CN114630683A - 包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 - Google Patents
包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分。本发明的用于治疗癌症的药物组合物包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分，与仅施用现有痘苗病毒的情况相比，该药物组合物具有优异的抗癌作用和安全性。因此，本发明的包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分的药物组合物可以有效地用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分。
背景技术
溶瘤病毒具有优异的肿瘤特异性靶向能力、在癌细胞中的增殖能力和癌细胞杀伤能力。最近，已经进行了各种基于溶瘤病毒的临床研究。2015年，随着基于单纯疱疹病毒的溶瘤病毒talimogene laherparepvec(T-Vec)作为晚期黑色素瘤的治疗剂成功商业化，美国和欧洲开启了溶瘤病毒领域的时代。
最近，溶瘤病毒的有用性超过了它们自身的功效，并且病毒激活了肿瘤免疫，从而显示出它们作为与另一种免疫治疗剂联合使用的治疗剂的潜力。直到溶瘤病毒发展的早期阶段2000年，由病毒的癌细胞特异性增殖引起的病毒直接杀伤作用才相对更为重要。然而，随后的临床研究发现，肿瘤免疫激活而非直接的癌细胞杀伤作用是关键的机制，。基于这一发现，最近正在开发包含联合施用的溶瘤病毒和免疫治疗剂如免疫检查点抑制剂的治疗剂。这是因为已知溶瘤病毒将抑制免疫的肿瘤微环境转变为适合免疫治疗的肿瘤微环境。
在基于痘苗病毒的溶瘤病毒的多项临床研究中，溶瘤病毒治疗可能导致急性肿瘤坏死、持久应答或完全应答，但在某些情况下，可能导致难以预测的结果(药效动力学可变性)，例如进行性疾病或过早死亡。例如，对于基于痘苗病毒的Pexa-vec，在1期临床试验中，一些患者在溶瘤病毒治疗后一个月内过早死亡，这与持续的全身性炎症反应和主要器官功能障碍有关。此外，溶瘤病毒治疗后观察到的短暂流感症状(高热)和低血压是溶瘤病毒治疗后最常见的不良事件。
同时，在使用溶瘤病毒进行治疗中，尚未有关于药物引起嗜中性粒细胞增加对治疗结果的影响的准确报道。对溶瘤病毒施用有反应的第一固有免疫细胞是嗜中性粒细胞，嗜中性粒细胞在人体内的半衰期短，不到20小时。临床上，虽然在接受药物(如氯氮平)治疗或急性炎症和急性损伤的患者中观察到大量嗜中性粒细胞(Liao Y et al，PloS One，8(7)，2013)，嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的增加不被认为是异常反应，因为这不包括在不良事件通用术语标准(CTCAE)中。
因此，需要研究嗜中性粒细胞数量变化对溶瘤病毒治疗的影响。
发明内容
技术问题
因此，作为为了增强用作溶瘤病毒的痘苗病毒的抗癌效果而进行研究的结果，本发明人发现在向患有癌症的个体施用痘苗病毒时，与现有的单独施用牛痘病毒的情况相比，当联合施用降低嗜中性粒细胞水平的抑制剂时，共同施用可以显著降低全身炎症反应以确保安全使用。此外，本发明人发现当联合施用抑制剂时，痘苗病毒的癌细胞特异性选择性和增殖能力得到提高，从而完成了本发明。推测该抑制剂抑制粒细胞生成，从而降低嗜中性粒细胞水平，从而提高溶瘤病毒的抗癌作用。
解决方案
为实现上述目的，在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的个体施用痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂。
在本发明的又一方面，提供了包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的再一方面，提供了一种抗癌佐剂，该抗癌佐剂包含粒细胞生成抑制剂作为活性成分。
有益效果
本发明的用于治疗癌症的药物组合物包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分，与仅施用痘苗病毒的常规情况相比，该药物组合物具有优异的抗癌效果和安全性。因此，本发明的包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分的药物组合物可以有效地用于治疗癌症。
附图说明
图1示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用野生型痘苗病毒(WesternReserve株痘苗病毒，WR)和羟基脲(HU)，然后在第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积而获得的结果。
图2示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用野生型痘苗病毒(WR)和HU，然后在第0、3、7、10和14天测量体重而获得的结果。
图3示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WRVVtk-)和HU(60mg/kg)，然后在第0、3、7、10、14、17和21天测量肿瘤体积而获得的结果，该重组痘苗病毒(WRVVtk-)通过缺失WR中的TK基因而获得。
图4示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WRVVtk-)和HU(30mg/kg)，然后在第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积而获得的结果。
图5示出了通过在向小鼠黑色素瘤移植小鼠(B16F10)施用重组痘苗病毒(VV_DD)和HU的前1天和施用后的第4天和第7天测量肿瘤体积而获得的结果，该重组痘苗病毒(VV_DD)通过同时缺失WR中的TK基因和痘苗病毒生长因子(VGF)基因而获得。
图6示出了通过向人肺癌细胞(NCI-H460)移植小鼠施用重组痘苗病毒(WOTS-418)和HU，然后在第0、5、10、12和15天测量肿瘤体积而获得的结果。
图7示出了通过向人肺癌细胞(NCI-H460)移植小鼠施用重组痘苗病毒(WOTS-418)和HU，然后测量存活率而获得的结果。
图8示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(VVtk-)和人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)或HU，然后测量小鼠肿瘤体积而获得的结果。
图9示出了通过从已施用重组痘苗病毒(VVtk-)和人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)或HU的小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)分离脾脏中的淋巴细胞，将淋巴细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果。
图10示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-)和HU，然后测量小鼠肿瘤体积而获得的结果。
图11示出了通过从已施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-)和HU的小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)分离T淋巴细胞，将T淋巴细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果。
图12示出了通过从已施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-)和HU的小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)分离脾细胞，将脾细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果。
图13示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-)和HU，然后在第22天测量肿瘤体积而获得的结果。
图14示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-)和HU，然后观察脾组织中CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖而获得的结果。
图15示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1)施用重组痘苗病毒(OTS-412)和HU，然后观察血液和脾组织中CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖而获得的结果。
图16示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1)中的左侧肿瘤施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和HU，然后测量左侧肿瘤体积而获得的结果。
图17示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1)中的左侧肿瘤施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和HU，然后测量右侧肿瘤体积而获得的结果。
图18示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WR)和HU，然后在第22天进行染色以确定重组痘苗病毒在小鼠肿瘤组织中的分布而获得的结果。
图19示出了通过向正常小鼠施用野生型痘苗病毒(WR)、或野生型痘苗病毒(WR)和HU，然后确认野生型痘苗病毒在肝组织和肾组织中的分布而获得的结果。
图20示出了向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用盐水、HU、重组痘苗病毒(OTS-412)、重组痘苗病毒和重组人粒细胞集落刺激因子(OTS-412+rhG-CSF)、或重组痘苗病毒和HU(OTS-412+HU)后各组小鼠的嗜中性粒细胞绝对计数。
图21示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用盐水、重组痘苗病毒或重组痘苗病毒(WR VVtk-)和HU后在各组中测量的小鼠血液嗜中性粒细胞计数。
图22示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用盐水、重组痘苗病毒或重组痘苗病毒(WOTS-418)和HU后，在各组中测量的小鼠血液嗜中性粒细胞计数。
图23示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用盐水、来那度胺(lenalidomide)或HU后，在各组中测得的小鼠血液嗜中性粒细胞计数。
图24示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用盐水、重组痘苗病毒、重组痘苗病毒(WOTS-418)和来那度胺、或重组痘苗病毒和HU后，在各组中测量的小鼠血液嗜中性粒细胞计数。
图25示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和来那度胺后测量的小鼠肿瘤体积。
图26示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和帕布昔利布(palbociclib)后测量的小鼠肿瘤体积。
图27示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和帕布昔利布后测量的小鼠体重。
图28示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、PD-1抑制剂和HU后第0天、第4天、第10天、第14天、第17天和第21天测量的小鼠肿瘤体积。
图29示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、CTLA-4抑制剂和HU后第0天、第4天、第10天、第14天和第17天测量的小鼠肿瘤体积。
图30示出了在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、PD-L1抑制剂和HU后第0天、第4天、第10天、第14天、第17天和第21天测量的小鼠肿瘤体积。
图31示出了在向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1)施用溶瘤病毒(WR VVtk-)、CTLA-4抑制剂和HU后第0天、第3天、第7天、第10天和第14天测量的小鼠肿瘤体积。
图32示出了在向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1)施用溶瘤病毒(WOTS-418)、PD-L1抑制剂和HU后第0天、第3天、第7天、第10天、第14天和第18天测量的小鼠肿瘤体积。
图33说明在向小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca)施用WesternReserve株痘苗病毒(WR)、CTLA-4抑制剂和HU后第0天、第3天和第7天测量的小鼠肿瘤体积。
最佳实施方式
下面将具体描述本发明。
在本发明的一个方面，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂作为活性成分。
药物组合物中所含的痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以同时、依次或以相反的顺序联合施用。具体而言，痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以同时施用。此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后施用痘苗病毒。此外，可以先施用痘苗病毒，然后施用粒细胞生成抑制剂。另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，接着施用痘苗病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
