PAAD, SKCM, UCEC NO: 1598) KLVVVGADGV (A02.01) (SEQ ID NO: 1655) LVVVGADGV (A02.01) (SEQ ID NO: 1656) KRAS G12V MTEYKLVVVGAVGVGKSA KLVVVGAVGV (A02.01) (SEQ BRCA, CESC, CRC, LTIQLIQNHFVDEYDPTI ID NO: 1657) LUAD, PAAD, THCA, EDSYRKQVVIDGETCLLD LVVVGAVGV (A02.01) (SEQ ID UCEC ILDTAGQE (SEQ ID NO: 1658) NO: 1599) VVGAVGVGK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 1659) VVVGAVGVGK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 1660) KRAS Q61H AGGVGKSALTIQLIQNHF ILDTAGHEEY (A01.01) (SEQ CRC, LUSC, PAAD, VDEYDPTIEDSYRKQVVI ID NO: 1661) SKCM, UCEC
DGETCLLDILDTAGHEEY SAMRDQYMRTGEGFLCVF
AINNTKSFEDIHHYREQI KRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 1600) KRAS Q61L AGGVGKSALTIQLIQNHF ILDTAGLEEY (A01.01) (SEQ CRC, GBM, HNSC, VDEYDPTIEDSYRKQVVI ID NO: 1662) LUAD, SKCM, UCEC DGETCLLDILDTAGLEEY LLDILDTAGL (A02.01) (SEQ SAMRDQYMRTGEGFLCVF ID NO: 1663)
AINNTKSFEDIHHYREQI KRVKDSEDVPM (SEQ
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A ID NO: 1601) NRAS Q61K AGGVGKSALTIQLIQNHF ILDTAGKEEY (A01.01) (SEQ BLCA, CRC, LIHC, VDEYDPTIEDSYRKQVVI ID NO: 1664) LUAD, LUSC, SKCM, DGETCLLDILDTAGKEEY THCA, UCEC
SAMRDQYMRTGEGFLCVF
AINNSKSFADINLYREQI KRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1602) NRAS Q61R AGGVGKSALTIQLIQNHF ILDTAGREEY (A01.01) (SEQ BLCA, CRC, LUSC, VDEYDPTIEDSYRKQVVI ID NO: 1665) PAAD, PRAD, SKCM, DGETCLLDILDTAGREEY THCA, UCEC
SAMRDQYMRTGEGFLCVF
AINNSKSFADINLYREQI KRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1603) PIK3CA E542K IEEHANWSVSREAGFSYS AISTRDPLSK (A03.01) (SEQ BLCA, BRCA, CESC, HAGLSNRLARDNELREND ID NO: 1666) CRC, GBM, HNSC, KEQLKAISTRDPLSKITE KIRC, KIRP, LIHC, QEKDFLWSHRHYCVTIPE LUAD, LUSC, PRAD,
ILPKLLLSVKWNSRDEVA UCEC QMYCLVKDWPP (SEQ ID NO: 1604) PTEN R130Q KFNCRVAQYPFEDHNPPQ QTGVMICAY (A01.01) (SEQ ID BRCA, CESC, CRC, LELIKPFCEDLDQWLSED NO: 1667) GBM, KIRC, LUSC,
DNHVAAIHCKAGKGQTGV UCEC MICAYLLHRGKFLKAQEA
LDFYGEVRTRDKKGVTIP SQRRYVYYYSY (SEQ ID NO: 1605) RAC1 P29S MQAIKCVVVGDGAVGKTC FSGEYIPTV (A02.01) (SEQ ID Melanoma LLISYTTNAFSGEYIPTV NO: 1668) FDNYSANVMVDGKPVNLG TTNAFSGEY (A01.01) (SEQ ID LWDTAGQEDYDRLRPLSY NO: 1669) PQTVGET (SEQ ID NO: YTTNAFSGEY (A01.01) (SEQ 1606) ID NO: 1670) SF3B1 K700E AVCKSKKSWQARHTGIKI GLVDEQQEV (A02.01) (SEQ ID AML associado a VQQIAILMGCAILPHLRS NO: 1671) MDS; Leucemia LVEIIEHGLVDEQQEVRT linfocítica
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A ISALAIAALAEAATPYGI crônica-linfoma ESFDSVLKPLWKGIRQHR linfocítico GKGLAAFLKAI (SEQ pequeno; Síndrome ID NO: 1607) mielodisplásica; AML; Carcinoma NS luminal de mama; Leucemia mieloide crônica; Carcinoma ductal do pâncreas; Leucemia mielomonocítica crônica; Leucemia linfocítica crônica-linfoma linfocítico pequeno; Mielofibrose; Síndrome mielodisplásica; PRAD; Trombocitemia essencial; Medulomioblastom a SPOP F133L YLSLYLLLVSCPKSEVRA FVQGKDWGL (A02.01, B08.01) PRAD KFKFSILNAKGEETKAME (SEQ ID NO: 1672)
SQRAYRFVQGKDWGLKKF IRRDFLLDEANGLLPDDK
LTLFCEVSVVQDSVNISG QNTMNMVKVPE (SEQ ID NO: 1608) SPOP F133V YLSLYLLLVSCPKSEVRA FVQGKDWGV (A02.01) (SEQ ID PRAD KFKFSILNAKGEETKAME NO: 1673)
SQRAYRFVQGKDWGVKKF IRRDFLLDEANGLLPDDK
LTLFCEVSVVQDSVNISG QNTMNMVKVPE (SEQ ID NO: 1609)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A TP53 G245S IRVEGNLRVEYLDDRNTF CMGSMNRRPI (A02.01, BLCA, BRCA, CRC, RHSVVVPYEPPEVGSDCT B08.01) (SEQ ID NO: 1674) GBM, HNSC, LUSC, TIHYNYMCNSSCMGSMNR GSMNRRPIL (B08.01) (SEQ ID PAAD, PRAD RPILTIITLEDSSGNLLG NO: 1675) RNSFEVRVCACPGRDRRT MGSMNRRPI (B08.01) (SEQ ID EEENLRKKGEP (SEQ NO: 1676) ID NO: 1610) MGSMNRRPIL (B08.01) (SEQ ID NO: 1677) SMNRRPILTI (A02.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1678) TP53 R248Q EGNLRVEYLDDRNTFRHS CMGGMNQRPI (A02.01, BLCA, BRCA, CRC, VVVPYEPPEVGSDCTTIH B08.01) (SEQ ID NO: 1679) GBM, HNSC, KIRC, YNYMCNSSCMGGMNQRPI GMNQRPILTI (A02.01, LIHC, LUSC, PAAD, LTIITLEDSSGNLLGRNS B08.01) (SEQ ID NO: 1680) PRAD, UCEC FEVRVCACPGRDRRTEEE NQRPILTII (A02.01, B08.01) NLRKKGEPHHE (SEQ (SEQ ID NO: 1681) ID NO: 1611) TP53 R248W EGNLRVEYLDDRNTFRHS CMGGMNWRPI (A02.01, BLCA, BRCA, CRC, VVVPYEPPEVGSDCTTIH A24.02, B08.01) (SEQ ID GBM, HNSC, LIHC, YNYMCNSSCMGGMNWRPI NO: 1682) LUSC, PAAD, SKCM, LTIITLEDSSGNLLGRNS GMNWRPILTI (A02.01, UCEC FEVRVCACPGRDRRTEEE B08.01) (SEQ ID NO: 1683) NLRKKGEPHHE (SEQ MNWRPILTI (A02.01, A24.02, ID NO: 1612) B08.01) (SEQ ID NO: 1684) MNWRPILTII (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 1685) TP53 R273C PEVGSDCTTIHYNYMCNS NSFEVCVCA (A02.01) (SEQ ID BLCA, BRCA, CRC, SCMGGMNRRPILTIITLE NO: 1686) GBM, HNSC, LUSC, DSSGNLLGRNSFEVCVCA PAAD, UCEC
CPGRDRRTEEENLRKKGE
PHHELPPGSTKRALPNNT SSSPQPKKKPL (SEQ ID NO: 1613) TP53 R273H PEVGSDCTTIHYNYMCNS NSFEVHVCA (A02.01) (SEQ ID BRCA, CRC, GBM, SCMGGMNRRPILTIITLE NO: 1687) HNSC, LIHC, LUSC, DSSGNLLGRNSFEVHVCA PAAD, UCEC
CPGRDRRTEEENLRKKGE
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A
PHHELPPGSTKRALPNNT SSSPQPKKKPL (SEQ ID NO: 1614) TP53 Y220C TEVVRRCPHHERCSDSDG VVPCEPPEV (A02.01) (SEQ ID BLCA, BRCA, GBM, LAPPQHLIRVEGNLRVEY NO: 1688) HNSC, LIHC, LUAD, LDDRNTFRHSVVVPCEPP VVVPCEPPEV (A02.01) (SEQ LUSC, PAAD, SKCM, EVGSDCTTIHYNYMCNSS ID NO: 1689) UCEC
CMGGMNRRPILTIITLED SSGNLLGRNSF (SEQ ID NO: 1615) Tabela DESLOCAMENTOS DE 3B QUADRO DE LEITURA ASSOCIADOS A MSI 1 MSH6 F1088fs; +1 YNFDKNYKDWQSAVECIA ILLPEDTPPL (A02.01) (SEQ MSI+ CRC, Câncer VLDVLLCLANYSRGGDGP ID NO: 1690) Uterino/do MCRPVILLPEDTPPLLRA LLPEDTPPL (A02.01) (SEQ ID Endométrio de (SEQ ID NO: 1616) NO: 1691) MSI+, Câncer do Estômago de MSI+, Síndrome de Lynch Tabela DESLOCAMENTOS DE 3C QUADRO DE LEITURA 1 APC F1354fs AKFQQCHSTLEPNPADCR APFRVNHAV (B07.02) (SEQ ID CRC, LUAD, UCEC, VLVYLQNQPGTKLLNFLQ NO: 1692) STAD ERNLPPKVVLRHPKVHLN CLADVLLSV (A02.01) (SEQ ID TMFRRPHSCLADVLLSVH NO: 1693) LIVLRVVRLPAPFRVNHA FLQERNLPPK (A03.01) (SEQ VEW* (SEQ ID NO: ID NO: 1694) 1617) HLIVLRVVRL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 1695) HPKVHLNTM (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1696) HPKVHLNTMF (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1697) KVHLNTMFR (A03.01) (SEQ ID NO: 1698) KVHLNTMFRR (A03.01) (SEQ ID NO: 1699) LPAPFRVNHA (B07.02) (SEQ ID NO: 1700)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A MFRRPHSCL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1701) MFRRPHSCLA (B08.01) (SEQ ID NO: 1702) NTMFRRPHSC (B08.01) (SEQ ID NO: 1703) RPHSCLADV (B07.02) (SEQ ID NO: 1704) RPHSCLADVL (B07.02) (SEQ ID NO: 1705) RVVRLPAPFR (A03.01) (SEQ ID NO: 1706) SVHLIVLRV (A02.01) (SEQ ID NO: 1707) TMFRRPHSC (B08.01) (SEQ ID NO: 1708) TMFRRPHSCL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 1709) VLLSVHLIV (A02.01) (SEQ ID NO: 1710) VLLSVHLIVL (A02.01) (SEQ ID NO: 1711) VLRVVRLPA (B08.01) (SEQ ID NO: 1712) VVRLPAPFR (A03.01) (SEQ ID NO: 1713) ARID1A Y1324fs ALGPHSRISCLPTQTRGC AMPILPLPQL (A02.01) (SEQ STAD, UCEC, BLCA, ILLAATPRSSSSSSSNDM ID NO: 1714) BRCA, LUSC, CESC, IPMAISSPPKAPLLAAPS APLLAAPSPA (B07.02) (SEQ KIRC, UCS PASRLQCINSNSRITSGQ ID NO: 1715) WMAHMALLPSGTKGRCTA APRTNFHSS (B07.02) (SEQ ID CHTALGRGSLSSSSCPQP NO: 1716) SPSLPASNKLPSLPLSKM APRTNFHSSL (B07.02, YTTSMAMPILPLPQLLLS B08.01) (SEQ ID NO: 1717) ADQQAAPRTNFHSSLAET CPQPSPSLPA (B07.02) (SEQ VSLHPLAPMPSKTCHHK* ID NO: 1718) (SEQ ID NO: 1618) GQWMAHMAL (A02.01) (SEQ ID NO: 1719) GQWMAHMALL (A02.01) (SEQ ID NO: 1720)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A HMALLPSGTK (A03.01) (SEQ ID NO: 1721) HTALGRGSL (B07.02) (SEQ ID NO: 1722) IPMAISSPP (B07.02) (SEQ ID NO: 1723) IPMAISSPPK (B07.02) (SEQ ID NO: 1724) KLPSLPLSK (A03.01) (SEQ ID NO: 1725) KLPSLPLSKM (A02.01) (SEQ ID NO: 1726) KMYTTSMAM (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 1727) LLAAPSPASR (A03.01) (SEQ ID NO: 1728) LLLSADQQAA (A02.01) (SEQ ID NO: 1729) LLSADQQAA (A02.01) (SEQ ID NO: 1730) LPASNKLPS (B07.02) (SEQ ID NO: 1731) LPASNKLPSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1732) LPLPQLLLSA (B07.02) (SEQ ID NO: 1733) LPSLPLSKM (B07.02) (SEQ ID NO: 1734) LSKMYTTSM (B08.01) (SEQ ID NO: 1735) MALLPSGTK (A03.01) (SEQ ID NO: 1736) MPILPLPQL (B07.02) (SEQ ID NO: 1737) MPILPLPQLL (B07.02) (SEQ ID NO: 1738) MYTTSMAMPI (A24.02) (SEQ ID NO: 1739) PMAISSPPK (A03.01) (SEQ ID NO: 1740)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A QWMAHMALL (A24.02) (SEQ ID NO: 1741) SKMYTTSMAM (B07.02) (SEQ ID NO: 1742) SMAMPILPL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1743) SNKLPSLPL (B08.01) (SEQ ID NO: 1744) SPASRLQCI (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1745) SPPKAPLLAA (B07.02) (SEQ ID NO: 1746) SPSLPASNKL (B07.02) (SEQ ID NO: 1747) YTTSMAMPI (A02.01) (SEQ ID NO: 1748) YTTSMAMPIL (A02.01) (SEQ ID NO: 1749) ARID1A G1848fs RSYRRMIHLWWTAQISLG CLPGLTHPA (A02.01) (SEQ ID STAD, UCEC, BLCA, VCRSLTVACCTGGLVGGT NO: 1750) BRCA, LUSC, CESC, PLSISRPTSRARQSCCLP GLTHPAHQPL (A02.01) (SEQ KIRC, UCS GLTHPAHQPLGSM* ID NO: 1751) (SEQ ID NO: 1619) HPAHQPLGSM (B07.02) (SEQ ID NO: 1752) LTHPAHQPL (B07.02) (SEQ ID NO: 1753) RPTSRARQSC (B07.02) (SEQ ID NO: 1754) RQSCCLPGL (A02.01) (SEQ ID NO: 1755) TSRARQSCCL (B08.01) (SEQ ID NO: 1756) β2M L13fs QHSGRDVSLRGLSCARAT ELLCVWVSSI (A02.01) (SEQ CRC, STAD, SKCM, LSFWPGGYPAYSKDSGLL ID NO: 1757) HNSC TSSSREWKVKFPELLCVW EWKVKFPEL (B08.01) (SEQ ID VSSIRH* (SEQ ID NO: NO: 1758) 1620) KFPELLCVW (A24.02) (SEQ ID NO: 1759) LLCVWVSSI (A02.01) (SEQ ID NO: 1760)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A LLTSSSREWK (A03.01) (SEQ ID NO: 1761) LTSSSREWK (A03.01) (SEQ ID NO: 1762) YPAYSKDSGL (B07.02) (SEQ ID NO: 1763) CLQCLWALL (A02.01) (SEQ ID NO: 1764) AQAKAVCSQESRDVLCEL CQWGPCLQCL (A02.01) (SEQ L328fs SDHHNHTLEEECQWGPCL ID NO: 1765) GATA3 Câncer de Mama N334fs QCLWALLQASQY* (SEQ QWGPCLQCL (A24.02) (SEQ ID ID NO: 1621) NO: 1766) QWGPCLQCLW (A24.02) (SEQ ID NO: 1767) AIQPVLWTT (A02.01) (SEQ ID NO: 1768) ALQPLQPHA (A02.01) (SEQ ID NO: 1769) DLHFCRSSIM (B08.01) (SEQ ID NO: 1770) EPHLALQPL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1771) ESKIMFATL (B08.01) (SEQ ID PGRPLQTHVLPEPHLALQ NO: 1772) H400fs PLQPHADHAHADAPAIQP FATLQRSSL (B07.02, B08.01) S408fs VLWTTPPLQHGHRHGLEP (SEQ ID NO: 1773) S408fs CSMLTGPPARVPAVPFDL FLKAESKIM (B08.01) (SEQ ID GATA3 Câncer de Mama S430fs HFCRSSIMKPKRDGYMFL NO: 1774) H434fs KAESKIMFATLQRSSLWC FLKAESKIMF (B08.01) (SEQ H435fs LCSNH* (SEQ ID NO: ID NO: 1775) 1622) GPPARVPAV (B07.02) (SEQ ID NO: 1776) IMKPKRDGYM (B08.01) (SEQ ID NO: 1777) KIMFATLQR (A03.01) (SEQ ID NO: 1778) KPKRDGYMF (B07.02) (SEQ ID NO: 1779) KPKRDGYMFL (B07.02) (SEQ ID NO: 1780)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A LHFCRSSIM (B08.01) (SEQ ID NO: 1781) LQHGHRHGL (B08.01) (SEQ ID NO: 1782) MFATLQRSSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1783) MFLKAESKI (A24.02) (SEQ ID NO: 1784) MLTGPPARV (A02.01) (SEQ ID NO: 1785) QPVLWTTPPL (B07.02) (SEQ ID NO: 1786) SMLTGPPARV (A02.01) (SEQ ID NO: 1787) TLQRSSLWCL (A02.01) (SEQ ID NO: 1788) VLPEPHLAL (A02.01) (SEQ ID NO: 1789) VPAVPFDLHF (B07.02) (SEQ ID NO: 1790) YMFLKAESK (A03.01) (SEQ ID NO: 1791) YMFLKAESKI (A02.01, A03.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1792) MLL2 P647fs TRRCHCCPHLRSHPCPHH APGPRGRTC (B07.02) (SEQ ID STAD, BLCA, CRC, L656fs LRNHPRPHHLRHHACHHH NO: 1793) HNSC, BRCA LRNCPHPHFLRHCTCPGR CLRSHTCPPR (A03.01) (SEQ WRNRPSLRRLRSLLCLPH ID NO: 1794) LNHHLFLHWRSRPCLHRK CLWCHACLHR (A03.01) (SEQ SHPHLLHLRRLYPHHLKH ID NO: 1795) RPCPHHLKNLLCPRHLRN CPHLGSHPC (B07.02) (SEQ ID CPLPRHLKHLACLHHLRS NO: 1796) HPCPLHLKSHPCLHHRRH CPLGLKSPL (B07.02) (SEQ ID LVCSHHLKSLLCPLHLRS NO: 1797) LPFPHHLRHHACPHHLRT CPRSCRCPH (B07.02) (SEQ ID RLCPHHLKNHLCPPHLRY NO: 1798) RAYPPCLWCHACLHRLRN CPRSCRCPHL (B07.02, LPCPHRLRSLPRPLHLRL B08.01) (SEQ ID NO: 1799) HASPHHLRTPPHPHHLRT CSLPLGNHPY (A01.01) (SEQ
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A HLLPHHRRTRSCPCRWRS ID NO: 1800) HPCCHYLRSRNSAPGPRG GLRNRICPL (A02.01, B07.02, RTCHPGLRSRTCPPGLRS B08.01) (SEQ ID NO: 1801) HTYLRRLRSHTCPPSLRS GLRSHTYLR (A03.01) (SEQ ID HAYALCLRSHTCPPRLRD NO: 1802) HICPLSLRNCTCPPRLRS GLRSHTYLRR (A03.01) (SEQ RTCLLCLRSHACPPNLRN ID NO: 1803) HTCPPSLRSHACPPGLRN GPRGRTCHPG (B07.02) (SEQ RICPLSLRSHPCPLGLKS ID NO: 1804) PLRSQANALHLRSCPCSL HLGSHPCRL (B08.01) (SEQ ID PLGNHPYLPCLESQPCLS NO: 1805) LGNHLCPLCPRSCRCPHL HLRLHASPH (A03.01) (SEQ ID GSHPCRLS* (SEQ ID NO: 1806) NO: 1623) HLRSCPCSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1807) HLRTHLLPH (A03.01) (SEQ ID NO: 1808) HLRTHLLPHH (A03.01) (SEQ ID NO: 1809) HLRYRAYPP (B08.01) (SEQ ID NO: 1810) HLRYRAYPPC (B08.01) (SEQ ID NO: 1811) HPHHLRTHL (B07.02) (SEQ ID NO: 1812) HPHHLRTHLL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1813) HTYLRRLRSH (A03.01) (SEQ ID NO: 1814) LPCPHRLRSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1815) LPHHRRTRSC (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1816) LPLGNHPYL (B07.02) (SEQ ID NO: 1817) LPRPLHLRL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1818) NLRNHTCPP (B08.01) (SEQ ID NO: 1819) PPRLRSRTCL (B07.02,
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A B08.01) (SEQ ID NO: 1820) RLHASPHHL (A02.01) (SEQ ID NO: 1821) RLHASPHHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1822) RLRDHICPL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1823) RLRNLPCPH (A03.01) (SEQ ID NO: 1824) RLRNLPCPHR (A03.01) (SEQ ID NO: 1825) RLRSHTCPP (B08.01) (SEQ ID NO: 1826) RLRSLPRPL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1827) RLRSLPRPLH (A03.01) (SEQ ID NO: 1828) RLRSRTCLL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1829) RNRICPLSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1830) RPLHLRLHA (B07.02) (SEQ ID NO: 1831) RPLHLRLHAS (B07.02) (SEQ ID NO: 1832) RSHACPPGLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1833) RSHACPPNLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1834) RSHAYALCLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1835) RSHPCCHYLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1836) RSHPCPLGLK (A03.01) (SEQ ID NO: 1837) RSHTCPPSLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1838) RSLPRPLHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1839) RSRTCLLCL (B07.02) (SEQ ID
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A NO: 1840) RSRTCLLCLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1841) RSRTCPPGL (B07.02) (SEQ ID NO: 1842) RSRTCPPGLR (A03.01) (SEQ ID NO: 1843) RTHLLPHHRR (A03.01) (SEQ ID NO: 1844) RTRSCPCRWR (A03.01) (SEQ ID NO: 1845) RYRAYPPCL (A24.02) (SEQ ID NO: 1846) RYRAYPPCLW (A24.02) (SEQ ID NO: 1847) SLGNHLCPL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1848) SLPLGNHPYL (A02.01) (SEQ ID NO: 1849) SLPRPLHLRL (A02.01) (SEQ ID NO: 1850) SLRNCTCPPR (A03.01) (SEQ ID NO: 1851) SLRSHAYAL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1852) SLRSHPCPL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1853) SPHHLRTPP (B07.02) (SEQ ID NO: 1854) SPHHLRTPPH (B07.02) (SEQ ID NO: 1855) SPLRSQANAL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1856) YLRRLRSHTC (B08.01) (SEQ ID NO: 1857) YLRSRNSAP (B08.01) (SEQ ID NO: 1858) YLRSRNSAPG (B08.01) (SEQ ID NO: 1859)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A MLL2 P2354fs GPRSHPLPRLWHLLLQVT ALAPTLTHM (A02.01) (SEQ ID STAD, BLCA, CRC, QTSFALAPTLTHMLSPH* NO: 1860) HNSC, BRCA (SEQ ID NO: 1624) ALAPTLTHML (A02.01) (SEQ ID NO: 1861) LLQVTQTSFA (A02.01) (SEQ ID NO: 1862) LQVTQTSFAL (A02.01) (SEQ ID NO: 1863) RLWHLLLQV (A02.01) (SEQ ID NO: 1864) RLWHLLLQVT (A02.01) (SEQ ID NO: 1865) RNF43 G659fs PLGLVPWTRWCPQGKPRF CTQLARFFPI (A24.02) (SEQ STAD PAMSTTTATGTTTTKSGS ID NO: 1866) SGMAGSLAQKPESPSPGL FFPITPPVW (A24.02) (SEQ ID LFLGHSPSQSHLLLISKS NO: 1867) PDPTQQPLRGGSLTHSAP FPITPPVWHI (B07.02) (SEQ GPSLSQPLAQLTPPASAP ID NO: 1868) VPAVCSTCKNPASLPDTH GPRMQLCTQL (B07.02, RGKGGGVPPSPPLALGPR B08.01) (SEQ ID NO: 1869) MQLCTQLARFFPITPPVW ITPPVWHIL (A24.02) (SEQ ID HILGPQRHTP* (SEQ NO: 1870) ID NO: 1625) LALGPRMQL (B07.02) (SEQ ID NO: 1871) MQLCTQLARF (A24.02) (SEQ ID NO: 1872) RFFPITPPV (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 1873) RFFPITPPVW (A24.02) (SEQ ID NO: 1874) RMQLCTQLA (A02.01) (SEQ ID NO: 1875) RMQLCTQLAR (A03.01) (SEQ ID NO: 1876) SPPLALGPRM (B07.02) (SEQ ID NO: 1877) TQLARFFPI (A02.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1878)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1
3A SMAP1 E169fs KYEKKKYYDKNAIAITNI KSRQNHLQL (B07.02) (SEQ ID MSI+ CRC, Câncer SSSDAPLQPLVSSPSLQA NO: 1879) Uterino/do AVDKNKLEKEKEKKRKRK ALKKLRSPL (B08.01, B07.02) Endométrio de REKRSQKSRQNHLQLKSC (SEQ ID NO: 1880) MSI+, Câncer do RRKISNWSLKKVPALKKL HLQLKSCRRK (A03.01) (SEQ Estômago de MSI+ RSPLWIF (SEQ ID NO: ID NO: 1881) 1626) KISNWSLKK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 1882) KISNWSLKKV (A03.01) (SEQ ID NO: 1883) KLRSPLWIF (A24.02) (SEQ ID NO: 1884) KSRQNHLQLK (A03.01) (SEQ ID NO: 1885) NWSLKKVPAL (B08.01) (SEQ ID NO: 1886) SLKKVPALK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 1887) SLKKVPALKK (A03.01) (SEQ ID NO: 1888) SQKSRQNHL (B08.01) (SEQ ID NO: 1889) WSLKKVPAL (B08.01) (SEQ ID NO: 1890) WSLKKVPALK (A03.01) (SEQ ID NO: 1891) TP53 P58fs CCPRTILNNGSLKTQVQM KLPECQRLL (A02.01) (SEQ ID BRCA, CRC, LUAD, P72fs KLPECQRLLPPWPLHQQL NO: 1892) PRAD, HNSC, LUSC, G108fs LHRRPLHQPPPGPCHLLS KPTRAATVSV (B07.02) (SEQ PAAD, STAD, BLCA, R110fs LPRKPTRAATVSVWASCI ID NO: 1893) OV, LIHC, SKCM, LGQPSL* (SEQ ID NO: LPPWPLHQQL (B07.02) (SEQ UCEC, LAML, UCS, 1627) ID NO: 1894) KICH, GBM, ACC LPRKPTRAA (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1895) LPRKPTRAAT (B07.02) (SEQ ID NO: 1896) QQLLHRRPL (B08.01) (SEQ ID NO: 1897) RLLPPWPLH (A03.01) (SEQ ID NO: 1898)
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A TP53 P152fs LARTPLPSTRCFANWPRP APASAPWPST (B07.02) (SEQ BRCA, CRC, LUAD, ALCSCGLIPHPRPAPASA ID NO: 1899) PRAD, HNSC, LUSC, PWPSTSSHST* (SEQ APWPSTSSH (B07.02) (SEQ ID PAAD, STAD, BLCA, ID NO: 1628) NO: 1900) OV, LIHC, SKCM, RPAPASAPW (B07.02) (SEQ ID UCEC, LAML, UCS, NO: 1901) KICH, GBM, ACC WPSTSSHST (B07.02) (SEQ ID NO: 1902) UBR5 K2120fs SQGLYSSSASSGKCLMEV RVQNQGHLL (B07.02) (SEQ ID TVDRNCLEVLPTKMSYAA NO: 1903)
NLKNVMNMQNRQKKKGKN
SPCCQKKLRVQNQGHLLM ILLHN* (SEQ ID NO: 1629) VHL L116fs TRASPPRSSSAIAVRASC FLPISHCQCI (A02.01) (SEQ KIRC, KIRP G123fs CPYGSTSTASRSPTQRCR ID NO: 1904) LARAAASTATEVTFGSSE FWLTKLNYL (A24.02, B08.01) MQGHTMGFWLTKLNYLCH (SEQ ID NO: 1905) LSMLTDSLFLPISHCQCI HLSMLTDSL (A02.01) (SEQ ID L* (SEQ ID NO: NO: 1906) 1630) HTMGFWLTK (A03.01) (SEQ ID NO: 1907) HTMGFWLTKL (A02.01) (SEQ ID NO: 1908) KLNYLCHLSM (A02.01) (SEQ ID NO: 1909) LPISHCQCI (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1910) LPISHCQCIL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1911) LTDSLFLPI (A01.01, A02.01) (SEQ ID NO: 1912) LTKLNYLCHL (B08.01) (SEQ ID NO: 1913) MLTDSLFLPI (A01.01, A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 1914) MQGHTMGFWL (A02.01) (SEQ ID NO: 1915) NYLCHLSML (A24.02) (SEQ ID
Gene Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo (ou Doenças Proteína Sequência de exemplos) de alelo HLA) Exemplificativas Exemplificativa Mutação Tabela MUTAÇÕES DE PONTO 1 3A NO: 1916) SMLTDSLFL (A02.01) (SEQ ID NO: 1917) TMGFWLTKL (A02.01) (SEQ ID NO: 1918) YLCHLSMLT (A02.01) (SEQ ID NO: 1919) Tabela INSERTO1 3D HER2 G776insYVMA LGSGAFGTVYKGIWIPDG ILDEAYVMAY (A01.01) (SEQ Câncer de Pulmão ("YVMA" ENVKIPVAIKVLRENTSP ID NO: 1920) revelado como KANKEILDEAYVMAYVMA VMAYVMAGV (A02.01) (SEQ ID SEQ ID NO: GVGSPYVSRLLGICLTST NO: 1921) 3823) VQLVTQLMPYGCLLDHVR YVMAYVMAG (A02.01, B07.02, ENRGRLGSQDLLNW B08.01) (SEQ ID NO: 1922) (SEQ ID NO: 1631) YVMAYVMAGV (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 1923) 1AAs sublinhados representam Aas não nativos 2AAs em negrito representam AAs nativos da sequência de aminoácidos codificada pelo segundo dentre os dois genes fusionados 3AAs sublinhado e em negrito representam AAs não nativos da sequência de aminoácidos codificada pelo segundo dos dois genes fusionados devido a um deslocamento de quadro de leitura.
[0328] Uma mutação muito comum para ibrutinibe, uma molécula que alveja Tirosina Quinase de Bruton (BTK) e usada para CLL e certos linfomas, é uma alteração de Cisteína para Serina na posição 481 (C481S). Essa alteração produz vários peptídeos de ligação que se ligam a uma faixa de moléculas de HLA. A mutação é abrigada em uma região que tem a sequência de aminoácidos: IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR (SEQ ID NO: 1924), a Serina mutada está sublinhada.
[0329] Os peptídeos neoantigênicos exemplificativos que correspondem à mutação C481S são apresentados na Tabela 34. A Tabela também fornece uma lista de alelos HLA, cujos produtos de proteína codificada podem se ligar aos peptídeos. Em algumas modalidades, a revelação fornece neoepítopos C481S para terapêuticas de câncer, como, ANGSLLNY (SEQ ID NO: 1925); ANGSLLNYL (SEQ ID NO: 1926); ANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 1927); EYMANGSL (SEQ ID NO: 1928); EYMANGSLLN (SEQ ID NO: 1929); EYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 1930); GSLLNYLR (SEQ ID NO: 1931); GSLLNYLREM (SEQ ID NO: 1932); ITEYMANGS (SEQ ID NO: 1933); ITEYMANGSL (SEQ ID NO: 1934); ITEYMANGSLL (SEQ ID NO: 1935); MANGSLLNYL (SEQ ID NO: 1936); MANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 1937); NGSLLNYL (SEQ ID NO: 1938); NGSLLNYL (SEQ ID NO: 1939); SLLNYLREMR (SEQ ID NO: 1940); TEYMANGSLL (SEQ ID NO: 1941); TEYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 1942); YMANGSLL (SEQ ID NO: 1943); e YMANGSLLN (SEQ ID NO: 1944). As Tabelas 35 e 3 fornecem candidatos de neoantígeno exemplificativos correspondentes a outras mutações de gene associadas a câncer. A Tabela 36 fornece uma lista de peptídeos BTK limitados por HLA selecionados para o propósito deste Pedido e a proteína codificada correspondente pelo alelo HLA ao qual o peptídeo BTK mutante se liga ou se prevê que se ligue. A Tabela 37 fornece uma lista de peptídeos de BTK selecionado e a proteína preferencial correspondente codificada pelo alelo HLA ao qual o peptídeo se liga ou se prevê que se ligue, conforme aplicável ao contexto deste Pedido.
Tabela 34 abaixo lista peptídeos neoantigênicos exemplificativos que correspondem à mutação C481S Peptídeos BTK Alelo HLA ANGSLLNY (SEQ HLA-A36:01 ID NO: 1945) ANGSLLNYL (SEQ HLA-C15:02; HLA-C08:01; HLA-C06:02; HLA- ID NO: 1946) A02:04; HLA-C12:02; HLA-B44:02; HLA- C17:01; HLA-B38:01 ANGSLLNYLR HLA-A74:01, HLA-A31:01 (SEQ ID NO: 1947) EYMANGSL (SEQ HLA-C14:02; HLA-C14:03; HLA-A24:02 ID NO: 1948) EYMANGSLL (SEQ HLA-A24:02; HLA-A23:01; HLA-A68:04; HLA- ID NO: 1949) C14:02, HLA-C14:03, HLA-A33:03, HLA- C04:01, HLA-B15:09, HLA-B38:01, EYMANGSLLN HLA-A23:01, HLA-A24:02 (SEQ ID NO: 1950) EYMANGSLLNY HLA-A29:02 (SEQ ID NO: 1951) GSLLNYLR (SEQ HLA-A74:01, HLA-A31:01 ID NO: 1952) GSLLNYLREM HLA-B57:01, HLA-B58:02 (SEQ ID NO: 1953) ITEYMANGS (SEQ HLA-A01:01 ID NO: 1954)
Peptídeos BTK Alelo HLA ITEYMANGSL HLA-A01:01 (SEQ ID NO: 1955) ITEYMANGSLL HLA-A01:01 (SEQ ID NO: 1956) MANGSLLNY (SEQ HLA-C02:02, HLA-C03:02, HLA-B53:01, HLA- ID NO: 1957) C12:02, HLA-C12:03, HLA-A36:01, HLA- A26:01, HLA-A25:01, HLA-A03:01, HLA- B46:01, HLA-B15:03, HLA-A33:03, HLA-B35:03, HLA-A11:01, HLA-B15:01, HLA- B35:03, HLA-A29:02, HLA-B58:01, HLA-A30:02, HLA-B35:01 MANGSLLNYL HLA-C17:01, HLA-C02:02, HLA-B35:01, HLA- (SEQ ID NO: C03:03, HLA-C08:01, HLA-B35:03, HLA- 1958) C12:02, HLA-C01:02, HLA-C03:04, HLA- C08:02 MANGSLLNYLR HLA-A33:03, HLA-A74:01 (SEQ ID NO: 1959) NGSLLNYL (SEQ HLA-B14:02 ID NO: 1960) NGSLLNYLR (SEQ HLA-A68:01, HLA-A33:03, HLA-A31:01, HLA- ID NO: 1961) A74:01 SLLNYLREM (SEQ HLA-A02:04, HLA-A02:03, HLA-C03:02, HLA- ID NO: 1962) A03:01, HLA-A32:01, HLA-A02:07, HLA- C14:03, HLA-C14:02, HLA-A31:01, HLA- A30:02, HLA-A74:01, HLA-C06:02, HLA-
Peptídeos BTK Alelo HLA B15:03, HLA-B46:01, HLA-B13:02, HLA- A25:01, HLA-A29:02, HLA-C01:02, HLA- A02:01 SLLNYLREMR HLA-A74:01, HLA-A31:01 (SEQ ID NO: 1963) TEYMANGSL (SEQ HLA-B14:02, HLA-B49:01, HLA-B44:03, HLA- ID NO: 1964) B44:02, HLA-B37:01, HLA-B15:09, HLA- B41:01, HLA-B50:01, HLA-B18:01, HLA- B40:01, HLA-B40:02 TEYMANGSLL HLA-B40:02, HLA-B44:03, HLA-B49:01, HLA- (SEQ ID NO: B44:02, HLA-B49:01 1965) TEYMANGSLLNY HLA-B44:03 (SEQ ID NO: 1966) YMANGSLL (SEQ HLA-A01:01, HLA-C02:02, HLA-C04:01, HLA- ID NO: 1967) C14:02, HLA-C14:03, HLA-C03:02, HLA- C17:01, HLA-C03:03, HLA-C03:04, HLA-B15:09 YMANGSLLN (SEQ HLA-A01:01, HLA-A29:02 ID NO: 1968) YMANGSLLNY HLA-A29:02, HLA-A36:01, HLA-B46:01, HLA- (SEQ ID NO: A25:01, HLA-B15:01, HLA-A26:01, HLA- 1969) A30:02, HLA-A32:01
As Tabelas 35 fornecem candidatos de neoantígeno exemplificativos correspondentes a outras mutações de gene associado a câncer
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
GQYGKVYEG (A02.01) (SEQ ID NO: 2105) GQYGKVYEGV (A02.01) (SEQ ID NO: 2106) KLGGGQYGK (A03.01) Leucemia mieloide VADGLITTLHYPAPKRN (SEQ ID NO: 2107) crônica (CML), KPTVYGVSPNYDKWEME KLGGGQYGKV (A02.01) Leucemia RTDITMKHKLGGGQYGK (SEQ ID NO: 2108) linfocítica aguda ABL1 E255K VYEGVWKKYSLTVAVKT KVYEGVWKK (A02.01, (ALL), Tumores LKEDTMEVEEFLKEAAV A03.01) (SEQ ID NO: estromais MKEIKHPNLVQLLGVC 2109) gastrointestinais (SEQ ID NO: 1970) KVYEGVWKKY (A03.01) (GIST) (SEQ ID NO: 2110) QYGKVYEGV (A24.02) (SEQ ID NO: 2111) QYGKVYEGVW (A24.02) (SEQ ID NO: 2112) GQYGVVYEG (A02.01) (SEQ ID NO: 2113) GQYGVVYEGV (A02.01) (SEQ ID NO: 2114) KLGGGQYGV (A02.01) Leucemia mieloide VADGLITTLHYPAPKRN (SEQ ID NO: 2115) crônica (CML), KPTVYGVSPNYDKWEME KLGGGQYGVV (A02.01) Leucemia RTDITMKHKLGGGQYGV (SEQ ID NO: 2116) linfocítica aguda ABL1 E255V VYEGVWKKYSLTVAVKT QYGVVYEGV (A24.02) (ALL), Tumores LKEDTMEVEEFLKEAAV (SEQ ID NO: 2117) estromais MKEIKHPNLVQLLGVC QYGVVYEGVW (A24.02) gastrointestinais (SEQ ID NO: 1971) (SEQ ID NO: 2118) (GIST) VVYEGVWKK (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 2119) VVYEGVWKKY (A03.01) (SEQ ID NO: 2120) LLGVCTREPPFYIITEF ATQISSATEY (A01.01) Leucemia mieloide MTYGNLLDYLRECNRQE (SEQ ID NO: 2121) crônica (CML), VNAVVLLYMATQISSAT ISSATEYLEK (A03.01) Leucemia ABL1 M351T EYLEKKNFIHRDLAARN (SEQ ID NO: 2122) linfocítica aguda CLVGENHLVKVADFGLS SSATEYLEK (A03.01) (ALL), Tumores RLMTGDTYTAHAGAKF (SEQ ID NO: 2123) estromais
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 1972) TQISSATEYL (A02.01) gastrointestinais (SEQ ID NO: 2124) (GIST) YMATQISSAT (A02.01) (SEQ ID NO: 2125) FYIIIEFMTY (A24.02) (SEQ ID NO: 2126) Leucemia mieloide
SLTVAVKTLKEDTMEVE IIEFMTYGNL (A02.01) crônica (CML),
EFLKEAAVMKEIKHPNL (SEQ ID NO: 2127) Leucemia
VQLLGVCTREPPFYIII IIIEFMTYG (A02.01) linfocítica aguda ABL1 T315I EFMTYGNLLDYLRECNR (SEQ ID NO: 2128) (ALL), Tumores
QEVNAVVLLYMATQISS IIIEFMTYGN (A02.01) estromais
AMEYLEKKNFIHRDLA (SEQ ID NO: 2129) gastrointestinais (SEQ ID NO: 1973) YIIIEFMTYG (A02.01) (GIST) (SEQ ID NO: 2130) Leucemia mieloide
STVADGLITTLHYPAPK crônica (CML),
RNKPTVYGVSPNYDKWE GQHGEVYEGV (A02.01) Leucemia
MERTDITMKHKLGGGQH (SEQ ID NO: 2131) linfocítica aguda ABL1 Y253H GEVYEGVWKKYSLTVAV KLGGGQHGEV (A02.01) (ALL), Tumores
KTLKEDTMEVEEFLKEA (SEQ ID NO: 2132) estromais
AVMKEIKHPNLVQLLG gastrointestinais (SEQ ID NO: 1974) (GIST)
SSLAMLDLLHVARDIAC GCQYLEENHFIHRDIAA KIADFGMAR (A03.01) RNCLLTCPGPGRVAKIA (SEQ ID NO: 2133) ALK G1269A DFGMARDIYRASYYRKG RVAKIADFGM (A02.01, NSCLC GCAMLPVKWMPPEAFME B07.02) (SEQ ID NO: GIFTSKTDTWSFGVLL 2134) (SEQ ID NO: 1975) FILMELMAGG (A02.01) (SEQ ID NO: 2135)
QVAVKTLPEVCSEQDEL ILMELMAGG (A02.01)
DFLMEALIISKFNHQNI (SEQ ID NO: 2136)
VRCIGVSLQSLPRFILM ILMELMAGGD (A02.01) ALK L1196M ELMAGGDLKSFLRETRP NSCLC (SEQ ID NO: 2137)
RPSQPSSLAMLDLLHVA LMELMAGGDL (A02.01)
RDIACGCQYLEENHFI (SEQ ID NO: 2138) (SEQ ID NO: 1976) LPRFILMEL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO:
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 2139) LPRFILMELM (B07.02) (SEQ ID NO: 2140) LQSLPRFILM (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2141) SLPRFILMEL (A02.01, A24.02, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2142)
MIKLIDIARQTAQGMDY LATEKSRWS (A02.01,
LHAKSIIHRDLKSNNIF B08.01) (SEQ ID NO:
LHEDLTVKIGDFGLATE 2143) CRC, GBM, KIRP, BRAF V600E KSRWSGSHQFEQLSGSI LATEKSRWSG (A02.01, LUAD, SKCM, THCA
LWMAPEVIRMQDKNPYS B08.01) (SEQ ID NO:
FQSDVYAFGIVLYELM 2144) (SEQ ID NO: 1977)
MIKEGSMSEDEFIEEAK VMMNLSHEKLVQLYGVC
TKQRPIFIITEYMANGS EYMANGSLL (A24.02) BTK C481S LLNYLREMRHRFQTQQL BTK (SEQ ID NO: 2145)
LEMCKDVCEAMEYLESK
QFLHRDLAARNCLVND (SEQ ID NO: 1978)
MGFGDLKSPAGLQVLND YLADKSYIEGYVPSQAD
VAVFEAVSGPPPADLCH GPPPADLCHAL (B07.02) BLCA, KIRP, PRAD, EEF1B2 S43G ALRWYNHIKSYEKEKAS (SEQ ID NO: 2146) SKCM
LPGVKKALGKYGPADVE DTTGSGAT (SEQ ID NO: 1979)
ERCEVVMGNLEIVLTGH NADLSFLQWIREVTGYV
LVAMNEFSTLPLPNLRM CRC, Câncer de ERBB3 V104M VRGTQVYDGKFAIFVML Estômago
NYNTNSSHALRQLRLTQ
LTEILSGGVYIEKNDK (SEQ ID NO: 1980)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 GLLLEMLDA (A02.01) (SEQ ID NO: 2147) LYGLLLEML (A24.02) (SEQ ID NO: 2148) NVVPLYGLL (A02.01)
HLMAKAGLTLQQQHQRL (SEQ ID NO: 2149)
AQLLLILSHIRHMSNKG PLYGLLLEM (A02.01)
MEHLYSMKCKNVVPLYG (SEQ ID NO: 2150) ESR1 D538G LLLEMLDAHRLHAPTSR Câncer de Mama PLYGLLLEML (A02.01,
GGASVEETDQSHLATAG A24.02) (SEQ ID NO:
STSSHSLQKYYITGEA 2151) (SEQ ID NO: 1981) VPLYGLLLEM (B07.02) (SEQ ID NO: 2152) VVPLYGLLL (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 2153) FLPSTLKSL (A02.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2154) GVYTFLPST (A02.01)
NQGKCVEGMVEIFDMLL (SEQ ID NO: 2155)
ATSSRFRMMNLQGEEFV GVYTFLPSTL (A02.01,
CLKSIILLNSGVYTFLP A24.02) (SEQ ID NO: ESR1 S463P STLKSLEEKDHIHRVLD Câncer de Mama 2156)
KITDTLIHLMAKAGLTL TFLPSTLKSL (A24.02)
QQQHQRLAQLLLILSH (SEQ ID NO: 2157) (SEQ ID NO: 1982) VYTFLPSTL (A24.02) (SEQ ID NO: 2158) YTFLPSTLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2159) NVVPLCDLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2160)
IHLMAKAGLTLQQQHQR NVVPLCDLLL (A02.01)
LAQLLLILSHIRHMSNK (SEQ ID NO: 2161)
GMEHLYSMKCKNVVPLC PLCDLLLEM (A02.01) ESR1 Y537C DLLLEMLDAHRLHAPTS Câncer de Mama (SEQ ID NO: 2162)
RGGASVEETDQSHLATA PLCDLLLEML (A02.01)
GSTSSHSLQKYYITGE (SEQ ID NO: 2163) (SEQ ID NO: 1983) VPLCDLLLEM (B07.02) (SEQ ID NO: 2164)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 VVPLCDLLL (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 2165) NVVPLNDLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2166)
IHLMAKAGLTLQQQHQR NVVPLNDLLL (A02.01)
LAQLLLILSHIRHMSNK (SEQ ID NO: 2167)
GMEHLYSMKCKNVVPLN PLNDLLLEM (A02.01) ESR1 Y537N DLLLEMLDAHRLHAPTS Câncer de Mama (SEQ ID NO: 2168)
RGGASVEETDQSHLATA PLNDLLLEML (A02.01)
GSTSSHSLQKYYITGE (SEQ ID NO: 2169) (SEQ ID NO: 1984) VPLNDLLLEM (B07.02) (SEQ ID NO: 2170) NVVPLSDLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2171) NVVPLSDLLL (A02.01) IHLMAKAGLTLQQQHQR (SEQ ID NO: 2172) LAQLLLILSHIRHMSNK PLSDLLLEM (A02.01) GMEHLYSMKCKNVVPLS (SEQ ID NO: 2173) ESR1 Y537S DLLLEMLDAHRLHAPTS PLSDLLLEML (A02.01) Câncer de Mama RGGASVEETDQSHLATA (SEQ ID NO: 2174) GSTSSHSLQKYYITGE VPLSDLLLEM (B07.02) (SEQ ID NO: 1985) (SEQ ID NO: 2175) VVPLSDLLL (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 2176)
HRIGGIKLRHQQWSLVM ESVVPSDRGNYTCVVEN VLERCPHRPI (A02.01, KFGSIRQTYTLDVLERC B08.01) (SEQ ID NO: BLCA, HNSC, KIRP, FGFR3 S249C PHRPILQAGLPANQTAV 2177)
LUSC LGSDVEFHCKVYSDAQP YTLDVLERC (A02.01) HIQWLKHVEVNGSKVG (SEQ ID NO: 2178) (SEQ ID NO: 1986)
AVKLSDSRIALKSGYGK YLGINSDELVGHSDAIG
PREQWEPVFQNGKMALS FQNGKMALS (A02.01) GBM, KIRP, PRAD, FRG1B L52S ASNSCFIRCNEAGDIEA (SEQ ID NO: 2179) SKCM
KSKTAGEEEMIKIRSCA
EKETKKKDDIPEEDKG (SEQ ID NO: 1987)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
GSGAFGTVYKGIWIPDG
ENVKIPVAIKVLRENTS PKANKEILDEAYVMAGL VMAGLGSPYV (A02.01, V777L HER2 GSPYVSRLLGICLTSTV A03.01) (SEQ ID NO: BRCA (Resistência) QLVTQLMPYGCLLDHVR 2180)
ENRGRLGSQDLLNWCM (SEQ ID NO: 1988)
RVEEFKLKQMWKSPNGT IRNILGGTVFREAIICK
NIPRLVSGWVKPIIIGH KPIIIGHHA (B07.02) IDH1 R132H HAYGDQYRATDFVVPGP BLCA, GBM, PRAD (SEQ ID NO: 2181)
GKVEITYTPSDGTQKVT
YLVHNFEEGGGVAMGM (SEQ ID NO: 1989)
RVEEFKLKQMWKSPNGT IRNILGGTVFREAIICK
NIPRLVSGWVKPIIIGC KPIIIGCHA (B07.02) IDH1 R132C HAYGDQYRATDFVVPGP BLCA, GBM, PRAD (SEQ ID NO: 2182)
GKVEITYTPSDGTQKVT
YLVHNFEEGGGVAMGM (SEQ ID NO: 1990)
RVEEFKLKQMWKSPNGT
IRNILGGTVFREAIICK NIPRLVSGWVKPIIIGG BLCA, BRCA, CRC, KPIIIGGHA (B07.02) IDH1 R132G HAYGDQYRATDFVVPGP GBM, HNSC, LUAD, (SEQ ID NO: 2183) GKVEITYTPSDGTQKVT PAAD, PRAD, UCEC
YLVHNFEEGGGVAMGM (SEQ ID NO: 1991)
RVEEFKLKQMWKSPNGT IRNILGGTVFREAIICK BLCA, BRCA, GBM,
NIPRLVSGWVKPIIIGS KPIIIGSHA (B07.02) HNSC, LIHC, LUAD, IDH1 R132S HAYGDQYRATDFVVPGP (SEQ ID NO: 2184) LUSC, PAAD, SKCM,
GKVEITYTPSDGTQKVT UCEC
YLVHNFEEGGGVAMGM (SEQ ID NO: 1992) VAVKMLKPSAHLTEREA IIEYCCYGDL (A02.01) LMSELKVLSYLGNHMNI (SEQ ID NO: 2185) Tumores estromais KIT T670I VNLLGACTIGGPTLVII TIGGPTLVII (A02.01) gastrointestinais EYCCYGDLLNFLRRKRD (SEQ ID NO: 2186) (GIST) SFICSKQEDHAEAALYK VIIEYCCYG (A02.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 NLLHSKESSCSDSTNE (SEQ ID NO: 2187) (SEQ ID NO: 1993) HMNIANLLGA (A02.01) (SEQ ID NO: 2188) VEATAYGLIKSDAAMTV IANLLGACTI (A02.01) AVKMLKPSAHLTEREAL (SEQ ID NO: 2189) MSELKVLSYLGNHMNIA MNIANLLGA (A02.01) Tumores estromais KIT V654A NLLGACTIGGPTLVITE (SEQ ID NO: 2190) gastrointestinais YCCYGDLLNFLRRKRDS YLGNHMNIA (A02.01, (GIST) FICSKQEDHAEAALYK B08.01) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1994) 2191) YLGNHMNIAN (A02.01) (SEQ ID NO: 2192)
ISELGAGNGGVVFKVSH
KPSGLVMARKLIHLEIK VLHESNSPY (A03.01)
PAIRNQIIRELQVLHES (SEQ ID NO: 2193) MEK C121S NSPYIVGFYGAFYSDGE Melanoma VLHESNSPYI (A02.01)
ISICMEHMDGGSLDQVL (SEQ ID NO: 2194)
KKAGRIPEQILGKVSI (SEQ ID NO: 1995) LQVLHECNSL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2195) LYIVGFYGAF (A24.02) (SEQ ID NO: 2196) NSLYIVGFY (A01.01) LGAGNGGVVFKVSHKPS (SEQ ID NO: 2197) GLVMARKLIHLEIKPAI QVLHECNSL (A02.01, RNQIIRELQVLHECNSL B08.01) (SEQ ID NO: MEK P124L YIVGFYGAFYSDGEISI 2198) Melanoma CMEHMDGGSLDQVLKKA SLYIVGFYG (A02.01) GRIPEQILGKVSIAVI (SEQ ID NO: 2199) (SEQ ID NO: 1996) SLYIVGFYGA (A02.01) (SEQ ID NO: 2200) VLHECNSLY (A03.01) (SEQ ID NO: 2201) VLHECNSLYI (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 2202) MYC E39D MPLNVSFTNRNYDLDYD FYQQQQQSDL (A24.02) Câncer Linfoide;
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 SVQPYFYCDEEENFYQQ (SEQ ID NO: 2203) Linfoma de QQQSDLQPPAPSEDIWK QQQSDLQPPA (A02.01) Burkitt KFELLPTPPLSPSRRSG (SEQ ID NO: 2204) LCSPSYVAVTPFSLRGD QQSDLQPPA (A02.01) NDGG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2205) 1997) YQQQQQSDL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2206)
FTNRNYDLDYDSVQPYF YCDEEENFYQQQQQSEL FELLSTPPL (A02.01, QPPAPSEDIWKKFELLS B08.01) (SEQ ID NO: MYC P57S TPPLSPSRRSGLCSPSY 2207) Câncer Linfoide VAVTPFSLRGDNDGGGG LLSTPPLSPS (A02.01) SFSTADQLEMVTELLG (SEQ ID NO: 2208) (SEQ ID NO: 1998) FELLPIPPL (A02.01) TNRNYDLDYDSVQPYFY (SEQ ID NO: 2209) CDEEENFYQQQQQSELQ IWKKFELLPI (A24.02) PPAPSEDIWKKFELLPI (SEQ ID NO: 2210) MYC T58I PPLSPSRRSGLCSPSYV LLPIPPLSPS (A02.01, Neuroblastoma AVTPFSLRGDNDGGGGS B07.02) (SEQ ID NO: FSTADQLEMVTELLGG 2211) (SEQ ID NO: 1999) LPIPPLSPS (B07.02) (SEQ ID NO: 2212) IIEYCFYGDL (A02.01) (SEQ ID NO: 2213)
VAVKMLKPTARSSEKQA IIIEYCFYG (A02.01)
LMSELKIMTHLGPHLNI (SEQ ID NO: 2214) VNLLGACTKSGPIYIII Leucemia IYIIIEYCF (A24.02) PDGFRa T674I EYCFYGDLVNYLHKNRD Eosinofílica (SEQ ID NO: 2215) SFLSHHPEKPKKELDIF Crônica IYIIIEYCFY (A24.02)
GLNPADESTRSYVILS (SEQ ID NO: 2216) (SEQ ID NO: 2000) YIIIEYCFYG (A02.01) (SEQ ID NO: 2217)
IEEHANWSVSREAGFSY BLCA, BRCA, CESC,
SHAGLSNRLARDNELRE CRC, GBM, HNSC, NDKEQLKAISTRDPLSK KITEQEKDFL (A02.01) PIK3CA E542K KIRC, KIRP, LIHC, ITEQEKDFLWSHRHYCV (SEQ ID NO: 2218) LUAD, LUSC, PRAD,
TIPEILPKLLLSVKWNS UCEC RDEVAQMYCLVKDWPP
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2001)
HANWSVSREAGFSYSHA GLSNRLARDNELRENDK BLCA, BRCA, CESC, STRDPLSEITK (A03.01) EQLKAISTRDPLSEITK CRC, GBM, HNSC, (SEQ ID NO: 2219) PIK3CA E545K QEKDFLWSHRHYCVTIP KIRC, KIRP, LIHC, DPLSEITK (A03.01) EILPKLLLSVKWNSRDE LUAD, LUSC, PRAD, (SEQ ID NO: 2220) VAQMYCLVKDWPPIKP SKCM, UCEC (SEQ ID NO: 2002)
LFINLFSMMLGSGMPEL QSFDDIAYIRKTLALDK BRCA, CESC, CRC, TEQEALEYFMKQMNDAR GBM, HNSC, LIHC, PIK3CA H1047R HGGWTTKMDWIFHTIKQ LUAD, LUSC, PRAD, HALN (SEQ ID NO: UCEC 2003) Adenocarcinoma colorretal; Adenocarcinoma uterino/do Endométrio; Adenocarcinoma colorretal, MSI+;
QRGGVITDEEETSKKIA Adenocarcinoma
DQLDNIVDMREYDVPYH uterino/do
IRLSIDIETTKLPLKFR LPLKFRDAET (B07.02) Endométrio, MSI+; POLE P286R DAETDQIMMISYMIDGQ (SEQ ID NO: 2221) Carcinoma
GYLITNREIVSEDIEDF endometrioide;
EFTPKPEYEGPFCVFN Carcinoma seroso (SEQ ID NO: 2004) do endométrio; Endométrio Carcinossarcoma- tumor mesodérmico maligno misto; Glioma; Astrocitoma; GBM
KFNCRVAQYPFEDHNPP
QLELIKPFCEDLDQWLS BRCA, CESC, CRC, EDDNHVAAIHCKAGKGQ QTGVMICAYL (A02.01) PTEN R130Q GBM, KIRC, LUSC, TGVMICAYLLHRGKFLK (SEQ ID NO: 2222)
UCEC AQEALDFYGEVRTRDKK GVTIPSQRRYVYYYSY
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2005)
MQAIKCVVVGDGAVGKT
CLLISYTTNAFSGEYIP AFSGEYIPTV (A02.01,
TVFDNYSANVMVDGKPV RAC1 P29S A24.02) (SEQ ID NO: Melanoma
NLGLWDTAGQEDYDRLR 2223) PLSYPQTVGET (SEQ ID NO: 2006)
IRVEGNLRVEYLDDRNT FRHSVVVPYEPPEVGSD SMNRRPILT (A02.01, CTTIHYNYMCNSSCMGS B08.01) (SEQ ID NO: BLCA, BRCA, CRC, TP53 G245S MNRRPILTIITLEDSSG 2224) GBM, HNSC, LUSC, NLLGRNSFEVRVCACPG YMCNSSCMGS (A02.01) PAAD, PRAD RDRRTEEENLRKKGEP (SEQ ID NO: 2225) (SEQ ID NO: 2007)
TYSPALNKMFCQLAKTC
PVQLWVDSTPPPGTRVR AMAIYKQSQHMTEVVRH BLCA, BRCA, CRC, TP53 R175H CPHHERCSDSDGLAPPQ GBM, HNSC, LUAD, HLIRVEGNLRVEYLDDR PAAD, PRAD, UCEC
NTFRHSVVVPYEPPEV (SEQ ID NO: 2008)
EGNLRVEYLDDRNTFRH SVVVPYEPPEVGSDCTT BLCA, BRCA, CRC,
IHYNYMCNSSCMGGMNQ GMNQRPILT (A02.01) GBM, HNSC, KIRC, TP53 R248Q RPILTIITLEDSSGNLL (SEQ ID NO: 2226) LIHC, LUSC, PAAD,
GRNSFEVRVCACPGRDR PRAD, UCEC
RTEEENLRKKGEPHHE (SEQ ID NO: 2009)
EGNLRVEYLDDRNTFRH SVVVPYEPPEVGSDCTT BLCA, BRCA, CRC,
IHYNYMCNSSCMGGMNW GMNWRPILT (A02.01) GBM, HNSC, LIHC, TP53 R248W RPILTIITLEDSSGNLL (SEQ ID NO: 2227) LUSC, PAAD, SKCM,
GRNSFEVRVCACPGRDR UCEC
RTEEENLRKKGEPHHE (SEQ ID NO: 2010)
PEVGSDCTTIHYNYMCN SSCMGGMNRRPILTIIT BLCA, BRCA, CRC, LLGRNSFEVC (A02.01) TP53 R273C LEDSSGNLLGRNSFEVC GBM, HNSC, LUSC, (SEQ ID NO: 2228) VCACPGRDRRTEEENLR PAAD, UCEC
KKGEPHHELPPGSTKRA
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
LPNNTSSSPQPKKKPL (SEQ ID NO: 2011)
DESLOCAMENTOS DE TABELA
QUADRO DE LEITURA 35B ASSOCIADOS A MSI 1 MSI+ CRC, Câncer
GVEPCYGDKDKRRHCFA Uterino/do
TWKNISGSIEIVKQGCW Endométrio de ACVR2A D96fs; +1 LDDINCYDRTDCVEKKR MSI+, Câncer do QP* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2012) Síndrome de Lynch ALKYIFVAV (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2229) ALKYIFVAVR (A03.01) (SEQ ID NO: 2230) AVRAICVMK (A03.01) (SEQ ID NO: 2231) AVRAICVMKS (A03.01) (SEQ ID NO: 2232) CVEKKTALK (A03.01) (SEQ ID NO: 2233)
GVEPCYGDKDKRRHCFA CVEKKTALKY (A01.01) TWKNISGSIEIVKQGCW MSI+ CRC, Câncer (SEQ ID NO: 2234) LDDINCYDRTDCVEKKT Uterino/do CVMKSFLIF (A24.02, ALKYIFVAVRAICVMKS Endométrio de ACVR2A D96fs; -1 B08.01) (SEQ ID NO: FLIFRRWKSHSPLQIQL MSI+, Câncer do 2235) HLSHPITTSCSIPWCHL Estômago de MSI+, CVMKSFLIFR (A03.01) C* (SEQ ID NO: Síndrome de Lynch (SEQ ID NO: 2236) 2013) FLIFRRWKS (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2237) FRRWKSHSPL (B08.01) (SEQ ID NO: 2238) FVAVRAICV (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2239) FVAVRAICVM (B08.01) (SEQ ID NO: 2240) IQLHLSHPI (A02.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
(SEQ ID NO: 2241) KSFLIFRRWK (A03.01) (SEQ ID NO: 2242) KTALKYIFV (A02.01) (SEQ ID NO: 2243) KYIFVAVRAI (A24.02) (SEQ ID NO: 2244) RWKSHSPLQI (A24.02) (SEQ ID NO: 2245) TALKYIFVAV (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2246) VAVRAICVMK (A03.01) (SEQ ID NO: 2247) VMKSFLIFR (A03.01) (SEQ ID NO: 2248) VMKSFLIFRR (A03.01) (SEQ ID NO: 2249) YIFVAVRAI (A02.01) (SEQ ID NO: 2250) ALFFFFFET (A02.01) (SEQ ID NO: 2251) ALFFFFFETK (A03.01) (SEQ ID NO: 2252) AQAGVQWRSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2253) TAEAVNVAIAAPPSEGE CLANFCIFNR (A03.01) ANAELCRYLSKVLELRK (SEQ ID NO: 2254) MSI+ CRC, Câncer SDVVLDKVGLALFFFFF CLSFLSSWDY (A01.01, Uterino/do ETKSCSVAQAGVQWRSL A03.01) (SEQ ID NO: Endométrio de C15ORF40 L132fs; +1 GSLQPPPPGFKLFSCLS 2255) MSI+, Câncer do FLSSWDYRRMPPCLANF FFETKSCSV (B08.01) Estômago de MSI+, CIFNRDGVSPCWSGWS* (SEQ ID NO: 2256) Síndrome de Lynch (SEQ ID NO: 2014) FFFETKSCSV (A02.01) (SEQ ID NO: 2257) FKLFSCLSFL (A02.01) (SEQ ID NO: 2258) FLSSWDYRRM (A02.01) (SEQ ID NO: 2259) GFKLFSCLSF (A24.02)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2260) KLFSCLSFL (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 2261) KLFSCLSFLS (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 2262) LALFFFFFET (A02.01) (SEQ ID NO: 2263) LFFFFFETK (A03.01) (SEQ ID NO: 2264) LSFLSSWDY (A01.01) (SEQ ID NO: 2265) LSFLSSWDYR (A03.01) (SEQ ID NO: 2266) RMPPCLANF (A24.02) (SEQ ID NO: 2267) RRMPPCLANF (A24.02) (SEQ ID NO: 2268) SLQPPPPGFK (A03.01) (SEQ ID NO: 2269) VQWRSLGSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2270) FFFSVIFST (A02.01) (SEQ ID NO: 2271) LSVIIFFFVYIWHWALP MSI+ CRC, Câncer MSVCFFFFSV (A02.01) LILNNHHICLMSSIILD Uterino/do (SEQ ID NO: 2272) CNSVRQSIMSVCFFFFS Endométrio de CNOT1 L1544fs; +1 SVCFFFFSV (A02.01, VIFSTRCLTDSRYPNIC MSI+, Câncer do B08.01) (SEQ ID NO: WFK* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2273) 2015) Síndrome de Lynch SVCFFFFSVI (A02.01) (SEQ ID NO: 2274) FFCYILNTMF (A24.02) MSI+ CRC, Câncer
LSVIIFFFVYIWHWALP (SEQ ID NO: 2275) Uterino/do
LILNNHHICLMSSIILD MSVCFFFFCY (A01.01) Endométrio de CNOT1 L1544fs; -1 CNSVRQSIMSVCFFFFC (SEQ ID NO: 2276) MSI+, Câncer do YILNTMFDR* (SEQ SVCFFFFCYI (A02.01) Estômago de MSI+, ID NO: 2016) (SEQ ID NO: 2277) Síndrome de Lynch VLVLSCDLITDVALHEV KQWSSVTSL (A02.01) MSI+ CRC, Câncer EIF2B3 A151fs; -1 VDLFRAYDASLAMLMRK (SEQ ID NO: 2278) Uterino/do
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 GQDSIEPVPGQKGKKKQ VLWMPTSTV (A02.01) Endométrio de WSSVTSLEWTAQERGCS (SEQ ID NO: 2279) MSI+, Câncer do SWLMKQTWMKSWSLRDP Estômago de MSI+, SYRSILEYVSTRVLWMP Síndrome de Lynch TSTV* (SEQ ID NO: 2017)
SIQVMRAQMNQIQSVEG QPLARRPRATGRTKRCQ MSI+ CRC, Câncer PRDVTKKTCNSNDGKKR Uterino/do EWEKRKQILGGGGKYKE ILIRKAMTV (A02.01) Endométrio de EPHB2 K1020fs; -1 YFLKRILIRKAMTVLAG (SEQ ID NO: 2280) MSI+, Câncer do DKKGLGRFMRCVQSETK Estômago de MSI+, AVSLQLPLGR* (SEQ Síndrome de Lynch ID NO: 2018) MSI+ CRC, Câncer
LDFLGEFATDIRTHGVH Uterino/do
MVLNHQGRPSGDAFIQM Endométrio de ESRP1 N512fs; +1 KSADRAFMAAQKCHKKK MSI+, Câncer do HEGQIC* (SEQ ID Estômago de MSI+, NO: 2019) Síndrome de Lynch MSI+ CRC, Câncer
LDFLGEFATDIRTHGVH Uterino/do
MVLNHQGRPSGDAFIQM Endométrio de ESRP1 N512fs; -1 KSADRAFMAAQKCHKKT MSI+, Câncer do * (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2020) Síndrome de Lynch GALCKDGRFRSDIGEFE MSI+ CRC, Câncer WKLKEGHKKIYGKQSMV Uterino/do DEVSGKVLEMDISKKKH RMKVPLMK (A03.01) Endométrio de FAM111B A273fs; -1 YNRKISIKKLNRMKVPL (SEQ ID NO: 2281) MSI+, Câncer do MKLITRV* (SEQ ID Estômago de MSI+, NO: 2021) Síndrome de Lynch MSI+ CRC, Câncer
RERAQLLEEQEKTLTSK Uterino/do
LQEQARVLKERCQGEST TLKKKPRDI (B08.01) Endométrio de GBP3 T585fs; -1 QLQNEIQKLQKTLKKKP (SEQ ID NO: 2282) MSI+, Câncer do RDICRIS* (SEQ ID Estômago de MSI+, NO: 2022) Síndrome de Lynch VNTLKEGKRLPCPPNCP LIEGFEALLK (A03.01) MSI+ CRC, Câncer JAK1 P861fs; +1 DEVYQLMRKCWEFQPSN (SEQ ID NO: 2283) Uterino/do
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 RTSFQNLIEGFEALLKT Endométrio de SN* (SEQ ID NO: MSI+, Câncer do 2023) Estômago de MSI+, Síndrome de Lynch QQLKWTPHI (A02.01) (SEQ ID NO: 2284) QLKWTPHILK (A03.01) (SEQ ID NO: 2285) IVSEKNQQLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2286) MSI+ CRC, Câncer
CRPVTPSCKELADLMTR QLKWTPHILK (A03.01) Uterino/do
CMNYDPNQRPFFRAIMR (SEQ ID NO: 2287) Endométrio de JAK1 K860fs; -1 DINKLEEQNPDIVSEKN QQLKWTPHI (A24.02) MSI+, Câncer do QQLKWTPHILKSAS* (SEQ ID NO: 2288) Estômago de MSI+, (SEQ ID NO: 2024) NQQLKWTPHIL (B08.01) Síndrome de Lynch (SEQ ID NO: 2289) NQQLKWTPHI (B08.01) (SEQ ID NO: 2290) QLKWTPHIL (B08.01) (SEQ ID NO: 2291) DDHDVLSFLTFQLTEPG MSI+ CRC, Câncer KEPPTPDKEISEKEKEK GPPRPPRAAC (B07.02) Uterino/do YQEEFEHFQQELDKKKR (SEQ ID NO: 2292) Endométrio de LMAN1 E305fs; +1 GIPEGPPRPPRAACGGN PPRPPRAAC (B07.02) MSI+, Câncer do I* (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2293) Estômago de MSI+, 2025) Síndrome de Lynch DDHDVLSFLTFQLTEPG MSI+ CRC, Câncer KEPPTPDKEISEKEKEK Uterino/do YQEEFEHFQQELDKKKR SLRRKYLRV (B08.01) Endométrio de LMAN1 E305fs; -1 NSRRATPTSKGSLRRKY (SEQ ID NO: 2294) MSI+, Câncer do LRV* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2026) Síndrome de Lynch TKSTLIGEDVNPLIKLD MSI+ CRC, Câncer DAVNVDEIMTDTSTSYL Uterino/do LCISENKENVRDKKKGQ SAACHRRGCV (B08.01) Endométrio de MSH3 N385fs; +1 HFYWHCGSAACHRRGCV (SEQ ID NO: 2295) MSI+, Câncer do * (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2027) Síndrome de Lynch LYTKSTLIGEDVNPLIK ALWECSLPQA (A02.01) MSI+CRC, Câncer MSH3 K383fs; -1 LDDAVNVDEIMTDTSTS (SEQ ID NO: 2296) Uterino/do
