CN110022867A - 高迁移率族蛋白box i突变体 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及经修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其被修饰成含有编码变异HMGB1蛋白的外源核酸。本公开内容至少部分地提供，被修饰成含有编码变异HMGB1的核酸并且表达变异HMGB1或其片段的痘苗病毒与化疗联合可实现协同效应。此外，本公开内容提供了溶瘤痘苗病毒以及将其用于治疗各种癌症的方法。

Description

高迁移率族蛋白BOX I突变体

资助信息

本公开内容在国立卫生研究院授予的CA140215下由政府支持完成。政府对本公开内容享有一定的权利。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和NCBI登录号均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入，并且如同以其全文进行阐述。如果本文所用的术语与并入的参考文献中所定义的术语之间存在冲突，则以本公开内容的定义为准。

交叉引用

本申请要求于2016年9月21日提交的美国临时申请号 62/397,523的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。

发明内容

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13 至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和 170-203中的至少一段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含 SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:15的残基1-20。

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在其第一核定位信号(NLS1)、第二核定位信号(NLS2)或它们的任何组合中的突变。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1进一步包含在boxA、boxB或其任何组合中的突变。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与 SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述HMGB1变体包含在SEQ ID NO:15的位置43和65处的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述 HMGB1变体包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203 中的至少一段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述HMGB1变体包含SEQ ID NO:15的残基21-74和109-128或170-203。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:15的残基1-20。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的外源核酸序列，其中所述核酸序列是SEQ ID NO:13的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约 99％或100％，或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码抗体或其抗原结合片段的外源核酸序列，所述外源核酸序列可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒进一步包含编码透明质酸酶的外源核酸序列，所述外源核酸序列可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS1 中的突变，其中所述在NLS1中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS2中的突变，其中所述在NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS1和 NLS2中的突变，其中所述在NLS1和NLS2中的突变促进所述变异 HMGB1的细胞质重新定位。

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1与人HMGB1(SEQ ID NO: 16)的同源性小于或等于95％。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1 包含SEQ ID NO:16的残基1-85、89-108和150-183中的至少一段。在一些实施方案中，所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基1-85。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基 89-108。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16 的残基150-183。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基1-85、89-108和150-183。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和 202中的一个或多个残基处的突变。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异 HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和202 处的突变。

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基23、45、89-108和150-183，并且其中所述变异HMGB1包含与 SEQ ID NO:16的同源性小于或等于95％的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQID NO:16的残基23-45、89-108、 150-183。在一些实施方案中，所述变异HMGB1包含在SEQID NO:16 的残基35、42、89、181、189和202中的一个或多个残基处的突变。在一些实施方案中，所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基 35、42、89、181、189和202处的突变。

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与 SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17 的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO: 17的残基1-20。

一个实施方案提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:19至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与 SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17 的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异 HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO: 17的残基1-20。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS2 中的突变，其中所述在NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含在NLS1和 NLS2中的突变，其中所述在NLS1和NLS2中的突变促进所述变异 HMGB1的细胞质重新定位。在一些实施方案中，由所述痘苗病毒表达的所述变异HMGB1分泌到细胞质中。在一些实施方案中，与缺少编码所述变异HMGB1的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1从所述痘苗病毒的表达增强细胞自噬。在一些实施方案中，与缺少编码所述变异HMGB1的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1的表达增强所述痘苗病毒的肿瘤特异性复制。在一些实施方案中，与缺少编码所述变异HMGB1 的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1的表达使针对被所述痘苗病毒感染的肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答增强。在一些实施方案中，所述变异HMGB1的表达诱导针对在被所述痘苗病毒感染的肿瘤细胞附近的肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答，其中所述附近的肿瘤细胞未被所述痘苗病毒感染。在一些实施方案中，所述痘苗病毒在其基因组中包含一个或多个缺失。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述痘苗病毒包含胸苷激酶基因缺失，并且所述外源核酸被插入所述胸苷激酶基因座中。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述痘苗病毒包含一个或多个毒力基因的缺失。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒是细胞外包膜病毒(EEV)。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒进一步表达透明质酸酶。在一些实施方案中，痘苗病毒表达所述透明质酸酶，并且其中与不包含可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸的编码所述透明质酸酶的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的传播相比，所述透明质酸酶增加所述痘苗病毒在肿瘤微环境中的传播。在一些实施方案中，所述痘苗病毒表达所述透明质酸酶，并且其中所述透明质酸酶增加所述痘苗病毒在肿瘤微环境中的传播。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒进一步表达使所述变异HMGB1在循环中稳定的蛋白质。在一些实施方案中，使所述变异HMGB1在循环中稳定的所述蛋白质是免疫球蛋白或其结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白是IgE。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白结构域是Fc结构域。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含编码所述变异HMGB1的外源核酸序列，其中编码所述IgE的其他外源核酸序列在上游与所述变异HMGB1编码序列融合。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒进一步表达外排泵阻滞剂。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒进一步表达化疗敏化剂。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含增强对化疗的敏化的修饰。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含吸引嵌合抗原受体T细胞的修饰。在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒增强基于CAR T细胞的疗法的功效。

一个实施方案提供了一种分离的多核苷酸，其编码变异HMGB1，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:13至少85％同源的序列或其片段。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码变异HMGB1，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码所述变异HMGB1，其中所述变异HMGB1包含在其第一核定位信号(NLS1)或第二核定位信号(NLS2)中的突变。在一些实施方案中，所述变异HMGB1进一步包含在boxA或boxB中的突变。在一些实施方案中，所述变异HMGB1进一步包含在boxA或boxB中的多个突变。在一些实施方案中，所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:15的位置43和65处的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述 HMGB1变体包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-183 中的至少一段。在一些实施方案中，所述HMGB1变体包含SEQ ID NO: 15的残基21-105、108-182和183-205。

一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的分离的多核苷酸、增溶剂和赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂包括缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任何组合中的一种或多种。在一些实施方案中，所述赋形剂包括二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、肌醇、山梨糖醇或其任何组合。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含防腐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含防腐剂、稀释剂和载体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的活性成分或其盐。在一些实施方案中，所述增溶剂是无菌水。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的活性成分，其中所述另外的活性成分是其他溶瘤病毒。

一个实施方案提供了一种用于产生如权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒的方法，所述方法包括：(i)通过将痘苗病毒碱基核酸序列可操作地连接至本公开内容中的所述外源核酸序列来生成经修饰的痘苗病毒DNA载体；(ii)用所述经修饰的痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合于病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞包括HeLa细胞、293细胞或Vero细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的痘苗病毒DNA载体中的如本公开内容中所述的外源核酸有助于主要含有细胞外包膜病毒(EEV)的病毒颗粒群体。在一些实施方案中，与不包含根据本公开内容的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒DNA载体相比，所述经修饰的痘苗病毒DNA载体中的如本公开内容中所述的外源核酸在HeLa细胞和293细胞的至少一种中产生更高的滴度。

一个实施方案提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或根据本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述治疗有效量的如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物，其中所述癌症是实体瘤、白血病或淋巴瘤。一个实施方案提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述治疗有效量的如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物，其中所述肿瘤是实体瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物。

一个实施方案提供了一种治疗具有高脂肪酸生物利用度的肿瘤的方法，其包括施用如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒在具有高游离脂肪酸生物利用度的肿瘤中表现出增加的肿瘤选择性复制。一个实施方案提供了一种治疗肥胖癌症患者的方法，其包括施用如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒在所述肥胖癌症患者中表现出增加的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，所述增加的肿瘤选择性复制是相对于不包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，所述增加的肿瘤选择性复制是相对于所述痘苗病毒在非肥胖癌症患者中的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，所述痘苗病毒在所述肥胖癌症患者中产生增加的EEV比例。在一些实施方案中，所述肥胖癌症患者中所述增加的EEV比例是相对于由不包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒所产生的EEV比例。在一些实施方案中，所述肥胖癌症患者中所述增加的EEV比例是相对于由所述痘苗病毒在非肥胖癌症患者中所产生的EEV比例。

一个实施方案提供了一种降低化疗后癌症复发的可能性的方法，其包括施用如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物制剂。

一个实施方案提供了一种治疗方法，其包括将如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物制剂施用于包括免疫疗法的先前治疗已失败的受试者。

一个实施方案提供了一种治疗方法，其包括将如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物制剂施用于化疗后癌症复发的受试者。

一个实施方案提供了一种治疗方法，其包括将如本公开内容所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容所述的药物制剂施用于患有腹膜癌的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是肥胖的。在一些实施方案中，所述方法包括施用如权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所述的药物制剂，其中所述方法进一步包括施用其他疗法。在一些实施方案中，所述方法包括将如权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所述的药物制剂与所述其他疗法联合施用，其中所述其他疗法包括化疗、放射、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任何组合。在一些实施方案中，所述其他疗法包括化疗。在一些实施方案中，相比于所述化疗与不包含如本文所述的编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的联合，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物制剂与化疗的联合施用导致协同效应。在一些实施方案中，相比于化疗与不包含如本文所述的编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的联合，化疗与如权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物制剂联合施用的剂量更低。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法同时或顺序地施用。在一些实施方案中，所述方法包括顺序施用所述其他疗法，其中在施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物之前施用所述其他疗法。在一些实施方案中，所述方法包括顺序施用所述其他疗法，其中在施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物之后施用所述其他疗法。一个实施方案提供了一种在癌细胞中产生毒性作用的方法，所述方法包括向癌细胞群体施用治疗有效量的如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述治疗有效量的如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述癌细胞群体中并非每个癌细胞都感染所述溶瘤痘苗病毒。在一些实施方案中，在未直接感染所述溶瘤痘苗病毒的情况下，未感染的癌细胞的生长被抑制。在一些实施方案中，在未直接感染所述溶瘤痘苗病毒的情况下，诱导出未感染的癌细胞中的细胞毒性免疫应答。一个实施方案提供了一种药物递送方法，其包括向受试者的肿瘤中引入如本公开内容中所述的溶瘤痘苗载体或如本公开内容中所述的药物制剂。在一些实施方案中，所述药物包含与肿瘤受体配体缀合的纳米颗粒。一个实施方案提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括施用感染如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒的细胞。在一些实施方案中，所述方法提高基于溶瘤痘苗病毒的癌症疗法的功效。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以包含约10⁶ PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用根据本公开内容的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以包含约5x10⁹PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用根据本公开内容的所述溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并且以高剂量施用第三时间段。在一些实施方案中，所述方法包括独立地施用所述初始剂量、所述中间剂量和所述高剂量，其中所述初始剂量低于所述中间剂量，并且所述中间剂量低于所述高剂量。在一些实施方案中，所述第一时间段、所述第二时间段和所述第三时间段各自为约1周至约3周。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒和所述药物组合物独立地构成液体剂型，所述液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL 至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL 至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350 mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500 mL至750mL或约750mL至1000mL的体积施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6 周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以每日一次、每日两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物静脉内施用、腹膜内施用或通过瘤内注射施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒或所述药物制剂以团注或缓慢输注的形式施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物的施用在自施用第一剂量起约1小时至约3天后导致第一峰值病毒载量，并且在约3天至约10天后导致第二峰值病毒载量。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10 周或约12周。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法以每日一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法经口服施用、静脉内施用、通过瘤内注射施用或通过放射施用。在一些实施方案中，所述方法包括将如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物施用于有需要的受试者，其中所述受试者是人。在一些实施方案中，所述方法包括将如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括将如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者被诊断为患有癌症或肿瘤，并且其中所述受试者是肥胖的。在一些实施方案中，所述方法包括将如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物与所述其他疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物或所述其他疗法之前，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括将如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物与所述其他疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者被诊断为患有癌症或肿瘤，并且其中所述受试者是肥胖的。在一些实施方案中，在施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物之前、同时或之后向所述受试者施用生酮饮食。在一些实施方案中，在施用如本公开内容中所述的溶瘤痘苗病毒或如本公开内容中所述的药物组合物之前、同时或之后对所述受试者进行短期禁食。

一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异 HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1 包含在其第一核定位信号(NLS1)、第二核定位信号(NLS2)或它们的任何组合中的突变。一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1与人 HMGB1(SEQ ID NO:16)的同源性小于或等于95％。一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基23、45、89-108和 150-183中的至少一段，并且其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO: 16的同源性小于或等于95％的氨基酸序列。一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。一个实施方案提供了一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:19至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述经修饰的病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、VSV、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、麻疹病毒、马拉巴病毒(Marabavirus)、新城疫病毒(NDV)、塞内加谷病毒(Seneca valley virus)、门戈病毒(Mengovirus)或粘液瘤病毒(Myxomavir)。

在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒包含NLS1和NLS2，其中NLS1包含SEQ IDNO:20，并且NLS2包含SEQ ID NO:21。

附图说明

在所附的权利要求书中具体阐述了本公开内容的新颖特征。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1示出了根据本公开内容的示例性变异HMGB1的结构和表达。图1(a)是示例性变异HMGB1蛋白(mHMGB1mut)的图示，与HMGB1野生型蛋白质(mHMGB1wt)相比，其具有位于BoxA 中的第一核定位信号(NLS1)区域中的突变和在Box B与酸性C尾之间的第二核定位信号(NLS2)区域中的突变；以及附接至蛋白质 5'端的IgE序列。图1(b)是包含变异HMGB1蛋白(mHMGB1mut) 的编码序列的痘苗病毒基因组的图示。图1(c)是凝胶电泳的图像，其示出了HMGB1野生型与HMGB1mut之间的分子量差异，并表明 HMGB1mut从痘苗病毒毒株的表达。图1(d)是示出在用阴性对照、 TK(具有病毒胸苷激酶基因缺失的对照溶瘤痘苗病毒)或 TK-HMGB1mut(具有病毒胸苷激酶基因缺失并且插入用于表达示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的编码序列的溶瘤痘苗病毒)感染指定细胞(Renca和4T1)后分泌的HMGB蛋白的量的图表。

图2示出了用含有示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的痘苗病毒处理对肿瘤生长的影响。图2(a)和(b)是示出在注射PBS、 TK(具有病毒胸苷激酶基因缺失的对照溶瘤痘苗病毒)或 TK-HMGB1mut(具有病毒胸腺嘧啶激酶基因缺失并且插入用于表达示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的编码序列的溶瘤痘苗病毒)后携带Renca或MC38肿瘤的小鼠中的相对肿瘤大小的图表。