痘苗病毒可以属于但不限于：Western Reserve(WR)、纽约痘苗病毒(New Yorkvaccinia virus，NYVAC)、Wyeth(纽约市卫生局(The New York City Board of Health，NYCBOH))、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛(Tian Tan)、USSR、Tashkent、Evans、International Health Division-J(IHD-J)或International Health Division-White(IHD-W)痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用了WesternReserve株痘苗病毒和Wyeth株痘苗病毒。
痘苗病毒可以是野生型痘苗病毒或重组痘苗病毒。具体而言，重组痘苗病毒可以通过在野生型痘苗病毒中缺失基因或向其中插入外源基因而获得。本文中，在野生型痘苗病毒的基因中，可以缺失编码选自由以下组成的组中的任一种病毒毒力相关基因：胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)、痘苗生长因子(VGF)、WR53.5、F13.5L、F14.5L、A56R、B18R或其组合。
此外，插入的外源基因可以是促进免疫和编码选自由以下组成的组中的任一种的基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)、突变的HSV-TK、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulatingfactor，G-CSF)、胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase，CD)、1型羧酸酯酶、2型羧酸酯酶、干扰素β(Interferon beta，INF-β)、生长抑素受体2及其组合。
具体而言，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因而获得：Western Reserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、Wyeth(纽约市卫生局(NYCBOH))、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、International Health Division-J(IHD-J)或International Health Division-White(IHD-W)痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用通过在WesternReserve株痘苗病毒中缺失TK基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“WR VVtk-”。另外，在本发明的一个实施方式中，使用通过在Wyeth株痘苗病毒中缺失TK基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“Wyeth VVtk-”。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因和VGF基因而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-w痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用通过在WesternReserve株痘苗病毒中缺失TK基因和VGF基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“VV_DD”。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将HSV-TK基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将突变的HSV-TK基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，重组痘苗病毒是通过在Wyeth株痘苗病毒中缺失TK基因并在缺失位置插入编码SEQID NO：1(1-330aa)的HSV-TK片段的基因而获得的，该病毒被命名为“OTS-412”。此外，在本发明的一个实施方式中，使用通过从Western Reserve株痘苗病毒中缺失TK基因并在缺失位置插入编码HSV-TK基因的SEQ ID NO：2的HSV-TK变体的基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“WOTS-418”。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将GM-CSF基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将G-CSF基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将胞嘧啶脱氨酶(CD)基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失TK基因并将生长抑素受体2基因插入该痘苗病毒中而获得：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在痘苗病毒中缺失TK基因并将选自由各自编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、突变的HSV-TK、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、胞嘧啶脱氨酶(CD)或生长抑素受体2的基因组成的组中的任何两种或更多种基因插入该痘苗病毒中来获得，所述痘苗病毒属于：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
此外，重组痘苗病毒可以通过在痘苗病毒中缺失TK基因和VGF基因并将选自由各自编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、突变的HSV-TK、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、胞嘧啶脱氨酶(CD)或生长抑素受体2的基因及其组合组成的组中的任一种基因插入该痘苗病毒中来获得，所述痘苗病毒属于：WesternReserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
如本文所用，术语“基因缺失”是指由于基因的部分或完全缺失或外源基因插入其中而导致的基因不表达。在基因中发生部分缺失的情况下，该基因表达的多肽的N末端或C末端的一些氨基酸可能会缺失。
如本文所用，术语“胸苷激酶(TK)”是指称为胸苷激酶并参与核苷酸生物合成的酶。TK是在细胞和病毒中用于核苷酸生物合成的一种酶。这里，对于细胞而言，正常细胞不再分裂，因此其中不存在TK；即使对于快速分裂的细胞，如毛囊细胞，TK的存在量也不足以让病毒利用。从这些观点来看，病毒通过缺失其中的TK基因而只在存在TK的癌细胞的情况下能够增殖，从而可以选择性地杀死癌细胞。
如本文所用，术语“痘苗生长因子(VGF)”是指与表皮生长因子具有序列同源性并刺激感染细胞周围的细胞增殖的多肽。痘苗病毒在增殖细胞中复制得更好，因此可以有利地用于体内病毒复制。为了使溶瘤病毒更特定地仅在癌细胞中增殖，除了TK基因缺失之外，该病毒还可以另外进行VGF基因缺失。
如本文所用，术语“GM-CSF”被称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是指由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白质。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)和单核细胞。此外，GM-CSF迅速增加巨噬细胞的数量，从而诱导免疫反应。GM-CSF可以是人类来源的并且可以是具有GenBank：AAA52578.1的序列的蛋白质。
如本文所用，术语“CD”被称为胞嘧啶脱氨酶，是指催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶和氨的酶。
如本文所用，术语“G-CSF”被称为粒细胞集落刺激因子，是指由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在受到炎症或内毒素刺激时产生的细胞因子。G-CSF促进嗜中性粒细胞的产生。G-CSF可以是人类来源的(rhGCSF)并且可以是具有GenBank：AAA03056.1的序列的蛋白质。
如本文所用，术语“生长抑素受体2”是指由人类中的SSTR2基因编码的蛋白质。生长抑素受体2主要在肿瘤中表达，并且过度表达生长抑素受体2的神经内分泌肿瘤患者显示出预后改善。生长抑素受体2具有刺激许多细胞(包括癌细胞)凋亡的能力。
骨髓细胞可以是粒细胞，具体地，骨髓细胞可以是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
粒细胞生成抑制剂可以是抑制主要在骨髓中产生的粒细胞(例如，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞)的物质。粒细胞生成抑制剂在减少或抑制体内嗜中性粒细胞(即骨髓细胞中的一种)的数量时可称为嗜中性粒细胞生成抑制剂或包括嗜中性粒细胞生成抑制剂。嗜中性粒细胞也称为中性白细胞，是指在血液中循环的嗜中性粒细胞，该嗜中性粒细胞是主要在骨髓中产生的粒细胞。嗜中性粒细胞是粒细胞的主要成分，正常数量为每1mm3血液中约1,500至约8,000个。嗜中性粒细胞通过吞噬作用吸收侵入体内的外来物质如细菌，并用消化酶(例如过氧化氢、溶酶体等)分解外来物质。
如本文所用，术语“嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)”是指通过白细胞数乘以(×)嗜中性粒细胞百分比获得的数字。
粒细胞生成抑制剂可以是羟基脲、来那度胺、沙利度胺(thalidomide)、他达拉非(tadalafil)、帕布昔利布、烷化剂、蒽环类药物、抗代谢药物、喜树碱(camptothecin)、表鬼臼毒素、丝裂霉素C、紫杉烷或长春碱(vinblastine)。羟基脲可以是具有下式1的结构的化合物：
[式1]
羟基脲被认为是抑制DNA合成的抗癌剂。然而，其确切的作用机制尚未阐明。此外，羟基脲可以含有羟基脲的商品化药物的形式包含在药物组合物中。含有羟基脲的商品化药物的例子可以包括但不限于
DroxiaTM、MylocelTM、
和
胶囊。羟基脲可以口服，也可以肠胃外施用。
来那度胺可以是具有下式2的结构的化合物：
[式2]
来那度胺是用于治疗多发性骨髓瘤等的抗癌剂。另外，来那度胺通过激活肿瘤抑制基因作为抗癌作用来使癌细胞的生长周期停止并抑制癌症增殖。作为免疫调节作用，来那度胺通过激活免疫细胞(例如T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等)来消除肿瘤细胞。此外，来那度胺具有抑制为癌细胞提供营养的新血管的形成的血管生成抑制作用。
沙利度胺可以是具有下式3的结构的化合物：
[式3]
沙利度胺的确切作用机制尚不清楚，但用于治疗多发性骨髓瘤以及麻风病(汉森病)患者的严重皮肤损伤。
他达拉非可以是具有下式4的结构的化合物：
[式4]
帕布昔利布可以是具有下式5的结构的化合物：
[式5]
烷化剂可以是用于恶性肿瘤的化学治疗剂中的氮芥、乙烯衍生物、烷基磺酸衍生物、亚硝基脲类或三嗪类化合物。这些也可以称为烷化剂，因为它们使许多有机化合物、蛋白质或核酸中的氢被烷基取代。通过用烷化剂烷化，可以抑制肿瘤细胞的DNA复制和mRNA转录，并且可以表现出抗肿瘤作用。作为常见的药理作用，烷化剂非特异性地作用于细胞周期的每个阶段，并且可以抑制具有高增殖潜力的细胞分裂。由于烷化剂表现出类似放射线的作用，因此造血不全可能很强烈，并且可能引起免疫抑制。
蒽环类药物是从链霉菌属(Streptomyces)细菌中提取的药物，用于癌症化疗，并且用于治疗多种癌症，包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌和肺癌。最早发现的蒽环类药物是柔红霉素(daunorubicin；商标：Daunomycin)，它是由作为放线菌(Actinomycete)物种的波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)天然产生的。临床上最重要的蒽环类药物包括多柔比星(doxombicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)等。
抗代谢药物可以是通过对微生物或肿瘤细胞代谢或生长的必需代谢物产生拮抗作用来抑制细胞发育和增殖的物质。历史上首次开发出来Slupamine，其被用作化学治疗剂并且对细菌对氨基苯甲酸酯(PABA)具有拮抗作用。抗代谢药物可能包括用于细菌的磺胺类药物、用于恶性肿瘤的嘌呤抗代谢药物(8-氮鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤)、嘧啶抗代谢药物(5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氮杂尿苷)、叶酸抗代谢药物(4-氨蝶呤、甲氨蝶呤)或谷氨酰胺抗代谢药物(捕虫草酶(azerin)、DON)。
喜树碱可以是从植物如喜树(Camptotheca acuminate)(Camptotheca，Happytree)和大叶鹿角藤(Chonemorpha ffagrans)中分离出来的天然抗癌物质。