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 YLLCISENKENVRDKKR CLIVSRTLL (B08.01) Endométrio de ATFLLALWECSLPQARL (SEQ ID NO: 2297) MSI+, Câncer de CLIVSRTLLLVQS* CLIVSRTLLL (A02.01, Estômago de MSI+, (SEQ ID NO: 2028) B08.01) (SEQ ID NO: Síndrome de Lynch 2298) FLLALWECS (A02.01) (SEQ ID NO: 2299) FLLALWECSL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2300) IVSRTLLLV (A02.01) (SEQ ID NO: 2301) LIVSRTLLL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2302) LIVSRTLLLV (A02.01) (SEQ ID NO: 2303) LLALWECSL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2304) LPQARLCLI (B08.01, B07.02) (SEQ ID NO: 2305) LPQARLCLIV (B08.01) (SEQ ID NO: 2306) NVRDKKRATF (B08.01) (SEQ ID NO: 2307) SLPQARLCLI (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2308) FFCWILSCK (A03.01) (SEQ ID NO: 2309) FFFCWILSCK (A03.01) MSI+ CRC, Câncer
LPPPKLTDPRLLYIGFL (SEQ ID NO: 2310) Uterino/do
GYCSGLIDNLIRRRPIA ITAFFFCWI (A02.01) Endométrio de NDUFC2 A70fs; +1 TAGLHRQLLYITAFFFC (SEQ ID NO: 2311) MSI+, Câncer do WILSCKT* (SEQ ID LYITAFFFCW (A24.02) Estômago de MSI+, NO: 2029) (SEQ ID NO: 2312) Síndrome de Lynch YITAFFFCWI (A02.01) (SEQ ID NO: 2313)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 ITAFFLLDI (A02.01) (SEQ ID NO: 2314) LLYITAFFL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2315) MSI+ CRC, Câncer
SLPPPKLTDPRLLYIGF LLYITAFFLL (A02.01, Uterino/do
LGYCSGLIDNLIRRRPI A24.02) (SEQ ID NO: Endométrio de NDUFC2 F69fs; -1 ATAGLHRQLLYITAFFL 2316) MSI+, Câncer do LDIIL* (SEQ ID LYITAFFLL (A24.02) Estômago de MSI+, NO: 2030) (SEQ ID NO: 2317) Síndrome de Lynch LYITAFFLLD (A24.02) (SEQ ID NO: 2318) YITAFFLLDI (A02.01) (SEQ ID NO: 2319)
NQSGGAGEDCQIFSTPG HPKMIYSSSNLKTPSKL GSNEVTTRY (A01.01) MSI+ CRC, Câncer CSGSKSHDVQEVLKKKT (SEQ ID NO: 2320) Uterino/do GSNEVTTRYEEKKTGSV MPKDVNIQV (B07.02) Endométrio de RBM27 Q817; +1 RKANRMPKDVNIQVRKK (SEQ ID NO: 2321) MSI+, Câncer do QKHETRRKSKYNEDFER TGSNEVTTRY (A01.01) Estômago de MSI+, AWREDLTIKR* (SEQ (SEQ ID NO: 2322) Síndrome de Lynch ID NO: 2031) MSI+ CRC, Câncer Uterino/do
MAPVKKLVVKGGKKKEA Endométrio de RPL22 K16fs; +1 SSEVHS* (SEQ ID MSI+, Câncer do NO: 2032) Estômago de MSI+, Síndrome de Lynch MSI+ CRC, Câncer Uterino/do
MAPVKKLVVKGGKKRSK Endométrio de RPL22 K15fs; -1 F* (SEQ ID NO: MSI+, Câncer do 2033) Estômago de MSI+, Síndrome de Lynch MSI+ CRC, Câncer
MPSHQGAEQQQQQHHVF Uterino/do
ISQVVTEKEFLSRSDQL Endométrio de SEC31A I462fs; +1 QQAVQSQGFINYCQKKN MSI+, Câncer do * (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2034) Síndrome de Lynch
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
KKLMLLRLNL (A02.01) (SEQ ID NO: 2323) KLMLLRLNL (A02.01, A03.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2324) KLMLLRLNLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2325) LLRLNLRKM (B08.01) (SEQ ID NO: 2326) LMLLRLNL (B08.01) MSI+ CRC, Câncer MPSHQGAEQQQQQHHVF (SEQ ID NO: 2327) Uterino/do ISQVVTEKEFLSRSDQL LMLLRLNLRK (A03.01) Endométrio de SEC31A I462fs; -1 QQAVQSQGFINYCQKKL (SEQ ID NO: 2328) MSI+, Câncer do MLLRLNLRKMCGPF* LNLRKMCGPF (B08.01) Estômago de MSI+, (SEQ ID NO: 2035) (SEQ ID NO: 2329) Síndrome de Lynch MLLRLNLRK (A03.01) (SEQ ID NO: 2330) MLLRLNLRKM (A02.01, A03.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2331) NLRKMCGPF (B08.01) (SEQ ID NO: 2332) NYCQKKLMLL (A24.02) (SEQ ID NO: 2333) YCQKKLMLL (B08.01) (SEQ ID NO: 2334) FKKKTYTCAI (B08.01) (SEQ ID NO: 2335) ITTVKATETK (A03.01) (SEQ ID NO: 2336) AEVFEKEQSICAAEEQP MSI+ CRC, Câncer KSKKKETFK (A03.01) AEDGQGETNKNRTKGGW Uterino/do (SEQ ID NO: 2337) QQKSKGPKKTAKSKKKE Endométrio de SEC63 K530fs; +1 KSKKKETFKK (A03.01) TFKKKTYTCAITTVKAT MSI+, Câncer do (SEQ ID NO: 2338) ETKAGKWSRWE* (SEQ Estômago de MSI+, KTYTCAITTV (A02.01, ID NO: 2036) Síndrome de Lynch A24.02) (SEQ ID NO: 2339) TFKKKTYTC (B08.01) (SEQ ID NO: 2340)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 TYTCAITTV (A24.02) (SEQ ID NO: 2341) TYTCAITTVK (A03.01) (SEQ ID NO: 2342) YTCAITTVK (A03.01) (SEQ ID NO: 2343) MSI+ CRC, Câncer
MAEVFEKEQSICAAEEQ Uterino/do
PAEDGQGETNKNRTKGG TAKSKKRNL (B08.01) Endométrio de SEC63 K529fs; -1 WQQKSKGPKKTAKSKKR (SEQ ID NO: 2344) MSI+, Câncer do NL* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2037) Síndrome de Lynch NIMEIRQLPSSHALEAK MSI+ CRC, Câncer LSRMSYPVKEQESILKT Uterino/do VGKLTATQVAKISFFFA FALCGFWQI (A02.01) Endométrio de SLC35F5 C248fs; -1 LCGFWQICHIKKHFQTH (SEQ ID NO: 2345) MSI+, Câncer do KLL* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2038) Síndrome de Lynch YEKKKYYDKNAIAITNI MSI+ CRC, Câncer SSSDAPLQPLVSSPSLQ Uterino/do AAVDKNKLEKEKEKKKG Endométrio de SMAP1 K172fs; +1 REKERKGARKAGKTTYS MSI+, Câncer do * (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2039) Síndrome de Lynch LKKLRSPL (B08.01)
KYEKKKYYDKNAIAITN (SEQ ID NO: 2346) MSI+ CRC, Câncer
ISSSDAPLQPLVSSPSL SLKKVPAL (B08.01) Uterino/do
QAAVDKNKLEKEKEKKR (SEQ ID NO: 2347) Endométrio de SMAP1 K171fs; -1 KRKREKRSQKSRQNHLQ RKISNWSLKK (A03.01) MSI+, Câncer do
LKSCRRKISNWSLKKVP (SEQ ID NO: 2348) Estômago de MSI+, ALKKLRSPLWIF* VPALKKLRSPL (B07.02) Síndrome de Lynch (SEQ ID NO: 2040) (SEQ ID NO: 2349) KRVNTAWKTK (A03.01) (SEQ ID NO: 2350) MSI+ CRC, Câncer
IYQDAYRAEWQVYKEEI MTKKKRVNTA (B08.01) Uterino/do
SRFKEQLTPSQIMSLEK (SEQ ID NO: 2351) Endométrio de TFAM E148fs; +1 EIMDKHLKRKAMTKKKR RVNTAWKTK (A03.01) MSI+, Câncer do VNTAWKTKKTSFSL* (SEQ ID NO: 2352) Estômago de MSI+, (SEQ ID NO: 2041) RVNTAWKTKK (A03.01) Síndrome de Lynch (SEQ ID NO: 2353)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 TKKKRVNTA (B08.01) (SEQ ID NO: 2354) WKTKKTSFSL (B08.01) (SEQ ID NO: 2355) MSI+ CRC, Câncer
IYQDAYRAEWQVYKEEI Uterino/do
SRFKEQLTPSQIMSLEK Endométrio de TFAM E148fs; -1 EIMDKHLKRKAMTKKKS MSI+, Câncer do * (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2042) Síndrome de Lynch MSI+ CRC, Câncer
KPQEVCVAVWRKNDENI Uterino/do
TLETVCHDPKLPYHDFI Endométrio de TGFBR2 P129fs; +1 LEDAASPKCIMKEKKKA MSI+, Câncer do W* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2043) Síndrome de Lynch ALMSAMTTS (A02.01) (SEQ ID NO: 2356) AMTTSSSQK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 2357) AMTTSSSQKN (A03.01) (SEQ ID NO: 2358) CIMKEKKSL (B08.01) (SEQ ID NO: 2359) EKPQEVCVAVWRKNDEN CIMKEKKSLV (B08.01) MSI+ CRC, Câncer ITLETVCHDPKLPYHDF (SEQ ID NO: 2360) Uterino/do ILEDAASPKCIMKEKKS IMKEKKSL (B08.01) Endométrio de TGFBR2 K128fs: -1 LVRLSSCVPVALMSAMT (SEQ ID NO: 2361) MSI+, Câncer do TSSSQKNITPAILTCC* IMKEKKSLV (B08.01) Estômago de MSI+, (SEQ ID NO: 2044) (SEQ ID NO: 2362) Síndrome de Lynch KSLVRLSSCV (A02.01) (SEQ ID NO: 2363) LVRLSSCVPV (A02.01) (SEQ ID NO: 2364) RLSSCVPVA (A02.01, A03.01) (SEQ ID NO: 2365) RLSSCVPVAL (A02.01) (SEQ ID NO: 2366)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 SAMTTSSSQK (A03.01, A11.01) (SEQ ID NO: 2367) SLVRLSSCV (A02.01) (SEQ ID NO: 2368) VPVALMSAM (B07.02) (SEQ ID NO: 2369) VRLSSCVPVA (A02.01) (SEQ ID NO: 2370) VPSKYQFLCSDHFTPDS MSI+ CRC, Câncer LDIRWGIRYLKQTAVPT Uterino/do IFSLPEDNQGKDPSKKN KMRKKYAQK (A03.01) Endométrio de THAP5 K99fs; -1 PRRKTWKMRKKYAQKPS (SEQ ID NO: 2371) MSI+, Câncer do QKNHLY* (SEQ ID Estômago de MSI+, NO: 2045) Síndrome de Lynch FVMSDTTYK (A03.01) (SEQ ID NO: 2372) FVMSDTTYKI (A02.01) (SEQ ID NO: 2373)
GTTEEMKYVLGQLVGLN KTFEKKGEK (A03.01) MSI+ CRC, Câncer
SPNSILKAAKTLYEHYS (SEQ ID NO: 2374) Uterino/do
GGESHNSSSSKTFEKKG LFVMSDTTYK (A03.01) Endométrio de TTK R854fs; -1 EKNDLQLFVMSDTTYKI (SEQ ID NO: 2375) MSI+, Câncer do
YWTVILLNPCGNLHLKT MSDTTYKIY (A01.01) Estômago de MSI+, TSL* (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2376) Síndrome de Lynch 2046) VMSDTTYKI (A02.01) (SEQ ID NO: 2377) VMSDTTYKIY (A01.01) (SEQ ID NO: 2378) MSI+ CRC, Câncer
QQLIRETLISWLQAQML Uterino/do
NPQPEKTFIRNKAAQVF YLTKWPKFFL (A02.01) Endométrio de XPOT F126fs; -1 ALLFVTEYLTKWPKFFL (SEQ ID NO: 2379) MSI+, Câncer do TFSQ* (SEQ ID NO: Estômago de MSI+, 2047) Síndrome de Lynch
DESLOCAMENTOS DE TABELA
QUADRO DE LEITURA 35C 1 V1352fs AKFQQCHSTLEPNPADC FLQERNLPP (A02.01) CRC, LUAD, UCEC,
APC F1354fs RVLVYLQNQPGTKLLNF (SEQ ID NO: 2380) STAD
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 Q1378fs LQERNLPPKVVLRHPKV FRRPHSCLA (B08.01) S1398fs HLNTMFRRPHSCLADVL (SEQ ID NO: 2381) LSVHLIVLRVVRLPAPF LIVLRVVRL (B08.01) RVNHAVEW* (SEQ ID (SEQ ID NO: 2382) NO: 2048) LLSVHLIVL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2383) EVKHLHHLL (B08.01) (SEQ ID NO: 2384) HLHHLLKQLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2385) HLLLKRERV (B08.01) (SEQ ID NO: 2386) KIKHLLLKR (A03.01) (SEQ ID NO: 2387) KPSEKYLKI (B07.02) S1421fs (SEQ ID NO: 2388) R1435fs KYLKIKHLL (A24.02) T1438fs APVIFQIALDKPCHQAE (SEQ ID NO: 2389) P1442fs VKHLHHLLKQLKPSEKY KYLKIKHLLL (A24.02) CRC, LUAD, UCEC, APC P1443fs LKIKHLLLKRERVDLSK (SEQ ID NO: 2390)
STAD V1452fs LQ* (SEQ ID NO: LLKQLKPSEK (A03.01) P1453fs 2049) (SEQ ID NO: 2391) K1462fs LLKRERVDL (B08.01) E1464fs (SEQ ID NO: 2392) LLLKRERVDL (B08.01) (SEQ ID NO: 2393) QLKPSEKYLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2394) YLKIKHLLL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2395) YLKIKHLLLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2396) ILPRKVLQM (B08.01) (SEQ ID NO: 2397) T1487fs MLQFRGSRFFQMLILYY KVLQMDFLV (A02.01, CRC, LUAD, UCEC, APC H1490fs ILPRKVLQMDFLVHPA* A24.02) (SEQ ID NO: STAD L1488fs (SEQ ID NO: 2050) 2398) LPRKVLQMDF (B07.02,
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 B08.01) (SEQ ID NO: 2399) LQMDFLVHPA (A02.01) (SEQ ID NO: 2400) QMDFLVHPA (A02.01) (SEQ ID NO: 2401) YILPRKVLQM (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2402) APSPASRLQC (B07.02) (SEQ ID NO: 2403) HPLAPMPSKT (B07.02) (SEQ ID NO: 2404) ALGPHSRISCLPTQTRG ILPLPQLLL (A02.01) CILLAATPRSSSSSSSN (SEQ ID NO: 2405) DMIPMAISSPPKAPLLA LLLSADQQA (A02.01) Q1306fs APSPASRLQCINSNSRI (SEQ ID NO: 2406) S1316fs TSGQWMAHMALLPSGTK LPTQTRGCI (B07.02) Y1324fs STAD, UCEC, BLCA, GRCTACHTALGRGSLSS (SEQ ID NO: 2407) ARID1A T1348fs BRCA, LUSC, CESC, SSCPQPSPSLPASNKLP LPTQTRGCIL (B07.02) G1351fs KIRC, UCS SLPLSKMYTTSMAMPIL (SEQ ID NO: 2408) G1378fs PLPQLLLSADQQAAPRT RISCLPTQTR (A03.01) P1467fs NFHSSLAETVSLHPLAP (SEQ ID NO: 2409) MPSKTCHHK* (SEQ SLAETVSLH (A03.01) ID NO: 2051) (SEQ ID NO: 2410) TPRSSSSSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2411) TPRSSSSSSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2412) ALPPVLLSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2413) ALPPVLLSLA (A02.01)
AHQGFPAAKESRVIQLS (SEQ ID NO: 2414) S674fs LLSLLIPPLTCLASEAL ALPRPLLAL (A02.01) STAD, UCEC, BLCA, P725fs PRPLLALPPVLLSLAQD ARID1A (SEQ ID NO: 2415) BRCA, LUSC, CESC, R727fs HSRLLQCQATRCHLGHP ASRTASCIL (B07.02) KIRC, UCS I736fs VASRTASCILP* (SEQ (SEQ ID NO: 2416) ID NO: 2052) EALPRPLLAL (B08.01) (SEQ ID NO: 2417) HLGHPVASR (A03.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
(SEQ ID NO: 2418) HPVASRTAS (B07.02) (SEQ ID NO: 2419) HPVASRTASC (B07.02) (SEQ ID NO: 2420) IIQLSLLSLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2421) IQLSLLSLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2422) IQLSLLSLLI (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 2423) LLALPPVLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2424) LLIPPLTCL (A02.01) (SEQ ID NO: 2425) LLIPPLTCLA (A02.01) (SEQ ID NO: 2426) LLSLLIPPL (A02.01) (SEQ ID NO: 2427) LLSLLIPPLT (A02.01) (SEQ ID NO: 2428) LPRPLLALPP (B07.02) (SEQ ID NO: 2429) QLSLLSLLI (A02.01) (SEQ ID NO: 2430) RLLQCQATR (A03.01) (SEQ ID NO: 2431) RPLLALPPV (B07.02) (SEQ ID NO: 2432) RPLLALPPVL (B07.02) (SEQ ID NO: 2433) SLAQDHSRL (A02.01) (SEQ ID NO: 2434) SLAQDHSRLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2435) SLLIPPLTCL (A02.01) (SEQ ID NO: 2436) SLLSLLIPP (A02.01) (SEQ ID NO: 2437) SLLSLLIPPL (A02.01,
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 B08.01) (SEQ ID NO: 2438) AAATSAASTL (B07.02) (SEQ ID NO: 2439) AAIPASTSAV (B07.02) (SEQ ID NO: 2440) AIPASTSAV (A02.01) (SEQ ID NO: 2441) ALPAGCVSSA (A02.01) (SEQ ID NO: 2442) APLLTATGSV (B07.02) (SEQ ID NO: 2443) APVLSASIL (B07.02) (SEQ ID NO: 2444)
PILAATGTSVRTAARTW ATLLPATTV (A02.01)
VPRAAIRVPDPAAVPDD (SEQ ID NO: 2445)
HAGPGAECHGRPLLYTA ATVSTTTAPV (A02.01)
DSSLWTTRPQRVWSTGP (SEQ ID NO: 2446) G414fs DSILQPAKSSPSAAAAT AVPANCLFPA (A02.01) Q473fs LLPATTVPDPSCPTFVS (SEQ ID NO: 2447) H477fs AAATVSTTTAPVLSASI STAD, UCEC, BLCA, CLFPAALPST (A02.01) ARID1A S499fs LPAAIPASTSAVPGSIP BRCA, LUSC, CESC, (SEQ ID NO: 2448) P504fs LPAVDDTAAPPEPAPLL KIRC, UCS CPTFVSAAA (B07.02) Q548fs TATGSVSLPAAATSAAS (SEQ ID NO: 2449) P549fs TLDALPAGCVSSAPVSA FPAALPSTA (B07.02)
VPANCLFPAALPSTAGA (SEQ ID NO: 2450)
ISRFIWVSGILSPLNDL FPAALPSTAG (B07.02) Q* (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2451) 2053) GAECHGRPL (B07.02) (SEQ ID NO: 2452) GAISRFIWV (A02.01) (SEQ ID NO: 2453) ILPAAIPAST (A02.01) (SEQ ID NO: 2454) IWVSGILSPL (A24.02) (SEQ ID NO: 2455) LLTATGSVSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2456) LLYTADSSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2457)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
LPAAATSAA (B07.02) (SEQ ID NO: 2458) LPAAATSAAS (B07.02) (SEQ ID NO: 2459) LPAAIPAST (B07.02) (SEQ ID NO: 2460) LPAGCVSSA (B07.02) (SEQ ID NO: 2461) LPAGCVSSAP (B07.02) (SEQ ID NO: 2462) LYTADSSLW (A24.02) (SEQ ID NO: 2463) QPAKSSPSA (B07.02) (SEQ ID NO: 2464) QPAKSSPSAA (B07.02) (SEQ ID NO: 2465) RFIWVSGIL (A24.02) (SEQ ID NO: 2466) RPQRVWSTG (B07.02) (SEQ ID NO: 2467) RVWSTGPDSI (A02.01) (SEQ ID NO: 2468) SAVPGSIPL (B07.02) (SEQ ID NO: 2469) SILPAAIPA (A02.01) (SEQ ID NO: 2470) SLPAAATSA (A02.01) (SEQ ID NO: 2471) SLPAAATSAA (A02.01) (SEQ ID NO: 2472) SLWTTRPQR (A03.01) (SEQ ID NO: 2473) SLWTTRPQRV (A02.01) (SEQ ID NO: 2474) SPSAAAATL (B07.02) (SEQ ID NO: 2475) SPSAAAATLL (B07.02) (SEQ ID NO: 2476) TLDALPAGCV (A02.01) (SEQ ID NO: 2477) TVSTTTAPV (A02.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2478) VLSASILPA (A02.01) (SEQ ID NO: 2479) VLSASILPAA (A02.01) (SEQ ID NO: 2480) VPANCLFPA (B07.02) (SEQ ID NO: 2481) VPANCLFPAA (B07.02) (SEQ ID NO: 2482) VPDPSCPTF (B07.02) (SEQ ID NO: 2483) VPGSIPLPA (B07.02) (SEQ ID NO: 2484) VPGSIPLPAV (B07.02) (SEQ ID NO: 2485) WVSGILSPL (A02.01) (SEQ ID NO: 2486) YTADSSLWTT (A02.01) (SEQ ID NO: 2487) APAGMVNRA (B07.02) (SEQ ID NO: 2488) ASLHRRSYL (B08.01) (SEQ ID NO: 2489) ASLHRRSYLK (A03.01)
PCRAGRRVPWAASLIHS T433fs (SEQ ID NO: 2490)
RFLLMDNKAPAGMVNRA A441fs FLLMDNKAPA (A02.01)
RLHITTSKVLTLSSSSH Y447fs (SEQ ID NO: 2491)
PTPSNHRPRPLMPNLRI P483fs HPRRSPSRL (B07.02,
SSSHSLNHHSSSPLSLH P484fs B08.01) (SEQ ID NO: STAD, UCEC, BLCA,
TPSSHPSLHISSPRLHT ARID1A P504fs 2492) BRCA, LUSC, CESC,
PPSSRRHSSTPRASPPT S519fs HPSLHISSP (B07.02) KIRC, UCS
HSHRLSLLTSSSNLSSQ H544fs (SEQ ID NO: 2493)
HPRRSPSRLRILSPSLS P549fs HRRSYLKIHL (B08.01)
SPSKLPIPSSASLHRRS P554fs (SEQ ID NO: 2494) YLKIHLGLRHPQPPQ* Q563fs HSRFLLMDNK (A03.01) (SEQ ID NO: 2054) (SEQ ID NO: 2495) KLPIPSSASL (A02.01) (SEQ ID NO: 2496) KVLTLSSSSH (A03.01) (SEQ ID NO: 2497)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
LIHSRFLLM (B08.01) (SEQ ID NO: 2498) LLMDNKAPA (A02.01) (SEQ ID NO: 2499) LMDNKAPAGM (A02.01) (SEQ ID NO: 2500) LPIPSSASL (B07.02) (SEQ ID NO: 2501) MPNLRISSS (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2502) MPNLRISSSH (B07.02) (SEQ ID NO: 2503) NLRISSSHSL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2504) PPTHSHRLSL (B07.02) (SEQ ID NO: 2505) RAGRRVPWAA (B08.01) (SEQ ID NO: 2506) RARLHITTSK (A03.01) (SEQ ID NO: 2507) RISSSHSLNH (A03.01) (SEQ ID NO: 2508) RLHTPPSSR (A03.01) (SEQ ID NO: 2509) RLHTPPSSRR (A03.01) (SEQ ID NO: 2510) RLRILSPSL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2511) RPLMPNLRI (B07.02) (SEQ ID NO: 2512) RPRPLMPNL (B07.02) (SEQ ID NO: 2513) SASLHRRSYL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2514) SLHISSPRL (A02.01) (SEQ ID NO: 2515) SLHRRSYLK (A03.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2516) SLHRRSYLKI (B08.01) (SEQ ID NO: 2517) SLIHSRFLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2518) SLIHSRFLLM (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2519) SLLTSSSNL (A02.01) (SEQ ID NO: 2520) SLNHHSSSPL (A02.01, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2521) SLSSPSKLPI (A02.01) (SEQ ID NO: 2522) SPLSLHTPS (B07.02) (SEQ ID NO: 2523) SPLSLHTPSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2524) SPPTHSHRL (B07.02) (SEQ ID NO: 2525) SPRLHTPPS (B07.02) (SEQ ID NO: 2526) SPRLHTPPSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2527) SPSLSSPSKL (B07.02) (SEQ ID NO: 2528) SYLKIHLGL (A24.02) (SEQ ID NO: 2529) TPSNHRPRPL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2530) TPSSHPSLHI (B07.02) (SEQ ID NO: 2531) CVPFWTGRIL (B07.02)
RTNPTVRMRPHCVPFWT A2137fs (SEQ ID NO: 2532) GRILLPSAASVCPIPFE STAD, UCEC, BLCA, P2139fs HCVPFWTGRIL (B07.02) ARID1A ACHLCQAMTLRCPNTQG BRCA, LUSC, CESC, L1970fs (SEQ ID NO: 2533) CCSSWAS* (SEQ ID KIRC, UCS V1994fs ILLPSAASV (A02.01) NO: 2055) (SEQ ID NO: 2534)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
ILLPSAASVC (A02.01) (SEQ ID NO: 2535) LLPSAASVCPI (A02.01) (SEQ ID NO: 2536) LPSAASVCPI (B07.02) (SEQ ID NO: 2537) MRPHCVPF (B08.01) (SEQ ID NO: 2538) RILLPSAASV (A02.01) (SEQ ID NO: 2539) RMRPHCVPF (A24.02, B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2540) RMRPHCVPFW (A24.02) (SEQ ID NO: 2541) RTNPTVRMR (A03.01) (SEQ ID NO: 2542) SVCPIPFEA (A02.01) (SEQ ID NO: 2543) TVRMRPHCV (B08.01) (SEQ ID NO: 2544) TVRMRPHCVPF (B08.01) (SEQ ID NO: 2545) VPFWTGRIL (B07.02) (SEQ ID NO: 2546) VPFWTGRILL (B07.02) (SEQ ID NO: 2547) VRMRPHCVPF (B08.01) (SEQ ID NO: 2548) AMVPRGVSM (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: TNQALPKIEVICRGTPR 2549) N756fs CPSTVPPSPAQPYLRVS AMVPRGVSMA (A02.01) S764fs LPEDRYTQAWAPTSRTP (SEQ ID NO: 2550) STAD, UCEC, BLCA, ARID1A T783fs WGAMVPRGVSMAHKVAT AWAPTSRTPW (A24.02) BRCA, LUSC, CESC, Q799fs PGSQTIMPCPMPTTPVQ (SEQ ID NO: 2551) KIRC, UCS A817fs AWLEA* (SEQ ID CPMPTTPVQA (B07.02) NO: 2056) (SEQ ID NO: 2552) CPSTVPPSPA (B07.02) (SEQ ID NO: 2553)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
GAMVPRGVSM (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2554) MPCPMPTTPV (B07.02) (SEQ ID NO: 2555) MPTTPVQAW (B07.02) (SEQ ID NO: 2556) MPTTPVQAWL (B07.02) (SEQ ID NO: 2557) SLPEDRYTQA (A02.01) (SEQ ID NO: 2558) SPAQPYLRV (B07.02) (SEQ ID NO: 2559) SPAQPYLRVS (B07.02) (SEQ ID NO: 2560) TIMPCPMPT (A02.01) (SEQ ID NO: 2561) TPVQAWLEA (B07.02) (SEQ ID NO: 2562) TSRTPWGAM (B07.02) (SEQ ID NO: 2563) VPPSPAQPYL (B07.02) (SEQ ID NO: 2564) VPRGVSMAH (B07.02) (SEQ ID NO: 2565) CLSARTGLSI (B08.01) (SEQ ID NO: 2566) CTTLNSPPLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2567) GLSISCTTL (A02.01) N62fs (SEQ ID NO: 2568) E67fs RMERELKKWSIQTCLSA SPPLKKMSM (B07.02, L74fs RTGLSISCTTLNSPPLK CRC, STAD, SKCM, β2M B08.01) (SEQ ID NO: F82fs KMSMPAV* (SEQ ID HNSC 2569) T91fs NO: 2057) TLNSPPLKK (A03.01) E94fs (SEQ ID NO: 2570) TTLNSPPLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2571) TTLNSPPLKK (A03.01) (SEQ ID NO: 2572)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 LQRFRFTHV (B08.01) (SEQ ID NO: 2573) LQRFRFTHVI (B08.01) (SEQ ID NO: 2574)
LCSRYSLFLAWRLSSVL RLSSVLQRF (A24.02) L13fs QRFRFTHVIQQRMESQI CRC, STAD, SKCM, β2M (SEQ ID NO: 2575) S14fs S* (SEQ ID NO: HNSC RLSSVLQRFR (A03.01) 2058) (SEQ ID NO: 2576) VLQRFRFTHV (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2577) ASVGRHSLSK (A03.01) (SEQ ID NO: 2578) KFLPFWGFL (A24.02) (SEQ ID NO: 2579) RSACVTVKGPLASVGRH LASVGRHSL (B07.02) A691fs SLSKQDCKFLPFWGFLE (SEQ ID NO: 2580) Câncer de Mama CDH1 P708fs EFLLC* (SEQ ID LPFWGFLEEF (B07.02) ILC LumA L711fs NO: 2059) (SEQ ID NO: 2581) PFWGFLEEF (A24.02) (SEQ ID NO: 2582) SVGRHSLSK (A03.01) (SEQ ID NO: 2583) APRPIRPPF (B07.02) (SEQ ID NO: 2584) APRPIRPPFL (B07.02) H121fs (SEQ ID NO: 2585) P126fs AQKMKKAHFL (B08.01) H128fs IQWGTTTAPRPIRPPFL (SEQ ID NO: 2586) N144fs ESKQNCSHFPTPLLASE FLPSAAQKM (A02.01) V157fs DRRETGLFLPSAAQKMK (SEQ ID NO: 2587) Câncer de Mama CDH1 P159fs KAHFLKTWFRSNPTKTK GLFLPSAAQK (A03.01) ILC LumA N166fs KARFSTASLAKELTHPL (SEQ ID NO: 2588) N181fs LVSLLLKEKQDG* HPLLVSLLL (B07.02) F189fs (SEQ ID NO: 2060) (SEQ ID NO: 2589) P201fs KAHFLKTWFR (A03.01) F205fs (SEQ ID NO: 2590) KARFSTASL (B07.02) (SEQ ID NO: 2591) KMKKAHFLK (A03.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
(SEQ ID NO: 2592) KTWFRSNPTK (A03.01) (SEQ ID NO: 2593) LAKELTHPL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2594) LAKELTHPLL (B08.01) (SEQ ID NO: 2595) NPTKTKKARF (B07.02) (SEQ ID NO: 2596) QKMKKAHFL (B08.01) (SEQ ID NO: 2597) RFSTASLAK (A03.01) (SEQ ID NO: 2598) RPIRPPFLES (B07.02) (SEQ ID NO: 2599) RSNPTKTKK (A03.01) (SEQ ID NO: 2600) SLAKELTHPL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2601) TKKARFSTA (B08.01) (SEQ ID NO: 2602) GLRFWNPSR (A03.01) (SEQ ID NO: 2603) ISQLLSWPQK (A03.01) (SEQ ID NO: 2604) RIAHISQLL (A02.01) PTDPFLGLRLGLHLQKV (SEQ ID NO: 2605) V114fs FHQSHAEYSGAPPPPPA RLGYSSHQL (A02.01) P127fs PSGLRFWNPSRIAHISQ (SEQ ID NO: 2606) Câncer de Mama CDH1 V132fs LLSWPQKTEERLGYSSH SQLLSWPQK (A03.01) ILC LumA P160fs QLPRK* (SEQ ID (SEQ ID NO: 2607) NO: 2061) SRIAHISQL (B08.01) (SEQ ID NO: 2608) WPQKTEERL (B07.02) (SEQ ID NO: 2609) YSSHQLPRK (A03.01) (SEQ ID NO: 2610) CDH1 L731fs FCCSCCFFGGERWSKSP CPQRMTPGTT (B07.02) Câncer de Mama
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 R749fs YCPQRMTPGTTFITMMK (SEQ ID NO: 2611) ILC LumA E757fs KEAEKRTRTLT* (SEQ EAEKRTRTL (B08.01) G759fs ID NO: 2062) (SEQ ID NO: 2612) GTTFITMMK (A03.01) (SEQ ID NO: 2613) GTTFITMMKK (A03.01) (SEQ ID NO: 2614) ITMMKKEAEK (A03.01) (SEQ ID NO: 2615) RMTPGTTFI (A02.01) (SEQ ID NO: 2616) SPYCPQRMT (B07.02) (SEQ ID NO: 2617) TMMKKEAEK (A03.01) (SEQ ID NO: 2618) TPGTTFITM (B07.02) (SEQ ID NO: 2619) TPGTTFITMM (B07.02) (SEQ ID NO: 2620) TTFITMMKK (A03.01) (SEQ ID NO: 2621) CPGATWREA (B07.02)
WRRNCKAPVSLRKSVQT (SEQ ID NO: 2622)
PARSSPARPDRTRRLPS CPGATWREAA (B07.02) S19fs LGVPGQPWALGAAASRR (SEQ ID NO: 2623) Câncer de Mama CDH1 E24fs CCCCCRSPLGSARSRSP RSRCPGATWR (A03.01) ILC LumA S36fs ATLALTPRATRSRCPGA (SEQ ID NO: 2624) TWREAASWAE* (SEQ TPRATRSRC (B07.02) ID NO: 2063) (SEQ ID NO: 2625) P394fs P387fs
PGRPLQTHVLPEPHLAL S398fs QPLQPHADHAHADAPAI HVLPEPHLAL (B07.02) H400fs QPVLWTTPPLQHGHRHG (SEQ ID NO: 2626) M401fs LEPCSMLTGPPARVPAV RPLQTHVLPE (B07.02) GATA3 S408fs Câncer de Mama PFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 2627) P409fs GYMFLKAESKIMFATLQ VLWTTPPLQH (A03.01) S408fs RSSLWCLCSNH* (SEQ (SEQ ID NO: 2628) P409fs ID NO: 2064) T419fs H424fs
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
P425fs S427fs F431fs S430fs H434fs H435fs S438fs M443fs G444fs *445fs APSESPCSPF (B07.02) (SEQ ID NO: 2629) CPLDHTTPPA (B07.02) (SEQ ID NO: 2630) FLQEQYHEA (A02.01, PRPRRCTRHPACPLDHT B08.01) (SEQ ID NO: P426fs TPPAWSPPWVRALLDAH 2631) H434fs GATA3 RAPSESPCSPFRLAFLQ RLAFLQEQYH (A03.01) Câncer de Mama P433fs EQYHEA* (SEQ ID (SEQ ID NO: 2632) T441fs NO: 2065) SPCSPFRLAF (B07.02) (SEQ ID NO: 2633) SPPWVRALL (B07.02) (SEQ ID NO: 2634) YPACPLDHTT (B07.02) (SEQ ID NO: 2635) TRRCHCCPHLRSHPCPH ALHLRSCPC (B08.01) HLRNHPRPHHLRHHACH (SEQ ID NO: 2636) HHLRNCPHPHFLRHCTC CLHHRRHLV (B08.01) PGRWRNRPSLRRLRSLL (SEQ ID NO: 2637) P519fs CLPHLNHHLFLHWRSRP CLHHRRHLVC (B08.01) E524fs CLHRKSHPHLLHLRRLY (SEQ ID NO: 2638) P647fs PHHLKHRPCPHHLKNLL CLHRKSHPHL (B08.01) S654fs STAD, BLCA, CRC, MLL2 CPRHLRNCPLPRHLKHL (SEQ ID NO: 2639) L656fs HNSC, BRCA ACLHHLRSHPCPLHLKS CLRSHACPP (B08.01) R755fs HPCLHHRRHLVCSHHLK (SEQ ID NO: 2640) L761fs SLLCPLHLRSLPFPHHL CLRSHTCPP (B08.01) Q773fs RHHACPHHLRTRLCPHH (SEQ ID NO: 2641) LKNHLCPPHLRYRAYPP CLWCHACLH (A03.01) CLWCHACLHRLRNLPCP (SEQ ID NO: 2642) HRLRSLPRPLHLRLHAS CPHHLKNHL (B07.02)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
PHHLRTPPHPHHLRTHL (SEQ ID NO: 2643) LPHHRRTRSCPCRWRSH CPHHLKNLL (B07.02) PCCHYLRSRNSAPGPRG (SEQ ID NO: 2644) RTCHPGLRSRTCPPGLR CPHHLRTRL (B07.02, SHTYLRRLRSHTCPPSL B08.01) (SEQ ID NO: RSHAYALCLRSHTCPPR 2645) LRDHICPLSLRNCTCPP CPLHLRSLPF (B07.02, RLRSRTCLLCLRSHACP B08.01) (SEQ ID NO: PNLRNHTCPPSLRSHAC 2646) PPGLRNRICPLSLRSHP CPLPRHLKHL (B07.02, CPLGLKSPLRSQANALH B08.01) (SEQ ID NO: LRSCPCSLPLGNHPYLP 2647) CLESQPCLSLGNHLCPL CPLSLRSHPC (B07.02) CPRSCRCPHLGSHPCRL (SEQ ID NO: 2648) S* (SEQ ID NO: CPRHLRNCPL (B07.02, 2066) B08.01) (SEQ ID NO: 2649) FPHHLRHHA (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2650) FPHHLRHHAC (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2651) GLRSRTCPP (B08.01) (SEQ ID NO: 2652) HACLHRLRNL (B08.01) (SEQ ID NO: 2653) HLACLHHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2654) HLCPPHLRY (A03.01) (SEQ ID NO: 2655) HLCPPHLRYR (A03.01) (SEQ ID NO: 2656) HLKHLACLH (A03.01) (SEQ ID NO: 2657) HLKHRPCPH (B08.01) (SEQ ID NO: 2658) HLKNHLCPP (B08.01) (SEQ ID NO: 2659) HLKSHPCLH (A03.01) (SEQ ID NO: 2660)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
HLKSLLCPL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2661) HLLHLRRLY (A03.01) (SEQ ID NO: 2662) HLRNCPLPR (A03.01) (SEQ ID NO: 2663) HLRNCPLPRH (A03.01) (SEQ ID NO: 2664) HLRRLYPHHL (B08.01) (SEQ ID NO: 2665) HLRSHPCPL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2666) HLRSHPCPLH (A03.01) (SEQ ID NO: 2667) HLRSLPFPH (A03.01) (SEQ ID NO: 2668) HLRTRLCPH (A03.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2669) HLVCSHHLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2670) HPCLHHRRHL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2671) HPGLRSRTC (B07.02) (SEQ ID NO: 2672) HPHLLHLRRL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2673) HRKSHPHLL (B08.01) (SEQ ID NO: 2674) HRRTRSCPC (B08.01) (SEQ ID NO: 2675) KSHPHLLHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2676) KSLLCPLHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2677) LLCPLHLRSL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO:
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
2678) LLHLRRLYPH (B08.01) (SEQ ID NO: 2679) LPRHLKHLA (B07.02) (SEQ ID NO: 2680) LPRHLKHLAC (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2681) LRRLRSHTC (B08.01) (SEQ ID NO: 2682) LRRLYPHHL (B08.01) (SEQ ID NO: 2683) LVCSHHLKSL (B08.01) (SEQ ID NO: 2684) NLRNHTCPPS (B08.01) (SEQ ID NO: 2685) PLHLRSLPF (B08.01) (SEQ ID NO: 2686) RLCPHHLKNH (A03.01) (SEQ ID NO: 2687) RLYPHHLKH (A03.01) (SEQ ID NO: 2688) RLYPHHLKHR (A03.01) (SEQ ID NO: 2689) RPCPHHLKNL (B07.02) (SEQ ID NO: 2690) RSHPCPLHLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2691) RSLPFPHHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2692) RTRLCPHHL (B07.02) (SEQ ID NO: 2693) RTRLCPHHLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2694) SLLCPLHLR (A03.01) (SEQ ID NO: 2695) SLRSHACPP (B08.01) (SEQ ID NO: 2696) SPLRSQANA (B07.02) (SEQ ID NO: 2697) YLRRLRSHT (B08.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2698) YPHHLKHRPC (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2699) FITSGQIFK (A03.01) I122fs (SEQ ID NO: 2700)
SWKGTNWCNDMCIFITS I135fs IFITSGQIF (A24.02) UCEC, PRAD, SKCM,
GQIFKGTRGPRFLWGSK A148fs (SEQ ID NO: 2701) STAD, BRCA, LUSC,
PTEN DQRQKGSNYSQSEALCV L152fs SQSEALCVL (A02.01) KIRC, LIHC, KIRP, LL* (SEQ ID NO: D162fs (SEQ ID NO: 2702) GBM 2067) I168fs SQSEALCVLL (A02.01) (SEQ ID NO: 2703) UCEC, PRAD, SKCM, L265fs KRTKCFTFG* (SEQ STAD, BRCA, LUSC,
PTEN K266fs ID NO: 2068) KIRC, LIHC, KIRP,
GBM A39fs AYTGTILMM (A24.02) UCEC, PRAD, SKCM, E40fs PIFIQTLLLWDFLQKDL (SEQ ID NO: 2704) STAD, BRCA, LUSC, PTEN V45fs KAYTGTILMM* (SEQ DLKAYTGTIL (B08.01) KIRC, LIHC, KIRP, R47fs ID NO: 2069) (SEQ ID NO: 2705) GBM N48fs ILTKQIKTK (A03.01) (SEQ ID NO: 2706) KMILTKQIK (A03.01) T319fs (SEQ ID NO: 2707) UCEC, PRAD, SKCM, T321fs QKMILTKQIKTKPTDTF KPTDTFLQI (B07.02) STAD, BRCA, LUSC, PTEN K327fs LQILR* (SEQ ID (SEQ ID NO: 2708) KIRC, LIHC, KIRP, A328fs NO: 2070) KPTDTFLQIL (B07.02) GBM A333fs (SEQ ID NO: 2709) MILTKQIKTK (A03.01) (SEQ ID NO: 2710) ITRYTIFVLK (A03.01) (SEQ ID NO: 2711) LIAELHNIL (A02.01) N63fs GFWIQSIKTITRYTIFV UCEC, PRAD, SKCM, (SEQ ID NO: 2712) E73fs LKDIMTPPNLIAELHNI STAD, BRCA, LUSC, PTEN LIAELHNILL (A02.01) A86fs LLKTITHHS* (SEQ KIRC, LIHC, KIRP, (SEQ ID NO: 2713) N94fs ID NO: 2071) GBM MTPPNLIAEL (A02.01) (SEQ ID NO: 2714) NLIAELHNI (A02.01)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
(SEQ ID NO: 2715) NLIAELHNIL (A02.01) (SEQ ID NO: 2716) RYTIFVLKDI (A24.02) (SEQ ID NO: 2717) TITRYTIFVL (A02.01) (SEQ ID NO: 2718) TPPNLIAEL (B07.02) (SEQ ID NO: 2719) FLQFRTHTT (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2720) T202fs LPAKGEDIFL (B07.02) G209fs (SEQ ID NO: 2721) C211fs NYSNVQWRNLQSSVCGL UCEC, PRAD, SKCM, LQFRTHTTGR (A03.01) I224fs PAKGEDIFLQFRTHTTG STAD, BRCA, LUSC, PTEN (SEQ ID NO: 2722) G230fs RQVHVL* (SEQ ID KIRC, LIHC, KIRP, NLQSSVCGL (A02.01) P231fs NO: 2072) GBM (SEQ ID NO: 2723) R233fs SSVCGLPAK (A03.01) D236fs (SEQ ID NO: 2724) VQWRNLQSSV (A02.01) (SEQ ID NO: 2725) GQNVSLLGK (A03.01) (SEQ ID NO: 2726) HTRTRGNLRK (A03.01) (SEQ ID NO: 2727) G251fs ILHTRTRGNL (B08.01) E256fs (SEQ ID NO: 2728) K260fs YQSRVLPQTEQDAKKGQ KGQNVSLLGK (A03.01) UCEC, PRAD, SKCM, Q261fs NVSLLGKYILHTRTRGN (SEQ ID NO: 2729) STAD, BRCA, LUSC, PTEN L265fs LRKSRKWKSM* (SEQ LLGKYILHT (A02.01) KIRC, LIHC, KIRP, M270fs ID NO: 2073) (SEQ ID NO: 2730) GBM H272fs LRKSRKWKSM (B08.01) T286fs (SEQ ID NO: 2731) E288fs SLLGKYILH (A03.01) (SEQ ID NO: 2732) SLLGKYILHT (A02.01) (SEQ ID NO: 2733) A70fs SSQNARGCSPRGPCTSS CTSPLLAPV (A02.01) BRCA, CRC, LUAD, TP53 P72fs SYTGGPCTSPLLAPVIF (SEQ ID NO: 2734) PRAD, HNSC, LUSC,
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
A76fs CPFPENLPGQLRFPSGL FPENLPGQL (B07.02) PAAD, STAD, BLCA, A79fs LAFWDSQVCDLHVLPCP (SEQ ID NO: 2735) OV, LIHC, SKCM, P89fs QQDVLPTGQDLPCAAVG GLLAFWDSQV (A02.01) UCEC, LAML, UCS, W91fs * (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2736) KICH, GBM, ACC S96fs 2074) IFCPFPENL (A24.02) V97fs (SEQ ID NO: 2737) V97fs LLAFWDSQV (A02.01) G108fs (SEQ ID NO: 2738) G117fs LLAPVIFCP (A02.01) S121fs (SEQ ID NO: 2739) V122fs LLAPVIFCPF (A02.01, C124fs A24.02) (SEQ ID NO: K139fs 2740) V143fs LPCPQQDVL (B07.02) (SEQ ID NO: 2741) RFPSGLLAF (A24.02) (SEQ ID NO: 2742) RFPSGLLAFW (A24.02) (SEQ ID NO: 2743) SPLLAPVIF (B07.02) (SEQ ID NO: 2744) SPRGPCTSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2745) SPRGPCTSSS (B07.02) (SEQ ID NO: 2746) SQVCDLHVL (A02.01) (SEQ ID NO: 2747) VIFCPFPENL (A02.01) (SEQ ID NO: 2748) V173fs AMVWPLLSI (A02.01) H178fs (SEQ ID NO: 2749) D186fs AMVWPLLSIL (A02.01) GAAPTMSAAQIAMVWPL BRCA, CRC, LUAD, H193fs (SEQ ID NO: 2750) LSILSEWKEICVWSIWM PRAD, HNSC, LUSC, L194fs AQIAMVWPL (A02.01, TETLFDIVWWCPMSRLR PAAD, STAD, BLCA, TP53 E198fs A24.02) (SEQ ID NO: LALTVPPSTTTTCVTVP OV, LIHC, SKCM, V203fs 2751) AWAA* (SEQ ID NO: UCEC, LAML, UCS, E204fs AQIAMVWPLL (A02.01) 2075) KICH, GBM, ACC L206fs (SEQ ID NO: 2752) D207fs CPMSRLRLA (B07.02, N210fs B08.01) (SEQ ID NO:
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
T211fs 2753) F212fs CPMSRLRLAL (B07.02, V225fs B08.01) (SEQ ID NO: S241fs 2754) IAMVWPLLSI (A02.01, A24.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2755) ILSEWKEICV (A02.01) (SEQ ID NO: 2756) IVWWCPMSR (A03.01) (SEQ ID NO: 2757) IVWWCPMSRL (A02.01) (SEQ ID NO: 2758) IWMTETLFDI (A24.02) (SEQ ID NO: 2759) LLSILSEWK (A03.01) (SEQ ID NO: 2760) MSAAQIAMV (A02.01) (SEQ ID NO: 2761) MSRLRLALT (B08.01) (SEQ ID NO: 2762) MSRLRLALTV (B08.01) (SEQ ID NO: 2763) MVWPLLSIL (A02.01) (SEQ ID NO: 2764) RLALTVPPST (A02.01) (SEQ ID NO: 2765) TLFDIVWWC (A02.01) (SEQ ID NO: 2766) TLFDIVWWCP (A02.01) (SEQ ID NO: 2767) TMSAAQIAMV (A02.01) (SEQ ID NO: 2768) VWSIWMTETL (A24.02) (SEQ ID NO: 2769) WMTETLFDI (A02.01, A24.02) (SEQ ID NO: 2770) WMTETLFDIV (A01.01, A02.01) (SEQ ID NO: 2771)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1
ALRCVFVPV (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2772) ALRCVFVPVL (A02.01, R248fs B08.01) (SEQ ID NO: P250fs 2773) S260fs ALSEHCPTT (A02.01) N263fs (SEQ ID NO: 2774) G266fs AQRKRISARK (A03.01) N268fs (SEQ ID NO: 2775) V272fs GAQRKRISA (B08.01) V274fs (SEQ ID NO: 2776) P278fs HWMENISPF (A24.02) D281fs (SEQ ID NO: 2777) R282fs LPSQRRNHW (B07.02) T284fs TGGPSSPSSHWKTPVVI (SEQ ID NO: 2778) BRCA, CRC, LUAD, E285fs YWDGTALRCVFVPVLGE LPSQRRNHWM (B07.02, PRAD, HNSC, LUSC, L289fs TGAQRKRISARKGSLTT B08.01) (SEQ ID NO: PAAD, STAD, BLCA, TP53 K292fs SCPQGALSEHCPTTPAP 2779) OV, LIHC, SKCM, P301fs LPSQRRNHWMENISPFR NISPFRSVGV (A02.01) UCEC, LAML, UCS, S303fs SVGVSASRCSES* (SEQ ID NO: 2780) KICH, GBM, ACC T312fs (SEQ ID NO: 2076) RISARKGSL (B07.02, S314fs B08.01) (SEQ ID NO: K319fs 2781) K320fs SPFRSVGVSA (B07.02) P322fs (SEQ ID NO: 2782) Y327fs SPSSHWKTPV (B07.02, F328fs B08.01) (SEQ ID NO: L330fs 2783) R333fs TALRCVFVPV (A02.01) R335fs (SEQ ID NO: 2784) R337fs VIYWDGTAL (A02.01) E339fs (SEQ ID NO: 2785) VIYWDGTALR (A03.01) (SEQ ID NO: 2786) VLGETGAQRK (A03.01) (SEQ ID NO: 2787) S149fs FHTPARHPRPRHGHLQA HPRPRHGHL (B07.02, BRCA, CRC, LUAD, TP53 P151fs VTAHDGGCEALPPP* B08.01) (SEQ ID NO: PRAD, HNSC, LUSC, P152fs (SEQ ID NO: 2077) 2788) PAAD, STAD, BLCA,
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 V157fs HPRPRHGHLQ (B07.02) OV, LIHC, SKCM, Q165fs (SEQ ID NO: 2789) UCEC, LAML, UCS, S166fs RPRHGHLQA (B07.02) KICH, GBM, ACC H168fs (SEQ ID NO: 2790) V173fs RPRHGHLQAV (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2791) P47fs D48fs D49fs Q52fs F54fs E56fs P58fs GSLKTQVQMK (A03.01) P60fs (SEQ ID NO: 2792) E62fs PPGPCHLLSL (B07.02) M66fs CCPRTILNNGSLKTQVQ (SEQ ID NO: 2793) BRCA, CRC, LUAD, P72fs MKLPECQRLLPPWPLHQ RTILNNGSLK (A03.01) PRAD, HNSC, LUSC, V73fs QLLHRRPLHQPPPGPCH (SEQ ID NO: 2794) PAAD, STAD, BLCA, TP53 P75fs LLSLPRKPTRAATVSVW SLKTQVQMK (A03.01) OV, LIHC, SKCM, A78fs ASCILGQPSL* (SEQ (SEQ ID NO: 2795) UCEC, LAML, UCS, P82fs ID NO: 2078) SLKTQVQMKL (B08.01) KICH, GBM, ACC P85fs (SEQ ID NO: 2796) S96fs TILNNGSLK (A03.01) P98fs (SEQ ID NO: 2797) T102fs Y103fs G108fs F109fs R110fs G117fs L26fs BRCA, CRC, LUAD, P27fs CPPCRPKQWM (B07.02) PRAD, HNSC, LUSC,
VRKHFQTYGNYFLKTTF P34fs (SEQ ID NO: 2798) PAAD, STAD, BLCA, TP53 CPPCRPKQWMI* (SEQ P36fs TTFCPPCRPK (A03.01) OV, LIHC, SKCM, ID NO: 2079) A39fs (SEQ ID NO: 2799) UCEC, LAML, UCS, Q38fs KICH, GBM, ACC C124fs LARTPLPSTRCFANWPR CFANWPRPAL (A24.02) BRCA, CRC, LUAD, TP53 L130fs PALCSCGLIPHPRPAPA (SEQ ID NO: 2800) PRAD, HNSC, LUSC, N131fs SAPWPSTSSHST* FANWPRPAL (B07.02, PAAD, STAD, BLCA,
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 C135fs (SEQ ID NO: 2080) B08.01) (SEQ ID NO: OV, LIHC, SKCM, K139fs 2801) UCEC, LAML, UCS, A138fs GLIPHPRPA (A02.01) KICH, GBM, ACC T140fs (SEQ ID NO: 2802) V143fs HPRPAPASA (B07.02, Q144fs B08.01) (SEQ ID NO: V147fs 2803) T150fs HPRPAPASAP (B07.02) P151fs (SEQ ID NO: 2804) P152fs IPHPRPAPA (B07.02, G154fs B08.01) (SEQ ID NO: R156fs 2805) R158fs IPHPRPAPAS (B07.02) A161fs (SEQ ID NO: 2806) RPALCSCGL (B07.02) (SEQ ID NO: 2807) RPALCSCGLI (B07.02) (SEQ ID NO: 2808) TPLPSTRCF (B07.02) (SEQ ID NO: 2809) WPRPALCSC (B07.02) (SEQ ID NO: 2810) WPRPALCSCG (B07.02) (SEQ ID NO: 2811) ALRRSGRPPK (A03.01) (SEQ ID NO: 2812) GLVPSLVSK (A03.01) (SEQ ID NO: 2813) L178fs KISVETYTV (A02.01)
ELQETGHRQVALRRSGR D179fs (SEQ ID NO: 2814)
PPKCAERPGAADTGAHC L184fs LLMVLMSLDL (A02.01,
TSTDGRLKISVETYTVS VHL T202fs B08.01) (SEQ ID NO: KIRC, KIRP
SQLLMVLMSLDLDTGLV R205fs 2815) PSLVSKCLILRVK* D213fs LMSLDLDTGL (A02.01) (SEQ ID NO: 2081) G212fs (SEQ ID NO: 2816) LMVLMSLDL (A02.01) (SEQ ID NO: 2817) LVSKCLILRV (A02.01) (SEQ ID NO: 2818)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 QLLMVLMSL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2819) RPGAADTGA (B07.02) (SEQ ID NO: 2820) RPGAADTGAH (B07.02) (SEQ ID NO: 2821) SLDLDTGLV (A02.01) (SEQ ID NO: 2822) SLVSKCLIL (A02.01, B08.01) (SEQ ID NO: 2823) SQLLMVLMSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2824) TVSSQLLMV (A02.01) (SEQ ID NO: 2825) TYTVSSQLL (A24.02) (SEQ ID NO: 2826) TYTVSSQLLM (A24.02) (SEQ ID NO: 2827) VLMSLDLDT (A02.01) (SEQ ID NO: 2828) VPSLVSKCL (B07.02) (SEQ ID NO: 2829) VSKCLILRVK (A03.01) (SEQ ID NO: 2830) YTVSSQLLM (A01.01) (SEQ ID NO: 2831) YTVSSQLLMV (A02.01) (SEQ ID NO: 2832) L158fs K159fs KSDASRLSGA* (SEQ VHL KIRC, KIRP R161fs ID NO: 2082) Q164fs P146fs
RTAYFCQYHTASVYSER I147fs FCQYHTASV (B08.01) VHL AMPPGCPEPSQA* KIRC, KIRP F148fs (SEQ ID NO: 2833) (SEQ ID NO: 2083) L158fs S68fs TRASPPRSSSAIAVRAS CPYGSTSTA (B07.02) VHL KIRC, KIRP S72fs CCPYGSTSTASRSPTQR (SEQ ID NO: 2834)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 I75fs CRLARAAASTATEVTFG CPYGSTSTAS (B07.02) S80fs SSEMQGHTMGFWLTKLN (SEQ ID NO: 2835) P86fs YLCHLSMLTDSLFLPIS LARAAASTAT (B07.02) P97fs HCQCIL* (SEQ ID (SEQ ID NO: 2836) I109fs NO: 2084) MLTDSLFLP (A02.01) H115fs (SEQ ID NO: 2837) L116fs PPRSSSAIAV (B07.02) G123fs (SEQ ID NO: 2838) T124fs RAAASTATEV (B07.02) N131fs (SEQ ID NO: 2839) L135fs SPPRSSSAI (B07.02) V137fs (SEQ ID NO: 2840) G144fs SPPRSSSAIA (B07.02) D143fs (SEQ ID NO: 2841) I147fs SPTQRCRLA (B07.02) (SEQ ID NO: 2842) TQRCRLARA (B08.01) (SEQ ID NO: 2843) TQRCRLARAA (B08.01) (SEQ ID NO: 2844) K171fs P172fs KIWKTTQMCR (A03.01)
SSLRITGDWTSSGRSTK N174fs (SEQ ID NO: 2845) VHL IWKTTQMCRKTWSG* KIRC, KIRP L178fs WTSSGRSTK (A03.01) (SEQ ID NO: 2085) D179fs (SEQ ID NO: 2846) L188fs ALGELARAL (A02.01) (SEQ ID NO: 2847) V62fs AQLRRRAAA (B08.01) V66fs RRRRGGVGRRGVRPGRV (SEQ ID NO: 2848) Q73fs RPGGTGRRGGDGGRAAA AQLRRRAAAL (B08.01) V84fs ARAALGELARALPGHLL (SEQ ID NO: 2849) F91fs QSQSARRAARMAQLRRR ARRAARMAQL (B08.01) VHL T100fs KIRC, KIRP AAALPNAAAWHGPPHPQ (SEQ ID NO: 2850) P103fs LPRSPLALQRCRDTRWA HPQLPRSPL (B07.02, S111fs SG* (SEQ ID NO: B08.01) (SEQ ID NO: L116fs 2086) 2851) H115fs HPQLPRSPLA (B07.02) D126fs (SEQ ID NO: 2852) LARALPGHL (B07.02)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 (SEQ ID NO: 2853) LARALPGHLL (B07.02) (SEQ ID NO: 2854) MAQLRRRAA (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2855) MAQLRRRAAA (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2856) QLRRRAAAL (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2857) RAAALPNAAA (B07.02) (SEQ ID NO: 2858) RMAQLRRRAA (B07.02, B08.01) (SEQ ID NO: 2859) SQSARRAARM (B08.01) (SEQ ID NO: 2860)
TABELA éxon críptico 1 35D SCKVFFKRAAEGKQKYL GMTLGEKFRV (A02:01) Câncer de CASRNDCTIDKFRRKNC (SEQ ID NO: 2861) próstata, Câncer éxon críptico AR-v7 PSCRLRKCYEAGMTLGE RVGNCKHLK (A03.01) de Próstata final KFRVGNCKHLKMTRP* (SEQ ID NO: 2862) Resistente à (SEQ ID NO: 2087) Castração
TABELA FUSÕES FORA DO 35E QUADRO 1,3
MAGAPPPASLPPCSLIS GPSEPGNNI (B07.02) LUSC, Câncer de AC011997 AC011997.1:LRRC6 DCCASNQRDSVGVGPSE (SEQ ID NO: 2863) Mama, Câncer de .1:LRRC6 9 *fora do P:G:NNIKICNESASRK KICNESASRK (A03.01) Cabeça e Pescoço, 9 quadro * (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2864) LUAD 2088) GIQVLNVSLK (A03.01) HGWRPFLPVRARSRWNR (SEQ ID NO: 2865) RLDVTVANGR:S:WKYG IQVLNVSLK (A03.01) EEF1DP3:FRY EEF1DP3 WSLLRVPQVNGIQVLNV (SEQ ID NO: 2866) Câncer de Mama *fora do quadro SLKSSSNVISYE* KSSSNVISY (A01.01, (SEQ ID NO: 2089) A03.01) (SEQ ID NO: 2867)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 KYGWSLLRV (A24.02) (SEQ ID NO: 2868) RSWKYGWSL (A02.01) (SEQ ID NO: 2869) SLKSSSNVI (B08.01) (SEQ ID NO: 2870) SWKYGWSLL (A24.02) (SEQ ID NO: 2871) TVANGRSWK (A03.01) (SEQ ID NO: 2872) VPQVNGIQV (B07.02) (SEQ ID NO: 2873) VPQVNGIQVL (B07.02) (SEQ ID NO: 2874) VTVANGRSWK (A03.01) (SEQ ID NO: 2875) WSLLRVPQV (B08.01) (SEQ ID NO: 2876) HPGDCLIFKL (B07.02) (SEQ ID NO: 2877) KLRVPGSSV (B07.02) (SEQ ID NO: 2878)
RLKEVFQTKIQEFRKAC KLRVPGSSVL (B07.02)
YTLTGYQIDITTENQYR MAD1L1:M (SEQ ID NO: 2879) MAD1L1:MAFK LTSLYAEHPGDCLIFK: CLL AFK RVPGSSVLV (A02.01) :LRVPGSSVLVTVPGL* (SEQ ID NO: 2880) (SEQ ID NO: 2090) SVLVTVPGL (A02.01) (SEQ ID NO: 2881) VPGSSVLVTV (B07.02) (SEQ ID NO: 2882)
AEVLKVIRQSAGQKTTC
GQGLEGPWERPPPLDES ERDGGSEDQVEDPALS: ALLLRPRPPR (A03.01) PPP1R1B: A:LLLRPRPPRPEVGAH (SEQ ID NO: 2883) PPP1R1B:STARD3 Câncer de Mama STARD3 QDEQAAQGADPRLGAQP ALSALLLRPR (A03.01) ACRGLPGLLTVPQPEPL (SEQ ID NO: 2884) LAPPSAA* (SEQ ID NO: 2091) Tabela FUSÕES E 35F DEFINIÇÕES EM
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 QUADRO 1,2
ERAEWRENIREQQKKCF
RSFSLTSVELQMLTNSC VKLQTVHSIPLTINKE: LTINKEEAL (A02.01, BCR:ABL BCR:ABL :EALQRPVASDFEPQGL B08.01) (SEQ ID NO: CML, AML SEAARWNSKENLLAGPS 2885)
ENDPNLFVALYDFVASG (SEQ ID NO: 2092)
ELQMLTNSCVKLQTVHS
IPLTINKEDDESPGLYG IVHSATGFK (A03.01) FLNVIVHSATGFKQSS: (SEQ ID NO: 2886) K:ALQRPVASDFEPQGL BCR:ABL BCR:ABL ATGFKQSSK (A03.01) CML, AML
SEAARWNSKENLLAGPS (SEQ ID NO: 2887)
ENDPNLFVALYDFVASG D (SEQ ID NO: 2093) ISNSWDAHLGLGACGEA ELFPLIFPA (A02.01, EGLGVQGAEEEEEEEEE B08.01) (SEQ ID NO: EEEEGAGVPACPPKGP: 2888) C11orf95 E:LFPLIFPAEPAQASG KGPELFPLI (A02.01, Ependimomas C11orf95:RELA :RELA PYVEIIEQPKQRGMRFR A24.02) (SEQ ID NO: supratentoriais YKCEGRSAGSIPGERST 2889) D (SEQ ID NO: KGPELFPLIF (A24.02) 2094) (SEQ ID NO: 2890)
LQRLDGMGCLEFDEERA
QQEDALAQQAFEEARRR TREFEDRDRSHREEME: CBFB:MYH (variante “tipo :VHELEKSKRALETQME AML 11 a”)
EMKTQLEELEDELQATE
DAKLRLEVNMQALKGQF (SEQ ID NO: 2095)
KGSFPENLRHLKNTMET
IDWKVFESWMHHWLLFE MSRHSLEQKPTDAPPK: CD74:ROS KPTDAPPKAGV (B07.02) NSCLC, Crizotinib (éxon6:éxon32) :AGVPNKPGIPKLLEGS 1 (SEQ ID NO: 2891) resistance
KNSIQWEKAEDNGCRIT
YYILEIRKSTSNNLQNQ (SEQ ID NO: 2096) SWENSDDSRNKLSKIPS QVYRRKHQEL (B08.01) EML4:ALK EML4:ALK NSCLC TPKLIPKVTKTADKHKD (SEQ ID NO: 2892)
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 VIINQAKMSTREKNSQ: STREKNSQV (B08.01) V:YRRKHQELQAMQMEL (SEQ ID NO: 2893) QSPEYKLSKLRTSTIMT VYRRKHQEL (A24.02, DYNPNYCFAGKTSSISD B08.01) (SEQ ID NO: L (SEQ ID NO: 2894) 2097)
EGHRMDKPANCTHDLYM
IMRECWHAAPSQRPTFK VLTVTSTDV (A02.01) QLVEDLDRVLTVTSTD: FGFR3:TA (SEQ ID NO: 2895) Câncer de bexiga, FGFR3:TACC3 :VKATQEENRELRSRCE CC3 VLTVTSTDVK (A03.01) LUSC
ELHGKNLELGKIMDRFE (SEQ ID NO: 2896)
EVVYQAMEEVQKQKELS (SEQ ID NO: 2098) IMSLWGLVS (A02.01) (SEQ ID NO: 2897) IMSLWGLVSK (A03.01) (SEQ ID NO: 2898)
RDNTLLLRRVELFSLSR KLKQEATSK (A03.01)
QVARESTYLSSLKGSRL (SEQ ID NO: 2899) HPEELGGPPLKKLKQE: QIMSLWGLV (A02.01) NAB:STAT :ATSKSQIMSLWGLVSK Solitary fibrous NAB:STAT6 “” (SEQ ID NO: 2900) 6 MPPEKVQRLYVDFPQHL tumors SQIMSLWGL (A02.01,
RHLLGDWLESQPWEFLV A24.02, B08.01) (SEQ GSDAFCC (SEQ ID ID NO: 2901) NO: 2099) SQIMSLWGLV (A02.01) (SEQ ID NO: 2902) TSKSQIMSL (B08.01) (SEQ ID NO: 2903)
MSREMQDVDLAEVKPLV EKGETITGLLQEFDVQ: LLQEFDVQEA (A02.01) NDRG1:ER :EALSVVSEDQSLFECA (SEQ ID NO: 2904) Câncer de NDRG1:ERG G YGTPHLAKTEMTASSSS LQEFDVQEAL (A02.01) Próstata DYGQTSKMSPRVPQQDW (SEQ ID NO: 2905) (SEQ ID NO: 2100)
VLDMHGFLRQALCRLRQ
EEPQSLQAAVRTDGFDE Leucemia PML:RARA FKVRLQDLSSCITQGK: PML:RARA promielocítica (éxon3:éxon3) A:IETQSSSSEEIVPSP aguda
PSPPPLPRIYKPCFVCQ DKSSGYHYGVSACEGCK
Alteração de Contexto de Peptídeos (exemplo Doenças Gene Proteína Sequência de (ou exemplos) de Exemplificativas Exemplificativa Mutação alelo HLA) TABELA 35A MUTAÇÃO DE PONTO 1 G (SEQ ID NO: 2101)
RSSPEQPRPSTSKAVSP
PHLDGPPSPRSPVIGSE VFLPNSNHVASGAGEA: Leucemia PML:RARA A:IETQSSSSEEIVPSP PML:RARA promielocítica (éxon6:éxon3) PSPPPLPRIYKPCFVCQ aguda
DKSSGYHYGVSACEGCK G (SEQ ID NO: 2102)
VARFNDLRFVGRSGRGK
SFTLTITVFTNPPQVAT YHRAIKITVDGPREPR: GPREPRNRT (B07.02) RUNX1(ex5)- N:RTEKHSTMPDSPVDV (SEQ ID NO: 2906) RUNX1 AML RUNX1T1(ex2) KTQSRLTPPTMPPPPTT RNRTEKHSTM (B08.01) QGAPRTSSFTPTTLTNG (SEQ ID NO: 2907) T (SEQ ID NO: 2103) ALNSEALSV (A02.01) MALNS::EALSVVSEDQ (SEQ ID NO: 2908) SLFECAYGTPHLAKTEM ALNSEALSVV (A02.01) TMPRSS2: Câncer de TMPRSS2:ERG TASSSSDYGQTSKMSPR (SEQ ID NO: 2909) ERG Próstata VPQQDW (SEQ ID MALNSEALSV (A02.01, NO: 2104) B08.01) (SEQ ID NO: 2910) 1AAs sublinhados representam Aas não nativos 2AAs em negrito representam AAs nativos da sequência de aminoácidos codificada pelo segundo dentre os dois genes fusionados 3AAs sublinhado e em negrito representam AAs não nativos da sequência de aminoácidos codificada pelo segundo dos dois genes fusionados devido a um deslocamento de quadro de leitura. A Tabela 36 abaixo fornece uma lista de peptídeos BTK limitados por HLA selecionados para o propósito deste Pedido e a proteína codificada correspondente pelo alelo HLA ao qual o peptídeo BTK mutante se liga ou se prevê que se ligue.