图3示出了用含有示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的痘苗病毒处理对四种不同细胞系(包括Renca、MC38、4T1和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))中的细胞免疫应答以及对小鼠肿瘤生长的影响。示出了在用对照(PBS)、TK(具有病毒胸苷激酶基因缺失的对照溶瘤痘苗病毒)或TK-HMGB1mut(具有病毒胸腺嘧啶激酶基因缺失并且插入用于表达示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的编码序列的溶瘤痘苗病毒)处理的细胞系中(a)核因子κ-B激酶亚基β的磷酸化抑制剂(b)白细胞介素6(IL-6)；(c)干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)；(d)肿瘤坏死因子α以及(e)干扰素β的水平。图3(f)是示出对痘苗病毒的细胞免疫应答的图表，该应答在携带肿瘤并用PBS、TK或TK-HMGB1mut处理的小鼠中通过ELISpot测定来评价。图3(g)是示出在用PBS、 TK或TK-HMGB1处理后携带植入肿瘤的小鼠中的相对肿瘤大小的图表。

图4示出了用含有示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的痘苗病毒处理对细胞系和荷瘤小鼠中的病毒复制和肿瘤细胞存活率的影响。图4(a)包含这样的图表，其示出与具有来自痘苗病毒的TK表达相比，具有来自痘苗病毒的TK-HMGB1mut表达的Renca、MC38 和4T1细胞中的病毒复制增加。图4(b)包含示出用TK或 TK-HMGB1mut处理后Renca和MC38细胞的存活率的图表。图4(c) 示出了携带用TK或TK-HMGB1mut处理的Renca细胞衍生的肿瘤的小鼠中的病毒基因表达。图4(d)包含示出用TK或TK-HMGB1mut 处理后4T1细胞和MEF的存活率的图表。图4(e)示出了携带用TK 或TK-HMGB1mut处理的MC38细胞衍生的肿瘤的小鼠中的病毒基因表达。图4(f)示出了在用TK或TK-HMGB1mut处理的免疫缺陷小鼠的全身的体内病毒复制，而图(g)示出了在用TK或TK-HMGB1mut 处理的免疫缺陷小鼠的肿瘤中的体内病毒复制。

图5示出了用含有示例性变异HMGB1(HMGB1mut)的痘苗病毒处理对细胞系中的自噬和病毒复制的影响。轻链3(LC3)是用作自噬标志物的可溶性蛋白质。图5(a)是示出用PBS、TK或 TK-HMGB1mut处理的细胞系中LC3+细胞百分比的图表。图5(b) 包含这样的图表，其示出用单独的TK，或TK-HMGB1或，与自噬泡成熟抑制剂(包括巴佛洛霉素A(bafilomycinA)或LY294002)联合的TK或TK-HMGB1处理的Renca、MC38和4T1细胞系中的病毒复制。

图6示出了Atg5敲除和脂肪酸对细胞系和荷瘤小鼠中的病毒复制的影响。图6(a)是示出在不用或用靶向Atg5的siRNA转染的HCT116细胞中病毒复制随时间变化的图表。图6(b)是示出在不用或用浅蓝菌素(一种脂肪酸抑制剂)处理的MDA-MB-231细胞中病毒复制随时间变化的图表。图6(c)是生物发光图像，其示出在喂食对照饮食或高脂肪饮食的小鼠中，植入腹膜腔的肿瘤中的TK或 TK-HMGB1mut表达的病毒基因表达。图6(d)是这样的图表，其量化了在喂食对照饮食或高脂肪饮食(HFD)的小鼠中，在处理后第3 天时，植入腹膜腔的肿瘤中的TK或TK-HMGB1mut表达的病毒基因表达。

图7示出了单独的PBS、TK或TK-HMGB1mut或TK或 TK-HMGB1mut与化学治疗剂紫杉醇联合对肿瘤细胞存活率和肿瘤生长的影响。图7(a)是这样的图表，其示出了在喂食取自经PBS、TK或TK-HMGB1mut处理的UCI-101细胞的培养基且暴露于紫杉醇之后的肿瘤细胞存活率。图7(b)示出了用紫杉醇、TK和 TK-HMGB1mut的指定组合处理的小鼠中相对肿瘤大小随时间的变化。

图8示出了单独的痘苗毒株或结合基质金属蛋白酶-8(MMP8) 表达或透明质酸酶PH20表达的痘苗毒株的效果。图8(a)包含生物发光图像，其呈现了用痘苗毒株(WR)或者还表达MMP8或PH2O 的毒株处理的小鼠中的肿瘤的病毒基因表达。图8(b)示出了用仅痘苗毒株(仅WR TK)、痘苗毒株和MMP8表达(WR TK-mmp8)或痘苗毒株和PH20表达(WR TK-ph20)处理的生物发光成像数据(n＝5) 的量化。PH20的表达导致病毒传播增加。

图9示出了用单独的含有示例性变异HMGB1(HMGB1mut) 的痘苗病毒或结合PH20表达的该痘苗病毒处理对肿瘤体积的影响。通过单次静脉内处理，用1E7噬斑形成单位(PFU)的指定病毒来处理携带皮下MDA-MB-231肿瘤(50-100mm³)的无胸腺nu/nu小鼠。所示的肿瘤体积在治疗后14天时测量。

图10示出了表达HMGB1mut和PH20的病毒对肿瘤体积的影响。在第0天通过单次静脉内注射媒介物(作为对照)、1E8 PFU表达HMGB1mut和PH20的病毒(WO-H1)或1E8 PFU最佳同类临床病毒Pexa-Vec的模拟物(也称为JX-594(WR.TK-GMCSF+))来处理携带皮下Renca肿瘤(50-100mm³)的小鼠(BALB/c)。测量了随治疗后天数变化的肿瘤体积。

图11示出了在肥胖小鼠的腹膜癌模型中表达HMGB1mut和 PH20的病毒对肿瘤体积的影响。给小鼠(C57/BL6)喂食高脂肪饮食，直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％。然后向小鼠的腹膜腔中植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞。在肿瘤生长之后进行生物发光成像。一旦建立肿瘤，就通过单次低剂量腹膜内注射PBS(对照)、5E6 PFU表达HMGB1mut和PH20的病毒(WO-H1) 或5E6 PFU最佳同类临床病毒Pexa-Vec的模拟物(也称为JX-594 (WR.TK-GMCSF+)来处理小鼠。

图12示出了在喂食生酮饮食的小鼠中表达HMGB1mut和PH20 的病毒对肿瘤体积的影响。向小鼠(C57/BL6)的腹膜腔中植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞。在肿瘤生长之后进行生物发光成像。一旦建立肿瘤，就通过饥饿24小时的时间并随后用WO-H1 进行低剂量(5E6 PFU腹膜内)病毒处理(饥饿-病毒)来处理小鼠，或通过单独的病毒来处理小鼠。

具体实施方式

尽管本文中已经示出并描述了本公开内容的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本公开内容实施方案的各种替代方案可用于实施本公开内容。旨在以下权利要求限定本公开内容的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

某些定义

本文使用的术语仅为了描述具体情况，而并非旨在限制。如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”还包括复数形式。此外，在术语“含有”、“包括”、“具有”、“带有”或其变化形式用于具体实施方式和/或权利要求时，这样的术语旨在是包含性的，类似于术语“包含”。

术语“约”或“大约”可意指处于如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，该范围将部分取决于该值如何测量或确定，即测量系统的局限性。例如，“约”可意指按照本领域中的实践，在1个或超过1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内，如由术语“约”修饰的值的±10％内。

术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。这些术语均不要求或限于以医疗保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的照看(例如，持续或间歇的照看) 为特征的情况。在一些实施方案中，患者、受试者或个体可以在医疗保健工作者的照看下。

如本文所用，与特定病毒相关的术语“异源核酸序列”或“外源核酸序列”可以指源自除指定病毒之外的来源的核酸序列。

如本文所用，术语“突变”可以指缺失、异源核酸的插入、倒位或置换，包括本领域通常理解的消除突变的开放阅读框。

如本文所用，术语“基因”可以指编码单个蛋白质或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，其任选地与相关联的调节区如启动子、操纵子、终止子等在一起，该调节区域可以位于编码序列的上游或下游。

如在本文中可互换使用的术语“突变病毒”和“经修饰的病毒”可以指包含在其基因组中的一个或多个突变(包括但不限于缺失、异源核酸的插入、倒位、置换或其组合)的病毒。

如本文所用的有关病毒的术语“天然存在的”可以指示该病毒可以在自然界中发现，即它可以从自然界中的来源分离并且未经有意修饰。

本文提及的术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变化可包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。

如本文所用，“启动子”可以是控制序列，该控制序列是控制转录起始和转录速率的核酸序列区域。在某些实施方案中，启动子可含有调节蛋白和分子如RNA聚合酶和其他转录因子可结合的遗传元件。术语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“受控制”和“受转录控制”可意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。在某些实施方案中，启动子可以与或不与“增强子”结合使用，“增强子”是指与核酸序列的转录激活有关的顺式作用调节序列。

如本文所用，术语“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入间隙)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑到需要为了两个序列的最佳比对而引入的间隙的数目和每个间隙的长度。在一些实施方案中，为了比较而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或95％。搜索可以确定两个序列之间的同源性。同源性可以是在两个序列的整个长度之间或在两个序列的整个长度中的部分之间。两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过众所周知的方法完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90-5873-5877(1993)中。如Altschul,S.等人,Nucleic Acids Res., 25:3389-3402(1997)中所述，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST 程序(2.0版)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可设置为得分＝100，字长＝12，或者可以变化(例如，W＝5 或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法、 ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys, Cambridge,UK)中的GAP程序完成。

术语“受试者”可以指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在涉及例如哺乳动物受试者如人受试者时在本文中可互换使用。

术语“治疗”和“处理”可意在包括减轻或消除病症、疾病或病况；或与病症、疾病或病况相关的一种或多种症状；或者减轻或根除病症、疾病或病况本身的病因。治疗的理想效果可包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。

术语“治疗有效量”可以指在施用时可足以预防所治疗的病症、疾病或病况的一种或多种症状的发展或在一定程度上减轻该症状的化合物的量。术语“治疗有效量”还可以指足以引起研究人员、兽医、医生或临床医师正在寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物或医学反应的化合物的量。

术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”可以指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上，组分可以是“药学上可接受的”。它还适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过多的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，相当于有合理的益处/风险比。参见，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams和Wilkins:Philadelphia,PA, 2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版；Rowe等人编著, The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation: 2005；以及Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash和Ash 编著,Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation andFormulation,Gibson编著,CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004。

术语“药物组合物”可以指本文公开的化合物与其他化学组分如稀释剂或载体的混合物。药物组合物可以有利于将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。药物组合物还可以通过使化合物与无机或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等反应来获得。

如本文所用，“抗癌剂”可以指能够负面地影响受试者的癌症的药剂或疗法，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞中的凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或次数、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或增加患有癌症的受试者的寿命。抗癌剂的非限制性实例可包括生物制剂(生物疗法)、化疗药剂和放射疗法药剂。

如本文所用，术语“溶瘤”可以指通过药剂如溶瘤痘苗病毒来杀死癌症或肿瘤细胞，该杀死是例如通过经由刺激针对所述细胞的免疫应答、凋亡、表达有毒蛋白质、自噬和停止蛋白质合成、诱导抗肿瘤免疫力或其任何组合来直接裂解所述细胞。由药剂如溶瘤痘苗病毒感染的癌症或肿瘤细胞的直接裂解可以由该病毒在所述细胞内的复制导致。在某些实例中，术语“溶瘤”是指在不裂解所述细胞的情况下杀死癌症或肿瘤细胞。

经修饰的病毒

在一些实施方案中提供了经修饰的病毒，例如，溶瘤痘苗病毒，其可含有可编码变异HMGB1蛋白的外源核酸序列。还可通过单独地插入任何本文公开的外源核酸序列，或将该步骤与另外的外源核酸序列、病毒基因(例如，毒力基因)的进一步缺失或其任何组合相结合来修饰任何其他溶瘤病毒。病毒的实例包括但不限于单纯疱疹病毒 (HSV)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、VSV、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、麻疹病毒、马拉巴病毒、新城疫病毒(NDV)、塞内加谷病毒、门戈病毒或粘液瘤病毒。

本文所述的病毒包含一个或多个外源核酸序列，该序列可替代地称为转基因，可以生成编码变异HMGB1蛋白(在本文中也称为 HMGB1mut)的mRNA。在结构上，HMGB1蛋白大约为25kDa并且可包含由多个结构域如box A结构域、box B结构域、C末端酸性尾和由box B与C末端酸性尾之间的区域形成的结构域组成的结构。在 box A内，HMGB1蛋白可包含第一核定位信号(NLS1)，并且在由 box B与C末端酸性尾之间的区域形成的结构域内，HMGB1蛋白可包含第二核定位信号(NLS2)。图1(a)示出了HMGB1蛋白的示例性结构排列。在本公开内容的某些实施方案中，描述了病毒，例如，溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列，其中所述变异HMGB1包含NLS1和NLS2中的至少一个的突变。该外源核酸可包含在上述结构域如box A、box B或由box B与C末端酸性尾之间的区域形成的结构域，或其任何组合中的至少一个中的其他突变。在一些实例中，box A中的一个或多个突变可以与变异HMGB1 的细胞质重新定位相关联。在一些情况下，该外源核酸可不包含C末端酸性尾结构域。

细胞质重新定位可归因于box A内的NLS1中的一个或多个突变，或归因于位于由box B与C末端酸性尾之间的区域形成的结构域内的NLS2中的一个或多个突变，或归因于在box A内的NLS1和位于由box B与C末端酸性尾之间的区域形成的结构域内的NLS2二者中的一个或多个突变。重新定位到细胞质的变异HMGB1可有利于在已感染可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒的肿瘤细胞中，以及在感染的肿瘤细胞附近但可能未被痘苗病毒直接感染的细胞中诱导细胞毒性免疫应答。因此，与不包含编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，包含编码变异HMGB1 的外源核酸的本公开内容的溶瘤痘苗病毒可以更有效地作为肿瘤微环境中细胞毒性免疫应答的诱导剂，并通过旁观者效应在未感染的细胞中生成增强的细胞毒性免疫应答。