帕布昔利布可以是具有下式6的结构的化合物：
[式6]
表鬼臼毒素可能是在盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum)的根中天然产生的天然抗癌物质。目前，表鬼臼毒素的衍生物可用于癌症治疗。
表鬼臼毒素可以是具有下式7的结构的化合物：
[式7]
丝裂霉素C可以是灰色链霉菌(Streptomyces griseus)分离的抗生素物质。丝裂霉素C对热稳定，毒性最低，抗癌作用强。丝裂霉素C抑制细胞酶系统和核酸代谢，因此抑制细胞核的分裂，从而阻止恶性肿瘤细胞的增殖。丝裂霉素C的副作用的例子包括出血伴随白细胞减少和血小板减少等。
紫杉烷也称为细胞分裂抑制剂或抗微管抑制剂，可以是通过抑制细胞分裂来抑制癌细胞生长的抗癌剂。紫杉烷可以通过破坏细胞有丝分裂期间使染色体移动的微管来杀死癌细胞。紫杉烷用于治疗各种类型的癌症，如乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌。具体而言，紫杉烷包括紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)等。
长春碱可以是用于治疗各种癌症的长春花生物碱成分的抗癌剂。长春碱最初是从属于夹竹桃(Oleander)科的长春花植物中提取的，目前使用的是合成材料。长春碱是抗癌剂中最广泛使用的药剂，也广泛用于与其他抗癌剂联合治疗。长春碱通过干扰微管的正常功能来防止癌细胞分裂。长春碱可广泛用于睾丸癌、乳腺癌、淋巴瘤、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)等。长春碱最重要的副作用是白细胞和血栓细胞减少，可能会出现诸如胃肠道疾病、血压升高、出汗过多、抑郁、肌肉疼痛、恶心和头痛的副作用。
痘苗病毒的给药量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。给药量可以使得患者接受1×105至1×1018的病毒颗粒、传染性病毒单位(TCID50)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，给药量可以使得患者接受1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各个数值和范围。优选地，痘苗病毒可以1×105pfu至1×1010pfu的剂量施用。更优选地，痘苗病毒可以等于或大于1×105pfu且低于1×109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒以1×105pfu或1×107pfu施用。
此外，粒细胞生成抑制剂可以以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。具体地，粒细胞生成抑制剂可以以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，羟基脲、来那度胺或帕布昔利布作为粒细胞生成抑制剂以25mg/kg/天、30mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天、或100mg/kg/天的剂量施用。取决于给药量，粒细胞生成抑制剂可以每天数次分剂量施用。具体地，粒细胞生成抑制剂可以每天施用1至4次或每天1至2次。
药物组合物还可包含免疫检查点抑制剂(ICI)。
免疫检查点抑制剂是指抑制癌细胞干扰T细胞活化的机制的物质，可以是选自由以下组成的组中的任一种：抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L2抗体、LTF2调节抗体、抗LAG3抗体、抗A2aR抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗VISTA抗体、抗CD47抗体、抗BTLA抗体、抗KIR抗体、抗IDO抗体及其组合。
癌细胞劫持免疫检查点系统作为逃避免疫反应的机制。具体来说，癌细胞利用免疫检查点受体来逃避免疫反应，代表性受体包括PD-L1、PD-1、CTLA-4等。为了防止这些癌细胞的免疫逃避，使用作为特异性结合免疫检查点受体的分子的免疫检查点抑制剂进行癌症治疗。首个免疫检查点抑制剂是伊匹单抗
伊匹单抗是特异性结合细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体。接下来开发的免疫检查点疗法是针对程序性细胞死亡-1(PD-1)及相应配体程序性死亡配体-1(PD-L1)的单克隆抗体。代表性药物包括抗PD-1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab；
)、派姆单抗(pembrolizumab；
)等)和抗PD-L1抗体(例如，阿维鲁单抗(avelumab；
)、阿特珠单抗(atezolizumab；
)、德瓦鲁单抗(durvalumab；
)等)。
除此之外，对特异性结合各种免疫检查点受体(例如，糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4))的单克隆抗体的研究正在进行。
免疫检查点抑制剂的剂量可以按照每个制造商的给药方案施用。免疫检查点抑制剂的剂量可以是0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至5mg/kg。例如，在含有纳武单抗作为活性成分的Opdivo Inj的情况下，可以每隔2周在60分钟内静脉滴注3mg/kg，对于作为联合治疗的给药方案，可在30分钟内静脉滴注1mg/kg。此外，在含有派姆单抗作为活性成分的KeytrudaInj的情况下，可以每隔3周在30分钟内静脉滴注200mg。因此，由于即使是相同的抗PD-1抗体也取决于产品而具有不同的给药方案，优选按照制造商的给药方案来施用抗体。
当药物组合物还包含免疫检查点抑制剂时，药物组合物中包含的溶瘤病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂可以同时、依次或以相反的顺序施用。
具体而言，溶瘤病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂可以同时施用。另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。
此外，可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用溶瘤病毒，然后可以同时施用粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂。
另外，可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和粒细胞生成抑制剂。
此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。
此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
另外，可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
此外，本发明的药物组合物还可以包含生理上可接受的运载体。此外，本发明的药物组合物还可以包含通常用于制备药物组合物的合适的赋形剂和稀释剂。此外，药物组合物可以按照常规方法以注射剂形式配制。
在配制成肠胃外施用的制剂的情况下，药物组合物可以配制成无菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为非水溶液或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用WitepsolTM、聚乙二醇、TweenTM61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
关于施用途径、给药量和施用频率，药物组合物可以根据患者的状况和有无副作用以多种方式和量施用于对象；并且本领域技术人员可以在合适的范围内选择最佳的施用途径、给药量和施用频率。此外，该药物组合物可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以与其他药物配制成组合制剂的形式。
药物组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、静脉内或动脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，药物组合物的给药量可以根据施用方案、总给药量和患者的健康状况来确定。
用于治疗癌症的药物组合物的特征可以在于痘苗病毒的癌症选择性增加。
本发明的另一方面提供了一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含含有痘苗病毒作为活性成分的第一组合物和含有粒细胞生成抑制剂作为活性成分的第二组合物。该试剂盒还可以包含第三组合物，该第三组合物包含免疫检查点抑制剂作为活性成分。
痘苗病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂与在药物组合物中所描述的那些相同。
包含粒细胞生成抑制剂作为活性成分的第二组合物可以是商品化药物。含有羟基脲作为活性成分作为粒细胞生成抑制剂的商业化药物的实例可以包括
DroxiaTM、MylocelTM、
和
胶囊。第二组合物可以口服，也可以肠胃外施用。
第一组合物的给药量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。给药量可以使得患者接受1×105至1×1018的病毒颗粒、传染性病毒单位(TCID50)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，给药量可以使得患者接受1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各个数值和范围。优选地，第一组合物可以1×105pfu至1×1010pfu的剂量施用。更优选地，第一组合物可以等于或大于1×105pfu且低于1×109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，第一组合物以1×105pfu或1×107pfu施用。
此外，第二组合物可以以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。具体地，第二组合物可以以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方案中，第二组合物以25mg/kg/天、30mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天或100mg/kg/天施用。取决于给药量，第二组合物可以每天数次分剂量施用。具体地，第二组合物可以每天施用1至4次或每天1至2次。
第三组合物的剂量可以按照每个制造商的包含在第三组合物中的免疫检查点抑制剂的施用方案来施用。第三组合物的剂量可以是0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至5mg/kg。
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
第一组合物、第二组合物和第三组合物还可以包含生理上可接受的运载体。此外，本发明的试剂盒中包含的组合物还可以包含通常用于制备药物组合物的合适的赋形剂和稀释剂。此外，组合物可以按照常规方法以注射剂形式配制。
在配制成肠胃外施用的制剂的情况下，第一组合物、第二组合物和第三组合物可以配制成无菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为非水溶液或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用WitepsolTM、聚乙二醇、TweenTM61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
关于施用途径、给药量和施用频率，第一组合物、第二组合物和第三组合物可以根据患者的病症和有无副作用以多种方式和量施用于对象；并且本领域技术人员可以在合适的范围内选择最佳的施用途径、给药量和施用频率。此外，该药物组合物可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以与其他药物配制成组合制剂的形式。
第二组合物可以口服或肠胃外施用。具体地，第二组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过腹膜内、动脉内或静脉内施用来进行。
第一组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、动脉内或静脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，第一组合物的给药量和第二组合物的给药量可以根据施用方案、总给药量和患者的健康状况来确定。
此外，第一组合物可以施用1至10次或2至5次，并且可以以7至30天的间隔将其施用于个体。具体地，可以以7天、14天、21天或30天的间隔施用第一组合物。
第二组合物可以在施用第一组合物之前或之后施用。具体而言，第二组合物可以从第一组合物施用前3至5天开始每天一次连续施用，并且可以从第一组合物施用24小时以内或24小时后开始每天一次连续施用9至28天。在本发明的一个实施方式中，第二组合物可以从第一组合物施用前1至3天开始每天一次连续施用，并且可以在第一组合物施用后每天一次施用13天、17天、18天或28天。
第三组合物可以在施用第一组合物后每周至少一次连续施用1至10周。具体地，第三组合物可以在施用第一组合物后每周至少两次连续施用1至8周。
在本发明的又一个方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向患有癌症的个体施用痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂。
该治疗方法可以进一步包括向患有癌症的个体施用免疫检查点抑制剂。