Tabela 36 Peptídeo BTK Alelo HLA SLLNYLREM (SEQ ID NO: 2911) HLA-A02:04 HLA-A02:03 HLA-C03:02 HLA-A03:01 HLA-A32:01 HLA-A02:07 HLA-C14:03 HLA-C14:02 HLA-A31:01 HLA-A30:02 HLA-A74:01 HLA-C06:02 HLA-B15:03 HLA-B46:01 HLA-B13:02 HLA-A25:01 HLA-A29:02 HLA-C01:02 EYMANGSLL (SEQ ID NO: 2912) HLA-C14:02 HLA-C14:03 HLA-A33:03 HLA-C04:01 HLA-B15:09 HLA-B38:01 TEYMANGSL (SEQ ID NO: 2913) HLA-B14:02
Peptídeo BTK Alelo HLA HLA-B49:01 HLA-B44:03 HLA-B44:02 HLA-B37:01 HLA-B15:09 HLA-B41:01 HLA-B50:01 MANGSLLNY (SEQ ID NO: 2914) HLA-C02:02 HLA-C03:02 HLA-B53:01 HLA-C12:02 HLA-C12:03 HLA-A36:01 HLA-A26:01 HLA-A25:01 HLA-B57:01 HLA-A03:01 HLA-B46:01 HLA-B15:03 HLA-A33:03 HLA-B35:03 HLA-A11:01 YMANGSLLNY (SEQ ID NO: 2915) HLA-A29:02 HLA-A36:01 HLA-B46:01 HLA-A25:01 HLA-B15:01 HLA-A26:01
Peptídeo BTK Alelo HLA HLA-A30:02 HLA-A32:01 A Tabela 37 fornece uma lista de peptídeos de BTK selecionado e a proteína preferencial correspondente codificada pelo alelo HLA ao qual o peptídeo se liga ou se prevê que se ligue, conforme aplicável ao contexto deste Pedido. Tabela 37
PEPTÍDEO ALELO ANGSLLNY (SEQ ID NO: 2916) HLA-A36:01 ANGSLLNYL (SEQ ID NO: 2917) HLA-C15:02 HLA-C08:01 HLA-C06:02 HLA-A02:04 HLA-C12:02 HLA-B44:02 HLA-C17:01 HLA-B38:01 ANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 2918) HLA-A74:01 HLA-A31:01 EYMANGSL (SEQ ID NO: 2919) HLA-C14:02 HLA-C14:03 HLA-A24:02 EYMANGSLL (SEQ ID NO: 2920) HLA-C14:02 HLA-C14:03 HLA-A33:03 HLA-C04:01 HLA-B15:09
PEPTÍDEO ALELO HLA-B38:01 EYMANGSLLN (SEQ ID NO: 2921) HLA-A24:02 HLA-A23:01 EYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 2922) HLA-A29:02 GSLLNYLR (SEQ ID NO: 2923) HLA-A31:01 HLA-A74:01 GSLLNYLREM (SEQ ID NO: 2924) HLA-B58:02 HLA-B57:01 ITEYMANGS (SEQ ID NO: 2925) HLA-A01:01 ITEYMANGSL (SEQ ID NO: 2926) HLA-A01:01 ITEYMANGSLL (SEQ ID NO: 2927) HLA-A01:01 MANGSLLNY (SEQ ID NO: 2928) HLA-C02:02 HLA-C03:02 HLA-B53:01 HLA-C12:02 HLA-C12:03 HLA-A36:01 HLA-A26:01 HLA-A25:01 HLA-B57:01 HLA-A03:01 HLA-B46:01 HLA-B15:03 HLA-A33:03 HLA-B35:03 HLA-A11:01 MANGSLLNYL (SEQ ID NO: 2929) HLA-C17:01 HLA-C02:02
PEPTÍDEO ALELO HLA-B35:01 HLA-C03:03 HLA-C08:01 HLA-B35:03 HLA-C12:02 HLA-C01:02 HLA-C03:04 HLA-C08:02 MANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 2930) HLA-A33:03 HLA-A74:01 NGSLLNYL (SEQ ID NO: 2931) HLA-B14:02 NGSLLNYLR (SEQ ID NO: 2932) HLA-A68:01 HLA-A33:03 HLA-A31:01 HLA-A74:01 SLLNYLREM (SEQ ID NO: 2933) HLA-A02:04 HLA-A02:03 HLA-C03:02 HLA-A03:01 HLA-A32:01 HLA-A02:07 HLA-C14:03 HLA-C14:02 HLA-A31:01 HLA-A30:02 HLA-A74:01 HLA-C06:02 HLA-B15:03
PEPTÍDEO ALELO HLA-B46:01 HLA-B13:02 HLA-A25:01 HLA-A29:02 HLA-C01:02 SLLNYLREMR (SEQ ID NO: 2934) HLA-A74:01 HLA-A31:01 TEYMANGSL (SEQ ID NO: 2935) HLA-B14:02 HLA-B49:01 HLA-B44:03 HLA-B44:02 HLA-B37:01 HLA-B15:09 HLA-B41:01 HLA-B50:01 TEYMANGSLL (SEQ ID NO: 2936) HLA-B40:01 HLA-B44:03 HLA-B49:01 HLA-B44:02 HLA-B40:02 TEYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 2937) HLA-B44:03 YMANGSLL (SEQ ID NO: 2938) HLA-B15:09 HLA-C03:04 HLA-C03:03 HLA-C17:01 HLA-C03:02 HLA-C14:03 HLA-C14:02
PEPTÍDEO ALELO HLA-C04:01 HLA-C02:02 HLA-A01:01 YMANGSLLN (SEQ ID NO: 2939) HLA-A29:02 HLA-A01:01 YMANGSLLNY (SEQ ID NO: 2940) HLA-A29:02 HLA-A36:01 HLA-B46:01 HLA-A25:01 HLA-B15:01 HLA-A26:01 HLA-A30:02 HLA-A32:01
[0330] As mutações exemplificativas no gene EGFR, que são prevalentes em vários tipos de câncer são apresentadas na Tabela 40A-40D. A Tabela também fornece peptídeos neoantigênicos de EGFR exemplificativos. As mutações envolvendo substituições de aminoácidos únicos prevalentes no câncer estão listadas nas Tabelas 40A-40C. Mutações exemplificativas envolvendo uma deleção ou deleção e inserção são apresentadas na Tabela 40D. Tabela 40A. Mutações de ponto de EGFR exemplificativas em peptídeos mutantes e com câncer Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer EGFR c.1786C>T p.P596S CTGRGPDNCIQCAHYI CVKTCSAGV (SEQ ID GBM DGPRCVRTC[p.P596 NO: S]SAGVMGENNTLVWK 2959),VKTCSAGVM YADAGHVCHLCH (SEQ (SEQ ID NO:
Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer ID NO: 2941) 2960),CVKTCSAGVM (SEQ ID NO: 2961) EGFR c.1787C>T p.P596L CTGRCPDNCIQCAHYI CVKTCLAGV (SEQ ID GBM DGPHCVKTC[p.S596 NO: L] 2962),GPHCVKTCL LAGVMGENNTLVWKYA (SEQ ID NO: DAGHVCHLCH (SEQ 2963),VKTCLAGVM ID NO: 2942) (SEQ ID NO: 2964) EGFR c.1793G>C p.G598A GRGPDNCIQCAHYIDG CVKTCPAAV (SEQ ID GBM PHCVKTCPA[p.G598 NO: A]AVMGENNTLVWKYA 2965),VKTCPAAVM DAGHVCHLCHPN (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2943) 2966),AVMGENNTL (SEQ ID NO: 2967),AVMGENNTLV (SEQ ID NO: 2968),CVKTCPAAVM (SEQ ID NO: 2969),AAVMGENNTL (SEQ ID NO: 2970) EGFR c.1793G>T p.G598V GRGPDNCIQCAHYIDG CVKCPAVV (SEQ ID GBM PHCVKTCPA[p.G598 NO: V]VVMGENNTLVWKYA 2971),VKTCPAVVM DAGHVCHLCHPN (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2944) 2972),VVMGENNTLV (SEQ ID NO: 2973),CVKTCPAVVM (SEQ ID NO: 2974) EGFR c.185T>G p.162R KLTQLGTFEDHFLSLQ MFNNCEVVR (SEQ ID GBM RMFNNCLVV[p.L62R NO: ]RGNLEITYVQRNYDL 2975),EVVRGNLEI SFLKTQEVAG (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2945) 2976),VRGNLETTY (SEQ ID NO: 2977),RMFNNCEVVR (SEQ ID NO: 2978),VVRGNLEITY (SEQ ID NO: 2979),CEVVRGNIE (SEQ ID NO: 2980) EGFR c.2125G>A p.E709K QERELVEPLTPSGEAP RILKKTEFK (SEQ ID GBM
Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer NQALLRILK[p.E709 NO: K]KTEFKKIKVLGSGA 2981),ILKKTEFKK FGTVYKGLWIP (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2946) 2982),QALLRILKK (SEQ ID NO: 2983),LRILKTEF (SEQ ID NO: 2984),RILKKTEFKK (SEQ ID NO: 2985),NQALLRILKK (SEQ ID NO: 2986),LLRLKKTEF (SEQ ID NO: 2987) EGFR c.2156G>C p.G719A PSGEAPNQALLRILKE ASGAFGTVY (SEQ ID LUAD TEFKKIKVL[p.G719 NO: A]ASGAFGTVYKGLWI 2988),VLASGAFGT PEGEKVKIPVAI (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2947) 2989),LASAFGTY (SEQ ID NO: 2990),KIKVLASGA (SEQ ID NO: 2991),KVLASGAFG (SEQ ID NO: 2992),IKVLASGAF (SEQ ID NO: 2993),KKIKVLASG (SEQ ID NO: 2994),VLASG (SEQ ID NO: 2995),VLASGAFGTV (SEQ ID NO: 2996),ASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 2997),KIKVLASGAF (SEQ ID NO: 2998),LASGAFGTVY (SEQ ID NO: 2999),KKIKVLASGA (SEQ ID NO: 3000),TEFKKIKVIA (SEQ ID NO: 3001) EGFR c.2235, p.ELREA746de GAFGTVYKGLWIPEGE AIKTSPKANK (SEQ ID LUAD
Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer 2249> | I ("ELREA" KVKIPVAIK[p.ELRE NO: GGAATTAAGAGA revelado A745del]TSPKANKE 3002),KVKIPVAIKT AGC (SEQ ID como SEQ ID ILDEAYVMASVDNPHV (SEQ ID NO: NO: 3820) NO: 3821) CRLLGICLTSTVQLIT 3003),KTSPKANKEI (SEQ ID NO: 2948) (SEQ ID NO: 3004) ("ELREA" revelado como SEQ ID NO: 3822) EGFR c.2303G>T p.S768I AIKELREQATSPKANK MAIVDNPHV (SEQ ID LUAD EILDEAYVMA[p.S76 NO: 8I]IVDNPHVCRLLGI 3005),VMAIVDNPH CLTSTVQLITQLM (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2949) 3006),DEAYVMAIV (SEQ ID NO: 3007),LDEAYYMAI (SEQ ID NO: 3008),RDEAYVMAI (SEQ ID NO: 3009),VMAIVDNPHV (SEQ ID NO: 3010),AIVDNPHVCR (SEQ ID NO: 3011),YVMAIVDNPH (SEQ ID NO: 3012),DEAYVMAIVD (SEQ ID NO: 3013) EGFR c.2512C>A p.L838M YLLNVVCVQLAKGMNY RLVHRDMAA (SEQ ID KIRC LEDRRLVHRD[p.L83 NO: 8M]MAARNVLVKTPQH 3014),DMAARNVLV VKITDFGLAKLLG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2950) 3015),MAARNVLVK (SEQ ID NO: 3016),LVHRDMARR (SEQ ID NO: 3017),RDMAARNVL (SEQ ID NO: 3018),RLVHRDMAAR (SEQ ID NO: 3019),DMAARNVLVK (SEQ ID NO: 3020),HRDMAARNVL (SEQ ID NO:
Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer 3021),RDMAARNVLV (SEQ ID NO: 3022) EGFR c.2573T>G p.L858R LVHRDLAARNVLVKTP KITDGRAK (SEQ ID LUAD QHIVKITDEG[p.L85 NO: 8R]RAKLGAEEKEYHA 3023),HVKITDFGR FGGRVPIKWMAL (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2951) 3024),FGRAKLLGA (SEQ ID NO: 3025),HVKITDFGRA (SEQ ID NO: 3026),RAKLIGAEEK (SEQ ID NO: 3027) EGFR c.2582T>A p.L861Q RDLAARNVLVKTPQHV LAKQLGAEEK (SEQ ID LUSC RITDFGLAK[p.L861 NO: Q]QLGAEEKEYHAEGG 3028),KQLGAEEKEY KVPIKWMALES (SEQ (SEQ ID NO: 3029) ID NO: 2952) EGFR c.323G>A p.R108K QEVAGYVLIALNTVER QHKGNMYY (SEQ ID GBM IPLENLQAIE[p.R10 NO: 3030),LQHKGNMY 8K]KGNMYYENSYALV (SEQ ID NO: LSNYDANKTGLK (SEQ 3031),LQHKGNMYY ID NO: 2953) (SEQ ID NO: 3032),KGNMYYENSY (SEQ ID NO: 3033) EGFR c.754C>T p.R252C SPSDECLMNQCAAGEI RESDCLVCC (SEQ ID GBM GPNESDLVC[p.R252 NO: 3034) C]CKFRDEATCKDTCP PLMLYNPTTYQM (SEQ ID NO: 2954) EGFR c.865G>A p.A289T CPPLMLYNPTTYQMDV YSFGTTCVK (SEQ ID GBM NPEGKYSFG[p.A289 NO: T]TTCVKKCPRNYVVT 3035),TTCVKKCPR DHGSCVRACGAD (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2955) 3036),GKYSFGTTC (SEQ ID NO: 3037),YSFGTTCVKK (SEQ ID NO: 3038),KYSFGTTCVK (SEQ ID NO: 3039),GTTCVKKCPR (SEQ ID NO:
Contexto de Mutação Sequência de Gene Nucleotídeo (aminoácido) Mutação Neopeptídeos Câncer 3040),GKYSFGTTCV (SEQ ID NO: 3041) EGFR c.866C>A p.A289D CPPLMLYNPTTYQMDV YSFGDTCVK (SEQ ID GBM NPEGKYSFG[p.A289 NO: D]DTCVKKCPRNYVVT 3042),DTCVKKCPR DHGSCVRACGAD (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2956) 3043),GKYSFGDTC (SEQ ID NO: 3044),YSFGDTCVKK (SEQ ID NO: 3045),KYSFGTCVK (SEQ ID NO: 3046),GKYSFGDTCV (SEQ ID NO: 3047) EGFR c.866C>T p.A289V CPPLMLYNPTTYQMDV YSFGVTCVK (SEQ ID GBM NPEGKYSFG[p.A289 NO: V]VTCVKKCPRNYVVT 3048),KYSFGVTCV DHGSCVRACGAD (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 2957) 3049),VTCVKKCPR (SEQ ID NO: 3050),GKYSFGVTC (SEQ ID NO: 3051),YSFGVTCVKK (SEQ ID NO: 3052),KYSFGVTCVK (SEQ ID NO: 3053),GVTCVKKCPR (SEQ ID NO: 3054),GKYSFGVTCV (SEQ ID NO: 3055) EGFR c.910C>T p.H304Y VNPEGKYSFGATCVKK VVTDYGSCV (SEQ ID GBM ICPRNYVVTD[p.H30 NO: 4Y]YGSCVRACGADSY 3056),YVVTDYGSCV EMEEDGVRKCKKC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2958) 3057),VVTDYGSCVR (SEQ ID NO: 3058),CPRNYVVTDY (SEQ ID NO: 3059)
Tabela 40B.
Mutações de ponto de EGFR exemplificativas em peptídeos mutantes e com câncer
Aminoácido de Neopeptídeos Câncer Alelo mutação (nucleotídeo) EGFRp.L858R FGRAKLLGA Adenocarcinoma HLA.B08.01 (uc003tqk.2) (SEQ ID NO: pulmonar 3060) EGFRp.L858R KITDFGRAK Adenocarcinoma HLA.A03.01 (uc003tqk.2) (SEQ ID NO: pulmonar HLA.A11.01 3061) HLA.A30.01 Tabela 40C. Mutações de ponto de EGFR exemplificativas em peptídeos mutantes e com câncer Mutação Contexto de Neopeptídeos Doença de EGFR Sequência de Mutação EGFR, GICLTSTVQLIM VQLIMQLMPF (SEQ ID NO: T790M QLMPFGCLLDY 3064), STVQLIMQLM (SEQ ID (SEQ ID NO: NO: 3065), QLIMQLMPF (SEQ 3062) ID NO: 3066), MQLMPFGCLL (SEQ ID NO: 3067), LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3068), LTSTVQLIM (SEQ ID NO:
CRC 3069), STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3070), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3071), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3072), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3073), VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3074), CLTSTVQLIM (SEQ ID NO:
Mutação Contexto de Neopeptídeos Doença de EGFR Sequência de Mutação 3075), IMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3076), IMQLMPFGCL (SEQ ID NO: 3077), LIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3078), LIMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3079), QLIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3080) EGFR, SLNITSLGLRSL IIRNRGENSCK (SEQ ID NO: S492R KEISDGDVIISG 3081)
NKNLCYANTINW KKLFGTSGQKTK IIRNRGENSCKA NSCLC, TGQVCHALCSPE PRAD GCWGPEPRDCVS
CRNVSRGRECVD KCNLL (SEQ ID NO: 3063)
Tabela 40D. Mutação de deleção de EGFR exemplificativa, mutações de fusão em câncer Mutação Contexto de Neopeptídeos Doença de EGFR Sequência de Mutação EGFRvIII MRPSGTAGAALLALLAA ALEEKKGNYV (SEQ GBM (deleção LCPASRALEEKK:G:NY ID NO: 3084) interna) VVTDHGSCVRACGADSY
EMEEDGVRKCKKCEGPC
RKVCNGIGIGEFKD (SEQ ID NO: 3082) EGFR:SEP LPQPPICTIDVYMIMVK IQLQDKFEHL (SEQ GBM, Glioma, T14 CWMIDADSRPKFRELII ID NO: 3085) Câncer de EFSKMARDPQRYLVIQ: QLQDKFEHL (SEQ Cabela e :LQDKFEHLKMIQQEEI ID NO: 3086) Pescoço RKLEEEKKQLEGEIIDF QLQDKFEHLK (SEQ YKMKAASEALQTQLSTD ID NO: 3087) (SEQ ID NO: 3083) YLVIQLQDKF (SEQ ID NO: 3088) Nas Tabelas acima, para uma ou mais das fusões exemplificativas, uma sequência anterior ao primeiro “:” pertence a uma sequência de éxons de um polipeptídeo codificado por um primeiro gene, uma sequência que vem após o segundo “:” pertence a uma sequência de éxons de um polipeptídeo codificado por um segundo gene, e um aminoácido que aparece entre os símbolos “:” é codificado por um códon que é divido entre a sequência de éxons de um polipeptídeo codificado por um primeiro gene e a sequência de éxons de um polipeptídeo codificado por um segundo gene.
[0331] No entanto, em algumas modalidades, por exemplo, NAB:STAT6, o éxon NAB é ligado à 5’ UTR de STAT6 e o primeiro aminoácido que aparece após a junção é o códon de partida normal de STAT6 (não há quadro presente nesse sítio (visto que não é normalmente traduzido).
[0332] AR-V7 nas tabelas acima também pode ser considerado, em algumas modalidades, uma variante de splice do gene AR que codifica uma proteína que não possui o domínio de ligação ao ligante encontrado no AR de comprimento total.
[0333] Em algumas modalidades, métodos de sequenciamento são usados para identificar mutações específicas do tumor. Qualquer método de sequenciamento adequado pode ser usado de acordo com a presente revelação, por exemplo, tecnologias de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). Os métodos de Sequenciamento de Terceira Geração podem substituir a tecnologia NGS no futuro para acelerar a etapa de sequenciamento do método. Para fins de esclarecimento: os termos "Sequenciamento de Próxima Geração" ou "NGS" no contexto da presente revelação significam todas as novas tecnologias de sequenciamento de alto rendimento que, em contraste com a metodologia de sequenciamento "convencional" conhecida como química de Sanger, leem modelos de ácido nucleico aleatoriamente em paralelo ao longo de todo o genoma, quebrando todo o genoma em pequenos pedaços. Essas tecnologias NGS (também conhecidas como tecnologias de sequenciamento maciçamente paralelas) são capazes de entregar informações de sequência de ácidos nucleicos de um genoma completo, exoma, transcriptoma (todas as sequências transcritas de um genoma) ou metiloma (todas as sequências metiladas de um genoma) em períodos de tempo muito curtos,
por exemplo, em 1-2 semanas, por exemplo, em 1-7 dias ou em menos de 24 horas e permitem, em princípio, abordagens de sequenciamento de célula única. Múltiplas plataformas NGS que estão comercialmente disponíveis ou que são mencionadas na literatura podem ser usadas no contexto da presente revelação, por exemplo, aquelas descritas em detalhes no documento WO 2012/159643.
[0334] Em certas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode compreender, porém sem limitação, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800, cerca de 900, cerca de 1.000, cerca de 1.500, cerca de 2.000, cerca de 2.500, cerca de 3.000, cerca de 4.000, cerca de 5.000, cerca de
7.500, cerca de 10.000 aminoácidos ou mais resíduos de aminoácido, e qualquer faixa derivável nos mesmos. Em modalidades específicas, uma molécula de peptídeo não antigênico é igual ou menor que 100 aminoácidos.
[0335] Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter cerca de 8 e cerca de 50 resíduos de aminoácido de comprimento, ou de cerca de 8 e cerca de 30, de cerca de 8 e cerca de 20, de cerca de 8 e cerca de 18, de cerca de 8 e cerca de 15, ou de cerca de 8 e cerca de 12 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter cerca de 8 e cerca de 500 resíduos de aminoácido de comprimento, ou de cerca de 8 e cerca de 450, de cerca de 8 e cerca de 400, de cerca de 8 e cerca de 350, de cerca de 8 e cerca de 300, de cerca de 8 e cerca de 250, de cerca de 8 e cerca de 200, de cerca de 8 e cerca de 150, de cerca de 8 e cerca de 100, de cerca de 8 e cerca de 50, ou de cerca de 8 e cerca de 30 resíduos de aminoácido de comprimento.
[0336] Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter no máximo de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou menos resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter no máximo de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou menos resíduos de aminoácido de comprimento.
[0337] Em algumas modalidades, os peptídeos tem um comprimento total de pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450 ou pelo menos 500 aminoácidos.
[0338] Em algumas modalidades, os peptídeos têm um comprimento total de no máximo de 8, no máximo de 9, no máximo de 10, no máximo de 11, no máximo de 12, no máximo de 13, no máximo de 14, no máximo de 15, no máximo de 16, no máximo de 17, no máximo de 18, no máximo de 19, no máximo de 20, no máximo de 21, no máximo de 22, no máximo de 23, no máximo de 24, no máximo de 25, no máximo de 26, no máximo de 27, no máximo de 28, no máximo de 29, no máximo de 30, no máximo de 40, no máximo de 50, no máximo de 60, no máximo de 70, no máximo de 80, no máximo de 90, no máximo de 100, no máximo de 150, no máximo de 200, no máximo de 250, no máximo de 300, no máximo de 350, no máximo de 400, no máximo de 450, ou no máximo de 500 aminoácidos.
[0339] Um peptídeo maior pode ser projetado de várias maneiras. Em algumas modalidades, quando os peptídeos de ligação a HLA são previstos ou conhecidos, um peptídeo mais longo compreende (1) peptídeos de ligação individuais com extensões de 2-5 aminoácidos em direção às terminações N e C de cada produto de gene correspondente; ou (2) uma concatenação de alguns ou todos os peptídeos de ligação com sequências estendidas para cada um. Em outras modalidades, quando o sequenciamento revela uma sequência de neoepítopo longa (> 10 resíduos) presente no tumor (por exemplo, devido a um deslocamento de quadro de leitura, leitura direta ou inclusão de íntron que leva a uma nova sequência de peptídeo), um peptídeo mais longo poderia consistir na extensão inteira de aminoácidos específicos de tumor inovadores como um único peptídeo mais longo ou vários peptídeos mais longos sobrepostos. Em algumas modalidades, o uso de um peptídeo mais longo é presumido para permitir o processamento endógeno por células do paciente e pode levar a uma apresentação de antígeno mais eficaz e indução de respostas de células T. Em algumas modalidades, dois ou mais peptídeos podem ser usados, em que os peptídeos se sobrepões e estão dispostos lado a lado do peptídeo não antigênico longo.
[0340] Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter um valor de pI de cerca de 0,5 a cerca de 12, de cerca de 2 a cerca de 10, ou de cerca de 4 a cerca de 8. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter um valor de pI de pelo menos 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ou mais. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ter um valor de pI de no máximo de 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ou menos.
[0341] Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode estar na solução, ser liofilizado ou pode estar na forma de cristal. Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode ser preparado sinteticamente, por tecnologia de DNA recombinante ou síntese química, ou pode ser isolado de fontes naturais, como tumores nativos ou organismos patogênicos. Os neoepítopos podem ser sintetizados individualmente ou unidos direta ou indiretamente no peptídeo. Embora o peptídeo descrito no presente documento possa ser substancialmente livre de outras proteínas de célula hospedeira de ocorrência natural e fragmentos das mesmas, em algumas modalidades, o peptídeo pode ser sinteticamente conjugado como unido às partículas ou fragmentos nativos.
[0342] Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode ser preparado em uma ampla variedade de maneiras. Em algumas modalidades, os peptídeos podem ser sintetizados em solução ou em um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos são comercialmente disponíveis e podem ser usados de acordo com protocolos conhecidos. Consulte, por exemplo, Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., 1984. Além disso, os peptídeos individuais podem ser unidos usando ligação química para produzir peptídeos maiores que ainda estão dentro dos limites da presente revelação.
[0343] Alternativamente, a tecnologia de DNA recombinante pode ser empregada em que uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo inserido em um vetor de expressão, transformado ou transfectado em uma célula hospedeira apropriada e cultivada sob condições adequadas para expressão. Esses procedimentos são geralmente conhecidos na técnica, como descrito genericamente em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA. (1989). Desse modo, peptídeos recombinantes, que compreendem um ou mais peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento, podem ser usados para apresentar o epítopo de célula T apropriado.
[0344] Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por um gene com uma mutação de ponto resultando em uma substituição de aminoácido do peptídeo nativo. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por um gene com uma mutação de ponto resultando em mutação de deslocamento de quadro de leitura. Um deslocamento de quadro de leitura ocorre quando uma mutação interrompe a fase normal de uma periodicidade de códon de gene (também conhecida como “quadro de leitura”), resultando na translação de uma sequência de proteína não nativa. É possível que diferentes mutações em um gene alcancem o mesmo quadro de leitura alterado. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por um gene com uma mutação resultando em polipeptídeo de fusão, deleção em quadro, inserção, expressão de polipeptídeos retrovirais endógenos e superexpressão de tumor específico de polipeptídeos. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por uma fusão de um primeiro gene com um segundo gene. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por uma fusão em quadro de um primeiro gene com um segundo gene. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por uma fusão de um primeiro gene com um éxon de uma variante de splice do primeiro gene. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por uma fusão de um primeiro gene com um éxon críptico do primeiro gene. Em algumas modalidades, o peptídeo é codificado por uma fusão de um primeiro gene com um segundo gene, em que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma das sequências de quadro resultantes da fusão.
[0345] Em alguns aspectos, a presente revelação fornece uma composição que compreende pelo menos dois ou mais que dois peptídeos. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento contém pelo menos dois peptídeos distintos. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento contém um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos são derivados da mesma proteína. Os pelo menos dois peptídeos distintos podem variar em seu comprimento, sua sequência de aminoácidos ou ambos. Os peptídeos podem ser derivados de qualquer proteína conhecida ou foram encontrados para conter uma mutação de tumor específico. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da mesma proteína, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreende pelo menos um aminoácido da segunda região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma mutação de sítio de splice, uma mutação de deslocamento de quadro de leitura, uma mutação de leitura direta, uma mutação de fusão de gene e qualquer combinação das mesmas.
[0346] Em algumas modalidades, o peptídeo pode ser derivado de uma proteína com uma mutação de substituição, por exemplo, a mutação de KRAS G12C, G12D, G12V, Q61H ou Q61L, ou a mutação de NRAS Q61K ou Q61R, ou mutação de BTK C481S ou mutação de EGFR S492R ou mutação de EGFR T490M. A substituição pode ser posicionada em qualquer parte ao longo do comprimento do peptídeo. Por exemplo, a mesma pode estar localizada no terceiro N terminal do peptídeo, o terceiro central do peptídeo ou o terceiro C terminal do peptídeo. Em outra modalidade, o resíduo substituído está localizado a 2- 5 resíduos longe da extremidade do N-terminal ou 2-5 resíduos longe da extremidade do C-terminal. Os peptídeos podem ser derivados de modo similar de mutações de inserção específica de tumor em que o peptídeo compreende um ou mais, ou todos os resíduos inseridos.
[0347] Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo compreende pelo menos uma mutação adicional. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional não é uma mutação no primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional é uma mutação no primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo compreende pelo menos uma mutação adicional. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional não é uma mutação no segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, uma ou mais dentre a pelo menos uma mutação adicional é uma mutação no segundo neoepítopo.
[0348] Em alguns aspectos, a presente revelação fornece uma composição que compreende um polipeptídeo único que compreende o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo, ou um polinucleotídeo único codifica o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo. Em algumas modalidades, a composição fornecida no presente documento compreende um ou mais peptídeos adicionais, em que o um ou mais peptídeos adicionais compreendem um terceiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo e o segundo peptídeo são codificados por uma sequência transcrita a partir do mesmo sítio de início de transcrição. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é codificado por uma sequência transcrita a partir de um primeiro sítio de início de transcrição e o segundo peptídeo é codificado por uma sequência transcrita a partir de um segundo sítio de início de transcrição. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um comprimento de pelo menos 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900;
1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 7.500; ou
10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma primeira sequência com pelo menos 60 %, 61 %,
62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem; e uma segunda sequência com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma primeira sequência de pelo menos 8 ou 9 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem; e uma segunda sequência de pelo menos 16 ou 17 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0349] Em algumas modalidades, o segundo peptídeo é maior que o primeiro peptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo é maior que o segundo peptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo tem um comprimento de pelo menos 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900;
1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000; 7.500; ou
10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo tem um comprimento de pelo menos 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 600; 700; 800; 900; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 4.000; 5.000;
7.500; ou 10.000 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo compreende uma sequência de pelo menos 9 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade para um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo compreende uma sequência de pelo menos 17 aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0350] Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo, o segundo peptídeo ou ambos compreendem pelo menos uma sequência de flanqueamento, em que a pelo menos uma sequência de flanqueamento é a montante ou a jusante do neoepítopo. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento tem pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com uma correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento compreende uma sequência do tipo não selvagem. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento é uma sequência de flanqueamento de terminação N. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento é uma sequência de flanqueamento de terminação C. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de flanqueamento do primeiro peptídeo tem pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência para a pelo menos uma sequência de flanqueamento do segundo peptídeo. Em algumas modalidades, a pelo menos uma região de flanqueamento do primeiro peptídeo é diferente da a pelo menos uma região de flanqueamento do segundo peptídeo. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo de flanqueamento compreende a mutação.
[0351] Em algumas modalidades, o peptídeo não antigênico com as sequências de flanqueamento compreende um polipeptídeo, que pode ser representado por uma fórmula (N- terminal Xaa)N-(XaaBTK)P-(Xaa-C terminal)C, em que (XaaBTK)P é uma sequência de peptídeos BTK mutantes que compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína BTK mutante, P é um número inteiro maior que 7; N é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa de N-terminal)N é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína mutante; C é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa-C terminal)C é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína BTK mutante; e, tanto N e C não são 0.
[0352] Em algumas modalidades, o peptídeo não antigênico com as sequências de flanqueamento compreende um polipeptídeo, que pode ser representado por uma fórmula (N- terminal Xaa)N-(XaaEGFR)P-(Xaa-C terminal)C, em que (XaaEGFR)P é uma sequência de peptídeos EGFR mutantes que compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína EGFR mutante, P é um número inteiro maior que 7; N é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa de N-terminal)N é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína EGFR mutante; C é (i) 0 ou (ii) um número inteiro maior que 2; (Xaa-C terminal)C é qualquer sequência de aminoácidos heteróloga à proteína EGFR mutante; e, tanto N e C não são
0.
[0353] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos mutantes. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante; pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante; e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante.
[0354] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de peptídeos neoantigênicos descrita nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos descrita nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante
(aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos mutantes (aminoácidos sublinhados) como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de peptídeos neoantigênicos descrita nas Tabelas 34 ou 36. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de BTK de neoepítopos descrita nas Tabelas 34 ou 36. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 34 ou 36. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos mutantes.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos um aminoácido em negrito como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 1 ou 2. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado), pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante, e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 1 ou 2.
[0355] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 34 ou 36. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante, e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 34 ou 36.
[0356] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de peptídeos neoantigênicos descrita nas Tabelas 40A-40D, 32 ou 3A-3D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de EGFR de neoepítopos descrita nas Tabelas 40A-40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 40A- 40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos mutantes (por exemplo, um aminoácido sublinhado em qualquer uma das Tabelas 40A-40D). Em algumas modalidades, um peptídeo de EGFR compreende uma sequência de neoepítopos que compreende pelo menos um aminoácido mutante descrito em negrito como descrito nas Tabelas 40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes como descrito nas Tabelas 40A-
40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (por exemplo, aminoácido sublinhado na Tabela 40C) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 40A-40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 40A-40D. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado), pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a montante de pelo menos um aminoácido mutante, e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos não mutantes a jusante de pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 40A-40D.
[0357] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %,
70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0358] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0359] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2 e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2 e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0360] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2 e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2 e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 1 ou 2, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0361] Em algumas modalidades, um peptídeo BTK compreendem uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 34 ou 36 e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 34 ou 36 e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 34 ou 36, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0362] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 34 ou 36, e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito na Tabela 34 ou 36 e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito na Tabela 34 ou 36, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %,
72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0363] Os peptídeos neoantigênicos exemplificativos que correspondem à mutação C481S são apresentados na Tabela 34. A Tabela também fornece uma lista de alelos HLA, cujos produtos de proteína codificada podem se ligar aos peptídeos. Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação C481S é:
MIKEGSMSEDEFIEEAKVMMNLSHEKLVQLYGVCTKQRPIFIITEYMANGSLLNYLREM RHRFQTQQLLEMCKDVCEAMEYLESKQFLHRDLAARNCLVND (SEQ ID NO: 3089). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ANGSLLNY (SEQ ID NO: 3090). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ANGSLLNYL (SEQ ID NO: 3091). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 3092). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de EYMANGSL (SEQ ID NO: 3093). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de EYMANGSLLN (SEQ ID NO: 3094). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de EYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 3095). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de GSLLNYLR (SEQ ID NO: 3096). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de GSLLNYLREM (SEQ ID NO: 3097). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ITEYMANGS (SEQ ID NO: 3098). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ITEYMANGSL (SEQ ID NO: 3099). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de ITEYMANGSLL (SEQ ID NO: 3100). MANGSLLNYL (SEQ ID NO: 3101). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de MANGSLLNYLR (SEQ ID NO: 3102). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de NGSLLNYL (SEQ ID NO: 3103). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de NGSLLNYL (SEQ ID NO: 3104). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de SLLNYLREMR
(SEQ ID NO: 3105). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de TEYMANGSLL (SEQ ID NO: 3106); TEYMANGSLLNY (SEQ ID NO: 3107). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de C481S BTK compreende uma sequência de neoepítopos de YMANGSLL (SEQ ID NO: 3108).
[0364] Em algumas modalidades, um peptídeo de EGFR compreendem uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 40A-40D e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 40A-40D e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante como descrito nas Tabelas 40A-40D, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0365] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 40A-40D e uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 40A-40D e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma sequência de neoepítopos derivada de uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido mutante (aminoácido sublinhado) como descrito nas Tabelas 40A-40D, uma sequência a montante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem, e uma sequência a jusante de pelo menos um aminoácido mutante que compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %,
74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um correspondente da sequência do tipo selvagem.
[0366] Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de GICLTSTVQLIMQLMPFGCLLDY (SEQ ID NO: 3109). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de VQLIMQLMPF (SEQ ID NO: 3110). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3111). Em algumas modalidades, um peptídeo EGFR mutante que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 3112). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de MQLMPFGCLL (SEQ ID NO: 3113). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3114). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3115). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3116). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3117). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3118). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3119). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3120). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de CLTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3121). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de IMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3122). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de IMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3123). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de IMQLMPFGCL (SEQ ID NO: 3124). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3125). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LIMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3126). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de QLIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3127).
[0367] Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR, S492R compreende uma sequência de
SLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIIRNRGENSCK ATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLL (SEQ ID NO: 3128). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR S492R compreende uma sequência de neoepítopos de IIRNRGENSCK (SEQ ID NO: 3129).
[0368] Em algumas modalidades, um neopeptídeo de EGFR é selecionado a partir da Tabela 40A-40D.
[0369] Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de deleção em EGFR, como deleção de G em EGFRvIII (deleção interna), MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK:G:NYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVR KCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD (SEQ ID NO: 3130), compreende uma sequência de neoepítopos de ALEEKKGNYV (SEQ ID NO: 3131).
[0370] Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação descrita na sequência: LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEH LKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD (SEQ ID NO: 3132), compreende uma sequência de neoepítopos de IQLQDKFEHL (SEQ ID NO: 3133). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação descrita na sequência: LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEH LKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD (SEQ ID NO: 3134), compreende uma sequência de neoepítopos de QLQDKFEHL (SEQ ID NO: 3135). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação descrita na sequência: LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEH LKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD (SEQ ID NO: 3136), compreende uma sequência de neoepítopos de QLQDKFEHLK (SEQ ID NO: 3137). Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação descrita na sequência: LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEH LKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD (SEQ ID NO: 3138), compreende uma sequência de neoepítopos de Modificação de Peptídeo
[0371] Em algumas modalidades, a presente revelação inclui peptídeos modificados. Uma modificação pode incluir uma modificação química covalente que não altera a sequência de aminoácidos primária do próprio peptídeo antigênico. As modificações podem produzir peptídeos com as propriedades desejadas, por exemplo, prolongando a meia-vida in vivo, aumentando a estabilidade, reduzindo a depuração, alterando a imunogenicidade ou alergenicidade, permitindo o aumento de anticorpos particulares, direcionamento celular, absorção de antígeno, processamento de antígeno, afinidade de HLA, estabilidade de HLA ou apresentação de antígeno. Em algumas modalidades, um peptídeo pode compreender uma ou mais sequências que aumentam o processamento e a apresentação de epítopos por APCs, por exemplo, para a geração de uma resposta imune.
[0372] Em algumas modalidades, o peptídeo pode ser modificado para fornecer os atributos desejados. Por exemplo, a capacidade dos peptídeos para induzir a atividade de CTL pode ser aumentada pela ligação a uma sequência que contém pelo menos um epítopo que é capaz de induzir uma resposta de células T auxiliares. Em algumas modalidades, os conjugados de peptídeos imunogênicos/auxiliares T são ligados por uma molécula espaçadora. Em algumas modalidades, um espaçador compreende moléculas neutras relativamente pequenas, como aminoácidos ou miméticos de aminoácido, que são substancialmente descarregados em condições fisiológicas. Os espaçadores podem ser selecionados a partir de, por exemplo, Ala, Gly ou outros espaçadores neutros de aminoácidos não polares ou aminoácidos polares neutros. Será entendido que o espaçador opcionalmente presente não precisa ser composto pelos mesmos resíduos e, portanto, pode ser um hetero ou homo-oligômero. O peptídeo neoantigênico pode ser ligado ao peptídeo T auxiliar diretamente ou através de um espaçador na terminação amino ou carboxila do peptídeo. A terminação amino do peptídeo neoantigênico ou do peptídeo T auxiliar pode ser acilada. Exemplos de peptídeos T auxiliares incluem resíduos de toxoide tetânico 830-843, resíduos de influenza 307-319 e resíduos de circunsporozoíta de malária 382-398 e resíduos 378-389.
[0373] As sequências de peptídeos da presente revelação podem ser opcionalmente alteradas por meio de alterações no nível do DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o peptídeo em bases pré-selecionadas de modo que sejam gerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados.
[0374] Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode conter substituições para modificar uma propriedade física (por exemplo, estabilidade ou solubilidade) do peptídeo resultante. Por exemplo, os peptídeos podem ser modificados pela substituição de uma cisteína (C) por ácido α-amino butírico ("B"). Devido à sua natureza química, a cisteína tem a tendência de formar pontes de dissulfeto e alterar suficientemente o peptídeo estruturalmente de modo a reduzir a capacidade de ligação. Substituir o ácido α-amino butírico por C não só alivia esse problema, mas na verdade melhora a capacidade de ligação e de ligação cruzada em certos casos. A substituição de cisteína com ácido α-amino butírico pode ocorrer em qualquer resíduo de um peptídeo neoantigênico, por exemplo, nas posições âncora ou não âncora de um epítopo ou análogo dentro de um peptídeo, ou em outras posições de um peptídeo.
[0375] O peptídeo também pode ser modificado pela extensão ou diminuição da sequência de aminoácidos do composto, por exemplo, pela adição ou deleção de aminoácidos. Os peptídeos ou análogos também podem ser modificados alterando-se a ordem ou composição de certos resíduos. Será apreciado pelo elemento versado na técnica que certos resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade biológica, por exemplo, aqueles em sítios de contato críticos ou resíduos conservados, podem geralmente não ser alterados sem um efeito adverso na atividade biológica. Os aminoácidos não críticos não precisam ser limitados aos que ocorrem naturalmente em proteínas, como L-α-aminoácidos, mas podem incluir aminoácidos não naturais também, como D-isômeros, β- γ-δ-aminoácidos, bem como muitos derivados de L-α- aminoácidos.
[0376] Em algumas modalidades, o peptídeo pode ser modificado usando uma série de peptídeos com substituições de aminoácido único para determinar o efeito da carga eletrostática, hidrofobicidade, etc. na ligação de HLA. Por exemplo, uma série de substituições de aminoácidos carregados positivamente (por exemplo, Lys ou Arg) ou carregados negativamente (por exemplo, Glu) podem ser feitas ao longo do comprimento do peptídeo, revelando diferentes padrões de sensibilidade para várias moléculas de HLA e receptores de células T. Além disso, podem ser empregues múltiplas substituições usando porções pequenas e relativamente neutras, como Ala, Gly, Pro ou resíduos similares. As substituições podem ser homo-oligômeros ou hetero-oligômeros. O número e os tipos de resíduos que são substituídos ou adicionados dependem do espaçamento necessário entre os pontos de contato essenciais e certos atributos funcionais que são procurados (por exemplo, hidrofobicidade versus hidrofilicidade). A afinidade de ligação aumentada para uma molécula de HLA ou receptor de células T também pode ser alcançada por tais substituições, em comparação com a afinidade do peptídeo parental. Em qualquer caso, tais substituições devem empregar resíduos de aminoácidos ou outros fragmentos moleculares escolhidos para evitar, por exemplo, a interferência estérica e de carga que pode interromper a ligação. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos. Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação dos mesmos podem ser combinadas para chegar a um peptídeo final.
[0377] Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode compreender miméticos de aminoácido ou resíduos de aminoácidos não naturais, por exemplo, D- ou L-nafilalanina; D- ou L-fenilglicina; D- ou L-2- tieneilalanina; D- ou L-1, -2, 3-, ou 4-pirenoilalanina; D- ou L-3 tienoilalanina; D- ou L-(2-piridinil)-alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina; D- ou L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)- fenilglicina; D-(trifluoro-metil)-fenilalanina; D-ρ- fluorofenilalanina; D- ou L-ρ-bifenil-fenilalanina; D- ou L- ρ-metoxibifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol(alil)alaninas; e, D- ou L-alquilalaninas, em que o grupo alquila podem ser uma metila substituída ou não substituída, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-butila, sec- isotila, iso-pentila ou resíduos de aminoácido não ácidos. Os anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila e piridila. Os peptídeos modificados que possuem várias miméticos de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos não naturais podem ter estabilidade aumentada in vivo. Esses peptídeos também podem ter uma meia-vida melhorada ou propriedades de fabricação melhorada.
[0378] Em algumas modalidades, um peptídeo descrito no presente documento pode ser modificado por acilação de terminal-NH2, por exemplo, por acetilação de alcanoila (C1- C20) ou acetilação de tioglicolila, amidação de terminal carboxila, por exemplo, amônia, metilamina, etc. Em algumas modalidades, essas modificações podem fornecer sítios de ligação a um suporte ou outra molécula. Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode conter modificações, como, porém sem limitação, a glicosilação, oxidação de cadeia lateral, biotinilação, fosforilação, adição de um material ativo em superfície, por exemplo, um lipídio, ou pode ser quimicamente modificado, por exemplo, acetilação, etc. Além disso, as ligações no peptídeo podem ser diferentes das ligações peptídicas, por exemplo, ligações covalentes, ligações de éster ou éter, ligações de dissulfeto, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, etc.
[0379] Em algumas modalidades, um peptídeo descrito no presente documento pode compreender carreadores, como aqueles bem conhecidos na técnica, por exemplo, tireoglobulina, albuminas, como albumina sérica humana, toxoide do tétano, resíduos de poliaminoácidos, como poli L- lisina e ácido poli L-glutâmico, proteínas do vírus influenza, proteína do núcleo do vírus da hepatite B e similares.
[0380] Os peptídeos podem ser adicionalmente modificados para conter frações químicas adicionais que normalmente não fazem parte de uma proteína.
Essas frações derivatizadas podem melhorar a solubilidade, a meia-vida biológica, a absorção da proteína ou a afinidade de ligação.
As porções também podem reduzir ou eliminar quaisquer efeitos colaterais desejáveis dos peptídeos e similares.
Uma visão geral dessas frações pode ser encontrada em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, EUA (2000). Por exemplo, peptídeos neoantigênicos que têm a atividade desejada podem ser modificados conforme necessário para fornecer certos atributos desejados, por exemplo, características farmacológicas melhoradas, enquanto aumenta ou pelo menos retém substancialmente toda a atividade biológica do peptídeo não modificado para se ligar à molécula de HLA desejada e ativar a célula T apropriada.
Por exemplo, o peptídeo pode estar sujeito a várias alterações, como substituições, conservativas ou não conservativas, em que tais alterações podem fornecer certas vantagens em seu uso, como uma ligação de HLA melhorada.
Essas substituições conservativas podem abranger a substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo de aminoácido que seja biológica e/ou quimicamente semelhante, por exemplo, um resíduo hidrofóbico por um outro ou um resíduo polar para um outro.
O efeito das substituições de um único aminoácido também pode ser investigado usando D-aminoácidos.
Tais modificações podem ser feitas usando procedimentos de síntese de peptídeos bem conhecidos, como descrito em, por exemplo, Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany &
Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); e Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2ª Ed. (1984).
[0381] Em algumas modalidades, o peptídeo descrito no presente documento pode ser conjugado macromoléculas grandes e metabolizadas lentamente, como proteínas; polissacarídeos, como sefarose, agarose, celulose, microesferas de celulose; aminoácidos poliméricos, como ácido poliglutâmico, polilisina; copolímeros de aminoácido; partículas de vírus inativado; toxinas bacterianas inativadas, como toxoide da difteria, tétano, cólera, moléculas de leucotoxina; bactéria inativada; e células dendríticas.
[0382] Alterações no peptídeo que podem incluir, porém sem limitação, a conjugação a uma proteína carreadora, conjugação a um ligante, conjugação a um anticorpo, PEGilação, polissialilação HESilação, miméticos de PEG recombinantes, fusão de Fc, fusão de albumina, fixação de nanopartículas, encapsulamento de nanoparticulado, fusão de colesterol, fusão de ferro, acilação, amidação, glicosilação, oxidação da cadeia lateral, fosforilação, biotinilação, adição de um material ativo em superfície, adição de miméticos de aminoácidos ou adição de aminoácidos não naturais.
[0383] A glicosilação pode afetar as propriedades físicas das proteínas e também pode ser importante na estabilidade, secreção e localização subcelular das proteínas. A glicosilação apropriada pode ser importante para atividade biológica. Na verdade, alguns genes de organismos eucarióticos, quando expressos em bactérias (por exemplo, E.
coli) que não possuem processos celulares para glicosilação de proteínas, produzem proteínas que são recuperadas com pouca ou nenhuma atividade em virtude de sua falta de glicosilação. A adição de locais de glicosilação pode ser realizada alterando-se a sequência de aminoácidos. A alteração para o peptídeo ou proteína pode ser feita, por exemplo, pela adição de ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina (para sítios de glicosilação ligada em O) ou resíduos de asparagina (para sítios de glicosilação ligada em N). As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo podem ser diferentes. Um tipo de açúcar comumente encontrado em ambos é o ácido N- acetilneuramínico (doravante no presente documento denominado ácido siálico). O ácido siálico é geralmente o resíduo terminal de oligossacarídeos ligados tanto em N quanto e O e, em virtude de sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas à glicoproteína. As modalidades da presente revelação compreendem a geração e o uso de variantes de N-glicosilação. A remoção de carboidratos pode ser realizada química ou enzimaticamente, ou por substituição de códons que codificam resíduos de aminoácidos que são glicosilados. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas, e a clivagem enzimática de frações de carboidratos em polipeptídeos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo e exoglicosidases.
[0384] Componentes e moléculas adicionais adequados para conjugação incluem, por exemplo, moléculas para direcionamento para o sistema linfático, tireoglobulina; albuminas, como albumina sérica humana (HAS); toxoide tetânico; toxoide diftérico; Poliaminoácidos, como poli(D- lisina:ácido D-glutâmico); VP6 polipeptídeos de rotavírus; hemaglutinina do vírus influenza, nucleoproteína do vírus influenza; Hemocianina de Lapa de Fechadura (KLH); e proteína de núcleo de vírus da hepatite B e antígeno de superfície; ou qualquer combinação dos anteriores.
[0385] Outro tipo de modificação consiste em conjugar (por exemplo, ligar) um ou mais componentes ou moléculas adicionais na terminação N e/ou C de uma sequência polipeptídica, como uma outra proteína (por exemplo, uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos heteróloga à proteína em questão) ou uma molécula carreadora. Assim, uma sequência polipeptídica exemplificativa pode ser fornecida como um conjugado com um outro componente ou molécula. Em algumas modalidades, a fusão de albumina com o peptídeo ou proteína da presente revelação pode, por exemplo, ser alcançada por manipulação genética, de modo que o DNA que codifica HSA, ou um fragmento do mesmo, seja unido ao DNA que codifica uma ou mais sequências polipeptídicas. Posteriormente, um hospedeiro adequado pode ser transformado ou transfectado com as sequências de nucleotídeos fundidas na forma de, por exemplo, um plasmídeo adequado, de modo a expressar um polipeptídeo de fusão. A expressão pode ser efetuada in vitro a partir de, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas ou in vivo a partir de, por exemplo, um organismo transgênico. Em algumas modalidades da presente revelação, a expressão da proteína de fusão é realizada em linhagens celulares de mamíferos, por exemplo, linhagens celulares de CHO. Além disso, a própria albumina pode ser modificada para estender sua meia-vida circulante.
A fusão da albumina modificada em um ou mais polipeptídeos pode ser alcançada pelas técnicas de manipulação genética descritas acima ou por conjugação química; a molécula de fusão resultante tem uma meia-vida que excede a das fusões com albumina não modificada (consulte, por exemplo, o documento WO2011/051489). Várias estratégias de ligação de albumina foram desenvolvidas como alternativas para a fusão direta, incluindo a ligação de albumina através de uma cadeia de ácido graxo conjugada (acilação). Devido ao fato de que a albumina sérica é uma proteína de transporte de ácidos graxos, esses ligantes naturais com atividade de ligação de albumina foram usados para prolongar a meia-vida de terapêuticas de pequenas proteínas.
[0386] Componentes e moléculas candidatos adicionais para conjugação incluem aqueles adequados para isolamento ou purificação. Exemplos não limitativos incluem moléculas de ligação, como biotina (par de ligação específica de biotina- avidina), um anticorpo, um receptor, um ligante, uma lectina ou moléculas que compreendem um suporte sólido, incluindo, por exemplo, microesferas de plástico ou poliestireno, placas ou microesferas, microesferas magnéticas, tiras de teste e membranas. Métodos de purificação, como cromatografia de troca catiônica, podem ser usados para separar conjugados por diferença de carga, o que separa de modo eficaz os conjugados em seus vários pesos moleculares. O conteúdo das frações obtidas por cromatografia de troca catiônica pode ser identificado por peso molecular usando métodos convencionais, por exemplo, espectroscopia de massa, SDS-PAGE ou outros métodos conhecidos para separar entidades moleculares por peso molecular.
[0387] Em algumas modalidades, o terminal amino ou carboxila da sequência de proteínas ou peptídeos da presente revelação pode ser fundido com uma região de Fc de imunoglobulina (por exemplo, Fc humano) para formar um conjugado de fusão (ou molécula de fusão). Os conjugados de fusão de Fc demonstraram aumentar a meia-vida sistêmica dos biofármacos e, desse modo, o produto biofarmacêutico pode exigir uma administração menos frequente. O Fc se liga ao receptor de Fc neonatal (FcRn) nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e, ao se ligar, a molécula de fusão Fc é protegida da degradação e novamente liberada na circulação, mantendo a molécula em circulação por mais tempo. Acredita-se que essa ligação de Fc seja o mecanismo pelo qual a IgG endógena retém sua longa meia-vida plasmática. A tecnologia de fusão de Fc mais recente liga uma única cópia de um biofarmacêutico à região de Fc de um anticorpo para otimizar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do biofarmacêutico em comparação com os conjugados de fusão de Fc tradicionais.
[0388] A presente revelação contempla o uso de outras modificações, atualmente conhecidas ou desenvolvidas no futuro, dos peptídeos para melhorar uma ou mais propriedades. Um tal método para prolongar a meia-vida de circulação, aumentando a estabilidade, reduzindo a depuração ou alterando a imunogenicidade ou alergenicidade do peptídeo da presente revelação envolve a modificação das sequências de peptídeos por hesilação, que utiliza derivados de amido de hidroxietila ligados a outras moléculas a fim de modificar as características da molécula. Vários aspectos de hesilação são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente nº U.S.
2007/0134197 e 2006/0258607.
[0389] A estabilidade de peptídeo pode ser avaliada de inúmeras maneiras. Por exemplo, peptidases e vários meios biológicos, como plasma e soro humano, foram usados para testar a estabilidade. Consulte, por exemplo, Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986). A meia-vida dos peptídeos descritos no presente documento é convenientemente determinada usando um ensaio de soro humano a 25 % (v/v). O protocolo é o seguinte: o soro humano agrupado (Tipo AB, não inativado pelo calor) é dilapidado por centrifugação antes do uso. O soro é, então, diluído para 25 % com RPMI-1640 ou outro meio de cultura de tecido adequado. Em intervalos de tempo predeterminados, uma pequena quantidade de solução de reação é removida e adicionada a ácido tricloroacético aquoso a 6 % (TCA) ou etanol. A amostra de reação turva é resfriada (4 °C) por 15 minutos e, então, centrifugada para sedimentar as proteínas séricas precipitadas. A presença dos peptídeos é, então, determinada por HPLC de fase reversa usando condições de cromatografia de estabilidade específica.
[0390] Problemas associados à meia-vida plasmática curta ou susceptibilidade à degradação de protease podem ser superados por várias modificações, incluindo a conjugação ou ligação do peptídeo ou sequência de proteínas a qualquer um dentre uma variedade de polímeros não proteicos, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol ou polioxialquilenos (consulte, por exemplo, tipicamente através de uma fração de ligação covalentemente ligada à proteína e ao polímero não proteináceo, por exemplo, um PEG). Foi demonstrado que tais biomoléculas conjugadas com PEG possuem propriedades clinicamente úteis, incluindo melhor estabilidade física e térmica, proteção contra suscetibilidade à degradação enzimática, solubilidade aumentada, meia-vida de circulação mais longa in vivo e eliminação diminuída, imunogenicidade e antigenicidade reduzidas e toxicidade reduzida.
[0391] PEGs adequados para conjugação a uma sequência de polipeptídeos ou proteínas são geralmente solúveis em água à temperatura ambiente e têm a fórmula geral R-(O-CH2-CH2)n- O-R, onde R é hidrogênio ou um grupo protetor, como um grupo alquila ou um grupo alcanol, e onde n é um número inteiro de 1 a 1000. Quando R é um grupo protetor, geralmente possui de 1 a 8 carbonos. O PEG conjugado com a sequência polipeptídica pode ser linear ou ramificado. Derivados ramificados de PEG, "PEGs em forma de estrela" e PEGs multiarmados são contemplados pela presente revelação. A presente revelação também contempla composições de conjugados em que os PEGs têm diferentes valores de n e, desse modo, os vários PEGs diferentes estão presentes em razões específicas. Por exemplo, algumas composições compreendem uma mistura de conjugados onde n = 1, 2, 3 e 4. Em algumas composições, a porcentagem de conjugados onde n = 1 é 18-25 %, a porcentagem de conjugados onde n = 2 é 50-66 %, a porcentagem de conjugados onde n = 3 é 12-16 % e a porcentagem de conjugados onde n = 4 é até 5 %. Essas composições podem ser produzidas por condições de reação e métodos de purificação conhecidos na técnica. Por exemplo, a cromatografia de troca catiônica pode ser usada para separar os conjugados, e é então identificada uma fração que contém o conjugado tendo, por exemplo, o número desejado de PEGs anexados, purificado livre de sequências de proteínas não modificadas e de conjugados com outros números de PEGs anexados.
[0392] O PEG pode ser ligado ao peptídeo ou proteína da presente revelação por meio de um grupo reativo terminal (um "espaçador"). O espaçador é, por exemplo, um grupo reativo terminal que medeia uma ligação entre os grupos amino ou carboxila livres de uma ou mais das sequências polipeptídicas e PEG. O PEG que tem o espaçador que pode ser ligado ao grupo amino livre inclui PEG de N-hidroxissuccinilimida que pode ser preparado ativando-se éster de ácido succínico de PEG com N-hidroxissuccinilimida. Outro PEG ativado que pode ser ligado a um grupo amino livre é 2,4-bis(O- metoxipolietilenoglicol)-6-cloro-s-triazina que pode ser preparada pela reação de PEG monometil éter com cloreto cianúrico. O PEG ativado que está ligado ao grupo carboxila livre inclui polioxietilenodiamina.
[0393] A conjugação de uma ou mais das sequências de peptídeos ou proteínas da presente revelação com PEG com um espaçador pode ser realizada por vários métodos convencionais. Por exemplo, a reação de conjugação pode ser realizada em solução a um pH de 5 a 10, a uma temperatura de 4 °C à temperatura ambiente, por 30 minutos a 20 horas, utilizando uma razão molar entre reagente e peptídeo/proteína de desde 4: 1 a 30: 1. As condições de reação podem ser selecionadas para direcionar a reação no sentido de produzir predominantemente um grau desejado de substituição. Em geral, temperatura baixa, pH baixo (por exemplo, pH = 5) e tempo de reação curto tendem a diminuir o número de PEGs anexados, enquanto a temperatura alta, o pH neutro a alto (por exemplo, pH> 7) e o tempo de reação mais longo tendem a aumentar o número de PEGs anexados. Vários meios conhecidos na técnica podem ser usados para terminar a reação. Em algumas modalidades, a reação é terminada acidificando-se a mistura de reação e congelando-se, por exemplo, a -20 °C.
[0394] A presente revelação também contempla o uso de miméticos de PEG. Os miméticos de PEG recombinantes foram desenvolvidos para reter os atributos de PEG (por exemplo, meia-vida sérica aumentada) enquanto conferem várias propriedades vantajosas adicionais. A título de exemplo, cadeias polipeptídicas simples (compreendendo, por exemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser e Thr) capazes de formar uma conformação estendida similar a PEG podem ser produzidas de forma recombinante já fundidas com o peptídeo ou fármaco de proteína de interesse (por exemplo, tecnologia Amunix XTEN; Mountain View, CA, EUA). Isso evita a necessidade de uma etapa de conjugação adicional durante o processo de fabricação. Além disso, as técnicas de biologia molecular estabelecidas permitem o controle da composição da cadeia lateral das cadeias polipeptídicas, permitindo a otimização da imunogenicidade e das propriedades de fabricação. Neoepítopos
[0395] Um neoepítopo compreende uma parte determinante neoantigênica de um peptídeo neoantigênico ou polipeptídeo neoantigênico que é reconhecido pelo sistema imune. Um neoepítopo se refere a um epítopo que não está presente em uma referência, como uma célula não doente, por exemplo, uma célula não cancerosa ou uma célula da linha germinativa, mas é encontrado em uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerosa. Isso inclui situações em que um epítopo correspondente é encontrado em uma célula não doente normal ou uma célula de linhagem germinativa mas, devido a uma ou mais mutações em uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerosa, a sequência do epítopo é alterada de modo a resultar no neoepítopo. O termo "neoepítopo" é usado indistintamente com "neoepítopo específico de tumor" no presente relatório descritivo para designar uma série de resíduos, tipicamente L-aminoácidos, conectados um ao outro, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos α-amino e carboxila de aminoácidos adjacentes. O neoepítopo pode ter uma variedade de comprimentos, tanto em suas formas neutras (não carregadas) ou em formas que são sais e livres de modificações, como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fosforilação ou contendo essas modificações, sujeito à condição de que a modificação não destrói a atividade biológica dos polipeptídeos como descrito no presente documento. A presente revelação fornece neoepítopos isolados que compreendem uma mutação específica do tumor da Tabela 1 ou 2. A presente revelação também forneceu neoepítopos isolados exemplificativos que compreendem uma mutação específica de tumor da Tabela 34. Essa revelação também fornece Neoepítopos isolados exemplificativos que compreendem uma mutação de tumor específico das Tabelas 40A- 40D e Tabela 3A-3D.
[0396] Em algumas modalidades, os neoepítopos descritos no presente documento para HLA de Classe I são 13 resíduos ou menos de comprimento e geralmente consistem em entre cerca de 8 e cerca de 12 resíduos, particularmente 9 ou 10 resíduos. Em algumas modalidades, os neoepítopos descritos no presente documento para HLA de Classe II são 25 resíduos ou menos de comprimento e geralmente consistem em entre cerca de 16 e cerca de 25 resíduos.
[0397] Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da mesma proteína, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, a composição descrita no presente documento compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreende pelo menos um aminoácido da segunda região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma mutação de sítio de splice, uma mutação de deslocamento de quadro de leitura, uma mutação de leitura direta, uma mutação de fusão de gene e qualquer combinação das mesmas.
[0398] Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II.
Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD8+ T. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD4+ T. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD4+ T. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD8+ T. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, uma composição que compreende peptídeo de C418S BTK não antigênico compreende um primeiro neoepítopo de BTK e um segundo neoepítopo de BTK. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo de BTK compreende um neoepítopo selecionado a partir da Tabela 34. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo de BTK compreende um neoepítopo selecionado a partir da Tabela 34.
[0399] Em algumas modalidades, a primeira sequência de peptídeos BTK mutantes que é selecionada a partir da Tabela 34 se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA listado na Tabela 34, correspondendo ao respectivo peptídeo (coluna da esquerda versus direita).
[0400] Em algumas modalidades, uma composição que compreende peptídeos de EGFR neoantigênicos compreendem um primeiro neoepítopo de EGFR e um segundo neoepítopo de EGFR. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo de EGFR compreende um neoepítopo selecionado a partir da Tabela 40A- 40D. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo de EGFR compreende um neoepítopo selecionado a partir da Tabela 40A- 40D.
[0401] Em algumas modalidades, um primeiro neoepítopo de EGFR mutante é selecionado a partir do grupo que consiste em STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3139), LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3140), LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3141), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3142), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3143), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3144) e VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3145).
[0402] Em algumas modalidades, as primeiras sequências de peptídeos EGFR mutantes que são selecionadas a partir do grupo que consiste em STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3146), LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3147), LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3148), TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3149), TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3150), TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3151) e VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3152), se ligam ou prevê-se que se liguem a uma proteína codificada por um alelo HLA-A68:01, um alelo HLA-B15:02, um alelo HLA-A25:01, um alelo HLA-B57:03, um alelo HLA-C12:02, um alelo HLA-C03:02 e alelo HLA-A26:01, um alelo HLA-C12:03, um alelo HLA-C06:02, um alelo HLA-C03:03, um alelo HLA-B52:01, alelo HLA-A30:01, um alelo HLA-C02:02, um alelo HLA-C12:03, um alelo HLA- A11:01, um alelo HLA-A32:01, um alelo HLA-A02:04, um alelo HLA-B15:09, alelo HLA-C17:01, um alelo HLA- C03:04, um alelo HLA-B08:01, um alelo HLA-A01:01, um alelo HLA-B42:01, um alelo HLA-B57:01, um alelo HLA-B14:02, um alelo HLA-B37:01, um alelo HLA-B36:01, um alelo HLA-B38:01, um alelo HLA-
C03:03, um alelo HLA-B14:02, um alelo HLA-B37:01, um alelo HLA-A02:03, um alelo HLA-B58:02, um alelo HLA-C08:01, um alelo HLA-B35:01, um alelo HLA-B40:01 e/ou um alelo HLA- B35:03. A Tabela 41 fornece uma lista de alelos HLA exemplificativos que codificam uma proteína de HLA que pode se ligar ou prevê- se que se ligue a um peptídeo de EGFR não antigênico.
HLA-A23:01 HLA-A25:01 HLA-A26:01 HLA-A32:01 HLA-B15:01 HLA-B15:02 HLA-B38.01 HLA-B39:01 HLA-B39:06 HLA-B40:02 HLA-C03:02 HLA-C12:03 HLA-A01:01 HLA-C15:02 HLA-B57:01 HLA-B57:03 HLA-A36:01 HLA-C12:02 HLA-C03:03 HLA-B58:02 HLA-B15:01 HLA-A26:01
HLA-A68:02 HLA-C15:02 HLA-A25:01 HLA-B57:03 HLA-C12:02 HLA-A26:01 HLA-C12:03 HLA-C06:02 HLA-C03:03 HLA-A30:01 HLA-C02:02 HLA-A11:01 HLA-A32:01 HLA-A02:04 HLA-A68:01 HLA-B15:09 HLA-C03:04 HLA-B38:01 HLA-B57:01 HLA-A02:03 HLA-C08:01 HLA-B35:01 HLA-B40:01 HLA-A26:01 HLA-B57:01 HLA-C15:02 HLA-C17:01 HLA-B08:01 HLA-B42:01
HLA-B14:02 HLA-B37:01 HLA-B15:09 HLA-B35:03 HLA-B52:01 HLA-B14:02 HLA-B37:01 As Tabelas 42Ai, 42Aii e 42B mostram neoepítopos de EGFR com especificidade de subtipo de HLA prevista. As Tabelas 5Ai, 5Aii e 5B mostram neoepítopos de EGFR com especificidade de subtipo de HLA prevista. Tabela 42Ai Mutação Contexto de Sequência Peptídeos Alelo HLA de EGFR de Mutação S492R SLNITSLGLRSLKEISDGDVII IIRNRGENSCK A03.01 SGNKNLCYANTINWKKLFGTSG (SEQ ID NO: QKTKIIRNRGENSCKATGQVCH 3154)
ALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNV SRGRECVDKCNLL (SEQ ID NO: 3153) Tabela 42Aii Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação T790M IPVAIKELREA CLTSTVQLIM A01.01, A02.01 TSPKANKEILD (SEQ ID NO: EAYVMASVDNP 3156)
Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação HVCRLLGICLT IMQLMPFGC A02.01 STVQLIMQLMP (SEQ ID NO: FGCLLDYVREH 3157) KDNIGSQYLLN IMQLMPFGCL A02.01, A24.02, B08.01 WCVQIAKGMNY (SEQ ID NO: LEDRRLVHRDL 3158) AA (SEQ ID LIMQLMPFG A02.01 NO: 3155) (SEQ ID NO: 3159) LIMQLMPFGC A02.01 (SEQ ID NO: 3160) LTSTVQLIM A01.01 (SEQ ID NO: 3161) MQLMPFGCL A02.01, B07.02, B08.01 (SEQ ID NO: 3162) MQLMPFGCLL A02.01, A24.02, B08.01 (SEQ ID NO: 3163) VQLIMQLMPF A02.01, A24.02, B08.01 (SEQ ID NO: 3164) LIMQLMPF HLA-C03:02 (SEQ ID NO:
Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação 3165) LTSTVQLIM HLA-C12:03, HLA-A01:01, (SEQ ID NO: HLA-C15:02, HLA-B57:01 3166) HLA-B57:03, HLA-A36:01, HLA-C12:02, HLA-C03:03, HLA-B58:02, QLIMQLMPF HLA-A26:01 (SEQ ID NO: 3167) STVQLIMQL HLA-A68:02, HLA-C15:02, (SEQ ID NO: HLA-A25:01, HLA-B57:03, 3168) HLA-C12:02, HLA-A26:01, HLA-C12:03, HLA-C06:02, HLA-C03:03, HLA-A30:01, HLA-C02:02, HLA-A11:01, HLA-A32:01, HLA-A02:04, HLA-A68:01, HLA-B15:09, HLA-C03:04, HLA-B38:01, HLA-B57:01, HLA-A02:03, HLA-C08:01, HLA-B35:01, HLA-B40:01 STVQLIMQLM HLA-B57:01 (SEQ ID NO: 3169) TSTVQLIMQL HLA-C15:02 (SEQ ID NO:
Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação 3170) TVQLIMQL HLA-C17:01, HLA-B08:01, (SEQ ID NO: HLA-B42:01, HLA-B14:02, 3171) HLA-B37:01, HLA-B15:09 TVQLIMQLM HLA-B35:03 (SEQ ID NO: 3172) VQLIMQLM HLA-B52:01, HLA-B14:02, (SEQ ID NO: HLA-B37:01 3173) Tabela 42B Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação
MRPSGTAGAALLALLAALCP EGFRvIII ASRALEEKK:G:NYVVTDHG ALEEKKGNYV (deleção SCVRACGADSYEMEEDGVRK (SEQ ID NO: A02.01 interna) CKKCEGPCRKVCNGIGIGEF 3176) KD (SEQ ID NO: 3174)
LPQPPICTIDVYMIMVKCWM IQLQDKFEHL A02.01, IDADSRPKFRELIIEFSKMA (SEQ ID NO: EGFR:SEPT B08.01 RDPQRYLVIQ::LQDKFEHL 3177) 14 KMIQQEEIRKLEEEKKQLEG QLQDKFEHL (SEQ A02.01, EIIDFYKMKAASEALQTQLS ID NO: 3178) B08.01
Mutação Contexto de Peptídeos Alelo HLA de EGFR Sequência de Mutação TD (SEQ ID NO: 3175) QLQDKFEHLK (SEQ ID NO: A03.01 3179)
YLVIQLQDKF A02.01, (SEQ ID NO: A24.02 3180)
[0403] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo neoepítopos são epítopos diferentes. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo é maior que o primeiro neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo tem um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo tem um comprimento de 8 a 12 aminoácidos. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 8 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 1 dos 8 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 8 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 2 dos 8 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo tem um comprimento de pelo menos 16 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo tem um comprimento de 16 a 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 16 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 1 dos 16 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo compreende uma sequência de pelo menos 16 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 2 dos 16 aminoácidos contíguos são diferentes em posições correspondentes de uma sequência do tipo selvagem.
[0404] Em algumas modalidades, o neoepítopo compreende pelo menos um resíduo âncora. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo, o segundo neoepítopo ou ambos compreendem pelo menos um resíduo âncora. Em uma modalidade, o pelo menos um resíduo âncora do primeiro neoepítopo está em uma posição âncora canônica ou uma posição âncora não canônica. Em uma outra modalidade, o pelo menos um resíduo âncora do segundo neoepítopo está em uma posição âncora canônica ou uma posição âncora não canônica. Ainda em uma outra modalidade, o pelo menos um resíduo âncora do primeiro neoepítopo é diferente do pelo menos um resíduo âncora do segundo neoepítopo.
[0405] Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora é um do tipo selvagem resíduo. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora é uma substituição. Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo âncora não compreende a mutação.
[0406] Em algumas modalidades, o primeiro ou o segundo neoepítopo ou ambos compreendem pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora. Em algumas modalidades, o neoepítopo compreende pelo menos um resíduo âncora. Em algumas modalidades, o pelo menos um resíduo âncora compreendem pelo menos dois resíduos âncora. Em algumas modalidades, os pelo menos dois resíduos âncora são separados por uma região de separação que compreende pelo menos 1 aminoácido. Em algumas modalidades, a pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora não está dentro da região de separação. Em algumas modalidades, a pelo menos uma região de flanqueamento de resíduo âncora está (a) a montante de um resíduo âncora de N-terminal dos pelo menos dois resíduos âncora; (b) a jusante de um resíduo âncora de C-terminal dos pelo menos dois resíduos âncora; ou tanto (a) quanto (b). Em algumas modalidades, o segundo neopeptídeo é selecionado a partir da Tabela 34.
[0407] Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo compreende uma mutação T790M. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de VQLIMQLMPF (SEQ ID NO: 3181). Em algumas modalidades o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3182). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 3183). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de MQLMPFGCLL (SEQ ID NO: 3184). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3185). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3186). Em algumas modalidades, o segundo neopeptídeo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3187). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3188). Em algumas modalidades o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3189). Em algumas modalidades o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3190). Em algumas modalidades o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3191). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de CLTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3192). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de IMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3193). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de IMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3194). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de IMQLMPFGCL (SEQ ID NO: 3195). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de neoepítopos de LIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3196). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de LIMQLMPFGC (SEQ ID NO: 3197). Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR T790M compreende uma sequência de QLIMQLMPFG (SEQ ID NO: 3198).
[0408] Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo que compreende uma mutação de EGFR S492R. Em algumas modalidades, um peptídeo que compreende uma mutação de EGFR S492R compreende uma sequência de neoepítopos de IIRNRGENSCK (SEQ ID NO: 3199).
[0409] Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo de EGFR que compreende uma mutação de deleção em EGFR, como deleção de G em EGFRvIII (deleção interna), em que a sequência de neoepítopos é ALEEKKGNYV (SEQ ID NO: 3200).
[0410] Em algumas modalidades, um segundo neoepítopo que compreende uma mutação descrita na sequência: LPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQ::LQDKFEH LKMIQQEEIRKLEEEKKQLEGEIIDFYKMKAASEALQTQLSTD (SEQ ID NO: 3201), em que a sequência de neoepítopos é IQLQDKFEHL (SEQ ID NO: 3202). Em algumas modalidades, a segunda sequência de neoepítopos é QLQDKFEHL (SEQ ID NO: 3203). Em algumas modalidades, a segunda sequência de neoepítopos é QLQDKFEHLK (SEQ ID NO: 3204). Em algumas modalidades, a segunda sequência de neoepítopos é YLVIQLQDKF (SEQ ID NO: 3205).
[0411] Em algumas modalidades, o segundo neopeptídeo é selecionado a partir da Tabela 35 ou Tabela 3A-Tabela 3D.
[0412] Em algumas modalidades, os neoepítopos ligam uma proteína de HLA (por exemplo, HLA de classe I ou HLA de classe II). Em algumas modalidades, os neoepítopos ligam uma proteína de HLA com maior afinidade que o peptídeo do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o neoepítopo tem um IC50 menor que 5.000 nM, menor que
1.000 nM, menor que 500 nM, menor que 100 nM, menor que 50 nM ou menos.
[0413] Em algumas modalidades, o neoepítopo pode ter uma afinidade de ligação de HLA entre cerca de 1 pM e cerca de 1 mM, cerca de 100 pM e cerca de 500 µM, cerca de 500 pM e cerca de 10 µM, cerca de 1 nM e cerca de 1 µM, ou cerca de
10 nM e cerca de 1 µM. Em algumas modalidades, o neoepítopo pode ter uma afinidade de ligação de HLA de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 nM ou mais. Em algumas modalidades, o neoepítopo pode ter uma afinidade de ligação de HLA de no máximo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 nM.
[0414] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA com uma afinidade maior que um neoepítopo do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA com um KD ou um IC50 menor que
1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA de classe I com um KD ou um IC50 menor que 1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína de HLA de classe II com um KD ou um IC50 menor que 2.000 nM, 1.500 nM, 1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM.
[0415] Em um aspecto, o primeiro e/ou o segundo neoepítopos se ligam a uma proteína codificada por um alelo HLA expresso por um indivíduo. Em um outro aspecto, a mutação não está presente em células não cancerosas de um indivíduo.
Ainda em um outro aspecto, o primeiro e/ou o segundo neoepítopo são codificados por um gene ou um gene expresso de células cancerosas de um indivíduo.
[0416] Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo compreende uma mutação como descrito na coluna 2 da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo compreende uma mutação como descrito na coluna 2 da Tabela 1 ou 2. Em algumas modalidades, certos peptídeos antigênicos são pareados com alelos específicos.
[0417] Uma substituição pode ser posicionada em qualquer parte ao longo do comprimento do neoepítopo. Por exemplo, a mesma pode estar localizada no terceiro N terminal do peptídeo, o terceiro central do peptídeo ou o terceiro C terminal do peptídeo. Em outra modalidade, o resíduo substituído está localizado a 2-5 resíduos longe da extremidade do N-terminal ou 2-5 resíduos longe da extremidade do C-terminal. Os peptídeos podem ser derivados de modo similar de mutações de inserção específica de tumor em que o peptídeo compreende um ou mais, ou todos os resíduos inseridos.
[0418] Em algumas modalidades, o peptídeo como descrito no presente documento pode ser prontamente sintetizado quimicamente utilizando reagentes que são livres de substâncias bacterianas ou animais contaminantes (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). Em algumas modalidades, os peptídeos são preparados por (1) síntese de fase sólida paralela em instrumentos de múltiplos canais com uso de síntese uniforme e condições de clivagem; (2) purificação por uma coluna RP-HPLC com esterilização por vapor de coluna; e nova lavagem, mas não substituição, entre peptídeos; seguido de (3) análise com um conjunto limitado dos ensaios mais informativos. A pegada das Boas Práticas de Fabricação (GMP) pode ser definida em torno do conjunto de peptídeos para um paciente individual, exigindo, assim, procedimentos de troca de pacote apenas entre sínteses de peptídeos para diferentes pacientes. Polinucleotídeos
[0419] Alternativamente, um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica o peptídeo da presente revelação pode ser usado para produzir o peptídeo não antigênico in vitro. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, de fita simples e/ou dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos, como, por exemplo, polinucleotídeos com uma estrutura de fosforotiato, ou combinações dos mesmos e pode ou não conter íntrons, desde que codifique o peptídeo. Em algumas modalidades, a tradução in vitro é usada para produzir o peptídeo.
[0420] São fornecidos no presente documento polinucleotídeos neoantigênicos que codificam cada um dos peptídeos neoantigênicos descritos na presente revelação. O termo “polinucleotídeo”, “nucleotídeos” ou “ácido nucleico” é usado de maneira intercambiável com “polinucleotídeo mutante”, “nucleotídeo mutante”, “ácido nucleico mutante”, “polinucleotídeo neoantigênico”, “nucleotídeo neoantigênico” ou “ácido nucleico mutante neoantigênico” na presente revelação. Várias sequências de ácido nucleico podem codificar o mesmo peptídeo devido à redundância do código genético. Cada um desses ácidos nucleicos se encontra dentro do escopo da presente revelação. Os ácidos nucleicos que codificam peptídeos podem ser DNA ou RNA, por exemplo, mRNA ou uma combinação de DNA e RNA. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo é um mRNA de autoamplificação (Brito et al., Adv. Genet. 2015; 89:179-233). Qualquer polinucleotídeo adequado que codifica um peptídeo descrito no presente documento se encontra no escopo da presente revelação.
[0421] O termo “RNA” inclui e em algumas modalidades se refere a “mRNA”. O termo “mRNA” significa “RNA mensageiro” e se refere a uma “transcrição” que é gerada através do uso de um modelo de DNA e codifica um peptídeo ou polipeptídeo. Tipicamente, um mRNA compreende uma 5’-UTR, uma região de codificação de proteína, e uma 3’-UTR. mRNA apenas possui meia-vida limitada em células e in vitro. Em algumas modalidades, o mRNA é mRNA de autoamplificação. No contexto da presente revelação, mRNA pode ser gerado por transcrição in vitro de um modelo de DNA. A metodologia de transcrição in vitro é conhecida pela pessoa versada. Por exemplo, há uma variedade de kits de transcrição in vitro comercialmente disponíveis.
[0422] A estabilidade e a eficiência da tradução do RNA podem ser modificadas como necessário. Por exemplo, o RNA pode ser estabilizado e sua tradução aumentada por uma ou mais modificações que têm efeitos estabilizadores e/ou eficiência de tradução crescente do RNA. Tais modificações são descritas, por exemplo, no documento PCT/EP2006/009448, incorporado ao presente documento a título de referência. A fim de aumentar a expressão do RNA usado de acordo com a presente revelação, o mesmo pode ser modificado dentro da região de codificação, isto é, a sequência que codifica o peptídeo ou proteína expressa, sem alterar a sequência do peptídeo ou proteína expressa, de modo a aumentar o teor de GC para aumentar a estabilidade de mRNA e para realizar uma otimização de códon e, assim, melhorar a tradução nas células.