在一些实例中，当病毒例如包含编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒与化疗联合施用时，存在于如本文所述的变异 HMGB1中的突变，例如，在至少一个以下结构域中的一个或多个突变可以与增强的协同效应相关联：box A、box B、由box B与酸性C 末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合。在施用缺少编码变异HMGB1的外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒时未观察到所述协同效应，该变异HMGB1可包含至少一个以下结构域中的突变：box A、box B、由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由boxB与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合。与化疗联合的协同效应可通过免疫效应介导，并且在一些情况下可归因于变异HMGB1与 TLR4和RAGE中的至少一个的结合增强。

在一些实例中，存在于如本文所述的变异HMGB1中的突变，例如，在至少一个以下结构域中的一个或多个突变可与病毒例如可包含可编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性复制增加相关联：box A、box B、由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合。在施用缺少编码变异 HMGB1的外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒时未观察到所述肿瘤选择性复制的增加，该变异HMGB1可包含至少一个以下结构域中的突变：box A、box B、由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由boxB与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合。在一些实例中，增加的肿瘤特异性病毒复制可通过变异HMGB1对自噬的作用来介导，并且在一些情况下，归因于变异HMGB1蛋白内的某些半胱氨酸残基。

在一些实例中，存在于如本文所述的变异HMGB1中的突变，例如，在至少一个以下结构域中的一个或多个突变可与通过施用例如可包含可编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒而引起的肿瘤生长减少相关联：box A、box B、由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合，该溶瘤痘苗病毒降低肿瘤间质液压(TIFP)。在施用缺少编码变异HMGB1的外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒时未观察到通过降低TIFP而引起的所述肿瘤生长减少，该变异HMGB1可包含至少一个以下结构域中的突变：box A、box B、由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域；box A内的NLS1、在由box B与酸性C末端尾之间的区域形成的结构域内的NLS2或其任何组合。

在一些实施方案中，所述变异HMGB1可包含与SEQ ID NO:16 具有小于约或等于80％、小于约或等于81％、小于约或等于82％、小于约或等于83％、小于约或等于84％、小于约或等于85％、小于约或等于86％、小于约或等于87％、小于约或等于88％、小于约或等于89％、小于约或等于90％、小于约或等于91％、小于约或等于92％、小于约或等于93％、小于约或等于94％、小于约或等于95％、小于约或等于 96％、小于约或等于97％、小于约或等于98％或小于约或等于99％的同源性的氨基酸序列，SEQ ID NO:16对应于人野生型HMGB1(在本文中也称为HMGB1wt)。

在如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列内，HMGB1wt的各个结构域可如下描述：boxA可包含残基1-85；box B可包含残基88-162， C末端酸性尾可包含残基186-215；在box B与C末端酸性尾之间形成的结构域可包含残基162-185；NLS1可包含残基28-54；并且NLS2 可包含残基179-185。所述病毒的一些实例可包含可编码变异HMGB1 的外源核酸序列，该变异HMGB1与SEQ ID NO:16的同源性可小于约或等于95％，并且可包含残基1-85、89-108和150-183中的至少一段，其中与SEQ ID NO:16的氨基酸序列相比，所述残基1-85、89-108 和150-183中的至少一段可包含至少一个突变。例如，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含SEQ ID NO:16的残基1-85，其中该段中的一个或多个丝氨酸残基可以突变为例如丙氨酸。此外，在一些实例中，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含SEQ ID NO:16的残基 89-108，其中该段中的一个或多个苯丙氨酸残基可突变为例如谷氨酸。在其他实例中，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含SEQ ID NO:16的残基150-183，其中该段内的丝氨酸残基可突变为例如丙氨酸。在某些情况下，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含在SEQ ID NO: 16的位置35、42、89、181、189和202中的一个或多个处的突变。在其他情况下，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含在SEQ ID NO:16的位置35、42、89、181、189 和202的所有位置处的突变。

一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列，该变异HMGB1与SEQ ID NO:16 的同源性小于约或等于95％并且可包含SEQ IDNO:16的残基23、45、 23-45、89-108和150-183中的至少一段。在这样的病毒的情况下，位置23和45处的氨基酸均为半胱氨酸。关于残基89-108和150-183所覆盖的段，与氨基酸SEQ IDNO:16相比，如本文所述的编码变异 HMGB1的外源核酸可包含在这些段中的至少一个突变。例如，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含 SEQ IDNO:16的残基89-108，其中该段内的一个或多个苯丙氨酸残基可突变为例如谷氨酸。在其他实例中，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含SEQ IDNO:16的残基 150-183，其中该段内的丝氨酸残基可突变为例如丙氨酸。在某些情况下，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含在SEQ ID NO:16的位置35、42、89、181、189和202 的一个或多个处的突变。在其他情况下，所述病毒例如溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，该外源核酸序列可包含在SEQ ID NO:16的位置35、42、89、181、189和202的所有位置处的突变。在一些情况下，所述外源核酸包含SEQ ID NO:16的残基23-54，其中位置23和 45处的氨基酸可以是半胱氨酸，并且该段中的一个或多个丝氨酸残基可突变为例如丙氨酸。

另一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列或其片段，该变异HMGB1可以与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源。如上所述的病毒可包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。在一些情况下，所述病毒可包含SEQ ID NO:15的残基21-105、 109-128和170-203中的至少一段。由残基109-128和170-183所覆盖的段可分别在HMGB1变体与TLR4和RAGE的结合中起作用。当所述病毒例如包含编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒与化疗联合施用时，变异HMGB1与TLR4和RAGE中的至少一个的结合可与其能导致的免疫效果相关。SEQ ID NO:15的位置43和65中的氨基酸可以是半胱氨酸。在某些实例中，变异HMGB1的成熟形式可不包含SEQ ID NO:15的残基1-20。本文所述的核酸或氨基酸的“片段”可以指这样的部分，其包含该片段所属的核酸或氨基酸序列的全长的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％。

另一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列或其片段，该变异HMGB1可以与 SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源。如上所述的病毒可包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。在一些情况下，所述病毒可包含SEQ ID NO:17的残基21-105、 109-128和170-203中的至少一段。由残基109-128和170-183所覆盖的段可分别在HMGB1变体与TLR4和RAGE的结合中起作用。当所述病毒例如包含编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒与化疗联合施用时，变异HMGB1与TLR4和RAGE中的至少一个的结合可与免疫效果相关，该免疫效应可介导增强的协同效应。SEQ IDNO:17 的位置43和65处的氨基酸可以是半胱氨酸。SEQ ID NO:15的位置 43和65处的氨基酸可以是半胱氨酸。在某些实例中，变异HMGB1 的成熟形式可不包含SEQ ID NO:17的残基1-20。

另一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列或其片段，该变异HMGB1可以与 SEQ ID NO:4至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源。如上所述的病毒可包含SEQ ID NO:4的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。在一些情况下，所述病毒可包含SEQ ID NO:4的残基21-105、 109-128和170-203中的至少一段。由残基109-128和170-183所覆盖的段可分别在HMGB1变体与TLR4和RAGE的结合中起作用。当所述病毒例如包含编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒与化疗联合施用时，变异HMGB1与TLR4和RAGE中的至少一个的结合可与免疫效果相关，该免疫效果可介导增强的协同效应。SEQ ID NO:4的位置43和65处的氨基酸可以是半胱氨酸。SEQ ID NO:4的位置 43和65处的氨基酸可以是半胱氨酸。在某些实例中，变异HMGB1 的成熟形式可不包含SEQ ID NO:4的残基1-20。

另一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列或其片段，该变异HMGB1可以与 SEQ ID NO:5、6、22-23中的任一个至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源。在一些情况下，变异HMGB1的编码序列可以在上游与IgE前导序列的编码序列融合。所得蛋白质可包含IgE前导序列和随后的如 SEQ ID NO:24和25中所示的变异HMGB1序列。

在SEQ ID NO:4、15和17所示的氨基酸序列内，HMGB1的各个结构域可以如下描述：box A可包含残基21-105；box B可包含残基108-182，C末端酸性尾可包含残基206-235；在box B与C末端酸性尾之间形成的结构域可包含残基183-205；NLS1可包含残基47-74；并且NLS2可包含残基199-205。

另一个实施方案提供了病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可包含可编码变异HMGB1的外源核酸序列或其片段，该变异HMGB1可以与 SEQ ID NO:24-25中的任一个至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源。

在如SEQ ID NO:22和23所示的氨基酸序列内，HMGB1的各个结构域可如下描述：box A可包含残基1-85；box B可包含残基 88-162，C末端酸性尾可包含残基186-215；在boxB与C末端酸性尾之间形成的结构域可包含残基162-185；NLS1可包含残基28-54；并且NLS2可包含残基179-185。

在如SEQ ID NO:24和25所示的氨基酸序列内，HMGB1的各种结构域可如下描述：box A可包含残基19-103；box B可包含残基 106-180，C末端酸性尾可包含残基204-233；在box B与C末端酸性尾之间形成的结构域可包含残基181-203；NLS1可包含残基45-72；并且NLS2可包含残基197-203。

在一些情况下，在与SEQ ID NO:16小于约或等于95％同源的外源核酸的位置23和45以及与SEQ ID NO:4、15和17中任一个至少约80％同源的外源核酸的位置43和65处存在半胱氨酸残基可与可包含编码变异HMGB1的所述外源核酸序列之一的病毒例如溶瘤痘苗病毒的肿瘤特异性复制的增加相关。表达变异HMGB1蛋白的溶瘤痘苗病毒的肿瘤特异性复制增加可通过HMGB1蛋白对自噬的作用来介导，并且上文鉴定的半胱氨酸残基可起到同样的作用。

编码变异HMGB1的外源核酸可包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:13、2、3、7、9、14和19中的任一个至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在一些实例中，外源性核酸包含与SEQ IDNO:13中的任一个至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，至少约99％或100％同源的核酸序列，并且其中所述核酸编码变异HMGB1，该变异HMGB1与SEQ ID NO:15中的任一个至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约 96％、至少约97％、至少约98％，至少约99％或100％同源。

一个实施方案描述了病毒，例如溶瘤病毒，除变异HMGB1之外，其可进一步表达透明质酸酶。该透明质酸酶可由溶瘤痘苗病毒内的其他外源核酸序列编码；所述其他外源核酸序列可具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，并且从溶瘤痘苗病毒表达的透明质酸酶可具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。任何透明质酸酶均可从该病毒中表达，包括但不限于HYAL1、HYAL2和HYAL3、HYAL4、PH-20、 SPAM1(精子黏附分子1)以及HYALP1。

一个实施方案描述了病毒，例如溶瘤病毒，除变异HMGB1之外，其可进一步表达使该病毒在循环中稳定的蛋白质。这样的蛋白质的实例可包括IgE、Fc结构域蛋白质。在一些情况下，IgE可以由溶瘤痘苗病毒内的其他外源核酸序列编码；从溶瘤痘苗病毒表达的所述IgE可具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

编码透明质酸酶的外源核酸序列和编码IgE的序列可以与编码如本文所述的变异HMGB1的外源核酸序列可操作地连接。在一些实例中，IgE在上游与变异HMGB1编码基因和透明质酸酶编码基因二者融合。还考虑IgE、透明质酸酶和变异HMGB1编码基因的其他排列。

对所述病毒例如溶瘤痘苗病毒的另外的修饰可包括但不限于删除毒力基因如B8R(编码IFN-g结合蛋白)、B18R(编码I型IFN结合蛋白)、B13R(编码具有抗凋亡活性的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白SPI-1)、 B22R(编码具有抗凋亡活性的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白SPI-2)、B15R (编码IL-1b结合蛋白)、VGF(编码痘苗生长因子)、E3L(编码 dsRNA结合)、K3L(编码PKR结合)。

经修饰的病毒可进一步表达化疗敏化剂，如透明质酸；凋亡增强剂，如TRAIL或胱天蛋白酶。在一些情况下，经修饰的病毒可进一步表达外排泵阻滞剂，如多药物转运蛋白抑制剂。

在某些实施方案中，可以对用于插入病毒基因组(例如插入胸苷激酶基因座中或插入以代替溶瘤痘苗病毒的基因组内的其他缺失) 中的外源核酸序列进行密码子优化。此外，由这样的外源核酸序列表达的变异HMGB1，以及透明质酸酶和稳定化蛋白质序列均可具有变体，使得所得蛋白质保持其如本文所述的相应功能。在某些实施方案中，这样的变化称为保守置换。如本文所用，术语“保守置换”和“保守修饰”是指这样的氨基酸修饰，其不显著影响或改变本文公开的包含该氨基酸序列的变异HMGB1蛋白的结合特征。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入本公开内容的HMGB1蛋白中。氨基酸可根据其物理化学性质如电荷和极性分组。

保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被同组内的氨基酸替换的氨基酸置换。例如，氨基酸可按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，变异HMGB1蛋白内的一个或多个氨基酸残基可用来自同一组的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法来测试改变的变异HMGB1蛋白的功能保留。在某些实施方案中，改变特定序列内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基。

示例性保守氨基酸置换示于表I中。

表I

癌症靶标

在本公开内容的一个实施方案中，考虑了通过递送经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒来治疗过度增生性疾病如癌症或肿瘤的方法。可通过经修饰的病毒例如如本文所述的可包含编码变异 HMGB1蛋白的外源核酸的溶瘤痘苗病毒来治疗的癌症可包括但不限于黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、上皮癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、胰腺癌、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝细胞癌、胆管肉瘤、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、肠型胃腺癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓增生性赘生物和肉瘤。

可以通过本公开内容的方法治疗的癌细胞包括来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。另外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但不限于这些组织学类型：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病(paget'sdisease)，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌(sertoli cellcarcinoma)；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；勃勒纳瘤(brenner tumor)，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin's disease)；霍奇金症；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；以及多毛细胞白血病。在各个实例中，在可用于治疗本文公开的癌症靶标的本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒中使用的变异HMGB1可以是包含如SEQ ID NO:4、15、17、22、23、24或25 所示的序列的变异HMGB1。