溶瘤病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂与在药物组合物中所描述的相同。
痘苗病毒可以属于但不限于：Western Reserve、NYVAC、Wyeth、LC16m8、Lister、Copenhagen、天坛、USSR、Tashkent、Evans、IHD-J或IHD-W痘苗病毒株。
痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以同时、依次或以相反的顺序联合施用。具体而言，痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以同时施用。此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后施用痘苗病毒。此外，可以先施用痘苗病毒，然后施用粒细胞生成抑制剂。另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用痘苗病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
此外，当治疗方法还包括施用免疫检查点抑制剂时，溶瘤病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂可以同时、依次或以相反的顺序施用。具体而言，溶瘤病毒、粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂可以同时施用。另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。
此外，可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂和免疫检查点抑制剂，然后可以同时施用粒细胞生成抑制剂。
另外，可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和粒细胞生成抑制剂。
此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以同时施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
另外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒。
此外，可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
另外，可以先施用溶瘤病毒，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用免疫检查点抑制剂，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。可以先施用免疫检查点抑制剂，然后可以施用粒细胞生成抑制剂，然后可以施用溶瘤病毒，然后可以再次施用粒细胞生成抑制剂。
痘苗病毒的给药量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。给药量可以使得患者接受1×105至1×1018的病毒颗粒、传染性病毒单位(TCID50)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，给药量可以使得患者接受1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各个数值和范围。优选地，痘苗病毒可以1×105pfu至1×1010pfu的剂量施用。更优选地，痘苗病毒可以等于或大于1×105pfu且低于1×109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒以1×105pfu或1×107pfu施用。
此外，粒细胞生成抑制剂可以以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。具体地，粒细胞生成抑制剂可以以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，羟基脲、来那度胺或帕布昔利布作为粒细胞生成抑制剂以25mg/kg/天、30mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天、或100mg/kg/天的剂量施用。取决于给药量，粒细胞生成抑制剂可以每天数次分剂量施用。具体地，粒细胞生成抑制剂可以每天施用1至4次或每天1至2次。
此外，痘苗病毒可以以施用1至10次或2至5次，并且可以以7至30天的间隔将其施用于个体。具体地，可以以7天、14天、21天或30天的间隔施用痘苗病毒。
粒细胞生成抑制剂可以在施用痘苗病毒之前、期间或之后施用。具体地，粒细胞生成抑制剂可以在施用痘苗病毒之前或之后施用。粒细胞生成抑制剂可以从痘苗病毒施用前3至5天开始每天一次连续施用，并且可以从痘苗病毒施用24小时后开始每天一次连续施用9至28天。在本发明的一个实施方式中，粒细胞生成抑制剂可以从痘苗病毒施用前1至3天开始每天一次连续施用，并且可以在痘苗病毒施用后每天一次施用13天、17天、18天或28天。
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
粒细胞生成抑制剂可以口服或肠胃外施用。具体而言，粒细胞生成抑制剂可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过腹膜内、动脉内或静脉内施用来进行。
痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、静脉内或动脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的给药量可以根据施用方案、总给药量和患者的健康状况来确定。
如本文所用，术语“个体”是指患有或正在遭受可通过施用本发明的药物组合物而缓解、抑制或治疗的疾病的人。
如本文所用，术语“施用”是指通过适当的方法将有效量的物质引入个体，痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的施用可以通过使物质到达目标组织的一般途径进行。
此外，痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以以与其他药物配制成组合制剂的形式。
在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的再一方面，提供了一种抗癌佐剂，该抗癌佐剂包含粒细胞生成抑制剂作为活性成分。这里，粒细胞生成抑制剂如上针对药物组合物所述。此外，抗癌助剂的特征可以在于其用作包含痘苗病毒作为活性成分的抗癌剂的抗癌佐剂。抗癌佐剂的特征可以在于其改善、增强或增加痘苗病毒的抗癌活性。抗癌佐剂的特征可以在于其增加痘苗病毒的癌症选择性。
粒细胞生成抑制剂可以是羟基脲、来那度胺、沙利度胺、他达拉非、帕布昔利布、烷化剂、蒽环类药物、抗代谢药物、喜树碱、表鬼臼毒素、丝裂霉素C、紫杉烷或长春碱。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不限于此。
制备例1.生产重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-、WR VVtk-)
制备例1.1.穿梭质粒载体的构建
为了生产缺失胸苷激酶(TK)基因的重组痘苗病毒，野生型痘苗病毒，即Wyeth株(NYC卫生局)和Western Reserve株购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)。对于重组，使用含有萤火虫荧光素酶报告物(p7.5启动子)基因或GFP基因的穿梭质粒载体对野生型痘苗病毒中的TK区域进行置换。
制备例1.2.生产重组痘苗病毒
为了获得重组病毒，将HeLa细胞(ATCC)以每孔4×105个细胞接种在6孔板中，然后在含有10％胎牛血清的EMEM培养基中进行培养。随后，以0.05MOI用野生型痘苗病毒进行处理。2小时后，将培养基更换为含有2％胎牛血清的EMEM培养基，然后使用XfectTM聚合物(Clonetech 631317，USA)用4μg制备例1.1中构建并线性化的穿梭质粒载体转染细胞。培养4小时。随后，将培养基更换为含有2％胎牛血清的EMEM培养基，再培养72小时。最后收集感染细胞，然后重复冻融3次。随后，通过超声裂解细胞，采用蔗糖垫层法获得游离的重组痘苗病毒，命名为Wyeth VVtk-或WR VVtk-。
制备例2.生产重组痘苗病毒(OTS-412)
为了生产缺失胸苷激酶(TK)基因并表达突变的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组痘苗病毒，使用其中重组有合成的SEQ ID NO：1的突变1型HSV-TK基因(pSE/L启动子)和萤火虫萤光素酶报告物(p7.5启动子)基因的pUC57amp+质粒(Genewiz，USA)作为穿梭载体，对Wyeth株野生型痘苗病毒中的TK区域进行置换。使用如上构建的穿梭载体以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为OTS-412。
制备例3.生产重组痘苗病毒(WOTS-418)
为了生产缺失胸苷激酶(TK)基因并表达突变的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组痘苗病毒，使用其中重组有合成的SEQ ID NO：2的突变1型HSV-TK基因(pSE/L启动子)和萤火虫萤光素酶报告物(p7.5启动子)基因的pUC57amp+质粒(Genewiz，USA)作为穿梭载体，对Western Reserve株野生型痘苗病毒中的TK区域进行置换。使用如上构建的穿梭载体以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为WOTS-418。
制备例4.生产重组痘苗病毒(WR VV_DD)
为了生产缺失胸苷激酶(TK)基因和痘苗生长因子(VGF)基因的重组痘苗病毒，使用含有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的穿梭质粒对Western Reserve株野生型痘苗病毒中的TK区域进行置换，并且使用含有lacZ基因的穿梭质粒对同一病毒中的VGF基因区域进行置换。使用含有EGFP基因的穿梭质粒和含有lacZ基因的穿梭质粒，以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为VV_DD。
I.共同施用痘苗病毒和羟基脲的协同抗癌作用的确认
实验例1.野生型痘苗病毒(WR)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(I))的癌症治疗作用的确认
实验例1.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以5×106个细胞皮下移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至80mm3，然后开始施用野生型痘苗病毒。另一方面，WesternReserve株野生型痘苗病毒(WR)在同种异体移植模型中具有比Wyeth株野生型痘苗病毒更强的增殖能力。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用野生型痘苗病毒(WR，1×105pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用野生型痘苗病毒(WR，1×105pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。野生型痘苗病毒瘤内施用一次；并且从施用野生型痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除野生型痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周5次。
实验例1.2.检查肿瘤体积的变化
在实验例1.1中对各组小鼠施用药物后第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积。结果确认了，与阴性对照组相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积被抑制，而实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图1)。
实验例1.3.检查体重的变化
每次对实验例1.1中的阴性对照组、阳性对照组和实验组的小鼠施用药物后在第3、7、10、14天测量体重。结果，所有三组都没有显著的体重减轻(图2)。
实验例2.重组痘苗病毒(WR VVtk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(II))的癌症治疗作用的确认
实验例2.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，Western Reserve株衍生的重组痘苗病毒(WR VVtk-)在同种异体移植模型中具有比Wyeth株衍生的重组痘苗病毒更强的增殖能力。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝8)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(WR VVtk-，1×107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(60mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用两次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第21天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
实验例2.2.检查肿瘤体积的变化