[0423] O termo "modificação" no contexto do RNA usado na presente revelação inclui qualquer modificação de um RNA que não está naturalmente presente no dito RNA. Em algumas modalidades, o RNA não tem 5’-trifosfatos sem cap. A remoção de tais 5'-trifosfatos sem cap pode ser alcançada tratando o RNA com uma fosfatase. Em outras modalidades, o RNA pode ter ribonucleotídeos modificados a fim de aumentar sua estabilidade e/ou diminuir a citotoxicidade. Em algumas modalidades, a 5-metilcitidina pode ser substituída parcial ou completamente no RNA, por exemplo, por citidina. Alternativamente, a pseudouridina é substituída parcial ou completamente, por exemplo, por uridina.
[0424] Em algumas modalidades, o termo “modificação” se refere ao fornecimento de um RNA com um análogo de 5’-cap ou 5’- cap. O termo “5’-cap” se refere a uma estrutura de cap encontrada na extremidade 5’ de uma molécula de mRNA e geralmente consiste em um nucleotídeo de guanosina conectado ao mRNA através de uma ligação de trifosfafo de 5’ a 5’ incomum. Em algumas modalidades, essa guanosina é metilada na posição 7. O termo “5’-cap convencional” se refere a um RNA 5’-cap de ocorrência natural, ao cap de 7-metilguanosina (m G). No contexto da presente revelação, o termo “5’-cap” inclui um análogo de 5’-cap que se parece com a estrutura de cap de RNA e é modificado para possuir a capacidade de estabilizar o RNA e/ou melhorar a translação de RNA se anexado ao mesmo, in vivo e/ou em uma célula.
[0425] Em certas modalidades, um mRNA que codifica um peptídeo não antigênico da presente revelação é administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece moléculas de RNA, oligorribonucleotídeo e polirribonucleotídeo que compreendem um nucleosídeo modificado, em que os vetores de terapia gênica compreendem o mesmo, em que métodos de terapia gênica e métodos de silenciamento de transcrição de gene compreendem o mesmo. Em algumas modalidades, o mRNA a ser administrado compreende pelo menos um nucleosídeo modificado.
[0426] Os polinucleotídeos que codificam peptídeos descritos no presente documento podem ser sintetizados por técnicas químicas, por exemplo, o método de fosfotriéster de Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981). Polinucleotídeos que codificam peptídeos que compreendem ou que consistem em um análogo podem ser feitos simplesmente substituindo-se a base (ou bases) de ácido nucleico apropriada e desejada por aquelas que codificam o epítopo nativo.
[0427] Os polinucleotídeos descritos no presente documento podem compreender um ou mais íntrons sintéticos ou de ocorrência natural na região transcrita. A inclusão de sequências de estabilização de mRNA e sequências para replicação em células de mamíferos também pode ser considerada para aumentar a expressão de polinucleotídeos. Além disso, um polinucleotídeo descrito no presente documento pode compreender sequências imunoestimuladoras (ISSs ou CpGs). Essas sequências podem estar incluídas no vetor, fora da sequência de codificação de polinucleotídeo para aumentar a imunogenicidade.
[0428] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem compreender a sequência de codificação para o peptídeo ou proteína fundida no mesmo quadro de leitura a um polinucleotídeo que auxilia, por exemplo, na expressão e/ou secreção do peptídeo ou proteína de uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência líder que funciona como uma sequência secretora para controlar o transporte de um polipeptídeo da célula). O polipeptídeo que tem uma sequência líder é uma pré-proteína e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo.
[0429] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem compreender a sequência de codificação para o peptídeo ou proteína fundida no mesmo quadro de leitura a uma sequência de marcador que permite, por exemplo, a purificação do peptídeo codificado, que pode então ser incorporado em uma vacina de doença personalizada ou composição imunogênica. Por exemplo, a sequência de marcador pode ser uma etiqueta de hexa-histidina (SEQ ID NO: 3206) fornecida por um vetor pQE-9 para fornecer purificação do polipeptídeo maduro fundido ao marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a sequência de marcador pode ser uma etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada da proteína hemaglutinina da influenza quando um mamífero hospedeiro é usado (por exemplo, células COS-7). As etiquetas adicionais incluem, porém sem limitação, etiquetas Calmodulina, etiquetas FLAG, etiquetas Myc, etiquetas S, etiquetas SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta V5, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, etiquetas Biotin
Carboxyl Carrier Protein (BCCP), Etiquetas GST, etiquetas de proteína fluorescente (por exemplo, etiquetas de proteína fluorescente verde), etiquetas de proteína de ligação de maltose, etiquetas Nus, etiqueta Strep, etiqueta de tioredoxina, etiqueta TC, etiqueta Ty e similares.
[0430] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem compreender a sequência de codificação para um ou mais dos peptídeos ou proteínas presentemente descritos fundidos no mesmo quadro de leitura para criar um único construto de peptídeo neoantigênico concatamerizado capaz de produzir vários peptídeos neoantigênicos.
[0431] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA é construída usando tecnologia recombinante, isolando ou sintetizando uma sequência de DNA que codifica uma proteína de tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagênese específica de local para fornecer seus análogos funcionais. Consulte, por exemplo, Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662- 5066 (1984) e Patente nº US 4.588.585. Em outra modalidade, uma sequência de DNA que codifica o peptídeo ou proteína de interesse seria construída por síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeo. Esses oligonucleotídeos podem ser projetados com base na sequência de aminoácidos do peptídeo desejado e selecionando os códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante de interesse é produzido. Os métodos padrão podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos completa pode ser usada para construir um gene retrotraduzido. Além disso, um oligômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo isolado particular pode ser sintetizado. Por exemplo, vários pequenos oligonucleotídeos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e, então, ligados. Os oligonucleotídeos individuais normalmente contêm protuberâncias de 5 'ou 3' para montagem complementar
[0432] Uma vez montadas (por exemplo, por síntese, mutagênese de sítio direcionada ou um outro método), as sequências polinucleotídicas que codificam um determinado polipeptídeo isolado de interesse são inseridas em um vetor de expressão e, opcionalmente, operativamente ligadas a uma sequência de controle de expressão apropriada para a expressão da proteína em um hospedeiro desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleotídeos, mapeamento de restrição e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como bem conhecido na técnica, a fim de obter altos níveis de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene pode ser operativamente ligado a sequências de controle de expressão transcricional e translacional que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.
[0433] Assim, a presente revelação também é direcionada a vetores e vetores de expressão úteis para a produção e administração dos peptídeos neoantigênicos e neoepítopos descritos no presente documento e para células hospedeiras compreendendo tais vetores. Vetores
[0434] Em algumas modalidades, um vetor de expressão capaz de expressar o peptídeo ou proteína como descrito no presente documento também pode ser preparado. Os vetores de expressão para diferentes tipos de células são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados sem experimentação indevida. Geralmente, o DNA é inserido em um vetor de expressão, como um plasmídeo, na orientação adequada e quadro de leitura correto para a expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulador transcricional e translacional reconhecidas pelo hospedeiro desejado (por exemplo, bactérias), embora tais controles estejam geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor é então introduzido na bactéria hospedeira para clonagem usando técnicas padrão (consulte, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA).
[0435] Um grande número de vetores e sistemas hospedeiros adequados para produzir e administrar um peptídeo neoantigênico descrito no presente documento são conhecidos pelos versados na técnica e estão disponíveis comercialmente. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pCR (Invitrogen). Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); p75.6 (Valentis); pCEP (Invitrogen); pCEI (Epimmune). No entanto, qualquer outro plasmídeo ou vetor pode ser usado, desde que seja replicável e viável no hospedeiro.
[0436] Para a expressão dos peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento, a sequência de codificação fornecerá códons de início e parada operavelmente ligados, regiões promotoras e terminadoras e, em algumas modalidades, e um sistema de replicação para fornecer um vetor de expressão para expressão no hospedeiro celular desejado. Por exemplo, sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos são fornecidas em plasmídeos contendo sítios de restrição convenientes para a inserção da sequência de codificação desejada. Os vetores de expressão resultantes são transformados em hospedeiros bacterianos adequados.
[0437] Os vetores de expressão de mamíferos compreenderão uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados, e também quaisquer sítios de ligação de ribossomo, sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores de splice, sequências de terminação da transcrição e sequências não transcritas de flanqueamento de 5'. Esses promotores também podem ser derivados de fontes virais, como, por exemplo, citomegalovírus humano (promotor CMV-IE) ou vírus herpes simplex tipo 1 (promotor HSV TK). As sequências de ácido nucleico derivadas do splice de SV40 e os sítios de poliadenilação podem ser usados para fornecer os elementos genéticos não transcritos necessários.
[0438] Os vetores de expressão recombinantes podem ser usados para amplificar e expressar DNA que codifica o peptídeo ou proteína como descrito no presente documento. Os vetores de expressão recombinantes são construtos de DNA replicáveis que têm fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA que codificam um peptídeo ou um análogo bioequivalente operacionalmente ligado a elementos reguladores de transcrição ou tradução derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de inseto.
Uma unidade de transcrição geralmente compreende um conjunto de (1) um elemento ou elementos genéticos com um papel regulador na expressão de gene, por exemplo, promotores ou intensificadores da transcrição, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e terminação de transcrição e tradução apropriadas, como descrito em detalhes no presente documento.
Esses elementos reguladores podem incluir uma sequência de operação para controlar a transcrição.
A capacidade de se replicar em um hospedeiro, geralmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes podem ser incorporados adicionalmente.
As regiões de DNA estão operativamente ligadas quando estão funcionalmente relacionadas entre si.
Por exemplo, o DNA de um peptídeo sinal (líder secretor) está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como um precursor que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se controlar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de forma a permitir a tradução.
Geralmente, operativamente ligado significa contíguo e, no caso de líderes secretores, significa contíguo e em quadro de leitura.
Os elementos estruturais destinados ao uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira.
Alternativamente, onde a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, a mesma pode incluir um resíduo de metionina N- terminal. Esse resíduo pode ser opcionalmente clivado subsequentemente da proteína recombinante expressa para fornecer um produto final.
[0439] Geralmente, os vetores de expressão recombinantes incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação da célula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência à ampicilina de gene TRP1 de E. coli e S. cerevisiae, e um promotor derivado de um gene altamente expresso para direcionar a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. Tais promotores podem ser derivados de operons que codificam enzimas glicolíticas, como 3-fosfoglicerato quinase (PGK), fosfatase ácida ou proteínas de choque térmico, entre outras. A sequência estrutural heteróloga é montada em fase apropriada com sequências de iniciação e terminação da tradução e, em algumas modalidades, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida para o espaço periplasmático ou meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal que confere as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso.
[0440] Os polinucleotídeos que codificam os peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento também podem compreender uma sequência de sinal de ubiquitinação e/ou uma sequência de direcionamento, como uma sequência de sinal de retículo endoplasmático (ER) para facilitar o movimento do peptídeo resultante para o retículo endoplasmático.
[0441] Em algumas modalidades, o peptídeo não antigênico descrito no presente documento também pode ser administrado e/ou expresso pelos vetores virais ou bacterianos. Os exemplos de vetores de expressão incluem hospedeiros virais atenuados, como vaccinia ou fowlpox. Como um exemplo dessa abordagem, o vírus vaccinia é usado como um vetor para expressar sequências de nucleotídeos que codificam os peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento. Os vetores vaccinia e métodos úteis em protocolos de imunização são descritos em, por exemplo, Patente nº US 4.722.848. Um outro vetor é BCG (Bacille Calmette Guerin). Os vetores de BCG são descritos por Stover et al., Nature 351:456-460 (1991).
[0442] Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração terapêutica ou imunização dos polipeptídeos neoantigênicos descritos no presente documento, por exemplo, vetores de vírus adeno e adenoassociados, vetores retrovirais, vetores de Salmonella Typhimurium, vetores de toxina antraz desintoxicada, vetores de vírus Sendai, vetores de poxvírus, vetores de canarypox e de fowlpox e similares, serão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor é Vaccinia Ankara (VA) modificado (por exemplo, Bavarian Noridic (MVA-BN)).
[0443] Entre os vetores que podem ser usados na prática da presente revelação, a integração no genoma hospedeiro de uma célula é possível com métodos de transferência de genes de retrovírus, muitas vezes resultando na expressão de longo prazo do transgene inserido. Em algumas modalidades, o retrovírus é um lentivírus. Além disso, altas eficiências de transdução foram observadas em muitos tipos de células e tecidos-alvo diferentes.
O tropismo de um retrovírus pode ser alterado pela incorporação de proteínas de envelope estranhas, expandindo a população-alvo potencial de células alvo.
Um retrovírus também pode ser projetado para permitir a expressão condicional do transgene inserido, de modo que apenas certos tipos de células sejam infectados pelo lentivírus.
Os promotores específicos de tipo de célula podem ser usados para alvejar a expressão em tipos de célula específica.
Os vetores lentivirais são vetores retrovirais (e, portanto, os vetores lentivirais e retrovirais podem ser usados na prática da presente revelação). Além disso, os vetores lentivirais são capazes de transduzir ou infectar células que não se dividem e normalmente produzem tituladores virais elevados.
A seleção de um sistema retroviral de transferência de genes pode, portanto, depender do tecido alvo.
Os vetores retrovirais são compostos de repetições terminais longas de ação cis com capacidade de empacotamento de até 6-10 kb de sequência estranha.
Os LTRs de ação cis mínimos são suficientes para a replicação e empacotamento dos vetores, que são então usados para integrar o ácido nucleico desejado na célula alvo para fornecer expressão permanente.
Os vetores retrovirais amplamente utilizados que podem ser utilizados na prática da presente revelação incluem aqueles baseados no vírus da leucemia murina (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da Imunodeficiência Símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) e combinações dos mesmos (consulte, por exemplo, Buchscher et al., (1992) J.
Virol. 66:2731-2739; Johann et al., (1992) J.
Virol.66:1635-1640; Sommnerfelt et al., (1990) Virol.176:58-
59; Wilson et al., (1998) J. Virol.63:2374-2378; Miller et al., (1991) J. Virol.65:2220-2224; PCT/US94/05700).
[0444] Também útil na prática da presente revelação está um vetor lentiviral de não primata mínimo, como um vetor lentiviral à base de vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). Os vetores podem ter o promotor de citomegalovírus (CMV) que conduz a expressão do gene-alvo. Por conseguinte, a presente revelação contempla entre os vetores úteis na prática da presente revelação: vetores virais, incluindo vetores retrovirais e vetores lentivirais.
[0445] Também útil na prática da presente revelação está um vetor de adenovírus. Uma vantagem é a capacidade de os adenovírus recombinantes transferirem e expressarem de modo eficaz genes recombinantes em uma variedade de células e tecidos de mamíferos in vitro e in vivo, resultando na alta expressão dos ácidos nucleicos transferidos. Além disso, a capacidade de infectar produtivamente células quiescentes, expandir a utilidade de vetores adenovirais recombinantes. Além disso, altos níveis de expressão garantem que os produtos dos ácidos nucleicos serão expressos em níveis suficientes para gerar uma resposta imune (consulte, por exemplo, Patente nº US 7.029.848, incorporada ao presente documento a título de referência).
[0446] Quanto aos vetores de adenovírus úteis na prática da presente revelação, é feita menção à Patente nº US
6.955.808. O vetor de adenovírus usado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste nos vetores Ad5, Ad35, Ad11, C6 e C7. A sequência do genoma de Adenovírus 5 (“Ad5”) foi publicada. (Chroboczek, J., Bieber, F., e Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its
Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285; cujos conteúdos são incorporados a título de referência). Os vetores de Ad35 são descritos nas Patentes nº US 6.974.695, 6.913.922 e 6.869.794. Os vetores de Ad11 são descritos na Patente nº US 6.913.922. Os vetores de adenovírus C6 são descritos nas Patentes nº US 6.780.407;
6.537.594; 6.309.647; 6.265.189; 6.156.567; 6.090.393;
5.942.235 e 5.833.975. Os vetores de C7 são descritos na Patente nº US 6.277.558. Os vetores de adenovírus que são defeituosos em E1 ou deletados, defeituosos em E3 ou deletados e/ou defeituosos em E4 ou deletados também podem ser usados. Certos adenovírus com mutações na região E1 têm margem de segurança melhorada devido ao fato de que os mutantes de adenovírus defeituosos em E1 são deficientes para replicação em células não permissivas ou, pelo menos, são altamente atenuados. Os adenovírus com mutações na região E3 podem ter aumentado a imunogenicidade ao interromper o mecanismo pelo qual o adenovírus regula de modo descendente as moléculas de MHC de classe I. Os adenovírus com mutações E4 podem ter imunogenicidade reduzida do vetor de adenovírus devido à supressão da expressão gênica tardia. Esses vetores podem ser particularmente úteis quando é desejada a revacinação repetida utilizando o mesmo vetor. Vectores de adenovírus que são eliminados ou mutados em E1, E3, E4; E1 e E3; e E1 e E4 podem ser usados de acordo com a presente revelação.
[0447] Além disso, vetores de adenovírus "incompletos (gutless)", nos quais todos os genes virais são excluídos, também podem ser usados de acordo com a presente revelação. Esses vetores requerem um vírus auxiliar para a sua replicação e requerem uma linhagem de célula 293 humana especial que expressa E1a e Cre, uma condição que não existe no ambiente natural. Esses vetores "incompletos" não são imunogênicos e, desse modo, os vetores podem ser inoculados várias vezes para revacinação. Os vetores de adenovírus "incompletos" podem ser usados para inserção de inserções/genes heterólogos, como os transgenes da presente revelação, e podem até mesmo ser usados para coentrega de um grande número de inserções/genes heterólogos.
[0448] Em algumas modalidades, a entrega é por meio de um adenovírus, que pode estar em uma única dose de reforço. Em algumas modalidades, o adenovírus é entregue por meio de doses múltiplas. Em termos de entrega in vivo, o AAV é vantajoso em relação a outros vetores virais devido à baixa toxicidade e baixa probabilidade de causar mutagênese de inserção devido ao fato de que não se integra ao genoma do hospedeiro. O AAV tem um limite de pacote de 4,5 ou 4,75 Kb. Construções maiores do que 4,5 ou 4,75 Kb resultam em produção de vírus significativamente reduzida. Existem muitos promotores que podem ser usados para conduzir a expressão da molécula de ácido nucleico. ITR de AAV pode servir como um promotor e é vantajoso para eliminar a necessidade de um elemento promotor adicional.
[0449] Para expressão ubíqua, os seguintes promotores podem ser usados: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadeias pesadas ou leves de ferritina, etc. Para a expressão do cérebro, os seguintes promotores podem ser usados: Sinapsina I para todos os neurônios, CaMK II alfa para neurônios excitatórios, GAD67 ou GAD65 ou VGAT para neurônios GABAérgicos, etc. Os promotores usados para conduzir a síntese de RNA podem incluir: Promotores Pol III, como U6 ou H1. O uso de um promotor Pol II e cassetes intrônicos pode ser usado para expressar o RNA guia (gRNA). No que diz respeito aos vetores AAV úteis na prática da presente revelação, é feita menção às Patentes nº US 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 e 6258595 e documentos citados nas mesmas. Quanto ao AAV, o AAV pode ser AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação dos mesmos. Pode-se selecionar o AAV em relação às células a serem direcionadas; por exemplo, pode-se selecionar os serotipos 1, 2, 5 de AAV ou um capsídeo híbrido AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação dos mesmos para direcionar células cerebrais ou neuronais; e pode-se selecionar AAV4 para direcionar o tecido cardíaco. AAV8 é útil para entrega ao fígado. Em algumas modalidades, a entrega é por meio de um AAV. A dosagem pode ser ajustada para equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais.
[0450] Em algumas modalidades, um Poxvírus é usado na composição atualmente descrita. Esses incluem ortopoxvírus, avipox, vaccinia, MVA, NYVAC, canarypox, ALVAC, fowlpox, TROVAC, etc. (consulte, por exemplo, Verardiet al., Hum. Vaccin. Immunother. Julho de 2012;8(7):961-70; e Moss, Vaccine. 2013; 31(39): 4220–4222). Os vetores de expressão de poxvírus foram descritos em 1982 e rapidamente se tornaram amplamente usados para o desenvolvimento de vacinas, bem como para pesquisas em diversos campos. As vantagens dos vetores incluem construção simples, capacidade de acomodar grandes quantidades de DNA estranho e altos níveis de expressão. Informações sobre poxvírus que podem ser usados na prática da presente revelação, como poxvírus da subfamília
Chordopoxvirinae (poxvírus de vertebrados), por exemplo, ortopoxvírus e avipoxvírus, por exemplo, vaccinia vírus (por exemplo, Wyeth Strain, WR Strain (por exemplo, ATCC® VR- 1354), Copenhagen Strain, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVA- BN), vírus canarypox (por exemplo, Wheatley C93 Strain, ALVAC), fowlpox virus (por exemplo, FP9 Strain, Webster, TROVAC), varíola aviária, varíola de pombo, varíola de codorna e varíola de guaxinim, entre outros, seus recombinantes sintéticos ou não naturais, seus usos e métodos para fazer e usar tais recombinantes podem ser encontrados na literatura científica e de patentes.
[0451] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia é usado na vacina contra a doença ou composição imunogênica para expressar um antígeno. (Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr. Opin. Immunol. 9:517-524, 1997). O vírus vaccinia recombinante é capaz de se replicar no citoplasma da célula hospedeira infectada e o polipeptídeo de interesse pode, portanto, induzir uma resposta imune. Além disso, os Poxvírus têm sido amplamente utilizados como vacinas ou vetores de composição imunogênica devido à sua capacidade de direcionar antígenos codificados para processamento pela via do complexo principal de histocompatibilidade de classe I, infectando-se diretamente células do sistema imunológico, em particular, células que apresentam antígeno, mas também devido à sua capacidade de ser autoadjuvante.
[0452] Em algumas modalidades, ALVAC é usado como um vetor em uma vacina contra doenças ou composição imunogênica. ALVAC é um vírus canarypox que pode ser modificado para expressar transgenes estranhos e tem sido usado como um método para vacinação contra antígenos procarióticos e eucarióticos (Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol. Immunother. 2000;49:504–14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin. Cancer. Res. 2000; 6:2219–28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1- uninfected individuals. J. Immunol. 2003;171:1094–101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996;93:11349–53; Patente nº US 7.255.862). Em um ensaio clínico de fase I, um vírus ALVAC que expressa o antígeno tumoral CEA mostrou um perfil de segurança excelente e resultou em respostas aumentadas de células T específicas de CEA em pacientes selecionados; respostas clínicas objetivas, no entanto, não foram observadas (Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J. Clin. Oncol. 1999;17:332–7).
[0453] Em algumas modalidades, um vírus Vaccinia Ankara (MVA) modificado pode ser usado como um vetor viral para uma vacina de antígeno ou composição imunogênica. MVA é um membro da família Orthopoxvirus e foi gerado por cerca de 570 passagens em série em fibroblastos de embrião de galinha da cepa Ankara do vírus Vaccinia (CVA) (consulte, por exemplo,
Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14, 1975). Como consequência dessas passagens, o vírus MVA resultante contém 31 quilobases menos informações genômicas em comparação com CVA, e é altamente restrito a células hospedeiras (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). O MVA é caracterizado pela sua extrema atenuação, a saber, pela diminuição da virulência ou capacidade infecciosa, mas ainda detém uma excelente imunogenicidade. Quando testado em uma variedade de modelos animais, o MVA provou ser avirulento, mesmo em indivíduos imunossuprimidos. Além disso, MVA-BN®-HER2 é uma imunoterapia candidata projetada para o tratamento de câncer de mama positivo para HER-2 e está atualmente em ensaios clínicos. (Mandl et al., Cancer Immunol. Immunother. janeiro de 2012; 61(1): 19–29). Métodos para fazer e usar MVA recombinante foram descritos (por exemplo, consulte as Patentes nº US 8.309.098 e 5.185.146 incorporadas ao presente documento em sua totalidade).
[0454] As células hospedeiras adequadas para expressão de um polipeptídeo incluem procariotas, levedura, células eucarióticas de inseto ou maiores sob o controle de promotores adequados. Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. Células eucarióticas superiores incluem linhagens celulares estabelecidas celulares de origem de mamífero. Sistemas de tradução livres de células também podem ser empregados. Os vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamíferos são bem conhecidos na técnica (consulte Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., EUA, 1985).
[0455] Vários sistemas de cultura de células de mamífero ou inseto são também vantajosamente empregados para expressar proteína recombinante. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada devido ao fato de que tais proteínas são geralmente dobradas corretamente, apropriadamente modificadas e completamente funcionais. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem as linhagens COS-7 de células de rim de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor apropriado incluindo, por exemplo, células L, C127, 3T3, ovário de hamster chinês (CHO), linhagens celulares 293, HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não transcritos como uma origem de replicação, um promotor adequado e intensificador ligado ao gene a ser expresso, e outras sequências não transcritas de flanqueamento 5’ ou 3’, e sequências não traduzidas 5’ ou 3’, como sítios de ligação ao ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e receptores de splice, e sequências de terminação transcricional. Os sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insetos são revistos por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
[0456] As células hospedeiras são geneticamente modificadas (transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com os vetores que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc. As células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meio de nutrientes convencional modificado como apropriado para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificar os polinucleotídeos. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes ao indivíduo de habilidade comum.
[0457] Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, como E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus; células fúngicas, como levedura; células de inseto, como Drosophila e Sf9; células animais, como linhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritas por Gluzman, Cell 23:175 (1981), e outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK ou melanoma de Bowes; células vegetais, etc. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada como estando dentro do escopo daquele elemento versado na técnica a partir dos ensinamentos no presente documento.
[0458] Hospedeiros de levedura, inseto ou célula de mamífero também podem ser usados, empregando vetores adequados e sequências de controle. Exemplos de sistemas de expressão de mamíferos incluem as linhagens de COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritas por Gluzman, Cell 23: 175 (1981), e outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, o C127, 3T3, CHO, HeLa e linhagens de células BHK.
[0459] Os polinucleotídeos descritos no sente documento podem ser administrados e expressos em células humanas (por exemplo, células imunes, incluindo células dendríticas). Uma tabela de uso de códon humano pode ser usada para orientar a escolha do códon para cada aminoácido. Tais polinucleotídeos compreendem resíduos de aminoácidos espaçadores entre epítopos e/ou análogos, como aqueles descritos acima, ou podem compreender sequências de flanqueamento de ocorrência natural adjacentes aos epítopos e/ou análogos (e/ou CTL (por exemplo, CD8+), Th (por exemplo, CD4+) e epítopos de células B).
[0460] Sequências regulatórias padrão bem conhecidas dos versados na técnica podem estar incluídas no vetor para assegurar a expressão nas células alvo humanas. Vários elementos do vetor são desejáveis: um promotor com um sítio de clonagem a jusante para o polinucleotídeo, por exemplo, inserção de minigene; um sinal de poliadenilação para terminação de transcrição eficaz; uma origem de E. coli de replicação; e um marcador selecionável de E. coli (por exemplo, resistência à ampicilina ou canamicina). Vários promotores podem ser usados para esse propósito, por exemplo, o promotor de citomegalovírus humano (hCMV). Consulte, por exemplo, Patentes nº US 5.580.859 e 5.589.466 para outras sequências promotoras adequadas. Em algumas modalidades, o promotor é o promotor de CMV-IE.
[0461] Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, especialmente mamíferos ou seres humanos, incluem, por exemplo, vetores que compreendem sequências de controle de expressão de SV40, papiloma vírus bovino, adenovírus e citomegalovírus. Vectores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, como plasmídeos de Escherichia coli, incluindo pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de faixa mais ampla de hospedeiros, como M13 e fagos de DNA de fita simples.
[0462] Os vetores podem ser introduzidos em tecidos animais por vários métodos diferentes. As duas abordagens mais populares são a injeção de DNA em solução salina, usando uma agulha hipodérmica padrão, e a entrega por arma de genes. Um esboço esquemático da construção de um plasmídeo de vacina de DNA e sua entrega subsequente por esses dois métodos em um hospedeiro é ilustrado em Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34–41). A injeção em solução salina é normalmente conduzida por via intramuscular (IM) no músculo esquelético ou intradermicamente (ID), com o DNA sendo entregue aos espaços extracelulares. Isso pode ser auxiliado por eletroporação, danificando-se temporariamente as fibras musculares com miotoxinas, como a bupivacaína; ou usando soluções hipertônicas de solução salina ou sacarose (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343– 410). As respostas imunológicas a esse método de administração podem ser afetadas por muitos fatores, incluindo tipo de agulha, alinhamento da agulha, velocidade de injeção, volume de injeção, tipo de músculo e idade, sexo e condição fisiológica do animal que está sendo injetado (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343–410).
[0463] A entrega por arma de genes, o outro método de entrega comumente usado, acelera balisticamente o DNA de plasmídeo (pDNA) que foi adsorvido em micropartículas de ouro ou tungstênio nas células alvo, usando hélio comprimido como um acelerador (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343–410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129–88).
[0464] Métodos alternativos de entrega podem incluir a instilação de aerossol de DNA nu em superfícies mucosas, como a mucosa nasal e pulmonar, (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129–88) e administração tópica de pDNA no olho e na mucosa vaginal (Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129–88). A entrega na superfície da mucosa também foi alcançada usando preparações catiônicas de DNA de lipossomo, microesferas biodegradáveis, vetores atenuados de Shigella ou Listeria para administração oral na mucosa intestinal e vetores de adenovírus recombinantes. DNA ou RNA também podem ser entregues às células após leve ruptura mecânica da membrana celular, permeabilizando temporariamente as células. Essa ruptura mecânica suave da membrana pode ser realizada forçando suavemente as células através de uma pequena abertura (Sharei et al., Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, PLOS ONE (2015)).
[0465] Os meios químicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomos. Um sistema coloidal exemplificativo para uso como veículo de entrega in vitro e in vivo é um lipossomo (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial). No caso em que um sistema de entrega não viral é utilizado, um veículo de entrega exemplificativo é um lipossomo. “Lipossomo” é um termo genérico que engloba uma variedade de veículos lipídicos simples e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados de lipídios fechados. Os lipossomos podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Os lipossomos multilamelares têm múltiplas camadas de lipídios separadas por meio aquoso. Os mesmos se formam espontaneamente quando os fosfolipídios são suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)). No entanto, composições que possuem estruturas em solução diferentes da estrutura vesicular normal também são abrangidas. Por exemplo, os lipídios podem assumir uma estrutura micelar ou simplesmente existir como agregados não uniformes de moléculas de lipídios. Também são contemplados os complexos de lipofectamina-ácido nucleico.
[0466] O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídio pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossomo, ligado a um lipossomo por meio de uma molécula de ligação que está associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso numa solução contendo um lipídeo,
misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão num lipídeo, contido ou complexado com uma micela, ou então associado a um lipídeo. As composições associadas a lipídios, lipídios/DNA ou lipídios/vetores de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, as mesmas podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. As mesmas também podem ser simplesmente intercaladas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma. Os lipídeos são substâncias gordurosos que podem ser lipídeos de ocorrência natural ou lipídeos sintéticos. Por exemplo, os lipídios incluem as gotículas de gordura que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.
[0467] Os lipídios adequados para uso podem ser obtidos de fontes comerciais. Por exemplo, a dimiristilfosfatidilcolina (“DMPC”) pode ser obtida junto a Sigma, St. Louis, Mo., EUA; dicetil fosfato (“DCP”) pode ser obtido junto a K & K Laboratories (Plainview, N.Y., EUA); o colesterol (“Choi”) pode ser obtido junto a Calbiochem- Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídios podem ser obtidos junto a Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala., EUA). As soluções estoque de lipídios em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20 °C. O clorofórmio é usado como o único solvente, uma vez que é mais facilmente evaporado do que o metanol.
[0468] Em algumas modalidades, um vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos são derivados da mesma proteína. Os pelo menos dois peptídeos distintos podem variar em seu comprimento, sua sequência de aminoácidos ou ambos. Os peptídeos são derivados de qualquer proteína conhecida para ou foram encontrados para conter uma mutação de tumor específico. Em algumas modalidades, um vetor compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da mesma proteína, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, um vetor compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreende pelo menos um aminoácido da segunda região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma mutação de sítio de splice, uma mutação de deslocamento de quadro de leitura, uma mutação de leitura direta, uma mutação de fusão de gene e qualquer combinação das mesmas.
[0469] Em algumas modalidades, um vetor compreende um polinucleotídeo unido de forma operável a um promotor. Em algumas modalidades, o vetor é um replicon, plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion de RNA de autoamplificação. Em algumas modalidades, o vetor é derivado de um retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adenosassociado, vírus herpes, poxvírus, vírus alfa, vírus vaccinia, vírus da hepatite B, papilomavírus humano ou um pseudótipo dos mesmos. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral é uma nanopartícula, um lipídio catiônico, um polímero catiônico, um nanopolímero metálico, um nanorod, um lipossomo, uma micela, uma microbolha, um peptídeo de penetração celular ou uma liposfera. Receptores de Célula T
[0470] Em um aspecto, a presente revelação fornece células que expressam um receptor de reconhecimento de neoantígeno que ativa uma célula imunorresponsiva (por exemplo, receptor de células T (TCR) ou receptor de antígeno quimérico (CAR)) e métodos de uso de tais células para o tratamento de uma doença que requer uma resposta imune aprimorada. Essas células incluem células imunorresponsivas geneticamente modificadas (por exemplo, células T, células Exterminadoras Naturais (NK), células de linfócitos T citotóxicos (CTL (por exemplo, CD8+)), linfócitos T auxiliares (células Th (por exemplo, CD4+))) que expressam um receptor de reconhecimento de antígeno (por exemplo, TCR ou CAR) que se liga a um dos peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento, e métodos de uso, portanto, para o tratamento de neoplasia e outras patologias onde um aumento em uma resposta imune específica do antígeno é desejado. A ativação de célula T é mediada por um TCR ou um CAR alvejado por um antígeno.
[0471] A presente revelação fornece células que expressam uma combinação de um receptor de reconhecimento de antígeno que ativa uma célula imunorresponsiva (por exemplo, TCR, CAR) e um receptor de coestimulação quimérico (CCR) e métodos de uso de tais células para o tratamento de uma doença que requer uma resposta imune aprimorada. Em algumas modalidades, células T específicas do antígeno tumoral, células NK, células CTL ou outras células imunorresponsivas são utilizadas como lançadeiras para o enriquecimento seletivo de um ou mais ligantes coestimuladores para o tratamento ou prevenção de neoplasia. Essas células são administradas a um sujeito humano com necessidade das mesmas para o tratamento ou prevenção de um câncer específico.
[0472] Em algumas modalidades, os linfócitos humanos específicos do antígeno tumoral que podem ser usados nos métodos da presente revelação incluem, porém sem limitação, linfócitos doadores periféricos geneticamente modificados para expressar receptores de antígenos quiméricos (CARs) (Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3: 35-45), linfócitos de doadores periféricos geneticamente modificados para expressar um complexo de receptor de célula T de reconhecimento de antígeno tumoral de comprimento total compreendendo o heterodímero a e p (Morgan, RA, et al. 2006 Science 314: 126-129 ), culturas de linfócitos derivados de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em biópsias de tumor (Panelli, MC, et al. 2000 J Immunol 164: 495-504; Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164: 4382-4392), e leucócitos de sangue periférico específicos de antígeno expandidos seletivamente in vitro empregando células que apresentam antígenos artificiais (AAPCs) ou células dendríticas pulsadas (Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65: 5417-5427; Papanicolaou, G. A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505). As células T podem ser autólogas, alogênicas ou derivadas in vitro de células-tronco ou progenitoras manipuladas.
[0473] Em algumas modalidades, a imunoterapêutica é um receptor projetado. Em algumas modalidades, o receptor projetado é um receptor de antígeno quimérico (CAR), um receptor de células T (TCR) ou um receptor de células B (BCR), uma terapia de células T adotiva (ACT) ou um derivado dos mesmos. Em outros aspectos, o receptor manipulado é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em alguns aspectos, o CAR é um CAR de primeira geração. Em outros aspectos, o CAR é um CAR de segunda geração. Ainda em aspectos, o CAR é um CAR de terceira geração. Em alguns aspectos, o CAR compreende uma porção extracelular, uma porção de transmembrana e uma porção intracelular. Em alguns aspectos, a porção intracelular compreende pelo menos um domínio coestimulador de célula T. Em alguns aspectos, o domínio coestimulador de célula T é selecionado a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, TNFRS9 (4-1BB), TNFRSF4 (OX40), TNFRSF8 (CD30), CD40LG (CD40L), ICOS, ITGB2 (LFA-1), CD2, CD7, KLRC2 (NKG2C), TNFRS18 (GITR), TNFRSF14 (HVEM) ou qualquer combinação dos mesmos.
[0474] Em alguns aspectos, o receptor manipulado se liga a um alvo. Em alguns aspectos, a ligação é específica a um peptídeo específico a uma ou mais indivíduos que sofrem de uma doença ou condição.
[0475] Em alguns aspectos, a imunoterapêutica é uma célula como descrito em detalhes no presente documento. Em alguns aspectos, a imunoterapêutica é uma célula que compreende um receptor que se liga especificamente a um peptídeo ou neoepítopo descrito no presente documento. Em alguns aspectos, a imunoterapêutica é uma célula usada em combinação com os peptídeos/ácidos nucleicos da presente revelação. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de paciente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula é linfócito infiltrante de tumor.
[0476] Em alguns aspectos, um indivíduo com uma condição ou doença é tratado com base em um repertório de receptor de célula T do indivíduo. Em algumas modalidades, um peptídeo ou neoepítopo é selecionado com base em um repertório de receptores de células T do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com células T que expressam TCRs específicos para um peptídeo ou neoepítopo como descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um peptídeo ou neoepítopo específico para TCRs, por exemplo, TCRs específicos do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um peptídeo ou neoepítopo específico para TCRs que expressam células T, por exemplo, TCRs específicos de indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um peptídeo ou neoepítopo específico para TCRs específicos para indivíduo.
[0477] Em algumas modalidades, a composição como descrito no presente documento é selecionada com base em TCRs identificados em uma ou mais indivíduos. Em algumas modalidades, identificação de um repertório de célula T e testagem em ensaios funcionais são usados para determinar a composição a ser administrada a um ou mais indivíduos com uma condição ou doença. Em algumas modalidades, a composição é uma vacina de antígeno que compreende um ou mais peptídeos ou proteínas como descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a vacina compreende neoantigênicos de peptídeos específicos de indivíduo. Em algumas modalidades, os peptídeos a estarem incluídos na vacina são selecionados com base em uma quantificação de TCRs específicos para indivíduo que se liga aos neoepítopos. Em algumas modalidades, os peptídeos são selecionados com base em uma afinidade de ligação do peptídeo a um TCR. Em algumas modalidades, a seleção tem como base uma combinação de tanto de quantidade quanto de afinidade de ligação. Por exemplo, um TCR que se liga fortemente a um neoepítopo em um ensaio funcional, mas que não é altamente representado em um repertório de TCR pode ser um candidato satisfatório para uma vacina de antígeno devido ao fato de que as células T que expressam o TCR seriam vantajosamente amplificadas.
[0478] Em algumas modalidades, o peptídeo ou proteína é selecionado para administrar um ou mais indivíduos com base na ligação aos TCRs. Em algumas modalidades, células T, como células T de um indivíduo com uma doença ou condição, podem ser expandidas. As células T expandidas que expressam TCRs específicos para um peptídeo neoantigênico ou neoepítopo podem ser administradas de volta a um indivíduo. Em algumas modalidades, células adequadas, por exemplo, PBMCs, são transduzidas ou transfectadas com polinucleotídeos para a expressão de TCRs específicos para um peptídeo neoantigênico ou neoepítopo e administradas a um indivíduo. As células T que expressam TCRs específicos para um peptídeo neoantigênico ou neoepítopo podem ser expandidas e administradas de volta a um indivíduo. Em algumas modalidades, as células T que expressam TCRs específicos para um peptídeo neoantigênico ou neoepítopo que resultam em atividade citolítica quando incubadas com tecido doente autólogo podem ser expandidas e administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, as células T usadas em ensaios funcionais resultam na ligação a um peptídeo neoantigênico ou neoepítopo pode ser expandido e administrado a um indivíduo. Em algumas modalidades, os TCRs que foram determinados para se ligarem a peptídeos neoantigênicos ou neoepítopos específicos do sujeito podem ser expressos em células T e administrados a um indivíduo.
[0479] Em uma modalidade, a presente revelação fornece uma composição que compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, a composição como fornecido no presente documento compreende uma primeira célula T que compreende um primeiro receptor de célula T (TCR) específico para o primeiro neoepítopo e uma segunda célula T que compreende um segundo TCR específico para o segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos são derivados da mesma proteína.
[0480] Em uma outra modalidade, a presente revelação fornece uma composição que compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreendem pelo menos um aminoácido do segundo região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a composição como fornecido no presente documento compreende uma primeira célula T que compreende um primeiro receptor de célula T (TCR) específico para o primeiro neoepítopo e uma segunda célula T que compreende um segundo TCR específico para o segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais.
[0481] Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe II para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo se liga a uma proteína de HLA de classe I para formar um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD8+ T. Em algumas modalidades, o primeiro neoepítopo ativa células CD4+ T. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD4+ T. Em algumas modalidades, o segundo neoepítopo ativa células CD8+ T. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe II. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD8+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I. Em algumas modalidades, um TCR de uma célula CD4+ T se liga a um complexo de peptídeo de HLA de classe I.
[0482] Em algumas modalidades, o primeiro TCR é um primeiro receptor de antígeno quimérico específico para o primeiro neoepítopo e o segundo TCR é um segundo receptor de antígeno quimérico específico para o segundo neoepítopo. Em algumas modalidades, a primeira célula T é uma célula T citotóxica. Em algumas modalidades, a primeira célula T é uma célula T gama delta. Em algumas modalidades, a segunda célula T é uma célula T auxiliar. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo TCRs se ligam a um complexo de HLA- peptídeo com um KD ou um IC50 of menor que 1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo TCRs se ligam a um complexo de peptídeo de classe I de HLA com um KD ou um IC50 of menor que 1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo TCRs se ligam a um complexo de peptídeo de classe II de HLA com um KD ou um IC50 of menor que 2.000, 1.500, 1.000 nM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM ou 10 nM. Células que Apresentam Antígeno
[0483] A proteína ou peptídeo neoantigênico pode ser fornecido como células que apresentam antígeno (por exemplo, células dendríticas) contendo tais peptídeos, proteínas ou polinucleotídeos como descrito no presente documento. Em outras modalidades, tais células que apresentam antígeno são usadas para estimular células T para uso em pacientes. Desse modo, uma modalidade da presente revelação é uma composição contendo pelo menos uma célula que apresenta antígeno (por exemplo, uma célula dendrítica) que é pulsado ou carregado com um ou mais peptídeos neoantigênicos ou polinucleotídeos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, tais APCs são autólogos (por exemplo, células dendríticas autólogas). Alternativamente, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) isoladas de um paciente podem ser carregadas com peptídeos neoantigênicos ou polinucleotídeos ex vivo. Em modalidades relacionadas, tais APCs ou PBMCs são injetadas de volta no paciente. Em algumas modalidades, as células que apresentam antígeno são células dendríticas. Em modalidades relacionadas, as células dendríticas são células dendríticas autólogas que são pulsadas com o peptídeo não antigênico ou ácido nucleico. O peptídeo não antigênico pode ser qualquer peptídeo adequado que dá origem a uma resposta de célula T apropriada. A terapia de célula T com uso de células dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos a partir de um antígeno associado ao tumor é revelada em Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 e Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278. Em algumas modalidades, a célula T é um CTL (por exemplo, CD8+). Em algumas modalidades, a célula T é um linfócito T auxiliar (Th (por exemplo, CD4+)).
[0484] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma composição farmacêutica imunogênica à base de célula que também pode ser administrada a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica imunogênica à base de célula que apresenta antígeno (APC) pode ser formulada com uso de quaisquer técnicas conhecidas, carreadores e excipientes como adequado e como entendido na técnica. APCs incluem monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Às vezes, uma composição farmacêutica imunogênica à base de APC pode ser uma composição farmacêutica imunogênica à base de células dendríticas.
[0485] Uma composição farmacêutica imunogênica à base de células dendríticas pode ser preparada por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica. Em alguns casos, composições farmacêuticas imunogênicas à base de células dendríticas podem ser preparadas através de um método ex vivo ou in vivo. O método ex vivo pode compreender o uso de DCs autólogas pulsadas ex vivo com os polipeptídeos descritos no presente documento, para ativar ou carregar as DCs antes da administração no paciente. O método in vivo pode compreender alvejar receptores de DC específicos com uso de anticorpos acoplados aos polipeptídeos descritos no presente documento. A composição farmacêutica imunogênica à base de DC pode compreender ainda ativadores de DC, como TLR3, TLR-7-8 e agonistas de CD40. A composição farmacêutica imunogênica à base de DC pode ainda compreender adjuvantes e um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0486] As células apresentadoras de antígeno (APCs) podem ser preparadas a partir de uma variedade de fontes, incluindo primatas humanos e não humanos, outros mamíferos e vertebrados. Em certas modalidades, as APCs podem ser preparadas a partir do sangue de um vertebrado humano ou não humano. As APCs também podem ser isoladas de uma população enriquecida de leucócitos. As populações de leucócitos podem ser preparadas por métodos conhecidos dos elementos versados na técnica. Tais métodos incluem tipicamente a coleta de sangue heparinizado, aférese ou leucoforese, preparação de buffy coats, rosetting, centrifugação, centrifugação de gradiente de densidade (por exemplo, usando Ficoll, partículas de sílica coloidal e sacarose), células não leucocitárias de lise diferencial e filtração. Uma população de leucócitos também pode ser preparada pela coleta de sangue de um indivíduo, desfibrilando para remover as plaquetas e lisando os glóbulos vermelhos. A população de leucócitos pode ser opcionalmente enriquecida em precursores de células dendríticas monocíticas.
[0487] As populações de células sanguíneas podem ser obtidas de uma variedade de indivíduos, de acordo com o uso desejado da população enriquecida de leucócitos. O indivíduo pode ser um indivíduo saudável. Alternativamente, as células sanguíneas podem ser obtidas de um indivíduo em necessidade de imunoestimulação, como, por exemplo, um paciente com câncer ou outro paciente para o qual a imunoestimulação será benéfica. Da mesma forma, as células sanguíneas podem ser obtidas de um indivíduo em necessidade de supressão imunológica, como, por exemplo, um paciente com um transtorno autoimune (por exemplo, artrite reumatoide, diabetes, lúpus, esclerose múltipla e similares). Uma população de leucócitos também pode ser obtida de um indivíduo saudável compatível com HLA.
[0488] Quando o sangue é usado como fonte de APC, os leucócitos sanguíneos podem ser obtidos usando métodos convencionais que mantêm sua viabilidade. De acordo com um aspecto da presente revelação, o sangue pode ser diluído em um meio que pode ou não conter heparina ou outro anticoagulante adequado. O volume de sangue médio pode ser cerca de 1 para 1. As células podem ser concentradas por centrifugação do sangue em meio a cerca de 1.000 rpm (150 g) a 4 °C. As plaquetas e os glóbulos vermelhos podem ser esgotados ressuspendendo as células em qualquer número de soluções conhecidas na técnica que irão lisar os eritrócitos, por exemplo, cloreto de amônio. Por exemplo, a mistura pode ser meio e cloreto de amônio em cerca de 1:1 em volume. As células podem ser concentradas por centrifugação e lavadas na solução desejada até que uma população de leucócitos, substancialmente livre de plaquetas e glóbulos vermelhos, seja obtida. Qualquer solução isotônica comumente usada em cultura de tecidos pode ser usada como meio para separar leucócitos sanguíneos de plaquetas e glóbulos vermelhos. Exemplos de tais soluções isotônicas podem ser solução salina tamponada com fosfato, solução salina balanceada de Hanks e meio de crescimento completo. APCs e/ou células precursoras de APC também podem ser purificadas por elutriação.
[0489] Em uma modalidade, as APCs podem ser APCs não nominais sob condições inflamatórias ou de outra forma ativadas. Por exemplo, APCs não nominais podem incluir células epiteliais estimuladas com interferon-gama, células T, células B e/ou monócitos ativados por fatores ou condições que induzem a atividade de APC. Tais APCs não nominais podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0490] As APCs podem ser cultivadas, expandidas, diferenciadas e/ou maturadas, como desejado, de acordo com o tipo de APC. As APCs podem ser cultivadas em qualquer recipiente de cultura adequado, como, por exemplo, placas de cultura, frascos, sacos de cultura e biorreatores.
[0491] Em certas modalidades, as APCs podem ser cultivadas em cultura adequada ou meio de crescimento para manter e/ou expandir o número de APCs na preparação. Os meios de cultura podem ser selecionados de acordo com o tipo de APC isolado. Por exemplo, APCs maduras, como células dendríticas maduras, podem ser cultivadas em meios de crescimento adequados para sua manutenção e expansão. O meio de cultura pode ser suplementado com aminoácidos, vitaminas, antibióticos, cátions divalentes e similares. Além disso, citocinas, fatores de crescimento e/ou hormônios podem estar incluídos no meio de crescimento. Por exemplo, para a manutenção e/ou expansão de células dendríticas maduras, podem ser adicionadas citocinas, como fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e/ou interleucina 4 (IL-4). Em outras modalidades, APCs imaturas podem ser cultivadas e/ou expandidas. As células dendríticas imaturas podem reter a capacidade de captar o mRNA alvo e processar novos antígenos. Em algumas modalidades, as células dendríticas imaturas podem ser cultivadas em meios adequados para sua manutenção e cultura. O meio de cultura pode ser suplementado com aminoácidos, vitaminas, antibióticos, cátions divalentes e similares. Além disso, citocinas, fatores de crescimento e/ou hormônios podem estar incluídos no meio de crescimento.
[0492] Outras APCs imaturas podem ser cultivadas ou expandidas de forma semelhante. As preparações de APCs imaturas podem ser amadurecidas para formar APCs maduras. A maturação das APCs pode ocorrer durante ou após a exposição aos peptídeos neoantigênicos. Em certas modalidades, as preparações de células dendríticas imaturas podem ser amadurecidas. Fatores de maturação adequados incluem, por exemplo, citocinas TNF-α, produtos bacterianos (por exemplo, BCG) e similares. Em um outro aspecto, precursores de APC isolados podem ser usados para preparar as preparações de APCs imaturas. Os precursores de APC podem ser cultivados, diferenciados e/ou maturados. Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser cultivados na presença de meios de cultura adequados suplementados com aminoácidos, vitaminas, citocinas e/ou cátions divalentes, para promover a diferenciação dos precursores de células dendríticas monocíticas em células dendríticas imaturas. Em algumas modalidades, os precursores de APC são isolados de PBMCs. As PBMCs podem ser obtidas de um doador, por exemplo, um doador humano, e podem ser usados frescos ou congelados para uso futuro. Em algumas modalidades, a APC é preparada a partir de uma ou mais preparações de APC. Em algumas modalidades, a APC compreende uma APC carregada com o primeiro e o segundo peptídeos neoantigênicos compreendendo o primeiro e o segundo neoepítopos ou polinucleotídeos que codificam o primeiro e o segundo peptídeos neoantigênicos compreendendo o primeiro e o segundo neoepítopos. Em algumas modalidades, a APC é uma APC autóloga, uma APC alogênica ou uma APC artificial.
[0493] Em uma modalidade, a presente revelação fornece uma composição compreendendo uma APC compreendendo um primeiro peptídeo compreendendo um primeiro neoepítopo e um segundo peptídeo compreendendo um segundo neoepítopo, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos são derivados da mesma proteína. Em uma outra modalidade, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma APC que compreende um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreende pelo menos um aminoácido da segunda região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreende uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Adjuvantes
[0494] Um adjuvante pode ser usado para melhorar a resposta imune (humoral e/ou celular) provocada em um paciente que recebe uma composição como fornecido no presente documento. Algumas vezes, os adjuvantes podem provocar uma resposta do tipo Th1. Outras vezes, os adjuvantes podem provocar uma resposta do tipo Th2. Uma resposta do tipo Th1 pode ser caracterizada pela produção de citocinas, como IFN- γ, em oposição a uma resposta do tipo Th2, que pode ser caracterizada pela produção de citocinas, como IL-4, IL-5 e IL-10.
[0495] Em alguns aspectos, adjuvantes à base de lipídios, como MPLA e MDP, podem ser usados com as composições farmacêuticas imunogênicas reveladas no presente documento. O monofosforil lipídeo A (MPLA), por exemplo, é um adjuvante que causa aumento da apresentação do antígeno lipossomal para linfócitos T específicos. Além disso, um dipeptídeo muramil (MDP) também pode ser usado como um adjuvante adequado em conjunto com as formulações farmacêuticas imunogênicas descritas no presente documento.
[0496] Adjuvantes adequados são conhecidos na técnica (consulte o documento WO 2015/095811) e incluem, porém sem limitação, poly(I:C), poli-ICLC, Hiltonol, agonista de STING, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-
870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídeo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®. sistema de vetor, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, Pam3CSK4, estímulo QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., EUA) que é derivado de saponina, extratos de micobactérias e simuladores de parede celular bacteriana sintética e outros adjuvantes proprietários, como Ribi's Detox. Quil ou Superfos. Adjuvantes também incluem Freund incompleto ou GM- CSF. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e sua preparação foram descritos anteriormente (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev. Biol. Stand. 1998; 92:3-11) (Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060) (Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516). As citocinas também podem ser usadas. Várias citocinas foram diretamente ligadas à influência da migração de células dendríticas para tecidos linfoides (por exemplo, TNF-alfa), acelerando a maturação de células dendríticas em células apresentadoras de antígenos eficientes para linfócitos T (por exemplo, GM-CSF, PGE1, PGE2, IL -1, IL-1b, IL-4, IL-6 e CD40L) (Patente nº US 5.849.589 incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade) e atuando como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12)) (Gabrilovich D I, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
[0497] O adjuvante também pode compreender moléculas estimuladoras, como citocinas. Os exemplos não limitativos de citocinas incluem: CCL20, a-interferon (IFN-a), β- interferon (IFN-β), γ-interferon, fator de crescimento derivado de pélete (PDGF), TNFα, TNFβ (linfotoxina alfa (LTα)), GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina que atrai células T cutâneas (CTACK), quimiocina expressa do timo epitelial (TECK), quimiocina epitelial associada à mucosa (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1-, IL-8, L- selectina, P-selectina, E- selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblasto, IL-7, fator de crescimento de nervo, vascular fator de crescimento endotelial, Fas, TNF receptor, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, NIK Inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta de interferon, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A,
NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI e TAP2.
[0498] Adjuvantes adicionais incluem: MCP-1, MIP-la, MIP- lp, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL- 4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblasto, IL-7, IL-22, fator de crescimento de nervo, vascular fator de crescimento endotelial, Fas, TNF receptor, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp- 1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, NIK Inativo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de resposta de interferon, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL- R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.
[0499] Em alguns aspectos, um adjuvante pode ser um modulador de um receptor semelhante a Toll. Exemplos de moduladores de receptores semelhantes a toll incluem agonistas de TLR-9 e não estão limitados a moduladores de pequenas moléculas de receptores semelhantes a toll, como Imiquimod. Outros exemplos de adjuvantes que são usados em combinação com uma composição farmacêutica imunogênica descrita no presente documento podem incluir e não estão limitados a saponina, CpG ODN e similares. Às vezes, um adjuvante é selecionado a partir de toxoides de bactérias, polímeros de bloco de polioxipropileno-polioxietileno, sais de alumínio, lipossomas, polímeros CpG, emulsões de óleo em água ou uma combinação dos mesmos. Às vezes, um adjuvante é uma emulsão de óleo em água. A emulsão de óleo em água pode incluir pelo menos um óleo e pelo menos um tensoativo, com o óleo (ou óleos) e tensoativo (ou tensoativos) sendo biodegradável (metabolizáveis) e biocompatível. As gotículas de óleo na emulsão podem ter menos de 5 µm de diâmetro e podem até ter um diâmetro submícron, com esses tamanhos pequenos sendo alcançados com um microfluidificador para fornecer emulsões estáveis. Gotículas com tamanho inferior a 220 nm podem ser submetidas a esterilização por filtro. Métodos de Tratamento e Composições Farmacêuticas
[0500] As terapêuticas de neoantígeno (por exemplo, peptídeos, polinucleotídeos, TCR, CAR, células contendo TCR ou CAR, APC ou célula dendrítica contendo polipeptídeo, célula dendrítica contendo polinucleotídeo, anticorpo, etc.) descritas no presente documento são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo, porém sem limitação, métodos de tratamento terapêutico, como o tratamento de câncer. Em algumas modalidades, os métodos de tratamento terapêutico compreendem imunoterapia. Em certas modalidades, um peptídeo neoantigênico é útil para ativar, promover, aumentar e/ou intensificar uma resposta imune, redirecionando uma resposta imune existente para um novo alvo, aumentando a imunogenicidade de um tumor, inibindo o crescimento do tumor, reduzindo o volume do tumor, aumentando apoptose de células tumorais e/ou redução da tumorigenicidade de um tumor. Os métodos de uso podem ser métodos in vitro, ex vivo, ou in vivo.
[0501] Em alguns aspectos, a presente revelação fornece métodos para ativar uma resposta imune em um indivíduo com uso de um peptídeo não antigênico ou proteína descrita no presente documento.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para promover uma resposta imune em um indivíduo com uso de um peptídeo não antigênico descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para aumentar uma resposta imune em um indivíduo com uso de um peptídeo não antigênico descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para melhorar uma resposta imune com uso de um peptídeo não antigênico.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar a imunidade mediada por célula.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar a imunidade humoral ou atividade de célula T.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar atividade de CTL ou Th.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar atividade de célula de NK.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar atividade de célula T e aumentar a atividade de célula de NK.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem aumentar a atividade de CTL e aumentar a atividade de célula de NK.
Em algumas modalidades, a ativação, promoção, aumento e/ou melhora de uma resposta imune compreendem inibir ou diminuir a atividade supressora de células T reguladoras (Treg). Em algumas modalidades, a resposta imune é um resultado da estimulação antigênica.
Em algumas modalidades, a estimulação antigênica é uma célula tumoral. Em algumas modalidades, a estimulação antigênica é câncer.
[0502] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos de ativação, promoção, aumento e/ou melhoria de uma resposta imune usando um peptídeo neoantigênico descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo não antigênico que entrega um peptídeo não antigênico ou polinucleotídeo a uma célula tumoral. Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo não antigênico internalizado pela célula tumoral. Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo não antigênico que é internalizado por uma célula tumoral, e o peptídeo não antigênico é processado pela célula. Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo neoantigênico que é internalizado por uma célula tumoral e um neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral. Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo neoantigênico que é internalizado pela célula tumoral, é processado pela célula e um peptídeo antigênico está apresentado na superfície da célula tumoral.
[0503] Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo não antigênico ou polinucleotídeo descrito no presente documento que entrega um polipeptídeo exógeno que compreende pelo menos um peptídeo não antigênico a uma célula tumoral, em que pelo menos um neoepítopo derivado do peptídeo não antigênico está apresentado na superfície da célula tumoral. Em algumas modalidades, o peptídeo antigênico está apresentado na superfície da célula tumoral em complexo com uma molécula de classe II de MHC. Em algumas modalidades, o neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral em complexo com uma molécula de classe II de MHC.
[0504] Em algumas modalidades, um método compreende colocar uma célula tumoral em contato com um polipeptídeo ou polinucleotídeo neoantigênico descrito no presente documento que entrega um polipeptídeo exógeno que compreende pelo menos um peptídeo não antigênico para a célula tumoral, em que pelo menos um neoepítopo derivado do pelo menos um peptídeo não antigênico está apresentado na superfície da célula tumoral. Em algumas modalidades, o neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral em complexo com uma molécula de classe I de MHC. Em algumas modalidades, o neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral em complexo com uma molécula de classe II de MHC.
[0505] Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou polinucleotídeo neoantigênico descrito no presente documento que entrega um polipeptídeo exógeno que compreende pelo menos um peptídeo antigênico a uma célula tumoral, em que o neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral, e uma resposta imune contra a célula tumoral é induzida. Em algumas modalidades, a resposta imune contra a célula tumoral é aumentada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo ou polinucleotídeo neoantigênico entrega um polipeptídeo exógeno que compreende pelo menos um peptídeo não antigênico a uma célula tumoral, em que o neoepítopo está apresentado na superfície da célula tumoral, e crescimento tumoral é inibido.
[0506] Em algumas modalidades, um método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou polinucleotídeo neoantigênico descrito no presente documento que entrega um polipeptídeo exógeno que compreende pelo menos um peptídeo não antigênico a uma célula tumoral, em que o neoepítopo derivado do pelo menos um peptídeo não antigênico está apresentado na superfície da célula tumoral, e morte de célula T direcionada contra a célula tumoral é induzida. Em algumas modalidades, a morte de célula T direcionada contra a célula tumoral é melhorada. Em algumas modalidades, a morte de célula T direcionada contra a célula tumoral é aumentada.
[0507] Em algumas modalidades, um método para aumentar uma resposta imune em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica neoantigênica descrita no presente documento, em que o agente é um anticorpo que se liga especificamente ao neoantígeno descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um método para aumentar uma resposta imune em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo.
[0508] A presente revelação fornece métodos para redirecionar uma resposta imune existente para um tumor. Em algumas modalidades, um método para redirecionar uma resposta imune existente para um tumor compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a resposta imune existente é contra um vírus. Em algumas modalidades, o vírus é selecionado a partir do grupo que consiste em: vírus do sarampo, vírus da varicela-zóster (VZV; vírus da varicela), vírus da influenza, vírus da caxumba, poliovírus, vírus da rubéola, rotavírus, vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus Epstein Barr (EBV) e citomegalovírus (CMV). Em algumas modalidades, o vírus é vírus varicela- zoster. Em algumas modalidades, o vírus é citomegalovírus. Em algumas modalidades, o vírus é vírus do sarampo. Em algumas modalidades, a resposta imune existente foi adquirida após uma infecção viral natural. Em algumas modalidades, a resposta imune existente foi adquirida após vacinação contra um vírus. Em algumas modalidades, a resposta imune existente é uma resposta mediada por células. Em algumas modalidades, a resposta imune existente compreende células T citotóxicas (CTLs) ou células Th.
[0509] Em algumas modalidades, um método para redirecionar uma resposta imune existente a um tumor em um indivíduo compreende administrar uma proteína de fusão compreendendo (i) um anticorpo que se liga especificamente a um neoantígeno e (ii) pelo menos um peptídeo neoantigênico descrito no presente documento, em que (a) a proteína de fusão é internalizada por uma célula tumoral após a ligação ao antígeno associado ao tumor ou ao neoepítopo; (b) o peptídeo neoantigênico é processado e apresentado na superfície da célula tumoral associada a uma molécula de MHC de classe I; e (c) o complexo de peptídeo neoantigênico/MHC de Classe I é reconhecido por células T citotóxicas. Em algumas modalidades, as células T citotóxicas são células T de memória. Em algumas modalidades, as células T de memória são o resultado de uma vacinação com o peptídeo neoantigênico.
[0510] A presente revelação fornece métodos para aumentar a imunogenicidade de um tumor. Em algumas modalidades, um método para aumentar a imunogenicidade de um tumor compreende o contato de um tumor ou células tumorais com uma quantidade eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento. Em algumas modalidades, um método para aumentar a imunogenicidade de um tumor compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento.
[0511] A presente revelação também fornece métodos para inibir o crescimento de um tumor usando uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento. Em certas modalidades, um método para inibir o crescimento de um tumor compreende colocar uma mistura de célula em contato com uma terapêutica de neoantígeno in vitro. Por exemplo, uma linha de células imortalizadas ou uma linha de células de câncer misturada com células imunes (por exemplo, células T) é cultivada em meio ao qual é adicionado um peptídeo neoantigênico. Em algumas modalidades, as células tumorais são isoladas de uma amostra de paciente, por exemplo, uma biópsia de tecido, derrame pleural ou amostra de sangue, misturadas com células imunes (por exemplo, células T) e cultivadas em meio ao qual uma terapêutica de neoantígeno é adicionado. Em algumas modalidades, uma terapêutica de neoantígeno aumenta, promove e/ou melhora a atividade das células imunes. Em algumas modalidades, uma terapêutica de neoantígeno inibe o crescimento de células tumorais. Em algumas modalidades, uma terapêutica de neoantígeno ativa a morte das células tumorais.
[0512] Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o indivíduo tem um tumor ou o indivíduo tinha um tumor que foi removido pelo menos parcialmente.
[0513] Em algumas modalidades, um método para inibir o crescimento de um tumor compreende redirecionar uma resposta imune existente a um novo alvo, que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno, em que a resposta imune existente é contra um peptídeo antigênico entregue para a célula tumoral pelo peptídeo não antigênico. Em algumas modalidades, o método de tratamento envolve uma etapa para identificar um ou mais subtipos de HLA expressos no indivíduo antes de administrar um peptídeo, de modo que o peptídeo se ligue a pelo menos uma ou mais subtipos de HLA especificamente expressos pelo indivíduo. Em algumas modalidades, se um ou mais peptídeos BTK mutantes selecionados a partir da Tabela 34 forem administrados em um indivíduo, uma determinação anterior da expressão do subtipo de HLA correspondente ao peptídeo da Tabela 34 é realizada no indivíduo, de modo que o peptídeo administrado se ligue a pelo menos um ou mais subtipos de HLA especificamente expressos pelo indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por alelo HLA-C14:02, alelo HLA-C14:03, alelo HLA-A33:03, alelo HLA-C04:01, alelo HLA-B15:09 ou HLA-B38:02 em que a terapêutica compreende um peptídeo de BTK mutante que tem a sequência de aminoácidos EYMANGSLL (SEQ ID NO: 3207). Em algumas modalidades, se o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por qualquer um dentre alelo HLA-C02:02, alelo HLA-C03:02, alelo HLA-B53:01, alelo HLA-C12:02, alelo HLA-C12:03, alelo HLA-A36:01, alelo HLA-A26:01, alelo HLA-A25:01, alelo HLA- B57:01, alelo HLA-A03:01, alelo HLA-B46:01, alelo HLA- B15:03, alelo HLA-A33:03, alelo HLA-B35:03 ou um alelo HLA- A11:01, em que a terapêutica compreende um peptídeo de BTK mutante que tem a sequência de aminoácidos MANGSLLNY (SEQ ID NO: 3208). Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por qualquer um dentre alelo HLA-A02:04, alelo HLA-A02:03, alelo HLA-C03:02, alelo HLA-A03:01, alelo HLA-A32:01, alelo HLA-A02:07, alelo HLA-C14:03, alelo HLA-C14:02, alelo HLA- A31:01, alelo HLA-A30:02, alelo HLA-A74:01, alelo HLA- C06:02, alelo HLA-B15:03, alelo HLA-B46:01, alelo HLA- B13:02, alelo HLA-A25:01, alelo HLA-A29:02 ou um alelo HLA- C01:02 em que a terapêutica compreende um peptídeo de BTK mutante que tem a sequência de aminoácidos SLLNYLREM (SEQ ID NO: 3209).
[0514] Em algumas modalidades, o método compreende determinar que o indivíduo expressa uma proteína codificada por qualquer um dentre alelo HLA-B14:02, alelo HLA-B49:01,
alelo HLA-B44:03, alelo HLA-B44:02, alelo HLA-B37:01, alelo HLA-B15:09, alelo HLA-B41:01 ou alelo HLA-B50:01, em que a terapêutica compreende um peptídeo de BTK mutante que tem a sequência de aminoácidos TEYMANGSL (SEQ ID NO: 3210).
[0515] Em certas modalidades, o tumor compreende células tronco de câncer. Em certas modalidades, a frequência de células-tronco de câncer no tumor é reduzida pela administração da terapêutica de neoantígeno. Em algumas modalidades, um método para reduzir a frequência de células- tronco de câncer em um tumor em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno é fornecido.
[0516] Além disso, em alguns aspectos, a presente revelação fornece um método para reduzir a tumorigenicidade de um tumor em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento. Em certas modalidades, o tumor compreende células tronco de câncer. Em algumas modalidades, a tumorigenicidade de um tumor é reduzida reduzindo-se a frequência de células-tronco de câncer no tumor. Em algumas modalidades, os métodos compreendem usar a terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento. Em certas modalidades, a frequência de células-tronco de câncer no tumor é reduzida pela administração de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento.
[0517] Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido. Em certas modalidades, o tumor é um tumor selecionado a partir do grupo que consiste em: tumor colorretal, tumor pancreático, tumor pulmonar, tumor ovariano, tumor hepático,
tumor mamário, tumor renal, tumor prostático, tumor neuroendócrino, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de bexiga, glioblastoma e tumor de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o tumor é um tumor colorretal. Em certas modalidades, o tumor é um tumor ovariano. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor mamário. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor pulmonar. Em certas modalidades, o tumor é um tumor pancreático. Em certas modalidades, o tumor é um tumor de melanoma. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido.
[0518] A presente revelação fornece adicionalmente métodos para tratar câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento.
[0519] Em algumas modalidades, um método de tratamento de câncer compreende redirecionar uma resposta imune existente a um novo alvo, em que o método compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de terapêutica de neoantígeno, em que a resposta imune existente é contra um peptídeo antigênico entregue para a célula cancerosa pelo peptídeo não antigênico.
[0520] A presente revelação fornece métodos para tratar câncer que compreendem administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento (por exemplo, um indivíduo em necessidade da mesma). Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o indivíduo tem um tumor canceroso. Em certas modalidades, o indivíduo teve um tumor pelo menos parcialmente removido.
[0521] Os indivíduos podem ser, por exemplo, mamíferos, humanos, mulheres grávidas, adultos idosos, adultos, adolescentes, pré-adolescentes, crianças, bebês, lactantes, recém-nascidos ou neonatos. Um indivíduo pode ser um paciente. Em alguns casos, um indivíduo pode ser um humano. Em alguns casos, um indivíduo pode ser uma criança (isto é, um humano jovem que está abaixo da idade da puberdade). Em alguns casos, um indivíduo pode ser um lactante. Em alguns casos, o indivíduo pode ser um lactante alimentado por fórmula. Em alguns casos, um indivíduo pode ser um indivíduo envolvido em um estudo clínico. Em alguns casos, um indivíduo pode ser um animal de laboratório, por exemplo, um mamífero ou um roedor. Em alguns casos, o indivíduo pode ser um camundongo. Em alguns casos, o indivíduo pode ser um indivíduo obeso ou com sobrepeso.
[0522] Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado anteriormente com uma ou mais modalidades diferentes de tratamento do câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado anteriormente com um ou mais dentre radioterapia, quimioterapia ou imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado com uma, duas, três, quatro ou cinco linhas de terapia anterior. Em algumas modalidades, a terapia anterior é uma terapia citotóxica.
[0523] Em certas modalidades, o câncer é um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de mama, câncer de rim, câncer de próstata, câncer gastrointestinal, melanoma, câncer cervical, câncer neuroendócrino, câncer de bexiga, glioblastoma e câncer de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o câncer é câncer pancreático. Em certas modalidades, o câncer é câncer ovarino. Em certas modalidades, o câncer é câncer colorretal. Em certas modalidades, o câncer é câncer de mama. Em certas modalidades, o câncer é câncer de próstata. Em certas modalidades, o câncer é câncer de pulmão. Em certas modalidades, o câncer é melanoma. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer sólido. Em algumas modalidades, o câncer compreende um tumor sólido.
[0524] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico. Em alguma modalidade, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia mieloide aguda (AML), linfoma de Hodgkin, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células pilosas, leucemia mieloide crônica (CML), linfoma não-Hodgkin, linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), linfoma de células do manto (MCL) e linfoma cutâneo de células T (CTCL).
[0525] Em algumas modalidades, a terapêutica de neoantígeno é administrada como uma terapia combinada. A terapia combinada com dois ou mais agentes terapêuticos utiliza agentes que atuam por diferentes mecanismos de ação, embora isso não seja necessário. A terapia combinada usando agentes com diferentes mecanismos de ação pode resultar em efeitos aditivos ou sinérgicos. A terapia combinada pode permitir uma dose mais baixa de cada agente do que a usada em monoterapia, reduzindo assim os efeitos colaterais tóxicos e/ou aumentando o índice terapêutico do agente (ou agentes). A terapia combinada pode diminuir a probabilidade de desenvolvimento de células cancerosas resistentes. Em algumas modalidades, a terapia combinada compreende um agente terapêutico que afeta a resposta imune (por exemplo, aumenta ou ativa a resposta) e um agente terapêutico que afeta (por exemplo, inibe ou mata) as células tumorais/cancerosas.
[0526] Em alguns casos, uma composição farmacêutica imunogênica pode ser administrada com um agente adicional. Em algumas modalidades, a terapêutica de neoantígeno pode ser administrada com uma imunoterapia. A imunoterapia pode ser, por exemplo, um anticorpo direcionado a um ponto de controle imunológico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. A escolha do agente adicional pode depender, pelo menos em parte, da condição a ser tratada. O agente adicional pode incluir, por exemplo, um agente de inibidor de ponto de verificação, como um agente anti-PD1, anti-CTLA4, anti-PD-L1, anti CD40 ou anti-TIM3 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1, anti-CTLA4, anti-PD-L1, anti CD40 ou anti-TIM3); ou quaisquer agentes que têm um efeito terapêutico para uma infecção por patógeno (por exemplo, infecção viral), incluindo, por exemplo, fármacos usados para tratar condições inflamatórias, como um NSAID, por exemplo, ibuprofeno, naproxeno, acetaminofeno, cetoprofeno ou aspirina. Por exemplo, o inibidor de ponto de verificação pode ser um antagonista de PD-1/PD-L1 selecionado a partir do grupo que consiste em: nivolumabe (ONO-4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO), pembrolizumabe (MK- 3475, KEYTRUDA), pidilizumabe (CT-011) e MPDL328OA (ROCHE). Como um outro exemplo, as formulações podem conter adicionalmente um ou mais suplementos, como vitamina C, E ou outros antioxidantes.