本公开内容还考虑了用于抑制或预防任何类型的原发性癌症的局部侵袭或转移或两者的方法。例如，原发性癌症可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头部癌症、颈部癌症、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方案中，原发性癌症可以是肺癌。例如，肺癌可以是非小细胞肺癌。此外，本公开内容可用于预防癌症或治疗癌前病变或恶化前的细胞，包括化生、发育不良和增生。它还可用于抑制非期望但良性的细胞，例如鳞状化生、发育不良、良性前列腺增生细胞、增生性病变等。在一些实施方案中，可通过涉及可由经修饰的病毒例如如本文讨论的溶瘤痘苗病毒编码的变异HMGB1蛋白的本公开内容的方法来停止、破坏或延迟向癌症或更严重形式的癌症的进展。在各个实例中，用于本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒的变异HMGB1可用于抑制或预防任何类型的原发性癌症的局部侵袭或转移或两者，且可以是包含如SEQ ID NO:4、15、17、22、23、24或25所示的序列的变异HMGB1。

在一些情况下，可以施用经修饰的病毒如包含编码变异 HMGB1的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒，以用于治疗腹膜癌。腹膜癌可以指腹膜的癌症。腹膜可定义为沿腹壁排列并覆盖腹部器官的组织。原发性腹膜癌可以指起源于腹膜并且未从身体的另一部分扩散到腹膜的癌症。

此外，可以施用经修饰的病毒如包含编码变异HMGB1的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒，以用于治疗肿瘤微环境中具有高游离脂肪酸生物利用度的肿瘤。在一些情况下，由肥胖患者的肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给经修饰病毒并增强其在肿瘤内的复制。在非肥胖患者，尤其是患有腹膜癌的患者中，也可以实现这一优点。例如，几种腹膜癌可以是使用本公开内容的经修饰病毒的疗法的靶标，因为这些癌倾向于在网膜壁中生长并且可以由脂肪细胞供给，并且如上所述，由肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给经修饰病毒并且增强其在肿瘤内的复制。经修饰的病毒如包含编码变异HMGB1 的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒可以在具有高游离脂肪酸生物利用度的肿瘤中形成滴度增加的细胞外包膜病毒(EEV)。

可受益于本公开内容的经修饰病毒如表达变异HMGB1的溶瘤痘苗病毒(任选地表达透明质酸酶，例如PH-20)的示例性癌症患者群体包括但不限于肥胖的患者、生酮饮食或短期禁食的患者、患有腹膜癌的患者、患有原发性腹膜癌的患者、患有累及子宫、膀胱和直肠的腹膜癌的患者。此外，根据本文公开的方法，可以将先前免疫疗法已失败的患者鉴定为使用本文所述的经修饰的病毒来治疗的目标群体。此类患者可能无法从另一轮免疫疗法中受益，并且可以转向单独或与化疗联合的使用经修饰病毒如本公开内容的溶瘤痘苗病毒的治疗。因此，在免疫疗法失败的患者的情况下，使用本公开内容的经修饰病毒的疗法可以是关键的备选方案。

术语“肥胖的”或“肥胖”可以指其中个体具有等于或大于30 kg/m2的BMI的病况。根据世界卫生组织(WHO)的定义，肥胖可归类如下：术语“I类肥胖”可以是其中BMI等于或大于30kg/m2但低于35kg/m2的病况；术语“II类肥胖”可以是其中BMI等于或大于35 kg/m2但低于40kg/m2的病况；术语“III类肥胖”可以是其中BMI等于或大于40kg/m2的病况。18.5至24.9kg/m2的BMI可归类为正常，而25.0至29.9kg/m2的BMI可归类为超重。术语“体重指数”或“BMI”可定义为以千克为单位的体重除以以平方米为单位的高度，使得BMI 具有kg/m2的单位。BMI可以作为定义肥胖的一种量度。

治疗方法和测定疗效和药代动力学

本公开内容提供了通过施用如本文公开的一种或多种经修饰的病毒来治疗受试者的方法。如本文中可互换使用的“个体”或“受试者”是指人或非人受试者。非人受试者的非限制性实例包括非人灵长类动物、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、禽、马、牛、山羊、绵羊、鲸等。在一些实施方案中，受试者是人。

提供了在癌细胞中产生毒性作用的方法，该方法包括向癌细胞施用治疗有效量的经修饰的病毒例如如上所述的溶瘤痘苗病毒，或含有该病毒的药物组合物。本公开内容进一步提供了抑制第二癌细胞的生长和增殖中的至少一种的方法，该方法包括向第一癌细胞施用如上所述的经修饰的病毒，使得第一癌细胞被所述病毒感染。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，预期并非每种癌症或肿瘤细胞都在治疗有效量的如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物施用后被感染，并且可以在没有直接感染的情况下抑制未感染细胞的生长。

在一些实例中，为了使用本公开内容的方法和组合物来诱导溶瘤、杀死细胞、抑制生长、抑制转移、减小肿瘤大小以及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，可以使癌细胞或肿瘤与治疗有效剂量的如本文所述的示例性溶瘤痘苗病毒或含该病毒的药物组合物接触。在某些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导癌细胞的溶瘤、破坏或裂解，或癌细胞的生长或大小的抑制或减少的量。例如，可通过细胞死亡，或包含该细胞的肿瘤的复制速率或生长速率降低，或含有癌细胞的受试者的存活期延长来显现癌细胞生长的减慢。

在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症或肿瘤的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如上所述的经修饰的病毒。这样的方法中的有效量可包括减缓癌症的生长速率或扩散，或延长受试者存活期的量。本公开内容提供了减少肿瘤生长的方法，该方法可包括向肿瘤施用有效量的如上所述的经修饰的病毒。在某些实施方案中，经修饰的病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导肿瘤生长或大小的减缓、抑制或减少的量，并且可包括根除肿瘤。例如，可通过生长速率降低或含有肿瘤的受试者的存活期延长来显现肿瘤生长的减慢。

本公开内容还提供了确定如本文所述的溶瘤痘苗病毒的感染性或抗肿瘤活性或肿瘤特异性病毒复制量的方法，该方法可包括：(i) 向受试者施用单独或与其他疗法联合的治疗有效量的根据本公开内容的溶瘤痘苗病毒或药物组合物，其进一步表达萤光素酶报告基因； (ii)在施用该病毒后立即从受试者采集第一生物样品并确定第一生物样品中萤光素酶报告基因的水平；(iii)在步骤(ii)中施用后从受试者采集第二生物样品；以及并且(iii)检测第二生物样品中萤光素酶报告基因的水平，其中如果在步骤(iii)中萤光素酶的水平高于步骤(ii)，则确定溶瘤性痘苗病毒具有感染性、显示出抗肿瘤活性、表现出肿瘤特异性病毒复制。在步骤(i)中施用后约30分钟、约1 小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7 小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月、约2个月采集第二生物样品。在一些实施方案中，上述方法可进一步包括在步骤(i)和(iii) 中检测在向受试者施用治疗有效量的本公开内容的经修饰病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物后从所述受试者采集的血浆样品中的一个或多个测定细胞因子水平(例如，IL-2、 IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5和 IL-13)的水平。在本公开内容的一些实施方案中，与不含有编码变异 HMGB1的外源核酸序列但其他方面相同的病毒相比，对于本公开内容的经修饰病毒例如如上所述的含有编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒，上述步骤(ii)与(iv)之间萤光素酶生物发光的增加更高。用于在施用经修饰的病毒后检测和监测病毒载量的其他示例性技术包括实时定量PCR。

进一步提供了在施用根据本公开内容的治疗有效量的经修饰病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物后监测药代动力学的方法。用于监测药代动力学的示例性方法可包括以下步骤：(i)向受试者施用单独或与其他疗法联合的治疗有效量的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物；(ii)在步骤(i)中施用后的选自约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟和约240分钟、约5小时、约6 小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约 15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约 12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月的一个或多个时间点从受试者采集生物样品，以及(iii)检测在上述时间点采集的生物样品中病毒基因组(或插入病毒基因组内的报告基因，如萤光素酶基因)的量。在一些情况下，在15分钟时间点采集的样品中病毒基因组拷贝/mL可以是最高的，并且进一步地，在240分钟时间点采集的样品可能不包含可检测量的病毒基因组。因此，在一些情况下，在施用后约15分钟可观察到病毒峰值，并且大部分病毒可在约 240分钟(或4小时)后从受试者的系统中清除。在一些情况下，在施用后约15分钟后可以观察到第一病毒峰值，并且在随后的时间点 (例如，在约30分钟、约45分钟、约60分钟或约90分钟)采集的生物样品中可以观察到第二病毒峰值。在示例性实施方案中，生物样品可以是血液，并且可通过定量PCR或其他合适的技术来确定每mL 血液的病毒基因组的量。在一些实例中，在施用后约15分钟后可观察到第一病毒峰值，并且在施用本公开内容的经修饰病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48 小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9 天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约 1个月至约2个月后可观察到第二病毒峰值。

在一些情况下，可通过使用报告基因如萤光素酶基因来测量经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，可将萤光素酶基因插入病毒的基因组中，并且肿瘤细胞可以感染该病毒。可以测量感染的肿瘤细胞中的生物发光以监测肿瘤选择性复制。一些实例示出，与不含有编码变异HMGB1的外源核酸序列但其他方面相同的溶瘤性痘苗病毒相比，本公开内容的经修饰病毒如包含编码变异HMGB1的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒中的萤光素酶报告基因生物发光增加。

透明质酸酶PH-2O可以在细胞外基质降解中起作用，这可以改善病毒扩散。还可以通过使用报告基因如萤光素酶基因来测量病毒扩散。可将萤光素酶基因插入病毒的基因组中，并且肿瘤细胞可以感染该病毒。可以测量感染的肿瘤细胞中的生物发光以评估病毒扩散。一些实例示出，与不含有编码变异HMGB1及PH-20的外源核酸序列但其他方面相同的溶瘤性痘苗病毒相比，本公开内容的经修饰病毒如包含编码变异HMGB1及PH-20的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒中的萤光素酶报告基因生物发光增加。因此，在某些情况下，本公开内容的经修饰病毒如包含单独编码变异HMGB1或编码变异HMGB1及 PH-20的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒表现出与不具有上述外源基因的病毒相比增加的肿瘤特异性病毒复制和改善的病毒传播。