在实验例2.1中对各组小鼠施用药物后第0、3、7、10、14、17和21天测量肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图3)。
实验例3.重组痘苗病毒(WR VVtk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(III))的癌症治疗作用的确认
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以5×106个细胞在左大腿处皮下移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(WR VVtk-，1×105pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用一次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
对各组小鼠施用药物后第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积。结果确定了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积的生长被抑制了约25％(图4)。
实验例4.重组痘苗病毒(VV_DD)和羟基脲对小鼠黑色素瘤移植小鼠(B16F10)的癌症治疗作用的确认
使购自KOATECH(韩国)的C57BL/6小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5×105个细胞皮下移植小鼠黑色素瘤癌细胞系(ATCC，B16F10)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用重组痘苗病毒(VV_DD)。重组痘苗病毒(VV_DD)是通过对WesternReserve株痘苗病毒中的胸苷激酶(TK)和痘苗生长因子(VGF)区域进行双重缺失获得的，并且在同种异体移植模型中具有有限的增殖能力。
将产生的小鼠黑色素瘤移植小鼠分为4组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了单独施用羟基脲(30mg/kg)或重组痘苗病毒(VV_DD，1×106pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在第0天和第5天腹膜内施用重组痘苗病毒；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第15天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
在对各组小鼠施用药物前1天和施用后第4天和第7天测量肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图5)。从这些结果确认了，在重组痘苗病毒(VV_DD)和羟基脲共同施用的情况下观察到协同效应。
实验例5.重组痘苗病毒(WOTS-418)和羟基脲对人肺癌细胞系移植小鼠(NCI-H460)的癌症治疗作用的确认
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c nu/nu小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5×106个细胞皮下异种移植NCI-H460人肺癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒(WOTS-418)。另一方面，Western Reserve株衍生的重组痘苗病毒(WOTS-418)在人肺癌细胞系(NCI-H460)异种移植小鼠中具有增殖能力。
将产生的人肺癌细胞系移植小鼠分为2组(n＝4)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为对照组，将接受了共同施用重组痘苗病毒(WOTS-418，1×107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒腹膜内施用一次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第15天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
在对各组小鼠施用药物后第0、5、10、12和15天测量肿瘤体积。结果确认了，与对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约40％(图6)。
实验例6.重组痘苗病毒(WOTS-418)和羟基脲在小鼠结直肠癌细胞移植小鼠(CT-26)中的存活率分析
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以1×106个细胞皮下移植小鼠结直肠癌细胞系(CT-26，Korea Cell Line Bank)。7天后，开始施用重组痘苗病毒(WOTS-418)和羟基脲。另一方面，Western Reserve株衍生的重组痘苗病毒(WOTS-418)在同种异体移植模型中具有比Wyeth株衍生的重组痘苗病毒更强的增殖能力。
将产生的小鼠结直肠癌细胞系移植小鼠分为2组(n＝12)，即接受了腹膜内施用重组痘苗病毒(WOTS-418，1×107pfu)的组和接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/kg)的组。重组痘苗病毒腹膜内施用一次；羟基脲从重组痘苗病毒施用后第1天开始连续腹膜内施用5次。
分析各组小鼠的存活曲线。结果，对于仅接受了施用重组痘苗病毒的组，所有小鼠在施用后25天死亡；然而，30％或更高的接受了共同施用羟基脲和重组痘苗病毒的小鼠存活了55天或更长(图7)。从这些结果确认，在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，安全性提高。
实验例7.重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(IV))的癌症治疗作用的确认
实验例7.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF，75μg/kg)的组、以及接受了重组病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前3天开始，腹膜内施用rhG-CSF或羟基脲每周5次，直至处死。
实验例7.2.检查肿瘤体积的变化
施用药物后第16天处死实验例7.1的各组小鼠，并测量肿瘤体积。结果，与初始肿瘤体积相比，阳性对照组的小鼠和接受了共同施用重组痘苗病毒和rhG-CSF的实验组的小鼠显示出近10倍的增加。另一方面，与初始肿瘤体积相比，接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的实验组小鼠显示出近8倍的增加，这是观察到的受到最大抑制的肿瘤体积(图8)。
实验例7.3.确认抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化
为确认共同施用重组痘苗病毒与羟基脲的情况下是否获得肿瘤特异性抗癌作用，在第16天处死实验例7.1中的各组小鼠，然后从各组中分离出脾脏中的淋巴细胞。然后，将分离出的淋巴细胞分别注射到新的正常小鼠体内。进行了癌移植并观察肿瘤体积。具体地，一周后，将小鼠以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)，并在第19天测量肿瘤体积。
结果，在注射了从接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组的小鼠中收集的脾细胞的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制。另一方面，在注射了从其余组的小鼠中收集的脾细胞的每只小鼠中，肿瘤生长没有被显著抑制(图9)。从这些结果确认了，接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组不仅产生了免疫细胞例如细胞毒性T细胞，而且活化了适应性免疫。
实验例8.重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renea(V))的癌症治疗作用的确认
实验例8.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(KoreaCellLineBank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，Wyeth株衍生的重组痘苗病毒(WyethVVtk-)在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了单独施用羟基脲(30mg/kg)的组和接受了单独施用重组痘苗病毒(WyethVVtk-，1×107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前3天开始，腹膜内施用羟基脲每周5次，直至处死。
实验例8.2.检查肿瘤体积的变化
在实验例8.1中对各组小鼠施用药物后第0、4、10、15和22天测量肿瘤体积。结果，与初始肿瘤体积相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积增加了约11至13倍。另一方面，与初始肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积增加了约4倍(图10)。
实验例8.3.确认肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化
为确认共同施用重组痘苗病毒与羟基脲的情况下是否获得肿瘤特异性抗癌作用，在第16天处死实验例8.1中的各组小鼠，然后从各组中分离出脾细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CD8+ T细胞)。然后，将分离出的脾细胞或细胞毒性T淋巴细胞分别注射到新的正常小鼠体内。进行了癌移植并观察了肿瘤体积。具体地，一周后，将小鼠以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)，并在第7、10、14、18和21天测量肿瘤体积。
结果，在注射了从实验组小鼠收集的脾细胞或T淋巴细胞的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制。另一方面，在注射了从其余组的小鼠中收集的脾细胞或T淋巴细胞的小鼠中，肿瘤生长没有被显著抑制(图11)。从这些结果确认了，接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组中，具有抗癌功效的适应性免疫不仅因T淋巴细胞，而且因脾中形成的其他免疫细胞，而被活化(图11和图12)。
实验例9.重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(VI))的癌症治疗作用的确认
实验例9.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，Wyeth株衍生的重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-)在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了施用重组痘苗病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前1天开始，腹膜内施用羟基脲每周6次，直至处死。
实验例9.2.检查肿瘤体积的变化
施用后第22天处死实验例9.1的各组小鼠，并测量肿瘤体积。结果，与阴性对照组小鼠的肿瘤体积相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积被抑制了约25％。特别地，与阴性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约37.5％，并且与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约15％(图13)。
实验例9.3.脾脏组织微环境的确认
当共同施用重组痘苗病毒和羟基脲时，对免疫细胞在肿瘤微环境中的分布进行了分析。为了分析，使用二氨基联苯胺(DAB)进行免疫组织化学染色。具体地，从各组的小鼠中收集脾脏。将脾组织切成0.4μm并干燥。随后，用PBS洗涤组织，然后用牛血清白蛋白(Bovineserum albumin，BSA)处理。用按1∶50的比例稀释的一抗(抗CD3抗体(Abcam)、抗CD4抗体(BDBiosciences)、抗CD8抗体(BD Biosciences))对组织进行处理，使反应在4℃过夜进行。第二天，用PBS洗涤组织，然后在室温下与二抗(Dako)反应30分钟。再次用PBS洗涤组织，使用ABC试剂盒(Dako)进行反应，然后通过添加H2O2使其显色。然后，对组织进行脱水，然后封装。
结果确认了，CD4+T细胞和CD8+T细胞更丰富地分布在实验组小鼠的肿瘤组织中(图14)。从这些结果确认了，在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，脾组织中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞更加分化和活化。也就是说，确认了在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，适应性免疫被更好地活化。
实验例10.小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1(I))中由重组痘苗病毒(OTS-412)和羟基脲引起的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化的确认