[0527] Os métodos da revelação podem ser usados para tratar qualquer tipo de câncer conhecido na técnica. Exemplos não limitativos de cânceres a serem tratados pelos métodos da presente revelação podem incluir melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônios), adenocarcinoma pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de esôfago, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de tiroide, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma e outras doenças neoplásicas.
[0528] Além disso, a doença ou condição fornecida nesse documento inclui malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido usando os métodos de tratamento da presente revelação. Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos de tratamento da presente revelação é selecionado a partir do grupo que consiste em carcinoma, carcinoma escamoso, adenocarcinoma, sarcomata, câncer endometrial, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de trompa de Falópio, câncer peritoneal primário, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma de células escamosas da região anogenital, melanoma, carcinoma de células renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas do pulmão, câncer de estômago, câncer de bexiga, câncer de vesícula biliar, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de laringe, câncer de glândula salivar, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, glioblastoma, glioma, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer pancreático, mesotelioma, sarcoma, câncer hematológico, leucemia, linfoma, neuroma e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos da presente revelação inclui, por exemplo, carcinoma, carcinoma escamoso (por exemplo, canal cervical, pálpebra, túnica conjuntiva, vagina, pulmão, cavidade oral, pele, bexiga urinária, língua, laringe e esófago) e adenocarcinoma (por exemplo, próstata, intestino delgado, endométrio, canal cervical, intestino grosso, pulmão, pâncreas, esófago, reto, útero, estômago, glândula mamária e ovário). Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos da presente revelação inclui ainda sarcoma (por exemplo, sarcoma miogênico), leucose, neuroma, melanoma e linfoma. Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos da presente revelação é câncer de mama. Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos de tratamento da presente revelação é câncer de mama triplo negativo (TNBC). Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos de tratamento da presente revelação é câncer ovarino. Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado pelos métodos de tratamento da presente revelação é câncer colorretal.
[0529] Em algumas modalidades, um paciente ou população de pacientes a ser tratado com uma composição farmacêutica da presente revelação tem um tumor sólido. Em algumas modalidades, um tumor sólido é um melanoma, carcinoma de células renais, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de vesícula biliar, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de tiroide, câncer de estômago, câncer de glândula salivar, câncer de próstata, câncer pancreático ou carcinoma de células de Merkel. Em algumas modalidades, um paciente ou população de pacientes a ser tratado com uma composição farmacêutica da presente revelação tem um câncer hematológico. Em algumas modalidades, o paciente tem um câncer hematológico, como linfoma difuso de grandes células B ("DLBCL"), linfoma de Hodgkin ("HL"), linfoma não-Hodgkin ("NHL"), linfoma folicular ("FL"), leucemia mieloide aguda (“AML”) ou mieloma múltiplo (“MM”). Em algumas modalidades, um paciente ou população de pacientes a ser tratado que tem o câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer ovarino, câncer de pulmão e melanoma.
[0530] Os exemplos específicos de cânceres que podem ser impedidos e/ou tratados de acordo com a presente revelação incluem, porém sem limitação, o seguinte: câncer renal, câncer de rins, glioblastoma multiforme, câncer de mama metastático; carcinoma de mama; Sarcoma de mama; neurofibroma; neurofibromatose; tumores pediátricos; neuroblastoma; melanoma maligno; carcinomas da epiderme; leucemias, como, porém sem limitação, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, como mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia e síndrome micodisplásica, leucemia mielocítica crônica, como, porém sem limitação, leucemia mielocítica crônica (granulometria) (leucemia linfocítica crônica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas, como, porém sem limitação, doença de Hodgkin, doença não-Hodgkin; mielomas múltiplos, como, porém sem limitação, mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gamopatia monoclonal de significância indeterminada; gamopatia monoclonal benigna; doença de cadeia pesada; câncer ósseo e sarcoma do tecido conjuntivo, como, porém sem limitação, a sarcoma ósseo, mieloma doença óssea, mieloma múltiplo, osteossarcoma ósseo induzido por colesteatoma, doença óssea de Paget, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrossarcoma ósseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcoma de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangio sarcoma, neurilemmoma, rabdomiossarcoma e sarcoma sinovial; tumores cerebrais, como, porém sem limitação, glioma, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglioma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pinocitoma, pineoblastoma e linfoma cerebral primário; câncer de mama, incluindo, porém sem limitação, adenocarcinoma, carcinoma lobular (células pequenas), carcinoma intraductal, câncer de mama medular, câncer de mama mucinoso, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget (incluindo doença de Paget juvenil) e câncer de mama inflamatório; câncer adrenal, como, porém sem limitação, feocromocitoma e carcinoma adrenocortical; câncer da tiroide, como, porém sem limitação, câncer papilar ou folicular da tiroide, câncer medular da tiroide e câncer anaplásico da tiroide; câncer do pâncreas como, porém sem limitação, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina e tumor carcinoide ou de células das ilhotas; cânceres da hipófise, como, porém sem limitação, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia e diabetes insipius; cânceres dos olhos, como, porém sem limitação, melanoma ocular, como melanoma da íris, melanoma da coroide e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; cânceres vaginais, como carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e melanoma; câncer vulvar, como carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basais, sarcoma e doença de Paget; cânceres cervicais, como, porém sem limitação, carcinoma de célula escamosa, e adenocarcinoma; cânceres cervicais, como, porém sem limitação, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma; cânceres do ovário, como, porém sem limitação, carcinoma epitelial do ovário, tumor limítrofe, tumor de células germinativas e tumor estromal; carcinoma cervical; cânceres esofágicos, como, porém sem limitação, câncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma adenoide cítico, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso e carcinoma de células de aveia (células pequenas); cânceres do estômago como, porém sem limitação, adenocarcinoma, fungicida (polipoide), ulceração, disseminação superficial, disseminação difusa, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma e carcinossarcoma; cânceres de cólon; câncer colorretal, câncer colorretal com mutação KRAS; carcinoma de cólon; cânceres retais; cânceres do fígado, como, porém sem limitação, carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma, cânceres da vesícula biliar, como adenocarcinoma; colangiocarcinomas, como, porém sem limitação, papilares, nodulares e difusos; cânceres do pulmão, como câncer do pulmão de células não pequenas com mutação KRAS, câncer do pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e câncer do pulmão de células pequenas; carcinoma de pulmão; cânceres testiculares, como, porém sem limitação, tumor germinativo, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, não seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor do saco vitelino), cânceres de próstata, como, porém sem limitação, independente de andrógeno câncer da próstata, câncer da próstata dependente de androgénio, adenocarcinoma, leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma; cânceres penais; cânceres orais, como porém sem limitação carcinoma de células escamosas; cânceres basais; cânceres das glândulas salivares, como, porém sem limitação, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide e carcinoma adenoidcístico; cânceres da faringe, como, porém sem limitação, câncer das células escamosas e verrucoso; cânceres da pele, como, porém sem limitação, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas e melanoma, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma acralentiginoso; cânceres renais, como, porém sem limitação, câncer das células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, câncer das células transicionais (pélvis renal e/ou útero); carcinoma renal; tumor de Wilms; cânceres da bexiga, como, porém sem limitação, carcinoma de células transicionais, câncer de células escamosas, adenocarcinoma, carcinossarcoma.
Além disso, os cânceres incluem mixossarcoma, sarcoma osteogênico, endoteliossarcoma, linfangioendoteliosarcoma,
mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cianenocarcinoma, carcinoma broncogênico, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma papilífero e carcinoma de glândula sebácea, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilenocarcinoma sebáceo.
[0531] Os cânceres incluem, porém sem limitação, câncer de células B, por exemplo, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, as doenças da cadeia pesada, como, por exemplo, doença da cadeia alfa, doença da cadeia gama e doença da cadeia mu, gamopatia monoclonal benigna e amiloidose imunocítica, melanomas, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de brônquio, câncer colorretal, câncer de próstata (por exemplo, metastático, câncer de próstata refratário a hormônios), câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de ovário, câncer de bexiga urinária, cérebro ou câncer do sistema nervoso central, câncer do sistema nervoso periférico, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer uterino ou endometrial, câncer da cavidade oral ou faringe, câncer de fígado, câncer de rim, câncer testicular, câncer do trato biliar, intestino delgado ou câncer de apêndice, câncer de glândula salivar, câncer de glândula tiroide, câncer da glândula adrenal, osteossarcoma, condrossarcoma, câncer de tecidos hematológicos e semelhantes. Outros exemplos não limitantes de tipos de cânceres aplicáveis aos métodos abrangidos pela presente revelação incluem sarcomas e carcinomas humanos, por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, mesofangiossarcoma, mesofangiosarcoma, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma,
linfangiosarcoma, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma, linfangiosarcoma, mesotelioendioma, mesotelioendioma, mesotelioendioma, mesotelioendiosarcoma, mixosarcoma, mixosarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, mixossarcoma, condrossarcoma, Tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilenocarcinoma cistadenocarcinoma, adenocarcinoma papilenocarcinoma, adenocarcinoma papilenocarcinoma. carcinoma, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, câncer de fígado, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer ósseo, tumor cerebral, câncer testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequenas, bexiga carcinoma, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por exemplo, leucemia linfocítica aguda e leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia); leucemia crônica (leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica); e policitemia vera, linfoma (doença de Hodgkin e doença não-Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e doença da cadeia pesada.
Em algumas modalidades, o câncer cujo fenótipo é determinado pelo método da presente revelação é um câncer epitelial, como, porém sem limitação, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer ginecológico, câncer renal, câncer de laringe, câncer de pulmão, câncer oral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata ou câncer de pele. Em outras modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer de cólon. Em ainda outras modalidades, o câncer epitelial é câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células renais não papilares, carcinoma cervical, carcinoma de ovário (por exemplo, carcinoma de ovário seroso) ou carcinoma de mama. Os cânceres epiteliais podem ser caracterizados de várias outras maneiras, incluindo, porém sem limitação, seroso, endometrioide, mucinoso, células claras, brenner ou indiferenciado. Em algumas modalidades, a presente revelação é usada no tratamento, diagnóstico e/ou prognóstico de linfoma ou seus subtipos, incluindo, porém sem limitação, linfoma de células do manto. Os transtornos linfoproliferativos também são considerados doenças proliferativas.
[0532] Em algumas modalidades, a combinação de um agente descrito no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional resulta em resultados aditivos ou sinérgicos. Em algumas modalidades, a terapia combinada resulta em um aumento no índice terapêutico do agente. Em algumas modalidades, a terapia combinada resulta em um aumento no índice terapêutico do agente (ou agentes) terapêutico adicional. Em algumas modalidades, a terapia combinada resulta em uma diminuição na toxicidade e/ou efeitos colaterais do agente. Em algumas modalidades, a terapia combinada resulta em uma diminuição na toxicidade e/ou efeitos colaterais do agente (ou agentes) terapêutico adicional.
[0533] Em certas modalidades, além de administrar uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento, o método ou tratamento compreende adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional. um agente terapêutico adicional pode ser administrado antes, simultaneamente com e/ou subsequentemente à administração do agente. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente terapêutico adicional compreende 1, 2, 3, ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[0534] Os agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com a terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento incluem agentes quimioterápicos. Desse modo, em algumas modalidades, o método ou tratamento envolve a administração de um agente descrito no presente documento em combinação com um agente quimioterápico ou em combinação com um coquetel de agentes quimioterápicos. O tratamento com um agente pode ocorrer antes, simultaneamente com e/ou subsequentemente à administração de quimioterapias. A administração combinada pode incluir coadministração, de uma única formulação farmacêutica ou com o uso de formulações separadas, ou administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo de modo que todos os agentes ativos possam exercer suas atividades biológicas simultaneamente. A preparação e os cronogramas de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com as instruções dos fabricantes ou como determinado empiricamente pelo médico versado. A preparação e os cronogramas de dosagem para tal quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Source Book, 4ª Edição, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA., EUA.
[0535] Classes úteis de agentes quimioterápicos incluem, por exemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligantes de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, como cisplatina, mono(platina), bis(platina) e complexos de platina trinuclear e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabólitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposídeos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinóis, antimetabólitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, inibidores de taxação, vinca alcaloides ou similares. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico é um agente alquilante, um antimetabólito, um antimitótico, um inibidor da topoisomerase ou um inibidor da angiogênese.
[0536] Os agentes quimioterápicos úteis na presente revelação incluem, mas não são limitados a, agentes alquilantes, como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN); sulfonatos de alquila, como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamima; mostardas de nitrogênio, como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citosina arabinosídeo, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçadores de ácido fólico, como ácido folínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacarina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2’’- triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida (Ara-C); taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL) e docetaxel (TAXOTERE); clorambucila; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; análogos de platina, como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrono; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; ibandronato; CPT11; inhibitor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina (XELODA); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos mencionados acima.
Os agentes quimioterápicos também incluem agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores, como antiestrogênios, incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis de inibição de aromatase, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (FARESTON); e antiandrógenos, como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos mencionados acima.
Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é cisplatina.
Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é carboplatina.
[0537] Em certas modalidades, o agente quimioterápico é um inibidor de topoisomerase. Os inibidores da topoisomerase são agentes quimioterápicos que interferem na ação de uma enzima topoisomerase (por exemplo, topoisomerase I ou II). Os inibidores da topoisomerase incluem, porém sem limitação, doxorrubicina HCl, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HCl, actinomicina D, etoposídeo, topotecano HCl, teniposídeo (VM-26) e irinotecano, bem como sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um desses. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é irinotecano.
[0538] Em certas modalidades, o agente quimioterápico é um antimetabólito. Um antimetabólito é uma substância química com uma estrutura que é similar a um metabólito necessário para as reações bioquímicas normais, mas diferente o suficiente para interferir em uma ou mais funções normais das células, como a divisão celular. Os antimetabólitos incluem, porém sem limitação, gemcitabina, fluorouracila, capecitabina, metotrexato de sódio, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, citosina arabinosídeo, tioguanina, 5-azacitidina, 6 mercaptopurina, azatioprina, 6- tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina e cladribina, bem como sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um desses. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é gemcitabina.
[0539] Em certas modalidades, o agente quimioterápico é um agente antimitótico, incluindo, porém sem limitação, agentes que se ligam à tubulina. Em algumas modalidades, o agente é um taxano. Em certas modalidades, o agente é paclitaxel ou docetaxel, ou um sal farmaceuticamente aceitável, ácido ou derivado de paclitaxel ou docetaxel. Em certas modalidades, o agente é paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel ligado à albumina (ABRAXANE), DHA- paclitaxel ou PG-paclitaxel. Em certas modalidades alternativas, o agente antimitótico compreende um alcaloide de vinca, como vincristina, vinblastina, vinorelbina ou vindesina, ou seus sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o agente antimitótico é um inibidor de cinesina Eg5 ou um inibidor de uma quinase mitótica, como Aurora A ou Plk1. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é paclitaxel. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é paclitaxel ligado à albumina.
[0540] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional compreende um agente como uma molécula pequena. Por exemplo, o tratamento pode envolver a administração combinada de um agente da presente revelação com uma pequena molécula que atua como um inibidor contra antígenos associados a tumor incluindo, porém sem limitação, EGFR, HER2 (ErbB2) e/ou VEGF. Em algumas modalidades, um agente da presente revelação é administrado em combinação com um inibidor de proteína quinase selecionado a partir do grupo que consiste em: gefitinibe (IRESSA), erlotinibe (TARCEVA), sunitinibe (SUTENT), lapatanibe, vandetanibe (ZACTIMA), AEE788, CI-1033, cediranibe (RECENTIN), sorafenibe (NEXAVAR) e pazopanibe (GW786034B). Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional compreende um inibidor de mTOR. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico adicional é quimioterapia ou outros inibidores que reduzem o número de células Treg. Em certas modalidades, o agente terapêutico é ciclofosfamida ou um anticorpo anti-CTLA4. Em uma outra modalidade, a terapêutica adicional reduz a presença de células supressoras derivadas de mieloide. Em uma modalidade adicional, a terapêutica adicional é carbotaxol. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico adicional muda as células para uma resposta T auxiliar 1. Em uma modalidade adicional, o agente terapêutico adicional é ibrutinibe.
[0541] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional compreende uma molécula biológica, como um anticorpo. Por exemplo, tratamento pode envolver a administração combinada de um agente da presente revelação com anticorpos contra antígenos associados a tumor incluindo, porém sem limitação, anticorpos que ligam EGFR, HER2/ErbB2 e/ou VEGF. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo específico para um marcador de célula-tronco de câncer. Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que é um inibidor de angiogênese (por exemplo, um anticorpo de receptor de VEGF ou anti-VEGF). Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional é bevacizumabe (AVASTIN), ramucirumabe, trastuzumabe (HERCEPTIN), pertuzumabe (OMNITARG), panitumumabe (VECTIBIX), nimotuzumabe, zalutumumabe ou cetuximabe (ERBITUX).
[0542] Os agentes e composições fornecidos no presente documento podem ser usados em separado ou em combinação com regimes terapêuticos convencionais, como cirurgia, irradiação, quimioterapia e/ou transplante de medula óssea (autólogo, singênico, alogênico ou não relacionado). Um conjunto de antígenos tumorais pode ser útil, por exemplo, em uma grande fração de pacientes com câncer.
[0543] Em algumas modalidades, pelo menos um ou mais agentes quimioterápicos podem ser administrados além da composição que compreende uma vacina imunogênica. Em algumas modalidades, a uma ou mais agentes quimioterápicos podem pertencer a diferentes classes de agentes quimioterápicos.
[0544] Exemplos de agentes de quimioterapia incluem, porém sem limitação, agentes alquilantes, como mostardas de nitrogênio (por exemplo, mecloretamina (mostarda de nitrogênio), clorambucila, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida e melfalano); nitrosoureias (por exemplo, N- Nitroso-N-metilureia, estreptozocina, carmustina (BCNU), lomustina e semustina); alquil sulfonatos (por exemplo, busulfano); tetrazinas (por exemplo, dacarbazina (DTIC), mitozolomida e temozolomida (Temodar®)); aziridinas (por exemplo, tiotepa, mitomicina e diaziquona); e fármacos de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina); agentes de alquilação não clássicos, como procarbazina e altretamina (hexametilmelamina); agentes antimetabólitos, como 5-fluorouracila (5-FU), 6- mercaptopurina (6-MP), capecitabina (Xeloda®), cladribina, clofarabina, citarabina (Ara-C®), decitabina, floxuridina, fludarabina, nelarabina, gemcitabina (Gemzar®), hidroxiureia, metotrexato, pemetrexed (Alimta®), pentostatina, tioguanina, Vidaza; agentes antimicrotúbulos, como alcaloides de vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina e vinflunina); taxanos (por exemplo, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®)); podofillotoxina (por exemplo, etoposídeo e teniposídeo);
epotilonas (por exemplo, ixabepilona (Ixempra®)); estramustina (Emcyt®); antibióticos antitumorais, como antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina, doxorrubicina (Adriamycin®, epirrubicina, idarrubicina); actinomicina-D; e bleomicina; inibidores de topoisomerase I, como topotecano e irinotecano (CPT-11); inibidores de topoisomerase II, como etoposídeo (VP-16), teniposídeo, mitoxantrona, novobiocina, merbarona e aclarubicina; corticosteroides, como prednisona, metilprednisolona (Solumedrol®) e dexametasona (Decadron®); L-asparaginase; bortezomibe (Velcade®); agentes imunoterápicos, como rituximabe (Rituxan®), alemtuzumabe (Campath®), talidomida, lenalidomida (Revlimid®), BCG, interleucina-2, interferon-alfa e vacinas contra câncer, como Provenge®; agentes hormonais terapêuticos, como fulvestrant (Faslodex®), tamoxifeno, toremifeno (Fareston®), anastrozol (Arimidex®), exemestan (Aromasin®), letrozol (Femara®), acetato de megestrol (Megace®), estrogênios, bicalutamida (Casodex® ), flutamida (Eulexin®), nilutamida (Nilandron®), leuprolida (Lupron®) e goserelina (Zoladex®); agentes de diferenciação, como retinoides, tretinoína (ATRA ou Atralin®), bexaroteno (Targretin®) e trióxido de arsênio (Arsenox®); e agentes terapêuticos direcionados, como imatinibe (Gleevec®), gefitinibe (Iressa®) e sunitinibe (Sutent®). Em algumas modalidades, a quimioterapia é uma terapia de coquetel.
Exemplos de uma terapia de coquetel incluem, porém sem limitação, CHOP/R-CHOP (rituxano, ciclofosfamida, hidroxidoxorrubicina, vincristina e prednisona), EPOCH (etoposido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, hidroxidoxorrubicina), Hiper-CVAD (ciclofosfamida), vincristina, hidroxidoxorrubicina,
dexametasona), FOLFOX (fluorouracil (5-FU), leucovorina, oxaliplatina), ICE (ifosfamida, carboplatina, etoposídeo), DHAP (citarabina em alta dosagem [ara-C], dexametasona (etoposatina), metilprednisolona, citarabina [ara-C], cisplatina) e CMF (ciclofosfamida, metotrexato, fluouracila).
[0545] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica pode ser usada em combinação com um inibidor de uma fosfoinositídeo 3-quinase (PI3 quinase, PI3K). Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser usada em combinação com Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477, AEZS-136 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0546] Em algumas modalidades, doses do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136, empregadas para o tratamento humano podem estar na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg por dia (por exemplo, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg por dia, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg por dia, cerca de 10 mg/kg por dia ou cerca de 30 mg/kg por dia). A dose desejada pode ser convenientemente administrada em uma dose única ou como múltiplas doses administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia.
[0547] Em algumas modalidades, a dosagem do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136, pode ser de cerca de 1 ng/kg a cerca de 100 mg/kg. A dosagem do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136, pode estar em qualquer dosagem incluindo, porém sem limitação, cerca de 1 µg/kg, 25 µg/kg, 50 µg/kg, 75 µg/kg, 100 µ µg/kg, 125 µg/kg, 150 µg/kg, 175 µg/kg, 200 µg/kg, 225 µg/kg, 250 µg/kg,
275 µg/kg, 300 µg/kg, 325 µg/kg, 350 µg/kg, 375 µg/kg, 400 µg/kg, 425 µg/kg, 450 µg/kg, 475 µg/kg, 500 µg/kg, 525 µg/kg, 550 µg/kg, 575 µg/kg, 600 µg/kg, 625 µg/kg, 650 µg/kg, 675 µg/kg, 700 µg/kg, 725 µg/kg, 750 µg/kg, 775 µg/kg, 800 µg/kg, 825 µg/kg, 850 µg/kg, 875 µg/kg, 900 µg/kg, 925 µg/kg, 950 µg/kg, 975 µg/kg, 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg ou 100 mg/kg.
[0548] O modo de administração da vacina imunogênica e do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE- 477 ou AEZS-136, pode ser simultânea ou sequencialmente, em que a vacina imunogênica e o pelo menos um agente farmaceuticamente ativo adicional são sequencialmente (ou separadamente) administrados. Por exemplo, a vacina imunogênica e o inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe
(GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136, podem ser fornecidos em uma forma de dosagem unitária única para serem tomados em conjunto ou como entidades separadas (por exemplo, em reservatórios separados) para serem administrados simultaneamente ou com uma certa diferença de tempo.
Essa diferença de tempo pode ser entre 1 hora e 1 mês, por exemplo, entre 1 dia e 1 semana, por exemplo, 48 horas e 3 dias.
Além disso, é possível administrar a vacina imunogênica através de uma outra maneira de administração diferente do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136. Por exemplo, pode ser vantajoso administrar a vacina imunogênica ou o inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136, por via intravenosa e o outro sistemicamente ou por via oral. Por exemplo, a vacina imunogênica é administrada por via intravenosa ou por via subcutânea e o inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136, por via oral.
[0549] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente antes do inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136. Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada de 1-24 horas, 2-24 horas, 3-24 horas, 4-24 horas, 5-24 horas, 6-24 horas, 7-24 horas, 8-24 horas, 9-24 horas, 10-24 horas, 11-24 horas, 12-24 horas, 1-30 dias, 2-30 dias, 3-30 dias, 4-30 dias, 5-30 dias, 6-30 dias, 7-30 dias, 8-30 dias, 9,-30 dias, 10-30 dias, 11-30 dias, 12-30 dias, 13-30 dias, 14-30 dias, 15-30 dias, 16-30 dias, 17-30 dias, 18-30 dias, 19-30 dias, 20-30 dias, 21-30 dias, 22-30 dias, 23-30 dias, 24-30 dias, 25-30 dias, 26-30 dias, 27-30 dias, 28-30 dias, 29-30 dias, 1-4 semana, 2-4 semanas, 3-4 semanas, 1-12 meses, 2-12 meses, 3-12 meses, 4- 12 meses, 5-12 meses, 6-12 meses, 7-12 meses, 8-12 meses, 9- 12 meses, 10-12 meses, 11-12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de PI3 quinase ser administrado.
Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de PI3 quinase ser administrado.
Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe,
Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136 ser administrado.
[0550] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de PI3 quinase ser administrado. Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada no máximo de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona
C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136 ser administrado.
[0551] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de PI3 quinase ser administrado. Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos,
antes de Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136 ser administrado.
[0552] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente ao mesmo tempo que o pelo menos um agente farmaceuticamente ativo adicional.
[0553] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente após o inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136. Em algumas modalidades, o inibidor de PI3 quinase é administrado a partir de 1-24 horas, 2-24 horas, 3-24 horas, 4-24 horas, 5-24 horas, 6-24 horas, 7-24 horas, 8-24 horas, 9-24 horas, 10-24 horas, 11- 24 horas, 12-24 horas, 1-30 dias, 2-30 dias, 3-30 dias, 4- 30 dias, 5-30 dias, 6-30 dias, 7-30 dias, 8-30 dias, 9,-30 dias, 10-30 dias, 11-30 dias, 12-30 dias, 13-30 dias, 14-30 dias, 15-30 dias, 16-30 dias, 17-30 dias, 18-30 dias, 19-30 dias, 20-30 dias, 21-30 dias, 22-30 dias, 23-30 dias, 24-30 dias, 25-30 dias, 26-30 dias, 27-30 dias, 28-30 dias, 29-30 dias, 1-4 semana, 2-4 semanas, 3-4 semanas, 1-12 meses, 2- 12 meses, 3-12 meses, 4-12 meses, 5-12 meses, 6-12 meses, 7- 12 meses, 8-12 meses, 9-12 meses, 10-12 meses, 11-12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
Em algumas modalidades, o inibidor de PI3 quinase é administrado pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
Por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-136, podem ser administrados pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias,
8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0554] Em algumas modalidades, o inibidor de PI3 quinase é administrado no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada. Por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136, podem ser administrados no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas,
8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0555] Em algumas modalidades, o inibidor de PI3 quinase é administrado cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada. Por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-
103, GNE-477 ou AEZS-136 podem ser administrados cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0556] Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de PI3 quinase. Por exemplo, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615,
ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136.
[0557] Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica é administrada uma vez, duas vezes ou três vezes por dia por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias consecutivos seguido de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias de repouso (por exemplo, nenhuma administração da vacina imunogênica/descontinuação de tratamento) em um ciclo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias; e o inibidor de PI3 quinase (por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136) é administrado antes, concomitantemente com ou subsequente à administração da vacina imunogênica em um ou mais dias (por exemplo, no dia 1 do ciclo 1). Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 13 ciclos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1 a 12 ou 13 ciclos de 28 dias (por exemplo, cerca de 12 meses).
[0558] Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de PI3 quinase, por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136 e um agente ativo secundário, como um inibidor de ponto de verificação. Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica é administrada uma vez, duas vezes ou três vezes por dia por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias consecutivos seguido de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias de repouso (por exemplo, nenhuma administração da vacina imunogênica/descontinuação de tratamento) em um ciclo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias; o inibidor de PI3 quinase (por exemplo, Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719),
Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC- 907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI- 103, GNE-477 ou AEZS-136) é administrado antes, concomitantemente com, ou subsequente à administração da vacina imunogênica em um ou mais dias (por exemplo, no dia 1 do ciclo 1), e o agente secundário é administrado por dia, por semana ou por mês. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 13 ciclos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1 a 12 ou 13 ciclos de 28 dias (por exemplo, cerca de 12 meses).
[0559] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica pode ser usada em combinação com inibidores das quinases dependentes de ciclina, por exemplo, com um inibidor de CDK4 e/ou CDK6. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é palbociclibe (IBRANCE) (consulte, por exemplo, Clin. Cancer Res.; 2015, 21(13); 2905–10). Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é ribociclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é abemaciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é seliciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é dinaciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é milciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é roniciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é atuveciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é briciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é riviciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é seliciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é trilaciclibe. Um exemplo de tal inibidor que pode ser usado em combinação com a presente vacina imunogênica é voruciclibe. Em alguns exemplos, as vacinas imunogênicas da revelação podem ser usadas em combinação com um inibidor de CDK4 e/ou CDK6 e com um agente que reforça a atividade citostática de inibidores de CDK4/6 e/ou com um agente que converte citostase reversível em morte celular ou parada de crescimento irreversível. Os subtipos de câncer exemplificativos incluem NSCLC, melanoma, neuroblastoma, glioblastoma, lipossarcoma e linfoma de células do manto.
[0560] Em algumas modalidades, as doses do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe empregada para o tratamento humano podem estar na faixa de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg por dia (por exemplo, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg por dia, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg por dia, cerca de 10 mg/kg por dia ou cerca de
30 mg/kg por dia). A dose desejada pode ser convenientemente administrada em uma dose única ou como múltiplas doses administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia.
[0561] Em algumas modalidades, a dosagem do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe pode ser de cerca de 1 ng/kg a cerca de 100 mg/kg. A dosagem do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe pode estar em qualquer dosagem incluindo, porém sem limitação, cerca de 1 µg/kg, 25 µg/kg, 50 µg/kg, 75 µg/kg, 100 µ µg/kg, 125 µg/kg, 150 µg/kg, 175 µg/kg, 200 µg/kg, 225 µg/kg, 250 µg/kg, 275 µg/kg, 300 µg/kg, 325 µg/kg, 350 µg/kg, 375 µg/kg, 400 µg/kg, 425 µg/kg, 450 µg/kg, 475 µg/kg, 500 µg/kg, 525 µg/kg, 550 µg/kg, 575 µg/kg, 600 µg/kg, 625 µg/kg, 650 µg/kg, 675 µg/kg, 700 µg/kg, 725 µg/kg, 750 µg/kg, 775 µg/kg, 800 µg/kg, 825 µg/kg, 850 µg/kg, 875 µg/kg, 900 µg/kg, 925 µg/kg, 950 µg/kg, 975 µg/kg, 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg ou 100 mg/kg.
[0562] O modo de administração da vacina imunogênica e do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe, pode ser simultânea ou sequencialmente, em que a vacina imunogênica e o pelo menos um agente farmaceuticamente ativo adicional são sequencialmente (ou separadamente) administrados. Por exemplo, a vacina imunogênica e o inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe,
ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe, podem ser fornecidas em uma forma de dosagem unitária única para serem tomados em conjunto ou como entidades separadas (por exemplo, em reservatórios separados) a serem administradas simultaneamente ou com uma certa diferença de tempo. Essa diferença de tempo pode ser entre 1 hora e 1 mês, por exemplo, entre 1 dia e 1 semana, por exemplo, 48 horas e 3 dias. Além disso, é possível administrar a vacina imunogênica através de uma outra via de administração diferente do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe. Por exemplo, pode ser vantajoso administrar a vacina imunogênica ou o inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe por via intravenosa e o outro sistemicamente ou por via oral. Por exemplo, a vacina imunogênica é administrada por via intravenosa ou por via subcutânea e o inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe por via oral.
[0563] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente antes do inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe. Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada de 1-24 horas, 2-24 horas, 3-24 horas, 4-24 horas, 5-24 horas, 6-24 horas, 7-24 horas, 8-24 horas, 9-24 horas, 10-24 horas, 11-24 horas, 12-24 horas, 1-30 dias, 2-30 dias, 3-30 dias, 4-30 dias, 5-30 dias, 6-30 dias, 7-30 dias, 8-30 dias, 9,-30 dias, 10-30 dias, 11-30 dias, 12-30 dias, 13-30 dias, 14-30 dias, 15-30 dias, 16-30 dias, 17-30 dias, 18-30 dias, 19-30 dias, 20-30 dias, 21-30 dias, 22-30 dias, 23-30 dias, 24-30 dias, 25-30 dias, 26-30 dias, 27-30 dias, 28-30 dias, 29-30 dias, 1-4 semana, 2-4 semanas, 3-4 semanas, 1-12 meses, 2-12 meses, 3-12 meses, 4- 12 meses, 5-12 meses, 6-12 meses, 7-12 meses, 8-12 meses, 9- 12 meses, 10-12 meses, 11-12 meses, ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de quinase dependente de ciclina ser administrado.
Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de quinase dependente de ciclina ser administrado.
Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe ser administrado.
[0564] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de quinase dependente de ciclina ser administrado. Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada no máximo de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe ser administrado.
[0565] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, ou qualquer combinação dos mesmos, antes de o inibidor de quinase dependente de ciclina ser administrado. Por exemplo, a vacina imunogênica pode ser administrada cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe ser administrado.
[0566] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente ao mesmo tempo que o pelo menos um agente farmaceuticamente ativo adicional.
[0567] Em algumas modalidades, a vacina imunogênica é administrada cronologicamente após o inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase dependente de ciclina é administrado a partir de 1-24 horas, 2-24 horas, 3-24 horas, 4-24 horas, 5- 24 horas, 6-24 horas, 7-24 horas, 8-24 horas, 9-24 horas, 10-24 horas, 11-24 horas, 12-24 horas, 1-30 dias, 2-30 dias, 3-30 dias, 4-30 dias, 5-30 dias, 6-30 dias, 7-30 dias, 8-30 dias, 9,-30 dias, 10-30 dias, 11-30 dias, 12-30 dias, 13-30 dias, 14-30 dias, 15-30 dias, 16-30 dias, 17-30 dias, 18-30 dias, 19-30 dias, 20-30 dias, 21-30 dias, 22-30 dias, 23-30 dias, 24-30 dias, 25-30 dias, 26-30 dias, 27-30 dias, 28-30 dias, 29-30 dias, 1-4 semana, 2-4 semanas, 3-4 semanas, 1- 12 meses, 2-12 meses, 3-12 meses, 4-12 meses, 5-12 meses, 6- 12 meses, 7-12 meses, 8-12 meses, 9-12 meses, 10-12 meses, 11-12 meses, ou qualquer combinação dos mesmos, antes de avacina imunogênica ser administrada.
Em algumas modalidades, o inibidor de quinase dependente de ciclina é administrado pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
Por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe pode ser administrado pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0568] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase dependente de ciclina é administrado no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada. Por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe pode ser administrado no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0569] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase dependente de ciclina é administrado cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, três semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada. Por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe pode ser administrado cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9, dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou qualquer combinação dos mesmos, antes de a vacina imunogênica ser administrada.
[0570] Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de quinase dependente de ciclina. Por exemplo, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe.
[0571] Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica é administrada uma vez, duas vezes ou três vezes por dia por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias consecutivos seguido de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias de repouso (por exemplo, nenhuma administração da vacina imunogênica/descontinuação de tratamento) em um ciclo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias; e o inibidor de quinase dependente de ciclina (por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe) é administrado antes, concomitantemente com ou subsequente à administração da vacina imunogênica em um ou mais dias (por exemplo, no dia 1 do ciclo 1). Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 13 ciclos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1 a 12 ou 13 ciclos de 28 dias (por exemplo, cerca de 12 meses).
[0572] Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de uma condição ou doença que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina imunogênica em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de quinase dependente de ciclina, por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe, e um agente ativo secundário, como um inibidor de ponto de verificação. Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica é administrada uma vez, duas vezes ou três vezes por dia por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias consecutivos seguido de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias de repouso (por exemplo, nenhuma administração da vacina imunogênica/descontinuação de tratamento) em um ciclo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias; o inibidor de quinase dependente de ciclina (por exemplo, seliciclibe, ribociclibe, abemaciclibe ou palbociclibe) é administrado antes, concomitantemente com ou subsequente à administração da vacina imunogênica em um ou mais dias (por exemplo, no dia 1 do ciclo 1), e o agente secundário é administrado por dia, por semana ou por mês. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou 13 ciclos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 dias. Em algumas modalidades, a terapia combinada é administrada por 1 a 12 ou 13 ciclos de 28 dias (por exemplo, cerca de 12 meses).
[0573] Em certas modalidades, um agente terapêutico adicional compreende um segundo agente imunoterápico. Em algumas modalidades, o agente imunoterápico adicional inclui, porém sem limitação, um fator estimulador de colônia,
uma interleucina, um anticorpo que bloqueia as funções imunossupressoras (por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, anticorpo anti-CD28, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-PD- 1, anticorpo anti-PD-L1, anticorpo anti-TIGIT), um anticorpo que melhora as funções de célula imune (por exemplo, um anticorpo anti-GITR, um anticorpo anti-OX-40, um anticorpo anti-CD40 ou um anticorpo anti-4-1BB), um receptor semelhante a toll (por exemplo, TLR4, TLR7, TLR9), um ligante solúvel (por exemplo, GITRL, GITRL-Fc, OX-40L, OX-40L-Fc, CD40L, CD40L-Fc, ligante de 4-1BB ou ligante-Fc de 4-1BB), ou um membro da família B7 (por exemplo, CD80, CD86). Em algumas modalidades, o agente imunoterápico adicional alveja CTLA-4, CD28, CD3, PD-1, PD-L1, TIGIT, GITR, OX-40, CD-40 ou 4-1BB.
[0574] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um inibidor de ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imune é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-CD28, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-LAG3, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-GITR, um anticorpo anti-4-1BB ou um anticorpo anti-OX-40. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-TIGIT. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD-1 selecionado a partir do grupo que consiste em: nivolumabe (OPDIVO), pembrolizumabe (KEYTRUDA), pidilzumabe, MEDI0680, REGN2810, BGB-A317 e PDR001. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-PD-L1 selecionado a partir do grupo que consiste em: BMS935559 (MDX-1105), atexolizumabe (MPDL3280A), durvalumabe
(MEDI4736) e avelumabe (MSB0010718C). Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-CTLA-4 selecionado a partir do grupo que consiste em: ipilimumabe (YERVOY) e tremelimumabe. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-LAG-3 selecionado a partir do grupo que consiste em: BMS-986016 e LAG525. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-OX-40 selecionado a partir do grupo que consiste em: MEDI6469, MEDI0562 e MOXR0916. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-4-1BB selecionado a partir do grupo que consiste em: PF-05082566.
[0575] Em algumas modalidades, o neoantígeno terapêutico podem ser administradas em combinação com uma molécula biológica selecionada a partir do grupo que consiste em: adrenomedulina (AM), angiopoietina (Ang), BMPs, BDNF, EGF, eritropoietina (EPO), FGF, GDNF, fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), fator estimulador de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF), fator de célula tronco (SCF), GDF9, HGF, HDGF, IGF, fator estimulador de migração, miostatina (GDF-8), NGF, neurotrofinas, PDGF, trombopoietina, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, gama-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, e IL-18.
[0576] Em algumas modalidades, o tratamento com uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento podem ser acompanhado por remoção cirúrgica de tumores, remoção de células cancerosas, ou quaisquer outras terapias cirúrgicas consideradas necessárias por um médico de tratamento.
[0577] Em certas modalidades, o tratamento envolve a administração de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento em combinação com terapia por radiação. O tratamento com um agente pode ocorrer antes de, simultaneamente com ou subsequente à administração de terapia por radiação. Os cronogramas de dosagem para tal terapia por radiação podem ser determinados pelo praticante médico versado na técnica.
[0578] A administração combinada pode incluir coadministração, de uma única formulação farmacêutica ou com o uso de formulações separadas, ou administração consecutiva em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo de modo que todos os agentes ativos possam exercer suas atividades biológicas simultaneamente.
[0579] Deve-se observar que a combinação de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento e pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser administrada em qualquer ordem ou simultaneamente. Em algumas modalidades, o agente será administrado a pacientes que passaram anteriormente por tratamento com um segundo agente terapêutico. Em determinadas outras modalidades, o neoantígeno terapêutico e um segundo agente terapêutico serão administrados substancialmente de modo simultâneo ou concomitante. Por exemplo, um indivíduo pode receber um agente enquanto passa por um curso de tratamento com um segundo agente terapêutico (por exemplo, quimioterapia). Em certas modalidades, uma terapêutica de neoantígeno será administrada dentro de 1 ano do tratamento com um segundo agente terapêutico. Deve-se observar adicionalmente que os dois (ou mais) agentes ou tratamentos podem ser administrados ao indivíduo em questão de horas ou minutos (isto é, substancialmente de modo simultâneo).
[0580] Para o tratamento de uma doença, a dosagem adequada de uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento depende do tipo de doença a ser tratado, da gravidade e do curso da doença, da reatividade da doença, da possibilidade de o agente ser administrado para propósitos terapêuticos ou preventivos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente, e assim por diante, todos a critério do médico de tratamento. A terapêutica de neoantígeno pode ser administrada uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos que duram de vários dias a vários meses, ou até uma cura ser efetuada ou uma diminuição do estado da doença ser obtido (por exemplo, redução em tamanho de tumor). Os cronogramas de dosagem ideais podem ser calculados a partir de medições de acúmulo de fármaco no corpo do paciente e variarão dependendo da potência relativa de um agente individual. O médico de administração pode determinar dosagens ideais, metodologias de dosagem e taxas de repetição.
[0581] Em algumas modalidades, uma terapêutica de neoantígeno pode ser administrada a uma dose de "carga" superior inicial, seguido por uma ou mais doses inferiores. Em algumas modalidades, a frequência de administração também pode ser alterada. Em algumas modalidades, um regime de dosagem pode compreender administrar uma dose inicial, seguida por doses adicionais (ou doses de "manutenção") uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada mês. Por exemplo, um regime de dosagem pode compreender administrar uma dose de carga inicial, seguido por uma dose de manutenção semanal de, por exemplo, metade da dose inicial. ou um regime de dosagem pode compreender administrar uma dose de carga inicial, seguido por doses de manutenção de, por exemplo, metade da dose inicial a cada semana. ou um regime de dosagem pode compreender administrar três doses iniciais por 3 semanas, seguido por doses de manutenção, por exemplo, da mesma quantidade a cada semana.
[0582] Como é conhecido pelos elementos versados na técnica, a administração de qualquer agente terapêutico pode resultar em efeitos colaterais e/ou toxicidades. Em alguns casos, os efeitos colaterais e/ou as toxicidades são tão graves que impedem a administração do agente particular em uma dose terapeuticamente eficaz. Em alguns casos, a terapia deve ser descontinuada, e outros agentes podem ser tentados. No entanto, muitos agentes na mesma classe terapêutica exibem efeitos colaterais e/ou toxicidades similares, o que significa que o paciente deve interromper a terapia, ou, se possível, sofrer os efeitos colaterais indesejáveis associados ao agente terapêutico.
[0583] Em algumas modalidades, o cronograma de dosagem pode ser limitado a um número específico de administrações ou “ciclos”. Em algumas modalidades, o agente é administrado por 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ciclos. Por exemplo, o agente é administrado a cada 2 semanas por 6 ciclos, o agente é administrado a cada 3 semanas por 6 ciclos, o agente é administrado a cada 2 semanas por 4 ciclos, o agente é administrado a cada 3 semanas por 4 ciclos, etc. Os cronogramas de dosagem podem ser decididos e subsequentemente modificados pelos elementos versados na técnica.
[0584] A presente revelação fornece métodos para administrar a um indivíduo uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento que compreende usar uma estratégia de dosagem intermitente para administrar uma ou mais agentes, que pode reduzir efeitos colaterais e/ou toxicidades associados a administração de um agente, agente quimioterápico, etc. Em algumas modalidades, um método para tratar câncer em um indivíduo humano compreendem administrar ao indivíduo uma dose terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno em combinação com uma dose terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico, em que um ou ambos os agentes são administrados de acordo com uma estratégia de dosagem intermitente. Em algumas modalidades, um método para tratar câncer em um indivíduo humano compreendem administrar ao indivíduo uma dose terapeuticamente eficaz de uma terapêutica de neoantígeno em combinação com uma dose terapeuticamente eficaz de um segundo agente imunoterápico, em que um ou ambos os agentes são administrados de acordo com uma estratégia de dosagem intermitente. Em algumas modalidades, a estratégia de dosagem intermitente compreende administrar uma dose inicial de uma terapêutica de neoantígeno ao indivíduo, e administrar doses subsequentes do agente cerca de uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, a estratégia de dosagem intermitente compreende administrar uma dose inicial de um neoantígeno terapêutico ao indivíduo, e administrar doses subsequentes do agente cerca de uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, a estratégia de dosagem intermitente compreende administrar uma dose inicial de um neoantígeno terapêutico ao indivíduo, e administrar doses subsequentes do agente cerca de uma vez a cada 4 semanas. Em algumas modalidades, o agente é administrado com o uso de uma estratégia de dosagem intermitente e o agente terapêutico adicional é administrada semanalmente.
[0585] A presente revelação fornece composições que compreendem o neoantígeno terapêutico descrito no presente documento. A presente revelação também fornece composições farmacêuticas que compreendem uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são usadas em imunoterapia. Em algumas modalidades, as composições são usadas em inibições de crescimento tumoral. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são usadas em inibição de crescimento tumoral em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano). Em algumas modalidades, as composições são usadas em tratamento de câncer. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são usadas em tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano).
[0586] As formulações são preparadas para armazenamento e uso combinando-se uma terapêutica de neoantígeno da presente revelação com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um carreador ou excipiente). Os elementos versados na técnica geralmente consideram os carreadores, excipientes e/ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis como ingredientes inativos de uma formulação ou composição farmacêutica. As formulações exemplificativas são listadas no documento WO 2015/095811.
[0587] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, porém sem limitação, tampões não tóxicos como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzila, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico ou benzílico, alquil parabenos, como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol; polipeptídeos de peso molecular baixo (por exemplo, menor que cerca de 10 resíduos de aminoácido); proteínas como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; carboidratos como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, tre- halose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como sódio; complexos metálicos como complexos de proteína Zn; e tensoativos não iônicos como TWEEN ou polietileno glicol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22º Edição, 2012, Pharmaceutical Press, Londres.). Em algumas modalidades, o veículo é 5 % de dextrose em água.
[0588] As composições farmacêuticas descrita no presente documento podem ser administradas em diversas formas para tratamento local ou sistêmico. A administração pode ser tópica por adesivos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aspersões, líquidos ou pós epidérmicos ou transdérmicos; pulmonar por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador, intratraqueal e intranasal; oral; ou parenteral incluindo intravenosa, intra-arterial, intratumoral, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular (por exemplo, injeção ou infusão), ou intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular).
[0589] A formulação terapêutica pode ser em forma de dosagem unitária. Tais formulações incluem comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões em água ou meios não aquosos, ou supositórios.
[0590] Os peptídeos neoantigênicos descrita no presente documento também podem ser aprisionados em microcápsulas. Tais microcápsulas são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões, como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22º Edição, 2012, Pharmaceutical Press, Londres.
[0591] Em certas modalidades, formulações farmacêuticas incluem uma terapêutica de neoantígeno descrita no presente documento complexado com lipossomos. Métodos para produzir lipossomos são conhecidos pelos elementos versados na técnica. Por exemplo, alguns lipossomos podem ser gerados por evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreende fosfatidilcolina, colesterol, e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos podem ser extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado.
[0592] Em certas modalidades, preparações de liberação contínua que compreendem os peptídeos neoantigênicos descritos no presente documento podem ser produzidas. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm um agente, em que a matrizes estão na forma de artigos conformados (por exemplo, películas ou microcápsulas). Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis como poli(2-hidroxietil- metacrilato) ou poli(vinil álcool), polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, acetato etileno-vinílico não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarose, e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico.
[0593] A presente revelação fornece métodos de tratamento que compreende uma vacina imunogênica. São fornecidos métodos de tratamento para uma doença (como câncer ou uma infecção viral). Um método pode compreender administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um antígeno imunogênico. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno viral. Em algumas modalidades, o antígeno compreende um antígeno de tumor.
[0594] Os exemplos não limitativos de vacinas que podem ser preparadas incluem uma vacina à base de peptídeo, uma vacina à base de ácido nucleico, uma vacina à base de anticorpo, uma vacina à base de célula T e uma vacina à base de célula que apresenta antígeno.
[0595] As composições de vacina podem ser formuladas com o uso de um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis incluindo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos agentes ativos nas preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada pode ser dependente da via de administração escolhida. Qualquer um dentre as técnicas, os carreadores e os excipientes bem conhecidos podem ser usados como adequado e entendido na técnica.
[0596] Em alguns casos, a composição de vacina é formulada como uma vacina à base de peptídeo, uma vacina à base de ácido nucleico, uma vacina à base de anticorpo, ou uma vacina à base de célula. Por exemplo, uma composição de vacina pode incluir cDNA nu em formulações de lipídeo catiônico; lipopeptídeos (por exemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), cDNA nu ou peptídeos, encapsulados, por exemplo, em microesferas de poli(DL-lactídeo-co- glicosídeo) (“PLG”) (consulte, por exemplo, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al, Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al, Vaccine 13:675-681, 1995); composição peptídica contida em complexos imunoestimulantes (ISCOMS) (por exemplo, Takahashi et al, Nature 344:873- 875, 1990; Hu et al, Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998); ou múltiplos sistemas peptídicos de antígeno (MAPs) (consulte, por exemplo, Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17- 32, 1996). Algumas vezes, uma vacina é formulada como uma vacina à base de peptídeo, ou vacina à base de ácido nucleico na qual o ácido nucleico codifica os polipeptídeos. Algumas vezes, uma vacina é formulada como uma vacina à base de anticorpo. Algumas vezes, uma vacina é formulada como uma vacina à base de célula.
[0597] A sequência de aminoácidos de um peptídeo imunogênico de neoantígeno específico de doença identificada pode ser usada para desenvolver uma composição farmaceuticamente aceitável. A fonte de antígeno pode ser, porém sem limitação, proteínas naturais ou sintéticas, incluindo glicoproteínas, peptídeos e superantígenos; complexos de anticorpo/antígeno; lipoproteínas; RNA ou um produto de tradução do mesmo; e DNA ou um polipeptídeo codificado pelo DNA. A fonte de antígeno também pode compreender células ou linhagens celulares não transformadas, transformadas, transfectadas ou transduzidas. As células podem ser transformadas, transfectadas ou transduzidas com o uso de qualquer um dentre uma variedade de vetores de expressão ou retrovirais conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica que podem ser empregados para expressar antígenos recombinantes. A expressão também pode ser obtida em qualquer célula hospedeira apropriada que tenha sido transformada, transfectada ou transduzida com um vetor de expressão ou retroviral que contém um DNA molécula que codifica antígeno(s) recombinante(s). Qualquer quantidade de protocolos de transfecção, transformação e transdução conhecido pelos elementos versados na técnica pode ser usada. Vetores e células de vaccinia recombinantes infectados com o vetor de vaccinia, podem ser usados como uma fonte de antígeno.
[0598] Uma composição pode compreender um peptídeo imunogênico de neoantígeno específico de doença sintética. Uma composição pode compreender dois ou mais peptídeos imunogênicos de neoantígeno específicos de doença. Uma composição pode compreender um precursor a um peptídeo imunogênico específico de doença (como uma proteína, peptídeo, DNA e RNA). Um precursor para um peptídeo imunogênico específico de doença pode gerar ou ser gerado para o peptídeo imunogênico de neoantígeno específico de doença identificada. Em algumas modalidades, uma composição terapêutica compreende um precursor de um peptídeo imunogênico. O precursor para um peptídeo imunogênico específico de doença podem ser um pró-fármaco. Em algumas modalidades, a composição que compreende um peptídeo imunogênico de neoantígeno específico de doença pode compreender adicionalmente um adjuvante. Por exemplo, o peptídeo de neoantígeno pode ser usado como uma vacina. Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica pode compreender um peptídeo imunogênico de neoantígeno farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma vacina imunogênica pode compreender um precursor farmaceuticamente aceitável para um peptídeo imunogênico de neoantígeno (como uma proteína, peptídeo, DNA e RNA). Em algumas modalidades, um método de tratamento compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que reconhece especificamente um peptídeo imunogênico de neoantígeno. Em algumas modalidades, um método de tratamento compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um TCR solúvel ou análogo de TCR que reconhece especificamente um peptídeo imunogênico de neoantígeno.
[0599] Os métodos descritos no presente documento são particularmente úteis no contexto de medicina personalizada, em que os peptídeos imunogênicos de neoantígeno são usados para desenvolver terapias (como vacinas ou anticorpos terapêuticos) para o mesmo indivíduo. Desse modo, um método de tratamento de uma doença em um indivíduo pode compreender identificar um peptídeo imunogênico de neoantígeno em um indivíduo de acordo com os métodos descritos no presente documento; e sintetizar o peptídeo (ou um precursor do mesmo); e administrar o peptídeo ou um anticorpo que reconhece especificamente o peptídeo ao indivíduo. Em algumas modalidades, um padrão de expressão de um neoantígeno imunogênico pode servir como a base essencial para a geração de vacinas específicas para paciente. Em algumas modalidades, um padrão de expressão de um neoantígeno imunogênico pode servir como a base essencial para a geração de uma vacina para um grupo de pacientes com uma doença particular. Desse modo, doenças particulares, por exemplo, tipos particulares de tumores, podem ser seletivamente tratados em um grupo de pacientes.
[0600] Em algumas modalidades, os peptídeos descritos no presente documento são antígenos estruturalmente normais que podem ser reconhecidos por células T antidoença autólogas em um grupo grande de pacientes. Em algumas modalidades, um padrão de expressão de antígeno de um grupo de indivíduos doentes cuja doença expressa neoantígenos estruturalmente normais é determinado.
[0601] Em algumas modalidades, os peptídeos descritos no presente documento compreendem um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo da mesma proteína, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo, e em que o primeiro neoepítopo compreende uma mutação e o segundo neoepítopo compreende a mesma mutação. Em algumas modalidades, os peptídeos descritos no presente documento compreendem um primeiro peptídeo que compreende um primeiro neoepítopo de uma primeira região de uma proteína e um segundo peptídeo que compreende um segundo neoepítopo de uma segunda região da mesma proteína, em que a primeira região compreende pelo menos um aminoácido da segunda região, em que o primeiro peptídeo é diferente do segundo peptídeo e em que o primeiro neoepítopo compreendem uma primeira mutação e o segundo neoepítopo compreende uma segunda mutação. Em algumas modalidades, a primeira mutação e a segunda mutação são iguais. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação de ponto, uma mutação de sítio de splice, uma mutação de deslocamento de quadro de leitura, uma mutação de leitura direta, uma mutação de fusão de gene e qualquer combinação das mesmas.
[0602] Há uma variedade de formas pelas quais pode-se produzir neoantígenos imunogênicos. As proteínas ou os peptídeos podem ser feitos por qualquer técnica conhecida pelos elementos versados na técnica, incluindo a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas biológicas e moleculares padrão, a isolação de proteínas ou peptídeos de fontes naturais, a tradução in vitro, ou a síntese química de proteínas ou peptídeos. De modo geral, tais neoantígenos específicos de doença podem ser produzidos in vitro ou in vivo. Os neoantígenos imunogênicos podem ser produzidos in vitro como peptídeos ou polipeptídeos, que podem, então, ser formulados em uma vacina personalizada ou composição imunogênica e administrados a um indivíduo. A produção in vitro de neoantígenos imunogênicos pode compreender síntese de peptídeo ou expressão de um peptídeo/polipeptídeo de uma molécula de DNA ou RNA em qualquer variedade de sistemas de expressão recombinante bacterianos, eucarióticos ou virais, seguida pela purificação do peptídeo/polipeptídeo expresso. Alternativamente, neoantígenos imunogênicos podem ser produzidos in vivo introduzindo-se moléculas (por exemplo, DNA, RNA e sistemas de expressão viral) que codificam um neoantígeno imunogênico em um indivíduo, em que os neoantígenos imunogênicos codificados são expressos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo imunogênico de neoantígeno pode ser usado para produzir o peptídeo de neoantígeno in vitro.
[0603] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um polinucleotídeo que codifica um neoantígeno imunogênico.
[0604] O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, formas nativa ou estabilizada de fita simples e/ou fita dupla de polinucleotídeos, ou combinações dos mesmos. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo imunogênico de neoantígeno pode ou não conter íntrons tão longos quanto os códigos de sequência de ácido nucleico para o peptídeo. Em algumas modalidades, a tradução in vitro é usada para produzir o peptídeo.
[0605] Os vetores de expressão que compreendem sequências que codificam o neoantígeno, bem como células hospedeiras que contêm os vetores de expressão, são também contemplados. Os vetores de expressão adequados para uso em uma presente revelação podem compreender pelo menos um elemento de controle de expressão operacionalmente ligados à sequência de ácido nucleico. Os elementos de controle de expressão são inseridos no vetor para controlar e regular a expressão da sequência de ácido nucleico. Exemplos de elementos de controle de expressão são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o sistema lac, regiões operadoras e promotoras de fago lambda, promotores de levedura e promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus ou SV40. Os elementos operacionais adicionais incluem, porém sem limitação, sequências líder, códons de terminação, sinais de poliadenilação e quaisquer outras sequências necessárias ou preferidas para a transcrição adequada e tradução subsequente da sequência de ácido nucleico no sistema hospedeiro. Deve ser entendido por um elemento versado na técnica que a combinação correta de elementos de controle de expressão dependerá do sistema hospedeiro escolhido. Deve ser entendido adicionalmente que o vetor de expressão deve conter elementos adicionais necessários para a transferência e replicação subsequente do vetor de expressão que contém a sequência de ácido nucleico no sistema hospedeiro. Exemplos de tais elementos incluem, porém sem limitação, origens de replicação e marcadores selecionáveis.
[0606] Os peptídeos de neoantígeno podem ser fornecidos na forma de moléculas de RNA ou cDNA que codificam os peptídeos de neoantígeno desejados. Um ou mais peptídeos de neoantígeno da presente revelação podem ser codificados por um vetor de expressão simples. De modo geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão, como um plasmídeo, em orientação adequada e quadro de leitura correto para expressão, se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de controle regulatórias transcricionais e translacionais adequadas de nucleotídeos reconhecidos pelo hospedeiro desejado (por exemplo, bactérias), embora tais controles estejam geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor é, então, introduzido na bactéria hospedeira para clonagem com o uso de técnicas padrão. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, especialmente mamíferos ou seres humanos, incluem, por exemplo, vetores que compreendem sequências de controle de expressão de SV40, papiloma vírus bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, como plasmídeos de E. coli, incluindo pCR 1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de faixa de hospedeiro mais ampla, como M13 e fagos de DNA de fita simples filamentosos.
[0607] Em modalidades, uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse pode ser construída pela síntese química com o uso de um sintetizador de oligonucleotídeo. Tais oligonucleotídeos podem ser projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e selecionar tais códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante de interesse é produzido. Os métodos padrão podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse.
[0608] As células hospedeiras adequadas para expressão de um polipeptídeo incluem procariotas, levedura, células eucarióticas de inseto ou maiores sob o controle de promotores adequados. Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. Células eucarióticas superiores incluem linhagens celulares estabelecidas celulares de origem de mamífero. Os sistemas de tradução isentos de célula também podem ser empregados. Os vetores de clonagem e expressão para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamíferos são bem conhecidos na técnica. Vários sistemas de cultura celular de mamífero ou inseto podem ser empregados para expressar proteína recombinante. As linhagens celulares hospedeiras de mamífero exemplificativas incluem, porém sem limitação, COS-7, células L, C127, 3T3, ovário de hamster chinês (CHO), 293, linhagens celulares HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não transcritos como uma origem de replicação, um promotor adequado e intensificador ligado ao gene a ser expresso, e outras sequências não transcritas de flanqueamento 5’ ou 3’, e sequências não traduzidas 5’ ou 3’, como sítios de ligação ao ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e receptores de splice, e sequências de terminação transcricional.
[0609] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padrão incluem cromatografia (por exemplo, troca de íons, cromatografia de coluna por afinidade e dimensionamento, e similares), centrifugação, a solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para purificação de proteína. As etiquetas de afinidade como hexa-histidina (SEQ ID NO: 3211), domínio de ligação a maltose, sequência de revestimento de influenza, glutationa-S-transferase, e similares podem ser fixadas à proteína para permitir a fácil purificação pela passagem ao longo de uma coluna de afinidade adequada. As proteínas isoladas também podem ser fisicamente caracterizadas com o uso de tais técnicas como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia por raio-X.
[0610] Uma vacina pode compreender uma entidade que liga uma sequência de polipeptídeo descrita no presente documento. A entidade podem ser um anticorpo. A vacina à base de anticorpo pode ser formulada com o uso de qualquer um dentre as técnicas, os carreadores e os excipientes bem conhecidos como adequado e como entendido na técnica. Em algumas modalidades, os peptídeos descritos no presente documento podem ser usados para compor terapias específicas de neoantígeno como terapias de anticorpo. Por exemplo, neoantígenos podem ser usados para elevar e/ou identificar anticorpos que reconhecem especificamente os neoantígenos. Esses anticorpos podem ser usados como terapias. O anticorpo pode ser um anticorpo natural, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou podem ser um fragmento de anticorpo. O anticorpo pode reconhecer um ou mais dos polipeptídeos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reconhecer um polipeptídeo que tem uma sequência com no máximo 40 %, 50 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com um polipeptídeo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reconhecer um polipeptídeo que tem uma sequência com pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com um polipeptídeo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reconhecer um polipeptídeo sequência que é pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de um comprimento de um polipeptídeo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo pode reconhecer um polipeptídeo sequência que tem no máximo 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de um comprimento de um polipeptídeo descrito no presente documento.
[0611] A presente revelação também contempla o uso de moléculas de ácido nucleico como veículos para distribuir peptídeos de neoantígeno/polipeptídeos ao indivíduo em necessidade do mesmo, in vivo, na forma de, por exemplo, vacinas de DNA/RNA.
[0612] Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina de ácido nucleico. Em algumas modalidades, os neoantígenos podem ser administrados a um indivíduo pelo uso de um plasmídeo. Os plasmídeos podem ser introduzidos em tecidos animais por uma variedade de métodos diferentes, por exemplo, injeção ou instilação em aerossol de DNA nu em superfícies mucosais, como a mucosa nasal e pulmonar. Em algumas modalidades, entrega física, como com uma “pistola de gene” pode ser usada. A escolha exata de vetores de expressão pode depender do peptídeo/polipeptídeos a serem expressos, e está na habilidade da pessoa comum na técnica.
[0613] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um peptídeo imunogênico ou precursor de peptídeo. Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico compreende sequências que flanqueiam a sequência que codifica o peptídeo imunogênico ou precursor de peptídeo. Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico compreende mais que um epítopo imunogênico. Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico é uma vacina à base de DNA. Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico é uma vacina à base de RNA. Em algumas modalidades, a vacina à base de RNA compreende mRNA. Em algumas modalidades, a vacina à base de RNA compreende mRNA nu. Em algumas modalidades, a vacina à base de RNA compreende mRNA modificado (por exemplo, mRNA protegido contra degradação com o uso de protamina. mRNA que contém estrutura de CAP 5' modificada ou mRNA que contém nucleotídeos modificados). Em algumas modalidades, a vacina à base de RNA compreende mRNA de fita simples.
[0614] O polinucleotídeo pode ser substancialmente puro, ou contido em um vetor ou sistema de entrega adequado. Os vetores e sistemas de entrega adequados incluem virais, como sistemas com base em adenovírus, vírus vaccinia, retrovírus, vírus da herpes, vírus adenoassociados ou híbridos que contêm elementos de mais que um vírus. Sistemas de entrega não virais incluem lipídeos catiônicos e polímeros catiônicos (por exemplo, lipossomos catiônicos).
[0615] Um ou mais peptídeos de neoantígeno podem ser codificados e expressos em vivo com o uso de um sistema com base viral. Os vetores virais podem ser usados como vetores recombinantes na presente revelação, em que uma porção do genoma viral é deletada para introduzir novos genes sem destruir a infectividade do vírus. O vetor viral da presente revelação é um vírus não patogênico. Em algumas modalidades, o vetor viral tem um tropismo para um tipo celular específico no mamífero. Em outra modalidade, o vetor viral da presente revelação tem a capacidade para infectar antígeno profissional que apresenta células como células dendríticas e macrófagos. Em ainda outra modalidade da presente revelação, o vetor viral tem a capacidade para infectar qualquer célula no mamífero. O vetor viral também pode infectar células tumorais. Os vetores virais usados na presente revelação incluem, porém sem limitação, Poxvirus como vírus vaccinia, avipox vírus, fowlpox vírus e um vírus vaccinia altamente atenuado (Ankara ou MVA), retrovírus, adenovírus, baculovÍrus e similares.
[0616] Uma vacina pode ser distribuída por meio de uma variedade de vias. As vias de entrega podem incluir administração oral (incluindo bucal e sublingual), retal, nasal, topical, adesivo transdérmico, pulmonar, vaginal, supositório ou parenteral (incluindo intramuscular, intra-
arterial, intratecal, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea e intravenosa) ou em uma forma adequada para administração por aerossolização, inalação ou insuflação. As informações gerais sobre sistemas de entrega de fármaco podem ser constatadas em Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999). A vacina descrita no presente documento pode ser administrada a músculo, ou pode ser administrada por meio de injeções intradérmicas ou subcutâneas, ou transdermicamente, como por iontoforese. A administração epidérmica da vacina pode ser empregada.
[0617] Em alguns exemplos, a vacina também pode ser formulada para administração por meio das passagens nasais. As formulações adequadas para administração nasal, em que o carreador é um sólido, podem incluir um pó bruto que tem um tamanho de partícula, por exemplo, na faixa de cerca de 10 a cerca de 500 mícrons que é administrada de maneira em que rapé seja tomado, isto é, por inalação rápida através da passagem nasal de um recipiente do pó mantido próximo do nariz. A formulação pode ser uma aspersão nasal, gotas nasais, ou por administração de aerossol por nebulizador. A formulação pode incluir soluções aquosas ou oleosas da vacina.
[0618] A vacina pode ser uma preparação líquida como uma suspensão, xarope ou elixir. A vacina também pode ser uma preparação para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), como uma suspensão ou emulsão estéril.
[0619] A vacina pode incluir material para uma imunização única, ou pode incluir material para múltiplas imunizações (isto é, um kit “multidose”). A inclusão de um conservante é preferida em disposições de multidose. Como uma alternativa (ou em adição) a incluir um conservante em composições de multidose, as composições podem ser contidas em um recipiente que tem um adaptador asséptico para remoção de material.
[0620] A vacina pode ser administrada em um volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, embora meia dose (isto é, cerca de 0,25 ml) possa ser administrada a crianças. Algumas vezes a vacina pode ser administrada em uma dose superior, por exemplo, cerca de 1 ml.
[0621] A vacina pode ser administrada como um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais regimes de curso de dose. Algumas vezes, a vacina é administrada como um 1, 2, 3 ou 4 regimes de curso de dose. Algumas vezes, a vacina é administrada como um 1 regime de curso de dose. Algumas vezes, a vacina é administrada como um 2 regime de curso de dose.
[0622] A administração da primeira dose e segunda dose pode ser separada por cerca de 0 dia, 1 dia, 2 dias, 5 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, 30 dias, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 1 ano, 1,5 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, ou mais.
[0623] A vacina descrita no presente documento pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos. Algumas vezes, a vacina descrita no presente documento é administrada a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais anos. Algumas vezes, a vacina descrita no presente documento é administrada a cada 4, 5, 6, 7, ou mais anos. Algumas vezes, a vacina descrita no presente documento é administrada uma vez.
[0624] Os exemplos de dosagem não são limitantes e são apenas usados para exemplificar regimes de dosagem particulares para administrar uma vacina descrita no presente documento. A quantidade eficaz para uso em seres humanos pode ser determinada a partir de modelos animais. Por exemplo, uma dose para seres humanos pode ser formulada para obter concentrações de circulação, fígado, tópicas e/ou gastrointestinais que foram constatadas como eficazes em animais. Com base em dados de animais, e outros tipos de dados similares, os elementos versados na técnica podem determinar as quantidades eficazes de uma composição de vacina adequada para seres humanos.
[0625] A quantidade eficaz quando estiver se referindo a um agente ou uma combinação de agentes significará, de modo geral, as faixas de dose, os modos de administração, as formulações, etc., que foram recomendadas ou aprovadas por qualquer uma das diversas organizações regulatórias e de consultoria nas técnicas médicas ou farmacêuticas (por exemplo, FDA, AMA) ou pelo fabricante ou fornecedor.
[0626] Em alguns aspectos, a vacina e o kit descritos no presente documento podem ser armazenados entre 2 °C e 8 °C. Em alguns exemplos, a vacina não é armazenada congelada. Em alguns exemplos, a vacina é armazenada em temperaturas de - 20 °C ou -80 °C. Em alguns exemplos, a vacina é armazenada distante da luz solar. Kits
[0627] O neoantígeno terapêutico descrito no presente documento pode ser fornecido em forma de kit em conjunto com instruções para administração. Tipicamente, o kit incluiria o neoantígeno terapêutico desejado em um recipiente, em forma de dosagem unitária e instruções para administração. Terapêuticas adicionais, por exemplo, citocinas, linfocinas,
inibidores de ponto de checagem, anticorpos, também podem ser incluídos no kit. Outros componentes de kit que também podem ser desejáveis incluem, por exemplo, uma seringa estéril, dosagens intensificadoras e outros excipientes desejados.
[0628] Kits e artigos de fabricação também são fornecidos no presente documento para uso com uma ou mais métodos descritos no presente documento. Os kits podem conter um ou mais polipeptídeos neoantigênicos que compreendem um ou mais neoepítopos. Os kits também podem conter ácidos nucleicos que codificam um ou mais dentre os peptídeos ou proteínas descritos no presente documento, anticorpos que reconhecem um ou mais dentre os peptídeos descritos no presente documento, ou células à base de APC ativados com um ou mais dentre os peptídeos descritos no presente documento. Os kits podem conter adicionalmente adjuvantes, reagentes e tampões necessários para a composição e entrega das vacinas.
[0629] Os kits também podem incluir um carreador, pacote, ou recipiente que é compartimentalizado para receber um ou mais recipientes como frascos, tubos e similares, em que cada um dentre os recipientes compreende um dentre os elementos separados, como os peptídeos e adjuvantes, a serem usados em um método descrito no presente documento. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico.
[0630] Os artigos de manufatura proporcionados no presente documento contêm materiais de embalagem. Exemplos de materiais de embalagem farmacêutica incluem, sem limitação, embalagens em blister, garrafas, tubos, sacos, recipientes, garrafas e qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e um modo de administração e tratamento pretendido. Um kit inclui tipicamente rótulos que listam conteúdos e/ou instruções para uso, e insertos de pacote com instruções para uso. Um conjunto de instruções também será tipicamente incluído.
[0631] A presente revelação será descrita em maiores detalhes a título de exemplos específicos. Os seguintes exemplos são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas, e não são destinados a limitar a presente revelação de qualquer maneira. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser alterados ou modificados para gerar modalidades alternativas, de acordo com a presente revelação. Todas as patentes, publicações de patente e publicações impressas listadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades.
EXEMPLOS
[0632] Esses exemplos são fornecidos para fins ilustrativos apenas e não para limitar o escopo das reivindicações fornecidas no presente documento. Exemplo 1 - Indução de respostas de célula T CD4+ e CD8+
[0633] As induções de célula T in vitro são usadas para expandir células T específicas de neoantígeno. As APCs profissionais maduras são preparadas para esses ensaios da seguinte forma. Os monócitos são enriquecidos a partir de PBMCs de doador humano saudável com o uso de um kit com base em microesfera (Miltenyi). As células enriquecidas são plaqueadas em GM-CSF e IL-4 para induzir DCs imaturos. Após
5 dias, DCs imaturos são incubados a 37 °C com agrupamentos de peptídeos por 1 hora antes da adição de um coquetel de maturação de citocina (GM-CSF, IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, PGE1β). Os agrupamentos de peptídeos podem incluir múltiplas mutações, tanto com iniciadores curtos e iniciadores longos para expandir células T CD8+ e CD4+, respectivamente. As células são incubadas a 37 °C para amadurecer DCs.