经修饰病毒的递送

在一些实施方案中，向受试者施用的本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒的量可为约10³至10¹²个感染性病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约10⁵至10¹⁰PFU，或约10⁵至10⁸PFU或约10⁸至 10¹⁰PFU。在一些实施方案中，向受试者施用的本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒的量可为约10³至10¹²个病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约10⁵至10¹⁰PFU，或约10⁵至10⁸PFU，或约10⁸至 10¹⁰PFU。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约10³PFU/剂量至约10⁴ PFU/剂量、约10⁴PFU/剂量至约10⁵PFU/剂量、约10⁵PFU/剂量至约10⁶ PFU/剂量、约10⁷PFU/剂量至约10⁸PFU/剂量、约10⁹PFU/剂量至约10¹⁰ PFU/剂量、约10¹⁰PFU/剂量至约10¹¹PFU/剂量、约10¹¹PFU/剂量至约 10¹²PFU/剂量、约10¹²PFU/剂量至约10¹³PFU/剂量、约10¹³PFU/剂量至约10¹⁴PFU/剂量或约10¹⁴PFU/剂量至约10¹⁵PFU/剂量。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x10³PFU/剂量、3x10³PFU/剂量、4x10³PFU/ 剂量、5x10³PFU/剂量、6x10³PFU/剂量、7x10³PFU/剂量、8x10³PFU/ 剂量、9x10³PFU/剂量、约10⁴PFU/剂量、约2x10⁴PFU/剂量、约3x10⁴ PFU/剂量、约4x10⁴PFU/剂量、约5x10⁴PFU/剂量、约6x10⁴PFU/ 剂量、约7x10⁴PFU/剂量、约8x10⁴PFU/剂量、约9x10⁴PFU/剂量、约10⁵PFU/剂量、2x10⁵PFU/剂量、3x10⁵PFU/剂量、4x10⁵PFU/剂量、5x10⁵PFU/剂量、6x10⁵PFU/剂量、7x10⁵PFU/剂量、8x10⁵PFU/ 剂量、9x10⁵PFU/剂量、约10⁶PFU/剂量、约2x10⁶PFU/剂量、约3x 10⁶PFU/剂量、约4x10⁶PFU/剂量、约5x10⁶PFU/剂量、约6x10⁶PFU/ 剂量、约7x10⁶PFU/剂量、约8x10⁶PFU/剂量、约9x10⁶PFU/剂量、约10⁷PFU/剂量、约2x10⁷PFU/剂量、约3x10⁷PFU/剂量、约4x10⁷ PFU/剂量、约5x10⁷PFU/剂量、约6x10⁷PFU/剂量、约7x10⁷PFU/ 剂量、约8x10⁷PFU/剂量、约9x10⁷PFU/剂量、约10⁸PFU/剂量、约 2x10⁸PFU/剂量、约3x10⁸PFU/剂量、约4x10⁸PFU/剂量、约5x10⁸ PFU/剂量、约6x10⁸PFU/剂量、约7x10⁸PFU/剂量、约8x10⁸PFU/ 剂量、约9x10⁸PFU/剂量、约10⁹PFU/剂量、约2x10⁹PFU/剂量、约 3x10⁹PFU/剂量、约4x10⁹PFU/剂量、约5x10⁹PFU/剂量、约6x10⁹ PFU/剂量、约7x10⁹PFU/剂量、约8x10⁹PFU/剂量、约9x10⁹PFU/剂量、约10¹⁰PFU/剂量、约2x10¹⁰PFU/剂量、约3x10¹⁰PFU/剂量、约4x10¹⁰PFU/剂量、约5x10¹⁰PFU/剂量、约6x10¹⁰PFU/剂量、约7x 10¹⁰PFU/剂量、约8x10¹⁰PFU/剂量、约9x10¹⁰PFU/剂量、约10¹⁰PFU/ 剂量、约2x10¹⁰PFU/剂量、约3x10¹⁰PFU/剂量、约4x10¹⁰PFU/剂量、约5x10¹⁰PFU/剂量、约6x10¹⁰PFU/剂量、约7x10¹⁰PFU/剂量、约8 x10¹⁰PFU/剂量、约9x10¹⁰PFU/剂量、约10¹¹PFU/剂量、约2x10¹¹PFU/ 剂量、约3x10¹¹PFU/剂量、约4x10¹¹PFU/剂量、约5x10¹¹PFU/剂量、约6x10¹¹PFU/剂量、约7x10¹¹PFU/剂量、约8x10¹¹PFU/剂量、约9 x10¹¹PFU/剂量或约10¹²PFU/剂量、约10¹²PFU/剂量至约10¹³PFU/剂量、约10¹³PFU/剂量至约10¹⁴PFU/剂量或约10¹⁴PFU/剂量至约10¹⁵PFU/ 剂量。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5x10⁹PFU/剂量。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含最高5x10⁹PFU/剂量。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约10³个病毒颗粒/剂量至约 10⁴个病毒颗粒/剂量、约10⁴个病毒颗粒/剂量至约10⁵个病毒颗粒/剂量、约10⁵个病毒颗粒/剂量至约10⁶个病毒颗粒/剂量、约10⁷个病毒颗粒/剂量至约10⁸个病毒颗粒/剂量、约10⁹个病毒颗粒/剂量至约10¹⁰个病毒颗粒/剂量、约10¹⁰个病毒颗粒/剂量至约10¹¹个病毒颗粒/剂量、约10¹¹个病毒颗粒/剂量至约10¹²个病毒颗粒/剂量、约10¹²个病毒颗粒/剂量至约 10¹³个病毒颗粒/剂量、约10¹³个病毒颗粒/剂量至约10¹⁴个病毒颗粒/剂量，或10¹⁴个病毒颗粒/剂量至约10¹⁵个病毒颗粒/剂量。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约10³PFU/kg至约10⁴PFU/kg、约10⁴PFU/kg 至约10⁵PFU/kg、约10⁵PFU/kg至约10⁶PFU/kg、约10⁷PFU/kg至约10⁸ PFU/kg、约10⁹PFU/kg至约10¹⁰PFU/kg、约10¹⁰PFU/kg至约10¹¹PFU/kg、约10¹¹PFU/kg至约10¹²PFU/kg、约10¹²PFU/kg至约10¹³PFU/kg、约 10¹³PFU/kg至约10¹⁴PFU/kg或约10¹⁴PFU/kg至约10¹⁵PFU/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x10³PFU/kg、3x10³PFU/kg、4x10³ PFU/kg、5x10³PFU/kg、6x10³PFU/kg、7x10³PFU/kg、8x10³PFU/kg、 9x10³PFU/kg、约10⁴PFU/kg、约2x10⁴PFU/kg、约3x10⁴PFU/kg、约4x10⁴PFU/kg、约5x10⁴PFU/kg、约6x10⁴PFU/kg、约7x10⁴PFU/kg、约8x10⁴PFU/kg、约9x10⁴PFU/kg、约10⁵PFU/kg、2x10⁵PFU/kg、3 x10⁵PFU/kg、4x10⁵PFU/kg、5x10⁵PFU/kg、6x10⁵PFU/kg、7x10⁵ PFU/kg、8x10⁵PFU/kg、9x10⁵PFU/kg、约10⁶PFU/kg、约2x10⁶PFU/kg、约3x10⁶PFU/kg、约4x10⁶PFU/kg、约5x10⁶PFU/kg、约6x10⁶PFU/kg、约7x10⁶PFU/kg、约8x10⁶PFU/kg、约9x10⁶PFU/kg、约10⁷PFU/kg、约2x10⁷PFU/kg、约3x10⁷PFU/kg、约4x10⁷PFU/kg、约5x10⁷PFU/kg、约6x10⁷PFU/kg、约7x10⁷PFU/kg、约8x10⁷PFU/kg、约9x10⁷PFU/kg、约10⁸PFU/kg、约2x10⁸PFU/kg、约3x10⁸PFU/kg、约4x10⁸PFU/kg、约5x10⁸PFU/kg、约6x10⁸PFU/kg、约7x10⁸PFU/kg、约8x10⁸PFU/kg、约9x10⁸PFU/kg、约10⁹PFU/kg、约2x10⁹PFU/kg、约3x10⁹PFU/kg、约4x10⁹PFU/kg、约5x10⁹PFU/kg、约6x10⁹PFU/kg、约7x10⁹PFU/kg、约8x10⁹PFU/kg、约9x10⁹PFU/kg、约10¹⁰PFU/kg、约2x10¹⁰PFU/kg、约3x10¹⁰PFU/kg、约4x10¹⁰PFU/kg、约5x10¹⁰PFU/kg、约6x10¹⁰ PFU/kg、约7x10¹⁰PFU/kg、约8x10¹⁰PFU/kg、约9x10¹⁰PFU/kg、约 10¹⁰PFU/kg、约2x10¹⁰PFU/kg、约3x10¹⁰PFU/kg、约4x10¹⁰PFU/kg、约5x10¹⁰PFU/kg、约6x10¹⁰PFU/kg、约7x10¹⁰PFU/kg、约8x10¹⁰ PFU/kg、约9x10¹⁰PFU/kg、约10¹¹PFU/kg、约2x10¹¹PFU/kg、约3x 10¹¹PFU/kg、约4x10¹¹PFU/kg、约5x10¹¹PFU/kg、约6x10¹¹PFU/kg、约7x10¹¹PFU/kg、约8x10¹¹PFU/kg、约9x10¹¹PFU/kg或约10¹² PFU/kg、约10¹²PFU/kg至约10¹³PFU/kg、约10¹³PFU/kg至约10¹⁴PFU/kg，或约10¹⁴PFU/kg至约10¹⁵PFU/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5 x10⁹PFU/kg。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含最高5x10⁹PFU/kg。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约10³个病毒颗粒/kg至约10⁴个病毒颗粒/kg、约10⁴个病毒颗粒/kg至约10⁵个病毒颗粒/kg、约10⁵个病毒颗粒/kg至约10⁶个病毒颗粒/kg、约10⁷个病毒颗粒/kg至约10⁸个病毒颗粒/kg、约 10⁹个病毒颗粒/kg至约10¹⁰个病毒颗粒/kg、约10¹⁰个病毒颗粒/kg至约 10¹¹个病毒颗粒/kg、约10¹¹个病毒颗粒/kg至约10¹²个病毒颗粒/kg、约 10¹²个病毒颗粒/kg至约10¹³个病毒颗粒/kg、约10¹³个病毒颗粒/kg至约 10¹⁴个病毒颗粒/kg，或约10¹⁴个病毒颗粒/kg至约10¹⁵个病毒颗粒/kg。

在某些实施方案中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒的液体剂型可包含约10³PFU/mL至约10⁴PFU/mL、约10⁴PFU/mL至约10⁵PFU/mL、约10⁵PFU/mL至约10⁶PFU/mL、约10⁷PFU/mL至约10⁸PFU/mL、约 10⁹PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL至约10¹¹PFU/mL、约 10¹¹PFU/mL至约10¹²PFU/mL、约10¹²PFU/mL至约10¹³PFU/mL、约 10¹³PFU/mL至约10¹⁴PFU/mL或约10¹⁴PFU/mL至约10¹⁵PFU/mL的病毒剂量。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x10³PFU/mL、3x10³ PFU/mL、4x10³PFU/mL、5x10³PFU/mL、6x10³PFU/mL、7x10³ PFU/mL、8x10³PFU/mL、9x10³PFU/mL、约10⁴PFU/mL、约2x10⁴ PFU/mL、约3x10⁴PFU/mL、约4x10⁴PFU/mL、约5x10⁴PFU/mL、约6x10⁴PFU/mL、约7x10⁴PFU/mL、约8x10⁴PFU/mL、约9x10⁴ PFU/mL、约10⁵PFU/mL、2x10⁵PFU/mL、3x10⁵PFU/mL、4x10⁵ PFU/mL、5x10⁵PFU/mL、6x10⁵PFU/mL、7x10⁵PFU/mL、8x10⁵ PFU/mL、9x10⁵PFU/mL、约10⁶PFU/mL、约2x10⁶PFU/mL、约3x10⁶ PFU/mL、约4x10⁶PFU/mL、约5x10⁶PFU/mL、约6x10⁶PFU/mL、约7x10⁶PFU/mL、约8x10⁶PFU/mL、约9x10⁶PFU/mL、约10⁷PFU/mL、约2x10⁷PFU/mL、约3x10⁷PFU/mL、约4x10⁷PFU/mL、约5x10⁷ PFU/mL、约6x10⁷PFU/mL、约7x10⁷PFU/mL、约8x10⁷PFU/mL、约9x10⁷PFU/mL、约10⁸PFU/mL、约2x10⁸PFU/mL、约3x10⁸PFU/mL、约4x10⁸PFU/mL、约5x10⁸PFU/mL、约6x10⁸PFU/mL、约7x10⁸ PFU/mL、约8x10⁸PFU/mL、约9x10⁸PFU/mL、约10⁹PFU/mL、约2 x10⁹PFU/mL、约3x10⁹PFU/mL、约4x10⁹PFU/mL、约5x10⁹PFU/mL、约6x10⁹PFU/mL、约7x10⁹PFU/mL、约8x10⁹PFU/mL、约9x10⁹ PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL、约2x10¹⁰PFU/mL、约3x10¹⁰PFU/mL、约 4x10¹⁰PFU/mL、约5x10¹⁰PFU/mL、约6x10¹⁰PFU/mL、约7x10¹⁰ PFU/mL、约8x10¹⁰PFU/mL、约9x10¹⁰PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL、约2x10¹⁰PFU/mL、约3x10¹⁰PFU/mL、约4x10¹⁰PFU/mL、约5x10¹⁰ PFU/mL、约6x10¹⁰PFU/mL、约7x10¹⁰PFU/mL、约8x10¹⁰PFU/mL、约9x10¹⁰PFU/mL、约10¹¹PFU/mL、约2x10¹¹PFU/mL、约3x10¹¹ PFU/mL、约4x10¹¹PFU/mL、约5x10¹¹PFU/mL、约6x10¹¹PFU/mL、约7x10¹¹PFU/mL、约8x10¹¹PFU/mL、约9x10¹¹PFU/mL或约10¹²PFU/mL、约10¹²PFU/mL至约10¹³PFU/mL、约10¹³PFU/mL至约10¹⁴ PFU/mL，或约10¹⁴PFU/mL至约10¹⁵PFU/mL。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5x10⁹PFU/mL。在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含最高5x10⁹ PFU/mL。

在一些情况下，在通过注射施用经修饰的病毒时，剂量可包括每次注射约10³个病毒颗粒、每次注射10⁴个病毒颗粒、每次注射10⁵个病毒颗粒、每次注射10⁶个病毒颗粒、每次注射10⁷个病毒颗粒、每次注射10⁸个病毒颗粒、每次注射10⁹个病毒颗粒、每次注射10¹⁰个病毒颗粒、每次注射10¹¹个病毒颗粒、每次注射10¹²个病毒颗粒、每次注射2x10¹²个病毒颗粒、每次注射10¹³个病毒颗粒、每次注射10¹⁴个病毒颗粒或每次注射10¹⁵个病毒颗粒。在其他情况下，在通过注射施用经修饰的病毒时，剂量可包括每次注射约10³个感染性病毒颗粒、每次注射10⁴个感染性病毒颗粒、每次注射10⁵个感染性病毒颗粒、每次注射10⁶个感染性病毒颗粒、每次注射10⁷个感染性病毒颗粒、每次注射 10⁸个感染性病毒颗粒、每次注射10⁹个感染性病毒颗粒、每次注射10¹⁰个感染性病毒颗粒、每次注射10¹¹个感染性病毒颗粒、每次注射10¹²个感染性病毒颗粒、每次注射2x10¹²个感染性病毒颗粒、每次注射10¹³个感染性病毒颗粒、每次注射10¹⁴个感染性病毒颗粒或每次注射10¹⁵个感染性病毒颗粒。在另外的实施方案中，本公开内容的经修饰的病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可为约10³半数组织培养抑制剂剂量 (TCID₅₀)/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴ TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、 10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、3x10⁸ TCID₅₀/kg、4x10⁸TCID₅₀/kg、5x10⁸TCID₅₀/kg、3x10⁹TCID₅₀/kg、4x10⁹ TCID₅₀/kg、5x10⁹TCID₅₀/kg、3x10¹⁰TCID₅₀/kg、4x10¹⁰TCID₅₀/kg或4x10¹⁰TCID₅₀/kg。注意，本文中10^x替代地表示为1eX。在某些实施方案中，经修饰的病毒可以以一个或多个剂量施用。在某些实施方案中，病毒可以以一定量施用，该量足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞、肿瘤中至少约30％的细胞、肿瘤中至少约40％的细胞、肿瘤中至少约50％的细胞、肿瘤中至少约60％的细胞、肿瘤中至少约70％的细胞、肿瘤中至少约80％的细胞或肿瘤中至少约90％的细胞的溶瘤作用。在某些实施方案中，单剂量的病毒可以指在1、2、5、10、15、20或24 小时的时期内施用于受试者或肿瘤的量。在某些实施方案中，该剂量可以随时间或通过单独注射来扩散。在某些实施方案中，可以向受试者施用多剂量(例如，2、3、4、5、6或更多剂量)的痘苗病毒，例如，其中在第二次治疗可在第一次治疗的1、2、3、4、5、6、7天或数周内进行。在某些实施方案中，可以在1、2、3、4、5、6、7天或更多天或数周的时期内向受试者施用多剂量的经修饰的病毒。在某些实施方案中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2 周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约 7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48 周、约48周或约52周或更长的时期内施用。在某些情况下，如本文所述的溶瘤疫苗病毒或药物组合物的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每 6个月一次)。在本文公开的方法的一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并且以高剂量施用第三时间段。在一些实施方案中，初始剂量低于中间剂量，并且中间剂量低于高剂量。在一些实施方案中，第一时间段、第二时间段和第三时间段可以独立地为约1周至约2周、约 2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11 周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48 周或约52周，或更长。