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历一周的驯化期，然后以1×106个细胞同种异体移植4T1癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，Wyeth株衍生的重组痘苗病毒(OTS-412)在小鼠乳腺癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。另外，乳腺癌细胞系移植小鼠是转移进展至包括肺组织在内的全身的动物模型，转移一般通过肿瘤表面的结节数来评估。
将产生的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为4组(n＝5)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(OTS-412，1×107pfu)或羟基脲(30mg/kg)的组设置为阳性对照组。将接受了施用重组痘苗病毒和羟基脲的组设置为实验组。重组痘苗病毒先瘤内施用，然后第一次施用后第7天再次施用。从施用重组痘苗病毒前3天开始到处死前3天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每天一次。
施用药物后第18天处死各组小鼠，从小鼠中收集血液和脾脏。通过流式细胞术分析免疫细胞在血液和脾细胞中的分布。结果确认了，诱导肿瘤免疫反应的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在血液和脾脏中的分布在实验组小鼠中最高。此外确认了，与阴性对照组和阳性对照组的小鼠相比，实验组小鼠中具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞(Myeloid-derivedsuppressor cell，MDSC)的数量显著减少(图15)。
实验例11.重组痘苗病毒(WR VVtk-)和羟基脲对小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1(II))的适应性免疫增强作用的确认
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以1×106个细胞在左大腿处皮下移植4T1癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。两天后，将相同数量的4T1癌细胞系皮下移植到小鼠的右大腿。观察左大腿上皮下移植的肿瘤直至其体积达到50mm3至200mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
将产生的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(WR VVtk-，1×105pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(90mg/kg)的组设置为实验组。将重组痘苗病毒施用到左侧肿瘤中一次，并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除重组痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
在对各组小鼠施用药物后第0、3、7、10和14天测量皮下移植于两个大腿的肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的左侧肿瘤体积相比，实验组小鼠的左侧肿瘤体积的生长被抑制了约35％(图16)。此外，与阳性对照组小鼠的右侧肿瘤体积相比，实验组小鼠的右侧肿瘤体积的生长被抑制了约45％(图17)。根据这些结果，确认了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲对周围肿瘤的影响。
也就是说确认了，在通过共同施用痘苗病毒和羟基脲对肿瘤进行局部处理的情况下，即使在未施用病毒的肿瘤中也观察到抗癌作用。
实验例12.共同施用野生型痘苗病毒(WR)和羟基脲后，小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症选择性增加的确认(I)
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用野生型Western Reserve株痘苗病毒(WR)。同时，野生型Wyeth株痘苗病毒在同基因小鼠中具有有限的增殖能力。
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝8)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用野生型痘苗病毒(WR，1×107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用野生型痘苗病毒和羟基脲(60mg/kg)的组设置为实验组。野生型痘苗病毒瘤内施用两次；并且从施用野生型痘苗病毒前1天开始至施用后第21天，除野生型痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周6次。
第22天处死各组小鼠，并从小鼠中分离出肿瘤。通过使用二氨基联苯胺(DAB)进行免疫组织化学染色来比较病毒增殖。具体地，从各组的小鼠中收集肿瘤组织。将肿瘤组织切成0.4μm并干燥。随后，用PBS洗涤组织，然后用牛血清白蛋白(BSA)处理。用以1∶50的比例稀释的一抗(货号ABIN1606294，Antibodies-Online)对组织进行处理，反应在4℃过夜进行。第二天，用PBS洗涤组织，然后在室温下与二抗(Alexa 594，货号A21205，Invitrogen)反应30分钟。再次用PBS洗涤组织，使用ABC试剂盒(Dako)进行反应，然后通过添加H2O2使其显色。然后，对组织进行脱水，然后封装。
结果确认了，野生型痘苗病毒更丰富地分布在实验组小鼠的肿瘤组织中(图18)。从这些结果确认了，在全身施用野生型痘苗病毒的同时共同施用羟基脲的情况下，观察到野生型痘苗病毒的更有效的肿瘤特异性增殖。
实验例13.在正常小鼠(II)中共同施用野生型痘苗病毒(WR)和羟基脲后存活率和癌症选择性增加的确认
使购自ORIENTBIO(釜山，韩国)的Balb/cnu/nu小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后开始施用野生型Western Reserve株痘苗病毒(WR)。另一方面，野生型Wyeth株痘苗病毒在同基因小鼠中的增殖能力有限。
将小鼠分为两组(n＝12)。将接受了施用野生型Western Reserve株痘苗病毒(1×107pfu)的组设置为对照组，将接受了共同施用野生型Western Reserve株痘苗病毒与羟基脲(50mg/kg)的组设置为实验组。野生型痘苗病毒鼻内施用一次；并且从施用野生型痘苗病毒前1天开始，除野生型痘苗病毒施用日外，腹膜内施用羟基脲每周5次。
第8天，处死对照组和实验组小鼠，并从小鼠中分离出肾组织和肝组织。进行免疫组织化学染色。制造石蜡块，并使用二甲苯和乙醇对每个块进行脱蜡。使用去掩蔽室(decloaking chamber)对所得的块进行抗原修复。然后，将一抗(货号ABIN1606294，Antibodies-Online)连接到该块上，并将FITC标记的二抗(Alexa594，货号A21205，Invitrogen)连接到其上。然后，使用荧光显微镜进行观察。
结果确认了，与对照组小鼠的肝组织和肾组织相比，病毒在实验组小鼠的肝组织和肾组织中分布和增殖数量较少(图19)。
实验例14.重组痘苗病毒(OTS-412)和羟基脲共同施用后小鼠肾癌细胞移植小鼠嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的确认
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历7天的驯化期，然后以5×106个细胞皮下移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。同时，重组痘苗病毒(OTS-412)在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。×
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用羟基脲(30mg/kg)的组设置为阳性对照组。将接受了施用重组痘苗病毒(OTS-412，1×107pfu)的组、接受了施用重组痘苗病毒(OTS-412，1×107pfu)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF，75μg/kg)的组和接受了施用重组痘苗病毒(OTS-412，1×107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用，在第一次施用后13天进行第二次施用。rhG-CSF或羟基脲从重组痘苗病毒施用前2天开始腹膜内施用，直至处死小鼠。
重组痘苗病毒施用后第8天，每组处死3只小鼠，进行全血细胞计数(CBC)，结果证实阳性对照组的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)与阴性对照组相比减少。在实验组中，仅在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组中，测得嗜中性粒细胞绝对计数与阳性对照组中的嗜中性粒细胞绝对计数相似(图20)。
实验例15.重组痘苗病毒(WR VVtk-)和羟基脲共同施用后小鼠肾癌细胞移植小鼠嗜中性粒细胞计数的测量
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。同时，重组痘苗病毒(WRVVtk-)可以在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中增殖。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝8)。将接受了瘤内施用盐水的组设置为对照组。将接受了施用重组痘苗病毒(WRVVtk-，1×107pfu)的组和接受了共同施用重组痘苗病毒(WRVVtk-，1×107pfu)和羟基脲(60mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒腹膜内施用2次，除了重组痘苗病毒施用日外，从施用重组痘苗病毒的前1天至施用后第21天每周腹膜内施用羟基脲6次。
重组痘苗病毒施用后第8天，每组处死3只小鼠，进行全血细胞计数(CBC)，结果仅接受了施用重组痘苗病毒的组中小鼠血液中的嗜中性粒细胞数与对照组相比有所增加。同时，重组痘苗病毒和羟基脲共同施用组小鼠血液中的嗜中性粒细胞计数与对照组相比显著降低(图21)。
实验例16.重组痘苗病毒(WOTS-418)和羟基脲共同施用后小鼠肾癌细胞移植小鼠嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的确认
使购自OrientBio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用Western Reserve株痘苗病毒衍生的溶瘤病毒(WOTS-418)。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝3)。将接受了腹膜内施用盐水的组作设置为阴性对照组，将接受了施用溶瘤病毒(WOTS-418，1×107pfu)的组设置为阳性对照组，将接受了共同施用溶瘤病毒和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。溶瘤病毒腹膜内施用一次，从溶瘤病毒施用前1天至施用后第2天每天腹膜内施用羟基脲。
施用溶瘤病毒后第3天，处死每组小鼠，进行全血细胞计数(CBC)，结果证实实验组的嗜中性粒细胞计数有减少的趋势(图22)。
II.痘苗病毒和来那度胺共同施用的协同抗癌作用鉴定
实验例17.施用来那度胺后小鼠肾癌细胞移植小鼠嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的确认
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。再经过一周的驯化期后，将小鼠分为3组(n＝3)，从溶瘤病毒施用前1天开始至施用后第4天，每天分别腹膜内施用盐水、羟基脲(30mg/kg)和来那度胺(30mg/kg)。
施用溶瘤病毒后第5天，处死每组小鼠，进行全血细胞计数(CBC)，结果证实除一只异常小鼠外，来那度胺施用组的小鼠的嗜中性粒细胞计数与盐水施用组相比减少。此外，确认了羟基脲施用组的小鼠的嗜中性粒细胞计数显著低于盐水施用组的小鼠(图23)。
实验例18.共同施用重组痘苗病毒(WOTS-418)和来那度胺后小鼠肾癌细胞移植小鼠嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的确认
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用Western Reserve株痘苗病毒衍生的抗癌剂(WOTS-418)。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝5)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，接受了施用溶瘤病毒(WOTS-418，1×107pfu)的组设置为阳性对照组，接受了共同施用溶瘤病毒和羟基脲(30mg/kg)的组和接受了共同施用溶瘤病毒和来那度胺(30mg/kg)的组设置为实验组。溶瘤病毒腹膜内施用一次，从溶瘤病毒施用前1天至施用后第2天每天腹膜内施用羟基脲或来那度胺。
施用溶瘤病毒后第5天，处死每组小鼠，进行全血细胞计数(CBC)，结果证实实验组小鼠的嗜中性粒细胞计数显著低于单独施用溶瘤病毒的阳性对照组(图24)。
实验例19.共同施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和来那度胺在小鼠肾癌细胞移植小鼠中的癌症治疗作用的确认