[0634] Após a maturação de DCs, PBMCs (em volume ou enriquecidos por células T) são adicionados a células dendríticas maduras com citocinas de proliferação. As culturas são monitoradas quanto a células T específicas de peptídeo com o uso de uma combinação de ensaios funcionais e/ou coloração de tetrâmero. Ensaios de imunogenicidade paralelos com os peptídeos modificados e parentais permitidos para comparações da eficácia relativa com os quais os peptídeos expandiram as células T específicas de peptídeo. Exemplo 2 - Ensaio de Coloração de Tetrâmero
[0635] Os tetrâmeros MHC foram adquiridos ou fabricados no local, e são usados para medir a expansão de célula T específica de peptídeo nos ensaios de imunogenicidade. Para a avaliação, o tetrâmero é adicionado a 1 x 105 células em PBS que contém 1 % de FCS e 0,1 % de azida de sódio (tampão de FACS) de acordo com as instruções do fabricante. As células são incubadas no escuro por 20 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos específicos para marcadores de célula T, como CD8, são, então, adicionados a uma concentração final sugerida pelo fabricante, e as células são incubadas no escuro a 4 °C por 20 minutos. As células são lavadas com tampão de FACS frio e ressuspensas em tampão que contém formaldeído a 1 %. As células são obtidas em um instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson), e são analisadas pelo uso de software Cellquest (Becton Dickinson). Para a análise de células positivas de tetrâmero, a porta de linfócito é tomada a partir dos gráficos de dispersão frontal e lateral. Os dados são relatados como a porcentagem de células que foram CD8+/tetrâmero+. Exemplo 3 - Ensaio de Coloração de Citocina Intracelular
[0636] Na ausência de coloração de tetrâmero bem estabelecida para identificar populações de célula T específicas de antígeno, a especificidade de antígeno pode ser estimada com o uso de avaliação de produção citocina com o uso de ensaios de citometria de fluxo bem estabelecidos. Resumidamente, as células T são estimuladas com o peptídeo de interesse e comparadas a um controle. Após o estímulo, a produção de citocinas por células T CD4+ (por exemplo, IFNγ e TNFα) é avaliada por coloração intracelular. Essas citocinas, especialmente IFNγ, podem ser usadas para identificar células estimuladas. A FIG. 11 descreve uma análise de FACS de indução específica de antígeno de níveis de IFNγ e TNFα de células CD4+ de um doador de HLA-A02:01 saudável estimulado com APCs carregado com ou sem um peptídeo neoORF de GATA3. Exemplo 4 - Ensaio ELISPOT
[0637] As células T específicas de peptídeo são funcionalmente enumeradas com o uso do ensaio ELISPOT (BD Biosciences), que mede a liberação de IFNγ das células T em uma base celular única. As células alvo (C1Rs transfectadas com T2 ou HLA-A0201) foram pulsadas com 10 µM de peptídeo por 1 hora a 37 °C, e lavadas três vezes. 1 x 105 alvos pulsados de peptídeo são cocultivados nos poços de placa
ELISPOT com concentrações variantes de células T (5 x 102 a 2 x 103) tomadas a partir da cultura de imunogenicidade. As placas são desenvolvidas de acordo com o protocolo do fabricante, e analisadas em um leitor de ELISPOT (Cellular Technology Ltd.) com software anexo. Os pontos correspondentes ao número de células T que produzem IFNγ são relatados como o número absoluto de pontos por número de células T plaqueadas. As células T expandidas em peptídeos modificados são testadas apenas quanto as suas habilidades para reconhecer alvos pulsados com o peptídeo modificado, mas também quanto as suas habilidades para reconhecer alvos pulsados com o peptídeo parental. A FIG. 35 é um gráfico que mostra a indução específica de antígeno de IFNγ. Os níveis de IFNγ de duas simulações de amostra transduzidas ou transduzidas com um vetor lentiviral de expressão que codifica um peptídeo neoORF de GATA3 são mostrados. Exemplo 5 - Ensaio de Coloração de CD107
[0638] CD107a e b são expressos na superfície celular de células T CD8+ após a ativação com peptídeo cognato. Os grânulos líticos de células T têm uma bicamada de lipídeo que contém glicoproteínas de membrana lisossomal associada (“LAMPs”), que incluem as moléculas CD107a e b. Quando as células T citotóxicas são ativadas através do receptor de célula T, as membranas desses grânulos líticos mobilizam e se fusionam com a membrana plasmática da célula T. Os teores de grânulo são liberados, e isso resulta em morte da célula- alvo. Visto que a membrana granular se fusiona com a membrana plasmática, C107a e b são expostos na superfície celular, e, portanto, são marcadores de desgranulação. Devido à desgranulação como medida por coloração de CD107a e b ser relatada em uma base celular única, o ensaio é usado para enumerar funcionalmente as células T específicas de peptídeo. Para realizar o ensaio, o peptídeo é adicionado a C1R de células transfectadas por HLA-A02:01 a uma concentração final de 20 µM, as células foram incubadas por 1 hora a 37 °C, e lavadas três vezes. 1 x 105 das células C1R pulsadas por peptídeo foram aliquotadas em tubos, e anticorpos específicos para CD107a e b são adicionados a uma concentração final sugerida pelo fabricante (Becton Dickinson). Os anticorpos são adicionados antes da adição de células T a fim de “capturar” as moléculas de CD107 conforme as mesmas aparecem de modo transiente na superfície durante o curso do ensaio. 1 x 105 de células T da cultura de imunogenicidade são adicionados em seguida, e as amostras foram incubadas por 4 horas a 37 °C. As células T são adicionalmente colorizadas para moléculas de superfície celular adicionais como CD8 e adquiridas em um instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson). Os dados são analisados com o uso do software Cellquest anexo, e os resultados são relatados como a porcentagem de células de CD8+/CD107a e b+. A FIG. 34 é um gráfico que mostram indução específica de antígeno do marcador citotóxico CD107a. A porcentagem de células de CD107a+ de células de CD8+ totais de duas simulações de amostra transduzidas ou transduzidas com um vetor lentiviral de expressão que codifica um peptídeo neoORF de GATA3 são mostrados. Exemplo 6 - Ensaios de Citotoxicidade
[0639] A atividade citotóxica é medida com o uso do método 1 ou do método 2. O método 1 envolve um ensaio de liberação de cromo. As células T2 alvo são marcadas por 1 hora a 37 °C com Na51Cr e lavadas, 5 x 103 de células T2 alvo são, então, adicionados aos números variantes de células T da cultura de imunogenicidade. A liberação de crômio é medida em tensoativo colhido após 4 horas de incubação a 37 °C. A porcentagem de lise específica é calculada como: Equation10. Liberação experimental-liberação espontânea/Liberação total-liberação espontânea x 100.
[0640] No método 2, a atividade de citotoxicidade é medida com a detecção de Caspase 3 clivada em células alvo por Citometria de fluxo. As células cancerosas alvo são manipuladas para expressar o peptídeo mutante em conjunto com o alelo MHC-I adequado. Células alvo com transdução simulada (isto é, não expressando o peptídeo mutante) são usadas como um controle negativo. As células são marcadas com CFSE para distinguir as mesmas das PBMCs estimuladas usadas como células efetoras. As células alvo e efetoras são cocultivadas por 6 horas antes de serem coletadas. A coloração intracelular é realizada para detectar a forma clivada de Caspase 3 nas células cancerosas alvo positivas de CFSE. A porcentagem de lise específica é calculada como: Equação 11. Clivagem experimental de Caspase 3/clivagem espontânea de Caspase 3 (medida na ausência de expressão de peptídeo mutante) x 100.
[0641] O ensaio de citotoxicidade do método 2 é fornecido na seção de materiais e métodos do Exemplo 25 no presente documento. Exemplo 7- Respostas de célula T CD8+ melhoradas in vivo com o uso de iniciadores longos e iniciadores curtos sequencialmente
[0642] A vacinação com peptídeos de iniciador longo pode induzir respostas de célula T tanto CD4+ quanto CD8+, dependendo do processamento e apresentação dos peptídeos. A vacinação com epítopos de iniciador curto mínimos foca na geração de respostas de célula T CD8+, mas não exige o processamento de peptídeo antes da apresentação de antígeno. Como tal, qualquer célula pode apresentar o epítopo prontamente, não apenas células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs). Isso pode levar a tolerância de células T que entram em contato com células saudáveis que apresentam antígenos como parte de tolerância periférica. Para contornar isso, a imunização inicial com iniciadores longos permite a preparação de células T CD8+ apenas por APCs que podem processar e apresentar os peptídeos. As imunizações subsequentes intensificam as respostas de célula T CD8+ iniciais. Ensaios de imunogenicidade in vivo
[0643] Dezenove camundongos C57BL/6 fêmea de 8- 12 semanas de idade (Taconic Biosciences) foram aleatória e prospectivamente atribuídos a grupos de tratamento mediante a chegada. Os animais foram aclimatados por três (3) dias antes do início do estudo. Os animais foram mantidos em LabDiet™ 5053, foram fornecidos ração de roedor estéril e água estéril ad libitum. Os animais no Grupo 1 serviram como controles de adjuvante de vacinação apenas e foram administrados ácido poli-inosínico:policitidílico (poliI:C) por si só a 100 µg em um volume de 0,1 ml administrado via injeção subcutânea (s.c.) no dia 0, 7 e 14. Os animais no Grupo 2 foram administrados com 50 µg cada de seis peptídeos de iniciador longo (descrito abaixo) em conjunto com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml no dia 0, 7 e 14. Os animais no Grupo 3 foram administrados com 50 µg cada de seis peptídeos de iniciador longo (descrito abaixo) em conjunto com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml no dia 0 e equivalentes compatíveis molares de peptídeos de iniciador curto correspondentes (descrito abaixo) em conjunto com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml no dia 7 e 14. Os animais foram pesados e monitorados quanto a saúde geral diariamente. Os animais foram eutanasiados por overdose de CO2 na conclusão do estudo no Dia 21, se um animal perdeu > 30 % de sua massa corporal em comparação ao peso no Dia 0; ou se um animal foi encontrado moribundo. No sacrifício, os baços foram colhidos e processados em suspensões de célula única com o uso de protocolos padrão. Resumidamente, os baços foram degradados de modo mecânico através de um filtro de 70 µM, peletizados e lisados com tampão de lise de ACK (Sigma) antes da ressuspensão em meios de cultura celular. Peptídeos
[0644] Seis neoantígenos murinos anteriormente identificados foram usados com base em suas habilidades demonstradas para induzir respostas de célula T CD8+. Para cada neoantígeno, iniciadores curtos (8-11 aminoácidos) correspondentes ao epítopo mínimo foram definidos. Os iniciadores longos correspondentes a 20-27 aminoácidos que circundam a mutação foram usados.
ELISPOT
[0645] A análise ELISPOT (IFNγ de Camundongo ELISPOT Reasy-SET-Go; EBioscience) foi realizada de acordo com o protocolo de kit. Resumidamente, um dia antes do dia da análise, as placas de filtro de 96 poços (0,45 µm de tamanho de poro de membrana de PVDF hidrofóbica; EMD Millipore) foram ativadas (EtOH a 35 %), lavadas (PBS) e revestidas com anticorpo de captura (1:250; 4 °C O/N). No dia da análise, os poços foram lavados e bloqueados (meios; 2 horas a 37 °C). Aproximadamente 2 x 105 células em 100 µl foram adicionadas aos poços em conjunto com 100 µl de agrupamento de peptídeos de teste a 10 mM (iniciadores curtos), ou antígeno de controle positivo de PMA/ionomicina, ou veículo.
As células incubadas com antígeno da noite para o dia (16- 18 horas) a 37 °C.
No dia seguinte, a suspensão de célula foi descartada, e os poços foram lavados uma vez com PBS, e duas vezes com água desionizada.
Para todas as etapas de lavagem no restante do ensaio, permitiu-se que os poços fossem embebidos por 3 minutos em cada etapa de lavagem.
Os poços foram, então, lavados três vezes com tampão de lavagem (PBS + 0,05 % de Tween-20), e o anticorpo de detecção (1:250) foi adicionado a todos os poços.
As placas foram incubadas por duas horas à temperatura ambiente.
A solução de anticorpo de detecção foi descartada, e os poços foram lavados três vezes com tampão de lavagem.
Avidin-HRP (1:250) foi adicionado a todos os poços, e as placas foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente.
A solução conjugada foi descartada, e os poços lavados três vezes com tampão de lavagem, então, uma vez com PBS.
O substrato (3-amino-9-etil-carbazol, tampão de Acetato a 0,1 M, H2O2) foi adicionado a todos os poços, e o desenvolvimento de ponto monitorado (aproximadamente 10 minutos). A reação de substrato foi interrompida lavando-se os poços com água, e permitiu-se que as placas fossem secas por ar da noite para o dia.
As placas foram analisadas em um leitor de ELISPOT (Cellular Technology
Ltd.) com software anexo. Os pontos correspondentes ao número de células T que produzem IFNγ são relatados como o número absoluto de pontos por número de células T plaqueadas. Exemplo 8 - Detecção de peptídeos neoORF de GATA3 por espectrometria de massa
[0646] As células 293T foram transduzidas com um vetor lentiviral que codifica várias regiões de peptídeos codificados pelo neoORF de GATA3. 50-700 milhões das células transduzidas que expressam peptídeos codificados pela sequência de neoORF de GATA3 foram cultivadas e os peptídeos foram eluídos a partir de complexos de peptídeo de HLA com o uso de uma lavagem com ácido. Os peptídeos eluídos foram, então, analisados por MS/MS. Para células 293T que expressam um HLA-A02:01 proteína, os peptídeos VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3212), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3213) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3214) foram detectados por espectrometria de massa (FIG. 5). Para células 293T que expressam um HLA-B07:02 proteína, os peptídeos KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3215) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3216) foram detectados por espectrometria de massa (FIG. 5). Para células 293T que expressam um HLA-B08:01 proteína, o peptídeo ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3217) foi detectado por espectrometria de massa (FIG. 5). Exemplo 9 - neoORF de GATA3 produz epítopo forte em múltiplos alelos.
[0647] Múltiplos peptídeos que contém os neoepítopos na Tabela 4 abaixo foram expressos ou carregados em células que apresentam antígeno (APCs). A espectrometria de massa foi, então, realizada e a afinidade dos neoepítopos para os alelos HLA indicados e a estabilidade dos neoepítopos com os alelos HLA foi determinada.
A Tabela 4 lista neoORF de GATA3 exemplificativos que produziu epítopos em múltiplos alelos Alelo Neoepítopo Região Afinidade Estabilidade comum (C) de MHC de MHC ou observada observada variável (nM) (hr) (V) A02.01 AIQPVLWTT V 8 1,5 (SEQ ID NO: 3218) MLTGPPARV C 11 5,8 (SEQ ID NO: 3219) SMLTGPPARV C 14 21,7 (SEQ ID NO: 3220) VLPEPHLAL V 16 1,1 (SEQ ID NO: 3221) TLQRSSLWCL C 118 0,5 (SEQ ID NO: 3222) YMFLKAESKI C 141 0,6 (SEQ ID NO: 3223) ALQPLQPHA V 604 1,5 (SEQ ID NO: 3224)
Alelo Neoepítopo Região Afinidade Estabilidade comum (C) de MHC de MHC ou observada observada variável (nM) (hr) (V) A03:01 KIMFATLQR C 3 5,6 (SEQ ID NO: 3225) VLWTTPPLQH V 16 0,3 (SEQ ID NO: 3226) YMFLKAESK C 80 0,3 (SEQ ID NO: 3227) A11:01 KIMFATLQR C 23 8,9 (SEQ ID NO: 3228) VLWTTPPLQH V 4539 0 (SEQ ID NO: 3229) YMFLKAESK C 1729 0 (SEQ ID NO: 3230) A24:02 MFLKAESKI C 332 0,2 (SEQ ID NO: 3231) YMFLKAESKI C 6.995 1,2 (SEQ ID NO: 3232)
Alelo Neoepítopo Região Afinidade Estabilidade comum (C) de MHC de MHC ou observada observada variável (nM) (hr) (V) B07:02 FATLQRSSL C 14 0,7 (SEQ ID NO: 3233) EPHLALQPL V 17 7,2 (SEQ ID NO: 3234) KPKRDGYMF C 28 8,6 (SEQ ID NO: 3235) KPKRDGYMFL C 98 3,3 (SEQ ID NO: 3236) QPVLWTTPPL V 109 1,4 (SEQ ID NO: 3237) GPPARVPAV C 221 1,6 (SEQ ID NO: 3238) MFATLQRSSL V 267 0 (SEQ ID NO: 3239) B08:01 EPHLALQPL V 12 0 (SEQ ID NO: 3240)
Alelo Neoepítopo Região Afinidade Estabilidade comum (C) de MHC de MHC ou observada observada variável (nM) (hr) (V) ESKIMFATL C 18 1,3 (SEQ ID NO: 3241) FLKAESKIM C 22 1,2 (SEQ ID NO: 3242) FATLQRSSL C 27 0 (SEQ ID NO: 3243) YMFLKAESKI C 32 0,4 (SEQ ID NO: 3244) IMKPKRDGYM C 33 0,4 (SEQ ID NO: 3245) MFATLQRSSL C 53 0 (SEQ ID NO: 3246) FLKAESKIMF C 82 0 (SEQ ID NO: 3247) LHFCRSSIM C 119 0 (SEQ ID NO: 3248)
Exemplo 10 - Múltiplos neoepítopos Elicitam Respostas de célula T CD8+
[0648] As amostras de PBMC de um doador humano foram usadas para realizar indução de célula T específica de antígeno. As induções de célula T CD8+ foram analisadas após a fabricação de células T. As amostras celulares podem ser tomadas em pontos no tempo diferentes para a análise. Os multímeros de pMHC foram usados para monitorar a fração de células T CD8+ específicas de antígeno nas culturas de indução. As FIGs. 9A-9C e 10A-10B retratam resultados exemplificativos que mostram a fração de células T de memória de CD8+ específicas de antígeno induzidas com e SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3249) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3250), respectivamente. A FIG. 9A descreve um resultado exemplificativo de um ensaio de resposta de célula T com o uso de PBMCs de 6 doadores saudáveis diferentes que mostram a fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam a peptídeo MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3251) analisado por citometria de fluxo após estímulo ou indução. Um aumento na fração de células T específicas de antígeno foi observado. A FIG. 9B descreve um resultado exemplificativo de um ensaio de resposta de célula T com o uso de PBMCs de um doador saudável que mostra a fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam a peptídeo SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3252) analisado por citometria de fluxo após estímulo ou indução. Um aumento na fração de células T específicas de antígeno foi observado. Dentre os cinco doadores saudáveis testados, 4 mostraram um aumento na fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam ao peptídeo MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3253). Um ensaio de resposta de célula
T com o uso de PBMCs de 3 doadores saudáveis diferentes mostrou um aumento na fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam ao peptídeo VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3254) analisado por citometria de fluxo após estímulo ou indução em um dentre os três doadores. A FIG. 9C descreve um resultado exemplificativo de um ensaio de resposta de célula T com o uso de PBMCs de HLA-A02:01, HLA-A03:01 HLA-A11:01, HLA-B07:02 e HLA-B08:01 de doadores saudáveis que mostram fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam ao peptídeo SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3255), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3256), KIMFATLQR (SEQ ID NO: 3257), KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3258), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3259) ou ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3260) analisado por citometria de fluxo após estímulo ou indução. A FIG. 10A descreve um resultado exemplificativo de um ensaio de resposta de célula T com o uso de PBMCs de um HLA-B07:02 doador saudável que mostram fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam ao peptídeo de estímulo KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3261) (epítopo mínimo KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3262) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3263) analisado). A FIG. 10B descreve um resultado exemplificativo de um ensaio de resposta de célula T com o uso de PBMCs de um HLA-A02:01 doador saudável que mostram fração de células T CD8+ específicas de antígeno que responderam ao peptídeo de estímulo SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3264) (epítopo mínimo SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3265) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3266) analisado). Exemplo 11 – Ensaio de citotoxicidade de células T induzidas
[0649] Um ensaio de citotoxicidade foi usado para avaliar a possibilidade de as culturas de célula T induzidas poderem matar o antígeno que expressa linhagens tumorais. Nesse exemplo, a expressão de caspase 3 ativo em células tumorais vivas ou mortas foi medida para quantificar a morte celular prematura e as células tumorais mortas. Na FIG. 33, as respostas de CD8+ induzidas foram capazes de matar antígeno que expressa alvos tumorais. A porcentagem viva de células alvo positivas de caspase-A de duas simulações de amostra transduzidas ou transduzidas com um vetor lentiviral de expressão que codifica um peptídeo neoORF de GATA3 são mostrados. Exemplo 12 – Síntese de Peptídeo
[0650] Os peptídeos na Tabela 5 abaixo foram sintetizados e purificados. Os pesos moleculares previstos e determinados são mostrados. Também são mostrados as purezas brutas e purezas finais para os peptídeos indicados. Tabela 5 MW MW Pureza Pureza ID Sequências Teórico Determinado Bruta Final EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: L7 2234,6 2235,2 47 % 97,4 % 3267) GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID L8 2922,5 2923,5 51 % 99,5 % NO: 3268) LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID L9 2986,6 2987,7 37 % 98,1 % NO: 3269) KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQR (SEQ ID L10 2759,3 2760,3 53 % 92,6 % NO: 3270) KPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: L10b 2361,9 2362,4 41 % 97,6 % 3271) L10b- KKKKKPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID 2874,5 2874,9 57 % 85,7 % 4K NO: 3272) L10c KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3273) 1911,3 1911,4 69 % 98,4 % FLKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: L11 2473,0 2473,0 66 % 86 % 3274) YMFLKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID L11b 2767,4 2767,2 37 % 80,0 % NO: 3275)
MW MW Pureza Pureza ID Sequências Teórico Determinado Bruta Final YMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: L11c 2251,7 2252,4 38 % 95,9 % 3276) L11c- KKKKYMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID 2764,3 2764,8 45 % 82,0 % 4K NO: 3277) KAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: L11d 2212,7 2213,0 32 % 96,6 % 3278) L11d- KKKKKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID 2725,3 2725,8 28 % 82,3 % 4K NO: 3279) L11e DGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 3280) 1852,2 1852,3 39 % 91,6 % L11f FLKAESKIMFATLQRS (SEQ ID NO: 3281) 1870,2 1870,2 62 % 95,0 % L11g ESKIMFATLQRSSLWC (SEQ ID NO: 3282) 1900,2 1900,2 41 % 91,0 % L11h FLKAESKIMFATLQR (SEQ ID NO: 3283) 1783,1 1783,8 35 % 84 % L11i ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3284) 1610,87 1610,80 75 % 97 % KIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: L12 2238,7 2238,6 31 % 68,0 % 3285) KKKKKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID L12-4K 2751,3 2751,8 49 % 75,7 % NO: 3286) MFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: L12b 1997,3 1997,8 47 % 98,7 % 3287) L12b- KKKKMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2510 2510,4 39 % 92,7 % 4K 3288) L12c MFATLQRSSLWCLC (SEQ ID NO: 3289) 1659,0 1659 57 % 90 % L12d TLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3290) 1647,9 1648 60 % 99 % SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: L14 1905,2 1905,3 64,5 % 99,5 % 3291)
KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH L15 3890,58 3891 37 % 96 % (SEQ ID NO: 3292) KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ L15b 3449,1 3449,5 42 % 87 % ID NO: 3293)
DLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRS L15c 4639,5 4640,4 40 % 90 % SLWCL (SEQ ID NO: 3294) Exemplo 13 – Testes de Solubilidade de Peptídeo neoORF de GATA3 Sintético
[0651] A solubilidade de cada peptídeo na Tabela 6 abaixo foi testada nas várias soluções indicadas. SS = succinato de sódio. Formulação A testada incluiu 4 % de DMSO, succinato de sódio (SS) a 5 mM em D5W. Formulação B testada inclui nenhum DMSO, SS a 5 mM em D5W. Formulação C testada inclui nenhum DMSO, SS a 0,25 mM em D5W. A síntese do 33mer L15, que contém duas cisteínas, foi realizada com o uso, por criação, de blocos de construção de pseudo–prolina através de conjugação das cadeias laterais de ES, AT e SS na sequência. Isso permitiu que L15 fosse purificado a 95 % de pureza e impedisse a agregação durante a síntese de peptídeo de fase sólida. A Tabela 6 abaixo lista as solubilidades de peptídeo ID Sequência AA SS a SS a SS a SS a poliI poliI poliI poliI SS a poliI SS a poliI 5 mM 0,5 m 0,75 0,25 CLC + CLC + CLC + CLC + 0,25 CLC + 5 mM CLC + em M em mM em mM em SS a SS a SS a SS a mM em SS a em SS a D5W D5W D5W D5W 0,5 m 0,75 0,25 5 mM D5W 0,25 D5W 5 mM com com com com M em mM em mM em em como mM em como em 4 % 4 % 4 % 4 % D5W D5W D5W D5W DMSO D5W DMSO D5W de de de de com com com com como como DMSO DMSO DMSO DMSO 4 % 4 % 4 % 4 % DMSO DMSO de de de de
DMSO DMSO DMSO DMSO 7 EPCSMLTGPPAR 21 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim
VPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3295) 14 SMLTGPPARVPA 18 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim VPFDLH (SEQ ID NO: 3296) 8 GPPARVPAVPFD 26 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim
LHFCRSSIMKPK RD (SEQ ID NO: 3297) 9 LHFCRSSIMKPK 25 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim
RDGYMFLKAESK I (SEQ ID NO: 3298) 10 KPKRDGYMFLKA 23 Sim Sim Não Não
ESKIMFATLQR (SEQ ID NO:
ID Sequência AA SS a SS a SS a SS a poliI poliI poliI poliI SS a poliI SS a poliI 5 mM 0,5 m 0,75 0,25 CLC + CLC + CLC + CLC + 0,25 CLC + 5 mM CLC + em M em mM em mM em SS a SS a SS a SS a mM em SS a em SS a D5W D5W D5W D5W 0,5 m 0,75 0,25 5 mM D5W 0,25 D5W 5 mM com com com com M em mM em mM em em como mM em como em 4 % 4 % 4 % 4 % D5W D5W D5W D5W DMSO D5W DMSO D5W de de de de com com com com como como DMSO DMSO DMSO DMSO 4 % 4 % 4 % 4 % DMSO DMSO de de de de
DMSO DMSO DMSO DMSO 3299) 11 FLKAESKIMFAT 21 Não
LQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3300) 12 KIMFATLQRSSL 19 WCLCSNH (SEQ ID NO: 3301) 10b KPKRDGYMFLKA 20 Sim Sim Sim Não Não
ESKIMFAT (SEQ ID NO: 3302) 11b YMFLKAESKIMF 23
ATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3303) 11c YMFLKAESKIMF 19 Sim Sim Sim Não Não ATLQRSS (SEQ ID NO: 3304) 11d KAESKIMFATLQ 19 Sim Sim Sim Sim Sim RSSLWCL (SEQ ID NO: 3305) 12b MFATLQRSSLWC 17 Sim Sim Sim Não Não LCSNH (SEQ ID NO: 3306) 10b KKKKKPKRDGYM 25 Sim -4K FLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 3307) 11c KKKKYMFLKAES 23 -4K KIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 3308) 11d KKKKKAESKIMF 23 Sim
ID Sequência AA SS a SS a SS a SS a poliI poliI poliI poliI SS a poliI SS a poliI 5 mM 0,5 m 0,75 0,25 CLC + CLC + CLC + CLC + 0,25 CLC + 5 mM CLC + em M em mM em mM em SS a SS a SS a SS a mM em SS a em SS a D5W D5W D5W D5W 0,5 m 0,75 0,25 5 mM D5W 0,25 D5W 5 mM com com com com M em mM em mM em em como mM em como em 4 % 4 % 4 % 4 % D5W D5W D5W D5W DMSO D5W DMSO D5W de de de de com com com com como como DMSO DMSO DMSO DMSO 4 % 4 % 4 % 4 % DMSO DMSO de de de de
DMSO DMSO DMSO DMSO -4K ATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3309) 12b KKKKMFATLQRS 20 Sim -4K SLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3310) 12- KKKKKIMFATLQ 23 Sim 4K RSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3311) L10 KPKRDGYMFLKA 16 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim c ESKI (SEQ ID NO: 3312) L11 DGYMFLKAESKI 16 Não Não e MFAT (SEQ ID NO: 3313) L11 FLKAESKIMFAT 16 Sim Sim Sim Sim f LQRS (SEQ ID NO: 3314) L11 ESKIMFATLQRS 16 Não Sim Não g SLWC (SEQ ID NO: 3315) L11 FLKAESKIMFAT 15 h LQR (SEQ ID NO: 3316) L11 ESKIMFATLQRS 14 Sim Sim i SL (SEQ ID NO: 3317) L12 MFATLQRSSLWC 14 Não Não c LC (SEQ ID NO: 3318) L12 TLQRSSLWCLCS 14 Sim Sim Sim Sim Sim d NH (SEQ ID
ID Sequência AA SS a SS a SS a SS a poliI poliI poliI poliI SS a poliI SS a poliI 5 mM 0,5 m 0,75 0,25 CLC + CLC + CLC + CLC + 0,25 CLC + 5 mM CLC + em M em mM em mM em SS a SS a SS a SS a mM em SS a em SS a D5W D5W D5W D5W 0,5 m 0,75 0,25 5 mM D5W 0,25 D5W 5 mM com com com com M em mM em mM em em como mM em como em 4 % 4 % 4 % 4 % D5W D5W D5W D5W DMSO D5W DMSO D5W de de de de com com com com como como DMSO DMSO DMSO DMSO 4 % 4 % 4 % 4 % DMSO DMSO de de de de
DMSO DMSO DMSO DMSO NO: 3319) L15 KPKRDGYMFLKA 33 Não Sim Sim
ESKIMFATLQRS
SLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3320) L15 KPKRDGYMFLKA 29 b ESKIMFATLQRS SLWCL (SEQ ID NO: 3321) L15 DLHFCRSSIMKP 39 c KRDGYMFLKAES
KIMFATLQRSSL WCL (SEQ ID NO: 3322) 10b KKKKKPKRDGYM 24 Sim -4K FLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 3323) 11c KKKKYMFLKAES 23 -4K KIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 3324) 11d KKKKKAESKIMF 23 Sim -4K ATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3325) 12b KKKKMFATLQRS 21 Sim -4K SLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3326) 12- KKKKKIMFATLQ 23 Sim 4K RSSLWCLCSNH (SEQ ID NO:
ID Sequência AA SS a SS a SS a SS a poliI poliI poliI poliI SS a poliI SS a poliI 5 mM 0,5 m 0,75 0,25 CLC + CLC + CLC + CLC + 0,25 CLC + 5 mM CLC + em M em mM em mM em SS a SS a SS a SS a mM em SS a em SS a D5W D5W D5W D5W 0,5 m 0,75 0,25 5 mM D5W 0,25 D5W 5 mM com com com com M em mM em mM em em como mM em como em 4 % 4 % 4 % 4 % D5W D5W D5W D5W DMSO D5W DMSO D5W de de de de com com com com como como DMSO DMSO DMSO DMSO 4 % 4 % 4 % 4 % DMSO DMSO de de de de
DMSO DMSO DMSO DMSO 3327) Exemplo 14 – Projeto de Agrupamentos de Peptídeo neoORF de GATA3 Sintético para Administração a Indivíduos
[0652] Diversos agrupamentos dos peptídeos de GATA3 indicados foram projetados de acordo com a Tabela 7 abaixo. Por exemplo, “Projeto 1” contém três agrupamentos de peptídeos em que o agrupamento 1 contém três peptídeos (isto é, L7, L8 e L14), o agrupamento 2 contém dois peptídeos (isto é, L9 e L10c) e o agrupamento 3 contém dois peptídeos (isto é, L15 e L11f). Por exemplo, o “Projeto 6” contém dois agrupamentos de peptídeos em que o agrupamento 1 contém quatro peptídeos (isto é, L7, L8, L9 e L14) e o agrupamento 2 contém dois peptídeos (isto é, L15 e L11f). Por exemplo, o “Projeto 10” contém quatro agrupamentos de peptídeos em que agrupamento 1 contém cinco peptídeos (isto é, L7, L8, L9, L10c e L14), agrupamento 2 contém um peptídeo (isto é, L15), agrupamento 3 contém um peptídeo (isto é, L11f) e agrupamento 4 contém um peptídeo (isto é, L11i). A concentração de cada peptídeo nos agrupamentos pode ser alterada de acordo com um elemento versado na técnica de preparação de formulações de peptídeo. A Tabela 7 abaixo lista a descrição de projetos de agrupamento de GATA3.
Tabela 7 Exemplo 15 –Síntese de peptídeo de neoORF de GATA3
[0653] A síntese convencional é realizada com um alvo de 700 mg de material bruto. Os seguintes aminoácidos de Fmoc com proteções de cadeia lateral adequadas foram usadas na construção de peptídeo L7 (EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3328)): Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)- OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met- OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, e Fmoc-Val-OH. A histidina C-terminal foi incorporada na sequência sendo pré-carregada em uma resina usando-se resina de H-His(Trt)-2Cl-Trt ou resina Wang de Fmoc-His(Trt). Fmoc-Asp(OMpe)-OH pode ser usada no lugar de Fmoc-Asp(OtBu)-OH para ajudar a melhorar a síntese, como com combinações de sequência de “DG” para minimizar a formação de aspartamida.
[0654] As sequências de peptídeos foram intumescidas com dimetilformamida (DMF) e drenadas duas vezes. A síntese começou com a desproteção do grupo de proteção N-α-FMOC com o uso de piperidina a 20 % em DMF com dispensação de nitrogênio para mistura. Após a drenagem, uma resina foi lavada com DMF. Em seguida, uma solução de 0,4 M de aminoácido foi adicionada em conjunto com 0,4 M de HCTU e 0,8 M de DIEA. A reação de acoplamento foi executada com dispensação de nitrogênio para mistura, seguida por drenagem do vaso de reação (RV). As adições de aminoácido, HCTU e DIEA foram repetidas por um ciclo de acoplamento duplo com os mesmos parâmetros de mistura e drenagem que a primeira etapa de acoplamento. A resina foi, então, lavada com DMF novamente. Esse ciclo foi repetido para todos os resíduos de aminoácido. O método de desproteção final removeu o Fmoc N- terminal por meio de piperidina a 20 % em DMF, e uma resina foi lavada com DMF seguida por lavagens com MeOH. A resina estava no instrumento sob nitrogênio até ser removida.
[0655] Para síntese de micro-ondas, os mesmos materiais de partida de aminoácido de Fmoc foram usados, com apenas a resina Wang de Fmoc-His(Trt) (mas não a resina de H-His(Trt)- 2Cl Trt) sendo utilizada para incorporar a histidina C- terminal.
[0656] No sintetizador de micro-ondas, a resina foi intumescida em DMF até que fosse transferida através das linhagens de HT para o vaso de reação de micro-onda (RV). Enquanto está no RV, a resina carregada de Fmoc-His(Trt)-OH foi tratada com pirrolidina a 25 % em DMF para remover o N- α-FMOC sob 85 °C/90 W seguido por 100 °C/20 W. Em seguida, o RV foi drenado e lavado com DMF, e drenado novamente. O aminoácido de Fmoc programado foi adicionado (0,5 M em DMF) ao RV em conjunto com DIC a 4 M e Oxymapure a 0,25 M. Essa reação de acoplamento seguiu o aquecimento de 105 °C/288W seguida por aquecimento de 105 °C/73W. Essa primeira desproteção foi inicialmente diluída com DMF, no entanto, essa etapa não foi exigida para quaisquer desproteções subsequentes visto que o RV já conteve DMF da reação de acoplamento. Os ciclos de desproteção, lavagem e acoplamento foram repetidos para cada resíduo até que o peptídeo fosse sintetizado. Para resíduos de arginina, uma etapa de acoplamento duplo foi realizada, em que após o acoplamento simples foi realizado, a solução foi drenada, e a etapa de acoplamento foi repetida antes de prosseguir para a desproteção. A desproteção final do grupo N-terminal de Fmoc foi realizada como acima, exceto por ser drenada e lavada duas vezes com DMF antes de ser transferida por meio de DMF de volta para a posição de resina de HT original.
[0657] Após a síntese, uma resina foi transferida para uma seringa de frita com o uso de DMF, enxaguada com MeOH, e seca com o uso de um coletor a vácuo. Então, uma resina foi clivada com o uso de Reagente K (82,5 % de ácido trifluoroacético (TFA), 5 % de água, 5 % de tioanisol, 5 % de fenol, e 2,5 % de etanoditiol) com o uso de um suporte vertical em um agitador oscilante por três horas à temperatura ambiente.
[0658] O coquetel de clivagem foi, então, dispensado através de um frita de seringa filtrada em dietil éter frio ou metil terc-butil éter frio (MTBE). Cada seringa foi, então, enxaguada com um 95:5 de solução de ácido trifluoroacético:água por agitação. O enxágue foi, então, adicionado ao restante do coquetel/mistura de éter. A mistura foi, então, centrifugada. Após decantar o éter, outra lavagem de éter frio foi adicionada. O recipiente foi vortexado e centrifugado novamente. Isso foi repetido para enxaguar completamente o pélete. A lavagem final foi decantada e o pélete seco por meio de dessecador a vácuo. Uma amostra do pélete foi dissolvida em solvente (por exemplo, DMSO, DMF, água ou acetonitrila) e analisada por meio de UPLC-MS quanto a identidade, pureza bruta, e tempo de retenção. Outros peptídeos, por exemplo L14 (SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3329)), L8 (GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 3330)), L10c (KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3331)), L11h (FLKAESKIMFATLQR (SEQ ID NO: 3332)), e L11i (ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3333)) foram feitos de um modo similar, com uso de aminoácidos e resinas pré-carregadas específicas para aquelas sequências. Exemplo 16 – Síntese de peptídeo neoORF de GATA3
[0659] Os seguintes aminoácidos de Fmoc foram usados na sintetização de peptídeo L15 (KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3334)): Fmoc- Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc- Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc- Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, e Fmoc- Tyr(tBu)-OH. A histidina C-terminal foi incorporada na sequência sendo pré-carregada em uma resina usando-se resina de H-His(Trt)-2Cl-Trt ou resina Wang de Fmoc-His(Trt). Fmoc- Asp(OMpe)-OH pode ser usada no lugar de Fmoc-Asp(OtBu)-OH para ajudar a melhorar a síntese, como com combinações de sequência de “DG” para minimizar a formação de aspartamida. Em que os resíduos de serina (Ser, S) e treonina (Thr, T) estão presentes, os dipeptídeos de aminoácido (psuedoprolinas) foram incorporados para aprimorar os rendimentos de síntese, como Fmoc-Ser(tBu)- Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “SS”, Fmoc-Ala- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “AT”, e Fmoc-Glu(OtBu)- Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “ES”. Para algumas sínteses de L15, uma combinação de todas as três pseudoprolinas (isto é, Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “SS”, Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “AT”, e Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH) no lugar de “ES”) foi usada. Para outras sínteses de L15, a seguinte pesudoprolina e as combinações de pseudoprolina foram usadas, respectivamente: Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “AT” e Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “ES”; Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “SS” e Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “ES”; Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “SS” e Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “AT”; Fmoc-Ala- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “AT”; Fmoc-Glu(OtBu)- Ser(psi(Me,Me)pro)-OH) no lugar de “ES”; e Fmoc-Ser(tBu)- Ser(psi(Me,Me)pro)-OH no lugar de “SS”.
[0660] As sequências de peptídeos foram intumescidas com DMF e drenadas duas vezes. Uma síntese começou com a desproteção do grupo N-α-Fmoc com o uso de piperidina a 20 % em DMF com dispensação de nitrogênio para mistura. Após a drenagem, uma resina foi lavada com DMF. Em seguida, uma solução de 0,4 M de aminoácido foi adicionada em conjunto com 0,4 M de HCTU e 0,8 M de DIEA. A reação de acoplamento foi realizada com dispensação de nitrogênio para mistura, seguida por drenagem do vaso de reação (RV). As adições de aminoácido, HCTU e DIEA foram repetidas por um ciclo de acoplamento duplo com os mesmos parâmetros de mistura e drenagem que a primeira etapa de acoplamento. A resina foi, então, lavada com DMF novamente. Esse ciclo foi repetido para todos os resíduos de aminoácido. O método de desproteção final removeu o Fmoc N-terminal por meio de piperidina a
20 % em DMF, e uma resina foi lavada com DMF seguida por lavagens com MeOH. A resina estava no instrumento sob cobertura de nitrogênio até ser removida.
[0661] Para síntese de micro-ondas, os mesmos materiais de partida de aminoácido foram usados, com apenas a resina Wang de Fmoc-His(Trt) (mas não a resina de H-His(Trt)-2Cl Trt) sendo utilizada para incorporar a histidina C-terminal.
[0662] No sintetizador de micro-ondas, a resina foi intumescida em DMF até que fosse transferida através das linhagens de HT para o vaso de reação de micro-onda (RV). Enquanto está no RV, a resina carregada de Fmoc-His(Trt) foi tratada com pirrolidina a 25 % em DMF para remover o N-α- Fmoc sob 85 °C/90 W seguido por 100 °C/20 W. Essa primeira desproteção foi inicialmente diluída com DMF; no entanto, essa etapa não foi exigida para quaisquer desproteções subsequentes visto que o RV já conteve DMF da reação de acoplamento. Em seguida, o RV foi drenado e lavado com DMF, e drenado novamente. O aminoácido de Fmoc programado, então, foi adicionado (0,5 M em DMF) ao RV em conjunto com DIC a 4 M e Oxymapure a 0,25 M. Essa reação de acoplamento seguiu o aquecimento de 105 °C/288W seguida por aquecimento de 105 °C/73W. Os ciclos de desproteção, lavagem e acoplamento foram repetidos para cada resíduo até que o peptídeo fosse sintetizado. Para os resíduos de arginina, houve uma etapa de acoplamento duplo, em que após o acoplamento simples foi realizada, a solução foi drenada, e a etapa de acoplamento foi repetida antes de prosseguir para a desproteção. A desproteção final do grupo N-terminal de Fmoc foi realizada da mesma forma que para todas as outras etapas de desproteção, exceto por ser drenada e lavada duas vezes com
DMF antes de ser transferida por meio de DMF de volta para a posição de resina de HT original.
[0663] Após a síntese, uma resina foi transferida para uma seringa de frita com o uso de DMF, enxaguada com MeOH, e seca com o uso de coletor a vácuo. A resina foi, então, clivada com o uso de Reagente K (82,5 % de ácido trifluoroacético (TFA), 5 % de água, 5 % de tioanisol, 5 % de fenol e 2,5 % de etanoditiol) com o uso de um suporte vertical em um agitador oscilante à temperatura ambiente.
[0664] O coquetel de clivagem foi, então, dispensado através da seringa filtrada em dietil éter frio (ou MTBE frio). Cada seringa foi, então, enxaguada com um 95:5 de solução de ácido trifluoroacético: água por agitação. O enxágue foi, então, adicionado ao restante do coquetel/mistura de éter. Então, a mistura foi centrifugada. Após decantar o éter, outra lavagem de éter frio foi adicionada. O recipiente foi vortexado e centrifugado novamente. Isso foi repetido para enxaguar completamente o pélete. A lavagem final foi decantada e o pélete foi seco por meio de dessecador a vácuo. Uma amostra do pélete foi dissolvida em solvente (por exemplo, DMSO, DMF, água ou acetonitrila) e analisada por meio de UPLC-MS quanto a identidade, pureza bruta, e tempo de retenção.
[0665] Outros peptídeos, por exemplo, L9 (LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3335)), foram feitos de maneira similar, com o uso de aminoácidos e resinas pré- carregadas específicas àquelas sequências, bem como pseudoprolina derivados em que resíduos de serina (Ser, S) ou treonina (Thr, T) estão presentes e Fmoc-Asp(OMpe)-OH, como descrito acima.
Exemplo 17 – Estudos de Solubilidade
[0666] Uma diversidade de peptídeos de GATA3 com neoepítopos foram primeiro testados quanto solubilidade com o uso de succinato de sódio (SS) a 5 mM em D5W com 4 % de DMSO. Com base nos resultados iniciais, a estratégia de formulação foi aprimorada ajustando-se a concentração de succinato de sódio (SS) e quantidade de DMSO, que resulta na seleção de 7 peptídeos. As estratégias de agrupamento desses peptídeos foram determinadas quanto à solubilidade e à compatibilidade com poliICLC. Com base nesses resultados, três agrupamentos foram selecionados. Dois agrupamentos cada um com apenas um peptídeo em SS a 0,25 mM em D5W e um terceiro agrupamento com 5 peptídeos em SS a 5 mM em D5W. O pH dos agrupamentos após serem combinados com poliICLC foram todos de pH 5,0- 6,0 e houve perda mínima durante a filtração.
[0667] Os peptídeos triados para os seguintes estudos são todos listados na Tabela 8. Tabela 8 Nome Sequência Peso Teor de % de Teor % de molecular TFA de pureza Teórico peptídeo teórico L7 EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3336) 2234,6 13,3 80,3 97 GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: L8 3337) 2922,4 21,5 72,1 100 LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: L9 3338) 2986,6 23,4 70,2 98 L10B KPKRDGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 3339) 2361,8 22,5 71,1 98 L11C YMFLKAESKIMFATLQRSS (SEQ ID NO: 3340) 2251,7 16,8 76,8 93 L11D KAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3341) 2212,6 17,1 76,5 92 L12B MFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3342) 1997,3 14,6 79,0 93 L10 KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQR (SEQ ID NO: 3343) 2759,3 22,4 71,2 93 L10c KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3344) 1911,3 26,4 67,2 98 L11 FLKAESKIMFATLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3345) 2473,0 15,6 78,0 86 L11e DGYMFLKAESKIMFAT (SEQ ID NO: 3346) 1852,2 15,6 78,0 92
Nome Sequência Peso Teor de % de Teor % de molecular TFA de pureza Teórico peptídeo teórico L11f FLKAESKIMFATLQRS (SEQ ID NO: 3347) 1870,2 19,6 74,0 95 L11 g ESKIMFATLQRSSLWC (SEQ ID NO: 3348) 1900,2 15,3 78,3 91 L12c MFATLQRSSLWCLC (SEQ ID NO: 3349) 1659,0 12,1 81,5 90 L12d TLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3350) 1647,9 17,2 76,4 99 KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID L15 NO: 3351) 3890,6 19,0 74,6 98 L14 SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3352) 1905,2 15,2 78,4 99 L11i ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3353) 1610,9 17,5 76,1 96
[0668] Todos os tampões foram preparados diariamente. D5W foi preparado ponderando-se a dextrose e adicionando-se água milliQ à dextrose para obter o volume adequado. Por exemplo, água foi adicionada a 12,5 g de dextrose para obter um volume total de 250 ml. Para preparar 50 ml de SS a 5 mM em D5W ponderando-se 67,54 mg, SS foi pesado e adicionado a D5W para obter 50 ml de volume total. Para preparar SS a 0,25 mM em D5W, 2,5 ml de SS a 5 mM em D5W foi diluído com 47,5 ml de D5W.
[0669] A % de teor de peptídeo de cada peptídeo foi determinada como a seguir: O TFA teórico total é igual a uma soma do número de cargas positivas (terminação N, Arg, Lys e His). Tal número foi inserido na seguinte equação em que MW é o peso molecular do peptídeo: Equação 1. % de TFA=100*((%TFA*114,02)/((%TFA*114,02)+MW))
[0670] Esse valor foi, então, usado para calcular a porcentagem de teor de peptídeo com o uso de 6,45 % como teor de água teórico: Equação 2. %peptídeo=100-%TFA-6,45 %
[0671] O peso bruto alvo para esses experimentos foi calculado com o uso da equação abaixo.
Equação 3. Peso bruto alvo=(13,2*10000)/(% de teor de peptídeo*% de pureza)
[0672] Os peptídeos foram pesados em tubos cônicos de 15 ml ou 50 ml com o uso de uma balança analítica Mettler Toledo XP105 Delta Mass e o peso bruto real foi registrado e usado para determinar quanto DMSO é necessário para obter 50 mg/ml. O cálculo é mostrado abaixo: Equação 4. DMSO (µl)=(Peso bruto real (mg)*264 µl)/(Peso bruto alvo (mg))
[0673] O estoque foi, então, diluído a 2 mg/ml (1 parte de estoque de DMSO, 24 partes de tampão) no tampão de formulação adequado.
[0674] Os pesos de peptídeos e a porcentagem de teor foram calculados como descrito acima e o tampão adequado foi adicionada diretamente aos peptídeos. O peso bruto alvo calculado com o uso da Eq. 3 e o volume de tampão usados para obter 2 mg/ml de peptídeo foi calculado com o uso da Equação 5. Equação 5. Tampão (ml)=(Peso bruto real (mg)*6,6 ml)/(Peso bruto alvo (mg))
[0675] Os peptídeos foram adicionalmente diluídos 1:4 com tampão para obter 0,4 mg/ml ou, apenas quando indicado, o tampão foi adicionado diretamente ao peptídeo seco para obter 0,4 mg/ml. No caso anterior, a Equação 6 para determinar o volume adequado a ser adicionado. Equação 6. Tampão (ml)=(Peso bruto real (mg)*33 ml)/(Peso bruto alvo (mg))
[0676] Os peptídeos foram dissolvidos invertendo-se os tubos cônicos e não sonicando-se ou vortexando-se os mesmos.
[0677] Para agrupar 5 peptídeos, o volume igual de cada
2 mg/ml de estoque foi combinado para obter 0,4 mg/ml de cada peptídeo. Nesse caso de agrupamentos com menos que 5 peptídeos, volumes iguais dos peptídeos foram combinados, então, a solução foi diluída com o tampão adequado para obter 0,4 mg/ml de cada peptídeo. Os agrupamentos foram invertidos 3-5 vezes para mistura. Os peptídeos formulados foram transferidos para frascos de vidro para visualizar a solubilidade. Fotografias foram tiradas a cada duas horas para observar quaisquer alterações na aparência.
[0678] O poliICLC foi obtido comercialmente. Os agrupamentos foram combinados em uma razão de 3:1 de peptídeo para poliICLC com o uso de agrupamento de 150 µl de poliICLC com 450 µl de peptídeo em um frasco de vidro de 2 ml. A solução foi invertida 3- 5 vezes para mistura e fotografias foram tiradas a cada duas horas por 6 horas para observar quaisquer alterações na aparência. Todas as medições de pH foram feitas com o uso de um medidor de pH Mettler Toledo inLab Micro, que foi calibrado todos os dias antes do uso. 100 µl da amostra que é analisada foram removidos e adicionados a um tubo de microcentrífuga para medir o pH. A amostra foi, então, descartada. Amostras por UPLC-MS (Waters Acquity H-Class com um espectrômetro de massa Acquity QDa). Uma injeção de 2 µl de cada amostra foi analisada em duplicata com o uso de um gradiente de 8 minutos de 10:90 de solvente A:B para 50:50 de solvente A:B (A:0,1 % de TFA/água, B: 0,1 % de TFA:acetonitrila). A solubilidade inicial de peptídeos na formulação padrão foi determinada para cada peptídeo a 0,4 mg/ml e 2 mg/ml. Embora fotografias tenham sido tiradas, as mesmas nem sempre mostram claramente a solubilidade visto que os géis foram frequentemente claros ou os peptídeos para particulados vítreos pequenos quando dissolvidos. As solubilidades de peptídeo em SS a 5 mM/D5W com 4 % de DMSO são indicadas na Tabela 9. A Tabela 9 abaixo lista Observações e Solubilidades de Peptídeo em SS a 5 mM/D5W com 4 % de DMSO Solubilidade de Solubilidade de Observações de Observações de Nome de Peptídeo (em Peptídeo (em Formulação (em Formulação (em Peptídeo 0,4 mg/ml) 2 mg/ml) (S/N) 2 mg/ml) 0,4 mg/ml) (S/N) L7 Y clara Y clara L8 Y clara Y clara L9 Y clara Y clara L15 N turvo N Turvo por 4 horas L14 Y clara Y clara L10 Y clara Y clara L10c Y clara Y clara Turvo, L11 N N Particulados vítreos precipitação turvo, L11e N particulados N Particulados vítreos grandes L11f N turvo N Particulados vítreos L11 g N turvo N Particulados vítreos turvo, L12c N particulados N Particulados vítreos grandes L12d Y clara Y clara
[0679] Os peptídeos que eram insolúveis em SS a 5 mM foram testados com uso de SS a 0,25 mM em D5W com 4 % de DMSO. Os resultados são resumidos na Tabela 10. Muitos desses peptídeos que eram insolúveis em SS a 5 mM, eram solúveis em uma concentração de 0,4 mg/ml em SS a 0,25 mM/D5W com 4 % de DMSO após 6 horas e foram testados em estudos adicionais com uso dessa concentração de SS inferior. A Tabela 10 lista Solubilidades e Observações de Peptídeo em SS a 0,25 mM/D5W com 4 % de DMSO
Solubilidade de Observações de Solubilidade de Observações de Nome de Peptídeo (em Formulação (em Peptídeo (em Formulação (em Peptídeo 2 mg/ml) (S/N) 2 mg/ml) 0,4 mg/ml) (S/N) 0,4 mg/ml) L15 Y clara Y clara N (particulados particulados L11 Y clara vítreos) vítreos particulados L11e N gel N vítreos L11f Y clara Y clara N (gel ao longo gel ao longo do L11 g Y clara do tempo) tempo Particulados L12c N N turvo grandes L12d Y clara Y clara
[0680] Com base nesses resultados, os peptídeos L7, L8, L9, L14, L10c, L11d, L11f e L15 foram selecionados para estudos de formulação. As formulações sem DMSO foram testadas como forma de melhorar a estabilidade dos peptídeos formulados e para retardar a dimerização de peptídeos contendo cisteína. Todos os peptídeos foram testados (L7, L8, L9, L14, L10c, L11d, L11f e L15) em uma concentração de 0,4 mg/ml em SS a 0,25 mM e eram solúveis sem DMSO após 6 horas. Os peptídeos L7, L8, L9, L10c, L12d e L14 foram testados em SS a 5 mM e também eram solúveis sem DMSO após 6 horas. Os valores de pH das formulações de peptídeo em SS a 0,25 mM/D5W e SS a 5 mM/D5W são listados na Tabela 11. A Tabela 11 abaixo mostra o pH de Formulações de Peptídeo de 0,4 mg/ml em SS a 0,25 mM/D5W e SS a 5 mM/D5W pH em SS a Nome de Peptídeo pH em SS a 0,25 mM/D5W 5 mM/D5W L7 6,4 4,5 L8 6,4 5,0 L9 6,4 4,6 pH em SS a Nome de Peptídeo pH em SS a 0,25 mM/D5W 5 mM/D5W L10c 6,4 4,3 L11f N/A 5,0 L14 6,4 4,2 L15 N/A 4,8
[0681] Devido ao fato de que os peptídeos relatados na Tabela 11 eram todos solúveis em SS a 0,25 mM, os projetos de agrupamento inicial foram estudados com uso da concentração de SS inferior. Os agrupamentos também foram projetados com solubilidade individual em mente. Devido ao fato de que L15 e L11f eram solúveis em SS baixo, esses dois peptídeos foram agrupados em conjunto. Os primeiros três projetos de agrupamento são mostrados na Tabela 12. A Tabela 12 abaixo mostra Agrupamentos de Peptídeo Iniciais em SS a 0,25 mM/D5W Projeto 1 Projeto 2 Projeto 3 Nome de 3 3 3 peptídeo agrupamentos agrupamentos agrupamentos L7 1 1 1 L14 1 1 1 L8 1 2 2 L9 2 2 2 L15 3 3 3 L11f 3 3 3 L10c 2 2 1
[0682] Todos os peptídeos permaneceram solúveis após o agrupamento. Os valores de pH dos agrupamentos de peptídeos com ou sem adição de poliICLC são determinados na Tabela 13. A Tabela 13 abaixo lista o pH de Agrupamentos de Peptídeo da Tabela 12 com ou sem Adição de poliICLC pH de Agrupamento pH de Agrupamento com poliICLC Agrupamento Projeto 1 Agrupamento 1 3,4 4,7 Agrupamento 2 3,8 5,1 Agrupamento 3 4,0 5,5 Projeto 2 Agrupamento 1 3,7 5,0 Agrupamento 2 3,6 4,8 Agrupamento 3 4,0 5,5 Projeto 3 Agrupamento 1 3,5 4,7 Agrupamento 2 3,9 5,5 Agrupamento 3 4,0 5,5
[0683] Os agrupamentos de cada projeto foram, então, misturados com poliICLC para testar sua compatibilidade com o adjuvante. Agrupamento 3 e cada agrupamento contendo o peptídeo L10c precipitaram quando combinados com poliICLC. Adicionalmente, os agrupamentos com 3 peptídeos tinham um pH abaixo de 5,0 quando combinados com poliICLC, o que sugere que a capacidade de tamponamento deveria ser maior quando um agrupamento contiver mais que dois peptídeos.
[0684] Devido ao fato de que L7, L8, L9, L10c e L14 são todos solúveis em SS a 5 mM, os mesmos foram testados em agrupamentos com a alta concentração de SS. Esses agrupamentos foram testados com esses cinco peptídeos. Um agrupamento foi sem L10c, um tinha L10c sozinho e o terceiro tinha todos os cinco peptídeos. Devido ao fato de que L11f e L15 não eram solúveis nessas concentrações maiores, os mesmos foram formulados em SS a 0,25 mM. No entanto, devido à precipitação observada, os mesmos foram formulados para 0,4 mg/ml separadamente em vez de em um agrupamento único. Cada um dos peptídeos era solúvel em suas respectivas formulações. Esses agrupamentos também eram compatíveis com poliICLC com base na visualização e os valores de pH após os agrupamentos terem sido combinados com poliICLC estavam, todos, entre 5,0 e 6,3 (Tabela 14), o que é apropriado para injeção subcutânea. A Tabela 14 lista o pH de Agrupamentos de Peptídeo sem poliICLC versus pH de Agrupamentos de Peptídeo com poliICLC pH de agrupamento Agrupamento pH de agrupamento com poliICLC sem poliICLC Agrupamento 1 5,6 5,6 Agrupamento 2 5,4 5,5 L10c 6,4 6,3 L11f 5,0 5,9 L15 4,8 6,0
[0685] O peptídeo L11i foi testado em D5W com várias concentrações de succinato sem DMSO. O peptídeo pareceu solúvel em todas as concentrações de SS em 0,4 mg/ml. Alguma precipitação foi observada em 2 mg/ml na concentração de SS maior. Todas as amostras pareciam iguais quando combinadas com poliICLC. Os valores de pH das formulações de 2 mg/ml ou
0,4 mg/ml de peptídeo L11i em SS a 0,25 mM, SS a 0,5 mM ou SS a 5 mM sem poliICLC e 0,4 mg/ml de peptídeo L11i em SS a 0,25 mM, SS a 0,5 mM ou SS a 5 mM com poliICLC são mostrados na Tabela 15. A Tabela 15 lista o pH de 2 mg/ml ou 0,4 mg/ml de peptídeo L11i em SS a 0,25 mM, SS a 0,5 mM e SS a 5 mM sem poliICLC e 0,4 mg/ml em SS a 0,25 mM, SS a 0,5 mM e SS a 5 mM com poliICLC pH 2 mg/ml de 0,4 mg/ml de 0,4 mg/ml de peptídeo peptídeo L11i com peptídeo L11i L11i poliICLC SS a 5,8 6,7 6,6 5 mM SS a 4,1 5,8 6,1 0,5 mM SS a 0,25 m 3,7 5,3 6,1
M
[0686] Os agrupamentos finalizados com base nos resultados incluíram o Agrupamento 1 (L7, L8, L9, L10c e L14 em SS a 5 mM/D5W), agrupamento 2 (L11i ou L11f em SS a 0,25 mM/D5W), e agrupamento 3 (L15 em SS a 0,25 mM/D5W). Cada um desses agrupamentos foi testado para retenção em um filtro de 0,2 µm junto a Pall (HP1002). A amostra pré- filtrada bem como a amostra após cada uma das 2 filtrações foram analisadas por UPLC-MS. Menos de 3 % de L11f e L11i foram perdidos após a primeira etapa de filtração e nenhum peptídeo adicional foi perdido após a segunda etapa de filtração. Apenas 4,9 % de L15 foram perdidos após a primeira filtração e, então, 1,3 % foram perdidos após a segunda filtração. Menos de um total de 3 % de cada peptídeo no Agrupamento 1 foi perdido após as duas etapas de filtrações. Conclusões
[0687] Uma série de peptídeos de GATA3 potenciais foi testada quanto a solubilidade no tampão de formulação que contém SS a 5 mM/D5W com 4 % de DMSO. Os peptídeos que foram insolúveis em SS a 5 mM também foram testados em concentrações de SS inferiores. Com base nesses resultados, sete peptídeos foram selecionados, em que cinco desses são solúveis em SS a 5 mM (L7, L8, L9, L10c e L14) e os outros são solúveis na concentração inferior (L11f, L11i, e L15). A remoção de DMSO também foi testada, e pode aprimorar a solubilidade e atrasar a formação de dissulfeto que pode tornar a análise de UPLC mais difícil. Cada um dos peptídeos selecionados foi solúvel sem DMSO.
[0688] Com base nos resultados de solubilidade, 3 projetos de agrupamento foram gerados com o uso de SS a 0,25 mM/D5W. Embora os agrupamentos fossem solúveis, alguns não foram compatíveis com poliICLC. Em alguns exemplos, a precipitação foi observada quando os agrupamentos que contêm L10c foram misturados com poliICLC. A mesma observação foi feita quando o agrupamento que contém tanto L11f quanto L15 foi combinado com poliICLC. Com base nesses resultados, um quarto conjunto de agrupamentos foi projetado. O primeiro agrupamento conteve L7, L8, L9, L10c e L14 em SS a 5 mM/D5W e foi compatível com poliICLC. Os peptídeos L15 e L11f ou L11i foram mantidos como peptídeos individuais para serem preparados dissolvendo-se os mesmos diretamente em 0,4 mg/ml com SS a 0,25 mM/D5W. Esses agrupamentos foram todos acima de pH 5,0 quando misturados com poliICLC, que é aceitável para injeção subcutânea. Exemplo 18 Prevalência de mutação de neoORF de GATA3
[0689] Esse exemplo caracteriza a prevalência e evidência traducional de mutação de neoORF de GATA3. A vacina é compreendida de um agrupamento de peptídeos longos que duram um quadro de leitura aberto inovador em GATA3 (Proteína de Ligação à GATA 3) que está presente apenas em células que abrigam determinadas mutações de alteração de quadro nesse gene. Dependendo da posição de partida da mutação de alteração de quadro, os quadros de leitura aberta resultantes podem variar de comprimento, mas os mesmos compartilham uma região traduzida comum “neoORF de GATA3” A FIG. 13 fornece uma sequência de aminoácidos exemplificativa de uma região traduzida comum. Quaisquer mutações de alteração de quadro genéticas que resultam em sequência traduzida de neoORF de GATA3 é “mutação de neoORF de GATA3”. Os conjuntos de dados genômicos e proteômicos publicamente disponíveis foram investigados quanto a prevalência de mutação de neoORF de GATA3 e evidência de tradução para o neoORF de GATA3 Materiais e métodos Conjuntos de Dados
[0690] O conjunto de dados de câncer de mama MSK-IMPACT: O conjunto de dados de câncer de mama MSK-IMPACT (Razavi et al., 2018) é um conjunto de dados público disponível no cBioPortal para Cancer Genomics (http://www.cbioportal.org/study?id=breast_msk_2018). Esse conjunto de dados contém dados de sequenciamento com o uso de MSK-IMPACT, um ensaio de sequenciamento de próxima geração com base em captura de hibridização, que analisa todos os éxons que codificam proteína entre 341 e 468 de genes associados ao câncer, de um total de 1918 espécimes de tumor de mamas e normais de pacientes compatíveis de 1756 pacientes. Os dados de mutação e dados clínicos publicamente disponíveis que incluem estado de ER, estado de HER2, e sobrevivência geral, foram transferidos por download para esse estudo.
[0691] Conjunto de dados de proteoma de câncer de mama do TCGA: O conjunto de dados de proteoma de câncer de mama do TCGA (NCI CPTAC et al., 2016) é um conjunto de dados público disponibilizado no portal de dados de CPTAC (https://cptac- data-portal.georgetown.edu/cptac/s/S015). Esse conjunto de dados contém dados de espectrometria de massa em tandem da proteoma global de pacientes de câncer de mama do 105 TCGA com o uso de métodos de quantificação de proteína iTRAQ. Os dados brutos publicamente disponíveis foram transferidos por download para esse estudo. Análise de prevalência de mutação
[0692] Identificação de neoORF de GATA3: Cada evento de mutação do gene de GATA3 do conjunto de dados de câncer de mama MSK-IMPACT é mapeado para a transcrição de GATA3 ENST00000346208.3 do genoma humano (hg19, GRCh37 Consórcio Genoma Referência Humano Referência 37), e, então, traduzido in silico em uma proteína de comprimento inteiro. Se uma proteína de comprimento inteiro contém a sequência de neoORF de GATA3, a amostra que contém esse evento de mutação é marcada como neoORF de GATA3 positiva.
[0693] Prevalência de neoORF de GATA3: Para todos os indivíduos em um coorte, se um indivíduo tem pelo menos uma amostra de tumor sequenciada que foi identificada como neoORF de GATA3 positiva, o indivíduo é considerado como neoORF de GATA3 positiva. A prevalência de neoORF de GATA3 é definida como a porcentagem de indivíduos de neoORF de GATA3 positiva no coorte. Identificação de peptídeo a partir de dados proteômicos
[0694] Banco de dados de sequência de proteína: O banco de dados de sequência de proteína contém 63.691 sequências de proteína do banco de dados de sequência de proteína de UCSC (a sequência de referência humana de fevereiro de 2009, GRCh37/hg19), e uma proteína de comprimento inteiro que contém a sequência de neoORF de GATA3.
[0695] Identificação de peptídeo: Os dados brutos do conjunto de dados de proteoma de câncer de mama do TCGA foram analisados com ferramenta de pesquisa Comet (http://comet- ms.sourceforge.net), um pacote de software de fonte aberta para interpretação de espectros de massa em tandem. Comet (versão 2017.01 rev.2) foi usado para pesquisar todos os espectros de MS/MS do conjunto de dados de proteoma de câncer de mama do TCGA contra o banco de dados de sequência de proteína de UCSC. Os espectros de MS/MS com íons precursores de até +6 foram permitidos na pesquisa. A tolerância de erro de massa para íons precursores foi de ± 10 partes por milhão (ppm), e um m/z de espessura de compartimento de 0,02 foi usado para íons de fragmento. Todas as pesquisas foram ligadas por tripsina de modo que cada peptídeo compatível com o espectro experimental devesse se conformar com a especificidade de clivagem da enzima, isto é, lado C-terminal de lisinas ou argininas. Um máximo de 2 clivagens perdidas foi permitido. Uma modificação fixa de +144,1021 Da foi aplicada à terminação N de um peptídeo e a todos os resíduos de lisina, como esperado para identificação de iTRAQ. As modificações variáveis incluíram até dois resíduos de Metionina oxidados por peptídeo. Uma modificação fixa de +57,021464 Da foi aplicada a todas as cisteínas para cisteínas carbamidometiladas. Durante a pesquisa, os peptídeos de chamariz foram automaticamente gerados como parte do mecanismo de pesquisa Comet para estimar taxas de constatação de falso chamariz-alvo. Os resultados de pesquisa foram processados por Percolator (versão 3.02.0) para calcular os valores q de nível de peptídeo, uma medição convencional para estimar a taxa de constatação falsa de identificação de peptídeo com o uso de dados de espectrometria de massa em tandem. Um limite padrão (valor q < 0,01) foi usado para aceitar peptídeos identificado a partir do conjunto de dados de modo que menos que 1 % dos peptídeos aceitos fossem provavelmente constatações falsas.
[0696] Evidência de neoORF de GATA3 de tradução: Os peptídeos especificamente derivados de uma sequência de proteína que contêm o neoORF de GATA3 e não de quaisquer outras proteínas no banco de dados de sequência de proteína de UCSC foram chamados os peptídeos específicos de neoORF de GATA3. A identificação de peptídeos específicos de neoORF de GATA3 foi considerada como evidência de tradução do neoORF de GATA3. Resultados Prevalência de mutação de neoORF de GATA3 em câncer de mama
[0697] A partir do conjunto de dados de câncer de mama MSK-IMPACT de 1.756 pacientes, análise de prevalência de mutação foi realizada (Materiais e Métodos da Seção 1 acima)
e 91 pacientes identificados que foram neoORF de GATA3 positiva. Dentre esses 91 pacientes, 77 pacientes foram relatados como HR+Her2(-), e 62 pacientes foram relatados como metastáticos em diagnóstico. A prevalência de pacientes de neoORF de GATA3 positiva em cada subgrupo é relatada na Tabela 16 abaixo. Dentre os pacientes de HR+Her2(-), os pacientes de neoORF de GATA3 positiva não têm uma diferença estatística na sobrevivência geral em comparação a todos os pacientes de HR+Her2(-) (independentemente de seus estados de neoORF de GATA3) (valor p = 0,246) (FIG. 14). A Tabela 16 abaixo lista a prevalência de neoORF de GATA3 Número de pacientes Preva Número de positivos para neoORF de lênci pacientes GATA3 a todos os
1.756 91 5,2 % pacientes HR+Her2(-) 1.272 77 6,1 % HR+Her2(-) 856 62 7,2 % metastático A Tabela 17 abaixo lista peptídeos específicos para neoORF de GATA3 e outros peptídeos mapeados para GATA3 canônico identificado a partir do conjunto de dados de proteoma de câncer de mama de TCGA n° sequência de peptídeos proteínas mapeadas HGLEPCSMLTGPPAR (SEQ ID NO: 1 neoORF de GATA3 3354) 2 RDGYMFLK (SEQ ID NO: 3355) neoORF de GATA3 3 SSIMKPK (SEQ ID NO: 3356) neoORF de GATA3 n° sequência de peptídeos proteínas mapeadas
AGTSCANCQTTTTTLWR (SEQ ID NO: 4 GATA3 3357) ALGSHHTASPWNLSPFSK (SEQ ID NO: 5 GATA3 3358) DGTGHYLCNACGLYHK (SEQ ID NO: GATA2, GATA3, GATA4, 6 3359) GATA5 DVSPDPSLSTPGSAGSAR (SEQ ID NO: 7 GATA3 3360) ECVNCGATSTPLWR (SEQ ID NO: 8 GATA3 3361) GATA2, GATA3, GATA4, 9 EGIQTR (SEQ ID NO: 3362) GATA6 10 EGIQTRNR (SEQ ID NO: 3363) GATA2, GATA3 GATA2, GATA3, GATA4, 11 KEGIQTR (SEQ ID NO: 3364) GATA6 12 KVHDSLEDFPK (SEQ ID NO: 3365) GATA3 13 LHNINRPLTMK (SEQ ID NO: 3366) GATA3 14 LHNINRPLTMKK (SEQ ID NO: 3367) GATA3 15 MNGQNRPLIKPK (SEQ ID NO: 3368) GATA2, GATA3 NANGDPVCNACGLYYK (SEQ ID NO: 16 GATA2, GATA3 3369) 17 NSSFNPAALSR (SEQ ID NO: 3370) GATA3 RAGTSCANCQTTTTTLWR (SEQ ID NO: 18 GATA3 3371) RDGTGHYLCNACGLYHK (SEQ ID NO: GATA2, GATA3, GATA4, 19 3372) GATA5 n° sequência de peptídeos proteínas mapeadas SSTEGRECVNCGATSTPLWR (SEQ ID 20 GATA3 NO: 3373) 21 VHDSLEDFPK (SEQ ID NO: 3374) GATA3 22 YQVPLPDSMK (SEQ ID NO: 3375) GATA3
[0698] A investigação de um conjunto de dados genômicos de câncer de mama mostrou que neoORF de GATA3 foi prevalente em 6-7 % dos pacientes de câncer de mama de HR+Her2(-) dependendo de seus estados metastáticos. Múltiplos peptídeos específicos de neoORF de GATA3 em conjunto com outros peptídeos que foram mapeados para GATA3 canônicas foram identificados indicando a tradução de neoORF de GATA3. Em conjunto, esses resultados demostraram que a mutação de neoORF de GATA3 é prevalente em câncer de mama de HR+Her2(- ), e quando presente, o neoORF de GATA3 pode ser traduzido para gerar os produtos de proteína. Exemplo 19 contagem de epítopo de neoORF de GATA3 ao longo dos tipos de HLA
[0699] Esse exemplo fornece a estimativa do número típico de epítopos que pode ser esperado a partir do neoORF de GATA3 ao longo de uma população de pacientes com diversos tipos de HLA. Materiais e Métodos
[0700] Todos os peptídeos (comprimentos 8-11) dentro de uma região comum do neoORF de GATA3 (como definido no EXEMPLO 18) foram avaliados quanto a probabilidade de apresentação com o uso de um algoritmo de previsão in silico que juntamente considera a expressão genética, o potencial de ligação a HLA e o potencial de processamento proteassomal. O algoritmo combina as três variáveis em uma previsão de apresentação geral por meio de um ajuste de regressão lógica em dados de perfilagem de HLA-I de espectrometria de massa monoalélica. As seguintes suposições e ferramentas foram usadas para definir as três variáveis de entrada: Expressão
[0701] Com base nos dados de RNA-Seq do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), as amostras de câncer de mama têm uma expressão de GATA3 mediana de ~700 transcrições por milhão (TPM). Presumindo-se que o alelo mutante e o alelo do tipo selvagem contribuem igualmente com a expressão de GATA3 geral, estima-se que a transcrição de neoORF seria expressa em 350 TPM. Potencial de ligação a HLA
[0702] As frequências de alelo dos EUA foram inseridas com base nas frequências específicas de etnia e presumindo- se que a população dos EUA é 62,3 % europeia, 13,3 % afro- americana, 6,8 % asiático do Pacífico, e 17,6 % hispânica (Tabela 18). Para os 21 alelos de HLA-A mais comuns e os 49 alelos de HLA-B mais comuns, as previsões de ligação ao peptídeo foram executadas com o uso da ferramenta NetMHCpan-
3.0 (21 e 49 alelos fornecem 95 % de cobertura da população para HLA-A e HLA-B, respectivamente). Potencial de Processamento
[0703] Um preditor de potencial de processamento foi treinado com o uso de dados de perfilagem de HLA-I com base em espectrometria de massa publicamente disponíveis, por exemplo, como descrito em Abelin. J. et al. Immunity, 2017, Bassani-Sternberg, M. et al Molecular & Cellular Proteomics
2015, uma configuração de rede neural que determina o potencial de processamento com base no contexto de sequência a montante e a jusante de cada peptídeo.