在一些实例中，根据本文所述的任何治疗方法，可以在施用经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤疫苗病毒或包含该病毒的药物组合物之前、同时和之后使所述受试者进食碳水化合物减少的饮食，例如生酮饮食。在某些实施方案中，使所述受试者进食这样的饮食，该饮食可包括食用每天少于500克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于400克的碳水化合物、每天少于350克的碳水化合物、每天少于300克的碳水化合物、每天少于 250克的碳水化合物、每天少于200克的碳水化合物、每天少于150克的碳水化合物、每天少于100克的碳水化合物、每天少于90克的碳水化合物、每天少于80克的碳水化合物、每天少于70克的碳水化合物、每天少于60克的碳水化合物、每天少于50克的碳水化合物、每天少于40克的碳水化合物、每天少于30克的碳水化合物、每天少于20克的碳水化合物，或每天少于10克的碳水化合物。

用于将本公开内容的经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物递送至癌症或肿瘤细胞的示例性方法可以通过肿瘤内注射。然而，也可以使用替代的施用方法，例如静脉内、通过输注、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、透皮、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内或腹膜内。施用途径可随肿瘤的位置和性质而变化。在某些实施方案中，施用途径可以是牙内、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、局部(例如，在肿瘤附近，特别是肿瘤的脉管系统或相邻脉管系统)、经皮、鞘内、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、肿瘤内、吸入、灌注、通过灌洗或口服。可注射剂量的溶瘤病毒可以以团注或缓慢输注的形式施用。在某些实施方案中，可从植入患者体内的源头向患者施用经修饰的病毒。在某些实施方案中，经修饰的病毒的施用可以通过在选定的一段时间内连续输注来进行。在一些情况下，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物可以通过在约15分钟、约30分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约100分钟或约120分钟或更长的时间段内输注而以治疗有效剂量施用。本公开内容的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂量的形式施用，其中施用的总体积为约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL或约750mL至1000mL。

药物组合物

含有经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒的药物组合物可制备成溶液、在甘油、液体聚乙二醇中的分散体、及其在油中的任何组合、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或它们的任何组合。在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含增溶剂，如无菌水、 Tris缓冲液。在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含赋形剂。赋形剂可以是the Handbook ofPharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例可包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。

在一些实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例可包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合可用于药物制剂。

在一些实施方案中，赋形剂可包含防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例可包括抗氧化剂如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和酚。抗氧化剂可进一步包括但不限于 EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂可包括有效霉素A、TL-3、正钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例可包括淀粉、预糊化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮(polyvinyloxoazolidone)、聚乙烯醇、C₁₂-C₁₈脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、低聚糖及其组合。可在药物制剂中使用的粘合剂可选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然树胶和合成树胶；明胶；纤维素衍生物如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡类；碳酸钙；磷酸钙；醇类如山梨糖醇、木糖醇、甘露醇，以及水或其组合。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例可包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。可在药物制剂中使用的润滑剂可选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石粉或其组合。在一些实施方案中，药物制剂可包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例可包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂可以是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例可包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉，其预糊化和改性淀粉、甜味剂、粘土如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、羟基乙酸淀粉钠、树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶 (pecitin)和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂可以是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例可包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在一些实施方案中，赋形剂可包含调味剂。掺入外层的调味剂可选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶子、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树油；香草油；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏的香精。

在一些实施方案中，赋形剂可包含甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例可包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿司帕坦；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(甜菊甙)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；以及糖醇如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇 (sylitol)等。

在一些情况下，如本文所述的药物组合物可包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和化妆品着色剂(FD&C)、药物和化妆品着色剂(D&C)，以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D &C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。

在一些情况下，如本文所述的药物组合物可包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂可以是真菌螯合剂。实例可包括但不限于：乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1,2-环己二胺-N,N,N',N'-四乙酸一水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨基-2-羟基丙烷- N,N,N',N'-四乙酸；1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；乙二胺-N,N'- 二乙酸；乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N'-双(亚甲基膦酸) 半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸；乙二胺-N,N,N',N'-四 (亚甲基膦酸)；O,O'-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N',N'-四乙酸；N,N-双 (2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-六亚甲基二胺-N,N,N',N'-四乙酸； N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N',N'- 四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三乙烯四胺-N,N,N',N",N'",N'"-六乙酸。

还考虑了组合产品，其包含一种或多种本文公开的经修饰病毒和一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂，例如，多烯如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素、唑类和三唑类如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等；葡聚糖合酶抑制剂如卡泊芬净、米卡芬净(FK463) 和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙胺类如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。此外，预期肽可以与局部抗真菌剂如环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他局部药剂组合。在一些情况下，药物组合物可包含另外的药剂。在一些情况下，另外的药剂可以以治疗有效量存在于药物组合物中。

在通常的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物可包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物可不包含防腐剂。适于可注射使用的药物形式可包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物可包含载体，该载体为溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油，或其任何组合。例如，可通过使用诸如卵磷脂等涂层，通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。

例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，可以将液体剂型适当地缓冲，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可将一个剂量溶于1mL至20mL的等渗NaCl 溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中或在建议的输注部位处注射。

在某些实施方案中，可通过将根据本公开内容的经修饰病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物以所需的量掺入具有上文列举的各种其他成分(根据需要)的适当溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散剂，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。本文公开的组合物可配制成中性或形式盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)并且该盐是与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。通过游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，药物组合物可以以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。

在某些实施方案中，本公开内容的药物组合物可包含有效量的本文公开的经修饰的病毒，以及药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且/或者对其所施用至的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的其他非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有经修饰病毒的植入元件，或任何其他合适的媒介物、递送或分配装置或材料。这样的载体可通过常规方法配制，并且可以以有效量施用于受试者。

生产方法

可以通过本领域技术人员已知的方法来产生本公开内容的经修饰的病毒。在某些实施方案中，经修饰的病毒可以在合适的宿主细胞 (例如，HeLa细胞、293细胞或Vero细胞)中繁殖，从宿主细胞中分离并在有利于病毒的稳定性和完整性的条件下储存，从而使传染性随时间的丧失最小化。在某些示例性方法中，使用细胞堆叠器(cell stack)、滚瓶或灌注生物反应器在宿主细胞中繁殖经修饰的病毒。在一些实例中，用于纯化经修饰的病毒的下游方法可包括过滤(例如，深度过滤、正切流动过滤或其组合)、超速离心或色谱捕获。可以例如通过冷冻或干燥，如通过冻干法来储存经修饰的病毒。在某些实施方案中，在施用之前，可以恢复所储存的经修饰病毒(如果被干燥以供储存)并稀释在药学上可接受的载体中以供施用。

一些实施方案表明，与不含有编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的病毒相比，如本文所述的经修饰的病毒如包含编码变异HMGB1的外源核酸的溶瘤痘苗病毒在HeLa细胞和293细胞中表现出更高的滴度。在某些情况下，观察到表达变异HMGB1和透明质酸酶如PH-20的经修饰的痘苗病毒在HeLa细胞和293细胞中有更高的滴度。

联合疗法

在某些实施方案中，本公开内容的方法包括在一种或多种其他疗法之后、之前或与其联合地施用如本文公开的经修饰的病毒或含有该病毒的药物组合物。其他疗法的实例可包括但不限于化疗、放射疗法、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、抗癌剂或其任何组合。相对于经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒的施用，其他疗法可以同时或顺序地施用。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在一种或多种抗癌剂或癌症疗法之后、之前或与其联合地施用如本文公开的经修饰的病毒。抗癌剂可包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法可包括化疗、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在本公开内容的经修饰的病毒，例如包含编码单独的如本文所述的HMGB1或编码该HMGB1及 PH-20的外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒之后、之前或与联合地施用本文公开的经修饰的病毒。溶瘤痘苗病毒与化疗的联合实现了协同效应，该协同效应在不含有变异HMGB1编码核酸序列的经修饰病毒中未观察到。上述联合的协同效应可有利地用于降低化疗如的剂量。因此，本文公开的使用经修饰病毒的治疗方法可以降低与化疗相关的毒性，例如，对化疗有反应但在治疗剂量下遭受副作用的患者。在某些情况下，与单独的化疗或单独的溶瘤痘苗病毒相比，协同效应可导致肿瘤生长降低。肿瘤生长的示例性降低可为约2％至约50％，如约 5％、约10％、约20％、约25％、约35％、约45％或约50％。

在某些实施方案中，使用经修饰病毒的治疗可单独使用或与一种或多种免疫调节剂联合使用。免疫调节剂可包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。在某些实施方案中，免疫调节剂能够抑制对经修饰病毒的先天免疫或适应性免疫。免疫调节剂的非限制性实例包括抗-CD33抗体或其可变区、抗-CD11b 抗体或其可变区、COX2抑制剂(例如，塞来昔布)、细胞因子如IL-12、 GM-CSF、IL-2、IFN3和1FNy，以及趋化因子如MIP-1、MCP-1和 IL-8。在某些实施方案中，免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂，例如但不限于抗-CTLA4、抗-PD-1、抗-PDL1和TLR激动剂(例如，Poly 1:C)。

在某些实例中，在其他疗法是放射的情况下，示例性的剂量可以为5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad (500Gy)，或所述范围内的其他合适剂量。或者，放射剂量可以为约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy或约44Gy，或所述范围内的其他合适剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“Gy”可以指辐射的特定吸收剂量的单位，其等于100Rad。Gy是“Gray”的缩写。

在某些实施例中，在其他疗法是化疗的情况下，示例性的化学治疗剂可包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、肼和三嗪、亚硝基脲和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和各种抗肿瘤药(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性的化学治疗剂可包括但不限于阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧基羰基 -5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星 依托泊苷磷酸氟达拉滨5- 氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌麦罗塔、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他汀、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物枸橼酸他莫昔芬替尼泊甙6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨依鲁替尼、艾代拉利司(idelalisib)和维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)。

示例性的烷化剂可包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯(triazenes)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen )、盐酸氮芥环磷酰胺(Revimmune^TM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三亚乙基三聚氰胺三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺噻替派白消安 卡莫司汀洛莫司汀链脲菌素和达卡巴嗪另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-D，)；美法仑 (也称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU，)；顺铂(也称为CDDP，和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，)；异环磷酰胺泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(也称氮芥、盐酸氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐，)；链脲菌素噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，)；环磷酰胺 以及盐酸苯达莫司汀

示例性的蒽环类可包括但不限于，例如，多柔比星(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(Ellence^TM)；伊达比星(Idamycin )；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素 (ravidomycin)；以及去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。

示例性的长春花生物碱可包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，和)；以及长春瑞滨

示例性的蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2- 吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；以及O- 甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基 -N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

如本文所用，“与......联合”意指将经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物与其他疗法如包含一种或多种药剂的其他疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施方案中，联合使用并不要求在施用前将经修饰的病毒与一种或多种药剂物理混合，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，经修饰的病毒和一种或多种药剂可以同时施用于所治疗的受试者，或者可以同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点顺序施用。

在各个实施方案中，其他疗法可以以液体剂型、固体剂型、栓剂、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。在某些实施方案中，其他疗法在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约 4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时间内施用。在某些情况下，其他疗法的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在某些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可包括向受试者施用有效量的经修饰的病毒，例如痘苗病毒，该病毒表达编码变异HMGB1蛋白的一种或多种核酸，该变异HMGB1 蛋白包含与选自SEQ ID NO:4、15、17、19、5、6、8、10和22-25 的氨基酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约 98％、约99％或100％同源的氨基酸序列及其保守取代。例如，非限制性地，本公开内容的经修饰的病毒可包含这样的核酸，该核酸可包含与选自SEQ ID NO:8-10的核酸序列至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开内容的方法可进一步包括向受试者施用有效量的一种或多种药剂。例如，非限制性地，该药剂可以是如上所述的抗癌剂、免疫调节剂或其任何组合。

试剂盒

在实施方案中，本公开内容提供了用于施用如本文所述的经修饰病毒的试剂盒。在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包括经修饰的病毒或包含如上所述的经修饰病毒的药物组合物。在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可进一步包含一种或多种组成部分如使用说明书、装置和其他试剂，以及用于执行上述方法的组成部分如管、容器和注射器。在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可进一步包含一种或多种药剂，例如抗癌剂、免疫调节剂或其任何组合中的至少一种，该药剂可以与经修饰的病毒联合施用。

在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含一个或多个含有本文公开的经修饰病毒的容器。例如，非限制性地，本公开内容的试剂盒可包含一个或多个容器，该容器含有表达变异HMGB1并且表达或不表达PH20和IgE中的至少一种或其任何组合的经修饰的痘苗病毒。在某些实施方案中，变异HMGB1可以与细胞穿透肽缀合。

在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含有效量的经修饰的痘苗病毒，该经修饰的痘苗病毒包含编码变异HMGB1的一种或多种核酸，该变异HMGB1可包含可与选自SEQ ID NO:4、15、17和 22-25的氨基酸序列至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列及其保守取代。在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含有效量的经修饰的痘苗病毒，该经修饰的痘苗病毒包含编码变异 HMGB1的一种或多种核酸，该变异HMGB1可包含可与SEQ ID NO: 16小于约或等于85％、小于约或等于90％、小于约或等于95％、小于约或等于96％、小于约或等于97％或小于约或等于98％或小于约或等于99％同源的氨基酸序列及其保守取代。

在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含使用说明书、用于向受试者施用经修饰的病毒的装置或用于向受试者施用另外的药剂或化合物的装置。例如，非限制性地，说明书可包括对经修饰的病毒和可选的试剂盒中包含的其他组成部分，以及施用方法的描述，该施用方法包括用于确定受试者的适当状态、适当剂量的方法以及用于施用经修饰的病毒的适当施用方法。说明书还可包括在治疗时间的期间内监测受试者的指南。

在某些实施方案中，本公开内容的试剂盒可包含用于向受试者施用经修饰病毒的装置。本领域已知的用于施用药物和药物组合物的各种装置中的任一种均可包含在本文提供的试剂盒中。例如，非限制性地，这样的装置包括皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器如点眼药器。在某些实施方案中，有待例如通过静脉内注射、瘤内注射、腹膜内注射来全身递送的经修饰病毒可包含在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。