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用溶瘤病毒。同时，Western Reserve株痘苗病毒衍生的溶瘤病毒(WR VVtk-)可以在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中增殖。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为6组(n＝8)。将小鼠分为以下组进行实验：将接受了腹膜内施用盐水的组设置为对照组，接受了单独施用溶瘤病毒(WR VVtk-，1×107pfu)的组、接受了共同施用溶瘤病毒和羟基脲(60mg/kg)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒和来那度胺(25mg/kg)的组。溶瘤病毒腹膜内施用2次，除了溶瘤病毒施用日外，从溶瘤病毒施用前1天至施用后第21天，腹膜内施用羟基脲或来那度胺每周6次。
在第21天处死每组的小鼠，测量肿瘤体积，结果证实，溶瘤病毒单独施用组中肿瘤生长被显著抑制(p＜0.001)。与来那度胺单独处理组相比，溶瘤病毒和来那度胺共同施用组显示出抑制肿瘤生长的趋势。特别是，观察到溶瘤病毒和羟基脲共同施用组与溶瘤病毒单独处理组相比显著抑制了肿瘤生长(p＜0.05)，并且证实了来那度胺和羟基脲共同施用组显示出比溶瘤病毒和羟基脲共同施用组更高的肿瘤生长抑制作用(图25)。
III.痘苗病毒和帕布昔利布共同施用的协同抗癌作用确认
实验例20.共同施用重组痘苗病毒(WR VVtk-)和帕布昔利布对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗作用的确认
实验例20.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的制备及药物施用
使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用溶瘤病毒。同时，Western Reserve株痘苗病毒衍生的溶瘤病毒(WOTS-418)可以在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中增殖。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为5组(n＝5)。将小鼠分为以下组进行实验：将接受了腹膜内施用盐水的组设置为对照组，接受了单独施用溶瘤病毒(WR VVtk-，1×107pfu)的组、接受了共同施用溶瘤病毒和羟基脲(60mg/kg)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒和帕布昔利布(50mg/kg或100mg/kg)的组。溶瘤病毒腹膜内施用1次，除了溶瘤病毒施用日外，，溶瘤病毒施用前5天口服施用帕布昔利布每周一次从溶瘤病毒施用前1天至施用后第19天腹膜内施用羟基脲每周6次。
实验例20.2.肿瘤体积变化的确认
在第19天处死实验例20.1的各组小鼠，测定肿瘤体积，结果证实，与对照组相比，溶瘤病毒单独施用组在统计学上显著抑制肿瘤生长(p＜0.05)。证实与溶瘤病毒单独施用组相比，溶瘤病毒和羟基脲或帕布昔利布共同施用组显著抑制肿瘤生长(p＜0.0001)(图26)。
实验例20.3.体重变化的确认
向实验例20.1中的对照组和各组施用各自的药物后，于第3、6、9、12、16、19天测量小鼠体重。结果，在所有共同施用组中没有体重下降的趋势，并且即使在溶瘤病毒单独施用组中体重有持续下降的趋势，与开始施用时的体重相比，第19天的体重仍保持接近90％，从而确认安全性未到关注的水平(图27)。
IV.共同施用痘苗病毒、粒细胞生成抑制剂(羟基脲)和免疫检查点抑制剂的协同抗癌作用的确认
实验例21.共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、PD-1抑制剂和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(I))的癌症治疗作用的确认
为了证实在共同施用溶瘤病毒和PD-1抑制剂(CD279，BioXCell)(即一种免疫检查点抑制剂)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠肾癌细胞移植小鼠进行了实验。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到200mm3至300mm3，然后开始施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)。溶瘤病毒在同种异体移植模型中的增殖能力有限。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为5组(n＝5)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用小鼠PD-1抑制剂(200μg/只小鼠)的组、接受了瘤内施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和PD-1抑制剂的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WyethVVtk-，1×107pfu)、PD-1抑制剂和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒在瘤内施用一次，PD-1抑制剂在第14、16、18和20天每两天腹膜内施用一次，羟基脲每周腹膜内施用6次。
在对各组小鼠施用药物后第0、4、10、14、17、21天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图28)。
实验例22.共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、CTLA4抑制剂和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(II))的癌症治疗作用的确认
为了证实在共同施用溶瘤病毒和CTLA-4抑制剂(B7-H1，BioXCell)(即免疫检查点抑制剂)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠肾癌细胞移植小鼠进行了实验。
首先，使购自Oriient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至150mm3，然后开始施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)。溶瘤病毒在同种异体移植模型中的增殖能力有限。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为5组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用CTLA-4抑制剂(150μg/只小鼠)的组、接受了瘤内施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和CTLA-4抑制剂的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WyethVVtk-，1×107pfu)、CTLA-4抑制剂和羟基脲(30mg/kg)的组设定为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒在瘤内施用一次，CTLA-4抑制剂在第3、5、7和9天每两天腹膜内施用一次，羟基脲每周腹膜内施用6次。
在对各组小鼠施用药物后第0、4、7、10、14、17天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图29)。由这些结果确认，在共同施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂(CTLA-4抑制剂)时，另外对其施用羟基脲导致优异的小鼠肾癌抑制作用。
实验例23.共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)、PD-L1抑制剂和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(III))的癌症治疗作用的确认
为了证实在共同施用溶瘤病毒和PD-L1抑制剂(CD152，BioXCell)(即一种免疫检查点抑制剂)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠肾癌细胞移植小鼠进行了实验。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-)。溶瘤病毒在同种异体移植模型中的增殖能力有限。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为5组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用小鼠PD-L1抑制剂(300μg/只小鼠)的组、接受了瘤内施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和PD-L1抑制剂的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WyethVVtk-，1×107pfu)、PD-L1抑制剂和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒瘤内施用一次，PD-L1抑制剂在第0、3、7、10、14、17和21天腹膜内施用，羟基脲每周腹膜内施用6次。
在对各组小鼠施用药物后第0、3、7、10、14、17、21天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图30)。特别是比较处死小鼠前的肿瘤体积，证实实验组的肿瘤体积比接受了共同施用溶瘤病毒和PD-L1抑制剂的组小约46％。
由这些结果确认，在共同施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂(PD-L1抑制剂)的情况下，另外对其施用羟基脲导致优异的小鼠肾癌抑制作用。
实验例24.溶瘤病毒(WR VVtk-)、CTLA-4抑制剂和羟基脲对小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1(I))的癌症治疗效果确认
实验例24.1.小鼠乳腺癌细胞移植小鼠的制备及药物施用
为了证实在共同施用溶瘤病毒和CTLA-4抑制剂(B7-H1，BioXCell)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠乳腺癌细胞移植小鼠进行了实验。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以1×106个细胞同种异体移植4T1癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至150mm3，然后开始施用溶瘤病毒(WR VVtk-)。在同种异体移植模型中，Western Reserve株痘苗病毒衍生的溶瘤病毒(WR VVtk-)具有比Wyeth株痘苗病毒衍生的溶瘤病毒更强的增殖能力。
将制备的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为5组(n＝5)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用CTLA-4抑制剂(300μg/只小鼠)的组、接受了瘤内施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(Wyeth VVtk-，1×107pfu)和CTLA-4抑制剂的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WRVVtk-，1×107pfu)、CTLA-4抑制剂和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒腹膜内施用两次，CTLA-4抑制剂在第3、5、7和9天腹膜内施用，羟基脲每周腹膜内施用6次。
实验例24.2.肿瘤体积变化的确认
在对每组小鼠施用药物后第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图31)。
实验例24.3.存活率分析
此外，对于存活期，证实实验组小鼠的存活期和存活率是最好的。由该结果确认，在小鼠乳腺癌细胞移植小鼠中同时施用溶瘤病毒和CTLA-4抑制剂时，另外施用羟基脲显示出显著的作用。
实验例25.溶瘤病毒(WOTS-418)、PD-L1抑制剂和羟基脲对小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4T1(II))的癌症治疗作用的确认
实验例25.1.小鼠乳腺癌细胞移植小鼠的制备及药物施用
为了证实在共同施用溶瘤病毒和PD-L1抑制剂(CD152，BioXCell)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠乳腺癌细胞移植小鼠进行了实验。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以1×106个细胞同种异体移植4T1癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用溶瘤病毒(WOTS-418)。在同种异体移植模型中，Western Reserve株比Wyeth株具有更强的增殖能力。
将制备的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为5组(n＝6)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用小鼠PD-L1抑制剂(300μg/只小鼠)的组、接受了瘤内施用溶瘤病毒(WOTS-418，1×107pfu)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(WOTS-418，1×107pfu)和PD-L1抑制剂的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WOTS-418，1×107pfu)、PD-L1抑制剂和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒腹膜内施用两次，CTLA-4抑制剂在第3、5、7和9天腹腔内施用，羟基脲每周腹腔内施用6次。