[0704] Para estimular a contagem de epítopo por paciente, os genótipos de HLA de simulação foram criados extraindo-se aleatoriamente dois alelos de HLA-A e dois alelos de HLA-B (com substituição, para permitir a homozigosidade) de acordo com suas frequências dos EUA gerais (Tabela 18). A maior parte dos pacientes de simulação teve 4 alelos distintos, mas devido ao fato de a homozigosidade ter sido permitida, alguns pacientes de simulação tiveram apenas 2 ou 3 alelos distintos. Para cada para de peptídeo-alelo em um paciente de simulação, foi conduzido um lançamento de moeda de Bernoulli parametrizado pela probabilidade de apresentação imputada (derivados a partir do modelo acima); um resultado positivo foi tomado para indicar que o determinado peptídeo estaria presente no determinado alelo. Para cada paciente de simulação, o número total de peptídeos positivos únicos foi somado para determinar o número total de epítopos reativos (que significa que um peptídeo apresentado em múltiplos alelos na simulação foi apenas contado uma vez). Os resultados foram adicionalmente abatidos por contagem de epítopos agrupados (por exemplo, um 9mero positivo completamente contido em um 10mero positivo) como um epítopo simples. Dez mil pacientes foram simulados dessa maneira com o uso da linguagem de programação estatística R. A Tabela 18 abaixo lista frequências de alelo usadas na simulação
Ilha do Afro- Média Alelo Europeu Pacífico Hispânico americana de EUA Asiático A*02:01 29,6 % 12,5 % 9,5 % 19,4 % 24,2 % A*01:01 17,2 % 4,7 % 5,1 % 6,7 % 12,9 % A*03:01 14,3 % 8,1 % 2,6 % 7,9 % 11,6 % A*24:02 8,7 % 2,2 % 18,2 % 12,3 % 9,1 % A*11:01 5,6 % 1,6 % 17,9 % 4,6 % 5,8 % A*29:02 3,3 % 3,6 % 0,1 % 4,2 % 3,3 % A*23:01 1,7 % 10,8 % 0,2 % 3,7 % 3,1 % A*68:01 2,5 % 3,7 % 1,9 % 4,7 % 3,0 % A*26:01 2,9 % 1,4 % 3,9 % 2,9 % 2,8 % A*32:01 3,1 % 1,4 % 1,3 % 2,7 % 2,7 % A*31:01 2,4 % 1,0 % 3,2 % 4,8 % 2,7 % A*30:01 1,3 % 6,9 % 2,1 % 2,1 % 2,3 % A*30:02 0,9 % 6,2 % 0,1 % 2,8 % 1,9 % A*68:02 0,8 % 6,5 % 0,0 % 2,5 % 1,8 % A*33:03 0,1 % 4,5 % 9,4 % 1,3 % 1,5 % A*25:01 1,9 % 0,5 % 0,1 % 0,9 % 1,4 % A*33:01 1,0 % 2,1 % 0,1 % 2,0 % 1,3 % A*02:06 0,2 % 0,0 % 4,8 % 3,9 % 1,1 % A*02:05 0,8 % 1,9 % 0,3 % 1,5 % 1,0 % A*74:01 0,0 % 5,2 % 0,1 % 0,8 % 0,8 % A*02:02 0,1 % 4,2 % 0,0 % 0,7 % 0,7 % B*07:02 14,0 % 7,3 % 2,6 % 5,5 % 10,8 % B*08:01 12,5 % 3,8 % 1,6 % 4,5 % 9,2 % B*44:02 9,0 % 2,1 % 0,8 % 3,3 % 6,5 % B*35:01 5,7 % 6,5 % 4,3 % 6,4 % 5,8 % B*44:03 5,0 % 5,4 % 4,2 % 6,1 % 5,2 %
Ilha do Afro- Média Alelo Europeu Pacífico Hispânico americana de EUA Asiático B*15:01 6,7 % 1,0 % 3,5 % 2,9 % 5,0 % B*51:01 4,5 % 2,2 % 6,3 % 5,8 % 4,6 % B*40:01 5,6 % 1,3 % 8,0 % 1,4 % 4,5 % B*18:01 4,6 % 3,6 % 1,2 % 4,0 % 4,1 % B*14:02 3,1 % 2,2 % 0,1 % 4,1 % 3,0 % B*57:01 3,8 % 0,5 % 2,1 % 1,2 % 2,8 % B*27:05 3,3 % 0,7 % 0,8 % 1,7 % 2,5 % B*13:02 2,6 % 1,0 % 2,3 % 1,2 % 2,1 % B*53:01 0,3 % 11,2 % 0,1 % 1,6 % 2,0 % B*38:01 2,2 % 0,2 % 0,5 % 1,9 % 1,7 % B*40:02 1,0 % 0,4 % 3,1 % 4,9 % 1,7 % B*49:01 1,3 % 2,8 % 0,1 % 2,4 % 1,6 % B*52:01 1,0 % 1,4 % 3,7 % 2,7 % 1,5 % B*35:03 1,6 % 0,4 % 2,4 % 1,4 % 1,4 % B*58:01 0,5 % 3,5 % 5,8 % 1,5 % 1,4 % B*55:01 1,7 % 0,4 % 0,5 % 1,1 % 1,4 % B*15:03 0,1 % 6,2 % 0,0 % 1,6 % 1,2 % B*45:01 0,4 % 4,5 % 0,2 % 1,5 % 1,1 % B*37:01 1,3 % 0,5 % 1,5 % 0,6 % 1,1 % B*50:01 0,8 % 0,9 % 0,7 % 1,5 % 0,9 % B*39:01 1,0 % 0,4 % 1,3 % 1,0 % 0,9 % B*35:02 1,1 % 0,1 % 0,2 % 1,1 % 0,9 % B*42:01 0,0 % 5,5 % 0,0 % 0,6 % 0,8 % B*14:01 0,8 % 0,9 % 0,3 % 0,9 % 0,8 % B*39:06 0,5 % 0,2 % 0,0 % 2,0 % 0,7 % B*58:02 0,0 % 4,1 % 0,0 % 0,5 % 0,6 %
Ilha do Afro- Média Alelo Europeu Pacífico Hispânico americana de EUA Asiático B*57:03 0,0 % 3,4 % 0,0 % 0,7 % 0,6 % B*48:01 0,1 % 0,0 % 2,0 % 2,2 % 0,6 % B*41:01 0,4 % 0,5 % 0,1 % 1,3 % 0,5 % B*15:10 0,0 % 3,0 % 0,1 % 0,5 % 0,5 % B*07:05 0,2 % 0,7 % 2,0 % 0,5 % 0,5 % B*56:01 0,5 % 0,2 % 0,8 % 0,4 % 0,5 % B*39:05 0,0 % 0,0 % 0,1 % 2,3 % 0,4 % B*41:02 0,4 % 0,7 % 0,0 % 0,6 % 0,4 % B*46:01 0,0 % 0,0 % 6,1 % 0,0 % 0,4 % B*35:08 0,4 % 0,0 % 0,2 % 0,9 % 0,4 % B*15:17 0,3 % 0,6 % 0,5 % 0,7 % 0,4 % B*35:12 0,0 % 0,0 % 0,0 % 1,9 % 0,3 % B*15:16 0,0 % 1,7 % 0,0 % 0,5 % 0,3 % B*81:01 0,0 % 2,0 % 0,1 % 0,3 % 0,3 % B*40:06 0,0 % 0,0 % 3,7 % 0,3 % 0,3 % B*35:17 0,0 % 0,0 % 0,0 % 1,6 % 0,3 % B*15:02 0,0 % 0,1 % 3,6 % 0,0 % 0,3 % B*38:02 0,0 % 0,0 % 3,7 % 0,0 % 0,2 % Resultados
[0705] A análise descrita na seção de métodos mostrou que 95 % dos pacientes podem apresentar ≥2 epítopos HLA-I do neoORF de GATA3 (FIG. 15). O neoORF de GATA3 pode apresentar múltiplos epítopos de HLA-I apresentáveis independentemente do genótipo de HLA do paciente com base nos detalhes apresentados acima. Isso mostra que eficácia de uma terapia que induz respostas de célula T contra esses neoantígenos previstos. Um subconjunto dos epítopos previstos foi selecionado para validação em estudos de acompanhamento detalhados nos Exemplos 20, 21, 22, 23 abaixo. Exemplo 20 Medições bioquímicas do epítopo
[0706] O exemplo abaixo fornece validação bioquímica da afinidade de epítopo do GATA3neoORF. Um número grande de epítopos pode se ligar a diversos alelos HLA (como descritos no Exemplo 19). Nesse exemplo os epítopos foram avaliados quanto as suas habilidades para se ligarem a diversos alelos HLA comuns, a saber HLA-A02:01, HLA-B07:02 e HLA-B08:01. Tanto a afinidade quanto a estabilidade da ligação entre os epítopos e seus HLA previstos foram avaliados.
[0707] A afinidade é uma medição da força da ligação do epítopo ao HLA. A ligação forte (geralmente definida como <500 nM) é uma característica importante para um neoantígeno que pode ser alvejado por células T. Isso se deve ao fato de que o neoantígeno deve estar presente na superfície de células tumorais e, portanto, deve superar outros antígenos produzidos pela célula tumoral para a bolsa de ligação de uma dentre as moléculas de HLA, visto que apenas um peptídeo pode se ligar a uma molécula de HLA individual por vez. Ademais, mostrou-se que o epítopo imunogênico tende a ter afinidade forte quanto a seus HLA específicos.
[0708] A estabilidade é uma medição de quanto tempo um determinado epítopo permanece ligado ao HLA cognato. A ligação estável (geralmente definida como >1 hora) também é uma característica importante para um neoantígeno que pode ser alvejado por células T. Os epítopos devem permanecer ligados às células tumorais na superfície celular a fim de serem reconhecidos pelas células T. Ademais, similar à afinidade, mostrou-se anteriormente que o epítopo imunogênico tende a se ligar estavelmente a seus HLA específicos.
[0709] A fim de avaliar a estabilidade e afinidade de epítopos quanto as suas moléculas de HLA cognatas, os peptídeos foram sintetizados em purezas de >70 % (por análise UV de % de Área) e diluídos a 20 mM ou menos e suas afinidades e estabilidades foram medidas.
[0710] Nesse exemplo, a afinidade e a estabilidade da ligação entre 14 epítopos e moléculas de HLA cognatas são relatadas. Quatro epítopos foram estudados em HLA-A02:01, cinco epítopos foram estudados em HLA-B07:02, e oito epítopos foram estudados em HLA-B08:01 (três epítopos foram estudados tanto em HLA-B07:02 quanto em HLA-B08:01). Todos os peptídeos demonstraram ligações por afinidade, em uma faixa de 9,5 nM a 242,8 nM. As estabilidades estavam em uma faixa de 0 horas a 21,7 horas, com pelo menos um epítopo em cada alelo excedendo 1 hora. Esses resultados mostram que há pelo menos um epítopo forte derivado do neoORF de GATA3 por alelo. Materiais e métodos Seleção de epítopo para medições bioquímicas
[0711] Múltiplos epítopos derivados do neoORF de GATA3 foram selecionados para a confirmação de suas habilidades para se ligarem a um alelo HLA comum específico, a saber HLA-A02:01, HLA-B07:02 ou HLA-B08:01. Esse epítopos foram previstos em uma faixa de ligantes fracos a fortes. Síntese de peptídeo de fase sólida
[0712] Os peptídeos foram feitos em escala de 5 µmol com o uso de síntese de peptídeo de fase sólida no Sintetizador de Peptídeo Intavis. As desproteções de Fmoc foram realizadas com o uso de piperidina a 20 % em DMF e enxaguadas com DMF puro. Todos os aminoácidos foram duplamente acoplados em durações de 15 minutos à temperatura ambiente com o uso de 60 µl de aminoácido a 0,5 M (6eq), 55 µl de HCTU a 0,5 M (5,5eq), 5 µl de NMP (0,5eq) e 14 µl de NMM a 4 M (11,2eq). Após cada ciclo de acoplamento duplo, a cobertura de acetila foi realizada adicionando-se 100 µl de uma solução de DIEA (feita primeiro como uma solução a 2 M em NMP e, então, diluída a 12,5 % com o uso de DMF) e 6,25 % de anidrido acético em DMF por 15 minutos antes de drenagem a vácuo e enxágue com DMF. O ciclo de desproteção, lavagem, acoplamento duplo, cobertura de acetila, lavagem foi repetido para cada aminoácido na sequência. A desproteção final foi realizada com piperidina a 20 % em DMF e as lavagens finais com DMF, EtOH e DCM. Uma drenagem final foi completada por 5 minutos no instrumento, após o que os fundos da placa foram enxaguados com DCM. Clivagem de peptídeos
[0713] Os peptídeos foram clivados com o uso de uma solução de 92,5 % de TFA, 2,5 % de TIPS, 2,5 % de H2O, 2,5 % de EDT. Após 1 hora, as placas foram drenadas a vácuo em 1,2 ml de prateleiras Micronic. Após um total de 3 horas, os peptídeos foram, então, precipitados com éter dietílico frio por meio de centrifugação. Análise de UPLC-UV-MS de peptídeos
[0714] Os peptídeos brutos foram secos e ressuspensos em 1:1 de ACN:H2O que contém 0,1 % de TFA e mantidos a -80 ℃ até serem completamente congelados. Os peptídeos foram, então, secos por congelamento para isolar o peptídeo em forma de pó. Os pós de peptídeo foram dissolvidos primeiro em DMSO puro e, então, diluídos 3:1 em DMSO:H2O para análise de UPLC- UV-MS. O monitoramento UV foi realizado em um comprimento de ondas de 214 nm com a faixa do detector de massa abrangendo 200-1250 Da. O método de UPLC-UV-MS usado para peptídeos menores que 9 aminoácidos de comprimento compreendeu um gradiente de 0-100 % de fase móvel B (0,085 % de TFA em acetonitrila, com uma fase móvel correspondente A de 0,1 % de TFA em água) ao longo de 5 minutos em uma coluna de 2,1 x 50 mm, 1,7 µM BEH Acquity UPLC, enquanto o método para peptídeos maiores que 9 aminoácidos compreendeu um gradiente de 10-80 % de fase móvel B ao longo de 8 minutos em uma coluna de 2,1 x 100 mm, 1,7 µM BEH Acquity UPLC. Determinação de concentração de peptídeo pelo método A214
[0715] Os peptídeos brutos foram dissolvidos em DMSO puro com concentrações de 2-5 mg/ml para avaliação pelo método A214. A área de pico de peptídeo de um cromatograma de UPLC- UV é proporcional à quantidade de peptídeo injetada para análise e o coeficiente de extinção do peptídeo no comprimento de ondas de detecção. Portanto, a concentração de uma amostra de peptídeo pode ser determinada comparando- se sua área de pico de UV com a área de pico de UV de um peptídeo de referência de concentração conhecida e considerando os respectivos coeficientes de extinção. A seguinte equação é usada para calcular a concentração de peptídeo: Equação 7. = ∗( ∗ ∗ )/( ∗ ∗ )
[0716] em que, C é a concentração de amostra de peptídeo em mM, Cref é a concentração de peptídeo de referência em mM, Asam é a área de pico de UV de amostra de peptídeo, Aref é a área de pico de UV de peptídeo de referência, Eref é o coeficiente de extinção de peptídeo de referência em M-1 cm- 1, Esam é o coeficiente de extinção de amostra de peptídeo em M-1 cm-1, Vsam é o volume de injeção de amostra, e Vref é o volume de injeção de peptídeo de referência.
[0717] O coeficiente de extinção de um peptídeo em 214 nm é previsto combinando-se os coeficientes de extinção de ligações de peptídeos e aminoácidos individuais. Um peptídeo de referência com sequência de RAKFKQLL (SEQ ID NO: 3376) (peptídeo ID LS-18) em 0,2 mg/ml é executado na sequência com as amostras de peptídeo bruto em UPLC-UV-MS. As áreas de pico de UV e os coeficientes de extinção calculados são, então, usadas para calcular a concentração de peptídeo em mM. Medições de afinidade
[0718] A afinidade de ligação de um peptídeo às moléculas de HLA foi medida avaliando-se sua capacidade de superar um peptídeo radiomarcado definido para o bolso de ligação na molécula de HLA. Isso foi feito purificando-se moléculas de HLA e incubando-se as mesmas com múltiplas concentrações do peptídeo de interesse e um peptídeo de ligação de alta afinidade que é radiomarcado. Após 2 dias de incubação, o peptídeo radiomarcado não ligado foi separado por cromatografia de filtração em gel de exclusão de tamanho, e a fração de moléculas de HLA que possui o peptídeo radiomarcado foi determinada. Os peptídeos que têm baixas porcentagens de peptídeo radiomarcado ligado no final do ensaio têm uma forte afinidade para o HLA. Quantitativamente, a concentração do peptídeo de interesse necessária para inibir a ligação do peptídeo radiomarcado em 50 % pode ser determinada por uma análise de regressão da inibição através de múltiplas concentrações. Essa medição de IC50 foi usada como uma aproximação da afinidade de ligação verdadeira.
[0719] Na primeira onda de peptídeos analisados, as concentrações reais dos peptídeos eram conhecidas com base nas medições de A214 e quaisquer correções necessárias com base na concentração foram feitas. Na segunda onda de peptídeos analisados, a concentração de todos os peptídeos foi presumida como sendo 20 mM e os IC50s iniciais foram calculados com base nessa suposição, com ajustes contabilizando a concentração real realizada posteriormente. Para peptídeos com concentração real abaixo de 20 mM, o IC50 medido foi corrigido multiplicando-se pela concentração real como determinado pelo método A214 e dividindo-se por 20 mM. Medições de estabilidade
[0720] Para medir a estabilidade de ligação de peptídeos a MHC de Classe I, genes sintéticos que codificam cadeias pesadas e leves de MHC-I biotiniladas são expressos em E. coli e purificados a partir de corpos de inclusão usando métodos padrão. A cadeia leve (β2m) foi radiomarcada com iodo (125I) e combinada com a cadeia pesada MHC-I purificada e o peptídeo de interesse a 18 °C para iniciar a formação do complexo pMHC-I. Essas reações foram realizadas em microplacas revestidas com estreptavidina para ligar as cadeias pesadas de MHC-I biotiniladas à superfície e permitir a medição da cadeia leve radiomarcada para monitorar a formação de complexos. A dissociação foi iniciada pela adição de concentrações mais altas de cadeia leve não marcada e incubação a 37 °C. A estabilidade foi definida como o período de tempo em horas que metade dos complexos leva para se dissociar, como medido por contagens de cintilação. Medições em duplicada foram realizadas. A média das duas medições foi tomada como a estabilidade. Resultados Medições de afinidade A Tabela 19 abaixo lista medições de afinidade de epítopo. Concentração IC50 IC50 Alelo Onda Sequência de Peptídeos de Peptídeo Medido Corrigido
HLA Atual (mM) (nM) (nM) MLTGPPARV (SEQ ID NO: 2 A02:01 13,7 15,4 10,6 3377) SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 1 A02:01 20,0 15,4 15,4 3378) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 2 A02:01 8,4 281,2 117,7 3379) YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 1 A02:01 20,0 165,9 165,9 3380) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 2 B07:02 20,0 14,0 14,0 3381) KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 2 B07:02 20,0 28,2 28,2 3382) KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 2 B07:02 17,0 115,2 98,1 3383) GPPARVPAV (SEQ ID NO: 2 B07:02 15,7 281,9 221,2 3384) MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 2 B07:02 15,2 350,3 266,9 3385) ESKIMFATL (SEQ ID NO: 2 B08:01 15,2 23,3 17,7 3386) FLKAESKIM (SEQ ID NO: 2 B08:01 20,0 21,9 21,9 3387) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 2 B08:01 19,4 27,5 26,6 3388) YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 1 B08:01 20,0 32,0 32,0 3389) IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 2 B08:01 16,5 40,2 33,2 3390) MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 2 B08:01 20,0 53,4 53,4 3391)
Concentração IC50 IC50 Alelo Onda Sequência de Peptídeos de Peptídeo Medido Corrigido
HLA Atual (mM) (nM) (nM) FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 2 B08:01 18,3 90,0 82,3 3392) LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 2 B08:01 14,2 167,3 118,7 3393)
[0721] *Nota-se que a concentração de peptídeo atual e IC50 medido relatados aqui são arredondados a partir dos dados brutos, mas os valores de IC50 corrigidos foram calculados com uso de dados brutos não arredondados. Medições de estabilidade A Tabela 20 abaixo lista medições de estabilidade Meia-vida Meia-vida Meia- Alelo do do vida Onda Sequência HLA Experimento Experimento média 1 (horas) 2 (horas) (Horas) 2 TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3394) A02.01 0,5 0,5 0,5 2 MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3395) A02.01 5,8 5,8 5,8 1 YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3396) A02:01 0,6 0,6 0,6 1 SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3397) A02:01 21,7 21,8 21,7 2 KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3398) B07.02 3,3 3,3 3,3 2 KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3399) B07.02 8,3 9,0 8,6 2 FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3400) B07.02 0,7 0,6 0,7 2 MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3401) B07.02 0,0 0,0 0,0 2 GPPARVPAV (SEQ ID NO: 3402) B07.02 1,5 1,8 1,6 2 FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 3403) B08.01 0,0 0,0 0,0 2 FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3404) B08.01 0,0 0,0 0,0 2 MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3405) B08.01 0,0 0,0 0,0 2 ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3406) B08.01 1,0 1,6 1,3 2 FLKAESKIM (SEQ ID NO: 3407) B08.01 0,8 1,5 1,2 2 LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 3408) B08.01 0,0 0,0 0,0 2 IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 3409) B08.01 0,4 0,4 0,4 1 YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3410) B08:01 0,4 0,5 0,4
[0722] No Exemplo 20, epítopos previstos do neoORF de GATA3 em múltiplas moléculas de HLA comuns (HLA-A02:01, HLA- B07:02, HLA-B08:01) foram avaliados. Todos os epítopos foram determinados para ter uma afinidade forte (<500 nM). Um subconjunto desses epítopos também era ligantes estáveis (>1 hora), com pelo menos um ligante forte em cada um dos alelos HLA avaliados. Esses dados mostram que os epítopos de neoORF de GATA3 estão presentes através de múltiplos alelos HLA. Exemplo 21: Geração de linhagem celular com mutação de GATA3 e alelo HLA
[0723] Esse Exemplo descreveu a preparação de uma linhagem celular com a mutação de quadro de leitura aberta inovador (neoORF) de proteína 3 de ligação de GATA (GATA3) e alelos HLA de alta prevalência, HLA-A02:01 e HLA-B07:02. Essa linhagem celular pode ser usada como um substituto in vitro de células tumorais que contêm mutações de neoORF de GATA3. As linhagens celulares que apresentam naturalmente o neoORF de GATA3 específico de focalização não estão são prontamente disponíveis, uma foi preparada por transdução lentiviral estável de uma linhagem celular comumente usada, HEK293T. Essa linhagem celular foi escolhida devido ao fato de que expressa naturalmente dois dos alelos HLA comuns, HLA-A02:01 e HLA-B07:02. Essa linhagem celular modificada foi usada para ensaios funcionais com células T (Exemplo 25 e Exemplo 26). Adicionalmente, essa linhagem celular foi usada para validação de processamento/apresentação de neoantígenos do neoORF de GATA3 em múltiplos alelos HLA (Exemplo 22). Para esses estudos, os alelos HLA foram transfectados transitoriamente na linhagem celular modificada. Materiais e métodos Visão geral da geração de linhagem celular de mutação de GATA3
[0724] A geração de célula HEK 293T transduzida por mutação de GATA3 implicou (a) o projeto de plasmídeo codificado de mutação de GATA3, produção de lentivírus, transdução de mutação de GATA3 para linhagem celular de HEK 293T e seleção de células transduzidas. Essas etapas para a geração de linhagem celular de mutação de GATA3 são descritas abaixo. Cultura e linhagens celulares
[0725] As linhagens celulares de HEK 293T foram adquiridas junto a American Type Culture Collection (Rockford, MD, EUA) e mantidas em DMEM 10 % de FBS, e meio de Pen/Strep. Projeto de plasmídeo codificado de mutação de GATA3 Gene de mutação de GATA3
[0726] Para a expressão eficaz de construto de plasmídeo de gene de mutação de GATA3, a proteína 3 de ligação de GATA (GATA3) de 600 pb da sequência do tipo selvagem de 1473 a 2074 (que contém a sequência de DNA de codificação (CDS) de 558 a 1892) foi obtida a partir da Sequência de Referência de NCBI: NM_001002295.01. A sequência de mutação de GATA3 foi adicionalmente gerada deletando-se 2 nucleotídeos em 1734 e 1735 da sequência de referência (FIG. 16). A sequência de mutação de GATA3 traduz, então, um deslocamento de quadro de leitura na posição 87 de sequência de aminoácidos da sequência do tipo selvagem (FIG. 17). Esta construção de DNA pode cobrir 87 resíduos da sequência de aminoácidos GATA3 de tipo selvagem e 114 da sequência de aminoácidos GATA3 neoORF desviada de estrutura que é causada pela deleção. Projeto de plasmídeo de mutação GATA3
[0727] Sequências de mutação GATA3 foram otimizadas por códons, sintetizadas e clonadas no vetor pCDH-CMV-Puro (Genescript) (FIG 18). Produção de lentivírus
[0728] Células Lenti-X 293T (ClonTech) foram cultivadas em meio de cultura completo (DMEM contendo 10 % de FBS, Pen/Strep) e transfectadas com plasmídeo lentiviral codificado por mutação de GATA3 para produzir lentivírus para o gene de mutação de GATA3. No dia antes da transfecção, 8 x 105 das células foram semeadas por poço de uma placa de 6 poços. O meio de cultura foi substituído no dia da transfecção. 4 µg de plasmídeo de construção lentiviral e 4,6 µl da mistura de plasmídeo de empacotamento lentiviral (Sigma-Aldrich) foram misturados em Opti-MEM (Thermo Fisher). A mistura foi misturada com 10 µl de FuGENE HD (Promega) e adicionada diretamente às células. 24 horas depois, o meio foi substituído pelo meio de cultura completo fresco. O sobrenadante que continha lentivírus foi colhido 72 horas após a transfecção. Transdução de mutação de GATA3
[0729] 5 x 105 de células HEK 293T (ATCC) foram plaqueadas em 2 ml de meios de DMEM que continham 6 µg/ml de polibreno e 10 % de FBS em placa de 12 poços. 130 µl de sobrenadante contendo lentivírus GATA3 foram adicionados às células diretamente. As células foram incubadas em incubadora de 5 % de CO2. O meio foi substituído por meio de DMEM com 10 % de FBS e Pen/Strep em 24 horas. Seleção de puromicina
[0730] 1 µg/ml de concentração de tratamento de puromicina iniciou no dia 2 após a transdução de víruslenti de mutação de GATA3. As células foram cultivadas e expandidas com meio de DMEM com 10 % de FBS, Pen/Strep e 1 µg/ml de Puromicina até a colheita. Transfecção com construtos de codificação de HLA
[0731] 1,5 x 107 de células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 foram semeadas em frasco T175. 15 µg de plasmídeos codificados por HLA-A02:01, HLA-B07:02 ou HLA- B08.01 (Genewiz) foram misturados com 70 µl de Fugene HD (Promega) e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos. As misturadas de cada plasmídeo de tipo de HLA e Fugene HD foram adicionadas às células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 em frasco de T175 para transfecção. As 3 diferentes células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 e transfectadas por HLA foram cultivadas por 48 horas antes da colheita. Colher células transduzidas com mutação de GATA3 e transfectadas com HLA
[0732] As células foram lavadas com 1 x PBS e foi adicionado 0,25 % de Tripsina-EDTA (Thermo-Fisher Scientific). Após 3 minutos de incubação a 37 °C, as células foram ressuspensas e colhidas com meio de DMEM com FBS a 10 % e Pen/Strep. As etapas de lavagem foram realizadas 3 vezes, incluindo centrifugação a 1.500 rpm por 5 min, seguido de suspensão com tampão de PBS. Os sedimentos celulares foram congelados rapidamente em gelo seco em etanol a 70 %. Os péletes de células congelados foram armazenados em congelados -80 °C para análise proteômica. Resultados
[0733] HEK 293T transduzida por mutação de GATA3 foi usada como células alvo para avaliar um ensaio funcional de TCR específico de GATA3 e como material para avaliar a apresentação de mutação de GATA em HLA-A02.01 por espectrometria de massa (Exemplo 22). Descritos abaixo estão os resultados que demonstram a geração de células HEK 293T expressas por mutação de GATA3 Construto de plasmídeo de mutação de GATA3
[0734] A construção do plasmídeo codificado pela mutação de GATA3 foi gerada e avaliada por sequenciamento de DNA em GENEWIZ. Os dados de sequenciamento de DNA do plasmídeo codificado por mutação de GATA3 final são 100 % correspondidos com a sequência do gene de mutação GATA3 projetada (FIG. 19). Após a digestão da enzima de restrição AfIII, duas bandas de DNA foram observadas entre 5000 pb e 3000 pb na faixa 2 de um ensaio de eletroforese em gel. Essas bandas se correlacionam com os tamanhos esperados de 4243 pb e 3424 pb, respectivamente (FIG. 20). Colheita e transdução de mutação de GATA3
[0735] As células HEK 293T foram usadas para transdução de mutação de GATA3. As células transduzidas foram cultivadas até alcançarem 200 X 106 células do número total de célula. Na data de colheita, 1 x 106 células foram usadas para expressão de HLA-Classe I e HLA-Classe II por citometria de fluxo (FIG. 21). 99,5 % células foram positivas para HLA- Classe I. 193 X 106 células foram congeladas para análise proteômica. Transfecção de HLA
[0736] As células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 foram transitoriamente transfectadas com plasmídeo de expressão codificado por HLA-A02.01 etiquetado com BAP, HLA- B07.02 etiquetado com BAP e HLA-B08.01 etiquetado com BAP. As células transfectadas foram cultivadas por 48 horas e colhidas. Na data de colheita, 1 x 106 células foram usadas para expressão de HLA-A02.01 e HLA-Classe I por citometria de fluxo (FIG. 22). Células HEK293T de GATA3 não transfectadas (FIG. 22A), transfectadas com HLA-A02.01 (FIG. 22B), transfectadas com HLA-B07.02 (FIG. 22C) e transfectadas com HLA-B08.01 (FIG. 22C). Todas as células transfectadas altamente expressaram HLA-A02.01 e HLA-Classe I.
[0737] Foi gerada uma linhagem celular modificada que expressa o neoORF de GATA3 por transdução estável de lentivírus contendo o gene de GATA3 mutado em células HEK293T. As células HEK 293T transduzidas por mutação de GATA3 expressaram HLA-Classe I. Essa linhagem celular foi subsequentemente usada como um alvo para ensaios funcionais com células T específicas para neoantígenos de GATA3 (Exemplo 25 e Exemplo 26). Além disso, após a transfecção com vários alelos HLA comuns, essas linhagens celulares mostraram distribuição mais ampla de nível de expressão de HLA-Classe I e HLA-A:02 e foram usadas para avaliação de processamento e apresentação de múltiplos neoantígenos nesses alelos (Exemplo 22). Exemplo 22 Validação de Epítopos de Peptídeo de neoORF de GATA3 por Espectrometria de Massa
[0738] Esse Exemplo fornece validação do processamento endógeno e apresentação de epítopos de peptídeo previstos derivados do quadro de leitura inovador (neoORF) de região comum da proteína 3 de ligação de GATA (GATA3) para ligação a heterodímeros de HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 e HLA-B*08:01 por espectrometria de massa. As células HEK293T foram manipuladas para expressar estavelmente neoORF de GATA3 e transitoriamente transfectadas para expressar alelos HLA etiquetados com peptídeo aceitador de biotina (BAP). A previsão de epítopos peptídicos específicos de alelo e a geração de células HEK293T são descritas no Exemplo 19 e Exemplo 21, respectivamente. Os complexos de peptídeo de HLA foram isolados de lisados celulares por afinidade pull-down da etiqueta de BAP biotinilado expresso na cadeia alfa de cada heterodímero HLA classe I. Os ligantes peptídicos foram libertados dos complexos de peptídeo de HLA por tratamento com ácido e dessalinizados por cromatografia líquida de fase reversa. Os ligantes de peptídeo de HLA foram adicionalmente separados por nano cromatografia líquida acoplada a um espectrômetro de massa em tandem de alta resolução (nLC- MS/MS). Epítopos peptídicos previstos derivados do neoORF de GATA3 foram submetidos a nLC-MS/MS alvejado, em que um conhecimento a priori da massa precursora de cada epítopo peptídico foi usado para selecionar cada massa monoisotópica teórica do epítopo peptídico para fragmentação por dissociação colisional de alta energia (HCD) e subsequente sequenciamento de peptídeos. Os epítopos do peptídeo neoORF de GATA3 foram combinados ao espectro de massa em tandem resultante (MS/MS) por um algoritmo de correspondência de banco de dados contra um banco de dados contendo o neoORF de GATA3 e por comparação espectral de massa precursora (MS) e espectros MS/MS correspondentes às suas contrapartes de peptídeo sintético.
[0739] No total, cinco epítopos peptídicos da região comum do neoORF de GATA3 que se ligaram a três heterodímeros de HLA diferentes foram detectados por nLC-MS/MS em células HEK293T modificadas. Para HLA-A*02:01, os seguintes dois dos quatro epítopos de peptídeo alvejados foram detectados: SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3411) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3412). Para HLA-B*07:02, os seguintes dois dos cinco epítopos de peptídeo alvejados foram detectados: KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3413) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3414). Para HLA-B*08:01, o seguinte um dos oito epítopos de peptídeo alvejados foi detectado: ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3415). A detecção e identificação desses epítopos de peptídeo por nLC-MS/MS a partir de células que expressam o neoORF de GATA3 demonstraram que são endogenamente processados e subsequentemente ligados por heterodímeros de HLA. Materiais e métodos
[0740] Peptídeos: Peptídeos sintéticos 12C14N correspondentes aos epítopos de peptídeo de neoORF de GATA3 foram sintetizados. A Tabela 21 abaixo fornece a lista de peptídeos sintéticos correspondentes aos epítopos de peptídeo de neoORF de GATA3 previstos. Alelo Sequência Comprimento Peso Molecular Teórico HLA-A*02:01 SMLTGPPARV (SEQ 10 1027,5484 ID NO: 3416) HLA-A*02:01 MLTGPPARV (SEQ 9 940,5164 ID NO: 3417) HLA-B*07:02 KPKRDGYMF (SEQ 9 1140,5750 ID NO: 3418) HLA-B*07:02 KPKRDGYMFL (SEQ 10 1253,6590 ID NO: 3419)
Alelo Sequência Comprimento Peso Molecular Teórico HLA-B*08:01 ESKIMFATL (SEQ 9 1054,5368 ID NO: 3420) Cultura de Célula
[0741] A geração das células HEK293T manipuladas que expressam estavelmente o neoORF de GATA3 e a transiente de cada alelo etiquetado por afinidade (etiquetado com BAP) foi descrita no Exemplo 21. A Tabela 22 lista as amostras e números de célula que foram usados para nLC-MS/MS alvejado. A Tabela 22 abaixo fornece o sumário de amostras para nLC- MS/MS alvejado Número Tipo de de Alelo Tipo de Suspensão Célula Célula (x106) HLA-A*02:01 HEK293T 55 Etiqueta de afinidade HLA-B*07:02 HEK293T 61 Etiqueta de afinidade HLA-B*08:01 HEK293T 60 Etiqueta de afinidade Suspensão de complexos de peptídeo HLA etiquetado por afinidade (etiquetado com BAP)
[0742] Os péletes de célula congelados que contêm moléculas de HLA etiquetadas com BAP foram descongelados em gelo por 20 minutos, então, gentilmente lisados por pipetagem manual em tampão de lise frio [20 mM de Tris-Cl de pH 8, 100 mM de NaCl, 6 mM de MgCl2, 1,5 % (v/v) de Triton X-100, 60 mM de B-D-glicopiranosídeo de octial, 0,2 mM de 2- Iodoacetamida, 1 mM de EDTA de pH 8, 1 mM de PMSF, 1X de coquetel inibidor de protease isento de EDTA completo] em uma razão entre 1,2 ml de tampão de lise por 50x106 células.
Os lisados foram incubadas extremidade/sobre/extremidade a 4 °C por 15 minutos com nuclease Benzonase a uma razão entre >250 unidades de Benzonase por 50x106 células para degradar DNA/RNA, então, centrifugados a 15.000 x g a 4 °C por 20 minutos para remover resíduos celulares e materiais insolúveis.
Os tensoativos liberados foram transferidos para novos tubos e as moléculas de HLA etiquetadas com BAP foram biotiniladas incubando-se extremidade/sobre/extremidade à temperatura ambiente por 10 minutos em um tubo de 1,5 ml com 0,56 µM de biotina, 1 mM de ATP/1 mM de acetato de magnésio, e 3 µM de BirA.
Os tensoativos foram incubados extremidade/sobre/extremidade a 4 °C por 30 minutos com um volume correspondente a 200 µl de pasta fluida de resina de agarose de microesfera NeutrAvidin de alta capacidade da Pierce por 50x106 células para complexos de peptídeo de HLA biotinilados enriquecidos por afinidade.
Finalmente, a resina de ligação a HLA foi lavada quatro vezes com 1 ml de tampão de lavagem frio (20 mM de Tris-Cl de pH 8, 100 mM de NaCl, 60 mM de B-D-glicopiranosídeo de octila, 0,2 mM de 2- Iodoacetamida, 1 mM de EDTA de pH 8), então, lavada quatro vezes com 1 ml de 10 mM de Tris-Cl frio de pH 8. Entre as lavagens, a resina de ligação a HLA foi gentilmente misturada manualmente, então, peletizada por centrifugação a 1.500 x g a 4 °C por 1 minuto.
A resina de agarose de microesfera NeutrAvidin foi lavada três vezes com 1 ml de PBS fria antes do uso.
A resina de ligação a HLA lavada foi armazenada a - 80 °C por menos que uma semana antes de eluição de peptídeo de HLA. Dessalinização, redução e alquilação de peptídeo de HLA
[0743] Os peptídeos de HLA foram eluídos a partir de complexos de HLA etiquetados por afinidade (etiquetado com BAP) e simultaneamente dessalinizados com o uso de um sistema de extração de fase sólida Sep-Pak. Em resumo, os cartuchos Sep-Pak foram fixados a um coletor de extração de fase sólida de posição 24, ativado duas vezes com 200 µl de metanol seguido por 100 µl de 50 % (v/v) de acetonitrila/0,1 % (v/v) de ácido fórmico, então, lavados quatro vezes com 500 µl de 1 % (v/v) de ácido fórmico. Para dissociar peptídeos de HLA de moléculas de HLA etiquetadas por afinidade (etiquetadas com BAP) e facilitar a ligação de peptídeo à fase sólida de tC18, 400 µl de 3 % (v/v) de acetonitrila/5 % (v/v) de ácido fórmico foram adicionados aos tubos que contém resina de agarose de microesfera ligada a HLA. A pasta fluida foi misturada por pipetagem, então, transferida para os cartuchos Sep-Pak. Os tubos e as pontas de pipeta foram enxaguadas com 1 % (v/v) de ácido fórmico (2 x 200 µl) e o enxague foi transferido para os cartuchos. 100 femtomol de mistura de calibragem de tempo de retenção de peptídeo Pierce foram adicionados aos cartuchos como um controle de carga. A resina de agarose de microesfera foi incubada duas vezes por 5 min com 200 µl de 10 % (v/v) em ácido acético para dissociar adicionalmente os peptídeos de HLA das moléculas de HLA etiquetadas por afinidade (etiquetadas com BAP), então, lavada quatro vezes com 500 µl de 1 % (v/v) de ácido fórmico. Os peptídeos de HLA foram eluídos do tC18 em novos microtubos de 1,5 ml pelo fracionamento de etapa com 250 µl de 15 % (v/v) de acetonitrila/1 % (v/v) de ácido fórmico seguidos por 250 µl de 30 % (v/v) de acetonitrila/1 % (v/v) de ácido fórmico. As soluções usadas para ativação, carregamento de amostra, lavagem e eluição fluíram por meio de gravidade, mas o vácuo (>-0,17 Bar (> -2,5 PSI)) foi usado para remover o restante do eluato dos cartuchos. Os eluatos que contêm peptídeos de HLA foram congelados, secos por centrifugação a vácuo, e armazenados a -80 ℃ antes de serem submetidos a redução, alquilação e um segundo fluxo de trabalho de dessalinização.
[0744] A redução e a alquilação de peptídeos de HLA que contêm cisteína foi realizada em microtubos de 1,5 ml, como o seguinte. Os peptídeos secos foram solubilizados em 200 µl de 10 mM de Tris-Cl de pH 8, então, reduzidos por incubação com 5 mM de ditiotreitol a 60 ℃ por 30 minutos enquanto agitava a 1.000 rpm em um ThermoMixer. Os tióis reduzidos foram alquilados incubando-se com 15 mM de 2-Iodoacetamida à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Qualquer 2- Iodoacetamida não reagida foi extinta por incubação com 5 mM de Ditiotreitol por 15 min à temperatura ambiente no escuro. As amostras foram dessalinizadas imediatamente após a redução e a alquilação.
[0745] A dessalinização secundária das amostras de peptídeo de HLA foi realizada com StageTips embutidos empacotados com o uso de duas punções de 16 graduações de um disco de extração de fase sólida de C18 Empore. StageTips foram ativados duas vezes com 100 µl de metanol seguido por 50 µl de 99,9 % (v/v) de acetonitrila/0,1 % (v/v) de ácido fórmico, então, lavados três vezes com 100 µl de 1 % (v/v) de ácido fórmico. A solução de peptídeo foi acidificada adicionando-se 200 µl de 3 % (v/v) de acetonitrila/5 %
(v/v), então, e carregada em StageTips. Os tubos e as pontas de pipetas foram enxaguados com 200 µl de 3 % (v/v) de acetonitrila/5 % (v/v) seguidos por 1 % (v/v) de ácido fórmico (2 x 100 µl) e o volume de enxágue foi transferido para os StageTips. StageTips foram lavados cinco vezes com 100 µl de 1 % (v/v) de ácido fórmico. Os peptídeos foram eluídos em microtubos de 1,5 ml com o uso de um gradiente escalonado de 20 µl, 15 % (v/v) de acetonitrila/1 % (v/v) de ácido fórmico seguidos por dois 20 µl de cortes de 30 % (v/v) de acetonitrila/1 % (v/v) de ácido fórmico. O carregamento de amostra, as lavagens e a eluição foram realizados em uma centrífuga de mesa com uma velocidade máxima de 1.800- 3.500 x g à temperatura ambiente. Eluatos foram congelados, secos por centrifugação a vácuo, e armazenados a -80 ℃. Sequenciamento de peptídeo de HLA por nLC-MS/MS
[0746] Todas as análises de nLC-MS/MS empregaram as mesmas condições de separação de cromatografia líquida descritas abaixo. Os peptídeos foram cromatograficamente separados com o uso de um Sistema EASY-nLC 1200 ajustado com um PicoFrit de diâmetro interno de 75 µm e 10 µm de coluna de nanoaspersão emissora empacotada a ~68,94 Bar (~1.000 psi) de pressão com hélio a ~35 cm com ReproSil-Pur de 120 Ǻ C18-AQ de material de empacotamento de 1,9 µm e aquecido a 60 °C durante a separação. A coluna foi equilibrada com 10X volume de leito de solvente A [3 % (v/v) de acetonitrila/0,1 % (v/v) de ácido fórmico], as amostras foram carregadas em 4 µl de 3 % (v/v) de acetonitrila/5 % (v/v) de ácido fórmico, e os peptídeos foram eluídos com um gradiente linear de 6-40 % de Solvente B [80 % (v/v) de acetonitrila/0,1 % (v/v) de ácido fórmico] ao longo de
84 min, 40-60 % de Solvente B ao longo de 9 min, então, mantidos a 90 % de Solvente B por 5 minutos e 50 % de Solvente B por 9 minutos para lavar a coluna. Os gradientes lineares foram executados em uma taxa de 200 nl/min.
[0747] Os peptídeos foram eluídos em um Espectrômetro de Massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado com uma fonte de Íons Nanospray Flex a 2,5 kV. Um MS de varredura completa foi obtido em uma resolução de 15.000 de 300- 1.800 m/z com um controle de ganho automático (AGC) alvo de 4x105 e tempo de injeção de no máximo 50 milissegundos. Cada varredura de MS foi seguida por varreduras de MS/MS, de acordo com uma lista de massa de inclusão (Tabela 23) que compreende as massas de íons calculados (m/z) dos epítopos de peptídeo de neoORF de GATA3 alvo e seus estados de carga previstos (z). As massas de íons calculados adicionais foram incluídas para peptídeos que cumpriram os seguintes critérios: i) múltiplos estados de carga esperados devido à presença de um ou mais resíduos básicos na sequência e/ou ii) peptídeos que contém aminoácidos que se esperou que fossem modificados durante o processamento de amostra como cisteína, metionina, e glutamina N-terminal. Os tempos de injeção máximos variaram entre 100 milissegundos e 120 milissegundos para manter os tempos de ciclo de 2-2,8 segundos ao longo do pico cromatográfico. As varreduras de MS/MS foram obtidas em uma resolução de 15.000 de 110 a 1.300-1.500 m/z, com o uso de uma espessura de isolamento de 1 m/z, energia de colisão de HCD normalizada de 34 e um alvo de AGC de 1x 105. A Tabela 23 lista as listas de massa de inclusão de epítopos de peptídeo de neoORF de GATA3 para cada alelo HLA
Sequência de n° Alelo m/z z Peptídeos* MLTGPPARV (SEQ ID 1 HLA-A*02:01 471,2655 2 NO: 3421) mlTGPPARV (SEQ ID 2 HLA-A*02:01 479,2629 2 NO: 3422) SMLTGPPARV (SEQ 3 HLA-A*02:01 514,7815 2 ID NO: 3423) SmlTGPPARV (SEQ 4 HLA-A*02:01 522,7790 2 ID NO: 3424) TLQRSSLWCamcL 5 HLA-A*02:01 421,8887 3 (SEQ ID NO: 3425) TLQRSSLWCamcL 6 HLA-A*02:01 632,3294 2 (SEQ ID NO: 3426) TLQRSSLWCcysL 7 HLA-A*02:01 442,5495 3 (SEQ ID NO: 3427) TLQRSSLWCcysL 8 HLA-A*02:01 663,3207 2 (SEQ ID NO: 3428) TLQRSSLWCL (SEQ 9 HLA-A*02:01 402,8815 3 ID NO: 3429) TLQRSSLWCL (SEQ 10 HLA-A*02:01 603,8186 2 ID NO: 3430) YMFLKAESKI (SEQ 11 HLA-A*02:01 410,5581 3 ID NO: 3431) YmFLKAESKI (SEQ 12 HLA-A*02:01 415,8898 3 ID NO: 3432) YMFLKAESKI (SEQ 13 HLA-A*02:01 615,3336 2 ID NO: 3433)
Sequência de n° Alelo m/z z Peptídeos* YmFLKAESKI (SEQ 14 HLA-A*02:01 623,3310 2 ID NO: 3434) FATLQRSSL (SEQ ID 1 HLA-B*07:02 511,7851 2 NO: 3435) GPPARVPAV (SEQ ID 2 HLA-B*07:02 432,2585 2 NO: 3436) KPKRDGYMF (SEQ ID 3 HLA-B*07:02 381,1989 3 NO: 3437) KPKRDGYmF (SEQ ID 4 HLA-B*07:02 386,5306 3 NO: 3438) KPKRDGYMF (SEQ ID 5 HLA-B*07:02 571,2948 2 NO: 3439) KPKRDGYmF (SEQ ID 6 HLA-B*07:02 579,2922 2 NO: 3440) KPKRDGYMFL (SEQ 7 HLA-B*07:02 418,8936 3 ID NO: 3441) KPKRDGYmFL (SEQ 8 HLA-B*07:02 424,2253 3 ID NO: 3442) KPKRDGYMFL (SEQ 9 HLA-B*07:02 627,8368 2 ID NO: 3443) KPKRDGYmFL (SEQ 10 HLA-B*07:02 635,8343 2 ID NO: 3444) MFATLQRSSL (SEQ 11 HLA-B*07:02 577,3053 2 ID NO: 3445) mFATLQRSSL (SEQ 12 HLA-B*07:02 585,3028 2 ID NO: 3446)
Sequência de n° Alelo m/z z Peptídeos* ESKIMFATL (SEQ ID 1 HLA-B*08:01 520,2783 2 NO: 3447) ESKImFATL (SEQ ID 2 HLA-B*08:01 528,2757 2 NO: 3448) FATLQRSSL (SEQ ID 3 HLA-B*08:01 511,7851 2 NO: 3449) FLKAESKIM (SEQ ID 4 HLA-B*08:01 356,2037 3 NO: 3450) FLKAESKIm (SEQ ID 5 HLA-B*08:01 361,5353 3 NO: 3451) FLKAESKIM (SEQ ID 6 HLA-B*08:01 533,8019 2 NO: 3452) FLKAESKIm (SEQ ID 7 HLA-B*08:01 541,7994 2 NO: 3453) FLKAESKIMF (SEQ 8 HLA-B*08:01 405,2265 3 ID NO: 3454) FLKAESKImF (SEQ 9 HLA-B*08:01 410,5581 3 ID NO: 3455) IMKPKRDGYM (SEQ 10 HLA-B*08:01 413,5510 3 ID NO: 3456) ImKPKRDGYM (SEQ 11 HLA-B*08:01 418,8826 3 ID NO: 3457) ImKPKRDGYm (SEQ 12 HLA-B*08:01 424,2143 3 ID NO: 3458) IMKPKRDGYM (SEQ 13 HLA-B*08:01 619,8228 2 ID NO: 3459)
Sequência de n° Alelo m/z z Peptídeos* ImKPKRDGYM (SEQ 14 HLA-B*08:01 627,8203 2 ID NO: 3460) ImKPKRDGYm (SEQ 15 HLA-B*08:01 635,8178 2 ID NO: 3461) LHFCamcRSSIM (SEQ 16 HLA-B*08:01 384,1881 3 ID NO: 3462) LHFCamcRSSIm (SEQ 17 HLA-B*08:01 389,5197 3 ID NO: 3463) LHFCamcRSSIM (SEQ 18 HLA-B*08:01 575,7784 2 ID NO: 3464) LHFCamcRSSIm (SEQ 19 HLA-B*08:01 583,7759 2 ID NO: 3465) LHFCcysRSSIM (SEQ 20 HLA-B*08:01 606,7698 2 ID NO: 3466) LHFCcysRSSIm (SEQ 21 HLA-B*08:01 614,7672 2 ID NO: 3467) MFATLQRSSL (SEQ 22 HLA-B*08:01 577,3053 2 ID NO: 3468) mFATLQRSSL (SEQ 23 HLA-B*08:01 585,3028 2 ID NO: 3469) YMFLKAESKI (SEQ 24 HLA-B*08:01 410,5581 3 ID NO: 3470) YmFLKAESKI (SEQ 25 HLA-B*08:01 415,8898 3 ID NO: 3471) YMFLKAESKI (SEQ 26 HLA-B*08:01 615,3336 2 ID NO: 3472)
Sequência de n° Alelo m/z z Peptídeos* YmFLKAESKI (SEQ 27 HLA-B*08:01 623,3310 2 ID NO: 3473) *m minúsculo = metionina oxidada, Camc = cisteína carbamidometilada, Ccys = cisteína cisteinilada Pesquisa na base de dados
[0748] Os espectros de massa foram interpretados com o uso do pacote de software Spectrum Mill. Os espectros de MS/MS foram excluídos da pesquisa se os mesmos não tivessem um precursor MH+ na faixa de 600 a 2.000 Da, tivessem uma carga precursora >5 ou tivessem <4 picos detectados. A fusão de espectros similares com o mesmo precursor m/z adquirido no mesmo pico cromatográfico foi desativada. Os espectros de MS/MS foram pesquisados em um banco de dados que continha todos os genes do navegador do genoma UCSC com anotação hg19 do genoma e seus transcritos de codificação de proteína (63.691 entradas) combinados com uma sequência GATA3 neoORF de comprimento total e 150 contaminantes comuns. Antes da busca na base de dados, todos os MS/MS tinham que passar pelo filtro de qualidade espectral com comprimento de etiqueta de sequência >2 (isto é, mínimo de 3 massas separadas pela massa na cadeia de um aminoácido). Uma classificação mínima de clivagem de cadeia principal foi definida como 5 e o esquema de classificação “ESI QExactive HLA v2” foi usado. Todos os espectros foram pesquisados com o uso de uma especificidade sem enzima, uma modificação fixa de carbamidometilação de cisteína (Camc) e as seguintes modificações variáveis: metionina oxidada (m), ácido piroglutâmico e cisteinilação (Ccys). As tolerâncias de massa do precursor e do produto foram estabelecidas em 0,1 Da e 10 ppm, respectivamente, e a intensidade de pico combinada mínima foi fixada em 30 %. As correspondências de espectro de peptídeos (PSMs) para espectros individuais foram designadas automaticamente como atribuídas com segurança com o uso do módulo de autovalidação Spectrum Mill para aplicar estimativa de FDR com base em isca de alvo na classificação PSM para definir critérios de limite de pontuação. Uma estratégia de limiares automáticos com o uso de um comprimento mínimo de sequência de 7, filtragem de massa de precursor de faixa variável automática e limiares de classificação e classificação delta Rank1-Rank2 foram otimizados em todas as execuções de nLC-MS/MS para um alelo HLA produzindo uma estimativa de PSM FDR de <1 % para cada estado de carga do precursor. Equação
[0749] O peso molecular monoisotópico experimental (MW) de cada epítopo peptídico foi calculado de acordo com a seguinte equação, em que m/z é a razão massa-carga do epítopo peptídico detectado pelo espectrômetro de massa, z é a carga do epítopo peptídico, e 1,007276 é o peso molecular monoisotópico de um próton. Equação 8. MW Experimental = ((m/z) × (z)) – ((z) × (1,007276)) Resultados
[0750] O nLC-MS/MS direcionado foi usado para validar o processamento endógeno de epítopos peptídicos derivados do GATA3 neoORF que foram previstos para se ligar a HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 e HLA-B*08:01. Cinco epítopos de peptídeo derivados da região comum do GATA3 neoORF foram detectados em células HEK293T através dos três alelos (Figura 23).
[0751] Para o heterodímero HLA-A*02:01, quatro peptídeos derivados da região comum do GATA3 neoORF foram direcionados por nLC-MS/MS. Dois peptídeos da região comum, SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3474) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3475), foram identificados com sucesso por pesquisa de banco de dados e por correspondência espectral com suas contrapartes de peptídeos sintéticos. Os pesos moleculares monoisotópicos teóricos e experimentais para cada epítopo de peptídeo com erro de massa associado são mostrados na Tabela 24. A classificação de clivagem de cadeia principal e a intensidade de pico classificada conforme relatado pelo fluxo de trabalho de pesquisa de banco de dados Spectrum Mill são listadas na Tabela 25. A classificação de clivagem de cadeia principal é indicativa do número de íons específicos do fragmento gerados por HCD, enquanto a intensidade de pico classificada mostra a porcentagem da corrente de íons no espectro de MS/MS que é explicado pela interpretação da pesquisa. A Tabela 24 abaixo lista os pesos moleculares teóricos e experimentais com erro de massa Erro
MW MW Teórico de Alelo Sequência* Experimental (Da) Massa (Da) (Da)
SMLTGPPARV HLA- (SEQ ID NO: 1027,5484 1027,5570 0,0086 A*02:01 3476) HLA- MLTGPPARV - 940,5164 940,5126 A*02:01 (SEQ ID NO: 0,0038
Erro
MW MW Teórico de Alelo Sequência* Experimental (Da) Massa (Da) (Da) 3477)
KPKRDGYMF HLA- - (SEQ ID NO: 1140,5750 1140,5748 B*07:02 0,0002 3478)
KPKRDGYMFL HLA- - (SEQ ID NO: 1253,6590 1253,6514 B*07:02 0,0076 3479) ESKImFATL HLA- (SEQ ID NO: 1054,5368 1054,5370 0,0002 B*08:01 3480) *m minúsculo indica oxidação de metionina. A Tabela 25 mostra métricas de interpretação a partir da pesquisa de base de dados Mapa de Cobertura de Pontuação Intensidade Sequência* de de Pico Alelo Legenda: / y-íon, \ b- Clivagem Pontuada íon, | b- & y-íons Principal (%) HLA- S M|L|T/G/P/P A R V (SEQ 5/9 78,5 A*02:01 ID NO: 3481) HLA- M/L|T/G/P/P A R V (SEQ 5/8 83,6 A*02:01 ID NO: 3482) HLA- K/P|K/R D G Y|M|F (SEQ 5/8 81,1 B*07:02 ID NO: 3483) HLA- K/P/K R D G Y\M|F\L (SEQ 5/9 72,2 B*07:02 ID NO: 3484)
Mapa de Cobertura de Pontuação Intensidade Sequência* de de Pico Alelo Legenda: / y-íon, \ b- Clivagem Pontuada íon, | b- & y-íons Principal (%) HLA- E S K\I m\F\A/T/L (SEQ 5/8 73,9 B*08:01 ID NO: 3485) *m minúsculo indica oxidação de metionina.
[0752] Cada espectro de MS/MS adquirido no epítopo de peptídeo processado endogenamente foi combinado com um espectro de MS/MS gerado com o uso do peptídeo sintético correspondente. A FIG. 24 mostra a comparação espectral do espectro de MS/MS para o epítopo de peptídeo processado endogenamente SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3486) (FIG. 24A inferior) e o espectro de MS/MS de seu peptídeo sintético correspondente (FIG. 24A superior). A FIG. 24B mostra uma representação alternativa da correspondência espectral idêntica. Esses gráficos da cabeça aos pés foram gerados com o uso dos 45 ou 50 íons mais abundantes para os epítopos de peptídeo 9mer e 10mer, respectivamente (http://orgmassspec.github.io/).
[0753] A FIG. 25 mostra a comparação espectral de MS/MS para o peptídeo endogenamente processado HLA-A*02:01 MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3487).
[0754] Para HLA-B*07:02, cinco epítopos peptídicos derivados da região comum do GATA3 neoORF foram direcionados por nLC-MS/MS. Dois epítopos de peptídeo da região comum, KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3488) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3489), foram identificados com sucesso por pesquisa de banco de dados e por correspondência espectral com seus peptídeos sintéticos correspondentes. Os pesos moleculares teóricos e experimentais para cada epítopo de peptídeo com erro de massa associado são mostrados na Tabela 24. A classificação de clivagem de cadeia principal e classificação de pico de intensidade, conforme relatado pelo mecanismo de pesquisa, são listadas na Tabela 25.
[0755] A FIG. 26 e a FIG. 27 mostram a comparação espectral para epítopos de peptídeo HLA-B*07:02 KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3490) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3491), respectivamente.
[0756] Para HLA-B*08:01, oito epítopos de peptídeo derivados da região comum do GATA3 neoORF foram direcionados por nLC-MS/MS. Um epítopo de peptídeo da região comum, ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3492), foi identificado com sucesso por pesquisa de banco de dados e por correspondência espectral com o peptídeo sintético correspondente. Esse peptídeo foi detectado com a forma de sulfóxido de metionina que resultou em um deslocamento de massa de 15,999 Da, indicativo da adição de oxigênio à cadeia lateral. A oxidação da metionina (indicada como m minúsculo) em sua forma de sulfóxido é um resultado comum do processamento da amostra. O peso molecular teórico e experimental para ESKImFATL (SEQ ID NO: 3493) com erro de massa associado é mostrado na Tabela
24. A classificação de clivagem de cadeia principal e classificação de pico de intensidade, conforme relatado pelo mecanismo de pesquisa, são listadas na Tabela 25.
[0757] A FIG. 28 mostra a comparação espectral para epítopo de peptídeo HLA-B*08:01 ESKImFATL (SEQ ID NO: 3494).
[0758] O nLC-MS/MS direcionado foi usado para validar o processamento e a apresentação de cinco epítopos de peptídeo derivados da região comum do GATA3 neoORF que foram previstos para se ligar a heterodímeros HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 e HLA-B*08:01. Os heterodímeros de HLA de classe I foram purificados a partir de células HEK293T que expressam de forma estável o GATA3 neoORF com o uso de uma etiqueta de afinidade que foi geneticamente expressa na cadeia alfa de cada heterodímero de HLA de classe I.
Cada heterodímero etiquetado por afinidade (alelo HLA etiquetado por BAP) foi transitoriamente transfectado em células HEK293T expressando neoORF GATA3 como descrito em RP19-005. A sequência linear correta para cada epítopo de peptídeo direcionado foi confirmada por sequenciamento de peptídeo nLC-MS/MS.
Todos os espectros de MS/MS foram interpretados com o fluxo de trabalho de pesquisa de banco de dados Spectrum Mill que combinou espectros MS/MS experimentais contra peptídeos de um banco de dados composto de >63.000 entradas, incluindo o GATA3 neoORF de comprimento total.
O peso molecular para cada epítopo de peptídeo observado foi calculado dentro de +/- 0,01 Da de seu peso molecular teórico.
A interpretação dos espectros experimentais de MS/MS mostrou que ≥72 % da corrente de íons nos espectros de MS/MS pode ser explicada pelos íons do fragmento específico da sequência.
A confirmação adicional da sequência de epítopos de peptídeo processado endogenamente foi realizada por correspondência espectral com o espectro de MS/MS do peptídeo sintético correspondente que mostrou massas de íon de fragmento idênticas e padrões de clivagem de estrutura principal.
Juntos, nLC-MS/MS direcionados confirmaram que os epítopos de peptídeo HLA-A*02:01 SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3495) e MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3496), os epítopos de peptídeo HLA- B*07:02 KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3497) e KPKRDGYMFL (SEQ ID NO:
3498) e o epítopo de peptídeo HLA-B*08:01 ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3499) foram endogenamente processados em células HEK293T e subsequentemente ligados por heterodímeros de HLA. Exemplo 23 Imunogenicidade em MHC I
[0759] Esse exemplo avalia a imunogenicidade do GATA3 neoORF em vários alelos de HLA de alta prevalência. O GATA3 neudORF é uma mutação de deslocamento de quadro de leitura que ocorre antes do códon de parada natural, resultando em uma extensão da proteína em pelo menos 61 novos aminoácidos. A imunogenicidade foi avaliada por uma indução in vitro de doador saudável (HD) PBMCs contra epítopos mínimos previstos específicos para HLA-A02:01, A03:01, A24:02, B07:02 ou B08:01. Materiais e Métodos A Tabela 26 lista agrupamentos de peptídeos preparados com base na restrição de alelo Agrupamento Sequência Comprimento Pureza MW Alelo HLA de Peptídeo de Peptídeo Final Experimental A02.01 SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 10 100 % 1028,1 A02.01 3500) YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 10 100 % 1229,4 B08.01/A0 3501) 2.01/A24. 02 VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 9 100 % 988,4 A02.01 3502) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 10 98 % 1206,5 A02.01 3503) MLTGPPARV (SEQ ID NO: 9 100 % 941,3 A02.01 3504) A03.01 YMFLKAESK (SEQ ID NO: 9 80 % 1116,2 A03.01 3505) KIMFATLQR (SEQ ID NO: 9 71 % 1107,3 A03.01 3506) VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 10 85 % 1191,3 A03.01 3507)
Agrupamento Sequência Comprimento Pureza MW Alelo HLA de Peptídeo de Peptídeo Final Experimental A24.02 YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 10 85 % 1229,4 B08.01/A0 3508) 2.01/A24. 02 MFLKAESKI (SEQ ID NO: 9 86 % 1066,3 A24.02 3509) YMFLKAESK (SEQ ID NO: 9 80 % 1116,2 A03.01 / 3510) A24.02 KIMFATLQR (SEQ ID NO: 9 71 % 1107,3 A03.01 / 3511) A24.02 VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 10 85 % 1191,3 A03.01 / 3512) A24.02 B07.02 KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 10 71 % 1254,3 B07.02 3513) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 9 83 % 1022,2 B08.01/B0 3514) 7.02 EPHLALQPL (SEQ ID NO: 9 81 % 1017,2 B08.01/B0 3515) 7.02 KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 9 73 % 1141,2 B07.02 3516) GPPARVPAV (SEQ ID NO: 9 81 % 863,0 B07.02 3517) B08.01-1 FATLQRSSL (SEQ ID NO: 9 83 % 1022,2 B08.01/A2 3518) 4.02 ESKIMFATL (SEQ ID NO: 9 76 % 1039,2 B08.01/B0 3519) 7.02 FLKAESKIM (SEQ ID NO: 9 78 % 1066,2 B08.01/B0 3520) 7.02 EPHLALQPL (SEQ ID NO: 9 81 % 1017,2 B08.01 3521) B08.01-2 YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 10 85 % 1229,4 B08.01/A0 3522) 2.01/A24. 02 MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 10 80 % 1153,2 B08.01/B0 3523) 7.02 IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 10 74 % 1238,4 B08.01 3524) FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 10 71 % 1213,3 B08.01 3525)
A Tabela 27 lista informações de doador saudável
ID de Tipo de Classe I Doador HLA-A HLA-B HLA-C Saudáv el HD44 11:01: 24:02: 13:01: 40:01: 03:04: N/A 01 01 01 02 01 HD45 03:01 68:01: 39:01: 51:08: 07:02: 16:02: 02 01 01 01 01 HD48 02:06: 29:02: 07:02: 48:01: 07:02: 08:03: 01 01 01 01 01 01 HD50 02:01: 68:03: 35:01: 51:01: 07:02: 16:02: 01 01 01 01 01 01 HD56 01:01: 68:01: 08:01: 40:08 03:04: 07:01: 01 02 01 01 01 N/A = O doador é homozigoto para o alelo específico. Os alelos direcionados ao epítopo estão em negrito Indução com o uso de ligante de tirosina quinase 3 do tipo FMS (FLT3L) para estimular DCs
[0760] O Estímulo FLT3L foi realizado pelo seguinte método. PBMCs foram descongelados e ressuspensos a 5x107 células/ml em meio AIM-V. Benzonase (Sigma-Aldrich 70746) foi adicionada a 25-29 U/µl e incubada a 37 °C por 30 min a 1 h. A depleção de CD14/CD25 foi realizada para remover monócitos (CD14) e células T reguladoras (CD25) de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi Biotec, Inc 130-050- 201, 130-092-983). As células a 2x106 células/ml foram ressuspensas em meio AIM-V com FLT3L (CellGenix 1415- 050) a 50 ng/ml e semeadas 2 ml por poço em uma placa de 24 poços durante a noite. O peptídeo diluído em AIM-V foi adicionado a uma concentração final de 2 uM e os poços foram misturados suavemente. As células foram incubadas com o peptídeo durante 1 hora a 37 °C.
[0761] Coquetel de maturação com fator de necrose tumoral a (TNF-a) (1000U/ml) (CellGenix1406-050), IL-1b (10 ng/ml) (CellGenix1411-050), prostaglandina-E 1 (PGE-1) (0,5 µg/ml) e IL-7 (0,5 ng/ml) foi adicionado e incubado a 37 °C durante a noite. Após a incubação do coquetel de maturação durante a noite, FBS foi adicionado a cada poço em uma concentração final de 10 % em volume e misturado. A cocultura foi alimentada a cada 2-3 dias, começando no dia 5, substituindo cuidadosamente 75 % do meio por Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) + FBS a 10 % com IL-7 e IL-15 suficientes para uma concentração final de 5 ng/ml no poço. Para alimentações após a primeira, o meio foi substituído por 20/80 + FBS a 10 % fresco com IL-7 e IL-15 suficientes para uma concentração final de 5 ng/ml no poço. O início da geração de mDC foi iniciado no dia 4. Geração de Célula Dendrítica Madura (mDC)
[0762] PBMCs foram descongeladas e ressuspensas a 5x107 células/ml em meio de células dendríticas (DC) (Cellgenix 20801-0500). Benzonase foi adicionada (sigma-aldrich 70746) em 25-29U/ul e incubada a 37 °C por 30 min-1 hr.
[0763] Um Isolamento de Monócitos Pan foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi biotec, Inc 130- 096- 537). As células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 3x106células/poço em 2 ml de meio DC com fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (800 U/ml) (CellGenix 1412- 050) e IL-4 (400 U/ml) (CellGenix 1403-050) e incubadas a 37 °C durante 5 dias.
[0764] O carregamento e a maturação de peptídeo foram realizados da seguinte maneira. As ImmDCs dos poços foram coletadas por pipetagem e peletização por centrifugação a
1.200 RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 1 ml em meio DC. As células foram separadas em conjuntos com 0,2x106 (ou 0,5x106) células por poço para cada conjunto e incubadas por 1 hora a 37 °C com 1,6 uM de peptídeo (concentração final de 0,4 uM). 800 ul (ou 2 ml) de meio de DC foram adicionados por poço às ImmDCs carregadas com peptídeo e plaqueadas em uma placa de 6 poços com as seguintes citocinas e incubadas a 37 °C por 2 dias: IL-4 (400 U/ml) (CellGenix 1403-050), GM-CSF (800 U/ml) (CellGenix 1412-050), TNF-a (10ng/ml) (CellGenix1406-050), IL-1b (10 ng/ml) (CellGenix1411-050), PGE-1 (0,5 µg/ml) (Cayman da República Tcheca), IL-6 (10 ng/ml) (CellGenix 1004-50). Estímulo de Longo Prazo mediado por Células Dendríticas Maduras (mDC LTS)
[0765] No dia 12, células T estimuladas com FLT3L foram adicionadas. As DCs foram ressuspensas em 1 ml a 20/80. Os poços de cocultura foram coletados e contados e as células foram ressuspensas a 5x106/ml a 20/80. Adicionou-se 1 ml de células T naïve às mDCs a uma razão de 10:1 (células T:mDC) com citocinas IL-7 (5 ng/ml) IL-15 (5 ng/ml). Foi adicionado meio a um volume final de 5 ml por poço. A cocultura foi incubada a 37 °C. A cocultura foi alimentada a cada 2-3 dias, começando no dia 15. As células foram expandidas em frascos de maior volume conforme a necessidade. Equação 9. Meio para adição(ml) = (vol atual(ml)×(180- Glicose))/60
[0766] As culturas foram reestimuladas no dia 23 em novas mDCs. As DCs foram ressuspensas em 1 ml a 20/80. Os poços de cocultura foram coletados e as células ressuspensas a 2e6/ml (ou 5e6/ml) em 20/80. Adicionou-se 1 ml de células T naïve às mDCs a uma razão de 10:1 (células T:mDC) com citocinas IL-7 (5 ng/ml) IL-15 (5 ng/ml). O meio foi adicionado a um volume final de 5 ml por poço. A cocultura foi incubada a 37 °C. A cocultura foi alimentada a cada 2-3 dias. As células foram expandidas em frascos de maior volume conforme necessário. Equação 9: Meio para adição(ml) = (vol atual(ml)×(180- Glicose))/60
[0767] No dia 31, as células foram congeladas em 1 ml de meio de congelamento (90 % de FBS, 10 % de DMSO). As células foram mantidas durante a noite a -80 °C em um CoolCell Freeze Container (VWR 75779-816) antes de transferir as mesmas para o nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Geração e análise de multímero Monômeros de Troca de Peptídeo
[0768] Monômeros HLA MHC Classe I carregados com um peptídeo clivável por UV foram gerados internamente. Os monômeros foram ressuspensos a 100 ug/ml em PBS filtrado e os peptídeos de ensaio ressuspensos a 10 mg/ml em DMSO e o peptídeo clivável por UV foram trocados por peptídeos de ensaio individuais a uma razão de 1 ul de peptídeo: 50 ul de monômero sob luz UV por 1 hora a 4 °C. Os monômeros trocados foram girados a 3.600 RPM e o sobrenadante, coletado. Conjugação de fluorocromo
[0769] 50 ul de pMHC foi combinado com o fluorocromo marcado com estreptavidina em gelo por 30 min no escuro de acordo com cada uma das seguintes razões de conjugação de fluorocromo (CR): PE (BioLegend 405203) (CR: 2); APC (BioLegend 405207) (CR: 3); BV421 (BioLegend 405226) (CR: 2); QD605 (Life Technologies Q10101 MP) (CR: 2); QD705 (Life Technologies Q10161 MP) (CR: 2); BUV395 (BD 564176) (CR: 2); BV650 (BD 563855) (CR: 2). Cada pMHC foi derramado e conjugado a dois fluorocromos individuais. Biotina foi adicionada (Avidity BIO200) + azida a 0,5 % na a uma razão de 1:20 e os multímeros armazenados a 4 °C no escuro durante 1 e 3 dias. Leitura de citometria de fluxo obtida nos dias 11, 22 e pós-congelamento. ~2x106 células foram coletadas em uma placa de 96 poços com fundo em V de polipropileno em meio com Benzonase (sigma-aldrich 70746) a 25-29U/ul e incubadas a 37 °C por 30 min a 1 h.
[0770] As células foram coradas com todos os seguintes multímeros conjugados com fluorocromo carregados com os peptídeos induzidos em 50 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada por 15 min a 37 °C no escuro. PE (BioLegend 405203) 1 ul; APC (BioLegend 405207) 3 ul; BV421 (BioLegend 405226) 1 ul; QD605 (Life Technologies Q10101 MP) 4,5 ul; QD705 (Life Technologies Q10161 MP) 4,5 ul; BUV395 (BD 564176) 3,5 ul; BV650 (BD 563855) 2,5 ul. As amostras foram coradas com os seguintes anticorpos de superfície por 30 min em gelo no escuro. Analisado em LSR-Fortessa para Agrupamento de diferenciação (CD)8(+) / CD4(-) / CD14(-) / CD16(-) / CD19(-)/ Dead(-) / Multimer_1(+) / Multimer_2 (+) / Irrelevant Multimer(-): CD8-FITC (Biolegend 344704) 2 ul, CD4-AF700 (BD 557922) 1 ul, CD14-AF700 (BD 557923) 1ul, CD19- AFF700 (BD 557921) 1 ul, CD16-AF700 (BD 557920) 1 ul, Live dead stain (Molecular probes L-23101) 0,1 ul. Resultados
[0771] Cada amostra foi machada com dois multímeros para cada peptídeo contra o qual o doador foi induzido em uma combinação única de fluorocromo.
As induções positivas foram determinadas por pelo menos 10 eventos positivos para pelo menos 1 combinação de fluorocromo específica e negativos para combinações irrelevantes de fluorocromo.
Os dados foram coletados após cada estímulo e um resultado positivo em dois estímulos foi considerado uma indução positiva.
A FIG. 29A e a FIG. 29B mostram a indução representativa de Respostas de CD8+ de Neoantígeno de GATA3. A Tabela 28 mostra a porcentagem de Respostas de CD8+ de Neoantígeno de GATA3 Positivo Peptídeo de Alelo Número Número Induções Indução de poços de poços positivas com uma testados em TCR porcentagem reativa MLTGPPARV (SEQ ID A02:01 5 5 100 % NO: 3526) SMLTGPPARV (SEQ A02:01 1 5 20 % ID NO: 3527) GPPARVPAV (SEQ ID B07:02 1 5 20 % NO: 3528) KPKRDGYMF (SEQ ID B07:02 1 5 20 % NO: 3529) ESKIMFATL (SEQ ID B08:01 1 5 20 % NO: 3530)
A Tabela 28 relata a porcentagem de repetições que resultou em uma indução de células T CD8+ naïve confirmada por meio de dois estímulos independentes.