实施例

以下实施例进一步说明了所描述的实施方案，但不限制本公开内容的范围。

实施例1：示例性变异HMGB1的设计和表达

图1a中示出了提供意想不到的治疗优势的变异HMGB1(在本文中也称为“HMGB1mut”)的一个实例。该图示出，HMGB1中的两个核定位信号(NLS)突变，并且IgE序列与该转基因的N末端融合以使该蛋白质在细胞外环境中稳定。这增加了变异HMGB1的免疫激活功能，从而允许更强的旁观者效应，其中在周围未感染的细胞中的摄取导致增强的自噬。

在病毒p7.5启动子的控制下将该转基因插入病毒胸苷激酶基因座中(图1b)。胸苷激酶功能的丧失是一种经充分表征的用于产生肿瘤选择性VACV载体的方法。另外，在pSE/L启动子的控制下将萤光素酶插入相同基因座中，并将其用作报告基因以在体外和体内跟踪病毒基因表达。在用不同病毒感染后的两个小鼠肿瘤细胞系(Renca 和4T1)的培养基中通过蛋白质印迹(图1c)和ELISA(图1d)证实了HMGB1mut的表达。

实施例2：示例性变异HMGB1的病毒表达增强癌细胞系和鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达HMGB1mut的核酸的溶瘤痘苗病毒(在本文中称为TK-)相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤痘苗病毒(其中胸苷激酶基因被删除并且添加编码变异 HMGB1的外源核酸)(在本文中称为TK-HMGB1mut)在癌细胞系和鼠模型中的效果。

在最初的体内实验中，使用单次静脉内剂量的病毒(TK-或 TK-HMGB1mut)来处理具有预先建立的皮下肿瘤的免疫活性小鼠(图 2)。可以看出，在正常抗性Renca肿瘤模型中，HMGB1mut表达导致显著增强的治疗活性。在更敏感的MC38模型中，HMGB1mut表达提供了额外且显著的治疗益处；然而，这并不那么引人注目。

在一系列小鼠肿瘤和正常细胞系中检查了HMGB1mut表达的作用，以更好地确定使治疗活性增强的机制。最初注意到，HMGB1mut 表达使磷酸化的IKKb水平显著增加(图3a)。预计这将导致NF-κB 活化，进而可使细胞对凋亡敏感和/或增强多种细胞因子的释放。然而，在感染表达HMGB1mut的病毒(相对于TK-病毒感染)后，与先天性免疫和适应性免疫有关的多种细胞因子和趋化因子的表达水平没有改变或降低(图3b-e)。此外，在幼稚BALB/c小鼠接种TK-或 TK-HMGB1mut后，诱导的抗病毒CTL应答水平没有显著变化；事实上，存在CTL应答随HMGB1mut表达降低的趋势，尽管这并不显著 (图3f)。最后，当用TK-或TK-HMGB1mut处理携带Renca肿瘤的 SCID小鼠时，HMGB1mut表达保持治疗优势(图3g)。因此，由该转基因提供的治疗优势存在非免疫组分。

HMGB1通常与细胞存活相关。因此，当使用HMGB1mut时，预期病毒复制减少或病毒复制没有增加。然而，当使用HMGB1mut 时，一个意外的发现是在培养的多个肿瘤细胞系中观察到病毒复制的增加(图4a)。尽管细胞杀伤的差异不显著，但观察到这种意外的、增加的复制(图4b和4d)。HMGB1mut表达导致细胞杀伤的小幅度增加，其与的激活增加相结合(图3a)

细胞凋亡。

在体内肿瘤中也观察到病毒复制增加，其中在Renca(图4c) 和MC38(图4e)肿瘤中都检测到病毒萤光素酶基因表达的显著增加。Renca肿瘤模型中的增加更为显著，该模型也显示出更大的治疗效益增加(图2)。值得注意的是，体内观察到的复制增加(病毒基因表达)局限于肿瘤(图4f)，即使在肿瘤中的复制增强保持持续的SCID 小鼠中也是如此(图4g)。这是值得注意的，因为产生肿瘤靶向OV 菌株的病毒修饰通常涉及减弱在正常组织中的病毒复制，而不是选择性地增强在肿瘤中的复制。

检查了HMGB1mut表达对自噬标志物的影响。可以看出，该转基因的表达导致LC3增加(图5a)，并且自噬泡成熟的抑制剂(液泡H+ATP酶抑制剂，巴佛洛霉素A1)和PI3K(LY294002；已知 PI3K/AKT/mTOR途径调节自噬)均导致最初用HMGB1mut表达观察到的病毒基因表达增加的丧失(图5b)。这意味着HMGB1对自噬的影响可能会使得病毒复制增强。

用靶向Atg5(一种自噬途径的关键介质)的siRNA转染HCT116 细胞。可以看出，自噬能力的丧失对病毒复制产生负面影响(图6a)。这一发现与先前的研究相矛盾，先前研究表明自噬不会影响痘苗复制。

检查了脂肪酸合酶在痘苗复制中的潜在作用。可以看出，脂肪酸合成酶抑制剂浅蓝菌素也显著降低了体外肿瘤细胞中的痘苗复制 (图6b)。

TK-HMGB1mut的复制进一步受益于感染肥胖模型中的肿瘤。在喂食高脂肪饮食的小鼠中，TK-和TK-HMGB1mut的复制均增加(图 6c和6d)。

HMGB1mut与化疗(包括紫杉醇和基于铂的药物如顺铂)有协同作用。取得来自感染TK-HMGB1mut的细胞的培养基，将其过滤以去除任何病毒颗粒，然后置于新鲜的肿瘤细胞层上，使这些细胞对随后的化疗(包括顺铂和紫杉醇)敏化(图7a)。对于表达HMGB1mut 的病毒而言，该效果出乎意料地显著。

在体内，该效果甚至更出乎意料地显著(图7b)。用单独或与紫杉醇联合的单次静脉内病毒注射(TK-或TK-HMGB1mut) 来治疗携带Renca肿瘤的BALB/c小鼠。可以看出，TK-HMGBlmut 加产生的治疗效果显著高于任何其他治疗。

在小鼠中评价了单独的痘苗毒株表达或其与基质金属蛋白酶-8 (MMP8)表达或透明质酸酶PH-2O表达组合对病毒扩散的影响。用仅痘苗毒株(仅WR TK)、痘苗毒株和MMP8表达(WR TK-mmp8) 或痘苗毒株和PH20表达(WR TK-ph20)处理的小鼠中肿瘤的生物发光成像揭示，相对于其他条件，具有痘苗毒株和PH20表达的肿瘤中病毒扩散显著增加(图8a和8b)。

体内实验进一步证明，HMGB1mut与PH20表达的组合增强治疗效果。用单次静脉内剂量的PBS(对照)或病毒(WR.TK-、 WR.TK-PH20或WR.TK-PH20.HMGB1mut)治疗携带预先建立的皮下MDA-MB-231肿瘤(50-100mm³)的免疫受损(无胸腺nu/nu)小鼠，并测量肿瘤体积。如治疗后14天所测量的，用 WR.TK-PH20.HMGB1治疗最显著地减小肿瘤体积(图9)。

将HMGB1mut与PH20表达组合的治疗效果与最佳同类临床病毒Pexa-Vec的模拟物(也称为JX-594)(WR.TK-GMCSF+；图10) 进行了比较。在第0天通过单次静脉内注射媒介物(作为对照)、 1E8PFU的表达HMGB1mut和PH20的病毒(WO-H1)或1E8 PFU 的表达WR.TK-GMCSF+的病毒来处理携带皮下Renca肿瘤(50-100 mm³)的BALB/c小鼠(n＝10只/组)。随处理后天数测量肿瘤体积。用HMGB1mut和PH20处理相对于用Pexa-Vec模拟物处理导致肿瘤体积减小(图10)。

还在肥胖小鼠的腹膜癌模型中将HMGB1mut和PH20表达组合的治疗效果与Pexa-Vec模拟物进行了比较。给C57/BL6小鼠喂食高脂肪饮食，直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％。然后给小鼠的腹膜腔中植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞。肿瘤生长之后进行生物发光成像。一旦建立肿瘤(5天后)，就单次低剂量地腹膜内注射PBS(对照)、5E6 PFU的表达HMGB1mut和 PH20的病毒或5E6 PFU的表达Pexa-Vec模拟物的病毒来治疗小鼠。值得注意的是，Pexa-Vec模拟物(WR.TK-.GMCSF+)实际上导致肿瘤生长略微增加，而HMGB1mut和PH20表达病毒(WO-H1)相对于PBS对照展现出显著降低的肿瘤负荷(图11)。

在先前的短期饥饿的背景下评价了HMGB1mut与PH20表达组合的治疗活性。给C57/BL6小鼠的腹膜腔中植入表达萤光素酶的 MC-38结肠直肠癌细胞。肿瘤生长之后进行生物发光成像。一旦建立肿瘤(5天后)，就用单独的病毒处理小鼠，或者先饥饿24小时的时间，然后用低剂量(5E6 PFU腹膜内)HMGB1mut和PH20表达(WO-H1) 的病毒处理小鼠(图12)。确定了虽然WO-H1在该模型中展现出治疗活性，但是这种效果通过先前的短期饥饿得到增强，而该短期饥饿是一种旨在模拟生酮饮食并且预期增加肿瘤中的自噬的预处理。

实施例3：示例性变异HMGB1从经修饰的腺相关病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤 模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的腺相关病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤腺相关病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照腺相关病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的腺相关病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰腺相关病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例4：示例性变异HMGB1从经修饰的单纯疱疹病毒(HSV)的表达增强癌细胞系 和鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的HSV相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤HSV(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照HSV 相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的HSV导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰HSV的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例5：示例性变异HMGB1从经修饰的腺病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤模型 中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的腺病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤腺病毒(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照腺病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的腺病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰腺病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例6：示例性变异HMGB1从经修饰的水泡性口炎病毒(VSV)的表达增强癌细胞 系和鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的VSV相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤VSV(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照VSV 相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的VSV导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰VSV的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例6：示例性变异HMGB1从经修饰的脊髓灰质炎病毒的表达增强癌细胞系和鼠 肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的脊髓灰质炎病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤脊髓灰质炎病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照脊髓灰质炎病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的脊髓灰质炎病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰脊髓灰质炎病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例7：示例性变异HMGB1从经修饰的新城疫病毒(NDV)的表达增强癌细胞系和 鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的NDV 相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤NDV(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照NDV 相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的NDV导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰NDV的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例8：示例性变异HMGB1从经修饰的塞内加谷病毒(SVV)的表达增强癌细胞系 和鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的SVV相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤SVV(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照SVV 相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的SVV导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰SVV的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例9：示例性变异HMGB1从经修饰的柯萨奇病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤 模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的柯萨奇病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤柯萨奇病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照柯萨奇病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的柯萨奇病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰柯萨奇病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例10：示例性变异HMGB1从经修饰的呼肠孤病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿 瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的呼肠孤病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤呼肠孤病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照呼肠孤病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的呼肠孤病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰呼肠孤病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例11：示例性变异HMGB1从经修饰的慢病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤模 型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的慢病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤慢病毒(其中编码变异 HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照慢病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的慢病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰慢病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例12：示例性变异HMGB1从经修饰的麻疹病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤 模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的麻疹病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤麻疹病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照麻疹病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的麻疹病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38 结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰麻疹病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例13：示例性变异HMGB1从经修饰的马拉巴病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿 瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的马拉巴病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤马拉巴病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照马拉巴病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的马拉巴病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰马拉巴病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例14：示例性变异HMGB1从经修饰的粘液瘤病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿 瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的粘液瘤病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤粘液瘤病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照粘液瘤病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的粘液瘤病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰粘液瘤病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例15：示例性变异HMGB1从经修饰的门戈病毒的表达增强癌细胞系和鼠肿瘤 模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1的核酸的门戈病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤门戈病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸单独或与编码PH-20的其他外源基因组合地插入病毒基因组中)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照门戈病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的门戈病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加>10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38 结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰门戈病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

实施例16：示例性变异HMGB1以及其他病毒基因修饰从经修饰的痘苗病毒的表达 增强癌细胞系和鼠肿瘤模型中的治疗效果

本研究的目的是探索与不含表达变异HMGB1和PH-20的核酸及B8R基因缺失的溶瘤痘苗病毒相比，根据本公开内容的示例性的经修饰溶瘤痘苗病毒(其中编码变异HMGB1的外源核酸与编码PH-20 的其他外源基因组合地插入病毒基因组中并且B8R基因被删除)在癌细胞系和鼠模型中的效果。观察到与对照溶瘤痘苗病毒相比，与化疗联合施用本公开内容的经修饰的溶瘤痘苗病毒导致协同效应。在施用于被喂食高脂肪饮食直至与喂食正常饮食的对照小鼠相比体重增加 >10％并随后在腹膜腔中被植入表达萤光素酶的MC-38结肠直肠癌细胞的小鼠之后，与对照病毒相比，在测试的经修饰溶瘤痘苗病毒的情况下观察到显著减少的肿瘤负荷。

序列表：

Claims (151)

1.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

2.根据权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。

3.根据权利要求1或2所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:15的残基1-20。

7.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在其第一核定位信号(NLS1)、第二核定位信号(NLS2)或它们的任何组合中的突变。

8.根据权利要求7所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1进一步包含在boxA、boxB或其任何组合中的突变。

9.根据权利要求7或8所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。

10.根据权利要求9所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述HMGB1变体包含在SEQ ID NO:15的位置43和65处的半胱氨酸残基。

11.根据权利要求9或10所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述HMGB1变体包含SEQ ID NO:15的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。

12.根据权利要求9或10所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述HMGB1变体包含SEQ ID NO:15的残基21-74和109-128或170-203。

13.根据权利要求7-12中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:15的残基1-20。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的外源核酸序列，其中所述核酸序列是SEQ ID NO:13的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％，或其片段。

15.根据权利要求7-14中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含编码抗体或其抗原结合片段的外源核酸序列，所述外源核酸序列可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列。