实验例25.2.肿瘤体积变化的确认
对实验例5.1各组小鼠施用药物后第0、3、7、10、14天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图32)。特别是比较处死小鼠前的肿瘤体积，证实实验组的肿瘤体积比接受了共同施用溶瘤病毒和PD-L1抑制剂的组小约30％。
由这些结果确认，在共同施用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂(PD-L1抑制剂)的情况下，另外对其施用羟基脲导致显示出抑制小鼠乳腺癌的协同作用。
实验例25.3.存活率分析
分析实验例5.1各组小鼠30天的存活率。结果证实，实验组小鼠的存活率高于阴性和阳性对照组小鼠。
实验例26.在小鼠结直肠癌细胞移植小鼠(CT-26I)中溶瘤病毒(WR，WOTS-418)、PD-L1抑制剂和羟基脲导致的存活率分析
为了确认Western Reserve株痘苗病毒(WR)、PD-L1抑制剂和羟基脲共同施用的安全性，使用小鼠结肠直肠癌细胞移植小鼠分析存活期。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以1×106个细胞皮下移植结直肠癌(CT-26)(Korea Cell Line Bank)。7天后，腹膜内施用溶瘤病毒(WR)和PD-L1抑制剂，从次日起每天施用羟基脲，持续5天。同时，在同种异体移植模型中，Western Reserve株痘苗病毒具有比Wyeth株痘苗病毒更强的增殖能力。
将制备的小鼠结直肠癌细胞移植小鼠分为5组(n＝13)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了单独施用小鼠PD-L1抑制剂(300μg/只小鼠)的组、和接受了共同施用溶瘤病毒(WOTS-418)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为阳性对照组。此外，将接受了共同施用溶瘤病毒(WR，1×106pfu或WOTS-418，1×107pfu)、PD-L1抑制剂和羟基脲的组设定为实验组。在这种情况下，溶瘤病毒腹膜内施用一次，PD-L1抑制剂在第1、4、8和11天腹膜内施用，羟基脲每周腹膜内施用5次。
对各组小鼠的生存曲线进行分析，观察到实验组小鼠的生存期相比阴性对照组小鼠和阳性对照组小鼠的生存期是最长的。从这些结果确认，当共同施用溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂和羟基脲时，安全性得到了提高。
实验例27.在小鼠肾癌细胞移植小鼠(Renca(IV))中Western Reserve株痘苗病毒(WR)、CTLA-4抑制剂和羟基脲导致的存活率分析
为了证实在共同施用Western Reserve株痘苗病毒(WR)和CTLA-4抑制剂(B7-H1，BioXCell)(即一种免疫检查点抑制剂)时施用羟基脲的额外作用，使用小鼠肾癌细胞移植小鼠进行进行了实验。
首先，使购自Orient Bio(釜山，韩国)的Balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历7天的驯化期，然后以5×106个细胞同种异体移植Renca癌细胞系(Korea Cell Line Bank)。观察肿瘤体积直至达到30mm3至50mm3，然后开始施用Western Reserve株痘苗病毒(WR)。在同种异体移植模型中，Western Reserve株痘苗病毒(WR)具有比Wyeth株痘苗病毒更强的增殖能力。
将制备的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了腹膜内施用盐水的组设置为阴性对照组，将接受了共同施用WesternReserve株痘苗病毒(WR，1×105pfu)和羟基脲(30mg/kg)和接受了共同施用Western Reserve株痘苗病毒和CTLA-4抑制剂(150μg/只小鼠)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用Wester nReserve株痘苗病毒、CTLA-4抑制剂和羟基脲的组设定为实验组。在这种情况下，Western Reserve株痘苗病毒腹膜内施用一次，CTLA-4抑制剂在第2、4、6和8天腹膜内施用，羟基脲每周腹膜内施用4次。
在对各组小鼠施用药物后第0、3、7天测量肿瘤体积。结果证实，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图33)。
序列表
<110> 拜耳诺克斯有限公司
<120> 包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物
<130> SPO21-068/BNX-PCT
<150> KR 10-2019-0106736
<151> 2019-08-29
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for 330 aa fregment of HSV-TK (OTS-412)
<400> 1
ttagtcgtaa tccaggataa agacgtgcat gggacggagg cgtttggcca agacgtccaa 60
ggcccaggca aacacgttat acaggtcgcc gttgggggcc agcaactcgg gggcccgaaa 120
cagggtaaat aacgtgtccc cgatatgggg tcgtgggccc gcgttgctct ggggctcggc 180
accctggggc ggcacggccg tccccgaaag ctgtccccaa tcctcccacc acgacccgcc 240
gccctgcaga taccgcaccg tattggcaag cagcccgtaa acgcggcgaa tcgcggccag 300
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gtcctccgga agggccccca acacgatgtt tgtgccgggc aaggtcggcg ggatgagggc 420
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agacgcgtgt tgatggcagg ggtacgaagc cat 993
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<211> 1131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for mutated HSV-TK of WOTS-418
<400> 2
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ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
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gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatgtcg gtggtgaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcta cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc ctcaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780
cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840
cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaacta a 1131
Claims (30)
1.一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含以下作为活性成分：
痘苗病毒；和
粒细胞生成抑制剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述痘苗病毒属于Western Reserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、Wyeth(纽约市卫生局；NYCBOH))、LC16m8、Lister、Copenhagen、TianTan、USSR、Tashkent、Evans、International Health Division-J(IHD-J)或InternationalHealth Division-White(IHD-W)痘苗病毒株。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述痘苗病毒是野生型痘苗病毒或重组痘苗病毒。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述重组痘苗病毒通过在野生型痘苗病毒中缺失至少一种基因或在野生型痘苗病毒中插入外源基因而获得。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述野生型痘苗病毒的基因选自由以下组成的组中任一种：胸苷激酶基因、痘苗生长因子基因、F13.5L基因、F14.5L基因、A56R基因、B18R基因及其组合。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述外源基因是编码选自由以下组成的组中的任一种的基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、突变的HSV-TK、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、1型羧酸酯酶、2型羧酸酯酶、干扰素β(INF-β)、生长抑素受体2及其组合。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述粒细胞生成抑制剂是羟基脲、来那度胺、沙利度胺、他达拉非、帕布昔利布、烷化剂、蒽环类药物、抗代谢药物、喜树碱、表鬼臼毒素、丝裂霉素C、紫杉烷或长春碱。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述粒细胞是嗜中性粒细胞。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，还包含免疫检查点抑制剂。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述痘苗病毒的癌症选择性增加。
12.一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，包括：
第一组合物，其包含痘苗病毒作为活性成分；和
第二组合物，其包含粒细胞生成抑制剂作为活性成分。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，还包含第三组合物，所述第三组合物包含免疫检查点抑制剂作为活性成分。
14.一种治疗癌症的方法，包括：
向患有癌症的个体施用粒细胞生成抑制剂和痘苗病毒。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括向患有癌症的个体施用免疫检查点抑制剂。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述痘苗病毒和所述粒细胞生成抑制剂同时、依次或以相反顺序共同施用。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述粒细胞生成抑制剂在所述痘苗病毒的施用之前、期间或之后施用。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述粒细胞生成抑制剂从所述痘苗病毒施用前3至5天开始每天一次连续施用，并在所述痘苗病毒施用后持续9至28天。
19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述粒细胞生成抑制剂以10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。
20.根据权利要求14所述的方法，其中，所述痘苗病毒以1×105pfu至1×1010pfu的剂量施用。
21.根据权利要求14所述的方法，其中，所述痘苗病毒以7至30天的间隔施用于个体。
22.根据权利要求14所述的方法，其中，所述粒细胞生成抑制剂通过瘤内、腹膜内或静脉内施用。
23.根据权利要求14所述的方法，其中，所述痘苗病毒通过瘤内、腹膜内或静脉内施用。
24.包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
25.包含痘苗病毒和粒细胞生成抑制剂的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
26.一种抗癌佐剂，包含以下作为活性成分：
粒细胞生成抑制剂。
27.根据权利要求26所述的抗癌佐剂，其中，所述抗癌佐剂用作包含以痘苗病毒为有效成分的抗癌剂的抗癌佐剂。
28.根据权利要求26所述的抗癌佐剂，其中，所述抗癌佐剂改善、增强或增加痘苗病毒的抗癌活性。
29.根据权利要求26所述的抗癌佐剂，其中，所述抗癌佐剂增加痘苗病毒的癌症选择性。
30.根据权利要求26所述的抗癌佐剂，其中，所述粒细胞生成抑制剂是羟基脲、来那度胺、沙利度胺、他达拉非、帕布昔利布、烷化剂、蒽环类药物、抗代谢药物、喜树碱、表鬼臼毒素、丝裂霉素C、紫杉烷或长春碱。
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