[0772] Esses resultados mostram que há pelo menos um epítopo mínimo dentro do GATA3 neoORF que pode gerar uma indução específica de CD8+ in vitro para 4 dos 5 HLAs testados. Os resultados indicam ampla imunogenicidade do GATA3 neoORF em todos os HLAs e identificam epítopos de neoantígenos mínimos imunogênicos específicos para os HLAs de alta prevalência. Exemplo 24 Imunogenicidade em MHC II
[0773] Esse exemplo avalia a imunogenicidade de CD4 de peptídeos mais longos (> 15 aminoácidos) específicos para o GATA3neoORF. Para prever a imunogenicidade de CD4 in vivo, um ensaio de indução in vitro foi usado contra cinco doadores saudáveis diferentes com sobreposição mínima de HLA-Classe II. Materiais e métodos A Tabela 29 abaixo lista peptídeos de indução Agrupamento Sequência Comprimento Pureza Peso de Peptídeo de Peptídeo Final molecular L1 PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHA (SEQ 27 95 % 2971,2 ID NO: 3531) APAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCS (SEQ ID 26 90 % 2843,4 NO: 3532) PPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID 25 93 % 2865,8 NO: 3533) L2 EPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPV (SEQ ID 26 92 % 2774,2 NO: 3534) TPPLQHGHRHGLEPCSMLTGPPARVPA (SEQ 27 96 % 2857,8 ID NO: 3535) DLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESK (SEQ ID 25 88 % 2989,0 NO: 3536) KAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID 24 100 % 1810,0 NO: 3537) L3 HADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQH (SEQ ID 24 94 % 2624,1 NO: 3538)
Agrupamento Sequência Comprimento Pureza Peso de Peptídeo de Peptídeo Final molecular EPCSMLTGPPARVPAVPFDLHFCR (SEQ ID 24 98 % 2641,4 NO: 3539) KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRS (SEQ ID 24 98 % 2846,8 NO: 3540)
A Tabela 30 abaixo forneceu informações de doador saudável ID de Doador Saudável HD41 HD44 HD63 HD47 HD56 01:03:0 02:02:0 01:03:0 01:03:0 01:03:01 HLA- 1 2 1 1 DPA1 01:04:0 02:02:0 01:03:0 02:01:0 01:03:01 1 2 1 2 05:01:0 05:01:0 04:01:0 01:01:0 04:01:01 HLA- 1 1 1 1 DPB1 05:01:0 15:01:0 04:02:0 107:01 04:01:01 1 1 1 Alelo de Classe II
03:03:0 01:02:0 05:01:0 03:01:0 02:01:01 HLA- 1 2 1 1 DQA1 01:03:0 05:05:0 05:01:0 05:08 04:01:01 1 1 1 01:03:0 03:01:0 02:01:0 02:01:0 02:02:01 HLA- 1 1 1 1 DQB1 01:03:0 05:02:0 03:01:0 03:02:0 04:02:01 1 1 1 1 04:05:0 12:01:0 03:01:0 03:01:0 07:01:01 HLA- 1 1 1 1 DRB1 11:01:0 16:02:0 11:02:0 04:04:0 08:02:01 1 1 1 1 HLA- 02:02:0 01:01:0 01:01:01 02:02:0 01:01:0
ID de Doador Saudável HD41 HD44 HD63 HD47 HD56 DRB34 1 2 1 2 5 01:03:0 01:01:0 Não 02:02:0 01:03:0 1 1 Presente 1 1 Geração de Célula Dendrítica Madura (mDC) Isolamento de Monócito
[0774] PBMCs foram descongeladas e ressuspensas a 5x107 células/ml em meio de células dendríticas (DC) (Cellgenix 20801-0500). Benzonase foi adicionada (sigma-aldrich 70746) em 25-29U/ul e incubada a 37 °C por 30 min-1 hr. Um Isolamento de Monócitos Pan foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi biotec, Inc 130- 096- 537). As células foram plaqueadas em placas de 6 poços a 3x106 células/poço em 2 ml de meio DC com GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (400 U/ml) e incubadas a 37 °C por 5 dias. Carregamento e Maturação de Peptídeo
[0775] As ImDCs foram coletadas dos poços por pipetagem e peletizadas por centrifugação a 1.200 RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 1 ml em meio DC. As células foram separadas em conjuntos com 0,2x106 (ou 0,5x106) células por poço para cada conjunto e incubadas por 1 hora a 37 °C com 1,6 uM de peptídeo (concentração final de 0,4 uM). 800 ul (ou 2 ml) de meio DC foram adicionados por poço às imDCs carregadas com peptídeo e plaqueados em uma placa de 24 (ou 6) poços com as seguintes citocinas e incubados a 37 °C por 2 dias; IL-4 (400 U/ml) (CellGenix 1403-050), GM-CSF (800 U/ml) (CellGenix 1412-050), TNF-a (10ng/ml) (CellGenix1406- 050), IL-1b (10 ng/ml) (CellGenix1411-050), PGE-1
(0,5 µg/ml) (Cayman da República Tcheca), IL-6 (10 ng/ml) (CellGenix 1004-50 Estímulo de Longo Prazo (LTS)
[0776] Foram adicionadas Células T naïve. PBMCs foram descongeladas e ressuspensas a 5x107 células/ml em meio DC (Cellgenix 20801-0500). Benzonase foi adicionada (sigma- aldrich 70746) em 25-29U/ul e incubada a 37 °C por 30 min-1 hr.
[0777] A depleção de CD14/CD25 foi realizada para remover monócitos (CD14) e células T reguladoras (CD25) de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi Biotec, Inc 130-050- 201, 130-092-983). Adicionou-se 1 ml de células T naïve às mDCs a uma razão de 10:1 (células T:mDC) com citocinas IL-7 (5 ng/ml; CellGenix) IL-15 (5 ng/ml; CellGenix). A cocultura foi incubada a 37 °C. As mDCs foram ressuspensas em 20/80 ou mantidas no meio DC com citocinas.
[0778] A cocultura foi alimentada a cada 2- 3 dias começando no dia 5 seguindo o método 1 ou método 2 abaixo (2.3.2.1.1 ou 2.3.2.1.2). As células foram expandidas em frascos de maior volume conforme a necessidade. Para o método 1,
[0779] meio para adição foi calculado como (ml) = (vol atual(ml)×(180-Glicose))/60. Para o método 2, o medidor de glicose foi usado para verificar se o meio é amarelo. Se a glicose permanecer alta (>90 mg/dl), 100 ul de 20x IL-7 e IL-15 foram adicionados ao poço. Se a glicose estiver baixa (<90 mg/dl), as células foram expandidas para placas de 6 poços (4 ml/poço) e suplementadas com 1x IL-15 e IL-7. Se a glicose estiver muito baixa (<60 mg/dl), expandir para 6 ml/poço em uma placa de 6 poços. Nos dias 6 e 13 ou 14 novas mDCs foram geradas.
[0780] Nos dias 13 e 21 ou 22 as culturas em novas mDCs foram reestimuladas. Os poços de cocultura foram coletados e contados e as células ressuspensas a 2x106/ml (ou 5x106/ml) em 20/80. Adicionou-se 1 ml de células T naïve às mDCs a uma razão de 10:1 (células T:mDC) com citocinas IL-7 (5 ng/ml) IL-15 (5 ng/ml). A cocultura foi incubada a 37 °C. As mDCs foram ressuspensas em 20/80 ou mantidas no meio DC com citocinas. No dia 28 ou 29, as células foram congeladas em 1 ml de meio de congelamento (90 % de FBS, 10 % de DMSO). As células foram mantidas durante a noite a -80 °C em um CoolCell Freeze Container (VWR 75779- 816) antes de transferir as mesmas para o nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Ensaio de Recuperação de CD4
[0781] Ou novas mDCs foram geradas ou PBMCs frescas foram descongeladas do mesmo doador de indução. Placa as células a 0,26/poço de PBMCs e 0,02x106/poço de mDCs em uma placa de fundo em U de 96 poços com peptídeo ou DMSO na concentração final de 0,8uM. A amostra de indução foi adicionada a uma indução 1:1: PBMC ou razão de indução:mDc 10: 1 para os poços e incubada a 32 ºC por 20-24 horas Leitura de citrometria de fluxo
[0782] A parada de Golgi (BD 554724) e o tampão de golgi (BD 555029) foram adicionados às culturas de acordo com o protocolo do fabricante e incubadas por 4 horas. As células foram coradas com CD4-BV786 (BD 563877), CD8-AF700 (BD 561453), CD14-FITC (BD 340682), CD16-FITC (BD 340704), CD19- FITC (BD 340864), Live dead stain (Molecular probes L-23101) por 20 minutos. As amostras foram fixadas com o uso do kit de fixação/permeabilização (BD 554714) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram coradas com IFN- y-PE (Biolegend 502508) por 20 minutos. Análise foi realizada em LSR-Fortessa para CD4 (+) / CD8 (-) / CD14 (-) / CD16 (- ) / CD19 (-), Dead (-) / IFNy (+). Resultados
[0783] Com o uso de citometria de fluxo, células T CD4 específicas para antígenos foram identificadas (Figuras 30A e 30B). Foi identificada pelo menos uma indução a um peptídeo específico GATA3 neoORF em cada doador saudável testado.
[0784] Peptídeos reativos específicos foram identificados por recuperação das células induzidas contra peptídeos individuais e comparando com uma recuperação sem peptídeo. Cada amostra de indução foi executada inicialmente contra os agrupamentos de indução e as amostras positivas foram subsequentemente recuperadas contra os peptídeos individuais. Todas as amostras foram executadas em placas duplicadas e se a porcentagem média de CD4+/IFNy+ das amostras de indução com peptídeo foi maior do que 2 % em comparação com a mesma amostra sem peptídeo, a amostra foi considerada um sucesso. A Tabela 31 mostra o percentual de Respostas de CD4 de Neoantígeno de GATA3 Peptídeo de Indução HD4 HD4 HD5 HD4 HD6 1 4 6 7 3 EPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPV (SEQ ID 0 % 20 0 % 0 % 0 % NO: 3541) % APAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCS (SEQ ID 0 % 0 % 0 % 20 0 % NO: 3542) % PPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID 0 % 20 20 0 % 0 %
Peptídeo de Indução HD4 HD4 HD5 HD4 HD6 1 4 6 7 3 NO: 3543) % % DLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESK (SEQ ID 40 0 % 20 40 20 NO: 3544) % % % % KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRS (SEQ ID 0 % 40 0 % 0 % 0 % NO: 3545) % LKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID 20 0 % 0 % 0 % 0 % NO: 3546) % As sequências em negrito estão em uma região de GATA3 NeoOrf comum a todos os pacientes
[0785] Foi observada pelo menos uma resposta específica de CD4 para a região comum do GATA3 neoORF em todos os dadores saudáveis testados. Esses doadores tinham uma ampla gama de alelos HLA MHC de classe II, indicando que a capacidade de gerar uma resposta CD4 GATA3 não é dependente de alelos. Exemplo 25 Ensaios funcionais com células T CD8+ induzidas
[0786] Esse exemplo mostra a capacidade de as células T CD8 + específicas para neoantígenos derivados do novo quadro de leitura aberta da proteína de ligação GATA 3 (GATA3) (neoORF) matar células que apresentam a mutação GATA3 neoORF apropriada. A indução das células T CD8+ específicas do neoantígeno é descrita anteriormente no Exemplo 23 e a geração da linha celular que abriga a mutação GATA3 neoORF é descrita no Exemplo 21.
[0787] Nesse Exemplo, células T CD8+ específicas para um único epítopo do GATA3 neoORF apresentado em HLA-A02:01 (coberto pela sequência de peptídeos MLTGPPARV (SEQ ID NO:
3547)) foram selecionadas para essa análise detalhada. Resumidamente, as células T CD8+ induzidas foram cocultivadas com células alvo transduzidas com o GATA3 neoORF ou não manipuladas como um controle negativo. Após a cocultura, as células alvo foram avaliadas quanto à expressão de Caspase 3, um marcador de morte celular, como medida de citotoxicidade pelas células T CD8+ induzidas. Caspase 3 aumentada nas células alvo que expressam o GATA3 neoORF em relação às células não manipuladas representa morte específica devido ao epítopo cognato sendo apresentado na superfície das células alvo. Além disso, as células T CD8+ foram avaliadas quanto à expressão de CD107a, um marcador de ativação de células T, para medir a ativação de células T específicas do antígeno. Para avaliar ainda mais o reconhecimento específico do antígeno de PBMC induzido por GATA3, IFN-γ, uma citocina produzida por células T citotóxicas CD8+ após o reconhecimento do antígeno, também foi medido no sobrenadante.
[0788] No total, quatro populações diferentes de células T CD8+ específicas para um epítopo GATA3 neoORF em HLA-A02:01 foram testadas quanto à sua capacidade de matar células alvo que abrigam a mutação. Em todos os quatro casos, o aumento da Caspase 3 foi observado nas células alvo que abrigam o GATA3 neoORF em relação às células alvo sem a mutação. O aumento na Caspase 3 demonstra a capacidade de as células T CD8+ específicas para epítopos de GATA3 neoORF matar células que abrigam a mutação GATA3 neoORF. Materiais e métodos Ensaio de citotoxicidade
[0789] As linhagens celulares de HEK 293T foram adquiridas junto a American Type Culture Collection (Rockford, MD, EUA) e mantidas em DMEM 10 % de FBS, e meio de Pen/Strep. O lentivírus codificado pelo gene GATA3 foi gerado e transduzido para células HEK 293T. As células HEK 293T transduzidas por GATA3 foram mantidas sob 1 µg/ml de puromicina em meio completo por mais de 2 semanas. Mais detalhes são descritos no Exemplo 21.
[0790] 1x107 células alvo em 1 ml foram adicionadas a 1 µl de violeta Tag-it (Biolegend) seguido por incubação em incubadora de CO2 a 5 % por 20 minutos, lavagem de 5 ml de meio de cultura com FBS a 10 % duas vezes e ressuspensão das células em 1x106 células de meio de cultura.
[0791] Os frascos de PBMC induzidos foram descongelados colocando os mesmos em banho-maria a 37 °C. Então, 1 ml de FBS foi adicionado a cada frasco. As células foram transferidas para tubo cônico de 50 ml contendo 15 ml de meio de cultura de AIM-V, FBS a 10 % e meio Pen/Strep. As células foram centrifugadas a 1.500 rpm por 5 min e ressuspensas em 5 ml de meio de cultura. As células foram deixadas em repouso por 1 hora e 30 min em 37 °C, incubadora de 5 % de CO2 antes de adicionar 5 µl de Benzonase (Millipore Sigma) e incubação adicional por 30 min em 37 °C, incubadora de 5 % de CO2. As células incubadas foram centrifugadas novamente e, após a remoção do sobrenadante, foram ressuspensas em 5 ml de meio AIM-V. O número de células foi contado usando o contador Vi-CELL (Beckman coulter).
[0792] As células foram centrifugadas e ressuspensas em 40 µl de tampão MACS por 1x107 células alvo. As células positivas para CD8+ foram enriquecidas negativamente de acordo com o kit de isolamento de células T CD8+ humanas
(Miltenyi Biotec). As células CD8+ foram ressuspensas em 2,5X106 células em 1 ml de meio AIM-V. 5x104 células alvo por poço foram semeadas em 50 µl de meio de cultura em placa de fundo plano de 96 poços e cultivadas durante a noite em 37 °C, incubadora de 5 % de CO2. As células induzidas por GATA3 e enriquecidas com CD8 + foram semeadas sobre as células alvo a 2,5x105 células por poço em 100 µl de meio AIM-V. As células de cocultura foram incubadas por 6 horas em 37 °C, incubadora de 5 % de CO2.
[0793] Os sobrenadantes de cultura de cocultura foram coletados e avaliados a concentração de IFN-γ com ensaios de IFN-γ humano V-PLEX de acordo com o protocolo do fabricante (Meso Scale Discovery).
[0794] As células em suspensão foram transferidas para uma nova placa de coloração e as células aderentes foram transferidas após a adição de 50 µl de tripsina por poço, incubação a 37 °C e ressuspensão com meio V AIM. As células foram combinadas, centrifugadas e lavadas com tampão FACS. 50 µl de mistura de anticorpo (anti-CD3-BUV8052, anti-CD4- BV711, anti-CD107a-BV786, anti-CD8+-PE-cy5, e IR dye Live/Dead; BD) foram adicionados a cada amostra após incubação por 30 min em gelo. As células foram lavadas com 100 µl de tampão FACS. O coloração intracelular de caspase- 3 foi realizado de acordo com o manual de fabricação do kit Cytofix/Cytoperm (BD) com 2 µl de anticorpo Caspase-3. As células coradas foram analisadas por Fortessa II (BD). Resultados Ensaio de citotoxicidade por PBMC induzido por GATA3
[0795] Três diferentes PBMCs de doadores saudáveis (HD47, HD50 e HD51) foram induzidos com o peptídeo neoantígeno GATA3
HLA-A:02 MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3548) por método de estímulo a longo prazo. Esta combinação epítopo:alelo foi determinada como ideal para teste em ensaio de citotoxicidade em comparação com outro epítopo:alelos relacionados a GATA3 neoORF considerando a frequência de alelo e contagens de células. As FIGs. 31A-31D mostram células T CD8+ específicas de GATA3 por coloração de multímero. Essas células T foram selecionadas como células efetoras para o ensaio de citotoxicidade.
[0796] Células HEK293T transduzidas GATA3 foram usadas como célula alvo (Exemplo 21). Além disso, células HEK 293T transduzidas foram usadas para controle negativo. Após 6 horas de cocultura de células efetoras e células alvo, médias de 3,3 %, 3,7 %, 2,5 % e 2,8 % de células positivas para Caspase-3 foram encontradas para os 4 experimentos em células alvo não transduzidas e médias de 4,4 %, 5,2 %, 6,3 % e 6,9 % de células positivas para Caspase-3 foram observadas em células transduzidas GATA3, respectivamente (FIG. 32). Células alvo positivas para Caspase-3 significativamente maiores foram observadas em cocultura com PBMCs induzidos por GATA3 de HD51 (FIG. 33). A maior frequência de células T CD8+ expressas por CD107a foi observada em condição de cocultura de células HEK293T transduzidas por GATA3 com 2 de PBMC de dadores saudáveis induzidos por GATA (amostra 1 e amostra 2) (FIG. 34). Níveis mais altos de IFN-γ foram detectados na mesma condição de cocultura com 2 de PBMC de dadores saudáveis induzidos por GATA (amostra 1 e amostra 2) (FIG. 35).
[0797] Um ensaio de citotoxicidade in vitro foi utilizado para avaliar a capacidade das células T CD8+ específicas para o GATA3 neoORF de reconhecer e matar células que abrigam a mutação GATA3 de deslocamento de quadro de leitura. PBMCs incluindo células T específicas para neoantígenos GATA3 de deslocamento de quadro de leitura em HLA-A02:01 derivados de doadores saudáveis estimulados com o peptídeo GATA3 de deslocamento de quadro de leitura MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3549) foram testadas como representativos de tipos de células T que podem ser induzidos a partir de uma vacina de GATA3 de deslocamento de quadro de leitura. Essas células T levaram à morte de células tumorais, conforme confirmado pelo ensaio da presença do marcador de morte de células alvo, Caspase-
3. Os resultados do marcador de ativação de células T CD8+ CD107a e ensaios de IFN-γ de citocina sugerem ainda que essas células T induzidas por peptídeos podem reconhecer e matar células que processam naturalmente e apresentam neoantígenos GATA3 de deslocamento de quadro de leitura. Exemplo 26 Clonagem de TCR e ensaios funcionais
[0798] O Exemplo mostra a clonagem do receptor de células T (TCR) de uma célula T CD8+ específica para um neoantígeno do GATA3 neoORF em HLA-A02:01 e ensaios funcionais. A indução de células T CD8+ específicas para neoantígenos é descrita no Exemplo 23. As células T CD8+ específicas foram isoladas com o uso de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e a sequência de TCR foi identificada com o uso das plataformas 10x Genomics e MiSeq. O TCR selecionado foi então expresso de forma recombinante em uma linha de células T para caracterização funcional do TCR e avaliação do processamento e apresentação do neoantígeno na superfície de uma célula que abriga a mutação GATA3 neoORF, cuja geração é descrita no Exemplo 21.
[0799] O TCR foi caracterizado por ter uma avidez abaixo de 40 nM. Isso demonstra que é possível gerar células T CD8+ com TCRs para neoantígenos GATA3. Além disso, o TCR tem a capacidade de reconhecer o neoantígeno processado e apresentado na superfície de células HEK293T que abrigam a mutação GATA3 neoORF, que suporta os resultados no Exemplo 22, demonstrando o processamento e apresentação de neoantígenos GATA3 na superfície de células que abrigam a mutação. Materiais e métodos
[0800] As FIGs. 36-38 mostram uma visão geral de clonagem de TCR e ensaio funcional. Classificação de células T CD8+ GATA3 por multímero
[0801] Células T específicas para GATA3 neoORF foram induzidas e expandidas (Exemplo 23). As células induzidas foram coradas com multímero de peptídeo GATA3 9mer e anticorpos de superfície (CD8, CD4, CD14, CD16, CD19 e um corante reativo fluorescente quase IR). Células T específicas de GATA3, que eram multímero GATA3 e CD8 positivas, foram classificadas por fusão FACS ARIA (BD) e coletadas em tubo de 1,5 ml contendo FBS a 2 % em PBS. Sequenciamento de TCR de célula T única por 10x Genomics e MiSeq
[0802] Após a classificação, as células coletadas foram imediatamente processadas para codificação de célula única e geração de cDNA com os kits de reagentes Chromium Single Cell V(D)J (10x Genomics). O enriquecimento da sequência de TCR e a construção da biblioteca foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento foi realizado na escala de 10 pM com o kit de reagente MiSeq 300 ciclos e
MiSeq (Illumina). A análise da sequência e clonalidade do TCR foram realizadas com o uso do software Cell ranger e do navegador Loupe VDJ (10x Genomics). Síntese e clonagem do gene TCR
[0803] As sequências de TCR selecionadas foram otimizadas por códons para o sistema de mamíferos. As sequências de DNA do TCR foram sintetizadas e clonadas no vetor lentivírus (pCDH-EF1ɑ-Puro, System Biosciences) pela GENEWIZ (NJ, EUA). O vetor lentivírus continha o promotor EF1ɑ seguido por TCR beta, sítio de clivagem de furina, F2A, TCR alfa, T2A e sítio de resistência à puromicina (FIG. 40) Produção de lentivírus
[0804] Para gerar o gene GATA3 neoORF TCR codificado por lentivírus, o vetor lentivírus, plasmídeos de pacote e as células HEK 293T (ATCC) foram usados pelo método de transfecção. Os detalhes de transfecção e coleta são descritos no Exemplo 21. Transdução de células Jurkat ou PBMC
[0805] As células Jurkat modificadas (J.RT3-T3.5, ATCC), que não apresenta o TCR beta, foram modificadas para expressar a cadeia alfa CD8+ pelo lentivírus que codifica o gene alfa CD8+. As células Jurkat modificadas foram usadas para a transdução do lentivírus GATA3 TCR. 1,8 x 106 células Jurkat foram semeadas em 1,2 ml de meio RPMI-1640 com FBS a 10 % e 6 µg/ml de polibreno em placa de 24 poços. Após 0,6 ml de lentivírus TCR específico de GATA3 ter sido adicionado às células, a placa foi centrifugada a 2.400 rpm por 45 minutos a 32 °C. As células foram incubadas em incubadora de 5 % de CO2 por 24 horas. As células Jurkat transduzidas foram mantidas em meio RPMI-1640 com FBS a 10 % com 1 µg/ml de
Puromicina durante 10 dias. Ensaio de liberação de IL-2 com titulação de peptídeo
[0806] Para avaliar a sensibilidade do TCR que foi clonado nas células Jurkat, foi realizado um ensaio de titulação de peptídeo. As células Jurkat secretam IL-2 especificamente em resposta à sinalização de TCR. Uma vez que as células Jurkat empregadas nesse ensaio não têm um TCR beta endógeno, o TCR na superfície dessas células é especificamente o TCR clonado. Os peptídeos foram adicionados em uma ampla faixa de concentrações às células alvo HEK293T com o HLA relevante (HLA-A02:01), mas não a mutação GATA3 para avaliar a secreção máxima de IL-2 e para estimar a concentração de peptídeo necessária para liberar 50 % dessa secreção máxima (EC50). Esse EC50 é considerado a avidez do TCR. 20.000 células HEK 293T não modificadas que expressam endogenamente HLA:A02.01 foram semeadas em placa de 96 poços com adição de 100 µl de peptídeo GATA3 ou peptídeo irrelevante variando de 20 µM a 2 pM de concentração em DMEM com FBS a 10 %. Após incubação durante a noite a 37 ℃, 200.000 células Jurkat transduzidas por TCR específicas de GATA3 neoORF foram adicionadas a cada poço a uma razão de 10:1 entre células Jurkat transduzidas por TCR e células HEK 293T carregadas com peptídeo. A cocultura foi incubada em incubadora de 5 % de CO2 a 37 °C por 24 horas. 50 µl de sobrenadante de cada poço foram coletados e a concentração de IL-2 humana foi medida pelo kit de descoberta de escala Meso de acordo com o protocolo do fabricante. Ensaio de liberação de IL-2 com célula alvo transduzida por mutação de GATA3
[0807] Para avaliar a capacidade do TCR de reconhecer um neoantígeno verdadeiramente processado e apresentado, uma cocultura de células Jurkat transduzidas por TCR e células alvo HEK 293T. Nesse sistema, entretanto, nenhum peptídeo foi adicionado exogenamente. Em vez disso, as linhagens de células transduzidas com o GATA3 neoORF ou um gene irrelevante foram utilizadas como alvos. Dessa forma, para que as células Jurkat transduzidas por TCR reconheçam seus alvos, o neoantígeno GATA3 deve ser processado e apresentado na superfície da célula alvo.
[0808] 20.000 de mutação GATA3 ou células HEK 293T transduzidas por gene irrelevante foram semeadas em placas de 96 poços. Após incubação durante a noite, 200.000 de células Jurkat transduzidas por TCR específicas de GATA3 foram adicionadas a cada poço. A cocultura foi incubada em incubadora de 5 % de CO2 a 37 °C por 24 horas. 50 µl de sobrenadante de cada poço foram coletados e a concentração de IL-2 humana foi medida pelo kit de descoberta de escala Meso de acordo com o protocolo do fabricante (Meso Scale Discovery). Resultados Células TCR Jurkat específicas de GATA3 Classificação de células T CD8+ específicas para GATA3
[0809] 2,1 % de células T CD8+ específicas para GATA3 foram detectadas no poço número 5 do doador saudável 42 por multímero GATA3 HLA-A02 após estimulação de longo prazo com peptídeo GATA3 neoORF MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3550). As células
5.402 duplamente positivas de multímero foram classificadas por FACSARIA (Figura 39). As células classificadas foram com código de barras de uma única célula com o kit 10X Genomics V(D)J. As sequências emparelhadas de TCR alfa e beta foram analisadas com o navegador Loupe V(D)J. O clonotipo dominante (clonotype1) tem sequências CALDIYGNNRLAF (SEQ ID NO: 3551) e CASSLDFVLAGSYSYEQFF (SEQ ID NO: 3552) de sequências de aminoácidos alfa e beta de TCR de CDR3, respectivamente. O clonotipo 2 tem a mesma sequência de TCR beta que o clonotipo 1 sem a sequência de TCR alfa. O clonotipo 4 tem a mesma sequência de TCR alfa que o clonotipo 1 sem a sequência de TCR beta. A razão da soma dos clonotipos 1, 2 e 4 foi de 82,5 % de todos os clonotipos TCR e outros clonotipos foram inferiores a 1 % (Tabela 32). A Tabela 32 abaixo mostra análise de clonotipo de TCR específico de GATA3 exemplificativo clonotype_id frequência proporção Sequência de aminoácidos CDR3 clonotype1 1178 48 % TRA:CALDIYGNNRLAF (SEQ ID NO: 3553);TRB:CASSLDFVLAGSYSYNEQFF (SEQ ID NO: 3554) clonotype2 848 34 % TRB:CASSLDFVLAGSYSYNEQFF (SEQ ID NO: 3555) clonotype4 12 0,5 % TRA:CALDIYGNNRLAF (SEQ ID NO: 3556) clonotype3 12 0,5 % TRA:CAEKVPNTGNQFYF (SEQ ID NO: 3557);TRB:CASSSLGTVRTEAFF (SEQ ID NO: 3558) clonotype5 10 0,4 % TRA:CAVEAYNFNKFYF (SEQ ID NO: 3559);TRB:CASRSENTIYF (SEQ ID NO: 3560) clonotype6 10 0,4 % TRA:CILSDSGNTPLVF (SEQ ID NO: 3561);TRB:CASSDWAVSGNTIYF (SEQ ID NO: 3562) clonotype7 9 0 % TRA:CAGAANAGGTSYGKLTF (SEQ ID NO: 3563);TRB:CASSQAQGANYGYTF (SEQ ID NO: 3564) clonotype9 7 0 % TRA:CAEIPTFSGGYNKLIF (SEQ ID NO: 3565);TRB:CASSLAGQETQYF (SEQ ID NO: 3566) clonotype8 7 0 % TRA:CLRGGSTLGRLYF (SEQ ID NO: 3567);TRB:CASSLYPTGGSGMDEQYF (SEQ ID NO: 3568) clonotype10 6 0 % TRA:CAVRDGNTGGFKTIF (SEQ ID NO: 3569);TRB:CASSELKTGGAFF (SEQ ID NO: 3570) Clonagem e síntese de DNA de TCR específico de GATA3
[0810] As sequências alfa e beta do TCR do clonotipo 1 foram otimizadas por códons de acordo com a frequência de uso de códons humanos para expressão máxima em linha de células humanas e PBMC (Tabela 32). O plasmídeo de lentivírus codificado pelo gene TCR (Figura 40) foi avaliado por sequenciamento de DNA e digestão com enzimas de restrição. Os dados da sequência de DNA do plasmídeo codificado de TCR específico de GATA3 neoORF final são 100 % correspondidos com a sequência otimizada de códons alfa e beta de TCR (fonte em negrito na Figura 41). Após a digestão com a enzima de restrição AflII, duas bandas de DNA foram observadas; uma banda entre 6.000 pb e 5.000 pb, e a outra banda entre 4.000 pb e 3.000 pb. Essas bandas se correlacionam com o tamanho esperado de 5590 pb e 3424 pb, respectivamente (Figura 42). A Tabela 33 abaixo mostra a sequência de DNA alfa e beta de TCR específica de GATA3 e a sequência otimizada de códons. Códon de TCR alfa de TCR alfa de clonotipo 1 Clonotipo 1 otimizado
ATGGCTTTTTGGCTGAGAAGGCTGGGT ATGGCCTTCTGGCTGAGGAGACTGGGT CTACATTTCAGGCCACATTTGGGGAGA TTACACTTCAGACCCCATTTAGGCAGA CGAATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTT AGAATGGAGAGCTTTTTAGGCGGCGTG TTGCTGATTTTGTGGCTTCAAGTGGAC CTGCTGATTTTATGGCTGCAAGTTGAC TGGGTGAAGAGCCAAAAGATAGAACAG TGGGTGAAGAGCCAGAAGATCGAGCAG AATTCCGAGGCCCTGAACATTCAGGAG AACAGCGAGGCTTTAAACATTCAAGAA GGTAAAACGGCCACCCTGACCTGCAAC GGCAAGACAGCCACTTTAACTTGTAAC TATACAAACTATTCTCCAGCATACTTA TATACCAACTACTCCCCCGCTTATTTA CAGTGGTACCGACAAGATCCAGGAAGA CAGTGGTACAGACAAGATCCCGGCAGA GGCCCTGTTTTCTTGCTACTCATACGT GGCCCCGTGTTTTTACTGCTGATTCGT GAAAATGAGAAAGAAAAAAGGAAAGAA GAGAACGAGAAGGAGAAGAGGAAGGAG AGACTGAAGGTCACCTTTGATACCACC AGACTGAAGGTGACCTTCGACACCACT CTTAAACAGAGTTTGTTTCATATCACA TTAAAGCAGTCTTTATTCCACATCACC GCCTCCCAGCCTGCAGACTCAGCTACC GCCAGCCAGCCCGCTGATAGCGCCACC
Códon de TCR alfa de TCR alfa de clonotipo 1 Clonotipo 1 otimizado
TACCTCTGTGCTCTAGACATTTATGGG TATTTATGCGCTTTAGACATCTACGGC
AACAACAGACTCGCTTTTGGGAAGGGG AACAATCGTCTGGCCTTCGGCAAGGGC AACCAAGTGGTGGTCATACCA (SEQ AACCAAGTTGTGGTGATCCCC (SEQ ID NO: 3571) ID NO: 3573) Códon de TCR beta de TCR beta de clonotipo 1 clonotipo 1 otimizado
ATGGGAATCAGGCTCCTCTGTCGTGTG ATGGGCATTCGTCTGCTGTGTCGTGTG GCCTTTTGTTTCCTGGCTGTAGGCCTC GCCTTCTGCTTTTTAGCCGTGGGTTTA GTAGATGTGAAAGTAACCCAGAGCTCG GTGGACGTGAAGGTGACCCAGTCCTCT AGATATCTAGTCAAAAGGACGGGAGAG CGTTATTTAGTGAAGAGGACCGGCGAG AAAGTTTTTCTGGAATGTGTCCAGGAT AAGGTGTTTTTAGAATGCGTGCAAGAT ATGGACCATGAAAATATGTTCTGGTAT ATGGACCACGAGAACATGTTCTGGTAC CGACAAGACCCAGGTCTGGGGCTACGG AGACAAGATCCCGGACTGGGTTTAAGG CTGATCTATTTCTCATATGATGTTAAA CTGATCTACTTCAGCTACGACGTGAAG ATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAG ATGAAGGAGAAGGGCGACATCCCCGAG GGGTACAGTGTCTCTAGAGAGAAGAAG GGCTACTCCGTGTCTCGTGAGAAGAAG GAGCGCTTCTCCCTGATTCTGGAGTCC GAGAGGTTCTCTTTAATTTTAGAGTCC GCCAGCACCAACCAGACATCTATGTAC GCCAGCACCAACCAGACCAGCATGTAT CTCTGTGCCAGCAGTTTAGATTTTGTG TTATGCGCCAGCTCTTTAGACTTTGTG CTAGCGGGGTCCTACTCCTACAATGAG CTGGCCGGCAGCTACAGCTACAACGAG
CAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTC CAGTTCTTCGGCCCCGGCACCAGACTG ACCGTGCTAG (SEQ ID NO: 3572) ACCGTGCTG (SEQ ID NO: 3574) Expressão de TCR específico de GATA3
[0811] Para células Jurkat expressas por TCR específico de GATA3, o sistema de lentivírus foi usado após a transfecção da linha de células HEK 293T com construto de TCR específico de GATA3 e o lentivírus foi transduzido em células Jurkat. As células Jurkat transduzidas e selecionadas com puromicina foram coradas com multímero GATA3-PE e multímero GATA3-BV650 e comparadas com células Jurkat não transduzidas para verificar a expressão de TCR específica de GATA3. 73,1 % das células foram positivas para ambos multímero GATA3-PE e multímero GATA3-BV650, indicando expressão de TCR específica de GATA3 neoORF (Figura 43) Teste de Titulação de Peptídeo
[0812] Para verificar se o TCR recombinante é funcional, concentrações de peptídeo de 20 µM a 0,2 pM foram testadas com células Jurkat transduzidas por TCR específicas de GATA3. Os níveis de secreção de IL-2 das células Jurkat mostraram correlação não linear com a concentração do peptídeo GATA3 com uma EC50 observado = 37,85 nM (FIG. 44). Ensaio de liberação de IL-2 de Jurkat transduzida por TCR específico de GATA3
[0813] Para verificar o reconhecimento do antígeno de mutação GATA3 endógeno pela Jurkat de TCR específico de mutação de GATA3, as células HEK 293T transduzidas por mutação foram usadas como uma célula alvo e cocultivadas com células Jurkat transduzidas por TCR de GATA3. O nível de IL- 2 foi mais alto no grupo de células HEK 293T carregado com o peptídeo com mutação de GATA3 (círculos) do que no grupo de células carregadas com o peptídeo irrelevante (triângulos) na FIG. 45. O nível de IL-2 também foi mais alto no grupo de células alvo transduzidas por mutação de GATA3 (quadrados) do que no grupo de células alvo transduzidas por gene irrelevante (triângulo invertido) na FIG. 45.
[0814] Nesse estudo, um TCR foi clonado a partir de uma célula T CD8+ específica para um neoantígeno GATA3 apresentado em HLA-A02:01. A avidez do TCR foi definida como sendo inferior a 40 nM por titulação de peptídeo (EC50) e o TCR teve a capacidade de reconhecer uma linha celular que expressa GATA3 neoORF. Esses dados confirmam a geração de células T CD8+ que têm TCRs potentes que podem reconhecer células com a mutação de GATA3 neoORF. Exemplos 27 - 41 descritos abaixo se referem a peptídeos de BTK mutantes e de EGFR mutantes Exemplo 27 Ensaio de Coloração de Citocina Intracelular
[0815] A indução de respostas de células T CD4+ e CD8+ específicas do neoantígeno de BTK e o ensaio de coloração de tetrâmero são realizados conforme descrito nos Exemplos 1 e
2. A indução de respostas de células T CD4+ e CD8+ específicas do neoantígeno de EGFR e o ensaio de coloração de tetrâmero são realizados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Na ausência de coloração de tetrâmero bem estabelecida para identificar populações de célula T específicas de antígeno, a especificidade de antígeno pode ser estimada com o uso de avaliação de produção citocina com o uso de ensaios de citometria de fluxo bem estabelecidos. Resumidamente, as células T são estimuladas com o peptídeo de interesse e comparadas a um controle. Após o estímulo, a produção de citocinas por células T CD4+ (por exemplo, IFNγ e TNFα) é avaliada por coloração intracelular. Essas citocinas, especialmente IFNγ, podem ser usadas para identificar células estimuladas. A análise FACS da indução específica do antígeno de IFNγ e níveis de TNFα de células CD4+ de um doador saudável estimulado com APCs carregados com ou sem um BTK mutante é realizada. A análise FACS da indução específica do antígeno de IFNγ e níveis de TNFα de células CD4+ de um doador saudável estimulado com APCs carregados com ou sem um peptídeo de EGFR mutante é realizada. Exemplo 28 - Ensaio ELISPOT
[0816] As células T específicas de peptídeo são funcionalmente enumeradas com o uso do ensaio ELISPOT (BD Biosciences), que mede a liberação de IFNγ das células T em uma base celular única. As células alvo (C1Rs transfectadas com T2 ou HLA-A0201) foram pulsadas com 10 µM de peptídeo por 1 hora a 37 °C, e lavadas três vezes. 1 x 105 alvos pulsados de peptídeo são cocultivados nos poços de placa ELISPOT com concentrações variantes de células T (5 x 102 a 2 x 103) tomadas a partir da cultura de imunogenicidade. As placas são desenvolvidas de acordo com o protocolo do fabricante, e analisadas em um leitor de ELISPOT (Cellular Technology Ltd.) com software anexo. Os pontos correspondentes ao número de células T que produzem IFNγ são relatados como o número absoluto de pontos por número de células T plaqueadas. As células T expandidas em peptídeos modificados são testadas apenas quanto as suas habilidades para reconhecer alvos pulsados com o peptídeo modificado, mas também quanto as suas habilidades para reconhecer alvos pulsados com o peptídeo parental. Os níveis de IFNγ de amostras simulado transduzidas ou transduzidas com um vetor de expressão lentiviral que codifica um peptídeo BTK mutante ou peptídeo EGFR mutante são determinados. Exemplo 29 - Ensaio de Coloração de CD107
[0817] CD107a e b são expressos na superfície celular de células T CD8+ após a ativação com peptídeo cognato. Os grânulos líticos de células T têm uma bicamada de lipídeo que contém glicoproteínas de membrana lisossomal associada (“LAMPs”), que incluem as moléculas CD107a e b.
Quando as células T citotóxicas são ativadas através do receptor de célula T, as membranas desses grânulos líticos mobilizam e se fusionam com a membrana plasmática da célula T.
Os teores de grânulo são liberados, e isso resulta em morte da célula- alvo.
Visto que a membrana granular se fusiona com a membrana plasmática, C107a e b são expostos na superfície celular, e, portanto, são marcadores de desgranulação.
Devido à desgranulação como medida por coloração de CD107a e b ser relatada em uma base celular única, o ensaio é usado para enumerar funcionalmente as células T específicas de peptídeo.
Para realizar o ensaio, o peptídeo é adicionado a células C1R transfectadas com HLA-A02:01 até uma concentração final de 20 µM, as células são incubadas durante 1 hora a 37 °C e lavadas três vezes. 1 x 105 das células C1R pulsadas com peptídeo são divididas em alíquotas em tubos, e anticorpos específicos para CD107a e b são adicionados a uma concentração final sugerida pelo fabricante (Becton Dickinson). Os anticorpos são adicionados antes da adição de células T a fim de “capturar” as moléculas de CD107 conforme as mesmas aparecem de modo transiente na superfície durante o curso do ensaio. 1 x 105 de células T da cultura de imunogenicidade são adicionados em seguida, e as amostras foram incubadas por 4 horas a 37 °C.
As células T são adicionalmente colorizadas para moléculas de superfície celular adicionais como CD8 e adquiridas em um instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson). Os dados são analisados com o uso do software Cellquest anexo, e os resultados são relatados como a porcentagem de células de CD8+/CD107a e b+.
Exemplo 30 - Ensaios de Citotoxicidade
[0818] A atividade citotóxica é medida com o uso do método 1 ou do método 2. O método 1 envolve um ensaio de liberação de cromo. As células T2 alvo são marcadas por 1 hora a 37 °C com Na51Cr e lavadas, 5 x 103 de células T2 alvo são, então, adicionados aos números variantes de células T da cultura de imunogenicidade. A liberação de crômio é medida em tensoativo colhido após 4 horas de incubação a 37 °C. A porcentagem de lise específica é calculada como: Equation10. Liberação experimental-liberação espontânea/Liberação total-liberação espontânea x 100. No método 2, a atividade de citotoxicidade é medida com a detecção de Caspase 3 clivada em células alvo por Citometria de fluxo. As células cancerosas alvo são manipuladas para expressar o peptídeo mutante em conjunto com o alelo MHC-I adequado. Células alvo com transdução simulada (isto é, não expressando o peptídeo mutante) são usadas como um controle negativo. As células são marcadas com CFSE para distinguir as mesmas das PBMCs estimuladas usadas como células efetoras. As células alvo e efetoras são cocultivadas por 6 horas antes de serem coletadas. A coloração intracelular é realizada para detectar a forma clivada de Caspase 3 nas células cancerosas alvo positivas de CFSE. A porcentagem de lise específica é calculada como: Equação 11. Clivagem experimental de Caspase 3/clivagem espontânea de Caspase 3 (medida na ausência de expressão de peptídeo mutante) x 100. O ensaio de citotoxicidade do método 2 é fornecido na seção de materiais e métodos do Exemplo 25 no presente documento. Exemplo 31- Respostas de célula T CD8+ melhoradas in vivo com o uso de iniciadores longos e iniciadores curtos sequencialmente
[0819] A vacinação com peptídeos de iniciador longo pode induzir respostas de célula T tanto CD4+ quanto CD8+, dependendo do processamento e apresentação dos peptídeos. A vacinação com epítopos de iniciador curto mínimos foca na geração de respostas de célula T CD8+, mas não exige o processamento de peptídeo antes da apresentação de antígeno. Como tal, qualquer célula pode apresentar o epítopo prontamente, não apenas células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs). Isso pode levar a tolerância de células T que entram em contato com células saudáveis que apresentam antígenos como parte de tolerância periférica. Para contornar isso, a imunização inicial com iniciadores longos permite a preparação de células T CD8+ apenas por APCs que podem processar e apresentar os peptídeos. As imunizações subsequentes intensificam as respostas de célula T CD8+ iniciais. Ensaios de imunogenicidade in vivo
[0820] Dezenove camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-12 semanas de vida (Taconic Biosciences) são aleatória e prospectivamente designados a grupos de tratamento na chegada. Os animais são aclimatados por três (3) dias antes do início do estudo. Os animais são mantidos em ração para roedores estéril LabDiet™ 5053 e água estéril fornecida ad libitum. Os animais no Grupo 1 servem como controles apenas de adjuvante de vacinação e são administrados ácido polinossínico:policitidílico (poliI:C) sozinho a 100 µg em um volume de 0,1 ml administrado por injeção subcutânea (s.c.) no dia 0, 7 e 14. Os animais do Grupo 2 são administrados com 50 µg de cada um dos seis peptídeos mais longos (descritos abaixo) juntamente com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml nos dias 0, 7 e 14. Os animais do Grupo 3 são administrados com 50 µg de cada um dos seis peptídeos mais longos (descritos abaixo) juntamente com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml no dia 0 e equivalentes molares correspondentes dos peptídeos mais curtos correspondentes (descritos abaixo) juntamente com poliI:C a 100 µg s.c. em um volume de 0,1 ml nos dias 7 e
14. Os animais são pesados e monitorados em relação a sua saúde geral diariamente. Os animais são sacrificados por sobredosagem de CO2 no dia 21 de conclusão do estudo, se um animal perder >30 % do seu peso corporal em comparação com o peso no dia 0; ou se um animal foi encontrado moribundo. No sacrifício, os baços são coletados e processados em suspensões de células únicas com o uso de protocolos padrão. Resumidamente, os baços são degradados mecanicamente através de um filtro de 70 µM, peletizados e lisados com tampão de lise ACK (Sigma) antes da ressuspensão em meio de cultura de células. Peptídeos
[0821] Seis neoantígenos murinos previamente identificados são usados com base em sua capacidade demonstrada para induzir respostas de células T CD8+. Para cada neoantígeno, iniciadores curtos (8-11 aminoácidos) correspondentes ao epítopo mínimo foram definidos. São usados longmers correspondendo a 20-27 aminoácidos em torno da mutação.
ELISPOT
[0822] A análise ELISPOT (IFNγ de Camundongo ELISPOT
Reasy-SET-Go; EBioscience) é realizado de acordo com o protocolo do kit.
Resumidamente, um dia antes do dia da análise, as placas de filtro de 96 poços (0,45 µm de tamanho de poro de membrana de PVDF hidrofóbica; EMD Millipore) são ativadas (EtOH a 35 %), lavadas (PBS) e revestidas com anticorpo de captura (1:250; 4 °C O/N). No dia da análise, os poços são lavados e bloqueados (meio; 2 horas a 37 °C). Aproximadamente 2 x 105 células em 100 µl são adicionadas aos poços juntamente com 100 µl de agrupamento de peptídeos de teste 10 mM (shortmers), ou antígeno de controle positivo de PMA/ionomicina, ou veículo.
As células são incubadas com antígeno durante a noite (16-18 horas) a 37 °C.
No dia seguinte, a suspensão de células é descartada e os poços são lavados uma vez com PBS e duas vezes com água desionizada.
Para todas as etapas de lavagem no restante do ensaio, os poços são deixados de molho por 3 minutos em cada etapa de lavagem.
Os poços são então lavados três vezes com tampão de lavagem (PBS + Tween-20 a 0,05 %) e o anticorpo de detecção (1:250) é adicionado a todos os poços.
As placas são incubadas durante duas horas à temperatura ambiente.
A solução de detecção de anticorpos é descartada e os poços são lavados três vezes com tampão de lavagem.
Avidin-HRP (1:250) é adicionado a todos os poços e as placas são incubadas durante uma hora à temperatura ambiente.
A solução do conjugado é descartada e os poços são lavados três vezes com tampão de lavagem e uma vez com PBS.
O substrato (3- amino-9-etil-carbazol, tampão de acetato a 0,1 M, H2O2) é adicionado a todos os poços e o desenvolvimento local é monitorado (aproximadamente 10 minutos). A reação do substrato é interrompida lavando os poços com água e as placas podem secar ao ar durante a noite. As placas são analisadas em um leitor ELISPOT (Cellular Technology Ltd.) com software que o acompanha. Os pontos correspondentes ao número de células T que produzem IFNγ são relatados como o número absoluto de pontos por número de células T plaqueadas. Exemplo 32 - Detecção de peptídeos BTK mutantes por espectrometria de massa
[0823] As células 293T são transduzidas com um vetor lentiviral que codifica várias regiões de um peptídeo BTK mutante. 50-100 milhões das células transduzidas que expressam peptídeos codificados pelo peptídeo BTK mutante são cultivadas e os peptídeos são eluídos de complexos de peptídeo de HLA usando uma lavagem ácida. Os peptídeos eluídos foram, então, analisados por MS/MS. Exemplo 33 – Peptídeos BTK mutantes produzem epítopos fortes em múltiplos alelos.
[0824] Múltiplos peptídeos contendo os neoepítopos são expressos ou carregados em células que apresentam antígeno (APCs). A espectrometria de massa foi, então, realizada e a afinidade dos neoepítopos para os alelos HLA indicados e estabilidade dos neoepítopos com os alelos HLA são determinadas. Exemplo 34- Múltiplos Neoepítopos de BTK Provocam Respostas de célula CD8+ T
[0825] As amostras de PBMC de um doador humano podem ser usadas para realizar indução de célula T específica de antígeno. As induções de célula CD8+ T são analisadas após a fabricação de células T. As amostras de célula podem ser tomadas em diferentes intervalos de tempo para análise. Os multímeros de pMHC são usadas para monitorar a fração de células CD8+ específicas de antígeno nas culturas de indução. Exemplo 35 – Especificidades de HLA previsto de neopeptídeos de BTK mutantes
[0826] Neopeptídeos de BTK específicos foram executados no algoritmo RECON proprietário para prever as especificidades de HLA. Neopeptídeos foram classificados com base nas afinidades de ligação previstas. A Tabela 38 descreve as especificidades de alelos que são adicionalmente classificadas com base em afinidade alta para baixa. Um valor de classificação menor indica afinidade mais forte. A Tabela 38 demonstra adicionalmente que os neopeptídeos BTK mutantes identificados e caracterizados no presente documento têm epítopos fortes com múltiplos alelos. A Tabela 38 descreve as especificidades de alelos que são adicionalmente classificadas com base em afinidade alta para baixa. IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR (SEQ ID BTK, C481S NO: 3575)
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PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B44:02 17 3672) TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B37:01 19 3673) TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B18:01 20 3674) TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B15:09 23 3675) TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B41:01 25 3676) TEYMANGSL (SEQ ID NO: HLA-B50:01 25 3677) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B40:01 7 3678) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B44:03 15 3679) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B49:01 17 3680) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B44:02 21 3681) TEYMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B40:02 24 3682) TEYMANGSLLNY (SEQ ID HLA-B44:03 21 NO: 3683) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-B15:09 14 3684)
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PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C03:04 15 3685) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C03:03 16 3686) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C17:01 16 3687) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C03:02 21 3688) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C14:03 22 3689) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C14:02 23 3690) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C04:01 24 3691) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-C02:02 26 3692) YMANGSLL (SEQ ID NO: HLA-A01:01 26 3693) YMANGSLLN (SEQ ID NO: HLA-A29:02 25 3694) YMANGSLLN (SEQ ID NO: HLA-A01:01 25 3695) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A01:01 6 3696) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A29:02 10 3697)
IFIITEYMANGSLLNYLREMRHR (SEQ ID BTK, C481S NO: 3575)
PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A36:01 16 3698) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A03:01 16 3699) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-B46:01 18 3700) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A25:01 19 3701) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-B15:01 20 3702) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A26:01 20 3703) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A30:02 21 3704) YMANGSLLNY (SEQ ID NO: HLA-A32:01 24 3705) Exemplo 36 Afinidade e Estabilidade de Neopeptídeos BTK Mutantes
[0827] Os múltiplos peptídeos contendo neoepítopos na Tabela abaixo foram expressos ou carregados em células que apresentam antígeno. A espectrometria de massa foi, então, realizada e a afinidade dos neoepítopos para alelos HLA indicados foi determinada, e a estabilidade dos neoepítopos com os alelos HLA foi determinada. A Tabela 39 mostra as respectivas afinidade e estabilidade dos peptídeos BTK mutantes.
Gene Alelo Sequência de Afinidade Estabilidade HLA Peptídeos (nM) (1/2hr) BTK, A01.01 YMANGSLLNY 13,24495 0,866167 C481S (SEQ ID NO: 3706) BTK, A01.01 MANGSLLNY 439,029 0,216408 C481S (SEQ ID NO: 3707) BTK, A03.01 MANGSLLNY 35,62463 0,237963 C481S (SEQ ID NO: 3708) BTK, A03.01 YMANGSLLNY 95,93212 0,279088 C481S (SEQ ID NO: 3709) BTK, A11.01 MANGSLLNY 535,6333 NB C481S (SEQ ID NO: 3710) BTK, A11.01 YMANGSLLNY 974,2881 NB C481S (SEQ ID NO: 3711) BTK, A24.02 EYMANGSLL 4,961145 5,716141 C481S (SEQ ID NO: 3712) BTK_C481S A02.01 SLLNYLREM 67,69132 3,043604 (SEQ ID NO: 3713) BTK_C481S A02.01 MANGSLLNYL 1006,566 0 (SEQ ID NO: 3714)
Gene Alelo Sequência de Afinidade Estabilidade HLA Peptídeos (nM) (1/2hr) BTK_C481S A02.01 YMANGSLLN 3999,442 0 (SEQ ID NO: 3715) BTK_C481S B07.02 SLLNYLREM 865,8805 0 (SEQ ID NO: 3716) BTK_C481S B07.02 MANGSLLNYL 16474,59 0 (SEQ ID NO: 3717) BTK_C481S B08.01 SLLNYLREM 959,6542 0 (SEQ ID NO: 3718) BTK_C481S B08.01 MANGSLLNYL 18463,09 0 (SEQ ID NO: 3719) Exemplo 37 - Detecção de peptídeos EGRF mutantes por espectrometria de massa
[0828] As células 293T são transduzidas com um vetor lentiviral que codifica várias regiões de um peptídeo EGFR mutante. 50-100 milhões das células transduzidas que expressam peptídeos codificados pelo peptídeo EGFR mutante são cultivadas e os peptídeos são eluídos de complexos de peptídeo de HLA usando uma lavagem ácida. Os peptídeos eluídos foram, então, analisados por MS/MS. Exemplo 38 – Peptídeos EGFR mutantes produzem epítopos fortes em múltiplos alelos
[0829] Múltiplos peptídeos contendo os neoepítopos são expressos ou carregados em células que apresentam antígeno (APCs). A espectrometria de massa foi, então, realizada e a afinidade dos neoepítopos para os alelos HLA indicados e estabilidade dos neoepítopos com os alelos HLA são determinadas. Exemplo 39- Múltiplos Neoepítopos de EGFR Provocam Respostas de célula CD8+ T
[0830] As amostras de PBMC de um doador humano podem ser usadas para realizar indução de célula T específica de antígeno. As induções de célula CD8+ T são analisadas após a fabricação de células T. As amostras de célula podem ser tomadas em diferentes intervalos de tempo para análise. Os multímeros de pMHC são usadas para monitorar a fração de células CD8+ específicas de antígeno nas culturas de indução. Exemplo 40 – Especificidades de HLA previsto de neopeptídeos de EGFR
[0831] Neopeptídeos específicos foram executados no algoritmo RECON proprietário para prever as especificidades de HLA. Neopeptídeos foram classificados com base nas afinidades de ligação previstas. A Tabela 43 descreve as especificidades de alelo que são adicionalmente classificas com base em afinidade alta a baixa. Um valor de classificação menor indica afinidade mais forte. A Tabela 43 também demonstra que os neopeptídeos de EGFR mutantes identificados e caracterizados no presente documento têm epítopos fortes com múltiplos alelos. Tabela 43
PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO LIMQLMPF (SEQ ID NO: 3720) HLA-C03:02 5 LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 3721) HLA-C12:03 10
PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO HLA-A01:01 13 HLA-C15:02 13 HLA-B57:01 14 HLA-B57:03 15 HLA-A36:01 16 HLA-C12:02 18 HLA-C03:03 19 HLA-B58:02 21 QLIMQLMPF (SEQ ID NO: 3722) HLA-B15:01 15 HLA-A26:01 21 STVQLIMQL (SEQ ID NO: 3723) HLA-A68:02 1 HLA-C15:02 2 HLA-A25:01 3 HLA-B57:03 4 HLA-C12:02 4 HLA-A26:01 5 HLA-C12:03 6 HLA-C06:02 7 HLA-C03:03 8 HLA-A30:01 9 HLA-C02:02 9 HLA-A11:01 10 HLA-A32:01 10 HLA-A02:04 10 HLA-A68:01 11 HLA-B15:09 11 HLA-C03:04 12 HLA-B38:01 18
PEPTÍDEO ALELO CLASSIFICAÇÃO HLA-B57:01 19 HLA-A02:03 20 HLA-C08:01 21 HLA-B35:01 21 HLA-B40:01 21 STVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3724) HLA-A26:01 15 HLA-B57:01 17 TSTVQLIMQL (SEQ ID NO: 3725) HLA-C15:02 17 TVQLIMQL (SEQ ID NO: 3726) HLA-C17:01 11 HLA-B08:01 12 HLA-B42:01 13 HLA-B14:02 15 HLA-B37:01 15 HLA-B15:09 17 TVQLIMQLM (SEQ ID NO: 3727) HLA-B35:03 21 VQLIMQLM (SEQ ID NO: 3728) HLA-B52:01 8 HLA-B14:02 19 HLA-B37:01 19 Exemplo 41 Afinidade e Estabilidade de Neopeptídeos de EGFR Mutantes
[0832] Os múltiplos peptídeos contendo neoepítopos na Tabela abaixo foram expressos ou carregados em células que apresentam antígeno. A espectrometria de massa foi, então, realizada e a afinidade dos neoepítopos para alelos HLA indicados foi determinada, e a estabilidade dos neoepítopos com os alelos HLA foi determinada. A Tabela 44 mostra as respectivas afinidade e estabilidade dos peptídeos EGRF mutantes.
Tabela 44 Gene Alelo Sequência de Afinidade Estabilidade HLA Peptídeos (nM) (1/2hr) EGFR, A01.01 LTSTVQLIM 2891,111 0,103721 T790M (SEQ ID NO: 3729) EGFR_T790M A01.01 CLTSTVQLIM 8276,876 0 (SEQ ID NO: 3730) EGFR_T790M A02.01 MQLMPFGCLL 16,26147 0,381118 (SEQ ID NO: 3731) EGFR_T790M A02.01 MQLMPFGCL 116,3352 0,368273 (SEQ ID NO: 3732) EGFR_T790M A02.01 LIMQLMPFGC 132,4766 0,381284 (SEQ ID NO: 3733) EGFR_T790M A02.01 QLIMQLMPF 192,8406 0,34067 (SEQ ID NO: 3734) EGFR_T790M A02.01 CLTSTVQLIM 537,1391 0 (SEQ ID NO: 3735) EGFR_T790M A02.01 IMQLMPFGCL 653,1065 0,515559 (SEQ ID NO: 3736) EGFR_T790M A02.01 IMQLMPFGC 1205,368 0,370112 (SEQ ID NO:
Gene Alelo Sequência de Afinidade Estabilidade HLA Peptídeos (nM) (1/2hr) 3737) EGFR_T790M A02.01 LIMQLMPFG 3337,708 0 (SEQ ID NO: 3738) EGFR_T790M A02.01 VQLIMQLMPF 4942,892 0 (SEQ ID NO: 3739) EGFR_T790M A02.01 QLIMQLMPFG 5214,668 0 (SEQ ID NO: 3740) EGFR_T790M A02.01 STVQLIMQL 7256,773 0 (SEQ ID NO: 3741) EGFR_T790M A24.02 QLIMQLMPF 2030,807 0,368673 (SEQ ID NO: 3742) EGFR_T790M A24.02 VQLIMQLMPF 4103,131 0 (SEQ ID NO: 3743) EGFR_T790M A24.02 IMQLMPFGCL 14119,38 0 (SEQ ID NO: 3744) EGFR_T790M A24.02 MQLMPFGCLL 18857,47 0 (SEQ ID NO: 3745) EGFR_T790M B07.02 MQLMPFGCL 1589,188 0 (SEQ ID NO:
Gene Alelo Sequência de Afinidade Estabilidade HLA Peptídeos (nM) (1/2hr) 3746) EGFR_T790M B08.01 QLIMQLMPF 330,1933 0 (SEQ ID NO: 3747) EGFR_T790M B08.01 IMQLMPFGCL 427,3913 0 (SEQ ID NO: 3748) EGFR_T790M B08.01 MQLMPFGCL 4931,727 0 (SEQ ID NO: 3749) EGFR_T790M B08.01 MQLMPFGCLL 11244,9 0 (SEQ ID NO: 3750) EGFR_T790M B08.01 VQLIMQLMPF 16108,18 0 (SEQ ID NO: 3751) EGFR_T790M B08.02 QLIMQLMPF 5590,3 ND (SEQ ID NO: 3752)

Claims (55)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: (a) pelo menos um polipeptídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo que compreende uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, cada uma, compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma sequência de C-terminal da primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se sobrepõe a uma sequência de N-terminal da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes; em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência PGRPLQTHVL
PEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPCS
MLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2); ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes ou a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
3. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos mutantes compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-3, caracterizada pelo fato de que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2 compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos da sequência PGRPLQTHVL PEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGL (SEQ ID NO: 3).
5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4, caracterizada pelo fato de que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência EPCSMLTGPP ARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 4).
6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem pelo menos 14 aminoácidos mutantes.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos 3 sequências de peptídeos de GATA3 mutantes.
8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos dois polipeptídeos.
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende adicionalmente uma terceira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que a terceira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência SEQ ID NO:
2.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o terceiro peptídeo mutante de GATA3 compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2.
11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01.
12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de peptídeos de GATA3 mutantes que se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por: (a) um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-A24:02; (b) um alelo HLA-A02:01 e um alelo HLA-B08:01; (c) um alelo HLA-A24:02 e um alelo HLA-B08:01; ou (d) alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02 e um alelo HLA-B08:01.
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizada pelo fato de que, (a) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA- A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA-B08:01; e (b) a segunda sequência de peptídeos de GATA3 se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada por um alelo HLA-A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 ou um alelo HLA- B08:01; em que a primeira sequência de peptídeos GATA3 mutantes se liga ou se prevê que se ligue a uma proteína codificada pelo alelo HLA diferente daquele da segunda sequência de peptídeos GATA3 mutantes.
14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos GATA 3 mutantes se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma afinidade menor que 500 nM.
15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos mutantes se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA com uma estabilidade maior que 1 hora.
16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos uma das seguintes sequências: (a) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3753), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3754), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3755), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 3756), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 3757), APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 3758), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3759), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3760), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3761); e/ou (b) MFLKAESKI (SEQ ID NO: 3762) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3763) (c) VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 3764), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 3765) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 3766); e/ou (d) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3767), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 3768), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 3769), GPPARVPAV (SEQ ID NO: 3770), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3771), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3772) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3773) e/ou (e) IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 3774), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3775), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 3776), LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 3777), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 3778), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3779), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3780), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 3781) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3782).
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polipeptídeo compreende pelo menos duas das seguintes sequências: (a) TLQRSSLWCL (SEQ ID NO: 3783), VLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3784), HVLPEPHLAL (SEQ ID NO: 3785), ALQPLQPHA (SEQ ID NO: 3786), AIQPVLWTT (SEQ ID NO: 3787),
APAIQPVLWTT (SEQ ID NO: 3788), SMLTGPPARV (SEQ ID NO: 3789), MLTGPPARV (SEQ ID NO: 3790), e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3791); e/ou (b) MFLKAESKI (SEQ ID NO: 3792) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3793); e/ou (c) VLWTTPPLQH (SEQ ID NO: 3794), YMFLKAESK (SEQ ID NO: 3795) e/ou KIMFATLQR (SEQ ID NO: 3796); e/ou (d) FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3797), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 3798), QPVLWTTPPL (SEQ ID NO: 3799), GPPARVPAV (SEQ ID NO: 3800), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3801), KPKRDGYMF (SEQ ID NO: 3802) e/ou KPKRDGYMFL (SEQ ID NO: 3803) e/ou (e) IMKPKRDGYM (SEQ ID NO: 3804), MFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3805), FLKAESKIMF (SEQ ID NO: 3806), LHFCRSSIM (SEQ ID NO: 3807), EPHLALQPL (SEQ ID NO: 3808), FATLQRSSL (SEQ ID NO: 3809), ESKIMFATL (SEQ ID NO: 3810), FLKAESKIM (SEQ ID NO: 3811) e/ou YMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3812).
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que as sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem: (a) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b); (b) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c); (c) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d);
(d) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (a) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e); (e) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c); (f) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d); (g) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (b) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e); (h) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d); (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (c) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e); ou (j) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (d) e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de (e).
19. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizada pelo fato de que as primeiras sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, e a segunda sequência de peptídeos GATA 3 mutantes compreendem um peptídeo da Tabela 5 e/ou Tabela 6.
20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreende um primeiro neoepítopo de proteína de GATA3 e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes de peptídeo compreende um segundo neoepítopo de uma proteína GATA mutante, em que a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes é diferente da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, e em que o primeiro neoepítopo compreende pelo menos um aminoácido mutante e o segundo neoepítopo compreende o mesmo aminoácido mutante.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizada pelo fato de que cada uma dentre a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e as segundas sequências de peptídeos de GATA3 mutantes que compreendem os pelo menos oito aminoácidos contíguos é representada por uma fórmula de [Xaa]F-[Xaa]N-[Xaa]C ou [Xaa]N-[Xaa]C-[Xaa]F, em que cada Xaa é um aminoácido, em que [Xaa]N e [Xaa]C, cada um, compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por uma porção diferente do gene de GATA3, em que [Xaa]F é qualquer sequência de aminoácidos, em que [Xaa]N é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que [Xaa]C compreende o pelo menos um aminoácido mutante e é codificado em um quadro de leitura do tipo selvagem do gene de GATA3, em que N é um número inteiro de 0-100, em que C é um número inteiro de 1-100, em que F é um número inteiro de 0-100, em que a soma de N e M é pelo menos 8.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que cada Xaa de
[Xaa]F é um resíduo de lisina e F é um número inteiro de 1- 100, 1-10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que F é 3, 4 ou
5.
24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizada pelo fato de que cada uma das sequências de peptídeos de GATA3 mutantes está presente em uma concentração de pelo menos 50 µg/ml- 400 µg/ml.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24, caracterizada pelo fato de que as primeiras sequências de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem uma sequência da Tabela 1 ou 2.
26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, sendo a composição caracterizada por compreender adicionalmente um agente imunomodulador ou um adjuvante.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é poliICLC.
28. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que a uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em ESKIMFATLQRSSL (SEQ ID NO: 3813), KPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3814), SMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3815), EPCSMLTGPPARVPAVPFDLH (SEQ ID NO: 3816),
LHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKI (SEQ ID NO: 3817), GPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRD (SEQ ID NO: 3818) e KPKRDGYMFLKAESKIMFATLQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 3819).
29. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, sendo a composição farmacêutica caracterizada por compreender um modificador de pH presente em uma concentração de 0,1 mM –1 mM.
30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, sendo a composição farmacêutica caracterizada por compreender um modificador de pH presente em uma concentração de 1 mM – 10 mM.
31. Método de síntese de um peptídeo de GATA3, em que o peptídeo compreende uma sequência de pelo menos dois aminoácidos contíguos selecionados a partir do grupo que consiste em Xaa-Cys, Xaa-Ser, e Xaa-Thr, em que Xaa é qualquer aminoácido, sendo o método caracterizado por compreender: (a) acoplar pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo a um aminoácido ou derivado do mesmo de um peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo para obter um peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo, em que o dipeptídeo ou derivado do mesmo compreende uma fração de pseudoprolina; (b) acoplar um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo; e (c) clivar o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo a partir da resina.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, sendo o método caracterizado por compreender desproteger o peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-32, caracterizado pelo fato de que o aminoácido ou derivado do mesmo ao qual o pelo menos um dipeptídeo ou derivado do mesmo é acoplado é selecionado a partir do grupo que consiste em Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, Tyr, His e Val.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-33, caracterizado pelo fato de que o um ou mais aminoácidos selecionados, peptídeos pequenos ou derivados dos mesmos opcionalmente acoplados ao peptídeo de GATA3 contendo pseudoprolina ou derivado do mesmo compreendem Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc- Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val- OH, Fmoc-His(Trt)-OH e Fmoc-His(Boc)-OH.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-34, caracterizado pelo fato de que um aminoácido de N-terminal ou derivado do mesmo do peptídeo de GATA3 ou derivado do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fmoc-Ala-OH∙H2O, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc- Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-
Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val- OH, Fmoc-His(Trt)-OH e Fmoc-His(Boc)-OH.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-35, caracterizado pelo fato de que a fração de pseudoprolina é (a) Fmoc-Ser(tBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH, (b) Fmoc-Ala-Thr(psi(Me,Me)pro)-OH, (c) Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(psi(Me,Me)pro)-OH, (d) Fmoc-Leu- Thr(psi(Me,Me)pro)-OH, (e) Fmoc-Leu-Cys(psi(Dmp,H)pro)-OH.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-36, caracterizado pelo fato de que (a) Xaa-Ser é Ser-Ser, (b) Xaa-Ser é Glu-Ser, (c) Xaa-Thr é Ala-Thr, (d) Xaa-Thr é Leu-Thr ou (e) Xaa-Cys é Leu-Cys.
38. Método de tratamento de um indivíduo com câncer caracterizado por compreender administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-30.
39. Método de identificação de um indivíduo com câncer como um candidato para uma terapêutica, sendo o método caracterizado por compreender: identificar o indivíduo como um que expressa uma proteína codificada por um alelo HLA- A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01, em que a terapêutica compreende (a) pelo menos um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes compreende pelo menos um aminoácido mutante e é fragmento de pelo menos 8 aminoácidos contíguos de uma proteína de GATA3 mutante proveniente de uma mutação em um gene de GATA3 de uma célula cancerosa; ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo, em que cada uma dentre uma ou mais sequências de peptídeos de GATA3 mutantes ou uma porção das mesmas se liga a uma proteína codificada por um alelo HLA- A02:01, um alelo HLA-A24:02, um alelo HLA-A03:01, um alelo HLA-B07:02 e/ou um alelo HLA-B08:01.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, sendo o método caracterizado por compreender adicionalmente administrar a terapêutica ao indivíduo.
41. Método de tratamento de um indivíduo com câncer caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende: (a) pelo menos um polipeptídeo que compreende uma primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e uma segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, em que (i) a primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes e a segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes, cada uma, compreendem pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1, e (ii) uma sequência de C-terminal da primeira sequência de peptídeos de GATA3 mutantes se sobrepõe a uma sequência de N-terminal da segunda sequência de peptídeos de GATA3 mutantes; em que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência PGRPLQTHVL
PEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEPC
SMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2); ou (b) pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica o pelo menos um polipeptídeo, em que os alelos HLA expressos pelo indivíduo são desconhecidos no momento da administração.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que os pelo menos 8 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1 compreendem pelo menos um aminoácido da sequência:
PGRPLQTHVLPEPHLALQPLQPHADHAHADAPAIQPVLWTTPPLQHGHRHGLEP
CSMLTGPPARVPAVPFDLHFCRSSIMKPKRDGYMFLKAESKIMFAT LQRSSLWCLCSNH (SEQ ID NO: 2).
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-42, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer ovarino, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer colorretal, câncer do endométrio e leucemia linfocítica crônica (CLL).
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um câncer de mama que é resistente à terapia antiestrogênio, é um câncer de mama de MSI, é um câncer de mama metastático, é um câncer de mama negativo para Her2, é um câncer de mama positivo para Her2, é um câncer de mama negativo para ER, é um câncer de mama positivo para ER, câncer de mama positivo para PR, câncer de mama negativo para PR ou qualquer combinação dos mesmos.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama expressa um receptor de estrogênio com uma mutação.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-45, caracterizado por compreender adicionalmente administrar pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional ou modalidade é cirurgia, um inibidor de ponto de verificação, um anticorpo ou fragmento do mesmo, um agente quimioterápico, radiação, uma vacina, uma molécula pequena, uma célula T, um vetor e APC, um polinucleotídeo, um vírus oncolítico ou qualquer combinação dos mesmos.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é um agente anti-PD-1 e agente anti- PD-L1, um agente anti-CTLA-4, um agente anti-CD40, letrozol, fulvestrant, um inibidor de PI3 quinase e/ou um inibidor de CDK 4/6.
49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é palbociclibe, ribociclibe, abemaciclibe, seliciclibe, dinaciclibe, milciclibe, roniciclibe, atuveciclibe, briciclibe, riviciclibe, seliciclibe, trilaciclibe, voruciclibe ou qualquer combinação dos mesmos.
50. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é palbociclibe (PD0332991); abemaciclibe (LY2835219); ribociclibe (LEE 011); voruciclibe (P1446A-05); fascaplisina; arciriaflavina; 2-bromo-12,13- di-hidro-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol-5,7(6H)- diona; 3-amino tioacridona (3-ATA), trans-4-((6-(etilamino)- 2-((1-(fenilmetil)-1H-indol-5-il)amino)-4- pirimidinil)amino)-ciclo-hexano (CINK4); 1,4- dimetoxiacridina-9(10H)-tiona (NSC 625987); 2-metil-5-(p- tolilamino)benzo[d]tiazol-4,7-diona (riuvidina); flavopiridol (alvocidibe); seliciclibe; dinaciclibe; milciclibe; roniciclibe; atuveciclibe; briciclibe; riviciclibe; trilaciclibe (G1T28); ou qualquer combinação dos mesmos.
51. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é Wortmanina, Demetoxiviridina, LY294002, hibiscona C, Idelalisibe, Copanlisibe, Copanlisibe, Taselisibe, Perifosine, Buparlisibe, Copanlisibe, Alpelisibe (BYL719), Umbralisibe, (TGR 1202), Copanlisibe (BAY 80-6946), PX-866, Dactolisibe, CUDC-907, Voxtalisibe (SAR245409, XL765), CUDC-907, ME-401, IPI-549, SF1126, RP6530, INK1117, pictilisibe (GDC-0941), XL147 (SAR245408), Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100–115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477 ou AEZS-
136.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-51, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama metastático ou recorrente.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-52, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo que teve progressão da doença após a terapia endócrina em combinação com um inibidor de CDK 4/6; ou em que o indivíduo não recebeu terapia sistêmica anterior.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-53, sendo o método caracterizado por compreender determinar uma situação de mutação de um gene de receptor de estrogênio de células do indivíduo.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as células são células isoladas ou células enriquecidas para expressão de receptor de estrogênio.
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