16.根据权利要求7-15中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含编码透明质酸酶的外源核酸序列，所述外源核酸序列可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列。

17.根据权利要求7-16中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS1中的突变，其中所述在NLS1中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。

18.根据权利要求7-16中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS2中的突变，其中所述在NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。

19.根据权利要求7-16中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS1和NLS2中的突变，其中所述在NLS1和NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。

20.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1与人HMGB1(SEQ ID NO:16)的同源性小于或等于95％。

21.根据权利要求20所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基1-85、89-108和150-183中的至少一段。

22.根据权利要求20或21所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基1-85。

23.根据权利要求20或21所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基89-108。

24.根据权利要求20或21所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基150-183。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基1-85、89-108和150-183。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和202中的一个或多个残基处的突变。

27.根据权利要求20-25中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和202处的突变。

28.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基23、45、89-108和150-183，并且其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:16的同源性小于或等于95％的氨基酸序列。

29.根据权利要求28所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基23-45、89-108、150-183。

30.根据权利要求28或29所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和202中的一个或多个残基处的突变。

31.根据权利要求28或29所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:16的残基35、42、89、181、189和202处的突变。

32.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

33.根据权利要求32所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。

34.根据权利要求31或32所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。

36.根据权利要求32-34中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:17的残基1-20。

38.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:19至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

39.根据权利要求38所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的核苷酸序列或其片段。

40.根据权利要求38或39所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:17至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203中的至少一段。

42.根据权利要求38-40中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:17的残基21-74、109-128和170-203。

43.根据权利要求38-42中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述变异HMGB1不包含SEQ ID NO:17的残基1-20。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS2中的突变，其中所述在NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，所述变异HMGB1包含所述在NLS1和NLS2中的突变，其中所述在NLS1和NLS2中的突变促进所述变异HMGB1的细胞质重新定位。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中由所述痘苗病毒表达的所述变异HMGB1分泌到细胞质中。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中与缺少编码所述变异HMGB1的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1从所述痘苗病毒的表达增强细胞自噬。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中与缺少编码所述变异HMGB1的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1的表达增强所述痘苗病毒的肿瘤特异性复制。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中与缺少编码所述变异HMGB1的所述外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒相比，所述变异HMGB1的表达使针对被所述痘苗病毒感染的肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答增强。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述变异HMGB1的表达诱导针对在被所述痘苗病毒感染的肿瘤细胞附近的肿瘤细胞的细胞毒性免疫应答，其中所述附近的肿瘤细胞未被所述痘苗病毒感染。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述痘苗病毒在其基因组中包含一个或多个缺失。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述痘苗病毒包含胸苷激酶基因缺失，并且所述外源核酸被插入所述胸苷激酶基因座中。

53.根据权利要求1-51中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸，其中所述痘苗病毒包含一个或多个毒力基因的缺失。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒是细胞外包膜病毒(EEV)。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述痘苗病毒进一步表达透明质酸酶。

56.根据权利要求1-55中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述痘苗病毒表达所述透明质酸酶，并且其中与不包含可操作地连接至编码所述变异HMGB1的所述外源核酸的编码所述透明质酸酶的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的传播相比，所述透明质酸酶增加所述痘苗病毒在肿瘤微环境中的传播。

57.根据权利要求1-56中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述痘苗病毒表达所述透明质酸酶，并且其中所述透明质酸酶增加所述痘苗病毒在肿瘤微环境中的传播。

58.根据权利要求1-57中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述痘苗病毒进一步表达使所述变异HMGB1在循环中稳定的蛋白质。

59.根据权利要求58所述的溶瘤痘苗病毒，其中使所述变异HMGB1在循环中稳定的所述蛋白质是免疫球蛋白或其结构域。

60.根据权利要求59所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述免疫球蛋白是IgE。

61.根据权利要求59所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述免疫球蛋白结构域是Fc结构域。

62.根据权利要求60所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列，其中编码所述IgE的其他外源核酸序列在上游与所述变异HMGB1编码序列融合。

63.根据权利要求1-62中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒进一步表达外排泵阻滞剂。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒进一步表达化疗敏化剂。

65.根据权利要求1-64中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒包含增强对化疗的敏化的修饰。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒包含吸引嵌合抗原受体T细胞的修饰。

67.根据权利要求1-66中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒增强基于CAR T细胞的疗法的功效。

68.一种分离的多核苷酸，其编码变异HMGB1，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:13至少85％同源的序列或其片段。

69.根据权利要求68所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码变异HMGB1，其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:15至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同源的氨基酸序列或其片段。

70.根据权利要求68或69中任一项所述的分离的多核苷酸，其编码所述变异HMGB1，其中所述变异HMGB1包含在其第一核定位信号(NLS1)或第二核定位信号(NLS2)中的突变。

71.根据权利要求70所述的分离的多核苷酸，其编码所述变异HMGB1，其中所述变异HMGB1进一步包含在boxA或boxB中的突变。

72.根据权利要求70所述的分离的多核苷酸，其编码所述变异HMGB1，其中所述变异HMGB1进一步包含在boxA或boxB中的多个突变。

73.根据权利要求68-72中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述变异HMGB1包含在SEQ ID NO:15的位置43和65处的半胱氨酸残基。

74.根据权利要求68-73中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述HMGB1变体包含SEQID NO:15的残基21-74、109-128和170-183中的至少一段。

75.根据权利要求68-73中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述HMGB1变体包含SEQID NO:15的残基21-105、108-182和183-205。

76.一种药物组合物，其包含如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求68-75中任一项所限定的分离的多核苷酸、增溶剂和赋形剂。

77.根据权利要求76所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任何组合中的一种或多种。

78.根据权利要求77所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、肌醇、山梨糖醇或其任何组合。

79.根据权利要求76-78中任一项所述的药物组合物，其不包含防腐剂。

80.根据权利要求76-79中任一项所述的药物组合物，其进一步包含防腐剂、稀释剂和载体中的一种或多种。

81.根据权利要求76-80中任一项所述的药物组合物，其进一步包含另外的活性成分或其盐。

82.根据权利要求76-81中任一项所述的药物组合物，其中所述增溶剂是无菌水。

83.根据权利要求76-81中任一项所述的药物组合物，其包含另外的活性成分，其中所述另外的活性成分是其他溶瘤病毒。

84.一种用于产生如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒的方法，所述方法包括：(i)通过将痘苗病毒碱基核酸序列可操作地连接至根据权利要求1-67中任一项所述的外源核酸序列来生成经修饰的痘苗病毒DNA载体；(ii)用所述经修饰的痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合于病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包括HeLa细胞、293细胞或Vero细胞。

86.根据权利要求84或85所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒DNA载体中的根据权利要求1-67中任一项所述的外源核酸有利于主要含有细胞外包膜病毒(EEV)的病毒颗粒群体。

87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，其中与不包含根据权利要求1-67中任一项所述的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒DNA载体相比，所述经修饰的痘苗病毒DNA载体中的根据权利要求1-67中任一项所述的外源核酸在HeLa细胞和293细胞的至少一种中产生更高的滴度。

88.一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物。

89.根据权利要求88所述的方法，其包括施用所述治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症是实体瘤、白血病或淋巴瘤。

90.一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物。

91.根据权利要求87所述的方法，其包括施用所述治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤是实体瘤、白血病或淋巴瘤。

92.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物。

93.一种治疗具有高脂肪酸生物利用度的肿瘤的方法，其包括施用如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒在具有高游离脂肪酸生物利用度的肿瘤中表现出增加的肿瘤选择性复制。

94.一种治疗肥胖癌症患者的方法，其包括施用如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒在所述肥胖癌症患者中表现出增加的肿瘤选择性复制。

95.根据权利要求93或94所述的方法，其中所述增加的肿瘤选择性复制是相对于不包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒的肿瘤选择性复制。

96.根据权利要求94所述的方法，其中所述增加的肿瘤选择性复制是相对于所述痘苗病毒在非肥胖癌症患者中的肿瘤选择性复制。

97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述痘苗病毒在所述肥胖癌症患者中产生增加的EEV比例。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述肥胖癌症患者中所述增加的EEV比例是相对于由不包含编码所述变异HMGB1的所述外源核酸序列但其他方面相同的痘苗病毒所产生的EEV比例。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述肥胖癌症患者中所述增加的EEV比例是相对于由所述痘苗病毒在非肥胖癌症患者中所产生的EEV比例。

100.一种降低化疗后癌症复发的可能性的方法，其包括施用如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂。

101.一种治疗方法，其包括将如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂施用于包括免疫疗法的先前治疗已失败的受试者。

102.一种治疗方法，其包括将如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂施用于化疗后癌症复发的受试者。

103.一种治疗方法，其包括将如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂施用于患有腹膜癌的受试者。

104.根据权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述受试者是肥胖的。

105.根据权利要求88-104中任一项所述的方法，其包括施用如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂，其中所述方法进一步包括施用其他疗法。

106.根据权利要求88-105中任一项所述的方法，其包括将如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂与所述其他疗法联合施用，其中所述其他疗法包括化疗、放射、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任何组合。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述其他疗法包括化疗。

108.根据权利要求107所述的方法，其中相比于化疗与不包含如权利要求1-67中任一项所限定的编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的联合，如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂与化疗的联合施用导致协同效应。

109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中相比于化疗与不包含如权利要求1-67中任一项所限定的编码变异HMGB1的外源核酸但其他方面相同的痘苗病毒的联合，化疗与如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂联合施用的剂量更低。

110.根据权利要求105-109中任一项所述的方法，其包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法同时或顺序地施用。

111.根据权利要求110所述的方法，其包括顺序施用所述其他疗法，其中在施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物之前施用所述其他疗法。

112.根据权利要求111所述的方法，其包括顺序施用所述其他疗法，其中在施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物之后施用所述其他疗法。

113.一种在癌细胞中产生毒性作用的方法，所述方法包括向癌细胞群体施用治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物。

114.根据权利要求113所述的方法，其包括施用所述治疗有效量的根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述癌细胞群体中并非每个癌细胞都感染所述溶瘤痘苗病毒。

115.根据权利要求114所述的方法，其中在未直接感染所述溶瘤痘苗病毒的情况下，未感染的癌细胞的生长被抑制。

116.根据权利要求114或115所述的方法，其中在未直接感染所述溶瘤痘苗病毒的情况下，诱导出未感染的癌细胞中的细胞毒性免疫应答。

117.一种药物递送方法，其包括向受试者的肿瘤中引入如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗载体或如权利要求76-83中任一项所限定的药物制剂。

118.根据权利要求117所述的方法，其中所述药物包含与肿瘤受体配体缀合的纳米颗粒。

119.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括施用感染如权利要求1-67中任一项所限定的溶瘤痘苗病毒的细胞。

120.根据权利要求119所述的方法，其中所述方法提高基于溶瘤痘苗病毒的癌症疗法的功效。

121.根据权利要求88-120中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以包含约10⁶PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。

122.根据权利要求88-121中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以包含约5 x 10⁹PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。

123.根据权利要求88-122中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并且以高剂量施用第三时间段。

124.根据权利要求123所述的方法，其包括独立地施用所述初始剂量、所述中间剂量和所述高剂量，其中所述初始剂量低于所述中间剂量，并且所述中间剂量低于所述高剂量。

125.根据权利要求123或124所述的方法，其中所述第一时间段、所述第二时间段和所述第三时间段各自为约1周至约3周。

126.根据权利要求88-125中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒和所述药物组合物独立地构成液体剂型，所述液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL或约750mL至1000mL的体积施用。

127.根据权利要求88-126中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。

128.根据权利要求88-127中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。

129.根据权利要求88-128中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以每日一次、每日两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。

130.根据权利要求88-129中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物静脉内施用、腹膜内施用或通过瘤内注射施用。

131.根据权利要求88-130中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述痘苗病毒或所述药物制剂以团注或缓慢输注的形式施用。

132.根据权利要求88-131中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物的施用在自施用第一剂量起约1小时至约3天后导致第一峰值病毒载量，并且在约3天至约10天后导致第二峰值病毒载量。

133.根据权利要求88-132中任一项所述的方法，其包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。

134.根据权利要求88-133中任一项所述的方法，其包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法以每日一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。

135.根据权利要求88-134中任一项所述的方法，其包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。

136.根据权利要求88-135中任一项所述的方法，其包括施用所述其他疗法，其中所述其他疗法经口服施用、静脉内施用、通过瘤内注射施用或通过放射施用。

137.根据权利要求88-136中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物施用于有需要的受试者，其中所述受试者是人。

138.根据权利要求88-137中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。

139.根据权利要求88-138中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者被诊断为患有癌症或肿瘤，并且其中所述受试者是肥胖的。

140.根据权利要求88-139中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物与所述其他疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物或所述其他疗法之前，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。

141.根据权利要求88-140中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物与所述其他疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前，所述受试者被诊断为患有癌症或肿瘤，并且其中所述受试者是肥胖的。

142.根据权利要求88-141中任一项所述的方法，其中在施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物之前、同时或之后向所述受试者施用生酮饮食。

143.根据权利要求88-142中任一项所述的方法，其中在施用根据权利要求1-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或根据权利要求76-83中任一项所述的药物组合物之前、同时或之后对所述受试者进行短期禁食。

144.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:13至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

145.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含在其第一核定位信号(NLS1)、第二核定位信号(NLS2)或它们的任何组合中的突变。

146.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1与人HMGB1(SEQ ID NO:16)的同源性小于或等于95％。

147.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述变异HMGB1包含SEQ ID NO:16的残基23、45、89-108和150-183中的至少一段，并且其中所述变异HMGB1包含与SEQ ID NO:16的同源性小于或等于95％的氨基酸序列。

148.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:14至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

149.一种经修饰的病毒，其包含编码变异HMGB1的外源核酸，其中所述外源核酸包含与SEQ ID NO:19至少约80％同源的核苷酸序列或其片段。

150.根据权利要求144-149中任一项所述的经修饰的病毒，其包括单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、VSV、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、麻疹病毒、马拉巴病毒、新城疫病毒(NDV)、塞内加谷病毒、门戈病毒或粘液瘤病毒。

151.根据权利要求7-19中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中NLS1包含SEQ ID NO:20，并且NLS2包含SEQ ID NO:21。